糖タンパク質の試料調製方法および分析方法
【課題】 糖タンパク質含有試料から糖鎖を遊離することなく糖タンパク質を分離する糖タンパク質の試料調製方法を提供する。
【解決手段】糖タンパク質含有試料を酸化して糖タンパク質に含まれる−ＣＨ2ＯＨを−ＣＨＯに酸化する工程、前記酸化糖タンパク質含有試料を−ＣＨＯと結合しうる反応基を有するポリマー粒子と反応させ、糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を得る工程、前記糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を洗浄する工程、前記洗浄した糖タンパク質−ポリマー粒子結合体から糖タンパク質を遊離する工程とからなる、糖タンパク質の試料調製方法である。
【解決手段】糖タンパク質含有試料を酸化して糖タンパク質に含まれる−ＣＨ2ＯＨを−ＣＨＯに酸化する工程、前記酸化糖タンパク質含有試料を−ＣＨＯと結合しうる反応基を有するポリマー粒子と反応させ、糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を得る工程、前記糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を洗浄する工程、前記洗浄した糖タンパク質−ポリマー粒子結合体から糖タンパク質を遊離する工程とからなる、糖タンパク質の試料調製方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖が付加されたペプチドの分析方法に関し、より詳細には、糖タンパク質から糖鎖を遊離せずに糖タンパク質の試料を調製する方法、およびこのようにして得られた糖タンパク質を分析する方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテオミクスやグライコミクスなどの発展に伴い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳやＬＣ／ＭＳによる分析が活発化し、種々のタンパク質や糖鎖、その他の分析結果がデータベース化されている。試料タンパク質や糖質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳやＬＣ／ＭＳのデータとデータベースに収納されたデータとを対比させることで、短時間に試料タンパク質や糖質を同定することができる。
【０００３】
このようなＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳやＬＣ／ＭＳによって分析しうる試料として、糖タンパク質がある。糖タンパク質の生合成において、糖鎖は、タンパク質が翻訳される際に、または翻訳後に付加されるため、糖タンパク質の糖鎖構造が疾患や加齢、遺伝的背景による影響を受ける可能性があり、実際、腫瘍と特定の糖タンパク質との関係なども見出されている。このため、糖鎖をシグナルとして、診断や治療へ応用されることが期待されている。糖タンパク質には、糖鎖がアスパラギンに結合したＮ−結合型、糖鎖がセリンやスレオニン、ヒドロキシリジンなどに結合したＯ−結合型などが存在する。
【０００４】
このような糖タンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳやＬＣ／ＭＳで分析する方法として、糖タンパク質からエンド型グリコシダーゼを使用して糖鎖を遊離させ、遊離した糖鎖を解析する方法がある（特許文献１)。未精製糖タンパク質をＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、泳動後のゲルから該当糖タンパク質部分を分取し、ペプチド：Ｎ−グリカナーゼ処理して糖鎖をタンパク質部分と切断して遊離させる。糖鎖はアルデヒド基を有するため、遊離糖鎖とヒドラジド基を官能基とするポリマー粒子とを反応させると、アルデヒド基とヒドラジド基とのヒドラゾン結合によって糖鎖がポリマー粒子に結合され、ついで、Ｎ−アミノオキシアセチルトリプトファニルアルギニンメチルエステルを反応させるとポリマー粒子のヒドラジド基に結合していたアルデヒド基がＮ−アミノオキシアセチルトリプトファニルアルギニンメチルエステルのアミノオキシル基に結合するというものである。特許文献１では、このようにして得た糖鎖をマトリックスと混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を行っている。なお、上記特許文献１で使用するペプチド：Ｎ−グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅ）は、糖タンパク質や糖ペプチドからＮ型糖鎖を遊離させる酵素である。従って、Ｎ−結合型糖タンパク質の糖鎖の分析に適し、Ｏ−結合型糖タンパク質の糖鎖を分析することはできない。
【０００５】
一方、このような糖タンパク質としてコラーゲンがあり、タンパク質を構成するアミノ酸としてガラクトシルヒドロキシリジン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｘｙｌｙｓｉｎｅ： ＧＨＬ）や、グルコシルガラクトシルヒドロキシリジン（ｇｌｕｃｏｓｙｌｇａｌａｃｔｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｘｙｌｙｓｉｎｅ：ＧＧＨＬ）を含むものが存在する。コラーゲンの型、組織、生理的条件によって糖付加の割合は変化し、骨形成不全症での糖鎖の増加など、疾患との関係が報告されている。コラーゲンの糖鎖は、ヒドロキシリジンに結合するＯ−結合型糖鎖であり、このようなＯ−結合型糖タンパク質を簡便に解析する要請も高い。
【０００６】
このような、タンパク質のセリンやスレオニン残基に糖鎖が結合するＯ−結合型糖鎖を分析する方法として、酢酸酸性条件で糖鎖を遊離させる方法がある(特許文献２)。実施例では糖タンパク質を２％酢酸／アセトニトリル中で８０℃で１時間反応させて糖タンパク質から糖鎖を遊離させ、遊離した糖鎖の還元末端のアルデヒド基をそのままポリマー粒子のヒドラジド基と結合させ、ついで、ポリマー粒子にＯ−ベンジルヒドロキシルアミンを加えて２％酢酸／アセトニトリル中で８０℃で１時間加熱し、ヒドラゾン−オキシム交換反応によって糖鎖の還元末端のアルデヒド基をＯ−ベンジルヒドロキシルアミンのアミノオキシル基に結合させている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−１５６５８７号
【特許文献２】特開２００９−２１６６０９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
糖タンパク質は、生体内において細胞同士の認識や化学物質の輸送などの役割を担い、細胞膜の構成に不可欠な要素であって、その機能解明は様々な病気が起きる仕組みを明らかにしたり治療法を開発するうえで手がかりになる。細胞内のリボソームで糖タンパク質を構成するタンパク質が合成され、さらにゴルジ体に運ばれ分泌される間に糖が運び込まれて糖タンパク質となり機能するものであるから、糖鎖の解析と共にタンパク質部分の解析も重要である。しかしながら現在のところ、コラーゲンの配列解析においては、糖鎖修飾部位はペプチドシークエンサでは検出することができないため、ｃＤＮＡ配列情報、アミノ酸分析、糖鎖分析などの結果を組合わせてその部位を推定しているに過ぎない。
【０００９】
たとえば、特許文献１記載の方法は、ＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で糖タンパク質を精製したのちにＮ−グリコシダーゼ処理して糖鎖を遊離させ、遊離した糖鎖をマトリックスと混合しＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析するものである。遊離した糖鎖の解析が目的であって、糖タンパク質やタンパク質部分を解析するものではない。
【００１０】
また、特許文献２記載の方法も、特許文献１と同様に、糖タンパク質から糖鎖のみを分離し解析するものである。特に、特許文献２は、Ｏ−結合型糖鎖の切り出しに使用する無水ヒドラジンを使用したヒドラジン分解は毒性が強いこと、ヒドラジン分解で遊離された糖鎖試料には莢雑物が含まれており、ハイスループットで糖鎖を精製できる方法としてなされたものである。酢酸酸性条件で糖タンパク質から糖鎖を遊離すること、および遊離した糖鎖を酢酸酸性条件で前記ヒドラジド基含有ポリマー粒子と反応させると、糖鎖をポリマー粒子に結合させうることが特徴である。従って、当初から、糖鎖を遊離させることを目的とするものであって、特定の糖ペプチドを精製したり、タンパク質部分を解析するものではない。
【００１１】
一方、糖タンパク質のタンパク質部分を解析するには、タンパク質部分を精製する必要がある。しかしながら、糖タンパク質は、Ｎ−結合型とＯ−結合型とによってタンパク質部分の分離方法や分離能が異なる。たとえば、上記した特許文献１では、Ｎ−結合型糖タンパク質からＮ−グリコシダーゼ処理によって糖鎖を遊離するものであり、特許文献２では、Ｏ−結合型糖タンパク質を酢酸酸性条件で反応させて糖鎖を遊離するものである。従って、糖タンパク質からタンパク質部分を遊離させて分析する方法は、Ｎ−結合型とＯ−結合型とによってタンパク質部分の分離方法を変える必要があり、操作が煩雑である。
【００１２】
また、糖タンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳやＬＣ／ＭＳで分析するためには、目的とする糖タンパク質を精製する必要がある。上記特許文献１では、糖鎖を精製するために、糖鎖にヒドラジド基含有ポリマー粒子を結合させ、前記ポリマー粒子を洗浄することで莢雑物を除去しているが、糖タンパク質自体は、ＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で他と分離されるに過ぎない。特許文献２でも、糖タンパク質から遊離した糖鎖をヒドラジド基含有ポリマー粒子と結合させ、前記ポリマー粒子を洗浄することで莢雑物を除去しているが、糖タンパク質の分離は行っていない。
【００１３】
糖タンパク質は、発現率その他において、疾患と特定の関係が観察される化合物である。従って、健常者と疾患者由来の糖タンパク質を解析することで、疾患の診断ができれば便利である。特に、糖タンパク質の解析のみならず、定量できることがより好ましい。
【００１４】
上記現状に鑑み、本発明は、糖タンパク質を精製する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、精製した糖タンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで同定する方法を提供することを目的とする。
【００１５】
加えて、上記分析方法によって、疾患の診断方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、コラーゲンに含まれる糖タンパク質の分析方法について詳細に検討した結果、糖タンパク質を構成する糖鎖をガラクトースオキシダーゼ処理すると、糖タンパク質に含まれるガラクトース６位の−ＣＨ2ＯＨが−ＣＨＯに酸化され、この酸化糖タンパク質とヒドラジド基を有するポリマー粒子とを反応させると、糖タンパク質−ポリマー粒子結合体が形成されること、糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を洗浄した後に糖タンパク質とヒドラジド基との結合を切断すれば、糖タンパク質を遊離させ、糖タンパク質を高純度に精製できること、この糖タンパク質は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳにて糖タンパク質のまま分析でき、データベースと比較することで試料を同定できること、精製した糖タンパク質を標識化合物と反応させた後にＬＣ／ＭＳやＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分析することで、糖タンパク質の定量が可能となること、健常者由来の糖タンパク質と特定疾患由来の糖タンパク質とを用いてそれぞれ糖タンパク質を精製し、それぞれに異なる標識化合物と反応させた後にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析すれば、健常者と特定疾患由来の糖タンパク質の含有量を評価し、疾患を診断できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１７】
すなわち本発明は、糖タンパク質含有試料を酸化して糖タンパク質に含まれる−ＣＨ2ＯＨを−ＣＨＯに酸化する工程、前記酸化糖タンパク質含有試料を−ＣＨＯと結合しうる反応基を有するポリマー粒子と反応させ、糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を得る工程、前記糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を洗浄する工程、前記洗浄した糖タンパク質−ポリマー粒子結合体から糖タンパク質を遊離する工程とからなる、糖タンパク質の試料調製方法を提供するものである。
【００１８】
本発明は、前記糖タンパク質含有試料が、Ｏ−結合型糖タンパク質含有試料である、上記糖タンパク質の試料調製方法を提供するものである。
本発明は、前記Ｏ−結合型糖タンパク質が、コラーゲン由来であることを特徴とする、上記糖タンパク質の試料調製方法を提供するものである。
【００１９】
本発明は、前記ポリマー粒子が、ヒドラジド基含有ポリマー粒子であることを特徴とする、上記糖タンパク質の試料調製方法を提供するものである。
本発明は、上記糖タンパク質の試料調製方法で得た糖タンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析することを特徴とする、糖タンパク質の分析方法を提供するものである。
【００２０】
本発明は、上記糖タンパク質の試料調製方法で得た糖タンパク質に標識化合物を結合させ、ついでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析することを特徴とする、糖タンパク質の分析方法を提供するものである。
【００２１】
本発明は、上記糖タンパク質の試料調製方法で得た糖タンパク質をイオン化促進標識化合物と結合させ、得られた糖タンパク質−標識化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析することを特徴とする、糖タンパク質の分析方法を提供するものである。
【００２２】
