糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの製造方法
【課題】糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの製造方法の提供、及び糖化蛋白質測定用の標準試薬の製造方法の提供。
【解決手段】下記の成分：糖類 ３００ｍＭ〜５０００ｍＭ；アミノ酸及び／又はペプチド １ｍＭ〜５００ｍＭ；及び、リン酸化合物、鎖状飽和多価カルボン酸、及び鎖状飽和多価カルボン酸化合物から選ばれる１種以上の酸化合物 １５ｍＭ〜４００ｍＭ、を混合する工程を含む、糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドの製造方法。
【解決手段】下記の成分：糖類 ３００ｍＭ〜５０００ｍＭ；アミノ酸及び／又はペプチド １ｍＭ〜５００ｍＭ；及び、リン酸化合物、鎖状飽和多価カルボン酸、及び鎖状飽和多価カルボン酸化合物から選ばれる１種以上の酸化合物 １５ｍＭ〜４００ｍＭ、を混合する工程を含む、糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの製造方法、及び糖化蛋白質測定用の標準試薬の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査の分野においては、生体内の蛋白質の糖化率を測定することにより、過去の平均的な血糖レベルを推定し、糖尿病の診断に応用する検査が行われている。これは、生体内で蛋白質が糖化される度合いが、当該蛋白質の平均寿命に依存する過去の一定期間に、蛋白質と共存した糖質の平均濃度に依存することを利用したものである。
【０００３】
生体内の糖化蛋白質の測定方法には、高速液体クロマトグラフィーによる測定法（ＨＰＬＣ法）、抗原抗体反応を利用したラテックス凝集法、及び酵素反応を利用した酵素法などがある。この中で、酵素法では、プロテアーゼの作用により糖化蛋白質から糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを切り出し、この糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを基質とする酵素を作用させ生成した物質を定量することで、糖化蛋白質の測定を実現している。このような酵素法を用いた糖化蛋白質の測定技術としては、例えば特許文献１、特許文献２および特許文献３等に開示される技術がある。
【０００４】
糖化蛋白質の測定を行う場合、測定精度を確保するためには、既知濃度試料の測定による校正操作が必要である。この既知濃度試料は、「標準試薬」と呼ばれる。あるいは、臨床検査用分野においては、標準液、校正用試薬、キャリブレーター、あるいはコントロール等と呼ばれることもある。例えば、糖化蛋白質の１種であるヘモグロビンＡ１ｃを測定する場合、一般には、採血したヒト血液をプールし、当該プール血のヘモグロビンＡ１ｃ濃度を各種測定方法により測定して値付けをした、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度既知の血液試料を標準試薬としている。しかしながら、これらの製品は一般に高価であり、またヒト血液を原料とするため、原料の確保は容易ではなく、その調製には感染の危険が伴う。
【０００５】
一方、ヘモグロビン等の蛋白質を人工的に糖化して糖化蛋白質を調製し、これらを標準試薬として用いることも可能である。このような人工的に糖化した糖化蛋白質から得られた標準試薬は、上記ヒト血液を原料とする試薬よりも原料の入手や濃度レベルの調整が容易である。蛋白質を人工的に糖化する方法としては、例えば、対象とする蛋白質を、糖類の共存下で加温或いは減圧乾燥して糖化し、標準試薬の製造に利用する方法がある（特許文献４等）。しかしながら、この方法では、糖化反応を行った後の反応溶液中に未反応の糖類及び蛋白質が残存するため、これらの未反応成分を除去しないと、更なる糖化反応の進行によって溶液中の糖化蛋白質の含量に変化が生じてしまう。それ故、人工的に糖化して糖化蛋白質を調製した場合、糖化反応後にカラムクロマトグラフィー等の煩雑な操作により、未反応物を除去する必要があった。これらの除去操作は、長時間を要し、また収率の低下を招く場合が多い。
また、糖化蛋白質を含む標準試薬の場合、長期間の保存中に蛋白質が変性し、正確な校正ができなくなることがあった。
【０００６】
一方、上記の酵素法による糖化蛋白質の測定方法の場合、糖化蛋白質から切り出された糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを測定対象物としているため、当該測定対象物とアミノ酸配列が同一の濃度既知の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを標準試薬として用いることができる。一般に、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドは、上記の糖化蛋白質に比べて分子量が非常に小さいため、比較的安定で、保存中の変化が少ないという利点がある。
【０００７】
糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの調製方法としては、当該アミノ酸又はペプチドを糖類の共存下で加温或いは減圧乾燥して糖化する方法が挙げられる（特許文献４等）。しかし、この方法は一般に反応収率が悪く、かつ未反応物の除去操作が必要なため、操作が煩雑で、結果的に非常に高価となる。標準試薬による校正操作は頻繁に行う必要のあるため、標準試薬の消費量は比較的多く、高価な試料の使用は、コスト的に非常に不利であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−１５５６８４号公報
【特許文献２】特開２００４−３４４０５２号公報
【特許文献３】特開２０００−３００２９４号公報
【特許文献４】特開平１０−２９９９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来の糖化蛋白質測定用の標準試薬の欠点、すなわち、調製効率の低さ、調製の煩雑さ、高コスト、または保存安定性を改善するための技術である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、アミノ酸又はペプチド、及び糖類を、特定の酸化合物の存在下で反応させることにより、高収率で糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを得ることができること、及び、得られた反応物を、上記酸化合物が一定の濃度以下となるよう希釈することで、未反応物を除去することなく、長期間に渡って糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの含量を安定に維持し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、
（１）下記の成分：
糖類 ３００ｍＭ〜５０００ｍＭ；
アミノ酸及び／又はペプチド １ｍＭ〜５００ｍＭ；及び、
リン酸化合物、鎖状飽和多価カルボン酸、及び鎖状飽和多価カルボン酸化合物から選ばれる１種以上の酸化合物 １５ｍＭ〜４００ｍＭ、
を混合する工程を含む、糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドの製造方法。
（２）前記混合する工程で得られた混合物を４０〜８０℃でインキュベートする工程をさらに含む、（１）記載の方法。
（３）前記インキュベートする工程がｐＨ５〜９の条件下で行われる（２）記載の方法。
（４）前記インキュベートする工程が１０〜２００時間行われる（２）又は（３）記載の方法。
（５）下記の工程を含む、糖化蛋白質測定用標準試薬の製造方法：
（i）下記の成分：
糖類 ３００ｍＭ〜５０００ｍＭ；
アミノ酸及び／又はペプチド １ｍＭ〜５００ｍＭ；及び、
リン酸化合物、鎖状飽和多価カルボン酸、及び鎖状飽和多価カルボン酸化合物から選ばれる１種以上の酸化合物 １５ｍＭ〜４００ｍＭ、
を混合して糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドを含む溶液を調製する工程；ならびに、
（ii）当該溶液を、当該酸化合物の濃度が１０ｍＭ以下となるように希釈する工程。
（６）前記工程（i）において、前記成分を混合した後に得られた混合物を４０〜８０℃でインキュベートする、（５）記載の方法。
（７）前記インキュベートがｐＨ５〜９の条件下で行われる（６）記載の方法。
（８）前記インキュベートが１０〜２００時間行われる（６）又は（７）記載の方法。
（９）希釈後の溶液のｐＨが５〜９である、（５）〜（８）のいずれか１に記載の方法。
