糖化タンパク質の測定のための方法および組成物
【課題】糖化タンパク質の測定のための方法および組成物を提供すること。
【解決手段】１つの態様においては、本発明は、単離されたキメラタンパク質に関する。キメラタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ａ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｂ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片が含まれる。別の態様においては、本発明は、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸に関する。キメラタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ａ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｂ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片が含まれる。この核酸を含む組み換え細胞、およびこの核酸を使用してキメラタンパク質を生産するための方法もまた提供される。。
【解決手段】１つの態様においては、本発明は、単離されたキメラタンパク質に関する。キメラタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ａ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｂ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片が含まれる。別の態様においては、本発明は、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸に関する。キメラタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ａ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｂ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片が含まれる。この核酸を含む組み換え細胞、およびこの核酸を使用してキメラタンパク質を生産するための方法もまた提供される。。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
糖化タンパク質は、タンパク質を構成するアミノ酸のアミノ基の、アルドースのような還元糖のアルデヒド基との非酵素的な不可逆的結合によって生じる物質である。例えば、米国特許第６，１２７，１３８号を参照のこと。このような非酵素的な不可逆的結合反応は、「アマドリ転位」とも呼ばれ、したがって、上記の糖化タンパク質は、場合によっては「アマドリ化合物」とも呼ばれる。
【０００２】
タンパク質の非酵素的糖化は、特定の疾患、例えば、糖尿病性合併症および老化のプロセスの発症に関与している（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１９）：１２５０５−７（１９９７）；およびＢａｙｎｅｓ ａｎｄ Ｍｏｎｎｉｅｒ，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，３０４：１−４１０（１９８９））。この反応は、糖付加物および架橋の形成を通じて標的分子の機能不全を導く。インビトロおよびインビボでの非酵素的糖化の間の最も重要な「初期」修飾物であるアマドリ生成物に、相当な関心が集まっている。
【０００３】
糖化タンパク質についての種々のアッセイが知られている。例えば、米国特許第６，１２７，１３８号には、糖化タンパク質を含む試料をプロテアーゼＸＩＶまたはアスパラジラス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に由来するプロテアーゼで処理し、その後（または、上記のプロテアーゼで試料を処理しながら）、ＦＡＯＤ（フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ）反応によって消費された酸素の量、または得られる反応産物の量を測定するためにＦＡＯＤを試料と反応させ、それによって糖化タンパク質を測定することが開示されている。
【０００４】
別の例においては、米国特許第６，００８，００６号には、試料中の糖化タンパク質の量を、試料を、プロテアーゼとペルオキシダーゼの組み合わせである第１の試薬と、ケトアミンオキシダーゼを含む第２の試薬と反応させることによって定量できることが開示されている。米国特許第６，００８，００６号には、また、ペルオキシダーゼ／プロテアーゼ混合酵素試薬とケトアミンオキシダーゼを含むキットも、開示されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
１つの態様においては、本発明は、単離されたキメラタンパク質に関する。キメラタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ａ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｂ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片が含まれる。
【０００６】
別の態様においては、本発明は、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸に関する。キメラタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ａ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｂ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片が含まれる。この核酸を含む組み換え細胞、およびこの核酸を使用してキメラタンパク質を生産するための方法もまた提供される。
【０００７】
さらに別の態様においては、本発明は、試料中の糖化タンパク質をアッセイするための方法に関する。この方法には、ａ）アッセイされる試料をプロテアーゼと接触させて、糖化タンパク質（これが上記の試料中に含まれている場合）から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生じさせること；ｂ）上記の生じた糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ｉ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｉｉ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片を含むキメラタンパク質と接触させて、上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化させること；ならびに、ｃ）上記のキメラタンパク質による上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、上記試料中に上記の糖化タンパク質が存在すること、および／またはその量を決定することが含まれる。
【０００８】
さらに別の態様においては、本発明は、試料中の糖化タンパク質をアッセイするためのキットに関する。このキットには、ａ）糖化タンパク質（これが試料中に含まれている場合）から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生じさせるためのプロテアーゼ；ｂ）上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化させるための上記のキメラタンパク質；ならびに、ｃ）上記のキメラタンパク質による上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、上記試料中に上記糖化タンパク質が存在すること、および／またはその量を決定するための手段が含まれる。
【０００９】
さらに別の態様においては、本発明は、試料中の糖化タンパク質をアッセイするための方法に関する。この方法には、ａ）アッセイされる試料をプロテイナーゼＫと接触させて、糖化タンパク質（これが試料中に含まれている場合）から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生じさせること；ｂ）上記の生じた糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸をアマドリアーゼと接触させて、上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化させること；ならびに、ｃ）上記のアマドリアーゼによる上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、上記試料中に糖化タンパク質が存在すること、および／またはその量を決定することが含まれる。
【００１０】
さらに別の態様においては、本発明は、試料中の糖化タンパク質をアッセイするためのキットに関する。このキットには、ａ）糖化タンパク質（これが試料中に含まれている場合）から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生じさせるためのプロテイナーゼＫ；ｂ）上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化させるためのアマドリアーゼ；ならびに、ｃ）上記のアマドリアーゼによる上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、上記試料中に上記糖化タンパク質が存在すること、および／またはその量を決定するための手段が含まれる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
単離されたキメラタンパク質であって、該キメラタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって：
ａ）約５個から約３０個のアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む、第１のペプチジル断片；および
ｂ）アマドリアーゼを含む、第２のペプチジル断片
を含む、単離されたキメラタンパク質。
（項目２）
前記細菌のリーダー配列が、大腸菌タンパク質のリーダー配列である、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目３）
前記リーダー配列が、配列番号１（ＭＧＧＳＧＤＤＤＤＬＡＬ）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の同一性を有し、該パーセント同一性が、該配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して同じ大きさのアミノ酸配列の全体に関して決定される、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目４）
前記リーダー配列が、配列番号１に示されるアミノ酸配列に特異的に結合する抗体に結合する、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目５）
前記リーダー配列が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目６）
前記第１のペプチジル断片が、約２０個のアミノ酸残基を含む、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目７）
前記アマドリアーゼが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．起源である、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目８）
前記アマドリアーゼが補因子としてＦＡＤを使用する、項目７に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目９）
前記アマドリアーゼが、ＦＡＤ補因子結合コンセンサス配列Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｘ−Ｇｌｙ（配列番号２）を有し、Ｘは任意のアミノ酸残基である、項目８に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目１０）
前記アマドリアーゼが、アマドリアーゼＩａ、アマドリアーゼＩｂ、アマドリアーゼＩｃ、およびアマドリアーゼＩＩからなる群より選択される、項目７に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目１１）
前記アマドリアーゼが、配列番号３：
【化１】
に示されるアミノ酸に対して少なくとも４０％の同一性を有し、該パーセント同一性は、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して同じ大きさのアミノ酸配列の全体に関して決定される、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目１２）
前記アマドリアーゼが、配列番号３に示されるアミノ酸配列に特異的に結合する抗体に結合する、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目１３）
前記アマドリアーゼが、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目１４）
前記第１のペプチジル断片と第２のペプチジル断片とが、切断可能な連結によって連結されている、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目１５）
さらに、そのＣ末端に、約５個から約３０個のアミノ酸残基の第２の細菌のリーダー配列を含む第３のペプチジル断片を含む、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目１６）
前記第２のリーダー配列が、大腸菌タンパク質のリーダー配列である、項目１５に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目１７）
前記第２の細菌のリーダー配列が、配列番号４（ＫＧＥＬＥＧＬＰＩＰＮＰＬＬＲＴＧ）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の同一性を有し、該パーセント同一性は、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して同じ大きさのアミノ酸配列の全体に関して決定される、項目１５に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目１８）
前記第２の細菌のリーダー配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列に特異的に結合する抗体に結合する、項目１５に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目１９）
前記第２の細菌のリーダー配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、項目１５に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目２０）
前記第３のペプチジル断片が、約２０個のアミノ酸残基を含む、項目１５に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目２１）
さらに、そのＣ末端に、ペプチドタグを含む第３のペプチジル断片を含む、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目２２）
前記ペプチドタグが、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ＨＡ１タグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、６−Ｈｉｓタグ、ＡＵ１タグ、ＥＥタグ、Ｔ７タグ、４Ａ６タグ、εタグ、Ｂタグ、ｇＥタグおよびＴｙ１タグからなる群より選択される、項目２１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目２３）
さらに、そのＣ末端に、ペプチドタグを含む第４のペプチジル断片を含む、項目１５に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目２４）
前記ペプチドタグが、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ＨＡ１タグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、６−Ｈｉｓタグ、ＡＵ１タグ、ＥＥタグ、Ｔ７タグ、４Ａ６タグ、εタグ、Ｂタグ、ｇＥタグおよびＴｙ１タグからなる群より選択される、項目２３に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目２５）
単離されたキメラタンパク質であって、配列番号５：
【化２】
に示されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目２６）
項目１に記載のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
（項目２７）
項目２５に記載のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
（項目２８）
項目２６に記載の核酸であって、配列番号６：
【化３−１】
【化３−２】
に示されるヌクレオチド配列を含む、核酸。
（項目２９）
項目２６に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
（項目３０）
項目２６に記載の核酸を含む、組み換え細胞。
（項目３１）
キメラタンパク質を生成する方法であって、項目２６に記載の核酸を含む組み換え細胞を増殖させて、前記コードされたキメラタンパク質を該細胞によって発現させる工程、および発現されたキメラタンパク質を回収する工程を含む、方法。
（項目３２）
項目３１に記載の方法の生成物。
（項目３３）
試料中の糖化タンパク質に関してアッセイするための方法であって：
ａ）アッセイされるべき試料をプロテアーゼと接触させて、糖化タンパク質が該試料中に含まれている場合、該糖化タンパク質から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生成する工程；
ｂ）該生成した糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を、項目１に記載のキメラタンパク質と接触させて、該糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化させる工程；ならびに、
ｃ）該キメラタンパク質による該糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、該試料中における該糖化タンパク質の存在および／または量を決定する工程、
を含む、方法。
（項目３４）
前記試料が血液試料である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記血液試料が、血漿試料、血清試料、赤血球試料または全血試料である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記アッセイされるべき糖化タンパク質が、グリコアルブミンまたはグリコヘモグロビンである、項目３３に記載の方法。
（項目３７）
前記プロテアーゼが、エンド型プロテアーゼまたはエキソ型プロテアーゼである、項目３３に記載の方法。
（項目３８）
前記エンド型プロテアーゼが、トリプシン、α−キモトリプシン、スブチリシン、プロテイナーゼＫ、パパイン、カテプシンＢ、ペプシン、サーモリシン、プロテアーゼＸＶＩＩ、プロテアーゼＸＸＩ、リシル−エンドペプチダーゼ、プロレターおよびブロメラインＦからなる群より選択される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記エキソ型プロテアーゼがアミノペプチダーゼまたはカルボキシペプチダーゼである、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記プロテアーゼが、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ、アナニン、サーモリシン、スブチリシン、およびウシ膵臓プロテアーゼからなる群より選択される、項目３３に記載の方法。
（項目４１）
前記プロテアーゼが、約２個から約３０個のアミノ酸残基の糖化ペプチドを生成する、項目３３に記載の方法。
（項目４２）
前記プロテアーゼが、糖化グリシン残基、糖化バリン残基、または糖化リジン残基、あるいは糖化グリシン残基、糖化バリン残基もしくは糖化リジン残基を含む糖化ペプチドを生成する、項目３３に記載の方法。
（項目４３）
前記キメラタンパク質が、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む、項目３３に記載の方法。
（項目４４）
前記キメラタンパク質が配列番号６に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、項目３３に記載の方法。
（項目４５）
前記糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化が、酸化反応における糖化ペプチドもしくは糖化アミノ酸、Ｈ２Ｏ、またはＯ２の消費、あるいは酸化反応における酸化されたグルコース（グルコソン）、Ｈ２Ｏ２、またはアミノ酸の形成を評価することによって評価される、項目３３に記載の方法。
（項目４６）
前記Ｏ２の消費が酸素電極によって評価される、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記Ｈ２Ｏ２の形成がペルオキシダーゼによって評価される、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼである、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記Ｈ２Ｏ２の形成が、ペルオキシダーゼとトリンダー反応とによって評価される、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
