糖化アミンを測定するための試料の前処理方法および糖化アミンの測定方法
【課題】糖化アミンを測定対象物とする試料の前処理方法を提供し、信頼性に優れた糖化アミンの測定を可能にする。
【解決手段】試料中の糖化アミノ酸にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）を作用させて分解した後、さらに前記試料中の測定対象物である糖化アミンにＦＡＯＤを作用させて、その酸化還元反応を測定することにより糖化アミンの量を測定する。糖化アミノ酸に作用させるＦＡＯＤと糖化アミンに作用させるＦＡＯＤとは、同じ基質特異性でも異なる基質特異性でもよい。同じＦＡＯＤを使用する場合は、糖化アミノ酸にＦＡＯＤを作用させて分解した後、プロテアーゼによって前記ＦＡＯＤを失活させると共に前記糖化アミンを分解し、この分解物に、さらに同じＦＡＯＤを添加して作用させ、その酸化還元反応を測定する。
【解決手段】試料中の糖化アミノ酸にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）を作用させて分解した後、さらに前記試料中の測定対象物である糖化アミンにＦＡＯＤを作用させて、その酸化還元反応を測定することにより糖化アミンの量を測定する。糖化アミノ酸に作用させるＦＡＯＤと糖化アミンに作用させるＦＡＯＤとは、同じ基質特異性でも異なる基質特異性でもよい。同じＦＡＯＤを使用する場合は、糖化アミノ酸にＦＡＯＤを作用させて分解した後、プロテアーゼによって前記ＦＡＯＤを失活させると共に前記糖化アミンを分解し、この分解物に、さらに同じＦＡＯＤを添加して作用させ、その酸化還元反応を測定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化アミンを測定するための試料の前処理方法および糖化アミンの測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、酸化還元反応を利用して、試料中の測定対象物の量を測定することが広く実施されており、生化学分析や臨床検査等における糖化アミン（糖化タンパク質、糖化ペプチド、糖化アミノ酸等）の測定にも適用されている。
【０００３】
特に、血液中の糖化タンパク質、その中でも赤血球中の糖化ヘモグロビンは、生体血糖値の過去の履歴を反映しているため、糖尿病診断や治療等における重要な指標とされている。このような赤血球中の糖化タンパク質は、前記酸化還元反応を用いて、例えば、以下に示すようにして測定されている。
【０００４】
まず、赤血球を溶血させた試料を調製し、この溶血試料にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）を添加し、糖化タンパク質の糖化部分に作用させて酸化還元反応により過酸化水素を発生させる。この過酸化水素量は、前記糖化タンパク質量に対応する。そして、この試料に、ペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）および酸化により発色する還元剤を添加し、前記ＰＯＤを触媒として前記過酸化水素と前記還元剤との間で酸化還元反応させる。前記反応により前記還元剤を発色させ、この発色を測定することにより前記過酸化水素量が測定でき、この結果、赤血球中の糖化タンパク質量を知ることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、このような酸化還元反応を用いた糖化タンパク質の測定方法において、例えば、実際に試料中に含まれる糖化タンパク質に対応する以上の過酸化水素が発生するという問題があった。また、患者によっては、一時的に糖化タンパク質の測定値が急激に増加し、信頼性ある測定が行えないという問題もあった。このため、前記測定方法において、さらなる測定精度の向上が求められている。また、前記酸化還元反応を用いた測定方法には限られず、例えば、抗原抗体反応を用いた糖化アミン測定方法においても、同様に測定精度の向上が求められている。
【０００６】
そこで、本発明は、糖化アミンを測定するための試料の前処理方法の提供であって、これにより、信頼性に優れた糖化アミンの測定を可能にすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明の前処理方法は、糖化アミンを測定対象とする試料の前処理方法であって、前記試料中に測定対象の糖化アミンとは別に存在する糖化アミノ酸または糖化ペプチドを除去することを目的として、前記別に存在する糖化アミノ酸または糖化ペプチドにＦＡＯＤを作用させて分解する方法である。
【０００８】
なお、前記ＦＡＯＤは、一般名称であり、その基質としては糖化アミノ酸には限られず、例えば、糖化ペプチドにも作用する。また、本発明において「糖化ペプチド」とは、ＦＡＯＤが作用する長さのペプチドをいい、アミノ酸残基数が、例えば、２〜６の範囲のものをいう。これに伴い、本発明においては、ＦＡＯＤが作用しない長さの糖化ペプチドおよび糖化タンパク質を併せて「糖化タンパク質」という。そして、測定対象の前記糖化アミンとしては、例えば、糖化タンパク質、糖化ペプチド、糖化アミノ酸が含まれる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明者らは、測定精度の向上を図るべく鋭意研究を行った結果、以下の事を突き止めた。つまり、全血中には、本来、測定対象物である糖化アミンの他に、測定対象物以外の遊離の糖化アミノ酸や糖化ペプチドが存在しており、前記ＦＡＯＤは、このような糖化アミノ酸や糖化ペプチドに対しても作用する。このため、前述のようなＦＡＯＤを用いた糖化アミンの測定を行った場合、測定対象の糖化アミンとＦＡＯＤとの酸化還元反応だけでなく、測定対象以外の糖化アミノ酸や糖化ペプチドとＦＡＯＤとの酸化還元反応も生じてしまい、見かけ上、測定対象物の測定値が増加してしまうのである。さらに、同じ患者の全血試料について、全く同じ条件で前記測定方法により測定を行った場合でも、患者によっては採血時が異なると測定値が著しく変動するという前述の問題に関しても、以下の事を突き止めた。すなわち、この問題は、主に点滴等を受けた患者に見られる現象であり、このように測定値が変動するのは、点滴等の成分として、例えば、グルコース等の糖類や各種アミノ酸が含まれると、これらの外来成分から糖化アミノ酸が生成され、一過的に糖化アミノ酸が増加するためであることを突き止めたのである。このような現象は、前記酸化還元反応による測定においてだけでなく、例えば、前記抗原抗体反応を用いた測定方法においても、同様に生じていた。そこで、全血試料中に、恒常的な糖化アミノ酸や糖化ペプチド、一過性の外来糖化アミノ酸等といった測定対象物以外の糖化物が存在しても、本発明のように、試料に対して、予め、測定対象物以外の糖化アミノ酸や糖化ペプチドに分解用ＦＡＯＤを作用させて分解する前処理を行えば、前述のような見かけ上の測定値の向上が抑制されることを、本発明者らが初めて見出したのである。これによって、測定精度が向上でき、さらに、例えば、点滴を受けたか否かに関わらず、いつでも採血を行うことができるため、患者の負担も低減できる。このような試料の前処理方法を、例えば、前述のような糖化ヘモグロビンの測定において適用すれば、糖化ヘモグロビンの糖尿病診断の指標としての信頼性も増し、臨床医療等の分野において有用な方法となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の測定方法の一実施例において、ＦＡＯＤを用いた測定方法によるＨｂＡ１ｃ量と、自動分析装置によるＨｂＡ１ｃ量との相関関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
つぎに、本発明の測定方法は、試料中の糖化アミンにＦＡＯＤを作用させて、その酸化還元反応を測定することにより糖化アミンの量を測定する方法であって、前記試料中の糖化アミンとは別に存在する糖化アミノ酸または糖化ペプチドを除去することを目的として、前記酸化還元反応に先立ち、予め、前記試料を前記本発明の前処理方法によって処理して、前記糖化アミノ酸または糖化ペプチドを分解する方法である。
【００１２】
前述のような理由から、このような測定方法によれば、測定精度を向上できる。以下、本発明において、前記糖化アミノ酸や糖化ペプチドを分解するためのＦＡＯＤを「分解用ＦＡＯＤ」といい、前記糖化アミンに作用させる測定のためのＦＡＯＤを「測定用ＦＡＯＤ」という。また、測定対象の糖化アミンとは別に存在する糖化アミノ酸および糖化ペプチドを、以下、「非測定対象糖化物」ともいう。
【００１３】
本発明の測定方法としては、例えば、前記非測定対象糖化物と前記測定対象糖化アミンとに、異なる基質特異性のＦＡＯＤを使用する第１の測定方法と、同じＦＡＯＤを使用する第２の測定方法とがあげられる。
【００１４】
なお、ＦＡＯＤには、後述するように、例えば、α−アミノ基の糖化部分に作用するもの、リジンやアルギニン等のアミノ酸残基の側鎖アミノ基の糖化部分に作用するもの、および前記両方の糖化部分に作用するもの等があり、その基質特異性はＦＡＯＤの種類により様々である。そして、糖化アミンの測定において、前記α−アミノ基の糖化部分、前記側鎖アミノ基の糖化部分または両方の糖化部分のいずれにＦＡＯＤを作用させても、その量を測定することが可能である。
【００１５】
本発明の第１の測定方法としては、前記非測定対象糖化物に作用させる分解用ＦＡＯＤと、測定対象糖化アミンに作用させる測定用ＦＡＯＤとが、異なる基質特異性を有することが好ましい。これによれば、分解用ＦＡＯＤによって前記非測定対象糖化物の糖化部分を分解し、糖化アミンについては、前記分解用ＦＡＯＤが作用していない糖化部分に、さらに異なる基質特異性の測定用ＦＡＯＤを作用させることができるため、前記非測定対象糖化物の影響を受けず、測定精度を向上できるからである。
【００１６】
具体的には、例えば、非測定対象物は、α−アミノ基が糖化されており、測定対象糖化アミンは、α−アミノ基糖化部分および側鎖アミノ基が糖化されている場合、前記分解用ＦＡＯＤは、糖化されたα−アミノ基に特異的に作用し、前記測定用ＦＡＯＤは、糖化されたα−アミノ基および糖化されたアミノ酸残基側鎖に特異的に作用する酵素であることが好ましい。前記測定用ＦＡＯＤは、α−アミノ基糖化部分および側鎖アミノ基糖化部分の両方に作用するため、従来の方法であれば、前述のようにα−アミノ基が糖化された非測定対象糖化物にも作用していた。しかし、本発明においては、前記非測定対象糖化物の糖化部分は、予め、前記糖化α−アミノ基に特異的に作用する分解用ＦＡＯＤによって分解されているため、これに測定用ＦＡＯＤが作用することはなく、見かけ上の測定値の増加が抑制されて精度が向上する。また、測定用ＦＡＯＤは、前述のようにα−アミノ基糖化部分および側鎖アミノ基糖化部分の両方に作用するため、糖化アミンのα−アミノ基糖化部分も分解用ＦＡＯＤにより分解されており、糖化アミンの側鎖アミノ基糖化部分のみに測定用ＦＡＯＤを作用させることができる。このため、特に側鎖アミノ基の糖化量に特徴がある糖化アミンの測定に、有用な方法といえる。このような糖化アミンとしては、例えば、ε−糖化リジン、糖化アルブミン等があげられる。
【００１７】
このように異なるＦＡＯＤを用いる場合、前記非測定対象糖化物にＦＡＯＤを作用させる前または作用させた後に、糖化アミンをプロテアーゼで分解し、この糖化アミン分解物に、前記測定用ＦＡＯＤを作用させて前記酸化還元反応を行うことが好ましい。糖化アミンを分解するのは、測定対象物が糖化タンパク質の場合、ＦＡＯＤは前記糖化タンパク質には作用し難く、前述のような糖化ペプチドや糖化アミノ酸に作用するからであり、また、前記糖化ペプチドよりも糖化アミノ酸により一層作用し易いからである。また、プロテアーゼ処理の順序が、非測定対象糖化物の分解処理の前後で制限されないのは、測定用ＦＡＯＤは、前述のように分解用ＦＡＯＤとは異なる糖化部分に作用できるため、糖化アミンの測定自体には影響を受けないからである。また、測定対象が糖化ペプチドの場合も、さらに短い糖化ペプチドや糖化アミノ酸に分解すれば、より一層ＦＡＯＤが作用し易いため、プロテアーゼ処理を施すことが好ましい。
【００１８】
なお、本発明において「非測定対象糖化物である糖化アミノ酸および糖化ペプチド」とは、特に示さない限り、分解処理前から試料中に含まれるものをいい、例えば、測定対象物である糖化タンパク質や糖化ペプチドのプロテアーゼ分解物は含まない。
【００１９】
つぎに、本発明の第２の測定方法としては、非測定対象糖化物に分解用ＦＡＯＤを作用させた後、測定対象の糖化アミンをプロテアーゼで分解し、さらに前記分解用ＦＡＯＤと同じＦＡＯＤを添加して、前記プロテアーゼ分解物に作用させて前記酸化還元反応を行うことが好ましい。このような方法は、例えば、被測定対象糖化物が糖化アミノ酸であって、測定糖化アミンが糖化タンパク質や糖化ペプチドの場合に有用である。
【００２０】
具体的には、前記プロテアーゼにより、前記分解用ＦＡＯＤを失活させることが好ましい。前述のように、ＦＡＯＤは、糖化タンパク質には作用し難く、また、糖化ペプチドよりも糖化アミノ酸により一層作用し易いという性質を有している。このため、非測定対象糖化物が糖化アミノ酸である場合、例えば、分解用ＦＡＯＤを添加しても、酵素の反応速度論から、糖化アミノ酸を分解する処理時間においては、糖化タンパク質には作用せず、糖化ペプチドにもあまり作用し難いといえる。しかし、続くプロテアーゼ処理の間も前記分解用ＦＡＯＤの活性が残存していると、プロテアーゼ処理と併行して、プロテアーゼによる糖化タンパク質分解物（糖化ペプチドや糖化アミノ酸）や糖化ペプチド分解物（より短い糖化ペプチドや糖化アミノ酸）に前記分解用ＦＡＯＤが作用してしまう。このため、後に測定用ＦＡＯＤを添加しても、すでに前記糖化タンパク質分解物等の一部には分解用ＦＡＯＤが作用した状態となり、反対に測定精度が低下するおそれがある。したがって、前述のように糖化タンパク質等を分解するためのプロテアーゼ処理によって、同時に残存する前記分解用ＦＡＯＤを失活させれば、プロテアーゼ処理による糖化タンパク質分解物等は、前記分解用ＦＡＯＤとは未反応のままで維持され、続いて添加する測定用ＦＡＯＤと反応することができる。このため測定精度も向上するのである。
【００２１】
なお、この他に、例えば、測定対象物が糖化タンパク質であり、非測定対象糖化物が糖化ペプチドであってもよい。分解用ＦＡＯＤを糖化ペプチドに作用させでも、その際に、糖化タンパク質には作用しないからである。
【００２２】
