【課題】
受動免疫感作による粥状動脈硬化の治療または予防的処置のために使用される,アポリポ蛋白質Ｂの酸化フラグメントを指向する抗体またはその抗体フラグメントを提供する。
【解決手段】
アポリポ蛋白質Ｂの酸化フラグメントを指向する抗体またはその抗体フラグメントであって，該酸化フラグメントがＩＥＩＧＬＥＧＫＧＦＥＰＴＬＥＡＬＦＧＫであり，該抗体または抗体フラグメントが，特定配列の可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）及び特定配列の可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）を含む。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，アポリポ蛋白質Ｂの誘導体であるペプチドに対して産生される新規な単離されたヒト抗体，それらの製造方法，特に粥状動脈硬化の治療のための免疫療法のために使用される抗体，及び前記抗体を使用する受動免疫方法に関する。
【０００２】
本発明は特に次のものを含んでいる:表１に挙げたペプチドの酸化型，特にＭＤＡ修飾ペプチドに対する，任意の単離された抗体を，好ましくは適当な担体及び助剤と共に，虚血性心臓血管疾患の予防及び治療のための免疫療法または「抗粥状動脈硬化ワクチン」として使用すること。
【背景技術】
【０００３】
体液性免疫の保護効果は抗体と呼ばれる構造的に関連した糖蛋白質類によって媒介されることが知られている。抗体は抗原に結合することによりそれらの生物学的活動を始める。抗原に結合する抗体は，一般に一つの抗原に特異的であり，その結合は通常高い親和性を有する。抗体はＢリンパ球によって生産される。血液は，各々Ｂ細胞のクローンに由来し，各々別個の構造及び抗原に対する特異性を有する様々な抗体を含んでいる。抗体は，血漿中，組織の間質液中，並びに唾液及び粘膜表面の粘液のような分泌液中の，Ｂリンパ球の表面に存在する。
【０００４】
全ての抗体はそれらの全体的な構造において類似しており，このことは，電荷及び溶解性のような物理化学的性質における一定の類似性を説明する。全ての抗体は，各々約２４キロダルトンの二つの同一の軽鎖と各々約５５〜７０キロダルトンの二つの同一の重鎖の共通のコア構造を有する。一つの軽鎖は各重鎖に結合し，二つの重鎖は互いに結合する。軽鎖及び重鎖のいずれも，各々約１１０のアミノ酸残基の長さであり，独立して共通の球状のモチーフに折りたたまれている，一連の繰り返す相同な単位を含んでおり，その各々は免疫グロブリン（Ｉｇ）領域と呼ばれる。二つの重鎖の会合によって形成される抗体の領域は疎水性である。抗体，特にモノクローナル抗体は，それらが逆の物理化学的条件にさらされる場合に，軽鎖が重鎖に付いている部位で開裂することが知られている。抗体は多くのシステイン残基を含んでいるので，それらは多くのシステインシステインジスルフィド結合を有する。全てのＩｇ領域は，３あるいは４本の逆平行のポリペプチド鎖を有する二層のベータプリーツシートを含む。
【０００５】
それらの全体的な類似性にもかかわらず，抗体分子は，抗原に結合する際に，サイズ，電荷及び溶解性のような物理化学的な特徴及びそれらの抗原への結合における挙動に基づいた，少数の別個のクラス及びサブクラスに分類することができる。ヒトでは，抗体分子のクラスは次のとおりである：ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ及びＩｇＭ。各クラスのメンバーは同じアイソタイプのものであると言われている。ＩｇＡとＩｇＧのアイソタイプは，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２とＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３及びＩｇＧ４と呼ばれるサブタイプへさらに細分される。一つのアイソタイプ中の全ての抗体の重鎖は，アミノ酸配列が広範囲な領域で同一性を有するが，他のアイソタイプあるいはサブタイプに属する抗体とは異なる。重鎖は，抗体全てのアイソタイプに対応するギリシャ文字のアルファベットにより示される。例えば，ＩｇＡはα，ＩｇＤはδ，ＩｇＥはε，ＩｇＧはγ，ＩｇＭはμ重鎖を含んでいる。ＩｇＧ，ＩｇＥ及びＩｇＤはモノマーとして循環するが，ＩｇＡ及びＩｇＭの分泌型は，各々Ｊ鎖によって安定化されたダイマーまたはペンタマーである。いくつかのＩｇＡ分子はモノマーまたはトリマーとして存在する。
【０００６】
各個体に，各々抗原結合部位に独自のアミノ酸配列を有する構造上異なる１０^８〜１０^１０の抗体分子が存在する。抗体中の配列の多様性は，主に重鎖及び軽鎖の可変（Ｖ）領域と呼ばれるアミノ末端領域内の３つの短い領域に見出され，これはより保存された定常（Ｃ）領域と区別される。
【０００７】
粥状動脈硬化は大動脈及び中動脈の最も内側の層（内膜）の肥厚を引き起こす慢性病である。これは血液の流量を減少させて，影響を受けた血管によって供給される器官における乏血及び組織破壊を引き起こし得る。粥状動脈硬化は心筋梗塞，ストローク及び周辺の動脈疾病を含む心血管の疾病の主な原因である。それは西側世界の主な死因であり，２０年間の間に全世界の主要な死因になると予測されている。
【０００８】
この疾病は，血管の細胞間マトリックス中のリポ蛋白質，第一に低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）の蓄積によって始まる。これらのＬＤＬ粒子は凝集し，酸化的修飾を受ける。酸化ＬＤＬは有毒であり，血管の損傷を引き起こす。
【０００９】
粥状動脈硬化は，多くの点で，炎症と繊維症を含むこの傷に対する反応を表わす。
【００１０】
１９８９年には，パリンスキ(Palinski)とその同僚が，ヒトの酸化ＬＤＬに対する循環する自己抗体を同定した。この発見は，粥状動脈硬化が酸化したリポ蛋白質に対する免疫反応によって引き起こされた自己免疫病であることを提案した。この時に，いくつかの研究所は，酸化ＬＤＬに対する抗体価と心臓血管疾患との関連を探索し始めた。しかしながら，これらの研究から出た臨床像は全く明らかではなかった。酸化ＬＤＬには多くの異なるエピトープに対する抗体が存在したが，これらのエピトープの構造は未知であった。「酸化ＬＤＬ抗体」の用語は，このように一つの特異抗体にではなく異なる抗体の未知の混合物に関するものであった。Ｔ細胞独立のＩｇＭ抗体はＴ細胞依存のＩｇＧ抗体より頻繁にあった。
【００１１】
酸化ＬＤＬに対する抗体は，心臓血管疾患を有する患者及び健全な対照の両方に存在した。いくつかの初期の研究は酸化ＬＤＬ抗体価と心臓血管疾患の間の関連を報告したが，他のものはそのような関連を見つけることができなかった。これらの研究の主な弱点は，抗体価を測定するのに使用されるＥＬＩＳＡテストで配位子として酸化ＬＤＬ粒子を使用したことであった。ＬＤＬ組成物は異なる個体において異なり，酸化修飾の程度は制御するのも評価するのも困難であり，酸化ＬＤＬ粒子中の異なるエピトープに対する抗体のレベルを測定することはできない。ある程度までは技術的な問題により，これまでに利用可能な技術を使用して，酸化ＬＤＬに対する抗体反応の役割を評価することは困難であった。しかしながら，完全な酸化ＬＤＬ粒子を使用すると，よく定義され再生可能なワクチンのコンポーネントを作成することは不可能である。
【００１２】
血管壁内の酸化ＬＤＬに対する自己免疫反応が粥状動脈硬化の進行に重要な役割を果たす可能性を調査する別の方法は，それ自身の酸化ＬＤＬに対して動物を免疫感作することである。このアプローチを裏付ける思想は，古典的な免疫技術を使用して酸化ＬＤＬに対する自己免疫反応を強化すると，血管の炎症が増大し，粥状動脈硬化が進行するであろうと言うことにある。この仮説を試験するために，ウサギを同族の酸化ＬＤＬで免疫感作し，次に，３か月の間動物に高コレステロール食を与えて，粥状動脈硬化を引き起こした。
【００１３】
しかしながら，もともとの仮説とは対照的に，酸化ＬＤＬによる免疫感作は，約５０％粥状動脈硬化を縮小する保護効果を有していた。同様の結果は，高コレステロール食を血管バルーン損傷と組み合わせてより攻撃的なプラークの発達を生じさせる，続いての研究でも得られた。我々の研究と平行して，他のいくつかの研究所は同様の観察を報告した。利用可能なデータを合わせると，粥状動脈硬化の発達から保護する免疫反応が存在すること，及びこれらが酸化ＬＤＬに対する自己免疫を含んでいることが明白に実証される。
【００１４】
これらの観察は，さらにヒトにおける粥状動脈硬化をベースとする心臓血管疾患の治療のための免疫療法または「ワクチン」を開発する可能性を示唆する。これを行う一つのアプローチは，個体を，自分のＬＤＬを例えば銅に露呈することによって酸化した後に，これにより免疫感作することであろう。しかしながら，このアプローチは，酸化ＬＤＬの中で，どの構造が防御免疫を引き起こす原因であるか，そして酸化ＬＤＬがさらに逆の免疫反応を生じさせるエピトープを含んでいるかが知られていないという事実によって複雑になる。
【００１５】
酸化ＬＤＬ中のエピトープの同定はいくつかの点で重要である：
まず，これらのエピトープのうちの一つあるいはいくつかは，酸化ＬＤＬで免疫感作した動物中で観察される抗アテローム発生の免疫反応の活性化の原因であろう。従って，これらのエピトープを含んでいるペプチドは，ヒトにおいて免疫療法あるいは「粥状動脈硬化ワクチン」の開発の可能性を表すかもしれない。さらに，それらはヒトにおいて進行した粥状動脈硬化の治療的処置のために使用することができる。
【００１６】
第二に，同定されたエピトープを含むペプチドは，酸化ＬＤＬの特定の構造に対する抗体を検出することができるＥＬＩＳＡを開発するために使用することができる。そのようなＥＬＩＳＡは現在利用可能な抗原として酸化ＬＤＬ粒子を使用するものより正確でより信頼できるであろう。さらに，それは，心臓血管疾患に関連した，酸化ＬＤＬ中の異なるエピトープに対する免疫反応の分析を可能にするであろう。
【００１７】
米国特許第５，９７２，８９０号は，粥状動脈硬化を分析するためのペプチドの使用に関する。この米国特許に開示された技術は，原則として放射物理学的診断の形態である。ペプチド配列は放射標識され，血流中に注射される。このペプチド配列がアポリポ蛋白質Ｂ中に存在する配列と同一であった場合，アポリポ蛋白質Ｂについて存在するレセプターの存在する組織に結合するであろう。血管では，これは結局粥状動脈硬化のプラークとなる。その後，血管壁中の放射能の濃度を，例えばガンマカメラによって測定することができる。従って，この技術は，放射標識されたペプチド配列が，粥状動脈硬化のプラークの中にあるそれらの正常な組織レセプターに結合し，外部放射能分析を使用して検出されることに基づいた放射物理学的診断の方法である。それは粥状動脈硬化のプラークを識別する直接分析方法である。これは，患者に放射性化合物を与えられることを必要とする。
【００１８】
出版された研究(パリンスキ他（Palinski et al.）, 1995, 及び ジョージ他（George et al.）, 1998)は，酸化ＬＤＬに対する免疫感作が粥状動脈硬化の進行を縮小することを示した。これは，一般に酸化ＬＤＬに対する免疫反応が保護する効果があることを示すであろう。しかしながら，ここに示された結果は，驚くべきことに，これが必ずしもそうであるとは限らないことを示した。例えば，ペプチド＃１０，４５，１５４，１９９及び２４０の混合物を使用する免疫感作は，粥状動脈硬化の進行の増加を生じさせた。他のペプチド配列＃１，３０及び３４を使用する免疫感作は，粥状動脈硬化の進行に対して総合的効果を有しなかった。この結果は，酸化ＬＤＬの中のどの構造にそれらが向けられるかに依存して，それらが酸化ＬＤＬに対する免疫反応が粥状動脈硬化の進行に対して保護することができ，粥状動脈硬化の進行に寄与することができ，または全く効力がないという事実のための基礎を与えるので，驚くべきことである。これらの発見は，保護する免疫反応の活性化を分離する免疫感作方法を開発することを可能にする。さらに，それらは，完全な酸化ＬＤＬを使用する免疫感作が，使用される粒子がアテローム発生の免疫反応を生じさせる構造を高レベルで含んでいる場合，不利益な効果があるかもしれないことを示す。
【００１９】
本発明の技術は全く異なる原理及び方法に基づく。請求項１によると，本発明は，心臓血管疾患に対する免疫感作のために使用されるアポリポ蛋白質Ｂの酸化したフラグメントに対して産生される抗体に関する。
【００２０】
能動免疫感作の代わりとして，前記の識別されたペプチドを使用して，同じペプチドに向けられた，予め作られた抗体を用いる受動免疫感作は，魅力的な可能性である。そのような抗体は，例えば特異性及び交差反応性，アイソタイプ，親和性及び血しょう半減期に関する所望の性質を与えてもよい。予め定めた特性を備えた抗体を開発する可能性は，モノクローナル抗体技術(ミルステイン（Milstein）及びコーラー（Kohler）, 1975 ネイチャー（Nature）, 256: 495-7)の出現により既に明らかになっている。この技術は，同一のマウス抗体を大量に生産するマウスのハイブリドーマ細胞を使用した。実際，例えば癌の治療のために，マウスのモノクローナル抗体を使用して，多数の臨床前試験，及び臨床試験が始められた。しかしながら，抗体がヒトでない起源であったという事実により，患者の免疫系はそれらが外来のものであると認識し，それらに対する抗体を産生した。結果として，マウス抗体の有効性と血しょう半減期が減少し，また，しばしば外来の抗体によって引き起こされるアレルギー反応による副作用も治療の成功を妨げた。
【００２１】
これらの問題を解決するために，特定の有効な治療抗体のマウスの成分を減少するいくつかのアプローチがなされた。第一のアプローチは，該抗体のマウスの可変領域をヒト定常領域に移し，主としてヒトである抗体を得るいわゆるキメラ抗体を含むものであった(ニューバーガー他(Neuberger et al.) 1985, ネイチャー 314: 268-70)。このアプローチをさらに改良したものは，抗原と接触するマウス抗体の領域，いわゆる相補性決定領域（ＣＤＲ）が，ヒト抗体のフレームワークに移されたヒト化抗体を開発することであった。そのような抗体は，ほとんど完全にヒトであり，患者に投与された時に有害な抗体反応を起こすことはめったにない。いくつかのキメラまたはヒト化抗体が治療薬として登録され，種々の兆候に今日広く使用されている（ボレバエック（Borrebaeck）及びカールソン（Carlsson）, 2001, カレントオピニオン・イン・ファーマコロジー(Curr. Opin. Pharmacol.) 1: 404-408）。
【００２２】
今日，さらに完全にヒトである抗体も組換え技術を使用して生産され得る。典型的には，何十億もの異なる抗体を含む大ライブラリーが使用される。例えばマウスの抗体のキメラ化またはヒト化を使用する従来の技術とは対照的に，この技術は，動物を免疫感作して特定の抗体を生成させることに依存しない。その代わりに，リコンビナントライブラリーは，膨大な数の予め作られた抗体の変種を含む。これが，なぜライブラリーが任意の抗原に特異的な抗体をおそらく少なくとも一つ有するかの理由である。したがって，そのようなライブラリーの使用により，問題は，ライブラリーにおいて既存の特定のバインダーを見つけることになり，免疫感作によってそれを生成することではなくなる。効率的なやり方でライブラリ中で良好なバインダーを見つけるために，表現型，即ち抗体または抗原フラグメントをその遺伝子型，即ちコード遺伝子に結びつける様々なシステムが考案されてきた。最も一般的に使用されるそのようなシステムは，抗体フラグメントが，表示される分子をコードする遺伝情報を同時に有する線状ファージ粒子の表面上のファージコート蛋白質との融合として発現され，表示されるいわゆるファージディスプレーシステムである(マッカァファーティ他(McCafferty et al.), 1990, ネイチャー 348: 552-554)。特定の抗原に特異的な抗体フラグメントを表示するファージは，問題の抗原に結合することによって選択され得る。その後，単離されたファージは増幅され得る。また，選択された抗体の可変領域をコードする遺伝子は，所望により他の抗体フォーマットに，例えば完全長免疫グロブリンに自由に移入され，適当なベクター及び当該技術において公知の宿主細胞を使用して，大量に発現される。
【００２３】
ファージ粒子上に表示される抗体特異性のフォーマットは異なっていてもよい。最も一般的に使用されるフォーマットは，Ｆａｂ（グリフィス他(Griffiths et al.), 1994. EMBO J. 13 : 3245-3260)及び一本鎖（ｓｃＦｖ）（フーゲンブーム他(Hoogenboom et al.), 1992,日本分子生物学会(J Mol Biol.) 227: 381-388)であり，両方とも抗体の可変抗原結合領域を含む。一本鎖フォーマットは，柔軟なリンカー(米国特許第４，９４６，７７８号）によって可変軽鎖領域（ＶＬ）にリンクされた，可変重鎖領域（ＶＨ）から構成される。分析用試薬または治療薬としての使用する前に，表示された抗体特異性は，溶解性フォーマット，例えばＦａｂまたはｓｃＦｖに移され，そのまま分析される。後の工程で，望ましい形質を有することが確認された抗体フラグメントは，完全長抗体のようなさらに他のフォーマットに移入されてもよい。
【００２４】
最近，抗体ライブラリーの変種の生成の新規な技術が示された（国際特許公開第９８／３２８４５号，ソダーリンド他(Soderlind et al.), 2000, ネイチャーバイオテクノロジー (Nature BioTechnol.) 18: 852-856)。このライブラリーに由来した抗体フラグメントはすべて同じフレームワーク領域を持っており，それらのＣＤＲのみが異なる。フレームワーク領域が生殖細胞系列の配列であるので，このライブラリー，または同じ技術を使用して生産された同様のライブラリーに由来する抗体の免疫原性は特に低いことが予測される(ソダーリンド他, 2000, ネイチャーバイオテクノロジー 18: 852-856)。この特性が，患者が投与された治療用抗体に対して抗体を形成する危険を減少し，これによりアレルギー反応，阻止抗体の発生の危険を減少し，抗体の長い血しょう半減期を可能にする治療用抗体の高い価値を有することが期待される。リコンビナントライブラリーに由来したいくつかの抗体は現在臨床段階に達しており，近い将来に治療薬を提供すると予想される。
【００２５】
したがって，ヒトにおいて使用されるべき治療抗体を開発する試みに遭遇して，技術は，早期のハイブリドーマ技術を離れ，新しいリコンビナントライブラリー技術に向かっている(ソダーリンド他, 2001, Comb. Chem. & High Throughput Screen. 4: 409-416)。本発明の不可欠な部分である同定されたペプチド（国際特許出願ＰＣＴ／ＳＥ０２／００６７９号）を，前もって定めた特性を有する完全なヒト抗体の生成のための抗原として使用することが実現した。初期の技術（米国特許第６，２２５，０７０号）とは対照的に，この抗原の構造，即ち本発明において使用されるペプチドは，治療用の抗体のための標的配列として特に適することが確認された（国際特許出願ＰＣＴ／ＳＥ０２／００６７９号）。さらに，本発明においては，抗体はリポ蛋白質欠損マウスを免疫感作してマウス抗体を得る必要なく（米国特許第６，２２５，０７０号），抗体ライブラリーから得られる。さらに，生じる抗体は完全にヒトであり，患者に投与した時にいかなる望ましくない免疫反応を生成することもないと予想される。
【００２６】
使用した，既に同定されているペプチド（国際特許出願ＰＣＴ／ＳＥ０２／００６７９号）は下記のとおりである：
（表１）
Ａ．高いＩｇＧ，ＭＤＡの違い有り(MDA-difference)
Ｐ１１． ＦＬＤＴＶＹＧＮＣＳＴＨＦＴＶＫＴＲＫＧ
Ｐ２５． ＰＱＣＳＴＨＩＬＱＷＬＫＲＶＨＡＮＰＬＬ
Ｐ７４． ＶＩＳＩＰＲＬＱＡＥＡＲＳＥＩＬＡＨＷＳ
Ｂ．高いＩｇＭ，ＭＤＡの違い無し(no MDA-difference)
Ｐ４０． ＫＬＶＫＥＡＬＫＥＳＱＬＰＴＶＭＤＦＲＫ
Ｐ６８． ＬＫＦＶＴＱＡＥＧＡＫＱＴＥＡＴＭＴＦＫ
Ｐ９４． ＤＧＳＬＲＨＫＦＬＤＳＮＩＫＦＳＨＶＥＫ
Ｐ９９． ＫＧＴＹＧＬＳＣＱＲＤＰＮＴＧＲＬＮＧＥ
Ｐ１００． ＲＬＮＧＥＳＮＬＲＦＮＳＳＹＬＱＧＴＮＱ
Ｐ１０２． ＳＬＴＳＴＳＤＬＱＳＧＩＩＫＮＴＡＳＬＫ
Ｐ１０３． ＴＡＳＬＫＹＥＮＹＥＬＴＬＫＳＤＴＮＧＫ
Ｐ１０５． ＤＭＴＦＳＫＱＮＡＬＬＲＳＥＹＱＡＤＹＥ
Ｐ１７７． ＭＫＶＫＩＩＲＴＩＤＱＭＱＮＳＥＬＱＷＰ
Ｃ．高いＩｇＧ ＭＤＡの違い無し
Ｐ１４３． ＩＡＬＤＤＡＫＩＮＦＮＥＫＬＳＱＬＱＴＹ
Ｐ２１０． ＫＴＴＫＱＳＦＤＬＳＶＫＡＱＹＫＫＮＫＨ
Ｄ．ＮＨＳ／ＡＨＰ，ＩｇＧ−ａｋ＞２，ＭＤＡの違い有り
Ｐ１． ＥＥＥＭＬＥＮＶＳＬＶＣＰＫＤＡＴＲＦＫ
Ｐ１２９． ＧＳＴＳＨＨＬＶＳＲＫＳＩＳＡＡＬＥＨＫ
Ｐ１４８． ＩＥＮＩＤＦＮＫＳＧＳＳＴＡＳＷＩＱＮＶ
Ｐ１６２． ＩＲＥＶＴＱＲＬＮＧＥＩＱＡＬＥＬＰＱＫ
Ｐ２５２． ＥＶＤＶＬＴＫＹＳＱＰＥＤＳＬＩＰＦＦＥ
Ｅ．ＮＨＳ／ＡＨＰ，ＩｇＭ−ａｋ＞２，ＭＤＡの違い有り
Ｐ３０１． ＨＴＦＬＩＹＩＴＥＬＬＫＫＬＱＳＴＴＶＭ
Ｐ３０． ＬＬＤＩＡＮＹＬＭＥＱＩＱＤＤＣＴＧＤＥ
Ｐ３１． ＣＴＧＤＥＤＹＴＹＫＩＫＲＶＩＧＮＭＧＱ
Ｐ３２． ＧＮＭＧＱＴＭＥＱＬＴＰＥＬＫＳＳＩＬＫ
Ｐ３３． ＳＳＩＬＫＣＶＱＳＴＫＰＳＬＭＩＱＫＡＡ
Ｐ３４. ＩＱＫＡＡＩＱＡＬＲＫＭＥＰＫＤＫＤＱＥ
Ｐ１００． ＲＬＮＧＥＳＮＬＲＦＮＳＳＹＬＱＧＴＮＱ
Ｐ１０７． ＳＬＮＳＨＧＬＥＬＮＡＤＩＬＧＴＤＫＩＮ
Ｐ１４９． ＷＩＱＮＶＤＴＫＹＱＩＲＩＱＩＱＥＫＬＱ
Ｐ１６９． ＴＹＩＳＤＷＷＴＬＡＡＫＮＬＴＤＦＡＥＱ
Ｐ２３６． ＥＡＴＬＱＲＩＹＳＬＷＥＨＳＴＫＮＨＬＱ
Ｆ．ＮＨＳ／ＡＨＰ，ＩｇＧ−ａｋ＜０．５，ＭＤＡの違い無し
Ｐ１０． ＡＬＬＶＰＰＥＴＥＥＡＫＱＶＬＦＬＤＴＶ
Ｐ４５． ＩＥＩＧＬＥＧＫＧＦＥＰＴＬＥＡＬＦＧＫ
Ｐ１１１． ＳＧＡＳＭＫＬＴＴＮＧＲＦＲＥＨＮＡＫＦ
Ｐ１５４． ＮＬＩＧＤＦＥＶＡＥＫＩＮＡＦＲＡＫＶＨ
Ｐ１９９． ＧＨＳＶＬＴＡＫＧＭＡＬＦＧＥＧＫＡＥＦ
Ｐ２２２． ＦＫＳＳＶＩＴＬＮＴＮＡＥＬＦＮＱＳＤＩ
Ｐ２４０． ＦＰＤＬＧＱＥＶＡＬＮＡＮＴＫＮＱＫＩＲ
あるいはこれらのペプチドの一つ以上の活性部位。
【００２７】
前記の表１では，下記が予定されている：
（Ａ）ＭＤＡ修飾ペプチド（ｎ＝３）に対するＩｇＧ抗体を高レベルで生産するフラグメント
（Ｂ）ＩｇＭ抗体を高レベルで生産するが，天然型及びＭＤＡ修飾のペプチド（ｎ＝９）で違いがないフラグメント
（Ｃ）ＩｇＧ抗体を高レベルで生産するが，天然型及びＭＤＡ修飾のペプチド（ｎ＝２）で違いがないフラグメント
（Ｄ）ＭＤＡ修飾ペプチドに対するＩｇＧ抗体を高レベルで生産する，ＡＨＰプール（ｎ＝５）に比べてＮＨＰプールでの抗体が少なくとも２倍多いフラグメント
（Ｅ）ＭＤＡ修飾ペプチドに対するＩｇＭ抗体を高レベルで生産する，ＡＨＰプール（ｎ＝１１）に比べてＮＨＰプールでの抗体が少なくとも２倍多いフラグメント
（Ｆ）ＩｇＧ抗体を高レベルで生産するが，完全な及びＭＤＡ修飾のペプチドで違いがなく，ＮＨＰプール（ｎ＝７）に比べてＡＨＰプールでの抗体が少なくとも２倍多いフラグメント。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２８】
【特許文献１】米国特許第５，９７２，８９０号
【特許文献２】米国特許第４，９４６，７７８号
【特許文献３】米国特許第６，２２５，０７０号
【特許文献４】国際特許公開第９８／３２８４５号
【特許文献５】国際特許出願ＰＣＴ／ＳＥ０２／００６７９号
【非特許文献】
【００２９】
【非特許文献１】パリンスキ他（Palinski et al.）, 1995
【非特許文献２】ジョージ他（George et al.）, 1998
【非特許文献３】ミルステイン（Milstein）及びコーラー（Kohler）, 1975 ネイチャー（Nature）, 256: 495-7
【非特許文献４】ニューバーガー他(Neuberger et al.) 1985, ネイチャー 314: 268-70
【非特許文献５】ボレバエック（Borrebaeck）及びカールソン（Carlsson）, 2001, カレントオピニオン・イン・ファーマコロジー(Curr. Opin. Pharmacol.) 1: 404-408
【非特許文献６】マッァファーティ他(McCafferty et al.), 1990, ネイチャー 348: 552-554
【非特許文献７】グリフィス他(Griffiths et al.), 1994. EMBO J. 13 : 3245-3260
【非特許文献８】フーゲンブーム他(Hoogenboom et al.), 1992, 日本分子生物学会(J Mol Biol.)227: 381-388
【非特許文献９】ソダーリンド他(Soderlind et al.), 2000, ネイチャーバイオテクノロジー (Nature BioTechnol.) 18: 852-856
【非特許文献１０】ソダーリンド他, 2001, Comb. Chem. & High Throughput Screen. 4: 409-416
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明は，アポリポ蛋白質Ｂの酸化フラグメントを指向する抗体またはその抗体フラグメント，及び，アポリポ蛋白質Ｂの酸化フラグメントを指向する少なくとも一つの単離されたヒト抗体またはその抗体フラグメントの，受動免疫感作による粥状動脈硬化の治療または予防的処置のための医薬組成物の製造における使用，医薬に使用するための該抗体または抗体フラグメント，該抗体またはその抗体フラグメントの製造方法，該抗体またはその抗体フラグメントの遺伝子の増幅方法，並びに，該抗体またはその抗体フラグメントを含む受動免疫による粥状動脈硬化の治療または予防のための医薬組成物に関する。
【００３１】
さらに，本発明は，そのような抗体の組換え調製にも関し，また抗原として，酸化したアポリポ蛋白質Ｂフラグメント，特に前記に挙げたフラグメントを使用して産生される該抗体を用いる受動免疫感作方法に関する。
（１）本発明において，アポリポ蛋白質Ｂの少なくとも１個の酸化フラグメントを指向する少なくとも一つの単離されたヒト抗体またはその抗体フラグメントの，受動免疫感作による粥状動脈硬化の治療または予防的処置のための医薬組成物の製造における使用が提供される。
（２）本発明において，前記酸化フラグメントが，下記からなる群の１またはそれ以上から選択される使用が提供される：
ＦＬＤＴＶＹＧＮＣＳＴＨＦＴＶＫＴＲＫＧ
ＰＱＣＳＴＨＩＬＱＷＬＫＲＶＨＡＮＰＬＬ
ＶＩＳＩＰＲＬＱＡＥＡＲＳＥＩＬＡＨＷＳ
ＫＬＶＫＥＡＬＫＥＳＱＬＰＴＶＭＤＦＲＫ
ＬＫＦＶＴＱＡＥＧＡＫＱＴＥＡＴＭＴＦＫ
ＤＧＳＬＲＨＫＦＬＤＳＮＩＫＦＳＨＶＥＫ
ＫＧＴＹＧＬＳＣＱＲＤＰＮＴＧＲＬＮＧＥ
ＲＬＮＧＥＳＮＬＲＦＮＳＳＹＬＱＧＴＮＱ
ＳＬＴＳＴＳＤＬＱＳＧＩＩＫＮＴＡＳＬＫ
ＴＡＳＬＫＹＥＮＹＥＬＴＬＫＳＤＴＮＧＫ
ＤＭＴＦＳＫＱＮＡＬＬＲＳＥＹＱＡＤＹＥ
ＭＫＶＫＩＩＲＴＩＤＱＭＱＮＳＥＬＱＷＰ
ＩＡＬＤＤＡＫＩＮＦＮＥＫＬＳＱＬＱＴＹ
ＫＴＴＫＱＳＦＤＬＳＶＫＡＱＹＫＫＮＫＨ
ＥＥＥＭＬＥＮＶＳＬＶＣＰＫＤＡＴＲＦＫ
ＧＳＴＳＨＨＬＶＳＲＫＳＩＳＡＡＬＥＨＫ
ＩＥＮＩＤＦＮＫＳＧＳＳＴＡＳＷＩＱＮＶ
ＩＲＥＶＴＱＲＬＮＧＥＩＱＡＬＥＬＰＱＫ
ＥＶＤＶＬＴＫＹＳＱＰＥＤＳＬＩＰＦＦＥ
ＨＴＦＬＩＹＩＴＥＬＬＫＫＬＱＳＴＴＶＭ
ＬＬＤＩＡＮＹＬＭＥＱＩＱＤＤＣＴＧＤＥ
ＣＴＧＤＥＤＹＴＹＫＩＫＲＶＩＧＮＭＧＱ
ＧＮＭＧＱＴＭＥＱＬＴＰＥＬＫＳＳＩＬＫ
ＳＳＩＬＫＣＶＱＳＴＫＰＳＬＭＩＱＫＡＡ
ＩＱＫＡＡＩＱＡＬＲＫＭＥＰＫＤＫＤＱＥ
ＲＬＮＧＥＳＮＬＲＦＮＳＳＹＬＱＧＴＮＱ
ＳＬＮＳＨＧＬＥＬＮＡＤＩＬＧＴＤＫＩＮ
ＷＩＱＮＶＤＴＫＹＱＩＲＩＱＩＱＥＫＬＱ
ＴＹＩＳＤＷＷＴＬＡＡＫＮＬＴＤＦＡＥＱ
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ＡＬＬＶＰＰＥＴＥＥＡＫＱＶＬＦＬＤＴＶ
ＩＥＩＧＬＥＧＫＧＦＥＰＴＬＥＡＬＦＧＫ
ＳＧＡＳＭＫＬＴＴＮＧＲＦＲＥＨＮＡＫＦ
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ＧＨＳＶＬＴＡＫＧＭＡＬＦＧＥＧＫＡＥＦ
ＦＫＳＳＶＩＴＬＮＴＮＡＥＬＦＮＱＳＤＩ
ＦＰＤＬＧＱＥＶＡＬＮＡＮＴＫＮＱＫＩＲ