前記糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸が、キメラタンパク質およびペルオキシダーゼと、順次または同時に接触させられる、項目４７に記載の方法。
（項目５１）
前記グルコソンの形成が、グルコースオキシダーゼによって評価される、項目４５に記載の方法。
（項目５２）
前記グルコソンンの形成が、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼとヘキソキナーゼとの組み合わせによって評価される、項目４５に記載の方法。
（項目５３）
前記プロテアーゼが、前記糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸と前記キメラタンパク質との間での接触の前、または該接触と同時に不活化される、項目３３に記載の方法。
（項目５４）
前記プロテアーゼが熱処理または該プロテアーゼの阻害因子によって不活化される、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
アスコルビン酸塩による妨害が、銅（ＩＩ）化合物、コール酸もしくはジスルホン酸バソフェナントロリン、またはそれらの混合物を使用して計測される、項目３３に記載の方法。
（項目５６）
ビリルビンによる妨害が、フェロシアン化物塩を使用して計測される、項目３３に記載の方法。
（項目５７）
疾患または障害の予後診断または診断に使用される、項目３３に記載の方法。
（項目５８）
前記疾患または障害が糖尿病である、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
試料中の糖化タンパク質に関してアッセイするためのキットであって、該キットは、以下：
ａ）糖化タンパク質が試料中に含まれている場合に該糖化タンパク質から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生成するための、プロテアーゼ；
ｂ）該糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化するための、項目１に記載のキメラタンパク質；ならびに、
ｃ）該キメラタンパク質による該糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、該試料中における該糖化タンパク質の存在および／または量を決定するための手段
を含む、キット。
（項目６０）
前記キメラタンパク質による前記糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価するための手段が、ペルオキシダーゼを含む、項目５９に記載のキット。
（項目６１）
前記キメラタンパク質とペルオキシダーゼとが単一の組成物中に処方されている、項目６０に記載のキット。
（項目６２）
試料中の糖化タンパク質に関してアッセイするための方法であって、該方法は、以下：
ａ）アッセイされるべき試料をプロテイナーゼＫと接触させて、糖化タンパク質が該試料中に含まれている場合、該糖化タンパク質から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生成する工程；
ｂ）該生成された糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を、アマドリアーゼと接触させて、該糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化させる工程；ならびに、
ｃ）該アマドリアーゼによる該糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、該試料中における該糖化タンパク質の存在および／または量を決定する工程
を含む、方法。
（項目６３）
前記試料が血液試料である、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記血液試料が、血漿試料、血清試料、赤血球試料、または全血試料である、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記アッセイされるべき糖化タンパク質が、グリコアルブミンまたはグリコヘモグロビンである、項目６２に記載の方法。
（項目６６）
前記アマドリアーゼがキメラタンパク質を含み、前記キメラタンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に向かって：
ａ）約５個から約３０個のアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む、第１のペプチジル断片；および
ｂ）アマドリアーゼを含む、第２のペプチジル断片
を含む、項目６２に記載の方法。
（項目６７）
前記キメラタンパク質が、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記キメラタンパク質が、配列番号６に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、項目６６に記載の方法。
（項目６９）
前記糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化が、酸化反応における該糖化ペプチドもしくは糖化アミノ酸、Ｈ２Ｏ、またはＯ２の消費、あるいは酸化反応における酸化されたグルコース（グルコソン）、Ｈ２Ｏ２、またはアミノ酸の形成を評価することによって評価される、項目６２に記載の方法。
（項目７０）
前記Ｏ２の消費が酸素電極によって評価される、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記Ｈ２Ｏ２の形成がペルオキシダーゼによって評価される、項目６９に記載の方法。
（項目７２）
前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼである、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記Ｈ２Ｏ２の形成がペルオキシダーゼとトリンダー反応とによって評価される、項目７１に記載の方法。
（項目７４）
前記糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸が、前記アマドリアーゼおよびペルオキシダーゼと、順次または同時に接触させられる、項目７１に記載の方法。
（項目７５）
前記グルコソンの形成が、グルコースオキシダーゼによって評価される、項目６９に記載の方法。
（項目７６）
前記グルコソンンの形成が、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼとヘキソキナーゼとの組み合わせによって評価される、項目６９に記載の方法。
（項目７７）
前記プロテイナーゼＫが、前記糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸と前記アマドリアーゼとの間での接触の前、または該接触と同時に不活化される、項目６２に記載の方法。
（項目７８）
前記プロテイナーゼＫが熱処理または該プロテイナーゼＫの阻害因子によって不活化される、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
アスコルビン酸塩による妨害が、銅（ＩＩ）化合物、コール酸もしくはジスルホン酸バソフェナントロリン、またはそれらの混合物を使用して計測される、項目６２に記載の方法。
（項目８０）
ビリルビンによる妨害が、フェロシアン化物塩を使用して計測される、項目６２に記載の方法。
（項目８１）
疾患または障害の予後診断または診断に使用される、項目６２に記載の方法。
（項目８２）
前記疾患または障害が糖尿病である、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
試料中の糖化タンパク質に関してアッセイするためのキットであって、該キットは、以下：
ａ）糖化タンパク質が該試料中に含まれている場合に該糖化タンパク質から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生成するための、プロテイナーゼＫ；
ｂ）該糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化させるための、アマドリアーゼ；ならびに、
ｃ）該アマドリアーゼによる該糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、該試料中における該糖化タンパク質の存在および／または量を決定するための手段
を含む、キット。
（項目８４）
前記アマドリアーゼによる前記糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価するための手段が、ペルオキシダーゼを含む、項目８３に記載のキット。
（項目８５）
前記アマドリアーゼとペルオキシダーゼとが単一の組成物中に処方されている、項目８４に記載のキット。
（項目８６）
前記アマドリアーゼがキメラタンパク質を含み、該キメラタンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に向かって：
ａ）約５個から約３０個のアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む、第１のペプチジル断片；および
ｂ）アマドリアーゼを含む、第２のペプチジル断片
を含む、項目８３に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、例示的なＧＳＰキット、およびＲａｎｄｏｘのフルクトサミン（Ｆｒｕｃｔｏｓａｍｉｎｅ）キットの比較を示す。
【図２】図２は、試料中の糖化タンパク質をアッセイするための例示的な方法のアッセイについての線形性を示す。
【図３】図３は、フルクトシル−バリンを用いた用量依存性の反応を示す。
【図４】図４は、フルクトシル−バリンを用いた用量依存性の反応を示す。
【図５】図５は、プロテイナーゼで消化（５分間の消化）した患者のヘモグロビンを用いた用量依存性のシグナルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
開示を明確にするために、限定ではないが、本発明の詳細な説明を、以下のセクションに提供する。
【００１３】
（Ａ．定義）
別段の定義のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書中で言及される全ての特許、特許出願、公開出願、および他の刊行物は、それらの全体が参照によって組み入れられる。このセクションに示される定義が、参照により本明細書中に組み入れられる特許、特許出願、公開出願、および他の刊行物の中に示される定義と正反対であるか、または別の方法で矛盾する場合には、このセクションに示される定義が、参照によって本明細書中に組み入れられる定義に対して優位であるとする。
【００１４】
本明細書中で使用される場合は、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。
【００１５】
本明細書中で使用される場合は、「リーダー配列」は、標的ペプチドまたはタンパク質に融合させられた場合に、標的ペプチドまたはタンパク質の安定性および／または発現レベルを増大させるペプチド配列をいう。通常は、リーダー配列は、標的ペプチドまたはタンパク質の安定性および／または発現レベルを、少なくとも５０％増大させる。好ましくは、リーダー配列は、標的ペプチドまたはタンパク質の安定性および／または発現レベルを、少なくとも１倍、２倍、５倍、１０倍、または１０倍以上増大させる。原核生物中でのアミノ酸の合成に関与している酵素の遺伝子発現の調節においては、リーダー配列は、調節されるアミノ酸のいくつかの残基を含むリーダーペプチドをコードする。転写は翻訳と密接に関係しており、翻訳が特異的アミノ酸についてのアミノアシルｔＲＮＡの供給が限られていることによって遅れる場合は、リーダー配列の転写の様式により、オペロン遺伝子の完全な転写が可能となる。あるいは、リーダー配列の完全な転写により、調節される遺伝子の転写が早くに終結してしまう。
【００１６】
本明細書中で使用される場合は、「糖化タンパク質」は、タンパク質を構成するアミノ酸のアミノ基のアルドースのような還元糖のアルデヒド基との非酵素的な不可逆的結合によって生じる物質をいう。例えば、米国特許第６，１２７，１３８号を参照のこと。このような、非酵素的な不可逆的結合反応はまた、「アマドリ転位」とも呼ばれ、したがって、上記の糖化タンパク質は、場合によっては「アマドリ化合物」とも呼ばれる。
【００１７】
本明細書中で使用される場合は、「アマドリアーゼ」は、以下の反応に示されるように、対応するアミノ酸、グルコソンと、Ｈ２Ｏ２を生じる、アマドリ生成物の酸化的脱糖化を触媒する酵素をいう。
【００１８】
【化４】
式中、Ｒ１は、還元糖のアルドース残基を示し、Ｒ２はアミノ酸、タンパク質、またはペプチドの残基を示す。アマドリアーゼの他の異名としては、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）およびフルクトシルアミン：酸素オキシドレダクターゼ（ＦＡＯＯ）が挙げられる。本明細書中の目的については、名称「アマドリアーゼ」が本明細書中で使用されるが、全てのこのような化学的な異名も意図される。「アマドリアーゼ」にはまた、対応するアミノ酸、グルコソンと、Ｈ２Ｏ２を生じる、アマドリ生成物の酸化的脱糖化を触媒するその酵素活性をなおも実質的に保持している、機能性断片または誘導体も含まれる。通常は、機能性断片または誘導体は、そのアマドリアーゼの活性の少なくとも５０％を保持している。好ましくは、機能性断片または誘導体は、そのアマドリアーゼの活性の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％を保持している。アマドリアーゼには、その活性を実質的に変化させることのない保存的アミノ酸置換が含まれていてもよい。アミノ酸の適切な保存的置換は当業者に公知であり、通常は、得られる分子の生物学的活性を変化させることなく作成され得る。一般的には、ポリペプチドの必須ではない領域の１つのアミノ酸の置換によっては、生物学的活性は実質的には変化しないと、当業者に理解されている（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ Ｂｅｊａｃｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４を参照のこと）。このような例示的な置換は、好ましくは、以下の表１に示される置換にしたがって作成される。
【００１９】
（表１）
【００２０】
【表１】
他の置換もまた許容され、経験的に、または公知の保存的置換にしたがって決定することができる。
【００２１】
本明細書中で使用される場合は、「グリコヘモグロビン」は、血液中のヘモグロビンの糖化によって生じるフルクトシルアミン誘導体をいう。
【００２２】
本明細書中で使用される場合は、「グリコアルブミン」は、血液中のアルブミンの糖化によって生じるフルクトシルアミン誘導体をいう。
【００２３】
本明細書中で使用される場合は、「フルクトサミン」は、血液中のタンパク質の糖化によって生じる誘導体（還元能力を有しているもの）をいう。
【００２４】
本明細書中で使用される場合は、「組成物」は、２つ以上の生成物または化合物の任意の混合物をいう。これは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性のもの、非水性のもの、あるいは、それらの任意の組み合わせであり得る。
【００２５】
本明細書中で使用される場合は、「組み合わせ」は、２つ以上の要素の任意のつながりをいう。
【００２６】
本明細書中で使用される場合は、「血漿」は、凝固後に得られる血清とは区別される、血液の流動性の細胞構造のない部分をいう。
【００２７】
本明細書中で使用される場合は、「血清」は、循環している血液中の血漿とは区別される、フィブリン塊および血球の除去後に得られる血液の流動性の部分をいう。
【００２８】
本明細書中で使用される場合は、「流動体」は、流れることができる任意の組成物をいう。したがって、流動体には、半固体、ペースト、水溶液、水性の混合物、ゲル、ローション、クリームの形態である組成物、および他のそのような組成物が含まれる。
【００２９】
本明細書中で使用される場合は、「ペルオキシダーゼ」は、過酸化水素が特異的酸化剤であり、広範囲の基質が電子供与体の役割を果たす反応のホストを触媒する酵素をいう。その活性を実質的に変化させることのない保存的アミノ酸置換を有しているペプチドが含まれることが意図される。最重要な市販されているペルオキシダーゼは、西洋ワサビペルオキシダーゼである。
【００３０】
本明細書中で使用される場合は、「グルコースオキシダーゼ」は、グルコースとＨ２ＯとＯ２からのグルコン酸とＨ２Ｏ２の形成を触媒する酵素をいう。その活性を実質的に変化させることのない保存的アミノ酸置換を有しているグルコースオキシダーゼが含まれることが意図される。
【００３１】
本明細書中で使用される場合は、「ヘキソキナーゼ」は、解糖系によるグルコースの代謝の最初の反応である、グルコース−６−リン酸を形成させるためのＡＴＰからグルコースへのリン酸基の移動を触媒する酵素をいう。その活性を実質的に変化させることのない保存的アミノ酸置換を有しているヘキソキナーゼが含まれることが意図される。
【００３２】
本明細書中で使用される場合は、任意の保護基、アミノ酸、および他の化合物についての略号は、別段の定義のない限り、それらの一般的な使用法、認められている省略、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅに従う（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１：１７２６（１９７２）を参照のこと）。
【００３３】
（Ｂ．アマドリアーゼを含むキメラタンパク質およびそれをコードする核酸）
１つの態様においては、本発明は、単離されたキメラタンパク質に関する。キメラタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ａ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｂ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片が含まれる。
【００３４】
任意の適切な細菌のリーダー配列を使用することができる。米国特許第６，１９４，２００号に開示されているように、別の遺伝子に由来するリーダー配列を伴う融合タンパク質としての目的のポリペプチドの発現には、安定性が提供されることに加えていくつかの利点がある。例えば、Ｎ末端アミノ酸の存在により、任意の種々のポリペプチドの精製のための一般的な精製技術を使用するための手段が提供される。例えば、Ｎタンパク質のＮ末端アミノ酸は抗原性であると予想され、したがって、Ｎタンパク質のＮ末端アミノ酸に対して惹起させられた特異的抗体を、Ｎタンパク質のＮ末端を含む融合タンパク質のアミノ精製に使用することができる。さらに、Ｎタンパク質のＮ末端は高い正電荷を有しており、これにより、イオン交換クロマトグラフィーによって所望のタンパク質の精製が容易であること、などがある。
【００３５】
リーダー配列には、また、分泌のためのシグナル配列としての役割を果たすことができる疎水性アミノ酸配列を含めることができる。米国特許第６，１９４，２００号を参照のこと。シグナル配列をコードするＤＮＡ配列は、目的の遺伝子の上流に、そのリーディングフレーム内に連結される。通常は、シグナル配列には、シグナル配列ペプチダーゼによって認識される切断部位が含まれる。したがって、シグナル配列切断部位のすぐ後ろに目的のポリペプチドを配置させることにより、目的のポリペプチドをシグナル配列から特異的に切断し、成熟ポリペプチドとして分泌させることができる。疎水性アミノ酸配列の例として、細菌のアルカリホスファターゼのシグナル配列；ＯＭＰ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＦシグナル配列；ＬＰＰシグナル配列、β−ラクタマーゼシグナル配列；および毒素シグナル配列が挙げられる。
【００３６】
使用することができる他のリーダー配列としては、親水性配列、例えば、アンフィレグリンに由来するＮ末端の４１個のアミノ酸残基が挙げられる。これは、目的のポリペプチドの機能の変更のために提供することができる。米国特許第６，１９４，２００号を参照のこと。さらに、トキシンＡ鎖断片、リシンＡ鎖、ヘビ毒成長停止ペプチドのような細胞傷害因子、またはホルモンもしくは抗体のような標的化分子を、ほとんどの場合には目的の遺伝子産物の生物学的活性に対して最少の影響となるように、リーダー配列と共有結合させることができる。他のリーダー配列を用いる場合は、リーダー配列をコードするＤＮＡ配列は、目的の遺伝子の上流に、そのリーディングフレーム内に連結される。
【００３７】
リーダー配列がシグナル配列ではなく、好都合な自然界に存在している切断部位を含まない場合は、さらなるアミノ酸を、目的の遺伝子とリーダー配列との間に挿入して、リーダーペプチドの切断のため、その後の融合タンパク質の精製、その後の成熟ポリペプチドの精製を可能にするための酵素的または化学的切断部位を提供することができる。米国特許第６，１９４，２００号を参照のこと。例えば、融合タンパク質の２つのセグメントの間に酸に不安定なアスパルチル−プロリン結合を導入することによって、低いｐＨでそれらを分離することが容易にできる。この方法は、所望されるポリペプチドが酸に不安定である場合には適切ではない。融合タンパク質は、例えば、メチオニン残基のカルボキシ側に特異的である臭化シアンで切断することができる。リーダー配列と所望されるポリペプチドとの間にメチオニンを配置することにより、所望されるポリペプチドの放出が可能になる。この方法は、所望されるポリペプチドがメチオニン残基を含む場合には適切ではない。
【００３８】
