糖化ヘモグロビン測定用多層試験片、およびそれを用いた測定方法
【課題】測定試料中に存在する可能性のある、糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響を受けにくく、かつ保存安定性に優れた、糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片、および測定方法を提供する。
【解決手段】糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片であって、
少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層の順に積層されており、
かつ血液分離層を有さないことを特徴とする多層試験片。
（ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
（ｂ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
【解決手段】糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片であって、
少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層の順に積層されており、
かつ血液分離層を有さないことを特徴とする多層試験片。
（ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
（ｂ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断の現場で正確、簡便かつ迅速に測定試料中の糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片、および測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病の診断、予防、および治療を行う上で、糖化タンパク質の測定は非常に重要である。糖化タンパク質は、生体内でグルコースと血中タンパク質のアミノ基（主に、末端アミノ酸のα−アミノ基、リジン残基のγ−アミノ基）とが非酵素的に反応して生成する。タンパク質の糖化の程度は血中グルコース濃度（以下、血糖値という。）に直接比例するため、糖化タンパク質の測定により、例えば糖化ヘモグロビンの場合は約２〜３カ月間、糖化アルブミンの場合は約２〜３週間の血糖コントロール状態を把握することができる。
特に糖化ヘモグロビンの一種であるヘモグロビンＡ１ｃは、糖尿病の診断に際して最も重要であるとされている。
【０００３】
前記糖化タンパク質の測定法としては、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、免疫法、および酵素法などが知られている。従来は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、および免疫法が大部分を占めていたが、近年では大量検体を迅速、大量、正確、安価に測定できることから酵素法も多用され始めている。
【０００４】
酵素法については、例えば、以下の工程を経て糖化タンパク質を比色定量する技術が知られている。（例えば、特許文献１〜４参照）
（１）測定試料中の赤血球を溶血させ、糖化ヘモグロビンを取り出す工程。
（２）前記糖化ヘモグロビンとプロテアーゼを反応させ、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出す工程。
（３）前記糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドと糖化アミノ酸オキシダーゼを反応させ、過酸化水素を生成する工程。
（４）ペルオキシダーゼ存在下で、前記過酸化水素と酸化還元系発色試薬を反応させ、発色させる工程。
（５）前記発色から測定試料中の糖化ヘモグロビン量を比色定量する工程。
しかし、かかる従来技術は、測定試料中に存在する可能性のある、測定対象である糖化タンパク質に由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響で、見かけ上の測定値が増加してしまうという問題があった。
【０００５】
一方、前記問題点を解消すべく、糖化タンパク質をプロテアーゼで処理する前に、前記測定試料中に存在する可能性のある、糖化タンパク質に由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに、糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させることにより、前記糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを分解処理する前処理工程を含むことを特徴とする糖化タンパク質の含有量を測定する方法の発明がなされた。（例えば、特許文献５〜９）
かかる従来技術は、測定試料を希釈し、液体状態の試薬を添加し、反応容器内で反応させ、反応液の吸光度を測定する方法であり、生化学自動分析装置を用いた方法が主流である。しかし、前記生化学自動分析装置は大型かつ高価である、取扱いには熟練した検査技師が必要である、採血から結果報告までの時間が長い といった問題点があり、ＰＯＣＴ：ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ ｔｅｓｔｉｎｇ（すなわち、臨床現場即時検査）への適用は困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００２−００６５１９号
【特許文献２】特開２００４−２２２５７０号公報
【特許文献３】特開２００７−１８１４６６号公報
【特許文献４】特開２０１０−１４８５１５号公報
【特許文献５】特開２００７−２８９２０２号公報
【特許文献６】特開２０１０−１０４３８６号公報
【特許文献７】特開２０１０−１１０３３３号公報
【特許文献８】特開２０１０−２５２８１４号公報
【特許文献９】特開２０１０−２６３９２１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：１２ ２３９０−２３９６（１９９７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の目的は、診断の現場で正確、簡便かつ迅速に測定試料中の糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片、および測定方法を提供することにある。さらに詳しくは、測定試料中に存在する可能性のある、糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響を受けにくく、かつ保存安定性に優れた、糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片、および測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは糖化アミノ酸オキシダーゼがプロテアーゼより測定試料点着面に近い層に担持されることで、糖化ヘモグロビンをプロテアーゼで切断する前に、測定試料中に存在する可能性のある、糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに糖化アミノ酸オキシダーゼが作用し、前記糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを分解処理し得ることを見出した。
また、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼが同一層に担持されると、保存中にプロテアーゼによる糖化アミノ酸オキシダーゼの失活・分解が生じ、保存安定性が著しく低下することを見出した。
さらには、ペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬が同一層に担持されると、保存中にペルオキシダーゼによる酸化還元系発色試薬の自己発色が生じ、保存安定性が著しく低下することを見出した。測定試料中の糖化ヘモグロビン濃度は、グルコース濃度等に比べると一般的に低濃度であるため、糖化ヘモグロビンの測定には、高感度であるロイコ型色素を使用するのが好ましいが、ロイコ色素は特に不安定であり、自己発色を生じやすい。
【００１０】
そこで本発明者らは、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼを異なる層に担持させ、かつ糖化アミノ酸オキシダーゼをプロテアーゼより測定試料点着面に近い層に担持させた。これにより、測定試料中に存在する可能性のある、糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響を受けにくくなると共に、糖化アミノ酸オキシダーゼの保存安定性が著しく向上することも見出し、本発明に至った。加えて、ペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬をそれぞれ異なる層に担持させることにより、酸化還元系発色試薬の保存安定性を向上させることも同時に成功し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
１． 糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片であって、
少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層の順に積層されており、
かつ血液分離層を有さないことを特徴とする多層試験片。
（ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
（ｂ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
２． 糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片であって、
少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層の順に積層されており、
（ａ）層および（ｂ）層に、ペルオキシダーゼおよび酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されており、
かつ血液分離層を有さないことを特徴とする多層試験片。
（ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
（ｂ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
３． さらに、（ａ）層と（ｂ）層との少なくとも一層に、界面活性剤が担持されることを特徴とする１．または２．の多層試験片。
４． 糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片であって、
少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層と（ｃ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層／（ｃ）層、（ａ）層／（ｃ）層／（ｂ）層、または（ｃ）層／（ａ）層／（ｂ）層の順に積層されており、
かつ血液分離層を有さないことを特徴とする多層試験片。
（ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
（ｂ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
（ｃ）層：少なくともプロテアーゼおよび糖化アミノ酸オキシダーゼ以外の任意の試薬が担持された高分子基材
５． 糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片であって、
少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層と（ｃ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層／（ｃ）層、（ａ）層／（ｃ）層／（ｂ）層、または（ｃ）層／（ａ）層／（ｂ）層の順に積層されており、
（ａ）層と（ｂ）層と（ｃ）層とのいずれかに、ペルオキシダーゼおよび酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されており、
かつ血液分離層を有さないことを特徴とする多層試験片。
（ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
（ｂ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
（ｃ）層：少なくともプロテアーゼおよび糖化アミノ酸オキシダーゼ以外の任意の試薬が担持された高分子基材
６． さらに、（ａ）層と（ｂ）層と（ｃ）層との少なくとも一層に、界面活性剤が担持されることを特徴とする４．または５．の多層試験片。
７． プロテアーゼが、少なくともバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼ、およびトリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来プロテアーゼからなる群より選ばれた１種以上であることを特徴とする１．から６．いずれかの多層試験片。
８． 酸化還元系発色試薬が、極大吸収波長が６００〜８００ｎｍのロイコ型色素であることを特徴とする１．から７．いずれかの多層試験片。
９． 界面活性剤が、親水親油バランス値（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ Ｂａｌａｎｃｅ ｖａｌｕｅ：ＨＬＢ値）が１０〜２０の非イオン性界面活性剤であることを特徴とする１．から８．いずれかの多層試験片。
１０． １．から９．いずれかの多層試験片を用い、少なくとも下記工程（ｉ）から（iii）を経て、糖化ヘモグロビン量を比色定量する測定方法。
工程（ｉ）：前記多層試験片の上面に測定試料を点着させる工程
工程（ii）：前記多層試験片の測定試料点着面とは反対面から、反射光を用いて反射率および／または吸光度を測定する工程
工程（iii）：得られた反射率および／または吸光度からヘモグロビン量、糖化ヘモグロビン量、糖化ヘモグロビン量のヘモグロビン量に対する割合からなる群より選ばれた１つ以上を算出する工程
１１． 測定試料が全血検体であることを特徴とする１０．の測定方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、測定試料中に存在する可能性のある糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響を受けにくく、かつ保存安定性に優れた糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例において使用した、試験片を上下から挟んで固定するための板状の治具である。本治具には、２つの穿孔を設けている。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳述する。
（測定対象物）
本発明における測定対象物は、糖化ヘモグロビンであり、糖尿病診断への応用の観点から、ヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端が糖化されたヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃともいうことがある。）が好ましい。なお、測定対象物である糖化へモグロビンに由来する糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを測定対象糖化物といい、測定対象物である糖化へモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを非測定対象糖化物ともいうことがある。
【００１５】
（測定試料）
本発明における測定試料としては、全血、血球、血漿、血清、髄液、汗、尿、涙液、唾液、皮膚、粘膜、毛髪等の生体試料（すなわち生体から採取された試料）や、飲料水、調味料等の食品類が挙げられる。また、生体試料はヒト由来に限らず、イヌ、ネコ、ウシ等の哺乳類動物由来の生体試料も対象である。これら中でも、糖尿病診断への応用の観点から、全血または血球が好ましく、ＰＯＣＴの観点から、前処理として血球／血漿または血清分離を行わない全血がより好ましい。
【００１６】
本発明における測定試料の量は、特に限定されないが、例えば１〜５０μＬが好ましく、１〜４０μＬがより好ましく、１〜３０μＬがさらに好ましい。測定試料量が１μＬより少ないと、多層試験片の最上層から最下層まで展開できない恐れがある。一方、測定試料量が５０μＬより多いと、例えば測定試料が血液の場合、患者の負担が大きくなるため好ましくない。
【００１７】
（測定原理）
本発明における糖化ヘモグロビンの測定原理は、酵素反応を測定試料中の水分によって行う（いわゆる、ドライケミストリー）ことで多層試験片を呈色させ、その呈色の程度を反射光測定によって検知する方法（いわゆる、酵素比色法）によって行なわれる。前記測定原理を用いることで、装置の小型・軽量・低価格化が可能となる。また、正確、簡便かつ迅速な測定が可能となる。
【００１８】
以下に赤血球中の糖化ヘモグロビン量を測定する場合の反応について説明するが、本発明を何ら限定するものではない。
（１）測定試料中の赤血球と界面活性剤を反応させ、溶血させ、糖化ヘモグロビンを取り出す工程。
（２）非測定対象糖化物と糖化アミノ酸オキシダーゼを反応させ、非測定対象糖化物の影響を低減する工程。
（３）前記糖化ヘモグロビンとプロテアーゼを反応させ、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端から測定対象糖化物を切り出す工程。
（４）前記測定対象糖化物と糖化アミノ酸オキシダーゼを反応させ、過酸化水素を生成する工程。
（５）ペルオキシダーゼ存在下で、前記過酸化水素と酸化還元系発色試薬を反応させ、発色させる工程。
（６）前記発色から測定試料中の糖化ヘモグロビン量を比色定量する工程。
【００１９】
（多層試験片）
本発明の多層試験片は、複数の高分子基材（以下、層ともいうことがある。）からなる。前記多層試験片の層数は、実施形態に合わせて変化し得るが、２〜７層が好ましく、２〜６層がより好ましく、２〜５層がさらに好ましい。なお、層数には、本発明に必要な試薬（界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬等）が担持された高分子基材に加え、血液を展開するための展開層や透明支持層なども含む。層数が１層だと、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼとを同一層に担持せざるを得なくなり、非測定対象糖化物の影響を低減する工程を経ることが困難となる。さらに、層数が１層だと、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼ、およびペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬等を同一層に担持せざるを得なくなり、プロテアーゼによる糖化アミノ酸オキシダーゼの失活・分解や、酸化還元系発色試薬の自己発色が生じる恐れがある。つまり、多層試験片の保存安定性が著しく低下する恐れがある。一方、層数が７層より多いと、最上層から最下層まで展開するのに必要な測定試料量が多くなるため、好ましくない。
【００２０】
前記多層試験片は、任意の手順を用いて作製することができる。典型的には、複数の層を別個に、一種以上の試薬溶液に浸漬し、乾燥する慣用の手順を用いることにより作製し、次いで最終的な試験片に組み立てることができる。
【００２１】
前記多層試験片には、血液分離層を有さないことを特徴とする。なお、血液分離層とは全血から血球をろ別することで血漿または血清を得るための層を意味する。本発明における測定対象物は、血漿または血清中に含まれる糖化アルブミンではなく、血球中に含まれる糖化ヘモグロビンであるため、血球をろ別すると測定不可能となる。
【００２２】
（層構成）
前記多層試験片の層構成は、糖化アミノ酸オキシダーゼがプロテアーゼより測定試料点着面に近い層（以下、上層ともいうことがある。）に担持されることが必要である。糖化アミノ酸オキシダーゼがプロテアーゼよりも測定試料点着面から遠い層（以下、下層ともいうことがある。）に担持されると、非測定対象糖化物の影響を低減する工程を経ることが不可能となる。
【００２３】
また、前記多層試験片の層構成は、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼがそれぞれ異なる層に担持されることが必要であり、さらにペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されることが好ましい。プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼが同一層に担持されるとプロテアーゼによる糖化アミノ酸オキシダーゼの失活・分解が生じる恐れがあり、ペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬が同一層に担持されると酸化還元系発色試薬の自己発色が生じる恐れがある。つまり、多層試験片の保存安定性が著しく低下する恐れがある。以下に層構成の具体例を示すが、本発明を何ら限定するものではない。
【００２４】
前記多層試験片は、１層目の側が測定試料点着面、２層目の側が反射光測定面とすると、糖化アミノ酸オキシダーゼがプロテアーゼよりも上層に担持された以下の構成が挙げられる。
１．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬』
２．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬』
３．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、２層目：プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ』
４．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、２層目：プロテアーゼ』
【００２５】
これらの中でも、さらにペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されている以下の構成が好ましい。
２．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬』
３．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、２層目：プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ』
【００２６】
さらに酸化還元系発色試薬が反射光測定面（２層目）に担持されており、高感度な測定が期待できる以下の構成がより好ましい。
２．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬』
【００２７】
前記多層試験片は、１層目の側が測定試料点着面、３層目の側が反射光測定面とすると、糖化アミノ酸オキシダーゼがプロテアーゼよりも上層に担持された以下の構成が挙げられる。
１．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、３層目：ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬』
２．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：ペルオキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬』
３．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：酸化還元系発色試薬、３層目：プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ』
４．『１層目：ペルオキシダーゼ、２層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬』
５．『１層目：酸化還元系発色試薬、２層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ』
６．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、３層目：酸化還元系発色試薬』
７．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬、３層目：ペルオキシダーゼ』
８．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、３層目：プロテアーゼ』
９．『１層目：ペルオキシダーゼ、２層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、３層目：プロテアーゼ』
１０．『１層目：酸化還元系発色試薬、２層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ』
１１．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、３層目：酸化還元系発色試薬』
１２．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、２層目：プロテアーゼ、３層目：ペルオキシダーゼ』
１３．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、２層目：酸化還元系発色試薬、３層目：プロテアーゼ』
１４．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、２層目：ペルオキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ』