またはそれらの活性部位。
（３）本発明において，前記フラグメントが，マロンデアルデヒド（malone dealdehyde）を用いて酸化されている（１）または（２）に記載の使用が提供される。
（４）本発明において，前記フラグメントが，銅を用いて酸化されている（１）または（２）に記載の使用が提供される。
（５）本発明において，前記抗体が，下記からなる核酸配列の群から選択される可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）を含む（１）〜（４）のいずれかに記載の使用が提供される：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAATAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGA
AGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCAGACTCAGT
GAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGC
CTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTCAGTAGGTACTACTACGGACCAT
CTTTCTACTTTGACTCCTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCAGC （配列番号１）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGTGCGGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCCGGGA
AGGGGCTGGAGTGGGTATCGGGTGTTAGTTGGAATGGCAGTAGGACGCACTATGCAGACTCTG
TGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAG
CCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCGGCTAGGTACTCCTACTACTAC
TACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCAGC （配列番号３）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGA
AGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATCAGTGGTAGTGGTCGTAGGACATACTACGCAGACTCCGT
GCAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGC
CTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGATTGGTCTCCTATGGTTCGGGGAGTT
TCGGTTTTGACTACTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCAGC（配列番号５）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGTTCCAGGGA
AGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTCTTGGTGGTAGTGGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC
CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC
AGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAAGTTAGGGGGGCGATCCCGATAT
GGGCGGTGGCCCCGCCAATTTGACTACTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCAGC（配列番号７）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGA
AGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATCAGTGGCCGTGGGGGTAGTTCCTACTACGCAGACTCCG
TGAGGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAG
CCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTTTCCTACAGCTATGGTTACGAG
GGGGCCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCAGC（配列番号９）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGA
AGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTGGTCGTTTCATTTACTACGCAGACTCAATG
AAGGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCT
GAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTACGAGGCTCCGGAGAGGGAGCTACTTCTGGGC
TTTTGATATCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCAGC（配列番号１１）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGAACGTATTGGATGACCTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCTATTAGCAGTAGCAGTAATTACATATTCTAC
GCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTCAGA
CGGAGCAGCTGGTACGGGGGGTACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACC
GTGAGCTCA（配列番号１９）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT
CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCAACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCC
AGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCA
GACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC
AAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTAGGCCGGTA
TAACTGGAAGACGGGGCATGCTTTTGATATCTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGC
TCA（配列番号２１）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCCGTGACTACTACGTGAGCTGGATCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTAGTGGTAGTGGGGGTAGGACATACTAC
GCAGACTCCGTGGAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCATGTATTACTGTGCCAGAGTATCC
GCCCTTCGGAGACCCATGACTACAGTAACTACTTACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAAGGT
ACACTGGTCACCGTGAGCTCA（配列番号２３）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCCGCTATTAGTGGTAGTGGTAACACATACTATGCA
GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTG
CAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCCTCCCAC
CGTATATTAGGTTATGCTTTTGATATCTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA（配列番号２５）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTAGTGTTGGTGGACATAGGACATATTAT
GCAGATTCCGTGAAGGGCCGGTCCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCACGGATACGG
GTGGGTCCGTCCGGCGGGGCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGC
TCA（配列番号２７）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTAC
GCAGACTCAGTGAAGGGCCGATCCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGGCTCACA
AATATTTTGACTGGTTATTATACCTCAGGATATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGTACA
CTGGTCACCGTGAGCTCA（配列番号２９）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTCTTGGATGAGTTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTAC
GCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTAGGG
AACTACGGTTTCTACCACTACATGGACGTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGC
TCA（配列番号３１）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTAC
GCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATTAAA
CGGTTACGATTCGGCTGGACCCCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTG
AGCTCA（配列番号３３）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTAC
GCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTCAAT
AGCAAAAAGTGGTATGAGGGCTACTTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACC
GTGAGCTCA（配列番号３５）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTACTAGTAGTAATTACATATACTAC
GCAGACTCAGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTCAAG
AAGTATAGCAGTGGCTGGTACTCGAATTATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGTACACTG
GTCACCGTGAGCTCA（配列番号３７）。
（６）本発明において，前記抗体が，下記からなる核酸配列の群から選択される可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）を含む(１)〜（４）のいずれかに記載の使用が提供される：
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCCT
GCTCTGGAAGCAGGTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAAC
GGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAACAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTG
GCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTG
ATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTCATTGGGTGTTCGGCGGAGGAACCAA
GCTGACGGTCCTAGGT（配列番号２）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCCT
GTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGGAAATAATGCTGTAAACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAAC
GGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGGAATGATCGGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCT
GGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCT
GATTATTACTGTCAGACCTGGGGCACTGGCCGGGGGGTATTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACG
GTCCTAGGT（配列番号４）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTT
GTTCTGGAAGCAGCTCCAATATCGGAAGTAATTATGTATCCTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACG
GCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACTACAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGG
CTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGAT
TATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTTGGGTGTTCGGCGGAGGAACCAAGCTG
ACGGTCCTAGGT（配列番号６）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCCT
GCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGAAATAACTATGTATCCTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAAC
GGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGTAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTG
GCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTG
ATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTCATTGGCTGTTCGGCGGAGGAACCAAGCT
GACGGTCCTAGGT（配列番号８）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCCT
GCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAAC
GGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGGAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCT
GGCTCCAAGTCTGGCACCTTAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCT
GATTATTACTGTGCAACCTGGGATGACAGCCTGAATGGTTGGGTGTTCGGCGGAGGAACCAAGC
TGACGGTCCTAGGT（配列番号１０）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCCT
GTTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGCGGTGAGTCTGTATCCTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAAC
GGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGTAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTG
GCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTG
ATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTTGGGTGTTCGGCGGAGGAACCAAGCT
GACGGTCCTAGGT（配列番号１２）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGGAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTCATTGG
GTGTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号２０）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCT
CCTGCTCTGGAAGGACCTACAACATTGGAAATAATTATGTATCGTGGTATCAGCAGCTCCC
AGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGAC
CGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCG
AGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGTCAGGCTGAATGGTTGGGTGTTCGG
CGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号２２）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCCTGCTCTGGAAGGAGCTCCAACATTGGGAATAGTTATGTCTCCTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGGAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGGATGGGATGACACCCTGCGTGCTTGGGTG
TTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号２４）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCTTGTTCTGGAAGCCGCTCCAACATCGGGAGAAATGCTGTTAGTTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGCTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGGCAGCCTGAATGGTTGGGTG
TTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCC（配列番号２６）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCAT
CTCCTGCTCTGGAAGCAACACCAACATTGGGAAGAACTATGTATCTTGGTATCAGCAGC
TCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGCTAATAGCAATCGGCCCTCAGGGGTC
CCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCT
CCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCGTCATGGGATGCCAGCCTGAATGGTT
GGGTATTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号２８）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCCTGCTCTGGAAGCACCTCCAACATTGGGAAGAATTATGTATCCTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGCCAGCCTCAGTGGTTGGGTG
TTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号３０）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCTTGTTCTGGAGGCAGCTCAAACATCGGAAAAAGAGGTGTAAATTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGAAATCGGCCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCTACATGGGATTACAGCCTCAATGCTTGGGTG
TTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号３２）
CAGTCTGTTCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCCTGTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGGAAATAATGGTGTAAACTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAACAATCGGCCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGCGTGGTTGGCTG
TTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号３４）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGTCTGAGTGGTTGGGTG
TTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号３６）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAGCATTGGGAATAATTTTGTATCCTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGACAATAATAAGCGACCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTTGGGTG
TTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号３８）。
（７）本発明において，前記抗体が，下記からなる核酸配列の群から選択される
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAATAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGA
AGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCAGACTCAGT
GAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGC
CTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTCAGTAGGTACTACTACGGACCAT
CTTTCTACTTTGACTCCTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCAGC （配列番号１）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGTGCGGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCCGGGA
AGGGGCTGGAGTGGGTATCGGGTGTTAGTTGGAATGGCAGTAGGACGCACTATGCAGACTCTG
TGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAG
CCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCGGCTAGGTACTCCTACTACTAC
TACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCAGC（配列番号３）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGA
AGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATCAGTGGTAGTGGTCGTAGGACATACTACGCAGACTCCGT
GCAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGC
CTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGATTGGTCTCCTATGGTTCGGGGAGTT
TCGGTTTTGACTACTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCAGC（配列番号５）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGTTCCAGGGA
AGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTCTTGGTGGTAGTGGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC
CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC
AGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAAGTTAGGGGGGCGATCCCGATAT
