粘膜投与型ワクチン
【課題】粘膜、例えば口腔粘膜又は鼻腔粘膜に滞留的に投与することにより、効果的に、ウイルスに特異的な分泌型ＩｇＡ及び／又はＩｇＧ抗体の産生を誘導させる粘膜投与型ワクチンを提供すること、更には、かかるアジュバント作用物資を提供すること。
【解決手段】粘膜投与用のワクチンであって、
（ａ）病原体由来の不活性化抗原；
（ｂ）アジュバント；及び
（ｃ）β−グルカン等の多糖類、さらに
（ｄ）増粘剤；
を含むことを特徴とする粘膜投与型ワクチンであり、好ましくはアジュバントが、ＴＬＲ（Toll-Like Receptor）のリガンドである二本鎖または一本鎖ＲＮＡであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、キチン、キトサン又はホッキ貝の微粉末であり、粘膜投与、好ましくは口腔粘膜又は鼻腔内粘膜に投与することにより、良好に粘膜上に滞留し、その場でＩｇＡ抗体の分泌と、血清中でのＩｇＧ抗体応答を得ることを特徴とする粘膜投与型ワクチンである。
【解決手段】粘膜投与用のワクチンであって、
（ａ）病原体由来の不活性化抗原；
（ｂ）アジュバント；及び
（ｃ）β−グルカン等の多糖類、さらに
（ｄ）増粘剤；
を含むことを特徴とする粘膜投与型ワクチンであり、好ましくはアジュバントが、ＴＬＲ（Toll-Like Receptor）のリガンドである二本鎖または一本鎖ＲＮＡであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、キチン、キトサン又はホッキ貝の微粉末であり、粘膜投与、好ましくは口腔粘膜又は鼻腔内粘膜に投与することにより、良好に粘膜上に滞留し、その場でＩｇＡ抗体の分泌と、血清中でのＩｇＧ抗体応答を得ることを特徴とする粘膜投与型ワクチンである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粘膜、特に呼吸器粘膜、例えば口腔粘膜又は鼻腔粘膜に滞留的に投与することにより、効果的に、ウイルスに特異的な分泌型ＩｇＡ及び／又はＩｇＧ抗体の産生を誘導させる粘膜投与型ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
最近各種ウイルスによる感染症が大きく問題視されてきている。そのなかでも、現在、世界的に問題となっているウイルスとして、Ｈ５Ｎ１型トリインフルエンザウイルスがある。
このＨ５Ｎ１型トリインフルエンザウイルス（Avian influenza, bird flu）は、Ａ型インフルエンザウイルスの一種であり、高病原性トリインフルエンザの原因となるウイルスである。もともと鳥から鳥へ感染するウイルスであって、中国や東南アジアでは鶏などの家禽類への大量感染が報告されている。
感染力がきわめて高く、鳥類だけでなくヒトにも感染するといわれており、現在においては、ヒトからヒトへは感染しないとされているが、ウイルスが変異して新型のインフルエンザウイルスになる可能性が高く、既に東南アジアでは、ヒトからヒトへの感染の疑いも高まっており、世界保険機構（ＷＨＯ）は、強い警告を発している。
【０００３】
今までのインフルエンザウイルスは、感染したとしても、呼吸器官の表層における炎症の発生だけであるが、このトリインフルエンザウイルスは血液を介して他の臓器にも炎症を引き起こし、重篤が極めて高い危険性のあるウイルスである。
我が国においても、既にいくつかの養鶏場におけるトリインフルエンザの大量感染がみられ、このウイルスから変異した新型（高病原性）インフルエンザウイルスに対する対策は急務の問題とされている。しかしながら、現在有効な治療用のワクチンは登場してきておらず、さしあたって、抗ウイルス薬であるタミフル等を使って治療するより方策がないが、かかる抗ウイルス薬が、ヒトへの感染性を有するかも知れない高病原性インフルエンザウイルスに対して有効であるか否かは、判明していない。
【０００４】
ところでワクチンは、例えば、未感染の個体におけるウイルスまたは病原菌からの感染を防御する手段に使用するものとして確立したものであり、その方法は、ウイルスまたは病原菌等の病原体由来の不活化抗原であるワクチンを接種し、個体に意図的に抗体を誘導させる方法である。
そのようなものとして、既にインフルエンザワクチン、コレラワクチン、チフスワクチン、種痘ワクチン、ＢＣＧワクチン等などが知られている。
【０００５】
そのなかでもインフルエンザ、重症急性呼吸器感染症候群（ＳＡＲＳ）等の呼吸器疾患は、呼吸器官からの感染によるものであり、この空気感染によるインフルエンザ等の呼吸器感染症の防御には、粘膜より分泌される特異的ＩｇＡ抗体が非常に有効であることが知られている。特に型の異なるウイルスに対する交叉防御は、粘膜で分泌されるＩｇＡ抗体が主に担っており、インフルエンザウイルスに自然罹患した後に回復したヒトには、このＩｇＡ抗体が誘導されており、同亜型の変異型ウイルスの流行に対しても、獲得免疫による感染防御ができているとされている。
【０００６】
したがって、ワクチンの投与により呼吸器粘膜での免疫応答の確立が求められているが、現在用いられているワクチンは皮下注射によるものであり、効果的な粘膜免疫応答が得られず、交叉防御能を有する、より効果的なワクチンの開発が求められているのが現状である。
【０００７】
すなわち、注射型ワクチンは、血中（全身）の免疫能（ＩｇＧ抗体の産生）を増強するものの、粘膜での免疫能（分泌型ＩｇＡ抗体の産生）は増強しない。したがって、注射型ワクチンによる血中免疫に期待できる効果は、感染後における症状の重症化の予防でしかなく、粘膜経由による感染自体を防御することは困難である。
そのうえ、インフルエンザウイルスのように、その年その年における様々な流行型がある場合には、ワクチンである病原体由来の不活性化抗原が、感染防御の対象とするインフルエンザの病原体と異なっている場合には、その効果は大きく低下することとなり、全く効果がない事態まで生じている。したがって、現実には、その年に流行するインフルエンザの流行型を見極めてワクチンを製造しているのが現状である。
【０００８】
これに対して、粘膜投与型ワクチンは、対象となる疾患の病原体のタイプをあまり厳密に区別しないのが特徴であり、ワクチンと疾患の流行型が異なっていても、免疫能を獲得できる効果がある。
しかしながら、気道の絨毛、腸管の粘膜層などの粘膜には、外界からの異物の侵入に対する防御機構が備わっており、注射型ワクチンと同じ成分をそのまま粘膜投与しても、十分な免疫獲得の刺激を与えることができない。そのため、本来のワクチン成分以外に、免疫獲得能を増強する物質、すなわちアジュバントと共に粘膜へ投与する粘膜投与型ワクチンの研究が盛んに行われてきている。
【０００９】
本発明者も、かかる観点に立脚した粘膜投与型ワクチンのいくつかを提案してきている（特許文献１〜３）。これまで提案してきている粘膜投与型ワクチンは、ウイルスの不活性抗原のワクチン効果をより完全なものとすることを目的として、ワクチンに対するアジュバント作用を有する物質を同時に効果的に鼻腔内粘膜上に投与するものであり、例えば、液状のワクチンをアジュバントと共に霧状に噴霧したり、或いは微粉末状にして噴霧したりするものであり、粘膜上におけるＩｇＡ抗体の誘導を確保したものであり、その点で特異的なものである。
【００１０】
しかしながら、ワクチン投与による免疫能をより確実に、且つ効果的に獲得するためには、ワクチンを、アジュバント作用を有する物質と共に、さらに免疫増強物質を投与すること、また、これらの物質を、例えば鼻腔内粘膜上に滞留的に投与することが必要である。本発明者が提案している粘膜投与型のワクチンはアジュバント作用物質自体に粘膜滞留性を求めたものであるが、さらに免疫増強物質を添加し、その上で意図的に粘膜滞留性を付与した成分を添加したアジュバント作用物質を用いた粘膜投与型ワクチンは、これまで登場していないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００５−０８２５８１号公報
【特許文献２】特開２００７−０７７０７３号公報
【特許文献３】特開２００８−２３１０３７号公報
【００１２】
本発明者は、かかる現状を鑑み種々検討を加え、ワクチンに対するアジュバント作用を有する物質として、アジュバント共に免疫増強物質を添加すること、さらに呼吸器粘膜、具体的には口腔粘膜又は鼻腔粘膜への滞留性を有する増粘剤を添加することにより、より効果的に粘膜上でのＩｇＡ抗体分泌と、血清中におけるＩｇＧ抗体応答が得られ、さらに致死量の各種ウイルスに対する感染防御効果が認められることを確認し、本発明を完成させるに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明は、粘膜、好ましくは呼吸器粘膜、例えば口腔粘膜又は鼻腔粘膜に滞留的に投与することにより、効果的に、ウイルスに特異的な分泌型ＩｇＡ及び／又はＩｇＧ抗体の産生を誘導させる粘膜投与型ワクチンを提供すること、更には、かかるアジュバント作用物資を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
かかる課題を解決するための本発明は、その基本的な一態様として、粘膜投与用のワクチンであって、
（ａ）病原体由来の不活性化抗原、
（ｂ）アジュバント、及び
（ｃ）β−グルカン等の多糖類、
を含むことを特徴とする粘膜投与型ワクチンである。
【００１５】
また、本発明は上記の粘膜投与型ワクチンにあって、さらに増粘剤を含むことを特徴とする粘膜投与型ワクチンである。
【００１６】
より具体的には、病原体が、水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス（コロナウイルスの一種）、ウエストナイルウイルス、ハンタウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌、コレラ菌、マラリア病原体及び眠り病病原体からなる群から選択されるものである粘膜投与型ワクチンであり、最も具体的には、病原体がインフルエンザウイルスである粘膜投与型ワクチンである。
【００１７】
さらに具体的には、本発明は、アジュバントが、ＴＬＲ（Toll-Like Receptor）のリガンドである二本鎖または一本鎖ＲＮＡである粘膜投与型ワクチンであり、より具体的には、二本鎖ＲＮＡが、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）であり、好ましくは、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の分子サイズが３００ｂｐ以上である粘膜投与型ワクチンである。
【００１８】
また本発明は、アジュバントがキチン、キトサン又はホッキ貝の微粉末である粘膜投与型ワクチンである。
【００１９】
さらにまた、本発明は、具体的には、増粘剤が、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、デンプンリン酸エステルナトリウム、メチルセルロース又はポリアクリル酸ナトリウムからなる群から選択されるものである粘膜投与型ワクチンである。
【００２０】
本発明の上記の粘膜投与型ワクチンは、最も具体的には、粘膜投与用として、特に呼吸器粘膜、より好ましくは口腔粘膜又は鼻腔粘膜に投与される粘膜投与型ワクチンである。
【００２１】
さらにまた本発明は別の態様として、上記の粘膜投与型ワクチンに使用するアジュバントを提供し、具体的には、アジュバント、β−グルカン等の多糖類、及び増粘剤からなることを特徴とする粘膜投与用ワクチンのためのアジュバントである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明が提供する粘膜投与型ワクチンは、ウイルス由来の不活化抗原、アジュバント及びβ−グルカン等の多糖類、さらに増粘剤を含有する、好ましくは微粉末状の形態にあるワクチンであり、かかるワクチンを粘膜、特に呼吸器粘膜、例えば口腔粘膜又は鼻腔粘膜に投与することにより、免疫力を高め、口腔粘膜又は鼻腔粘膜上に増粘剤の作用によりワクチンと共にアジュバントが滞留的に止まり、その結果、各種ウイルスに特異的な呼吸器粘膜組織における分泌型ＩｇＡ及び／又はＩｇＧ抗体の産生が誘導される。