一方、前述のようにプロテアーゼ処理で分解用ＦＡＯＤを失活させなくとも、例えば、前記分解用ＦＡＯＤの添加量と、測定用ＦＡＯＤの添加量とを調整することによっても、高精度な測定を実現することもできる。この場合、例えば、前記分解用ＦＡＯＤ（Ａ）と測定用ＦＡＯＤ（Ｂ）の添加割合（活性比Ａ：Ｂ）を、Ａ：Ｂ＝１：１０〜１：５０，０００の範囲に設定することが好ましい。このような添加割合であれば、プロテアーゼ処理を行う際に、前記分解用ＦＡＯＤが残存しても、酵素の反応速度論の点から、糖化タンパク質はもちろんのこと、非測定対象糖化物である糖化アミノ酸に比べて測定糖化アミンである糖化ペプチドには作用し難いからである。また、非測定対象糖化物が糖化ペプチドであり、測定糖化アミンが糖化タンパク質の場合も同様である。
【００２３】
本発明の測定方法において、前記プロテアーゼとしては、例えば、メタロプロテアーゼ、ブロメライン、パパイン、トリプシン、プロテアーゼＫ、ズブチリシンおよびアミノペプチダーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼが使用できるが、特に制限されない。
【００２４】
また、測定対象物が、後述のような糖化ヘモグロビンである場合は、前記プロテアーゼは、糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテアーゼであって、メタロプロテアーゼ、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシンおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来のプロテアーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼであることが好ましく、より好ましくはメタロプロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来のプロテアーゼであり、特に好ましくはメタロプロテアーゼである。このようなプロテアーゼを作用させれば、糖化ヘモグロビン以外の糖化タンパク質は分解され難いため、前記他の糖化タンパク質にはＦＡＯＤも作用し難く、糖化ヘモグロビンのみの測定が可能になる。
【００２５】
本発明において、測定試料は特に制限されず、例えば、全血、血漿、血清、血球、尿、髄液等の生体試料や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等の試料に対しても、本発明の測定方法を適用できる。この中でも、例えば、前記全血、血漿、血清、血球などの血液試料やその他の生体試料に有用である。
【００２６】
また、例えば、前記全血試料が外来の糖化アミノ酸等を含んでいても、高精度な測定が可能である。例えば、前述のように外来の糖化アミノ酸は一過性のものであるが、全血中に含まれる間は著しく糖化タンパク質等の測定値に影響を与える。しかし、本発明によればそのような影響も回避できるからである。
【００２７】
前記全血試料は、特に制限されないが、本発明の測定方法は、例えば、点滴後の患者から採取した全血試料に対して有用である。前述のように、特に点滴後の試料に、生成された外来アミノ酸による測定値の変動がみられるからである。
【００２８】
本発明の測定方法において、測定対象物としては、酸化還元反応を利用するものであれば特に制限されない。例えば、全血中成分、赤血球内成分、血漿中成分、血清中成分、尿成分、髄液成分等があげられるが、好ましくは赤血球内成分である。例えば、前記赤血球成分を測定する場合、全血をそのまま溶血させたものを試料としてもよいし、全血から赤血球を分離して、前記赤血球を溶血させたものを試料として用いてもよい。
【００２９】
本発明の測定方法において、前記測定対象物の糖化アミンとしては、前述のように糖化タンパク質、糖化ペプチド、糖化アミノ酸等が含まれる。具体的には、例えば、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミン等の糖化タンパク質等があげられる。なお、赤血球成分である糖化ヘモグロビンを測定する場合は、例えば、全血をそのまま溶血させたものを試料としてもよいし、全血から赤血球を分離して、前記赤血球を溶血させたものを試料として用いてもよい。
【００３０】
本発明の測定方法において使用するＦＡＯＤは、下記式（１）に示す反応を触媒するＦＡＯＤであることが好ましく、例えば、α−アミノ基が糖化された糖化アミンに特異的に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ−α」という）、アミノ酸側鎖のアミノ基が糖化された糖化アミンに特異的に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ−Ｓ」という）、α−アミノ基が糖化された糖化アミンおよびアミノ酸側鎖のアミノ基が糖化された糖化アミンのいずれにも特異的に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ−αＳ」という）等があげられる。
【００３１】
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2 ＋ Ｈ2Ｏ ＋ Ｏ2
→ Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ ＮＨ2−Ｒ2 ＋ Ｈ2Ｏ2 …（１）
前記式（１）において、Ｒ1は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を意味する。前記糖残基（Ｒ1）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ1）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ1）は、例えば、
−［ＣＨ（ＯＨ）］n−ＣＨ2ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
前記式（１）において、Ｒ2は、特に制限されないが、糖化アミンが糖化アミノ酸または糖化ペプチドの場合、α−アミノ基が糖化されている場合と、それ以外のアミノ基（アミノ酸側鎖のアミノ基）が糖化されている場合とで異なる。
前記式（１）において、α−アミノ基が糖化されている場合、Ｒ2は、下記式（２）で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。この場合に前記式（１）の反応を特異的に触媒するのが前記ＦＡＯＤ−αおよびＦＡＯＤ−αＳである。
−ＣＨＲ3−ＣＯ−Ｒ4 …（２）
前記式（２）において、Ｒ3はアミノ酸側鎖基を示し、Ｒ4は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で示すことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様に、アミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
−（ＮＨ−ＣＲ3Ｈ−ＣＯ）n−ＯＨ …（３）
また、前記式（１）において、α−アミノ基以外のアミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基が糖化されている）場合、Ｒ2は下記式（４）で示すことができる。この場合に前記式（１）の反応を特異的に触媒するのが前記ＦＡＯＤ−ＳおよびＦＡＯＤ−αＳである。
−Ｒ5−ＣＨ（ＮＨ−Ｒ6）−ＣＯ−Ｒ7 …（４）
前記式（４）において、Ｒ5は、アミノ酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、Ｒ5は
−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−
であり、
例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、Ｒ5は、
−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ2）−
である。
また、前記式（４）において、Ｒ6は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（５）で示すことができる。なお、下記式（５）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
−（ＣＯ−ＣＲ3Ｈ−ＮＨ）n−Ｈ …（５）
また、前記式（４）において、Ｒ7は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（６）で示すことができる。なお、下記式（６）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
−（ＮＨ−ＣＨＲ3−ＣＯ）n−ＯＨ …（６）
【００３２】
前記糖化α−アミノ基に特異的に作用するＦＡＯＤ−αとしては、例えば、市販の商品名フルクトシル−アミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＸ−Ｅ）（キッコーマン社製）、ペニシリウム属由来ＦＡＯＤ（特開平８−３３６３８６公報）等があげられる。前記糖化されたアミノ酸側鎖に特異的に作用するＦＡＯＤ−Ｓとしては、例えば、フサリウム属由来ＦＡＯＤ（日本生物工学会大会 平成１２年度 「Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ 由来アミノ酸オキシダーゼの基質特異性の変換；藤原真紀 他」）等があげられる。また、前記糖化α−アミノ基および糖化アミノ酸側鎖基の両方に作用するＦＡＯＤ−αＳとしては、例えば、市販の商品名ＦＯＤ（旭化成社製）、ギベレラ属由来ＦＡＯＤ（特開平８−１５４６７２号公報）、フサリウム属由来ＦＡＯＤ（特開平７−２８９２５３号公報）、アスペルギルス属由来ＦＡＯＤ（ＷＯ９９／２００３９号）等があげられる。
【００３３】
つぎに、本発明の測定方法について、非測定対象糖化物として糖化アミノ酸を含む全血試料を用いて、血球由来の糖化タンパク質を測定する例をあげて説明する。なお、本発明において「非測定対象糖化物である糖化アミノ酸」は、特に示さない限り、測定前から試料中に含まれるものをいい、例えば、測定対象物である糖化タンパク質のプロテアーゼ分解物は含まない。
【００３４】
（第１の実施形態）
この実施形態は、前記糖化アミノ酸の分解にＦＡＯＤ−αを使用し、糖化タンパク質の測定にＦＡＯＤ−αＳを用いた前記第１の測定方法の一例である。
【００３５】
まず、全血を溶血して溶血試料を調製する。この溶血方法は、特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法、凍結溶解による方法等が使用できる。この中でも、操作の簡便性等の理由から、界面活性剤を用いる方法が好ましい。
【００３６】
前記界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニル エーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン ソルビタン アルキル エステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン アルキル エーテル（Ｂｒｉｊ系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、商品名Ｔｗｅｅｎ−２０、商品名Ｂｒｉｊ３５等があげられる。前記界面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が１〜１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．１〜１重量％になるように前記界面活性剤を添加し、室温で５秒〜１分程度攪拌すればよい。
【００３７】
また、前記浸透圧の差を利用する場合は、例えば、全血の体積に対し２〜１００倍体積量の精製水を添加して溶血させる。
【００３８】
つぎに、前記溶血試料に対し、プロテアーゼ処理を行う。このプロテアーゼ処理によって糖化タンパク質を分解し、後述するＦＡＯＤが作用し易いようにする。前記プロテアーゼの種類は、特に制限されず、前述のようなプロテアーゼＫ、ズブチリシン、トリプシン、アミノペプチダーゼ、パパイン、メタロプロテイナーゼ等が使用できる。前記プロテアーゼ処理は、通常、緩衝液中で行われ、その処理条件は、使用するプロテアーゼの種類、測定対象の糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される。
【００３９】
プロテアーゼとしてトリプシンを用いて、前記試料を処理する場合、例えば、反応液中のプロテアーゼ濃度１００〜６，０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．２〜５体積％、反応温度２０〜５０℃、反応時間１０分〜２０時間、ｐＨ６〜９の範囲である。この処理は、通常、緩衝液中で行われ、使用できる緩衝液は特に制限されないが、例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等である。
【００４０】
つぎに、前記プロテアーゼ処理した溶血試料を、前記式（１）の反応、具体的には下記式（７）の反応を触媒するＦＡＯＤ−αで処理する。
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨＲ3−ＣＯＯＨ ＋ Ｈ2Ｏ ＋ Ｏ2
→ Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ ＮＨ2−ＣＨＲ3−ＣＯＯＨ ＋ Ｈ2Ｏ2 …（７）
前記式（７）において、Ｒ1は前述と同様の糖残基を示し、Ｒ3は前述と同様にアミノ酸側鎖を示す。
【００４１】
この処理によって、前記溶血試料に含まれるα−アミノ基が糖化された糖化アミノ酸、および前記糖化タンパク質分解物のうちα−アミノ基の糖化部分が分解される。
【００４２】
なお、前記ＦＡＯＤ−α処理によっては、糖化アミノ酸の中でも側鎖アミノ基が糖化されたものは分解されずに残存する。しかし、この側鎖が糖化されたアミノ酸の糖化アミノ酸全体に対する割合と、糖化タンパク質における糖化された側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基に対する割合から考えても、残存する糖化アミノ酸の影響は小さく、測定精度は十分に向上するといえる。
【００４３】