GGGCGGTGGCCCCGCCAATTTGACTACTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCAGC（配列番号７）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGA
AGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATCAGTGGCCGTGGGGGTAGTTCCTACTACGCAGACTCCG
TGAGGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAG
CCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTTTCCTACAGCTATGGTTACGAG
GGGGCCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCAGC（配列番号９）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGA
AGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTGGTCGTTTCATTTACTACGCAGACTCAATG
AAGGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCT
GAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTACGAGGCTCCGGAGAGGGAGCTACTTCTGGGC
TTTTGATATCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCAGC（配列番号１１）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGAACGTATTGGATGACCTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCTATTAGCAGTAGCAGTAATTACATATTCTAC
GCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTCAGA
CGGAGCAGCTGGTACGGGGGGTACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACC
GTGAGCTCA（配列番号１９）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT
CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCAACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCC
AGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCA
GACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC
AAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTAGGCCGGTA
TAACTGGAAGACGGGGCATGCTTTTGATATCTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGC
TCA（配列番号２１）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCCGTGACTACTACGTGAGCTGGATCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTAGTGGTAGTGGGGGTAGGACATACTAC
GCAGACTCCGTGGAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCATGTATTACTGTGCCAGAGTATCC
GCCCTTCGGAGACCCATGACTACAGTAACTACTTACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAAGGT
ACACTGGTCACCGTGAGCTCA（配列番号２３）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCCGCTATTAGTGGTAGTGGTAACACATACTATGCA
GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTG
CAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCCTCCCAC
CGTATATTAGGTTATGCTTTTGATATCTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA（配列番号２５）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTAGTGTTGGTGGACATAGGACATATTAT
GCAGATTCCGTGAAGGGCCGGTCCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCACGGATACGG
GTGGGTCCGTCCGGCGGGGCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGC
TCA（配列番号２７）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTAC
GCAGACTCAGTGAAGGGCCGATCCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGGCTCACA
AATATTTTGACTGGTTATTATACCTCAGGATATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGTACA
CTGGTCACCGTGAGCTCA（配列番号２９）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTCTTGGATGAGTTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTAC
GCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTAGGG
AACTACGGTTTCTACCACTACATGGACGTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGC
TCA（配列番号３１）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTAC
GCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATTAAA
CGGTTACGATTCGGCTGGACCCCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTG
AGCTCA（配列番号３３）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTAC
GCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTCAAT
AGCAAAAAGTGGTATGAGGGCTACTTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACC
GTGAGCTCA（配列番号３５）
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTACTAGTAGTAATTACATATACTAC
GCAGACTCAGTGAAGGGCC GGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTCAAG
AAGTATAGCAGTGGCTGGTACTCGAATTATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGTACACTG
GTCACCGTGAGCTCA（配列番号３７）
を下記からなる核酸配列の群から選択される少なくとも一つの可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCCT
GCTCTGGAAGCAGGTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAAC
GGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAACAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTG
GCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTG
ATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTCATTGGGTGTTCGGCGGAGGAACCAA
GCTGACGGTCCTAGGT（配列番号２）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCCT
GTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGGAAATAATGCTGTAAACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAAC
GGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGGAATGATCGGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCT
GGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCT
GATTATTACTGTCAGACCTGGGGCACTGGCCGGGGGGTATTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACG
GTCCTAGGT（配列番号４）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTT
GTTCTGGAAGCAGCTCCAATATCGGAAGTAATTATGTATCCTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACG
GCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACTACAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGG
CTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGAT
TATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTTGGGTGTTCGGCGGAGGAACCAAGCTG
ACGGTCCTAGGT（配列番号６）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCCT
GCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGAAATAACTATGTATCCTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAAC
GGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGTAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTG
GCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTG
ATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTCATTGGCTGTTCGGCGGAGGAACCAAGCT
GACGGTCCTAGGT（配列番号８）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCCT
GCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAAC
GGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGGAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCT
GGCTCCAAGTCTGGCACCTTAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCT
GATTATTACTGTGCAACCTGGGATGACAGCCTGAATGGTTGGGTGTTCGGCGGAGGAACCAAGC
TGACGGTCCTAGGT（配列番号１０）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCCT
GTTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGCGGTGAGTCTGTATCCTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAAC
GGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGTAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTG
GCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTG
ATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTTGGGTGTTCGGCGGAGGAACCAAGCT
GACGGTCCTAGGT（配列番号１２）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGGAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTCATTGG
GTGTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号２０）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCT
CCTGCTCTGGAAGGACCTACAACATTGGAAATAATTATGTATCGTGGTATCAGCAGCTCCC
AGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGAC
CGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCG
AGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGTCAGGCTGAATGGTTGGGTGTTCGG
CGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号２２）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCCTGCTCTGGAAGGAGCTCCAACATTGGGAATAGTTATGTCTCCTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGGAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGGATGGGATGACACCCTGCGTGCTTGGGTG
TTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号２４）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCTTGTTCTGGAAGCCGCTCCAACATCGGGAGAAATGCTGTTAGTTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGCTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGGCAGCCTGAATGGTTGGGTG
TTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCC（配列番号２６）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCAT
CTCCTGCTCTGGAAGCAACACCAACATTGGGAAGAACTATGTATCTTGGTATCAGCAGC
TCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGCTAATAGCAATCGGCCCTCAGGGGTC
CCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCT
CCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCGTCATGGGATGCCAGCCTGAATGGTT
GGGTATTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号２８）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCCTGCTCTGGAAGCACCTCCAACATTGGGAAGAATTATGTATCCTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGCCAGCCTCAGTGGTTGGGTG
TTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号３０）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCTTGTTCTGGAGGCAGCTCAAACATCGGAAAAAGAGGTGTAAATTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGAAATCGGCCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCTACATGGGATTACAGCCTCAATGCTTGGGTG
TTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号３２）
CAGTCTGTTCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCCTGTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGGAAATAATGGTGTAAACTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAACAATCGGCCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGCGTGGTTGGCTG
TTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号３４）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGTCTGAGTGGTTGGGTG
TTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号３６）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAGCATTGGGAATAATTTTGTATCCTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGACAATAATAAGCGACCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTTGGGTG
TTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号３８）
との組み合わせで含むことを特徴とする（１）〜（６）のいずれかに記載の使用が提供される。
（８）本発明において，前記抗体が，
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAATAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGA
AGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCAGACTCAGT
GAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGC
CTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTCAGTAGGTACTACTACGGACCAT
CTTTCTACTTTGACTCCTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCAGC （配列番号１）及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）：
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCCT
GCTCTGGAAGCAGGTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAAC
GGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAACAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTG
GCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTG
ATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTCATTGGGTGTTCGGCGGAGGAACCAA
GCTGACGGTCCTAGGT（配列番号２）
を含むことを特徴とする（７）に記載の使用が提供される。
（９）本発明において，前記抗体が，
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGTGCGGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCCGGGA
AGGGGCTGGAGTGGGTATCGGGTGTTAGTTGGAATGGCAGTAGGACGCACTATGCAGACTCTG
TGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAG
CCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCGGCTAGGTACTCCTACTACTAC
TACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCAGC（配列番号３）及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）：
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCCT
GTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGGAAATAATGCTGTAAACTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAAC
GGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGGAATGATCGGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCT
GGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCT
GATTATTACTGTCAGACCTGGGGCACTGGCCGGGGGGTATTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACG
GTCCTAGGT（配列番号４）
を含むことを特徴とする（７）に記載の使用が提供される。
（１０）本発明において，前記抗体が，
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGA
AGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATCAGTGGTAGTGGTCGTAGGACATACTACGCAGACTCCGT
GCAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGC
CTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGATTGGTCTCCTATGGTTCGGGGAGTT
TCGGTTTTGACTACTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCAGC（配列番号５）及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）：
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTT
GTTCTGGAAGCAGCTCCAATATCGGAAGTAATTATGTATCCTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAACG
GCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACTACAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGG
CTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGAT
TATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTTGGGTGTTCGGCGGAGGAACCAAGCTG
ACGGTCCTAGGT（配列番号６）
を含むことを特徴とする（７）に記載の使用が提供される。
（１１）本発明において，前記抗体が，
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGTTCCAGGGA
AGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACTCTTGGTGGTAGTGGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTC
CGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC
AGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAAGTTAGGGGGGCGATCCCGATAT
GGGCGGTGGCCCCGCCAATTTGACTACTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCAGC（配列番号７）及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）：