【００２３】
分泌型ＩｇＡ及び／又はＩｇＧ抗体は、外分泌液中の主要な免疫グロブリンであり、粘膜表面の感染防御に役立っている病原菌特異的ＩｇＡ及び／又はＩｇＧ抗体であって、唾液、鼻汁、腸、気管などの分泌液中、あるいは初乳中に多くみられ、また血清中にも存在する。したがって、本発明が提供するワクチンを投与することによりこのＩｇＡ及び／又はＩｇＧ抗体の産生が効果的に誘導され、ウイルスによる感染を防御するものである。
そのうえ、アジュバントと共に投与されるβ−グルカン等の多糖類により、生体の免疫力をより効果的に高め、ウイルスによる感染を防御するものである。
また、本発明が提供するワクチンは、粉末として簡便に粘膜、特に口腔粘膜又は呼吸器粘膜上に投与し得るものであり、その有用性は多大なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明が提供する粘膜投与型ワクチンにおいて、ワクチンのアジュバントとして使用されるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）誘導体は、Ｔｏｌｌ様レセプター（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＬＲ）のリガンドである２本鎖ＲＮＡであり、自然免疫系を刺激するＴＬＲのリガンドとして、病原菌あるいはウイルス等の微生物の攻撃に対する防御免疫獲得能を発揮する。
事実、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含むＴＬＲのリガンドである２本鎖ＲＮＡが、アジュバントとしてワクチンと共に投与された場合には、そのワクチン能を増強させるのではなく、二本鎖ＲＮＡであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）自体が、種々の病原菌あるいはウイルス等の病原体の攻撃に対する防御免疫能を増強せしめ、特にウイルスまたは病原菌特異的ＩｇＡ抗体及びＩｇＧ抗体を誘導させることによって病原体による感染を防御する。
【００２５】
本発明で使用する二本鎖ＲＮＡであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、その分子の大きさとしては、その塩基対（ｂｐ）として低〜高サイズの種々のものを用いることが可能であるが、免疫応答に対してより優れた応答を発揮するものは、３００ｂｐ以上の分子サイズを有することが必要であることが判明した。そのような分子サイズを有するものとして、例えば、１００〜１０００ｂｐのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、東レ株式会社から容易に入手することができる。
【００２６】
アジュバントとしては上記したＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）誘導体に限定されるものではなく、アジュバント作用を有する物質であれば、広く本発明の粘膜投与型ワクチンとして使用することができることはいうまでもない。
そのようなアジュバント作用を有する物質として、例えば、キチン、キトサン又はホッキ貝の微粉末等を挙げることができる。
【００２７】
一方、本発明が提供する粘膜投与型ワクチンにより、アジュバントとしてのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）等と共に投与される不活性化抗原であるワクチンとしては、身体中に接種されて、活性な免疫を生成する、通常感染性因子または感染因子のある部分を含む抗原性懸濁液または溶液である。ワクチンを構成する抗原性部分は、一般的には微生物（例えば、ウイルスまたは細菌など）または微生物から精製された天然の産生物、合成生成物または遺伝子操作したタンパク質、ペプチド、多糖または同様な産生物であってもよい。
【００２８】
本発明においては、生ワクチン或いは不活化ワクチンとしては、具体的には、重症急性呼吸器感染症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス感染症の生ワクチン、インフルエンザの生ワクチン等をあげることができる。
しかしながら、これらに限定されるものではなく、病原体由来の不活性化抗原としてのワクチンを構成する病原体として、水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス（コロナウイルスの一種）、ウエストナイルウイルス、ハンタウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌、コレラ菌、マラリア病原体及び眠り病病原体等を挙げることができる。
【００２９】
また、本発明にいう不活化抗原とは、感染能を失わせた抗原をいい、完全ウイルス粒子であるビリオン、不完全ウイルス粒子、ビリオン構成粒子、その翻訳後修飾体、ビリオン非構成タンパク質、その翻訳後修飾体、感染防御抗原、中和反応のエピトープなどを挙げられることができる。不活化は、例えば、物理的（例えば、Ｘ線照射、熱、超音波）、化学的（ホルマリン、水銀、アルコール、塩素）などの操作により行うことができる。
【００３０】
本発明が提供する粘膜投与型ワクチンは、アジュバントであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）誘導体、または他のアジュバントにβ−グルカン等の多糖類を添加し、さらに増粘剤を添加し、投与されるワクチンと共に微粉末状の形態にしたものである。
【００３１】
本発明においてアジュバント共に添加されるβ−グルカンは、グルコースがβ１−３型の結合で連なった多糖であり、植物や菌類、細菌などの自然界に広く分布するものであり、強い免疫賦活作用をもつ物質である。本発明においては、β−グルカンとして、β−グルカンを多量に含むキノコの担子類を添加してもよい。
そのようなキノコ担子類としては、アガリクスや、ハナビラタケ、メシマコブ、マイタケ、カバノアナタケ、冬中夏草、霊芝或いは椎茸等を挙げることができるが、これらのものに限定されるものではない。
この場合のキノコ担子類は、乾燥品を微粉末状として用いるのが好ましい。
【００３２】
一方、本発明でアジュバントと共に使用する増粘剤としては、例えば、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、デンプンリン酸エステルナトリウム、メチルセルロース又はポリアクリル酸ナトリウム等をあげることができる。
増粘剤としては、上記のものに限定されるものではなく、粘膜上で増粘作用を発揮し、ワクチンをアジュバントと共に粘膜上に滞留させ得るものであれば、どのようなものでも使用することができる。
【００３３】
アジュバントとβ−グルカン等の多糖類、さらに増粘剤のワクチンに対する使用量は、一概に限定できないが、粘膜投与型ワクチンとして分泌型ＩｇＡ及び／又はＩｇＧ抗体の産生を確保する量のワクチン量に対し、粘膜上への噴霧が可能となり、粘膜上に滞留し得る量を用いればよい。
具体的には、本発明が提供する粘膜投与型ワクチンの投与量として、投与する対象者の年齢、体重、投与方法により一概に限定し得ないが、通常成人１日当たり、経鼻投与の場合には、０．１〜１０ｍｇ、好ましくは、０．１〜１ｍｇ程度であることより、これに対応したアジュバント、β−グルカン等の多糖類、さらに増粘剤の量を使用すればよい。
【００３４】
本発明の粘膜投与型ワクチンの投与は、微粉末を粘膜上に噴霧することにより行うことができる。脊椎動物における粘膜には、消化器、呼吸器、排出器、生殖器などの特に外通性の中腔器官の内壁が含まれる。したがって、本発明の投与形態である粘膜投与としては、例えば、鼻腔投与（経鼻投与）、口腔投与、膣内投与、上気道投与、肺胞投与などをあげることができる。そのなかでも口腔粘膜又は鼻腔内粘膜投与が好まし。口腔並びに鼻腔は特に、インフルエンザウイルスなどによる呼吸器感染症疾患の感染経路の門戸であることから、粘膜投与により分泌型ＩｇＡ反応を引き起こし、粘膜上皮細胞中に分泌型ＩｇＡ抗体を産生させることは、呼吸器感染症の防御に結びつくものである。
【００３５】
特に、鼻腔内投与（経鼻投与）に際しては、微粉末或いは懸濁液によるスプレー投与等の手段を、また口腔内投与に際しては、うがい薬、歯磨き粉、歯磨きペースト等による口腔粘膜への投与等の手段を採用することができる。特に歯磨き粉等による投与は、日常的に行う歯磨きによる投与であり、ウイルス感染症に対する防御として好ましく、特異的なものであるといえる。
【実施例】
【００３６】
以下に本発明を、具体的実施例により、さらに詳細に説明する。
実施例１：合成二本鎖ＲＮＡであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）のＩｇＡ、ＩｇＧ産生能
合成二本鎖ＲＮＡとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をアジュバントとして用い、β−グルカン、さらに増粘剤としてアルギン酸ナトリウムを用いて、また不活化抗原として不活化ウイルスまたはサブユニット抗原の中和抗体惹起能、ひいては抗病原体効果を確認した。
【００３７】
（材料）
マウス：ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌性）
ウイルス：インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１（Ａ／ＰＲ８）株（国立感染症研究所（東京）から入手した）。
ワクチン：インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１（Ａ／ＰＲ８）株Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ）株（国立感染症研究所）；Ｈ１Ｎ１（（Ａ／Ｙａｍａｇａｔａ）株（国立感染症研究所）；Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｇｕｉｚｏｕ）株（国立感染症研究所）；エーテル処理不活化ＨＡワクチン（財団法人 阪大微生物研究会、香川）
アジュバント：ポジティブコントロールとしてＣＴＢ＊［ＣＴＢ（コレラ毒素Ｂサブユニット）、０．１％ＣＴ（コレラ毒素）を含む］、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）
増粘剤：アルギン酸ナトリウム
β−グルカンとして、β−グルカン又はアガリクスの担子類
【００３８】
（方法）
６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本ＳＬＣ（株）、東京）各群５匹ずつ用いた。ＰＲ−８ＨＡワクチン（国立感染症研究所）１μｇを、それぞれのアジュバントとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、０．１μｇ、１μｇ、３μｇ、１０μｇ及びβ−グルカン並びに増粘剤としてアルギン酸ナトリウムの同量と共に微粉末化し、マウスの鼻に５μＬを接種し、その３週間後同量のワクチンを、アジュバントなし、もしくはアジュバント有りのものとして経鼻接種し、さらに２週間後に１００ｐｆｕのＰＲ８インフルエンザウイルスを片鼻に１．２μＬずつ接種し感染を行った。
コントロールとして、ＰＲ８ＨＡワクチンのみ、処置なしの群をおいた。
感染３日後に、鼻腔洗浄液、血清を回収し、鼻腔洗浄液中のＩｇＡおよび血清中のＩｇＧをＥＬＩＳＡ法により、また、鼻腔洗浄液中のウイルス価を、ＭＤＣＫ細胞を用いたプラークアッセイで測定した。