以下の特許、特許出願、および参考文献に開示されている他の細菌のリーダー配列もまた、使用することができる：ＷＯ００／２８０４１およびＷＯ８９／０３８８６；米国特許第５９１４２５０号、同第５８８５８１１号、同第５１７１６７０号、同第５０３０５６３号、同第４９４８７２９号、および同第４５８８６８４号；欧州特許第ＥＰ０，１９６，８６４号、同第ＥＰ０，１８６，６４３号、およびＥＰ０，１２１，３５２；Ｍｉｃｈｉｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９（４）：１６４−８（２００１）；Ｈｏｂｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．，８４：２５５−６２（１９９５）；Ｈａｒｄｙ ａｎｄ Ｒａｎｄａｌｌ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．Ｓｕｐｐｌ．，１１：２９−４３（１９８９）；Ｓａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２（３）：１９９−２０８（１９８８）；およびＰｅａｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０（２２）；６１１１−２（１９９２）。好ましくは、細菌のリーダー配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のタンパク質のリーダー配列であり、例えば、Ｒｏｅｓｓｅｒ ａｎｄ Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９（４）：７９５−８００（１９９１）；およびＫｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６７（３）：２３５−４１（１９７９）に開示されている大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のリーダー配列である。
【００３９】
１つの例においては、リーダー配列は、配列番号１（ＭＧＧＳＧＤＤＤＤＬＡＬ）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の同一性を有する。ここでは、パーセント同一性は、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、同じ大きさのアミノ酸配列全体に関して決定される。好ましくは、リーダー配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する。ここでは、パーセント同一性は、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、同じ大きさのアミノ酸配列全体に関して決定される。また、好ましくは、リーダー配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列に特異的に結合する抗体に結合する。さらに好ましくは、リーダー配列には、配列番号１に示されるアミノ酸配列が含まれる。
【００４０】
第１のペプチジル断片は、任意の適切な長さを有することができる。例えば、第１のペプチジル断片には、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６，２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸残基が含まれる。好ましくは、第１のペプチジル断片には、約２０個のアミノ酸残基が含まれる。
【００４１】
任意の適切なアマドリアーゼを使用することができる。１つの例においては、アマドリアーゼは、アスパラジラス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）が起源のものである（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（６）：３４３７−４３（１９９７）を参照のこと）。別の例においては、アマドリアーゼは、補因子としてＦＡＤを使用する。好ましくは、アマドリアーゼは、ＦＡＤ補因子結合コンセンサス配列Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｘ−Ｇｌｙ（配列番号２）を有する。Ｘは任意のアミノ酸残基である。さらに別の例においては、アマドリアーゼは、アマドリアーゼＩａ、アマドリアーゼＩｂ、アマドリアーゼＩｃ、またはアマドリアーゼＩＩである（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（６）：３４３７−４３（１９９７）を参照のこと）。アマドリアーゼＩａ、アマドリアーゼＩｂ、アマドリアーゼＩｃ、およびアマドリアーゼＩＩのＮ末端配列の間でのアミノ酸配列の相同性を、以下の表２に示す。これらのデータは、組み合わせたＧｅｎＢａｎｋ（商標）ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ／ＰＤＢ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＳＰｕｐｄａｔｅ／ＰＩＲデータベースを使用したコンピュータによる検索によって得た（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（６）：３４３７−４３（１９９７）の表ＩＶを参照のこと）。番号はそれぞれの配列中のアミノ酸位置を示す。保存的置換を（＋）で示す。アマドリアーゼのデータは、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（６）：３４３７−４３（１９９７）で得られたＮ末端配列に対応させた。
【００４２】
（表２ アマドリアーゼＩａ、アマドリアーゼＩｂ、アマドリアーゼＩｃ、およびアマドリアーゼＩＩのＮ末端配列の間でのアミノ酸配列の相同性）
【００４３】
【表２】
他のアマドリアーゼ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ８２８３０（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１９）：１２５０５−１２５０７（１９９７）に開示されているアマドリアーゼ、および米国特許第６，１２７，１３８号に開示されているアマドリアーゼもまた使用することができる。対応するアミノ酸、グルコソンと、Ｈ２Ｏ２を生じる、アマドリ生成物の酸化的脱糖化を触媒するその酵素活性をなおも実質的に保持しているアマドリアーゼの機能性断片または誘導体もまた、使用することができる。
【００４４】
通常は、アマドリアーゼの機能性断片または誘導体は、その酵素活性の少なくとも５０％を保持している。好ましくは、アマドリアーゼの機能性断片または誘導体は、その酵素活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％を保持している。
【００４５】
アマドリアーゼの酵素活性についてのアッセイは当該技術分野で公知である（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（６）：３４３７−４３（１９９７）、および米国特許第６，１２７，１３８号を参照のこと）。アマドリアーゼの酵素活性についての４個の例示的なアッセイが、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（６）：３４３７−４３（１９９７）に開示されている。
【００４６】
（グルコソンの形成）
このアッセイにおいては、酵素活性は、基質としてフルクトシルプロピルアミンを使用するＯＰＤでの比色反応によって測定される、グルコソンの放出によってモニターされる。このアッセイは、１２０分の反応時間の後での、形成されたグルコソンの終点測定をベースとする。反応混合物には、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＯＰＤ、１０ｍＭのフルクトシルプロピルアミン、および酵素タンパク質が、１ｍＬの最終容量の中に含められる。３７℃で２時間のインキュベーションのあと、３２０ｎｍでの吸光度が測定される。反応は、これらの条件下では用量依存性の様式で２４０分まで線形である。１単位の酵素活性は、１μｍｏｌのグルコソン／分を生じる酵素の量と定義される。合成されたグルコソンが標準物として使用される。
【００４７】
（遊離アミンアッセイ）
遊離アミンの放出をアッセイするために、蛍光がフルオレサミンとの反応の後に測定される。２５μｌの純粋な酵素もしくは酵素を多く含む画分の溶液、１５μｌの２０％のフルクトシルプロピルアミン水溶液、および２５０μｌのＰＢＳが、３７℃で記載される種々の時間の間インキュベートされる。反応は、４℃でＭｉｃｒｏｃｏｎ−１０（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を通して濾過することによって停止させる。１μｌの純物質または１：１０希釈した濾過物が、１．５ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に添加される。激しくボルテックスされた状態で、０．５ｍｌの０．０３％フルオレサミンのジオキサン溶液が迅速に添加される。５分後、蛍光が測定される（λｅｘ＝３９０ｎｍ、λｅｍ＝４７５ｎｍ）。標準物のプロットは、６〜１５０ｎｇのプロピルアミンを用いて作成される。
【００４８】
（Ｈ２Ｏ２アッセイ）
過酸化水素は、Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９：４８７−４９１（１９９５）にしたがってキノン色素アッセイによって定量される。反応混合物には、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭの４−アミノアンチピリン、２．０ｍＭのフェノール、２．０単位のペルオキシダーゼ、１０ｍＭのフルクトシルプロピルアミン、および酵素タンパク質が、１ｍｌの全容量の中に含まれる。Ｈ２Ｏ２の生産は、５０５ｎｍ（ε＝５．１３×１０３）での吸光度にしたがうキノン色素の形成によってモニターされる。０．５μｍｏｌのキノン色素の生産は、１．０μｍｏｌのＨ２Ｏ２の形成に対応する。
【００４９】
（酸素消費）
酸素消費は、Ｇｅｒｈａｒｄｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２１８−２２４（１９９５）に記載されているようなＣｌａｒｋｅ型酸素電極が取り付けられているＹＳＩ−Ｂｅｃｋｍａｎ ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ ＩＩを用いて決定される。簡単に言うと、酵素（５０μｌ）が、７５０μｌのＰＢＳと６５０μｌの水を含むチャンバーに添加される。反応は、５０μｌの３００ｍＭのフルクトシルプロピルアミン（最終濃度１０ｍＭ）の添加によって開始される。
【００５０】
別の例においては、アマドリアーゼは、配列番号３：
【００５１】
【化５】
に示されるアミノ酸に対して少なくとも４０％の同一性を有する。ここでは、パーセント同一性は、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して、同じ大きさのアミノ酸配列全体に関して決定される。好ましくは、アマドリアーゼは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する。ここでは、パーセント同一性は、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して、同じ大きさのアミノ酸配列全体に関して決定される。また、好ましくは、アマドリアーゼは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に特異的に結合する抗体に結合する。また、好ましくは、アマドリアーゼには、配列番号３に示されるアミノ酸配列が含まれる。
【００５２】
第１のペプチジル断片および第２のペプチジル断片は、任意の適切な連結によって連結させることができる。例えば、第１のペプチジル断片と第２のペプチジル断片を、切断することができる連結によって連結させることができる。
【００５３】
単離されたキメラタンパク質には、さらに、そのＣ末端に、約５個から約３０個までのアミノ酸残基の第２の細菌のリーダー配列を含む第３のペプチジル断片を含めることもできる。上記に記載したものを含む任意の適切な細菌のリーダー配列を使用することができる。
【００５４】
１つの例においては、第２の細菌のリーダー配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質のリーダー配列である。別の例においては、第２の細菌のリーダー配列は、配列番号４（ＫＧＥＬＥＧＬＰＩＰＮＰＬＬＲＴＧ）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の同一性を有する。ここでは、パーセント同一性は、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、同じ大きさのアミノ酸配列全体に関して決定される。好ましくは、第２の細菌のリーダー配列は、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する。ここでは、パーセント同一性は、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、同じ大きさのアミノ酸配列全体に関して決定される。また、好ましくは、第２の細菌のリーダー配列は、配列番号４に示されるアミノ酸配列に特異的に結合する抗体に結合する。また、好ましくは、第２の細菌のリーダー配列には、配列番号４に示されるアミノ酸配列が含まれる。
【００５５】
第３のペプチジル断片は、適切な長さを有することができる。例えば、第３のペプチジル断片には、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６，２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸残基が含まれる。好ましくは、第３のペプチジル断片には、約２０個のアミノ酸残基が含まれる。
【００５６】
単離されたキメラタンパク質には、さらに、そのＣ末端に、ペプチドタグを含む第３のペプチジル断片を含めることができる。任意の適切なタグを使用することができる。例えば、タグは、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＨＡ１、ｃ−Ｍｙｃ、６−Ｈｉｓ、ＡＵ１、ＥＥ、Ｔ７、４Ａ６、ε、Ｂ、ｇＥ、およびＴｙ１タグであり得る（表３を参照のこと）。
【００５７】
（表３ 例示的なエピトープタグシステム）
【００５８】
【表３】
【００５９】
【化６】
１つの例においては、単離されたキメラタンパク質には、配列番号５：
【００６０】
【化７】
に示されるアミノ酸配列が含まれる。
【００６１】
別の態様においては、本発明は、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸に関する。キメラタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ａ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｂ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片が含まれる。
【００６２】
１つの例においては、単離された核酸には、配列５に示されるアミノ酸配列を含むキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列が含まれる。別の例においては、単離された核酸には、配列番号６：
【００６３】
【化８−１】
【００６４】
【化８−２】
に示されるヌクレオチド配列が含まれる。
【００６５】
さらに別の例においては、単離された核酸には、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列が含まれる。キメラタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ａ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｂ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片が含まれる。
【００６６】
キメラタンパク質をコードする核酸、またはその相補鎖を含む組み換え細胞が意図される。キメラタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ａ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｂ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片が含まれる。
【００６７】
キメラタンパク質の生産方法もまた、意図される。この方法には、コードされるキメラタンパク質が細胞によって発現されるように、キメラタンパク質（キメラタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ａ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｂ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片が含まれる）をコードする核酸を含む組み換え細胞を増殖させること、および発現されたキメラタンパク質を回収することが含まれる。この方法による生成物が、さらに意図される。
【００６８】
キメラタンパク質またはキメラタンパク質をコードする核酸は、任意の適切な方法、例えば、化学合成、組み換え生産、またはそれらの併用によって調製することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０００）、およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照のこと）。
【００６９】
（Ｃ．キメラタンパク質を使用して糖化タンパク質をアッセイするための方法およびキット）
さらに別の態様においては、本発明は、試料中の糖化タンパク質をアッセイするための方法に関する。この方法には、ａ）アッセイされる試料をプロテアーゼと接触させて、糖化タンパク質（これが上記の試料中に含まれている場合）から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生じさせること；ｂ）上記の生じた糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ｉ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｉｉ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片を含むキメラタンパク質と接触させて、上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化させること；ならびに、ｃ）上記のキメラタンパク質による上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、上記試料中に上記の糖化タンパク質が存在すること、および／またはその量を決定することが含まれる。
【００７０】
本発明の方法は、任意の適切な試料をアッセイするために使用することができる。好ましくは、試料は血液試料、例えば、血漿、血清、赤血球、または全血試料である。
【００７１】
本発明の方法は、任意の適切な糖化タンパク質をアッセイするために使用することができる。好ましくは、アッセイされる糖化タンパク質はグリコアルブミンまたはグリコヘモグロビンである。
【００７２】
任意の適切なプロテアーゼを、本発明の方法において使用することができる。エンド型プロテアーゼまたはエキソ型プロテアーゼのいずれも、使用することができる。例示的なエンド型プロテアーゼとして、トリプシン、α−キモトリプシン、スブチリシン、プロテイナーゼＫ、パパイン、カテプシンＢ、ペプシン、サーモリシン、プロテアーゼＸＶＩＩ、プロテアーゼＸＸＩ、リシル−エンドペプチダーゼ、プロレター（ｐｒｏｌｅｔｈｅｒ）およびブロメラインＦが挙げられる。例示的なエキソ型プロテアーゼとしては、アミノペプチダーゼまたはカルボキシペプチダーゼが挙げられる。１つの例においては、プロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ、アナニン、サーモリシン、スブチリシン、またはウシの膵臓のプロテアーゼである。
【００７３】
プロテアーゼは、任意の適切な大きさの糖化ペプチドを生じるように使用することができる。例えば、プロテアーゼを、約２から約３０個までのアミノ酸残基の糖化ペプチドを生じるように使用することができる。別の例においては、プロテアーゼは、糖化グリシン、糖化バリン、または糖化リジン残基、あるいは、糖化グリシン、糖化バリン、もしくは糖化リジン残基を含む糖化ペプチドを生じるように使用される。
【００７４】
上記のセクションＢに記載されたものを含む任意の適切なキメラタンパク質を、本発明の方法において使用することができる。１つの例においては、キメラタンパク質には、配列番号５に示されるアミノ酸配列が含まれる。別の例においては、キメラタンパク質は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【００７５】
糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化は、任意の適切な方法によって評価することができる。例えば、糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化は、酸化反応における糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸、Ｈ２Ｏ、またはＯ２の消費、あるいは酸化反応における酸化されたグルコース（グルコソン）、Ｈ２Ｏ２、またはアミノ酸の形成を評価することによって評価することができる。
【００７６】
Ｏ２の消費は、任意の適切な方法によって評価することができる。例えば、Ｏ２の消費は、酸素電極によって評価することができる。
【００７７】
Ｈ２Ｏ２の形成は、任意の適切な方法によって評価することができる。例えば、Ｈ２Ｏ２の形成は、ペルオキシダーゼによって評価することができる。任意のペルオキシダーゼを本発明の方法において使用することができる。より好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼが使用される。例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号を有している西洋ワサビペルオキシダーゼを使用することができる：Ｅ０１６５１；Ｄ９０１１６（ｐｒｘＣ３遺伝子）；Ｄ９０１１５（ｐｒｘＣ２遺伝子）；Ｊ０５５５２（合成のイソ型酵素Ｃ（ＨＲＰ−Ｃ））；Ｓ１４２６８（中性）；ＯＰＲＨＣ（Ｃ１前駆体）；Ｓ００６２７（Ｃ１Ｃ前駆体）；ＪＨ０１５０（Ｃ３前駆体）；Ｓ００６２６（Ｃ１Ｂ前駆体）；ＪＨ０１４９（Ｃ２前駆体）；ＣＡＡ０００８３（ホースラディッシュ（Ａｒｍｏｒａｃｉａ ｒｕｓｔｉｃａｎａ）由来）；およびＡＡＡ７２２２３（合成の西洋ワサビペルオキシダーゼイソ酵素Ｃ（ＨＲＰ−Ｃ））。別の例においては、Ｈ２Ｏ２の形成は、ペルオキシダーゼとトリンダー反応によって評価することができる。糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を、キメラタンパク質とペルオキシダーゼに、連続して、または同時に接触させることができる。