（１０）（５）〜（９）のいずれか１に記載の方法により製造された糖化蛋白質測定用標準試薬を用いる糖化蛋白質の測定方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドの製造方法によれば、簡便且つ高収率に糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドを得ることができる。また、本発明の糖化蛋白質測定用標準試薬の製造方法によれば、未反応物の除去操作などの煩雑な操作を行うことなく、簡便、高収率且つ低コストで糖化蛋白質測定用標準試薬を提供することができる。本発明により提供される糖化蛋白質測定用標準試薬は、試薬に含まれる糖化アミノ酸類及び糖化ペプチドの濃度が長期間の保存においても実質的に変化することがないため、長期に渡って高精度な糖化蛋白質の測定を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】糖化反応における反応温度の影響を示した図。
【図２】糖化反応における反応時のｐＨ及び反応時間の影響を示した図。
【図３】本発明の方法により得られた標準試薬の保存安定性を示した図。
【図４】本発明の方法により得られた標準試薬の校正能力評価。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドの製造方法は、糖類、アミノ酸及び／又はペプチド、ならびにリン酸化合物、鎖状飽和多価カルボン酸、及び鎖状飽和多価カルボン酸化合物から選ばれる１種以上の酸化合物を混合する工程を含む。
【００１５】
上記方法に用いられる糖類の種類には、特に制限はない。糖類の例としては、具体的には例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース等の糖類が挙げられ、好ましくはグルコース及びフルクトースである。反応に用いる上記糖類の濃度は、糖類、アミノ酸又はペプチド、及び酸化合物を混合した溶液（以下、反応溶液）中の濃度として、好ましくは３００ｍＭ〜５０００ｍＭである。３００ｍＭ以下であると、反応効率が低下して標準試薬に適した糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの濃度が得られにくくなる。一方、５０００ｍＭを超える場合、糖化反応は十分に行われるが、高濃度糖類により粘度が増大するため、糖化反応の再現性が低下する等、操作上の問題があり好ましくない。より好ましい濃度は４００ｍＭ〜４５００ｍＭ、更に好ましくは５００ｍＭ〜４２００ｍＭである。
【００１６】
上記アミノ酸又はペプチドの種類には、特に制限はなく、任意のアミノ酸又はペプチドを使用することができる。ペプチドは、ジペプチドからポリペプチドまでのあらゆる鎖長のペプチドを含み、直鎖状であっても側鎖を有していてもよい。ペプチドは、好ましくはアミノ酸が２〜１０個ペプチド結合したペプチドであり、より好ましくはアミノ酸が２〜６個結合したペプチドである。アミノ酸又はペプチドの具体的な例としては、例えば、バリン、リジン等のアミノ酸、バリン−ヒスチジン（ＶＨ）等のジペプチド、バリン−ヒスチジン−ロイシン（ＶＨＬ）等のトリペプチド、バリン−ヒスチジン−ロイシン−スレオニン（ＶＨＬＴ）等のテトラペプチド、バリン−ヒスチジン−ロイシン−スレオニン−プロリン（ＶＨＬＴＰ）等のペンタペプチド、バリン−ヒスチジン−ロイシン−スレオニン−プロリン−グルタミン酸（ＶＨＬＴＰＥ）等のヘキサペプチド等が挙げられる。これらのアミノ酸及び／又はペプチドの反応溶液中の濃度は、１ｍＭ〜５００ｍＭであることが好ましい。濃度が１ｍＭ未満であると、反応効率が低下して標準試薬に適した糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの濃度が得られにくくなる。一方、５００ｍＭを超える場合、糖化反応は十分に行われるが、未反応のアミノ酸又はペプチドが多量に残存するため、コスト的に不利となり好ましくない。より好ましい濃度は１０ｍＭ〜４００ｍＭ、更に好ましくは２０ｍＭ〜３００ｍＭである。
【００１７】
上記方法においては、その反応溶液中に、上記糖類とアミノ酸及び／又はペプチドの他に、リン酸化合物、鎖状飽和多価カルボン酸、及び鎖状飽和多価カルボン酸化合物から選択される１以上の酸または酸化合物を添加する。リン酸化合物としては、例えば、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、ピリドキサールリン酸、アデノシン三リン酸、六フッ化リン酸カリウムが挙げられる。鎖状飽和多価カルボン酸は、炭素原子、水素原子、及び酸素原子のみよりなり、分子内に二つ以上のカルボン酸を有し、かつカルボン酸部分以外に不飽和結合を有さず、また分子内は鎖状構造であって、環状構造を有しない有機酸であり、好ましくは、クエン酸、マロン酸、コハク酸である。鎖状飽和多価カルボン酸化合物は、鎖状飽和多価カルボン酸の塩類、または該酸に置換基を導入した誘導体類を含むものであり、その具体的な例としては、例えば、クエン酸ナトリウム、マロン酸エチルカリウム、フェニルマロン酸、コハク酸二ナトリウム、２−フルオロクエン酸、（−）−ヒドロキシクエン酸 、２−メチルクエン酸、ホスホクエン酸、イソクエン酸、ホモクエン酸、メチルマロン酸、ブチルマロン酸、エチルマロン酸、ベンジルコハク酸、２−ブロモコハク酸、フェニルコハク酸、２−ヒドロキシコハク酸、等が挙げられる。好ましい酸化合物は、リン酸化合物、クエン酸化合物、マロン酸化合物、コハク酸化合物であり、より好ましくは、リン酸化合物である。酸化合物としては、上述した化合物のうちの１種のみを用いてもよく、または複数の化合物を混合して用いてもよい。
【００１８】
反応溶液中の酸化合物の濃度は、好ましくは１５ｍＭ〜４００ｍＭである。酸化合物の濃度が１５ｍＭ未満であると、糖化反応が促進されず収率が悪くなるか、反応時間が延長し好ましくない。また４００ｍＭを超える場合、糖化反応は十分に行われるが、後述する希釈操作において、所定の酸化合物濃度とするために、大量の希釈液による希釈操作が必要となる。希釈操作によって糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの含有量も低下するため条件設定が困難になり、操作上好ましくない設定条件となる。より好ましい酸化合物の濃度は２０ｍＭ〜３００ｍＭ、更に好ましくは５０ｍＭ〜２００ｍＭである。
【００１９】
本発明の糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドの製造方法においては、上記混合工程で得られた反応溶液を、さらにインキュベートするか、或いは凍結乾燥、減圧乾燥することが好ましい。インキュベートがより好ましい。インキュベート工程における反応温度は特に限定されないが、好ましくは４０〜８０℃である。４０℃未満であると反応速度が遅く、また糖化率が低下する場合がある。８０℃を超えると反応が急速に進行し、収率にバラツキが生じることがある。ここで、「糖化率」とは、糖化反応前のアミノ酸又はペプチド量に対する生成した糖化アミノ酸又は糖化ペプチド量の比率であり、糖化反応の収率の指標となり得る。糖化反応の進行のし易さは、用いるアミノ酸又はペプチドにより異なるが、本発明の糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドの製造方法を用いれば、従来法に比べて当該アミノ酸又はペプチドの糖化率を著しく向上させることができる。
【００２０】
糖化反応時における反応溶液のｐＨは、好ましくはｐＨ５〜９である。ｐＨ５未満及びｐＨ９を超えると、糖化反応が抑制されて糖化率が低下する場合がある。より好ましい反応溶液のｐＨは５．５〜８．５である。また反応時間は、好ましくは１０〜２００時間である。１０時間未満であると、反応が不十分で糖化率が低くなる場合がある。また２００時間以上反応させても糖化率の増大は少なくなる。より好ましい反応時間は、１５〜１５０時間である。
【００２１】
以上の工程によって、糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを製造することができる。製造された糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドは、血中糖化蛋白質測定のための標準試薬の原料として、または糖化蛋白質測定用の抗体作製における免疫原の作製等に使用することができる。あるいは、本発明の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの製造方法においては、使用する糖類ならびにアミノ酸及びペプチドの種類を適宜選択することによって、製造する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの種類をその利用目的に応じて適宜変更することができる。例えば、血中糖化蛋白質測定のための標準試薬の原料として使用する場合、フルクトシルリジン、フルクトシルバリン、フルクトシルＶＨ、フルクトシルＶＨＬＴＰ等を製造することができる。