１５．『１層目：ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、２層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ』
【００２８】
これらの中でも、さらにペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されている以下の構成が好ましい。
２．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：ペルオキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬』
３．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：酸化還元系発色試薬、３層目：プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ』
４．『１層目：ペルオキシダーゼ、２層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬』
５．『１層目：酸化還元系発色試薬、２層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ』
６．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、３層目：酸化還元系発色試薬』
７．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬、３層目：ペルオキシダーゼ』
９．『１層目：ペルオキシダーゼ、２層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、３層目：プロテアーゼ』
１０．『１層目：酸化還元系発色試薬、２層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ』
１１．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、３層目：酸化還元系発色試薬』
１２．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、２層目：プロテアーゼ、３層目：ペルオキシダーゼ』
１３．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、２層目：酸化還元系発色試薬、３層目：プロテアーゼ』
１４．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、２層目：ペルオキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ』
【００２９】
さらに酸化還元系発色試薬が反射光測定面（３層目）に担持されており、高感度な測定が期待できる以下の構成がより好ましい。
２．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：ペルオキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬』
４．『１層目：ペルオキシダーゼ、２層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬』
６．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、３層目：酸化還元系発色試薬』
１１．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、３層目：酸化還元系発色試薬』
【００３０】
前記の各層（１層目、２層目、３層目）の少なくとも一層に、さらに界面活性剤が担持されるのが好ましい。また、前記試薬（界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬等）は、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼ、およびペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬が同層に存在しない限り、各層（１層目、２層目、３層目）に重複して担持されてもよい。加えて、各層には緩衝剤を必要に応じて担持させることができる。
【００３１】
（高分子基材）
本発明の多層試験片を構成する高分子基材としては、前記試薬（界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬等）を必要量担持でき、かつ測定試料を水平方向および垂直方向に適切に展開できれば、いかなる形態、組成のものを用いてもよい。以下に高分子基材の形態、組成の具体例を示すが、本発明を何ら限定するものではない。
【００３２】
（形態）
前記高分子基材の形態としては、ろ紙、繊維構造体、多孔質膜（メンブレンフィルター）、フィルム等の自立可能なものや、高分子ゲル等の自立不可能なものが挙げられる。なお、高分子ゲル等の自立不可能なものを用いる際は、ろ紙、繊維構造体、多孔質膜（メンブレンフィルター）、フィルム等の自立可能なものを支持体として設けるのが好ましい。
【００３３】
（組成）
前記高分子基材の組成としては、ポリエステル樹脂であるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ポリブチレンナフタレート（ＰＢＮ）等、オレフィン樹脂であるポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリブテン等、ビニル樹脂であるポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル等、アクリル樹脂、アクリレート樹脂、フッ素樹脂であるポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）等、ポリカーボネート樹脂、ポリエーテル樹脂であるポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、ポリフェニレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリエーテルケトン（ＰＥＫ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリフェニレンスルフィド（ＰＰＳ）、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）等、ポリアミド樹脂であるナイロン、アラミド等、セルロース類であるセルロースアセテート、ニトロセルロース、再生セルロース等が挙げられる。
【００３４】
前記高分子基材の形状は、特に限定されないが、例えば正方形、長方形、円形、楕円形等の薄板状が挙げられる。
前記高分子基材の面積は、装置の小型・軽量・低価格化の観点から小さければ小さいほどよいが、例えば１〜１０００ｍｍ２が好ましく、２〜５００ｍｍ２がより好ましく、５〜２００ｍｍ２がさらに好ましい。
前記高分子基材の（１層の）厚みは、測定試料の展開性、および酵素（プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ）反応性の観点から、例えば１０〜２０００μｍが好ましく、２０〜１０００μｍがより好ましく、５０〜５００μｍがさらに好ましい。
【００３５】
（検出）
反応の検出には、発色した多層試験片に対して光（入射光）をあて、その反射光を検出することが最も簡便であるが、これ以外の方法を用いても良い。光源としては、特に限定されないが、例えばＵＶランプ、キセノンランプ、クリプトンランプ、水銀ランプ、重水素ランプ、タングステンランプ、ハロゲンランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザー等が挙げられる。これらの中でも、光波長の制御の容易さ、装置の小型・軽量・低価格化の観点から、発光ダイオード（ＬＥＤ）が好ましい。前記入射光の角度（入射角）は、特に限定されず、任意の角度を用いることができる。一方、反射光の検出は、特に限定されないが、検出面に対して垂直が好ましい。なお、検出には、フォトダイオードや積分球等を用いれば簡便に行う事ができる。
【００３６】
（プロテアーゼ）
本発明に用いるプロテアーゼとしては、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端に作用して測定対象糖化物を切り出すものであれば、いかなる種類のプロテアーゼを用いてもよく、例えば動物、植物、微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。以下にプロテアーゼの具体例を示すが、本発明を何ら限定するものではない。
【００３７】
（動物由来プロテアーゼ）
動物由来のプロテアーゼとしては、ファクターＸａ（ｆａｃｔｏｒＸａ）、プラスミン（ｐｌａｓｍｉｎ）、スロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、ペプシン（ｐｅｐｓｉｎ）、ロイシンアミノペプチダーゼ（ｌｅｕｃｉｎａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、パンクレアチン（ｐａｎｃｒｅａｔｉｎ）、エラスターゼ（ｅｌａｓｔａｓｅ）、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）、キモトリプシンＡ（ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎＡ）、アミノペプチダーゼＭ（ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＭ）、カルボキシペプチダーゼＡ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＡ）、カルボキシペプチダーゼＢ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＢ）、カルパイン（ｃａｌｐａｉｎ）、カテプシンＢ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎＢ）、カテプシンＣ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎＣ）、カテプシンＤ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎＤ）、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＡｒｇ−Ｃ）等が挙げられる。
【００３８】
（植物由来プロテアーゼ）
植物由来のプロテアーゼとしては、カルボキシペプチダーゼＷ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＷ）、カリクレイン（ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ）、フィシン（ｆｉｃｉｎ）、パパイン（ｐａｐａｉｎ）、キモパパイン（ｃｈｉｍｏｐａｐａｉｎ）、ブロメライン（ｂｒｏｍｅｌａｉｎ）等が挙げられる。
【００３９】
（微生物由来プロテアーゼ）
微生物由来のプロテアーゼとしては、ズブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、サーモリシン（ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）、ディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）、プロテイナーゼＮ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＮ）等に代表されるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、ＩＰ酵素等に代表されるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、プロナーゼ（ｐｒｏｎａｓｅ）等に代表されるストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼ、プロテイナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）等に代表されるトリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来プロテアーゼ、ペプチダーゼＲ（ｐｅｐｔｉｄａｓｅＲ）等に代表されるリゾバス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）由来プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼＰ、（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＰ）、ＰＤ酵素等に代表されるペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＧｌｕ−Ｃ）等に代表されるスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）由来プロテアーゼ、クロストリパイン（ｃｌｏｓｔｒｉｐａｉｎ）等に代表されるクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＬｙｓ−Ｃ）等に代表されるリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）由来プロテアーゼ、メタロエンドペプチダーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｅｎｄｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ）等に代表されるグリフォラ（Ｇｒｉｆｏｌａ）由来プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼＹ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＹ）、プロテイナーゼＡ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＡ）等に代表される酵母（Ｙｅａｓｔ）由来プロテアーゼ、アミノペプチダーゼＴ（ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＴ）等に代表されるサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＡｓｐ−Ｎ）等に代表されるシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ）由来プロテアーゼ、リジルエンドペプチダーゼ（ｌｙｓｙｌｅｎｄｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ）、アクロモペプチダーゼ（ａｃｈｒｏｍｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ）等に代表されるアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）由来プロテアーゼ等が挙げられる
【００４０】
これらの中でも、安定性、反応性（ヘモグロビンの切断速度）、入手の容易性、価格等の理由から、微生物由来のプロテアーゼが好ましく、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼ、およびトリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来プロテアーゼからなる群より選ばれた１種以上であることがより好ましい。市販品としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼのトヨチームＮＥＰ（東洋紡績社製）、Ｔｙｐｅ−Ｘ（シグマ社製）、Ｔｙｐｅ−ＸＸＩＶ（シグマ社製）、サーモリシン（大和化成社製）、サモアーゼＰＣ１０（大和化成社製）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼのＴｙｐｅ−ＸＩＩＩ（シグマ社製）、Ｔｙｐｅ−ＸＸＩＩＩ（シグマ社製）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼのＴｙｐｅ−ＸＩＶ、トリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来プロテアーゼのプロテイナーゼＫ（ロシュ社製）等が好適に用いられる。
【００４１】
これらの中でも、ヘモグロビンＡ１ｃ測定の観点から、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼのトヨチームＮＥＰ（東洋紡績社製）、Ｔｙｐｅ−Ｘ（シグマ社製）、Ｔｙｐｅ−ＸＸＩＶ（シグマ社製）、サーモリシン（大和化成社製）、サモアーゼＰＣ１０（大和化成社製）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼのＴｙｐｅ−ＸＩＶがより好適に用いられる。
【００４２】
前記プロテアーゼは、目的とする活性が発現すれば精製物であっても粗精製物であってもよい。また、遺伝子操作により作られたものでもよく、化学修飾の有無も問わない。さらに、前記プロテアーゼは単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４３】
前記プロテアーゼの濃度は、特に限定されないが、０．１〜１００００Ｕ／ｃｍ２であることが好ましく、１〜１０００Ｕ／ｃｍ２がより好ましい。プロテアーゼ濃度が０．１Ｕ／ｃｍ２より少ないと、反応性の低下により測定時間が長くなるため好ましくない。一方、プロテアーゼ濃度が１００００Ｕ／ｃｍ２より多いと、バッククラウンドの上昇や、高価格化の恐れがある。
【００４４】
前記プロテアーゼの反応を行う際のｐＨは、無調整でもよいが、使用するプロテアーゼの至適ｐＨとなるよう適当なｐＨ調整剤、例えば下記の緩衝剤によって調整するのが好ましい。
【００４５】
（糖化アミノ酸オキシダーゼ）
本発明に用いる糖化アミノ酸オキシダーゼ（以下、ＦＡＯＤともいうことがある。）は、公知文献では「フルクトシルアミンオキシダーゼ」「フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ」「フルクトシルペプチドオキシダーゼ」「フルクトシルアミン酸化酵素」「フルクトシルアミノ酸酸化酵素」「フルクトシルペプチド酸化酵素」「糖化アミンオキシダーゼ」「糖化アミノ酸オキシダーゼ」「糖化ペプチドオキシダーゼ」「糖化アミン酸化酵素」「糖化アミノ酸酸化酵素」「糖化ペプチド酸化酵素」「アマドリアーゼ」「ケトアミンオキシダーゼ」「ケトアミン酸化酵素」等、種々の名称で呼ばれている。
【００４６】
本発明に用いる糖化アミノ酸オキシダーゼとしては、測定対象糖化物または非測定対象糖化物に特異的に作用し、過酸化水素を生成する酵素であれば、いかなる種類の酵素を用いてもよい。以下に糖化アミノ酸オキシダーゼの具体例を示すが、本発明を何ら限定するものではない。
【００４７】
糖化アミノ酸オキシダーゼとしては、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）由来酵素、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来酵素、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）由来酵素、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）由来酵素、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来酵素、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）由来酵素、ユウペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）由来酵素、アカエトミエラ（Ａｃｈａｅｔｏｍｉｅｌｌａ）由来酵素、カエトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）由来酵素、大腸菌由来酵素、酵母属デバリオマイゼス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）由来酵素、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）由来酵素、ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）由来酵素、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来酵素、ファエオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）由来酵素、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）由来酵素、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）由来酵素等が挙げられる。
【００４８】
これらの中でも、安定性、反応性（測定対象糖化物または非測定対象糖化物の酸化速度）、入手の容易性、価格等の理由から、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）由来酵素、ユウペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）由来酵素、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）由来酵素、ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）由来酵素、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来酵素、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来酵素、ファエオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）由来酵素からなる群より選ばれた１種以上であることが好ましく、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）由来酵素、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来酵素、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来酵素、ファエオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）由来酵素からなる群より選ばれた１種以上であることがより好ましい。
【００４９】
これらの中でも、ヘモグロビンＡ１ｃ測定の観点から、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）由来酵素、ファエオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）由来酵素からなる群より選ばれた１種以上であることがさらに好ましい。
【００５０】
前記糖化アミノ酸オキシダーゼは、目的とする活性が発現すれば精製物であっても粗精製物であってもよい。また、遺伝子操作により作られたものでもよく、化学修飾の有無も問わない。さらに、前記糖化アミノ酸オキシダーゼは単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５１】
前記糖化アミノ酸オキシダーゼの濃度は、特に限定されないが、０．０１〜１０００Ｕ／ｃｍ２であることが好ましく、０．１〜１００Ｕ／ｃｍ２がより好ましい。糖化アミノ酸オキシダーゼ濃度が０．０１Ｕ／ｃｍ２より少ないと、反応性の低下により測定時間が長くなるため好ましくない。一方、糖化アミノ酸オキシダーゼ濃度が１０００Ｕ／ｃｍ２より多いと、バッククラウンドの上昇や、高価格化の恐れがある。
【００５２】
前記糖化アミノ酸オキシダーゼの反応を行う際のｐＨは、無調整でもよいが、使用する糖化アミノ酸オキシダーゼの至適ｐＨとなるよう適当なｐＨ調整剤、例えば後述の緩衝剤によって調整するのが好ましい。
【００５３】
（ペルオキシダーゼ）
本発明に用いるペルオキシダーゼとしては、過酸化水素と酸化還元系発色試薬との反応を触媒する酵素であれば、いかなる種類の酵素を用いてもよく、例えば植物由来、細菌由来、担子菌由来のペルオキシダーゼが挙げられる。これらの中でも、純度、入手の容易性、価格等の理由から、西洋ワサビ、イネ、大豆由来のペルオキシダーゼが好ましく、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼがより好ましい。市販品としては、ＰＥＯ−１３１（東洋紡績社製）、ＰＥＯ−３０１（東洋紡績社製）、ＰＥＯ−３０２（東洋紡績社製）等が好適に用いられる。
【００５４】
前記ペルオキシダーゼの濃度は、特に限定されないが、０．０１〜１０００Ｕ／ｃｍ２であることが好ましく、０．１〜１００Ｕ／ｃｍ２がより好ましい。ペルオキシダーゼ濃度が０．０１Ｕ／ｃｍ２より少ないと、反応性の低下により測定時間が長くなるため好ましくない。一方、ペルオキシダーゼ濃度が１０００Ｕ／ｃｍ２より多いと、バッククラウンドの上昇や、高価格化の恐れがある。
【００５５】
前記ペルオキシダーゼの反応を行う際のｐＨは、無調整でもよいが、使用するペルオキシダーゼの至適ｐＨとなるよう適当なｐＨ調整剤、例えば後述の緩衝剤によって調整するのが好ましい。
【００５６】
（酸化還元系発色試薬）