【００７８】
グルコソンの形成は、任意の適切な方法によって評価することができる。例えば、グルコソンの形成は、グルコースオキシダーゼによって評価することができる。任意の適切なグルコースオキシダーゼを使用することができる。例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号を有しているヌクレオチド配列によってコードされるグルコースオキシダーゼを使用することができる：ＡＦ０１２２７７（ペニシリウム・アマガサキナーゼ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ Ａｍａｇａｓａｋｉｅｎｓｅ）由来）；Ｕ５６２４０（タラロマイセス・フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｕｓ）由来）；Ｘ１６０６１（アスパラジラス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ｇｏｘ遺伝子）；Ｘ５６４４３（アスパラジラス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｇｏｄ遺伝子）；Ｊ０５２４２（アスパラジラス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来）；ＡＦ０１２２７７（ペニシリウム・アマガサキナーゼ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ Ａｍａｇａｓａｋｉｅｎｓｅ）由来）；Ｕ５６２４０（タラロマイセス・フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｕｓ）由来）；Ｘ１６０６１（アスパラジラス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ｇｏｘ遺伝子）；Ｘ５６４４３（アスパラジラス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｇｏｄ遺伝子）；Ｊ０５２４２（アスパラジラス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のグルコース）。好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｊ０５２４２のヌクレオチド配列（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（７）：３７９３−８０２（１９９０）もまた参照のこと）、および米国特許第５，８７９，９２１号に記載されているヌクレオチド配列を、グルコースオキシダーゼをコードする核酸を得るために使用することができる。
【００７９】
別の例においては、グルコソンの形成を、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼとヘキソキナーゼの組み合わせによって評価することができる。任意の適切なグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼを使用することができる。例えば、以下の特許および特許出願において開示されているグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼを使用することができる：ＷＯ０３／０４２３８９、ＷＯ０１／９８４７２、ＷＯ９３／０６１２５、および米国特許第６，１２７，３４５号、同第６，０６９，２９７号、同第５，８５６，１０４号、同第５，３０８，７７０号、同第５，２４４，７９６号、同第５，２２９，２８６号、同第５，１３７，８２１号、および同第４，８４７，１９５号。任意の適切なヘキソキナーゼを使用することができる。例えば、以下の特許および特許出願において開示されているヘキソキナーゼを使用することができる：ＷＯ０２／２０７９５、ＵＳ２００２／００９７７９、ＷＯ０１／９０３７８、ＷＯ０１／９０３２５、ＷＯ０１／６８６９４、ＷＯ０１／４７９６８、および米国特許第５，９４８，６６５号。
【００８０】
所望される場合は、プロテアーゼを、糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸と、キメラタンパク質との間での接触の前、またはそれと同時に不活化させることができる。プロテアーゼは、任意の適切な方法によって不活化させることができる。例えば、プロテアーゼは、熱処理、またはプロテアーゼの阻害因子によって不活化させることができる。
【００８１】
所望される場合は、アッセイの妨害を計測することができる。例えば、アスコルビン酸塩による妨害を、銅（ＩＩ）化合物、コール酸、もしくはジスルホン酸バソフェナントロリン、またはそれらの混合物を使用して計測することができる。ビリルビンによる妨害は、フェロシアン化物塩を使用して計測することができる。
【００８２】
本発明の方法は、任意の適切な目的のために使用することができる。好ましくは、この方法は、疾患または障害、例えば、糖尿病の予測または診断に使用される。
【００８３】
さらに別の態様においては、本発明は、試料中の糖化タンパク質をアッセイするためのキットに関する。このキットには、ａ）糖化タンパク質（これが試料中に含まれている場合）から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生じさせるためのプロテアーゼ；ｂ）上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化させるための、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ｉ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｉｉ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片を含むキメラタンパク質；ならびに、ｃ）上記のキメラタンパク質による上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、上記試料中に上記糖化タンパク質が存在すること、および／またはその量を決定するための手段が含まれる。
【００８４】
任意の適切な手段を、本発明のキットに含めることができる。例えば、上記糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の上記キメラタンパク質による酸化を評価するための手段には、ペルオキシダーゼを含めることができる。好ましくは、キメラタンパク質とペルオキシダーゼは、１つの組成物中に処方される。
【００８５】
（Ｄ．プロテーナーゼＫとアマドリアーゼを使用して糖化タンパク質を評価するための方法およびキット）
さらに別の態様においては、本発明は、試料中の糖化タンパク質をアッセイするための方法に関する。この方法には、ａ）アッセイされる試料をプロテイナーゼＫと接触させて、糖化タンパク質（これが上記の試料中に含まれている場合）から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生じさせること；ｂ）上記の生じた糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を、アマドリアーゼと接触させて、上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化させること；ならびに、ｃ）上記のアマドリアーゼによる上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、上記試料中に上記の糖化タンパク質が存在すること、および／またはその量を決定することが含まれる。
【００８６】
本発明の方法は、任意の適切な試料をアッセイするために使用することができる。好ましくは、試料は、血液試料、例えば、血漿、血清、赤血球、または全血試料である。
【００８７】
本発明の方法は、任意の適切な糖化タンパク質をアッセイするために使用することができる。好ましくは、アッセイされる糖化タンパク質はグリコアルブミンまたはグリコヘモグロビンである。
【００８８】
上記のセクションＢおよびＣに記載したものを含む任意の適切なアマドリアーゼを、本発明の方法において使用することができる。例えば、アマドリアーゼには、キメラタンパク質が含まれ得る。キメラタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ｉ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｉｉ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片が含まれる。好ましくは、キメラタンパク質には、配列５に示されるアミノ酸配列が含まれる。キメラタンパク質が、配列番号６に示されるヌクレオチドによってコードされることもまた好ましい。
【００８９】
糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化は、任意の適切な方法によって評価することができる。例えば、糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化は、酸化反応における糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸、Ｈ２Ｏ、またはＯ２の消費、あるいは酸化反応における酸化されたグルコース（グルコソン）、Ｈ２Ｏ２、またはアミノ酸の形成を評価することによって評価することができる。
【００９０】
Ｏ２の消費は、任意の適切な方法によって評価することができる。例えば、Ｏ２の消費は、酸素電極によって評価することができる。
【００９１】
Ｈ２Ｏ２の形成は、任意の適切な方法によって評価することができる。例えば、Ｈ２Ｏ２の形成は、ペルオキシダーゼによって評価することができる。上記のセクションＣに記載したものを含む任意のペルオキシダーゼを本発明の方法において使用することができる。より好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼが使用される。別の例においては、Ｈ２Ｏ２の形成は、ペルオキシダーゼとトリンダー反応によって評価することができる。糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を、キメラタンパク質とペルオキシダーゼに、連続して、または同時に接触させることができる。
【００９２】
グルコソンの形成は、任意の適切な方法によって評価することができる。例えば、グルコソンの形成は、グルコースオキシダーゼによって評価することができる。上記のセクションＣに記載したものを含む任意の適切なグルコースオキシダーゼを使用することができる。
【００９３】
別の例においては、グルコソンの形成を、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼとヘキソキナーゼの組み合わせによって評価することができる。上記のセクションＣに記載したものを含む任意の適切なグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼを使用することができる。上記のセクションＣに記載したものを含む任意の適切なヘキソキナーゼを使用することができる。
【００９４】
任意の適切なプロテイナーゼＫを、本発明の方法において使用することができる。例えば、以下の特許および特許出願に開示されているプロテイナーゼＫを使用することができる；ＷＯ０２／０７２６３４、ＷＯ０２／０６４７６０、ＷＯ９６／２８５５６、ならびに、米国特許第６，４５１，５７４号および同第５，３４４，７７０号。好ましくは、トリチラキウム・アルブム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ ａｌｂｕｍ）由来のプロテイナーゼＫが使用される（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号８２４５２）。
【００９５】
所望される場合は、プロテイナーゼＫは、糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸と、アマドリアーゼとの間での接触の前、またはそれと同時に不活化させることができる。例えば、プロテイナーゼＫは、熱処理、またはプロテイナーゼＫの阻害因子によって不活化させることができる。
【００９６】
所望される場合は、アッセイの妨害を計測することができる。例えば、アスコルビン酸塩による妨害を、銅（ＩＩ）化合物、コール酸、またはジスルホン酸バソフェナントロリン、またはそれらの混合物を使用して計測することができる。ビリルビンによる妨害は、フェロシアン化物塩を使用して計測することができる。
【００９７】
本発明の方法は、任意の適切な目的のために使用することができる。好ましくは、疾患または障害、例えば、糖尿病の予測または診断に使用される。
【００９８】
さらに別の態様においては、本発明は、試料中の糖化タンパク質をアッセイするためのキットに関する。このキットには、ａ）糖化タンパク質（これが試料中に含まれている場合）から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生じさせるためのプロテイナーゼＫ；ｂ）上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化させるためのアマドリアーゼ；ならびに、ｃ）上記アマドリアーゼによる上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、上記試料中に上記糖化タンパク質が存在すること、および／またはその量を決定するための手段が含まれる。
【００９９】
任意の適切な手段を、本発明のキットに含めることができる。例えば、上記糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の上記キメラタンパク質による酸化を評価するための手段には、ペルオキシダーゼを含めることができる。好ましくは、キメラタンパク質とペルオキシダーゼは、１つの組成物中に処方される。
【０１００】
上記のセクションＢおよびＣに記載したものを含む任意の適切なアマドリアーゼを、本発明のキットにおいて使用することができる。例えば、アマドリアーゼには、キメラタンパク質が含まれ得る。キメラタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ｉ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｉｉ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片が含まれる。好ましくは、キメラタンパク質には、配列５に示されるアミノ酸配列が含まれる。キメラタンパク質が、配列番号６に示されるヌクレオチドによってコードされることもまた好ましい。
【実施例】
【０１０１】
（Ｅ．実施例）
（実施例１．糖化血清タンパク質の酵素アッセイキット）
意図される用途。例示的なアッセイキットは、ヒトの血清中の糖化血清タンパク質（フルクトサミン）の決定のためのものである。フルクトサミンは、グルコースとタンパク質のアミノ酸残基との間での非酵素的メイラード反応によって形成される。糖尿病患者においては、高い血中グルコース濃度はフルクトサミンの形成の増大に関係している。フルクトサミンは、糖尿病の管理の中期（２〜３週間）の指標である。
【０１０２】
アッセイの原理。糖化血清タンパク質（ＧＳＰ）についての例示的な酵素的アッセイでは、ＧＳＰを低分子量の糖化タンパク質の断片（ＧＰＦ）へと消化するためにプロテイナーゼＫが使用され、そしてＤｉａｚｙｍｅの特異的フルクトサミナーゼ（商標）、微生物由来のアマドリアーゼが、ＰＦまたはアミノ酸、グルコソンとＨ２Ｏ２を生じる、アマドリ生成物ＧＰＦの酸化的消化を触媒するために使用される。放出されたＨ２Ｏ２は、比色トリンダー終点反応によって測定される。５５０ｎｍでの吸光度が、糖化血清タンパク質（ＧＳＰ）の濃度に比例する。
【０１０３】
【化９】
（表４ 試薬表）
【０１０４】
【表４】
試験試料。新しい患者の血清を使用するか、またはＥＤＴＡを処理した血漿試料を使用した。血漿は、回収後直ちに細胞と分離しなければならない。試料は、４℃では２週間、凍結すれば４週間まで保存することができる。
【０１０５】
再構成。試薬１の１つのバイアルを、２０ｍＬの蒸留水で再構成した。反転させて穏やかに混合し、その後、使用する前に室温に１０分間、置いておいた。再構成したＲ１は、４℃で４週間安定である。試薬２の１つのバイアルを５ｍＬの蒸留水で再構成した。反転させて穏やかに混合し、使用する前に室温で１０分間、置いておいた。再構成したＲ２は、４℃で６週間安定である。
【０１０６】
アッセイ手順
１．予め室温に暖めておいた再構成したＲ１およびＲ２
２．機器パラメーター：
波長：５５０ｎｍ；参照７００ｎｍ
キュベット：１ｃｍの光路
温度：３７℃
３．２００μＬの再構成したＲ１と、５０μＬの試料またはキャリブレーターをキュベットに添加する。混合し、５分間インキュベートする。５５０ｎｍでの吸光度をＡ１として読み取る。
４．５０μＬの再構成したＲ２を添加し、混合し、さらに５分間インキュベートし、その後、５５０ｎｍでの吸光度をＡ２として読み取る。
５．試薬を含まない場合（ブランク）の吸光度を、試料またはキャリブレーターの代わりに５０μＬのＨ２Ｏを使用して読み取る。
【０１０７】
【化１０】
計算
ΔＡ＝Ａ２−Ａ１
試料中の糖化血清タンパク質（フルクトサミン）の濃度：
フルクトサミン（μｍｏｌ／Ｌ）＝（ΔＡ試料−ΔＡブランク／Δ標準物−Δブランク）×キャリブレーターの濃度
。
【０１０８】
正常値。成人（２０歳〜６０歳）は、１２２〜２８５μｍｏｌ／Ｌの正常範囲を有している。それぞれの研究室において、一式の標準物を用いて予想される範囲を規定しなければならない。
【０１０９】
線形性および感度。このアッセイは、１２００μｍｏｌ／Ｌまで線形であり、３０μｍｏｌ／Ｌで感度がよい。Ｄｉａｚｙｍｅの糖化血清タンパク質（Ｄｉａｚｙｍｅ Ｇｌｙｃａｔｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（フルクトサミン）アッセイは正確で、＜３％の平均のアッセイ間ＣＶ、および＜２％の平均のアッセイ内ＣＶを有している。アッセイのデータは、別のフルクトサミン測定方法と、ｒ２＝０．９９の優れた相関関係を示した。
【０１１０】
妨害。以下の分析物濃度は、アッセイに影響を与えるとは認められなかった：
アスコルビン酸（４ｍｇ／ｄＬ）
ビリルビン（２ｍｇ／ｄＬ）
グルコース（１２００ｍｇ／ｄＬ）
ヘモグロビン（１００ｍｇ／ｄＬ）
トリグリセリド（２５０ｍｇ／ｄＬ）
尿酸（１５ｍｇ／ｄＬ）
較正。フルクトサミンキャリブレーター（カタログ番号ＤＺ１１２Ａ−Ｓ）が、較正のために必要である。
【０１１１】
品質管理。フルクトサミン対照（低および高）（カタログ番号ＤＺ１１２Ａ−Ｃ１およびＤＺ１１２Ａ−Ｃ３）を、対照血清として使用することが推奨される。１つの対照（低および高）を、３０個の試料ごとに試験しなければならない。これらの値は特定の範囲内になければならない。これらの値がその範囲を外れ、反復により誤差が全く許されない
場合は、以下の工程を行わなければならない：
１．機器の設定と光源をチェック
２．反応温度をチェック
３．キットと内容物の有効期限をチェック；そして
４．試薬の再構成に使用した水の品質をチェック。
【０１１２】
（参考文献）
【０１１３】
【化１１】
（実施例２．糖化血清タンパク質についてのアッセイの正確さおよび線形性）
（方法の比較）
１回の実行においてＤｉａｚｙｍｅのＧＳＰキットと、Ｒａｎｄｏｘのフルクトサミンキットの両方を使用して、一式のランダムな試料について２連で実行することによって決定した。Ｄｉａｚｙｍｅ ＧＳＰキットによって決定した分析能力の特性は、実施例１に記載した条件下でアッセイを行った場合には、Ｒａｎｄｏｘのフルクトサミンキットを用いて観察された特性に匹敵するものであった（図１もまた参照のこと）。
【０１１４】
（アッセイの線形性）
１回の実行において、一式の段階希釈した血清試料について２連で実行することによって決定した。アッセイは、４０〜８５６μｍｏｌ／Ｌまで線形であった（図２を参照のこと）。
【０１１５】
（妨害）
種々の妨害する可能性がある物質が存在しない条件下、および示した濃度でそのような種々の物質が存在する条件下で、対照試料のそれぞれについて３連で実行することによって決定した（以下の表５を参照のこと）。
【０１１６】
（表５ 妨害についての分析）
【０１１７】
【表５】
（実施例３．糖化ヘモグロビンＨｂＡ１ｃについてのアッセイ）
（Ａ．糖化バリンの測定）
１．１０μＬの１７０ｍＭの糖化バリン（Ｇ−バリン）（この値を、全てのバリンについて仮定し、作業手順においてＧ−バリンに変換した。）を、３００μＬのＲ１（８０ｍＭのＣＨＥＳ、３０ｍＭのＭＯＰＳ、０．９％のＢＲＩＪ）と混合した。この混合物を試料のストック溶液とした（ＧＶＲ１）。
【０１１８】
２．分光光度計の波長を７２６ｎｍ、温度を３７℃に設定した。１５０μＬのＲ２（３０ｍＭのＭＥＳ、１ｍＭのＣａＣｌ２、２ｍＭのＷＳＴ−３、１５７０Ｕ／ｍＬのプロテイナーゼＫ）をキュベットにピペッティングし、用量応答のために、それぞれ０μＬ、２．５μＬ、５μＬ、１０μＬ、１５μＬ、２０μＬの上記のＧＲＶ１を添加し、試料の容量をＲ１中のＨ２Ｏで２０μＬとし、５分間インキュベートし、最初のＯ．Ｄ．を読み取り、その後、３０μＬのＲ３（０．０８ｍＭのＤＡ−６４、２４０ｍＭのＴｒｉｓ、１８０Ｕ／ｍｌのＨＲＰ、２０Ｕ／ｍｌのＦＡＯＤ）を添加し、３分間インキュベートし、２回目のＯ．Ｄ．を読み取った。対照として２０μＬのＲ１中のＨ２Ｏを使用して、これらの２つの読み取り値の間のＯ．Ｄ．の差を計算した。図３および４は、フルクトシル−バリンを用いた用量依存性の反応を示す。
【０１１９】
（Ｂ．糖化ヘモグロビンの測定）
１．１０μＬの高レベル糖化ヘモグロビン（Ｇ−ｈｇ（ＨＨｇ））、１０μＬの中レベルＧ−ｈｇ（ＭＨｇ）、１０μｌの正常レベルＧ−ｈｇ（ＮＭＨｇ）をそれぞれ、３００μＬのＲ１と混合した。
【０１２０】
２．分光光度計の波長を５７０ｎｍ、温度を３７℃に設定した。１５０μＬのＲ２をキュベットにピペッティングし、２０μＬの上記のＲ１中のＨｇを試料として添加し、Ｒ１中のＨ２Ｏを対照として使用して、４分間のインキュベーションの後でＯ．Ｄ．を読み取った。このＯ．Ｄ．読み取り値から、相対的なＨｇ濃度を得た。
【０１２１】
３．分光光度計の波長を７２６ｎｍに変更し、最初のＯ．Ｄ．値を読み取り、３０μＬのＲ３を添加し、５分間インキュベートし、２回目のＯ．Ｄ．値を得た。これらの２つの読み取り値の間のＯ．Ｄ．の差を計算した。これらの試料についてのこれらのＯ．Ｄ．の差を、それらのＨｇ濃度を用いて較正した。図５は、プロテイナーゼで消化した患者のヘモグロビンを用いた用量依存性のシグナルを示す（５分間の消化）。
