糖化蛋白質測定用組成物
【課題】より正確に糖化蛋白質及び糖化アルブミン割合を測定すること。
【解決手段】本発明は、１）グロブリン成分及びアスコルビン酸の影響回避、２）プロテ
アーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化、３）正確にアルブミンを測
定、４）糖化ヘモグロビンの影響回避を行うことにより、糖化蛋白質を正確に測定するた
めの組成物、測定方法を提供する。
【解決手段】本発明は、１）グロブリン成分及びアスコルビン酸の影響回避、２）プロテ
アーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化、３）正確にアルブミンを測
定、４）糖化ヘモグロビンの影響回避を行うことにより、糖化蛋白質を正確に測定するた
めの組成物、測定方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化蛋白質を測定するための組成物及び糖化蛋白質の測定方法に関する。本
発明における糖化蛋白質の測定用組成物及び測定方法は臨床検査に用いられ、正確に糖化
蛋白質を測定することができる。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病の診断及び管理を行う上で糖化蛋白質の測定は非常に重要であり、過去約１〜２
ヶ月の平均血糖値を反映する糖化ヘモグロビン(GHb)、過去約２週間の平均血糖値を反映
する糖化アルブミン(GA)、及び血清中の還元能を示す糖化蛋白質の総称であるフルクトサ
ミン(FRA)等が日常的に測定されている。GHbはヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端バリンのαアミ
ノ基が、GA、FRAはアルブミン、血清蛋白質のリジン残基のεアミノ基がそれぞれ糖化さ
れている。
【０００３】
精度が高く、簡便かつ安価な糖化蛋白質の測定法としては酵素法があげられる。その例
としては特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６等
がある。
しかしながら、真に糖化蛋白質を正確に測定する組成物を提供するには、１）グロブリ
ン成分及びアスコルビン酸の影響回避、２）プロテアーゼ、少なくとも糖化アミノ酸に作
用する酵素の安定化が必須であり、さらに糖化蛋白質が糖化アルブミンである場合には、
３）正確にアルブミンを測定する方法、４）糖化ヘモグロビンの影響回避を行うことも重
要である。
【０００４】
１）グロブリン成分及びアスコルビン酸の影響回避に関する従来の技術
糖尿病患者ではグロブリン蛋白質量が変化しFRAの値に影響を及ぼすことが知られてい
る(例えば、非特許文献１参照。)。そこで本発明者らはプロテアーゼ反応液にある種の金
属イオンやプロテインＡ若しくはＧを添加することによりプロテアーゼのグロブリン成分
への作用を選択的に阻害する方法（例えば、特許文献７参照。）を開発してきた。この発
明ではグロブリン成分の影響を受けることなく糖化蛋白質を測定することが出来るが、そ
こで用いられるグロブリン選択的なプロテアーゼ阻害剤としては、金属、プロテインＡ、
Ｇが記載されている。しかし、ここで示されている特定の金属のうち、効果が強い金属は
重金属であり、環境安全上の問題がないとは言えず、また効果の弱い金属は他の試薬成分
（他の組成物）と組み合わせると試薬溶液に濁りが生じることがあった。またプロテイン
Ａ、Ｇは非常に高価である。
【０００５】
さらに、血液中のグロブリンを選択的に吸着する方法としてステロイド骨格を持ったリ
ガンドをビニル系の共重合体に導入しクロマトグラフィーの原理を用いて血液中の内毒素
やグロブリンを吸着する血液処理剤(例えば、特許文献８参照。)が知られている。しかし
この実施例表１の検討結果ではグロブリンのうち吸着が確認できているのはα１、α２グ
ロブリンだけでありグロブリン成分の７０％以上を占めるγグロブリンには吸着能を示し
ていない。またたとえγグロブリンに吸着能を示したとしてもプロテアーゼのγグロブリ
ンへの作用をどの程度阻害できるかは予測不可能である。
【０００６】
アスコルビン酸は近年補助食品として大量に摂取されるケースが増えており、高濃度の
アスコルビン酸を含有する臨床検体が増加している。アスコルビン酸は、その強力な還元
力により臨床検査を行う上で様々な影響を引き起こす。
検体中のアスコルビン酸の影響を回避する方法としては化学的な方法やアスコルビン酸
オキシダーゼを用いた酵素的な方法を用いて検体中のアスコルビン酸を消去する方法が知
られている。プロテアーゼを用いて糖化蛋白質を断片化し、次いで少なくとも糖化アミノ
酸に作用する酵素を用いて生じた糖化アミノ酸を測定する場合、プロテアーゼ反応と同時
にアスコルビン酸オキシダーゼ（ASOx）を作用させ、前もってアスコルビン酸を消去する
方法が発色系への影響が小さく好ましい。
【０００７】
プロテアーゼの存在下、被検液中のアスコルビン酸をASOxを用いて消去した例としては
、被検液に、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸(HEPES)緩衝
液pH8.0の条件で作用させた例(例えば、非特許文献２参照。)があり、冷蔵保存で2週間は
アスコルビン酸の処理能に変化は無いと記述されている。
しかし、本発明者らの検討ではHEPES緩衝液pH8.0、プロテアーゼ及びASOxが共存した場
合のアスコルビン酸処理能は37℃-1日若しくは10℃-2週間の保存でほとんど消失した。
【０００８】
２）プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化に関する従来の技
術
糖化蛋白質の臨床的な測定には他の分野、例えば食品分野等では考えられない程高濃度
のプロテアーゼが水溶液の状態で使用される。プロテアーゼは水溶液中では自己消化がお
こることが知られており、この様な高濃度の水溶液中で安定に存在するとは考えにくい。
よってこれまでの糖化蛋白測定用組成物に用いられるプロテアーゼは凍結乾燥品で供給さ
れている。
糖化蛋白測定用組成物、測定方法に関し液状で長期に保存出来るレベルまでプロテアー
ゼの安定化を行った例はない。同様に糖化蛋白測定用組成物、測定方法に関し液状で長期
に保存出来るレベルまで少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化を行った例はな
い。
【０００９】
３）正確にアルブミンを測定する方法に関する従来の技術
アルブミン測定法には抗アルブミン抗体を用いた免疫法、ブロモクレゾールグリーン（
BCG）、ブロモクレゾールパープル（BCP）等を用いた色素法等がある。操作が簡便でかつ
コストが安いことから、日常検査では色素法が広く用いられているが、BCG法はグロブリ
ン成分に作用が確認されておりアルブミンに対する特異性が低いという欠点がある。
一方BCP法はアルブミンに対する特異性は高いものの、共存物質の影響を受けやすく、
またSH化合物の影響を受けることからアルブミンの酸化還元状態により値が変化するとい
う問題があった。この問題を解決する方法としては蛋白質変性剤及び／またはSH試薬の存
在下BCPの反応を行った例（例えば、特許文献９参照。）が知られている。しかし、GAと
非糖化アルブミン(NGA)に対するBCP反応性の検討を行った例はこれまでなかった。
【００１０】
４）糖化ヘモグロビンの影響回避に関する従来の技術
前述のようにGAはアルブミンのεアミノ基が糖化されており、一方GHbはヘモグロビン
中のβ鎖Ｎ末端バリンのαアミノ基が糖化されている。よってGAを測定対象とする場合に
はεアミノ基が糖化されたアミノ酸のみを測定できれば好ましい。
【００１１】
これまでεアミノ基に高い特異性を示し、糖化バリンに作用しない酵素はいくつか知ら
れているが（例えば、特許文献１０参照。）、実用化できるほど安いコストで供給されて
いるものはない。このうち特にフザリウム・オキシスポルム由来のフルクトシルアミノ酸
オキシダーゼ（FOD）は反応性が高く有用であり、発明者らは該FODの遺伝子を分離し報告
している（例えば、特許文献１１参照。）。ただし本遺伝子を用いた製造法は生産性が高
く、低いコストでFODが生産できるもののαアミノ基が糖化されている糖化バリンへの反
応性が確認されており、特異性の点で満足いくものではなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、糖化蛋白質を正確に測定するにあたり、１）グロブリン成分及びアス
コルビン酸の影響回避した、２）プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵
素を安定化した組成物、安定化方法を提供することにあり、さらに糖化蛋白質が糖化アル
ブミンである場合には、３）正確にアルブミンを測定する、４）糖化ヘモグロビンの影響
回避を行う組成物、影響回避方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
糖化蛋白質を正確に測定するにあたり、１）グロブリン成分及びアスコルビン酸の影響
回避、２）プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化が正確な糖
化蛋白質の測定には必須であり、さらに糖化蛋白質が糖化アルブミンである場合には、３
）アルブミンの正確な測定、４）糖化ヘモグロビンの影響回避が必須である。
【００１６】
１）グロブリン成分及びアスコルビン酸の影響回避
本発明者らは鋭意検討の結果、プロテアーゼ反応液にデオキシコール酸、デオキシコー
ル酸アミド、コール酸アミド、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽
イオン界面活性剤、コンカナバリンＡ、オクチルグルコシドまたはベタインから選択され
る１種以上を添加することによりプロテアーゼのグロブリン成分への作用を選択的に阻害
できること、またこの反応液に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を直接作用させて
も酵素作用が阻害されることなく、再現性良く、精度良くかつ簡便に糖化蛋白質が測定で
きることを見出した。しかも、これらの化合物は、経済的に有利で、かつ従来の技術を用
いたときに比べて環境安全上問題がなく、検体と混合された場合に濁りを生じることもな
いものである。
【００１７】
またアスコルビン酸の消去にはASOxを用いると効率的であるがプロテアーゼが大量に存
在する反応液中でASOxが安定に存在するとは通常考えにくい。実際本発明者らの検討結果
ではプロテアーゼの種類やプロテアーゼ阻害剤及びASOxの種類等の検討ではプロテアーゼ
が大量に存在する反応液中でASOxを安定に存在させる条件は見つからなかった。
ところが本発明者らは鋭意検討の結果、意外にも緩衝液の種類によってASOxの安定性が
飛躍的に向上することを見出した。
【００１８】
２）プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化
糖化蛋白質の臨床的な測定には前述のように高濃度のプロテアーゼが水溶液の状態で使
用され、基本的にプロテアーゼ自体が不安定になる。ところが、本発明者らは鋭意検討の
結果、ジメチルスルホオキシド、アルコール、水溶性カルシウム塩、食塩、第四級アンモ
ニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤を添加することにより、プ
ロテアーゼの安定性が飛躍的に向上し、液状かつ高濃度の条件でも長期間保存が可能であ
ることを見出した。
【００１９】
また少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素は液状での37℃-4日保存で活性が約１割に
低下する酵素であり、安定な酵素とは言い難かった。しかしながら本発明者らは鋭意検討
の結果、少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素に糖アルコール、スクロース、水溶性マ
グネシウム塩、水溶性カルシウム塩、硫安、アミノ酸、ザルコシンより選ばれる安定化剤
を添加することにより液状、37℃-4日保存にて殆ど活性低下が見られない程の驚くべき安
定化効果が得られることを見出した。
【００２０】
さらにプロテアーゼは至適ｐＨ付近では強い蛋白質分解活性を示すが、同時に自己消化
反応も進行し特に液状での保存が困難になる。ところが本発明者らは鋭意検討の結果、第
１試薬をプロテアーゼ作用に適した条件にし、第２試薬にプロテアーゼを液状でも安定な
条件で処方することにより、測定時の条件には作用されずにプロテアーゼを安定に保存で
きること、また意外にも、前処理反応に使用する酵素を第２試薬に処方しても測定には影
響を与えず正確な測定が可能であることを見出した。加えて第１試薬に少なくとも糖化ア
ミノ酸に作用する酵素を処方することにより、試料中に存在する糖化アミノ酸を予め消去
し、選択的に糖化蛋白質を測定することが可能であった。
【００２１】
３）正確にアルブミンを測定する方法
本発明者らの検討により意外なことにBCPの反応性がGAとNGAで異なり、NGAが大量に混
入すると値が負の影響を受けることが判明した。そこで本発明者らは鋭意検討の結果、ア
ルブミン測定の前、若しくは同時に蛋白質変性剤及び／又はＳ−Ｓ結合を有する化合物に
て試料を処理することにより良好にNGAを大量に含むアルブミンを正確に測定できること
を見出した。
【００２２】
４）糖化ヘモグロビンの影響回避
本発明者らは、上記問題点に関し鋭意研究の結果、フザリウム・オキシスポルムIFO-99
72株由来FODの遺伝子を改変して、変異FODを作成し、その性状を測定することによってＮ
末端より372番目のリジンを他のアミノ酸に置換することによって基質特異性が顕著に変
化することを見出し、糖化バリンへの反応性が著しく低く、ほぼ糖化リジンに特異的に作
用する改変FODを複数作成した。
本変異FODは、上記の知見に基づいてなされたもので、FODについて配列表配列番号１の
アミノ酸配列372番のリジンを別のアミノ酸に置換することにより糖化バリン反応性が消
失した変異型FODである。配列表配列番号１のアミノ酸配列372番のリジンがトリプトファ
ン、メチオニンまたはバリンに置換された請求項１記載の変異型FODである。
最後に、本発明者らはこれらの発明を総合して正確に糖化蛋白質を測定する組成物、測
定方法を完成するに至った。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、より正確に被検体中の糖化蛋白質及び糖化アルブミン割合を測定するこ
とが可能になった。したがって、臨床検査薬として有用に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、この発明の構成及び好ましい形態について更に詳しく説明する。
本発明に使用しうるプロテアーゼは、被検液に含まれる糖化蛋白質に有効に作用し、か
つ当該蛋白質由来の糖化アミノ酸及び／若しくは糖化ペプチドを有効に生成するものであ
ればいかなるものを用いても良く、例えば動物、植物、バチルス(Bacillus)属、アスペル
ギルス(Aspergillus)、リゾパス(Rhizopus)、ペニシリウム(Penicillium)、ストレプトマ
イセス(Streptomyces)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、クロストリジウム(Clost
ridium)、リソバクター(Lysobacter)、グリフォラ(Glifila)、酵母(Yeast)、トリチラチ
ウム(Tritirachium)、サーマス(Thermus)、シュードモナス(Pseudomonus)、アクロモバク
ター(Achromobacter)等の微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。
【００２５】
また測定対象である糖化蛋白質がGAある場合にはバチルス属及びストレプトマイセス属
の微生物由来プロテアーゼがヒトアルブミン（Alb）に対する作用が大きい為より好まし
。また測定対象である糖化蛋白質がGHbである場合にはバチルス属、アスペルギルス属、
ストレプトマイセス属、トリチラチウム属由来のプロテアーゼがヒトヘモグロビン（Hb）
に対する作用が大きい為により好ましい。
本発明に用いることの出来るプロテアーゼの活性測定法を下記に示す。
【００２６】
＜＜プロテアーゼの活性測定方法＞＞
下記の測定条件で30℃、1 分間に1μgのチロシンに相当する呈色を示すプロテアーゼ活
性度を1PU（proteolytic Unit）と表示する。
＜基質＞ 0.6% ミルクカゼイン（メルク社製）
＜酵素溶液＞ 10PU〜20PUに希釈
＜酵素希釈溶液＞ 20mM 酢酸緩衝液 pH 7.5
1mM 酢酸カルシウム
100mM 塩化ナトリウム
＜反応停止液＞ 0.11M トリクロル酢酸
0.22M 酢酸ナトリウム
0.33M 酢酸
＜操作＞
プロテアーゼ溶液を10〜20PU/mlになるように酵素希釈溶液にて溶解し、この液1ml を
試験管に取り30℃に加温する。あらかじめ30℃に加温しておいた基質溶液5ml を加え正確
に10分後反応停止液5ml を添加し反応を停止する。そのまま30℃、30分加温を続け沈殿を
凝集させ、東洋ろ紙N0.131(9cm) で濾過を行い、濾液を得る。ブランク測定はプロテアー
ゼ溶液1ml を試験管に取り30℃に加温し、まず反応停止液5ml を添加し続いて基質溶液5m
l を添加後同様に凝集、濾過を行う。濾液2ml を0.55M 炭酸ナトリウム溶液5ml 、3 倍希
釈フォリン試薬1ml を加え30℃、30分反応後660nm の吸光度を測定する。酵素作用を行っ
た吸光度からブランク測定の吸光度を差し引いた吸光度変化を求め、別に作成した作用標
準曲線より酵素活性を求める。
【００２７】
＜標準作用曲線作成法＞
約50PU/ml に調整した酵素溶液を希釈し2〜50PU/ml の一連の希釈倍率を持った酵素溶
液を作成し上記操作を行い、得られた吸光度変化を縦軸に希釈倍数を横軸にプロットする
。一方L-チロシンを0.2N塩酸に0.01％ の濃度に溶解しその1ml に0.2N塩酸10ml加えたも
のを標準チロシン溶液とする（チロシン濃度9.09μg /ml）。標準チロシン溶液2ml と0.2
N塩酸2ml についてそれぞれ上記測定操作を行い、得られた吸光度変化がチロシン18.2μg
に相当する。この吸光度変化を前記グラフ上にとり、その点から横軸に垂線を下ろし横軸
との交点が10PU/ml に相当する。
【００２８】
また、これらのプロテアーゼの使用濃度としては、目的とする蛋白質を一定の時間で効
率よく切断できる濃度であれば良く、例えば通常1〜100000PU/ml、好ましくは10〜10000P
U/mlの濃度で用いればよい。
本発明に使用しうる少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素としては、前記プロテアー
ゼの作用により、被検液に含まれる糖化蛋白質から生成される糖化アミノ酸若しくは糖化
ペプチドに有効に作用し、実質的に糖化蛋白質が測定できる酵素であれば如何なるものを
用いても良いが、αアミノ基が糖化されたアミノ酸によく作用する少なくとも糖化アミノ
酸に作用する酵素、εアミノ基が糖化されたアミノ酸によく作用する少なくとも糖化アミ
ノ酸に作用する酵素等が挙げられる。
εアミノ基が糖化されたアミノ酸によく作用する少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵
素の例としては、ギベレラ（Gibberella）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、カン
ジダ（Candida）属、ペニシリウム（Penicillium）属、フサリウム（Fusarium）属、アク
レモニウム（Acremonium）属又はデバリオマイゼス（Debaryomyces）属由来のFOD等が挙
げられる。
αアミノ基が糖化されたアミノ酸によく作用する少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵
素の例としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）由来の酵素が挙げられる。
【００２９】
さらに、プロテアーゼと共存させた状態でも充分な活性を有し、かつ安価に製造可能な
酵素の例としては、遺伝子組み替え型ケトアミンオキシダーゼ（R-FOD；旭化成社製）お
よび加えて糖化バリン反応性を著しく低下させた変異型FOD（R-FOD-II；旭化成社製）が
挙げられる。
R-FOD-IIのもととなるフザリウム・オキシスポルムIFO-9972株由来のFOD蛋白質をコー
ドするDNAは、フザリウム・オキシスポルムIFO-9972株から常法により染色体DNAを抽出し
、PCR法やハイブリダイゼーション法などで分離して得られる。
得られた該FOD遺伝子への変異の導入は、DNAに直接変異を加えるならPCR法を応用して
もよいし部位特異的変異法を使用してもよい。また偶発変異によるならば、DNA修復能力
の低下した大腸菌宿主を使用しても良いし、あるいはDNA変異源を添加した培地でFOD遺伝
子を導入した宿主生物を培養することもできる。
【００３０】
かくして得られた変異FOD遺伝子を適当な宿主−ベクター系を用いて宿主微生物に導入
し、発現ベクターのマーカーと、FODの活性発現若しくはDNAプローブを指標としてスクリ
ーニングを行い、FOD遺伝子を含有する組換えDNAプラスミドを保持する微生物を分離し、
該遺伝子組換え微生物を培養し、該培養菌体から組換え蛋白を抽出精製することで変異FO
Dを得ることができる。
【００３１】
変異FODを得るためには、具体的には以下のように行えばよいが、その操作法のうち常
法とされるものは、例えばマニアティスらの方法（Maniatis,T., et al. Molecular Clon
ing. Cold Spring Harbor Laboratory 1982, 1989）や、市販の各種酵素、キット類に添
付された手順に従えば実施できるものである。
分離したFOD遺伝子に変異を導入するにはマンガンイオン添加条件下に於けるTaqポリメ
ラーゼを始めとする3'→5'修復能欠損型ポリメラーゼを使用したPCR法や、DNA修復能を欠
損した大腸菌宿主にFOD遺伝子を導入しジアニシジンなどの変異源を添加した培地で培養
することにより遺伝子変異を誘発し、作成した変異候補株群より目的の基質特異性を獲得
した変異体を分離すればよい。
上述の方法によって導入されたFODの変異は、ジデオキシ法（Sangar,F.（1981）Scienc
e, 214, 1205-1210）で変異を導入した遺伝子の塩基配列を確認することにより決定でき
る。
また一度変異が決定した後はゾラーらの方法（Zoller, M. J. and Smith, M. （1983）
Methods in Enzymology,154, 367）による部位特異変異法で特定の変異を導入することも
できる。
【００３２】
変異FODを構成するポリペプチドのアミノ酸配列の変異は、変異遺伝子の塩基配列より
決定できる。以上の方法で得られた変異FODは変異FOD遺伝子を適当な宿主−ベクター系に
組み込むことにより組換え体として生産できる。
変異FOD遺伝子を組み込むベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるフ
ァージ又はプラスミドから遺伝子組み換え用として構築されたものが適しており、ファー
ジベクターとしては、例えば、E. coliに属する微生物を宿主微生物とする場合にはλgt
・λC、λgt・λBなどが使用できる。また、プラスミドベクターとしては、例えば、E. c
oliを宿主微生物とする場合にはプラスミドpBR322、pBR325、pACYC184、pUC12、pUC13、p
UC18、pUC19、pUC118、pIN I、BluescriptKS+、枯草菌を宿主とする場合にはpUB110、pKH
300PLK、放線菌を宿主とする場合にはpIJ680、pIJ702、酵母特にサッカロマイセス・セル
ビシエ(Saccharomyces cerevisiae)を宿主とする場合にはYrp7、pYC1、Yep13などが使用
できる。
このようなベクターに変異FOD遺伝子を組み込むには、双方を同じ末端を生成する適当
な制限酵素で切断し、変異FOD遺伝子を含むDNAフラグメントとベクター断片とを、DNAリ
ガーゼ酵素により常法に従って結合させればよい。
【００３３】
変異FOD遺伝子を結合したベクターを移入する宿主微生物としては、組み換えDNAが安定
かつ自律的に増殖可能であればよく、例えば宿主微生物がE. coliに属する微生物の場合
、E. coli DH1、E. coli JM109、E. coli W3110、E. coli C600などが利用できる。また
、微生物宿主が枯草菌に属する微生物の場合、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis
)ISW1214など、放線菌に属する微生物の場合、ストレプトマイセス・リビダンス(Strepto
myces lividans)TK24など、サッカロマイセス・セルビシエに属する微生物の場合、サッ
カロマイセス・セルビシエINVSC1などが使用できる。
【００３４】
宿主微生物に組み換えDNAを移入する方法としては、例えば、宿主微生物がE. coliやサ
ッカロマイセス・セルビシエ、ストレプトマイセス・リビダンスに属する微生物の場合に
は、常法に従ってコンピテントセル化した宿主菌株に組み換えDNAの移入を行えばよく、
菌株によっては電気穿孔法を使用してもよい。
変異FODを生産するためには、変異FOD遺伝子を導入した宿主を適切な培地で培養し、培
養した菌体を集菌後、適当な緩衝液中にて超音波破砕やリゾチーム処理などにより菌体を
破壊し、菌体抽出液を調製すればよい。また、シグナル配列を付加することによる分泌発
現により、培養溶液中に変異FODを蓄積させても良い。
かようにして生産された変異FODは、通常の硫安沈殿、ゲル濾過、カラム精製などによ
って分離精製され、酵素標品として供給される。
【００３５】
上記の遺伝子操作に一般的に使用される量的関係は、供与微生物からのDNA及びベクタ
ーDNAを0.1〜10μgに対し、制限酵素を約1〜10U、リガーゼ約300U、その他の酵素約1〜10
U、程度が例示される。
変異FOD遺伝子を含み、変異FODを産生し得る形質転換微生物の具体的な例示としては、
エシェリヒア・コリに属する微生物を宿主微生物とし、その内部に変異FOD遺伝子を含有
するプラスミドpcmFOD3を保有する形質転換微生物、エシェリヒア・コリJM109・pcmFOD3
（FERM BP-7847）、およびpcmFOD4を保有する形質転換微生物、エシェリヒア・コリJM109
・pcmFOD4、およびpcmFOD5を保有する形質転換微生物、エシェリヒア・コリJM109・pcmFO
D5（FERM BP-7848）が挙げられる。これらの構造を図７に示した。
なお、前記エシェリヒア・コリJM109・pcmFOD3及びエシェリヒア・コリJM109・pcmFOD5
は、共に平成13年1月16日に日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6の独立行政法人
産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託され、それぞれ受託番号FERM BP-78
47及びFERM BP-7848を付与された。
【００３６】
形質転換微生物により該変異FODを製造するに当っては、該形質転換微生物を栄養培地
で培養して菌体内又は培養液中に該変異FODを産生せしめ、培養終了後、得られた培養物
を濾過又は遠心分離などの手段により菌体を採集し、次いでこの菌体を機械的方法又はリ
ゾチームなどの酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてEDTA及び／又は適当な界面活性剤
などを添加して該変異FODの水溶液を濃縮するか、又は濃縮する事なく硫安分画、ゲル濾
過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィーにより処理して、純度のよい該変異FODを得ることができる。
【００３７】
形質転換微生物の培養条件はその栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく
、通常多くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利で
ある。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用されうる。
炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、サッカロー
ス、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜などが使用される。窒素源としては利
用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加
水分解物などが使用される。
その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マン
ガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される
。
【００３８】
培養温度は微生物が発育し、変異FODを生産する範囲で適宜変更し得るが、E. coliの場
合、好ましくは20〜42℃程度である。培養条件は、条件によって多少異なるが、変異FOD
が最高終了に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、E. coliの場
合、通常は12〜48時間程度である。培地pHは菌が発育し、変異FODを生産する範囲で適宜
変更し得るが、E. coliの場合、好ましくはpH6〜8程度である。
【００３９】
培養物中の変異FODは、菌体を含む培養液そのままを採取し、利用することもできるが
、一般には常法に従って、変異FODが培養液中に存在する場合には、濾過、遠心分離など
により変異FOD含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。変異FODが菌体内に存
在する場合には、得られた培養物を濾過又は遠心分離などの手段により、菌体を採取し、
次いでこの菌体を必要に応じて機械的方法又はリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、ま
たEDTAなどのキレート剤及び／又は界面活性剤を添加して変異FODを可溶化し水溶液とし
て分離採取する。
この様にして得られた変異FOD含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、
硫酸ナトリウムなどの塩析処理などによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。
【００４０】
次いでこの沈澱物を、水に溶解し、半透膜にて透析せしめて、より低分子量の不純物を
除去することができる。また、吸着剤あるいはゲル濾過剤などによるゲル濾過、アフィニ
ティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー
等により精製し、これらの手段を用いて得られる変異FOD含有溶液から、減圧濃縮凍結乾
燥等の処理により精製された変異FODが得られる。
糖化アミノ酸に作用する酵素の活性は下記の方法にて測定した。
【００４１】
＜＜糖化アミノ酸に作用する酵素の活性測定法＞＞
＜反応液の組成＞
50mM トリス緩衝液 pH7.5
0.03% ４アミノアンチピリン（4-AA）（和光純薬社製）
0.02% フェノール（和光純薬社製）
4.5U/ml パーオキシダーゼ（POD）（シグマ社製）
1.0mM α-カルボベンズオキシ-ε-D-フルクトシル-L-リジン若しくはフルクト
シルバリン（ハシバらの方法に基づき合成、精製した。Hashiba H、
J.Agric.Food Chem.24：70、1976 以下ZFL、FVと略す。）
上記の反応液1mlを小試験管に入れ、37℃-5分間予備加温した後、適当に希釈した酵素
液0.02mlを添加して攪拌し、反応を開始する。正確に10分間反応の後に0.5％のSDSを2ml
添加して反応を停止し、波長500nmの吸光度を測定する(As)。またブランクとして酵素液
のかわりに蒸留水0.02mlを用いて同一の操作を行って吸光度を測定する(Ab)。この酵素作
用の吸光度(As)と盲検の吸光度(Ab)の吸光度差(As-Ab)より酵素活性を求める。別にあら
かじめ過酸化水素の標準溶液を用いて吸光度と生成した過酸化水素との関係を調べ、37℃
-1 分間に1 μmolの過酸化水素を生成する酵素量を1Uと定義する。計算式を下記に示す。
3.02 ： 総反応液量(ml)
0.02 ： 酵素溶液量(ml)
10 ： 反応時間
2 ： 過酸化水素2 分子から4-AA、フェノールが縮合した色素1
分子を生じることによる係数
12.0 ： 4-AA-フェノールのミリモル吸光係数
Ｂ ： 酵素液の希釈倍率
以上の方法によって得られる変異FODのうち、配列表配列番号１のアミノ酸配列372番のリ
ジンがトリプトファンに置換された変異FODの酵素学的性質は以下のようである。
【００４２】
（１）基質特異性
ZFL 100%
FV 0%
（２）酵素作用
下記に示すように、少なくともα-アミノ酸、ε-アミノ酸のアマドリ化合物を分解して
、グルコソンと過酸化水素および対応するα-アミノ酸、ε-アミノ酸を生成する反応を触
媒する。
（３）分子量
本酵素の分子量はSephadex・G-100を用いたカラムゲル濾過法で、0.2MのNaCl含有0.1M
のリン酸緩衝液（pH7.0）を溶出液として測定した結果、48000±2000、SDS-PAGEでは4700
0±2000であった。
（４）等電点
キャリアアンフォライトを用いる焦点電気泳動法によって４℃、700Vの定電圧で40時間
通電した後、分画し、各画分の酵素活性を測定した結果、pH4.3±0.2であった。
（５）Km値
50mMのトリス塩酸緩衝液（pH7.5）
0.03%の4-AA
0.02%のフェノール
4.5U/mlのパーオキシダーゼ
を含む反応液中で合成基質ZFLの濃度を変化させて、ZFLに対するKm値を測定した結果、3.