本発明に用いる酸化還元系発色試薬としては、過酸化水素と反応して呈色するものであれば、いかなる種類の色素を用いてもよく、例えば水素供与体とカップラー、ロイコ体等が挙げられる。なお、水素供与体とカップラーを用いた代表例は、水素供与体とカップラーとをペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素によって酸化縮合させて色素を形成させるトリンダー（Ｔｒｉｎｄｅｒ）法である。
以下に酸化還元系発色試薬の具体例を示すが、本発明を何ら限定するものではない。
【００５７】
（水素供与体）
水素供与体としては、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等が挙げられる。具体的には、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン等が挙げられる。
【００５８】
（カップラー）
カップラーとしては、４−アミノアンチピリン（４ＡＡ）、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等が挙げられる。
【００５９】
（ロイコ体）
ロイコ体としては、トリフェニルメタン誘導体、フェノチアジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体等が挙げられる。具体的には、４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）、４，４’−ビス［Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピルアミノ）−２，６−ジメチルフェニル］メタン、１−（エチルアミノチオカルボニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩（ＤＡ６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩（ＤＡ６７）等が挙げられる。
【００６０】
これらの中でも、モル吸光係数、極大吸収波長等の理由から、ロイコ体が好ましく、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩（ＤＡ６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩（ＤＡ６７）がより好ましい。
【００６１】
前記酸化還元系発色試薬の極大吸収波長は、６００〜８００ｎｍであることが好ましく、６５０〜７５０ｎｍがより好ましい。ヘモグロビンＡ１ｃ測定の観点から、極大吸収波長が６００ｎｍより低波長側であると、酸化還元系発色試薬の発色スペクトルとヘモグロビンのスペクトルとが重なるため、感度が低下する恐れがある。一方、極大吸収波長が８００ｎｍより高波長側であると、検出機器が大型化する恐れがある。
【００６２】
前記酸化還元系発色試薬の濃度は、特に限定されないが、０．０００１〜１０ｍｇ／ｃｍ２であることが好ましく０．００１〜１ｍｇ／ｃｍ２がより好ましい。酸化還元系発色試薬濃度が０．０００１ｍｇ／ｃｍ２より少ないと、感度が低下する恐れがある。一方、酸化還元系発色試薬濃度が１０ｍｇ／ｃｍ２より多いと、バッククラウンドの上昇や、高価格化の恐れがある。
【００６３】
（界面活性剤）
本発明に用いる界面活性剤としては、溶血剤および／またはプロテアーゼ反応促進剤として作用すれば、いかなる種類の界面活性剤を用いてもよいが、溶血剤およびプロテアーゼ反応促進剤として作用する界面活性剤が好ましい。前記界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、ショ糖脂肪酸エステル等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。これらの中でも、溶血剤としての反応性（溶血の速度）、プロテアーゼ反応促進剤としての作用性、価格等の理由からポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤等）が好ましい。市販品としては、ＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）−１００（ナカライテスク社製）、ＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）−１１４（ナカライテスク社製）、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（ナカライテスク社製）等が好適に用いられる。また、前記界面活性剤は単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００６４】
前記界面活性剤の親水親油バランス値（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ Ｂａｌａｎｃｅ ｖａｌｕｅ：ＨＬＢ値）は、１０〜２０であることが好ましく、１２〜２０がより好ましく、１４〜２０がさらに好ましい。ＨＬＢ値が１０より小さいと、十分な溶血効果、およびプロテアーゼ反応促進効果が得られない恐れがある。一方、ＨＬＢ値が２０より大きい界面活性剤は、ＨＬＢの定義上存在しない。
【００６５】
前記界面活性剤の濃度は、特に限定されないが、０．０００１〜１０ｍｇ／ｃｍ２であるとこが好ましく０．００１〜１ｍｇ／ｃｍ２がより好ましい。界面活性剤濃度が０．０００１ｍｇ／ｃｍ２より少ないと、十分な溶血効果、およびプロテアーゼ反応促進効果が得られない恐れがある。一方、界面活性剤濃度が１０ｍｇ／ｃｍ２より多くしても、効果の向上は見られない。
【００６６】
本発明の非測定対象糖化物と糖化アミノ酸オキシダーゼを反応させ、非測定対象糖化物の影響を低減する工程にて発生する過酸化水素は、測定試料中が全血である場合は、全血中のカタラーゼによって酸素と水に分解されるが、必要に応じてカタラーゼを添加してもよい。
【００６７】
本発明に用いるカタラーゼとしては、非測定対象糖化物を消去する際に生成する過酸化水素を不均化して酸素と水に分解する反応を触媒する酵素であれば、いかなる種類の酵素を用いてもよく、例えば動物由来、微生物由来のカタラーゼが挙げられる。これらの中でも、純度、入手の容易性、価格等の理由から、微生物由来のカタラーゼが好ましい。市販品としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来カタラーゼ Ｃ３５１５（シグマ社製）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来カタラーゼ ０２０７１（シグマ社製）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属由来カタラーゼ ６０６３８（シグマ社製）等が好適に用いられる。
【００６８】
前記カタラーゼの濃度は、特に限定されないが、０．１〜１００００Ｕ／ｃｍ２であることが好ましく、１〜１０００Ｕ／ｃｍ２がより好ましい。カタラーゼ濃度が０．１Ｕ／ｃｍ２より少ないと、非測定対象糖化物を消去する際に生成する過酸化水素を除去できず、見かけ上の測定値が増加してしまう恐れがある。一方、カタラーゼ濃度が１００００Ｕ／ｃｍ２より多いと、バッククラウンドの上昇や、高価格化の恐れがある。前記カタラーゼの反応を行う際のｐＨは、無調整でもよいが、使用するペルオキシダーゼの至適ｐＨとなるよう適当なｐＨ調整剤、例えば下記の緩衝剤によって調整するのが好ましい。
【００６９】
前記カタラーゼの反応後、カタラーゼの影響を排除するため、カタラーゼよりも下層にアジ化ナトリウムなどのカタラーゼ阻害剤を担持させてもよい。あるいは、カタラーゼとペルオキシダーゼの基質に対する親和性の違いを利用して、カタラーゼとペルオキシダーゼとの濃度比率を適切に設定することにより、カタラーゼよりも下層にカタラーゼ阻害剤を担持させない構成も可能である。
【００７０】
（緩衝剤）
本発明に用いることができる緩衝剤としては、目的とするｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、グッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン）等が挙げられる。
【００７１】
これらの中でも、本発明に用いるプロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、およびペルオキシダーゼの至適ｐＨ範囲である６．０〜８．５（好ましくは６．０〜７．５）において充分な緩衝能力を有する等の理由から、トリス、リン酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳが好ましく、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳがより好ましい。
【００７２】
前記緩衝剤の濃度は、特に限定されないが、多層試験片作製時の試薬に対して５０〜１００ｍＭ程度が好ましい。
【００７３】
（その他試薬）
本発明では前記試薬（界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬等）の他、必要に応じてヘモグロビンの酸化剤（フェロシアン化物、アジ化物、亜硝酸塩、硝酸塩等）、酵素反応を妨害するイオンを捕捉するキレート試薬（エチレンジアミン、ビピリジン、エチレンジアミン四酢酸、フェナントロリン、ポルフィリン、クラウンエーテル等）、過酸化水素の定量の妨害物質であるアスコルビン酸を消去するアスコルビン酸オキシダーゼ、塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化アルミニウム等）、酵素安定化剤（単糖類、オリゴ糖類、多糖類、糖アルコール、グリセロール、グルコン酸塩、アミノ酸類、アルブミン類、グロブリン類、繊維性タンパク質等）、酸化還元系発色試薬安定化剤（シクロデキストリン類、還元性チオアルコール類、還元性硫酸塩類等）を添加してもよい。これらは、単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【実施例】
【００７４】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。なお、明細書中の評価法は以下の通りである。
［各種評価法］
【００７５】
＜１．プロテアーゼの活性測定＞
プロテアーゼの活性は、Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬を用いたカゼインフォリン法により算出した。ここで、プロテアーゼの至適ｐＨで、３７℃−１分あたり、カゼインを加水分解し、１．０μｍｏｌのチロシンに相当する呈色を生ずる酵素量を１Ｕと定義した。
【００７６】
＜２．糖化アミノ酸オキシダーゼの活性測定＞
糖化アミノ酸オキシダーゼの活性は、ペルオキシダーゼ存在下で、糖化バリルヒスチジンと糖化アミノ酸オキシダーゼとの反応で生成した過酸化水素と酸化還元系発色試薬を反応させ、その吸光度変化から算出した。ここで、糖化アミノ酸オキシダーゼの至適ｐＨ（ｐＨ＝６．５）で、３７℃−1分あたり、糖化バリルヒスチジンを加水分解し、１．０μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義した。
【００７７】
＜３．ペルオキシダーゼの活性測定＞
ペルオキシダーゼの活性は、ペルオキシダーゼ存在下で、過酸化水素とピロガロール（Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ）とを反応させ、生成したプルプロガリン（Ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ）に由来する吸光度の変化から算出した。ここで、ペルオキシダーゼの至適ｐＨ（ｐＨ＝６．０）で、２０℃−２０秒あたり、１．０ｍｇのプルプロガリン（Ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ）に相当する呈色を生ずる酵素量を１Ｕと定義した。
【００７８】
＜４．カタラーゼの活性測定＞
カタラーゼの活性は、ペルオキシダーゼ存在下で、過酸化水素を水と酸素に分解し、過酸化水素に由来する２４０ｎｍでの吸光度の変化から算出した。ここで、ペルオキシダーゼの至適ｐＨで、２５℃−１分あたり、１．０μｍｏｌの過酸化水素を分解する酵素量を１Ｕと定義した。
【００７９】
＜５．親水親油バランス値（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ Ｂａｌａｎｃｅ ｖａｌｕｅ：ＨＬＢ値）の測定＞
ＨＬＢ値は、グリフィン法を用い、ＨＬＢ値＝２０×（親水部の式量の総和／分子量）で算出した。なお、界面活性剤の混合物のＨＬＢ値は、各成分のＨＬＢ値の加重平均で表す。
【００８０】
＜６．糖化アミノ酸オキシダーゼの保存安定性＞
８ｍｍφの桐山ろ紙 ＮＯ．５Ａ（東京硝子器械社製）に、下記試薬１を１０μＬ滴下し、遮光デシケーター ３９０９−０４（東京硝子器械社製）にて２５℃−２時間乾燥させ、ブランク試験片を作製した。
＜試薬１＞
１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ（同仁化学研究所社製） ｐＨ６．５
５００Ｕ／ｍＬ 糖化アミノ酸オキシダーゼ ＦＰＯ−３０１（東洋紡績社製）
【００８１】
次いで、ブランク試験片を、加速試験として、プログラム低温恒温器 ＩＮ６０４（ヤマト科学社製）にて３７℃−５時間インキュベートした。次いで、マイクロチューブ内に前記ブランク試験片と下記試薬２ １０００μＬとを添加し、ボルテックスミキサー（エムエス機器社製）で１分間攪拌することで、ブランク試験片中の糖化アミノ酸オキシダーゼを抽出した。次いで、前記抽出液をマイクロコン−３（ミリポア社製）にて１４０００Ｇで遠心濃縮し、２００μＬの濃縮液を得た。次いで、前記濃縮液 ５０μＬとＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）４７．５μＬと２−メルカプトエタノール（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）２．５μＬとを混合し、９５℃−５分間ボイルすることで、ブランク溶液を得た。
＜試薬２＞
１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ（同仁化学研究所社製） ｐＨ６．５
１００倍希釈 プロテアーゼ阻害剤カクテル 一般用、１００倍濃縮（ナカライテスク社製）
【００８２】
他方、本発明の多層試験片を、加速試験として、プログラム低温恒温器 ＩＮ６０４（ヤマト科学社製）にて３７℃−５時間インキュベートした。次いで、マイクロチューブ内に前記多層試験片と前記試薬２ １０００μＬとを添加し、ボルテックスミキサー（エムエス機器社製）で１分間攪拌することで、多層試験片中の界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬を抽出した。次いで、前記抽出液をマイクロコン−３（ミリポア社製）にて１４０００Ｇで遠心濃縮し、分子量３０００以下の低分子量成分（界面活性剤、酸化還元系発色試薬等）を除去し、２００μＬの濃縮液を得た。次いで、前記濃縮液 ５０μＬとＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）４７．５μＬと２−メルカプトエタノール（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）２．５μＬとを混合し、９５℃−５分間ボイルすることで、サンプル溶液を得た。
【００８３】
得られたブランク溶液、およびサンプル溶液を、電気泳動ベストパッケージ レディーゲル用（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）を用い、下記条件１でＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。なお、ブランク溶液、およびサンプル溶液は、同一ゲルの別レーンに流した。
＜条件１＞
プレキャストゲル ： レディーゲルＪ １０％Ｔ、１２ｗｅｌｌ
電気泳動システム ： ミニプロティアンＴｅｔｒａセル
パワーサプライ ： パワーパックＢａｓｉｃ
スタンダード ： プレシジョンＰｌｕｓデュアルスタンダード
泳動バッファー ： プレミックスバッファー トリス／グリシン／ＳＤＳ
スタンダード量 ： １０μＬ
泳動試料量 ： ２０μＬ
泳動条件 ： １００Ｖ定電圧−９０分
温度 ： ２５℃
【００８４】
次いで、タイトボックス ＮＯ．３（アズワン社製）に泳動後のゲルと、蒸留水 ２００ｍＬとを添加し、ロッキングミキサー ＲＭ−８０（アズワン社製）で５分間振とう後、蒸留水を除去するという洗浄作業を３回行なった。次いで、染色液 Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ ＣＢＢ Ｇ−２５０ステイン（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）５０ｍＬを添加し、前記ロッキングミキサーで１時間振とう後、前記染色液を除去した。最後に、蒸留水 ２００ｍＬを添加し、前記ロッキングミキサーで１時間振とう後、蒸留水を除去することで、泳動像が得られた。
【００８５】
得られた泳動像中の５０ｋＤａ付近の糖化アミノ酸オキシダーゼ由来のバンド太さ（泳動方向のバンドの寸法）および濃さ（バンドの吸光度）を、ＧＳ−８００ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）で通法に従い測定した。得られたブランクおよびサンプルのバンド太さから下式（１）のバンド保持率１を、ブランクおよびサンプルのバンド濃さから下式（２）のバンド保持率２をそれぞれ算出し、バンド保持率１およびバンド保持率２≧９０％を◎（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、バンド保持率１およびバンド保持率２＜９０％を×（Ｂａｄ）として、糖化アミノ酸オキシダーゼの保存安定性（つまり、耐分解性）を評価した。
［数１］
バンド保持率１（％）＝（サンプルバンド太さ／ブランクバンド太さ）×１００…（１）
［数２］
バンド保持率２（％）＝（サンプルバンド濃さ／ブランクバンド濃さ）×１００…（２）
【００８６】
＜７．酸化還元系発色試薬の保存安定性＞
本発明の多層試験片を、ラミジップ・アルミ ＡＬ−９（東京硝子器械社製）に入れ、窒素封入した後、プログラム低温恒温器 ＩＮ６０４（ヤマト科学社製）にて４℃−０、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、３３６、５０４時間、または２５℃−０、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、３３６、５０４時間インキュベートした。次いで、前記多層試験片を治具（図１参照）で上下から挟んで固定し、酸化還元系発色試薬が担持された層側の反射率を、下記条件２で測定した。
＜条件２＞
装置名 ： 分光光度計 ＵＶ−２４５０（島津製作所社製）
付属装置名 ： 積分球 ＩＳＲ−２２００（島津製作所社製）
標準白板 ： 硫酸バリウム標準白板
測定波長 ： ６６６ｎｍ（ＤＡ６７のλｍａｘ）
入射角 ： ０°
スリット幅 ： ２．０ｎｍ
光束寸法 ： ３ｍｍ×５ｍｍ
温度 ： ２５℃
【００８７】
得られた反射率から、下式（３）のＫｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ変換によりＫ／Ｓ値を算出し、３週間（５０４時間）後のＫ／Ｓ値が、Ｋ／Ｓ値（４℃）≦０．２５かつＫ／Ｓ値（２５℃）≦０．５０を◎（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、０．２５＜Ｋ／Ｓ値（４℃）≦０．３５かつ０．５０＜Ｋ／Ｓ値（２５℃）≦０．６０を○（Ｇｏｏｄ）、０．３５＜Ｋ／Ｓ値（４℃）≦０．４０かつ０．６０＜Ｋ／Ｓ値（２５℃）≦１．３０を△（Ｎｏｔ Ｂａｄ）、０．４０＜Ｋ／Ｓ値（４℃）かつ１．３０＜Ｋ／Ｓ値（２５℃）を×（Ｂａｄ）として、酸化還元系発色試薬の保存安定性（つまり、耐自己発色性）を評価した。なお、酸化還元系発色試薬が自己発色すると、Ｋ／Ｓ値は上昇することは公知である。また、式（３）中の％Ｒは反射率を意味する。
［数３］
Ｋ／Ｓ値＝（１−％Ｒ）２／（２×％Ｒ）…（３）
【００８８】
＜８．プロテアーゼの反応性＞
本発明の多層試験片に、１００ｇ／Ｌのヘモグロビン ヒト Ｈ７３７９（シグマ社製）水溶液 ２０μＬを１層目に点着し、プログラム低温恒温器 ＩＮ６０４（ヤマト科学社製）にて３７℃−０、５、１０、１５、３０、６０分間インキュベートした。次いで、マイクロチューブ内に前記多層試験片と前記試薬２ １０００μＬとを添加し、ボルテックスミキサー（エムエス機器社製）で１分間攪拌することで、多層試験片中の界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬を抽出した。次いで、前記抽出液をマイクロコン−３（ミリポア社製）にて１４０００Ｇで遠心濃縮し、分子量３０００以下の低分子量成分（界面活性剤、酸化還元系発色試薬等）を除去し、２００μＬの濃縮液を得た。次いで、前記濃縮液 ２．５μＬと蒸留水 ４７．５μＬとＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）４７．５μＬと２−メルカプトエタノール（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）２．５μＬとを混合し、９５℃−５分間ボイルすることで、サンプル溶液１〜６を得た。
【００８９】
得られたサンプル溶液１〜６を、電気泳動ベストパッケージ レディーゲル用（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）を用い、前記条件１でＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。なお、サンプル溶液１〜６は、同一ゲルの別レーンに流した。
【００９０】
次いで、タイトボックス ＮＯ．３（アズワン社製）に泳動後のゲルと、蒸留水 ２００ｍＬとを添加し、ロッキングミキサー ＲＭ−８０（アズワン社製）で５分間振とう後、蒸留水を除去するという洗浄作業を３回行なった。次いで、染色液 Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ ＣＢＢ Ｇ−２５０ステイン（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）５０ｍＬを添加し、前記ロッキングミキサーで１時間振とう後、前記染色液を除去した。最後に、蒸留水 ２００ｍＬを添加し、前記ロッキングミキサーで１時間振とう後、蒸留水を除去することで、泳動像が得られた。
【００９１】
得られた泳動像中の１６ｋＤａ付近のヘモグロビン サブユニット由来のバンド太さ（泳動方向のバンド寸法）および濃さ（バンドの吸光度）を、ＧＳ−８００ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）で通法に従い測定した。得られた３７℃−０〜６０分インキュベート後のバンド太さから下式（４）のバンド消失率１を、３７℃−０〜６０分インキュベート後のバンド濃さから下式（５）のバンド消失率２をそれぞれ算出し、バンド消失率１およびバンド消失率２が９０％以上となる時間（以下、バンド消失時間ともいうことがある。）が、０分＜バンド消失時間≦５分を◎（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、５分＜バンド消失時間≦１５分を○（Ｇｏｏｄ）、１５分＜バンド消失時間≦３０分を△（Ｎｏｔ Ｂａｄ）、３０分＜バンド消失時間を×（Ｂａｄ）として、プロテアーゼの反応性を評価した。
［数４］
バンド消失率１（％）
＝｛１−（バンド太さ（０〜６０分）／バンド太さ（０分））｝×１００…（４）
［数５］
バンド消失率２（％）
＝｛１−（バンド濃さ（０〜６０分）／バンド濃さ（０分））｝×１００…（５）
【００９２】
＜９．酸化還元系発色試薬の感度、相関性＞
１００ｇ／Ｌのヘモグロビン ヒト Ｈ７３７９（シグマ社製）水溶液に、合成したフルクトシルバリルヒスチジン（以下、Ｆ−ＶＨともいうことがある。）を、０、５０、１００、２００、５００μＭとなるよう溶解させ、５水準の測定試料を調整した。
次いで、本発明の多層試験片を、治具（図１参照）で上下から挟んで固定し、前記測定検体 ２０μＬを１層目に点着し、室温−１分間インキュベート後、測定試料点着面とは反対面の反射率を、下記条件３で測定した。
＜条件３＞
測定試料 ： ヘモグロビン ヒト Ｈ７３７９ １００ｇ／Ｌ
Ｆ−ＶＨ ０、５０、１００、２００、５００μＭ
カタラーゼ
装置名 ： 分光光度計 ＵＶ−２４５０（島津製作所社製）
付属装置名 ： 積分球 ＩＳＲ−２２００（島津製作所社製）
標準白板 ： 硫酸バリウム標準白板
測定波長 ： ６６６ｎｍ（ＤＡ６７）、７２７ｎｍ（ＤＡ６４）、５５５ｎｍ（ＴＯＯＳ）、６３０ｎｍ（ＭＡＯＳ）
入射角 ： ０°
スリット幅 ： ２．０ｎｍ
光束寸法 ： ３ｍｍ×５ｍｍ
温度 ： ２５℃
【００９３】
得られたＦ−ＶＨ ０〜５００μＭでの反射率から、上式（３）のＫｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ変換により、Ｆ−ＶＨ ０〜５００μＭでのＫ／Ｓ値を得た。得られたＦ−ＶＨ ０μＭでのＫ／Ｓ値と、Ｆ−ＶＨ ５００μＭでのＫ／Ｓ値から、下式（６）のＫ／Ｓ変動率を算出し、Ｋ／Ｓ変動率≧２．０を◎（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、Ｋ／Ｓ変動率＜２．０を×（Ｂａｄ）として、酸化還元系発色試薬の感度を評価した。なお、式（６）中のＫ／Ｓ値（０μＭ）はＦ−ＶＨ ０μＭでのＫ／Ｓ値を、Ｋ／Ｓ値（５００μＭ）はＦ−ＶＨ ５００μＭでのＫ／Ｓ値をそれぞれ意味する。
［数６］
Ｋ／Ｓ変動率＝Ｋ／Ｓ値（５００μＭ） ／ Ｋ／Ｓ値（０μＭ）…（６）
【００９４】
また、得られたＫ／Ｓ値とＦ−ＶＨ濃度とのピアソン相関係数：ｒを算出し、ｒ＞０．９５を◎（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、０．９５≦ｒ＜０．９０を○（Ｇｏｏｄ）、０．９０≦ｒ＜０．８５を△（Ｎｏｔ Ｂａｄ）、ｒ≦０．８５を×（Ｂａｄ）として、相関性を評価した。