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCCT
GCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGAAATAACTATGTATCCTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAAC
GGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGTAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTG
GCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTG
ATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTCATTGGCTGTTCGGCGGAGGAACCAAGCT
GACGGTCCTAGGT（配列番号８）
を含むことを特徴とする（７）に記載の使用が提供される。
（１２）本発明において，前記抗体が，
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGACTACTACATGAGCTGGATCCGCCAGGCTCCAGGGA
AGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATCAGTGGCCGTGGGGGTAGTTCCTACTACGCAGACTCCG
TGAGGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAG
CCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTTTCCTACAGCTATGGTTACGAG
GGGGCCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCAGC（配列番号９）及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）：
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCCT
GCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAAC
GGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGGAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCT
GGCTCCAAGTCTGGCACCTTAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCT
GATTATTACTGTGCAACCTGGGATGACAGCCTGAATGGTTGGGTGTTCGGCGGAGGAACCAAGC
TGACGGTCCTAGGT（配列番号１０）
を含むことを特徴とする（７）に記載の使用が提供される。
（１３）本発明において，前記抗体が，
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGA
AGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTGGTCGTTTCATTTACTACGCAGACTCAATG
AAGGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCT
GAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTACGAGGCTCCGGAGAGGGAGCTACTTCTGGGC
TTTTGATATCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGCAGC（配列番号１１）及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）：
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCCT
GTTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGCGGTGAGTCTGTATCCTGGTATCAGCAGCTCCCAGGAAC
GGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGTAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTG
GCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTG
ATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTTGGGTGTTCGGCGGAGGAACCAAGCT
GACGGTCCTAGGT（配列番号１２）
を含むことを特徴とする（７）に記載の使用が提供される。
（１４）本発明において，前記抗体が，
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGAACGTATTGGATGACCTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCTATTAGCAGTAGCAGTAATTACATATTCTAC
GCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTCAGA
CGGAGCAGCTGGTACGGGGGGTACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACC
GTGAGCTCA（配列番号１９）及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）：
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGGAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTCATTGG
GTGTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号２０）
を含むことを特徴とする（７）に記載の使用が提供される。
（１５）本発明において，前記抗体が，
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT
CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCAACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCC
AGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCA
GACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC
AAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTAGGCCGGTA
TAACTGGAAGACGGGGCATGCTTTTGATATCTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGC
TCA（配列番号２１）及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）：
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCT
CCTGCTCTGGAAGGACCTACAACATTGGAAATAATTATGTATCGTGGTATCAGCAGCTCCC
AGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGAC
CGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCG
AGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGTCAGGCTGAATGGTTGGGTGTTCGG
CGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号２２）
を含むことを特徴とする（７）に記載の使用が提供される。
（１６）本発明において，前記抗体が，
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCCGTGACTACTACGTGAGCTGGATCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTAGTGGTAGTGGGGGTAGGACATACTAC
GCAGACTCCGTGGAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCATGTATTACTGTGCCAGAGTATCC
GCCCTTCGGAGACCCATGACTACAGTAACTACTTACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAAGGT
ACACTGGTCACCGTGAGCTCA（配列番号２３）及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）：
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCCTGCTCTGGAAGGAGCTCCAACATTGGGAATAGTTATGTCTCCTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGGAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGGATGGGATGACACCCTGCGTGCTTGGGTG
TTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号２４）
を含むことを特徴とする（７）に記載の使用が提供される。
（１７）本発明において，前記抗体が，
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCCGCTATTAGTGGTAGTGGTAACACATACTATGCA
GACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTG
CAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCCTCCCAC
CGTATATTAGGTTATGCTTTTGATATCTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA（配列番号２５）及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）：
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCTTGTTCTGGAAGCCGCTCCAACATCGGGAGAAATGCTGTTAGTTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGCTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGGCAGCCTGAATGGTTGGGTG
TTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCC（配列番号２６）
を含むことを特徴とする(７）に記載の使用が提供される。
（１８）本発明において，前記抗体が，
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAAGTATTAGTGTTGGTGGACATAGGACATATTAT
GCAGATTCCGTGAAGGGCCGGTCCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCACGGATACGG
GTGGGTCCGTCCGGCGGGGCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGC
TCA（配列番号２７）及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）：
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCAT
CTCCTGCTCTGGAAGCAACACCAACATTGGGAAGAACTATGTATCTTGGTATCAGCAGC
TCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGCTAATAGCAATCGGCCCTCAGGGGTC
CCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCT
CCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCGTCATGGGATGCCAGCCTGAATGGTT
GGGTATTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号２８）
を含むことを特徴とする(７）に記載の使用が提供される。
（１９）本発明において，前記抗体が，
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTAC
GCAGACTCAGTGAAGGGCCGATCCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGGCTCACA
AATATTTTGACTGGTTATTATACCTCAGGATATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGTACA
CTGGTCACCGTGAGCTCA（配列番号２９）及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）：
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCCTGCTCTGGAAGCACCTCCAACATTGGGAAGAATTATGTATCCTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGCCAGCCTCAGTGGTTGGGTG
TTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号３０）
を含むことを特徴とする(７）に記載の使用が提供される。
（２０）本発明において，前記抗体が，
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTCTTGGATGAGTTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTAC
GCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTAGGG
AACTACGGTTTCTACCACTACATGGACGTCTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTGAGC
TCA（配列番号３１）及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）：
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCTTGTTCTGGAGGCAGCTCAAACATCGGAAAAAGAGGTGTAAATTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGAAATCGGCCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCTACATGGGATTACAGCCTCAATGCTTGGGTG
TTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号３２）
を含むことを特徴とする(７）に記載の使用が提供される。
（２１）本発明において，前記抗体が，
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTAC
GCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAATTAAA
CGGTTACGATTCGGCTGGACCCCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTG
AGCTCA（配列番号３３）及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）：
CAGTCTGTTCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCCTGTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGGAAATAATGGTGTAAACTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAACAATCGGCCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGCGTGGTTGGCTG
TTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号３４）
を含むことを特徴とする(７）に記載の使用が提供される。
（２２）本発明において，前記抗体が，
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTAC
GCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTCAAT
AGCAAAAAGTGGTATGAGGGCTACTTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACC
GTGAGCTCA（配列番号３５）及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）：
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGTCTGAGTGGTTGGGTG
TTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号３６）
を含むことを特徴とする(７）に記載の使用が提供される。
（２３）本発明において，前記抗体が，
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTC
TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACGCCTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTACTAGTAGTAATTACATATACTAC
GCAGACTCAGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTCAAG
AAGTATAGCAGTGGCTGGTACTCGAATTATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGTACACTG
GTCACCGTGAGCTCA（配列番号３７）及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATC
TCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAGCATTGGGAATAATTTTGTATCCTGGTATCAGCAGCTC
CCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGACAATAATAAGCGACCCTCAGGGGTCCCT
GACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGG
TCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTTGGGTG
TTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号３８）
を含むことを特徴とする(７）に記載の使用が提供される。
（２４）本発明において，下記からなる核酸配列の群から選択される可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）を含むＡｐｏＢ１００の少なくとも一つの酸化フラグメントに対して産生される抗体が提供される：
配列番号１，配列番号３，配列番号５，配列番号７，配列番号９，配列番号１１，配列番号１９，配列番号２１，配列番号２３，配列番号２５，配列番号２７，配列番号２９，配列番号３１，配列番号３３，配列番号３５，配列番号３７。
（２５）本発明において，下記からなる核酸配列の群から選択される可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）を含むＡｐｏＢ１００の少なくとも一つの酸化フラグメントに対して産生される抗体が提供される：
配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号８，配列番号１０，配列番号１２，配列番号２０，配列番号２２，配列番号２４，配列番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号３２，配列番号３４，配列番号３６，配列番号３８。
（２６）本発明において，下記からなる核酸配列の群から選択される可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）：
配列番号１，配列番号３，配列番号５，配列番号７，配列番号９，配列番号１１，配列番号１９，配列番号２１，配列番号２３，配列番号２５，配列番号２７，配列番号２９，配列番号３１，配列番号３３，配列番号３５，配列番号３７
を下記からなる核酸配列の群から選択される可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）：
配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号８，配列番号１０，配列番号１２，配列番号２０，配列番号２２，配列番号２４，配列番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号３２，配列番号３４，配列番号３６，配列番号３８
との組み合わせで含むＡｐｏＢ１００の少なくとも一つの酸化フラグメントに対して産生される抗体が提供される。
（２７）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号１及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号２
を含むことを特徴とする（２６）に記載の抗体が提供される。
（２８）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号３及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号４
を含むことを特徴とする（２６）に記載の抗体が提供される。
（２９）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号５及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号６
を含むことを特徴とする（２６）に記載の抗体が提供される。
（３０）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号７及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号８
を含むことを特徴とする（２６）に記載の抗体が提供される。
（３１）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号９及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号１０
を含むことを特徴とする（２６）に記載の抗体が提供される。
（３２）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号１１及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号１２
を含むことを特徴とする（２６）に記載の抗体が提供される。
（３３）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号１９及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号２０
を含むことを特徴とする（２６）に記載の抗体が提供される。
（３４）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号２１及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号２２
を含むことを特徴とする（２６）に記載の抗体が提供される。
（３５）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号２３及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号２４
を含むことを特徴とする（２６）に記載の抗体が提供される。
（３６）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号２５及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号２６
を含むことを特徴とする（２６）に記載の抗体が提供される。
（３７）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号２７及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号２８
を含むことを特徴とする（２６）に記載の抗体が提供される。
（３８）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号２９及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号３０
を含むことを特徴とする（２６）に記載の抗体が提供される。
（３９）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号３１及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号３２
を含むことを特徴とする（２６）に記載の抗体が提供される。
（４０）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号３３及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号３４
を含むことを特徴とする（２６）に記載の抗体が提供される。
（４１）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号３５及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号３６
を含むことを特徴とする（２６）に記載の抗体が提供される。
（４２）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号３７及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号３８