4mMの値を示した。
（６）至適pH
前記の酵素活性測定法に従い、反応液中の50mMのトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）に代え
て100mMの酢酸緩衝液（pH4.4-5.4）、リン酸緩衝液（pH5.6-7.9）、トリス−塩酸緩衝液
（pH7.3-8.5）、およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH8.0-10.3）の各緩衝液を
用いて測定した。この結果、pH7.5で最大の活性を示した。
（７）pH安定性
本酵素0.5Uを含有する0.5Mの至適pHを測定するときに用いた各種緩衝液0.5mlを40℃、1
0分間処理した後、その残存活性を後記の活性測定法に従って測定した。この結果、pH7.0
-9.0の範囲で80％以上の活性を保持していた。
（８）熱安定性
本酵素0.5Uを0.2Mのトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）で調製し、10分間加熱処理後、その
残存活性を活性測定法に従って測定した。この結果、40℃までは残存活性として95％以上
を保持した。
（９）至適温度
40mMのトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）を用い、活性測定法に従い、各温度で10分間反応
後、0.5％のラウリル硫酸ナトリウム（以下SDSと略称する）溶液2mlで反応を停止し、波
長500nmで吸光度を測定した。この結果、50℃で最大の活性を示した。
【００４３】
次に、FODについて配列表配列番号１のアミノ酸配列372番のリジンを他のアミノ酸に置
換することにより糖化バリン反応性を著しく低下させた変異型FODを用いて被検液中の糖
化リジンを消去した後に、糖化バリンに反応性を有するFODを用いて被検液中の糖化バリ
ンを測定する方法について述べる。
被検液中の糖化リジンを消去するFODは糖化バリンに作用しないFODであればなんら限定
されるものではないが、例えばFODについて配列表配列番号１のアミノ酸配列372番のリジ
ンを他のアミノ酸に置換することにより糖化バリン反応性を著しく低下させた変異型FOD
が用いられ、さらに好適には変異FODのうち、配列表配列番号１のアミノ酸配列372番のリ
ジンがトリプトファン、メチオニン、バリンのいずれかに置換された変異FODを用いれば
良い。このとき反応液に添加する酵素量は被検液中の糖化リジンを消去するのに十分な量
であればよく、例えば、0.5〜200U/ml、好適には1〜50U/mlである。
また、糖化バリンを測定するFODについては糖化バリンに反応性を持つFODであれば何ら
限定されるものではなく、例えば、フザリウム・オキシスポルムIFO-9972株由来FODを用
いれば良い。このとき反応液に添加する酵素量は被検液中の糖化バリンを測定するのに十
分な量であればよく、例えば、0.5〜200U/ml、好適には1〜50U/mlである。
【００４４】
具体的な測定方法は、まず、第一反応にて、糖化リジンおよび糖化バリンを含有する被
検液中の糖化リジンに変異型FODを作用させ、このとき生成する過酸化水素はカタラーゼ
等によって分解させ、第二反応にて、被検液中の糖化バリンにFODを作用させ生成する過
酸化水素を４−アミノアンチピリン(4-AA)およびトリンダー試薬と反応させ、生成する色
素を比色測定すればよい。また、第二反応液中にカタラーゼの阻害剤であるアジ化ナトリ
ウムを添加してもよい。
【００４５】
本発明を用いて糖化蛋白質を正確に測定する際に使用しうるグロブリン成分選択的なプ
ロテアーゼ阻害剤としては、被検液に、プロテアーゼをグロブリン成分選択的なプロテア
ーゼ阻害剤存在下作用せしめ、主にグロブリン成分以外の蛋白質を断片化しうるグロブリ
ン成分選択的な阻害剤であればいかなる阻害剤を用いても良い。その好ましい例としては
デオキシコール酸、デオキシコール酸アミド、コール酸アミド、第四級アンモニウム塩、
第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤、コンカナバリンＡ、オクチルグルコシド若
しくはベタインがあげられる。
デオキシコール酸アミドとしては、例えばビスグルコナミドプロピルデオキシコーラミ
ド(N,N-Bis(3-D-gluconamidopropyl)deoxycholamido)等が好ましく、コール酸アミドとし
ては、例えば、硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパン(3-[(3
-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxypropanesulfonicacid)、硫酸-3-[(コール
アミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハイドロキシ-1-プロパン(3-[(3-Cholamidoprop
yl)dimethylammonio]propanesulfonic acid)若しくはビスグルコナミドプロピルコーラミ
ド(N,N-Bis(3-D-gluconamido propyl)cholamido)等が好ましい。
第四級アンモニウム塩としては、例えば塩化ベンジルトリエチルアンモニウム、塩化ベ
ンジルトリ-n-ブチルアンモニウム等が好ましく、第四級アンモニウム塩型陽イオン界面
活性剤としては、例えば塩化ラウリルトリメチルアンモニウム若しくはラウリルジメチル
アミンオキサイド等が好ましい。
これらのグロブリン成分選択的な阻害剤は単独若しくは組み合わせて用いても良い。
【００４６】
また、これらのグロブリン成分選択的な阻害剤の使用濃度としては、プロテアーゼ作用
中にグロブリン成分への作用を十分抑えられる量であれば良く、例えばデオキシコ−ル酸
、デオキシコール酸アミド、コール酸アミド、オクチルグルコシド、第四級アンモニウム
塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤を用いる場合には0.01％〜20％程
度の濃度で使用することが好ましく、さらに好ましくは0.05％〜10％でありまたこれ以外
の濃度を用いることもできる。
また同様に例えばコンカナバリンＡ、オクチルグルコシドもしくはベタインを用いる場
合にはそれぞれ0.01〜10mg/ml、0.005〜5％の濃度で使用することが出来、またそれぞれ0
.02〜2mg/ml、0.01〜2％の濃度で使用することが好ましくこれ以外の濃度を用いることも
できる。
【００４７】
本発明を用いて糖化蛋白質を正確に測定する際に使用しうるASOxとしては、被検液に含
まれるアスコルビン酸に有効に作用するものであればいかなるものを用いても良いが、例
えば植物または微生物由来のASOx 等が挙げられる。具体的な例を以下に示すがこれらは
１例に過ぎず、なんら限定されるものではない。
植物由来のASOxの例としては、キュウリ由来（アマノ社製、東洋紡社製）およびカボチ
ャ由来（ロシュ社製、東洋紡社製）が挙げられる。
微生物由来のASOxの例としてはアクレモニウム（Acremonium）由来（旭化成社製）、微
生物由来（アマノ社製）が挙げられる。
ASOxの活性は下記の方法にて測定した。
【００４８】
＜＜ASOxの活性測定法＞＞
＜保存基質溶液＞
Lアスコルビン酸（和光純薬社製）176mgとEDTA（第一化学薬品社製）37mgを1mM塩酸100
mlで溶解する。
＜反応試薬混合液＞
上記の保存基質溶液を0.45mMのEDTAを含む90mM 燐酸2カリ−5mM燐酸1ナト緩衝液で20
倍に希釈する。
＜操作＞
上記の反応試薬混合液1mlを小試験管に入れ、30℃-5分間予備加温した後、適当に希釈
した酵素液0.10mlを添加して攪拌し、反応を開始する。正確に5分間反応の後に0.2N塩酸
水溶液3.0mlを添加して反応を停止し、波長245nmの吸光度を測定する(As)。またブランク
として上記の反応液1mlを小試験管に入れ、30℃-5分間予備加温した後、0.2N塩酸水溶液3
.0mlを添加して反応を停止する。適当に希釈した酵素液0.10mlを添加して攪拌し、波長24
5nmの吸光度を測定する(Ab)。この酵素作用の吸光度(As)と盲検の吸光度(Ab)の吸光度差(
Ab-As)より酵素活性を求める。30℃-1 分間に1μmolのアスコルビン酸をデヒドロアスコ
ルビン酸に酸化する酵素量を1Uと定義する。計算式を下記に示す。
10.0：ｐH1.0の条件でアスコルビン酸の245ｎｍに於けるミリモル分子吸光係数
5：反応時間（min）
4.10：反応液総量(ml)
0.10：反応に供した酵素試料液量
Ｂ：酵素液の希釈倍率
また、これらのASOxの使用濃度としては、プロテアーゼとASOxを共存させ保存する場合
に、試薬使用時でも十分なアスコルビン酸の消去が可能な量であれば良く、例えば通常0.
1U/ml〜100U/ml、好ましくは1U/ml〜50U/mlの濃度で用いればよい。
【００４９】
本発明を用いて糖化蛋白質を正確に測定する際にASOxと組み合わせて使用しうる4-(2-
ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル基を持たない緩衝剤としては、プロテアーゼとASOxを
共存させた状態で、ASOxが安定である緩衝剤であればいかなるものを用いても良いが、例
えば3-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸（EPPS）、2-[4-(2
-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸（HEPES）及び2-ヒドロキシ-3-[4
-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸（HEPPSO）等の4-(2-ヒドロ
キシエチル)-1-ピペラジニル基を持つ緩衝剤以外の緩衝剤であればいかなる緩衝剤を用い
ても良い。
さらに、好ましい緩衝剤の例としては、例えばN-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンス
ルホン酸(ACES)、N-(2-アセトアミド)イミノジ酢酸(ADA)、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル
)-2-アミノエタンスルホン酸(BES)、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン(Bicine)、
ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン(Bis-Tris)、N-シクロ
ヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸(CAPS)、N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシ-3-アミ
ノプロパンスルホン酸(CAPSO)、N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸(CHES)、3-
[N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、2-モ
ルフィリノエタンスルホン酸(MES)、3-モルフィリノプロパンスルホン酸(MOPS)、2-ヒド
ロキシ-3-モルフィリノプロパンスルホン酸(MOPSO)、ピペラジン-1,4-ビス（2-エタンス
ルホン酸(PIPES)、ピペラジン-1,4-ビス（2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸）(POPSO)
、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPS)、2-ハイドロ
キシ-N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPSO)、N-トリ
ス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノプロパンスルホン酸(TES)、N-[トリス(ヒドロキシ
メチル)メチル]グリシン(Tricine)およびトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）
等があげられる。
最も好ましい緩衝剤の例としては例えばトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）
及びピペラジン-1,4-ビス（2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸）(POPSO)が挙げられる
。
これらのASOxと共に使用する緩衝剤の使用濃度としては、プロテアーゼ共存下でもASOx
が安定である濃度であり、かつプロテアーゼ及びASOxの反応に影響を及ぼさない濃度であ
ればいかなる量用いても良く、例えば通常1mM〜1M、好ましくは5mM〜500mMの濃度で用い
ればよい。
【００５０】
本発明を用いて糖化アルブミンを正確に測定する際に使用しうるアルブミンの蛋白質変
性剤及び／またはＳ−Ｓ結合を有する化合物としてはBCPのアルブミンに対する反応性がG
A及びNGAで一致すればいかなるものを用いても良い。
好ましい蛋白質変性剤の例としては、例えば、尿素、グアニジン化合物、陰イオン界面
活性剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム(SDS)、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエ
ーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、アルキル
ベンゼンスルホン酸塩が挙げられ、これらは単独若しくは組み合わせて用いることが出来
る。また、これらの蛋白質変性剤の使用濃度としては、BCPのアルブミンに対する反応性
がGA及びNGAで一致する濃度であれば良く、例えば通常0.01％〜10％、好ましくは0.05％
〜5％の濃度で用いればよい。
好ましいＳ−Ｓ結合を有する化合物としては6,6'-ジチオジニコチン酸(6,6'-dithiodin
icotinic acid)、3,3'-ジチオジプロピオン酸(3,3'-dithiodipropionic acid)、2,2'-ジ
チオジサリチル酸(2,2'-dithiodibenzoicacid)、4,4'-ジチオジモルホリン(4,4'-dithiod
imorpholine)、2,2'-ジヒドロキシ-6,6'-ジナフチルジスルフィド(2.2'-dihydroxy-6,6'-
dinaphthyl disulfide;DDD)、2,2'-ジチオジピリジン(2,2'-dithiopyridine;2-PDS)、4,4
'-ジチオジピリジン(4,4'-dithiopyridine;4-PDS)、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)
(5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid);DTNB)、2,2'-ジチオビス(5-ニトロピリジン)(2
,2'-dithiobis-(5-nitropyridine))等があげられる。
また、これらのＳ−Ｓ結合を有する化合物の使用濃度としては、BCPのアルブミンに対
する反応性がGA及びNGAで一致する濃度であれば良く、例えば通常1μM〜10mM、好ましく
は10μM〜5mMの濃度で用いればよく、これ以外の濃度で用いても良い。
【００５１】
本発明を用いて糖化蛋白質を正確に測定する際に使用しうるプロテアーゼの安定化剤と
しては、試薬保存中にプロテアーゼの活性低下を抑える物質であればいかなるものを用い
ても良く、特に試薬を液体の状態で保存中にプロテアーゼの活性低下を抑える物質であれ
ば好ましい。
好ましい安定化剤の例としてはジメチルスルホオキシド、アルコール、水溶性カルシウ
ム塩、食塩、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤
があげられる。アルコールの例としては、エタノール、プロパノール、エチレングリコー
ル、グリセリン等が、第四級アンモニウム塩第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤
の例としてはラウリル硫酸トリエタノールアミン、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム
等があげられる。
また、これらのプロテアーゼ安定化剤の使用濃度としては、試薬保存中にプロテアーゼ
の活性低下を抑える物質であればいかなる濃度で用いても良く、特に試薬を液体の状態で
保存中にプロテアーゼの活性低下を抑える濃度であれば好ましい。好ましい濃度の例とし
ては、例えば通常0.01％〜30％、好ましくは0.1％〜20％の濃度で用いればよく、これ以
外の濃度で用いても良い。
【００５２】
本発明を用いて糖化蛋白質を正確に測定する際に使用しうる少なくとも糖化アミノ酸に
作用する酵素の安定化剤としては、試薬保存中に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素
の活性低下を抑える物質であればいかなるものを用いても良く、特に試薬を液体の状態で
保存中に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の活性低下を抑える物質であれば好まし
い。
好ましい安定化剤の例としては糖アルコール、スクロース、水溶性マグネシウム塩、水
溶性カルシウム塩、硫安、アミノ酸、ザルコシンがあげられる。糖アルコールの例として
は、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、グリセリン等が、アミノ酸としては全
てのアミノ酸に強い安定化効果があるが中でもより好ましくは、プロリン、グルタミン酸
、アラニン、バリン、グリシン、リジン等があげられる。
また、これらの少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化剤の使用濃度としては
、試薬保存中に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の活性低下を抑える物質であれば
いかなる濃度で用いても良く、特に試薬を液体の状態で保存中に少なくとも糖化アミノ酸
に作用する酵素の活性低下を抑える濃度であれば好ましい。好ましい濃度の例としては、
例えば糖アルコール、スクロース、アミノ酸、ザルコシンの場合、通常0.01％〜30％、好
ましくは0.1％〜20％の濃度で用いればよく、水溶性マグネシウム塩、水溶性カルシウム
塩、硫安の場合、通常1mM〜1M、好ましくは10mM〜500mMの濃度で用いればよく、これ以外
の濃度で用いても良い。
【００５３】
本発明の糖化蛋白質測定用組成物に於ける液組成については、プロテアーゼを含む蛋白
質分解試薬、生成した糖化アミノ酸若しくはペプチドの測定を行う糖化アミノ酸測定試薬
を同一反応槽中で使用できるよう適宜組み合わせれば良い。またこれらの試薬は液状品及
び液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供できる。
本発明に使用しうる蛋白質分解試薬組成としては、蛋白質分解反応が効率よく進行する
ようにpH、緩衝剤及びプロテアーゼ濃度を決定し、その後グロブリン成分選択的なプロテ
アーゼ阻害剤、ASOx、プロテアーゼ安定化剤を前述の有効な濃度になるよう適宜調製して
添加すればよい。
例えばプロテアーゼタイプXXIV（シグマ社製）を用いる場合にはpHが7 〜10付近で蛋白
質分解活性が強く、反応のpHは7 〜10を選択できる。緩衝液としては4-(2-ヒドロキシエ
チル)-1-ピペラジニル基を持たない緩衝剤である例えばpH7.2〜8.5に緩衝作用のあるPOPS
O緩衝液を使用することが出来、POPSOの濃度は1〜100mMの濃度、好ましくは10〜500mMで
使用すればよい。
またプロテアーゼ添加濃度は実際に使用される反応時間中に被検液中の糖化蛋白質を十
分に分解し得る濃度で有れば良く、100 〜50万PU/ml が好ましく、500〜10万PU/ml がよ
り好ましい。
グロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害剤、ASOx、プロテアーゼ安定化剤との組み合
わせとしては、例えばグロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害剤として硫酸-3-[(コー
ルアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパン、0.01％〜20％、好ましくは0.05％
〜10％、カボチャ由来アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製）、0.1U/ml〜100U/ml、
好ましくは1U/ml〜50U/ml、プロテアーゼ安定化剤としてジメチルスルホオキシド0.01％
〜30％、好ましくは0.1％〜20％等を用いることができる。
【００５４】
本発明に使用しうる糖化アミノ酸測定試薬組成については、使用する少なくとも糖化ア
ミノ酸に作用する酵素の至適pHを考慮し反応が効率よく進行するようにpHを選択し、次に
糖化アミノ酸に作用する酵素量を決定し、最後に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素
の安定化剤を添加すればよい。
例えばR-FOD 若しくはR-FOD-II（旭化成社製）を使用する場合、最大活性の50％ 以上
の活性を示す領域がpH6.5 〜10と広く、反応のpHは6.5 〜10を選択できる。また酵素添加
濃度は、使用される反応液中で糖化アミノ酸を十分に検出し得る濃度で有れば良く、0.5
〜200U/mlが好ましく、1〜50U/ml がより好ましい。
少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化剤としては、例えばグルタミン酸を用
いることができ、0.01％〜30％、好ましくは0.1％〜20％の濃度で用いればよい。
【００５５】
本発明に使用しうる第１試薬に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素、第２試薬にプ
ロテアーゼを含有する組成物としては、第１試薬をプロテアーゼ及び少なくとも糖化アミ
ノ酸に作用する酵素の作用可能な条件、例えばｐＨ、塩濃度、等を設定し、第２試薬には