【００９５】
＜１０．ヘモグロビンＡ１ｃ値検量線の作成＞
本発明の多層試験片を、治具（図１参照）で上下から挟んで固定し、ＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料 ＱＲＭ ＨｂＡ１ｃ ２００７−１（一般社団法人 検査医学標準物質機構社製）２０μＬを１層目に点着し、プログラム低温恒温器 ＩＮ６０４（ヤマト科学社製）にて３７℃−１５分間インキュベート後、測定試料点着面とは反対面の反射率を、下記条件４で測定した。
＜条件４＞
測定試料 ： ＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料 ＱＲＭ
ＬＥＶＥＬ１、２、３、４、５
装置名 ： 分光光度計 ＵＶ−２４５０（島津製作所社製）
付属装置名 ： 積分球 ＩＳＲ−２２００（島津製作所社製）
標準白板 ： 硫酸バリウム標準白板
測定波長 ： ４８０ｎｍ、６６６ｎｍ
入射角 ： ０°
スリット幅 ： ２．０ｎｍ
光束寸法 ： ３ｍｍ×５ｍｍ
温度 ： ２５℃
【００９６】
得られた４８０ｎｍでの反射率、および６６６ｎｍでの反射率から、上式（３）のＫｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ変換により４８０ｎｍでのＫ／Ｓ値、および６６６ｎｍでのＫ／Ｓ値を得た。次いで、得られた４８０ｎｍでのＫ／Ｓ値と、６６６ｎｍでのＫ／Ｓ値から、下式（７）のＫ／Ｓ比を算出した。なお、Ｋ／Ｓ比とヘモグロビンＡ１ｃ値が比例することは公知である（非特許文献１参照）。また、式中のＫ／Ｓ値（４８０ｎｍ）は４８０ｎｍでのＫ／Ｓ値を、Ｋ／Ｓ値（６６６ｎｍ）は６６６ｎｍでのＫ／Ｓ値をそれぞれ意味する。
［数７］
Ｋ／Ｓ比＝Ｋ／Ｓ値（６６６ｎｍ） ／ Ｋ／Ｓ値（４８０ｎｍ） … （７）
【００９７】
得られたＫ／Ｓ比と、ＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料 ＱＲＭで規定されているＨｂＡ１ｃ値（ＬＥＶＥＬ１＝４．６７％、ＬＥＶＥＬ２＝５．２９％、ＬＥＶＥＬ３＝６．９６％、ＬＥＶＥＬ４＝９．０８％、ＬＥＶＥＬ５＝１０．７９％）とのピアソン相関係数：ｒを算出し、ｒ＞０．９５を◎（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、０．９５≦ｒ＜０．９０を○（Ｇｏｏｄ）、０．９０≦ｒ＜０．８５を△（Ｎｏｔ Ｂａｄ）、ｒ≦０．８５を×（Ｂａｄ）として、相関性を評価した。
【００９８】
＜１１．ヘモグロビンＡ１ｃ値の測定＞
健常者血液に、合成したフルクトシルバリルヒスチジン（以下、Ｆ−ＶＨとも呼称する）を、０、１０、２０、５０、１００μＭとなるよう溶解させ、５水準の測定試料を調整した。
次いで、本発明の多層試験片を、治具（図１参照）で上下から挟んで固定し、前記測定検体 ２０μＬを１層目に点着し、プログラム低温恒温器 ＩＮ６０４（ヤマト科学社製）にて３７℃−１５分間インキュベート後、測定試料点着面とは反対面の反射率を、下記条件５で測定した。なお、健常者血液は、市販の自動分析機：日立自動分析機 ７１８０（日立ハイテク社製）、市販のヘモグロビンＡ１ｃ測定試薬：ノルディアＮ ＨｂＡ１ｃ（積水メディカル社製）を用いて、通法に従い測定を実施し、ヘモグロビンＡ１ｃ値を算出した。
＜条件５＞
測定試料 ： 健常者血液
Ｆ−ＶＨ ０、１０、２０、５０、１００μＭ
装置名 ： 分光光度計 ＵＶ−２４５０（島津製作所社製）
付属装置名 ： 積分球 ＩＳＲ−２２００（島津製作所社製）
標準白板 ： 硫酸バリウム標準白板
測定波長 ： ４８０ｎｍ、６６６ｎｍ
入射角 ： ０°
スリット幅 ： ２．０ｎｍ
光束寸法 ： ３ｍｍ×５ｍｍ
温度 ： ２５℃
【００９９】
得られた４８０ｎｍでの反射率、および６６６ｎｍでの反射率から、上式（３）のＫｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ変換により４８０ｎｍでのＫ／Ｓ値、および６６６ｎｍでのＫ／Ｓ値を得た。次いで、得られた４８０ｎｍでのＫ／Ｓ値と、６６６ｎｍでのＫ／Ｓ値から、上式（７）のＫ／Ｓ比を算出した。得られたＫ／Ｓ比と、前項で得られた検量線から、ヘモグロビンＡ１ｃ値を算出した。得られたＦ−ＶＨ ０μＭを添加した健常者血液のヘモグロビンＡ１ｃ値と、Ｆ−ＶＨ １００μＭを添加した健常者血液のヘモグロビンＡ１ｃ値から、下式（８）のＨｂＡ１ｃ値差を算出し、ＨｂＡ１ｃ値差≦０．５を◎（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、０．５＜ＨｂＡ１ｃ値差≦１．０を○（Ｇｏｏｄ）、１．０＜ＨｂＡ１ｃ値差≦１．５を△（Ｎｏｔ Ｂａｄ）、１．５＜ＨｂＡ１ｃ値差を×（Ｂａｄ）として、測定試料中に存在する可能性のある糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響を評価した。なお、式（８）中のＨｂＡ１ｃ値（０μＭ）はＦ−ＶＨ ０μＭを添加した健常者血液のヘモグロビンＡ１ｃ値を、ＨｂＡ１ｃ値（１００μＭ）はＦ−ＶＨ １００μＭを添加した健常者血液のヘモグロビンＡ１ｃ値をそれぞれ意味する。
［数８］
ＨｂＡ１ｃ値差＝ＨｂＡ１ｃ値（１００μＭ） − ＨｂＡ１ｃ値（０μＭ）…（８）
［試験片の作成］
［実施例１］
【０１００】
８ｍｍφの桐山ろ紙 ＮＯ．５Ａ（東京硝子器械社製）に、下記試薬３を１０μＬ滴下し、次いで別の８ｍｍφの桐山ろ紙 ＮＯ．５Ａ（東京硝子器械社製）に、下記試薬４を１０μＬ滴下し、それぞれ遮光デシケーター ３９０９−０４（東京硝子器械社製）にて２５℃−２時間乾燥させ、単層試験片を２種作製した。得られた２種の単層試験片を積層することで、多層試験片を作製した。なお、担持された界面活性剤濃度は０．１ｍｇ／ｃｍ２、プロテアーゼ濃度は１０Ｕ／ｃｍ２、糖化アミノ酸オキシダーゼ濃度は１０Ｕ／ｃｍ２、ペルオキシダーゼ濃度は４０Ｕ／ｃｍ２、酸化還元系発色試薬濃度は０．１ｍｇ／ｃｍ２である。
【０１０１】
得られた多層試験片の詳細を表１に示す。なお、表中のＮＰ４０はＮｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０が、ＸＩＶはプロテアーゼ Ｔｙｐｅ−ＸＩＶが、ＦＰＯは糖化アミノ酸オキシダーゼ ＦＰＯ−３０１が、ＰＥＯはペルオキシダーゼ ＰＥＯ−３０２が、ＤＡ６７はＤＡ６７が、それぞれ各層に担持されていること意味する。以下、同様である。
＜試薬３＞
１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ（同仁化学研究所社製） ｐＨ６．５
５．０ｍｇ／ｍＬ Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（ナカライテスク社製）
５００Ｕ／ｍＬ 糖化アミノ酸オキシダーゼ ＦＰＯ−３０１（東洋紡績社製）
＜試薬４＞
１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ（同仁化学研究所社製） ｐＨ６．５
５．０ｍｇ／ｍＬ Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（ナカライテスク社製）
５００Ｕ／ｍＬ プロテアーゼ Ｔｙｐｅ−ＸＩＶ（シグマ社製）
２０００Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ ＰＥＯ−３０２（東洋紡績社製）
５．０ｍｇ／ｍＬ ＤＡ６７（和光純薬工業社製）
［実施例２〜４］
【０１０２】
界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬が担持される層が異なる以外は、実施例１と同様にして、多層試験片を作製した。
得られた多層試験片の詳細を表１に示す。
【０１０３】
【表１】
［実施例５］
【０１０４】
８ｍｍφの桐山ろ紙 ＮＯ．５Ａ（東京硝子器械社製）に、下記試薬５を１０μＬ滴下し、次いで別の８ｍｍφの桐山ろ紙 ＮＯ．５Ａ（東京硝子器械社製）に、下記試薬６を１０μＬ滴下し、さらに別の８ｍｍφの桐山ろ紙 ＮＯ．５Ａ（東京硝子器械社製）に、下記試薬７を１０μＬ滴下し、それぞれ遮光デシケーター ３９０９−０４（東京硝子器械社製）にて２５℃−２時間乾燥させ、単層試験片を３種作製した。得られた３種の単層試験片を積層することで、多層試験片を作製した。なお、担持された界面活性剤濃度は０．１ｍｇ／ｃｍ２、プロテアーゼ濃度は１０Ｕ／ｃｍ２、糖化アミノ酸オキシダーゼ濃度１０Ｕ／ｃｍ２、ペルオキシダーゼ濃度は４０Ｕ／ｃｍ２、酸化還元系発色試薬濃度は０．１ｍｇ／ｃｍ２である。
得られた多層試験片の詳細を表２に示す。
＜試薬５＞
１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ（同仁化学研究所社製） ｐＨ６．５
５．０ｍｇ／ｍＬ Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（ナカライテスク社製）
５００Ｕ／ｍＬ 糖化アミノ酸オキシダーゼ ＦＰＯ−３０１（東洋紡績社製）
＜試薬６＞
１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ（同仁化学研究所社製） ｐＨ６．５
５．０ｍｇ／ｍＬ Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（ナカライテスク社製）
５００Ｕ／ｍＬ プロテアーゼ Ｔｙｐｅ−ＸＩＶ（シグマ社製）
＜試薬７＞
１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ（同仁化学研究所社製） ｐＨ６．５
５．０ｍｇ／ｍＬ Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（ナカライテスク社製）
２０００Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ ＰＥＯ−３０２（東洋紡績社製）
５．０ｍｇ／ｍＬ ＤＡ６７（和光純薬工業社製）
［実施例６〜９］
【０１０５】
界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬が担持される層が異なる以外は、実施例５と同様にして、多層試験片を作製した。
得られた多層試験片の詳細を表２に示す。
【０１０６】
【表２】
［比較例１］
【０１０７】
８ｍｍφの桐山ろ紙 ＮＯ．５Ａ（東京硝子器械社製）に、下記試薬８を１０μＬ滴下し、遮光デシケーター ３９０９−０４（東京硝子器械社製）にて２５℃−２時間乾燥させ、単層試験片を作製した。なお、担持された界面活性剤濃度は０．１ｍｇ／ｃｍ２、プロテアーゼ濃度は１０Ｕ／ｃｍ２、糖化アミノ酸オキシダーゼ濃度１０Ｕ／ｃｍ２、ペルオキシダーゼ濃度は４０Ｕ／ｃｍ２、酸化還元系発色試薬濃度は０．１ｍｇ／ｃｍ２である。
得られた単層試験片の詳細を表３に示す。
＜試薬８＞
１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ（同仁化学研究所社製） ｐＨ６．５
５．０ｍｇ／ｍＬ Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（ナカライテスク社製）
５００Ｕ／ｍＬ プロテアーゼ Ｔｙｐｅ−ＸＩＶ（シグマ社製）
５００Ｕ／ｍＬ 糖化アミノ酸オキシダーゼ ＦＰＯ−３０１（東洋紡績社製）
２０００Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ ＰＥＯ−３０２（東洋紡績社製）
５．０ｍｇ／ｍＬ ＤＡ６７（和光純薬工業社製）
【０１０８】
【表３】
［比較例２〜７］
【０１０９】
界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬が担持される層が異なる以外は、実施例１と同様にして、多層試験片を作製した。
得られた多層試験片の詳細を表４に示す。
【０１１０】
【表４】
［比較例８，９］
【０１１１】
界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬が担持される層が異なる以外は、実施例５と同様にして、多層試験片を作製した。
得られた多層試験片の詳細を表５に示す。
【０１１２】
【表５】
【０１１３】
＜糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬の保存安定性＞
実施例１〜９、比較例１〜９の多層試験片を用い、糖化アミノ酸オキシダーゼの保存安定性、酸化還元系発色試薬の保存安定性を評価した。
得られた評価結果を表６、７に示す。
【０１１４】
【表６】
【０１１５】
【表７】
【０１１６】
糖化アミノ酸オキシダーゼの保存安定性の評価結果より、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼが同一層に担持されるとプロテアーゼによる糖化アミノ酸オキシダーゼの失活・分解が生じ、保存安定性は著しく低下した。なお、糖化アミノ酸オキシダーゼの失活・分解により、測定不能となる恐れがある。
また、酸化還元系発色試薬の安定性の評価結果より、ペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬が同一層に担持されると酸化還元系発色試薬の自己発色が生じ、保存安定性は著しく低下した。なお、酸化還元系発色試薬の自己発色により、感度が低下する恐れがある。
以上の結果より、保存安定性に優れた多層試験片の層構成として、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼがそれぞれ異なる層に担持されることが必要であり、例えば実施例１〜９の多層試験片が挙げられる。さらに、ペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されることが好ましく、例えば実施例２、３、６〜９の多層試験片が挙げられる。
［実施例１０〜１３］
【０１１７】
プロテアーゼをＴｙｐｅ−ＸＩＶ（シグマ社製）の代わりに、トヨチームＮＥＰ（東洋紡績社製）、Ｔｙｐｅ−Ｘ（シグマ社製）、プロテイナーゼＫ（ロシュ社製）、Ｔｙｐｅ−ＸＩＩＩ（シグマ社製）とする以外は、実施例２と同様にして、多層試験片を作製した。
得られた多層試験片の詳細を表８に示す。なお、表中のＮＥＰはトヨチームＮＥＰが、ＸはＴｙｐｅ−Ｘが、ＫはプロテイナーゼＫが、ＸＩＩＩはＴｙｐｅ−ＸＩＩＩがそれぞれ各層に担持されていること意味する。
［比較例１０］
【０１１８】
プロテアーゼをＴｙｐｅ−ＸＩＶ（シグマ社製）の代わりに、Ｔｙｐｅ−Ｉ（シグマ社製）とする以外は、実施例２と同様にして、多層試験片を作製した。
得られた多層試験片の詳細を表８に示す。なお、表中のＩはＴｙｐｅ−Ｉが各層に担持されていること意味する。
【０１１９】
【表８】
【０１２０】
＜プロテアーゼの反応性＞
実施例２、１０〜１３、比較例１０の多層試験片を用い、プロテアーゼの反応性を評価した。
得られた評価結果を表９に示す。
【０１２１】
【表９】
【０１２２】
プロテアーゼ反応性の評価結果より、プロテアーゼとしては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼ、およびトリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来プロテアーゼからなる群より選ばれた１種以上であることが好ましい。
［実施例１４］
【０１２３】
酸化還元系発色試薬をＤＡ６７（和光純薬工業社製）：λｍａｘ＝６６６ｎｍの代わりに、ＤＡ６４（和光純薬工業社製）：λｍａｘ＝７２７ｎｍとする以外は、実施例２と同様にして、多層試験片を作製した。
得られた多層試験片の詳細を表１０に示す。なお、表中のＤＡ６４はＤＡ６４が各層に担持されていること意味する。
［比較例１１，１２］
【０１２４】
酸化還元系発色試薬をＤＡ６７（和光純薬工業社製）：λｍａｘ＝６６６ｎｍの代わりに、４ＡＡ（ナカライテスク社製）とＴＯＯＳ（同仁化学研究所社製）：λｍａｘ＝５５５ｎｍ、４ＡＡ（ナカライテスク社製）とＭＡＯＳ（同仁化学研究所社製）：λｍａｘ＝６３０ｎｍとする以外は、実施例２と同様にして、多層試験片を作製した。なお、担持された４ＡＡ濃度は０．０６ｍｇ／ｃｍ２、ＴＯＯＳ濃度は０．０９ｍｇ／ｃｍ２、ＭＡＯＳ濃度は０．０９ｍｇ／ｃｍ２である。
得られた多層試験片の詳細を表１０に示す。なお、表中の４ＡＡは４−アミノアンチピリンが、ＴＯＯＳはＴＯＯＳが、ＭＡＯＳはＭＡＯＳがそれぞれ各層に担持されていること意味する。
【０１２５】
【表１０】
【０１２６】
＜酸化還元系発色試薬の感度、相関性＞
実施例２、１４、比較例１１、１２の多層試験片を用い、酸化還元系発色試薬の感度、相関性を評価した。
得られた評価結果を表１１に示す。
【０１２７】
【表１１】
【０１２８】
酸化還元系発色試薬の感度、相関性の評価結果より、酸化還元系発色試薬としては、モル吸光係数が高く、かつヘモグロビンの色味の影響を受けにくい６５０〜８００ｎｍに極大吸収波長を持つロイコ型色素が好ましい。
［実施例１５〜１７］
【０１２９】
界面活性剤をＮｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（ナカライテスク社製）：ＨＬＢ値＝１７．６の代わりに、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（ナカライテスク社製）：ＨＬＢ値＝１３．５、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（和光純薬工業社製）：ＨＬＢ値＝１６．７、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５（和光純薬工業社製）：ＨＬＢ値＝１６．９とする以外は、実施例１０と同様にして、多層試験片を作製した。
得られた多層試験片の詳細を表１２に示す。なお、表中のＴＸ１００はＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００が、Ｔｗ２０はＴｗｅｅｎ（登録商標）２０が、Ｂｒ３５はＢｒｉｊ（登録商標）３５がそれぞれ各層に担持されていること意味する。
［比較例１３，１４］
【０１３０】
界面活性剤をＮｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（ナカライテスク社製）：ＨＬＢ値＝１７．６の代わりに、ＤＫエステル（登録商標）Ｆ５０（第一工業製薬社製）：ＨＬＢ値＝６．０、ＤＫエステル（登録商標）Ｆ７０（第一工業製薬社製）：ＨＬＢ値＝８．０とする以外は、実施例１０と同様にして、多層試験片を作製した。
得られた多層試験片の詳細を表１２に示す。なお、表中のＦ５０はＤＫエステル（登録商標）Ｆ５０（第一工業製薬社製）が、Ｆ７０はＤＫエステル（登録商標）Ｆ７０がそれぞれ各層に担持されていること意味する。
【０１３１】
【表１２】
【０１３２】
＜プロテアーゼの反応性＞
実施例１０、１５〜１７、比較例１３、１４の多層試験片を用い、プロテアーゼの反応性を評価した。
得られた評価結果を表１３に示す。
【０１３３】
【表１３】
【０１３４】
プロテアーゼ反応性の評価結果より、界面活性剤としては、プロテアーゼ反応促進効果に優れる、ＨＬＢ値が１０〜２０の非イオン性界面活性剤が好ましい。
【０１３５】
＜ヘモグロビンＡ１ｃ値検量線の作成：ＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料＞
実施例１〜４、比較例２の多層試験片を用い、ＨｂＡ１ｃ値の検量線を作成し、相関性を評価した。
得られた評価結果を表１４に示す。
【０１３６】
【表１４】
【０１３７】
＜ヘモグロビンＡ１ｃ値の測定＞
実施例１〜４、比較例２の多層試験片を用い、前項で得られたＨｂＡ１ｃ値の検量線を用い、ＨｂＡ１ｃ値を算出した。
得られた評価結果を表１５に示す。
【０１３８】
【表１５】
【０１３９】
以上の結果より、本発明の多層試験片を用いて測定したヘモグロビンＡ１ｃ値は、生化学自動分析装置を用いて測定したヘモグロビンＡ１ｃ値とよく一致した。さらに、本発明の多層試験片は測定試料中に存在する可能性のある糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響を受けにくく、かつ保存安定性に優れていることから、本発明の多層試験片を用いることで、正確、簡便かつ迅速に測定試料中の糖化ヘモグロビン量を比色定量することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
本発明の多層試験片を用いることにより、診断の現場で正確、簡便かつ迅速に測定試料中の糖化ヘモグロビン量を比色定量することができ、さらには測定試料中に存在する可能性のある糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響を受けにくく、かつ保存安定性にも優れることから、予防医学に基づく臨床検査分野、診断医療分野、製薬分野および保健医学分野をはじめ、生命科学分野の産業界に大きく寄与することが期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断の現場で正確、簡便かつ迅速に測定試料中の糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片、および測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病の診断、予防、および治療を行う上で、糖化タンパク質の測定は非常に重要である。糖化タンパク質は、生体内でグルコースと血中タンパク質のアミノ基（主に、末端アミノ酸のα−アミノ基、リジン残基のγ−アミノ基）とが非酵素的に反応して生成する。タンパク質の糖化の程度は血中グルコース濃度（以下、血糖値という。）に直接比例するため、糖化タンパク質の測定により、例えば糖化ヘモグロビンの場合は約２〜３カ月間、糖化アルブミンの場合は約２〜３週間の血糖コントロール状態を把握することができる。
特に糖化ヘモグロビンの一種であるヘモグロビンＡ１ｃは、糖尿病の診断に際して最も重要であるとされている。
【０００３】
前記糖化タンパク質の測定法としては、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、免疫法、および酵素法などが知られている。従来は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、および免疫法が大部分を占めていたが、近年では大量検体を迅速、大量、正確、安価に測定できることから酵素法も多用され始めている。
【０００４】
酵素法については、例えば、以下の工程を経て糖化タンパク質を比色定量する技術が知られている。（例えば、特許文献１〜４参照）
（１）測定試料中の赤血球を溶血させ、糖化ヘモグロビンを取り出す工程。
（２）前記糖化ヘモグロビンとプロテアーゼを反応させ、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端から糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを切り出す工程。
（３）前記糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドと糖化アミノ酸オキシダーゼを反応させ、過酸化水素を生成する工程。
（４）ペルオキシダーゼ存在下で、前記過酸化水素と酸化還元系発色試薬を反応させ、発色させる工程。
（５）前記発色から測定試料中の糖化ヘモグロビン量を比色定量する工程。
しかし、かかる従来技術は、測定試料中に存在する可能性のある、測定対象である糖化タンパク質に由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響で、見かけ上の測定値が増加してしまうという問題があった。
【０００５】
一方、前記問題点を解消すべく、糖化タンパク質をプロテアーゼで処理する前に、前記測定試料中に存在する可能性のある、糖化タンパク質に由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに、糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させることにより、前記糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを分解処理する前処理工程を含むことを特徴とする糖化タンパク質の含有量を測定する方法の発明がなされた。（例えば、特許文献５〜９）
かかる従来技術は、測定試料を希釈し、液体状態の試薬を添加し、反応容器内で反応させ、反応液の吸光度を測定する方法であり、生化学自動分析装置を用いた方法が主流である。しかし、前記生化学自動分析装置は大型かつ高価である、取扱いには熟練した検査技師が必要である、採血から結果報告までの時間が長い といった問題点があり、ＰＯＣＴ：ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ ｔｅｓｔｉｎｇ（すなわち、臨床現場即時検査）への適用は困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００２−００６５１９号
【特許文献２】特開２００４−２２２５７０号公報
【特許文献３】特開２００７−１８１４６６号公報
【特許文献４】特開２０１０−１４８５１５号公報
【特許文献５】特開２００７−２８９２０２号公報
【特許文献６】特開２０１０−１０４３８６号公報
【特許文献７】特開２０１０−１１０３３３号公報
【特許文献８】特開２０１０−２５２８１４号公報