【０１２２】
上記の実施例は、説明の目的のためだけに含められるものであり、本発明の範囲を限定するものではない。上記の実施例に対する多数の変更形態が可能である。上記の実施例に対するそのような変更形態および変形形態は当業者に明らかであり、本発明が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることが意図される。
（配列表）
【数１】
【数２】
【数３】
【数４】
【数５】
【数６】
【数７】
【数８】
【数９】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
糖化タンパク質は、タンパク質を構成するアミノ酸のアミノ基の、アルドースのような還元糖のアルデヒド基との非酵素的な不可逆的結合によって生じる物質である。例えば、米国特許第６，１２７，１３８号を参照のこと。このような非酵素的な不可逆的結合反応は、「アマドリ転位」とも呼ばれ、したがって、上記の糖化タンパク質は、場合によっては「アマドリ化合物」とも呼ばれる。
【０００２】
タンパク質の非酵素的糖化は、特定の疾患、例えば、糖尿病性合併症および老化のプロセスの発症に関与している（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１９）：１２５０５−７（１９９７）；およびＢａｙｎｅｓ ａｎｄ Ｍｏｎｎｉｅｒ，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，３０４：１−４１０（１９８９））。この反応は、糖付加物および架橋の形成を通じて標的分子の機能不全を導く。インビトロおよびインビボでの非酵素的糖化の間の最も重要な「初期」修飾物であるアマドリ生成物に、相当な関心が集まっている。
【０００３】
糖化タンパク質についての種々のアッセイが知られている。例えば、米国特許第６，１２７，１３８号には、糖化タンパク質を含む試料をプロテアーゼＸＩＶまたはアスパラジラス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に由来するプロテアーゼで処理し、その後（または、上記のプロテアーゼで試料を処理しながら）、ＦＡＯＤ（フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ）反応によって消費された酸素の量、または得られる反応産物の量を測定するためにＦＡＯＤを試料と反応させ、それによって糖化タンパク質を測定することが開示されている。
【０００４】
別の例においては、米国特許第６，００８，００６号には、試料中の糖化タンパク質の量を、試料を、プロテアーゼとペルオキシダーゼの組み合わせである第１の試薬と、ケトアミンオキシダーゼを含む第２の試薬と反応させることによって定量できることが開示されている。米国特許第６，００８，００６号には、また、ペルオキシダーゼ／プロテアーゼ混合酵素試薬とケトアミンオキシダーゼを含むキットも、開示されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
１つの態様においては、本発明は、単離されたキメラタンパク質に関する。キメラタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ａ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｂ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片が含まれる。
【０００６】
別の態様においては、本発明は、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸に関する。キメラタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ａ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｂ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片が含まれる。この核酸を含む組み換え細胞、およびこの核酸を使用してキメラタンパク質を生産するための方法もまた提供される。
【０００７】
さらに別の態様においては、本発明は、試料中の糖化タンパク質をアッセイするための方法に関する。この方法には、ａ）アッセイされる試料をプロテアーゼと接触させて、糖化タンパク質（これが上記の試料中に含まれている場合）から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生じさせること；ｂ）上記の生じた糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ｉ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｉｉ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片を含むキメラタンパク質と接触させて、上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化させること；ならびに、ｃ）上記のキメラタンパク質による上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、上記試料中に上記の糖化タンパク質が存在すること、および／またはその量を決定することが含まれる。
【０００８】
さらに別の態様においては、本発明は、試料中の糖化タンパク質をアッセイするためのキットに関する。このキットには、ａ）糖化タンパク質（これが試料中に含まれている場合）から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生じさせるためのプロテアーゼ；ｂ）上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化させるための上記のキメラタンパク質；ならびに、ｃ）上記のキメラタンパク質による上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、上記試料中に上記糖化タンパク質が存在すること、および／またはその量を決定するための手段が含まれる。
【０００９】
さらに別の態様においては、本発明は、試料中の糖化タンパク質をアッセイするための方法に関する。この方法には、ａ）アッセイされる試料をプロテイナーゼＫと接触させて、糖化タンパク質（これが試料中に含まれている場合）から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生じさせること；ｂ）上記の生じた糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸をアマドリアーゼと接触させて、上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化させること；ならびに、ｃ）上記のアマドリアーゼによる上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、上記試料中に糖化タンパク質が存在すること、および／またはその量を決定することが含まれる。
【００１０】
さらに別の態様においては、本発明は、試料中の糖化タンパク質をアッセイするためのキットに関する。このキットには、ａ）糖化タンパク質（これが試料中に含まれている場合）から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生じさせるためのプロテイナーゼＫ；ｂ）上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化させるためのアマドリアーゼ；ならびに、ｃ）上記のアマドリアーゼによる上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、上記試料中に上記糖化タンパク質が存在すること、および／またはその量を決定するための手段が含まれる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
単離されたキメラタンパク質であって、該キメラタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって：
ａ）約５個から約３０個のアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む、第１のペプチジル断片；および
ｂ）アマドリアーゼを含む、第２のペプチジル断片
を含む、単離されたキメラタンパク質。
（項目２）
前記細菌のリーダー配列が、大腸菌タンパク質のリーダー配列である、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目３）
前記リーダー配列が、配列番号１（ＭＧＧＳＧＤＤＤＤＬＡＬ）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の同一性を有し、該パーセント同一性が、該配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して同じ大きさのアミノ酸配列の全体に関して決定される、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目４）
前記リーダー配列が、配列番号１に示されるアミノ酸配列に特異的に結合する抗体に結合する、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目５）
前記リーダー配列が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目６）
前記第１のペプチジル断片が、約２０個のアミノ酸残基を含む、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目７）
前記アマドリアーゼが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．起源である、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目８）
前記アマドリアーゼが補因子としてＦＡＤを使用する、項目７に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目９）
前記アマドリアーゼが、ＦＡＤ補因子結合コンセンサス配列Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｘ−Ｇｌｙ（配列番号２）を有し、Ｘは任意のアミノ酸残基である、項目８に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目１０）
前記アマドリアーゼが、アマドリアーゼＩａ、アマドリアーゼＩｂ、アマドリアーゼＩｃ、およびアマドリアーゼＩＩからなる群より選択される、項目７に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目１１）
前記アマドリアーゼが、配列番号３：
【化１】
に示されるアミノ酸に対して少なくとも４０％の同一性を有し、該パーセント同一性は、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して同じ大きさのアミノ酸配列の全体に関して決定される、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目１２）
前記アマドリアーゼが、配列番号３に示されるアミノ酸配列に特異的に結合する抗体に結合する、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目１３）
前記アマドリアーゼが、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目１４）
前記第１のペプチジル断片と第２のペプチジル断片とが、切断可能な連結によって連結されている、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目１５）
さらに、そのＣ末端に、約５個から約３０個のアミノ酸残基の第２の細菌のリーダー配列を含む第３のペプチジル断片を含む、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目１６）
前記第２のリーダー配列が、大腸菌タンパク質のリーダー配列である、項目１５に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目１７）
前記第２の細菌のリーダー配列が、配列番号４（ＫＧＥＬＥＧＬＰＩＰＮＰＬＬＲＴＧ）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の同一性を有し、該パーセント同一性は、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して同じ大きさのアミノ酸配列の全体に関して決定される、項目１５に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目１８）
前記第２の細菌のリーダー配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列に特異的に結合する抗体に結合する、項目１５に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目１９）
前記第２の細菌のリーダー配列が、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、項目１５に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目２０）
前記第３のペプチジル断片が、約２０個のアミノ酸残基を含む、項目１５に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目２１）
さらに、そのＣ末端に、ペプチドタグを含む第３のペプチジル断片を含む、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目２２）
前記ペプチドタグが、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ＨＡ１タグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、６−Ｈｉｓタグ、ＡＵ１タグ、ＥＥタグ、Ｔ７タグ、４Ａ６タグ、εタグ、Ｂタグ、ｇＥタグおよびＴｙ１タグからなる群より選択される、項目２１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目２３）
さらに、そのＣ末端に、ペプチドタグを含む第４のペプチジル断片を含む、項目１５に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目２４）
前記ペプチドタグが、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ＨＡ１タグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、６−Ｈｉｓタグ、ＡＵ１タグ、ＥＥタグ、Ｔ７タグ、４Ａ６タグ、εタグ、Ｂタグ、ｇＥタグおよびＴｙ１タグからなる群より選択される、項目２３に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目２５）
単離されたキメラタンパク質であって、配列番号５：
【化２】
に示されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の単離されたキメラタンパク質。
（項目２６）
項目１に記載のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
（項目２７）
項目２５に記載のキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
（項目２８）
項目２６に記載の核酸であって、配列番号６：
【化３−１】
【化３−２】
に示されるヌクレオチド配列を含む、核酸。
（項目２９）
項目２６に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
（項目３０）
項目２６に記載の核酸を含む、組み換え細胞。
（項目３１）
キメラタンパク質を生成する方法であって、項目２６に記載の核酸を含む組み換え細胞を増殖させて、前記コードされたキメラタンパク質を該細胞によって発現させる工程、および発現されたキメラタンパク質を回収する工程を含む、方法。
（項目３２）
項目３１に記載の方法の生成物。
（項目３３）
試料中の糖化タンパク質に関してアッセイするための方法であって：
ａ）アッセイされるべき試料をプロテアーゼと接触させて、糖化タンパク質が該試料中に含まれている場合、該糖化タンパク質から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生成する工程；
ｂ）該生成した糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を、項目１に記載のキメラタンパク質と接触させて、該糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化させる工程；ならびに、
ｃ）該キメラタンパク質による該糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、該試料中における該糖化タンパク質の存在および／または量を決定する工程、
を含む、方法。
（項目３４）
前記試料が血液試料である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記血液試料が、血漿試料、血清試料、赤血球試料または全血試料である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記アッセイされるべき糖化タンパク質が、グリコアルブミンまたはグリコヘモグロビンである、項目３３に記載の方法。
（項目３７）
前記プロテアーゼが、エンド型プロテアーゼまたはエキソ型プロテアーゼである、項目３３に記載の方法。
（項目３８）
前記エンド型プロテアーゼが、トリプシン、α−キモトリプシン、スブチリシン、プロテイナーゼＫ、パパイン、カテプシンＢ、ペプシン、サーモリシン、プロテアーゼＸＶＩＩ、プロテアーゼＸＸＩ、リシル−エンドペプチダーゼ、プロレターおよびブロメラインＦからなる群より選択される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記エキソ型プロテアーゼがアミノペプチダーゼまたはカルボキシペプチダーゼである、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記プロテアーゼが、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ、アナニン、サーモリシン、スブチリシン、およびウシ膵臓プロテアーゼからなる群より選択される、項目３３に記載の方法。
（項目４１）
前記プロテアーゼが、約２個から約３０個のアミノ酸残基の糖化ペプチドを生成する、項目３３に記載の方法。
（項目４２）
前記プロテアーゼが、糖化グリシン残基、糖化バリン残基、または糖化リジン残基、あるいは糖化グリシン残基、糖化バリン残基もしくは糖化リジン残基を含む糖化ペプチドを生成する、項目３３に記載の方法。
（項目４３）
前記キメラタンパク質が、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む、項目３３に記載の方法。
（項目４４）
前記キメラタンパク質が配列番号６に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、項目３３に記載の方法。
（項目４５）
前記糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化が、酸化反応における糖化ペプチドもしくは糖化アミノ酸、Ｈ２Ｏ、またはＯ２の消費、あるいは酸化反応における酸化されたグルコース（グルコソン）、Ｈ２Ｏ２、またはアミノ酸の形成を評価することによって評価される、項目３３に記載の方法。
（項目４６）
前記Ｏ２の消費が酸素電極によって評価される、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記Ｈ２Ｏ２の形成がペルオキシダーゼによって評価される、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼである、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記Ｈ２Ｏ２の形成が、ペルオキシダーゼとトリンダー反応とによって評価される、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
前記糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸が、キメラタンパク質およびペルオキシダーゼと、順次または同時に接触させられる、項目４７に記載の方法。
（項目５１）
前記グルコソンの形成が、グルコースオキシダーゼによって評価される、項目４５に記載の方法。
（項目５２）
前記グルコソンンの形成が、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼとヘキソキナーゼとの組み合わせによって評価される、項目４５に記載の方法。
（項目５３）
前記プロテアーゼが、前記糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸と前記キメラタンパク質との間での接触の前、または該接触と同時に不活化される、項目３３に記載の方法。
（項目５４）
前記プロテアーゼが熱処理または該プロテアーゼの阻害因子によって不活化される、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
アスコルビン酸塩による妨害が、銅（ＩＩ）化合物、コール酸もしくはジスルホン酸バソフェナントロリン、またはそれらの混合物を使用して計測される、項目３３に記載の方法。
（項目５６）
ビリルビンによる妨害が、フェロシアン化物塩を使用して計測される、項目３３に記載の方法。
（項目５７）
疾患または障害の予後診断または診断に使用される、項目３３に記載の方法。
（項目５８）
前記疾患または障害が糖尿病である、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
試料中の糖化タンパク質に関してアッセイするためのキットであって、該キットは、以下：