プロテアーゼの保存に適した条件を設定すれば如何なる条件を用いても良い。
例えばＲ-ＦＯＤ、プロテアーゼタイプＸＸＩＶを使用する場合には、それぞれｐＨ６
．５〜１０、７〜１０で酵素が良く作用することから第１試薬はｐＨ７〜１０を選択し比
較的高濃度の例えば２０〜１０００ｍＭの緩衝剤濃度を選択すればよい。一方本プロテア
ーゼはｐＨ７以下で安定であることから、第２試薬のｐＨは７以下を選択し第１試薬より
も比較的低濃度の例えば１〜５０ｍＭ緩衝剤濃度を選択し、加えて例えばジメチルスルホ
オキシド１〜５０％程度のプロテアーゼ安定化剤を添加すると好ましい。この場合第１試
薬と第２試薬の混合の割合を例えば４：１と第１試薬を多くすればさらに高濃度の安定化
剤や第１試薬からかけ離れたｐＨ等が選択可能である。
【００５６】
さらに本発明に基づく糖化蛋白質を測定する酵素反応組成には、例えば界面活性剤、塩
類、緩衝剤、ｐＨ調製剤や防腐剤などを適宜選択して添加しても良い。
界面活性剤としてはポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンソル
ビタン脂肪酸エステル類、ポリビニルアルコール等の0.01〜10％、好適には0.05〜5％、
各種金属塩類、例えば塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マンガン、塩
化コバルト、塩化亜鉛、塩化カルシウム等の1mM〜5M、好適には10mM〜1M、各種緩衝液、
例えばトリス−塩酸緩衝液、グリシン−NaOH緩衝液、燐酸緩衝液、グッドの緩衝液等の10
mM〜2M、好適には20mM〜1M、各種防腐剤、例えばアジ化ナトリウムの0.01〜10％、好適に
は0.05〜1％を適宜添加すれば良い。
【００５７】
本発明に使用しうる糖化蛋白質の測定方法としては、前記本発明の糖化蛋白質測定用組
成物に被検液0.001〜0.5mlを加え、37℃の温度にて反応させ、レートアッセイを行う場合
には、反応開始後一定時間後の2点間の数分ないし数十分間、例えば3分後と4分後の1分間
、または3分後と8分後の5分間における変化した補酵素、溶存酸素、過酸化水素若しくは
その他生成物の量を直接または間接的に前記の方法で測定すれば良く、エンドポイントア
ッセイの場合には反応開始後一定時間後の変化した補酵素、溶存酸素、過酸化水素若しく
はその他生成物の量を同様に測定すれば良い。この場合既知濃度の糖化蛋白質を用いて測
定した場合の吸光度等の変化と比較すれば被検液中の糖化蛋白質量を求めることができる
。
【００５８】
本発明に使用しうる少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素作用の検出は、例えばデヒ
ドロゲナーゼを用いた場合には補酵素の変化量を直接測定するか、若しくは生じた還元型
補酵素を各種ジアフォラーゼ、またはフェナジンメトサルフェート等の電子キャリアー及
びニトロテトラゾリウム、WST-1、8（以上同人化学研究所社製）に代表される各種テトラ
ゾリウム塩等の還元系発色試薬を用い間接的に測定しても良く、またこれ以外の公知の方
法により直接、間接的に測定しても良い。
また例えばオキシダーゼを用いた場合には、酸素の消費量または反応生成物の量を測定
することが好ましい。反応生成物として、例えばR-FODを用いた場合には反応により過酸
化水素及びグルコソンが生成し、過酸化水素及びグルコソン共に公知の方法により直接、
間接的に測定する事が出来る。
上記過酸化水素の量は、例えばパーオキシダーゼ等を用いて色素等を生成し、発色、発
光、蛍光等により測定しても良く、また電気化学的手法によって測定しても良く、カタラ
ーゼ等を用いてアルコールからアルデヒドを生成せしめて、生じたアルデヒドの量を測定
しても良い。
【００５９】
過酸化水素の発色系は、パーオキシダーゼの存在下で4-AA若しくは3-メチル-2-ベンゾ
チアゾリノンヒドラゾン(MBTH)等のカップラーとフェノール等の色原体との酸化縮合によ
り色素を生成するトリンダー試薬、パーオキシダーゼの存在下で直接酸化、呈色するロイ
コ型試薬等を用いることが出来る。
トリンダー型試薬の色原体としては、フェノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン
誘導体等が使用可能であり、具体例として、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピ
ル）-m-トルイジン（TOOS）、N,Nビス（４−スルホプロピル）-3-メチルアニリン2ナトリ
ウム(TODB)（以上同人化学研究所社製）等が挙げられる。
またロイコ型試薬の具体例としては、N-（カルボキシメチルアミノカルボニル）-4,4-
ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン（DA64）、10-（カルボキシメチルアミノカル
ボニル）-3,7- ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（DA67）（以上和光純薬社製）等
が挙げられる。
蛍光法には、酸化によって蛍光を発する化合物、例えばホモバニリン酸、4-ヒドロキシ
フェニル酢酸等を、化学発光法には、触媒としてルミノール、ルシゲニン、イソルミノー
ル等を用いることが出来る。
【００６０】
また過酸化水素を電極を用いて測定する場合、電極には、過酸化水素との間で電子を授
受する事の出来る材料である限り特に制限されないが、例えば白金、金若しくは銀等が挙
げられ、電極測定方法としてはアンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリー
等の公知の方法を用いることが出来、さらにオキシダーゼまたは基質と電極との間の反応
に電子伝達体を介在させ、得られる酸化、還元電流或いはその電気量を測定しても良い。
電子伝達体としては電子伝達機能を有する任意の物質が使用可能であり、例えばフェロセ
ン誘導体、キノン誘導体等の物質が挙げられる。またオキシダーゼ反応により生成する過
酸化水素と電極の間に電子伝達体を介在させ得られる酸化、還元電流またはその電気量を
測定しても良い。
【００６１】
糖化蛋白質が糖化アルブミンであり、糖化アルブミン割合を正確に測定する場合に、本
発明において用いることができるアルブミン測定試薬としては、蛋白質変性剤及び／また
はＳ−Ｓ結合を有する化合物及びブロモクレゾールパープルを含有する組成物として調製
されているものであり、GAとNGAの間で測定に乖離を生じない組成であればいかなる組成
を用いても良い。
例えば蛋白質変性剤及び／またはＳ−Ｓ結合を有する化合物としてラウリル硫酸ナトリ
ウム及び5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)を用いる場合には、BCPの発色に影響を与え
ないように低濃度の緩衝液例えば１〜20mMを用い、ラウリル硫酸ナトリウム0.01％〜10％
、好ましくは0.05％〜5％及び5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)１μM〜10mM、好まし
くは10μM〜5mMの濃度で用いれば良い。またBCPは中性以上で激しく着色することからpH4
.5〜7.5で使用すると良い。
【００６２】
本発明に使用しうるアルブミンの測定方法としては、前記本発明のアルブミン測定用組
成物に被検液0.001〜0.5mlを加え、37℃の温度にて反応させ、１ポイントアッセイにて反
応開始から一定時間後の色素の量を測定すれば良い。アルブミン-BCPの発色の検出は吸収
極大が600nm付近であるから、550nm〜630nm付近で検出を行うと良い。この場合既知濃度
のアルブミンを用いて測定した場合の吸光度及び水のブランクと比較すれば被検液中のア
ルブミンの量を求めることができる。
【００６３】
本発明の測定対象となる被検液は、少なくとも糖化蛋白質を含有する被検液であれば如
何なるものを用いても良いが、好ましい被検液としては血液成分、例えば血清、血漿、血
球、全血等が挙げられる。また分離された赤血球も、分離の条件によってはグロブリン成
分が混入し測定値に影響を与える可能性があることから好ましい被検液として用いること
ができる。
本発明の糖化蛋白質測定組成物及び測定方法に於ける測定対象である糖化蛋白質として
は、例えばGAまたはGHbが挙げられるが、測定対象となる糖化蛋白質は何らこれらに限定
されるものではなく、何れの糖化蛋白質を測定しても良い。
ついで、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明は何らこれにより限定されるもので
はない。
【実施例１】
【００６４】
グロブリン成分に作用しないプロテアーゼをスクリーニングする目的で、プロテアーゼ
をアルブミン、グロブリン成分及びヘモグロビンに作用させ生じた糖化アミノ酸若しくは
糖化ペプチドをR-FOD（旭化成社製）にて測定した。
＜基質溶液＞
1; HSA基質溶液; Albumin Human; Essencially Globulin Free; 25mg/ml、GA%=31.9%
、フルクトサミン（FRA）値=256μmol/L [シグマ社製; 基質溶液中のアルブミン濃度はア
ルブミン測定キット(アルブミンII-HAテストワコー; 和光純薬社製)にて測定、GA%は糖化
アルブミン測定計(GAA-2000; 京都第一科学社製)にて測定した。
2; G-II,III基質溶液、FRA値48μmol/L[Globulins Human Cohn Fraction II,III;
16.9mg/ml(シグマ社製)]
3; G-IV基質溶液、FRA値26μmol/L[Globulins Human Cohn Fraction IV;6mg/ml(シグ
マ社製)]
4; G-I基質溶液、FRA値77μmol/L[グロベニンI;glovenin-I;免疫グロブリン製剤(武
田薬品社製)]
5; Hb基質溶液; Hemoglobin Human; 55mg/ml、糖化へモグロビン率;HbA1c=4.5%[シグ
マ社製;HbA1c値は糖化へモグロビン計(ハイオートエーワンシーHA-8150 ;京都第一科学社
製)にて測定した。]
なお基質溶液のフルクトサミン値はフルクトサミン測定キット（オートワコーフルクト
サミン、和光純薬社製）にて測定した。
＜プロテアーゼ反応試料作成＞
Hb以外の基質溶液200μl、プロテアーゼ溶液100mg/ml(この濃度が作成できない場合は
可能な限り濃い濃度、また溶液状のものはそのままの濃度)40μl、及び1Mトリス緩衝液(p
H8)10μlを良く混合し37℃-30分反応させ、1万膜(ウルトラフリーMC; ミリポア社製)で濾
過し、濾液をプロテアーゼ反応試料とした。また、基質の代わりに蒸留水を用い同様の操
作を行い、ブランク試料とした。
一方Hb基質溶液の場合は基質溶液150μl、プロテアーゼ溶液200mg/ml(この濃度が作成
できない場合は可能な限り濃い濃度、また溶液状のものはそのままの濃度)を60μl及び1M
トリス緩衝液(pH8)5μlを良く混合し37℃-60分反応させ、1万膜(ウルトラフリーMC；ミリ
ポア社製）で濾過し、濾液をプロテアーゼ反応試料とした。また、基質の代わりに蒸留水
を用い同様の操作を行い、ブランク試料とした。
【００６５】
＜プロテアーゼ反応試料中の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドの測定＞
＜反応液組成＞
50mM トリス緩衝液 pH8.0
0.02% 4-AA(和光純薬社製)
0.02% N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-m-トルイジン
(TOOS）(同人化学研究所社製)
2U/ml R-FOD(旭化成社製)
5U/ml POD(シグマ社製)
＜反応手順＞
上記糖化アミノ酸測定反応液300μlをセルに分注し37℃-3分間インキュベーションし55
5nmを測光する(A0)。続いてプロテアーゼ反応試料30μlを添加し37℃-5分間インキュベー
ションし555nmを測光する(A1)。またプロテアーゼ反応試料の代わりにブランク試料を用
い同様の操作を行いA0ブランク、A1ブランクを測定する。プロテアーゼの糖化蛋白質への
作用を吸光度変化で示すと下式となる。
ΔA=(A1-A0)-(A1ブランク-A0ブランク)
pH8.0における代表的なプロテアーゼのアルブミン、グロブリン、ヘモグロビンへの作
用(ΔA)を表１に示す。
【００６６】
【表１】
【００６７】
G-IV基質溶液中の糖化蛋白質に対する作用はどのプロテアーゼも小さい若しくは0であ
ったため、またG-II、-III基質溶液の測定値とG-I基質溶液の測定値がほぼ同じであった
ために表１にはグロブリン成分についてG-I基質溶液の結果のみを記載した。表１から分
かるようにアスペルギルス(Aspergillus)属由来のプロテアーゼ、及びプロテアーゼタイ
プXIVはグロブリン成分中の糖化グロブリンにも良く作用している。
しかしながらアルブミン中のGA及びヘモグロビン中のGHbに作用するエンド型、エキソ
型プロテアーゼは共にグロブリン成分中の糖化グロブリンに作用を示した。よって血清又
は血漿中のGA若しくは全血及び血球中のGHbを測定する場合にプロテアーゼの選択のみで
はグロブリン成分の影響を回避できないと考えられた。
【実施例２】
【００６８】
＜グロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害剤のスクリーニング＞
前記HSA基質溶液に高い作用を示すプロテアーゼタイプXXIV（シグマ社製）を用いて、H
SA基質溶液を基準に、前記各種グロブリン基質溶液へのプロテアーゼ作用を低下させる物
質をスクリーニングした。
＜反応液組成＞
R-1 蛋白質分解試薬
150mM トリシン緩衝液（和光純薬社製）pH8.5
2500U/ml プロテアーゼタイプXXIV（シグマ社製 + グロブリン選択的なプロテアー
ゼ阻害剤(デオキシコール酸、デオキシコール酸アミド、コール酸アミド、第四級アンモ
ニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤;1%、コンカナバリンＡ;0.
21mg/ml、ベタイン;0.1%、オクチルグルコシド;1%；同人化学研究所社製)
R-2 糖化アミノ酸測定試薬
150mM トリシン緩衝液（和光純薬社製）pH8.5
0.12% 4-AA(和光純薬社製)
0.08% TOOS(同人化学研究所社製)
24U/ml R-FOD(旭化成工業社製)
20U/ml POD(シグマ社製)
R-1 蛋白質分解試薬中のデオキシコール酸アミドとしては、ビスグルコナミドプロピル
デオキシコーラミドを、コール酸アミドとしては硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチ
ルアンモニオ]-1-プロパン、硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハ
イドロキシ-1-プロパン若しくはビスグルコナミドプロピルコーラミド、第四級アンモニ
ウム塩としては塩化ベンジルトリエチルアンモニウム、塩化ベンジルトリ-n-ブチルアン
モニウム、第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤としては、塩化ラウリルトリメチ
ルアンモニウム及びラウリルジメチルアミンオキサイドを使用した。
＜基質溶液＞
1; HSA基質溶液; Albumin Human; 40mg/ml、GA%=10.5%[和光純薬社製; 基質溶液中のア
ルブミン濃度はアルブミン測定キット(アルブミンII-HAテストワコー; 和光純薬社製)に
て測定し、GA%は糖化アルブミン測定計(GAA-2000;京都第一科学社製)にて測定した。]
2;γグロブリン添加基質溶液;上記HSA基質溶液にγグロブリン [γGlobulin s Human
(シグマ社製) フルクトサミン値34μM] 17.0mg/mlを添加した。
＜反応手順＞
37℃にインキュベートされたR-1;240μlに基質溶液（HSA基質溶液、G-I基質溶液）8μl
を添加し、37℃で反応を開始し、正確に5分後にR-2;80μlを添加した。R-2添加前後の546
nmの吸光度を測定し、その差を吸光度変化とした。また基質の代わりに蒸留水を用い同様
の操作を行い、ブランク試料とし、さらにグロブリン選択的なプロテアーゼ阻害剤を添加
しない反応液をコントロールとした。
HSA基質溶液から得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変化を差し引いたΔA(H
SA)及びγグロブリン添加基質溶液から得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変
化を差し引いたΔA(+γグロブリン)を算出し、
γグロブリン添加の影響
＝(ΔA(+γグロブリン) -ΔA(HSA))/ΔA(HSA)×100(%)
様々な候補物質の共存下及び非共存下（コントロール試料）にて比較した。その結果を表
２に示す。
【００６９】
【表２】
【００７０】
表２から分かるようにデオキシコール酸、デオキシコール酸アミド、コール酸アミド、
第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤、コンカナバ
リンＡ、オクチルグルコシド及びベタインにグロブリンへのプロテアーゼ作用を阻害する
効果が確認され、これらグロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害剤及びプロテアーゼを
用いることにより主にグロブリン以外の蛋白質を断片化できることが明白となった。
さらにHSA基質溶液の代わりにHb基質溶液を用い同様の測定を行った。但しHb基質溶液
を用いた場合にはR-1反応終了後、トリクロル酢酸にて除蛋白、中和後R-2を添加し評価を
行った。Hb基質溶液を用いた場合にもデオキシコール酸、デオキシコール酸アミド、コー
ル酸アミド、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤
、コンカナバリンＡ及びベタインにグロブリンへのプロテアーゼ作用を阻害する効果が確
認された。
【実施例３】
【００７１】
＜硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンのグロブリン成分選
択的なプロテアーゼ阻害効果＞
様々なプロテアーゼを用い、硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-
プロパンのグロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害効果を確認した。
R-1 蛋白質分解試薬
150mM トリシン緩衝液（和光純薬社製）pH8.5
2500U/ml プロテアーゼ*
1% 硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパン
＊ プロテアーゼはオリエンターゼ22BF(阪急バイオインダストリー社製)、プロテ
アーゼタイプVIII、プロテアーゼタイプXIV、プロテアーゼタイプXXVII（以上
シグマ社製）を使用した。
R-2 糖化アミノ酸測定試薬
実施例２に同じ
＜基質溶液＞
実施例２に同じ。
＜反応手順＞
実施例２に同じ手順でγグロブリン添加の影響を硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメ
チルアンモニオ]-1-プロパンの共存下及び非共存下（コントロール試料）にて比較した。
その結果を表３に示す。なお、判定の欄について、γグロブリンの添加の影響が有意に低
下した場合に○とした。
【００７２】
【表３】
【００７３】
表３から分かるようにオリエンターゼ22BF、プロテアーゼタイプVIII、プロテアーゼタ
イプXIV、プロテアーゼタイプXXVIIはすべて硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルア
ンモニオ]-1-プロパン共存下にγグロブリン基質へのプロテアーゼ作用が低下し、一方HS
A基質に対する作用は保持されていた。このことから本発明におけるグロブリン成分選択
的なプロテアーゼ阻害剤はプロテアーゼの種類を問わず有効であることが明らかとなった
。
さらに同様にGHbを測定する場合にも本発明を用いることにより、グロブリン成分の影
響を回避できた。
【実施例４】
【００７４】
＜糖化アルブミンの希釈直線性＞
R-1 蛋白質分解試薬
150mM トリシン緩衝液（和光純薬社製）pH8.5
2500U/ml プロテアーゼタイプXXVII（シグマ社製）
1% 硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハイドロキシ-1-
プロパン（シグマ社製）
R-2 糖化アミノ酸測定試薬
実施例２に同じ
＜基質溶液＞
1：HSA基質溶液；実施例１と同じ。但し濃度は4.0g/dlで用いた。
2：γグロブリン基質溶液；実施例２と同じ。
3： グロブリンIV基質溶液；実施例１と同じ。
＜操作＞
HSA基質溶液(4g/dl)、γグロブリン（γG）及びグロブリンIV（GIV）基質溶液1.7g/dl)
の0.0、0.5、1.0、1.5、2.0倍濃度の試料を調製し希釈直線性を確認した。操作は実施例
３に同じ。但しHSA1.0倍濃度は10回測定しCV値を計算した。その結果を図１に示す。
【００７５】
図１から分かるようにγグロブリン及びグロブリンIV基質溶液共に濃度を変化させても
吸光度変化が得られなかった。一方HSA基質溶液は濃度に応じて良好な直線性が得られ、
グロブリン成分の影響を実質的に受けずに糖化アルブミンが測定されていることが明白で
ある。またHSA1.0倍濃度ではＣＶ値＝0.9％と良好な再現性が確認されており、本発明の
測定系を用いて10分の反応時間で糖化アルブミンが選択的に、感度良く、また再現良く測
定されていることが明らかとなった。
【実施例５】
【００７６】
＜糖化ヘモグロビンの希釈直線性＞
R-1 蛋白質分解試薬
77mM トリス緩衝液 ｐH8.0
2500U/ml プロテアーゼタイプXIV(シグマ社製)
1% 硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハイドロキ
シ-1-プロパン（シグマ社製）
R-2 糖化アミノ酸測定試薬
実施例２に同じ。
＜基質溶液＞
実施例１と同一のＨｂ基質溶液及び実施例４と同じγグロブリン及びグロブリンIV基質
溶液を使用した。
＜操作＞
Hb基質溶液(4g/dl)、γグロブリン及びグロブリンIV基質溶液(1.7g/dl)の0.0、0.5、1.