【特許文献９】特開２０１０−２６３９２１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：１２ ２３９０−２３９６（１９９７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の目的は、診断の現場で正確、簡便かつ迅速に測定試料中の糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片、および測定方法を提供することにある。さらに詳しくは、測定試料中に存在する可能性のある、糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響を受けにくく、かつ保存安定性に優れた、糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片、および測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは糖化アミノ酸オキシダーゼがプロテアーゼより測定試料点着面に近い層に担持されることで、糖化ヘモグロビンをプロテアーゼで切断する前に、測定試料中に存在する可能性のある、糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに糖化アミノ酸オキシダーゼが作用し、前記糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを分解処理し得ることを見出した。
また、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼが同一層に担持されると、保存中にプロテアーゼによる糖化アミノ酸オキシダーゼの失活・分解が生じ、保存安定性が著しく低下することを見出した。
さらには、ペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬が同一層に担持されると、保存中にペルオキシダーゼによる酸化還元系発色試薬の自己発色が生じ、保存安定性が著しく低下することを見出した。測定試料中の糖化ヘモグロビン濃度は、グルコース濃度等に比べると一般的に低濃度であるため、糖化ヘモグロビンの測定には、高感度であるロイコ型色素を使用するのが好ましいが、ロイコ色素は特に不安定であり、自己発色を生じやすい。
【００１０】
そこで本発明者らは、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼを異なる層に担持させ、かつ糖化アミノ酸オキシダーゼをプロテアーゼより測定試料点着面に近い層に担持させた。これにより、測定試料中に存在する可能性のある、糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響を受けにくくなると共に、糖化アミノ酸オキシダーゼの保存安定性が著しく向上することも見出し、本発明に至った。加えて、ペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬をそれぞれ異なる層に担持させることにより、酸化還元系発色試薬の保存安定性を向上させることも同時に成功し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
１． 糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片であって、
少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層の順に積層されており、
かつ血液分離層を有さないことを特徴とする多層試験片。
（ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
（ｂ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
２． 糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片であって、
少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層の順に積層されており、
（ａ）層および（ｂ）層に、ペルオキシダーゼおよび酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されており、
かつ血液分離層を有さないことを特徴とする多層試験片。
（ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
（ｂ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
３． さらに、（ａ）層と（ｂ）層との少なくとも一層に、界面活性剤が担持されることを特徴とする１．または２．の多層試験片。
４． 糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片であって、
少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層と（ｃ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層／（ｃ）層、（ａ）層／（ｃ）層／（ｂ）層、または（ｃ）層／（ａ）層／（ｂ）層の順に積層されており、
かつ血液分離層を有さないことを特徴とする多層試験片。
（ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
（ｂ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
（ｃ）層：少なくともプロテアーゼおよび糖化アミノ酸オキシダーゼ以外の任意の試薬が担持された高分子基材
５． 糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片であって、
少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層と（ｃ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層／（ｃ）層、（ａ）層／（ｃ）層／（ｂ）層、または（ｃ）層／（ａ）層／（ｂ）層の順に積層されており、
（ａ）層と（ｂ）層と（ｃ）層とのいずれかに、ペルオキシダーゼおよび酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されており、
かつ血液分離層を有さないことを特徴とする多層試験片。
（ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
（ｂ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
（ｃ）層：少なくともプロテアーゼおよび糖化アミノ酸オキシダーゼ以外の任意の試薬が担持された高分子基材
６． さらに、（ａ）層と（ｂ）層と（ｃ）層との少なくとも一層に、界面活性剤が担持されることを特徴とする４．または５．の多層試験片。
７． プロテアーゼが、少なくともバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼ、およびトリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来プロテアーゼからなる群より選ばれた１種以上であることを特徴とする１．から６．いずれかの多層試験片。
８． 酸化還元系発色試薬が、極大吸収波長が６００〜８００ｎｍのロイコ型色素であることを特徴とする１．から７．いずれかの多層試験片。
９． 界面活性剤が、親水親油バランス値（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ Ｂａｌａｎｃｅ ｖａｌｕｅ：ＨＬＢ値）が１０〜２０の非イオン性界面活性剤であることを特徴とする１．から８．いずれかの多層試験片。
１０． １．から９．いずれかの多層試験片を用い、少なくとも下記工程（ｉ）から（iii）を経て、糖化ヘモグロビン量を比色定量する測定方法。
工程（ｉ）：前記多層試験片の上面に測定試料を点着させる工程
工程（ii）：前記多層試験片の測定試料点着面とは反対面から、反射光を用いて反射率および／または吸光度を測定する工程
工程（iii）：得られた反射率および／または吸光度からヘモグロビン量、糖化ヘモグロビン量、糖化ヘモグロビン量のヘモグロビン量に対する割合からなる群より選ばれた１つ以上を算出する工程
１１． 測定試料が全血検体であることを特徴とする１０．の測定方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、測定試料中に存在する可能性のある糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響を受けにくく、かつ保存安定性に優れた糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例において使用した、試験片を上下から挟んで固定するための板状の治具である。本治具には、２つの穿孔を設けている。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳述する。
（測定対象物）
本発明における測定対象物は、糖化ヘモグロビンであり、糖尿病診断への応用の観点から、ヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端が糖化されたヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃともいうことがある。）が好ましい。なお、測定対象物である糖化へモグロビンに由来する糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを測定対象糖化物といい、測定対象物である糖化へモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドを非測定対象糖化物ともいうことがある。
【００１５】
（測定試料）
本発明における測定試料としては、全血、血球、血漿、血清、髄液、汗、尿、涙液、唾液、皮膚、粘膜、毛髪等の生体試料（すなわち生体から採取された試料）や、飲料水、調味料等の食品類が挙げられる。また、生体試料はヒト由来に限らず、イヌ、ネコ、ウシ等の哺乳類動物由来の生体試料も対象である。これら中でも、糖尿病診断への応用の観点から、全血または血球が好ましく、ＰＯＣＴの観点から、前処理として血球／血漿または血清分離を行わない全血がより好ましい。
【００１６】
本発明における測定試料の量は、特に限定されないが、例えば１〜５０μＬが好ましく、１〜４０μＬがより好ましく、１〜３０μＬがさらに好ましい。測定試料量が１μＬより少ないと、多層試験片の最上層から最下層まで展開できない恐れがある。一方、測定試料量が５０μＬより多いと、例えば測定試料が血液の場合、患者の負担が大きくなるため好ましくない。
【００１７】
（測定原理）
本発明における糖化ヘモグロビンの測定原理は、酵素反応を測定試料中の水分によって行う（いわゆる、ドライケミストリー）ことで多層試験片を呈色させ、その呈色の程度を反射光測定によって検知する方法（いわゆる、酵素比色法）によって行なわれる。前記測定原理を用いることで、装置の小型・軽量・低価格化が可能となる。また、正確、簡便かつ迅速な測定が可能となる。
【００１８】
以下に赤血球中の糖化ヘモグロビン量を測定する場合の反応について説明するが、本発明を何ら限定するものではない。
（１）測定試料中の赤血球と界面活性剤を反応させ、溶血させ、糖化ヘモグロビンを取り出す工程。
（２）非測定対象糖化物と糖化アミノ酸オキシダーゼを反応させ、非測定対象糖化物の影響を低減する工程。
（３）前記糖化ヘモグロビンとプロテアーゼを反応させ、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端から測定対象糖化物を切り出す工程。
（４）前記測定対象糖化物と糖化アミノ酸オキシダーゼを反応させ、過酸化水素を生成する工程。
（５）ペルオキシダーゼ存在下で、前記過酸化水素と酸化還元系発色試薬を反応させ、発色させる工程。
（６）前記発色から測定試料中の糖化ヘモグロビン量を比色定量する工程。
【００１９】
（多層試験片）
本発明の多層試験片は、複数の高分子基材（以下、層ともいうことがある。）からなる。前記多層試験片の層数は、実施形態に合わせて変化し得るが、２〜７層が好ましく、２〜６層がより好ましく、２〜５層がさらに好ましい。なお、層数には、本発明に必要な試薬（界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬等）が担持された高分子基材に加え、血液を展開するための展開層や透明支持層なども含む。層数が１層だと、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼとを同一層に担持せざるを得なくなり、非測定対象糖化物の影響を低減する工程を経ることが困難となる。さらに、層数が１層だと、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼ、およびペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬等を同一層に担持せざるを得なくなり、プロテアーゼによる糖化アミノ酸オキシダーゼの失活・分解や、酸化還元系発色試薬の自己発色が生じる恐れがある。つまり、多層試験片の保存安定性が著しく低下する恐れがある。一方、層数が７層より多いと、最上層から最下層まで展開するのに必要な測定試料量が多くなるため、好ましくない。
【００２０】
前記多層試験片は、任意の手順を用いて作製することができる。典型的には、複数の層を別個に、一種以上の試薬溶液に浸漬し、乾燥する慣用の手順を用いることにより作製し、次いで最終的な試験片に組み立てることができる。
【００２１】
前記多層試験片には、血液分離層を有さないことを特徴とする。なお、血液分離層とは全血から血球をろ別することで血漿または血清を得るための層を意味する。本発明における測定対象物は、血漿または血清中に含まれる糖化アルブミンではなく、血球中に含まれる糖化ヘモグロビンであるため、血球をろ別すると測定不可能となる。
【００２２】
（層構成）
前記多層試験片の層構成は、糖化アミノ酸オキシダーゼがプロテアーゼより測定試料点着面に近い層（以下、上層ともいうことがある。）に担持されることが必要である。糖化アミノ酸オキシダーゼがプロテアーゼよりも測定試料点着面から遠い層（以下、下層ともいうことがある。）に担持されると、非測定対象糖化物の影響を低減する工程を経ることが不可能となる。
【００２３】
また、前記多層試験片の層構成は、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼがそれぞれ異なる層に担持されることが必要であり、さらにペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されることが好ましい。プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼが同一層に担持されるとプロテアーゼによる糖化アミノ酸オキシダーゼの失活・分解が生じる恐れがあり、ペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬が同一層に担持されると酸化還元系発色試薬の自己発色が生じる恐れがある。つまり、多層試験片の保存安定性が著しく低下する恐れがある。以下に層構成の具体例を示すが、本発明を何ら限定するものではない。
【００２４】
前記多層試験片は、１層目の側が測定試料点着面、２層目の側が反射光測定面とすると、糖化アミノ酸オキシダーゼがプロテアーゼよりも上層に担持された以下の構成が挙げられる。
１．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬』
２．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬』
３．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、２層目：プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ』
４．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、２層目：プロテアーゼ』
【００２５】
これらの中でも、さらにペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されている以下の構成が好ましい。
２．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬』
３．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、２層目：プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ』
【００２６】
さらに酸化還元系発色試薬が反射光測定面（２層目）に担持されており、高感度な測定が期待できる以下の構成がより好ましい。
２．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬』
【００２７】
前記多層試験片は、１層目の側が測定試料点着面、３層目の側が反射光測定面とすると、糖化アミノ酸オキシダーゼがプロテアーゼよりも上層に担持された以下の構成が挙げられる。
１．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、３層目：ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬』
２．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：ペルオキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬』
３．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：酸化還元系発色試薬、３層目：プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ』
４．『１層目：ペルオキシダーゼ、２層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬』
５．『１層目：酸化還元系発色試薬、２層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ』
６．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、３層目：酸化還元系発色試薬』
７．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬、３層目：ペルオキシダーゼ』
８．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、３層目：プロテアーゼ』
９．『１層目：ペルオキシダーゼ、２層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、３層目：プロテアーゼ』
１０．『１層目：酸化還元系発色試薬、２層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ』
１１．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、３層目：酸化還元系発色試薬』
１２．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、２層目：プロテアーゼ、３層目：ペルオキシダーゼ』
１３．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、２層目：酸化還元系発色試薬、３層目：プロテアーゼ』
１４．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、２層目：ペルオキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ』
１５．『１層目：ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、２層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ』
【００２８】
これらの中でも、さらにペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されている以下の構成が好ましい。
２．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：ペルオキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬』
３．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：酸化還元系発色試薬、３層目：プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ』
４．『１層目：ペルオキシダーゼ、２層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬』
５．『１層目：酸化還元系発色試薬、２層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ』
６．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、３層目：酸化還元系発色試薬』
７．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬、３層目：ペルオキシダーゼ』
９．『１層目：ペルオキシダーゼ、２層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、３層目：プロテアーゼ』
１０．『１層目：酸化還元系発色試薬、２層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ』
１１．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、３層目：酸化還元系発色試薬』
１２．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、２層目：プロテアーゼ、３層目：ペルオキシダーゼ』
１３．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、２層目：酸化還元系発色試薬、３層目：プロテアーゼ』
１４．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬、２層目：ペルオキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ』
【００２９】
さらに酸化還元系発色試薬が反射光測定面（３層目）に担持されており、高感度な測定が期待できる以下の構成がより好ましい。
２．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：ペルオキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬』
４．『１層目：ペルオキシダーゼ、２層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、３層目：プロテアーゼ、酸化還元系発色試薬』
６．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、３層目：酸化還元系発色試薬』
１１．『１層目：糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、２層目：プロテアーゼ、３層目：酸化還元系発色試薬』
【００３０】
前記の各層（１層目、２層目、３層目）の少なくとも一層に、さらに界面活性剤が担持されるのが好ましい。また、前記試薬（界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬等）は、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼ、およびペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬が同層に存在しない限り、各層（１層目、２層目、３層目）に重複して担持されてもよい。加えて、各層には緩衝剤を必要に応じて担持させることができる。
【００３１】
（高分子基材）
本発明の多層試験片を構成する高分子基材としては、前記試薬（界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬等）を必要量担持でき、かつ測定試料を水平方向および垂直方向に適切に展開できれば、いかなる形態、組成のものを用いてもよい。以下に高分子基材の形態、組成の具体例を示すが、本発明を何ら限定するものではない。
【００３２】
（形態）
前記高分子基材の形態としては、ろ紙、繊維構造体、多孔質膜（メンブレンフィルター）、フィルム等の自立可能なものや、高分子ゲル等の自立不可能なものが挙げられる。なお、高分子ゲル等の自立不可能なものを用いる際は、ろ紙、繊維構造体、多孔質膜（メンブレンフィルター）、フィルム等の自立可能なものを支持体として設けるのが好ましい。
【００３３】
（組成）
前記高分子基材の組成としては、ポリエステル樹脂であるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ポリブチレンナフタレート（ＰＢＮ）等、オレフィン樹脂であるポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリブテン等、ビニル樹脂であるポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル等、アクリル樹脂、アクリレート樹脂、フッ素樹脂であるポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）等、ポリカーボネート樹脂、ポリエーテル樹脂であるポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、ポリフェニレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリエーテルケトン（ＰＥＫ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリフェニレンスルフィド（ＰＰＳ）、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）等、ポリアミド樹脂であるナイロン、アラミド等、セルロース類であるセルロースアセテート、ニトロセルロース、再生セルロース等が挙げられる。