【００３９】
同様の方法で経鼻免疫したマウスに、４０ＬＤ５０の致死量（１０４．７ＥＩＯ５０（５０％の発育鶏卵において免疫性を示すウイルス量の約１００００倍量）のインフルエンザウイルスを２０μＬ感染させ、その生存を観察した。
【００４０】
また、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をアジュバントに用いた経鼻インフルエンザワクチンの交叉防御をみるために、亜型の違うインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１（Ａ／ＰＲ８）株Ｈ１Ｎ１（Ｂｅｉｊｉｎｇ）株、Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｙａｍａｇａｔａ）株、Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｇｕｉｚｏｕ）株のワクチンを、３μｇのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、同量のβーグルカン及び増粘剤（アルギン酸ナトリウム）をアジュバントとして用いて経鼻接種し、３週間後ワクチンのみを接種、さらに２週間後に１００ｐｆｕのＰＲ８インフルエンザウイルスを片鼻１．２μＬずつ接種し、感染を行った。感染３日後に鼻腔洗浄液、血清を回収し、鼻腔洗浄液中のＩｇＡおよび血清中のＩｇＧをＥＬＩＳＡ法により、また、鼻腔洗浄液中のウイルス価を、ＭＤＣＫ細胞を用いたプラークアッセイで測定した。
【００４１】
さらに、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の中枢神経系への安全性を調べるため、０．２５μｇ、２．５μｇ、２５μｇのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を２５μＬのＰＢＳに溶解し、二段針を用いて脳内接種を行った。接種後の体重の変化を測定し、また生存を観察した。
なお、対照群として２．５μｇ、１０μｇ、２５μｇのＣＴＢ＊（ＣＴＢ、０．１％ＣＴを含む）を同様に２５μＬのＰＢＳに溶解した溶液を脳内に接種した群をおいた。
【００４２】
（結果）
（１）Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をアジュバントに用い、β−グルカン、さらに増粘剤を用いた経鼻インフルエンザワクチンによる抗体誘導と感染防御について
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の粘膜アジュバント能を評価した。６週間前に１μｇのＰＲ８ワクチンを０．１μｇ〜１０μｇに量を振ったＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及び増粘剤と共に経鼻接種し、さらに２週間前に同量のワクチンを、ワクチンのみ、またはアジュバント／β−グルカン／増粘剤と共に経鼻接種した。経鼻粘膜でのＩｇＡ抗体応答と、血中ＩｇＧ応答を表１にまとめた。
【００４３】
【表１】
【００４４】
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の用量依存性のアジュバント効果をみるために、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の量は０．１μｇから１０μｇまで段階的に増やし、それと同量の増粘剤を添加したアジュバント作用をみた。
その結果、表１に示した結果からも判明するように、鼻腔粘膜にＩｇＡの応答のためには、最低で０．１μｇのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を初回免疫時に使用すると応答が認められることが判明した。
【００４５】
鼻腔粘膜に誘導されるＩｇＡの量は、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の量に依存的であり、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の量を増やせば増やすほどそのアジュバント効果が認められた。
２回の免疫ともに、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を用いると、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）１μｇの量で鼻腔洗浄液中に１００ｎｇ／ｍＬ以上のＩｇＡの分泌がみられ、初回のみの免疫の場合には３μｇのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）添加で、１００ｎｇ／ｍＬ以上の特異的ＩｇＡ抗体の誘導が認められた。
血清中のＩｇＧの産生も同時に検討したが、その産生は、ＩｇＡの分泌に相関するものであり、１μｇのＰＲ８ワクチンをＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と共に４週間間隔で２回免疫すると、１．４２μｇ／ｍＬの血中ＩｇＧが得られた。
【００４６】
また、同様の免疫条件で２回目の免疫の２週間後に１００ｐｆｕのＰＲ８ウイルスを、片鼻１．２μＬずつ感染を行った場合には、ワクチンを接種しないコントロール群では、鼻腔洗浄液中に１０２ｐｆｕ／ｍＬ以上のウイルス価に、ウイルス増殖が認められた。
これに対し、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）／β−グルカン／増粘剤を併用して経鼻ワクチン接種を２回行った群では、完全にウイルス増殖が抑制されており、また、ワクチン単独で１μｇ以上を２回免疫した群、ならびに３μｇ以上のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を初回免疫時のみ使用した群では、全くウイルス抑制効果は認められなかった。
【００４７】
また、１μｇ、０．１μｇのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及び同量の増粘剤を初回のみ併用接種した群においても、１００．７ｐｆｕ／ｍＬ、１０１．５ｐｆｕ／ｍＬと、顕著なウイルスの増殖抑制が認められた。なお、ワクチンのみの２回投与群では、ウイルスの増殖抑制は全く認められなかった。
これらの結果をまとめて表２に示した。
【００４８】
【表２】
【００４９】
なお、アジュバントとしてキチンの微粉末、キトサンの微粉末或いはホッキ貝の微粉末を用いて同様の検討を行った。
その結果、アジュバントとして先に検討したＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と同様に、これらのアジュバント作用物質にもＩｇＡ、ＩｇＧ産生能を高める効果があることが判明した。
【００５０】
（２）Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）／β−グルカン／増粘剤とワクチンの併用経鼻ワクチン接種による致死量のインフルエンザウイルス感染による肺炎の防御効果について
６週間前に１μｇのＰＲ８ワクチンと、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を１０μｇ、３μｇおよび１μｇ並びに同量のβ−グルカン及び増粘剤（アルギン酸ナトリウム）を併用してアジュバントとして用い、経鼻接種し、２週間前にワクチンのみで追加免疫し、４０ＬＤ５０のＰＲ８ウイルス２０μＬを感染させ、肺炎の防御能を調べた。
ワクチンを接種しない群では、マウスは１週間以内に前例（５／５）が死亡し、ウイルス感染３日後の肺のウイルス価も１０６ｐｆｕ以上であった。
これに対してワクチン接種群では、１μｇ以上のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）／β−グルカン／増粘剤と共に併用接種することで、全マウスは生存していた。この結果を表３に示す。
【００５１】
【表３】
【００５２】
以上の事実から、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）／β−グルカン／増粘剤のアジュバントを用いることにより、感染防御に十分な分泌型ＩｇＡ抗体を産生しており、粘膜ＩｇＡ抗体応答を引き出すことが判明した。
【００５３】
なお、同様の試験を、ウイルスとしてハンタウイルス［ハンタウイルス株（国立感染症研究所（東京）から入手）］を用い、ワクチンとしてエーテル不活性化ワクチン（国立感染症研究所から入手）を用い、アジュバントとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、β−グルカン、及び増粘剤としてアルギン酸ナトリウムを用いて行った。
その結果、同様に、感染防御に十分な分泌型ＩｇＡ抗体を産生しており、粘膜ＩｇＡ抗体応答を引き出すものであった。
【００５４】
さらに、アジュバントとしてキチンの微粉末、キトサンの微粉末或いはホッキ貝の微粉末を用いて同様の検討を行った。
その結果、アジュバントとして先に検討したＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と同様に、これらのアジュバント作用物質を用いた場合であっても、感染防御に十分な分泌型ＩｇＡ抗体を産生しており、粘膜ＩｇＡ抗体応答を引き出すものであった。
【００５５】
実施例２：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）併用経鼻ワクチンによる交叉防御
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）併用経鼻インフルエンザワクチンにより誘導されるインフルエンザ感染防御について、その交叉防御能について検討を行った。
ＰＲ８と亜型の違うインフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ）株、Ｈ１Ｎ１（Ｙａｍａｇａｔａ）株、Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｇｕｕｚｈｏｕ）株のワクチンを３μｇのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及び同量のβ−グルカン並びに増粘剤（アルギン酸ナトリウム）をアジュバントとして用い初回免疫し、４週後に同じ株のワクチンのみを接種し、さらに２週間後に１００ｐｆｕのＨ１Ｎ１（Ａ／ＰＲ８）株を１００ｐｆｕ感染させ、その３日後に鼻腔洗浄液中のＰＲ８と交叉反応するＩｇＡ、血清中のＩｇＧを測定し、またＰＲ８ウイルスの交叉防御について検討した。
それらの結果を表４および表５に示した。
【００５６】
【表４】
【００５７】
【表５】
注：二次は、ワクチンのみ。
＊：Ｐ＜０．００１
【００５８】
各表中の結果から判明するように、同じ亜型のＨ１Ｎ１（Ａ／ｂｅｉｊｉｎｇ）株、Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｙａｍａｇａｔａ）に対しては、ＩｇＡ、ＩｇＧ応答ともに認められ、ウイルス感染も完全に抑制していた。
亜型の異なるＨ３Ｎ２（Ａ／Ｇｕｕｚｈｏｕ）株に対しては、交叉反応するＩｇＡ、ＩｇＧが少量認められ、ウイルス感染の部分防御がみられた。
以上の事実から、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）／β−グルカン／増粘剤をアジュバントとして用いて併用経鼻インフルエンザワクチンにより、交叉防御が確認された。
【００５９】