本発明は、前記糖タンパク質含有試料が、健常者由来の糖タンパク質と特定疾患由来の糖タンパク質であり、上記糖タンパク質の試料調製方法で得た糖タンパク質を標識化合物と結合させ、得られた糖タンパク質−標識化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析するものであり、精製した健常者由来の糖タンパク質または特定疾患由来の糖タンパク質のいずれかに標識化合物を結合させ、他方に前記標識化合物に対応する安定同位体標識化合物を結合させ、得られた糖タンパク質−標識化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析し、前記標識化合物と前記安定同位体標識化合物との質量数の差から健常者と特定疾患由来の糖タンパク質の含有量を評価することを特徴とする、診断方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、Ｎ−結合型糖タンパク質であるか、Ｏ−結合型糖タンパク質であるかを問わず、糖タンパク質を高収率で精製し、糖タンパク質の試料を調製することができる。
【００２４】
本発明によれば、糖鎖を温和な条件で酸化して、糖タンパク質に含まれる−ＣＨ2ＯＨを−ＣＨＯに酸化できるため、安全性および再現性に優れる。
本発明によれば、既存のデータと対比することで、試料糖タンパク質の同定を簡便に行うことができる。これにより、糖鎖のみならず、タンパク質部分も分析することができる。
【００２５】
本発明によれば、健常者のデータと疾患由来の糖タンパク質の分析データとを比較することで、疾患の診断を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、実施例３のＧＯＤ酸化サンプルとＧＯＤ非酸化サンプル（コントロール）との全イオン電流クロマトグラムのチャートである。
【図２】図２は、実施例３のＧＯＤ酸化サンプルの全イオン電流クロマトグラムのチャートである。
【図３】図３は、実施例３の１５．０８１分のＭＳのチャートである。
【図４】図４は、実施例３の１５．０８１分のＭＳ／ＭＳのチャートである。
【図５】図５は、実施例４のＧＯＤ酸化サンプルとＧＯＤ非酸化サンプル（コントロール）との全イオン電流クロマトグラムのチャートである。
【図６】図６は、実施例４のＧＯＤ酸化サンプルの全イオン電流クロマトグラムのチャートである。
【図７】図７は、実施例４の１４．０７８分のＭＳのチャートである。
【図８】図８は、実施例４の１４．０７８分のＭＳ／ＭＳのチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の第一は、糖タンパク質含有試料を酸化して糖タンパク質に含まれる−ＣＨ2ＯＨを−ＣＨＯに酸化する工程、前記酸化糖タンパク質含有試料を−ＣＨＯと結合しうる反応基を有するポリマー粒子と反応させ、糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を得る工程、前記糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を洗浄する工程、前記洗浄した糖タンパク質−ポリマー粒子結合体から糖タンパク質を遊離する工程とからなる、糖タンパク質の試料調製方法である。
【００２８】
糖タンパク質含有試料に含まれる莢雑物を除去し、分析対象の糖タンパク質を分離して試料を調製する。タンパク質や核酸、脂質など糖鎖以外の生体内物質にはアルデヒド基が含まれていないため、アルデヒド基と特異的に反応するポリマー粒子と結合させることで糖タンパク質のみを選択的に捕捉し、ポリマー粒子を洗浄することで莢雑物を除去し、その後、ポリマー粒子から糖タンパク質を分離することで、糖タンパク質の試料を調製する。得られた糖タンパク質試料は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳやＬＣ／ＭＳなどで分析することができる。以下、本発明を詳細に説明する。
【００２９】
（１）糖タンパク質
本発明において、糖タンパク質とは、タンパク質を構成するアミノ酸の一部に糖鎖が結合したものをいう。糖鎖がアスパラギンのアミノ基に糖が結合するＮ−結合型や、セリンやスレオニン、ヒドロキシリジンなどの水酸基に結合するＯ−結合型などが存在するが、いずれであってもよい。従来は、Ｎ−結合型糖タンパク質、Ｏ−結合型糖タンパク質について、それぞれ糖タンパク質から結合型の相違に由来した異なる方法で糖鎖を遊離させ、ついで遊離糖鎖を分析するものであったが、本発明は、糖タンパク質から糖鎖を遊離させることなく糖タンパク質のまま分析するため、いずれの結合型であるかを問わず、試料とすることができる。
【００３０】
一方、好ましくは、Ｏ−結合型糖タンパク質である。従来の糖鎖を遊離する方法では、糖タンパク質から糖鎖を遊離することが困難であるため、Ｏ−結合型糖タンパク質の解析は、Ｎ−結合型糖タンパク質よりも遅滞していた。本発明によれば、Ｎ−結合型糖タンパク質と同様に簡便に分析できるため、特にＯ−結合型糖タンパク質に有効である。
【００３１】
本発明で好適に使用できるＯ−結合型糖タンパク質としては、Ｉ〜ＸＸＩＸ型コラーゲン；アグリカン、パールカン、シンデカン、デコリンなどのプロテオグリカン；カドヘリン；ムチンなどを例示することができる。特に好ましくは、Ｉ〜ＸＸＩＸ型コラーゲンである。糖鎖の精製や濃縮にはレクチンがよく使用されるが、コラーゲンの糖鎖に結合するレクチンは知られておらず、コラーゲン由来の糖タンパク質の精製方法や濃縮方法は存在しなかった。一方、コラーゲンは、体内に多量に存在するタンパク質であり、単一のタンパク質として精製する方法が確立しており、および糖鎖が１糖または２糖と単純であってその構造も判明しており、データベースの分析結果と対比することで、同定が容易だからである。
【００３２】
対象とする糖タンパク質の糖鎖の長さも限定されるものではない。一般には、糖が１〜２０個、好ましくは１〜１２個、特に好ましくは１〜８個、更に好ましくは１〜５個結合した糖鎖を有する糖タンパク質の精製に好適である。
【００３３】
また、糖タンパク質のタンパク質部分の長さも限定されない。ただし、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳやＬＣ／ＭＳにおいて、既存のデータと対比する場合には、タンパク質部分は対象とする糖タンパク質を特定できる限度で、短いことが好ましい。一般には、糖タンパク質をトリプシンなどによって切断されるものを好適に使用することができる。
【００３４】
（２）ポリマー粒子
本発明は、糖タンパク質含有試料を酸化して糖タンパク質に含まれる−ＣＨ2ＯＨを−ＣＨＯに酸化し、当該−ＣＨＯを介してポリマー粒子と反応させるものである。従って、ポリマー粒子としては、−ＣＨＯと結合しうる反応基を有するポリマー粒子を広く使用することができ、例えば、ヒドラジド基含有ポリマー粒子、アミノ基含有ポリマー粒子、オキシルアミノ基含有ポリマー粒子、セミチオカルバジド基含有ポリマー粒子などを好ましく使用することができる。オキシルアミノ基とアルデヒド基との反応によって生じるオキシム結合やヒドラジド基とアルデヒド基との反応によって生じるヒドラゾン結合は、酸処理などによって容易に切断されるため、ポリマー粒子によって糖タンパク質を捕捉したのち、簡便に糖タンパク質をポリマー粒子から簡単に切り離すことができる点で好ましい。
【００３５】
前記ポリマー粒子は、固体やゲル粒子であってもよい。ポリマー粒子に糖タンパク質を捕捉させたのち、遠心分離やろ過などの手段によって他と分離して回収することができる。また、ポリマー粒子をカラムに充填して用いてもよい。カラムに充填して用いる方法は、特に連続操作化に好適である。
【００３６】
ポリマー粒子の形状は特に限定しないが、球状またはそれに類する形状が好ましい。ポリマー粒子が球状の場合、平均粒径は好ましくは０．０５〜１０００μｍであり、より好ましくは０．０５〜２００μｍであり、さらに好ましくは０．１〜２００μｍであり、最も好ましくは０．１〜１００μｍである。この範囲で通液性に優れ、かつ糖タンパク質の捕捉性に優れるからである。
【００３７】
ポリマー粒子は、遠心分離やろ過などの手段で回収する時にのみ固体粒子あるいはゲル粒子であってもよい。たとえば温度、ｐＨなどの環境変化によって溶解性が変化するポリマーを用い、溶媒に溶解した状態の該ポリマーに糖鎖の−ＣＨＯと特異的に反応する官能基を介して糖鎖を捕捉させ、溶解性を変化させて該ポリマーを沈殿させ、回収してもよい。環境によって溶解性が変化するポリマーとして、たとえばポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を挙げることができる。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）分子の少なくとも一部に糖タンパク質の−ＣＨＯと特異的に反応する官能基を導入することで、上記のような糖タンパク質の捕捉が可能となる。
【００３８】
このようなポリマー粒子は、市販品であってもよい。例えば、住友ベークライト株式会社製のＢｌｏｔＧｌｙｃｏ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製のＡｆｆｉＧｅｌ ＨＺ Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ Ｇｅｌなどを使用することができる。
【００３９】
（３）糖タンパク質含有試料
本発明で使用する糖タンパク質含有試料は、上記したＮ−結合型糖タンパク質やＯ−結合型糖タンパク質それ自体でもよいが、タンパク質部分の一次構造の解析が進んでいるＯ−結合型糖タンパク質のコラーゲンを分析する場合で説明する。なお、コラーゲンのタンパク質部分を構成するアミノ酸には、ヒドロキシリジンにガラクトシル基が結合したガラクトシルヒドロキシリジン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｘｙｌｙｓｉｎｅ： ＧＨＬ）、グルコシル−ガラクトシル基が結合したグルコシルガラクトシルヒドロキシリジン（ｇｌｕｃｏｓｙｌｇａｌａｃｔｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｘｙｌｙｓｉｎｅ：ＧＧＨＬ）が存在することが知られている。
【００４０】
コラーゲンは、現在、Ｉ〜ＸＸＩＸ型が知られており、上記ＧＨＬやＧＧＨＬの含有率は、コラーゲン型によって大きく異なる。本発明で使用するコラーゲンとしてはいずれであってもよく、新たに見出されるコラーゲンであってもよい。コラーゲンは、魚や豚、牛などの生皮、腱、骨などを形成する主要タンパク質であるが、生体内に含まれる大部分は水に不溶性である。本発明では、動物の皮や骨等の原料に含まれるコラーゲンをプロテアーゼなどの酵素を添加して可溶化し、酸やアルカリを添加して可溶化したものを使用することができる。
【００４１】
更に、糖タンパク質含有試料としては、コラーゲンを、例えば、トリプシンやキモトリプシンなどでタンパク質部分をより短鎖に切断したものを使用することができる。コラーゲンはアミノ酸配列が解明されているため、タンパク質部分を分析すれば、トリプシンなどで切断した糖タンパク質がコラーゲンのいずれの部位であるかを、容易に特定することができる。更に、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動）や、等電点電気泳動とＳＤＳ−ＰＡＧＥを組み合わせた二次元電気泳動によって分離したものを糖タンパク質含有試料とすることもできる。また、泳動後のゲルを例えばクーマシーブリリアントブルーなどの染色剤を用いて染色したのち、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）などのメンブレンに転写してもよい。転写は一般的なブロッティング装置を用いて行うことができる。染色はメンブレンへの転写の後に行ってもよい。
（４）糖タンパク質の試料調製方法
本発明では、上記糖タンパク質含有試料を使用し、
糖タンパク質に含まれる−ＣＨ2ＯＨを−ＣＨＯに酸化する工程、
前記酸化糖タンパク質含有試料を−ＣＨＯと結合しうる反応基を有するポリマー粒子と反応させ、糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を得る工程、
前記糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を洗浄する工程、
前記洗浄した糖タンパク質−ポリマー粒子結合体から糖タンパク質を遊離する工程とによって糖タンパク質試料を調製することができる。
【００４２】
（ｉ）酸化工程
上記糖タンパク質を酸化して糖タンパク質に含まれる−ＣＨ2ＯＨを−ＣＨＯに酸化し、これに前記ポリマー粒子を反応させる。Ｎ−結合型の糖タンパク質にＮ−グリコシダーゼを作用させて糖鎖を分離すると、遊離した糖鎖の還元末端にアルデヒド基が生じ、このアルデヒド基を介して上記ポリマー粒子と糖鎖とが結合する。しかしながら、本発明では、糖タンパク質に含まれる６位の−ＣＨ2ＯＨを−ＣＨＯに酸化させるため、糖タンパク質から糖鎖を遊離させることなく、このアルデヒド基を介してポリマー粒子と糖タンパク質とを結合させることができる。
【００４３】
−ＣＨ2ＯＨを−ＣＨＯに酸化させる方法に限定は無いが、ガラクトースオキシダーゼを使用することが安全かつ簡便である。一般には、３７℃で６〜２４時間反応させる。
（ｉｉ）糖タンパク質−ポリマー粒子結合工程
次いで、前記酸化糖タンパク質含有試料を、−ＣＨＯと結合しうる反応基を有するポリマー粒子と反応させ、糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を得る。ポリマー粒子の添加量は、ポリマー粒子に結合される−ＣＨＯと結合しうる反応基の量によって異なり、使用するポリマー粒子の前記反応基量に応じて適宜選択することができる。一般には、室温で３〜２４時間、反応させればよい。
【００４４】
糖タンパク質を特異的に捕捉するポリマー粒子によって糖タンパク質を捕捉する際の反応系のｐＨは、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜７であり、さらに好ましくは２〜６である。ｐＨ調整のためには、各種緩衝液を用いることができる。糖鎖捕捉時の温度は、好ましくは４〜６０℃、より好ましくは１０〜５０℃、さらに好ましくは１５〜４０℃である。反応時間は適宜設定することができる。ポリマー粒子をカラムに充填して試料溶液を通過させてもよい。
【００４５】
（ｉｉｉ）洗浄工程
糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を洗浄することで、糖タンパク質含有試料に含まれる糖タンパク質以外の成分を除去することができる。洗浄液は、糖タンパク質−ポリマー粒子結合体から糖タンパク質を切断せず、かつ莢雑物と親和性を有するものを広く使用することができる。たとえば、水、緩衝液、有機溶媒、界面活性剤を含む水または緩衝液などを適宜組み合わせて用いることが好ましい。特に好ましい形態は、界面活性剤を含む水または緩衝液で十分に洗浄したのち、有機溶剤で洗浄し、最後に水で洗浄する方法である。これらの洗浄により、非特異的吸着物がポリマー粒子表面から除去される。
【００４６】
なお、ポリマー粒子に存在する−ＣＨＯと結合しうる反応基をキャップすることが好ましい。例えば、ポリマー粒子が−ＣＨＯと結合しうる反応基としてヒドラジド基を有する場合には、ポリマー粒子を洗浄した後に、無水酢酸を添加し、室温で３０分間反応させる。その後、再度、ポリマー粒子を洗浄することが好ましい。
【００４７】
（iｖ）糖タンパク質遊離工程
糖タンパク質−ポリマー粒子結合体から糖タンパク質を遊離させることで、糖タンパク質を精製し、純度の高い糖タンパク質試料とすることができる。
【００４８】
遊離方法は、ポリマー粒子の前記反応基の種類に応じて適宜選択することができるが、糖タンパク質とポリマー粒子との結合以外を切断するものであってはならない。本発明では、揮発性酸処理により糖タンパク質をポリマー粒子から分離することができる。このような揮発性酸によれば、糖タンパク質をポリマー粒子から分離できると共に、脱塩等の必要なくそのままＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳ分析を行うことができるからである。本発明で使用できる揮発性酸としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、塩酸などを例示することができる。ギ酸処理の場合は、例えば、濃度０．１〜１質量％のギ酸溶液で温度６０〜８０℃で、０．５〜２時間、より好ましくは０．１〜１時間反応させる。
【００４９】
（５）ＬＣ／ＭＳ分析
本発明では、上記で調製した糖タンパク質試料をＬＣ／ＭＳ分析し、糖タンパク質を同定することができる。ＬＣ／ＭＳの分析結果を、各種サンプルの分析結果を集積したデータベースと比較することで、糖鎖修飾部位を推定することができる。
【００５０】
さらに、上記糖タンパク質試料をそのまま使用するほか、例えば糖タンパク質の前記−ＣＨＯにヒドラジン（Ｈ2ＮＮＨ2）や重水素処理ヒドラジン（Ｄ2ＮＮＤ2）を結合して標識すれば、質量数が２異なる位置にピークが出現することを利用し、サンプル間での比較定量を行うことができる。このように、一方に標識化合物を、他方に前記標識化合物に対応する安定同位体標識化合物を結合することで、質量数の違いによるサンプル間の比較定量を行う事ができる。安定同位体としては、重水素（Ｄ）のほか、13Ｃや、15Ｎ、18Ｏ等を例示することができる。
【００５１】
また、標識化合物として、ヒドラジンのほか、ヒドラジド基を含む物質として、ジラール試薬Ｐ（ピリジニウム−１−アセトヒドラジド・クロリド）、ジラール試薬Ｔ（ベタインヒドラジド・ヒドロクロライド）、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルフォニルヒドラジン（ダンシルヒドラジン）；２−ヒドラジノピリジン；９−フルオレニルメチルカルバゼート（Ｆｍｏｃ ヒドラジン）；ベンジルヒドラジン；４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオノ酸，ヒドラジド；２−（６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン）アセトヒドラジン；７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボキシリック酸；ヒドラジン（ＤＣＣＨ）；フェニルヒドラジン；１−ナフタレンアセトヒドラジン；２−ヒドラジノベンゾイックアシド；フェニルアセチックヒドラジン；ビオチンヒドラジンなどがある。また、−ＣＨＯと反応する反応基として、アミノオキシ基がある。アミノオキシ基を含む物質として、Ｏ−ベンジルヒドロキシアミン；Ｏ−フェニルヒドロキシルアミン；Ｏ−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）ヒドロキシルアミン；Ｏ−（４−ニトロベンジル）ヒドロキシルアミン；２−アミノオキシピリジン；２−アミノオキシメチルピリジン；４−［（アミノオキシアセチル）アミノ］ベンゾイックアシドメチルエステル；４−［（アミノオキシアセチル）アミノ］ベンゾイック酸エチルエステル；４−［（アミノオキシアセチル）アミノ］ベンズアミノ酸ｎ−ブチルエステル；アミｋノオキシ−ビオチンなどを例示することができる。
【００５２】
更に、このような標識として、ジラール試薬Ｐや重水素処理ジラール試薬Ｐなどの標識化合物を使用すれば、ヒドラジンと同様に−ＣＨＯと反応して糖タンパク質に結合する標識となり、上記と同様に質量数が５異なる位置にピークが出現することを利用してサンプル間で比較定量を行うことができる。かつベンゼン環の中に４級アミンが含まれるためＭＳでのイオン化が促進され、感度を向上させることもできる。
【００５３】
このような標識化合物は、糖タンパク質の１．５質量倍以上、より好ましくは３質量倍以上、さらに好ましくは５質量倍以上である。ｐＨ調整のためには、各種緩衝液を用いることができる。反応系の温度は，好ましくは４〜９０℃、より好ましくは４〜７０℃、さらに好ましくは３０〜８０℃であり、最も好ましくは４０〜８０℃である。
【００５４】
（６）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析
本発明では、上記した糖タンパク質の試料調製方法で得た糖タンパク質をそのまま用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を行うことができる。また、ＬＣ／ＭＳ分析の試料と同様に、例えば糖タンパク質の前記−ＣＨＯにヒドラジン（Ｈ2ＮＮＨ2）や重水素処理ヒドラジン（Ｄ2ＮＮＤ2）を結合して標識して試料とすることができる。更に、ジラール試薬Ｐや重水素処理ジラール試薬Ｐ、その他の標識化合物を付加して試料とすることができる。これにより、高感度にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を行うことができる。
【００５５】
本発明では、上記で調製した糖タンパク質試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析し、糖タンパク質を同定することができる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの分析結果を、各種サンプルの分析結果を集積したデータベースと比較することで、糖鎖修飾部位を推定することができる。
【００５６】
（７）診断方法
本発明の診断方法は、糖タンパク質含有試料を使用し、健常者由来の糖タンパク質と特定疾患由来の糖タンパク質との質量の差から、糖タンパク質を定量し、疾患を診断するものである。
【００５７】
上記した糖タンパク質の試料調製方法で得た糖タンパク質を標識化合物と結合させ、得られた糖タンパク質−標識化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析するものであり、精製した健常者由来の糖タンパク質または特定疾患由来の糖タンパク質のいずれかに標識化合物を結合させ、他方に前記標識化合物に対応する安定同位体標識化合物を結合させる。得られた糖タンパク質−標識化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析すると、標識化合物と前記標識化合物に対応する安定同位体標識化合物との質量数の差から健常者と特定疾患由来の糖タンパク質の含有量を評価することができる。
【実施例】
【００５８】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
ＬＣ／ＭＳ測定条件
１．装置
高速液体クロマトグラフ：１２００ Ｓｅｒｉｅｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、
質量分析装置：３２００ＱＴＲＡＰ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）
２．ＧＨＬ、ＧＧＨＬの測定
（ｉ）ＨＰＬＣ条件
分析カラム：ＺＩＣ−ＨＩＬＩＣ ５μｍ， ２．１ｍｍｉ．ｄ．×１５０ｍｍ（ＳｅＱｕａｎｔ）、
移動相：Ａ液；０．１％酢酸、５ｍＭ 酢酸アンモニウム、
Ｂ液；１００％アセトニトリル、
グラジエント条件：０−５分：Ａ液１０％、５−１０分：Ａ液１０−５０％、１０−２５分：Ａ液５０−８０％、２５．１−３０分：Ａ液１０％、
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ、
カラム温度：４０℃、
注入量：１０μｌ、
（ｉｉ）質量分析条件
イオン化：ＥＳＩ、ポジティブ、
分析モード：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＭＲＭ）モード、
イオンスプレー電圧：４．５ｋＶ、
イオンソース温度：６００℃、
検出チャンネル（ｍ／ｚ）：ＧＨＬ ３２５．１→１６３．２、酸化ＧＨＬ ３２３．１→１６３．２、
ＧＧＨＬ ４８７．２→１６３．３、酸化ＧＧＨＬ ４８５．２→１６３．３、
３．コラーゲン糖タンパク質の測定
（ｉ）ＨＰＬＣ条件
分析カラム：Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ ２．７mｍ， ２．１ｍｍｉ．ｄ．×１５０ｍｍ（ＳＵＰＥＬＣＯ）、
移動相：Ａ液；０．１％ギ酸、Ｂ液；１００％アセトニトリル、
グラジエント条件：０−５分：Ａ液９８％、５−２０分：Ａ液９８−５０％、２０．１−２５分：Ａ液１０％、２５．１−３０分：Ａ液９８％、
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ、
カラム温度：２５℃、
注入量：１０μｌ
（ｉｉ）質量分析条件
イオン化：ＥＳＩ、ポジティブ、
分析モード：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ（ＩＤＡ）モード、
イオンスプレー電圧：５．５ｋＶ、
イオンソース温度：６００℃、
データベース検索ソフト：ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔソフトウェア３．０（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）
（実施例１）
ガラクトシルヒドロキシリジン（ＧＨＬ）１０ｎｍｏｌを、１００ｍＭ リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２溶液に溶解し、ついで、ガラクトースオキシダーゼ（ＳＩＧＭＡ社製、商品名「ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ」）を５０単位添加し、３７℃で２４時間処理した。この一部を採取し、溶液Ａとした。
【００５９】
その後、反応溶液をｐＨ５．５に調整し、ヒドラジドゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、商品名「ＡｆｆｉＧｅｌ ＨＺ Ｈｙｄｒａｚｉdｅ Ｇｅｌ」）を２５０ｍｇ添加し、室温で６時間、転倒攪拌した。ついで、ヒドラジドゲルを、１００ｍＭ 酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５溶液１ｍｌで３回洗浄した後、１％ギ酸２００μｌを添加し、８０℃で１時間反応した。この一部を採取し、溶液Ｂとした。
【００６０】
一方、ガラクトシルヒドロキシリジン（ＧＨＬ）１０ｎｍｏｌを、１００ｍＭ リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２溶液に溶解し、３７℃で２４時間処理した。この一部を採取し、対照溶液Ａとした。その後、反応溶液をｐＨ５．５に調整し、ヒドラジドゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、商品名「ＡｆｆｉＧｅｌ ＨＺ Ｈｙｄｒａｚｉdｅ Ｇｅｌ」）を２５０ｍｇ添加し、室温で６時間、転倒攪拌した。ついで、ヒドラジドゲルを、１００ｍＭ 酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５溶液１ｍｌで３回洗浄した後、１％ギ酸２００μｌを添加し、８０℃で１時間反応した。この一部を採取し、対照溶液Ｂとした。
【００６１】
得られた溶液Ａ、溶液Ｂ、対照溶液Ａ、対照溶液ＢをそれぞれＬＣ／ＭＳ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製、商品名「３２００ＱＴＲＡＰ」）にて、ＧＨＬと酸化ＧＨＬの強度を上記測定条件にて測定した。ＧＨＬと酸化ＧＨＬの強度および対照溶液Ａに対する％、溶液Ａに対する％の結果を表１に示す。
【００６２】
表１より、対照溶液ＡのＧＨＬ強度に対する溶液ＡのＧＨＬ強度は、１．６％であり、ガラクトースオキシダーゼによる酸化反応率は、９８．４％（＝１００−１．６）となった。また、溶液Ａの酸化ＧＨＬの強度に対する溶液Ｂの酸化ＧＨＬの強度で示される、酸化ＧＨＬの回収率は、４０１０００×１００／９２２０００＝４３．５％であった。
【００６３】
【表１】
（実施例２）
グルコシルガラクトシルヒドロキシリジン（ＧＧＨＬ）１０ｎｍｏｌを、１００ｍＭ リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２溶液に溶解し、ついで、ガラクトースオキシダーゼを５０単位添加し、３７℃で２４時間処理した。この一部を採取し、溶液Ａとした。
【００６４】
その後、反応溶液をｐＨ５．５に調整し、ヒドラジドゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、商品名「ＡｆｆｉＧｅｌ ＨＺ Ｈｙｄｒａｚｉdｅ Ｇｅｌ」）を２５０ｍｇ添加し、室温で６時間、転倒攪拌した。ついで、ヒドラジドゲルを、１００ｍＭ 酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５溶液１ｍｌで３回洗浄した後、１％ギ酸２００μｌを添加し、８０℃で１時間反応した。この一部を採取し、溶液Ｂとした。
【００６５】