【００２２】
従って、本発明はまた、糖化蛋白質測定用標準試薬の製造方法を提供する。この方法においては、第１の工程において、糖類、アミノ酸及び／又はペプチド、ならびにリン酸化合物、鎖状飽和多価カルボン酸、及び鎖状飽和多価カルボン酸化合物から選ばれる１種以上の酸化合物を混合して糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドを含む溶液を調製する。使用される糖類、アミノ酸及び／又はペプチドならびに酸化合物の種類及び濃度は上述のとおりである。糖類、アミノ酸及び／又はペプチドならびに酸化合物を混合した反応溶液は、好ましくは、さらにインキュベート、凍結乾燥、又は減圧乾燥されてもよい。糖化反応時における反応溶液のｐＨ、温度、及び反応時間は上記の条件に従えばよい。
【００２３】
上記方法の第２の工程においては、第１の工程において調製された糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドを含む溶液を、当該溶液中における酸化合物の濃度が１０ｍＭ以下となるように希釈する。この希釈工程により、上記反応溶液中の酸化合物の濃度を所定濃度の範囲内とすることにより、糖化アミノ酸や糖化ペプチドの濃度を長期間に渡って安定に保つことができる。
【００２４】
上記希釈工程は、上記糖化反応後の糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドを含む溶液に、希釈するための溶液（以下、希釈液）を添加することにより行う。ここで用いられる希釈液は、上記酸化合物の濃度を下げることができ、かつ標準試薬として使用する場合に、測定の妨害にならないものであれば特に制限はない。また上記希釈液は、一般的に臨床検査用試薬が含有する成分を含有していても良い。これらの成分としては、例えば、アミノ酸類、ペプチド類、蛋白質類、糖類、ポリマー類、界面活性剤、無機化合物、防腐剤などが挙げられる。希釈液の具体的な例としては、例えば、精製水、生理食塩液、各種緩衝液などが挙げられる。
【００２５】
上記希釈工程においては、酸化合物の濃度が、１０ｍＭ以下、好ましくは０．０１〜１０ｍＭとなるように溶液が希釈されることが好ましい。希釈後の酸化合物の濃度が１０ｍＭを超える場合は、反応溶液中に残存する糖化合物およびアミノ酸又はペプチドの糖化反応が進行し、標準試薬として保存中に含有される糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの濃度が変化する可能性があり好ましくない。一方、０．０１ｍＭ未満である場合は、試薬の保存上は特に不都合はないが、上記濃度未満とするためには煩雑な酸化合物除去手段が必要となるため好ましくない。より好ましい濃度範囲は０．１〜８ｍＭである。
【００２６】
また上記希釈工程は、糖化蛋白質の測定に供するための標準試料とするために、溶液中の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを所望の濃度とするための工程である。したがって、溶液の希釈倍率は、酸化合物の濃度に加えて糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの濃度を勘案して設定する必要がある。糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの濃度は、測定方法や測定に供される検体によって異なり得るが、好ましくは１μＭ〜５０００μＭ、より好ましくは５μＭ〜２０００μＭである。したがって、得られた糖化アミノ酸及び／又はペプチドの含有量、及び、上記酸化合物の濃度がそれぞれ上記範囲となるように溶液が希釈されることが好ましい。
【００２７】
また希釈後の反応溶液のｐＨは、ｐＨ５〜９であることが好ましい。ｐＨ５未満又はｐＨ９を超えた場合には、長期間の保存時に糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチド量が変化する場合がある。また、測定系によって異なるが、ｐＨ５未満又はｐＨ９を超えた溶液を標準試薬として用いる場合には、測定系に悪影響を及ぼす場合がある。希釈後の反応液のｐＨの調整は、希釈後に通常使用されるｐＨ調整剤を添加することによって行ってもよいが、上記希釈液を予め所望のｐＨとなるよう調整することによっても行うことができる。
【００２８】
上記希釈工程を経て得られた糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチド溶液は、含有する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの濃度を測定して値付けをすれば、未反応物を除去することなく、そのまま糖化蛋白質測定用の標準試薬として使用できる。すなわち、上記方法によれば、高効率且つ簡便に糖化蛋白質測定用標準試薬を製造することができるため、結果として当該標準試薬を低コストで提供することが可能になる。
【００２９】
本発明方法によって得られた標準試薬は、０〜１０℃で保存することが好ましい。０℃未満で保存すると、内容物が凍結し、測定値が変化する場合がある。また１０℃を超えた状態での保存は、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの含量が変化する場合がある。より好ましくは、保存温度は２〜８℃である。
【００３０】
上記方法により得られた標準試薬は、糖化蛋白質の測定方法において、測定精度や感度が維持されていることを確認するため、もしくは測定値の校正を行うために用いられることができる。本発明方法により得られる標準試薬は、一般の標準試薬と同様、検体と同様に測定方法に供され、測定の結果得られた標準試薬の測定値により検体測定値の校正を行うことができる。なお、一般の標準試薬と同様、本発明の標準試薬を各種測定方法に用いる場合には、上記の好ましい範囲内の２つ以上の異なる濃度の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを有する標準試薬を別個に調製して、それらの測定結果に基づき検体測定値の校正を行うことが好ましい。
【００３１】
上記方法により得られた糖化蛋白質測定用標準試薬を用いて、糖化蛋白質を測定することができる。すなわち、当該標準試薬を用いた糖化蛋白質の測定方法も、本発明の一態様である。本発明方法により得られる標準試薬が適用される糖化蛋白質の測定方法には特に制限はなく、従来公知の測定方法に適用できる。例えば、本発明の糖化蛋白質の測定においては、検体中の糖化蛋白質量を測定し、得られた測定値を当該標準試薬を用いて校正することによって、検体中の糖化蛋白質の量を定量することができる。測定対象となる糖化蛋白質としては、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミン等の既知の糖化蛋白質類が挙げられ、糖化ヘモグロビンの１種であるヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）が好ましい。
【実施例】
【００３２】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
（実施例１）
ジペプチドとして２ｍＭのバリルヒスチジン（コスモバイオ社製：以下ＶＨ）、糖類として７８０ｍＭのグルコース（和光純薬社製）を含む、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍＬを調製し、反応溶液とした。得られた反応溶液を攪拌しながら６０℃に加温し２４時間糖化反応を行い、ＶＨの糖化物であるフルクトシルバリルヒスチジン（以下、ＦＶＨ）を生成させた。
【００３３】
次に糖化反応後の反応溶液中のＦＶＨ濃度を測定した。ＦＶＨ濃度は、ノルディアＨｂＡ１ｃ測定試薬（積水メディカル株式会社製）を使用し、既知濃度の過酸化水素溶液をキャリブレーターに用いて、日立自動分析装置７１７０形で測定した。ノルディアＨｂＡ１ｃ測定試薬は、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端のＦＶＨをプロテアーゼで切り出し、このＦＶＨを基質とした酵素反応により生成する過酸化水素を検出することでＨｂＡ１ｃを測定しているため、本手順により、既知濃度の過酸化水素溶液を基準として、ＦＶＨ濃度が測定される。
上記反応による糖化率（ＦＶＨ／ＶＨ×１００）は５８％であり、高い反応収率が得られた。
【００３４】
（実施例２〜４、比較例１〜１４）
本実施例では、実施例１における酸化合物を変更して糖化反応を行った場合の例を示す。
実施例１における酸化合物であるリン酸ナトリウムを、表１に示す化合物（またはその塩類）に変更した以外は、実施例１と同様に反応を行い、ＦＶＨを生成させた。実施例１と同様の方法によりＦＶＨ量を測定し、各糖化率を求めた。