実施例３：不活化ウイルス粒子をＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と併用する経鼻インフルエンザワクチンとして用いた時の予防効果
（材料）
ワクチン：エーテル処理ＨＡワクチン（阪大微研製）；ホルマリン不活化全ウイルス粒ワクチン（Inactivated whole particle vaccine）、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルス)（阪大微研製）
マウス：ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌性）
【００６０】
（方法）
Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのホルマリン不活化全ウイルス粒子ワクチン（Inactivated whole particle vaccine）０．１μｇを、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）［１００−１０００ｂｐ：東レ］０．１μｇ、β−グルカン０．１μｇ及び増粘剤（アルギン酸ナトリウム）０．２μｇをアジュバントとして用い、併用経鼻インフルエンザワクチンのワクチン成分としてマウス：ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌性）に投与し、３週間後に同じワクチンを２回目投与した。
その１週間後にマウスの鼻洗浄液と血清中のＨＡとＮＡに対する抗体応答を、それぞれ粘膜および全身の防御免疫の指標として測定した。
【００６１】
また、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）に代え、アジュバントとしてキチンの微粉末、キトサンの微粉末或いはホッキ貝の微粉末を用いて同様の検討を行った。
【００６２】
（結果）
それらの結果のうち、アジュバントしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を用いた場合の結果を表６に示した。
なお、他のアジュバント用物質についても同様の結果を示すものであった。
【００６３】
【表６】
【００６４】
表中の結果から判明するように、不活化全ウイルス粒子をＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）／β−グルカン／増粘剤をアジュバントとして用い、インフルエンザワクチンのワクチン成分として用いたときも、粘膜の防御免疫および全身の防御免疫が高められていた。
しかも、ワクチンと、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）／増粘剤をそれぞれ０．１μｇ／０．２μｇで用いたときであっても、ｓｐｉｌｉｔ−ｐｒｏｄｕｃｔ ｖａｃｃｉｎｅをＣＴＢ＊と併用して安全なウイルス感染阻止が予測されるアジュバント活性の陽性対照群と同等の応答を示した。
さらにこれらの応答は、ｓｐｉｌｉｔ−ｐｒｏｄｕｃｔ ｖａｃｃｉｎｅをＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と共に用いた場合よりも高かった。
以上の事実から、ｓｐｉｌｉｔ−ｐｒｏｄｕｃｔ ｖａｃｃｉｎｅのみならず、他の形態のワクチンを使用した場合でも、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）／β−グルカン／増粘剤の併用経鼻ワクチンの有用性が確認された。
【００６５】
実施例４：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の分子の大きさの確認
（材料）
ウイルス：Ａ／Ｎｅｗ ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルス
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）：
サイズ（Ｌ）：１〜３００ｂｐ（Ｆｌｕｋａ）
サイズ（Ｍ）：１００〜１０００ｂｐ（東レ）
サイズ（Ｈ）：＞３．３×１０６ｂｐ（Ｆｌｕｋａ）
Ｐｏｌｙ（Ａ：Ｕ）
β−グルカンとしてアガリクスの担子類の粉末
増粘剤：アルギン酸ナトリウム
マウス：ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌性）
【００６６】
（方法）
Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのｓｐｉｌｉｔ−ｐｒｏｄｕｃｔ ｖａｃｃｉｎｅ（０．４μｇ）を、種々の大きさのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の０．１μｇ、β−グルカン０．１μｇ及び増粘剤としてのアルギン酸ナトリウム０．２μｇをアジュバントとし、ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌性）に経鼻投与し、３週間後に同じワクチンを２回目投与した。
その１週間後にマウスの鼻洗浄液と血清中のＨＡとＮＡに対する抗体応答を、それぞれ粘膜および全身の防御免疫の指標として測定した。
【００６７】
（結果）
その結果を表７に示した。
【００６８】
【表７】
【００６９】
表中に示した結果から判明するように、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の分子の大きさが１０〜３００ｂｐを用いた実験群では、他の群よりも低い粘膜応答が認められた。したがって、アジュバントとして有用なＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の分子の大きさは、約３００ｂｐ以上と考えられた。
【００７０】
実施例５：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）以外の２本鎖ＲＮＡの作用
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の作用を、他の２本鎖ＲＮＡであるＰｏｌｙ（Ａ：Ｕ）および単鎖Ｐｏｌｙ（Ａ，Ｕ）と比較した。
（材料）
サブユニット：精製ＨＡ
アジュバント：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、Ｐｏｌｙ（Ａ：Ｕ）、Ｐｏｌｙ（Ａ，Ｕ）
（方法）
Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスから経鼻的抗ＨＡモノクローナル抗体結合カラムを用いてＨＡ分子を精製し、その１μｇをＰｏｌｙ（Ａ：Ｕ）（東レ）及びβ−グルカン１μｇ、増粘剤（アルギン酸ナトリウム）２μｇ、並びに単鎖のＰｏｌｙ（Ａ，Ｕ）（東レ）の１μｇ、β−グルカン１μｇ及び増粘剤（アルギン酸ナトリウム）２μｇをアジュバントとし、一緒にＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌性）に経鼻投与し、３週間後にＨＡのみ２回目を投与した。その１週間後にマウスの鼻洗浄液および血清中のＨＡに対する抗体応答をそれぞれ粘膜および全身の防御免疫の指標として測定した。
【００７１】
（結果）
その結果を表８に示した。
【００７２】
【表８】
【００７３】
表中に示した結果からも判明するように、二本鎖Ｐｏｌｙ（Ａ：Ｕ）および単鎖Ｐｏｌｙ（Ａ，Ｕ）にもアジュバント活性が認められた。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）のアジュバント活性と比べると、二本鎖Ｐｏｌｙ（Ａ：Ｕ）、単鎖Ｐｏｌｙ（Ａ，Ｕ）の順に小さかった。
したがって、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）以外の二本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＲＮＡにも経鼻インフルエンザワクチンと併用するとアジュバント活性が認められることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
以上説明したように、本発明が提供する粘膜投与型ワクチンは、ウイルス由来の不活化抗原、アジュバント及びβ−グルカン、さらに増粘剤を含有するワクチンであり、かかるワクチンを粘膜、例えば口腔粘膜又は鼻腔粘膜に投与することにより、口腔粘膜又は鼻腔粘膜上にワクチンと共にアジュバントが滞留的に止まって、免疫能を上げ、その結果、各種ウイルスに特異的な、粘膜組織における分泌型ＩｇＡ及び／又はＩｇＧ抗体の産生が誘導される。
したがって、本発明が提供するワクチンを投与することによりこのＩｇＡ及び／又はＩｇＧ抗体の産生が効果的に誘導され、ウイルスによる感染を防御するものである。
また、本発明が提供するワクチンは、粉末として簡便に粘膜上に投与しうるものであり、その有用性は多大なものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粘膜、特に呼吸器粘膜、例えば口腔粘膜又は鼻腔粘膜に滞留的に投与することにより、効果的に、ウイルスに特異的な分泌型ＩｇＡ及び／又はＩｇＧ抗体の産生を誘導させる粘膜投与型ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
最近各種ウイルスによる感染症が大きく問題視されてきている。そのなかでも、現在、世界的に問題となっているウイルスとして、Ｈ５Ｎ１型トリインフルエンザウイルスがある。
このＨ５Ｎ１型トリインフルエンザウイルス（Avian influenza, bird flu）は、Ａ型インフルエンザウイルスの一種であり、高病原性トリインフルエンザの原因となるウイルスである。もともと鳥から鳥へ感染するウイルスであって、中国や東南アジアでは鶏などの家禽類への大量感染が報告されている。
感染力がきわめて高く、鳥類だけでなくヒトにも感染するといわれており、現在においては、ヒトからヒトへは感染しないとされているが、ウイルスが変異して新型のインフルエンザウイルスになる可能性が高く、既に東南アジアでは、ヒトからヒトへの感染の疑いも高まっており、世界保険機構（ＷＨＯ）は、強い警告を発している。
【０００３】
今までのインフルエンザウイルスは、感染したとしても、呼吸器官の表層における炎症の発生だけであるが、このトリインフルエンザウイルスは血液を介して他の臓器にも炎症を引き起こし、重篤が極めて高い危険性のあるウイルスである。
我が国においても、既にいくつかの養鶏場におけるトリインフルエンザの大量感染がみられ、このウイルスから変異した新型（高病原性）インフルエンザウイルスに対する対策は急務の問題とされている。しかしながら、現在有効な治療用のワクチンは登場してきておらず、さしあたって、抗ウイルス薬であるタミフル等を使って治療するより方策がないが、かかる抗ウイルス薬が、ヒトへの感染性を有するかも知れない高病原性インフルエンザウイルスに対して有効であるか否かは、判明していない。
【０００４】
ところでワクチンは、例えば、未感染の個体におけるウイルスまたは病原菌からの感染を防御する手段に使用するものとして確立したものであり、その方法は、ウイルスまたは病原菌等の病原体由来の不活化抗原であるワクチンを接種し、個体に意図的に抗体を誘導させる方法である。
そのようなものとして、既にインフルエンザワクチン、コレラワクチン、チフスワクチン、種痘ワクチン、ＢＣＧワクチン等などが知られている。
【０００５】
そのなかでもインフルエンザ、重症急性呼吸器感染症候群（ＳＡＲＳ）等の呼吸器疾患は、呼吸器官からの感染によるものであり、この空気感染によるインフルエンザ等の呼吸器感染症の防御には、粘膜より分泌される特異的ＩｇＡ抗体が非常に有効であることが知られている。特に型の異なるウイルスに対する交叉防御は、粘膜で分泌されるＩｇＡ抗体が主に担っており、インフルエンザウイルスに自然罹患した後に回復したヒトには、このＩｇＡ抗体が誘導されており、同亜型の変異型ウイルスの流行に対しても、獲得免疫による感染防御ができているとされている。