0、1.5、2.0倍濃度の試料を調製し希釈直線性を確認した。操作は実施例１に同じ。但しH
ｂ1.0倍濃度は10回測定しCV値を計算した。その結果を図２に示す。
【００７７】
図２から分かるようにγグロブリン及びグロブリンIV基質溶液共に濃度を変化させても
吸光度変化が得られなかった。一方Hb基質溶液は濃度に応じて良好な直線性が得られ、グ
ロブリン成分の影響を実質的に受けずに糖化ヘモグロビンが測定されていることが明白で
ある。またHb1.0倍濃度ではＣＶ値＝2.0％と良好な再現性が確認されており、本発明の測
定系を用いて10分の反応時間で糖化ヘモグロビンが選択的に、感度良く、また再現良く測
定されていることが明らかとなった。
【実施例６】
【００７８】
＜糖化アルブミンの直線性＞
R-1 蛋白質分解試薬 実施例４に同じ。
R-2 糖化アミノ酸測定試薬 実施例４に同じ。
＜基質溶液＞
血清A）* 糖尿病患者血清 GA%=32.9%；アルブミン濃度 4.3g/dl
血清B）* 健常者血清 GA%=16.4%；アルブミン濃度 4.1g/dl
＊ 上記血清A）とB）とを10：0、8：2、6：4、4：6、2：8、0：10の割合で混合し試
料とした。
＜操作＞ 実施例３に同じ。
結果を図３に示す。
【００７９】
図３から分かるようにアルブミン濃度を一定にした異なる糖化アルブミン率の試料に於
いても良好な直線性が得られた。従って本発明の糖化蛋白質の測定方法により、実際の血
清、血漿中の糖化アルブミンを定量的に検出できる事が分かった。また血清の代わりに赤
血球を溶血し作成したヘモグロビン基質溶液を用いても同様の直線性が確認された為、本
発明の糖化蛋白質の測定方法により、糖化ヘモグロビンを定量的に検出できることも確認
できた。
【実施例７】
【００８０】
＜糖化アルブミンHPLC法と酵素法（本発明）の相関性＞
R-1 蛋白質分解試薬 実施例４に同じ。
R-2 糖化アミノ酸測定試薬 実施例４に同じ。
＜基質溶液＞ 糖尿病患者血清 14検体
健常者血清 25検体
＜操作＞ 操作は実施例２に同じ。
糖尿病患者血清14検体を用い本発明に基づく酵素法と、公知のHPLC法の相関を確認した
。尚HPLC法の測定は、糖化アルブミン計(GAA-2000；アークレイ社製)にて糖化アルブミン
率を測定した。本発明に基づく測定方法から得られる吸光度変化は糖化アルブミン率と、
相関係数r=0.991と非常によい相関を示し、本発明に基づく測定方法は糖化アルブミンを
正確に測定していることが明らかとなった。
【実施例８】
【００８１】
＜アスコルビン酸オキシダーゼの安定化に及ぼす緩衝剤種類の効果＞
＜反応液組成＞
150mM 各種緩衝液 pH8.0
2500U/ml プロテアーゼタイプXXIV（シグマ社製）若しくはプロナーゼ（シグマ社
製）
10U/ml アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＳＯ-311；東洋紡社製）若しくは熱安定
型アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＳＯ-312；東洋紡社製）
R-1 蛋白質分解試薬中の緩衝剤としては3-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]
プロパンスルホン酸（EPPS）、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスル
ホン酸（HEPES）、2-ヒドロキシ-3-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパン
スルホン酸（HEPPSO）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）、ピペラジン-1,4
-ビス（2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸）(POPSO) (以上同人化学研究所社製)及び燐
酸（和光純薬社製）を用いた。
＜操作手順＞
上記反応液を各種緩衝剤を用いて作成し、その一部をとり、試薬中のアスコルビン酸オ
キシダーゼ活性を測定しコントロールとした。活性測定方法は前述の＜＜アスコルビン酸
オキシダーゼ（ASOx）の活性測定法＞＞を用いた。残りの反応液は室温にて２日間保存後
同様に活性を測定した。コントロールの活性に対する、室温−２日間保存後の活性の割合
を計算しアスコルビン酸オキシダーゼの安定性を比較した。結果を表４に示す。
【００８２】
【表４】
【００８３】
表４からわかるように4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル基を持つ3-[4-(2-ヒド
ロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸（EPPS）、2-[4-(2-ヒドロキシエチ
ル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸（HEPES）及び2-ヒドロキシ-3-[4-(2-ヒドロキシ
エチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸（HEPPSO）を緩衝剤に用いた場合よりも、4
-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル基を持たないトリスヒドロキシメチルアミノメタ
ン（Tris）、ピペラジン-1,4-ビス（2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸）(POPSO)及び
燐酸を緩衝剤に用いた場合、プロテアーゼの共存下に於いてアスコルビン酸オキシダーゼ
がより安定に存在していることが明白であった。
またアスコルビン酸オキシダーゼ、プロテアーゼの種類に係わらず同様の効果が確認さ
れていることも明白である。
【実施例９】
【００８４】
＜糖化蛋白質測定用組成物中のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化に及ぼす緩衝剤種類
の効果＞
＜反応液組成＞
R-1 蛋白質分解試薬
150mM 各種緩衝液 pH8.0
2500U/ml プロテアーゼタイプXXIV（シグマ社製）
2.0mM 4-アミノアンチピリン(和光純薬社製)
10U/ml アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製）
R-2 糖化アミノ酸測定試薬
150mM HEPES緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
6.0mM TOOS(同人化学研究所社製)
24U/ml R-FOD(旭化成社製)
20U/ml POD(シグマ社製)
R-1 蛋白質分解試薬中の緩衝剤としてはEPPS、HEPES、HEPPSO、Tris及びPOPSOを用いた
。
＜コントロール基質溶液、アスコルビン酸添加基質溶液＞
ヒトプール血清9容に1容のアスコルビン酸（国産化学社製）1g/dlを添加しアスコルビ
ン酸添加基質溶液とした。アスコルビン酸の代わりに蒸留水を添加したものをコントロー
ル基質溶液とした。
＜反応手順＞
37℃にインキュベートされたR-1;240μlにコントロール基質溶液若しくはアスコルビン
酸添加基質溶液8μlを添加し、37℃で反応を開始し、正確に5分後にR-2;80μlを添加した
。R-2添加前及び添加5分後の555nmの吸光度を測定した。また基質溶液の代わりに蒸留水
を用いた測定をブランクとし、コントロール基質溶液、アスコルビン酸添加基質溶液から
得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変化を差し引いたΔA0を算出した。一方同
じ反応液R-1を室温にて24時間保存し同様の測定を行いΔA24を算出した。コントロール基
質溶液から得られた吸光度変化を100としてアスコルビン酸添加基質溶液から得られたΔA
0及びΔA24の割合を計算した。結果を図４に示す。
【００８５】
アスコルビン酸は測定系に大きな負の影響を与え100mg/dlの濃度の場合消去反応を行わ
なければ糖化蛋白質のシグナルが観察できなくなる。図４からわかるようにアスコルビン
酸処理能は糖化蛋白質を測定する系でも4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル基を持
たないTris及びPOPSOにおいて室温-24時間保存後にも変化なく、一方EPPS、HEPES及びHEP
PSOを用いた4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル基を持つ緩衝剤の系ではアスコルビ
ン酸処理能が室温-24時間保存後にはほとんど観察されなかった。以上の結果からプロテ
アーゼとアスコルビン酸オキシダーゼが共存する糖化蛋白質測定試薬に於いても4-(2-ヒ
ドロキシエチル)-1-ピペラジニル基を持つ緩衝剤に用いた場合よりも、4-(2-ヒドロキシ
エチル)-1-ピペラジニル基を持たない緩衝剤に用いた場合アスコルビン酸オキシダーゼが
より安定に存在していることが明白であった。
また本結果から糖化アルブミン、フルクトサミン及び糖化へモグロビンの測定に関し本
発明が有用であることも明白である。
【実施例１０】
【００８６】
＜グリコアルブミン、ノングリコアルブミンに対するブロモクレゾールパープルの作用の
違い、及び蛋白質変性剤及び／または、Ｓ−Ｓ結合を有する化合物の効果＞
＜反応液組成＞
R-1 前処理試薬
10mM Tris-HCl緩衝液 pH8.0 + 各濃度の蛋白質変性剤及び／または、Ｓ-Ｓ
結合を有する化合物、対照としては蒸留水を添加した。
R-2 アルブミン発色試薬
200mM コハク酸緩衝液（和光純薬社製）pH5.5
0.15mM ブロモクレゾールパープル(和光純薬社製)
0.3% Tx-100(和光純薬社製)
R-1 前処理試薬中の蛋白質変性剤及び／または、Ｓ-Ｓ結合を有する化合物として以下
の1)〜9)を用いた。
1) 6,6'-ジチオジニコチン酸(6,6'-dithiodinicotinic acid;100mM)
2) 3,3'-ジチオジプロピオン酸(3,3'-dithiodipropionic acid;100mM)
3) 2,2'-ジチオジサリチル酸(2,2'-dithiodibenzoicacid;100mM)
4) 4,4'-ジチオジモルホリン(4,4'-dithiodimorpholine;100mM)
5) DTNB(50mM)
6) DDD(33mM)
7) 2-PDS(25mM)
8) 4-PDS(50mM)
9) SDS(0.3%)
1)〜5)和光純薬社製、6)〜9) 同人化学研究所社製
＜試料＞
グリコアルブミン、ノングリコアルブミン、健常者血清、患者血清を試料として、ブラ
ンクとしては蒸留水を用いた。グリコアルブミン、ノングリコアルブミンはヒト血清より
アルブミンを公知の方法で精製し、ホウ酸固定化樹脂を用いて精製した。
＜反応手順＞
37℃にインキュベートされた前処理試薬;160μlに試料2μlを添加し、37℃で反応を開
始し、正確に5分後にアルブミン発色試薬;160μlを添加した。アルブミン発色試薬添加前
及び添加5分後の600nmの吸光度を測定した。また試料の代わりに蒸留水及びアルブミン濃
度が既知である試料から検量線を作成しアルブミン測定値を求めた。またラテックス試薬
を用いた免疫法（ＬＸ試薬、栄研社製、Alb-II）を別途測定し、コントロールとした。結
果を表５に示す。
【００８７】
【表５】
【００８８】
表５からわかるように、前処理なしのBCP法では意外にもNGAに於いて低値を示し、同様
にNGAの少ない患者では免疫法とBCP法との乖離は、NGAの多い健常者に比べて小さかった
。また、蛋白質変性剤及び／または、Ｓ-Ｓ結合を持つ化合物にて前処理することにより
免疫法との乖離は有意に小さくなった。なかでも2,2'-ジチオサリチル酸、4,4'-ジチオジ
モルホリン、DDD、2-PDS、4-PDS、DTNB及びラウリル硫酸ナトリウムの効果が顕著であっ
た。このことから、糖化アルブミン割合を測定する際に使用するアルブミン試薬として、
蛋白質変性剤及び／または、Ｓ-Ｓ結合を持つ化合物にて前処理し、続いて若しくは同時
にBCPを作用させてアルブミンを測定する方法を用いることにより、NGAにより負の誤差を
与える現象が回避され、正確に糖化アルブミン割合が測定できることが明白となった。
【実施例１１】
【００８９】
＜プロテアーゼの安定化＞
＜反応液組成＞
R-1 蛋白質分解試薬
150mM Tris-HCl緩衝液 pH8.5
5000PU/ml プロテアーゼタイプXXIV（シグマ社製）
8mM 4-アミノアンチピリン(同人化学研究所社製)
15U/ml パーオキシダーゼ
1.0% 硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハイドロキ
シ-1-プロパン（シグマ社製）+ 各濃度のプロテアーゼ安定化剤、対照
としては蒸留水を添加した。
R-2 糖化アミノ酸測定試薬
150mM Tris-HCl緩衝液 pH8.5
24U/ml R-FOD-II（旭化成社製）
12mM TOOS(同人化学研究所社製)
前処理試薬中のプロテアーゼ安定化剤として以下の1)〜7)を用いた。
1) 0.5mM 塩化マグネシウム
2) 10mM 塩化カルシウム
3) 100mM 塩化ナトリウム
4) 0.1％ エチレングリコール（EtGly）
5) 10％ ジメチルスルホオキシド(DMSO)
6) １％ エタノール(EtOH)
7) 0.1％ ラウリル硫酸トリアタノールアミン(TEALS)
1)〜7)和光純薬社製
＜試料＞
5g/dl ＨＳＡ（シグマ社製；LOT38H7601）
＜反応手順＞
37℃にインキュベートされた蛋白質分解試薬;240μlに試料8μlを添加し、37℃で反応
を開始し、正確に5分後に糖化アミノ酸測定試薬;80μlを添加した。糖化アミノ酸測定試
薬添加前及び添加5分後の546nmの吸光度を測定した。また基質溶液の代わりに蒸留水を用
いた測定をブランクとし、基質溶液から得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変
化を差し引いたΔA0を算出した。一方同じ反応液蛋白質分解試薬を37℃にて24時間保存し
同様の測定を行いΔA24を算出した。安定化剤なしで、かつ保存なしの場合のΔA0を100％
として、安定化剤有り、無しの場合の相対感度を算出した。結果を図５に示す。
【００９０】
図５からわかるように、安定化剤がない場合、相対感度は60％に低下し蛋白質分解試薬
の安定化効果が観察された。一方安定化剤を添加した場合には安定化効果が塩化カルシウ
ム、塩化ナトリウム、DMSO、EtOH、TEALSに観察され、中でも塩化カルシウム、DMSOに関
してはほとんど性能低下は観察されなかった。さらにDMSO及び塩化カルシウムは安定性試
験を継続した結果、37℃−４週間保存でも性能低下が観察されず、液状、冷蔵で１年以上
の保存安定性を有することが明らかとなった。
【実施例１２】
【００９１】
＜少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化＞
＜反応液組成＞
R-1 蛋白質分解試薬
150mM Tris-HCl緩衝液 pH8.5
8mM 4-アミノアンチピリン(同人化学研究所社製)
15U/ml パーオキシダーゼR-2 糖化アミノ酸測定試薬
150mM Tris-HCl緩衝液 pH8.5
24U/ml R-FOD-II（旭化成社製）
12mM TODB(同人化学研究所社製) + 各濃度のプロテアーゼ安定化剤、対照
としては蒸留水を添加した。
糖化アミノ酸測定試薬中の少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の定化剤として以下
の1)〜15)を用いた。
1) 5％ マンニトール
2) 5％ ソルビトール
3) 5％ スクロース
4) 5％ トレハロース
5) 0.5mM 塩化カルシウム
6) 0.5mM 塩化マグネシウム
7) 3％ L-グルタミン酸（Glu）
8) 3％ L-グルタミン（Gln）
9) 3％ L-プロリン（Pro）
10) 3％ L-アラニン(Ala)
11) 3％ L-バリン（Val）
12) 3％ グリシン（Gly）
13) 3％ L-リジン(Lys)
14) 3％ ザルコシン
15) 100mM 硫安
1)〜14)和光純薬社製
＜試料＞
0.5mM FZL
＜反応手順＞
37℃にインキュベートされた蛋白質分解試薬;240μlに試料8μlを添加し、37℃で反応
を開始し、正確に5分後に糖化アミノ酸測定試薬;80μlを添加した。糖化アミノ酸測定試
薬添加前及び添加5分後の546nmの吸光度を測定した。また基質溶液の代わりに蒸留水を用
いた測定をブランクとし、基質溶液から得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変
化を差し引いたΔA0を算出した。一方同じ反応液糖化アミノ酸測定試薬を37℃にて２日間
保存し同様の測定を行いΔA24を算出した。安定化剤なしで、かつ保存なしの場合のΔA0
を100％として、安定化剤有り、無しの場合の相対感度を算出した。結果を図６に示す。
【００９２】
図６からわかるように、安定化剤がない場合、相対感度は30％に低下し糖化アミノ酸測
定試薬の安定化効果が観察された。一方安定化剤を添加した場合には安定化効果がマンニ
トール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、塩化カルシウム、塩化マグネシウム
、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-プロリン、L-アラニン、L-バリン、グリシン、L-リ
ジン、ザルコシン、硫安に観察され、中でも糖アルコール、アミノ酸、ザルコシンに関し
ては特に強い安定化効果が確認された。さらにL-アラニン、グリシン及びザルコシンは安
定性試験を継続した結果、37℃−４週間保存でも性能低下がほとんど観察されず、液状、
冷蔵で１年以上の保存安定性を有することが明らかとなった。
【実施例１３】
【００９３】
＜変異FOD遺伝子含有DNAフラグメントライブラリーの作成＞
配列表配列番号５の塩基配列の1から30の配列を有するオリゴヌクレオチドと配列表配
列番号６の塩基配列の1から30の配列を有するオリゴヌクレオチドの合成を外部委託（BEX
社）し、さらにフザリウム・オキシスポルムIFO-9972株由来のFOD蛋白質をコードするDNA
を鋳型にして、Taqポリメラーゼキット（宝酒造社製）を用いて添付のマニュアルに従っ
てPCRを実施し、FOD構造遺伝子を増幅した。この際、反応液中に最終濃度0.5mM相当の２
価マンガンイオンを添加し、塩基をdATP:0.51mM、dCTP:0.20mM、dGTP:1.15mM、dTTP:3.76
mMと濃度を偏在させて反応を実施し、変異導入効率を高めた。
【実施例１４】
【００９４】
＜変異FOD組換え体ライブラリーの作成＞
実施例１３により増幅したFOD遺伝子含有DNAフラグメントを制限酵素NcoIとEcoRIで消
化し、同じ制限酵素で処理したプラスミドoTV119N（宝酒造社製）に組み込み、エシェリ
ヒア・コリJM109株（東洋紡績社製）に導入し、100μg/mlアンピシリン含有LB寒天平板培
地（DIFCO社製）上、37℃で一晩培養して形質転換体のコロニーを形成させた。
【実施例１５】
【００９５】
＜リジン特異的変異FODのスクリーニング＞
実施例１４で用意したライブラリーのコロニーを2枚の100μg/mlアンピシリンと1mMのI
PTG（和光純薬社製）を含有するLB寒天平板培地にレプリカし、それぞれの培地上に5U/ml
のパーオキシダーゼ（旭化成社製）、0.02％のオルトジアニシジン（和光純薬社製）、2.
0mMの糖化バリンまたは糖化リジン（ハシバらの方法（Hashiba,H.(1976) J.Agric.Food C
hem., 24, 70）により調製）を含有するLB寒天（0.3％）培地を重層し、37℃で8時間培養
して糖化アミノ酸のFODによる酸化で発生する酸素ラジカルとジアニシジンによるコロニ
ーの発色を観察した。これにより糖化リジンで暗紫色に発色し、糖化バリンで発色しない
コロニーをスクリーニングし、該当するコロニーを164株得た。
【実施例１６】
【００９６】
＜変異FOD候補株の細胞抽出液の調製＞
実施例１５で得た変異体コロニー164株を50μg/mlのアンピシリンと1mMのIPTGを含有す
る3.7％のBHI（DIFCO社製）液体培地1.5mlで30℃、16時間培養し、そのうち1mlを遠心分
離（15,000G、1分、4℃）により集菌し、200μlの10mMのトリス塩酸緩衝液（pH8.0）を加
え、超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（14,000G、5分、4℃）し、上清
を取得して細胞抽出液とした。
【実施例１７】
【００９７】
＜変異FODの基質特異性検定＞
実施例１６で調製した細胞抽出液について、含有するFOD変異組換え体の糖化アミノ酸
基質特異性を、前述のFOD酵素活性測定法によって測定した。その結果、候補株の中に糖
化バリンへの活性が糖化リジンの活性の1000分の1未満となっている変異体を2つ確認し、
目的の変異体とした。
【実施例１８】
【００９８】
＜組み換えプラスミドの抽出＞
実施例１７で選ばれた変異体を50μg/mlのアンピシリン含有LB液体培地1.5mlに植菌し3
7℃で16時間振盪培養した後、常法に従ってプラスミドを抽出した。このプラスミドをpcm
FOD1及びpcmFOD2と命名した。
【実施例１９】
【００９９】
＜変異FOD遺伝子塩基配列の決定＞
実施例１８で得られた変異FOD遺伝子についてジデオキシ法により塩基配列を決定した
。その結果、2つの変異体は同じ構造を有し、配列表配列番号１の塩基配列1115のAがGに
変換され、コードされる組換え変異FODのアミノ酸配列が配列表配列番号１のアミノ酸配
列372番のリジンがアルギニンに変換されていることを確認した。
【実施例２０】
【０１００】
＜各種変異体の基質特異性確認＞
実施例１９で確認されたアミノ酸変異箇所について、他のアミノ酸への置換の効果を観
察するためにKunkelらの部位特異的変異法を行った。配列表配列番号７記載の塩基配列の
1から27までの配列を有するオリゴヌクレオチドの合成を外部に委託（BEX社）し、さらに
Mutan-Kキット（宝酒造社製）を使用して、添付されたマニュアルに従って部位特異変異
を行った。取得した変異遺伝子は再び発現プラスミドpTV119Nに組み込み、大腸菌宿主に
導入して50μg/mlのアンピシリンと1mMのIPTGを含有する3.7％のBHI液体培地で30℃、16
時間培養し、変異FOD蛋白を生産させた。以上のようにして得られた複数の変異体につい
て実施例１６、１７と同様の方法で基質特異性を測定したところ、アルギニン以外にトリ
プトファン、メチオニン、スレオニン、バリン、アラニン、セリン、システイン、グリシ
ンに変換した変異体がアルギニンに変換した変異体と同様の糖化リジン特異的な基質特異
性を有していることを確認した。この結果を表６に示す。
【０１０１】
【表６】
【０１０２】
なお表中の限界以下は測定限界以下、N.D.は測定データなしを示す。これにより、配列
表配列番号１のアミノ酸配列372番目のリジンを変換することによりFODの糖化リジン反応
性を糖化バリン反応性に対して相対的に低下させることができることが確かめられ、特に
トリプトファン、メチオニン、バリンへの変異体が高い糖化リジン特異性と良好な酵素性
状を有していることが判明した。このトリプトファンへの変異体をFOD-W、FOD-Wを生産す
る発現プラスミドをpcmFOD3、メチオニンへの変異体をFOD-M、FOD-Mを生産する発現プラ
スミドをpcmFOD4、バリンへの変異体をFOD-V、FOD-Vを生産する発現プラスミドをpcmFOD5
と命名した。図７に各プラスミドの共通構造を示す。
【実施例２１】
【０１０３】
＜被検液中のε-フルクトシル-L-リジン（ZFL）を消去した後、フルクトシル-L-バリン（
FV）の測定＞
反応液1
50mMのトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）
10U/mlのFOD-V
5U/mlのカタラーゼ
反応液2
50mMのトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）
10U/mlのFOD
20U/mlのペルオキシダーゼ
0.05%のアジ化ナトリウム
0.04%の４−アミノアンチピリン
0.04%のTOOS
被検液:0.3mMのZFL溶液に終濃度が0、0.1、0.2、0.3mMとなるようにFVを添加したもの。
0.5mlの反応液1を37℃、5分間、予備加温した後、0.05mlの上記被検液を添加して、37
℃、5分間反応させ、0.5mlの反応液2を添加し、5分後に555nmにおける吸光度を測定する
。ブランクには被検液の変わりに蒸留水を使用する。また対照として、反応液1のFOD-Vを
添加していない反応液を用いて同様に操作した。
図８の白丸はFOD-V無添加を、白四角はFOD-Vを添加した場合の測定値をそれぞれ示す。
【０１０４】
FOD-VおよびFODを用いることにより図８から明らかなように、FOD-Vにより、被検液中
のZFLを消去した後に、FVを定量的に測定することができた。
なお、配列表配列番号１のアミノ酸配列３７２番目のリジンをトリプトファン、メチオ
ニン及びバリンに変換した配列をそれぞれ配列表配列番号２、３及び４に示す。
【実施例２２】
【０１０５】
＜糖化アルブミン割合の測定＞
R-1 蛋白質分解試薬
50mM POPSO酸緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
2500U/ml プロテアーゼタイプXXIV（シグマ社製）
1% 硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハイドロキシ-
1-プロパン（シグマ社製）
5U/ml アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製）
5% DMSO
5mM 4-アミノアンチピリン
R-2 糖化アミノ酸測定試薬
150mM HEPES酸緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
5mM TODB
10U/ml POD
20U/ml R-FOD-II
3% グルタミン酸
R-3 アルブミン前処理試薬
10mM Tris-HCl緩衝液 pH8.0
0.3% ラウリル硫酸ナトリウム
R-4 アルブミン発色試薬
200mM コハク酸緩衝液（和光純薬社製）pH5.5
0.15mM ブロモクレゾールパープル(和光純薬社製)
0.3% Tx-100(和光純薬社製)
＜試料＞
1：健常者及び糖尿病患者血清各35検体
2：キャリブレーターは管理血清Ｈ（ビー・エム・エル社製）を用いた。
キャリブレーターのグリコアルブミン濃度は臨床検体のＨＰＬＣ法測定値と酵素法
の測定値が一致するようにあらかじめ設定した。アルブミン値はCRM470の値を移した。
＜反応手順＞
37℃にインキュベートされたR-1;240μlに試料8μlを添加し、37℃で反応を開始し、正
確に5分後にR-2;80μlを添加した。R-2添加前及び添加5分後の555nmの吸光度変化を測定
した。別途管理血清Ｈ、蒸留水を測定し検量線を作成し、検体中の糖化アルブミン濃度を
算出した。
一方37℃にインキュベートされたR-3;アルブミン前処理試薬;160μlに試料2μlを添加
し、37℃で反応を開始し、正確に5分後にR-4;アルブミン発色試薬;160μlを添加した。ア
ルブミン発色試薬添加前及び添加5分後の600nmの吸光度を測定した。また試料の代わりに
蒸留水及びアルブミン濃度が既知である試料から検量線を作成しアルブミン測定値を求め
た。
酵素法によるGA％はGA%=GA濃度/アルブミン濃度×100より求めた。またHPLC法測定値は
ハイオートジー・エイ・エイ2000（アークレイ社製）を用いて測定した。結果を図９に示
す。
【０１０６】
図９から分かるように酵素法とHPLC法はr=0.998と非常に良い相関を示した。また本試
薬全てを液状で37℃-2週間保存しても性能に変化はなかった。この事から1)グロブリン成
分及びアスコルビン酸の影響回避、2)プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用す
る酵素の安定化、3)正確にアルブミンを測定、4)糖化ヘモグロビンの影響回避を行うこと
により正確に糖化アルブミンを測定していること及び糖化アルブミン割合を測定している
ことが明らかであった。
【実施例２３】
【０１０７】
＜第１試薬に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素、第２試薬にプロテアーゼを含有
する組成物＞
R-1
200mM POPSO 緩衝液 pH7.5
5mM 4‐アミノアンチピリン
10 U／ml POD
20 U／ml R‐FOD
5 U／ml アスコルビン酸オキシダーゼ
3％ グルタミン酸
R-2
20mM ピベラジン-1,4-ビス(2-エタンスルホン酸)緩衝液 pH6.5
20％ DMSO
8000 U/ml プロテアーゼタイプXXIV
4％ 硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2ハイドロキシ-
1-プロパン
5 mM TODBR-3,4
実施例２２に同じ
＜試料＞実施例２２に同じ試料及び１０−２００μＭのＦＺＬ
＜反応手順＞実施例２２に同じ
結果を図１０に示す。
【０１０８】
図１０から分かるように第１試薬に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素、第２試薬
にプロテアーゼを処方した場合にも反応時間１０分という短い時間で良好に糖化蛋白質が
測定できており、また試料中に糖化アミノ酸が存在した場合にも、Ｒ−１に処方されてい
る少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素により糖化アミノ酸が消去されてより正確に糖
化蛋白質が測定できることが明白である。
また本試薬とＨＰＬＣ法との相関は、
酵素法ＧＡ％＝１．０３＊ＨＰＬＣ法ＧＡ％−０．３ Ｒ＝０．９９と良好な相関を
示し、正確に糖化蛋白質が測定されていることも明らかであった。さらに本試薬は液状で
３７℃−３週間若しくは冷蔵１５ケ月保存しても性能の低下はなかった。
[寄託生物材料への言及]
【０１０９】
（1）イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6（郵便番号305-8566）
ロ イの機関に寄託について付した日付(原寄託日)
平成13年1月16日
ハ イの機関に寄託について付した受託番号
FERM BP-7847
（2）イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6（郵便番号305-8566）
ロ イの機関に寄託について付した日付(原寄託日)
平成13年1月16日
ハ イの機関に寄託について付した受託番号
FERM BP−7848
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明により、より正確に被検体中の糖化蛋白質及び糖化アルブミン割合を測定するこ
とが可能になった。したがって、臨床検査薬として有用に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】本発明の実施例４に基づくHSA基質溶液(4g/dl)、γグロブリン及びグロブリンIV基質溶液の測定曲線及び再現性を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例５に基づくHｂ基質溶液(4g/dl)、γグロブリン及びグロブリンIV基質溶液の測定曲線及び再現性を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例６に基づく糖化アルブミンの測定曲線を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例９に基づく糖化蛋白質測定用組成物中のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化に及ぼす緩衝剤種類の効果を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例１１に基づくプロテアーゼの安定化に及ぼす安定化剤種類の効果を示すグラフである。
【図６】本発明の実施例１２に基づく少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化に及ぼす安定化剤種類の効果を示すグラフである。
【図７】本発明の実施例２０のプラスミドｐｃｍＦＯＤ１からｐｃｍＦＯＤ５までの共通構造を示す。
【図８】本発明の実施例２１の本変異フルクトシルアミノ酸オキシダーゼにより混入糖化リジンを消去した糖化バリン濃度測定反応液と非消去反応液における５５５ ｎｍの吸光度の測定結果を示すグラフである。
【図９】本発明の実施例２２に基づくグリコアルブミン割合測定結果の酵素法とHPLC法の相関を示すグラフである。
【図１０】本発明の実施例２３に基づく糖化蛋白質測定試薬の反応曲線である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化蛋白質を測定するための組成物及び糖化蛋白質の測定方法に関する。本