を含むことを特徴とする（２６）に記載の抗体が提供される。
（４３）ＡｐｏＢ１００に由来した酸化された，特にＭＤＡ修飾されたペプチドに対する特異的なヒト抗体フラグメントを生成させるフラグメントライブラリーを使用し，これにより同定された望ましい性質を有する抗体フラグメントを，完全長ヒト免疫グロブリン中に再構築する，治療に使用するための（２４）〜（４２）に記載された単離された抗体の製造方法が提供される。
（４４）本発明において，使用されるプライマーが下記のものであるＰＣＲ増幅を用いて，選択されたｓｃＦｖの可変部をコードする遺伝子の完全長ヒトＩｇＧ１ベクターへの移入を含む組換え技術を使用する（２２）に記載の単離されたヒト抗体の遺伝子の増幅方法が提供される：
ＶＨ−セグメントの増幅用のプライマー:
5'VH: 5'-GGTGTGCATTCCGAGGTGCAGCTGTTGGAG （配列番号１３）
3'VH: 5'-GACGTACGACTCACCTGAGCTCACGGTGACCAG（配列番号１４）及び
ＶＬ−セグメントの増幅用のプライマー：
5'VL: 5'-GGTGTGCATTCCCAGTCTGTGCTGACTCAG （配列番号１５）
3'VL: 5'-GACGTACGTTCTACTCACCTAGGACCGTCAGCTT（配列番号１６）。
（４５）本発明において，可変重鎖領域及び可変軽鎖領域挿入物を有する重鎖領域及び軽鎖領域プラスミドを含むコロニーを，フォワードプライマー: 5'-ATGGGTGACAATGACATC （配列番号１７），リバースプライマー:5'-AAGCTTGCTAGCGTACG（配列番号１８）を用いるコロニーＰＣＲにより確認する（４４）に記載の方法。
（４６）本発明において，アポリポ蛋白質Ｂの少なくとも一つの酸化フラグメントを指向する単離されたヒト抗体の治療または予防有効量を，粥状動脈硬化の治療のために投与するほ乳類，好ましくはヒトの受動免疫感作方法が提供される。
（４７）本発明において，前記酸化フラグメントが，下記からなる群の１またはそれ以上から選択される酸化フラグメントである（４６）に記載の方法が提供される：
ＦＬＤＴＶＹＧＮＣＳＴＨＦＴＶＫＴＲＫＧ
ＰＱＣＳＴＨＩＬＱＷＬＫＲＶＨＡＮＰＬＬ
ＶＩＳＩＰＲＬＱＡＥＡＲＳＥＩＬＡＨＷＳ
ＫＬＶＫＥＡＬＫＥＳＱＬＰＴＶＭＤＦＲＫ
ＬＫＦＶＴＱＡＥＧＡＫＱＴＥＡＴＭＴＦＫ
ＤＧＳＬＲＨＫＦＬＤＳＮＩＫＦＳＨＶＥＫ
ＫＧＴＹＧＬＳＣＱＲＤＰＮＴＧＲＬＮＧＥ
ＲＬＮＧＥＳＮＬＲＦＮＳＳＹＬＱＧＴＮＱ
ＳＬＴＳＴＳＤＬＱＳＧＩＩＫＮＴＡＳＬＫ
ＴＡＳＬＫＹＥＮＹＥＬＴＬＫＳＤＴＮＧＫ
ＤＭＴＦＳＫＱＮＡＬＬＲＳＥＹＱＡＤＹＥ
ＭＫＶＫＩＩＲＴＩＤＱＭＱＮＳＥＬＱＷＰ
ＩＡＬＤＤＡＫＩＮＦＮＥＫＬＳＱＬＱＴＹ
ＫＴＴＫＱＳＦＤＬＳＶＫＡＱＹＫＫＮＫＨ
ＥＥＥＭＬＥＮＶＳＬＶＣＰＫＤＡＴＲＦＫ
ＧＳＴＳＨＨＬＶＳＲＫＳＩＳＡＡＬＥＨＫ
ＩＥＮＩＤＦＮＫＳＧＳＳＴＡＳＷＩＱＮＶ
ＩＲＥＶＴＱＲＬＮＧＥＩＱＡＬＥＬＰＱＫ
ＥＶＤＶＬＴＫＹＳＱＰＥＤＳＬＩＰＦＦＥ
ＨＴＦＬＩＹＩＴＥＬＬＫＫＬＱＳＴＴＶＭ
ＬＬＤＩＡＮＹＬＭＥＱＩＱＤＤＣＴＧＤＥ
ＣＴＧＤＥＤＹＴＹＫＩＫＲＶＩＧＮＭＧＱ
ＧＮＭＧＱＴＭＥＱＬＴＰＥＬＫＳＳＩＬＫ
ＳＳＩＬＫＣＶＱＳＴＫＰＳＬＭＩＱＫＡＡ
ＩＱＫＡＡＩＱＡＬＲＫＭＥＰＫＤＫＤＱＥ
ＲＬＮＧＥＳＮＬＲＦＮＳＳＹＬＱＧＴＮＱ
ＳＬＮＳＨＧＬＥＬＮＡＤＩＬＧＴＤＫＩＮ
ＷＩＱＮＶＤＴＫＹＱＩＲＩＱＩＱＥＫＬＱ
ＴＹＩＳＤＷＷＴＬＡＡＫＮＬＴＤＦＡＥＱ
ＥＡＴＬＱＲＩＹＳＬＷＥＨＳＴＫＮＨＬＱ
ＡＬＬＶＰＰＥＴＥＥＡＫＱＶＬＦＬＤＴＶ
ＩＥＩＧＬＥＧＫＧＦＥＰＴＬＥＡＬＦＧＫ
ＳＧＡＳＭＫＬＴＴＮＧＲＦＲＥＨＮＡＫＦ
ＮＬＩＧＤＦＥＶＡＥＫＩＮＡＦＲＡＫＶＨ
ＧＨＳＶＬＴＡＫＧＭＡＬＦＧＥＧＫＡＥＦ
ＦＫＳＳＶＩＴＬＮＴＮＡＥＬＦＮＱＳＤＩ
ＦＰＤＬＧＱＥＶＡＬＮＡＮＴＫＮＱＫＩＲ
またはそれらの活性部位。
（４８）本発明において，前記抗体が，下記からなる核酸配列の群から選択される可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）を含むＡｐｏＢ１００の酸化フラグメントに対して産生される抗体である（４６）または（４７）に記載の方法が提供される：
配列番号１，配列番号３，配列番号５，配列番号７，配列番号９，配列番号１１，配列番号１９，配列番号２１，配列番号２３，配列番号２５，配列番号２７，配列番号２９，配列番号３１，配列番号３３，配列番号３５，配列番号３７。
（４９）本発明において，前記抗体が，下記からなる核酸配列の群から選択される可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）を含むＡｐｏＢ１００の酸化フラグメントに対して産生される抗体である（３６）または（３７）に記載の方法が提供される：
配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号８，配列番号１０，配列番号１２，配列番号２０，配列番号２２，配列番号２４，配列番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号３２，配列番号３４，配列番号３６，配列番号３８。
（５０）本発明において，前記抗体が，下記からなる核酸配列の群から選択される可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号１，配列番号３，配列番号５，配列番号７， 配列番号９，配列番号１１，配列番号１９，配列番号２１，配列番号２３，配列番号２５，配列番号２７，配列番号２９，配列番号３１，配列番号３３，配列番号３５，配列番号３７
を下記からなる核酸配列の群から選択される少なくとも一つの可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号２，配列番号４，配列番号６，配列番号８，配列番号１０，配列番号１２，配列番号２０，配列番号２２，配列番号２４，配列番号２６，配列番号２８，配列番号３０，配列番号３２，配列番号３４，配列番号３６，配列番号３８
との組み合わせで含むことを特徴とする（３８）または（３９）に記載の方法が提供される。
（５１）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号１及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号２
を含むことを特徴とする（５０）に記載の方法。
（５２）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号３及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号４
を含むことを特徴とする（５０）に記載の方法。
（５３）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号５及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号６
を含むことを特徴とする（５０）に記載の方法が提供される。
（５４）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号７
及び可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号８
を含むことを特徴とする（５０）に記載の方法が提供される。
（５５）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号９及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号１０
を含むことを特徴とする（５０）に記載の方法が提供される。
（５６）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号１１及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号１２
を含むことを特徴とする（５０）に記載の方法が提供される。
（５７）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号１９及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号２０
を含むことを特徴とする（５０）に記載の方法が提供される。
（５８）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号２１及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号２２
を含むことを特徴とする（５０）に記載の方法が提供される。
（５９）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号２３及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号２４
を含むことを特徴とする（５０）に記載の方法が提供される。
（６０）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号２５及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号２６
を含むことを特徴とする（５０）に記載の方法が提供される。
（６１）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号２７及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号２８
を含むことを特徴とする（５０）に記載の方法が提供される。
（６２）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号２９及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号３０
を含むことを特徴とする（５０）に記載の方法が提供される。
（６３）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号３１及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号３２
を含むことを特徴とする（５０）に記載の方法が提供される。
（６４）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号３３及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号３４
を含むことを特徴とする（５０）に記載の方法が提供される。
（６５）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号３５及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号３６
を含むことを特徴とする（５０）に記載の方法が提供される。
（６６）本発明において，前記抗体が
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）
配列番号３７及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）
配列番号３８
を含むことを特徴とする（５０）に記載の方法が提供される。
（６７）本発明において，アポリポ蛋白質Ｂの少なくとも一つの酸化フラグメントを指向する単離されたヒト抗体を含む受動免疫による粥状動脈硬化の治療または予防のための医薬組成物であって，該抗体が医薬用の賦形剤と組み合わせて存在する医薬組成物が提供される。
【発明の効果】
【００３２】
本発明は，ＡｐｏＢ１００に由来した酸化された，特にＭＤＡ修飾されたペプチドに対する特異的なヒト抗体フラグメントを生成する単離された抗体フラグメントライブラリーを利用する。そして，同定された望ましい性質を有する抗体フラグメントを，完全長ヒト免疫グロブリン中で再構築し，治療目的に使用し得る。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】実施形態１のスクリーニングIIにより得られたＩＥＩｓｃＦｖクローンのＬＤＬについてのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフ。
【図１Ｂ】実施形態１のスクリーニングIIにより得られたＩＥＩｓｃＦｖクローンのペプチドについてのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフ。
【図１Ｃ】実施形態１のスクリーニングIIにより得られたＫＴＴｓｃＦｖクローンのＬＤＬについてのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフ。
【図１Ｄ】実施形態１のスクリーニングIIにより得られたＫＴＴｓｃＦｖクローンのペプチドについてのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフ。
【図２Ａ】実施形態１で行われたＩＥＩ−Ａ８の用量依存性ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフ。
【図２Ｂ】実施形態１で行われたＩＥＩ−Ｄ８の用量依存性ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフ。
【図２Ｃ】実施形態１で行われたＩＥＩ−Ｅ３の用量依存性ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフ。
【図２Ｄ】実施形態１で行われたＩＥＩ−Ｇ８の用量依存性ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフ。
【図２Ｅ】実施形態１で行われたＫＴＴ−Ｂ８の用量依存性ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフ。
【図２Ｆ】実施形態１で行われたＫＴＴ−Ｄ６の用量依存性ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフ。
【図３Ａ】ＩＥＩ−Ａ８の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域のＤＮＡ配列。
【図３Ｂ】ＩＥＩ−Ｅ３の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域のＤＮＡ配列。
【図３Ｃ】ＩＥＩ−Ｇ８の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域のＤＮＡ配列。
【図３Ｄ】ＩＥＩ−Ｄ８の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域のＤＮＡ配列。
【図３Ｅ】ＫＴＴ−Ｄ６の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域のＤＮＡ配列。
【図３Ｆ】ＫＴＴ−Ｂ８の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域のＤＮＡ配列。
【図３Ｇ】１−Ｂ１２の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域のＤＮＡ配列。
【図３Ｈ】１−Ｃ０７の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域のＤＮＡ配列。
【図３Ｉ】１−Ｃ１２の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域のＤＮＡ配列。
【図３Ｊ】１−Ｇ１０の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域のＤＮＡ配列。
【図３Ｋ】２−Ｄ０３の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域のＤＮＡ配列。
【図３Ｌ】２−Ｆ０７の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域のＤＮＡ配列。
【図３Ｍ】２−Ｆ０９の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域のＤＮＡ配列。
【図３Ｎ】４−Ａ０２の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域のＤＮＡ配列。
【図３Ｏ】４−Ｃ０３の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域のＤＮＡ配列。
【図３Ｐ】４−Ｄ０４の可変重鎖領域及び可変軽鎖領域のＤＮＡ配列。
【図４Ａ】実施形態２で使用される軽鎖ベクターを示す図。
【図４Ｂ】実施形態２で使用される重鎖ベクターを示す図。
【図５】実施形態４で生成されたＩｇＧ１のＬＤＬに対するＥＬＩＳＡの結果を示すグラフ。
【図６】実施形態５で行われたＩＥＩ−Ｅ３抗体の抗アテローム効果の試験の結果を示すグラフ。
【図７】実施形態５で行われたＩＥＩ−Ｅ３抗体の用量依存性の抗アテローム効果の試験の結果を示すグラフ。
【図８Ａ】実施形態５で行われた酸化ＬＤＬの結合に対するＩＥＩ−Ｅ３抗体の効果の試験の結果を示すグラフ。
【図８Ｂ】実施形態５で行われた酸化ＬＤＬのマクロファージへの取り込みに対するＩＥ−Ｅ３抗体の効果の試験の結果を示すグラフ。
【図９】ＭＤＡ修飾ＡｐｏＢ１００誘導ペプチド及び対照ペプチドに対するｓｃＦｖの結合を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下に，単離された抗体フラグメントライブラリーに由来した，そしてＡｐｏＢ１００からの二つのＭＤＡ修飾ペプチド指向するヒト抗体により例証された，しかし限定的ではない本発明の詳細な説明を記載する。
【００３５】
実施形態１
ＭＤＡ修飾ペプチドＩＥＩＧＬ ＥＧＫＧＦ ＥＰＴＬＥ ＡＬＦＧＫ（Ｐ４５，表１）及びＫＴＴＫＱ ＳＦＤＬＳ ＶＫＡＱＹ ＫＫＮＫＨ（Ｐ２１０，表１）に対するＳｃＦｖの選択。
目的の抗原はリジンとヒスチジン上にマロンジアルデヒド（Malon-dialdehyde; ＭＤＡ）基を有するように化学的に修飾した。修飾したペプチドはＩＥＩ（Ｐ４５）及びＫＴＴ（Ｐ２１０）と表した。
【００３６】
選択は構築及び生産の原理がソダーリンド他（2000, ネイチャーバイオテクノロジー18, 852-856）に記述されたバイオインベント（BioInvent）のｎ−ＣｏＤｅＲ^ＴＭｓｃＦｖライブラリーを用いて行った。簡潔に述べると，ＣＤＲをヒト免疫グロブリン遺伝子から単離し，固定フレームワーク内に組換える。従って，生じた免疫グロブリン可変領域中の変異性は，固定フレームワークへの６つのＣＤＲ全ての組換の結果である。フレームワーク領域は全て生殖細胞系列であり，全ての抗体において同一である。したがって，変異性は，全て天然でヒト由来のＣＤＲに制限される。このライブラリーはおよそ２×１０^１０の独立したクローンを含んでおり，２０００倍過剰のクローンを各選択のためのインプットとして使用した。選択は３ラウンドで実行された。選択ラウンド１では，イムノチューブ（NUNC maxisorb 444202）をＰＢＳ（１３７ｍＭのＮａＣｌ，２．７ｍＭのＫＣｌ，４．３ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４，１．４ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４）中の２０μｇ／ｍｌのＭＤＡ修飾標的ペプチド１．２ｍｌで＋４℃で一晩の回転撹拌(end over en agitation)によりコートした。その後，チューブを３０分間，ＴＰＢＳＢ５％（ＰＢＳ中の５％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，０．０２％アジ化ナトリウム）でブロックし，使用の前にＴＰＢＳＢ３％（ＰＢＳの中の３％のＢＳＡ，０．０５％のＴｗｅｅｎ２０，０．０２％のアジ化ナトリウム）で２回洗浄した。その後，各目的チューブを回転撹拌により，室温で２時間，１．８ｍｌのＴＰＢＳＢ３％中でｎ−ＣｏｄｅＲ^ＴＭライブラリーからの約２×１０^１３のＣＦＵファージと共にインキュベートした。その後，このチューブを，１５×３ｍｌのＴＰＢＳＢ３％及び２×１ｍｌのＰＢＳで洗浄した後，結合したファージを室温で３０分間，２ｍｇ／ｍｌのトリプシン（ロシュ(Roche)，１０９８１９）１ｍｌ／チューブで溶出した。この方法は，ｓｃＦｖ融合蛋白質の特異的なトリプシン部位を利用してファージを標的から放す。この反応は，アプロテイン(Aprotein)（０．２ｍｇ／ｍｌ，ロシュ，分類番号２３６６２４）１００ｍｌの添加により止められ，イムノチューブを３００μｌのＰＢＳで洗浄して１．４ｍｌの最終容量とした。
【００３７】
選択されたファージの増幅のために，大腸菌(E.Coli)ＨＢ１０１Ｆの細胞を，ＬＢ培地（メルク(Merck)，分類番号１．１０２８５）１０ｍｌ中でＯＤ_６００＝０．５まで指数関数的に成長させ，原則として（ソダーリンド他, 2000, ネイチャーバイオテクノロジー18, 852-856）に記載されるように，選択され溶出されたファージを感染させた。その後，生じたファージ上清を，２．５ＭのＮａＣｌ中の２０％のＰＥＧ_６０００の１／４容量の添加によって沈殿させ，＋４℃で５時間インキュベートした。その後，該ファージを３０分間，１３０００×ｇの遠心分離によってペレット化した。５００μｌのＰＢＳに再懸濁し，選択ラウンド２で使用した。
【００３８】
増幅されたファージストックを，ＰＢＳ中の５％のＢＳＡ，０．０５％のＴｗｅｅｎ２０，０．０２％のアジ化ナトリウム最終容量１．５ｍｌ中で，選択ラウンド２に使用した。ＭＤＡ修飾していないペプチド（４×１０^−７Ｍ）も，ＭＤＡ実変性の目的ペプチドへのバインダーに対する競合のために含めた。ＴＰＢＳＢ３％の代わりに１％のカゼインでチューブをブロックしたこと以外は，前記と同様にして，該混合物を抗原で調製したイムノチューブ中でインキュベートした。選択１について記述したように，インキュベーション及びイムノチューブの洗浄を行った。その後，結合したファージを１００ｍＭのトリスグリシン(Tris-Glycine)バッファー，ｐＨ２．２を６００μｌ使用して，３０分間溶出した。チューブを追加の２００μｌのグリシンバッファーで洗浄し，溶出液を溜め，その後，９６μｌの１Ｍのトリス-ＨＣｌ（Tris-HCl），ｐＨ８．０で中和した。このサンプルを，室温で１時間で復元し，選択ラウンド３で使用した。
【００３９】
選択ラウンド３のために，ＢＳＡ，Ｔｗｅｅｎ２０及びアジ化ナトリウムを，復元したファージプールに各々最終濃度３％，０．０５％及び０．０２％で添加した。競合ペプチドであるＭＤＡ修飾した非関連のペプチド並びに修飾していない天然の目的ペプチドを１×１０^−７Ｍ濃度で添加した。ファージ混合物（１１００μｌ）を，選択１に記述されたように目的抗原をコートしたイムノチューブに添加し，その後，撹拌しながら４℃で一晩インキュベートした。その後このチューブを，３×３ｍｌのＴＰＢＳＢ３％，５×３ｍｌのＰＢＳで洗浄し，最後に，結合したファージを選択ラウンド１に記述したようなトリプシンを使用して溶出した。各溶出液を１００μｇ／ｍｌアンピシリン，１５μｇ／ｍｌテトラサイクリン，０．１％のグルコースを含有するＬＢ中の対数的に生長するＨＢ１０１Ｆ’１０ｍｌに感染させ，シェーカーインキュベーター中，３０℃，２００ｒｐｍで一晩培養した。
【００４０】
その，一晩培養物を，バイオラッド(Biorad)ミニ調製キット（分類番号７３２ ６１００）を使用する，プラスミドＤＮＡの小規模調製のために使用した。発現ベクターからファージ遺伝子III部分を取り除くために，プラスミドＤＮＡ０．２５μｇを，供給者に推奨される緩衝液中の２．５ＵのＥａｇ−１（ニューイングランドバイオラブス(New England Biolabs)，分類番号Ｒ０５０）を使用して，３７℃で２時間切断した。その後，このサンプルを６５℃で２０分熱不活性化し，３０μｌの１×リガーゼバッファー（ギブコ(Gibco)／ＢＲＬ）中の１ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを使用して，１６℃で一晩連結した。この操作は，ファージ遺伝子IIIフラグメントの反対側に位置していた二つのＥａｇ−１サイトを連結し，これにより末端６×ｈｉｓタグを示すフリーｓｃＦｖを製造する。ファージ遺伝子IIIセグメントが連結したクローンを破壊するために，ライゲーション反応の後に，この材料を３０μｌライゲーションミックス，３．６μｌの１０×ＲＥＡＣＴ３ストック，０．４μｌの１ＭＮａＣｌ，５μｌのＨ_２Ｏ_２を含有する溶液中，３７℃で２時間消化した。最終産物２０ナノグラムを化学コンピテントＴｏｐ１０Ｆ’にトランスフォームし，５００ｃｍ^２のＱトレイＬＡプレート（１００μｇ／ｍｌＡｍｐ，１％グルコース）に広げ，それ以上スクリーニングすることなく単一のコロニーを取り出すことを可能にした。
【００４１】
アポリポ蛋白質Ｂ−１００からのペプチドをＭＤＡ修飾したものに結合する特異抗体フラグメント用のｎ−ＣｏＤｅＲ^ＴＭｓｃＦｖライブラリーのスクリーニング。
ＭＤＡ修飾ＩＥＩ（Ｐ４５）ペプチドと天然のＩＥＩを，またＭＤＡ修飾ＫＴＴ（Ｐ２１０）と天然のＫＴＴを各々識別できるＳｃＦｖを確認するために，選択されたｓｃＦｖ発現クローンからの細菌上清上でスクリーニングを行った。
【００４２】
単一のクローンのコロニーピッキング，ｓｃＦｖの発現及びスクリーニングナンバー１は，標準法によりバイオインベントの自動システムで行われた。ＭＤＡ修飾ＩＥＩ及びＫＴＴペプチドに対して各々選択された１０８８及び８３１の単一クローンがそれぞれ取り上げられ，培養され，１００μｇアンピシリン／ｍｌを含有するＬＢ１００μｌ中マイクロタイタープレートで発現させた。
【００４３】
スクリーニングナンバー１について，白いアッセープレート（グレイナー(Greiner) ６５５０７４）を，コーティングバッファー（０．１Ｍの炭酸ナトリウム，ｐＨ ９．５）中５４ｐｍｏｌペプチド／ウェルで，ポジティブターゲットとして供されるＭＤＡ修飾ペプチドまたは非ターゲットとして供される対応する未修飾ペプチドでコーティングした。ＥＬＩＳＡにおいて，発現したｓｃＦｖを，ｓｃＦｖに対してＣ末端に配置したｍｙｃ−タグにより，洗浄バッファー中の１μｇ／ｍｌの抗ｃ−ｍｙｃモノクローナル（９Ｅ１０ ロシュ １６６７ １４９）を用いて検出した。第２抗体として，ヤギ抗マウスアルカリフォスファターゼコンジュゲート（アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems) 分類番号ＡＣ３２ＭＬ）を２５０００倍希釈で使用した。発光検出のためにＥｍｅｒａｌｄＩＩ Ｔｒｏｐｉｘ（アプライドバイオシステムズ 分類番号ＭＳ１００ＲＹ）と共に使用される，ＣＤＰ−Ｓｔａｒ−Ｒｅａｄｙを供給者の推奨に従って使用した。
【００４４】
ＭＤＡ修飾ペプチドを結合するが，天然のペプチドは結合しないＳｃＦｖクローンを，前記のように再発現させ，発光ＥＬＩＳＡ（表２及び図１）において別の時にスクリーニングした。試験は，直接コーティングしたペプチド（ＰＢＳを１０８ｐｍｏｌ／ウェルコートした）及びより生理学的なターゲットの両方に対して行った；ＭＤＡ修飾を行った及び行わないＡｐｏＢ−１００蛋白質を含むＬＤＬ粒子（ＰＢＳ＋１ｍＭのＥＤＴＡ中１μｇ／ウェルコーティングした）をターゲットとして使用した。ポジティブクローンは酸化ＬＤＬ及びＭＤＡ修飾ペプチドを結合するが，天然のＬＤＬまたはペプチドは結合しないものであった。また，抗Ｈｉｓ抗体（ＭａＢ０５０ ＲαＤ）を検出抗体として使用すること以外は前記と同じ方法によりＥＬＩＳＡを行った。１２個のＩＥＩクローン及び２個のＫＴＴクローンが検出され，ペプチド及びＬＤＬの両方についてＭＤＡ修飾型は天然型よりも７００ｎｍにおいて３倍以上高い発光を与えた。
【００４５】
ｓｃＦｖの用量依存性を評価するために，確認されたクローンをさらに，一定量（１μｇ／ウェル）のＭＤＡ ＬＤＬ及び天然のＬＤＬに対する滴定によって試験した（図２）。図２は，ＭＤＡ修飾ＬＤＬ及び非修飾天然ＬＤＬに対するｓｃＦＶのスクリーニングIII滴定の結果を示すものである。
【００４６】
【表２】