ａ）糖化タンパク質が試料中に含まれている場合に該糖化タンパク質から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生成するための、プロテアーゼ；
ｂ）該糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化するための、項目１に記載のキメラタンパク質；ならびに、
ｃ）該キメラタンパク質による該糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、該試料中における該糖化タンパク質の存在および／または量を決定するための手段
を含む、キット。
（項目６０）
前記キメラタンパク質による前記糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価するための手段が、ペルオキシダーゼを含む、項目５９に記載のキット。
（項目６１）
前記キメラタンパク質とペルオキシダーゼとが単一の組成物中に処方されている、項目６０に記載のキット。
（項目６２）
試料中の糖化タンパク質に関してアッセイするための方法であって、該方法は、以下：
ａ）アッセイされるべき試料をプロテイナーゼＫと接触させて、糖化タンパク質が該試料中に含まれている場合、該糖化タンパク質から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生成する工程；
ｂ）該生成された糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を、アマドリアーゼと接触させて、該糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化させる工程；ならびに、
ｃ）該アマドリアーゼによる該糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、該試料中における該糖化タンパク質の存在および／または量を決定する工程
を含む、方法。
（項目６３）
前記試料が血液試料である、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記血液試料が、血漿試料、血清試料、赤血球試料、または全血試料である、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記アッセイされるべき糖化タンパク質が、グリコアルブミンまたはグリコヘモグロビンである、項目６２に記載の方法。
（項目６６）
前記アマドリアーゼがキメラタンパク質を含み、前記キメラタンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に向かって：
ａ）約５個から約３０個のアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む、第１のペプチジル断片；および
ｂ）アマドリアーゼを含む、第２のペプチジル断片
を含む、項目６２に記載の方法。
（項目６７）
前記キメラタンパク質が、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記キメラタンパク質が、配列番号６に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、項目６６に記載の方法。
（項目６９）
前記糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化が、酸化反応における該糖化ペプチドもしくは糖化アミノ酸、Ｈ２Ｏ、またはＯ２の消費、あるいは酸化反応における酸化されたグルコース（グルコソン）、Ｈ２Ｏ２、またはアミノ酸の形成を評価することによって評価される、項目６２に記載の方法。
（項目７０）
前記Ｏ２の消費が酸素電極によって評価される、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記Ｈ２Ｏ２の形成がペルオキシダーゼによって評価される、項目６９に記載の方法。
（項目７２）
前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼである、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記Ｈ２Ｏ２の形成がペルオキシダーゼとトリンダー反応とによって評価される、項目７１に記載の方法。
（項目７４）
前記糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸が、前記アマドリアーゼおよびペルオキシダーゼと、順次または同時に接触させられる、項目７１に記載の方法。
（項目７５）
前記グルコソンの形成が、グルコースオキシダーゼによって評価される、項目６９に記載の方法。
（項目７６）
前記グルコソンンの形成が、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼとヘキソキナーゼとの組み合わせによって評価される、項目６９に記載の方法。
（項目７７）
前記プロテイナーゼＫが、前記糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸と前記アマドリアーゼとの間での接触の前、または該接触と同時に不活化される、項目６２に記載の方法。
（項目７８）
前記プロテイナーゼＫが熱処理または該プロテイナーゼＫの阻害因子によって不活化される、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
アスコルビン酸塩による妨害が、銅（ＩＩ）化合物、コール酸もしくはジスルホン酸バソフェナントロリン、またはそれらの混合物を使用して計測される、項目６２に記載の方法。
（項目８０）
ビリルビンによる妨害が、フェロシアン化物塩を使用して計測される、項目６２に記載の方法。
（項目８１）
疾患または障害の予後診断または診断に使用される、項目６２に記載の方法。
（項目８２）
前記疾患または障害が糖尿病である、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
試料中の糖化タンパク質に関してアッセイするためのキットであって、該キットは、以下：
ａ）糖化タンパク質が該試料中に含まれている場合に該糖化タンパク質から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生成するための、プロテイナーゼＫ；
ｂ）該糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化させるための、アマドリアーゼ；ならびに、
ｃ）該アマドリアーゼによる該糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、該試料中における該糖化タンパク質の存在および／または量を決定するための手段
を含む、キット。
（項目８４）
前記アマドリアーゼによる前記糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価するための手段が、ペルオキシダーゼを含む、項目８３に記載のキット。
（項目８５）
前記アマドリアーゼとペルオキシダーゼとが単一の組成物中に処方されている、項目８４に記載のキット。
（項目８６）
前記アマドリアーゼがキメラタンパク質を含み、該キメラタンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に向かって：
ａ）約５個から約３０個のアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む、第１のペプチジル断片；および
ｂ）アマドリアーゼを含む、第２のペプチジル断片
を含む、項目８３に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、例示的なＧＳＰキット、およびＲａｎｄｏｘのフルクトサミン（Ｆｒｕｃｔｏｓａｍｉｎｅ）キットの比較を示す。
【図２】図２は、試料中の糖化タンパク質をアッセイするための例示的な方法のアッセイについての線形性を示す。
【図３】図３は、フルクトシル−バリンを用いた用量依存性の反応を示す。
【図４】図４は、フルクトシル−バリンを用いた用量依存性の反応を示す。
【図５】図５は、プロテイナーゼで消化（５分間の消化）した患者のヘモグロビンを用いた用量依存性のシグナルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
開示を明確にするために、限定ではないが、本発明の詳細な説明を、以下のセクションに提供する。
【００１３】
（Ａ．定義）
別段の定義のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書中で言及される全ての特許、特許出願、公開出願、および他の刊行物は、それらの全体が参照によって組み入れられる。このセクションに示される定義が、参照により本明細書中に組み入れられる特許、特許出願、公開出願、および他の刊行物の中に示される定義と正反対であるか、または別の方法で矛盾する場合には、このセクションに示される定義が、参照によって本明細書中に組み入れられる定義に対して優位であるとする。
【００１４】
本明細書中で使用される場合は、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。
【００１５】
本明細書中で使用される場合は、「リーダー配列」は、標的ペプチドまたはタンパク質に融合させられた場合に、標的ペプチドまたはタンパク質の安定性および／または発現レベルを増大させるペプチド配列をいう。通常は、リーダー配列は、標的ペプチドまたはタンパク質の安定性および／または発現レベルを、少なくとも５０％増大させる。好ましくは、リーダー配列は、標的ペプチドまたはタンパク質の安定性および／または発現レベルを、少なくとも１倍、２倍、５倍、１０倍、または１０倍以上増大させる。原核生物中でのアミノ酸の合成に関与している酵素の遺伝子発現の調節においては、リーダー配列は、調節されるアミノ酸のいくつかの残基を含むリーダーペプチドをコードする。転写は翻訳と密接に関係しており、翻訳が特異的アミノ酸についてのアミノアシルｔＲＮＡの供給が限られていることによって遅れる場合は、リーダー配列の転写の様式により、オペロン遺伝子の完全な転写が可能となる。あるいは、リーダー配列の完全な転写により、調節される遺伝子の転写が早くに終結してしまう。
【００１６】
本明細書中で使用される場合は、「糖化タンパク質」は、タンパク質を構成するアミノ酸のアミノ基のアルドースのような還元糖のアルデヒド基との非酵素的な不可逆的結合によって生じる物質をいう。例えば、米国特許第６，１２７，１３８号を参照のこと。このような、非酵素的な不可逆的結合反応はまた、「アマドリ転位」とも呼ばれ、したがって、上記の糖化タンパク質は、場合によっては「アマドリ化合物」とも呼ばれる。
【００１７】
本明細書中で使用される場合は、「アマドリアーゼ」は、以下の反応に示されるように、対応するアミノ酸、グルコソンと、Ｈ２Ｏ２を生じる、アマドリ生成物の酸化的脱糖化を触媒する酵素をいう。
【００１８】
【化４】
式中、Ｒ１は、還元糖のアルドース残基を示し、Ｒ２はアミノ酸、タンパク質、またはペプチドの残基を示す。アマドリアーゼの他の異名としては、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）およびフルクトシルアミン：酸素オキシドレダクターゼ（ＦＡＯＯ）が挙げられる。本明細書中の目的については、名称「アマドリアーゼ」が本明細書中で使用されるが、全てのこのような化学的な異名も意図される。「アマドリアーゼ」にはまた、対応するアミノ酸、グルコソンと、Ｈ２Ｏ２を生じる、アマドリ生成物の酸化的脱糖化を触媒するその酵素活性をなおも実質的に保持している、機能性断片または誘導体も含まれる。通常は、機能性断片または誘導体は、そのアマドリアーゼの活性の少なくとも５０％を保持している。好ましくは、機能性断片または誘導体は、そのアマドリアーゼの活性の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％を保持している。アマドリアーゼには、その活性を実質的に変化させることのない保存的アミノ酸置換が含まれていてもよい。アミノ酸の適切な保存的置換は当業者に公知であり、通常は、得られる分子の生物学的活性を変化させることなく作成され得る。一般的には、ポリペプチドの必須ではない領域の１つのアミノ酸の置換によっては、生物学的活性は実質的には変化しないと、当業者に理解されている（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ Ｂｅｊａｃｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４を参照のこと）。このような例示的な置換は、好ましくは、以下の表１に示される置換にしたがって作成される。
【００１９】
（表１）
【００２０】
【表１】
他の置換もまた許容され、経験的に、または公知の保存的置換にしたがって決定することができる。
【００２１】
本明細書中で使用される場合は、「グリコヘモグロビン」は、血液中のヘモグロビンの糖化によって生じるフルクトシルアミン誘導体をいう。
【００２２】
本明細書中で使用される場合は、「グリコアルブミン」は、血液中のアルブミンの糖化によって生じるフルクトシルアミン誘導体をいう。
【００２３】
本明細書中で使用される場合は、「フルクトサミン」は、血液中のタンパク質の糖化によって生じる誘導体（還元能力を有しているもの）をいう。
【００２４】
本明細書中で使用される場合は、「組成物」は、２つ以上の生成物または化合物の任意の混合物をいう。これは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性のもの、非水性のもの、あるいは、それらの任意の組み合わせであり得る。
【００２５】
本明細書中で使用される場合は、「組み合わせ」は、２つ以上の要素の任意のつながりをいう。
【００２６】
本明細書中で使用される場合は、「血漿」は、凝固後に得られる血清とは区別される、血液の流動性の細胞構造のない部分をいう。
【００２７】
本明細書中で使用される場合は、「血清」は、循環している血液中の血漿とは区別される、フィブリン塊および血球の除去後に得られる血液の流動性の部分をいう。
【００２８】
本明細書中で使用される場合は、「流動体」は、流れることができる任意の組成物をいう。したがって、流動体には、半固体、ペースト、水溶液、水性の混合物、ゲル、ローション、クリームの形態である組成物、および他のそのような組成物が含まれる。
【００２９】
本明細書中で使用される場合は、「ペルオキシダーゼ」は、過酸化水素が特異的酸化剤であり、広範囲の基質が電子供与体の役割を果たす反応のホストを触媒する酵素をいう。その活性を実質的に変化させることのない保存的アミノ酸置換を有しているペプチドが含まれることが意図される。最重要な市販されているペルオキシダーゼは、西洋ワサビペルオキシダーゼである。
【００３０】
本明細書中で使用される場合は、「グルコースオキシダーゼ」は、グルコースとＨ２ＯとＯ２からのグルコン酸とＨ２Ｏ２の形成を触媒する酵素をいう。その活性を実質的に変化させることのない保存的アミノ酸置換を有しているグルコースオキシダーゼが含まれることが意図される。
【００３１】
本明細書中で使用される場合は、「ヘキソキナーゼ」は、解糖系によるグルコースの代謝の最初の反応である、グルコース−６−リン酸を形成させるためのＡＴＰからグルコースへのリン酸基の移動を触媒する酵素をいう。その活性を実質的に変化させることのない保存的アミノ酸置換を有しているヘキソキナーゼが含まれることが意図される。
【００３２】
本明細書中で使用される場合は、任意の保護基、アミノ酸、および他の化合物についての略号は、別段の定義のない限り、それらの一般的な使用法、認められている省略、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅに従う（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１：１７２６（１９７２）を参照のこと）。
【００３３】
（Ｂ．アマドリアーゼを含むキメラタンパク質およびそれをコードする核酸）
１つの態様においては、本発明は、単離されたキメラタンパク質に関する。キメラタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ａ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｂ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片が含まれる。
【００３４】
任意の適切な細菌のリーダー配列を使用することができる。米国特許第６，１９４，２００号に開示されているように、別の遺伝子に由来するリーダー配列を伴う融合タンパク質としての目的のポリペプチドの発現には、安定性が提供されることに加えていくつかの利点がある。例えば、Ｎ末端アミノ酸の存在により、任意の種々のポリペプチドの精製のための一般的な精製技術を使用するための手段が提供される。例えば、Ｎタンパク質のＮ末端アミノ酸は抗原性であると予想され、したがって、Ｎタンパク質のＮ末端アミノ酸に対して惹起させられた特異的抗体を、Ｎタンパク質のＮ末端を含む融合タンパク質のアミノ精製に使用することができる。さらに、Ｎタンパク質のＮ末端は高い正電荷を有しており、これにより、イオン交換クロマトグラフィーによって所望のタンパク質の精製が容易であること、などがある。
【００３５】
リーダー配列には、また、分泌のためのシグナル配列としての役割を果たすことができる疎水性アミノ酸配列を含めることができる。米国特許第６，１９４，２００号を参照のこと。シグナル配列をコードするＤＮＡ配列は、目的の遺伝子の上流に、そのリーディングフレーム内に連結される。通常は、シグナル配列には、シグナル配列ペプチダーゼによって認識される切断部位が含まれる。したがって、シグナル配列切断部位のすぐ後ろに目的のポリペプチドを配置させることにより、目的のポリペプチドをシグナル配列から特異的に切断し、成熟ポリペプチドとして分泌させることができる。疎水性アミノ酸配列の例として、細菌のアルカリホスファターゼのシグナル配列；ＯＭＰ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＦシグナル配列；ＬＰＰシグナル配列、β−ラクタマーゼシグナル配列；および毒素シグナル配列が挙げられる。
【００３６】
使用することができる他のリーダー配列としては、親水性配列、例えば、アンフィレグリンに由来するＮ末端の４１個のアミノ酸残基が挙げられる。これは、目的のポリペプチドの機能の変更のために提供することができる。米国特許第６，１９４，２００号を参照のこと。さらに、トキシンＡ鎖断片、リシンＡ鎖、ヘビ毒成長停止ペプチドのような細胞傷害因子、またはホルモンもしくは抗体のような標的化分子を、ほとんどの場合には目的の遺伝子産物の生物学的活性に対して最少の影響となるように、リーダー配列と共有結合させることができる。他のリーダー配列を用いる場合は、リーダー配列をコードするＤＮＡ配列は、目的の遺伝子の上流に、そのリーディングフレーム内に連結される。
【００３７】
リーダー配列がシグナル配列ではなく、好都合な自然界に存在している切断部位を含まない場合は、さらなるアミノ酸を、目的の遺伝子とリーダー配列との間に挿入して、リーダーペプチドの切断のため、その後の融合タンパク質の精製、その後の成熟ポリペプチドの精製を可能にするための酵素的または化学的切断部位を提供することができる。米国特許第６，１９４，２００号を参照のこと。例えば、融合タンパク質の２つのセグメントの間に酸に不安定なアスパルチル−プロリン結合を導入することによって、低いｐＨでそれらを分離することが容易にできる。この方法は、所望されるポリペプチドが酸に不安定である場合には適切ではない。融合タンパク質は、例えば、メチオニン残基のカルボキシ側に特異的である臭化シアンで切断することができる。リーダー配列と所望されるポリペプチドとの間にメチオニンを配置することにより、所望されるポリペプチドの放出が可能になる。この方法は、所望されるポリペプチドがメチオニン残基を含む場合には適切ではない。
【００３８】
以下の特許、特許出願、および参考文献に開示されている他の細菌のリーダー配列もまた、使用することができる：ＷＯ００／２８０４１およびＷＯ８９／０３８８６；米国特許第５９１４２５０号、同第５８８５８１１号、同第５１７１６７０号、同第５０３０５６３号、同第４９４８７２９号、および同第４５８８６８４号；欧州特許第ＥＰ０，１９６，８６４号、同第ＥＰ０，１８６，６４３号、およびＥＰ０，１２１，３５２；Ｍｉｃｈｉｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９（４）：１６４−８（２００１）；Ｈｏｂｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．，８４：２５５−６２（１９９５）；Ｈａｒｄｙ ａｎｄ Ｒａｎｄａｌｌ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．Ｓｕｐｐｌ．，１１：２９−４３（１９８９）；Ｓａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２（３）：１９９−２０８（１９８８）；およびＰｅａｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０（２２）；６１１１−２（１９９２）。好ましくは、細菌のリーダー配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のタンパク質のリーダー配列であり、例えば、Ｒｏｅｓｓｅｒ ａｎｄ Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９（４）：７９５−８００（１９９１）；およびＫｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６７（３）：２３５−４１（１９７９）に開示されている大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のリーダー配列である。
【００３９】
１つの例においては、リーダー配列は、配列番号１（ＭＧＧＳＧＤＤＤＤＬＡＬ）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の同一性を有する。ここでは、パーセント同一性は、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、同じ大きさのアミノ酸配列全体に関して決定される。好ましくは、リーダー配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する。ここでは、パーセント同一性は、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、同じ大きさのアミノ酸配列全体に関して決定される。また、好ましくは、リーダー配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列に特異的に結合する抗体に結合する。さらに好ましくは、リーダー配列には、配列番号１に示されるアミノ酸配列が含まれる。