【０００６】
したがって、ワクチンの投与により呼吸器粘膜での免疫応答の確立が求められているが、現在用いられているワクチンは皮下注射によるものであり、効果的な粘膜免疫応答が得られず、交叉防御能を有する、より効果的なワクチンの開発が求められているのが現状である。
【０００７】
すなわち、注射型ワクチンは、血中（全身）の免疫能（ＩｇＧ抗体の産生）を増強するものの、粘膜での免疫能（分泌型ＩｇＡ抗体の産生）は増強しない。したがって、注射型ワクチンによる血中免疫に期待できる効果は、感染後における症状の重症化の予防でしかなく、粘膜経由による感染自体を防御することは困難である。
そのうえ、インフルエンザウイルスのように、その年その年における様々な流行型がある場合には、ワクチンである病原体由来の不活性化抗原が、感染防御の対象とするインフルエンザの病原体と異なっている場合には、その効果は大きく低下することとなり、全く効果がない事態まで生じている。したがって、現実には、その年に流行するインフルエンザの流行型を見極めてワクチンを製造しているのが現状である。
【０００８】
これに対して、粘膜投与型ワクチンは、対象となる疾患の病原体のタイプをあまり厳密に区別しないのが特徴であり、ワクチンと疾患の流行型が異なっていても、免疫能を獲得できる効果がある。
しかしながら、気道の絨毛、腸管の粘膜層などの粘膜には、外界からの異物の侵入に対する防御機構が備わっており、注射型ワクチンと同じ成分をそのまま粘膜投与しても、十分な免疫獲得の刺激を与えることができない。そのため、本来のワクチン成分以外に、免疫獲得能を増強する物質、すなわちアジュバントと共に粘膜へ投与する粘膜投与型ワクチンの研究が盛んに行われてきている。
【０００９】
本発明者も、かかる観点に立脚した粘膜投与型ワクチンのいくつかを提案してきている（特許文献１〜３）。これまで提案してきている粘膜投与型ワクチンは、ウイルスの不活性抗原のワクチン効果をより完全なものとすることを目的として、ワクチンに対するアジュバント作用を有する物質を同時に効果的に鼻腔内粘膜上に投与するものであり、例えば、液状のワクチンをアジュバントと共に霧状に噴霧したり、或いは微粉末状にして噴霧したりするものであり、粘膜上におけるＩｇＡ抗体の誘導を確保したものであり、その点で特異的なものである。
【００１０】
しかしながら、ワクチン投与による免疫能をより確実に、且つ効果的に獲得するためには、ワクチンを、アジュバント作用を有する物質と共に、さらに免疫増強物質を投与すること、また、これらの物質を、例えば鼻腔内粘膜上に滞留的に投与することが必要である。本発明者が提案している粘膜投与型のワクチンはアジュバント作用物質自体に粘膜滞留性を求めたものであるが、さらに免疫増強物質を添加し、その上で意図的に粘膜滞留性を付与した成分を添加したアジュバント作用物質を用いた粘膜投与型ワクチンは、これまで登場していないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００５−０８２５８１号公報
【特許文献２】特開２００７−０７７０７３号公報
【特許文献３】特開２００８−２３１０３７号公報
【００１２】
本発明者は、かかる現状を鑑み種々検討を加え、ワクチンに対するアジュバント作用を有する物質として、アジュバント共に免疫増強物質を添加すること、さらに呼吸器粘膜、具体的には口腔粘膜又は鼻腔粘膜への滞留性を有する増粘剤を添加することにより、より効果的に粘膜上でのＩｇＡ抗体分泌と、血清中におけるＩｇＧ抗体応答が得られ、さらに致死量の各種ウイルスに対する感染防御効果が認められることを確認し、本発明を完成させるに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明は、粘膜、好ましくは呼吸器粘膜、例えば口腔粘膜又は鼻腔粘膜に滞留的に投与することにより、効果的に、ウイルスに特異的な分泌型ＩｇＡ及び／又はＩｇＧ抗体の産生を誘導させる粘膜投与型ワクチンを提供すること、更には、かかるアジュバント作用物資を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
かかる課題を解決するための本発明は、その基本的な一態様として、粘膜投与用のワクチンであって、
（ａ）病原体由来の不活性化抗原、
（ｂ）アジュバント、及び
（ｃ）β−グルカン等の多糖類、
を含むことを特徴とする粘膜投与型ワクチンである。
【００１５】
また、本発明は上記の粘膜投与型ワクチンにあって、さらに増粘剤を含むことを特徴とする粘膜投与型ワクチンである。
【００１６】
より具体的には、病原体が、水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス（コロナウイルスの一種）、ウエストナイルウイルス、ハンタウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌、コレラ菌、マラリア病原体及び眠り病病原体からなる群から選択されるものである粘膜投与型ワクチンであり、最も具体的には、病原体がインフルエンザウイルスである粘膜投与型ワクチンである。
【００１７】
さらに具体的には、本発明は、アジュバントが、ＴＬＲ（Toll-Like Receptor）のリガンドである二本鎖または一本鎖ＲＮＡである粘膜投与型ワクチンであり、より具体的には、二本鎖ＲＮＡが、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）であり、好ましくは、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の分子サイズが３００ｂｐ以上である粘膜投与型ワクチンである。
【００１８】
また本発明は、アジュバントがキチン、キトサン又はホッキ貝の微粉末である粘膜投与型ワクチンである。
【００１９】
さらにまた、本発明は、具体的には、増粘剤が、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、デンプンリン酸エステルナトリウム、メチルセルロース又はポリアクリル酸ナトリウムからなる群から選択されるものである粘膜投与型ワクチンである。
【００２０】
本発明の上記の粘膜投与型ワクチンは、最も具体的には、粘膜投与用として、特に呼吸器粘膜、より好ましくは口腔粘膜又は鼻腔粘膜に投与される粘膜投与型ワクチンである。
【００２１】
さらにまた本発明は別の態様として、上記の粘膜投与型ワクチンに使用するアジュバントを提供し、具体的には、アジュバント、β−グルカン等の多糖類、及び増粘剤からなることを特徴とする粘膜投与用ワクチンのためのアジュバントである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明が提供する粘膜投与型ワクチンは、ウイルス由来の不活化抗原、アジュバント及びβ−グルカン等の多糖類、さらに増粘剤を含有する、好ましくは微粉末状の形態にあるワクチンであり、かかるワクチンを粘膜、特に呼吸器粘膜、例えば口腔粘膜又は鼻腔粘膜に投与することにより、免疫力を高め、口腔粘膜又は鼻腔粘膜上に増粘剤の作用によりワクチンと共にアジュバントが滞留的に止まり、その結果、各種ウイルスに特異的な呼吸器粘膜組織における分泌型ＩｇＡ及び／又はＩｇＧ抗体の産生が誘導される。
【００２３】
分泌型ＩｇＡ及び／又はＩｇＧ抗体は、外分泌液中の主要な免疫グロブリンであり、粘膜表面の感染防御に役立っている病原菌特異的ＩｇＡ及び／又はＩｇＧ抗体であって、唾液、鼻汁、腸、気管などの分泌液中、あるいは初乳中に多くみられ、また血清中にも存在する。したがって、本発明が提供するワクチンを投与することによりこのＩｇＡ及び／又はＩｇＧ抗体の産生が効果的に誘導され、ウイルスによる感染を防御するものである。
そのうえ、アジュバントと共に投与されるβ−グルカン等の多糖類により、生体の免疫力をより効果的に高め、ウイルスによる感染を防御するものである。
また、本発明が提供するワクチンは、粉末として簡便に粘膜、特に口腔粘膜又は呼吸器粘膜上に投与し得るものであり、その有用性は多大なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明が提供する粘膜投与型ワクチンにおいて、ワクチンのアジュバントとして使用されるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）誘導体は、Ｔｏｌｌ様レセプター（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＬＲ）のリガンドである２本鎖ＲＮＡであり、自然免疫系を刺激するＴＬＲのリガンドとして、病原菌あるいはウイルス等の微生物の攻撃に対する防御免疫獲得能を発揮する。
事実、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含むＴＬＲのリガンドである２本鎖ＲＮＡが、アジュバントとしてワクチンと共に投与された場合には、そのワクチン能を増強させるのではなく、二本鎖ＲＮＡであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）自体が、種々の病原菌あるいはウイルス等の病原体の攻撃に対する防御免疫能を増強せしめ、特にウイルスまたは病原菌特異的ＩｇＡ抗体及びＩｇＧ抗体を誘導させることによって病原体による感染を防御する。
【００２５】
本発明で使用する二本鎖ＲＮＡであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、その分子の大きさとしては、その塩基対（ｂｐ）として低〜高サイズの種々のものを用いることが可能であるが、免疫応答に対してより優れた応答を発揮するものは、３００ｂｐ以上の分子サイズを有することが必要であることが判明した。そのような分子サイズを有するものとして、例えば、１００〜１０００ｂｐのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、東レ株式会社から容易に入手することができる。
【００２６】
アジュバントとしては上記したＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）誘導体に限定されるものではなく、アジュバント作用を有する物質であれば、広く本発明の粘膜投与型ワクチンとして使用することができることはいうまでもない。
そのようなアジュバント作用を有する物質として、例えば、キチン、キトサン又はホッキ貝の微粉末等を挙げることができる。
【００２７】
一方、本発明が提供する粘膜投与型ワクチンにより、アジュバントとしてのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）等と共に投与される不活性化抗原であるワクチンとしては、身体中に接種されて、活性な免疫を生成する、通常感染性因子または感染因子のある部分を含む抗原性懸濁液または溶液である。ワクチンを構成する抗原性部分は、一般的には微生物（例えば、ウイルスまたは細菌など）または微生物から精製された天然の産生物、合成生成物または遺伝子操作したタンパク質、ペプチド、多糖または同様な産生物であってもよい。
【００２８】
本発明においては、生ワクチン或いは不活化ワクチンとしては、具体的には、重症急性呼吸器感染症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス感染症の生ワクチン、インフルエンザの生ワクチン等をあげることができる。