【００３４】
前記高分子基材の形状は、特に限定されないが、例えば正方形、長方形、円形、楕円形等の薄板状が挙げられる。
前記高分子基材の面積は、装置の小型・軽量・低価格化の観点から小さければ小さいほどよいが、例えば１〜１０００ｍｍ２が好ましく、２〜５００ｍｍ２がより好ましく、５〜２００ｍｍ２がさらに好ましい。
前記高分子基材の（１層の）厚みは、測定試料の展開性、および酵素（プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ）反応性の観点から、例えば１０〜２０００μｍが好ましく、２０〜１０００μｍがより好ましく、５０〜５００μｍがさらに好ましい。
【００３５】
（検出）
反応の検出には、発色した多層試験片に対して光（入射光）をあて、その反射光を検出することが最も簡便であるが、これ以外の方法を用いても良い。光源としては、特に限定されないが、例えばＵＶランプ、キセノンランプ、クリプトンランプ、水銀ランプ、重水素ランプ、タングステンランプ、ハロゲンランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザー等が挙げられる。これらの中でも、光波長の制御の容易さ、装置の小型・軽量・低価格化の観点から、発光ダイオード（ＬＥＤ）が好ましい。前記入射光の角度（入射角）は、特に限定されず、任意の角度を用いることができる。一方、反射光の検出は、特に限定されないが、検出面に対して垂直が好ましい。なお、検出には、フォトダイオードや積分球等を用いれば簡便に行う事ができる。
【００３６】
（プロテアーゼ）
本発明に用いるプロテアーゼとしては、糖化ヘモグロビンの糖化されたβ鎖Ｎ末端に作用して測定対象糖化物を切り出すものであれば、いかなる種類のプロテアーゼを用いてもよく、例えば動物、植物、微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。以下にプロテアーゼの具体例を示すが、本発明を何ら限定するものではない。
【００３７】
（動物由来プロテアーゼ）
動物由来のプロテアーゼとしては、ファクターＸａ（ｆａｃｔｏｒＸａ）、プラスミン（ｐｌａｓｍｉｎ）、スロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、ペプシン（ｐｅｐｓｉｎ）、ロイシンアミノペプチダーゼ（ｌｅｕｃｉｎａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、パンクレアチン（ｐａｎｃｒｅａｔｉｎ）、エラスターゼ（ｅｌａｓｔａｓｅ）、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）、キモトリプシンＡ（ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎＡ）、アミノペプチダーゼＭ（ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＭ）、カルボキシペプチダーゼＡ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＡ）、カルボキシペプチダーゼＢ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＢ）、カルパイン（ｃａｌｐａｉｎ）、カテプシンＢ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎＢ）、カテプシンＣ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎＣ）、カテプシンＤ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎＤ）、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＡｒｇ−Ｃ）等が挙げられる。
【００３８】
（植物由来プロテアーゼ）
植物由来のプロテアーゼとしては、カルボキシペプチダーゼＷ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＷ）、カリクレイン（ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ）、フィシン（ｆｉｃｉｎ）、パパイン（ｐａｐａｉｎ）、キモパパイン（ｃｈｉｍｏｐａｐａｉｎ）、ブロメライン（ｂｒｏｍｅｌａｉｎ）等が挙げられる。
【００３９】
（微生物由来プロテアーゼ）
微生物由来のプロテアーゼとしては、ズブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、サーモリシン（ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）、ディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）、プロテイナーゼＮ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＮ）等に代表されるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、ＩＰ酵素等に代表されるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、プロナーゼ（ｐｒｏｎａｓｅ）等に代表されるストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼ、プロテイナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）等に代表されるトリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来プロテアーゼ、ペプチダーゼＲ（ｐｅｐｔｉｄａｓｅＲ）等に代表されるリゾバス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）由来プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼＰ、（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＰ）、ＰＤ酵素等に代表されるペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＧｌｕ−Ｃ）等に代表されるスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）由来プロテアーゼ、クロストリパイン（ｃｌｏｓｔｒｉｐａｉｎ）等に代表されるクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＬｙｓ−Ｃ）等に代表されるリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）由来プロテアーゼ、メタロエンドペプチダーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｅｎｄｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ）等に代表されるグリフォラ（Ｇｒｉｆｏｌａ）由来プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼＹ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＹ）、プロテイナーゼＡ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＡ）等に代表される酵母（Ｙｅａｓｔ）由来プロテアーゼ、アミノペプチダーゼＴ（ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＴ）等に代表されるサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＡｓｐ−Ｎ）等に代表されるシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ）由来プロテアーゼ、リジルエンドペプチダーゼ（ｌｙｓｙｌｅｎｄｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ）、アクロモペプチダーゼ（ａｃｈｒｏｍｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ）等に代表されるアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）由来プロテアーゼ等が挙げられる
【００４０】
これらの中でも、安定性、反応性（ヘモグロビンの切断速度）、入手の容易性、価格等の理由から、微生物由来のプロテアーゼが好ましく、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼ、およびトリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来プロテアーゼからなる群より選ばれた１種以上であることがより好ましい。市販品としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼのトヨチームＮＥＰ（東洋紡績社製）、Ｔｙｐｅ−Ｘ（シグマ社製）、Ｔｙｐｅ−ＸＸＩＶ（シグマ社製）、サーモリシン（大和化成社製）、サモアーゼＰＣ１０（大和化成社製）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼのＴｙｐｅ−ＸＩＩＩ（シグマ社製）、Ｔｙｐｅ−ＸＸＩＩＩ（シグマ社製）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼのＴｙｐｅ−ＸＩＶ、トリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来プロテアーゼのプロテイナーゼＫ（ロシュ社製）等が好適に用いられる。
【００４１】
これらの中でも、ヘモグロビンＡ１ｃ測定の観点から、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼのトヨチームＮＥＰ（東洋紡績社製）、Ｔｙｐｅ−Ｘ（シグマ社製）、Ｔｙｐｅ−ＸＸＩＶ（シグマ社製）、サーモリシン（大和化成社製）、サモアーゼＰＣ１０（大和化成社製）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼのＴｙｐｅ−ＸＩＶがより好適に用いられる。
【００４２】
前記プロテアーゼは、目的とする活性が発現すれば精製物であっても粗精製物であってもよい。また、遺伝子操作により作られたものでもよく、化学修飾の有無も問わない。さらに、前記プロテアーゼは単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４３】
前記プロテアーゼの濃度は、特に限定されないが、０．１〜１００００Ｕ／ｃｍ２であることが好ましく、１〜１０００Ｕ／ｃｍ２がより好ましい。プロテアーゼ濃度が０．１Ｕ／ｃｍ２より少ないと、反応性の低下により測定時間が長くなるため好ましくない。一方、プロテアーゼ濃度が１００００Ｕ／ｃｍ２より多いと、バッククラウンドの上昇や、高価格化の恐れがある。
【００４４】
前記プロテアーゼの反応を行う際のｐＨは、無調整でもよいが、使用するプロテアーゼの至適ｐＨとなるよう適当なｐＨ調整剤、例えば下記の緩衝剤によって調整するのが好ましい。
【００４５】
（糖化アミノ酸オキシダーゼ）
本発明に用いる糖化アミノ酸オキシダーゼ（以下、ＦＡＯＤともいうことがある。）は、公知文献では「フルクトシルアミンオキシダーゼ」「フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ」「フルクトシルペプチドオキシダーゼ」「フルクトシルアミン酸化酵素」「フルクトシルアミノ酸酸化酵素」「フルクトシルペプチド酸化酵素」「糖化アミンオキシダーゼ」「糖化アミノ酸オキシダーゼ」「糖化ペプチドオキシダーゼ」「糖化アミン酸化酵素」「糖化アミノ酸酸化酵素」「糖化ペプチド酸化酵素」「アマドリアーゼ」「ケトアミンオキシダーゼ」「ケトアミン酸化酵素」等、種々の名称で呼ばれている。
【００４６】
本発明に用いる糖化アミノ酸オキシダーゼとしては、測定対象糖化物または非測定対象糖化物に特異的に作用し、過酸化水素を生成する酵素であれば、いかなる種類の酵素を用いてもよい。以下に糖化アミノ酸オキシダーゼの具体例を示すが、本発明を何ら限定するものではない。
【００４７】
糖化アミノ酸オキシダーゼとしては、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）由来酵素、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来酵素、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）由来酵素、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）由来酵素、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来酵素、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）由来酵素、ユウペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）由来酵素、アカエトミエラ（Ａｃｈａｅｔｏｍｉｅｌｌａ）由来酵素、カエトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）由来酵素、大腸菌由来酵素、酵母属デバリオマイゼス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）由来酵素、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）由来酵素、ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）由来酵素、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来酵素、ファエオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）由来酵素、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）由来酵素、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）由来酵素等が挙げられる。
【００４８】
これらの中でも、安定性、反応性（測定対象糖化物または非測定対象糖化物の酸化速度）、入手の容易性、価格等の理由から、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）由来酵素、ユウペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）由来酵素、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）由来酵素、ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）由来酵素、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来酵素、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来酵素、ファエオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）由来酵素からなる群より選ばれた１種以上であることが好ましく、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）由来酵素、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来酵素、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来酵素、ファエオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）由来酵素からなる群より選ばれた１種以上であることがより好ましい。
【００４９】
これらの中でも、ヘモグロビンＡ１ｃ測定の観点から、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）由来酵素、ファエオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）由来酵素からなる群より選ばれた１種以上であることがさらに好ましい。
【００５０】
前記糖化アミノ酸オキシダーゼは、目的とする活性が発現すれば精製物であっても粗精製物であってもよい。また、遺伝子操作により作られたものでもよく、化学修飾の有無も問わない。さらに、前記糖化アミノ酸オキシダーゼは単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５１】
前記糖化アミノ酸オキシダーゼの濃度は、特に限定されないが、０．０１〜１０００Ｕ／ｃｍ２であることが好ましく、０．１〜１００Ｕ／ｃｍ２がより好ましい。糖化アミノ酸オキシダーゼ濃度が０．０１Ｕ／ｃｍ２より少ないと、反応性の低下により測定時間が長くなるため好ましくない。一方、糖化アミノ酸オキシダーゼ濃度が１０００Ｕ／ｃｍ２より多いと、バッククラウンドの上昇や、高価格化の恐れがある。
【００５２】
前記糖化アミノ酸オキシダーゼの反応を行う際のｐＨは、無調整でもよいが、使用する糖化アミノ酸オキシダーゼの至適ｐＨとなるよう適当なｐＨ調整剤、例えば後述の緩衝剤によって調整するのが好ましい。
【００５３】
（ペルオキシダーゼ）
本発明に用いるペルオキシダーゼとしては、過酸化水素と酸化還元系発色試薬との反応を触媒する酵素であれば、いかなる種類の酵素を用いてもよく、例えば植物由来、細菌由来、担子菌由来のペルオキシダーゼが挙げられる。これらの中でも、純度、入手の容易性、価格等の理由から、西洋ワサビ、イネ、大豆由来のペルオキシダーゼが好ましく、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼがより好ましい。市販品としては、ＰＥＯ−１３１（東洋紡績社製）、ＰＥＯ−３０１（東洋紡績社製）、ＰＥＯ−３０２（東洋紡績社製）等が好適に用いられる。
【００５４】
前記ペルオキシダーゼの濃度は、特に限定されないが、０．０１〜１０００Ｕ／ｃｍ２であることが好ましく、０．１〜１００Ｕ／ｃｍ２がより好ましい。ペルオキシダーゼ濃度が０．０１Ｕ／ｃｍ２より少ないと、反応性の低下により測定時間が長くなるため好ましくない。一方、ペルオキシダーゼ濃度が１０００Ｕ／ｃｍ２より多いと、バッククラウンドの上昇や、高価格化の恐れがある。
【００５５】
前記ペルオキシダーゼの反応を行う際のｐＨは、無調整でもよいが、使用するペルオキシダーゼの至適ｐＨとなるよう適当なｐＨ調整剤、例えば後述の緩衝剤によって調整するのが好ましい。
【００５６】
（酸化還元系発色試薬）
本発明に用いる酸化還元系発色試薬としては、過酸化水素と反応して呈色するものであれば、いかなる種類の色素を用いてもよく、例えば水素供与体とカップラー、ロイコ体等が挙げられる。なお、水素供与体とカップラーを用いた代表例は、水素供与体とカップラーとをペルオキシダーゼの存在下に過酸化水素によって酸化縮合させて色素を形成させるトリンダー（Ｔｒｉｎｄｅｒ）法である。
以下に酸化還元系発色試薬の具体例を示すが、本発明を何ら限定するものではない。
【００５７】
（水素供与体）
水素供与体としては、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等が挙げられる。具体的には、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン等が挙げられる。
【００５８】
（カップラー）
カップラーとしては、４−アミノアンチピリン（４ＡＡ）、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等が挙げられる。
【００５９】
（ロイコ体）
ロイコ体としては、トリフェニルメタン誘導体、フェノチアジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体等が挙げられる。具体的には、４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）、４，４’−ビス［Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピルアミノ）−２，６−ジメチルフェニル］メタン、１−（エチルアミノチオカルボニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩（ＤＡ６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩（ＤＡ６７）等が挙げられる。
【００６０】
これらの中でも、モル吸光係数、極大吸収波長等の理由から、ロイコ体が好ましく、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩（ＤＡ６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩（ＤＡ６７）がより好ましい。
【００６１】
前記酸化還元系発色試薬の極大吸収波長は、６００〜８００ｎｍであることが好ましく、６５０〜７５０ｎｍがより好ましい。ヘモグロビンＡ１ｃ測定の観点から、極大吸収波長が６００ｎｍより低波長側であると、酸化還元系発色試薬の発色スペクトルとヘモグロビンのスペクトルとが重なるため、感度が低下する恐れがある。一方、極大吸収波長が８００ｎｍより高波長側であると、検出機器が大型化する恐れがある。
【００６２】
前記酸化還元系発色試薬の濃度は、特に限定されないが、０．０００１〜１０ｍｇ／ｃｍ２であることが好ましく０．００１〜１ｍｇ／ｃｍ２がより好ましい。酸化還元系発色試薬濃度が０．０００１ｍｇ／ｃｍ２より少ないと、感度が低下する恐れがある。一方、酸化還元系発色試薬濃度が１０ｍｇ／ｃｍ２より多いと、バッククラウンドの上昇や、高価格化の恐れがある。
【００６３】
（界面活性剤）
本発明に用いる界面活性剤としては、溶血剤および／またはプロテアーゼ反応促進剤として作用すれば、いかなる種類の界面活性剤を用いてもよいが、溶血剤およびプロテアーゼ反応促進剤として作用する界面活性剤が好ましい。前記界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、ショ糖脂肪酸エステル等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。これらの中でも、溶血剤としての反応性（溶血の速度）、プロテアーゼ反応促進剤としての作用性、価格等の理由からポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤等）が好ましい。市販品としては、ＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）−１００（ナカライテスク社製）、ＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）−１１４（ナカライテスク社製）、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（ナカライテスク社製）等が好適に用いられる。また、前記界面活性剤は単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００６４】
前記界面活性剤の親水親油バランス値（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ Ｂａｌａｎｃｅ ｖａｌｕｅ：ＨＬＢ値）は、１０〜２０であることが好ましく、１２〜２０がより好ましく、１４〜２０がさらに好ましい。ＨＬＢ値が１０より小さいと、十分な溶血効果、およびプロテアーゼ反応促進効果が得られない恐れがある。一方、ＨＬＢ値が２０より大きい界面活性剤は、ＨＬＢの定義上存在しない。
【００６５】
前記界面活性剤の濃度は、特に限定されないが、０．０００１〜１０ｍｇ／ｃｍ２であるとこが好ましく０．００１〜１ｍｇ／ｃｍ２がより好ましい。界面活性剤濃度が０．０００１ｍｇ／ｃｍ２より少ないと、十分な溶血効果、およびプロテアーゼ反応促進効果が得られない恐れがある。一方、界面活性剤濃度が１０ｍｇ／ｃｍ２より多くしても、効果の向上は見られない。
【００６６】
本発明の非測定対象糖化物と糖化アミノ酸オキシダーゼを反応させ、非測定対象糖化物の影響を低減する工程にて発生する過酸化水素は、測定試料中が全血である場合は、全血中のカタラーゼによって酸素と水に分解されるが、必要に応じてカタラーゼを添加してもよい。
【００６７】
本発明に用いるカタラーゼとしては、非測定対象糖化物を消去する際に生成する過酸化水素を不均化して酸素と水に分解する反応を触媒する酵素であれば、いかなる種類の酵素を用いてもよく、例えば動物由来、微生物由来のカタラーゼが挙げられる。これらの中でも、純度、入手の容易性、価格等の理由から、微生物由来のカタラーゼが好ましい。市販品としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来カタラーゼ Ｃ３５１５（シグマ社製）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来カタラーゼ ０２０７１（シグマ社製）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属由来カタラーゼ ６０６３８（シグマ社製）等が好適に用いられる。