処理条件としては、例えば、反応液中のＦＡＯＤ−α濃度１０〜５０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．５〜２０体積％、反応温度２０〜５０℃、反応時間１分〜１時間、ｐＨ６〜９の範囲である。この処理は、通常、緩衝液中で行われ、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
【００４４】
つぎに、前記ＦＡＯＤ−α処理した前記溶血試料を、さらにＦＡＯＤ−αＳで処理する。このＦＡＯＤ−αＳは、前述のように、糖化されたα−アミノ基および糖化された側鎖アミノ基の両方に作用する。しかし、糖化タンパク質分解物は、予め、分解用ＦＡＯＤ−αによって処理されているため、糖化された側鎖アミノ基のみに測定用ＦＡＯＤ−αＳを作用させることができる。
【００４５】
このＦＡＯＤ−αＳ処理は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましく、前記緩衝液としては、特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
【００４６】
処理条件としては、例えば、反応液中のＦＡＯＤ−αＳ濃度１０〜３０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．１〜５体積％、反応温度２０〜５０℃、反応時間１分〜１時間、ｐＨ６〜９の範囲である。
【００４７】
つぎに、前記ＦＡＯＤ−αＳ処理で生成した過酸化水素を、ＰＯＤおよび前記発色性基質を用いてさらに酸化還元反応によって測定する。
【００４８】
前記発色性基質としては、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとを組み合せた基質等があげられる。前記トリンダー試薬としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等があげられる。また、前記アミノアンチピリンの他に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。このような発色性基質の中でも、特に好ましくは、前述のように、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムである。
【００４９】
前記酸化還元反応は、通常、緩衝液中で行われ、その条件は、前記生成した過酸化水素の濃度等により適宜決定される。通常、反応液中のＰＯＤ濃度１０〜１００，０００ ＩＵ／Ｌ、発色性基質濃度０．００５〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ、反応温度１５〜３７℃、反応時間０．１〜３０分、ｐＨ５〜９である。また、前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、前記プロテアーゼ処理およびＦＡＯＤ処理等と同様の緩衝液等が使用できる。
【００５０】
前記酸化還元反応において、例えば、前記発色性基質を用いた場合、前記反応液の発色程度（吸光度）を分光光度計で測定することにより、過酸化水素の量を測定できる。そして、例えば、この過酸化水素濃度と検量線等とを用いて、試料中の糖化タンパク質の量を求めることができる。本実施形態においては、アミノ酸残基の側鎖アミノ基の糖化量によって、糖化タンパク質の量や糖化量を測定することとなる。
【００５１】
なお、はじめに添加した分解用ＦＡＯＤ−αによって生成した過酸化水素は、血液試料（溶血試料）に存在するカタラーゼによって消失するため、ＦＡＯＤ−αＳにより生成した測定対象物由来の過酸化水素の測定には影響を及ぼすことはない。また、別途カタラーゼを添加して消去させてもよい。このように前記カタラーゼにより過酸化水素を消去した場合、後に行うＦＡＯＤ−αＳ処理で生成する過酸化水素までもが消去されることを防ぐために、ＦＡＯＤ−αＳの添加と共に、過剰量のＰＯＤおよび発色性基質を添加することが好ましい。この場合、ＰＯＤは、前記カタラーゼの添加量（Ｕ）に対し、例えば、５〜１００倍の活性（Ｕ）量を添加することが好ましい。
【００５２】
前記過酸化水素量は、前記ＰＯＤ等を用いた酵素的手法の他に、例えば、電気的手法により測定することもできる。
【００５３】
この測定において、前記プロテアーゼ処理は、前述のように前記分解用ＦＡＯＤ−α処理の前には限られず、例えば、前記ＦＡＯＤ−α処理の後に行ってもよい。前記プロテアーゼ処理は、前述のように、ＦＡＯＤを作用し易くするために行うが、前記ＦＡＯＤ−αは糖化アミノ酸の分解を目的として行うため、ＦＡＯＤ−α処理前にプロテアーゼによって糖化タンパク質が分解されていなくても、本発明の効果は十分に得ることができるからである。
【００５４】
また、例えば、非測定対象糖化物が、α−アミノ基が糖化された糖化アミノ酸であって、測定対象糖化アミンが、α−アミノ基が糖化された糖化タンパク質である場合等にも本実施形態の測定方法が適用できる。この場合は、分解用ＦＡＯＤが糖化タンパク質に作用し難くても、例えば、残存した分解用ＦＡＯＤがプロテアーゼ処理によるプロテアーゼ分解物に作用してしまうことが考えられるため、例えば、後述する第２の実施形態のように残存するＦＡＯＤをプロテアーゼ分解により失活させたり、第３の実施形態のように分解用ＦＡＯＤと測定用ＦＡＯＤの添加割合を調整することが好ましい。
【００５５】
（第２の実施形態）
この実施形態は、非測定対象糖化物である糖化アミノ酸の分解と測定対象である糖化タンパク質の測定に、同じＦＡＯＤを用いた前記第２の測定方法の一例である。ＦＡＯＤとしては、特に制限されず、例えば、ＦＡＯＤ−α、ＦＡＯＤ−Ｓ、ＦＡＯＤ−αＳのいずれを用いてもよい。
【００５６】
前記第１の実施形態と同様にして溶血試料を調製し、この溶血試料に分解用ＦＡＯＤを添加する。
【００５７】
処理条件としては、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度１０〜５０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．５〜２０体積％、反応温度２０〜５０℃、反応時間１分〜１時間、ｐＨ６〜９の範囲である。この処理は、通常、緩衝液中で行われ、前述と同様の緩衝液が使用できる。
【００５８】
つぎに、ＦＡＯＤ処理した試料に対しプロテアーゼ処理を行う。このプロテアーゼ処理の第１の目的は、前述と同様に、血球由来の糖化タンパク質を分解し、後の工程でさらに添加する測定用ＦＡＯＤを作用し易くするためである。そして、第２の目的は、前記分解用ＦＡＯＤを消化して失活させるためである。
【００５９】
ＦＡＯＤは、糖化タンパク質に作用し難く、糖化アミノ酸に作用し易いため、前記分解用ＦＡＯＤ処理では、試料中の糖化アミノ酸がまず分解される。しかし、この分解用ＦＡＯＤが残っている状態で、前記糖化タンパク質をプロテアーゼ処理すると、残存するＦＡＯＤと糖化タンパク質分解物の糖化部分とが反応してしまい、正確な測定ができないという問題がある。したがって、この残存するＦＡＯＤをプロテアーゼで失活させ、前記糖化タンパク質分解物との反応を防止ればよい。このためには、はじめに添加した分解用ＦＡＯＤを速やかに失活させ、かつ、糖化タンパク質を分解できるだけのプロテアーゼを添加する必要がある。
【００６０】
前記プロテアーゼとしては、特に制限されず、前述と同様のものが使用できる。また、その処理条件は、例えば、使用するプロテアーゼの種類、糖化タンパク質の種類やその濃度、分解用ＦＡＯＤの種類やその量等に応じて適宜決定される。
【００６１】
プロテアーゼ処理の反応溶液におけるプロテアーゼの添加量は、分解用ＦＡＯＤ １００Ｕ／Ｌに対して、例えば、１〜１０００，０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは１０〜３００，０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、より好ましくは１００〜１００，０００ＫＵ／Ｌの範囲である。
【００６２】
具体的に、プロテアーゼとしてトリプシンを用いて、前記試料を処理する場合、例えば、反応液中のプロテアーゼ濃度１０００〜３０，０００ＫＵ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．２〜５体積％、反応液中のＦＡＯＤ濃度１０〜１０００Ｕ／Ｌ、反応温度２０〜５０℃、反応時間１０分〜２０時間、ｐＨ６〜９の範囲である。
【００６３】
つぎに、前記プロテアーゼ処理により得られた糖化タンパク質分解物に、分解用ＦＡＯＤと同じＦＡＯＤを、再度測定用ＦＡＯＤとして添加して処理する。この測定用ＦＡＯＤは、前記プロテアーゼによって失活するおそれがあるため、十分量添加する必要がある。
【００６４】
この測定用ＦＡＯＤ処理も、前述と同様に緩衝液中で行うことが好ましく、前記緩衝液としては、特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
【００６５】
測定用ＦＡＯＤ処理の反応溶液における測定用ＦＡＯＤの添加量は、プロテアーゼ１０，０００ＫＵ／Ｌに対して、例えば、１０〜１０００，０００Ｕ／Ｌの範囲であり、好ましくは１００〜２００，０００Ｕ／Ｌの範囲であり、より好ましくは５００〜５０，０００Ｕ／Ｌの範囲である。
【００６６】
具体的な処理条件としては、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度５００〜２０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中のプロテアーゼ濃度１００〜３０，０００ＫＵ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０１〜１体積％、反応温度１５〜４０℃、反応時間１分〜１時間、ｐＨ６〜９の範囲である。
【００６７】
このような実施形態によれば、糖化アミノ酸の分解と糖化タンパク質の測定に使用するＦＡＯＤが同じであっても、前記糖化アミノ酸の影響を受けることなく、高い精度で測定が可能である。
【００６８】
（第３の実施形態）
この実施形態は、非測定対象糖化物である糖化アミノ酸の分解と測定対象である糖化タンパク質の測定に、同じＦＡＯＤを用いた例である。但し、この実施形態は、前記第２の実施形態とは異なり、分解用ＦＡＯＤを、プロテアーゼによって必ずしも失活させる必要がない。酵素には基質特異性があるため、プロテアーゼとＦＡＯＤとの組み合わせによっては、ＦＡＯＤをプロテアーゼで失活させ難い場合がある。このような場合に本実施形態の方法が有効になる。なお、はじめに添加した分解用ＦＡＯＤが、プロテアーゼにより生成した糖化タンパク質分解物と反応すると、測定精度を向上できないため、以下に示すように、ＦＡＯＤの添加割合を調整することが重要となる。
【００６９】
まず、前記第１の実施形態と同様にして溶血試料を調製し、この溶血試料に分解用ＦＡＯＤを添加する。
【００７０】
分解用ＦＡＯＤは、プロテアーゼで失活させ難い場合、活性が残存しても、プロテアーゼ処理の間に、生成した糖化タンパク質分解物に作用しない範囲で添加する必要がある。なお、ＦＡＯＤは、糖化タンパク質に作用し難く、糖化ペプチドよりも糖化アミノ酸により一層作用し易いという性質を有するため、例えば、糖化アミノ酸のみに作用する程度の添加量であり、かつ反応時間とすることが好ましい。
【００７１】
ＦＡＯＤ処理の条件としては、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度１０〜５０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．２〜２０体積％、反応温度２０〜５０℃、反応時間１分〜１時間、ｐＨ６〜９の範囲である。この処理は、通常、緩衝液中で行われ、前述と同様の緩衝液が使用できる。
【００７２】
つぎに、前記ＦＡＯＤ処理した試料に対しプロテアーゼ処理を行う。この実施形態は、前述のように、プロテアーゼが前記ＦＡＯＤに作用し難い場合の例であるため、プロテアーゼの添加量は特に制限されない。
【００７３】
前記プロテアーゼとしては、特に制限されず、前述と同様のものが使用できる。その処理条件は、前述と同様に、使用するプロテアーゼの種類、測定対象の糖化タンパク質の種類およびその濃度、はじめに添加したＦＡＯＤの種類およびその濃度、使用するプロテアーゼのＦＡＯＤに対する基質特異性等により適宜決定される。
【００７４】
このような実施形態に該当するＦＡＯＤとプロテアーゼの組み合わせとしては、例えば、商品名ＦＯＤ（旭化成社製）と商品名トヨチーム（東洋紡社製）、前記ギベレラ属由来ＦＡＯＤと商品名プロテナーゼＫ（ロッシュ社製）の組み合わせ等があげられる。
【００７５】
プロテアーゼとしてトリプシンを用いて、前記試料を処理する場合、例えば、反応液中のプロテアーゼ濃度１００〜６０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．２〜５体積％、反応液中のＦＡＯＤ濃度０．１〜１００Ｕ／Ｌ、反応温度２０〜５０℃、反応時間１０分〜２０時間、ｐＨ６〜９の範囲である。
【００７６】
続いて、前記プロテアーゼ処理により得られた分解物に、再度同じＦＡＯＤを測定用ＦＡＯＤとして添加する。
【００７７】
この測定用ＦＡＯＤ処理も、前述と同様に緩衝液中で行うことが好ましく、前記緩衝液としては、特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
【００７８】
このように、本実施形態においては、分解用ＦＡＯＤ（Ａ）と測定用ＦＡＯＤ（Ｂ）の添加割合（活性比Ａ：Ｂ）を、例えば、前述のように１：５０，０００〜１：１０の範囲、好ましくは１：５０００〜１：２５の範囲、より好ましくは１：５００〜１：５０の範囲にする。このように設定すれば、前記第２の実施形態と異なり前記分解用ＦＡＯＤは反応液中に残存するが、この残存したＦＡＯＤの反応速度は非常に遅いため、プロテアーゼ処理工程において、測定に影響を与える程度に、生成した糖化タンパク質分解物に残存ＦＡＯＤが作用することはない。
【００７９】
処理条件としては、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度５００〜２０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中のプロテアーゼ濃度１００〜３０，０００ＫＵ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０１〜１体積％、反応温度１５〜４０℃、反応時間１分〜１時間、ｐＨ６〜９の範囲である。
【実施例】
【００８０】
（実施例１および比較例１）