各条件におけるＶＨの糖化率を下記表１に示す。実施例２〜４の、本発明に用いられる酸化合物であるクエン酸、コハク酸、マロン酸を用いた場合は、糖化率が３０％以上と高い糖化率を示した。一方、比較例２〜１４の酸化合物を用いた場合の糖化率は、酸化合物を用いない場合（比較例１）と同程度かそれ以下であり、糖化率が非常に悪かった。
【００３５】
【表１】
【００３６】
（実施例５〜８、比較例１、１５、１６）
本実施例では、本発明の糖化反応に関わる、反応溶液中の３つの成分、すなわちペプチド類、糖類、酸化合物の濃度を変更して糖化反応を行った場合の例を示す。
下記表２の濃度のＶＨ（ペプチド）及びグルコース（糖類）を含むリン酸ナトリウム（酸化合物）緩衝液（ｐＨ７．０）を調製し、反応溶液とした。得られた反応溶液を実施例１と同様に反応を行い、ＦＶＨを生成させた。実施例１と同様の方法によりＦＶＨ量を測定し、各糖化率を求めた。得られた結果を下記表２に示す。
実施例５〜８の本発明の規定する濃度範囲の各成分を用いた場合においては高い糖化率が得られた。一方、３つの成分のうち、１つでも範囲外となる条件である比較例１、１５、１６においては、糖化率が低かった。
【００３７】
【表２】
【００３８】
（実施例９、比較例１７）
本実施例では、上記実施例に用いたジペプチドであるＶＨの代わりに、ヘキサペプチドを用いて、本発明の条件に基づく糖化反応を行った場合（実施例９）、及び、同ヘキサペプチドについて、酸化合物を用いずに糖化反応を行った例（比較例１７）を示す。
ヘキサペプチドとして２０ｍＭのＶＨＬＴＰＥ（蛋白精製工業社製）、糖類として２０００ｍＭのグルコースを含む、１００ｍＭリン酸ナトリウム（酸化合物：和光純薬社製）緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍＬを調製し、反応溶液とした。得られた反応溶液を攪拌しながら６０℃に加温し２４時間糖化反応を行い、ＶＨＬＴＰＥの糖化物であるフルクトシルＶＨＬＴＰＥ（以下、ＦＶＨＬＴＰＥ）を生成させた。
酸化合物を用いなかった場合（比較例１７）の糖化率は０．１％であり、ほとんど糖化反応が行われなかったのに対し、実施例９では１５．３％と、比較例１７に比べ約１５０倍の収率であった。
【００３９】
（実施例１０、比較例１８）
本実施例では、上記実施例に用いたジペプチドであるＶＨの代わりに、アミノ酸を用いて、本発明の条件に基づく糖化反応を行った場合（実施例１０）、及び、同アミノ酸について、酸化合物を用いずに糖化反応を行った例（比較例１８）を示す。
アミノ酸として５０ｍＭのバリン（和光純薬社製）、糖類として１０００ｍＭのグルコースを含む、１００ｍＭリン酸ナトリウム（酸化合物：和光純薬社製）緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍＬを調製し、反応溶液とした。得られた反応溶液を攪拌しながら６０℃に加温し２４時間糖化反応を行い、バリンの糖化物であるフルクトシルバリンを生成させた。
酸化合物を用いなかった場合（比較例１８）は、糖化率が０．４％と殆ど糖化反応が行われなかったのに対し、実施例１０の糖化率は２２．０％と、比較例１８に比べ５５倍の収率であった。
【００４０】
（糖化反応条件の確認試験１：反応温度の影響）
上記実施例５の条件において、反応温度を４〜８０℃に変更して糖化反応を行った。得られた反応溶液中の糖化ペプチド濃度を測定し、糖化率を算出したところ、図１のようになった。本発明方法における好ましい反応温度は、４０〜８０℃であった。
【００４１】
（糖化反応条件の確認試験２：反応時のｐＨ及び反応時間の影響）
上記実施例３の条件において、反応時のｐＨを４〜１０に変更し、かつ各ｐＨ下における反応時間を、０〜１９９時間まで変更して糖化反応を行った。得られた反応溶液中の糖化ペプチド濃度を測定し、糖化率を算出したところ、図２のようになった。本発明方法における好ましい反応時のｐＨは５〜９、反応時間は２０時間以上であった。
【００４２】
（標準試薬の評価例１：安定性試験）
上記実施例で得られた糖化ペプチドを用いて標準試薬を調製した。得られた標準試薬について、長期間の保存安定試験を実施した。
まず上記糖化ペプチド類から標準試薬を調製した。標準試薬の調製は、糖化ペプチドを含む糖化反応後の溶液を、精製水で希釈することにより行った。調製した各標準試薬の酸化合物濃度を下記表３に示す。実施例１と同様の方法で各標準試薬の糖化ペプチドの初期濃度を測定後、４℃で保存した。一定期間毎に同品を取り出し、同一の糖化ペプチドの濃度を測定した。それぞれの初期濃度を１００とした場合に対する相対比を図３に示す。また、１２ヶ月経過後の各標準試薬中の糖化ペプチド濃度の初期濃度に対する相対％を下記表３に示す。
【００４３】
実施例１及び２の糖化ペプチド溶液を希釈して標準試薬を調製した場合、同標準試薬中のリン酸（酸化合物）濃度が１０ｍＭ以下の場合（標準試薬＃Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）、４℃で１２ヶ月保存後においても糖化ペプチド濃度に変化は認められず、安定であった。一方、リン酸濃度が１０ｍＭを超える場合（＃Ａ、Ｂ、Ｇ）は、徐々に糖化ペプチド濃度が上昇し、１２ヶ月後には初期濃度の１．２倍程度となった。
また上記の他の実施例から得られた糖化ペプチド溶液について同様の試験を実施したが、実施例１及び２の糖化ペプチドの場合と同様の結果となった。
【００４４】
【表３】
【００４５】
（標準試薬の評価例２：校正能力の評価）
上記表３の各標準試薬を用いて、ヒト血液検体中のヘモグロビンＡ１ｃを測定する際の校正を行い、その校正能力の評価を行った。
上記安定性試験と同様に、４℃にて保存した各標準試薬を一定保存期間毎に取り出し、同標準試薬を健常人ヒト血液検体とともにヘモグロビンＡ１ｃの測定に供した。ヘモグロビンＡ１ｃの測定は、実施例１と同様に、ノルディアＨｂＡ１ｃ測定試薬（積水メディカル社製）を用いて行った。上記の各標準試薬により校正を行って得られた、同一のヒト血液検体を測定した場合におけるヘモグロビンＡ１ｃ値の推移を図４に示す。
【００４６】
図４から、本発明の標準試薬（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）は、長期間に渡ってヘモグロビンＡ１ｃ値の校正能力が維持されていることがわかった。一方、酸化合物の濃度が１０ｍＭを超える標準試薬（Ａ、Ｂ、Ｇ）では、ヘモグロビンＡ１ｃ値は大きく低下した。これは、標準試薬に含まれる糖化ペプチドの濃度が、上記安定性試験結果のように増加したため、正確な校正が行われなかったことに起因すると考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの製造方法、及び糖化蛋白質測定用の標準試薬の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査の分野においては、生体内の蛋白質の糖化率を測定することにより、過去の平均的な血糖レベルを推定し、糖尿病の診断に応用する検査が行われている。これは、生体内で蛋白質が糖化される度合いが、当該蛋白質の平均寿命に依存する過去の一定期間に、蛋白質と共存した糖質の平均濃度に依存することを利用したものである。
【０００３】
生体内の糖化蛋白質の測定方法には、高速液体クロマトグラフィーによる測定法（ＨＰＬＣ法）、抗原抗体反応を利用したラテックス凝集法、及び酵素反応を利用した酵素法などがある。この中で、酵素法では、プロテアーゼの作用により糖化蛋白質から糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを切り出し、この糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを基質とする酵素を作用させ生成した物質を定量することで、糖化蛋白質の測定を実現している。このような酵素法を用いた糖化蛋白質の測定技術としては、例えば特許文献１、特許文献２および特許文献３等に開示される技術がある。
【０００４】
糖化蛋白質の測定を行う場合、測定精度を確保するためには、既知濃度試料の測定による校正操作が必要である。この既知濃度試料は、「標準試薬」と呼ばれる。あるいは、臨床検査用分野においては、標準液、校正用試薬、キャリブレーター、あるいはコントロール等と呼ばれることもある。例えば、糖化蛋白質の１種であるヘモグロビンＡ１ｃを測定する場合、一般には、採血したヒト血液をプールし、当該プール血のヘモグロビンＡ１ｃ濃度を各種測定方法により測定して値付けをした、ヘモグロビンＡ１ｃ濃度既知の血液試料を標準試薬としている。しかしながら、これらの製品は一般に高価であり、またヒト血液を原料とするため、原料の確保は容易ではなく、その調製には感染の危険が伴う。
【０００５】