発明における糖化蛋白質の測定用組成物及び測定方法は臨床検査に用いられ、正確に糖化
蛋白質を測定することができる。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病の診断及び管理を行う上で糖化蛋白質の測定は非常に重要であり、過去約１〜２
ヶ月の平均血糖値を反映する糖化ヘモグロビン(GHb)、過去約２週間の平均血糖値を反映
する糖化アルブミン(GA)、及び血清中の還元能を示す糖化蛋白質の総称であるフルクトサ
ミン(FRA)等が日常的に測定されている。GHbはヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端バリンのαアミ
ノ基が、GA、FRAはアルブミン、血清蛋白質のリジン残基のεアミノ基がそれぞれ糖化さ
れている。
【０００３】
精度が高く、簡便かつ安価な糖化蛋白質の測定法としては酵素法があげられる。その例
としては特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６等
がある。
しかしながら、真に糖化蛋白質を正確に測定する組成物を提供するには、１）グロブリ
ン成分及びアスコルビン酸の影響回避、２）プロテアーゼ、少なくとも糖化アミノ酸に作
用する酵素の安定化が必須であり、さらに糖化蛋白質が糖化アルブミンである場合には、
３）正確にアルブミンを測定する方法、４）糖化ヘモグロビンの影響回避を行うことも重
要である。
【０００４】
１）グロブリン成分及びアスコルビン酸の影響回避に関する従来の技術
糖尿病患者ではグロブリン蛋白質量が変化しFRAの値に影響を及ぼすことが知られてい
る(例えば、非特許文献１参照。)。そこで本発明者らはプロテアーゼ反応液にある種の金
属イオンやプロテインＡ若しくはＧを添加することによりプロテアーゼのグロブリン成分
への作用を選択的に阻害する方法（例えば、特許文献７参照。）を開発してきた。この発
明ではグロブリン成分の影響を受けることなく糖化蛋白質を測定することが出来るが、そ
こで用いられるグロブリン選択的なプロテアーゼ阻害剤としては、金属、プロテインＡ、
Ｇが記載されている。しかし、ここで示されている特定の金属のうち、効果が強い金属は
重金属であり、環境安全上の問題がないとは言えず、また効果の弱い金属は他の試薬成分
（他の組成物）と組み合わせると試薬溶液に濁りが生じることがあった。またプロテイン
Ａ、Ｇは非常に高価である。
【０００５】
さらに、血液中のグロブリンを選択的に吸着する方法としてステロイド骨格を持ったリ
ガンドをビニル系の共重合体に導入しクロマトグラフィーの原理を用いて血液中の内毒素
やグロブリンを吸着する血液処理剤(例えば、特許文献８参照。)が知られている。しかし
この実施例表１の検討結果ではグロブリンのうち吸着が確認できているのはα１、α２グ
ロブリンだけでありグロブリン成分の７０％以上を占めるγグロブリンには吸着能を示し
ていない。またたとえγグロブリンに吸着能を示したとしてもプロテアーゼのγグロブリ
ンへの作用をどの程度阻害できるかは予測不可能である。
【０００６】
アスコルビン酸は近年補助食品として大量に摂取されるケースが増えており、高濃度の
アスコルビン酸を含有する臨床検体が増加している。アスコルビン酸は、その強力な還元
力により臨床検査を行う上で様々な影響を引き起こす。
検体中のアスコルビン酸の影響を回避する方法としては化学的な方法やアスコルビン酸
オキシダーゼを用いた酵素的な方法を用いて検体中のアスコルビン酸を消去する方法が知
られている。プロテアーゼを用いて糖化蛋白質を断片化し、次いで少なくとも糖化アミノ
酸に作用する酵素を用いて生じた糖化アミノ酸を測定する場合、プロテアーゼ反応と同時
にアスコルビン酸オキシダーゼ（ASOx）を作用させ、前もってアスコルビン酸を消去する
方法が発色系への影響が小さく好ましい。
【０００７】
プロテアーゼの存在下、被検液中のアスコルビン酸をASOxを用いて消去した例としては
、被検液に、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸(HEPES)緩衝
液pH8.0の条件で作用させた例(例えば、非特許文献２参照。)があり、冷蔵保存で2週間は
アスコルビン酸の処理能に変化は無いと記述されている。
しかし、本発明者らの検討ではHEPES緩衝液pH8.0、プロテアーゼ及びASOxが共存した場
合のアスコルビン酸処理能は37℃-1日若しくは10℃-2週間の保存でほとんど消失した。
【０００８】
２）プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化に関する従来の技
術
糖化蛋白質の臨床的な測定には他の分野、例えば食品分野等では考えられない程高濃度
のプロテアーゼが水溶液の状態で使用される。プロテアーゼは水溶液中では自己消化がお
こることが知られており、この様な高濃度の水溶液中で安定に存在するとは考えにくい。
よってこれまでの糖化蛋白測定用組成物に用いられるプロテアーゼは凍結乾燥品で供給さ
れている。
糖化蛋白測定用組成物、測定方法に関し液状で長期に保存出来るレベルまでプロテアー
ゼの安定化を行った例はない。同様に糖化蛋白測定用組成物、測定方法に関し液状で長期
に保存出来るレベルまで少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化を行った例はな
い。
【０００９】
３）正確にアルブミンを測定する方法に関する従来の技術
アルブミン測定法には抗アルブミン抗体を用いた免疫法、ブロモクレゾールグリーン（
BCG）、ブロモクレゾールパープル（BCP）等を用いた色素法等がある。操作が簡便でかつ
コストが安いことから、日常検査では色素法が広く用いられているが、BCG法はグロブリ
ン成分に作用が確認されておりアルブミンに対する特異性が低いという欠点がある。
一方BCP法はアルブミンに対する特異性は高いものの、共存物質の影響を受けやすく、
またSH化合物の影響を受けることからアルブミンの酸化還元状態により値が変化するとい
う問題があった。この問題を解決する方法としては蛋白質変性剤及び／またはSH試薬の存
在下BCPの反応を行った例（例えば、特許文献９参照。）が知られている。しかし、GAと
非糖化アルブミン(NGA)に対するBCP反応性の検討を行った例はこれまでなかった。
【００１０】
４）糖化ヘモグロビンの影響回避に関する従来の技術
前述のようにGAはアルブミンのεアミノ基が糖化されており、一方GHbはヘモグロビン
中のβ鎖Ｎ末端バリンのαアミノ基が糖化されている。よってGAを測定対象とする場合に
はεアミノ基が糖化されたアミノ酸のみを測定できれば好ましい。
【００１１】
これまでεアミノ基に高い特異性を示し、糖化バリンに作用しない酵素はいくつか知ら
れているが（例えば、特許文献１０参照。）、実用化できるほど安いコストで供給されて
いるものはない。このうち特にフザリウム・オキシスポルム由来のフルクトシルアミノ酸
オキシダーゼ（FOD）は反応性が高く有用であり、発明者らは該FODの遺伝子を分離し報告
している（例えば、特許文献１１参照。）。ただし本遺伝子を用いた製造法は生産性が高
く、低いコストでFODが生産できるもののαアミノ基が糖化されている糖化バリンへの反
応性が確認されており、特異性の点で満足いくものではなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、糖化蛋白質を正確に測定するにあたり、１）グロブリン成分及びアス
コルビン酸の影響回避した、２）プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵
素を安定化した組成物、安定化方法を提供することにあり、さらに糖化蛋白質が糖化アル
ブミンである場合には、３）正確にアルブミンを測定する、４）糖化ヘモグロビンの影響
回避を行う組成物、影響回避方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
糖化蛋白質を正確に測定するにあたり、１）グロブリン成分及びアスコルビン酸の影響
回避、２）プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化が正確な糖
化蛋白質の測定には必須であり、さらに糖化蛋白質が糖化アルブミンである場合には、３
）アルブミンの正確な測定、４）糖化ヘモグロビンの影響回避が必須である。
【００１６】
１）グロブリン成分及びアスコルビン酸の影響回避
本発明者らは鋭意検討の結果、プロテアーゼ反応液にデオキシコール酸、デオキシコー
ル酸アミド、コール酸アミド、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽
イオン界面活性剤、コンカナバリンＡ、オクチルグルコシドまたはベタインから選択され
る１種以上を添加することによりプロテアーゼのグロブリン成分への作用を選択的に阻害
できること、またこの反応液に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を直接作用させて
も酵素作用が阻害されることなく、再現性良く、精度良くかつ簡便に糖化蛋白質が測定で
きることを見出した。しかも、これらの化合物は、経済的に有利で、かつ従来の技術を用
いたときに比べて環境安全上問題がなく、検体と混合された場合に濁りを生じることもな
いものである。
【００１７】
またアスコルビン酸の消去にはASOxを用いると効率的であるがプロテアーゼが大量に存
在する反応液中でASOxが安定に存在するとは通常考えにくい。実際本発明者らの検討結果
ではプロテアーゼの種類やプロテアーゼ阻害剤及びASOxの種類等の検討ではプロテアーゼ
が大量に存在する反応液中でASOxを安定に存在させる条件は見つからなかった。
ところが本発明者らは鋭意検討の結果、意外にも緩衝液の種類によってASOxの安定性が
飛躍的に向上することを見出した。
【００１８】
２）プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化
糖化蛋白質の臨床的な測定には前述のように高濃度のプロテアーゼが水溶液の状態で使
用され、基本的にプロテアーゼ自体が不安定になる。ところが、本発明者らは鋭意検討の
結果、ジメチルスルホオキシド、アルコール、水溶性カルシウム塩、食塩、第四級アンモ
ニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤を添加することにより、プ
ロテアーゼの安定性が飛躍的に向上し、液状かつ高濃度の条件でも長期間保存が可能であ
ることを見出した。
【００１９】
また少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素は液状での37℃-4日保存で活性が約１割に
低下する酵素であり、安定な酵素とは言い難かった。しかしながら本発明者らは鋭意検討
の結果、少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素に糖アルコール、スクロース、水溶性マ
グネシウム塩、水溶性カルシウム塩、硫安、アミノ酸、ザルコシンより選ばれる安定化剤
を添加することにより液状、37℃-4日保存にて殆ど活性低下が見られない程の驚くべき安
定化効果が得られることを見出した。
【００２０】
さらにプロテアーゼは至適ｐＨ付近では強い蛋白質分解活性を示すが、同時に自己消化
反応も進行し特に液状での保存が困難になる。ところが本発明者らは鋭意検討の結果、第
１試薬をプロテアーゼ作用に適した条件にし、第２試薬にプロテアーゼを液状でも安定な
条件で処方することにより、測定時の条件には作用されずにプロテアーゼを安定に保存で
きること、また意外にも、前処理反応に使用する酵素を第２試薬に処方しても測定には影
響を与えず正確な測定が可能であることを見出した。加えて第１試薬に少なくとも糖化ア
ミノ酸に作用する酵素を処方することにより、試料中に存在する糖化アミノ酸を予め消去
し、選択的に糖化蛋白質を測定することが可能であった。
【００２１】
３）正確にアルブミンを測定する方法
本発明者らの検討により意外なことにBCPの反応性がGAとNGAで異なり、NGAが大量に混
入すると値が負の影響を受けることが判明した。そこで本発明者らは鋭意検討の結果、ア
ルブミン測定の前、若しくは同時に蛋白質変性剤及び／又はＳ−Ｓ結合を有する化合物に
て試料を処理することにより良好にNGAを大量に含むアルブミンを正確に測定できること
を見出した。
【００２２】
４）糖化ヘモグロビンの影響回避
本発明者らは、上記問題点に関し鋭意研究の結果、フザリウム・オキシスポルムIFO-99
72株由来FODの遺伝子を改変して、変異FODを作成し、その性状を測定することによってＮ
末端より372番目のリジンを他のアミノ酸に置換することによって基質特異性が顕著に変
化することを見出し、糖化バリンへの反応性が著しく低く、ほぼ糖化リジンに特異的に作
用する改変FODを複数作成した。
本変異FODは、上記の知見に基づいてなされたもので、FODについて配列表配列番号１の
アミノ酸配列372番のリジンを別のアミノ酸に置換することにより糖化バリン反応性が消
失した変異型FODである。配列表配列番号１のアミノ酸配列372番のリジンがトリプトファ
ン、メチオニンまたはバリンに置換された請求項１記載の変異型FODである。
最後に、本発明者らはこれらの発明を総合して正確に糖化蛋白質を測定する組成物、測
定方法を完成するに至った。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、より正確に被検体中の糖化蛋白質及び糖化アルブミン割合を測定するこ
とが可能になった。したがって、臨床検査薬として有用に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、この発明の構成及び好ましい形態について更に詳しく説明する。
本発明に使用しうるプロテアーゼは、被検液に含まれる糖化蛋白質に有効に作用し、か
つ当該蛋白質由来の糖化アミノ酸及び／若しくは糖化ペプチドを有効に生成するものであ
ればいかなるものを用いても良く、例えば動物、植物、バチルス(Bacillus)属、アスペル
ギルス(Aspergillus)、リゾパス(Rhizopus)、ペニシリウム(Penicillium)、ストレプトマ
イセス(Streptomyces)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、クロストリジウム(Clost
ridium)、リソバクター(Lysobacter)、グリフォラ(Glifila)、酵母(Yeast)、トリチラチ
ウム(Tritirachium)、サーマス(Thermus)、シュードモナス(Pseudomonus)、アクロモバク
ター(Achromobacter)等の微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。
【００２５】
また測定対象である糖化蛋白質がGAある場合にはバチルス属及びストレプトマイセス属
の微生物由来プロテアーゼがヒトアルブミン（Alb）に対する作用が大きい為より好まし
。また測定対象である糖化蛋白質がGHbである場合にはバチルス属、アスペルギルス属、
ストレプトマイセス属、トリチラチウム属由来のプロテアーゼがヒトヘモグロビン（Hb）
に対する作用が大きい為により好ましい。
本発明に用いることの出来るプロテアーゼの活性測定法を下記に示す。
【００２６】
＜＜プロテアーゼの活性測定方法＞＞
下記の測定条件で30℃、1 分間に1μgのチロシンに相当する呈色を示すプロテアーゼ活
性度を1PU（proteolytic Unit）と表示する。
＜基質＞ 0.6% ミルクカゼイン（メルク社製）
＜酵素溶液＞ 10PU〜20PUに希釈
＜酵素希釈溶液＞ 20mM 酢酸緩衝液 pH 7.5
1mM 酢酸カルシウム
100mM 塩化ナトリウム
＜反応停止液＞ 0.11M トリクロル酢酸
0.22M 酢酸ナトリウム
0.33M 酢酸
＜操作＞
プロテアーゼ溶液を10〜20PU/mlになるように酵素希釈溶液にて溶解し、この液1ml を
試験管に取り30℃に加温する。あらかじめ30℃に加温しておいた基質溶液5ml を加え正確
に10分後反応停止液5ml を添加し反応を停止する。そのまま30℃、30分加温を続け沈殿を
凝集させ、東洋ろ紙N0.131(9cm) で濾過を行い、濾液を得る。ブランク測定はプロテアー
ゼ溶液1ml を試験管に取り30℃に加温し、まず反応停止液5ml を添加し続いて基質溶液5m
l を添加後同様に凝集、濾過を行う。濾液2ml を0.55M 炭酸ナトリウム溶液5ml 、3 倍希
釈フォリン試薬1ml を加え30℃、30分反応後660nm の吸光度を測定する。酵素作用を行っ
た吸光度からブランク測定の吸光度を差し引いた吸光度変化を求め、別に作成した作用標
準曲線より酵素活性を求める。
【００２７】
＜標準作用曲線作成法＞
約50PU/ml に調整した酵素溶液を希釈し2〜50PU/ml の一連の希釈倍率を持った酵素溶
液を作成し上記操作を行い、得られた吸光度変化を縦軸に希釈倍数を横軸にプロットする
。一方L-チロシンを0.2N塩酸に0.01％ の濃度に溶解しその1ml に0.2N塩酸10ml加えたも
のを標準チロシン溶液とする（チロシン濃度9.09μg /ml）。標準チロシン溶液2ml と0.2
N塩酸2ml についてそれぞれ上記測定操作を行い、得られた吸光度変化がチロシン18.2μg
に相当する。この吸光度変化を前記グラフ上にとり、その点から横軸に垂線を下ろし横軸
との交点が10PU/ml に相当する。
【００２８】
また、これらのプロテアーゼの使用濃度としては、目的とする蛋白質を一定の時間で効
率よく切断できる濃度であれば良く、例えば通常1〜100000PU/ml、好ましくは10〜10000P
U/mlの濃度で用いればよい。
本発明に使用しうる少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素としては、前記プロテアー
ゼの作用により、被検液に含まれる糖化蛋白質から生成される糖化アミノ酸若しくは糖化
ペプチドに有効に作用し、実質的に糖化蛋白質が測定できる酵素であれば如何なるものを
用いても良いが、αアミノ基が糖化されたアミノ酸によく作用する少なくとも糖化アミノ
酸に作用する酵素、εアミノ基が糖化されたアミノ酸によく作用する少なくとも糖化アミ
ノ酸に作用する酵素等が挙げられる。
εアミノ基が糖化されたアミノ酸によく作用する少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵
素の例としては、ギベレラ（Gibberella）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、カン
ジダ（Candida）属、ペニシリウム（Penicillium）属、フサリウム（Fusarium）属、アク
レモニウム（Acremonium）属又はデバリオマイゼス（Debaryomyces）属由来のFOD等が挙
げられる。
αアミノ基が糖化されたアミノ酸によく作用する少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵
素の例としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）由来の酵素が挙げられる。
【００２９】
さらに、プロテアーゼと共存させた状態でも充分な活性を有し、かつ安価に製造可能な
酵素の例としては、遺伝子組み替え型ケトアミンオキシダーゼ（R-FOD；旭化成社製）お
よび加えて糖化バリン反応性を著しく低下させた変異型FOD（R-FOD-II；旭化成社製）が
挙げられる。
R-FOD-IIのもととなるフザリウム・オキシスポルムIFO-9972株由来のFOD蛋白質をコー
ドするDNAは、フザリウム・オキシスポルムIFO-9972株から常法により染色体DNAを抽出し
、PCR法やハイブリダイゼーション法などで分離して得られる。
得られた該FOD遺伝子への変異の導入は、DNAに直接変異を加えるならPCR法を応用して
もよいし部位特異的変異法を使用してもよい。また偶発変異によるならば、DNA修復能力
の低下した大腸菌宿主を使用しても良いし、あるいはDNA変異源を添加した培地でFOD遺伝
子を導入した宿主生物を培養することもできる。
【００３０】
かくして得られた変異FOD遺伝子を適当な宿主−ベクター系を用いて宿主微生物に導入
し、発現ベクターのマーカーと、FODの活性発現若しくはDNAプローブを指標としてスクリ
ーニングを行い、FOD遺伝子を含有する組換えDNAプラスミドを保持する微生物を分離し、
該遺伝子組換え微生物を培養し、該培養菌体から組換え蛋白を抽出精製することで変異FO
Dを得ることができる。
【００３１】
変異FODを得るためには、具体的には以下のように行えばよいが、その操作法のうち常
法とされるものは、例えばマニアティスらの方法（Maniatis,T., et al. Molecular Clon
ing. Cold Spring Harbor Laboratory 1982, 1989）や、市販の各種酵素、キット類に添
付された手順に従えば実施できるものである。
分離したFOD遺伝子に変異を導入するにはマンガンイオン添加条件下に於けるTaqポリメ
ラーゼを始めとする3'→5'修復能欠損型ポリメラーゼを使用したPCR法や、DNA修復能を欠
損した大腸菌宿主にFOD遺伝子を導入しジアニシジンなどの変異源を添加した培地で培養
することにより遺伝子変異を誘発し、作成した変異候補株群より目的の基質特異性を獲得
した変異体を分離すればよい。
上述の方法によって導入されたFODの変異は、ジデオキシ法（Sangar,F.（1981）Scienc
e, 214, 1205-1210）で変異を導入した遺伝子の塩基配列を確認することにより決定でき
る。
また一度変異が決定した後はゾラーらの方法（Zoller, M. J. and Smith, M. （1983）
Methods in Enzymology,154, 367）による部位特異変異法で特定の変異を導入することも
できる。
【００３２】
変異FODを構成するポリペプチドのアミノ酸配列の変異は、変異遺伝子の塩基配列より
決定できる。以上の方法で得られた変異FODは変異FOD遺伝子を適当な宿主−ベクター系に
組み込むことにより組換え体として生産できる。
変異FOD遺伝子を組み込むベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるフ
ァージ又はプラスミドから遺伝子組み換え用として構築されたものが適しており、ファー
ジベクターとしては、例えば、E. coliに属する微生物を宿主微生物とする場合にはλgt
・λC、λgt・λBなどが使用できる。また、プラスミドベクターとしては、例えば、E. c
oliを宿主微生物とする場合にはプラスミドpBR322、pBR325、pACYC184、pUC12、pUC13、p
UC18、pUC19、pUC118、pIN I、BluescriptKS+、枯草菌を宿主とする場合にはpUB110、pKH
300PLK、放線菌を宿主とする場合にはpIJ680、pIJ702、酵母特にサッカロマイセス・セル
ビシエ(Saccharomyces cerevisiae)を宿主とする場合にはYrp7、pYC1、Yep13などが使用
できる。
このようなベクターに変異FOD遺伝子を組み込むには、双方を同じ末端を生成する適当
な制限酵素で切断し、変異FOD遺伝子を含むDNAフラグメントとベクター断片とを、DNAリ
ガーゼ酵素により常法に従って結合させればよい。
【００３３】
変異FOD遺伝子を結合したベクターを移入する宿主微生物としては、組み換えDNAが安定
かつ自律的に増殖可能であればよく、例えば宿主微生物がE. coliに属する微生物の場合
、E. coli DH1、E. coli JM109、E. coli W3110、E. coli C600などが利用できる。また
、微生物宿主が枯草菌に属する微生物の場合、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis
)ISW1214など、放線菌に属する微生物の場合、ストレプトマイセス・リビダンス(Strepto
myces lividans)TK24など、サッカロマイセス・セルビシエに属する微生物の場合、サッ
カロマイセス・セルビシエINVSC1などが使用できる。
【００３４】
宿主微生物に組み換えDNAを移入する方法としては、例えば、宿主微生物がE. coliやサ
ッカロマイセス・セルビシエ、ストレプトマイセス・リビダンスに属する微生物の場合に
は、常法に従ってコンピテントセル化した宿主菌株に組み換えDNAの移入を行えばよく、
菌株によっては電気穿孔法を使用してもよい。
変異FODを生産するためには、変異FOD遺伝子を導入した宿主を適切な培地で培養し、培
養した菌体を集菌後、適当な緩衝液中にて超音波破砕やリゾチーム処理などにより菌体を
破壊し、菌体抽出液を調製すればよい。また、シグナル配列を付加することによる分泌発
現により、培養溶液中に変異FODを蓄積させても良い。
かようにして生産された変異FODは、通常の硫安沈殿、ゲル濾過、カラム精製などによ
って分離精製され、酵素標品として供給される。
【００３５】
上記の遺伝子操作に一般的に使用される量的関係は、供与微生物からのDNA及びベクタ
ーDNAを0.1〜10μgに対し、制限酵素を約1〜10U、リガーゼ約300U、その他の酵素約1〜10
U、程度が例示される。
変異FOD遺伝子を含み、変異FODを産生し得る形質転換微生物の具体的な例示としては、
エシェリヒア・コリに属する微生物を宿主微生物とし、その内部に変異FOD遺伝子を含有
するプラスミドpcmFOD3を保有する形質転換微生物、エシェリヒア・コリJM109・pcmFOD3
（FERM BP-7847）、およびpcmFOD4を保有する形質転換微生物、エシェリヒア・コリJM109
・pcmFOD4、およびpcmFOD5を保有する形質転換微生物、エシェリヒア・コリJM109・pcmFO
D5（FERM BP-7848）が挙げられる。これらの構造を図７に示した。
なお、前記エシェリヒア・コリJM109・pcmFOD3及びエシェリヒア・コリJM109・pcmFOD5
は、共に平成13年1月16日に日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6の独立行政法人
産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託され、それぞれ受託番号FERM BP-78
47及びFERM BP-7848を付与された。
【００３６】
形質転換微生物により該変異FODを製造するに当っては、該形質転換微生物を栄養培地
で培養して菌体内又は培養液中に該変異FODを産生せしめ、培養終了後、得られた培養物
を濾過又は遠心分離などの手段により菌体を採集し、次いでこの菌体を機械的方法又はリ
ゾチームなどの酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてEDTA及び／又は適当な界面活性剤
などを添加して該変異FODの水溶液を濃縮するか、又は濃縮する事なく硫安分画、ゲル濾
過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィーにより処理して、純度のよい該変異FODを得ることができる。
【００３７】
形質転換微生物の培養条件はその栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく
、通常多くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利で
ある。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用されうる。
炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、サッカロー
ス、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜などが使用される。窒素源としては利
用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加
水分解物などが使用される。
その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マン
ガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される
。
【００３８】
培養温度は微生物が発育し、変異FODを生産する範囲で適宜変更し得るが、E. coliの場
合、好ましくは20〜42℃程度である。培養条件は、条件によって多少異なるが、変異FOD
が最高終了に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、E. coliの場
合、通常は12〜48時間程度である。培地pHは菌が発育し、変異FODを生産する範囲で適宜
変更し得るが、E. coliの場合、好ましくはpH6〜8程度である。
【００３９】
培養物中の変異FODは、菌体を含む培養液そのままを採取し、利用することもできるが
、一般には常法に従って、変異FODが培養液中に存在する場合には、濾過、遠心分離など
により変異FOD含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。変異FODが菌体内に存
在する場合には、得られた培養物を濾過又は遠心分離などの手段により、菌体を採取し、
次いでこの菌体を必要に応じて機械的方法又はリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、ま
たEDTAなどのキレート剤及び／又は界面活性剤を添加して変異FODを可溶化し水溶液とし
て分離採取する。
この様にして得られた変異FOD含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、
硫酸ナトリウムなどの塩析処理などによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。
【００４０】
次いでこの沈澱物を、水に溶解し、半透膜にて透析せしめて、より低分子量の不純物を
除去することができる。また、吸着剤あるいはゲル濾過剤などによるゲル濾過、アフィニ
ティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー
等により精製し、これらの手段を用いて得られる変異FOD含有溶液から、減圧濃縮凍結乾
燥等の処理により精製された変異FODが得られる。
糖化アミノ酸に作用する酵素の活性は下記の方法にて測定した。
【００４１】
＜＜糖化アミノ酸に作用する酵素の活性測定法＞＞
＜反応液の組成＞
50mM トリス緩衝液 pH7.5
0.03% ４アミノアンチピリン（4-AA）（和光純薬社製）
0.02% フェノール（和光純薬社製）
4.5U/ml パーオキシダーゼ（POD）（シグマ社製）
1.0mM α-カルボベンズオキシ-ε-D-フルクトシル-L-リジン若しくはフルクト
シルバリン（ハシバらの方法に基づき合成、精製した。Hashiba H、
J.Agric.Food Chem.24：70、1976 以下ZFL、FVと略す。）
上記の反応液1mlを小試験管に入れ、37℃-5分間予備加温した後、適当に希釈した酵素
液0.02mlを添加して攪拌し、反応を開始する。正確に10分間反応の後に0.5％のSDSを2ml
添加して反応を停止し、波長500nmの吸光度を測定する(As)。またブランクとして酵素液
のかわりに蒸留水0.02mlを用いて同一の操作を行って吸光度を測定する(Ab)。この酵素作
用の吸光度(As)と盲検の吸光度(Ab)の吸光度差(As-Ab)より酵素活性を求める。別にあら
かじめ過酸化水素の標準溶液を用いて吸光度と生成した過酸化水素との関係を調べ、37℃
-1 分間に1 μmolの過酸化水素を生成する酵素量を1Uと定義する。計算式を下記に示す。
3.02 ： 総反応液量(ml)
0.02 ： 酵素溶液量(ml)
10 ： 反応時間
2 ： 過酸化水素2 分子から4-AA、フェノールが縮合した色素1
分子を生じることによる係数
12.0 ： 4-AA-フェノールのミリモル吸光係数
Ｂ ： 酵素液の希釈倍率
以上の方法によって得られる変異FODのうち、配列表配列番号１のアミノ酸配列372番のリ
ジンがトリプトファンに置換された変異FODの酵素学的性質は以下のようである。
【００４２】
（１）基質特異性
ZFL 100%
FV 0%
（２）酵素作用
下記に示すように、少なくともα-アミノ酸、ε-アミノ酸のアマドリ化合物を分解して
、グルコソンと過酸化水素および対応するα-アミノ酸、ε-アミノ酸を生成する反応を触
媒する。
（３）分子量
本酵素の分子量はSephadex・G-100を用いたカラムゲル濾過法で、0.2MのNaCl含有0.1M
のリン酸緩衝液（pH7.0）を溶出液として測定した結果、48000±2000、SDS-PAGEでは4700
0±2000であった。
（４）等電点
キャリアアンフォライトを用いる焦点電気泳動法によって４℃、700Vの定電圧で40時間
通電した後、分画し、各画分の酵素活性を測定した結果、pH4.3±0.2であった。
（５）Km値
50mMのトリス塩酸緩衝液（pH7.5）
0.03%の4-AA
0.02%のフェノール
4.5U/mlのパーオキシダーゼ
を含む反応液中で合成基質ZFLの濃度を変化させて、ZFLに対するKm値を測定した結果、3.