患者に、アミノ酸およびブドウ糖を含む点滴を行い、１時間後、血液を採取した。その血液を遠心分離（１０００ｇ、１０分間）して血球と血漿とに分離し、前記血球画分０．００６ｍＬ、前記血漿画分０．００６ｍＬおよび下記溶血試薬Ａ ０．４５ｍＬとを混合して、前記血球を溶血させて溶血試料を調製した。
【００８１】
（溶血試薬Ａ：ｐＨ８．５）
商品名ＴＡＰＳ（同仁化学社製） １４０ｍｍｏｌ／Ｌ
グリシンアミド（ナカライテスク社製） ６０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ナカライテスク社製） ２４ｇ／Ｌ
【００８２】
前記溶血試料に下記各種ＦＡＯＤ溶液（濃度２００ＫＵ／Ｌ）０．００２３ｍＬを２５℃で添加し、３７℃で４０分間インキュベートを行った。なお、下記（１）ペニシリウム属由来ＦＡＯＤは、糖化されたα−アミノ基に特異的に作用し、（２）アスペルギルス属由来ＦＡＯＤは、糖化されたα−アミノ基および糖化されたε−アミノ基に特異的に作用し、（３）ＦＡＯＸ−Ｅは、糖化されたα−アミノ基に特異的に作用するＦＡＯＤである。
【００８３】
（使用したＦＡＯＤ）
（１）前記ペニシリウム属由来ＦＡＯＤ（特開平８−３３６３８６公報）
（２）前記アスペルギルス属由来ＦＡＯＤ（ＷＯ９９／２００３９号）
（３）商品名ＦＡＯＸ−Ｅ（キッコーマン社製、以下同じ）
【００８４】
つぎに、前記ＦＡＯＤを添加した溶血試料０．０１ｍＬに精製水０．０１ｍＬを添加し、さらに下記プロテアーゼ試薬０．０６５ｍＬを添加して３７℃で５分間インキュベートした。続いて、下記発色試薬０．０４５ｍＬを添加して３７℃で３分間インキュベートし、反応液の吸光度（波長７５１ｎｍ）を測定装置（商品名ＪＣＡ ＢＭ−８、日本電子社製）によって測定した。なお、比較例としては、前記溶血試料に、前記各種ＦＡＯＤに代えて精製水を添加した以外は、前記実施例と同様にして測定を行った。また、コントロールとしては、前記血球に、前記血漿に代えて精製水を添加した以外は、前記実施例と同様にして測定を行った。これらの結果を下記表１に示す。
【００８５】
（プロテアーゼ試薬：ｐＨ６．５）
ＭＯＰＳ（同仁化学社製） ５ｍｍｏｌ／Ｌ
テトラゾリウム化合物（商品名ＷＳＴ−３、同仁化学社製） ２ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＮ3（ナカライテスク社製） ０．０５ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ2（ナカライテスク社製） ５ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ（ナカライテスク社製） ３００ｍｍｏｌ／Ｌ
メタロプロテアーゼ ３ｇ／Ｌ
【００８６】
（発色試薬）
ギベレラ属由来ＦＡＯＤ（特開平８−１５４６７２号公報） ２６ＫＵ／Ｌ
ＰＯＤ（東洋紡社製） ７７．６ＫＵ／Ｌ
発色基質（商品名ＤＡ−６４、和光純薬工業社製） ０．０５２ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．９） ２００ｍｍｏｌ／Ｌ
【００８７】
【表１】
【００８８】
前記表１に示すように、比較例１では、血漿中に含まれる糖化アミノ酸も発色試薬に含まれるＦＡＯＤと反応してしまうため、血球中の糖化タンパクのみを測定したコントロールよりも高い吸光度となった。これに対して、実施例１は、血漿中の糖化アミノ酸を予めＦＡＯＤで処理しているため、前記糖化タンパク質を正確に測定することができ、コントロールとの相関も高かった。これは、発色試薬に含有されたＦＡＯＤを、血球由来の糖化タンパク質分解物のみに作用させることができたからである。
【００８９】
（実施例２および比較例２）
前記実施例１と同様に点滴後の血液を採血し、これを静置した。そして、自然沈降した血球を回収し、この血球画分０．０１ｍＬに下記溶血試薬Ｂ ０．３ｍＬを添加して溶血試料を調製した。この溶血試料のＨｂ濃度およびＨｂＡ１ｃ濃度を、前記自動分析装置により分析した。なお、前記血球は自然沈降により回収しているため、前記血球画分は血漿成分を含んでいる。
【００９０】
（溶血試薬Ｂ：ｐＨ８．５）
商品名ＴＡＰＳ（同仁化学社製） １４０ｍｍｏｌ／Ｌ
グリシンアミド（ナカライテスク社製） ６０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ナカライテスク社製） ２４ｇ／Ｌ
商品名ＦＡＯＸ−Ｅ（キッコーマン社製、以下同じ） １ＫＵ／Ｌ
【００９１】
前記溶血試料０．０１ｍＬに精製水０．０１ｍＬおよび前記プロテアーゼ試薬０．０６５ｍＬを添加して３７℃でインキュベートした。そして、インキュベート開始から４．５分後における５７１ｎｍの吸光度を測定し、これをＨｂ濃度を示す吸光度とした。続いて、インキュベート開始から５分後に、実施例１と同じ発色試薬０．０４５ｍＬを添加して３７℃で３分間インキュベートし、さらに３分間反応させた後の７５１ｎｍにおける吸光度を前記自動分析装置により測定し、ＨｂＡ１ｃ濃度を示す吸光度とした。
【００９２】
そして、予め作成したＨｂ濃度（ｇ／Ｌ）またはＨｂＡ１ｃ濃度（ｇ／Ｌ）と、吸光度との関係を示す検量線に、測定したそれぞれの吸光度を代入してＨｂＡ１ｃ濃度およびＨｂ濃度を求め、下記式からＨｂＡ１ｃ％を算出した。
ＨｂＡ１ｃ（％）＝（ＨｂＡ１ｃ濃度／Ｈｂ濃度）×１００
【００９３】
なお、前記検量線は、以下に示す方法で作成した。まず、ＨｂＡ１ｃ濃度およびＨｂ濃度が既知である種々濃度の標準液について、自動測定器（商品名ＨＡ−８１５０：アークレイ株式会社）を用いてＨｂＡ１ｃ濃度とＨｂ濃度とを測定した。一方、前記各標準液について、前記実施例と同様の測定方法により、Ｈｂ濃度およびＨｂＡ１ｃ濃度に相当する吸光度の測定を行った。そして、前記自動測定器による測定値と前記吸光度から一次回帰式を作成し、これを検量線とした。
【００９４】
比較例２としては、前記血球に、前記溶血試薬Ｂの代わりに、商品名ＦＡＯＸ−Ｅを含有しない前記溶血試薬Ａを添加した以外は、前記実施例２と同様にして測定を行った。
【００９５】
また、コントロールとしては、自然沈降により回収した前記血球画分０．０５ｍＬに、下記自動測定器ＨＡ−８１５０専用希釈液２．５ｍＬを添加して溶血させたものを、溶血試料とした。そして、この溶血試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度（％）を、前記自動測定器（商品名ＨＡ−８１５０：アークレイ株式会社）により測定した値を使用した。
【００９６】
以上の結果を図１に示す。同図は、酵素法により測定した実施例２および比較例２のＨｂＡ１ｃ（％）と、コントロールの自動分析によるＨｂＡ１ｃ（％）との関係を示すグラフである。同図において、実施例は、相関式、「ｙ＝１．０７９ｘ−０．４０９」、相関係数「０．９６７」であり、比較例は、相関式、「ｙ＝１．１２４ｘ−０．５５９」、相関係数「０．９３１」であった。
【００９７】
図１に示すように、実施例２によれば、血漿中に含まれる外来の糖化アミノ酸は、はじめのＦＡＯＤ処理（溶血試薬Ｂ中のＦＡＯＤ）によって分解されており、この処理によって発生する過酸化水素も試料中のカタラーゼによって消失している。このため、後で添加するＦＡＯＤによる酸化還元反応においては、血球の糖化タンパク質由来の過酸化水素のみが発生し、血漿を添加せずに自動分析により測定したコントロールの値と非常に近い値が得られ、その相関係数（０．９６７）も非常に高かった。一方、比較例２においては、血漿中に含まれる糖化アミノ酸についても、糖化タンパク質に作用させるためのＦＡＯＤが反応するため、発生する過酸化水素の量も、糖化タンパク質により生じる過酸化水素の量よりも多くなる。このため、比較例のＨｂＡ１ｃ（％）は、コントロールのＨｂＡ１ｃ（％）よりも高い値となり、コントロールとの相関関係も実施例２に比べて低い結果となった（相関係数０．９３１）。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
以上のように、本発明の試料の前処理方法によれば、試料中に含まれる非測定対象糖化物である糖化ペプチドや糖化アミノ酸を分解除去できるため、このような前処理済み試料について糖化アミンの測定を行えば、前記非測定対象糖化物による影響を回避できるため、優れた測定精度となる。このため、例えば、採血前に点滴を受けた患者の血液であって、一過性の外来糖化アミノ酸等を含む場合であっても、その影響を回避できる。このような方法を、例えば、赤血球中の糖化ヘモグロビンの測定の際に適用すれば、従来よりも測定精度が向上し、糖尿病診断等の指標物質としての重要性がさらに向上する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化アミンを測定するための試料の前処理方法および糖化アミンの測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、酸化還元反応を利用して、試料中の測定対象物の量を測定することが広く実施されており、生化学分析や臨床検査等における糖化アミン（糖化タンパク質、糖化ペプチド、糖化アミノ酸等）の測定にも適用されている。
【０００３】
特に、血液中の糖化タンパク質、その中でも赤血球中の糖化ヘモグロビンは、生体血糖値の過去の履歴を反映しているため、糖尿病診断や治療等における重要な指標とされている。このような赤血球中の糖化タンパク質は、前記酸化還元反応を用いて、例えば、以下に示すようにして測定されている。
【０００４】
まず、赤血球を溶血させた試料を調製し、この溶血試料にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）を添加し、糖化タンパク質の糖化部分に作用させて酸化還元反応により過酸化水素を発生させる。この過酸化水素量は、前記糖化タンパク質量に対応する。そして、この試料に、ペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）および酸化により発色する還元剤を添加し、前記ＰＯＤを触媒として前記過酸化水素と前記還元剤との間で酸化還元反応させる。前記反応により前記還元剤を発色させ、この発色を測定することにより前記過酸化水素量が測定でき、この結果、赤血球中の糖化タンパク質量を知ることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、このような酸化還元反応を用いた糖化タンパク質の測定方法において、例えば、実際に試料中に含まれる糖化タンパク質に対応する以上の過酸化水素が発生するという問題があった。また、患者によっては、一時的に糖化タンパク質の測定値が急激に増加し、信頼性ある測定が行えないという問題もあった。このため、前記測定方法において、さらなる測定精度の向上が求められている。また、前記酸化還元反応を用いた測定方法には限られず、例えば、抗原抗体反応を用いた糖化アミン測定方法においても、同様に測定精度の向上が求められている。
【０００６】
そこで、本発明は、糖化アミンを測定するための試料の前処理方法の提供であって、これにより、信頼性に優れた糖化アミンの測定を可能にすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明の前処理方法は、糖化アミンを測定対象とする試料の前処理方法であって、前記試料中に測定対象の糖化アミンとは別に存在する糖化アミノ酸または糖化ペプチドを除去することを目的として、前記別に存在する糖化アミノ酸または糖化ペプチドにＦＡＯＤを作用させて分解する方法である。
【０００８】
なお、前記ＦＡＯＤは、一般名称であり、その基質としては糖化アミノ酸には限られず、例えば、糖化ペプチドにも作用する。また、本発明において「糖化ペプチド」とは、ＦＡＯＤが作用する長さのペプチドをいい、アミノ酸残基数が、例えば、２〜６の範囲のものをいう。これに伴い、本発明においては、ＦＡＯＤが作用しない長さの糖化ペプチドおよび糖化タンパク質を併せて「糖化タンパク質」という。そして、測定対象の前記糖化アミンとしては、例えば、糖化タンパク質、糖化ペプチド、糖化アミノ酸が含まれる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明者らは、測定精度の向上を図るべく鋭意研究を行った結果、以下の事を突き止めた。つまり、全血中には、本来、測定対象物である糖化アミンの他に、測定対象物以外の遊離の糖化アミノ酸や糖化ペプチドが存在しており、前記ＦＡＯＤは、このような糖化アミノ酸や糖化ペプチドに対しても作用する。このため、前述のようなＦＡＯＤを用いた糖化アミンの測定を行った場合、測定対象の糖化アミンとＦＡＯＤとの酸化還元反応だけでなく、測定対象以外の糖化アミノ酸や糖化ペプチドとＦＡＯＤとの酸化還元反応も生じてしまい、見かけ上、測定対象物の測定値が増加してしまうのである。さらに、同じ患者の全血試料について、全く同じ条件で前記測定方法により測定を行った場合でも、患者によっては採血時が異なると測定値が著しく変動するという前述の問題に関しても、以下の事を突き止めた。すなわち、この問題は、主に点滴等を受けた患者に見られる現象であり、このように測定値が変動するのは、点滴等の成分として、例えば、グルコース等の糖類や各種アミノ酸が含まれると、これらの外来成分から糖化アミノ酸が生成され、一過的に糖化アミノ酸が増加するためであることを突き止めたのである。このような現象は、前記酸化還元反応による測定においてだけでなく、例えば、前記抗原抗体反応を用いた測定方法においても、同様に生じていた。そこで、全血試料中に、恒常的な糖化アミノ酸や糖化ペプチド、一過性の外来糖化アミノ酸等といった測定対象物以外の糖化物が存在しても、本発明のように、試料に対して、予め、測定対象物以外の糖化アミノ酸や糖化ペプチドに分解用ＦＡＯＤを作用させて分解する前処理を行えば、前述のような見かけ上の測定値の向上が抑制されることを、本発明者らが初めて見出したのである。これによって、測定精度が向上でき、さらに、例えば、点滴を受けたか否かに関わらず、いつでも採血を行うことができるため、患者の負担も低減できる。このような試料の前処理方法を、例えば、前述のような糖化ヘモグロビンの測定において適用すれば、糖化ヘモグロビンの糖尿病診断の指標としての信頼性も増し、臨床医療等の分野において有用な方法となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の測定方法の一実施例において、ＦＡＯＤを用いた測定方法によるＨｂＡ１ｃ量と、自動分析装置によるＨｂＡ１ｃ量との相関関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