一方、ヘモグロビン等の蛋白質を人工的に糖化して糖化蛋白質を調製し、これらを標準試薬として用いることも可能である。このような人工的に糖化した糖化蛋白質から得られた標準試薬は、上記ヒト血液を原料とする試薬よりも原料の入手や濃度レベルの調整が容易である。蛋白質を人工的に糖化する方法としては、例えば、対象とする蛋白質を、糖類の共存下で加温或いは減圧乾燥して糖化し、標準試薬の製造に利用する方法がある（特許文献４等）。しかしながら、この方法では、糖化反応を行った後の反応溶液中に未反応の糖類及び蛋白質が残存するため、これらの未反応成分を除去しないと、更なる糖化反応の進行によって溶液中の糖化蛋白質の含量に変化が生じてしまう。それ故、人工的に糖化して糖化蛋白質を調製した場合、糖化反応後にカラムクロマトグラフィー等の煩雑な操作により、未反応物を除去する必要があった。これらの除去操作は、長時間を要し、また収率の低下を招く場合が多い。
また、糖化蛋白質を含む標準試薬の場合、長期間の保存中に蛋白質が変性し、正確な校正ができなくなることがあった。
【０００６】
一方、上記の酵素法による糖化蛋白質の測定方法の場合、糖化蛋白質から切り出された糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを測定対象物としているため、当該測定対象物とアミノ酸配列が同一の濃度既知の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを標準試薬として用いることができる。一般に、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドは、上記の糖化蛋白質に比べて分子量が非常に小さいため、比較的安定で、保存中の変化が少ないという利点がある。
【０００７】
糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの調製方法としては、当該アミノ酸又はペプチドを糖類の共存下で加温或いは減圧乾燥して糖化する方法が挙げられる（特許文献４等）。しかし、この方法は一般に反応収率が悪く、かつ未反応物の除去操作が必要なため、操作が煩雑で、結果的に非常に高価となる。標準試薬による校正操作は頻繁に行う必要のあるため、標準試薬の消費量は比較的多く、高価な試料の使用は、コスト的に非常に不利であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−１５５６８４号公報
【特許文献２】特開２００４−３４４０５２号公報
【特許文献３】特開２０００−３００２９４号公報
【特許文献４】特開平１０−２９９９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来の糖化蛋白質測定用の標準試薬の欠点、すなわち、調製効率の低さ、調製の煩雑さ、高コスト、または保存安定性を改善するための技術である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、アミノ酸又はペプチド、及び糖類を、特定の酸化合物の存在下で反応させることにより、高収率で糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを得ることができること、及び、得られた反応物を、上記酸化合物が一定の濃度以下となるよう希釈することで、未反応物を除去することなく、長期間に渡って糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの含量を安定に維持し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、
（１）下記の成分：
糖類 ３００ｍＭ〜５０００ｍＭ；
アミノ酸及び／又はペプチド １ｍＭ〜５００ｍＭ；及び、
リン酸化合物、鎖状飽和多価カルボン酸、及び鎖状飽和多価カルボン酸化合物から選ばれる１種以上の酸化合物 １５ｍＭ〜４００ｍＭ、
を混合する工程を含む、糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドの製造方法。
（２）前記混合する工程で得られた混合物を４０〜８０℃でインキュベートする工程をさらに含む、（１）記載の方法。
（３）前記インキュベートする工程がｐＨ５〜９の条件下で行われる（２）記載の方法。
（４）前記インキュベートする工程が１０〜２００時間行われる（２）又は（３）記載の方法。
（５）下記の工程を含む、糖化蛋白質測定用標準試薬の製造方法：
（i）下記の成分：
糖類 ３００ｍＭ〜５０００ｍＭ；
アミノ酸及び／又はペプチド １ｍＭ〜５００ｍＭ；及び、
リン酸化合物、鎖状飽和多価カルボン酸、及び鎖状飽和多価カルボン酸化合物から選ばれる１種以上の酸化合物 １５ｍＭ〜４００ｍＭ、
を混合して糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドを含む溶液を調製する工程；ならびに、
（ii）当該溶液を、当該酸化合物の濃度が１０ｍＭ以下となるように希釈する工程。
（６）前記工程（i）において、前記成分を混合した後に得られた混合物を４０〜８０℃でインキュベートする、（５）記載の方法。
（７）前記インキュベートがｐＨ５〜９の条件下で行われる（６）記載の方法。
（８）前記インキュベートが１０〜２００時間行われる（６）又は（７）記載の方法。
（９）希釈後の溶液のｐＨが５〜９である、（５）〜（８）のいずれか１に記載の方法。
（１０）（５）〜（９）のいずれか１に記載の方法により製造された糖化蛋白質測定用標準試薬を用いる糖化蛋白質の測定方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドの製造方法によれば、簡便且つ高収率に糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドを得ることができる。また、本発明の糖化蛋白質測定用標準試薬の製造方法によれば、未反応物の除去操作などの煩雑な操作を行うことなく、簡便、高収率且つ低コストで糖化蛋白質測定用標準試薬を提供することができる。本発明により提供される糖化蛋白質測定用標準試薬は、試薬に含まれる糖化アミノ酸類及び糖化ペプチドの濃度が長期間の保存においても実質的に変化することがないため、長期に渡って高精度な糖化蛋白質の測定を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】糖化反応における反応温度の影響を示した図。
【図２】糖化反応における反応時のｐＨ及び反応時間の影響を示した図。
【図３】本発明の方法により得られた標準試薬の保存安定性を示した図。
【図４】本発明の方法により得られた標準試薬の校正能力評価。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドの製造方法は、糖類、アミノ酸及び／又はペプチド、ならびにリン酸化合物、鎖状飽和多価カルボン酸、及び鎖状飽和多価カルボン酸化合物から選ばれる１種以上の酸化合物を混合する工程を含む。
【００１５】
上記方法に用いられる糖類の種類には、特に制限はない。糖類の例としては、具体的には例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース等の糖類が挙げられ、好ましくはグルコース及びフルクトースである。反応に用いる上記糖類の濃度は、糖類、アミノ酸又はペプチド、及び酸化合物を混合した溶液（以下、反応溶液）中の濃度として、好ましくは３００ｍＭ〜５０００ｍＭである。３００ｍＭ以下であると、反応効率が低下して標準試薬に適した糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの濃度が得られにくくなる。一方、５０００ｍＭを超える場合、糖化反応は十分に行われるが、高濃度糖類により粘度が増大するため、糖化反応の再現性が低下する等、操作上の問題があり好ましくない。より好ましい濃度は４００ｍＭ〜４５００ｍＭ、更に好ましくは５００ｍＭ〜４２００ｍＭである。
【００１６】
上記アミノ酸又はペプチドの種類には、特に制限はなく、任意のアミノ酸又はペプチドを使用することができる。ペプチドは、ジペプチドからポリペプチドまでのあらゆる鎖長のペプチドを含み、直鎖状であっても側鎖を有していてもよい。ペプチドは、好ましくはアミノ酸が２〜１０個ペプチド結合したペプチドであり、より好ましくはアミノ酸が２〜６個結合したペプチドである。アミノ酸又はペプチドの具体的な例としては、例えば、バリン、リジン等のアミノ酸、バリン−ヒスチジン（ＶＨ）等のジペプチド、バリン−ヒスチジン−ロイシン（ＶＨＬ）等のトリペプチド、バリン−ヒスチジン−ロイシン−スレオニン（ＶＨＬＴ）等のテトラペプチド、バリン−ヒスチジン−ロイシン−スレオニン−プロリン（ＶＨＬＴＰ）等のペンタペプチド、バリン−ヒスチジン−ロイシン−スレオニン−プロリン−グルタミン酸（ＶＨＬＴＰＥ）等のヘキサペプチド等が挙げられる。これらのアミノ酸及び／又はペプチドの反応溶液中の濃度は、１ｍＭ〜５００ｍＭであることが好ましい。濃度が１ｍＭ未満であると、反応効率が低下して標準試薬に適した糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの濃度が得られにくくなる。一方、５００ｍＭを超える場合、糖化反応は十分に行われるが、未反応のアミノ酸又はペプチドが多量に残存するため、コスト的に不利となり好ましくない。より好ましい濃度は１０ｍＭ〜４００ｍＭ、更に好ましくは２０ｍＭ〜３００ｍＭである。