4mMの値を示した。
（６）至適pH
前記の酵素活性測定法に従い、反応液中の50mMのトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）に代え
て100mMの酢酸緩衝液（pH4.4-5.4）、リン酸緩衝液（pH5.6-7.9）、トリス−塩酸緩衝液
（pH7.3-8.5）、およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH8.0-10.3）の各緩衝液を
用いて測定した。この結果、pH7.5で最大の活性を示した。
（７）pH安定性
本酵素0.5Uを含有する0.5Mの至適pHを測定するときに用いた各種緩衝液0.5mlを40℃、1
0分間処理した後、その残存活性を後記の活性測定法に従って測定した。この結果、pH7.0
-9.0の範囲で80％以上の活性を保持していた。
（８）熱安定性
本酵素0.5Uを0.2Mのトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）で調製し、10分間加熱処理後、その
残存活性を活性測定法に従って測定した。この結果、40℃までは残存活性として95％以上
を保持した。
（９）至適温度
40mMのトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）を用い、活性測定法に従い、各温度で10分間反応
後、0.5％のラウリル硫酸ナトリウム（以下SDSと略称する）溶液2mlで反応を停止し、波
長500nmで吸光度を測定した。この結果、50℃で最大の活性を示した。
【００４３】
次に、FODについて配列表配列番号１のアミノ酸配列372番のリジンを他のアミノ酸に置
換することにより糖化バリン反応性を著しく低下させた変異型FODを用いて被検液中の糖
化リジンを消去した後に、糖化バリンに反応性を有するFODを用いて被検液中の糖化バリ
ンを測定する方法について述べる。
被検液中の糖化リジンを消去するFODは糖化バリンに作用しないFODであればなんら限定
されるものではないが、例えばFODについて配列表配列番号１のアミノ酸配列372番のリジ
ンを他のアミノ酸に置換することにより糖化バリン反応性を著しく低下させた変異型FOD
が用いられ、さらに好適には変異FODのうち、配列表配列番号１のアミノ酸配列372番のリ
ジンがトリプトファン、メチオニン、バリンのいずれかに置換された変異FODを用いれば
良い。このとき反応液に添加する酵素量は被検液中の糖化リジンを消去するのに十分な量
であればよく、例えば、0.5〜200U/ml、好適には1〜50U/mlである。
また、糖化バリンを測定するFODについては糖化バリンに反応性を持つFODであれば何ら
限定されるものではなく、例えば、フザリウム・オキシスポルムIFO-9972株由来FODを用
いれば良い。このとき反応液に添加する酵素量は被検液中の糖化バリンを測定するのに十
分な量であればよく、例えば、0.5〜200U/ml、好適には1〜50U/mlである。
【００４４】
具体的な測定方法は、まず、第一反応にて、糖化リジンおよび糖化バリンを含有する被
検液中の糖化リジンに変異型FODを作用させ、このとき生成する過酸化水素はカタラーゼ
等によって分解させ、第二反応にて、被検液中の糖化バリンにFODを作用させ生成する過
酸化水素を４−アミノアンチピリン(4-AA)およびトリンダー試薬と反応させ、生成する色
素を比色測定すればよい。また、第二反応液中にカタラーゼの阻害剤であるアジ化ナトリ
ウムを添加してもよい。
【００４５】
本発明を用いて糖化蛋白質を正確に測定する際に使用しうるグロブリン成分選択的なプ
ロテアーゼ阻害剤としては、被検液に、プロテアーゼをグロブリン成分選択的なプロテア
ーゼ阻害剤存在下作用せしめ、主にグロブリン成分以外の蛋白質を断片化しうるグロブリ
ン成分選択的な阻害剤であればいかなる阻害剤を用いても良い。その好ましい例としては
デオキシコール酸、デオキシコール酸アミド、コール酸アミド、第四級アンモニウム塩、
第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤、コンカナバリンＡ、オクチルグルコシド若
しくはベタインがあげられる。
デオキシコール酸アミドとしては、例えばビスグルコナミドプロピルデオキシコーラミ
ド(N,N-Bis(3-D-gluconamidopropyl)deoxycholamido)等が好ましく、コール酸アミドとし
ては、例えば、硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパン(3-[(3
-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxypropanesulfonicacid)、硫酸-3-[(コール
アミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハイドロキシ-1-プロパン(3-[(3-Cholamidoprop
yl)dimethylammonio]propanesulfonic acid)若しくはビスグルコナミドプロピルコーラミ
ド(N,N-Bis(3-D-gluconamido propyl)cholamido)等が好ましい。
第四級アンモニウム塩としては、例えば塩化ベンジルトリエチルアンモニウム、塩化ベ
ンジルトリ-n-ブチルアンモニウム等が好ましく、第四級アンモニウム塩型陽イオン界面
活性剤としては、例えば塩化ラウリルトリメチルアンモニウム若しくはラウリルジメチル
アミンオキサイド等が好ましい。
これらのグロブリン成分選択的な阻害剤は単独若しくは組み合わせて用いても良い。
【００４６】
また、これらのグロブリン成分選択的な阻害剤の使用濃度としては、プロテアーゼ作用
中にグロブリン成分への作用を十分抑えられる量であれば良く、例えばデオキシコ−ル酸
、デオキシコール酸アミド、コール酸アミド、オクチルグルコシド、第四級アンモニウム
塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤を用いる場合には0.01％〜20％程
度の濃度で使用することが好ましく、さらに好ましくは0.05％〜10％でありまたこれ以外
の濃度を用いることもできる。
また同様に例えばコンカナバリンＡ、オクチルグルコシドもしくはベタインを用いる場
合にはそれぞれ0.01〜10mg/ml、0.005〜5％の濃度で使用することが出来、またそれぞれ0
.02〜2mg/ml、0.01〜2％の濃度で使用することが好ましくこれ以外の濃度を用いることも
できる。
【００４７】
本発明を用いて糖化蛋白質を正確に測定する際に使用しうるASOxとしては、被検液に含
まれるアスコルビン酸に有効に作用するものであればいかなるものを用いても良いが、例
えば植物または微生物由来のASOx 等が挙げられる。具体的な例を以下に示すがこれらは
１例に過ぎず、なんら限定されるものではない。
植物由来のASOxの例としては、キュウリ由来（アマノ社製、東洋紡社製）およびカボチ
ャ由来（ロシュ社製、東洋紡社製）が挙げられる。
微生物由来のASOxの例としてはアクレモニウム（Acremonium）由来（旭化成社製）、微
生物由来（アマノ社製）が挙げられる。
ASOxの活性は下記の方法にて測定した。
【００４８】
＜＜ASOxの活性測定法＞＞
＜保存基質溶液＞
Lアスコルビン酸（和光純薬社製）176mgとEDTA（第一化学薬品社製）37mgを1mM塩酸100
mlで溶解する。
＜反応試薬混合液＞
上記の保存基質溶液を0.45mMのEDTAを含む90mM 燐酸2カリ−5mM燐酸1ナト緩衝液で20
倍に希釈する。
＜操作＞
上記の反応試薬混合液1mlを小試験管に入れ、30℃-5分間予備加温した後、適当に希釈
した酵素液0.10mlを添加して攪拌し、反応を開始する。正確に5分間反応の後に0.2N塩酸
水溶液3.0mlを添加して反応を停止し、波長245nmの吸光度を測定する(As)。またブランク
として上記の反応液1mlを小試験管に入れ、30℃-5分間予備加温した後、0.2N塩酸水溶液3
.0mlを添加して反応を停止する。適当に希釈した酵素液0.10mlを添加して攪拌し、波長24
5nmの吸光度を測定する(Ab)。この酵素作用の吸光度(As)と盲検の吸光度(Ab)の吸光度差(
Ab-As)より酵素活性を求める。30℃-1 分間に1μmolのアスコルビン酸をデヒドロアスコ
ルビン酸に酸化する酵素量を1Uと定義する。計算式を下記に示す。
10.0：ｐH1.0の条件でアスコルビン酸の245ｎｍに於けるミリモル分子吸光係数
5：反応時間（min）
4.10：反応液総量(ml)
0.10：反応に供した酵素試料液量
Ｂ：酵素液の希釈倍率
また、これらのASOxの使用濃度としては、プロテアーゼとASOxを共存させ保存する場合
に、試薬使用時でも十分なアスコルビン酸の消去が可能な量であれば良く、例えば通常0.
1U/ml〜100U/ml、好ましくは1U/ml〜50U/mlの濃度で用いればよい。
【００４９】
本発明を用いて糖化蛋白質を正確に測定する際にASOxと組み合わせて使用しうる4-(2-
ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル基を持たない緩衝剤としては、プロテアーゼとASOxを
共存させた状態で、ASOxが安定である緩衝剤であればいかなるものを用いても良いが、例
えば3-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸（EPPS）、2-[4-(2
-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸（HEPES）及び2-ヒドロキシ-3-[4
-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸（HEPPSO）等の4-(2-ヒドロ
キシエチル)-1-ピペラジニル基を持つ緩衝剤以外の緩衝剤であればいかなる緩衝剤を用い
ても良い。
さらに、好ましい緩衝剤の例としては、例えばN-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンス
ルホン酸(ACES)、N-(2-アセトアミド)イミノジ酢酸(ADA)、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル
)-2-アミノエタンスルホン酸(BES)、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン(Bicine)、
ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン(Bis-Tris)、N-シクロ
ヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸(CAPS)、N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシ-3-アミ
ノプロパンスルホン酸(CAPSO)、N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸(CHES)、3-
[N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、2-モ
ルフィリノエタンスルホン酸(MES)、3-モルフィリノプロパンスルホン酸(MOPS)、2-ヒド
ロキシ-3-モルフィリノプロパンスルホン酸(MOPSO)、ピペラジン-1,4-ビス（2-エタンス
ルホン酸(PIPES)、ピペラジン-1,4-ビス（2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸）(POPSO)
、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPS)、2-ハイドロ
キシ-N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPSO)、N-トリ
ス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノプロパンスルホン酸(TES)、N-[トリス(ヒドロキシ
メチル)メチル]グリシン(Tricine)およびトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）
等があげられる。
最も好ましい緩衝剤の例としては例えばトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）
及びピペラジン-1,4-ビス（2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸）(POPSO)が挙げられる
。
これらのASOxと共に使用する緩衝剤の使用濃度としては、プロテアーゼ共存下でもASOx
が安定である濃度であり、かつプロテアーゼ及びASOxの反応に影響を及ぼさない濃度であ
ればいかなる量用いても良く、例えば通常1mM〜1M、好ましくは5mM〜500mMの濃度で用い
ればよい。
【００５０】
本発明を用いて糖化アルブミンを正確に測定する際に使用しうるアルブミンの蛋白質変
性剤及び／またはＳ−Ｓ結合を有する化合物としてはBCPのアルブミンに対する反応性がG
A及びNGAで一致すればいかなるものを用いても良い。
好ましい蛋白質変性剤の例としては、例えば、尿素、グアニジン化合物、陰イオン界面
活性剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム(SDS)、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエ
ーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、アルキル
ベンゼンスルホン酸塩が挙げられ、これらは単独若しくは組み合わせて用いることが出来
る。また、これらの蛋白質変性剤の使用濃度としては、BCPのアルブミンに対する反応性
がGA及びNGAで一致する濃度であれば良く、例えば通常0.01％〜10％、好ましくは0.05％
〜5％の濃度で用いればよい。
好ましいＳ−Ｓ結合を有する化合物としては6,6'-ジチオジニコチン酸(6,6'-dithiodin
icotinic acid)、3,3'-ジチオジプロピオン酸(3,3'-dithiodipropionic acid)、2,2'-ジ
チオジサリチル酸(2,2'-dithiodibenzoicacid)、4,4'-ジチオジモルホリン(4,4'-dithiod
imorpholine)、2,2'-ジヒドロキシ-6,6'-ジナフチルジスルフィド(2.2'-dihydroxy-6,6'-
dinaphthyl disulfide;DDD)、2,2'-ジチオジピリジン(2,2'-dithiopyridine;2-PDS)、4,4
'-ジチオジピリジン(4,4'-dithiopyridine;4-PDS)、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)
(5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid);DTNB)、2,2'-ジチオビス(5-ニトロピリジン)(2
,2'-dithiobis-(5-nitropyridine))等があげられる。
また、これらのＳ−Ｓ結合を有する化合物の使用濃度としては、BCPのアルブミンに対
する反応性がGA及びNGAで一致する濃度であれば良く、例えば通常1μM〜10mM、好ましく
は10μM〜5mMの濃度で用いればよく、これ以外の濃度で用いても良い。
【００５１】
本発明を用いて糖化蛋白質を正確に測定する際に使用しうるプロテアーゼの安定化剤と
しては、試薬保存中にプロテアーゼの活性低下を抑える物質であればいかなるものを用い
ても良く、特に試薬を液体の状態で保存中にプロテアーゼの活性低下を抑える物質であれ
ば好ましい。
好ましい安定化剤の例としてはジメチルスルホオキシド、アルコール、水溶性カルシウ
ム塩、食塩、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤
があげられる。アルコールの例としては、エタノール、プロパノール、エチレングリコー
ル、グリセリン等が、第四級アンモニウム塩第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤
の例としてはラウリル硫酸トリエタノールアミン、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム
等があげられる。
また、これらのプロテアーゼ安定化剤の使用濃度としては、試薬保存中にプロテアーゼ
の活性低下を抑える物質であればいかなる濃度で用いても良く、特に試薬を液体の状態で
保存中にプロテアーゼの活性低下を抑える濃度であれば好ましい。好ましい濃度の例とし
ては、例えば通常0.01％〜30％、好ましくは0.1％〜20％の濃度で用いればよく、これ以
外の濃度で用いても良い。
【００５２】
本発明を用いて糖化蛋白質を正確に測定する際に使用しうる少なくとも糖化アミノ酸に
作用する酵素の安定化剤としては、試薬保存中に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素
の活性低下を抑える物質であればいかなるものを用いても良く、特に試薬を液体の状態で
保存中に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の活性低下を抑える物質であれば好まし
い。
好ましい安定化剤の例としては糖アルコール、スクロース、水溶性マグネシウム塩、水
溶性カルシウム塩、硫安、アミノ酸、ザルコシンがあげられる。糖アルコールの例として
は、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、グリセリン等が、アミノ酸としては全
てのアミノ酸に強い安定化効果があるが中でもより好ましくは、プロリン、グルタミン酸
、アラニン、バリン、グリシン、リジン等があげられる。
また、これらの少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化剤の使用濃度としては
、試薬保存中に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の活性低下を抑える物質であれば
いかなる濃度で用いても良く、特に試薬を液体の状態で保存中に少なくとも糖化アミノ酸
に作用する酵素の活性低下を抑える濃度であれば好ましい。好ましい濃度の例としては、
例えば糖アルコール、スクロース、アミノ酸、ザルコシンの場合、通常0.01％〜30％、好
ましくは0.1％〜20％の濃度で用いればよく、水溶性マグネシウム塩、水溶性カルシウム
塩、硫安の場合、通常1mM〜1M、好ましくは10mM〜500mMの濃度で用いればよく、これ以外
の濃度で用いても良い。
【００５３】
本発明の糖化蛋白質測定用組成物に於ける液組成については、プロテアーゼを含む蛋白
質分解試薬、生成した糖化アミノ酸若しくはペプチドの測定を行う糖化アミノ酸測定試薬
を同一反応槽中で使用できるよう適宜組み合わせれば良い。またこれらの試薬は液状品及
び液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供できる。
本発明に使用しうる蛋白質分解試薬組成としては、蛋白質分解反応が効率よく進行する
ようにpH、緩衝剤及びプロテアーゼ濃度を決定し、その後グロブリン成分選択的なプロテ
アーゼ阻害剤、ASOx、プロテアーゼ安定化剤を前述の有効な濃度になるよう適宜調製して
添加すればよい。
例えばプロテアーゼタイプXXIV（シグマ社製）を用いる場合にはpHが7 〜10付近で蛋白
質分解活性が強く、反応のpHは7 〜10を選択できる。緩衝液としては4-(2-ヒドロキシエ
チル)-1-ピペラジニル基を持たない緩衝剤である例えばpH7.2〜8.5に緩衝作用のあるPOPS
O緩衝液を使用することが出来、POPSOの濃度は1〜100mMの濃度、好ましくは10〜500mMで
使用すればよい。
またプロテアーゼ添加濃度は実際に使用される反応時間中に被検液中の糖化蛋白質を十
分に分解し得る濃度で有れば良く、100 〜50万PU/ml が好ましく、500〜10万PU/ml がよ
り好ましい。
グロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害剤、ASOx、プロテアーゼ安定化剤との組み合
わせとしては、例えばグロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害剤として硫酸-3-[(コー
ルアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパン、0.01％〜20％、好ましくは0.05％
〜10％、カボチャ由来アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製）、0.1U/ml〜100U/ml、
好ましくは1U/ml〜50U/ml、プロテアーゼ安定化剤としてジメチルスルホオキシド0.01％
〜30％、好ましくは0.1％〜20％等を用いることができる。
【００５４】
本発明に使用しうる糖化アミノ酸測定試薬組成については、使用する少なくとも糖化ア
ミノ酸に作用する酵素の至適pHを考慮し反応が効率よく進行するようにpHを選択し、次に
糖化アミノ酸に作用する酵素量を決定し、最後に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素
の安定化剤を添加すればよい。
例えばR-FOD 若しくはR-FOD-II（旭化成社製）を使用する場合、最大活性の50％ 以上
の活性を示す領域がpH6.5 〜10と広く、反応のpHは6.5 〜10を選択できる。また酵素添加
濃度は、使用される反応液中で糖化アミノ酸を十分に検出し得る濃度で有れば良く、0.5
〜200U/mlが好ましく、1〜50U/ml がより好ましい。
少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化剤としては、例えばグルタミン酸を用
いることができ、0.01％〜30％、好ましくは0.1％〜20％の濃度で用いればよい。
【００５５】
本発明に使用しうる第１試薬に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素、第２試薬にプ
ロテアーゼを含有する組成物としては、第１試薬をプロテアーゼ及び少なくとも糖化アミ