一方、グルコシルガラクトシルヒドロキシリジン（ＧＧＨＬ）１０ｎｍｏｌを、１００ｍＭ リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２溶液に溶解し、３７℃で２４時間処理した。この一部を採取し、対照溶液Ａとした。その後、反応溶液をｐＨ５．５に調整し、ヒドラジドゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、商品名「ＡｆｆｉＧｅｌ ＨＺ Ｈｙｄｒａｚｉdｅ Ｇｅｌ」）を２５０ｍｇ添加し、室温で６時間、転倒攪拌した。ついで、ヒドラジドゲルを、１００ｍＭ 酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５溶液１ｍｌで３回洗浄した後、１％ギ酸２００μｌを添加し、８０℃で１時間反応した。この一部を採取し、対照溶液Ｂとした。
【００６６】
得られた溶液Ａ、溶液Ｂ、対照溶液Ａ、対照溶液ＢをそれぞれＬＣ／ＭＳ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製、商品名「３２００ＱＴＲＡＰ」）にて、ＧＧＨＬと酸化ＧＧＨＬの強度を上記条件で測定した。ＧＧＨＬと酸化ＧＧＨＬの強度および対照溶液Ａに対する％、溶液Ａに対する％の結果を表２に示す。
【００６７】
表２より、対照溶液ＡのＧＧＨＬ強度に対する溶液ＡのＧＧＨＬ強度は、８８．９％であり、ガラクトースオキシダーゼによる酸化反応率は、１１．１％（＝１００−８８．９）となった。
【００６８】
また、溶液Ａの酸化ＧＧＨＬの強度に対する溶液Ｂの酸化ＧＧＨＬの強度で示される、酸化ＧＧＨＬの回収率は、２２９００×１００／５２９００＝４３．３％であった。
【００６９】
【表２】
（実施例３）
（１）脱脂した牛皮に４０倍量（ｗ／ｖ）の０．５Ｍ酢酸を添加し、２〜３時間攪拌させて牛皮を十分に膨潤させ、ポリトロンホモジナイザーで牛皮をホモジナイズした。ペプシン量が組織の１／２０量になるように、組織の１０倍量のペプシン−０．５Ｍ酢酸を加えて一晩保持した後、遠心分離した。上清に終濃度１Ｍとなるように塩化ナトリウムを加えて塩析させ、遠心分離により沈殿を回収した。沈殿を最初に水、次に５ｍＭ酢酸に対して透析した後、リン酸緩衝液でｐＨ７．５に調整して等電点沈殿させた。さらに沈殿を５ ｍＭ酢酸に対して透析し、フィルター濾過してＩ型コラーゲンを得た。
【００７０】
このＩ型コラーゲン１ｍｇを１００ｍＭ リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２溶液で６０℃、３０分加熱処理して変性させ、トリプシン（ＳＩＧＭＡ社製、商品名「Ｔｒｙｐｓｉｎ」）５０μｇを投与し、３７℃、１６時間処理した。トリプシン処理後、トリプシンインヒビター（ＳＩＧＭＡ社製、商品名「Ｔｒｙｐｓｉｎ−ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」）を１００μｇ添加し、ついで、ガラクトースオキシダーゼを５０単位添加し、３７℃で２４時間処理した。その後、反応溶液をｐＨ５．５に調整し、ヒドラジドゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、商品名「ＡｆｆｉＧｅｌ ＨＺ Ｈｙｄｒａｚｉdｅ Ｇｅｌ」）２５０ｍｇを添加し、室温で６時間、転倒攪拌した。
【００７１】
ついで、ヒドラジドゲルを、１００ｍＭ酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５溶液、１．５Ｍ ＮａＣｌ、メタノール、蒸留水の順に洗浄した後、１％ギ酸２００μｌを添加し、８０℃で１時間反応した。
【００７２】
得られた反応液をＬＣ／ＭＳにて上記条件で分析した。全イオン電流クロマトグラムを図１に示す。なお、ガラクトースオキシダーゼで酸化しないサンプルについて同様に操作した。ＧＯＤ酸化サンプルとＧＯＤ非酸化サンプル（コントロール）とを同一チャートに示す。
【００７３】
また、ＧＯＤ酸化サンプルの全イオン電流クロマトグラムを図２に示す。図２の１５．０８１分のピークのＭＳ分析の結果を図３に、ＭＳ／ＭＳ分析の結果を図４に示す。ＭＳ／ＭＳの結果から、データベース検索ソフト（ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔソフトウェア３．０（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ））で検索したところ、下記配列がヒットした。この同定された糖鎖修飾部位は、これまでに報告されている部位と一致するものである。なお、配列表の配列番号１において、右から４番目のリジンがＧＨＬとして同定された。
【００７４】
(実施例４)
ウシの大腿骨から軟骨をメスで削りとり、１０％塩化ナトリウムで洗浄した後、組織の９．９倍量の０．１Ｎ塩酸に浸して一晩置いた。氷冷しながらポリトロンホモジナイザーでホモジナイズし、ペプシン量が組織の１／１００量となるように組織と等量のペプシン０．１Ｎ塩酸を加え、一晩攪拌して可溶化処理を行った。遠心分離により得た上清を１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整して等電点沈殿させ、遠心分離して沈殿を回収した。得られた沈殿の量に対して１０倍量の０．０１Ｎ塩酸を加えて溶解し、そこに１０％濃度となるように塩化ナトリウムを加えて塩析させ、遠心分離により沈殿を回収した。沈殿を最初に水、次に５ｍＭ酢酸に対して透析した後、フィルター濾過してＩＩ型コラーゲンを得た。
【００７５】
このＩＩ型コラーゲン１ｍｇを１００ｍＭ リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２溶液で６０℃、３０分加熱処理して変性させ、トリプシン５０μｇを投与し、３７℃、１６時間処理した。トリプシン処理後、トリプシンインヒビター（ＳＩＧＭＡ社製、商品名「Ｔｒｙｐｓｉｎ−ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」）を１００μｇ添加し、ついで、ガラクトースオキシダーゼを５０単位添加し、３７℃で２４時間処理した。その後、反応溶液をｐＨ５．５に調整し、ヒドラジドゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、商品名「ＡｆｆｉＧｅｌ ＨＺ Ｈｙｄｒａｚｉdｅ Ｇｅｌ」）２５０ｍｇを添加し、室温で６時間、転倒攪拌した。
【００７６】
ついで、ヒドラジドゲルを、１００ｍＭ酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５溶液、１．５Ｍ ＮａＣｌ、メタノール、蒸留水の順にした後、１％ギ酸２００μｌを添加し、８０℃で１時間反応した。
【００７７】
得られた反応液をＬＣ／ＭＳにて上記条件で分析した。全イオン電流クロマトグラムを図５に示す。なお、ガラクトースオキシダーゼで酸化しないサンプルについて同様に操作した。ＧＯＤ酸化サンプルとＧＯＤ非酸化サンプル（コントロール）とを同一チャートに示す。
【００７８】
また、ＧＯＤ酸化サンプルの全イオン電流クロマトグラムを図６に示す。図６の１４．０７８分のピークのＭＳ分析の結果を図７に、ＭＳ／ＭＳ分析の結果を図８に示す。ＭＳ／ＭＳの結果から、データベース検索ソフト（ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔソフトウェア３．０（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ））で検索したところ、下記配列がヒットした。この同定された糖鎖修飾部位は、従来知られているものではなかった。なお、配列表の配列番号２において、左から９番目のリジンがＧＨＬとして同定された。
【００７９】
(実施例５)
実施例３と同様に操作してＩ型コラーゲンを得た。実施例３と同様に、このＩ型コラーゲン等電点沈殿物１ｍｇを１００ｍＭ リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２溶液で６０℃、３０分加熱処理して変性させ、トリプシン５０μｇを投与し、３７℃、１６時間処理した。トリプシン処理後、トリプシンインヒビター（ＳＩＧＭＡ社製、商品名「Ｔｒｙｐｓｉｎ−ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」）を１００μｇ添加し、ついで、ガラクトースオキシダーゼを５０単位添加し、３７℃で２４時間処理した。その後、反応溶液をｐＨ５．５に調整し、ヒドラジドゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、商品名「ＡｆｆｉＧｅｌ ＨＺ Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ Ｇｅｌ」）２５０ｍｇを添加し、室温で６時間、転倒攪拌した。ついで、ヒドラジドゲルを、１００ｍＭ酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５溶液、１．５Ｍ ＮａＣｌ、メタノール、蒸留水の順に洗浄した後、１％ギ酸２００μｌを添加し、８０℃で１時間反応した。
【００８０】
次いで、上記反応液液に、０．１ｍＭジラール試薬Ｐ、または重水素処理ジラール試薬Ｐを加え、８０℃で１時間反応させた。さらに、形成されたヒドラゾン結合を１ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムにより室温で１時間還元することにより、アミンの形にして安定化させた。得られた反応液を１００ｍＭリン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．２溶液に対して透析後、ＬＣ−ＭＳ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製、商品名「３２００ＱＴＲＡＰ」）で分析した。
【００８１】
(実施例６)
健常者由来コラーゲンおよび骨形成不全症患者由来コラーゲンを使用した。実施例３と同様に、コラーゲン１ｍｇを１００ｍＭ リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２溶液で６０℃、３０分加熱処理して変性させ、トリプシン５０μｇを投与し、３７℃、１６時間処理した。トリプシン処理後、トリプシンインヒビター（ＳＩＧＭＡ社製、商品名「Ｔｒｙｐｓｉｎ−ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」）を１００μｇ添加し、ついで、ガラクトースオキシダーゼを５０単位添加し、３７℃で２４時間処理した。その後、反応溶液をｐＨ５．５に調整し、ヒドラジドゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、商品名「ＡｆｆｉＧｅｌ ＨＺ Ｈｙｄｒａｚｉdｅ Ｇｅｌ」）２５０ｍｇを添加し、室温で６時間、転倒攪拌した。ついで、ヒドラジドゲルを、１００ｍＭ 酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５溶液１ｍｌで３回洗浄した後、１％ギ酸２００μｌを添加し、８０℃で１時間反応した。
【００８２】
健常者由来サンプルには０．１ｍＭジラール試薬Ｐ、骨形成不全症患者由来サンプルには０．１ｍＭ重水素処理ジラール試薬Pを加え、８０℃で１時間反応させた。さらに、形成されたヒドラゾン結合を１ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムにより室温で１時間還元することにより、アミンの形にして安定化させた。得られた反応液を１００ｍＭリン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．２溶液に対して透析後、ＬＣ−ＭＳ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製、商品名「３２００ＱＴＲＡＰ」）で分析した。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明によれば、簡便な操作で糖タンパク質を解析することができ、有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖が付加されたペプチドの分析方法に関し、より詳細には、糖タンパク質から糖鎖を遊離せずに糖タンパク質の試料を調製する方法、およびこのようにして得られた糖タンパク質を分析する方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテオミクスやグライコミクスなどの発展に伴い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳやＬＣ／ＭＳによる分析が活発化し、種々のタンパク質や糖鎖、その他の分析結果がデータベース化されている。試料タンパク質や糖質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳやＬＣ／ＭＳのデータとデータベースに収納されたデータとを対比させることで、短時間に試料タンパク質や糖質を同定することができる。
【０００３】
このようなＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳやＬＣ／ＭＳによって分析しうる試料として、糖タンパク質がある。糖タンパク質の生合成において、糖鎖は、タンパク質が翻訳される際に、または翻訳後に付加されるため、糖タンパク質の糖鎖構造が疾患や加齢、遺伝的背景による影響を受ける可能性があり、実際、腫瘍と特定の糖タンパク質との関係なども見出されている。このため、糖鎖をシグナルとして、診断や治療へ応用されることが期待されている。糖タンパク質には、糖鎖がアスパラギンに結合したＮ−結合型、糖鎖がセリンやスレオニン、ヒドロキシリジンなどに結合したＯ−結合型などが存在する。
【０００４】
このような糖タンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳやＬＣ／ＭＳで分析する方法として、糖タンパク質からエンド型グリコシダーゼを使用して糖鎖を遊離させ、遊離した糖鎖を解析する方法がある（特許文献１)。未精製糖タンパク質をＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、泳動後のゲルから該当糖タンパク質部分を分取し、ペプチド：Ｎ−グリカナーゼ処理して糖鎖をタンパク質部分と切断して遊離させる。糖鎖はアルデヒド基を有するため、遊離糖鎖とヒドラジド基を官能基とするポリマー粒子とを反応させると、アルデヒド基とヒドラジド基とのヒドラゾン結合によって糖鎖がポリマー粒子に結合され、ついで、Ｎ−アミノオキシアセチルトリプトファニルアルギニンメチルエステルを反応させるとポリマー粒子のヒドラジド基に結合していたアルデヒド基がＮ−アミノオキシアセチルトリプトファニルアルギニンメチルエステルのアミノオキシル基に結合するというものである。特許文献１では、このようにして得た糖鎖をマトリックスと混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を行っている。なお、上記特許文献１で使用するペプチド：Ｎ−グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅ）は、糖タンパク質や糖ペプチドからＮ型糖鎖を遊離させる酵素である。従って、Ｎ−結合型糖タンパク質の糖鎖の分析に適し、Ｏ−結合型糖タンパク質の糖鎖を分析することはできない。