【００１７】
上記方法においては、その反応溶液中に、上記糖類とアミノ酸及び／又はペプチドの他に、リン酸化合物、鎖状飽和多価カルボン酸、及び鎖状飽和多価カルボン酸化合物から選択される１以上の酸または酸化合物を添加する。リン酸化合物としては、例えば、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、ピリドキサールリン酸、アデノシン三リン酸、六フッ化リン酸カリウムが挙げられる。鎖状飽和多価カルボン酸は、炭素原子、水素原子、及び酸素原子のみよりなり、分子内に二つ以上のカルボン酸を有し、かつカルボン酸部分以外に不飽和結合を有さず、また分子内は鎖状構造であって、環状構造を有しない有機酸であり、好ましくは、クエン酸、マロン酸、コハク酸である。鎖状飽和多価カルボン酸化合物は、鎖状飽和多価カルボン酸の塩類、または該酸に置換基を導入した誘導体類を含むものであり、その具体的な例としては、例えば、クエン酸ナトリウム、マロン酸エチルカリウム、フェニルマロン酸、コハク酸二ナトリウム、２−フルオロクエン酸、（−）−ヒドロキシクエン酸 、２−メチルクエン酸、ホスホクエン酸、イソクエン酸、ホモクエン酸、メチルマロン酸、ブチルマロン酸、エチルマロン酸、ベンジルコハク酸、２−ブロモコハク酸、フェニルコハク酸、２−ヒドロキシコハク酸、等が挙げられる。好ましい酸化合物は、リン酸化合物、クエン酸化合物、マロン酸化合物、コハク酸化合物であり、より好ましくは、リン酸化合物である。酸化合物としては、上述した化合物のうちの１種のみを用いてもよく、または複数の化合物を混合して用いてもよい。
【００１８】
反応溶液中の酸化合物の濃度は、好ましくは１５ｍＭ〜４００ｍＭである。酸化合物の濃度が１５ｍＭ未満であると、糖化反応が促進されず収率が悪くなるか、反応時間が延長し好ましくない。また４００ｍＭを超える場合、糖化反応は十分に行われるが、後述する希釈操作において、所定の酸化合物濃度とするために、大量の希釈液による希釈操作が必要となる。希釈操作によって糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの含有量も低下するため条件設定が困難になり、操作上好ましくない設定条件となる。より好ましい酸化合物の濃度は２０ｍＭ〜３００ｍＭ、更に好ましくは５０ｍＭ〜２００ｍＭである。
【００１９】
本発明の糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドの製造方法においては、上記混合工程で得られた反応溶液を、さらにインキュベートするか、或いは凍結乾燥、減圧乾燥することが好ましい。インキュベートがより好ましい。インキュベート工程における反応温度は特に限定されないが、好ましくは４０〜８０℃である。４０℃未満であると反応速度が遅く、また糖化率が低下する場合がある。８０℃を超えると反応が急速に進行し、収率にバラツキが生じることがある。ここで、「糖化率」とは、糖化反応前のアミノ酸又はペプチド量に対する生成した糖化アミノ酸又は糖化ペプチド量の比率であり、糖化反応の収率の指標となり得る。糖化反応の進行のし易さは、用いるアミノ酸又はペプチドにより異なるが、本発明の糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドの製造方法を用いれば、従来法に比べて当該アミノ酸又はペプチドの糖化率を著しく向上させることができる。
【００２０】
糖化反応時における反応溶液のｐＨは、好ましくはｐＨ５〜９である。ｐＨ５未満及びｐＨ９を超えると、糖化反応が抑制されて糖化率が低下する場合がある。より好ましい反応溶液のｐＨは５．５〜８．５である。また反応時間は、好ましくは１０〜２００時間である。１０時間未満であると、反応が不十分で糖化率が低くなる場合がある。また２００時間以上反応させても糖化率の増大は少なくなる。より好ましい反応時間は、１５〜１５０時間である。
【００２１】
以上の工程によって、糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを製造することができる。製造された糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドは、血中糖化蛋白質測定のための標準試薬の原料として、または糖化蛋白質測定用の抗体作製における免疫原の作製等に使用することができる。あるいは、本発明の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの製造方法においては、使用する糖類ならびにアミノ酸及びペプチドの種類を適宜選択することによって、製造する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの種類をその利用目的に応じて適宜変更することができる。例えば、血中糖化蛋白質測定のための標準試薬の原料として使用する場合、フルクトシルリジン、フルクトシルバリン、フルクトシルＶＨ、フルクトシルＶＨＬＴＰ等を製造することができる。
【００２２】
従って、本発明はまた、糖化蛋白質測定用標準試薬の製造方法を提供する。この方法においては、第１の工程において、糖類、アミノ酸及び／又はペプチド、ならびにリン酸化合物、鎖状飽和多価カルボン酸、及び鎖状飽和多価カルボン酸化合物から選ばれる１種以上の酸化合物を混合して糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドを含む溶液を調製する。使用される糖類、アミノ酸及び／又はペプチドならびに酸化合物の種類及び濃度は上述のとおりである。糖類、アミノ酸及び／又はペプチドならびに酸化合物を混合した反応溶液は、好ましくは、さらにインキュベート、凍結乾燥、又は減圧乾燥されてもよい。糖化反応時における反応溶液のｐＨ、温度、及び反応時間は上記の条件に従えばよい。
【００２３】
上記方法の第２の工程においては、第１の工程において調製された糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドを含む溶液を、当該溶液中における酸化合物の濃度が１０ｍＭ以下となるように希釈する。この希釈工程により、上記反応溶液中の酸化合物の濃度を所定濃度の範囲内とすることにより、糖化アミノ酸や糖化ペプチドの濃度を長期間に渡って安定に保つことができる。
【００２４】
上記希釈工程は、上記糖化反応後の糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドを含む溶液に、希釈するための溶液（以下、希釈液）を添加することにより行う。ここで用いられる希釈液は、上記酸化合物の濃度を下げることができ、かつ標準試薬として使用する場合に、測定の妨害にならないものであれば特に制限はない。また上記希釈液は、一般的に臨床検査用試薬が含有する成分を含有していても良い。これらの成分としては、例えば、アミノ酸類、ペプチド類、蛋白質類、糖類、ポリマー類、界面活性剤、無機化合物、防腐剤などが挙げられる。希釈液の具体的な例としては、例えば、精製水、生理食塩液、各種緩衝液などが挙げられる。
【００２５】
上記希釈工程においては、酸化合物の濃度が、１０ｍＭ以下、好ましくは０．０１〜１０ｍＭとなるように溶液が希釈されることが好ましい。希釈後の酸化合物の濃度が１０ｍＭを超える場合は、反応溶液中に残存する糖化合物およびアミノ酸又はペプチドの糖化反応が進行し、標準試薬として保存中に含有される糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの濃度が変化する可能性があり好ましくない。一方、０．０１ｍＭ未満である場合は、試薬の保存上は特に不都合はないが、上記濃度未満とするためには煩雑な酸化合物除去手段が必要となるため好ましくない。より好ましい濃度範囲は０．１〜８ｍＭである。
【００２６】
また上記希釈工程は、糖化蛋白質の測定に供するための標準試料とするために、溶液中の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを所望の濃度とするための工程である。したがって、溶液の希釈倍率は、酸化合物の濃度に加えて糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの濃度を勘案して設定する必要がある。糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの濃度は、測定方法や測定に供される検体によって異なり得るが、好ましくは１μＭ〜５０００μＭ、より好ましくは５μＭ〜２０００μＭである。したがって、得られた糖化アミノ酸及び／又はペプチドの含有量、及び、上記酸化合物の濃度がそれぞれ上記範囲となるように溶液が希釈されることが好ましい。