しかしながら、これらに限定されるものではなく、病原体由来の不活性化抗原としてのワクチンを構成する病原体として、水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス（コロナウイルスの一種）、ウエストナイルウイルス、ハンタウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌、コレラ菌、マラリア病原体及び眠り病病原体等を挙げることができる。
【００２９】
また、本発明にいう不活化抗原とは、感染能を失わせた抗原をいい、完全ウイルス粒子であるビリオン、不完全ウイルス粒子、ビリオン構成粒子、その翻訳後修飾体、ビリオン非構成タンパク質、その翻訳後修飾体、感染防御抗原、中和反応のエピトープなどを挙げられることができる。不活化は、例えば、物理的（例えば、Ｘ線照射、熱、超音波）、化学的（ホルマリン、水銀、アルコール、塩素）などの操作により行うことができる。
【００３０】
本発明が提供する粘膜投与型ワクチンは、アジュバントであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）誘導体、または他のアジュバントにβ−グルカン等の多糖類を添加し、さらに増粘剤を添加し、投与されるワクチンと共に微粉末状の形態にしたものである。
【００３１】
本発明においてアジュバント共に添加されるβ−グルカンは、グルコースがβ１−３型の結合で連なった多糖であり、植物や菌類、細菌などの自然界に広く分布するものであり、強い免疫賦活作用をもつ物質である。本発明においては、β−グルカンとして、β−グルカンを多量に含むキノコの担子類を添加してもよい。
そのようなキノコ担子類としては、アガリクスや、ハナビラタケ、メシマコブ、マイタケ、カバノアナタケ、冬中夏草、霊芝或いは椎茸等を挙げることができるが、これらのものに限定されるものではない。
この場合のキノコ担子類は、乾燥品を微粉末状として用いるのが好ましい。
【００３２】
一方、本発明でアジュバントと共に使用する増粘剤としては、例えば、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、デンプンリン酸エステルナトリウム、メチルセルロース又はポリアクリル酸ナトリウム等をあげることができる。
増粘剤としては、上記のものに限定されるものではなく、粘膜上で増粘作用を発揮し、ワクチンをアジュバントと共に粘膜上に滞留させ得るものであれば、どのようなものでも使用することができる。
【００３３】
アジュバントとβ−グルカン等の多糖類、さらに増粘剤のワクチンに対する使用量は、一概に限定できないが、粘膜投与型ワクチンとして分泌型ＩｇＡ及び／又はＩｇＧ抗体の産生を確保する量のワクチン量に対し、粘膜上への噴霧が可能となり、粘膜上に滞留し得る量を用いればよい。
具体的には、本発明が提供する粘膜投与型ワクチンの投与量として、投与する対象者の年齢、体重、投与方法により一概に限定し得ないが、通常成人１日当たり、経鼻投与の場合には、０．１〜１０ｍｇ、好ましくは、０．１〜１ｍｇ程度であることより、これに対応したアジュバント、β−グルカン等の多糖類、さらに増粘剤の量を使用すればよい。
【００３４】
本発明の粘膜投与型ワクチンの投与は、微粉末を粘膜上に噴霧することにより行うことができる。脊椎動物における粘膜には、消化器、呼吸器、排出器、生殖器などの特に外通性の中腔器官の内壁が含まれる。したがって、本発明の投与形態である粘膜投与としては、例えば、鼻腔投与（経鼻投与）、口腔投与、膣内投与、上気道投与、肺胞投与などをあげることができる。そのなかでも口腔粘膜又は鼻腔内粘膜投与が好まし。口腔並びに鼻腔は特に、インフルエンザウイルスなどによる呼吸器感染症疾患の感染経路の門戸であることから、粘膜投与により分泌型ＩｇＡ反応を引き起こし、粘膜上皮細胞中に分泌型ＩｇＡ抗体を産生させることは、呼吸器感染症の防御に結びつくものである。
【００３５】
特に、鼻腔内投与（経鼻投与）に際しては、微粉末或いは懸濁液によるスプレー投与等の手段を、また口腔内投与に際しては、うがい薬、歯磨き粉、歯磨きペースト等による口腔粘膜への投与等の手段を採用することができる。特に歯磨き粉等による投与は、日常的に行う歯磨きによる投与であり、ウイルス感染症に対する防御として好ましく、特異的なものであるといえる。
【実施例】
【００３６】
以下に本発明を、具体的実施例により、さらに詳細に説明する。
実施例１：合成二本鎖ＲＮＡであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）のＩｇＡ、ＩｇＧ産生能
合成二本鎖ＲＮＡとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をアジュバントとして用い、β−グルカン、さらに増粘剤としてアルギン酸ナトリウムを用いて、また不活化抗原として不活化ウイルスまたはサブユニット抗原の中和抗体惹起能、ひいては抗病原体効果を確認した。
【００３７】
（材料）
マウス：ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌性）
ウイルス：インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１（Ａ／ＰＲ８）株（国立感染症研究所（東京）から入手した）。
ワクチン：インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１（Ａ／ＰＲ８）株Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ）株（国立感染症研究所）；Ｈ１Ｎ１（（Ａ／Ｙａｍａｇａｔａ）株（国立感染症研究所）；Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｇｕｉｚｏｕ）株（国立感染症研究所）；エーテル処理不活化ＨＡワクチン（財団法人 阪大微生物研究会、香川）
アジュバント：ポジティブコントロールとしてＣＴＢ＊［ＣＴＢ（コレラ毒素Ｂサブユニット）、０．１％ＣＴ（コレラ毒素）を含む］、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）
増粘剤：アルギン酸ナトリウム
β−グルカンとして、β−グルカン又はアガリクスの担子類
【００３８】
（方法）
６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本ＳＬＣ（株）、東京）各群５匹ずつ用いた。ＰＲ−８ＨＡワクチン（国立感染症研究所）１μｇを、それぞれのアジュバントとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、０．１μｇ、１μｇ、３μｇ、１０μｇ及びβ−グルカン並びに増粘剤としてアルギン酸ナトリウムの同量と共に微粉末化し、マウスの鼻に５μＬを接種し、その３週間後同量のワクチンを、アジュバントなし、もしくはアジュバント有りのものとして経鼻接種し、さらに２週間後に１００ｐｆｕのＰＲ８インフルエンザウイルスを片鼻に１．２μＬずつ接種し感染を行った。
コントロールとして、ＰＲ８ＨＡワクチンのみ、処置なしの群をおいた。
感染３日後に、鼻腔洗浄液、血清を回収し、鼻腔洗浄液中のＩｇＡおよび血清中のＩｇＧをＥＬＩＳＡ法により、また、鼻腔洗浄液中のウイルス価を、ＭＤＣＫ細胞を用いたプラークアッセイで測定した。
【００３９】
同様の方法で経鼻免疫したマウスに、４０ＬＤ５０の致死量（１０４．７ＥＩＯ５０（５０％の発育鶏卵において免疫性を示すウイルス量の約１００００倍量）のインフルエンザウイルスを２０μＬ感染させ、その生存を観察した。
【００４０】
また、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をアジュバントに用いた経鼻インフルエンザワクチンの交叉防御をみるために、亜型の違うインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１（Ａ／ＰＲ８）株Ｈ１Ｎ１（Ｂｅｉｊｉｎｇ）株、Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｙａｍａｇａｔａ）株、Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｇｕｉｚｏｕ）株のワクチンを、３μｇのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、同量のβーグルカン及び増粘剤（アルギン酸ナトリウム）をアジュバントとして用いて経鼻接種し、３週間後ワクチンのみを接種、さらに２週間後に１００ｐｆｕのＰＲ８インフルエンザウイルスを片鼻１．２μＬずつ接種し、感染を行った。感染３日後に鼻腔洗浄液、血清を回収し、鼻腔洗浄液中のＩｇＡおよび血清中のＩｇＧをＥＬＩＳＡ法により、また、鼻腔洗浄液中のウイルス価を、ＭＤＣＫ細胞を用いたプラークアッセイで測定した。
【００４１】
さらに、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の中枢神経系への安全性を調べるため、０．２５μｇ、２．５μｇ、２５μｇのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を２５μＬのＰＢＳに溶解し、二段針を用いて脳内接種を行った。接種後の体重の変化を測定し、また生存を観察した。
なお、対照群として２．５μｇ、１０μｇ、２５μｇのＣＴＢ＊（ＣＴＢ、０．１％ＣＴを含む）を同様に２５μＬのＰＢＳに溶解した溶液を脳内に接種した群をおいた。
【００４２】
（結果）
（１）Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をアジュバントに用い、β−グルカン、さらに増粘剤を用いた経鼻インフルエンザワクチンによる抗体誘導と感染防御について
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の粘膜アジュバント能を評価した。６週間前に１μｇのＰＲ８ワクチンを０．１μｇ〜１０μｇに量を振ったＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及び増粘剤と共に経鼻接種し、さらに２週間前に同量のワクチンを、ワクチンのみ、またはアジュバント／β−グルカン／増粘剤と共に経鼻接種した。経鼻粘膜でのＩｇＡ抗体応答と、血中ＩｇＧ応答を表１にまとめた。
【００４３】
【表１】
【００４４】
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の用量依存性のアジュバント効果をみるために、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の量は０．１μｇから１０μｇまで段階的に増やし、それと同量の増粘剤を添加したアジュバント作用をみた。
その結果、表１に示した結果からも判明するように、鼻腔粘膜にＩｇＡの応答のためには、最低で０．１μｇのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を初回免疫時に使用すると応答が認められることが判明した。
【００４５】
鼻腔粘膜に誘導されるＩｇＡの量は、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の量に依存的であり、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の量を増やせば増やすほどそのアジュバント効果が認められた。
２回の免疫ともに、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を用いると、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）１μｇの量で鼻腔洗浄液中に１００ｎｇ／ｍＬ以上のＩｇＡの分泌がみられ、初回のみの免疫の場合には３μｇのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）添加で、１００ｎｇ／ｍＬ以上の特異的ＩｇＡ抗体の誘導が認められた。