【００４７】
独自のクローンを発見するために，選択されたｓｃＦｖクローンの配列を決定した。細菌のＰＣＲをボエリンガーマンヘイムエクスパンドキット(Boeringer Mannheim Expand kit)により，プライマー（５’−ＣＣＣ ＡＧＴ ＣＡＣ ＧＡＣ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＡＡ ＣＧ−３’）及び（５’−ＧＡＡ ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＴＧ ＡＡＡ ＴＡＣ ＣＴＡ ＴＴＧ Ｃ−３’），並びにジーンアンプ(GeneAmp)ＰＣＲシステム９７００（ピーイーアプライドシステム;PE Applied system）を用いて，９４℃で５分間，そして９４℃で３０分間，５２℃で３０分間及び６８℃で２分間のサイクルを３０サイクル，そして最後に６８℃で５分間の温度サイクルプログラムで行った。シーケンシング反応は，鋳型として細菌のＰＣＲ生成物（５倍希釈）を用い，ピーイーアプライドバイオシステムズ(PE Applied Biosystems)のビッグダイターミネイターミックス（Big Dye Terminator mix）及びジーンアンプＰＣＲシステム９７００（ピーイーアプライドシステム）を用い，９６℃で１０秒間，５０℃で５秒間及び６０℃で４分間のサイクルを２５サイクルの温度サイクルプログラムで行った。伸長生成物は，供給者の指示により精製し，伸長生成物の分離及び検出は，３１００遺伝子解析装置（ピーイーアプライドバイオシステムズ）を使用して行った。配列を院内(in house)コンピュータープログラムで分析した。相同なクローン及び不適切な制限部位によるクローンを配列情報から除き，ＩｇＧ遺伝子変換のための６つのクローンが残った。最後に選択されたクローンの可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）領域のＤＮＡ配列を図３に示す。図３は，ＭＤＡ修飾ＡｐｏＢ１００ペプチドに結合する６個のｓｃＦＶの可変領域のＤＮＡ配列を示す。
【００４８】
実施形態２
選択されたｓｃＦｖの可変部分をコードする遺伝子の完全長ヒトＩｑＧｌベクターへの移入。
Ｉｇフォーマットに変換されるｓｃＦｖクローンを含有する細菌を，１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補ったＬＢ中で一晩培養した。プラスミドＤＮＡを，バイオラッドのクアンタムプレッププラスミドキット（＃７３２−６１００）を使用して，一晩培養物から調製した。ＤＮＡ濃度を，２６０ｎｍでの吸光度を測定することにより評価し，該ＤＮＡを，２ｎｇ／μｌの濃度に希釈した。
【００４９】
異なるｓｃＦｖ−プラスミドからのＶＨ及びＶＬを，これらのセグメントに発現ベクターと互換性をもつ制限部位を供給するために，ＰＣＲ増幅した（以下を参照）。５’プライマーはＢｓｍＩ，３’プライマーはＢｓｉＷＩ制限酵素切断部位を含んでいる（イタリック体で示される）。３’プライマーはさらにスプライスドナー部位（太字で示される）を含んでいた。
【００５０】
ＶＨセグメントの増幅用のプライマー：