【００２７】
また希釈後の反応溶液のｐＨは、ｐＨ５〜９であることが好ましい。ｐＨ５未満又はｐＨ９を超えた場合には、長期間の保存時に糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチド量が変化する場合がある。また、測定系によって異なるが、ｐＨ５未満又はｐＨ９を超えた溶液を標準試薬として用いる場合には、測定系に悪影響を及ぼす場合がある。希釈後の反応液のｐＨの調整は、希釈後に通常使用されるｐＨ調整剤を添加することによって行ってもよいが、上記希釈液を予め所望のｐＨとなるよう調整することによっても行うことができる。
【００２８】
上記希釈工程を経て得られた糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチド溶液は、含有する糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドの濃度を測定して値付けをすれば、未反応物を除去することなく、そのまま糖化蛋白質測定用の標準試薬として使用できる。すなわち、上記方法によれば、高効率且つ簡便に糖化蛋白質測定用標準試薬を製造することができるため、結果として当該標準試薬を低コストで提供することが可能になる。
【００２９】
本発明方法によって得られた標準試薬は、０〜１０℃で保存することが好ましい。０℃未満で保存すると、内容物が凍結し、測定値が変化する場合がある。また１０℃を超えた状態での保存は、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの含量が変化する場合がある。より好ましくは、保存温度は２〜８℃である。
【００３０】
上記方法により得られた標準試薬は、糖化蛋白質の測定方法において、測定精度や感度が維持されていることを確認するため、もしくは測定値の校正を行うために用いられることができる。本発明方法により得られる標準試薬は、一般の標準試薬と同様、検体と同様に測定方法に供され、測定の結果得られた標準試薬の測定値により検体測定値の校正を行うことができる。なお、一般の標準試薬と同様、本発明の標準試薬を各種測定方法に用いる場合には、上記の好ましい範囲内の２つ以上の異なる濃度の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを有する標準試薬を別個に調製して、それらの測定結果に基づき検体測定値の校正を行うことが好ましい。
【００３１】
上記方法により得られた糖化蛋白質測定用標準試薬を用いて、糖化蛋白質を測定することができる。すなわち、当該標準試薬を用いた糖化蛋白質の測定方法も、本発明の一態様である。本発明方法により得られる標準試薬が適用される糖化蛋白質の測定方法には特に制限はなく、従来公知の測定方法に適用できる。例えば、本発明の糖化蛋白質の測定においては、検体中の糖化蛋白質量を測定し、得られた測定値を当該標準試薬を用いて校正することによって、検体中の糖化蛋白質の量を定量することができる。測定対象となる糖化蛋白質としては、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミン等の既知の糖化蛋白質類が挙げられ、糖化ヘモグロビンの１種であるヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）が好ましい。
【実施例】
【００３２】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
（実施例１）
ジペプチドとして２ｍＭのバリルヒスチジン（コスモバイオ社製：以下ＶＨ）、糖類として７８０ｍＭのグルコース（和光純薬社製）を含む、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍＬを調製し、反応溶液とした。得られた反応溶液を攪拌しながら６０℃に加温し２４時間糖化反応を行い、ＶＨの糖化物であるフルクトシルバリルヒスチジン（以下、ＦＶＨ）を生成させた。
【００３３】
次に糖化反応後の反応溶液中のＦＶＨ濃度を測定した。ＦＶＨ濃度は、ノルディアＨｂＡ１ｃ測定試薬（積水メディカル株式会社製）を使用し、既知濃度の過酸化水素溶液をキャリブレーターに用いて、日立自動分析装置７１７０形で測定した。ノルディアＨｂＡ１ｃ測定試薬は、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端のＦＶＨをプロテアーゼで切り出し、このＦＶＨを基質とした酵素反応により生成する過酸化水素を検出することでＨｂＡ１ｃを測定しているため、本手順により、既知濃度の過酸化水素溶液を基準として、ＦＶＨ濃度が測定される。
上記反応による糖化率（ＦＶＨ／ＶＨ×１００）は５８％であり、高い反応収率が得られた。
【００３４】
（実施例２〜４、比較例１〜１４）
本実施例では、実施例１における酸化合物を変更して糖化反応を行った場合の例を示す。
実施例１における酸化合物であるリン酸ナトリウムを、表１に示す化合物（またはその塩類）に変更した以外は、実施例１と同様に反応を行い、ＦＶＨを生成させた。実施例１と同様の方法によりＦＶＨ量を測定し、各糖化率を求めた。
各条件におけるＶＨの糖化率を下記表１に示す。実施例２〜４の、本発明に用いられる酸化合物であるクエン酸、コハク酸、マロン酸を用いた場合は、糖化率が３０％以上と高い糖化率を示した。一方、比較例２〜１４の酸化合物を用いた場合の糖化率は、酸化合物を用いない場合（比較例１）と同程度かそれ以下であり、糖化率が非常に悪かった。
【００３５】
【表１】
【００３６】
（実施例５〜８、比較例１、１５、１６）
本実施例では、本発明の糖化反応に関わる、反応溶液中の３つの成分、すなわちペプチド類、糖類、酸化合物の濃度を変更して糖化反応を行った場合の例を示す。
下記表２の濃度のＶＨ（ペプチド）及びグルコース（糖類）を含むリン酸ナトリウム（酸化合物）緩衝液（ｐＨ７．０）を調製し、反応溶液とした。得られた反応溶液を実施例１と同様に反応を行い、ＦＶＨを生成させた。実施例１と同様の方法によりＦＶＨ量を測定し、各糖化率を求めた。得られた結果を下記表２に示す。
実施例５〜８の本発明の規定する濃度範囲の各成分を用いた場合においては高い糖化率が得られた。一方、３つの成分のうち、１つでも範囲外となる条件である比較例１、１５、１６においては、糖化率が低かった。
【００３７】
【表２】
【００３８】
（実施例９、比較例１７）
本実施例では、上記実施例に用いたジペプチドであるＶＨの代わりに、ヘキサペプチドを用いて、本発明の条件に基づく糖化反応を行った場合（実施例９）、及び、同ヘキサペプチドについて、酸化合物を用いずに糖化反応を行った例（比較例１７）を示す。
ヘキサペプチドとして２０ｍＭのＶＨＬＴＰＥ（蛋白精製工業社製）、糖類として２０００ｍＭのグルコースを含む、１００ｍＭリン酸ナトリウム（酸化合物：和光純薬社製）緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍＬを調製し、反応溶液とした。得られた反応溶液を攪拌しながら６０℃に加温し２４時間糖化反応を行い、ＶＨＬＴＰＥの糖化物であるフルクトシルＶＨＬＴＰＥ（以下、ＦＶＨＬＴＰＥ）を生成させた。
酸化合物を用いなかった場合（比較例１７）の糖化率は０．１％であり、ほとんど糖化反応が行われなかったのに対し、実施例９では１５．３％と、比較例１７に比べ約１５０倍の収率であった。
【００３９】
（実施例１０、比較例１８）
本実施例では、上記実施例に用いたジペプチドであるＶＨの代わりに、アミノ酸を用いて、本発明の条件に基づく糖化反応を行った場合（実施例１０）、及び、同アミノ酸について、酸化合物を用いずに糖化反応を行った例（比較例１８）を示す。
アミノ酸として５０ｍＭのバリン（和光純薬社製）、糖類として１０００ｍＭのグルコースを含む、１００ｍＭリン酸ナトリウム（酸化合物：和光純薬社製）緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍＬを調製し、反応溶液とした。得られた反応溶液を攪拌しながら６０℃に加温し２４時間糖化反応を行い、バリンの糖化物であるフルクトシルバリンを生成させた。
酸化合物を用いなかった場合（比較例１８）は、糖化率が０．４％と殆ど糖化反応が行われなかったのに対し、実施例１０の糖化率は２２．０％と、比較例１８に比べ５５倍の収率であった。
【００４０】
（糖化反応条件の確認試験１：反応温度の影響）
上記実施例５の条件において、反応温度を４〜８０℃に変更して糖化反応を行った。得られた反応溶液中の糖化ペプチド濃度を測定し、糖化率を算出したところ、図１のようになった。本発明方法における好ましい反応温度は、４０〜８０℃であった。
【００４１】