【０００５】
一方、このような糖タンパク質としてコラーゲンがあり、タンパク質を構成するアミノ酸としてガラクトシルヒドロキシリジン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｘｙｌｙｓｉｎｅ： ＧＨＬ）や、グルコシルガラクトシルヒドロキシリジン（ｇｌｕｃｏｓｙｌｇａｌａｃｔｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｘｙｌｙｓｉｎｅ：ＧＧＨＬ）を含むものが存在する。コラーゲンの型、組織、生理的条件によって糖付加の割合は変化し、骨形成不全症での糖鎖の増加など、疾患との関係が報告されている。コラーゲンの糖鎖は、ヒドロキシリジンに結合するＯ−結合型糖鎖であり、このようなＯ−結合型糖タンパク質を簡便に解析する要請も高い。
【０００６】
このような、タンパク質のセリンやスレオニン残基に糖鎖が結合するＯ−結合型糖鎖を分析する方法として、酢酸酸性条件で糖鎖を遊離させる方法がある(特許文献２)。実施例では糖タンパク質を２％酢酸／アセトニトリル中で８０℃で１時間反応させて糖タンパク質から糖鎖を遊離させ、遊離した糖鎖の還元末端のアルデヒド基をそのままポリマー粒子のヒドラジド基と結合させ、ついで、ポリマー粒子にＯ−ベンジルヒドロキシルアミンを加えて２％酢酸／アセトニトリル中で８０℃で１時間加熱し、ヒドラゾン−オキシム交換反応によって糖鎖の還元末端のアルデヒド基をＯ−ベンジルヒドロキシルアミンのアミノオキシル基に結合させている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−１５６５８７号
【特許文献２】特開２００９−２１６６０９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
糖タンパク質は、生体内において細胞同士の認識や化学物質の輸送などの役割を担い、細胞膜の構成に不可欠な要素であって、その機能解明は様々な病気が起きる仕組みを明らかにしたり治療法を開発するうえで手がかりになる。細胞内のリボソームで糖タンパク質を構成するタンパク質が合成され、さらにゴルジ体に運ばれ分泌される間に糖が運び込まれて糖タンパク質となり機能するものであるから、糖鎖の解析と共にタンパク質部分の解析も重要である。しかしながら現在のところ、コラーゲンの配列解析においては、糖鎖修飾部位はペプチドシークエンサでは検出することができないため、ｃＤＮＡ配列情報、アミノ酸分析、糖鎖分析などの結果を組合わせてその部位を推定しているに過ぎない。
【０００９】
たとえば、特許文献１記載の方法は、ＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で糖タンパク質を精製したのちにＮ−グリコシダーゼ処理して糖鎖を遊離させ、遊離した糖鎖をマトリックスと混合しＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析するものである。遊離した糖鎖の解析が目的であって、糖タンパク質やタンパク質部分を解析するものではない。
【００１０】
また、特許文献２記載の方法も、特許文献１と同様に、糖タンパク質から糖鎖のみを分離し解析するものである。特に、特許文献２は、Ｏ−結合型糖鎖の切り出しに使用する無水ヒドラジンを使用したヒドラジン分解は毒性が強いこと、ヒドラジン分解で遊離された糖鎖試料には莢雑物が含まれており、ハイスループットで糖鎖を精製できる方法としてなされたものである。酢酸酸性条件で糖タンパク質から糖鎖を遊離すること、および遊離した糖鎖を酢酸酸性条件で前記ヒドラジド基含有ポリマー粒子と反応させると、糖鎖をポリマー粒子に結合させうることが特徴である。従って、当初から、糖鎖を遊離させることを目的とするものであって、特定の糖ペプチドを精製したり、タンパク質部分を解析するものではない。
【００１１】
一方、糖タンパク質のタンパク質部分を解析するには、タンパク質部分を精製する必要がある。しかしながら、糖タンパク質は、Ｎ−結合型とＯ−結合型とによってタンパク質部分の分離方法や分離能が異なる。たとえば、上記した特許文献１では、Ｎ−結合型糖タンパク質からＮ−グリコシダーゼ処理によって糖鎖を遊離するものであり、特許文献２では、Ｏ−結合型糖タンパク質を酢酸酸性条件で反応させて糖鎖を遊離するものである。従って、糖タンパク質からタンパク質部分を遊離させて分析する方法は、Ｎ−結合型とＯ−結合型とによってタンパク質部分の分離方法を変える必要があり、操作が煩雑である。
【００１２】
また、糖タンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳやＬＣ／ＭＳで分析するためには、目的とする糖タンパク質を精製する必要がある。上記特許文献１では、糖鎖を精製するために、糖鎖にヒドラジド基含有ポリマー粒子を結合させ、前記ポリマー粒子を洗浄することで莢雑物を除去しているが、糖タンパク質自体は、ＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で他と分離されるに過ぎない。特許文献２でも、糖タンパク質から遊離した糖鎖をヒドラジド基含有ポリマー粒子と結合させ、前記ポリマー粒子を洗浄することで莢雑物を除去しているが、糖タンパク質の分離は行っていない。
【００１３】
糖タンパク質は、発現率その他において、疾患と特定の関係が観察される化合物である。従って、健常者と疾患者由来の糖タンパク質を解析することで、疾患の診断ができれば便利である。特に、糖タンパク質の解析のみならず、定量できることがより好ましい。
【００１４】
上記現状に鑑み、本発明は、糖タンパク質を精製する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、精製した糖タンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで同定する方法を提供することを目的とする。
【００１５】
加えて、上記分析方法によって、疾患の診断方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、コラーゲンに含まれる糖タンパク質の分析方法について詳細に検討した結果、糖タンパク質を構成する糖鎖をガラクトースオキシダーゼ処理すると、糖タンパク質に含まれるガラクトース６位の−ＣＨ2ＯＨが−ＣＨＯに酸化され、この酸化糖タンパク質とヒドラジド基を有するポリマー粒子とを反応させると、糖タンパク質−ポリマー粒子結合体が形成されること、糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を洗浄した後に糖タンパク質とヒドラジド基との結合を切断すれば、糖タンパク質を遊離させ、糖タンパク質を高純度に精製できること、この糖タンパク質は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳにて糖タンパク質のまま分析でき、データベースと比較することで試料を同定できること、精製した糖タンパク質を標識化合物と反応させた後にＬＣ／ＭＳやＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分析することで、糖タンパク質の定量が可能となること、健常者由来の糖タンパク質と特定疾患由来の糖タンパク質とを用いてそれぞれ糖タンパク質を精製し、それぞれに異なる標識化合物と反応させた後にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析すれば、健常者と特定疾患由来の糖タンパク質の含有量を評価し、疾患を診断できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１７】
すなわち本発明は、糖タンパク質含有試料を酸化して糖タンパク質に含まれる−ＣＨ2ＯＨを−ＣＨＯに酸化する工程、前記酸化糖タンパク質含有試料を−ＣＨＯと結合しうる反応基を有するポリマー粒子と反応させ、糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を得る工程、前記糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を洗浄する工程、前記洗浄した糖タンパク質−ポリマー粒子結合体から糖タンパク質を遊離する工程とからなる、糖タンパク質の試料調製方法を提供するものである。
【００１８】
本発明は、前記糖タンパク質含有試料が、Ｏ−結合型糖タンパク質含有試料である、上記糖タンパク質の試料調製方法を提供するものである。
本発明は、前記Ｏ−結合型糖タンパク質が、コラーゲン由来であることを特徴とする、上記糖タンパク質の試料調製方法を提供するものである。
【００１９】
本発明は、前記ポリマー粒子が、ヒドラジド基含有ポリマー粒子であることを特徴とする、上記糖タンパク質の試料調製方法を提供するものである。
本発明は、上記糖タンパク質の試料調製方法で得た糖タンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析することを特徴とする、糖タンパク質の分析方法を提供するものである。
【００２０】
本発明は、上記糖タンパク質の試料調製方法で得た糖タンパク質に標識化合物を結合させ、ついでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析することを特徴とする、糖タンパク質の分析方法を提供するものである。
【００２１】
本発明は、上記糖タンパク質の試料調製方法で得た糖タンパク質をイオン化促進標識化合物と結合させ、得られた糖タンパク質−標識化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析することを特徴とする、糖タンパク質の分析方法を提供するものである。
【００２２】
本発明は、前記糖タンパク質含有試料が、健常者由来の糖タンパク質と特定疾患由来の糖タンパク質であり、上記糖タンパク質の試料調製方法で得た糖タンパク質を標識化合物と結合させ、得られた糖タンパク質−標識化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析するものであり、精製した健常者由来の糖タンパク質または特定疾患由来の糖タンパク質のいずれかに標識化合物を結合させ、他方に前記標識化合物に対応する安定同位体標識化合物を結合させ、得られた糖タンパク質−標識化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析し、前記標識化合物と前記安定同位体標識化合物との質量数の差から健常者と特定疾患由来の糖タンパク質の含有量を評価することを特徴とする、診断方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、Ｎ−結合型糖タンパク質であるか、Ｏ−結合型糖タンパク質であるかを問わず、糖タンパク質を高収率で精製し、糖タンパク質の試料を調製することができる。
【００２４】
本発明によれば、糖鎖を温和な条件で酸化して、糖タンパク質に含まれる−ＣＨ2ＯＨを−ＣＨＯに酸化できるため、安全性および再現性に優れる。
本発明によれば、既存のデータと対比することで、試料糖タンパク質の同定を簡便に行うことができる。これにより、糖鎖のみならず、タンパク質部分も分析することができる。
【００２５】
本発明によれば、健常者のデータと疾患由来の糖タンパク質の分析データとを比較することで、疾患の診断を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、実施例３のＧＯＤ酸化サンプルとＧＯＤ非酸化サンプル（コントロール）との全イオン電流クロマトグラムのチャートである。
【図２】図２は、実施例３のＧＯＤ酸化サンプルの全イオン電流クロマトグラムのチャートである。
【図３】図３は、実施例３の１５．０８１分のＭＳのチャートである。
【図４】図４は、実施例３の１５．０８１分のＭＳ／ＭＳのチャートである。
【図５】図５は、実施例４のＧＯＤ酸化サンプルとＧＯＤ非酸化サンプル（コントロール）との全イオン電流クロマトグラムのチャートである。
【図６】図６は、実施例４のＧＯＤ酸化サンプルの全イオン電流クロマトグラムのチャートである。
【図７】図７は、実施例４の１４．０７８分のＭＳのチャートである。
【図８】図８は、実施例４の１４．０７８分のＭＳ／ＭＳのチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の第一は、糖タンパク質含有試料を酸化して糖タンパク質に含まれる−ＣＨ2ＯＨを−ＣＨＯに酸化する工程、前記酸化糖タンパク質含有試料を−ＣＨＯと結合しうる反応基を有するポリマー粒子と反応させ、糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を得る工程、前記糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を洗浄する工程、前記洗浄した糖タンパク質−ポリマー粒子結合体から糖タンパク質を遊離する工程とからなる、糖タンパク質の試料調製方法である。
【００２８】
糖タンパク質含有試料に含まれる莢雑物を除去し、分析対象の糖タンパク質を分離して試料を調製する。タンパク質や核酸、脂質など糖鎖以外の生体内物質にはアルデヒド基が含まれていないため、アルデヒド基と特異的に反応するポリマー粒子と結合させることで糖タンパク質のみを選択的に捕捉し、ポリマー粒子を洗浄することで莢雑物を除去し、その後、ポリマー粒子から糖タンパク質を分離することで、糖タンパク質の試料を調製する。得られた糖タンパク質試料は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳやＬＣ／ＭＳなどで分析することができる。以下、本発明を詳細に説明する。
【００２９】
（１）糖タンパク質
本発明において、糖タンパク質とは、タンパク質を構成するアミノ酸の一部に糖鎖が結合したものをいう。糖鎖がアスパラギンのアミノ基に糖が結合するＮ−結合型や、セリンやスレオニン、ヒドロキシリジンなどの水酸基に結合するＯ−結合型などが存在するが、いずれであってもよい。従来は、Ｎ−結合型糖タンパク質、Ｏ−結合型糖タンパク質について、それぞれ糖タンパク質から結合型の相違に由来した異なる方法で糖鎖を遊離させ、ついで遊離糖鎖を分析するものであったが、本発明は、糖タンパク質から糖鎖を遊離させることなく糖タンパク質のまま分析するため、いずれの結合型であるかを問わず、試料とすることができる。