血清中のＩｇＧの産生も同時に検討したが、その産生は、ＩｇＡの分泌に相関するものであり、１μｇのＰＲ８ワクチンをＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と共に４週間間隔で２回免疫すると、１．４２μｇ／ｍＬの血中ＩｇＧが得られた。
【００４６】
また、同様の免疫条件で２回目の免疫の２週間後に１００ｐｆｕのＰＲ８ウイルスを、片鼻１．２μＬずつ感染を行った場合には、ワクチンを接種しないコントロール群では、鼻腔洗浄液中に１０２ｐｆｕ／ｍＬ以上のウイルス価に、ウイルス増殖が認められた。
これに対し、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）／β−グルカン／増粘剤を併用して経鼻ワクチン接種を２回行った群では、完全にウイルス増殖が抑制されており、また、ワクチン単独で１μｇ以上を２回免疫した群、ならびに３μｇ以上のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を初回免疫時のみ使用した群では、全くウイルス抑制効果は認められなかった。
【００４７】
また、１μｇ、０．１μｇのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及び同量の増粘剤を初回のみ併用接種した群においても、１００．７ｐｆｕ／ｍＬ、１０１．５ｐｆｕ／ｍＬと、顕著なウイルスの増殖抑制が認められた。なお、ワクチンのみの２回投与群では、ウイルスの増殖抑制は全く認められなかった。
これらの結果をまとめて表２に示した。
【００４８】
【表２】
【００４９】
なお、アジュバントとしてキチンの微粉末、キトサンの微粉末或いはホッキ貝の微粉末を用いて同様の検討を行った。
その結果、アジュバントとして先に検討したＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と同様に、これらのアジュバント作用物質にもＩｇＡ、ＩｇＧ産生能を高める効果があることが判明した。
【００５０】
（２）Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）／β−グルカン／増粘剤とワクチンの併用経鼻ワクチン接種による致死量のインフルエンザウイルス感染による肺炎の防御効果について
６週間前に１μｇのＰＲ８ワクチンと、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を１０μｇ、３μｇおよび１μｇ並びに同量のβ−グルカン及び増粘剤（アルギン酸ナトリウム）を併用してアジュバントとして用い、経鼻接種し、２週間前にワクチンのみで追加免疫し、４０ＬＤ５０のＰＲ８ウイルス２０μＬを感染させ、肺炎の防御能を調べた。
ワクチンを接種しない群では、マウスは１週間以内に前例（５／５）が死亡し、ウイルス感染３日後の肺のウイルス価も１０６ｐｆｕ以上であった。
これに対してワクチン接種群では、１μｇ以上のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）／β−グルカン／増粘剤と共に併用接種することで、全マウスは生存していた。この結果を表３に示す。
【００５１】
【表３】
【００５２】
以上の事実から、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）／β−グルカン／増粘剤のアジュバントを用いることにより、感染防御に十分な分泌型ＩｇＡ抗体を産生しており、粘膜ＩｇＡ抗体応答を引き出すことが判明した。
【００５３】
なお、同様の試験を、ウイルスとしてハンタウイルス［ハンタウイルス株（国立感染症研究所（東京）から入手）］を用い、ワクチンとしてエーテル不活性化ワクチン（国立感染症研究所から入手）を用い、アジュバントとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、β−グルカン、及び増粘剤としてアルギン酸ナトリウムを用いて行った。
その結果、同様に、感染防御に十分な分泌型ＩｇＡ抗体を産生しており、粘膜ＩｇＡ抗体応答を引き出すものであった。
【００５４】
さらに、アジュバントとしてキチンの微粉末、キトサンの微粉末或いはホッキ貝の微粉末を用いて同様の検討を行った。
その結果、アジュバントとして先に検討したＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と同様に、これらのアジュバント作用物質を用いた場合であっても、感染防御に十分な分泌型ＩｇＡ抗体を産生しており、粘膜ＩｇＡ抗体応答を引き出すものであった。
【００５５】
実施例２：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）併用経鼻ワクチンによる交叉防御
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）併用経鼻インフルエンザワクチンにより誘導されるインフルエンザ感染防御について、その交叉防御能について検討を行った。
ＰＲ８と亜型の違うインフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ）株、Ｈ１Ｎ１（Ｙａｍａｇａｔａ）株、Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｇｕｕｚｈｏｕ）株のワクチンを３μｇのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及び同量のβ−グルカン並びに増粘剤（アルギン酸ナトリウム）をアジュバントとして用い初回免疫し、４週後に同じ株のワクチンのみを接種し、さらに２週間後に１００ｐｆｕのＨ１Ｎ１（Ａ／ＰＲ８）株を１００ｐｆｕ感染させ、その３日後に鼻腔洗浄液中のＰＲ８と交叉反応するＩｇＡ、血清中のＩｇＧを測定し、またＰＲ８ウイルスの交叉防御について検討した。
それらの結果を表４および表５に示した。
【００５６】
【表４】
【００５７】
【表５】
注：二次は、ワクチンのみ。
＊：Ｐ＜０．００１
【００５８】
各表中の結果から判明するように、同じ亜型のＨ１Ｎ１（Ａ／ｂｅｉｊｉｎｇ）株、Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｙａｍａｇａｔａ）に対しては、ＩｇＡ、ＩｇＧ応答ともに認められ、ウイルス感染も完全に抑制していた。
亜型の異なるＨ３Ｎ２（Ａ／Ｇｕｕｚｈｏｕ）株に対しては、交叉反応するＩｇＡ、ＩｇＧが少量認められ、ウイルス感染の部分防御がみられた。
以上の事実から、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）／β−グルカン／増粘剤をアジュバントとして用いて併用経鼻インフルエンザワクチンにより、交叉防御が確認された。
【００５９】
実施例３：不活化ウイルス粒子をＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と併用する経鼻インフルエンザワクチンとして用いた時の予防効果
（材料）
ワクチン：エーテル処理ＨＡワクチン（阪大微研製）；ホルマリン不活化全ウイルス粒ワクチン（Inactivated whole particle vaccine）、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルス)（阪大微研製）
マウス：ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌性）
【００６０】
（方法）
Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのホルマリン不活化全ウイルス粒子ワクチン（Inactivated whole particle vaccine）０．１μｇを、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）［１００−１０００ｂｐ：東レ］０．１μｇ、β−グルカン０．１μｇ及び増粘剤（アルギン酸ナトリウム）０．２μｇをアジュバントとして用い、併用経鼻インフルエンザワクチンのワクチン成分としてマウス：ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌性）に投与し、３週間後に同じワクチンを２回目投与した。
その１週間後にマウスの鼻洗浄液と血清中のＨＡとＮＡに対する抗体応答を、それぞれ粘膜および全身の防御免疫の指標として測定した。
【００６１】
また、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）に代え、アジュバントとしてキチンの微粉末、キトサンの微粉末或いはホッキ貝の微粉末を用いて同様の検討を行った。
【００６２】
（結果）
それらの結果のうち、アジュバントしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を用いた場合の結果を表６に示した。
なお、他のアジュバント用物質についても同様の結果を示すものであった。
【００６３】
【表６】
【００６４】
表中の結果から判明するように、不活化全ウイルス粒子をＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）／β−グルカン／増粘剤をアジュバントとして用い、インフルエンザワクチンのワクチン成分として用いたときも、粘膜の防御免疫および全身の防御免疫が高められていた。
しかも、ワクチンと、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）／増粘剤をそれぞれ０．１μｇ／０．２μｇで用いたときであっても、ｓｐｉｌｉｔ−ｐｒｏｄｕｃｔ ｖａｃｃｉｎｅをＣＴＢ＊と併用して安全なウイルス感染阻止が予測されるアジュバント活性の陽性対照群と同等の応答を示した。
さらにこれらの応答は、ｓｐｉｌｉｔ−ｐｒｏｄｕｃｔ ｖａｃｃｉｎｅをＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と共に用いた場合よりも高かった。
以上の事実から、ｓｐｉｌｉｔ−ｐｒｏｄｕｃｔ ｖａｃｃｉｎｅのみならず、他の形態のワクチンを使用した場合でも、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）／β−グルカン／増粘剤の併用経鼻ワクチンの有用性が確認された。
【００６５】
実施例４：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の分子の大きさの確認
（材料）
ウイルス：Ａ／Ｎｅｗ ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルス
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）：
サイズ（Ｌ）：１〜３００ｂｐ（Ｆｌｕｋａ）
サイズ（Ｍ）：１００〜１０００ｂｐ（東レ）
サイズ（Ｈ）：＞３．３×１０６ｂｐ（Ｆｌｕｋａ）
Ｐｏｌｙ（Ａ：Ｕ）
β−グルカンとしてアガリクスの担子類の粉末
増粘剤：アルギン酸ナトリウム
マウス：ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌性）
【００６６】
（方法）
Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのｓｐｉｌｉｔ−ｐｒｏｄｕｃｔ ｖａｃｃｉｎｅ（０．４μｇ）を、種々の大きさのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の０．１μｇ、β−グルカン０．１μｇ及び増粘剤としてのアルギン酸ナトリウム０．２μｇをアジュバントとし、ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌性）に経鼻投与し、３週間後に同じワクチンを２回目投与した。