（糖化反応条件の確認試験２：反応時のｐＨ及び反応時間の影響）
上記実施例３の条件において、反応時のｐＨを４〜１０に変更し、かつ各ｐＨ下における反応時間を、０〜１９９時間まで変更して糖化反応を行った。得られた反応溶液中の糖化ペプチド濃度を測定し、糖化率を算出したところ、図２のようになった。本発明方法における好ましい反応時のｐＨは５〜９、反応時間は２０時間以上であった。
【００４２】
（標準試薬の評価例１：安定性試験）
上記実施例で得られた糖化ペプチドを用いて標準試薬を調製した。得られた標準試薬について、長期間の保存安定試験を実施した。
まず上記糖化ペプチド類から標準試薬を調製した。標準試薬の調製は、糖化ペプチドを含む糖化反応後の溶液を、精製水で希釈することにより行った。調製した各標準試薬の酸化合物濃度を下記表３に示す。実施例１と同様の方法で各標準試薬の糖化ペプチドの初期濃度を測定後、４℃で保存した。一定期間毎に同品を取り出し、同一の糖化ペプチドの濃度を測定した。それぞれの初期濃度を１００とした場合に対する相対比を図３に示す。また、１２ヶ月経過後の各標準試薬中の糖化ペプチド濃度の初期濃度に対する相対％を下記表３に示す。
【００４３】
実施例１及び２の糖化ペプチド溶液を希釈して標準試薬を調製した場合、同標準試薬中のリン酸（酸化合物）濃度が１０ｍＭ以下の場合（標準試薬＃Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）、４℃で１２ヶ月保存後においても糖化ペプチド濃度に変化は認められず、安定であった。一方、リン酸濃度が１０ｍＭを超える場合（＃Ａ、Ｂ、Ｇ）は、徐々に糖化ペプチド濃度が上昇し、１２ヶ月後には初期濃度の１．２倍程度となった。
また上記の他の実施例から得られた糖化ペプチド溶液について同様の試験を実施したが、実施例１及び２の糖化ペプチドの場合と同様の結果となった。
【００４４】
【表３】
【００４５】
（標準試薬の評価例２：校正能力の評価）
上記表３の各標準試薬を用いて、ヒト血液検体中のヘモグロビンＡ１ｃを測定する際の校正を行い、その校正能力の評価を行った。
上記安定性試験と同様に、４℃にて保存した各標準試薬を一定保存期間毎に取り出し、同標準試薬を健常人ヒト血液検体とともにヘモグロビンＡ１ｃの測定に供した。ヘモグロビンＡ１ｃの測定は、実施例１と同様に、ノルディアＨｂＡ１ｃ測定試薬（積水メディカル社製）を用いて行った。上記の各標準試薬により校正を行って得られた、同一のヒト血液検体を測定した場合におけるヘモグロビンＡ１ｃ値の推移を図４に示す。
【００４６】
図４から、本発明の標準試薬（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）は、長期間に渡ってヘモグロビンＡ１ｃ値の校正能力が維持されていることがわかった。一方、酸化合物の濃度が１０ｍＭを超える標準試薬（Ａ、Ｂ、Ｇ）では、ヘモグロビンＡ１ｃ値は大きく低下した。これは、標準試薬に含まれる糖化ペプチドの濃度が、上記安定性試験結果のように増加したため、正確な校正が行われなかったことに起因すると考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の成分：
糖類 ３００ｍＭ〜５０００ｍＭ；
アミノ酸及び／又はペプチド １ｍＭ〜５００ｍＭ；及び、
リン酸化合物、鎖状飽和多価カルボン酸、及び鎖状飽和多価カルボン酸化合物から選ばれる１種以上の酸化合物 １５ｍＭ〜４００ｍＭ、
を混合する工程を含む、糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドの製造方法。
【請求項２】
前記混合する工程で得られた混合物を４０〜８０℃でインキュベートする工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記インキュベートする工程がｐＨ５〜９の条件下で行われる請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記インキュベートする工程が１０〜２００時間行われる請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
下記の工程を含む、糖化蛋白質測定用標準試薬の製造方法：
（i）下記の成分：
糖類 ３００ｍＭ〜５０００ｍＭ；
アミノ酸及び／又はペプチド １ｍＭ〜５００ｍＭ；及び、
リン酸化合物、鎖状飽和多価カルボン酸、及び鎖状飽和多価カルボン酸化合物から選ばれる１種以上の酸化合物 １５ｍＭ〜４００ｍＭ、
を混合して糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドを含む溶液を調製する工程；ならびに、
（ii）当該溶液を、当該酸化合物の濃度が１０ｍＭ以下となるように希釈する工程。
【請求項６】
前記工程（i）において、前記成分を混合した後に得られた混合物を４０〜８０℃でインキュベートする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記インキュベートがｐＨ５〜９の条件下で行われる請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記インキュベートが１０〜２００時間行われる請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
希釈後の溶液のｐＨが５〜９である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法により製造された糖化蛋白質測定用標準試薬を用いる糖化蛋白質の測定方法。
【請求項１】
下記の成分：
糖類 ３００ｍＭ〜５０００ｍＭ；
アミノ酸及び／又はペプチド １ｍＭ〜５００ｍＭ；及び、
リン酸化合物、鎖状飽和多価カルボン酸、及び鎖状飽和多価カルボン酸化合物から選ばれる１種以上の酸化合物 １５ｍＭ〜４００ｍＭ、
を混合する工程を含む、糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドの製造方法。
【請求項２】
前記混合する工程で得られた混合物を４０〜８０℃でインキュベートする工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記インキュベートする工程がｐＨ５〜９の条件下で行われる請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記インキュベートする工程が１０〜２００時間行われる請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
下記の工程を含む、糖化蛋白質測定用標準試薬の製造方法：
（i）下記の成分：
糖類 ３００ｍＭ〜５０００ｍＭ；
アミノ酸及び／又はペプチド １ｍＭ〜５００ｍＭ；及び、
リン酸化合物、鎖状飽和多価カルボン酸、及び鎖状飽和多価カルボン酸化合物から選ばれる１種以上の酸化合物 １５ｍＭ〜４００ｍＭ、
を混合して糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドを含む溶液を調製する工程；ならびに、
（ii）当該溶液を、当該酸化合物の濃度が１０ｍＭ以下となるように希釈する工程。
【請求項６】
前記工程（i）において、前記成分を混合した後に得られた混合物を４０〜８０℃でインキュベートする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記インキュベートがｐＨ５〜９の条件下で行われる請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記インキュベートが１０〜２００時間行われる請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
希釈後の溶液のｐＨが５〜９である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法により製造された糖化蛋白質測定用標準試薬を用いる糖化蛋白質の測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−９９７７７（Ｐ２０１１−９９７７７Ａ）
【公開日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２５５０３９（Ｐ２００９−２５５０３９）
【出願日】平成２１年１１月６日（２００９．１１．６）
【出願人】（３９００３７３２７）積水メディカル株式会社 (111)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月６日（２００９．１１．６）
【出願人】（３９００３７３２７）積水メディカル株式会社 (111)
【Ｆターム（参考）】
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