【００６８】
前記カタラーゼの濃度は、特に限定されないが、０．１〜１００００Ｕ／ｃｍ２であることが好ましく、１〜１０００Ｕ／ｃｍ２がより好ましい。カタラーゼ濃度が０．１Ｕ／ｃｍ２より少ないと、非測定対象糖化物を消去する際に生成する過酸化水素を除去できず、見かけ上の測定値が増加してしまう恐れがある。一方、カタラーゼ濃度が１００００Ｕ／ｃｍ２より多いと、バッククラウンドの上昇や、高価格化の恐れがある。前記カタラーゼの反応を行う際のｐＨは、無調整でもよいが、使用するペルオキシダーゼの至適ｐＨとなるよう適当なｐＨ調整剤、例えば下記の緩衝剤によって調整するのが好ましい。
【００６９】
前記カタラーゼの反応後、カタラーゼの影響を排除するため、カタラーゼよりも下層にアジ化ナトリウムなどのカタラーゼ阻害剤を担持させてもよい。あるいは、カタラーゼとペルオキシダーゼの基質に対する親和性の違いを利用して、カタラーゼとペルオキシダーゼとの濃度比率を適切に設定することにより、カタラーゼよりも下層にカタラーゼ阻害剤を担持させない構成も可能である。
【００７０】
（緩衝剤）
本発明に用いることができる緩衝剤としては、目的とするｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、グッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン）等が挙げられる。
【００７１】
これらの中でも、本発明に用いるプロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、およびペルオキシダーゼの至適ｐＨ範囲である６．０〜８．５（好ましくは６．０〜７．５）において充分な緩衝能力を有する等の理由から、トリス、リン酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳが好ましく、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳがより好ましい。
【００７２】
前記緩衝剤の濃度は、特に限定されないが、多層試験片作製時の試薬に対して５０〜１００ｍＭ程度が好ましい。
【００７３】
（その他試薬）
本発明では前記試薬（界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬等）の他、必要に応じてヘモグロビンの酸化剤（フェロシアン化物、アジ化物、亜硝酸塩、硝酸塩等）、酵素反応を妨害するイオンを捕捉するキレート試薬（エチレンジアミン、ビピリジン、エチレンジアミン四酢酸、フェナントロリン、ポルフィリン、クラウンエーテル等）、過酸化水素の定量の妨害物質であるアスコルビン酸を消去するアスコルビン酸オキシダーゼ、塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化アルミニウム等）、酵素安定化剤（単糖類、オリゴ糖類、多糖類、糖アルコール、グリセロール、グルコン酸塩、アミノ酸類、アルブミン類、グロブリン類、繊維性タンパク質等）、酸化還元系発色試薬安定化剤（シクロデキストリン類、還元性チオアルコール類、還元性硫酸塩類等）を添加してもよい。これらは、単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【実施例】
【００７４】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。なお、明細書中の評価法は以下の通りである。
［各種評価法］
【００７５】
＜１．プロテアーゼの活性測定＞
プロテアーゼの活性は、Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬を用いたカゼインフォリン法により算出した。ここで、プロテアーゼの至適ｐＨで、３７℃−１分あたり、カゼインを加水分解し、１．０μｍｏｌのチロシンに相当する呈色を生ずる酵素量を１Ｕと定義した。
【００７６】
＜２．糖化アミノ酸オキシダーゼの活性測定＞
糖化アミノ酸オキシダーゼの活性は、ペルオキシダーゼ存在下で、糖化バリルヒスチジンと糖化アミノ酸オキシダーゼとの反応で生成した過酸化水素と酸化還元系発色試薬を反応させ、その吸光度変化から算出した。ここで、糖化アミノ酸オキシダーゼの至適ｐＨ（ｐＨ＝６．５）で、３７℃−1分あたり、糖化バリルヒスチジンを加水分解し、１．０μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義した。
【００７７】
＜３．ペルオキシダーゼの活性測定＞
ペルオキシダーゼの活性は、ペルオキシダーゼ存在下で、過酸化水素とピロガロール（Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ）とを反応させ、生成したプルプロガリン（Ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ）に由来する吸光度の変化から算出した。ここで、ペルオキシダーゼの至適ｐＨ（ｐＨ＝６．０）で、２０℃−２０秒あたり、１．０ｍｇのプルプロガリン（Ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ）に相当する呈色を生ずる酵素量を１Ｕと定義した。
【００７８】
＜４．カタラーゼの活性測定＞
カタラーゼの活性は、ペルオキシダーゼ存在下で、過酸化水素を水と酸素に分解し、過酸化水素に由来する２４０ｎｍでの吸光度の変化から算出した。ここで、ペルオキシダーゼの至適ｐＨで、２５℃−１分あたり、１．０μｍｏｌの過酸化水素を分解する酵素量を１Ｕと定義した。
【００７９】
＜５．親水親油バランス値（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ Ｂａｌａｎｃｅ ｖａｌｕｅ：ＨＬＢ値）の測定＞
ＨＬＢ値は、グリフィン法を用い、ＨＬＢ値＝２０×（親水部の式量の総和／分子量）で算出した。なお、界面活性剤の混合物のＨＬＢ値は、各成分のＨＬＢ値の加重平均で表す。
【００８０】
＜６．糖化アミノ酸オキシダーゼの保存安定性＞
８ｍｍφの桐山ろ紙 ＮＯ．５Ａ（東京硝子器械社製）に、下記試薬１を１０μＬ滴下し、遮光デシケーター ３９０９−０４（東京硝子器械社製）にて２５℃−２時間乾燥させ、ブランク試験片を作製した。
＜試薬１＞
１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ（同仁化学研究所社製） ｐＨ６．５
５００Ｕ／ｍＬ 糖化アミノ酸オキシダーゼ ＦＰＯ−３０１（東洋紡績社製）
【００８１】
次いで、ブランク試験片を、加速試験として、プログラム低温恒温器 ＩＮ６０４（ヤマト科学社製）にて３７℃−５時間インキュベートした。次いで、マイクロチューブ内に前記ブランク試験片と下記試薬２ １０００μＬとを添加し、ボルテックスミキサー（エムエス機器社製）で１分間攪拌することで、ブランク試験片中の糖化アミノ酸オキシダーゼを抽出した。次いで、前記抽出液をマイクロコン−３（ミリポア社製）にて１４０００Ｇで遠心濃縮し、２００μＬの濃縮液を得た。次いで、前記濃縮液 ５０μＬとＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）４７．５μＬと２−メルカプトエタノール（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）２．５μＬとを混合し、９５℃−５分間ボイルすることで、ブランク溶液を得た。
＜試薬２＞
１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ（同仁化学研究所社製） ｐＨ６．５
１００倍希釈 プロテアーゼ阻害剤カクテル 一般用、１００倍濃縮（ナカライテスク社製）
【００８２】
他方、本発明の多層試験片を、加速試験として、プログラム低温恒温器 ＩＮ６０４（ヤマト科学社製）にて３７℃−５時間インキュベートした。次いで、マイクロチューブ内に前記多層試験片と前記試薬２ １０００μＬとを添加し、ボルテックスミキサー（エムエス機器社製）で１分間攪拌することで、多層試験片中の界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬を抽出した。次いで、前記抽出液をマイクロコン−３（ミリポア社製）にて１４０００Ｇで遠心濃縮し、分子量３０００以下の低分子量成分（界面活性剤、酸化還元系発色試薬等）を除去し、２００μＬの濃縮液を得た。次いで、前記濃縮液 ５０μＬとＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）４７．５μＬと２−メルカプトエタノール（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）２．５μＬとを混合し、９５℃−５分間ボイルすることで、サンプル溶液を得た。
【００８３】
得られたブランク溶液、およびサンプル溶液を、電気泳動ベストパッケージ レディーゲル用（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）を用い、下記条件１でＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。なお、ブランク溶液、およびサンプル溶液は、同一ゲルの別レーンに流した。
＜条件１＞
プレキャストゲル ： レディーゲルＪ １０％Ｔ、１２ｗｅｌｌ
電気泳動システム ： ミニプロティアンＴｅｔｒａセル
パワーサプライ ： パワーパックＢａｓｉｃ
スタンダード ： プレシジョンＰｌｕｓデュアルスタンダード
泳動バッファー ： プレミックスバッファー トリス／グリシン／ＳＤＳ
スタンダード量 ： １０μＬ
泳動試料量 ： ２０μＬ
泳動条件 ： １００Ｖ定電圧−９０分
温度 ： ２５℃
【００８４】
次いで、タイトボックス ＮＯ．３（アズワン社製）に泳動後のゲルと、蒸留水 ２００ｍＬとを添加し、ロッキングミキサー ＲＭ−８０（アズワン社製）で５分間振とう後、蒸留水を除去するという洗浄作業を３回行なった。次いで、染色液 Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ ＣＢＢ Ｇ−２５０ステイン（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）５０ｍＬを添加し、前記ロッキングミキサーで１時間振とう後、前記染色液を除去した。最後に、蒸留水 ２００ｍＬを添加し、前記ロッキングミキサーで１時間振とう後、蒸留水を除去することで、泳動像が得られた。
【００８５】
得られた泳動像中の５０ｋＤａ付近の糖化アミノ酸オキシダーゼ由来のバンド太さ（泳動方向のバンドの寸法）および濃さ（バンドの吸光度）を、ＧＳ−８００ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）で通法に従い測定した。得られたブランクおよびサンプルのバンド太さから下式（１）のバンド保持率１を、ブランクおよびサンプルのバンド濃さから下式（２）のバンド保持率２をそれぞれ算出し、バンド保持率１およびバンド保持率２≧９０％を◎（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、バンド保持率１およびバンド保持率２＜９０％を×（Ｂａｄ）として、糖化アミノ酸オキシダーゼの保存安定性（つまり、耐分解性）を評価した。
［数１］
バンド保持率１（％）＝（サンプルバンド太さ／ブランクバンド太さ）×１００…（１）
［数２］
バンド保持率２（％）＝（サンプルバンド濃さ／ブランクバンド濃さ）×１００…（２）
【００８６】
＜７．酸化還元系発色試薬の保存安定性＞
本発明の多層試験片を、ラミジップ・アルミ ＡＬ−９（東京硝子器械社製）に入れ、窒素封入した後、プログラム低温恒温器 ＩＮ６０４（ヤマト科学社製）にて４℃−０、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、３３６、５０４時間、または２５℃−０、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、３３６、５０４時間インキュベートした。次いで、前記多層試験片を治具（図１参照）で上下から挟んで固定し、酸化還元系発色試薬が担持された層側の反射率を、下記条件２で測定した。
＜条件２＞
装置名 ： 分光光度計 ＵＶ−２４５０（島津製作所社製）
付属装置名 ： 積分球 ＩＳＲ−２２００（島津製作所社製）
標準白板 ： 硫酸バリウム標準白板
測定波長 ： ６６６ｎｍ（ＤＡ６７のλｍａｘ）
入射角 ： ０°
スリット幅 ： ２．０ｎｍ
光束寸法 ： ３ｍｍ×５ｍｍ
温度 ： ２５℃
【００８７】
得られた反射率から、下式（３）のＫｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ変換によりＫ／Ｓ値を算出し、３週間（５０４時間）後のＫ／Ｓ値が、Ｋ／Ｓ値（４℃）≦０．２５かつＫ／Ｓ値（２５℃）≦０．５０を◎（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、０．２５＜Ｋ／Ｓ値（４℃）≦０．３５かつ０．５０＜Ｋ／Ｓ値（２５℃）≦０．６０を○（Ｇｏｏｄ）、０．３５＜Ｋ／Ｓ値（４℃）≦０．４０かつ０．６０＜Ｋ／Ｓ値（２５℃）≦１．３０を△（Ｎｏｔ Ｂａｄ）、０．４０＜Ｋ／Ｓ値（４℃）かつ１．３０＜Ｋ／Ｓ値（２５℃）を×（Ｂａｄ）として、酸化還元系発色試薬の保存安定性（つまり、耐自己発色性）を評価した。なお、酸化還元系発色試薬が自己発色すると、Ｋ／Ｓ値は上昇することは公知である。また、式（３）中の％Ｒは反射率を意味する。
［数３］
Ｋ／Ｓ値＝（１−％Ｒ）２／（２×％Ｒ）…（３）
【００８８】
＜８．プロテアーゼの反応性＞
本発明の多層試験片に、１００ｇ／Ｌのヘモグロビン ヒト Ｈ７３７９（シグマ社製）水溶液 ２０μＬを１層目に点着し、プログラム低温恒温器 ＩＮ６０４（ヤマト科学社製）にて３７℃−０、５、１０、１５、３０、６０分間インキュベートした。次いで、マイクロチューブ内に前記多層試験片と前記試薬２ １０００μＬとを添加し、ボルテックスミキサー（エムエス機器社製）で１分間攪拌することで、多層試験片中の界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬を抽出した。次いで、前記抽出液をマイクロコン−３（ミリポア社製）にて１４０００Ｇで遠心濃縮し、分子量３０００以下の低分子量成分（界面活性剤、酸化還元系発色試薬等）を除去し、２００μＬの濃縮液を得た。次いで、前記濃縮液 ２．５μＬと蒸留水 ４７．５μＬとＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）４７．５μＬと２−メルカプトエタノール（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）２．５μＬとを混合し、９５℃−５分間ボイルすることで、サンプル溶液１〜６を得た。
【００８９】
得られたサンプル溶液１〜６を、電気泳動ベストパッケージ レディーゲル用（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）を用い、前記条件１でＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。なお、サンプル溶液１〜６は、同一ゲルの別レーンに流した。
【００９０】
次いで、タイトボックス ＮＯ．３（アズワン社製）に泳動後のゲルと、蒸留水 ２００ｍＬとを添加し、ロッキングミキサー ＲＭ−８０（アズワン社製）で５分間振とう後、蒸留水を除去するという洗浄作業を３回行なった。次いで、染色液 Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ ＣＢＢ Ｇ−２５０ステイン（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）５０ｍＬを添加し、前記ロッキングミキサーで１時間振とう後、前記染色液を除去した。最後に、蒸留水 ２００ｍＬを添加し、前記ロッキングミキサーで１時間振とう後、蒸留水を除去することで、泳動像が得られた。
【００９１】
得られた泳動像中の１６ｋＤａ付近のヘモグロビン サブユニット由来のバンド太さ（泳動方向のバンド寸法）および濃さ（バンドの吸光度）を、ＧＳ−８００ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）で通法に従い測定した。得られた３７℃−０〜６０分インキュベート後のバンド太さから下式（４）のバンド消失率１を、３７℃−０〜６０分インキュベート後のバンド濃さから下式（５）のバンド消失率２をそれぞれ算出し、バンド消失率１およびバンド消失率２が９０％以上となる時間（以下、バンド消失時間ともいうことがある。）が、０分＜バンド消失時間≦５分を◎（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、５分＜バンド消失時間≦１５分を○（Ｇｏｏｄ）、１５分＜バンド消失時間≦３０分を△（Ｎｏｔ Ｂａｄ）、３０分＜バンド消失時間を×（Ｂａｄ）として、プロテアーゼの反応性を評価した。
［数４］
バンド消失率１（％）
＝｛１−（バンド太さ（０〜６０分）／バンド太さ（０分））｝×１００…（４）
［数５］
バンド消失率２（％）
＝｛１−（バンド濃さ（０〜６０分）／バンド濃さ（０分））｝×１００…（５）
【００９２】
＜９．酸化還元系発色試薬の感度、相関性＞
１００ｇ／Ｌのヘモグロビン ヒト Ｈ７３７９（シグマ社製）水溶液に、合成したフルクトシルバリルヒスチジン（以下、Ｆ−ＶＨともいうことがある。）を、０、５０、１００、２００、５００μＭとなるよう溶解させ、５水準の測定試料を調整した。
次いで、本発明の多層試験片を、治具（図１参照）で上下から挟んで固定し、前記測定検体 ２０μＬを１層目に点着し、室温−１分間インキュベート後、測定試料点着面とは反対面の反射率を、下記条件３で測定した。
＜条件３＞
測定試料 ： ヘモグロビン ヒト Ｈ７３７９ １００ｇ／Ｌ
Ｆ−ＶＨ ０、５０、１００、２００、５００μＭ
カタラーゼ
装置名 ： 分光光度計 ＵＶ−２４５０（島津製作所社製）
付属装置名 ： 積分球 ＩＳＲ−２２００（島津製作所社製）
標準白板 ： 硫酸バリウム標準白板
測定波長 ： ６６６ｎｍ（ＤＡ６７）、７２７ｎｍ（ＤＡ６４）、５５５ｎｍ（ＴＯＯＳ）、６３０ｎｍ（ＭＡＯＳ）
入射角 ： ０°
スリット幅 ： ２．０ｎｍ
光束寸法 ： ３ｍｍ×５ｍｍ
温度 ： ２５℃
【００９３】
得られたＦ−ＶＨ ０〜５００μＭでの反射率から、上式（３）のＫｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ変換により、Ｆ−ＶＨ ０〜５００μＭでのＫ／Ｓ値を得た。得られたＦ−ＶＨ ０μＭでのＫ／Ｓ値と、Ｆ−ＶＨ ５００μＭでのＫ／Ｓ値から、下式（６）のＫ／Ｓ変動率を算出し、Ｋ／Ｓ変動率≧２．０を◎（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、Ｋ／Ｓ変動率＜２．０を×（Ｂａｄ）として、酸化還元系発色試薬の感度を評価した。なお、式（６）中のＫ／Ｓ値（０μＭ）はＦ−ＶＨ ０μＭでのＫ／Ｓ値を、Ｋ／Ｓ値（５００μＭ）はＦ−ＶＨ ５００μＭでのＫ／Ｓ値をそれぞれ意味する。
［数６］
Ｋ／Ｓ変動率＝Ｋ／Ｓ値（５００μＭ） ／ Ｋ／Ｓ値（０μＭ）…（６）
【００９４】
また、得られたＫ／Ｓ値とＦ−ＶＨ濃度とのピアソン相関係数：ｒを算出し、ｒ＞０．９５を◎（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、０．９５≦ｒ＜０．９０を○（Ｇｏｏｄ）、０．９０≦ｒ＜０．８５を△（Ｎｏｔ Ｂａｄ）、ｒ≦０．８５を×（Ｂａｄ）として、相関性を評価した。
【００９５】
＜１０．ヘモグロビンＡ１ｃ値検量線の作成＞
本発明の多層試験片を、治具（図１参照）で上下から挟んで固定し、ＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料 ＱＲＭ ＨｂＡ１ｃ ２００７−１（一般社団法人 検査医学標準物質機構社製）２０μＬを１層目に点着し、プログラム低温恒温器 ＩＮ６０４（ヤマト科学社製）にて３７℃−１５分間インキュベート後、測定試料点着面とは反対面の反射率を、下記条件４で測定した。
＜条件４＞
測定試料 ： ＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料 ＱＲＭ
ＬＥＶＥＬ１、２、３、４、５
装置名 ： 分光光度計 ＵＶ−２４５０（島津製作所社製）
付属装置名 ： 積分球 ＩＳＲ−２２００（島津製作所社製）
標準白板 ： 硫酸バリウム標準白板
測定波長 ： ４８０ｎｍ、６６６ｎｍ
入射角 ： ０°
スリット幅 ： ２．０ｎｍ
光束寸法 ： ３ｍｍ×５ｍｍ
温度 ： ２５℃
【００９６】
得られた４８０ｎｍでの反射率、および６６６ｎｍでの反射率から、上式（３）のＫｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ変換により４８０ｎｍでのＫ／Ｓ値、および６６６ｎｍでのＫ／Ｓ値を得た。次いで、得られた４８０ｎｍでのＫ／Ｓ値と、６６６ｎｍでのＫ／Ｓ値から、下式（７）のＫ／Ｓ比を算出した。なお、Ｋ／Ｓ比とヘモグロビンＡ１ｃ値が比例することは公知である（非特許文献１参照）。また、式中のＫ／Ｓ値（４８０ｎｍ）は４８０ｎｍでのＫ／Ｓ値を、Ｋ／Ｓ値（６６６ｎｍ）は６６６ｎｍでのＫ／Ｓ値をそれぞれ意味する。
［数７］
Ｋ／Ｓ比＝Ｋ／Ｓ値（６６６ｎｍ） ／ Ｋ／Ｓ値（４８０ｎｍ） … （７）
【００９７】
得られたＫ／Ｓ比と、ＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料 ＱＲＭで規定されているＨｂＡ１ｃ値（ＬＥＶＥＬ１＝４．６７％、ＬＥＶＥＬ２＝５．２９％、ＬＥＶＥＬ３＝６．９６％、ＬＥＶＥＬ４＝９．０８％、ＬＥＶＥＬ５＝１０．７９％）とのピアソン相関係数：ｒを算出し、ｒ＞０．９５を◎（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、０．９５≦ｒ＜０．９０を○（Ｇｏｏｄ）、０．９０≦ｒ＜０．８５を△（Ｎｏｔ Ｂａｄ）、ｒ≦０．８５を×（Ｂａｄ）として、相関性を評価した。
【００９８】
＜１１．ヘモグロビンＡ１ｃ値の測定＞
健常者血液に、合成したフルクトシルバリルヒスチジン（以下、Ｆ−ＶＨとも呼称する）を、０、１０、２０、５０、１００μＭとなるよう溶解させ、５水準の測定試料を調整した。
次いで、本発明の多層試験片を、治具（図１参照）で上下から挟んで固定し、前記測定検体 ２０μＬを１層目に点着し、プログラム低温恒温器 ＩＮ６０４（ヤマト科学社製）にて３７℃−１５分間インキュベート後、測定試料点着面とは反対面の反射率を、下記条件５で測定した。なお、健常者血液は、市販の自動分析機：日立自動分析機 ７１８０（日立ハイテク社製）、市販のヘモグロビンＡ１ｃ測定試薬：ノルディアＮ ＨｂＡ１ｃ（積水メディカル社製）を用いて、通法に従い測定を実施し、ヘモグロビンＡ１ｃ値を算出した。
＜条件５＞
測定試料 ： 健常者血液
Ｆ−ＶＨ ０、１０、２０、５０、１００μＭ
装置名 ： 分光光度計 ＵＶ−２４５０（島津製作所社製）
付属装置名 ： 積分球 ＩＳＲ−２２００（島津製作所社製）
標準白板 ： 硫酸バリウム標準白板
測定波長 ： ４８０ｎｍ、６６６ｎｍ
入射角 ： ０°
スリット幅 ： ２．０ｎｍ
光束寸法 ： ３ｍｍ×５ｍｍ
温度 ： ２５℃
【００９９】
得られた４８０ｎｍでの反射率、および６６６ｎｍでの反射率から、上式（３）のＫｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ変換により４８０ｎｍでのＫ／Ｓ値、および６６６ｎｍでのＫ／Ｓ値を得た。次いで、得られた４８０ｎｍでのＫ／Ｓ値と、６６６ｎｍでのＫ／Ｓ値から、上式（７）のＫ／Ｓ比を算出した。得られたＫ／Ｓ比と、前項で得られた検量線から、ヘモグロビンＡ１ｃ値を算出した。得られたＦ−ＶＨ ０μＭを添加した健常者血液のヘモグロビンＡ１ｃ値と、Ｆ−ＶＨ １００μＭを添加した健常者血液のヘモグロビンＡ１ｃ値から、下式（８）のＨｂＡ１ｃ値差を算出し、ＨｂＡ１ｃ値差≦０．５を◎（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、０．５＜ＨｂＡ１ｃ値差≦１．０を○（Ｇｏｏｄ）、１．０＜ＨｂＡ１ｃ値差≦１．５を△（Ｎｏｔ Ｂａｄ）、１．５＜ＨｂＡ１ｃ値差を×（Ｂａｄ）として、測定試料中に存在する可能性のある糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響を評価した。なお、式（８）中のＨｂＡ１ｃ値（０μＭ）はＦ−ＶＨ ０μＭを添加した健常者血液のヘモグロビンＡ１ｃ値を、ＨｂＡ１ｃ値（１００μＭ）はＦ−ＶＨ １００μＭを添加した健常者血液のヘモグロビンＡ１ｃ値をそれぞれ意味する。
［数８］
ＨｂＡ１ｃ値差＝ＨｂＡ１ｃ値（１００μＭ） − ＨｂＡ１ｃ値（０μＭ）…（８）
［試験片の作成］
［実施例１］
【０１００】
８ｍｍφの桐山ろ紙 ＮＯ．５Ａ（東京硝子器械社製）に、下記試薬３を１０μＬ滴下し、次いで別の８ｍｍφの桐山ろ紙 ＮＯ．５Ａ（東京硝子器械社製）に、下記試薬４を１０μＬ滴下し、それぞれ遮光デシケーター ３９０９−０４（東京硝子器械社製）にて２５℃−２時間乾燥させ、単層試験片を２種作製した。得られた２種の単層試験片を積層することで、多層試験片を作製した。なお、担持された界面活性剤濃度は０．１ｍｇ／ｃｍ２、プロテアーゼ濃度は１０Ｕ／ｃｍ２、糖化アミノ酸オキシダーゼ濃度は１０Ｕ／ｃｍ２、ペルオキシダーゼ濃度は４０Ｕ／ｃｍ２、酸化還元系発色試薬濃度は０．１ｍｇ／ｃｍ２である。
【０１０１】
得られた多層試験片の詳細を表１に示す。なお、表中のＮＰ４０はＮｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０が、ＸＩＶはプロテアーゼ Ｔｙｐｅ−ＸＩＶが、ＦＰＯは糖化アミノ酸オキシダーゼ ＦＰＯ−３０１が、ＰＥＯはペルオキシダーゼ ＰＥＯ−３０２が、ＤＡ６７はＤＡ６７が、それぞれ各層に担持されていること意味する。以下、同様である。
＜試薬３＞