つぎに、本発明の測定方法は、試料中の糖化アミンにＦＡＯＤを作用させて、その酸化還元反応を測定することにより糖化アミンの量を測定する方法であって、前記試料中の糖化アミンとは別に存在する糖化アミノ酸または糖化ペプチドを除去することを目的として、前記酸化還元反応に先立ち、予め、前記試料を前記本発明の前処理方法によって処理して、前記糖化アミノ酸または糖化ペプチドを分解する方法である。
【００１２】
前述のような理由から、このような測定方法によれば、測定精度を向上できる。以下、本発明において、前記糖化アミノ酸や糖化ペプチドを分解するためのＦＡＯＤを「分解用ＦＡＯＤ」といい、前記糖化アミンに作用させる測定のためのＦＡＯＤを「測定用ＦＡＯＤ」という。また、測定対象の糖化アミンとは別に存在する糖化アミノ酸および糖化ペプチドを、以下、「非測定対象糖化物」ともいう。
【００１３】
本発明の測定方法としては、例えば、前記非測定対象糖化物と前記測定対象糖化アミンとに、異なる基質特異性のＦＡＯＤを使用する第１の測定方法と、同じＦＡＯＤを使用する第２の測定方法とがあげられる。
【００１４】
なお、ＦＡＯＤには、後述するように、例えば、α−アミノ基の糖化部分に作用するもの、リジンやアルギニン等のアミノ酸残基の側鎖アミノ基の糖化部分に作用するもの、および前記両方の糖化部分に作用するもの等があり、その基質特異性はＦＡＯＤの種類により様々である。そして、糖化アミンの測定において、前記α−アミノ基の糖化部分、前記側鎖アミノ基の糖化部分または両方の糖化部分のいずれにＦＡＯＤを作用させても、その量を測定することが可能である。
【００１５】
本発明の第１の測定方法としては、前記非測定対象糖化物に作用させる分解用ＦＡＯＤと、測定対象糖化アミンに作用させる測定用ＦＡＯＤとが、異なる基質特異性を有することが好ましい。これによれば、分解用ＦＡＯＤによって前記非測定対象糖化物の糖化部分を分解し、糖化アミンについては、前記分解用ＦＡＯＤが作用していない糖化部分に、さらに異なる基質特異性の測定用ＦＡＯＤを作用させることができるため、前記非測定対象糖化物の影響を受けず、測定精度を向上できるからである。
【００１６】
具体的には、例えば、非測定対象物は、α−アミノ基が糖化されており、測定対象糖化アミンは、α−アミノ基糖化部分および側鎖アミノ基が糖化されている場合、前記分解用ＦＡＯＤは、糖化されたα−アミノ基に特異的に作用し、前記測定用ＦＡＯＤは、糖化されたα−アミノ基および糖化されたアミノ酸残基側鎖に特異的に作用する酵素であることが好ましい。前記測定用ＦＡＯＤは、α−アミノ基糖化部分および側鎖アミノ基糖化部分の両方に作用するため、従来の方法であれば、前述のようにα−アミノ基が糖化された非測定対象糖化物にも作用していた。しかし、本発明においては、前記非測定対象糖化物の糖化部分は、予め、前記糖化α−アミノ基に特異的に作用する分解用ＦＡＯＤによって分解されているため、これに測定用ＦＡＯＤが作用することはなく、見かけ上の測定値の増加が抑制されて精度が向上する。また、測定用ＦＡＯＤは、前述のようにα−アミノ基糖化部分および側鎖アミノ基糖化部分の両方に作用するため、糖化アミンのα−アミノ基糖化部分も分解用ＦＡＯＤにより分解されており、糖化アミンの側鎖アミノ基糖化部分のみに測定用ＦＡＯＤを作用させることができる。このため、特に側鎖アミノ基の糖化量に特徴がある糖化アミンの測定に、有用な方法といえる。このような糖化アミンとしては、例えば、ε−糖化リジン、糖化アルブミン等があげられる。
【００１７】
このように異なるＦＡＯＤを用いる場合、前記非測定対象糖化物にＦＡＯＤを作用させる前または作用させた後に、糖化アミンをプロテアーゼで分解し、この糖化アミン分解物に、前記測定用ＦＡＯＤを作用させて前記酸化還元反応を行うことが好ましい。糖化アミンを分解するのは、測定対象物が糖化タンパク質の場合、ＦＡＯＤは前記糖化タンパク質には作用し難く、前述のような糖化ペプチドや糖化アミノ酸に作用するからであり、また、前記糖化ペプチドよりも糖化アミノ酸により一層作用し易いからである。また、プロテアーゼ処理の順序が、非測定対象糖化物の分解処理の前後で制限されないのは、測定用ＦＡＯＤは、前述のように分解用ＦＡＯＤとは異なる糖化部分に作用できるため、糖化アミンの測定自体には影響を受けないからである。また、測定対象が糖化ペプチドの場合も、さらに短い糖化ペプチドや糖化アミノ酸に分解すれば、より一層ＦＡＯＤが作用し易いため、プロテアーゼ処理を施すことが好ましい。
【００１８】
なお、本発明において「非測定対象糖化物である糖化アミノ酸および糖化ペプチド」とは、特に示さない限り、分解処理前から試料中に含まれるものをいい、例えば、測定対象物である糖化タンパク質や糖化ペプチドのプロテアーゼ分解物は含まない。
【００１９】
つぎに、本発明の第２の測定方法としては、非測定対象糖化物に分解用ＦＡＯＤを作用させた後、測定対象の糖化アミンをプロテアーゼで分解し、さらに前記分解用ＦＡＯＤと同じＦＡＯＤを添加して、前記プロテアーゼ分解物に作用させて前記酸化還元反応を行うことが好ましい。このような方法は、例えば、被測定対象糖化物が糖化アミノ酸であって、測定糖化アミンが糖化タンパク質や糖化ペプチドの場合に有用である。
【００２０】
具体的には、前記プロテアーゼにより、前記分解用ＦＡＯＤを失活させることが好ましい。前述のように、ＦＡＯＤは、糖化タンパク質には作用し難く、また、糖化ペプチドよりも糖化アミノ酸により一層作用し易いという性質を有している。このため、非測定対象糖化物が糖化アミノ酸である場合、例えば、分解用ＦＡＯＤを添加しても、酵素の反応速度論から、糖化アミノ酸を分解する処理時間においては、糖化タンパク質には作用せず、糖化ペプチドにもあまり作用し難いといえる。しかし、続くプロテアーゼ処理の間も前記分解用ＦＡＯＤの活性が残存していると、プロテアーゼ処理と併行して、プロテアーゼによる糖化タンパク質分解物（糖化ペプチドや糖化アミノ酸）や糖化ペプチド分解物（より短い糖化ペプチドや糖化アミノ酸）に前記分解用ＦＡＯＤが作用してしまう。このため、後に測定用ＦＡＯＤを添加しても、すでに前記糖化タンパク質分解物等の一部には分解用ＦＡＯＤが作用した状態となり、反対に測定精度が低下するおそれがある。したがって、前述のように糖化タンパク質等を分解するためのプロテアーゼ処理によって、同時に残存する前記分解用ＦＡＯＤを失活させれば、プロテアーゼ処理による糖化タンパク質分解物等は、前記分解用ＦＡＯＤとは未反応のままで維持され、続いて添加する測定用ＦＡＯＤと反応することができる。このため測定精度も向上するのである。
【００２１】
なお、この他に、例えば、測定対象物が糖化タンパク質であり、非測定対象糖化物が糖化ペプチドであってもよい。分解用ＦＡＯＤを糖化ペプチドに作用させでも、その際に、糖化タンパク質には作用しないからである。
【００２２】
一方、前述のようにプロテアーゼ処理で分解用ＦＡＯＤを失活させなくとも、例えば、前記分解用ＦＡＯＤの添加量と、測定用ＦＡＯＤの添加量とを調整することによっても、高精度な測定を実現することもできる。この場合、例えば、前記分解用ＦＡＯＤ（Ａ）と測定用ＦＡＯＤ（Ｂ）の添加割合（活性比Ａ：Ｂ）を、Ａ：Ｂ＝１：１０〜１：５０，０００の範囲に設定することが好ましい。このような添加割合であれば、プロテアーゼ処理を行う際に、前記分解用ＦＡＯＤが残存しても、酵素の反応速度論の点から、糖化タンパク質はもちろんのこと、非測定対象糖化物である糖化アミノ酸に比べて測定糖化アミンである糖化ペプチドには作用し難いからである。また、非測定対象糖化物が糖化ペプチドであり、測定糖化アミンが糖化タンパク質の場合も同様である。
【００２３】
本発明の測定方法において、前記プロテアーゼとしては、例えば、メタロプロテアーゼ、ブロメライン、パパイン、トリプシン、プロテアーゼＫ、ズブチリシンおよびアミノペプチダーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼが使用できるが、特に制限されない。
【００２４】
また、測定対象物が、後述のような糖化ヘモグロビンである場合は、前記プロテアーゼは、糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテアーゼであって、メタロプロテアーゼ、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシンおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来のプロテアーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼであることが好ましく、より好ましくはメタロプロテアーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来のプロテアーゼであり、特に好ましくはメタロプロテアーゼである。このようなプロテアーゼを作用させれば、糖化ヘモグロビン以外の糖化タンパク質は分解され難いため、前記他の糖化タンパク質にはＦＡＯＤも作用し難く、糖化ヘモグロビンのみの測定が可能になる。
【００２５】
本発明において、測定試料は特に制限されず、例えば、全血、血漿、血清、血球、尿、髄液等の生体試料や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等の試料に対しても、本発明の測定方法を適用できる。この中でも、例えば、前記全血、血漿、血清、血球などの血液試料やその他の生体試料に有用である。
【００２６】
また、例えば、前記全血試料が外来の糖化アミノ酸等を含んでいても、高精度な測定が可能である。例えば、前述のように外来の糖化アミノ酸は一過性のものであるが、全血中に含まれる間は著しく糖化タンパク質等の測定値に影響を与える。しかし、本発明によればそのような影響も回避できるからである。
【００２７】
前記全血試料は、特に制限されないが、本発明の測定方法は、例えば、点滴後の患者から採取した全血試料に対して有用である。前述のように、特に点滴後の試料に、生成された外来アミノ酸による測定値の変動がみられるからである。
【００２８】
本発明の測定方法において、測定対象物としては、酸化還元反応を利用するものであれば特に制限されない。例えば、全血中成分、赤血球内成分、血漿中成分、血清中成分、尿成分、髄液成分等があげられるが、好ましくは赤血球内成分である。例えば、前記赤血球成分を測定する場合、全血をそのまま溶血させたものを試料としてもよいし、全血から赤血球を分離して、前記赤血球を溶血させたものを試料として用いてもよい。
【００２９】
本発明の測定方法において、前記測定対象物の糖化アミンとしては、前述のように糖化タンパク質、糖化ペプチド、糖化アミノ酸等が含まれる。具体的には、例えば、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミン等の糖化タンパク質等があげられる。なお、赤血球成分である糖化ヘモグロビンを測定する場合は、例えば、全血をそのまま溶血させたものを試料としてもよいし、全血から赤血球を分離して、前記赤血球を溶血させたものを試料として用いてもよい。
【００３０】
本発明の測定方法において使用するＦＡＯＤは、下記式（１）に示す反応を触媒するＦＡＯＤであることが好ましく、例えば、α−アミノ基が糖化された糖化アミンに特異的に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ−α」という）、アミノ酸側鎖のアミノ基が糖化された糖化アミンに特異的に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ−Ｓ」という）、α−アミノ基が糖化された糖化アミンおよびアミノ酸側鎖のアミノ基が糖化された糖化アミンのいずれにも特異的に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ−αＳ」という）等があげられる。
【００３１】
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2 ＋ Ｈ2Ｏ ＋ Ｏ2
→ Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ ＮＨ2−Ｒ2 ＋ Ｈ2Ｏ2 …（１）
前記式（１）において、Ｒ1は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を意味する。前記糖残基（Ｒ1）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ1）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ1）は、例えば、
−［ＣＨ（ＯＨ）］n−ＣＨ2ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
前記式（１）において、Ｒ2は、特に制限されないが、糖化アミンが糖化アミノ酸または糖化ペプチドの場合、α−アミノ基が糖化されている場合と、それ以外のアミノ基（アミノ酸側鎖のアミノ基）が糖化されている場合とで異なる。
前記式（１）において、α−アミノ基が糖化されている場合、Ｒ2は、下記式（２）で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。この場合に前記式（１）の反応を特異的に触媒するのが前記ＦＡＯＤ−αおよびＦＡＯＤ−αＳである。
−ＣＨＲ3−ＣＯ−Ｒ4 …（２）
前記式（２）において、Ｒ3はアミノ酸側鎖基を示し、Ｒ4は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で示すことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様に、アミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
−（ＮＨ−ＣＲ3Ｈ−ＣＯ）n−ＯＨ …（３）
また、前記式（１）において、α−アミノ基以外のアミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基が糖化されている）場合、Ｒ2は下記式（４）で示すことができる。この場合に前記式（１）の反応を特異的に触媒するのが前記ＦＡＯＤ−ＳおよびＦＡＯＤ−αＳである。
−Ｒ5−ＣＨ（ＮＨ−Ｒ6）−ＣＯ−Ｒ7 …（４）
前記式（４）において、Ｒ5は、アミノ酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、Ｒ5は
−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−
であり、