【００３０】
一方、好ましくは、Ｏ−結合型糖タンパク質である。従来の糖鎖を遊離する方法では、糖タンパク質から糖鎖を遊離することが困難であるため、Ｏ−結合型糖タンパク質の解析は、Ｎ−結合型糖タンパク質よりも遅滞していた。本発明によれば、Ｎ−結合型糖タンパク質と同様に簡便に分析できるため、特にＯ−結合型糖タンパク質に有効である。
【００３１】
本発明で好適に使用できるＯ−結合型糖タンパク質としては、Ｉ〜ＸＸＩＸ型コラーゲン；アグリカン、パールカン、シンデカン、デコリンなどのプロテオグリカン；カドヘリン；ムチンなどを例示することができる。特に好ましくは、Ｉ〜ＸＸＩＸ型コラーゲンである。糖鎖の精製や濃縮にはレクチンがよく使用されるが、コラーゲンの糖鎖に結合するレクチンは知られておらず、コラーゲン由来の糖タンパク質の精製方法や濃縮方法は存在しなかった。一方、コラーゲンは、体内に多量に存在するタンパク質であり、単一のタンパク質として精製する方法が確立しており、および糖鎖が１糖または２糖と単純であってその構造も判明しており、データベースの分析結果と対比することで、同定が容易だからである。
【００３２】
対象とする糖タンパク質の糖鎖の長さも限定されるものではない。一般には、糖が１〜２０個、好ましくは１〜１２個、特に好ましくは１〜８個、更に好ましくは１〜５個結合した糖鎖を有する糖タンパク質の精製に好適である。
【００３３】
また、糖タンパク質のタンパク質部分の長さも限定されない。ただし、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳやＬＣ／ＭＳにおいて、既存のデータと対比する場合には、タンパク質部分は対象とする糖タンパク質を特定できる限度で、短いことが好ましい。一般には、糖タンパク質をトリプシンなどによって切断されるものを好適に使用することができる。
【００３４】
（２）ポリマー粒子
本発明は、糖タンパク質含有試料を酸化して糖タンパク質に含まれる−ＣＨ2ＯＨを−ＣＨＯに酸化し、当該−ＣＨＯを介してポリマー粒子と反応させるものである。従って、ポリマー粒子としては、−ＣＨＯと結合しうる反応基を有するポリマー粒子を広く使用することができ、例えば、ヒドラジド基含有ポリマー粒子、アミノ基含有ポリマー粒子、オキシルアミノ基含有ポリマー粒子、セミチオカルバジド基含有ポリマー粒子などを好ましく使用することができる。オキシルアミノ基とアルデヒド基との反応によって生じるオキシム結合やヒドラジド基とアルデヒド基との反応によって生じるヒドラゾン結合は、酸処理などによって容易に切断されるため、ポリマー粒子によって糖タンパク質を捕捉したのち、簡便に糖タンパク質をポリマー粒子から簡単に切り離すことができる点で好ましい。
【００３５】
前記ポリマー粒子は、固体やゲル粒子であってもよい。ポリマー粒子に糖タンパク質を捕捉させたのち、遠心分離やろ過などの手段によって他と分離して回収することができる。また、ポリマー粒子をカラムに充填して用いてもよい。カラムに充填して用いる方法は、特に連続操作化に好適である。
【００３６】
ポリマー粒子の形状は特に限定しないが、球状またはそれに類する形状が好ましい。ポリマー粒子が球状の場合、平均粒径は好ましくは０．０５〜１０００μｍであり、より好ましくは０．０５〜２００μｍであり、さらに好ましくは０．１〜２００μｍであり、最も好ましくは０．１〜１００μｍである。この範囲で通液性に優れ、かつ糖タンパク質の捕捉性に優れるからである。
【００３７】
ポリマー粒子は、遠心分離やろ過などの手段で回収する時にのみ固体粒子あるいはゲル粒子であってもよい。たとえば温度、ｐＨなどの環境変化によって溶解性が変化するポリマーを用い、溶媒に溶解した状態の該ポリマーに糖鎖の−ＣＨＯと特異的に反応する官能基を介して糖鎖を捕捉させ、溶解性を変化させて該ポリマーを沈殿させ、回収してもよい。環境によって溶解性が変化するポリマーとして、たとえばポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を挙げることができる。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）分子の少なくとも一部に糖タンパク質の−ＣＨＯと特異的に反応する官能基を導入することで、上記のような糖タンパク質の捕捉が可能となる。
【００３８】
このようなポリマー粒子は、市販品であってもよい。例えば、住友ベークライト株式会社製のＢｌｏｔＧｌｙｃｏ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製のＡｆｆｉＧｅｌ ＨＺ Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ Ｇｅｌなどを使用することができる。
【００３９】
（３）糖タンパク質含有試料
本発明で使用する糖タンパク質含有試料は、上記したＮ−結合型糖タンパク質やＯ−結合型糖タンパク質それ自体でもよいが、タンパク質部分の一次構造の解析が進んでいるＯ−結合型糖タンパク質のコラーゲンを分析する場合で説明する。なお、コラーゲンのタンパク質部分を構成するアミノ酸には、ヒドロキシリジンにガラクトシル基が結合したガラクトシルヒドロキシリジン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｘｙｌｙｓｉｎｅ： ＧＨＬ）、グルコシル−ガラクトシル基が結合したグルコシルガラクトシルヒドロキシリジン（ｇｌｕｃｏｓｙｌｇａｌａｃｔｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｘｙｌｙｓｉｎｅ：ＧＧＨＬ）が存在することが知られている。
【００４０】
コラーゲンは、現在、Ｉ〜ＸＸＩＸ型が知られており、上記ＧＨＬやＧＧＨＬの含有率は、コラーゲン型によって大きく異なる。本発明で使用するコラーゲンとしてはいずれであってもよく、新たに見出されるコラーゲンであってもよい。コラーゲンは、魚や豚、牛などの生皮、腱、骨などを形成する主要タンパク質であるが、生体内に含まれる大部分は水に不溶性である。本発明では、動物の皮や骨等の原料に含まれるコラーゲンをプロテアーゼなどの酵素を添加して可溶化し、酸やアルカリを添加して可溶化したものを使用することができる。
【００４１】
更に、糖タンパク質含有試料としては、コラーゲンを、例えば、トリプシンやキモトリプシンなどでタンパク質部分をより短鎖に切断したものを使用することができる。コラーゲンはアミノ酸配列が解明されているため、タンパク質部分を分析すれば、トリプシンなどで切断した糖タンパク質がコラーゲンのいずれの部位であるかを、容易に特定することができる。更に、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動）や、等電点電気泳動とＳＤＳ−ＰＡＧＥを組み合わせた二次元電気泳動によって分離したものを糖タンパク質含有試料とすることもできる。また、泳動後のゲルを例えばクーマシーブリリアントブルーなどの染色剤を用いて染色したのち、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）などのメンブレンに転写してもよい。転写は一般的なブロッティング装置を用いて行うことができる。染色はメンブレンへの転写の後に行ってもよい。
（４）糖タンパク質の試料調製方法
本発明では、上記糖タンパク質含有試料を使用し、
糖タンパク質に含まれる−ＣＨ2ＯＨを−ＣＨＯに酸化する工程、
前記酸化糖タンパク質含有試料を−ＣＨＯと結合しうる反応基を有するポリマー粒子と反応させ、糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を得る工程、
前記糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を洗浄する工程、
前記洗浄した糖タンパク質−ポリマー粒子結合体から糖タンパク質を遊離する工程とによって糖タンパク質試料を調製することができる。
【００４２】
（ｉ）酸化工程
上記糖タンパク質を酸化して糖タンパク質に含まれる−ＣＨ2ＯＨを−ＣＨＯに酸化し、これに前記ポリマー粒子を反応させる。Ｎ−結合型の糖タンパク質にＮ−グリコシダーゼを作用させて糖鎖を分離すると、遊離した糖鎖の還元末端にアルデヒド基が生じ、このアルデヒド基を介して上記ポリマー粒子と糖鎖とが結合する。しかしながら、本発明では、糖タンパク質に含まれる６位の−ＣＨ2ＯＨを−ＣＨＯに酸化させるため、糖タンパク質から糖鎖を遊離させることなく、このアルデヒド基を介してポリマー粒子と糖タンパク質とを結合させることができる。
【００４３】
−ＣＨ2ＯＨを−ＣＨＯに酸化させる方法に限定は無いが、ガラクトースオキシダーゼを使用することが安全かつ簡便である。一般には、３７℃で６〜２４時間反応させる。
（ｉｉ）糖タンパク質−ポリマー粒子結合工程
次いで、前記酸化糖タンパク質含有試料を、−ＣＨＯと結合しうる反応基を有するポリマー粒子と反応させ、糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を得る。ポリマー粒子の添加量は、ポリマー粒子に結合される−ＣＨＯと結合しうる反応基の量によって異なり、使用するポリマー粒子の前記反応基量に応じて適宜選択することができる。一般には、室温で３〜２４時間、反応させればよい。
【００４４】
糖タンパク質を特異的に捕捉するポリマー粒子によって糖タンパク質を捕捉する際の反応系のｐＨは、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜７であり、さらに好ましくは２〜６である。ｐＨ調整のためには、各種緩衝液を用いることができる。糖鎖捕捉時の温度は、好ましくは４〜６０℃、より好ましくは１０〜５０℃、さらに好ましくは１５〜４０℃である。反応時間は適宜設定することができる。ポリマー粒子をカラムに充填して試料溶液を通過させてもよい。
【００４５】
（ｉｉｉ）洗浄工程
糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を洗浄することで、糖タンパク質含有試料に含まれる糖タンパク質以外の成分を除去することができる。洗浄液は、糖タンパク質−ポリマー粒子結合体から糖タンパク質を切断せず、かつ莢雑物と親和性を有するものを広く使用することができる。たとえば、水、緩衝液、有機溶媒、界面活性剤を含む水または緩衝液などを適宜組み合わせて用いることが好ましい。特に好ましい形態は、界面活性剤を含む水または緩衝液で十分に洗浄したのち、有機溶剤で洗浄し、最後に水で洗浄する方法である。これらの洗浄により、非特異的吸着物がポリマー粒子表面から除去される。
【００４６】
なお、ポリマー粒子に存在する−ＣＨＯと結合しうる反応基をキャップすることが好ましい。例えば、ポリマー粒子が−ＣＨＯと結合しうる反応基としてヒドラジド基を有する場合には、ポリマー粒子を洗浄した後に、無水酢酸を添加し、室温で３０分間反応させる。その後、再度、ポリマー粒子を洗浄することが好ましい。
【００４７】
（iｖ）糖タンパク質遊離工程
糖タンパク質−ポリマー粒子結合体から糖タンパク質を遊離させることで、糖タンパク質を精製し、純度の高い糖タンパク質試料とすることができる。
【００４８】
遊離方法は、ポリマー粒子の前記反応基の種類に応じて適宜選択することができるが、糖タンパク質とポリマー粒子との結合以外を切断するものであってはならない。本発明では、揮発性酸処理により糖タンパク質をポリマー粒子から分離することができる。このような揮発性酸によれば、糖タンパク質をポリマー粒子から分離できると共に、脱塩等の必要なくそのままＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳ分析を行うことができるからである。本発明で使用できる揮発性酸としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、塩酸などを例示することができる。ギ酸処理の場合は、例えば、濃度０．１〜１質量％のギ酸溶液で温度６０〜８０℃で、０．５〜２時間、より好ましくは０．１〜１時間反応させる。
【００４９】
（５）ＬＣ／ＭＳ分析
本発明では、上記で調製した糖タンパク質試料をＬＣ／ＭＳ分析し、糖タンパク質を同定することができる。ＬＣ／ＭＳの分析結果を、各種サンプルの分析結果を集積したデータベースと比較することで、糖鎖修飾部位を推定することができる。
【００５０】
さらに、上記糖タンパク質試料をそのまま使用するほか、例えば糖タンパク質の前記−ＣＨＯにヒドラジン（Ｈ2ＮＮＨ2）や重水素処理ヒドラジン（Ｄ2ＮＮＤ2）を結合して標識すれば、質量数が２異なる位置にピークが出現することを利用し、サンプル間での比較定量を行うことができる。このように、一方に標識化合物を、他方に前記標識化合物に対応する安定同位体標識化合物を結合することで、質量数の違いによるサンプル間の比較定量を行う事ができる。安定同位体としては、重水素（Ｄ）のほか、13Ｃや、15Ｎ、18Ｏ等を例示することができる。
【００５１】
また、標識化合物として、ヒドラジンのほか、ヒドラジド基を含む物質として、ジラール試薬Ｐ（ピリジニウム−１−アセトヒドラジド・クロリド）、ジラール試薬Ｔ（ベタインヒドラジド・ヒドロクロライド）、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルフォニルヒドラジン（ダンシルヒドラジン）；２−ヒドラジノピリジン；９−フルオレニルメチルカルバゼート（Ｆｍｏｃ ヒドラジン）；ベンジルヒドラジン；４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオノ酸，ヒドラジド；２−（６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン）アセトヒドラジン；７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボキシリック酸；ヒドラジン（ＤＣＣＨ）；フェニルヒドラジン；１−ナフタレンアセトヒドラジン；２−ヒドラジノベンゾイックアシド；フェニルアセチックヒドラジン；ビオチンヒドラジンなどがある。また、−ＣＨＯと反応する反応基として、アミノオキシ基がある。アミノオキシ基を含む物質として、Ｏ−ベンジルヒドロキシアミン；Ｏ−フェニルヒドロキシルアミン；Ｏ−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）ヒドロキシルアミン；Ｏ−（４−ニトロベンジル）ヒドロキシルアミン；２−アミノオキシピリジン；２−アミノオキシメチルピリジン；４−［（アミノオキシアセチル）アミノ］ベンゾイックアシドメチルエステル；４−［（アミノオキシアセチル）アミノ］ベンゾイック酸エチルエステル；４−［（アミノオキシアセチル）アミノ］ベンズアミノ酸ｎ−ブチルエステル；アミｋノオキシ−ビオチンなどを例示することができる。