その１週間後にマウスの鼻洗浄液と血清中のＨＡとＮＡに対する抗体応答を、それぞれ粘膜および全身の防御免疫の指標として測定した。
【００６７】
（結果）
その結果を表７に示した。
【００６８】
【表７】
【００６９】
表中に示した結果から判明するように、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の分子の大きさが１０〜３００ｂｐを用いた実験群では、他の群よりも低い粘膜応答が認められた。したがって、アジュバントとして有用なＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の分子の大きさは、約３００ｂｐ以上と考えられた。
【００７０】
実施例５：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）以外の２本鎖ＲＮＡの作用
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の作用を、他の２本鎖ＲＮＡであるＰｏｌｙ（Ａ：Ｕ）および単鎖Ｐｏｌｙ（Ａ，Ｕ）と比較した。
（材料）
サブユニット：精製ＨＡ
アジュバント：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、Ｐｏｌｙ（Ａ：Ｕ）、Ｐｏｌｙ（Ａ，Ｕ）
（方法）
Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスから経鼻的抗ＨＡモノクローナル抗体結合カラムを用いてＨＡ分子を精製し、その１μｇをＰｏｌｙ（Ａ：Ｕ）（東レ）及びβ−グルカン１μｇ、増粘剤（アルギン酸ナトリウム）２μｇ、並びに単鎖のＰｏｌｙ（Ａ，Ｕ）（東レ）の１μｇ、β−グルカン１μｇ及び増粘剤（アルギン酸ナトリウム）２μｇをアジュバントとし、一緒にＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌性）に経鼻投与し、３週間後にＨＡのみ２回目を投与した。その１週間後にマウスの鼻洗浄液および血清中のＨＡに対する抗体応答をそれぞれ粘膜および全身の防御免疫の指標として測定した。
【００７１】
（結果）
その結果を表８に示した。
【００７２】
【表８】
【００７３】
表中に示した結果からも判明するように、二本鎖Ｐｏｌｙ（Ａ：Ｕ）および単鎖Ｐｏｌｙ（Ａ，Ｕ）にもアジュバント活性が認められた。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）のアジュバント活性と比べると、二本鎖Ｐｏｌｙ（Ａ：Ｕ）、単鎖Ｐｏｌｙ（Ａ，Ｕ）の順に小さかった。
したがって、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）以外の二本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＲＮＡにも経鼻インフルエンザワクチンと併用するとアジュバント活性が認められることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
以上説明したように、本発明が提供する粘膜投与型ワクチンは、ウイルス由来の不活化抗原、アジュバント及びβ−グルカン、さらに増粘剤を含有するワクチンであり、かかるワクチンを粘膜、例えば口腔粘膜又は鼻腔粘膜に投与することにより、口腔粘膜又は鼻腔粘膜上にワクチンと共にアジュバントが滞留的に止まって、免疫能を上げ、その結果、各種ウイルスに特異的な、粘膜組織における分泌型ＩｇＡ及び／又はＩｇＧ抗体の産生が誘導される。
したがって、本発明が提供するワクチンを投与することによりこのＩｇＡ及び／又はＩｇＧ抗体の産生が効果的に誘導され、ウイルスによる感染を防御するものである。
また、本発明が提供するワクチンは、粉末として簡便に粘膜上に投与しうるものであり、その有用性は多大なものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粘膜投与用のワクチンであって、
（ａ）病原体由来の不活性化抗原、
（ｂ）アジュバント、及び
（ｃ）β−グルカン等の多糖類、
を含むことを特徴とする粘膜投与型ワクチン。
【請求項２】
さらに増粘剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の粘膜投与型ワクチン。
【請求項３】
病原体が、水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス（コロナウイルスの一種）、ウエストナイルウイルス、ハンタウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌、コレラ菌、マラリア病原体及び眠り病病原体からなる群から選択されるものである請求項１又は２に記載の粘膜投与型ワクチン。
【請求項４】
病原体がインフルエンザウイルスである請求項１又は２に記載の粘膜投与型ワクチン。
【請求項５】
アジュバントが、ＴＬＲ（Toll-Like Receptor）のリガンドである二本鎖または一本鎖ＲＮＡである請求項１又は２に記載の粘膜投与型ワクチン。
【請求項６】
二本鎖ＲＮＡが、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）である請求項５に記載の粘膜投与型ワクチン。
【請求項７】
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の分子サイズが３００ｂｐ以上である請求項６に記載の粘膜投与型ワクチン。
【請求項８】
アジュバントが、キチン、キトサン又はホッキ貝の微粉末である請求項１に記載の粘膜投与型ワクチン。
【請求項９】
増粘剤が、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、デンプンリン酸エステルナトリウム、メチルセルロース又はポリアクリル酸ナトリウムからなる群から選択されるものである請求項２に記載の粘膜投与型ワクチン。
【請求項１０】
粘膜が呼吸器粘膜である請求項１〜９のいずれかに記載の粘膜投与型ワクチン。
【請求項１１】
呼吸器粘膜が、口腔粘膜、気管支粘膜又は鼻腔粘膜である請求項１０に記載の粘膜投与型ワクチン。
【請求項１２】
アジュバント、β−グルカン等の多糖類、及び増粘剤からなることを特徴とする粘膜投与用ワクチンのためのアジュバント。
【請求項１３】
アジュバントが、ＴＬＲ（Toll-Like Receptor）のリガンドである二本鎖または一本鎖ＲＮＡである請求項１２に記載のアジュバント。
【請求項１４】
二本鎖ＲＮＡが、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）である請求項１３に記載のアジュバント。
【請求項１５】
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の分子サイズが３００ｂｐ以上である請求項１４に記載のアジュバント。
【請求項１６】
アジュバントがキチン、キトサン又はホッキ貝の微粉末である請求項１２に記載のアジュバント。
【請求項１７】
増粘剤が、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、デンプンリン酸エステルナトリウム、メチルセルロース又はポリアクリル酸ナトリウムからなる群から選択されるものである請求項１２に記載のアジュバント。
【請求項１】
粘膜投与用のワクチンであって、
（ａ）病原体由来の不活性化抗原、
（ｂ）アジュバント、及び
（ｃ）β−グルカン等の多糖類、
を含むことを特徴とする粘膜投与型ワクチン。
【請求項２】
さらに増粘剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の粘膜投与型ワクチン。
【請求項３】
病原体が、水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス（コロナウイルスの一種）、ウエストナイルウイルス、ハンタウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌、コレラ菌、マラリア病原体及び眠り病病原体からなる群から選択されるものである請求項１又は２に記載の粘膜投与型ワクチン。
【請求項４】
病原体がインフルエンザウイルスである請求項１又は２に記載の粘膜投与型ワクチン。
【請求項５】
アジュバントが、ＴＬＲ（Toll-Like Receptor）のリガンドである二本鎖または一本鎖ＲＮＡである請求項１又は２に記載の粘膜投与型ワクチン。
【請求項６】
二本鎖ＲＮＡが、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）である請求項５に記載の粘膜投与型ワクチン。
【請求項７】
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の分子サイズが３００ｂｐ以上である請求項６に記載の粘膜投与型ワクチン。
【請求項８】
アジュバントが、キチン、キトサン又はホッキ貝の微粉末である請求項１に記載の粘膜投与型ワクチン。
【請求項９】
増粘剤が、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、デンプンリン酸エステルナトリウム、メチルセルロース又はポリアクリル酸ナトリウムからなる群から選択されるものである請求項２に記載の粘膜投与型ワクチン。
【請求項１０】
粘膜が呼吸器粘膜である請求項１〜９のいずれかに記載の粘膜投与型ワクチン。
【請求項１１】
呼吸器粘膜が、口腔粘膜、気管支粘膜又は鼻腔粘膜である請求項１０に記載の粘膜投与型ワクチン。
【請求項１２】
アジュバント、β−グルカン等の多糖類、及び増粘剤からなることを特徴とする粘膜投与用ワクチンのためのアジュバント。
【請求項１３】
アジュバントが、ＴＬＲ（Toll-Like Receptor）のリガンドである二本鎖または一本鎖ＲＮＡである請求項１２に記載のアジュバント。
【請求項１４】
二本鎖ＲＮＡが、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）である請求項１３に記載のアジュバント。
【請求項１５】
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の分子サイズが３００ｂｐ以上である請求項１４に記載のアジュバント。
【請求項１６】
アジュバントがキチン、キトサン又はホッキ貝の微粉末である請求項１２に記載のアジュバント。
【請求項１７】
増粘剤が、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、デンプンリン酸エステルナトリウム、メチルセルロース又はポリアクリル酸ナトリウムからなる群から選択されるものである請求項１２に記載のアジュバント。
【公開番号】特開２０１１−５７６０５（Ｐ２０１１−５７６０５Ａ）
【公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２０８３７９（Ｐ２００９−２０８３７９）
【出願日】平成２１年９月９日（２００９．９．９）
【出願人】（５０１３６９６１７）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月９日（２００９．９．９）
【出願人】（５０１３６９６１７）
【Ｆターム（参考）】
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