例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、Ｒ5は、
−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ2）−
である。
また、前記式（４）において、Ｒ6は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（５）で示すことができる。なお、下記式（５）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
−（ＣＯ−ＣＲ3Ｈ−ＮＨ）n−Ｈ …（５）
また、前記式（４）において、Ｒ7は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（６）で示すことができる。なお、下記式（６）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
−（ＮＨ−ＣＨＲ3−ＣＯ）n−ＯＨ …（６）
【００３２】
前記糖化α−アミノ基に特異的に作用するＦＡＯＤ−αとしては、例えば、市販の商品名フルクトシル−アミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＸ−Ｅ）（キッコーマン社製）、ペニシリウム属由来ＦＡＯＤ（特開平８−３３６３８６公報）等があげられる。前記糖化されたアミノ酸側鎖に特異的に作用するＦＡＯＤ−Ｓとしては、例えば、フサリウム属由来ＦＡＯＤ（日本生物工学会大会 平成１２年度 「Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ 由来アミノ酸オキシダーゼの基質特異性の変換；藤原真紀 他」）等があげられる。また、前記糖化α−アミノ基および糖化アミノ酸側鎖基の両方に作用するＦＡＯＤ−αＳとしては、例えば、市販の商品名ＦＯＤ（旭化成社製）、ギベレラ属由来ＦＡＯＤ（特開平８−１５４６７２号公報）、フサリウム属由来ＦＡＯＤ（特開平７−２８９２５３号公報）、アスペルギルス属由来ＦＡＯＤ（ＷＯ９９／２００３９号）等があげられる。
【００３３】
つぎに、本発明の測定方法について、非測定対象糖化物として糖化アミノ酸を含む全血試料を用いて、血球由来の糖化タンパク質を測定する例をあげて説明する。なお、本発明において「非測定対象糖化物である糖化アミノ酸」は、特に示さない限り、測定前から試料中に含まれるものをいい、例えば、測定対象物である糖化タンパク質のプロテアーゼ分解物は含まない。
【００３４】
（第１の実施形態）
この実施形態は、前記糖化アミノ酸の分解にＦＡＯＤ−αを使用し、糖化タンパク質の測定にＦＡＯＤ−αＳを用いた前記第１の測定方法の一例である。
【００３５】
まず、全血を溶血して溶血試料を調製する。この溶血方法は、特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法、凍結溶解による方法等が使用できる。この中でも、操作の簡便性等の理由から、界面活性剤を用いる方法が好ましい。
【００３６】
前記界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニル エーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン ソルビタン アルキル エステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン アルキル エーテル（Ｂｒｉｊ系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、商品名Ｔｗｅｅｎ−２０、商品名Ｂｒｉｊ３５等があげられる。前記界面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が１〜１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．１〜１重量％になるように前記界面活性剤を添加し、室温で５秒〜１分程度攪拌すればよい。
【００３７】
また、前記浸透圧の差を利用する場合は、例えば、全血の体積に対し２〜１００倍体積量の精製水を添加して溶血させる。
【００３８】
つぎに、前記溶血試料に対し、プロテアーゼ処理を行う。このプロテアーゼ処理によって糖化タンパク質を分解し、後述するＦＡＯＤが作用し易いようにする。前記プロテアーゼの種類は、特に制限されず、前述のようなプロテアーゼＫ、ズブチリシン、トリプシン、アミノペプチダーゼ、パパイン、メタロプロテイナーゼ等が使用できる。前記プロテアーゼ処理は、通常、緩衝液中で行われ、その処理条件は、使用するプロテアーゼの種類、測定対象の糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される。
【００３９】
プロテアーゼとしてトリプシンを用いて、前記試料を処理する場合、例えば、反応液中のプロテアーゼ濃度１００〜６，０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．２〜５体積％、反応温度２０〜５０℃、反応時間１０分〜２０時間、ｐＨ６〜９の範囲である。この処理は、通常、緩衝液中で行われ、使用できる緩衝液は特に制限されないが、例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液等である。
【００４０】
つぎに、前記プロテアーゼ処理した溶血試料を、前記式（１）の反応、具体的には下記式（７）の反応を触媒するＦＡＯＤ−αで処理する。
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨＲ3−ＣＯＯＨ ＋ Ｈ2Ｏ ＋ Ｏ2
→ Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ ＮＨ2−ＣＨＲ3−ＣＯＯＨ ＋ Ｈ2Ｏ2 …（７）
前記式（７）において、Ｒ1は前述と同様の糖残基を示し、Ｒ3は前述と同様にアミノ酸側鎖を示す。
【００４１】
この処理によって、前記溶血試料に含まれるα−アミノ基が糖化された糖化アミノ酸、および前記糖化タンパク質分解物のうちα−アミノ基の糖化部分が分解される。
【００４２】
なお、前記ＦＡＯＤ−α処理によっては、糖化アミノ酸の中でも側鎖アミノ基が糖化されたものは分解されずに残存する。しかし、この側鎖が糖化されたアミノ酸の糖化アミノ酸全体に対する割合と、糖化タンパク質における糖化された側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基に対する割合から考えても、残存する糖化アミノ酸の影響は小さく、測定精度は十分に向上するといえる。
【００４３】
処理条件としては、例えば、反応液中のＦＡＯＤ−α濃度１０〜５０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．５〜２０体積％、反応温度２０〜５０℃、反応時間１分〜１時間、ｐＨ６〜９の範囲である。この処理は、通常、緩衝液中で行われ、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
【００４４】
つぎに、前記ＦＡＯＤ−α処理した前記溶血試料を、さらにＦＡＯＤ−αＳで処理する。このＦＡＯＤ−αＳは、前述のように、糖化されたα−アミノ基および糖化された側鎖アミノ基の両方に作用する。しかし、糖化タンパク質分解物は、予め、分解用ＦＡＯＤ−αによって処理されているため、糖化された側鎖アミノ基のみに測定用ＦＡＯＤ−αＳを作用させることができる。
【００４５】
このＦＡＯＤ−αＳ処理は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましく、前記緩衝液としては、特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
【００４６】
処理条件としては、例えば、反応液中のＦＡＯＤ−αＳ濃度１０〜３０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．１〜５体積％、反応温度２０〜５０℃、反応時間１分〜１時間、ｐＨ６〜９の範囲である。
【００４７】
つぎに、前記ＦＡＯＤ−αＳ処理で生成した過酸化水素を、ＰＯＤおよび前記発色性基質を用いてさらに酸化還元反応によって測定する。
【００４８】
前記発色性基質としては、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとを組み合せた基質等があげられる。前記トリンダー試薬としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等があげられる。また、前記アミノアンチピリンの他に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。このような発色性基質の中でも、特に好ましくは、前述のように、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムである。
【００４９】
前記酸化還元反応は、通常、緩衝液中で行われ、その条件は、前記生成した過酸化水素の濃度等により適宜決定される。通常、反応液中のＰＯＤ濃度１０〜１００，０００ ＩＵ／Ｌ、発色性基質濃度０．００５〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ、反応温度１５〜３７℃、反応時間０．１〜３０分、ｐＨ５〜９である。また、前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、前記プロテアーゼ処理およびＦＡＯＤ処理等と同様の緩衝液等が使用できる。
【００５０】
前記酸化還元反応において、例えば、前記発色性基質を用いた場合、前記反応液の発色程度（吸光度）を分光光度計で測定することにより、過酸化水素の量を測定できる。そして、例えば、この過酸化水素濃度と検量線等とを用いて、試料中の糖化タンパク質の量を求めることができる。本実施形態においては、アミノ酸残基の側鎖アミノ基の糖化量によって、糖化タンパク質の量や糖化量を測定することとなる。
【００５１】
なお、はじめに添加した分解用ＦＡＯＤ−αによって生成した過酸化水素は、血液試料（溶血試料）に存在するカタラーゼによって消失するため、ＦＡＯＤ−αＳにより生成した測定対象物由来の過酸化水素の測定には影響を及ぼすことはない。また、別途カタラーゼを添加して消去させてもよい。このように前記カタラーゼにより過酸化水素を消去した場合、後に行うＦＡＯＤ−αＳ処理で生成する過酸化水素までもが消去されることを防ぐために、ＦＡＯＤ−αＳの添加と共に、過剰量のＰＯＤおよび発色性基質を添加することが好ましい。この場合、ＰＯＤは、前記カタラーゼの添加量（Ｕ）に対し、例えば、５〜１００倍の活性（Ｕ）量を添加することが好ましい。
【００５２】
前記過酸化水素量は、前記ＰＯＤ等を用いた酵素的手法の他に、例えば、電気的手法により測定することもできる。
【００５３】
この測定において、前記プロテアーゼ処理は、前述のように前記分解用ＦＡＯＤ−α処理の前には限られず、例えば、前記ＦＡＯＤ−α処理の後に行ってもよい。前記プロテアーゼ処理は、前述のように、ＦＡＯＤを作用し易くするために行うが、前記ＦＡＯＤ−αは糖化アミノ酸の分解を目的として行うため、ＦＡＯＤ−α処理前にプロテアーゼによって糖化タンパク質が分解されていなくても、本発明の効果は十分に得ることができるからである。
【００５４】
また、例えば、非測定対象糖化物が、α−アミノ基が糖化された糖化アミノ酸であって、測定対象糖化アミンが、α−アミノ基が糖化された糖化タンパク質である場合等にも本実施形態の測定方法が適用できる。この場合は、分解用ＦＡＯＤが糖化タンパク質に作用し難くても、例えば、残存した分解用ＦＡＯＤがプロテアーゼ処理によるプロテアーゼ分解物に作用してしまうことが考えられるため、例えば、後述する第２の実施形態のように残存するＦＡＯＤをプロテアーゼ分解により失活させたり、第３の実施形態のように分解用ＦＡＯＤと測定用ＦＡＯＤの添加割合を調整することが好ましい。
【００５５】
（第２の実施形態）
この実施形態は、非測定対象糖化物である糖化アミノ酸の分解と測定対象である糖化タンパク質の測定に、同じＦＡＯＤを用いた前記第２の測定方法の一例である。ＦＡＯＤとしては、特に制限されず、例えば、ＦＡＯＤ−α、ＦＡＯＤ−Ｓ、ＦＡＯＤ−αＳのいずれを用いてもよい。
【００５６】
前記第１の実施形態と同様にして溶血試料を調製し、この溶血試料に分解用ＦＡＯＤを添加する。
【００５７】
処理条件としては、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度１０〜５０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．５〜２０体積％、反応温度２０〜５０℃、反応時間１分〜１時間、ｐＨ６〜９の範囲である。この処理は、通常、緩衝液中で行われ、前述と同様の緩衝液が使用できる。
【００５８】
つぎに、ＦＡＯＤ処理した試料に対しプロテアーゼ処理を行う。このプロテアーゼ処理の第１の目的は、前述と同様に、血球由来の糖化タンパク質を分解し、後の工程でさらに添加する測定用ＦＡＯＤを作用し易くするためである。そして、第２の目的は、前記分解用ＦＡＯＤを消化して失活させるためである。
【００５９】
ＦＡＯＤは、糖化タンパク質に作用し難く、糖化アミノ酸に作用し易いため、前記分解用ＦＡＯＤ処理では、試料中の糖化アミノ酸がまず分解される。しかし、この分解用ＦＡＯＤが残っている状態で、前記糖化タンパク質をプロテアーゼ処理すると、残存するＦＡＯＤと糖化タンパク質分解物の糖化部分とが反応してしまい、正確な測定ができないという問題がある。したがって、この残存するＦＡＯＤをプロテアーゼで失活させ、前記糖化タンパク質分解物との反応を防止ればよい。このためには、はじめに添加した分解用ＦＡＯＤを速やかに失活させ、かつ、糖化タンパク質を分解できるだけのプロテアーゼを添加する必要がある。
【００６０】
前記プロテアーゼとしては、特に制限されず、前述と同様のものが使用できる。また、その処理条件は、例えば、使用するプロテアーゼの種類、糖化タンパク質の種類やその濃度、分解用ＦＡＯＤの種類やその量等に応じて適宜決定される。
【００６１】
プロテアーゼ処理の反応溶液におけるプロテアーゼの添加量は、分解用ＦＡＯＤ １００Ｕ／Ｌに対して、例えば、１〜１０００，０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは１０〜３００，０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、より好ましくは１００〜１００，０００ＫＵ／Ｌの範囲である。