【００５１】
ＶＬセグメントの増幅用のプライマー：

【００５２】
１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ，０．４μＭの５’プライマー，０．４μＭの３’プライマー及び０．６ｍＭのｄＮＴＰ（ロシュ，＃１ ９６９ ０６４）を含む総容量５０μｌでＰＣＲを行った。使用したポリメラーゼは，一反応あたり３．５ｕのエクスパンドロングテンプレートＰＣＲシステム(Expand long template PCR system)（ロシュ＃１ ７５９ ０６０）であり，３つの別々の反応に供給される各々の緩衝液と共に用いた。各ＰＣＲ増幅サイクルは，９４℃で３０秒間の変性工程，５５℃で３０秒間のアニーリング工程，６８℃で１．５分間の伸長工程からなる。この増幅サイクルを２５回繰り返した。各反応は９４℃で２分間，１回の変性工程で始め，６８℃で１０分間，１回の伸長工程で終えた。ＰＣＲ生成物の存在はアガロースゲル電気泳動によってチェックし，同じ増幅された材料（異なるバッファーによる反応からの）を含む反応物を溜めた。続いて，ＰＣＲ増幅生成物を，Ｓ４００−ＨＲカラム（アマシャムファルマシア バイオテック(Amersham-Pharmacia Biotech)＃２７−５２４０−０１）を使用して，スピンカラムクロマトグラフィーによって精製した。
【００５３】
ＰＣＲ生成物の各プールからの４μｌを，メーカーの推奨によりＴＯＰＯ ＴＡクローニング（ｐＣＲ ２．１ ＴＯＰＯ，インビトロジェン(InVitrogen)＃Ｋ４５５０−０１）に使用した。挿入物を有するプラスミドを含む細菌コロニーを，１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び２０μｇ／ｍｌカナマイシンを補ったＬＢ中で一晩培養した。プラスミドＤＮＡを，バイオラッドのクアンタムプレッププラスミドミニプレップキット(Quantum Prep, plasmid miniprep kit)（＃７３２−６１００）を使用して，一晩培養物から調製した。プラスミド調製物を，Ｓ４００−ＨＲカラム（アマシャムファルマシア バイオテック＃２７−５２４０−０１）を使用してスピンカラムクロマトグラフィーによって精製した。個々のＶＨ及びＶＬクローニングからの３つのプラスミドを，ビッグダイサイクルシーケンシング(Big Dye Cycle Sequencing)（パーキンエルマーアプライドバイオシステム；PerkinElmer Applied Biosystem），＃４３０３１５０）を用いる配列分析にかけた。このサイクルシーケンシングプログラムは，９６℃で１０秒間の変性工程，５０℃で１５秒間のアニーリング工程及び６０℃で４分間の伸長工程からなる。このサイクルを２５サイクル繰り返した。各反応は，９４℃で１分間の変性工程１回で始まる。反応は，１μＭのプライマー（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ），３μｌのプラスミドＤＮＡ及び４μｌのビッグダイ(Big Dye)反応混合物からなる１０μｌ容量中で行われた。この反応物をメーカーの推奨法により沈殿させ，サンプルを，ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００遺伝分析装置にかけた。配列を，ＯＭＩＧＡ配列分析ソフトウェア（オックスフォードモレキュラーリミテッド；Oxford Molecular Ltd）のアラインメント機能を使用して，もとのｓｃＦｖ配列と比較した。
【００５４】
突然変異のないＶＨとＶＬのセグメントを含むプラスミドを制限酵素で消化した。ｐＣＲ ２．１ ＴＯＰＯベクターを開裂するために，プラスミドを，まずＤｒａＩ（ロシュ＃１ ４１７ ９８３）により３７℃で２時間消化した。消化したものを７０℃で２０分間熱不活性化し，Ｓ４００−ＨＲカラム（アマシャムファルマシア バイオテック＃２７−５２４０−０１）を使用して，スピンカラムクロマトグラフィーによって精製した。続いて，精製したＤｒａＩ消化物を，ＢｓｍＩ（ロシュ＃１ ２９２ ３０７）及びＢｓｉＷＩ（ロシュ＃１ ３８８ ９５９）を用いて５５℃で一晩消化した。消化したものはフェノール抽出及び沈殿を用いて精製した。沈殿したＤＮＡを，１０μｌのＨ_２Ｏに溶解し，ライゲーションに使用した。
【００５５】
発現ベクターは，ラーズノーデンハーグ(Lars Norderhaug)（J. Immunol. Meth. 204 (1997) 77-87）から得た。いくつかの修飾の後，ベクター（図４）は，ＣＭＶプロモーター，Ｉｇリーダーペプチド，ＶＨ／ＶＬのクローニング用のＢｓｍＩとＢｓｉＷＩの制限部位を含むクローニングリンカー，ＩｇＧ１（重鎖（ＨＣ）ベクター）あるいはラムダ（軽鎖（ＬＣ）ベクター）のゲノムの定常領域，真核細胞での選択のためのネオマイシン（ＨＣベクター）またはメトトレキサート（ＬＣベクター）耐性遺伝子，ＳＶ４０及びＣｏｌＥＩ複製開始点，及び細菌での選択のためのアンピシリン（ＨＣベクター）またはカナマイシン（ＬＣベクター）耐性遺伝子を含む。
【００５６】
ＨＣ及びＬＣベクターを，ＢｓｍＩ及びＢｓｉＷＩで消化し，ホスファターゼ処理し，フェノール抽出及び沈殿により精製した。ライゲーションは，１００ｎｇの消化されたベクター，２μｌのＶＨ／ＶＬ−ｐＣＲ ２．１ ＴＯＰＯベクター（前記参照），１ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ライフテクノロジーズ(Life Technologies)，＃１５２２４−０２５）及び供給されたバッファーを含む１０μｌ容量で１６℃で一晩行った。続いて，２μｌのライゲーション混合物を，５０μｌのｃｈｅｍｏコンピーテントｔｏｐ１０Ｆ’細菌にトランスフォームし，選択的な（１００μｇ／ｍｌアンピシリンまたは２０μｇ／ｍｌカナマイシン）寒天板に載せた。
【００５７】
ＶＨ／ＶＬ挿入物を有するＨＣ／ＬＣプラスミドを含むコロニーは，コロニーＰＣＲによって確認された：
フォワードプライマー：５’−ＡＴＧＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧＡＣＡＴＣ
リバースプライマー：５’−ＡＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＣＧＴＡＣＧ。
【００５８】
ＰＣＲは，細菌，０．５μＭのフォワードプライマー，０．５μＭのリバースプライマー及び０．５ｍＭのｄＮＴＰ（ロシュ，＃１ ９６９ ０６４）を含む総容量２０μｌで行われた。使用されるポリメラーゼは，エクスパンドロングテンプレートＰＣＲシステム（ロシュ＃ １ ７５９ ０６０）であり，供給されたバッファー＃３と共に使用され，一反応あたり０．７Ｕであった。各ＰＣＲ増幅サイクルは，９４℃で３０秒の変性工程，５２℃で３０秒のアニーリング工程及び６８℃で１．５分間の伸長工程からなる。この増幅サイクルは，３０回繰り返された。各反応は９４℃で２分間の変性工程１回から始まり，６８℃で５分間の伸長工程１回で終わった。ＰＣＲ生成物の存在はアガロースゲル電気泳動によって確認した。ＶＨ／ＶＬ挿入物を有するＨＣ／ＬＣプラスミドを含むコロニーは，１００μｇ／ｍｌアンピシリンまたは２０μｇ／ｍｌカナマイシンを補ったＬＢ中で一晩培養した。この一晩培養物から，プラスミドＤＮＡを，バイオラッドのクアンタムプレッププラスミドキット（＃７３２−６１００）を使用して調製した。プラスミド調製物はＳ４００−ＨＲカラム（アマシャムファルマシア バイオテック＃２７−５２４０−０１）を使用して，スピンカラムクロマトグラフィーによって精製した。ＤＮＡ配列の完全さを確認するために，個々のＶＨ及びＶＬからの各々３つのプラスミドを，ビッグダイサイクルシーケンシング（パーキンエルマーアプライドバイオシステム，＃４３０３１５０）を使用する配列分析にかけた。サイクル配列決定プログラムは９６℃で１０秒の変性工程，５０℃で１５秒のアニーリング工程及び６０℃で４分間の伸長工程からなる。このサイクルを２５回繰り返した。各反応は９４℃で１分間の変性工程１回で始めた。この反応は１μＭのプライマー（５’−ＡＧＡＣＣＣＡＡＧＣＴＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣ），３μｌのプラスミドＤＮＡ及び４μｌのビッグダイ反応混合物からなる１０μｌ容量で行われた。この反応物を製造者の推奨法により沈殿させ，サンプルをＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００遺伝子解析装置(Genetic Analyzer)にかけた。配列を，ＯＭＩＧＡ配列分析ソフトウェア（オックスフォードモレキュラーリミテッド）を使用して分析した。プラスミドＤＮＡをＣＯＳ−７細胞（以下を参照）の一過性トランスフェクションに使用し，同じプラスミド上に重鎖及び軽鎖遺伝子を含む連結されたベクターの生産のために消化した。
【００５９】
同じｓｃＦｖ由来のＶＨ及びＶＬセグメントを含む重鎖及び軽鎖ベクターを，制限酵素により開裂し，連結した：まず，ＨＣ−及びＬＣ−ベクターをＭｕｎＩ（ロシュ＃１ ４４１ ３３７）で消化し，その後消化物を７０℃で２０分間，熱不活性化し，Ｓ２００−ＨＲカラム（アマシャムファルマシア バイオテック＃２７−５１２０−０１）を使用して，スピンカラムクロマトグラフィーによって精製した。続いて，ＨＣベクター消化物をＮｒｕＩ（ロシュ＃７７６ ７６９）でＬＣベクター消化物をＢｓｔｌｌ０７Ｉ（ロシュ＃１ ３７８ ９５３）で消化した。その後，消化物を７０℃で２０分間，熱不活性化し，Ｓ４００−ＨＲカラム（アマシャムファルマシア バイオテック＃２７−５２４０−０１）を使用して，スピンカラムクロマトグラフィーによって精製した。消化したプラスミド各々５μｌを，２ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ライフテクノロジーズ，＃１５２２４−０２５）及び供給されたバッファーを含む２０μｌの総容量で１６℃で一晩連結した。続いて，２μｌのライゲーション混合物を，５０μｌの化学（ｃｈｅｍｏ）コンピテントｔｏｐ１０Ｆ’細菌にトランスフォームし，選択的な（１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び２０μｇ／ｍｌカナマイシン）寒天板に載せた。
【００６０】
細菌のコロニーを，１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び２０μｇ／ｍｌカナマイシンを補ったＬＢ中で一晩培養した。この一晩培養物から，プラスミドＤＮＡを，バイオラッドのクアンタムプレッププラスミドキット（＃７３２−６１００）を用いて調製した。正確に連結されたベクターは，制限酵素消化及びそれに続くアガロースゲル電気泳動によるフラグメントサイズの分析により確認された。
【００６１】
プラスミド調製物を，Ｓ４００−ＨＲカラム（アマシャムファルマシア バイオテック＃２７−５２４０−０１）を使用してスピンカラムクロマトグラフィーによって精製し，ＣＯＳ−７細胞の一過性トランスフェクションのために使用した。
【００６２】
ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１６５１）は，０．１ｍＭ可欠アミノ酸（インビトロジェン＃１１１４００３５）及び１０％ウシ胎児血清（インビトロジェン＃１２４７６−０２４，バッチ＃１１２８０１６）を補ったダルベッコ(Dulbeccos) ＭＥＭ高グルコース＋グルタマックス(Glutamax)Ｉ（インビトロジェン＃３１９６６０２１）中，５％のＣＯ_２，３７℃で培養した。トランスフェクションの前日，細胞を，１２ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，＃１５０６２８）に，１ウェル当たり１．５×１０^５細胞の密度で入れた。
【００６３】
トランスフェクションに先立って，プラスミドＤＮＡを７０℃で１５分間加熱した。細胞に，１ウェル当たり１μｇのＨＣプラスミド＋１μｇのＬＣプラスミドまたは２μｇの結合したプラスミドを，リポフェクタミン(Lipofectamine)２０００試薬（インビトロジェン，＃１１６６８０１９）を使用してメーカーの推奨に従って感染させた。トランスフェクションから２４時間後，細胞培養培地を変え，細胞を５日間培養した。その後，培地を集め，蛋白質の生産をＥＬＩＳＡを用いて分析した。
【００６４】
９６ウェルプレート（コスター(Costar)＃９０１８，平底，高結合）に，コーティングバッファー（０．１Ｍ炭酸ナトリウム，ｐＨ ９．５）で４０００倍に希釈したウサギ抗ヒトラムダ軽鎖抗体（ＤＡＫＯ，＃Ａ０１９３）１００μｌ／ウェルを添加することにより，４℃で一晩コーティングした。プレートを，０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回洗浄した後，１００μｌ／ウェルのＰＢＳ＋３％ＢＳＡ（アルブミン，フラクション Ｖ，ロシュ＃７３５１０８）を用いて室温で１時間ブロッキングした。前記のように洗浄した後，１００μｌ／ウェルのサンプルを添加し，室温で１時間インキュベートした。濃度の評価のための基準として，ヒトの精製されたＩｇＧ１（シグマ(Sigma)，＃Ｉ５０２９）を使用した。サンプル及び標準を，サンプルバッファー（２％のＢＳＡ及び０．５％のウサギ血清（シグマ＃Ｒ４５０５）を含むｌ×ＰＢＳ。）で希釈した。続いて，プレートを前記のように洗浄し，サンプルバッファー中で８０００倍に希釈したウサギ抗ヒトＩｇＧ（ｙ−鎖）ＨＡＲＰ結合抗体（ＤＡＫＯ，＃Ｐ２１４）を１００μｌ／ウェルで添加し，室温で１時間インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで８回洗浄した後，１５ｍｌのクエン酸バッファー及び４．５μｌのＨ_２０_２（３０％）に溶解した１個のＯＰＤタブレット（１０ｍｇ，シグマ＃Ｐ８２８７）を含有する基質溶液１００μｌ／ウェルを添加した。１０分後，反応を，１ＭのＨＣｌを１５０μｌ／ウェル添加することにより終了した。４９０〜６５０ｎｍにおけるに吸光度を測定し，データをソフトマックス(Softmax)ソフトウェアを使用して分析した。
【００６５】
正しく結合したＨＣ−及びＬＣ−ベクターを含む細菌を，アンピシリン及びカナマイシンを補ったＬＢ５００ｍｌ中で一晩培養した。バイオラッドのクアンタムプレッププラスミドマキシプレップキット（＃７３２−６１３０）を使用して，一晩培養物からプラスミドＤＮＡを調製した。ベクターはＰｖｕＩ制限酵素（ロシュ＃６５０ １２９）を使用して線状にされた。トランスフェクションに先立って，線状化ＤＮＡを，Ｓ４００−ＨＲカラム（アマシャムファルマシア バイオテック＃２７−５２４０−０１）を使用してスピンカラムクロマトグラフィーによって精製し，７０℃で１５分間加熱した。
【００６６】
実施形態３
アポリポ蛋白質Ｂ−１００からのＭＤＡ修飾ペプチドに対する抗体を発現するＮＳＯ細胞の安定なトランスフェクション。
ＮＳＯ細胞（ＥＣＡＣＣ ８５１１０５０３番）を，１０％のウシ胎児血清（分類番号１２４７６−０２４，ロット：１１２８０１６，インビトロジェン）及び１×ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸，分類番号１１１４０−０５３，インビトロジェン）を補ったＤＭＥＭ（分類番号３１９６６−０２１，インビトロジェン）中で培養した。細胞培養は湿潤環境中，５％ＣＯ_２，３７℃に維持された。
【００６７】
トランスフェクトすべきＤＮＡ構築物は，４つの構造のＩＥＩ特異抗体（ＩＥＩ−Ａ８，ＩＥＩ−Ｄ８，ＩＥＩ−Ｅ３，ＩＥＩ−Ｇ８），二つのＫＴＴ特異抗体（ＫＴＴ−Ｂ８，ＫＴＴ−Ｄ６）及び一つの対照抗体（ＪＦＰＡ１２）であった。トランスフェクションの前日，細胞をトリプシン化し，数えた後，Ｔ−７５フラスコに１２×１０^６細胞／フラスコで入れた。トランスフェクションの当日，細胞が８５〜９０％コフルエントであった場合，細胞を１５ｍｌのＤＭＥＭ＋１×ＮＥＡＡ＋１０％ＦＢＳ（前記）に入れた。トランスフェクトすべき細胞の各フラスコに対し，３５〜４０μｇのＤＮＡを１．９ｍｌの血清なしのＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ 血清使用量低減培地(Reduced Serum Medium)（分類番号５１９８５−０２６，ロット：３０６２３１４，インビトロジェン）で希釈した。細胞の各フラスコのために，別のチューブで，リポフェクタミン２０００試薬（分類番号１１６６８−０１９，ロット：１１１６５４６，インビトロジェン）１１４μｌを，ＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ 血清使用量低減培地１．９ｍｌで希釈し，室温で５分間インキュベートした。希釈されたＤＮＡを，希釈されたリポフェクタミン２０００試薬と合わせ（３０分以内），室温で２０分間インキュベートしてＤＮＡ−ＬＦ２０００試薬複合体を生じさせた。
【００６８】
細胞を，培地で１回洗浄し，１１ｍｌのＤＭＥＭ＋１×ＮＥＡＡ＋１０％ＦＢＳを添加した。その後，ＤＮＡ−ＬＦ２０００試薬複合体（３．８ｍｌ）を，各フラスコに直接添加し，前後に振動させることにより穏やかに混合した。細胞を，５％のＣＯ_２インキュベーター中，３７℃で２４時間インキュベートした。
【００６９】
その後，細胞をトリプシン化し，計測し，続いて９６ウェルプレートに，２×１０^４細胞／ウェルで入れた。１構築物当たり５個の９６ウェルプレートを用いた。細胞を，Ｇ４１８−硫酸塩（分類番号１０１３１−０２７，ロット：３０６６６５１，インビトロジェン）を６００μｇ／ｍｌ含むＤＭＥＭ＋１×ＮＥＡＡ＋１０％ＦＢＳ（前記）１００μｌ／ウェルに入れた。選択圧は細胞の収穫まで不変にした。
【００７０】
細胞を１２日間培養し，ＥＬＩＳＡを使用して，抗体産生について分析した。各構築物から，最も高い量のＩｇＧを含む２４ウェルからの細胞を２４ウェルプレートに移し，コンフルエントに達するようにした。その後，これらのウェル中の細胞からの抗体産生を，ＥＬＩＳＡで分析し，５〜２１プール／構築物を再スクリーニングのために選択した（表３）。最後に，各構築物の最も良い１〜４ウェルからの細胞を選択した。これらの細胞を，細胞培養フラスコ中で連続的に拡張し，最後に３層フラスコ（５００ｃｍ^２）に，抗体産生のための（ＤＭＥＭ＋ｌ×ＮＥＡＡ＋１０％ Ｕｌｔｒａ ｌｏｗ ＩｇＧ ＦＢＳ（分類番号１６２５０−０７８，ロット番号１１３４６６，インビトロジェン）＋Ｇ４１８（６００μｇ／ｍｌ）２００ｍｌ中に移した。細胞を７〜１０日間インキュベートし，上清をＥＬＩＳＡによって分析し，収穫し，精製のために滅菌ろ過した。
【００７１】
実施形態４
ヒトＩｇＧ１上清の生産及び精製
異なるＩｇＧ１抗体をトランスフェクトしたＮＳＯ細胞からの上清を，０．２２μｍのフィルターを用いて滅菌ろ過し，組換え蛋白質Ａと共にアフィニティ媒体ＭａｂＳｅｌｅｃｔ^ＴＭ（分類番号１７５１９９０１ アマシャムバイオサイエンス(Amersham Biosciences)）を用いて精製した。
【００７２】
結合したヒトＩｇＧ１を，ＨＣＬグリシンバッファーｐＨ２．８で溶出した。溶出液を，０．５ｍｌのフラクションで回収し，ＯＤ_２８０を用いて蛋白質の存在を測定した。ピークのフラクションをプールし，２８０ｎｍ及び３２０ｎｍの吸光度を測定した。バッファーは大容量のＰＢＳに対する透析によって変更した。精製されたＩｇＧ１調製物における内毒素の存在を，ＬＡＬ試験（ＱＣＬ−１０００^Ｒ，分類番号５０−６４７Ｕ バイオウィッタカー(Bio Whittaker)）を使用して試験した。各サンプルは，１〜１２ＥＵ／ｍｌの内毒素を含んでいた。調製の純度はＰＡＧＥ分析によって９８％を超えると推測された。
【００７３】
【表３】