【００４０】
第１のペプチジル断片は、任意の適切な長さを有することができる。例えば、第１のペプチジル断片には、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６，２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸残基が含まれる。好ましくは、第１のペプチジル断片には、約２０個のアミノ酸残基が含まれる。
【００４１】
任意の適切なアマドリアーゼを使用することができる。１つの例においては、アマドリアーゼは、アスパラジラス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）が起源のものである（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（６）：３４３７−４３（１９９７）を参照のこと）。別の例においては、アマドリアーゼは、補因子としてＦＡＤを使用する。好ましくは、アマドリアーゼは、ＦＡＤ補因子結合コンセンサス配列Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｘ−Ｇｌｙ（配列番号２）を有する。Ｘは任意のアミノ酸残基である。さらに別の例においては、アマドリアーゼは、アマドリアーゼＩａ、アマドリアーゼＩｂ、アマドリアーゼＩｃ、またはアマドリアーゼＩＩである（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（６）：３４３７−４３（１９９７）を参照のこと）。アマドリアーゼＩａ、アマドリアーゼＩｂ、アマドリアーゼＩｃ、およびアマドリアーゼＩＩのＮ末端配列の間でのアミノ酸配列の相同性を、以下の表２に示す。これらのデータは、組み合わせたＧｅｎＢａｎｋ（商標）ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ／ＰＤＢ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＳＰｕｐｄａｔｅ／ＰＩＲデータベースを使用したコンピュータによる検索によって得た（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（６）：３４３７−４３（１９９７）の表ＩＶを参照のこと）。番号はそれぞれの配列中のアミノ酸位置を示す。保存的置換を（＋）で示す。アマドリアーゼのデータは、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（６）：３４３７−４３（１９９７）で得られたＮ末端配列に対応させた。
【００４２】
（表２ アマドリアーゼＩａ、アマドリアーゼＩｂ、アマドリアーゼＩｃ、およびアマドリアーゼＩＩのＮ末端配列の間でのアミノ酸配列の相同性）
【００４３】
【表２】
他のアマドリアーゼ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ８２８３０（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１９）：１２５０５−１２５０７（１９９７）に開示されているアマドリアーゼ、および米国特許第６，１２７，１３８号に開示されているアマドリアーゼもまた使用することができる。対応するアミノ酸、グルコソンと、Ｈ２Ｏ２を生じる、アマドリ生成物の酸化的脱糖化を触媒するその酵素活性をなおも実質的に保持しているアマドリアーゼの機能性断片または誘導体もまた、使用することができる。
【００４４】
通常は、アマドリアーゼの機能性断片または誘導体は、その酵素活性の少なくとも５０％を保持している。好ましくは、アマドリアーゼの機能性断片または誘導体は、その酵素活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％を保持している。
【００４５】
アマドリアーゼの酵素活性についてのアッセイは当該技術分野で公知である（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（６）：３４３７−４３（１９９７）、および米国特許第６，１２７，１３８号を参照のこと）。アマドリアーゼの酵素活性についての４個の例示的なアッセイが、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（６）：３４３７−４３（１９９７）に開示されている。
【００４６】
（グルコソンの形成）
このアッセイにおいては、酵素活性は、基質としてフルクトシルプロピルアミンを使用するＯＰＤでの比色反応によって測定される、グルコソンの放出によってモニターされる。このアッセイは、１２０分の反応時間の後での、形成されたグルコソンの終点測定をベースとする。反応混合物には、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＯＰＤ、１０ｍＭのフルクトシルプロピルアミン、および酵素タンパク質が、１ｍＬの最終容量の中に含められる。３７℃で２時間のインキュベーションのあと、３２０ｎｍでの吸光度が測定される。反応は、これらの条件下では用量依存性の様式で２４０分まで線形である。１単位の酵素活性は、１μｍｏｌのグルコソン／分を生じる酵素の量と定義される。合成されたグルコソンが標準物として使用される。
【００４７】
（遊離アミンアッセイ）
遊離アミンの放出をアッセイするために、蛍光がフルオレサミンとの反応の後に測定される。２５μｌの純粋な酵素もしくは酵素を多く含む画分の溶液、１５μｌの２０％のフルクトシルプロピルアミン水溶液、および２５０μｌのＰＢＳが、３７℃で記載される種々の時間の間インキュベートされる。反応は、４℃でＭｉｃｒｏｃｏｎ−１０（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を通して濾過することによって停止させる。１μｌの純物質または１：１０希釈した濾過物が、１．５ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に添加される。激しくボルテックスされた状態で、０．５ｍｌの０．０３％フルオレサミンのジオキサン溶液が迅速に添加される。５分後、蛍光が測定される（λｅｘ＝３９０ｎｍ、λｅｍ＝４７５ｎｍ）。標準物のプロットは、６〜１５０ｎｇのプロピルアミンを用いて作成される。
【００４８】
（Ｈ２Ｏ２アッセイ）
過酸化水素は、Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９：４８７−４９１（１９９５）にしたがってキノン色素アッセイによって定量される。反応混合物には、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭの４−アミノアンチピリン、２．０ｍＭのフェノール、２．０単位のペルオキシダーゼ、１０ｍＭのフルクトシルプロピルアミン、および酵素タンパク質が、１ｍｌの全容量の中に含まれる。Ｈ２Ｏ２の生産は、５０５ｎｍ（ε＝５．１３×１０３）での吸光度にしたがうキノン色素の形成によってモニターされる。０．５μｍｏｌのキノン色素の生産は、１．０μｍｏｌのＨ２Ｏ２の形成に対応する。
【００４９】
（酸素消費）
酸素消費は、Ｇｅｒｈａｒｄｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２１８−２２４（１９９５）に記載されているようなＣｌａｒｋｅ型酸素電極が取り付けられているＹＳＩ−Ｂｅｃｋｍａｎ ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ ＩＩを用いて決定される。簡単に言うと、酵素（５０μｌ）が、７５０μｌのＰＢＳと６５０μｌの水を含むチャンバーに添加される。反応は、５０μｌの３００ｍＭのフルクトシルプロピルアミン（最終濃度１０ｍＭ）の添加によって開始される。
【００５０】
別の例においては、アマドリアーゼは、配列番号３：
【００５１】
【化５】
に示されるアミノ酸に対して少なくとも４０％の同一性を有する。ここでは、パーセント同一性は、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して、同じ大きさのアミノ酸配列全体に関して決定される。好ましくは、アマドリアーゼは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する。ここでは、パーセント同一性は、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して、同じ大きさのアミノ酸配列全体に関して決定される。また、好ましくは、アマドリアーゼは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に特異的に結合する抗体に結合する。また、好ましくは、アマドリアーゼには、配列番号３に示されるアミノ酸配列が含まれる。
【００５２】
第１のペプチジル断片および第２のペプチジル断片は、任意の適切な連結によって連結させることができる。例えば、第１のペプチジル断片と第２のペプチジル断片を、切断することができる連結によって連結させることができる。
【００５３】
単離されたキメラタンパク質には、さらに、そのＣ末端に、約５個から約３０個までのアミノ酸残基の第２の細菌のリーダー配列を含む第３のペプチジル断片を含めることもできる。上記に記載したものを含む任意の適切な細菌のリーダー配列を使用することができる。
【００５４】
１つの例においては、第２の細菌のリーダー配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質のリーダー配列である。別の例においては、第２の細菌のリーダー配列は、配列番号４（ＫＧＥＬＥＧＬＰＩＰＮＰＬＬＲＴＧ）に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の同一性を有する。ここでは、パーセント同一性は、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、同じ大きさのアミノ酸配列全体に関して決定される。好ましくは、第２の細菌のリーダー配列は、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有する。ここでは、パーセント同一性は、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、同じ大きさのアミノ酸配列全体に関して決定される。また、好ましくは、第２の細菌のリーダー配列は、配列番号４に示されるアミノ酸配列に特異的に結合する抗体に結合する。また、好ましくは、第２の細菌のリーダー配列には、配列番号４に示されるアミノ酸配列が含まれる。
【００５５】
第３のペプチジル断片は、適切な長さを有することができる。例えば、第３のペプチジル断片には、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６，２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸残基が含まれる。好ましくは、第３のペプチジル断片には、約２０個のアミノ酸残基が含まれる。
【００５６】
単離されたキメラタンパク質には、さらに、そのＣ末端に、ペプチドタグを含む第３のペプチジル断片を含めることができる。任意の適切なタグを使用することができる。例えば、タグは、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＨＡ１、ｃ−Ｍｙｃ、６−Ｈｉｓ、ＡＵ１、ＥＥ、Ｔ７、４Ａ６、ε、Ｂ、ｇＥ、およびＴｙ１タグであり得る（表３を参照のこと）。
【００５７】
（表３ 例示的なエピトープタグシステム）
【００５８】
【表３】
【００５９】
【化６】
１つの例においては、単離されたキメラタンパク質には、配列番号５：
【００６０】
【化７】
に示されるアミノ酸配列が含まれる。
【００６１】
別の態様においては、本発明は、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸に関する。キメラタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ａ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｂ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片が含まれる。
【００６２】
１つの例においては、単離された核酸には、配列５に示されるアミノ酸配列を含むキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列が含まれる。別の例においては、単離された核酸には、配列番号６：
【００６３】
【化８−１】
【００６４】
【化８−２】
に示されるヌクレオチド配列が含まれる。
【００６５】
さらに別の例においては、単離された核酸には、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列が含まれる。キメラタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ａ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｂ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片が含まれる。
【００６６】
キメラタンパク質をコードする核酸、またはその相補鎖を含む組み換え細胞が意図される。キメラタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ａ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｂ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片が含まれる。
【００６７】
キメラタンパク質の生産方法もまた、意図される。この方法には、コードされるキメラタンパク質が細胞によって発現されるように、キメラタンパク質（キメラタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ａ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｂ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片が含まれる）をコードする核酸を含む組み換え細胞を増殖させること、および発現されたキメラタンパク質を回収することが含まれる。この方法による生成物が、さらに意図される。
【００６８】
キメラタンパク質またはキメラタンパク質をコードする核酸は、任意の適切な方法、例えば、化学合成、組み換え生産、またはそれらの併用によって調製することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０００）、およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照のこと）。
【００６９】
（Ｃ．キメラタンパク質を使用して糖化タンパク質をアッセイするための方法およびキット）
さらに別の態様においては、本発明は、試料中の糖化タンパク質をアッセイするための方法に関する。この方法には、ａ）アッセイされる試料をプロテアーゼと接触させて、糖化タンパク質（これが上記の試料中に含まれている場合）から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生じさせること；ｂ）上記の生じた糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ｉ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｉｉ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片を含むキメラタンパク質と接触させて、上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化させること；ならびに、ｃ）上記のキメラタンパク質による上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、上記試料中に上記の糖化タンパク質が存在すること、および／またはその量を決定することが含まれる。
【００７０】
本発明の方法は、任意の適切な試料をアッセイするために使用することができる。好ましくは、試料は血液試料、例えば、血漿、血清、赤血球、または全血試料である。
【００７１】
本発明の方法は、任意の適切な糖化タンパク質をアッセイするために使用することができる。好ましくは、アッセイされる糖化タンパク質はグリコアルブミンまたはグリコヘモグロビンである。
【００７２】
任意の適切なプロテアーゼを、本発明の方法において使用することができる。エンド型プロテアーゼまたはエキソ型プロテアーゼのいずれも、使用することができる。例示的なエンド型プロテアーゼとして、トリプシン、α−キモトリプシン、スブチリシン、プロテイナーゼＫ、パパイン、カテプシンＢ、ペプシン、サーモリシン、プロテアーゼＸＶＩＩ、プロテアーゼＸＸＩ、リシル−エンドペプチダーゼ、プロレター（ｐｒｏｌｅｔｈｅｒ）およびブロメラインＦが挙げられる。例示的なエキソ型プロテアーゼとしては、アミノペプチダーゼまたはカルボキシペプチダーゼが挙げられる。１つの例においては、プロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ、アナニン、サーモリシン、スブチリシン、またはウシの膵臓のプロテアーゼである。
【００７３】
プロテアーゼは、任意の適切な大きさの糖化ペプチドを生じるように使用することができる。例えば、プロテアーゼを、約２から約３０個までのアミノ酸残基の糖化ペプチドを生じるように使用することができる。別の例においては、プロテアーゼは、糖化グリシン、糖化バリン、または糖化リジン残基、あるいは、糖化グリシン、糖化バリン、もしくは糖化リジン残基を含む糖化ペプチドを生じるように使用される。
【００７４】
上記のセクションＢに記載されたものを含む任意の適切なキメラタンパク質を、本発明の方法において使用することができる。１つの例においては、キメラタンパク質には、配列番号５に示されるアミノ酸配列が含まれる。別の例においては、キメラタンパク質は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【００７５】
糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化は、任意の適切な方法によって評価することができる。例えば、糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化は、酸化反応における糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸、Ｈ２Ｏ、またはＯ２の消費、あるいは酸化反応における酸化されたグルコース（グルコソン）、Ｈ２Ｏ２、またはアミノ酸の形成を評価することによって評価することができる。
【００７６】
Ｏ２の消費は、任意の適切な方法によって評価することができる。例えば、Ｏ２の消費は、酸素電極によって評価することができる。
【００７７】
Ｈ２Ｏ２の形成は、任意の適切な方法によって評価することができる。例えば、Ｈ２Ｏ２の形成は、ペルオキシダーゼによって評価することができる。任意のペルオキシダーゼを本発明の方法において使用することができる。より好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼが使用される。例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号を有している西洋ワサビペルオキシダーゼを使用することができる：Ｅ０１６５１；Ｄ９０１１６（ｐｒｘＣ３遺伝子）；Ｄ９０１１５（ｐｒｘＣ２遺伝子）；Ｊ０５５５２（合成のイソ型酵素Ｃ（ＨＲＰ−Ｃ））；Ｓ１４２６８（中性）；ＯＰＲＨＣ（Ｃ１前駆体）；Ｓ００６２７（Ｃ１Ｃ前駆体）；ＪＨ０１５０（Ｃ３前駆体）；Ｓ００６２６（Ｃ１Ｂ前駆体）；ＪＨ０１４９（Ｃ２前駆体）；ＣＡＡ０００８３（ホースラディッシュ（Ａｒｍｏｒａｃｉａ ｒｕｓｔｉｃａｎａ）由来）；およびＡＡＡ７２２２３（合成の西洋ワサビペルオキシダーゼイソ酵素Ｃ（ＨＲＰ−Ｃ））。別の例においては、Ｈ２Ｏ２の形成は、ペルオキシダーゼとトリンダー反応によって評価することができる。糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を、キメラタンパク質とペルオキシダーゼに、連続して、または同時に接触させることができる。
【００７８】
グルコソンの形成は、任意の適切な方法によって評価することができる。例えば、グルコソンの形成は、グルコースオキシダーゼによって評価することができる。任意の適切なグルコースオキシダーゼを使用することができる。例えば、以下のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号を有しているヌクレオチド配列によってコードされるグルコースオキシダーゼを使用することができる：ＡＦ０１２２７７（ペニシリウム・アマガサキナーゼ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ Ａｍａｇａｓａｋｉｅｎｓｅ）由来）；Ｕ５６２４０（タラロマイセス・フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｕｓ）由来）；Ｘ１６０６１（アスパラジラス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ｇｏｘ遺伝子）；Ｘ５６４４３（アスパラジラス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｇｏｄ遺伝子）；Ｊ０５２４２（アスパラジラス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来）；ＡＦ０１２２７７（ペニシリウム・アマガサキナーゼ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ Ａｍａｇａｓａｋｉｅｎｓｅ）由来）；Ｕ５６２４０（タラロマイセス・フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｕｓ）由来）；Ｘ１６０６１（アスパラジラス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ｇｏｘ遺伝子）；Ｘ５６４４３（アスパラジラス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ｇｏｄ遺伝子）；Ｊ０５２４２（アスパラジラス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）のグルコース）。好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｊ０５２４２のヌクレオチド配列（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（７）：３７９３−８０２（１９９０）もまた参照のこと）、および米国特許第５，８７９，９２１号に記載されているヌクレオチド配列を、グルコースオキシダーゼをコードする核酸を得るために使用することができる。