【００６２】
具体的に、プロテアーゼとしてトリプシンを用いて、前記試料を処理する場合、例えば、反応液中のプロテアーゼ濃度１０００〜３０，０００ＫＵ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．２〜５体積％、反応液中のＦＡＯＤ濃度１０〜１０００Ｕ／Ｌ、反応温度２０〜５０℃、反応時間１０分〜２０時間、ｐＨ６〜９の範囲である。
【００６３】
つぎに、前記プロテアーゼ処理により得られた糖化タンパク質分解物に、分解用ＦＡＯＤと同じＦＡＯＤを、再度測定用ＦＡＯＤとして添加して処理する。この測定用ＦＡＯＤは、前記プロテアーゼによって失活するおそれがあるため、十分量添加する必要がある。
【００６４】
この測定用ＦＡＯＤ処理も、前述と同様に緩衝液中で行うことが好ましく、前記緩衝液としては、特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
【００６５】
測定用ＦＡＯＤ処理の反応溶液における測定用ＦＡＯＤの添加量は、プロテアーゼ１０，０００ＫＵ／Ｌに対して、例えば、１０〜１０００，０００Ｕ／Ｌの範囲であり、好ましくは１００〜２００，０００Ｕ／Ｌの範囲であり、より好ましくは５００〜５０，０００Ｕ／Ｌの範囲である。
【００６６】
具体的な処理条件としては、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度５００〜２０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中のプロテアーゼ濃度１００〜３０，０００ＫＵ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０１〜１体積％、反応温度１５〜４０℃、反応時間１分〜１時間、ｐＨ６〜９の範囲である。
【００６７】
このような実施形態によれば、糖化アミノ酸の分解と糖化タンパク質の測定に使用するＦＡＯＤが同じであっても、前記糖化アミノ酸の影響を受けることなく、高い精度で測定が可能である。
【００６８】
（第３の実施形態）
この実施形態は、非測定対象糖化物である糖化アミノ酸の分解と測定対象である糖化タンパク質の測定に、同じＦＡＯＤを用いた例である。但し、この実施形態は、前記第２の実施形態とは異なり、分解用ＦＡＯＤを、プロテアーゼによって必ずしも失活させる必要がない。酵素には基質特異性があるため、プロテアーゼとＦＡＯＤとの組み合わせによっては、ＦＡＯＤをプロテアーゼで失活させ難い場合がある。このような場合に本実施形態の方法が有効になる。なお、はじめに添加した分解用ＦＡＯＤが、プロテアーゼにより生成した糖化タンパク質分解物と反応すると、測定精度を向上できないため、以下に示すように、ＦＡＯＤの添加割合を調整することが重要となる。
【００６９】
まず、前記第１の実施形態と同様にして溶血試料を調製し、この溶血試料に分解用ＦＡＯＤを添加する。
【００７０】
分解用ＦＡＯＤは、プロテアーゼで失活させ難い場合、活性が残存しても、プロテアーゼ処理の間に、生成した糖化タンパク質分解物に作用しない範囲で添加する必要がある。なお、ＦＡＯＤは、糖化タンパク質に作用し難く、糖化ペプチドよりも糖化アミノ酸により一層作用し易いという性質を有するため、例えば、糖化アミノ酸のみに作用する程度の添加量であり、かつ反応時間とすることが好ましい。
【００７１】
ＦＡＯＤ処理の条件としては、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度１０〜５０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．２〜２０体積％、反応温度２０〜５０℃、反応時間１分〜１時間、ｐＨ６〜９の範囲である。この処理は、通常、緩衝液中で行われ、前述と同様の緩衝液が使用できる。
【００７２】
つぎに、前記ＦＡＯＤ処理した試料に対しプロテアーゼ処理を行う。この実施形態は、前述のように、プロテアーゼが前記ＦＡＯＤに作用し難い場合の例であるため、プロテアーゼの添加量は特に制限されない。
【００７３】
前記プロテアーゼとしては、特に制限されず、前述と同様のものが使用できる。その処理条件は、前述と同様に、使用するプロテアーゼの種類、測定対象の糖化タンパク質の種類およびその濃度、はじめに添加したＦＡＯＤの種類およびその濃度、使用するプロテアーゼのＦＡＯＤに対する基質特異性等により適宜決定される。
【００７４】
このような実施形態に該当するＦＡＯＤとプロテアーゼの組み合わせとしては、例えば、商品名ＦＯＤ（旭化成社製）と商品名トヨチーム（東洋紡社製）、前記ギベレラ属由来ＦＡＯＤと商品名プロテナーゼＫ（ロッシュ社製）の組み合わせ等があげられる。
【００７５】
プロテアーゼとしてトリプシンを用いて、前記試料を処理する場合、例えば、反応液中のプロテアーゼ濃度１００〜６０００Ｕ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．２〜５体積％、反応液中のＦＡＯＤ濃度０．１〜１００Ｕ／Ｌ、反応温度２０〜５０℃、反応時間１０分〜２０時間、ｐＨ６〜９の範囲である。
【００７６】
続いて、前記プロテアーゼ処理により得られた分解物に、再度同じＦＡＯＤを測定用ＦＡＯＤとして添加する。
【００７７】
この測定用ＦＡＯＤ処理も、前述と同様に緩衝液中で行うことが好ましく、前記緩衝液としては、特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
【００７８】
このように、本実施形態においては、分解用ＦＡＯＤ（Ａ）と測定用ＦＡＯＤ（Ｂ）の添加割合（活性比Ａ：Ｂ）を、例えば、前述のように１：５０，０００〜１：１０の範囲、好ましくは１：５０００〜１：２５の範囲、より好ましくは１：５００〜１：５０の範囲にする。このように設定すれば、前記第２の実施形態と異なり前記分解用ＦＡＯＤは反応液中に残存するが、この残存したＦＡＯＤの反応速度は非常に遅いため、プロテアーゼ処理工程において、測定に影響を与える程度に、生成した糖化タンパク質分解物に残存ＦＡＯＤが作用することはない。
【００７９】
処理条件としては、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度５００〜２０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中のプロテアーゼ濃度１００〜３０，０００ＫＵ／Ｌ、反応液中の血球濃度０．０１〜１体積％、反応温度１５〜４０℃、反応時間１分〜１時間、ｐＨ６〜９の範囲である。
【実施例】
【００８０】
（実施例１および比較例１）
患者に、アミノ酸およびブドウ糖を含む点滴を行い、１時間後、血液を採取した。その血液を遠心分離（１０００ｇ、１０分間）して血球と血漿とに分離し、前記血球画分０．００６ｍＬ、前記血漿画分０．００６ｍＬおよび下記溶血試薬Ａ ０．４５ｍＬとを混合して、前記血球を溶血させて溶血試料を調製した。
【００８１】
（溶血試薬Ａ：ｐＨ８．５）
商品名ＴＡＰＳ（同仁化学社製） １４０ｍｍｏｌ／Ｌ
グリシンアミド（ナカライテスク社製） ６０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ナカライテスク社製） ２４ｇ／Ｌ
【００８２】
前記溶血試料に下記各種ＦＡＯＤ溶液（濃度２００ＫＵ／Ｌ）０．００２３ｍＬを２５℃で添加し、３７℃で４０分間インキュベートを行った。なお、下記（１）ペニシリウム属由来ＦＡＯＤは、糖化されたα−アミノ基に特異的に作用し、（２）アスペルギルス属由来ＦＡＯＤは、糖化されたα−アミノ基および糖化されたε−アミノ基に特異的に作用し、（３）ＦＡＯＸ−Ｅは、糖化されたα−アミノ基に特異的に作用するＦＡＯＤである。
【００８３】
（使用したＦＡＯＤ）
（１）前記ペニシリウム属由来ＦＡＯＤ（特開平８−３３６３８６公報）
（２）前記アスペルギルス属由来ＦＡＯＤ（ＷＯ９９／２００３９号）
（３）商品名ＦＡＯＸ−Ｅ（キッコーマン社製、以下同じ）
【００８４】
つぎに、前記ＦＡＯＤを添加した溶血試料０．０１ｍＬに精製水０．０１ｍＬを添加し、さらに下記プロテアーゼ試薬０．０６５ｍＬを添加して３７℃で５分間インキュベートした。続いて、下記発色試薬０．０４５ｍＬを添加して３７℃で３分間インキュベートし、反応液の吸光度（波長７５１ｎｍ）を測定装置（商品名ＪＣＡ ＢＭ−８、日本電子社製）によって測定した。なお、比較例としては、前記溶血試料に、前記各種ＦＡＯＤに代えて精製水を添加した以外は、前記実施例と同様にして測定を行った。また、コントロールとしては、前記血球に、前記血漿に代えて精製水を添加した以外は、前記実施例と同様にして測定を行った。これらの結果を下記表１に示す。
【００８５】
（プロテアーゼ試薬：ｐＨ６．５）
ＭＯＰＳ（同仁化学社製） ５ｍｍｏｌ／Ｌ
テトラゾリウム化合物（商品名ＷＳＴ−３、同仁化学社製） ２ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＮ3（ナカライテスク社製） ０．０５ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ2（ナカライテスク社製） ５ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ（ナカライテスク社製） ３００ｍｍｏｌ／Ｌ
メタロプロテアーゼ ３ｇ／Ｌ
【００８６】
（発色試薬）
ギベレラ属由来ＦＡＯＤ（特開平８−１５４６７２号公報） ２６ＫＵ／Ｌ
ＰＯＤ（東洋紡社製） ７７．６ＫＵ／Ｌ
発色基質（商品名ＤＡ−６４、和光純薬工業社製） ０．０５２ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．９） ２００ｍｍｏｌ／Ｌ
【００８７】
【表１】
【００８８】
前記表１に示すように、比較例１では、血漿中に含まれる糖化アミノ酸も発色試薬に含まれるＦＡＯＤと反応してしまうため、血球中の糖化タンパクのみを測定したコントロールよりも高い吸光度となった。これに対して、実施例１は、血漿中の糖化アミノ酸を予めＦＡＯＤで処理しているため、前記糖化タンパク質を正確に測定することができ、コントロールとの相関も高かった。これは、発色試薬に含有されたＦＡＯＤを、血球由来の糖化タンパク質分解物のみに作用させることができたからである。
【００８９】
（実施例２および比較例２）
前記実施例１と同様に点滴後の血液を採血し、これを静置した。そして、自然沈降した血球を回収し、この血球画分０．０１ｍＬに下記溶血試薬Ｂ ０．３ｍＬを添加して溶血試料を調製した。この溶血試料のＨｂ濃度およびＨｂＡ１ｃ濃度を、前記自動分析装置により分析した。なお、前記血球は自然沈降により回収しているため、前記血球画分は血漿成分を含んでいる。
【００９０】
（溶血試薬Ｂ：ｐＨ８．５）
商品名ＴＡＰＳ（同仁化学社製） １４０ｍｍｏｌ／Ｌ
グリシンアミド（ナカライテスク社製） ６０ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ナカライテスク社製） ２４ｇ／Ｌ
商品名ＦＡＯＸ−Ｅ（キッコーマン社製、以下同じ） １ＫＵ／Ｌ
【００９１】
前記溶血試料０．０１ｍＬに精製水０．０１ｍＬおよび前記プロテアーゼ試薬０．０６５ｍＬを添加して３７℃でインキュベートした。そして、インキュベート開始から４．５分後における５７１ｎｍの吸光度を測定し、これをＨｂ濃度を示す吸光度とした。続いて、インキュベート開始から５分後に、実施例１と同じ発色試薬０．０４５ｍＬを添加して３７℃で３分間インキュベートし、さらに３分間反応させた後の７５１ｎｍにおける吸光度を前記自動分析装置により測定し、ＨｂＡ１ｃ濃度を示す吸光度とした。
【００９２】
そして、予め作成したＨｂ濃度（ｇ／Ｌ）またはＨｂＡ１ｃ濃度（ｇ／Ｌ）と、吸光度との関係を示す検量線に、測定したそれぞれの吸光度を代入してＨｂＡ１ｃ濃度およびＨｂ濃度を求め、下記式からＨｂＡ１ｃ％を算出した。
ＨｂＡ１ｃ（％）＝（ＨｂＡ１ｃ濃度／Ｈｂ濃度）×１００
【００９３】
なお、前記検量線は、以下に示す方法で作成した。まず、ＨｂＡ１ｃ濃度およびＨｂ濃度が既知である種々濃度の標準液について、自動測定器（商品名ＨＡ−８１５０：アークレイ株式会社）を用いてＨｂＡ１ｃ濃度とＨｂ濃度とを測定した。一方、前記各標準液について、前記実施例と同様の測定方法により、Ｈｂ濃度およびＨｂＡ１ｃ濃度に相当する吸光度の測定を行った。そして、前記自動測定器による測定値と前記吸光度から一次回帰式を作成し、これを検量線とした。
【００９４】
比較例２としては、前記血球に、前記溶血試薬Ｂの代わりに、商品名ＦＡＯＸ−Ｅを含有しない前記溶血試薬Ａを添加した以外は、前記実施例２と同様にして測定を行った。
【００９５】
また、コントロールとしては、自然沈降により回収した前記血球画分０．０５ｍＬに、下記自動測定器ＨＡ−８１５０専用希釈液２．５ｍＬを添加して溶血させたものを、溶血試料とした。そして、この溶血試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度（％）を、前記自動測定器（商品名ＨＡ−８１５０：アークレイ株式会社）により測定した値を使用した。
【００９６】
以上の結果を図１に示す。同図は、酵素法により測定した実施例２および比較例２のＨｂＡ１ｃ（％）と、コントロールの自動分析によるＨｂＡ１ｃ（％）との関係を示すグラフである。同図において、実施例は、相関式、「ｙ＝１．０７９ｘ−０．４０９」、相関係数「０．９６７」であり、比較例は、相関式、「ｙ＝１．１２４ｘ−０．５５９」、相関係数「０．９３１」であった。
【００９７】
図１に示すように、実施例２によれば、血漿中に含まれる外来の糖化アミノ酸は、はじめのＦＡＯＤ処理（溶血試薬Ｂ中のＦＡＯＤ）によって分解されており、この処理によって発生する過酸化水素も試料中のカタラーゼによって消失している。このため、後で添加するＦＡＯＤによる酸化還元反応においては、血球の糖化タンパク質由来の過酸化水素のみが発生し、血漿を添加せずに自動分析により測定したコントロールの値と非常に近い値が得られ、その相関係数（０．９６７）も非常に高かった。一方、比較例２においては、血漿中に含まれる糖化アミノ酸についても、糖化タンパク質に作用させるためのＦＡＯＤが反応するため、発生する過酸化水素の量も、糖化タンパク質により生じる過酸化水素の量よりも多くなる。このため、比較例のＨｂＡ１ｃ（％）は、コントロールのＨｂＡ１ｃ（％）よりも高い値となり、コントロールとの相関関係も実施例２に比べて低い結果となった（相関係数０．９３１）。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