ノ酸に作用する酵素の作用可能な条件、例えばｐＨ、塩濃度、等を設定し、第２試薬には
プロテアーゼの保存に適した条件を設定すれば如何なる条件を用いても良い。
例えばＲ-ＦＯＤ、プロテアーゼタイプＸＸＩＶを使用する場合には、それぞれｐＨ６
．５〜１０、７〜１０で酵素が良く作用することから第１試薬はｐＨ７〜１０を選択し比
較的高濃度の例えば２０〜１０００ｍＭの緩衝剤濃度を選択すればよい。一方本プロテア
ーゼはｐＨ７以下で安定であることから、第２試薬のｐＨは７以下を選択し第１試薬より
も比較的低濃度の例えば１〜５０ｍＭ緩衝剤濃度を選択し、加えて例えばジメチルスルホ
オキシド１〜５０％程度のプロテアーゼ安定化剤を添加すると好ましい。この場合第１試
薬と第２試薬の混合の割合を例えば４：１と第１試薬を多くすればさらに高濃度の安定化
剤や第１試薬からかけ離れたｐＨ等が選択可能である。
【００５６】
さらに本発明に基づく糖化蛋白質を測定する酵素反応組成には、例えば界面活性剤、塩
類、緩衝剤、ｐＨ調製剤や防腐剤などを適宜選択して添加しても良い。
界面活性剤としてはポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンソル
ビタン脂肪酸エステル類、ポリビニルアルコール等の0.01〜10％、好適には0.05〜5％、
各種金属塩類、例えば塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マンガン、塩
化コバルト、塩化亜鉛、塩化カルシウム等の1mM〜5M、好適には10mM〜1M、各種緩衝液、
例えばトリス−塩酸緩衝液、グリシン−NaOH緩衝液、燐酸緩衝液、グッドの緩衝液等の10
mM〜2M、好適には20mM〜1M、各種防腐剤、例えばアジ化ナトリウムの0.01〜10％、好適に
は0.05〜1％を適宜添加すれば良い。
【００５７】
本発明に使用しうる糖化蛋白質の測定方法としては、前記本発明の糖化蛋白質測定用組
成物に被検液0.001〜0.5mlを加え、37℃の温度にて反応させ、レートアッセイを行う場合
には、反応開始後一定時間後の2点間の数分ないし数十分間、例えば3分後と4分後の1分間
、または3分後と8分後の5分間における変化した補酵素、溶存酸素、過酸化水素若しくは
その他生成物の量を直接または間接的に前記の方法で測定すれば良く、エンドポイントア
ッセイの場合には反応開始後一定時間後の変化した補酵素、溶存酸素、過酸化水素若しく
はその他生成物の量を同様に測定すれば良い。この場合既知濃度の糖化蛋白質を用いて測
定した場合の吸光度等の変化と比較すれば被検液中の糖化蛋白質量を求めることができる
。
【００５８】
本発明に使用しうる少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素作用の検出は、例えばデヒ
ドロゲナーゼを用いた場合には補酵素の変化量を直接測定するか、若しくは生じた還元型
補酵素を各種ジアフォラーゼ、またはフェナジンメトサルフェート等の電子キャリアー及
びニトロテトラゾリウム、WST-1、8（以上同人化学研究所社製）に代表される各種テトラ
ゾリウム塩等の還元系発色試薬を用い間接的に測定しても良く、またこれ以外の公知の方
法により直接、間接的に測定しても良い。
また例えばオキシダーゼを用いた場合には、酸素の消費量または反応生成物の量を測定
することが好ましい。反応生成物として、例えばR-FODを用いた場合には反応により過酸
化水素及びグルコソンが生成し、過酸化水素及びグルコソン共に公知の方法により直接、
間接的に測定する事が出来る。
上記過酸化水素の量は、例えばパーオキシダーゼ等を用いて色素等を生成し、発色、発
光、蛍光等により測定しても良く、また電気化学的手法によって測定しても良く、カタラ
ーゼ等を用いてアルコールからアルデヒドを生成せしめて、生じたアルデヒドの量を測定
しても良い。
【００５９】
過酸化水素の発色系は、パーオキシダーゼの存在下で4-AA若しくは3-メチル-2-ベンゾ
チアゾリノンヒドラゾン(MBTH)等のカップラーとフェノール等の色原体との酸化縮合によ
り色素を生成するトリンダー試薬、パーオキシダーゼの存在下で直接酸化、呈色するロイ
コ型試薬等を用いることが出来る。
トリンダー型試薬の色原体としては、フェノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン
誘導体等が使用可能であり、具体例として、N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピ
ル）-m-トルイジン（TOOS）、N,Nビス（４−スルホプロピル）-3-メチルアニリン2ナトリ
ウム(TODB)（以上同人化学研究所社製）等が挙げられる。
またロイコ型試薬の具体例としては、N-（カルボキシメチルアミノカルボニル）-4,4-
ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン（DA64）、10-（カルボキシメチルアミノカル
ボニル）-3,7- ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（DA67）（以上和光純薬社製）等
が挙げられる。
蛍光法には、酸化によって蛍光を発する化合物、例えばホモバニリン酸、4-ヒドロキシ
フェニル酢酸等を、化学発光法には、触媒としてルミノール、ルシゲニン、イソルミノー
ル等を用いることが出来る。
【００６０】
また過酸化水素を電極を用いて測定する場合、電極には、過酸化水素との間で電子を授
受する事の出来る材料である限り特に制限されないが、例えば白金、金若しくは銀等が挙
げられ、電極測定方法としてはアンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリー
等の公知の方法を用いることが出来、さらにオキシダーゼまたは基質と電極との間の反応
に電子伝達体を介在させ、得られる酸化、還元電流或いはその電気量を測定しても良い。
電子伝達体としては電子伝達機能を有する任意の物質が使用可能であり、例えばフェロセ
ン誘導体、キノン誘導体等の物質が挙げられる。またオキシダーゼ反応により生成する過
酸化水素と電極の間に電子伝達体を介在させ得られる酸化、還元電流またはその電気量を
測定しても良い。
【００６１】
糖化蛋白質が糖化アルブミンであり、糖化アルブミン割合を正確に測定する場合に、本
発明において用いることができるアルブミン測定試薬としては、蛋白質変性剤及び／また
はＳ−Ｓ結合を有する化合物及びブロモクレゾールパープルを含有する組成物として調製
されているものであり、GAとNGAの間で測定に乖離を生じない組成であればいかなる組成
を用いても良い。
例えば蛋白質変性剤及び／またはＳ−Ｓ結合を有する化合物としてラウリル硫酸ナトリ
ウム及び5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)を用いる場合には、BCPの発色に影響を与え
ないように低濃度の緩衝液例えば１〜20mMを用い、ラウリル硫酸ナトリウム0.01％〜10％
、好ましくは0.05％〜5％及び5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)１μM〜10mM、好まし
くは10μM〜5mMの濃度で用いれば良い。またBCPは中性以上で激しく着色することからpH4
.5〜7.5で使用すると良い。
【００６２】
本発明に使用しうるアルブミンの測定方法としては、前記本発明のアルブミン測定用組
成物に被検液0.001〜0.5mlを加え、37℃の温度にて反応させ、１ポイントアッセイにて反
応開始から一定時間後の色素の量を測定すれば良い。アルブミン-BCPの発色の検出は吸収
極大が600nm付近であるから、550nm〜630nm付近で検出を行うと良い。この場合既知濃度
のアルブミンを用いて測定した場合の吸光度及び水のブランクと比較すれば被検液中のア
ルブミンの量を求めることができる。
【００６３】
本発明の測定対象となる被検液は、少なくとも糖化蛋白質を含有する被検液であれば如
何なるものを用いても良いが、好ましい被検液としては血液成分、例えば血清、血漿、血
球、全血等が挙げられる。また分離された赤血球も、分離の条件によってはグロブリン成
分が混入し測定値に影響を与える可能性があることから好ましい被検液として用いること
ができる。
本発明の糖化蛋白質測定組成物及び測定方法に於ける測定対象である糖化蛋白質として
は、例えばGAまたはGHbが挙げられるが、測定対象となる糖化蛋白質は何らこれらに限定
されるものではなく、何れの糖化蛋白質を測定しても良い。
ついで、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明は何らこれにより限定されるもので
はない。
【実施例１】
【００６４】
グロブリン成分に作用しないプロテアーゼをスクリーニングする目的で、プロテアーゼ
をアルブミン、グロブリン成分及びヘモグロビンに作用させ生じた糖化アミノ酸若しくは
糖化ペプチドをR-FOD（旭化成社製）にて測定した。
＜基質溶液＞
1; HSA基質溶液; Albumin Human; Essencially Globulin Free; 25mg/ml、GA%=31.9%
、フルクトサミン（FRA）値=256μmol/L [シグマ社製; 基質溶液中のアルブミン濃度はア
ルブミン測定キット(アルブミンII-HAテストワコー; 和光純薬社製)にて測定、GA%は糖化
アルブミン測定計(GAA-2000; 京都第一科学社製)にて測定した。
2; G-II,III基質溶液、FRA値48μmol/L[Globulins Human Cohn Fraction II,III;
16.9mg/ml(シグマ社製)]
3; G-IV基質溶液、FRA値26μmol/L[Globulins Human Cohn Fraction IV;6mg/ml(シグ
マ社製)]
4; G-I基質溶液、FRA値77μmol/L[グロベニンI;glovenin-I;免疫グロブリン製剤(武
田薬品社製)]
5; Hb基質溶液; Hemoglobin Human; 55mg/ml、糖化へモグロビン率;HbA1c=4.5%[シグ
マ社製;HbA1c値は糖化へモグロビン計(ハイオートエーワンシーHA-8150 ;京都第一科学社
製)にて測定した。]
なお基質溶液のフルクトサミン値はフルクトサミン測定キット（オートワコーフルクト
サミン、和光純薬社製）にて測定した。
＜プロテアーゼ反応試料作成＞
Hb以外の基質溶液200μl、プロテアーゼ溶液100mg/ml(この濃度が作成できない場合は
可能な限り濃い濃度、また溶液状のものはそのままの濃度)40μl、及び1Mトリス緩衝液(p
H8)10μlを良く混合し37℃-30分反応させ、1万膜(ウルトラフリーMC; ミリポア社製)で濾
過し、濾液をプロテアーゼ反応試料とした。また、基質の代わりに蒸留水を用い同様の操
作を行い、ブランク試料とした。
一方Hb基質溶液の場合は基質溶液150μl、プロテアーゼ溶液200mg/ml(この濃度が作成
できない場合は可能な限り濃い濃度、また溶液状のものはそのままの濃度)を60μl及び1M
トリス緩衝液(pH8)5μlを良く混合し37℃-60分反応させ、1万膜(ウルトラフリーMC；ミリ
ポア社製）で濾過し、濾液をプロテアーゼ反応試料とした。また、基質の代わりに蒸留水
を用い同様の操作を行い、ブランク試料とした。
【００６５】
＜プロテアーゼ反応試料中の糖化アミノ酸及び糖化ペプチドの測定＞
＜反応液組成＞
50mM トリス緩衝液 pH8.0
0.02% 4-AA(和光純薬社製)
0.02% N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-m-トルイジン
(TOOS）(同人化学研究所社製)
2U/ml R-FOD(旭化成社製)
5U/ml POD(シグマ社製)
＜反応手順＞
上記糖化アミノ酸測定反応液300μlをセルに分注し37℃-3分間インキュベーションし55
5nmを測光する(A0)。続いてプロテアーゼ反応試料30μlを添加し37℃-5分間インキュベー
ションし555nmを測光する(A1)。またプロテアーゼ反応試料の代わりにブランク試料を用
い同様の操作を行いA0ブランク、A1ブランクを測定する。プロテアーゼの糖化蛋白質への
作用を吸光度変化で示すと下式となる。
ΔA=(A1-A0)-(A1ブランク-A0ブランク)
pH8.0における代表的なプロテアーゼのアルブミン、グロブリン、ヘモグロビンへの作
用(ΔA)を表１に示す。
【００６６】
【表１】
【００６７】
G-IV基質溶液中の糖化蛋白質に対する作用はどのプロテアーゼも小さい若しくは0であ
ったため、またG-II、-III基質溶液の測定値とG-I基質溶液の測定値がほぼ同じであった
ために表１にはグロブリン成分についてG-I基質溶液の結果のみを記載した。表１から分
かるようにアスペルギルス(Aspergillus)属由来のプロテアーゼ、及びプロテアーゼタイ
プXIVはグロブリン成分中の糖化グロブリンにも良く作用している。
しかしながらアルブミン中のGA及びヘモグロビン中のGHbに作用するエンド型、エキソ
型プロテアーゼは共にグロブリン成分中の糖化グロブリンに作用を示した。よって血清又
は血漿中のGA若しくは全血及び血球中のGHbを測定する場合にプロテアーゼの選択のみで
はグロブリン成分の影響を回避できないと考えられた。
【実施例２】
【００６８】
＜グロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害剤のスクリーニング＞
前記HSA基質溶液に高い作用を示すプロテアーゼタイプXXIV（シグマ社製）を用いて、H
SA基質溶液を基準に、前記各種グロブリン基質溶液へのプロテアーゼ作用を低下させる物
質をスクリーニングした。
＜反応液組成＞
R-1 蛋白質分解試薬
150mM トリシン緩衝液（和光純薬社製）pH8.5
2500U/ml プロテアーゼタイプXXIV（シグマ社製 + グロブリン選択的なプロテアー
ゼ阻害剤(デオキシコール酸、デオキシコール酸アミド、コール酸アミド、第四級アンモ
ニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤;1%、コンカナバリンＡ;0.
21mg/ml、ベタイン;0.1%、オクチルグルコシド;1%；同人化学研究所社製)
R-2 糖化アミノ酸測定試薬
150mM トリシン緩衝液（和光純薬社製）pH8.5
0.12% 4-AA(和光純薬社製)
0.08% TOOS(同人化学研究所社製)
24U/ml R-FOD(旭化成工業社製)
20U/ml POD(シグマ社製)
R-1 蛋白質分解試薬中のデオキシコール酸アミドとしては、ビスグルコナミドプロピル
デオキシコーラミドを、コール酸アミドとしては硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチ
ルアンモニオ]-1-プロパン、硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハ
イドロキシ-1-プロパン若しくはビスグルコナミドプロピルコーラミド、第四級アンモニ
ウム塩としては塩化ベンジルトリエチルアンモニウム、塩化ベンジルトリ-n-ブチルアン
モニウム、第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤としては、塩化ラウリルトリメチ
ルアンモニウム及びラウリルジメチルアミンオキサイドを使用した。
＜基質溶液＞
1; HSA基質溶液; Albumin Human; 40mg/ml、GA%=10.5%[和光純薬社製; 基質溶液中のア
ルブミン濃度はアルブミン測定キット(アルブミンII-HAテストワコー; 和光純薬社製)に
て測定し、GA%は糖化アルブミン測定計(GAA-2000;京都第一科学社製)にて測定した。]
2;γグロブリン添加基質溶液;上記HSA基質溶液にγグロブリン [γGlobulin s Human
(シグマ社製) フルクトサミン値34μM] 17.0mg/mlを添加した。
＜反応手順＞
37℃にインキュベートされたR-1;240μlに基質溶液（HSA基質溶液、G-I基質溶液）8μl
を添加し、37℃で反応を開始し、正確に5分後にR-2;80μlを添加した。R-2添加前後の546
nmの吸光度を測定し、その差を吸光度変化とした。また基質の代わりに蒸留水を用い同様
の操作を行い、ブランク試料とし、さらにグロブリン選択的なプロテアーゼ阻害剤を添加
しない反応液をコントロールとした。
HSA基質溶液から得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変化を差し引いたΔA(H
SA)及びγグロブリン添加基質溶液から得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変
化を差し引いたΔA(+γグロブリン)を算出し、
γグロブリン添加の影響
＝(ΔA(+γグロブリン) -ΔA(HSA))/ΔA(HSA)×100(%)
様々な候補物質の共存下及び非共存下（コントロール試料）にて比較した。その結果を表
２に示す。
【００６９】
【表２】
【００７０】
表２から分かるようにデオキシコール酸、デオキシコール酸アミド、コール酸アミド、
第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤、コンカナバ
リンＡ、オクチルグルコシド及びベタインにグロブリンへのプロテアーゼ作用を阻害する
効果が確認され、これらグロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害剤及びプロテアーゼを
用いることにより主にグロブリン以外の蛋白質を断片化できることが明白となった。
さらにHSA基質溶液の代わりにHb基質溶液を用い同様の測定を行った。但しHb基質溶液
を用いた場合にはR-1反応終了後、トリクロル酢酸にて除蛋白、中和後R-2を添加し評価を
行った。Hb基質溶液を用いた場合にもデオキシコール酸、デオキシコール酸アミド、コー
ル酸アミド、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤
、コンカナバリンＡ及びベタインにグロブリンへのプロテアーゼ作用を阻害する効果が確
認された。
【実施例３】
【００７１】
＜硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンのグロブリン成分選
択的なプロテアーゼ阻害効果＞
様々なプロテアーゼを用い、硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-
プロパンのグロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害効果を確認した。
R-1 蛋白質分解試薬
150mM トリシン緩衝液（和光純薬社製）pH8.5
2500U/ml プロテアーゼ*
1% 硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパン
＊ プロテアーゼはオリエンターゼ22BF(阪急バイオインダストリー社製)、プロテ
アーゼタイプVIII、プロテアーゼタイプXIV、プロテアーゼタイプXXVII（以上
シグマ社製）を使用した。
R-2 糖化アミノ酸測定試薬
実施例２に同じ
＜基質溶液＞
実施例２に同じ。
＜反応手順＞
実施例２に同じ手順でγグロブリン添加の影響を硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメ
チルアンモニオ]-1-プロパンの共存下及び非共存下（コントロール試料）にて比較した。
その結果を表３に示す。なお、判定の欄について、γグロブリンの添加の影響が有意に低
下した場合に○とした。
【００７２】
【表３】
【００７３】
表３から分かるようにオリエンターゼ22BF、プロテアーゼタイプVIII、プロテアーゼタ
イプXIV、プロテアーゼタイプXXVIIはすべて硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルア
ンモニオ]-1-プロパン共存下にγグロブリン基質へのプロテアーゼ作用が低下し、一方HS
A基質に対する作用は保持されていた。このことから本発明におけるグロブリン成分選択
的なプロテアーゼ阻害剤はプロテアーゼの種類を問わず有効であることが明らかとなった
。
さらに同様にGHbを測定する場合にも本発明を用いることにより、グロブリン成分の影
響を回避できた。
【実施例４】
【００７４】
＜糖化アルブミンの希釈直線性＞
R-1 蛋白質分解試薬
150mM トリシン緩衝液（和光純薬社製）pH8.5
2500U/ml プロテアーゼタイプXXVII（シグマ社製）
1% 硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハイドロキシ-1-
プロパン（シグマ社製）
R-2 糖化アミノ酸測定試薬
実施例２に同じ
＜基質溶液＞
1：HSA基質溶液；実施例１と同じ。但し濃度は4.0g/dlで用いた。
2：γグロブリン基質溶液；実施例２と同じ。
3： グロブリンIV基質溶液；実施例１と同じ。
＜操作＞
HSA基質溶液(4g/dl)、γグロブリン（γG）及びグロブリンIV（GIV）基質溶液1.7g/dl)
の0.0、0.5、1.0、1.5、2.0倍濃度の試料を調製し希釈直線性を確認した。操作は実施例
３に同じ。但しHSA1.0倍濃度は10回測定しCV値を計算した。その結果を図１に示す。
【００７５】
図１から分かるようにγグロブリン及びグロブリンIV基質溶液共に濃度を変化させても
吸光度変化が得られなかった。一方HSA基質溶液は濃度に応じて良好な直線性が得られ、
グロブリン成分の影響を実質的に受けずに糖化アルブミンが測定されていることが明白で
ある。またHSA1.0倍濃度ではＣＶ値＝0.9％と良好な再現性が確認されており、本発明の
測定系を用いて10分の反応時間で糖化アルブミンが選択的に、感度良く、また再現良く測
定されていることが明らかとなった。
【実施例５】
【００７６】
＜糖化ヘモグロビンの希釈直線性＞
R-1 蛋白質分解試薬
77mM トリス緩衝液 ｐH8.0
2500U/ml プロテアーゼタイプXIV(シグマ社製)
1% 硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハイドロキ
シ-1-プロパン（シグマ社製）
R-2 糖化アミノ酸測定試薬
実施例２に同じ。
＜基質溶液＞
実施例１と同一のＨｂ基質溶液及び実施例４と同じγグロブリン及びグロブリンIV基質
溶液を使用した。
＜操作＞
Hb基質溶液(4g/dl)、γグロブリン及びグロブリンIV基質溶液(1.7g/dl)の0.0、0.5、1.