１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ（同仁化学研究所社製） ｐＨ６．５
５．０ｍｇ／ｍＬ Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（ナカライテスク社製）
５００Ｕ／ｍＬ 糖化アミノ酸オキシダーゼ ＦＰＯ−３０１（東洋紡績社製）
＜試薬４＞
１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ（同仁化学研究所社製） ｐＨ６．５
５．０ｍｇ／ｍＬ Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（ナカライテスク社製）
５００Ｕ／ｍＬ プロテアーゼ Ｔｙｐｅ−ＸＩＶ（シグマ社製）
２０００Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ ＰＥＯ−３０２（東洋紡績社製）
５．０ｍｇ／ｍＬ ＤＡ６７（和光純薬工業社製）
［実施例２〜４］
【０１０２】
界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬が担持される層が異なる以外は、実施例１と同様にして、多層試験片を作製した。
得られた多層試験片の詳細を表１に示す。
【０１０３】
【表１】
［実施例５］
【０１０４】
８ｍｍφの桐山ろ紙 ＮＯ．５Ａ（東京硝子器械社製）に、下記試薬５を１０μＬ滴下し、次いで別の８ｍｍφの桐山ろ紙 ＮＯ．５Ａ（東京硝子器械社製）に、下記試薬６を１０μＬ滴下し、さらに別の８ｍｍφの桐山ろ紙 ＮＯ．５Ａ（東京硝子器械社製）に、下記試薬７を１０μＬ滴下し、それぞれ遮光デシケーター ３９０９−０４（東京硝子器械社製）にて２５℃−２時間乾燥させ、単層試験片を３種作製した。得られた３種の単層試験片を積層することで、多層試験片を作製した。なお、担持された界面活性剤濃度は０．１ｍｇ／ｃｍ２、プロテアーゼ濃度は１０Ｕ／ｃｍ２、糖化アミノ酸オキシダーゼ濃度１０Ｕ／ｃｍ２、ペルオキシダーゼ濃度は４０Ｕ／ｃｍ２、酸化還元系発色試薬濃度は０．１ｍｇ／ｃｍ２である。
得られた多層試験片の詳細を表２に示す。
＜試薬５＞
１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ（同仁化学研究所社製） ｐＨ６．５
５．０ｍｇ／ｍＬ Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（ナカライテスク社製）
５００Ｕ／ｍＬ 糖化アミノ酸オキシダーゼ ＦＰＯ−３０１（東洋紡績社製）
＜試薬６＞
１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ（同仁化学研究所社製） ｐＨ６．５
５．０ｍｇ／ｍＬ Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（ナカライテスク社製）
５００Ｕ／ｍＬ プロテアーゼ Ｔｙｐｅ−ＸＩＶ（シグマ社製）
＜試薬７＞
１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ（同仁化学研究所社製） ｐＨ６．５
５．０ｍｇ／ｍＬ Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（ナカライテスク社製）
２０００Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ ＰＥＯ−３０２（東洋紡績社製）
５．０ｍｇ／ｍＬ ＤＡ６７（和光純薬工業社製）
［実施例６〜９］
【０１０５】
界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬が担持される層が異なる以外は、実施例５と同様にして、多層試験片を作製した。
得られた多層試験片の詳細を表２に示す。
【０１０６】
【表２】
［比較例１］
【０１０７】
８ｍｍφの桐山ろ紙 ＮＯ．５Ａ（東京硝子器械社製）に、下記試薬８を１０μＬ滴下し、遮光デシケーター ３９０９−０４（東京硝子器械社製）にて２５℃−２時間乾燥させ、単層試験片を作製した。なお、担持された界面活性剤濃度は０．１ｍｇ／ｃｍ２、プロテアーゼ濃度は１０Ｕ／ｃｍ２、糖化アミノ酸オキシダーゼ濃度１０Ｕ／ｃｍ２、ペルオキシダーゼ濃度は４０Ｕ／ｃｍ２、酸化還元系発色試薬濃度は０．１ｍｇ／ｃｍ２である。
得られた単層試験片の詳細を表３に示す。
＜試薬８＞
１００ｍＭ ＰＩＰＥＳ（同仁化学研究所社製） ｐＨ６．５
５．０ｍｇ／ｍＬ Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（ナカライテスク社製）
５００Ｕ／ｍＬ プロテアーゼ Ｔｙｐｅ−ＸＩＶ（シグマ社製）
５００Ｕ／ｍＬ 糖化アミノ酸オキシダーゼ ＦＰＯ−３０１（東洋紡績社製）
２０００Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ ＰＥＯ−３０２（東洋紡績社製）
５．０ｍｇ／ｍＬ ＤＡ６７（和光純薬工業社製）
【０１０８】
【表３】
［比較例２〜７］
【０１０９】
界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬が担持される層が異なる以外は、実施例１と同様にして、多層試験片を作製した。
得られた多層試験片の詳細を表４に示す。
【０１１０】
【表４】
［比較例８，９］
【０１１１】
界面活性剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、酸化還元系発色試薬が担持される層が異なる以外は、実施例５と同様にして、多層試験片を作製した。
得られた多層試験片の詳細を表５に示す。
【０１１２】
【表５】
【０１１３】
＜糖化アミノ酸オキシダーゼ、酸化還元系発色試薬の保存安定性＞
実施例１〜９、比較例１〜９の多層試験片を用い、糖化アミノ酸オキシダーゼの保存安定性、酸化還元系発色試薬の保存安定性を評価した。
得られた評価結果を表６、７に示す。
【０１１４】
【表６】
【０１１５】
【表７】
【０１１６】
糖化アミノ酸オキシダーゼの保存安定性の評価結果より、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼが同一層に担持されるとプロテアーゼによる糖化アミノ酸オキシダーゼの失活・分解が生じ、保存安定性は著しく低下した。なお、糖化アミノ酸オキシダーゼの失活・分解により、測定不能となる恐れがある。
また、酸化還元系発色試薬の安定性の評価結果より、ペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬が同一層に担持されると酸化還元系発色試薬の自己発色が生じ、保存安定性は著しく低下した。なお、酸化還元系発色試薬の自己発色により、感度が低下する恐れがある。
以上の結果より、保存安定性に優れた多層試験片の層構成として、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼがそれぞれ異なる層に担持されることが必要であり、例えば実施例１〜９の多層試験片が挙げられる。さらに、ペルオキシダーゼと酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されることが好ましく、例えば実施例２、３、６〜９の多層試験片が挙げられる。
［実施例１０〜１３］
【０１１７】
プロテアーゼをＴｙｐｅ−ＸＩＶ（シグマ社製）の代わりに、トヨチームＮＥＰ（東洋紡績社製）、Ｔｙｐｅ−Ｘ（シグマ社製）、プロテイナーゼＫ（ロシュ社製）、Ｔｙｐｅ−ＸＩＩＩ（シグマ社製）とする以外は、実施例２と同様にして、多層試験片を作製した。
得られた多層試験片の詳細を表８に示す。なお、表中のＮＥＰはトヨチームＮＥＰが、ＸはＴｙｐｅ−Ｘが、ＫはプロテイナーゼＫが、ＸＩＩＩはＴｙｐｅ−ＸＩＩＩがそれぞれ各層に担持されていること意味する。
［比較例１０］
【０１１８】
プロテアーゼをＴｙｐｅ−ＸＩＶ（シグマ社製）の代わりに、Ｔｙｐｅ−Ｉ（シグマ社製）とする以外は、実施例２と同様にして、多層試験片を作製した。
得られた多層試験片の詳細を表８に示す。なお、表中のＩはＴｙｐｅ−Ｉが各層に担持されていること意味する。
【０１１９】
【表８】
【０１２０】
＜プロテアーゼの反応性＞
実施例２、１０〜１３、比較例１０の多層試験片を用い、プロテアーゼの反応性を評価した。
得られた評価結果を表９に示す。
【０１２１】
【表９】
【０１２２】
プロテアーゼ反応性の評価結果より、プロテアーゼとしては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼ、およびトリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来プロテアーゼからなる群より選ばれた１種以上であることが好ましい。
［実施例１４］
【０１２３】
酸化還元系発色試薬をＤＡ６７（和光純薬工業社製）：λｍａｘ＝６６６ｎｍの代わりに、ＤＡ６４（和光純薬工業社製）：λｍａｘ＝７２７ｎｍとする以外は、実施例２と同様にして、多層試験片を作製した。
得られた多層試験片の詳細を表１０に示す。なお、表中のＤＡ６４はＤＡ６４が各層に担持されていること意味する。
［比較例１１，１２］
【０１２４】
酸化還元系発色試薬をＤＡ６７（和光純薬工業社製）：λｍａｘ＝６６６ｎｍの代わりに、４ＡＡ（ナカライテスク社製）とＴＯＯＳ（同仁化学研究所社製）：λｍａｘ＝５５５ｎｍ、４ＡＡ（ナカライテスク社製）とＭＡＯＳ（同仁化学研究所社製）：λｍａｘ＝６３０ｎｍとする以外は、実施例２と同様にして、多層試験片を作製した。なお、担持された４ＡＡ濃度は０．０６ｍｇ／ｃｍ２、ＴＯＯＳ濃度は０．０９ｍｇ／ｃｍ２、ＭＡＯＳ濃度は０．０９ｍｇ／ｃｍ２である。
得られた多層試験片の詳細を表１０に示す。なお、表中の４ＡＡは４−アミノアンチピリンが、ＴＯＯＳはＴＯＯＳが、ＭＡＯＳはＭＡＯＳがそれぞれ各層に担持されていること意味する。
【０１２５】
【表１０】
【０１２６】
＜酸化還元系発色試薬の感度、相関性＞
実施例２、１４、比較例１１、１２の多層試験片を用い、酸化還元系発色試薬の感度、相関性を評価した。
得られた評価結果を表１１に示す。
【０１２７】
【表１１】
【０１２８】
酸化還元系発色試薬の感度、相関性の評価結果より、酸化還元系発色試薬としては、モル吸光係数が高く、かつヘモグロビンの色味の影響を受けにくい６５０〜８００ｎｍに極大吸収波長を持つロイコ型色素が好ましい。
［実施例１５〜１７］
【０１２９】
界面活性剤をＮｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（ナカライテスク社製）：ＨＬＢ値＝１７．６の代わりに、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（ナカライテスク社製）：ＨＬＢ値＝１３．５、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（和光純薬工業社製）：ＨＬＢ値＝１６．７、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５（和光純薬工業社製）：ＨＬＢ値＝１６．９とする以外は、実施例１０と同様にして、多層試験片を作製した。
得られた多層試験片の詳細を表１２に示す。なお、表中のＴＸ１００はＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００が、Ｔｗ２０はＴｗｅｅｎ（登録商標）２０が、Ｂｒ３５はＢｒｉｊ（登録商標）３５がそれぞれ各層に担持されていること意味する。
［比較例１３，１４］
【０１３０】
界面活性剤をＮｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（ナカライテスク社製）：ＨＬＢ値＝１７．６の代わりに、ＤＫエステル（登録商標）Ｆ５０（第一工業製薬社製）：ＨＬＢ値＝６．０、ＤＫエステル（登録商標）Ｆ７０（第一工業製薬社製）：ＨＬＢ値＝８．０とする以外は、実施例１０と同様にして、多層試験片を作製した。
得られた多層試験片の詳細を表１２に示す。なお、表中のＦ５０はＤＫエステル（登録商標）Ｆ５０（第一工業製薬社製）が、Ｆ７０はＤＫエステル（登録商標）Ｆ７０がそれぞれ各層に担持されていること意味する。
【０１３１】
【表１２】
【０１３２】
＜プロテアーゼの反応性＞
実施例１０、１５〜１７、比較例１３、１４の多層試験片を用い、プロテアーゼの反応性を評価した。
得られた評価結果を表１３に示す。
【０１３３】
【表１３】
【０１３４】
プロテアーゼ反応性の評価結果より、界面活性剤としては、プロテアーゼ反応促進効果に優れる、ＨＬＢ値が１０〜２０の非イオン性界面活性剤が好ましい。
【０１３５】
＜ヘモグロビンＡ１ｃ値検量線の作成：ＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料＞
実施例１〜４、比較例２の多層試験片を用い、ＨｂＡ１ｃ値の検量線を作成し、相関性を評価した。
得られた評価結果を表１４に示す。
【０１３６】
【表１４】
【０１３７】
＜ヘモグロビンＡ１ｃ値の測定＞
実施例１〜４、比較例２の多層試験片を用い、前項で得られたＨｂＡ１ｃ値の検量線を用い、ＨｂＡ１ｃ値を算出した。
得られた評価結果を表１５に示す。
【０１３８】
【表１５】
【０１３９】
以上の結果より、本発明の多層試験片を用いて測定したヘモグロビンＡ１ｃ値は、生化学自動分析装置を用いて測定したヘモグロビンＡ１ｃ値とよく一致した。さらに、本発明の多層試験片は測定試料中に存在する可能性のある糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響を受けにくく、かつ保存安定性に優れていることから、本発明の多層試験片を用いることで、正確、簡便かつ迅速に測定試料中の糖化ヘモグロビン量を比色定量することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
本発明の多層試験片を用いることにより、診断の現場で正確、簡便かつ迅速に測定試料中の糖化ヘモグロビン量を比色定量することができ、さらには測定試料中に存在する可能性のある糖化ヘモグロビンに由来しない糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドの影響を受けにくく、かつ保存安定性にも優れることから、予防医学に基づく臨床検査分野、診断医療分野、製薬分野および保健医学分野をはじめ、生命科学分野の産業界に大きく寄与することが期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片であって、
少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層の順に積層されており、
かつ血液分離層を有さないことを特徴とする多層試験片。
（ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
（ｂ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
【請求項２】
糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片であって、
少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層の順に積層されており、
（ａ）層および（ｂ）層に、ペルオキシダーゼおよび酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されており、
かつ血液分離層を有さないことを特徴とする多層試験片。
（ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
（ｂ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
【請求項３】
さらに、（ａ）層と（ｂ）層との少なくとも一層に、界面活性剤が担持されることを特徴とする請求項１または２に記載の多層試験片。
【請求項４】
糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片であって、
少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層と（ｃ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層／（ｃ）層、（ａ）層／（ｃ）層／（ｂ）層、または（ｃ）層／（ａ）層／（ｂ）層の順に積層されており、
かつ血液分離層を有さないことを特徴とする多層試験片。
（ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
（ｂ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
（ｃ）層：少なくともプロテアーゼおよび糖化アミノ酸オキシダーゼ以外の任意の試薬が担持された高分子基材
【請求項５】
糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片であって、
少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層と（ｃ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層／（ｃ）層、（ａ）層／（ｃ）層／（ｂ）層、または（ｃ）層／（ａ）層／（ｂ）層の順に積層されており、
（ａ）層と（ｂ）層と（ｃ）層とのいずれかに、ペルオキシダーゼおよび酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されており、
かつ血液分離層を有さないことを特徴とする多層試験片。
（ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
（ｂ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
（ｃ）層：少なくともプロテアーゼおよび糖化アミノ酸オキシダーゼ以外の任意の試薬が担持された高分子基材
【請求項６】
さらに、（ａ）層と（ｂ）層と（ｃ）層との少なくとも一層に、界面活性剤が担持されることを特徴とする請求項４または５に記載の多層試験片。
【請求項７】
プロテアーゼが、少なくともバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼ、およびトリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来プロテアーゼからなる群より選ばれた１種以上であることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の多層試験片。
【請求項８】
酸化還元系発色試薬が、極大吸収波長が６００〜８００ｎｍのロイコ型色素であることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の多層試験片。
【請求項９】
界面活性剤が、親水親油バランス値（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ Ｂａｌａｎｃｅ ｖａｌｕｅ：ＨＬＢ値）が１０〜２０の非イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の多層試験片。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の多層試験片を用い、少なくとも下記工程（ｉ）から（iii）を経て、糖化ヘモグロビン量を比色定量する測定方法。
工程（ｉ）：前記多層試験片の上面に測定試料を点着させる工程
工程（ii）：前記多層試験片の測定試料点着面とは反対面から、反射光を用いて反射率および／または吸光度を測定する工程
工程（iii）：得られた反射率および／または吸光度からヘモグロビン量、糖化ヘモグロビン量、糖化ヘモグロビン量のヘモグロビン量に対する割合からなる群より選ばれた１つ以上を算出する工程
【請求項１１】
測定試料が全血検体であることを特徴とする請求項１０に記載の測定方法。
【請求項１】
糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片であって、
少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層の順に積層されており、
かつ血液分離層を有さないことを特徴とする多層試験片。
（ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
（ｂ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
【請求項２】
糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片であって、
少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層の順に積層されており、
（ａ）層および（ｂ）層に、ペルオキシダーゼおよび酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されており、
かつ血液分離層を有さないことを特徴とする多層試験片。
（ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
（ｂ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
【請求項３】
さらに、（ａ）層と（ｂ）層との少なくとも一層に、界面活性剤が担持されることを特徴とする請求項１または２に記載の多層試験片。
【請求項４】
糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片であって、
少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層と（ｃ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層／（ｃ）層、（ａ）層／（ｃ）層／（ｂ）層、または（ｃ）層／（ａ）層／（ｂ）層の順に積層されており、
かつ血液分離層を有さないことを特徴とする多層試験片。
（ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
（ｂ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
（ｃ）層：少なくともプロテアーゼおよび糖化アミノ酸オキシダーゼ以外の任意の試薬が担持された高分子基材
【請求項５】
糖化ヘモグロビン量を比色定量するための多層試験片であって、
少なくとも下記（ａ）層と（ｂ）層と（ｃ）層とが、測定試料点着面から（ａ）層／（ｂ）層／（ｃ）層、（ａ）層／（ｃ）層／（ｂ）層、または（ｃ）層／（ａ）層／（ｂ）層の順に積層されており、
（ａ）層と（ｂ）層と（ｃ）層とのいずれかに、ペルオキシダーゼおよび酸化還元系発色試薬がそれぞれ異なる層に担持されており、
かつ血液分離層を有さないことを特徴とする多層試験片。
（ａ）層：少なくとも糖化アミノ酸オキシダーゼが担持された高分子基材
（ｂ）層：少なくともプロテアーゼが担持された高分子基材
（ｃ）層：少なくともプロテアーゼおよび糖化アミノ酸オキシダーゼ以外の任意の試薬が担持された高分子基材
【請求項６】
さらに、（ａ）層と（ｂ）層と（ｃ）層との少なくとも一層に、界面活性剤が担持されることを特徴とする請求項４または５に記載の多層試験片。
【請求項７】
プロテアーゼが、少なくともバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼ、およびトリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来プロテアーゼからなる群より選ばれた１種以上であることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の多層試験片。
【請求項８】
酸化還元系発色試薬が、極大吸収波長が６００〜８００ｎｍのロイコ型色素であることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の多層試験片。
【請求項９】
界面活性剤が、親水親油バランス値（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ Ｂａｌａｎｃｅ ｖａｌｕｅ：ＨＬＢ値）が１０〜２０の非イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の多層試験片。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の多層試験片を用い、少なくとも下記工程（ｉ）から（iii）を経て、糖化ヘモグロビン量を比色定量する測定方法。
工程（ｉ）：前記多層試験片の上面に測定試料を点着させる工程
工程（ii）：前記多層試験片の測定試料点着面とは反対面から、反射光を用いて反射率および／または吸光度を測定する工程
工程（iii）：得られた反射率および／または吸光度からヘモグロビン量、糖化ヘモグロビン量、糖化ヘモグロビン量のヘモグロビン量に対する割合からなる群より選ばれた１つ以上を算出する工程
【請求項１１】
測定試料が全血検体であることを特徴とする請求項１０に記載の測定方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１３−７４８７７（Ｐ２０１３−７４８７７Ａ）
【公開日】平成２５年４月２５日（２０１３．４．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５７４２９（Ｐ２０１２−５７４２９）
【出願日】平成２４年３月１４日（２０１２．３．１４）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年４月２５日（２０１３．４．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年３月１４日（２０１２．３．１４）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]