【００７４】
精製されたＩｇＧ１調製物の，修飾したＭＤＡ及び修飾していないペプチドに対する反応性をＥＬＩＳＡで試験し（図５），その後，インビトロ(in vitro)及びインビボ(in vivo)研究における機能(functional)に使用した。図５のグラフは，２５ｎｇの精製したＩｇＧについてウサギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ Ｐ２１４）を用い，７００ｎｍでの発光で検出した結果を示す。プレートには０．５μｇ／ウェルのＬＤＬをコーティングした。
【００７５】
実施形態５
抗体の可能な抗アテローム発生効果を，実験動物において及び細胞培養研究において実行する。
１．アポリポ蛋白質Ｅノックアウト（ＡｐｏＥ）マウスにおける粥状動脈硬化に対する抗体の効果
５週齢のＡｐｏＥ−マウスに高コレステロール食を１５週間与える。この処理は大動脈及び頚動脈中にかなりの量の粥状動脈硬化のプラークを生じる事が知られている。その後，マウスに，前記で確認された各抗体５００μｇを含む腹膜腔内注射を行なう。対照マウスには，無関係の対照抗体またはＰＢＳのみを５００μｇ与える。処理を１及び２週後に繰り返す。マウスは最初の抗体注射から４週間後に犠牲にする。大動脈中の粥状動脈硬化の深刻さを，平面調製物のオイルレッドＯ染色により及び弁下の粥状動脈硬化のプラークのサイズを決定することによって決定する。弁下の粥状動脈硬化のプラークのコラーゲン，大食細胞及びＴ細胞含有量を，マッソン(Masson)の三色染色及び細胞特異的免疫組織化学によって決定する。オイルレッドＯ染色，弁下のプラークのサイズ，三色染色及び免疫組織化学染色の定量化はコンピューターベースの画像分析を使用して行われる。
【００７６】
最初の実験において，粥状動脈硬化の進行に対する抗体の効果が，高コレステロール食を与えたＡｐｏＥ−／マウスについて分析された。マウスは，対照としてＰＢＳを使用して，２１週齢で開始して，１週毎３回の抗体０．５ｍｇの腹膜腔内注射を行った。最後の抗体注射から２週間で犠牲にし，粥状動脈硬化の範囲を，下行大動脈の平面プレパレーションのオイルレッドＯ染色によって評価した。明白な効果が，ＩＥＩ−Ｅ３抗体で処理したマウスに見られ，これは，ＰＢＳグループ（Ｐ＝０．０２）及び非関連のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抗原を指向するヒトＩｇＧ１抗体（ＦＩＴＣ８）を受けた対照群（Ｐ＝０．０３）（図６）と比較して，粥状動脈硬化の５０％以上の減少であった。マウスはヒト抗体をよく許容し，また，マウスの一般的な健康状態に対する影響がないことが明白であった。
【００７７】
粥状動脈硬化に対するＩＥＩ−Ｅ３抗体の抑制効果を確認するために，我々は用量依存性の研究を実施した。スケジュールは最初の研究と同一であった。ＩＥＩ−Ｅ３抗体で処理したマウスにおいては，対応するＦＩＴＣ抗体で処理したグループ（図７）と比較して，粥状動脈硬化が０．２５ｍｇ群で２％（ｎ．ｓ．），０．５ｍｇ群で２５％，及び２．０ｍｇ群で４１％（Ｐ＝０．０２）減少した。
【００７８】
２．ＡｐｏＥ−マウスの頚動脈の機械的な損傷に続く新内膜形成に対する抗体の効果
動脈の機械的な損傷は３週以内に線維性筋性の新脈管内膜のプラークの発達をもたらす。このプラークは線維筋性粥状動脈硬化のプラークに形態学的に似ており，生じた傷害の進行の研究に一つのモデルとして使用されてきた。頚動脈のまわりにプラスチックのカラーを置いて機械的な傷を引き起こす。５週齢のＡｐｏＥ−マウスに１４週間高コレステロール食を与える。その後，マウスは，それぞれの抗体５００μｇを含む腹膜腔内注射を行う。対照マウスには，無関係の対照抗体またはＰＢＳ５００μｇを単独で与える。７日後にこの処置を繰り返し，１日後にプラスチックカラーの手術による配置を行う。抗体またはＰＢＳの最後の注射は，手術後６日目に行い，その後，１５日後に動物を犠牲にした。傷つけられた頚動脈を固定し，パラフィンに埋め込み，切片とした。新脈管内膜のプラークの大きさをコンピューターベースの画像分析を使用して測定する。
【００７９】
３．培養されたヒトマクロファージ中の酸化ＬＤＬの取り込みに対する抗体の効果
コレステロールを負荷したマクロファージ泡沫細胞の形成に結びつく動脈マクロファージ中の酸化ＬＤＬの取り込みは，粥状動脈硬化のプラークの最も特徴的な性質の一つである。いくつかのラインの証拠は，動脈マクロファージにおける酸化ＬＤＬの取り込みを阻害することが，粥状動脈硬化の治療の可能なターゲットを表わすことを提案する。酸化したｃのマクロファージ取り込みに対する抗体の効果を研究するために，^１２５Ｉで標識したヒト酸化ＬＤＬと共に２時間プレインキュベートする。ヒトマクロファージは献血者のバッフィコートからフィコールハイパック(Ficoll hypaque)中に遠心分離により単離し，その後，１０％の血清の存在下で６日間培養する。この細胞を，その後，抗体／酸化ＬＤＬ複合体を含む培地で６時間インキュベートし，洗浄し，ガンマカウンター中で細胞に関連する放射活性を測定した。ＩＥＩ−Ｅ３抗体の添加により，酸化ＬＤＬの結合（Ｐ＝０．００１）及びマクロファージへの取り込み（Ｐ＝０．００４）は ＦＩＴＣ−８と比較して５倍増加する結果となったが，天然のＬＤＬの結合または取り込みには効果がなかった（図８Ａ及び８Ｂ）。
【００８０】
４．酸化ＬＤＬ依存の細胞毒性に対する抗体の効果
酸化ＬＤＬは高度に細胞毒性である。粥状動脈硬化のプラーク中の炎症活性の多くが酸化ＬＤＬによって引き起こされた細胞障害によって説明されると信じられている。酸化ＬＤＬ細胞毒性の抑制は，このように粥状動脈硬化の治療の別の可能なターゲットを表わす。酸化ＬＤＬ細胞毒性に対する抗体の効果を研究するために，培養したヒト動脈平滑筋細胞を，増加する濃度（０〜２００ｎｇ／ｍｌ）の抗体の存在下で１００ｎｇ／ｍｌの酸化ＬＤＬに４８時間露呈する。細胞損傷率を，酵素ＬＤＨの放出を測定することにより測定する。
【００８１】
示された実験は，特定のペプチドに対して産生される特定の抗体の効果を示すが，当業者には，開示されたペプチドに対する他の抗体が同様に作用することが明らかである。
【００８２】
本発明の抗体は，受動免疫感作のための医薬組成物に使用され，これにより医薬組成物は，第一に，単一の抗体または抗体混合物を，治療的または予防的に有効なレベルを処理される個体に提供する投与量の，溶液，懸濁液または乳濁液を含む注射用のものが意図される。該組成物は，抗体または抗体混合物の吸収を強化する一般的に使用されるアジュバントと共に提供され得る。他の投与経路は，吸入することができる補形薬と組み合わせた抗体／抗体混合物を吸入することにより経鼻であり得る。
【００８３】
そのような医薬組成物は，有効な抗体を，０．５〜９９．５重量％，または５〜９０重量％，または１０〜９０重量％，または２５〜８０重量％，または４０〜９０重量％含有し得る。
【００８４】
抗体の１日投与量またはブースター量は，受動免疫感作経由で粥状動脈硬化の兆候及び症状を減少または予防するために治療される個体に治療的または予防的に有効なレベルで提供される。本発明による抗体の投与量は，体重ｋｇ当たり１μｇ〜１ｍｇ，またはそれ以上であり得る。
【００８５】
この抗体組成物には，β受容体遮断薬，カルシウム拮抗薬，利尿薬及び他の抗高血圧薬のような降圧剤のような粥状動脈硬化また心臓血管の疾病を治療または予防するための他の医薬を補ってもよい。
【００８６】
図９は，ＭＤＡ修飾ＡｐｏＢ１００誘導ペプチド及び非関連の配列のＭＤＡ修飾対照ペプチドに対する単離されたｓｃＦｖの結合を示す。また，修飾ＭＤＡ及び天然型ＡｐｏＢ１００蛋白質及びヒトＬＤＬへのｓｃＦｖの結合の比率が示されている。カラムは，それぞれの副図の右欄で上から下へ定義した順番で出現する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポリポ蛋白質Ｂの酸化フラグメントを指向する抗体またはその抗体フラグメントであって，
該酸化フラグメントがＩＥＩＧＬＥＧＫＧＦＥＰＴＬＥＡＬＦＧＫであり，
該抗体または抗体フラグメントが，
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT
CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCAACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCC
AGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCA
GACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC
AAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTAGGCCGGTA
TAACTGGAAGACGGGGCATGCTTTTGATATCTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGC
TCA（配列番号２１）及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）：
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCT
CCTGCTCTGGAAGGACCTACAACATTGGAAATAATTATGTATCGTGGTATCAGCAGCTCCC
AGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGAC
CGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCG
AGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGTCAGGCTGAATGGTTGGGTGTTCGG
CGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号２２）
を含むことを特徴とする抗体または抗体フラグメント。
【請求項２】
アポリポ蛋白質Ｂの酸化フラグメントを指向する少なくとも一つの単離されたヒト抗体またはその抗体フラグメントの，受動免疫感作による粥状動脈硬化の治療または予防的処置のための医薬組成物の製造における使用であって，
該酸化フラグメントがＩＥＩＧＬＥＧＫＧＦＥＰＴＬＥＡＬＦＧＫであり，
該抗体または抗体フラグメントが，
可変重鎖領域（Ｖ_Ｈ）：
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT
CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCAACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCC
AGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATATACTACGCA
GACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC
AAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTAGGCCGGTA
TAACTGGAAGACGGGGCATGCTTTTGATATCTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGC
TCA（配列番号２１）及び
可変軽鎖領域（Ｖ_Ｌ）：
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCT
CCTGCTCTGGAAGGACCTACAACATTGGAAATAATTATGTATCGTGGTATCAGCAGCTCCC
AGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGAC
CGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCG
AGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGTCAGGCTGAATGGTTGGGTGTTCGG
CGGAGGAACCAAGCTGACGGTCCTAGGT（配列番号２２）
を含むことを特徴とする使用。
【請求項３】
前記フラグメントが，マロンデアルデヒド（malone dealdehyde）を用いて酸化されている請求項２記載の使用。
【請求項４】
前記フラグメントが，銅を用いて酸化されている請求項２または３記載の使用。
【請求項５】
ＡｐｏＢ１００に由来した酸化された，特にＭＤＡ修飾されたペプチドに対する特異的なヒト抗体フラグメントを生成させるフラグメントライブラリーを使用し，これにより同定された望ましい性質を有する抗体フラグメントを，完全長ヒト免疫グロブリン中に再構築する，治療に使用するための請求項１記載の抗体またはその抗体フラグメントの製造方法。
【請求項６】
医薬に使用するための請求項１記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項７】
使用されるプライマーが下記のものであるＰＣＲ増幅を用いて，選択されたｓｃＦｖの可変部をコードする遺伝子の完全長ヒトＩｇＧ１ベクターへの移入を含む組換え技術を使用する請求項１記載の抗体またはその抗体フラグメントの遺伝子の増幅方法：
ＶＨ−セグメントの増幅用のプライマー:
5'VH: 5'-GGTGTGCATTCCGAGGTGCAGCTGTTGGAG （配列番号１３）
3'VH: 5'-GACGTACGACTCACCTGAGCTCACGGTGACCAG（配列番号１４）及び
ＶＬ−セグメントの増幅用のプライマー：
5'VL: 5'-GGTGTGCATTCCCAGTCTGTGCTGACTCAG （配列番号１５）
3'VL: 5'-GACGTACGTTCTACTCACCTAGGACCGTCAGCTT（配列番号１６）。
【請求項８】
可変重鎖領域及び可変軽鎖領域挿入物を有する重鎖領域及び軽鎖領域プラスミドを含むコロニーを，フォワードプライマー: 5'-ATGGGTGACAATGACATC （配列番号１７），リバースプライマー:5'-AAGCTTGCTAGCGTACG（配列番号１８）を用いるコロニーＰＣＲにより確認する請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項１記載の抗体またはその抗体フラグメントを含む受動免疫による粥状動脈硬化の治療または予防のための医薬組成物であって，該抗体が医薬用の賦形剤と組み合わせて存在する医薬組成物。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図１Ｃ】

【図１Ｄ】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図２Ｃ】

【図２Ｄ】

【図２Ｅ】

【図２Ｆ】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図３Ｄ】

【図３Ｅ】

【図３Ｆ】

【図３Ｇ】

【図３Ｈ】

【図３Ｉ】

【図３Ｊ】

【図３Ｋ】

【図３Ｌ】

【図３Ｍ】

【図３Ｎ】

【図３Ｏ】

【図３Ｐ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図９】

【公開番号】特開２０１０−１３６７２１（Ｐ２０１０−１３６７２１Ａ）
【公開日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７９４（Ｐ２０１０−１７９４）
【出願日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【分割の表示】特願２００５−５００９６１（Ｐ２００５−５００９６１）の分割
【原出願日】平成１５年１０月６日（２００３．１０．６）
【出願人】（５０７４１３１８１）バイオインベント　インターナショナル　アクチボラゲット (4)
【Ｆターム（参考）】