【００７９】
別の例においては、グルコソンの形成を、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼとヘキソキナーゼの組み合わせによって評価することができる。任意の適切なグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼを使用することができる。例えば、以下の特許および特許出願において開示されているグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼを使用することができる：ＷＯ０３／０４２３８９、ＷＯ０１／９８４７２、ＷＯ９３／０６１２５、および米国特許第６，１２７，３４５号、同第６，０６９，２９７号、同第５，８５６，１０４号、同第５，３０８，７７０号、同第５，２４４，７９６号、同第５，２２９，２８６号、同第５，１３７，８２１号、および同第４，８４７，１９５号。任意の適切なヘキソキナーゼを使用することができる。例えば、以下の特許および特許出願において開示されているヘキソキナーゼを使用することができる：ＷＯ０２／２０７９５、ＵＳ２００２／００９７７９、ＷＯ０１／９０３７８、ＷＯ０１／９０３２５、ＷＯ０１／６８６９４、ＷＯ０１／４７９６８、および米国特許第５，９４８，６６５号。
【００８０】
所望される場合は、プロテアーゼを、糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸と、キメラタンパク質との間での接触の前、またはそれと同時に不活化させることができる。プロテアーゼは、任意の適切な方法によって不活化させることができる。例えば、プロテアーゼは、熱処理、またはプロテアーゼの阻害因子によって不活化させることができる。
【００８１】
所望される場合は、アッセイの妨害を計測することができる。例えば、アスコルビン酸塩による妨害を、銅（ＩＩ）化合物、コール酸、もしくはジスルホン酸バソフェナントロリン、またはそれらの混合物を使用して計測することができる。ビリルビンによる妨害は、フェロシアン化物塩を使用して計測することができる。
【００８２】
本発明の方法は、任意の適切な目的のために使用することができる。好ましくは、この方法は、疾患または障害、例えば、糖尿病の予測または診断に使用される。
【００８３】
さらに別の態様においては、本発明は、試料中の糖化タンパク質をアッセイするためのキットに関する。このキットには、ａ）糖化タンパク質（これが試料中に含まれている場合）から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生じさせるためのプロテアーゼ；ｂ）上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化させるための、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ｉ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｉｉ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片を含むキメラタンパク質；ならびに、ｃ）上記のキメラタンパク質による上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、上記試料中に上記糖化タンパク質が存在すること、および／またはその量を決定するための手段が含まれる。
【００８４】
任意の適切な手段を、本発明のキットに含めることができる。例えば、上記糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の上記キメラタンパク質による酸化を評価するための手段には、ペルオキシダーゼを含めることができる。好ましくは、キメラタンパク質とペルオキシダーゼは、１つの組成物中に処方される。
【００８５】
（Ｄ．プロテーナーゼＫとアマドリアーゼを使用して糖化タンパク質を評価するための方法およびキット）
さらに別の態様においては、本発明は、試料中の糖化タンパク質をアッセイするための方法に関する。この方法には、ａ）アッセイされる試料をプロテイナーゼＫと接触させて、糖化タンパク質（これが上記の試料中に含まれている場合）から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生じさせること；ｂ）上記の生じた糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を、アマドリアーゼと接触させて、上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化させること；ならびに、ｃ）上記のアマドリアーゼによる上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、上記試料中に上記の糖化タンパク質が存在すること、および／またはその量を決定することが含まれる。
【００８６】
本発明の方法は、任意の適切な試料をアッセイするために使用することができる。好ましくは、試料は、血液試料、例えば、血漿、血清、赤血球、または全血試料である。
【００８７】
本発明の方法は、任意の適切な糖化タンパク質をアッセイするために使用することができる。好ましくは、アッセイされる糖化タンパク質はグリコアルブミンまたはグリコヘモグロビンである。
【００８８】
上記のセクションＢおよびＣに記載したものを含む任意の適切なアマドリアーゼを、本発明の方法において使用することができる。例えば、アマドリアーゼには、キメラタンパク質が含まれ得る。キメラタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ｉ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｉｉ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片が含まれる。好ましくは、キメラタンパク質には、配列５に示されるアミノ酸配列が含まれる。キメラタンパク質が、配列番号６に示されるヌクレオチドによってコードされることもまた好ましい。
【００８９】
糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化は、任意の適切な方法によって評価することができる。例えば、糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化は、酸化反応における糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸、Ｈ２Ｏ、またはＯ２の消費、あるいは酸化反応における酸化されたグルコース（グルコソン）、Ｈ２Ｏ２、またはアミノ酸の形成を評価することによって評価することができる。
【００９０】
Ｏ２の消費は、任意の適切な方法によって評価することができる。例えば、Ｏ２の消費は、酸素電極によって評価することができる。
【００９１】
Ｈ２Ｏ２の形成は、任意の適切な方法によって評価することができる。例えば、Ｈ２Ｏ２の形成は、ペルオキシダーゼによって評価することができる。上記のセクションＣに記載したものを含む任意のペルオキシダーゼを本発明の方法において使用することができる。より好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼが使用される。別の例においては、Ｈ２Ｏ２の形成は、ペルオキシダーゼとトリンダー反応によって評価することができる。糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を、キメラタンパク質とペルオキシダーゼに、連続して、または同時に接触させることができる。
【００９２】
グルコソンの形成は、任意の適切な方法によって評価することができる。例えば、グルコソンの形成は、グルコースオキシダーゼによって評価することができる。上記のセクションＣに記載したものを含む任意の適切なグルコースオキシダーゼを使用することができる。
【００９３】
別の例においては、グルコソンの形成を、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼとヘキソキナーゼの組み合わせによって評価することができる。上記のセクションＣに記載したものを含む任意の適切なグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼを使用することができる。上記のセクションＣに記載したものを含む任意の適切なヘキソキナーゼを使用することができる。
【００９４】
任意の適切なプロテイナーゼＫを、本発明の方法において使用することができる。例えば、以下の特許および特許出願に開示されているプロテイナーゼＫを使用することができる；ＷＯ０２／０７２６３４、ＷＯ０２／０６４７６０、ＷＯ９６／２８５５６、ならびに、米国特許第６，４５１，５７４号および同第５，３４４，７７０号。好ましくは、トリチラキウム・アルブム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ ａｌｂｕｍ）由来のプロテイナーゼＫが使用される（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号８２４５２）。
【００９５】
所望される場合は、プロテイナーゼＫは、糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸と、アマドリアーゼとの間での接触の前、またはそれと同時に不活化させることができる。例えば、プロテイナーゼＫは、熱処理、またはプロテイナーゼＫの阻害因子によって不活化させることができる。
【００９６】
所望される場合は、アッセイの妨害を計測することができる。例えば、アスコルビン酸塩による妨害を、銅（ＩＩ）化合物、コール酸、またはジスルホン酸バソフェナントロリン、またはそれらの混合物を使用して計測することができる。ビリルビンによる妨害は、フェロシアン化物塩を使用して計測することができる。
【００９７】
本発明の方法は、任意の適切な目的のために使用することができる。好ましくは、疾患または障害、例えば、糖尿病の予測または診断に使用される。
【００９８】
さらに別の態様においては、本発明は、試料中の糖化タンパク質をアッセイするためのキットに関する。このキットには、ａ）糖化タンパク質（これが試料中に含まれている場合）から糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を生じさせるためのプロテイナーゼＫ；ｂ）上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を酸化させるためのアマドリアーゼ；ならびに、ｃ）上記アマドリアーゼによる上記の糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の酸化を評価して、上記試料中に上記糖化タンパク質が存在すること、および／またはその量を決定するための手段が含まれる。
【００９９】
任意の適切な手段を、本発明のキットに含めることができる。例えば、上記糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸の上記キメラタンパク質による酸化を評価するための手段には、ペルオキシダーゼを含めることができる。好ましくは、キメラタンパク質とペルオキシダーゼは、１つの組成物中に処方される。
【０１００】
上記のセクションＢおよびＣに記載したものを含む任意の適切なアマドリアーゼを、本発明のキットにおいて使用することができる。例えば、アマドリアーゼには、キメラタンパク質が含まれ得る。キメラタンパク質には、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ｉ）約５個から約３０個までのアミノ酸残基の細菌のリーダー配列を含む第１のペプチジル断片；およびｉｉ）アマドリアーゼを含む第２のペプチジル断片が含まれる。好ましくは、キメラタンパク質には、配列５に示されるアミノ酸配列が含まれる。キメラタンパク質が、配列番号６に示されるヌクレオチドによってコードされることもまた好ましい。
【実施例】
【０１０１】
（Ｅ．実施例）
（実施例１．糖化血清タンパク質の酵素アッセイキット）
意図される用途。例示的なアッセイキットは、ヒトの血清中の糖化血清タンパク質（フルクトサミン）の決定のためのものである。フルクトサミンは、グルコースとタンパク質のアミノ酸残基との間での非酵素的メイラード反応によって形成される。糖尿病患者においては、高い血中グルコース濃度はフルクトサミンの形成の増大に関係している。フルクトサミンは、糖尿病の管理の中期（２〜３週間）の指標である。
【０１０２】
アッセイの原理。糖化血清タンパク質（ＧＳＰ）についての例示的な酵素的アッセイでは、ＧＳＰを低分子量の糖化タンパク質の断片（ＧＰＦ）へと消化するためにプロテイナーゼＫが使用され、そしてＤｉａｚｙｍｅの特異的フルクトサミナーゼ（商標）、微生物由来のアマドリアーゼが、ＰＦまたはアミノ酸、グルコソンとＨ２Ｏ２を生じる、アマドリ生成物ＧＰＦの酸化的消化を触媒するために使用される。放出されたＨ２Ｏ２は、比色トリンダー終点反応によって測定される。５５０ｎｍでの吸光度が、糖化血清タンパク質（ＧＳＰ）の濃度に比例する。
【０１０３】
【化９】
（表４ 試薬表）
【０１０４】
【表４】
試験試料。新しい患者の血清を使用するか、またはＥＤＴＡを処理した血漿試料を使用した。血漿は、回収後直ちに細胞と分離しなければならない。試料は、４℃では２週間、凍結すれば４週間まで保存することができる。
【０１０５】
再構成。試薬１の１つのバイアルを、２０ｍＬの蒸留水で再構成した。反転させて穏やかに混合し、その後、使用する前に室温に１０分間、置いておいた。再構成したＲ１は、４℃で４週間安定である。試薬２の１つのバイアルを５ｍＬの蒸留水で再構成した。反転させて穏やかに混合し、使用する前に室温で１０分間、置いておいた。再構成したＲ２は、４℃で６週間安定である。
【０１０６】
アッセイ手順
１．予め室温に暖めておいた再構成したＲ１およびＲ２
２．機器パラメーター：
波長：５５０ｎｍ；参照７００ｎｍ
キュベット：１ｃｍの光路
温度：３７℃
３．２００μＬの再構成したＲ１と、５０μＬの試料またはキャリブレーターをキュベットに添加する。混合し、５分間インキュベートする。５５０ｎｍでの吸光度をＡ１として読み取る。
４．５０μＬの再構成したＲ２を添加し、混合し、さらに５分間インキュベートし、その後、５５０ｎｍでの吸光度をＡ２として読み取る。
５．試薬を含まない場合（ブランク）の吸光度を、試料またはキャリブレーターの代わりに５０μＬのＨ２Ｏを使用して読み取る。
【０１０７】
【化１０】
計算
ΔＡ＝Ａ２−Ａ１
試料中の糖化血清タンパク質（フルクトサミン）の濃度：
フルクトサミン（μｍｏｌ／Ｌ）＝（ΔＡ試料−ΔＡブランク／Δ標準物−Δブランク）×キャリブレーターの濃度
。
【０１０８】
正常値。成人（２０歳〜６０歳）は、１２２〜２８５μｍｏｌ／Ｌの正常範囲を有している。それぞれの研究室において、一式の標準物を用いて予想される範囲を規定しなければならない。
【０１０９】
線形性および感度。このアッセイは、１２００μｍｏｌ／Ｌまで線形であり、３０μｍｏｌ／Ｌで感度がよい。Ｄｉａｚｙｍｅの糖化血清タンパク質（Ｄｉａｚｙｍｅ Ｇｌｙｃａｔｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（フルクトサミン）アッセイは正確で、＜３％の平均のアッセイ間ＣＶ、および＜２％の平均のアッセイ内ＣＶを有している。アッセイのデータは、別のフルクトサミン測定方法と、ｒ２＝０．９９の優れた相関関係を示した。
【０１１０】
妨害。以下の分析物濃度は、アッセイに影響を与えるとは認められなかった：
アスコルビン酸（４ｍｇ／ｄＬ）
ビリルビン（２ｍｇ／ｄＬ）
グルコース（１２００ｍｇ／ｄＬ）
ヘモグロビン（１００ｍｇ／ｄＬ）
トリグリセリド（２５０ｍｇ／ｄＬ）
尿酸（１５ｍｇ／ｄＬ）
較正。フルクトサミンキャリブレーター（カタログ番号ＤＺ１１２Ａ−Ｓ）が、較正のために必要である。
【０１１１】
品質管理。フルクトサミン対照（低および高）（カタログ番号ＤＺ１１２Ａ−Ｃ１およびＤＺ１１２Ａ−Ｃ３）を、対照血清として使用することが推奨される。１つの対照（低および高）を、３０個の試料ごとに試験しなければならない。これらの値は特定の範囲内になければならない。これらの値がその範囲を外れ、反復により誤差が全く許されない
場合は、以下の工程を行わなければならない：
１．機器の設定と光源をチェック
２．反応温度をチェック
３．キットと内容物の有効期限をチェック；そして
４．試薬の再構成に使用した水の品質をチェック。
【０１１２】
（参考文献）
【０１１３】
【化１１】
（実施例２．糖化血清タンパク質についてのアッセイの正確さおよび線形性）
（方法の比較）
１回の実行においてＤｉａｚｙｍｅのＧＳＰキットと、Ｒａｎｄｏｘのフルクトサミンキットの両方を使用して、一式のランダムな試料について２連で実行することによって決定した。Ｄｉａｚｙｍｅ ＧＳＰキットによって決定した分析能力の特性は、実施例１に記載した条件下でアッセイを行った場合には、Ｒａｎｄｏｘのフルクトサミンキットを用いて観察された特性に匹敵するものであった（図１もまた参照のこと）。
【０１１４】
（アッセイの線形性）
１回の実行において、一式の段階希釈した血清試料について２連で実行することによって決定した。アッセイは、４０〜８５６μｍｏｌ／Ｌまで線形であった（図２を参照のこと）。
【０１１５】
（妨害）
種々の妨害する可能性がある物質が存在しない条件下、および示した濃度でそのような種々の物質が存在する条件下で、対照試料のそれぞれについて３連で実行することによって決定した（以下の表５を参照のこと）。
【０１１６】
（表５ 妨害についての分析）
【０１１７】
【表５】
（実施例３．糖化ヘモグロビンＨｂＡ１ｃについてのアッセイ）
（Ａ．糖化バリンの測定）
１．１０μＬの１７０ｍＭの糖化バリン（Ｇ−バリン）（この値を、全てのバリンについて仮定し、作業手順においてＧ−バリンに変換した。）を、３００μＬのＲ１（８０ｍＭのＣＨＥＳ、３０ｍＭのＭＯＰＳ、０．９％のＢＲＩＪ）と混合した。この混合物を試料のストック溶液とした（ＧＶＲ１）。
【０１１８】
２．分光光度計の波長を７２６ｎｍ、温度を３７℃に設定した。１５０μＬのＲ２（３０ｍＭのＭＥＳ、１ｍＭのＣａＣｌ２、２ｍＭのＷＳＴ−３、１５７０Ｕ／ｍＬのプロテイナーゼＫ）をキュベットにピペッティングし、用量応答のために、それぞれ０μＬ、２．５μＬ、５μＬ、１０μＬ、１５μＬ、２０μＬの上記のＧＲＶ１を添加し、試料の容量をＲ１中のＨ２Ｏで２０μＬとし、５分間インキュベートし、最初のＯ．Ｄ．を読み取り、その後、３０μＬのＲ３（０．０８ｍＭのＤＡ−６４、２４０ｍＭのＴｒｉｓ、１８０Ｕ／ｍｌのＨＲＰ、２０Ｕ／ｍｌのＦＡＯＤ）を添加し、３分間インキュベートし、２回目のＯ．Ｄ．を読み取った。対照として２０μＬのＲ１中のＨ２Ｏを使用して、これらの２つの読み取り値の間のＯ．Ｄ．の差を計算した。図３および４は、フルクトシル−バリンを用いた用量依存性の反応を示す。
【０１１９】
（Ｂ．糖化ヘモグロビンの測定）
１．１０μＬの高レベル糖化ヘモグロビン（Ｇ−ｈｇ（ＨＨｇ））、１０μＬの中レベルＧ−ｈｇ（ＭＨｇ）、１０μｌの正常レベルＧ−ｈｇ（ＮＭＨｇ）をそれぞれ、３００μＬのＲ１と混合した。
【０１２０】
２．分光光度計の波長を５７０ｎｍ、温度を３７℃に設定した。１５０μＬのＲ２をキュベットにピペッティングし、２０μＬの上記のＲ１中のＨｇを試料として添加し、Ｒ１中のＨ２Ｏを対照として使用して、４分間のインキュベーションの後でＯ．Ｄ．を読み取った。このＯ．Ｄ．読み取り値から、相対的なＨｇ濃度を得た。
【０１２１】
３．分光光度計の波長を７２６ｎｍに変更し、最初のＯ．Ｄ．値を読み取り、３０μＬのＲ３を添加し、５分間インキュベートし、２回目のＯ．Ｄ．値を得た。これらの２つの読み取り値の間のＯ．Ｄ．の差を計算した。これらの試料についてのこれらのＯ．Ｄ．の差を、それらのＨｇ濃度を用いて較正した。図５は、プロテイナーゼで消化した患者のヘモグロビンを用いた用量依存性のシグナルを示す（５分間の消化）。
【０１２２】
上記の実施例は、説明の目的のためだけに含められるものであり、本発明の範囲を限定するものではない。上記の実施例に対する多数の変更形態が可能である。上記の実施例に対するそのような変更形態および変形形態は当業者に明らかであり、本発明が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることが意図される。
（配列表）
【数１】
【数２】
【数３】
【数４】
【数５】
【数６】
【数７】
【数８】
【数９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−２２４０２５（Ｐ２０１１−２２４０２５Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−１７６３４５（Ｐ２０１１−１７６３４５）
【出願日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【分割の表示】特願２００６−５２０３７１（Ｐ２００６−５２０３７１）の分割
【原出願日】平成１６年７月１６日（２００４．７．１６）
【出願人】（５０６０１７０８９）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１７６３４５（Ｐ２０１１−１７６３４５）
【出願日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【分割の表示】特願２００６−５２０３７１（Ｐ２００６−５２０３７１）の分割
【原出願日】平成１６年７月１６日（２００４．７．１６）
【出願人】（５０６０１７０８９）
【Ｆターム（参考）】
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