【００５２】
更に、このような標識として、ジラール試薬Ｐや重水素処理ジラール試薬Ｐなどの標識化合物を使用すれば、ヒドラジンと同様に−ＣＨＯと反応して糖タンパク質に結合する標識となり、上記と同様に質量数が５異なる位置にピークが出現することを利用してサンプル間で比較定量を行うことができる。かつベンゼン環の中に４級アミンが含まれるためＭＳでのイオン化が促進され、感度を向上させることもできる。
【００５３】
このような標識化合物は、糖タンパク質の１．５質量倍以上、より好ましくは３質量倍以上、さらに好ましくは５質量倍以上である。ｐＨ調整のためには、各種緩衝液を用いることができる。反応系の温度は，好ましくは４〜９０℃、より好ましくは４〜７０℃、さらに好ましくは３０〜８０℃であり、最も好ましくは４０〜８０℃である。
【００５４】
（６）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析
本発明では、上記した糖タンパク質の試料調製方法で得た糖タンパク質をそのまま用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を行うことができる。また、ＬＣ／ＭＳ分析の試料と同様に、例えば糖タンパク質の前記−ＣＨＯにヒドラジン（Ｈ2ＮＮＨ2）や重水素処理ヒドラジン（Ｄ2ＮＮＤ2）を結合して標識して試料とすることができる。更に、ジラール試薬Ｐや重水素処理ジラール試薬Ｐ、その他の標識化合物を付加して試料とすることができる。これにより、高感度にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析を行うことができる。
【００５５】
本発明では、上記で調製した糖タンパク質試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析し、糖タンパク質を同定することができる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの分析結果を、各種サンプルの分析結果を集積したデータベースと比較することで、糖鎖修飾部位を推定することができる。
【００５６】
（７）診断方法
本発明の診断方法は、糖タンパク質含有試料を使用し、健常者由来の糖タンパク質と特定疾患由来の糖タンパク質との質量の差から、糖タンパク質を定量し、疾患を診断するものである。
【００５７】
上記した糖タンパク質の試料調製方法で得た糖タンパク質を標識化合物と結合させ、得られた糖タンパク質−標識化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析するものであり、精製した健常者由来の糖タンパク質または特定疾患由来の糖タンパク質のいずれかに標識化合物を結合させ、他方に前記標識化合物に対応する安定同位体標識化合物を結合させる。得られた糖タンパク質−標識化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析すると、標識化合物と前記標識化合物に対応する安定同位体標識化合物との質量数の差から健常者と特定疾患由来の糖タンパク質の含有量を評価することができる。
【実施例】
【００５８】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
ＬＣ／ＭＳ測定条件
１．装置
高速液体クロマトグラフ：１２００ Ｓｅｒｉｅｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、
質量分析装置：３２００ＱＴＲＡＰ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）
２．ＧＨＬ、ＧＧＨＬの測定
（ｉ）ＨＰＬＣ条件
分析カラム：ＺＩＣ−ＨＩＬＩＣ ５μｍ， ２．１ｍｍｉ．ｄ．×１５０ｍｍ（ＳｅＱｕａｎｔ）、
移動相：Ａ液；０．１％酢酸、５ｍＭ 酢酸アンモニウム、
Ｂ液；１００％アセトニトリル、
グラジエント条件：０−５分：Ａ液１０％、５−１０分：Ａ液１０−５０％、１０−２５分：Ａ液５０−８０％、２５．１−３０分：Ａ液１０％、
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ、
カラム温度：４０℃、
注入量：１０μｌ、
（ｉｉ）質量分析条件
イオン化：ＥＳＩ、ポジティブ、
分析モード：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＭＲＭ）モード、
イオンスプレー電圧：４．５ｋＶ、
イオンソース温度：６００℃、
検出チャンネル（ｍ／ｚ）：ＧＨＬ ３２５．１→１６３．２、酸化ＧＨＬ ３２３．１→１６３．２、
ＧＧＨＬ ４８７．２→１６３．３、酸化ＧＧＨＬ ４８５．２→１６３．３、
３．コラーゲン糖タンパク質の測定
（ｉ）ＨＰＬＣ条件
分析カラム：Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ ２．７mｍ， ２．１ｍｍｉ．ｄ．×１５０ｍｍ（ＳＵＰＥＬＣＯ）、
移動相：Ａ液；０．１％ギ酸、Ｂ液；１００％アセトニトリル、
グラジエント条件：０−５分：Ａ液９８％、５−２０分：Ａ液９８−５０％、２０．１−２５分：Ａ液１０％、２５．１−３０分：Ａ液９８％、
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ、
カラム温度：２５℃、
注入量：１０μｌ
（ｉｉ）質量分析条件
イオン化：ＥＳＩ、ポジティブ、
分析モード：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ（ＩＤＡ）モード、
イオンスプレー電圧：５．５ｋＶ、
イオンソース温度：６００℃、
データベース検索ソフト：ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔソフトウェア３．０（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）
（実施例１）
ガラクトシルヒドロキシリジン（ＧＨＬ）１０ｎｍｏｌを、１００ｍＭ リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２溶液に溶解し、ついで、ガラクトースオキシダーゼ（ＳＩＧＭＡ社製、商品名「ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ」）を５０単位添加し、３７℃で２４時間処理した。この一部を採取し、溶液Ａとした。
【００５９】
その後、反応溶液をｐＨ５．５に調整し、ヒドラジドゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、商品名「ＡｆｆｉＧｅｌ ＨＺ Ｈｙｄｒａｚｉdｅ Ｇｅｌ」）を２５０ｍｇ添加し、室温で６時間、転倒攪拌した。ついで、ヒドラジドゲルを、１００ｍＭ 酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５溶液１ｍｌで３回洗浄した後、１％ギ酸２００μｌを添加し、８０℃で１時間反応した。この一部を採取し、溶液Ｂとした。
【００６０】
一方、ガラクトシルヒドロキシリジン（ＧＨＬ）１０ｎｍｏｌを、１００ｍＭ リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２溶液に溶解し、３７℃で２４時間処理した。この一部を採取し、対照溶液Ａとした。その後、反応溶液をｐＨ５．５に調整し、ヒドラジドゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、商品名「ＡｆｆｉＧｅｌ ＨＺ Ｈｙｄｒａｚｉdｅ Ｇｅｌ」）を２５０ｍｇ添加し、室温で６時間、転倒攪拌した。ついで、ヒドラジドゲルを、１００ｍＭ 酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５溶液１ｍｌで３回洗浄した後、１％ギ酸２００μｌを添加し、８０℃で１時間反応した。この一部を採取し、対照溶液Ｂとした。
【００６１】
得られた溶液Ａ、溶液Ｂ、対照溶液Ａ、対照溶液ＢをそれぞれＬＣ／ＭＳ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製、商品名「３２００ＱＴＲＡＰ」）にて、ＧＨＬと酸化ＧＨＬの強度を上記測定条件にて測定した。ＧＨＬと酸化ＧＨＬの強度および対照溶液Ａに対する％、溶液Ａに対する％の結果を表１に示す。
【００６２】
表１より、対照溶液ＡのＧＨＬ強度に対する溶液ＡのＧＨＬ強度は、１．６％であり、ガラクトースオキシダーゼによる酸化反応率は、９８．４％（＝１００−１．６）となった。また、溶液Ａの酸化ＧＨＬの強度に対する溶液Ｂの酸化ＧＨＬの強度で示される、酸化ＧＨＬの回収率は、４０１０００×１００／９２２０００＝４３．５％であった。
【００６３】
【表１】
（実施例２）
グルコシルガラクトシルヒドロキシリジン（ＧＧＨＬ）１０ｎｍｏｌを、１００ｍＭ リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２溶液に溶解し、ついで、ガラクトースオキシダーゼを５０単位添加し、３７℃で２４時間処理した。この一部を採取し、溶液Ａとした。
【００６４】
その後、反応溶液をｐＨ５．５に調整し、ヒドラジドゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、商品名「ＡｆｆｉＧｅｌ ＨＺ Ｈｙｄｒａｚｉdｅ Ｇｅｌ」）を２５０ｍｇ添加し、室温で６時間、転倒攪拌した。ついで、ヒドラジドゲルを、１００ｍＭ 酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５溶液１ｍｌで３回洗浄した後、１％ギ酸２００μｌを添加し、８０℃で１時間反応した。この一部を採取し、溶液Ｂとした。
【００６５】
一方、グルコシルガラクトシルヒドロキシリジン（ＧＧＨＬ）１０ｎｍｏｌを、１００ｍＭ リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２溶液に溶解し、３７℃で２４時間処理した。この一部を採取し、対照溶液Ａとした。その後、反応溶液をｐＨ５．５に調整し、ヒドラジドゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、商品名「ＡｆｆｉＧｅｌ ＨＺ Ｈｙｄｒａｚｉdｅ Ｇｅｌ」）を２５０ｍｇ添加し、室温で６時間、転倒攪拌した。ついで、ヒドラジドゲルを、１００ｍＭ 酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５溶液１ｍｌで３回洗浄した後、１％ギ酸２００μｌを添加し、８０℃で１時間反応した。この一部を採取し、対照溶液Ｂとした。
【００６６】
得られた溶液Ａ、溶液Ｂ、対照溶液Ａ、対照溶液ＢをそれぞれＬＣ／ＭＳ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製、商品名「３２００ＱＴＲＡＰ」）にて、ＧＧＨＬと酸化ＧＧＨＬの強度を上記条件で測定した。ＧＧＨＬと酸化ＧＧＨＬの強度および対照溶液Ａに対する％、溶液Ａに対する％の結果を表２に示す。
【００６７】
表２より、対照溶液ＡのＧＧＨＬ強度に対する溶液ＡのＧＧＨＬ強度は、８８．９％であり、ガラクトースオキシダーゼによる酸化反応率は、１１．１％（＝１００−８８．９）となった。
【００６８】
また、溶液Ａの酸化ＧＧＨＬの強度に対する溶液Ｂの酸化ＧＧＨＬの強度で示される、酸化ＧＧＨＬの回収率は、２２９００×１００／５２９００＝４３．３％であった。
【００６９】
【表２】
（実施例３）
（１）脱脂した牛皮に４０倍量（ｗ／ｖ）の０．５Ｍ酢酸を添加し、２〜３時間攪拌させて牛皮を十分に膨潤させ、ポリトロンホモジナイザーで牛皮をホモジナイズした。ペプシン量が組織の１／２０量になるように、組織の１０倍量のペプシン−０．５Ｍ酢酸を加えて一晩保持した後、遠心分離した。上清に終濃度１Ｍとなるように塩化ナトリウムを加えて塩析させ、遠心分離により沈殿を回収した。沈殿を最初に水、次に５ｍＭ酢酸に対して透析した後、リン酸緩衝液でｐＨ７．５に調整して等電点沈殿させた。さらに沈殿を５ ｍＭ酢酸に対して透析し、フィルター濾過してＩ型コラーゲンを得た。
【００７０】
このＩ型コラーゲン１ｍｇを１００ｍＭ リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２溶液で６０℃、３０分加熱処理して変性させ、トリプシン（ＳＩＧＭＡ社製、商品名「Ｔｒｙｐｓｉｎ」）５０μｇを投与し、３７℃、１６時間処理した。トリプシン処理後、トリプシンインヒビター（ＳＩＧＭＡ社製、商品名「Ｔｒｙｐｓｉｎ−ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」）を１００μｇ添加し、ついで、ガラクトースオキシダーゼを５０単位添加し、３７℃で２４時間処理した。その後、反応溶液をｐＨ５．５に調整し、ヒドラジドゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、商品名「ＡｆｆｉＧｅｌ ＨＺ Ｈｙｄｒａｚｉdｅ Ｇｅｌ」）２５０ｍｇを添加し、室温で６時間、転倒攪拌した。
【００７１】
ついで、ヒドラジドゲルを、１００ｍＭ酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５溶液、１．５Ｍ ＮａＣｌ、メタノール、蒸留水の順に洗浄した後、１％ギ酸２００μｌを添加し、８０℃で１時間反応した。
【００７２】
得られた反応液をＬＣ／ＭＳにて上記条件で分析した。全イオン電流クロマトグラムを図１に示す。なお、ガラクトースオキシダーゼで酸化しないサンプルについて同様に操作した。ＧＯＤ酸化サンプルとＧＯＤ非酸化サンプル（コントロール）とを同一チャートに示す。
【００７３】
また、ＧＯＤ酸化サンプルの全イオン電流クロマトグラムを図２に示す。図２の１５．０８１分のピークのＭＳ分析の結果を図３に、ＭＳ／ＭＳ分析の結果を図４に示す。ＭＳ／ＭＳの結果から、データベース検索ソフト（ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔソフトウェア３．０（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ））で検索したところ、下記配列がヒットした。この同定された糖鎖修飾部位は、これまでに報告されている部位と一致するものである。なお、配列表の配列番号１において、右から４番目のリジンがＧＨＬとして同定された。