以上のように、本発明の試料の前処理方法によれば、試料中に含まれる非測定対象糖化物である糖化ペプチドや糖化アミノ酸を分解除去できるため、このような前処理済み試料について糖化アミンの測定を行えば、前記非測定対象糖化物による影響を回避できるため、優れた測定精度となる。このため、例えば、採血前に点滴を受けた患者の血液であって、一過性の外来糖化アミノ酸等を含む場合であっても、その影響を回避できる。このような方法を、例えば、赤血球中の糖化ヘモグロビンの測定の際に適用すれば、従来よりも測定精度が向上し、糖尿病診断等の指標物質としての重要性がさらに向上する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖化アミンを測定対象とする試料の前処理方法であって、前記試料中に測定対象の糖化アミンとは別に存在する糖化アミノ酸または糖化ペプチドを除去することを目的として、前記糖化アミノ酸または糖化ペプチドにフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させて分解する試料の前処理方法。
【請求項２】
２試料中の糖化アミンに、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させて、その酸化還元反応を測定することにより糖化アミンの量を測定する方法であって、前記試料中に測定対象の糖化アミンとは別に存在する糖化アミノ酸または糖化ペプチドを除去することを目的として、前記酸化還元反応に先立ち、予め、前記試料を請求の範囲１記載の前処理方法によって処理して前記糖化アミノ酸または糖化ペプチドを分解する測定方法。
【請求項３】
測定対象の糖化アミンとは別に存在する糖化アミノ酸または糖化ペプチドに作用させるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと、糖化アミンに作用させるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとが、異なる基質特異性である請求の範囲２記載の測定方法。
【請求項４】
測定対象の糖化アミンとは別に存在する糖化アミノ酸または糖化ペプチドに作用させるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、糖化されたα−アミノ基に特異的に作用し、糖化アミンに作用させるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、糖化されたα−アミノ基および糖化されたアミノ酸残基側鎖に特異的に作用する請求の範囲３記載の測定方法。
【請求項５】
測定対象の糖化アミンとは別に存在する糖化アミノ酸または糖化ペプチドにフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させる前または作用させた後に、糖化アミンをプロテアーゼで分解し、この分解物に、前記糖化アミンに作用させるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させて前記酸化還元反応を行う請求の範囲３または４記載の測定方法。
【請求項６】
測定対象の糖化アミンとは別に存在する糖化アミノ酸が、α−アミノ基が糖化された糖化アミノ酸であり、測定対象の糖化アミンが、α−アミノ基およびアミノ酸残基側鎖が糖化された糖化タンパク質または糖化ペプチドである請求の範囲４または５記載の測定方法。
【請求項７】
糖化アミノ酸または糖化ペプチドにフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させた後、糖化アミンをプロテアーゼで分解し、さらに前記糖化アミノ酸または糖化ペプチドに作用させたのと同じフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを添加して、これを前記プロテアーゼによる糖化アミン分解物に作用させて前記酸化還元反応を行う請求の範囲２記載の測定方法。
【請求項８】
プロテアーゼにより、糖化アミノ酸または糖化ペプチドに作用させたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを失活させる請求の範囲７記載の測定方法。
【請求項９】
糖化アミノ酸または糖化ペプチドに作用させるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（Ａ）と糖化アミンの分解物に作用させるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（Ｂ）の添加割合（活性比Ａ：Ｂ）が、Ａ：Ｂ＝１：１０〜１：５０，０００の範囲である請求の範囲７記載の測定方法。
【請求項１０】
測定対象の糖化アミンとは別に存在する糖化アミノ酸または糖化ペプチドの糖化部位が、α−アミノ基であり、測定対象の糖化アミンが糖化タンパク質であって、その糖化部分がα−アミノ基である請求の範囲７〜９のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項１１】
糖化アミンが、糖化アミノ酸、糖化ペプチドおよび糖化タンパク質からなる群から選択された少なくとも一つの物質である請求の範囲２〜１０のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項１２】
糖化タンパク質が、糖化ヘモグロビンである請求の範囲１１記載の測定方法。
【請求項１３】
プロテアーゼが、メタロプロテアーゼ、ブロメライン、パパイン、トリプシン、プロテアーゼＫ、ズブチリシンおよびアミノペプチダーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼである請求の範囲５〜１２のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項１４】
プロテアーゼが、糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテアーゼであって、メタロプロテアーゼ、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシンおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来のプロテアーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼである請求の範囲１３記載の測定方法。
【請求項１５】
試料が、全血、結晶、血清、血球、尿および髄液からなる群から選択された少なくとも一つの生体試料である請求項２〜１４のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項１６】
試料が、点滴後の患者から採取した全血試料である請求の範囲１５記載の測定方法。
【請求項１７】
測定対象の糖化アミンとは別に存在する糖化アミノ酸が、外来の糖化アミノ酸を含む請求の範囲２〜１６のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項１】
糖化アミンを測定対象とする試料の前処理方法であって、前記試料中に測定対象の糖化アミンとは別に存在する糖化アミノ酸または糖化ペプチドを除去することを目的として、前記糖化アミノ酸または糖化ペプチドにフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させて分解する試料の前処理方法。
【請求項２】
２試料中の糖化アミンに、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させて、その酸化還元反応を測定することにより糖化アミンの量を測定する方法であって、前記試料中に測定対象の糖化アミンとは別に存在する糖化アミノ酸または糖化ペプチドを除去することを目的として、前記酸化還元反応に先立ち、予め、前記試料を請求の範囲１記載の前処理方法によって処理して前記糖化アミノ酸または糖化ペプチドを分解する測定方法。
【請求項３】
測定対象の糖化アミンとは別に存在する糖化アミノ酸または糖化ペプチドに作用させるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと、糖化アミンに作用させるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとが、異なる基質特異性である請求の範囲２記載の測定方法。
【請求項４】
測定対象の糖化アミンとは別に存在する糖化アミノ酸または糖化ペプチドに作用させるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、糖化されたα−アミノ基に特異的に作用し、糖化アミンに作用させるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、糖化されたα−アミノ基および糖化されたアミノ酸残基側鎖に特異的に作用する請求の範囲３記載の測定方法。
【請求項５】
測定対象の糖化アミンとは別に存在する糖化アミノ酸または糖化ペプチドにフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させる前または作用させた後に、糖化アミンをプロテアーゼで分解し、この分解物に、前記糖化アミンに作用させるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させて前記酸化還元反応を行う請求の範囲３または４記載の測定方法。
【請求項６】
測定対象の糖化アミンとは別に存在する糖化アミノ酸が、α−アミノ基が糖化された糖化アミノ酸であり、測定対象の糖化アミンが、α−アミノ基およびアミノ酸残基側鎖が糖化された糖化タンパク質または糖化ペプチドである請求の範囲４または５記載の測定方法。
【請求項７】
糖化アミノ酸または糖化ペプチドにフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させた後、糖化アミンをプロテアーゼで分解し、さらに前記糖化アミノ酸または糖化ペプチドに作用させたのと同じフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを添加して、これを前記プロテアーゼによる糖化アミン分解物に作用させて前記酸化還元反応を行う請求の範囲２記載の測定方法。
【請求項８】
プロテアーゼにより、糖化アミノ酸または糖化ペプチドに作用させたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを失活させる請求の範囲７記載の測定方法。
【請求項９】
糖化アミノ酸または糖化ペプチドに作用させるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（Ａ）と糖化アミンの分解物に作用させるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（Ｂ）の添加割合（活性比Ａ：Ｂ）が、Ａ：Ｂ＝１：１０〜１：５０，０００の範囲である請求の範囲７記載の測定方法。
【請求項１０】
測定対象の糖化アミンとは別に存在する糖化アミノ酸または糖化ペプチドの糖化部位が、α−アミノ基であり、測定対象の糖化アミンが糖化タンパク質であって、その糖化部分がα−アミノ基である請求の範囲７〜９のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項１１】
糖化アミンが、糖化アミノ酸、糖化ペプチドおよび糖化タンパク質からなる群から選択された少なくとも一つの物質である請求の範囲２〜１０のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項１２】
糖化タンパク質が、糖化ヘモグロビンである請求の範囲１１記載の測定方法。
【請求項１３】
プロテアーゼが、メタロプロテアーゼ、ブロメライン、パパイン、トリプシン、プロテアーゼＫ、ズブチリシンおよびアミノペプチダーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼである請求の範囲５〜１２のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項１４】
プロテアーゼが、糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテアーゼであって、メタロプロテアーゼ、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシンおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来のプロテアーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼである請求の範囲１３記載の測定方法。
【請求項１５】
試料が、全血、結晶、血清、血球、尿および髄液からなる群から選択された少なくとも一つの生体試料である請求項２〜１４のいずれか一項に記載の測定方法。
【請求項１６】
試料が、点滴後の患者から採取した全血試料である請求の範囲１５記載の測定方法。
【請求項１７】
測定対象の糖化アミンとは別に存在する糖化アミノ酸が、外来の糖化アミノ酸を含む請求の範囲２〜１６のいずれか一項に記載の測定方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−１１０３３３（Ｐ２０１０−１１０３３３Ａ）
【公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２８８１７（Ｐ２０１０−２８８１７）
【出願日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【分割の表示】特願２００７−１６５３２６（Ｐ２００７−１６５３２６）の分割
【原出願日】平成１４年１０月９日（２００２．１０．９）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【分割の表示】特願２００７−１６５３２６（Ｐ２００７−１６５３２６）の分割
【原出願日】平成１４年１０月９日（２００２．１０．９）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
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