【００７４】
(実施例４)
ウシの大腿骨から軟骨をメスで削りとり、１０％塩化ナトリウムで洗浄した後、組織の９．９倍量の０．１Ｎ塩酸に浸して一晩置いた。氷冷しながらポリトロンホモジナイザーでホモジナイズし、ペプシン量が組織の１／１００量となるように組織と等量のペプシン０．１Ｎ塩酸を加え、一晩攪拌して可溶化処理を行った。遠心分離により得た上清を１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整して等電点沈殿させ、遠心分離して沈殿を回収した。得られた沈殿の量に対して１０倍量の０．０１Ｎ塩酸を加えて溶解し、そこに１０％濃度となるように塩化ナトリウムを加えて塩析させ、遠心分離により沈殿を回収した。沈殿を最初に水、次に５ｍＭ酢酸に対して透析した後、フィルター濾過してＩＩ型コラーゲンを得た。
【００７５】
このＩＩ型コラーゲン１ｍｇを１００ｍＭ リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２溶液で６０℃、３０分加熱処理して変性させ、トリプシン５０μｇを投与し、３７℃、１６時間処理した。トリプシン処理後、トリプシンインヒビター（ＳＩＧＭＡ社製、商品名「Ｔｒｙｐｓｉｎ−ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」）を１００μｇ添加し、ついで、ガラクトースオキシダーゼを５０単位添加し、３７℃で２４時間処理した。その後、反応溶液をｐＨ５．５に調整し、ヒドラジドゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、商品名「ＡｆｆｉＧｅｌ ＨＺ Ｈｙｄｒａｚｉdｅ Ｇｅｌ」）２５０ｍｇを添加し、室温で６時間、転倒攪拌した。
【００７６】
ついで、ヒドラジドゲルを、１００ｍＭ酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５溶液、１．５Ｍ ＮａＣｌ、メタノール、蒸留水の順にした後、１％ギ酸２００μｌを添加し、８０℃で１時間反応した。
【００７７】
得られた反応液をＬＣ／ＭＳにて上記条件で分析した。全イオン電流クロマトグラムを図５に示す。なお、ガラクトースオキシダーゼで酸化しないサンプルについて同様に操作した。ＧＯＤ酸化サンプルとＧＯＤ非酸化サンプル（コントロール）とを同一チャートに示す。
【００７８】
また、ＧＯＤ酸化サンプルの全イオン電流クロマトグラムを図６に示す。図６の１４．０７８分のピークのＭＳ分析の結果を図７に、ＭＳ／ＭＳ分析の結果を図８に示す。ＭＳ／ＭＳの結果から、データベース検索ソフト（ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔソフトウェア３．０（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ））で検索したところ、下記配列がヒットした。この同定された糖鎖修飾部位は、従来知られているものではなかった。なお、配列表の配列番号２において、左から９番目のリジンがＧＨＬとして同定された。
【００７９】
(実施例５)
実施例３と同様に操作してＩ型コラーゲンを得た。実施例３と同様に、このＩ型コラーゲン等電点沈殿物１ｍｇを１００ｍＭ リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２溶液で６０℃、３０分加熱処理して変性させ、トリプシン５０μｇを投与し、３７℃、１６時間処理した。トリプシン処理後、トリプシンインヒビター（ＳＩＧＭＡ社製、商品名「Ｔｒｙｐｓｉｎ−ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」）を１００μｇ添加し、ついで、ガラクトースオキシダーゼを５０単位添加し、３７℃で２４時間処理した。その後、反応溶液をｐＨ５．５に調整し、ヒドラジドゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、商品名「ＡｆｆｉＧｅｌ ＨＺ Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ Ｇｅｌ」）２５０ｍｇを添加し、室温で６時間、転倒攪拌した。ついで、ヒドラジドゲルを、１００ｍＭ酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５溶液、１．５Ｍ ＮａＣｌ、メタノール、蒸留水の順に洗浄した後、１％ギ酸２００μｌを添加し、８０℃で１時間反応した。
【００８０】
次いで、上記反応液液に、０．１ｍＭジラール試薬Ｐ、または重水素処理ジラール試薬Ｐを加え、８０℃で１時間反応させた。さらに、形成されたヒドラゾン結合を１ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムにより室温で１時間還元することにより、アミンの形にして安定化させた。得られた反応液を１００ｍＭリン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．２溶液に対して透析後、ＬＣ−ＭＳ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製、商品名「３２００ＱＴＲＡＰ」）で分析した。
【００８１】
(実施例６)
健常者由来コラーゲンおよび骨形成不全症患者由来コラーゲンを使用した。実施例３と同様に、コラーゲン１ｍｇを１００ｍＭ リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２溶液で６０℃、３０分加熱処理して変性させ、トリプシン５０μｇを投与し、３７℃、１６時間処理した。トリプシン処理後、トリプシンインヒビター（ＳＩＧＭＡ社製、商品名「Ｔｒｙｐｓｉｎ−ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」）を１００μｇ添加し、ついで、ガラクトースオキシダーゼを５０単位添加し、３７℃で２４時間処理した。その後、反応溶液をｐＨ５．５に調整し、ヒドラジドゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、商品名「ＡｆｆｉＧｅｌ ＨＺ Ｈｙｄｒａｚｉdｅ Ｇｅｌ」）２５０ｍｇを添加し、室温で６時間、転倒攪拌した。ついで、ヒドラジドゲルを、１００ｍＭ 酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５溶液１ｍｌで３回洗浄した後、１％ギ酸２００μｌを添加し、８０℃で１時間反応した。
【００８２】
健常者由来サンプルには０．１ｍＭジラール試薬Ｐ、骨形成不全症患者由来サンプルには０．１ｍＭ重水素処理ジラール試薬Pを加え、８０℃で１時間反応させた。さらに、形成されたヒドラゾン結合を１ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムにより室温で１時間還元することにより、アミンの形にして安定化させた。得られた反応液を１００ｍＭリン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．２溶液に対して透析後、ＬＣ−ＭＳ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製、商品名「３２００ＱＴＲＡＰ」）で分析した。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明によれば、簡便な操作で糖タンパク質を解析することができ、有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖タンパク質含有試料を酸化して糖タンパク質に含まれる−ＣＨ2ＯＨを−ＣＨＯに酸化する工程、
前記酸化糖タンパク質含有試料を−ＣＨＯと結合しうる反応基を有するポリマー粒子と反応させ、糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を得る工程、
前記糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を洗浄する工程、
前記洗浄した糖タンパク質−ポリマー粒子結合体から糖タンパク質を遊離する工程とからなる、糖タンパク質の試料調製方法。
【請求項２】
前記糖タンパク質含有試料が、Ｏ−結合型糖タンパク質含有試料である、請求項１記載の糖タンパク質の試料調製方法。
【請求項３】
前記Ｏ−結合型糖タンパク質が、コラーゲン由来であることを特徴とする、請求項２記載の糖タンパク質の試料調製方法。
【請求項４】
前記ポリマー粒子が、ヒドラジド基含有ポリマー粒子であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の糖タンパク質の試料調製方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の糖タンパク質の試料調製方法で得た糖タンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析することを特徴とする、糖タンパク質の分析方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の糖タンパク質の試料調製方法で得た糖タンパク質に標識化合物を結合させ、ついでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析することを特徴とする、糖タンパク質の分析方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の糖タンパク質の試料調製方法で得た糖タンパク質をイオン化促進標識化合物と結合させ、得られた糖タンパク質−標識化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析することを特徴とする、糖タンパク質の分析方法。
【請求項８】
前記糖タンパク質含有試料が、健常者由来の糖タンパク質と特定疾患由来の糖タンパク質であり、
請求項１〜４のいずれかに記載の糖タンパク質の試料調製方法で得た糖タンパク質を標識化合物と結合させ、得られた糖タンパク質−標識化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析するものであり、
精製した健常者由来の糖タンパク質または特定疾患由来の糖タンパク質のいずれかに標識化合物を結合させ、他方に前記標識化合物に対応する安定同位体標識化合物を結合させ、得られた糖タンパク質−標識化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析し、前記標識化合物と前記安定同位体標識化合物との質量数の差から健常者と特定疾患由来の糖タンパク質の含有量を評価することを特徴とする、診断方法。
【請求項１】
糖タンパク質含有試料を酸化して糖タンパク質に含まれる−ＣＨ2ＯＨを−ＣＨＯに酸化する工程、
前記酸化糖タンパク質含有試料を−ＣＨＯと結合しうる反応基を有するポリマー粒子と反応させ、糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を得る工程、
前記糖タンパク質−ポリマー粒子結合体を洗浄する工程、
前記洗浄した糖タンパク質−ポリマー粒子結合体から糖タンパク質を遊離する工程とからなる、糖タンパク質の試料調製方法。
【請求項２】
前記糖タンパク質含有試料が、Ｏ−結合型糖タンパク質含有試料である、請求項１記載の糖タンパク質の試料調製方法。
【請求項３】
前記Ｏ−結合型糖タンパク質が、コラーゲン由来であることを特徴とする、請求項２記載の糖タンパク質の試料調製方法。
【請求項４】
前記ポリマー粒子が、ヒドラジド基含有ポリマー粒子であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の糖タンパク質の試料調製方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の糖タンパク質の試料調製方法で得た糖タンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析することを特徴とする、糖タンパク質の分析方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の糖タンパク質の試料調製方法で得た糖タンパク質に標識化合物を結合させ、ついでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析することを特徴とする、糖タンパク質の分析方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の糖タンパク質の試料調製方法で得た糖タンパク質をイオン化促進標識化合物と結合させ、得られた糖タンパク質−標識化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析することを特徴とする、糖タンパク質の分析方法。
【請求項８】
前記糖タンパク質含有試料が、健常者由来の糖タンパク質と特定疾患由来の糖タンパク質であり、
請求項１〜４のいずれかに記載の糖タンパク質の試料調製方法で得た糖タンパク質を標識化合物と結合させ、得られた糖タンパク質−標識化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析するものであり、
精製した健常者由来の糖タンパク質または特定疾患由来の糖タンパク質のいずれかに標識化合物を結合させ、他方に前記標識化合物に対応する安定同位体標識化合物を結合させ、得られた糖タンパク質−標識化合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよび／またはＬＣ／ＭＳで分析し、前記標識化合物と前記安定同位体標識化合物との質量数の差から健常者と特定疾患由来の糖タンパク質の含有量を評価することを特徴とする、診断方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−３２２９８（Ｐ２０１２−３２２９８Ａ）
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７２７００（Ｐ２０１０−１７２７００）
【出願日】平成２２年７月３０日（２０１０．７．３０）
【出願人】（０００１３５１５１）株式会社ニッピ (18)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月３０日（２０１０．７．３０）
【出願人】（０００１３５１５１）株式会社ニッピ (18)
【Ｆターム（参考）】
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