0、1.5、2.0倍濃度の試料を調製し希釈直線性を確認した。操作は実施例１に同じ。但しH
ｂ1.0倍濃度は10回測定しCV値を計算した。その結果を図２に示す。
【００７７】
図２から分かるようにγグロブリン及びグロブリンIV基質溶液共に濃度を変化させても
吸光度変化が得られなかった。一方Hb基質溶液は濃度に応じて良好な直線性が得られ、グ
ロブリン成分の影響を実質的に受けずに糖化ヘモグロビンが測定されていることが明白で
ある。またHb1.0倍濃度ではＣＶ値＝2.0％と良好な再現性が確認されており、本発明の測
定系を用いて10分の反応時間で糖化ヘモグロビンが選択的に、感度良く、また再現良く測
定されていることが明らかとなった。
【実施例６】
【００７８】
＜糖化アルブミンの直線性＞
R-1 蛋白質分解試薬 実施例４に同じ。
R-2 糖化アミノ酸測定試薬 実施例４に同じ。
＜基質溶液＞
血清A）* 糖尿病患者血清 GA%=32.9%；アルブミン濃度 4.3g/dl
血清B）* 健常者血清 GA%=16.4%；アルブミン濃度 4.1g/dl
＊ 上記血清A）とB）とを10：0、8：2、6：4、4：6、2：8、0：10の割合で混合し試
料とした。
＜操作＞ 実施例３に同じ。
結果を図３に示す。
【００７９】
図３から分かるようにアルブミン濃度を一定にした異なる糖化アルブミン率の試料に於
いても良好な直線性が得られた。従って本発明の糖化蛋白質の測定方法により、実際の血
清、血漿中の糖化アルブミンを定量的に検出できる事が分かった。また血清の代わりに赤
血球を溶血し作成したヘモグロビン基質溶液を用いても同様の直線性が確認された為、本
発明の糖化蛋白質の測定方法により、糖化ヘモグロビンを定量的に検出できることも確認
できた。
【実施例７】
【００８０】
＜糖化アルブミンHPLC法と酵素法（本発明）の相関性＞
R-1 蛋白質分解試薬 実施例４に同じ。
R-2 糖化アミノ酸測定試薬 実施例４に同じ。
＜基質溶液＞ 糖尿病患者血清 14検体
健常者血清 25検体
＜操作＞ 操作は実施例２に同じ。
糖尿病患者血清14検体を用い本発明に基づく酵素法と、公知のHPLC法の相関を確認した
。尚HPLC法の測定は、糖化アルブミン計(GAA-2000；アークレイ社製)にて糖化アルブミン
率を測定した。本発明に基づく測定方法から得られる吸光度変化は糖化アルブミン率と、
相関係数r=0.991と非常によい相関を示し、本発明に基づく測定方法は糖化アルブミンを
正確に測定していることが明らかとなった。
【実施例８】
【００８１】
＜アスコルビン酸オキシダーゼの安定化に及ぼす緩衝剤種類の効果＞
＜反応液組成＞
150mM 各種緩衝液 pH8.0
2500U/ml プロテアーゼタイプXXIV（シグマ社製）若しくはプロナーゼ（シグマ社
製）
10U/ml アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＳＯ-311；東洋紡社製）若しくは熱安定
型アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＳＯ-312；東洋紡社製）
R-1 蛋白質分解試薬中の緩衝剤としては3-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]
プロパンスルホン酸（EPPS）、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスル
ホン酸（HEPES）、2-ヒドロキシ-3-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパン
スルホン酸（HEPPSO）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）、ピペラジン-1,4
-ビス（2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸）(POPSO) (以上同人化学研究所社製)及び燐
酸（和光純薬社製）を用いた。
＜操作手順＞
上記反応液を各種緩衝剤を用いて作成し、その一部をとり、試薬中のアスコルビン酸オ
キシダーゼ活性を測定しコントロールとした。活性測定方法は前述の＜＜アスコルビン酸
オキシダーゼ（ASOx）の活性測定法＞＞を用いた。残りの反応液は室温にて２日間保存後
同様に活性を測定した。コントロールの活性に対する、室温−２日間保存後の活性の割合
を計算しアスコルビン酸オキシダーゼの安定性を比較した。結果を表４に示す。
【００８２】
【表４】
【００８３】
表４からわかるように4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル基を持つ3-[4-(2-ヒド
ロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸（EPPS）、2-[4-(2-ヒドロキシエチ
ル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸（HEPES）及び2-ヒドロキシ-3-[4-(2-ヒドロキシ
エチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸（HEPPSO）を緩衝剤に用いた場合よりも、4
-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル基を持たないトリスヒドロキシメチルアミノメタ
ン（Tris）、ピペラジン-1,4-ビス（2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸）(POPSO)及び
燐酸を緩衝剤に用いた場合、プロテアーゼの共存下に於いてアスコルビン酸オキシダーゼ
がより安定に存在していることが明白であった。
またアスコルビン酸オキシダーゼ、プロテアーゼの種類に係わらず同様の効果が確認さ
れていることも明白である。
【実施例９】
【００８４】
＜糖化蛋白質測定用組成物中のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化に及ぼす緩衝剤種類
の効果＞
＜反応液組成＞
R-1 蛋白質分解試薬
150mM 各種緩衝液 pH8.0
2500U/ml プロテアーゼタイプXXIV（シグマ社製）
2.0mM 4-アミノアンチピリン(和光純薬社製)
10U/ml アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製）
R-2 糖化アミノ酸測定試薬
150mM HEPES緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
6.0mM TOOS(同人化学研究所社製)
24U/ml R-FOD(旭化成社製)
20U/ml POD(シグマ社製)
R-1 蛋白質分解試薬中の緩衝剤としてはEPPS、HEPES、HEPPSO、Tris及びPOPSOを用いた
。
＜コントロール基質溶液、アスコルビン酸添加基質溶液＞
ヒトプール血清9容に1容のアスコルビン酸（国産化学社製）1g/dlを添加しアスコルビ
ン酸添加基質溶液とした。アスコルビン酸の代わりに蒸留水を添加したものをコントロー
ル基質溶液とした。
＜反応手順＞
37℃にインキュベートされたR-1;240μlにコントロール基質溶液若しくはアスコルビン
酸添加基質溶液8μlを添加し、37℃で反応を開始し、正確に5分後にR-2;80μlを添加した
。R-2添加前及び添加5分後の555nmの吸光度を測定した。また基質溶液の代わりに蒸留水
を用いた測定をブランクとし、コントロール基質溶液、アスコルビン酸添加基質溶液から
得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変化を差し引いたΔA0を算出した。一方同
じ反応液R-1を室温にて24時間保存し同様の測定を行いΔA24を算出した。コントロール基
質溶液から得られた吸光度変化を100としてアスコルビン酸添加基質溶液から得られたΔA
0及びΔA24の割合を計算した。結果を図４に示す。
【００８５】
アスコルビン酸は測定系に大きな負の影響を与え100mg/dlの濃度の場合消去反応を行わ
なければ糖化蛋白質のシグナルが観察できなくなる。図４からわかるようにアスコルビン
酸処理能は糖化蛋白質を測定する系でも4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル基を持
たないTris及びPOPSOにおいて室温-24時間保存後にも変化なく、一方EPPS、HEPES及びHEP
PSOを用いた4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル基を持つ緩衝剤の系ではアスコルビ
ン酸処理能が室温-24時間保存後にはほとんど観察されなかった。以上の結果からプロテ
アーゼとアスコルビン酸オキシダーゼが共存する糖化蛋白質測定試薬に於いても4-(2-ヒ
ドロキシエチル)-1-ピペラジニル基を持つ緩衝剤に用いた場合よりも、4-(2-ヒドロキシ
エチル)-1-ピペラジニル基を持たない緩衝剤に用いた場合アスコルビン酸オキシダーゼが
より安定に存在していることが明白であった。
また本結果から糖化アルブミン、フルクトサミン及び糖化へモグロビンの測定に関し本
発明が有用であることも明白である。
【実施例１０】
【００８６】
＜グリコアルブミン、ノングリコアルブミンに対するブロモクレゾールパープルの作用の
違い、及び蛋白質変性剤及び／または、Ｓ−Ｓ結合を有する化合物の効果＞
＜反応液組成＞
R-1 前処理試薬
10mM Tris-HCl緩衝液 pH8.0 + 各濃度の蛋白質変性剤及び／または、Ｓ-Ｓ
結合を有する化合物、対照としては蒸留水を添加した。
R-2 アルブミン発色試薬
200mM コハク酸緩衝液（和光純薬社製）pH5.5
0.15mM ブロモクレゾールパープル(和光純薬社製)
0.3% Tx-100(和光純薬社製)
R-1 前処理試薬中の蛋白質変性剤及び／または、Ｓ-Ｓ結合を有する化合物として以下
の1)〜9)を用いた。
1) 6,6'-ジチオジニコチン酸(6,6'-dithiodinicotinic acid;100mM)
2) 3,3'-ジチオジプロピオン酸(3,3'-dithiodipropionic acid;100mM)
3) 2,2'-ジチオジサリチル酸(2,2'-dithiodibenzoicacid;100mM)
4) 4,4'-ジチオジモルホリン(4,4'-dithiodimorpholine;100mM)
5) DTNB(50mM)
6) DDD(33mM)
7) 2-PDS(25mM)
8) 4-PDS(50mM)
9) SDS(0.3%)
1)〜5)和光純薬社製、6)〜9) 同人化学研究所社製
＜試料＞
グリコアルブミン、ノングリコアルブミン、健常者血清、患者血清を試料として、ブラ
ンクとしては蒸留水を用いた。グリコアルブミン、ノングリコアルブミンはヒト血清より
アルブミンを公知の方法で精製し、ホウ酸固定化樹脂を用いて精製した。
＜反応手順＞
37℃にインキュベートされた前処理試薬;160μlに試料2μlを添加し、37℃で反応を開
始し、正確に5分後にアルブミン発色試薬;160μlを添加した。アルブミン発色試薬添加前
及び添加5分後の600nmの吸光度を測定した。また試料の代わりに蒸留水及びアルブミン濃
度が既知である試料から検量線を作成しアルブミン測定値を求めた。またラテックス試薬
を用いた免疫法（ＬＸ試薬、栄研社製、Alb-II）を別途測定し、コントロールとした。結
果を表５に示す。
【００８７】
【表５】
【００８８】
表５からわかるように、前処理なしのBCP法では意外にもNGAに於いて低値を示し、同様
にNGAの少ない患者では免疫法とBCP法との乖離は、NGAの多い健常者に比べて小さかった
。また、蛋白質変性剤及び／または、Ｓ-Ｓ結合を持つ化合物にて前処理することにより
免疫法との乖離は有意に小さくなった。なかでも2,2'-ジチオサリチル酸、4,4'-ジチオジ
モルホリン、DDD、2-PDS、4-PDS、DTNB及びラウリル硫酸ナトリウムの効果が顕著であっ
た。このことから、糖化アルブミン割合を測定する際に使用するアルブミン試薬として、
蛋白質変性剤及び／または、Ｓ-Ｓ結合を持つ化合物にて前処理し、続いて若しくは同時
にBCPを作用させてアルブミンを測定する方法を用いることにより、NGAにより負の誤差を
与える現象が回避され、正確に糖化アルブミン割合が測定できることが明白となった。
【実施例１１】
【００８９】
＜プロテアーゼの安定化＞
＜反応液組成＞
R-1 蛋白質分解試薬
150mM Tris-HCl緩衝液 pH8.5
5000PU/ml プロテアーゼタイプXXIV（シグマ社製）
8mM 4-アミノアンチピリン(同人化学研究所社製)
15U/ml パーオキシダーゼ
1.0% 硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハイドロキ
シ-1-プロパン（シグマ社製）+ 各濃度のプロテアーゼ安定化剤、対照
としては蒸留水を添加した。
R-2 糖化アミノ酸測定試薬
150mM Tris-HCl緩衝液 pH8.5
24U/ml R-FOD-II（旭化成社製）
12mM TOOS(同人化学研究所社製)
前処理試薬中のプロテアーゼ安定化剤として以下の1)〜7)を用いた。
1) 0.5mM 塩化マグネシウム
2) 10mM 塩化カルシウム
3) 100mM 塩化ナトリウム
4) 0.1％ エチレングリコール（EtGly）
5) 10％ ジメチルスルホオキシド(DMSO)
6) １％ エタノール(EtOH)
7) 0.1％ ラウリル硫酸トリアタノールアミン(TEALS)
1)〜7)和光純薬社製
＜試料＞
5g/dl ＨＳＡ（シグマ社製；LOT38H7601）
＜反応手順＞
37℃にインキュベートされた蛋白質分解試薬;240μlに試料8μlを添加し、37℃で反応
を開始し、正確に5分後に糖化アミノ酸測定試薬;80μlを添加した。糖化アミノ酸測定試
薬添加前及び添加5分後の546nmの吸光度を測定した。また基質溶液の代わりに蒸留水を用
いた測定をブランクとし、基質溶液から得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変
化を差し引いたΔA0を算出した。一方同じ反応液蛋白質分解試薬を37℃にて24時間保存し
同様の測定を行いΔA24を算出した。安定化剤なしで、かつ保存なしの場合のΔA0を100％
として、安定化剤有り、無しの場合の相対感度を算出した。結果を図５に示す。
【００９０】
図５からわかるように、安定化剤がない場合、相対感度は60％に低下し蛋白質分解試薬
の安定化効果が観察された。一方安定化剤を添加した場合には安定化効果が塩化カルシウ
ム、塩化ナトリウム、DMSO、EtOH、TEALSに観察され、中でも塩化カルシウム、DMSOに関
してはほとんど性能低下は観察されなかった。さらにDMSO及び塩化カルシウムは安定性試
験を継続した結果、37℃−４週間保存でも性能低下が観察されず、液状、冷蔵で１年以上
の保存安定性を有することが明らかとなった。
【実施例１２】
【００９１】
＜少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化＞
＜反応液組成＞
R-1 蛋白質分解試薬
150mM Tris-HCl緩衝液 pH8.5
8mM 4-アミノアンチピリン(同人化学研究所社製)
15U/ml パーオキシダーゼR-2 糖化アミノ酸測定試薬
150mM Tris-HCl緩衝液 pH8.5
24U/ml R-FOD-II（旭化成社製）
12mM TODB(同人化学研究所社製) + 各濃度のプロテアーゼ安定化剤、対照
としては蒸留水を添加した。
糖化アミノ酸測定試薬中の少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の定化剤として以下
の1)〜15)を用いた。
1) 5％ マンニトール
2) 5％ ソルビトール
3) 5％ スクロース
4) 5％ トレハロース
5) 0.5mM 塩化カルシウム
6) 0.5mM 塩化マグネシウム
7) 3％ L-グルタミン酸（Glu）
8) 3％ L-グルタミン（Gln）
9) 3％ L-プロリン（Pro）
10) 3％ L-アラニン(Ala)
11) 3％ L-バリン（Val）
12) 3％ グリシン（Gly）
13) 3％ L-リジン(Lys)
14) 3％ ザルコシン
15) 100mM 硫安
1)〜14)和光純薬社製
＜試料＞
0.5mM FZL
＜反応手順＞
37℃にインキュベートされた蛋白質分解試薬;240μlに試料8μlを添加し、37℃で反応
を開始し、正確に5分後に糖化アミノ酸測定試薬;80μlを添加した。糖化アミノ酸測定試
薬添加前及び添加5分後の546nmの吸光度を測定した。また基質溶液の代わりに蒸留水を用
いた測定をブランクとし、基質溶液から得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変
化を差し引いたΔA0を算出した。一方同じ反応液糖化アミノ酸測定試薬を37℃にて２日間
保存し同様の測定を行いΔA24を算出した。安定化剤なしで、かつ保存なしの場合のΔA0
を100％として、安定化剤有り、無しの場合の相対感度を算出した。結果を図６に示す。
【００９２】
図６からわかるように、安定化剤がない場合、相対感度は30％に低下し糖化アミノ酸測
定試薬の安定化効果が観察された。一方安定化剤を添加した場合には安定化効果がマンニ
トール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、塩化カルシウム、塩化マグネシウム
、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-プロリン、L-アラニン、L-バリン、グリシン、L-リ
ジン、ザルコシン、硫安に観察され、中でも糖アルコール、アミノ酸、ザルコシンに関し
ては特に強い安定化効果が確認された。さらにL-アラニン、グリシン及びザルコシンは安
定性試験を継続した結果、37℃−４週間保存でも性能低下がほとんど観察されず、液状、
冷蔵で１年以上の保存安定性を有することが明らかとなった。
【実施例１３】
【００９３】
＜変異FOD遺伝子含有DNAフラグメントライブラリーの作成＞
配列表配列番号５の塩基配列の1から30の配列を有するオリゴヌクレオチドと配列表配
列番号６の塩基配列の1から30の配列を有するオリゴヌクレオチドの合成を外部委託（BEX
社）し、さらにフザリウム・オキシスポルムIFO-9972株由来のFOD蛋白質をコードするDNA
を鋳型にして、Taqポリメラーゼキット（宝酒造社製）を用いて添付のマニュアルに従っ
てPCRを実施し、FOD構造遺伝子を増幅した。この際、反応液中に最終濃度0.5mM相当の２
価マンガンイオンを添加し、塩基をdATP:0.51mM、dCTP:0.20mM、dGTP:1.15mM、dTTP:3.76
mMと濃度を偏在させて反応を実施し、変異導入効率を高めた。
【実施例１４】
【００９４】
＜変異FOD組換え体ライブラリーの作成＞
実施例１３により増幅したFOD遺伝子含有DNAフラグメントを制限酵素NcoIとEcoRIで消
化し、同じ制限酵素で処理したプラスミドoTV119N（宝酒造社製）に組み込み、エシェリ
ヒア・コリJM109株（東洋紡績社製）に導入し、100μg/mlアンピシリン含有LB寒天平板培
地（DIFCO社製）上、37℃で一晩培養して形質転換体のコロニーを形成させた。
【実施例１５】
【００９５】
＜リジン特異的変異FODのスクリーニング＞
実施例１４で用意したライブラリーのコロニーを2枚の100μg/mlアンピシリンと1mMのI
PTG（和光純薬社製）を含有するLB寒天平板培地にレプリカし、それぞれの培地上に5U/ml
のパーオキシダーゼ（旭化成社製）、0.02％のオルトジアニシジン（和光純薬社製）、2.
0mMの糖化バリンまたは糖化リジン（ハシバらの方法（Hashiba,H.(1976) J.Agric.Food C
hem., 24, 70）により調製）を含有するLB寒天（0.3％）培地を重層し、37℃で8時間培養
して糖化アミノ酸のFODによる酸化で発生する酸素ラジカルとジアニシジンによるコロニ
ーの発色を観察した。これにより糖化リジンで暗紫色に発色し、糖化バリンで発色しない
コロニーをスクリーニングし、該当するコロニーを164株得た。
【実施例１６】
【００９６】
＜変異FOD候補株の細胞抽出液の調製＞
実施例１５で得た変異体コロニー164株を50μg/mlのアンピシリンと1mMのIPTGを含有す
る3.7％のBHI（DIFCO社製）液体培地1.5mlで30℃、16時間培養し、そのうち1mlを遠心分
離（15,000G、1分、4℃）により集菌し、200μlの10mMのトリス塩酸緩衝液（pH8.0）を加
え、超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（14,000G、5分、4℃）し、上清
を取得して細胞抽出液とした。
【実施例１７】
【００９７】
＜変異FODの基質特異性検定＞
実施例１６で調製した細胞抽出液について、含有するFOD変異組換え体の糖化アミノ酸
基質特異性を、前述のFOD酵素活性測定法によって測定した。その結果、候補株の中に糖
化バリンへの活性が糖化リジンの活性の1000分の1未満となっている変異体を2つ確認し、
目的の変異体とした。
【実施例１８】
【００９８】
＜組み換えプラスミドの抽出＞
実施例１７で選ばれた変異体を50μg/mlのアンピシリン含有LB液体培地1.5mlに植菌し3
7℃で16時間振盪培養した後、常法に従ってプラスミドを抽出した。このプラスミドをpcm
FOD1及びpcmFOD2と命名した。
【実施例１９】
【００９９】
＜変異FOD遺伝子塩基配列の決定＞
実施例１８で得られた変異FOD遺伝子についてジデオキシ法により塩基配列を決定した
。その結果、2つの変異体は同じ構造を有し、配列表配列番号１の塩基配列1115のAがGに
変換され、コードされる組換え変異FODのアミノ酸配列が配列表配列番号１のアミノ酸配
列372番のリジンがアルギニンに変換されていることを確認した。
【実施例２０】
【０１００】
＜各種変異体の基質特異性確認＞
実施例１９で確認されたアミノ酸変異箇所について、他のアミノ酸への置換の効果を観
察するためにKunkelらの部位特異的変異法を行った。配列表配列番号７記載の塩基配列の
1から27までの配列を有するオリゴヌクレオチドの合成を外部に委託（BEX社）し、さらに
Mutan-Kキット（宝酒造社製）を使用して、添付されたマニュアルに従って部位特異変異
を行った。取得した変異遺伝子は再び発現プラスミドpTV119Nに組み込み、大腸菌宿主に
導入して50μg/mlのアンピシリンと1mMのIPTGを含有する3.7％のBHI液体培地で30℃、16
時間培養し、変異FOD蛋白を生産させた。以上のようにして得られた複数の変異体につい
て実施例１６、１７と同様の方法で基質特異性を測定したところ、アルギニン以外にトリ
プトファン、メチオニン、スレオニン、バリン、アラニン、セリン、システイン、グリシ
ンに変換した変異体がアルギニンに変換した変異体と同様の糖化リジン特異的な基質特異
性を有していることを確認した。この結果を表６に示す。
【０１０１】
【表６】
【０１０２】
なお表中の限界以下は測定限界以下、N.D.は測定データなしを示す。これにより、配列
表配列番号１のアミノ酸配列372番目のリジンを変換することによりFODの糖化リジン反応
性を糖化バリン反応性に対して相対的に低下させることができることが確かめられ、特に
トリプトファン、メチオニン、バリンへの変異体が高い糖化リジン特異性と良好な酵素性
状を有していることが判明した。このトリプトファンへの変異体をFOD-W、FOD-Wを生産す
る発現プラスミドをpcmFOD3、メチオニンへの変異体をFOD-M、FOD-Mを生産する発現プラ
スミドをpcmFOD4、バリンへの変異体をFOD-V、FOD-Vを生産する発現プラスミドをpcmFOD5
と命名した。図７に各プラスミドの共通構造を示す。
【実施例２１】
【０１０３】
＜被検液中のε-フルクトシル-L-リジン（ZFL）を消去した後、フルクトシル-L-バリン（
FV）の測定＞
反応液1
50mMのトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）
10U/mlのFOD-V
5U/mlのカタラーゼ
反応液2
50mMのトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）
10U/mlのFOD
20U/mlのペルオキシダーゼ
0.05%のアジ化ナトリウム
0.04%の４−アミノアンチピリン
0.04%のTOOS
被検液:0.3mMのZFL溶液に終濃度が0、0.1、0.2、0.3mMとなるようにFVを添加したもの。
0.5mlの反応液1を37℃、5分間、予備加温した後、0.05mlの上記被検液を添加して、37
℃、5分間反応させ、0.5mlの反応液2を添加し、5分後に555nmにおける吸光度を測定する
。ブランクには被検液の変わりに蒸留水を使用する。また対照として、反応液1のFOD-Vを
添加していない反応液を用いて同様に操作した。
図８の白丸はFOD-V無添加を、白四角はFOD-Vを添加した場合の測定値をそれぞれ示す。
【０１０４】
FOD-VおよびFODを用いることにより図８から明らかなように、FOD-Vにより、被検液中
のZFLを消去した後に、FVを定量的に測定することができた。
なお、配列表配列番号１のアミノ酸配列３７２番目のリジンをトリプトファン、メチオ
ニン及びバリンに変換した配列をそれぞれ配列表配列番号２、３及び４に示す。
【実施例２２】
【０１０５】
＜糖化アルブミン割合の測定＞
R-1 蛋白質分解試薬
50mM POPSO酸緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
2500U/ml プロテアーゼタイプXXIV（シグマ社製）
1% 硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハイドロキシ-
1-プロパン（シグマ社製）
5U/ml アスコルビン酸オキシダーゼ（ロシュ社製）
5% DMSO
5mM 4-アミノアンチピリン
R-2 糖化アミノ酸測定試薬
150mM HEPES酸緩衝液（和光純薬社製）pH7.5
5mM TODB
10U/ml POD
20U/ml R-FOD-II
3% グルタミン酸
R-3 アルブミン前処理試薬
10mM Tris-HCl緩衝液 pH8.0
0.3% ラウリル硫酸ナトリウム
R-4 アルブミン発色試薬
200mM コハク酸緩衝液（和光純薬社製）pH5.5
0.15mM ブロモクレゾールパープル(和光純薬社製)
0.3% Tx-100(和光純薬社製)
＜試料＞
1：健常者及び糖尿病患者血清各35検体
2：キャリブレーターは管理血清Ｈ（ビー・エム・エル社製）を用いた。
キャリブレーターのグリコアルブミン濃度は臨床検体のＨＰＬＣ法測定値と酵素法
の測定値が一致するようにあらかじめ設定した。アルブミン値はCRM470の値を移した。
＜反応手順＞
37℃にインキュベートされたR-1;240μlに試料8μlを添加し、37℃で反応を開始し、正
確に5分後にR-2;80μlを添加した。R-2添加前及び添加5分後の555nmの吸光度変化を測定
した。別途管理血清Ｈ、蒸留水を測定し検量線を作成し、検体中の糖化アルブミン濃度を
算出した。
一方37℃にインキュベートされたR-3;アルブミン前処理試薬;160μlに試料2μlを添加
し、37℃で反応を開始し、正確に5分後にR-4;アルブミン発色試薬;160μlを添加した。ア
ルブミン発色試薬添加前及び添加5分後の600nmの吸光度を測定した。また試料の代わりに
蒸留水及びアルブミン濃度が既知である試料から検量線を作成しアルブミン測定値を求め
た。
酵素法によるGA％はGA%=GA濃度/アルブミン濃度×100より求めた。またHPLC法測定値は
ハイオートジー・エイ・エイ2000（アークレイ社製）を用いて測定した。結果を図９に示
す。
【０１０６】
図９から分かるように酵素法とHPLC法はr=0.998と非常に良い相関を示した。また本試
薬全てを液状で37℃-2週間保存しても性能に変化はなかった。この事から1)グロブリン成
分及びアスコルビン酸の影響回避、2)プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用す
る酵素の安定化、3)正確にアルブミンを測定、4)糖化ヘモグロビンの影響回避を行うこと
により正確に糖化アルブミンを測定していること及び糖化アルブミン割合を測定している
ことが明らかであった。
【実施例２３】
【０１０７】
＜第１試薬に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素、第２試薬にプロテアーゼを含有
する組成物＞
R-1
200mM POPSO 緩衝液 pH7.5
5mM 4‐アミノアンチピリン
10 U／ml POD
20 U／ml R‐FOD
5 U／ml アスコルビン酸オキシダーゼ
3％ グルタミン酸
R-2
20mM ピベラジン-1,4-ビス(2-エタンスルホン酸)緩衝液 pH6.5
20％ DMSO
8000 U/ml プロテアーゼタイプXXIV
4％ 硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2ハイドロキシ-
1-プロパン
5 mM TODBR-3,4
実施例２２に同じ
＜試料＞実施例２２に同じ試料及び１０−２００μＭのＦＺＬ
＜反応手順＞実施例２２に同じ
結果を図１０に示す。
【０１０８】
図１０から分かるように第１試薬に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素、第２試薬
にプロテアーゼを処方した場合にも反応時間１０分という短い時間で良好に糖化蛋白質が
測定できており、また試料中に糖化アミノ酸が存在した場合にも、Ｒ−１に処方されてい
る少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素により糖化アミノ酸が消去されてより正確に糖
化蛋白質が測定できることが明白である。
また本試薬とＨＰＬＣ法との相関は、
酵素法ＧＡ％＝１．０３＊ＨＰＬＣ法ＧＡ％−０．３ Ｒ＝０．９９と良好な相関を
示し、正確に糖化蛋白質が測定されていることも明らかであった。さらに本試薬は液状で
３７℃−３週間若しくは冷蔵１５ケ月保存しても性能の低下はなかった。
[寄託生物材料への言及]
【０１０９】
（1）イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6（郵便番号305-8566）
ロ イの機関に寄託について付した日付(原寄託日)
平成13年1月16日
ハ イの機関に寄託について付した受託番号
FERM BP-7847
（2）イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6（郵便番号305-8566）
ロ イの機関に寄託について付した日付(原寄託日)
平成13年1月16日
ハ イの機関に寄託について付した受託番号
FERM BP−7848
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明により、より正確に被検体中の糖化蛋白質及び糖化アルブミン割合を測定するこ
とが可能になった。したがって、臨床検査薬として有用に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】本発明の実施例４に基づくHSA基質溶液(4g/dl)、γグロブリン及びグロブリンIV基質溶液の測定曲線及び再現性を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例５に基づくHｂ基質溶液(4g/dl)、γグロブリン及びグロブリンIV基質溶液の測定曲線及び再現性を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例６に基づく糖化アルブミンの測定曲線を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例９に基づく糖化蛋白質測定用組成物中のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化に及ぼす緩衝剤種類の効果を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例１１に基づくプロテアーゼの安定化に及ぼす安定化剤種類の効果を示すグラフである。
【図６】本発明の実施例１２に基づく少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化に及ぼす安定化剤種類の効果を示すグラフである。
【図７】本発明の実施例２０のプラスミドｐｃｍＦＯＤ１からｐｃｍＦＯＤ５までの共通構造を示す。
【図８】本発明の実施例２１の本変異フルクトシルアミノ酸オキシダーゼにより混入糖化リジンを消去した糖化バリン濃度測定反応液と非消去反応液における５５５ ｎｍの吸光度の測定結果を示すグラフである。
【図９】本発明の実施例２２に基づくグリコアルブミン割合測定結果の酵素法とHPLC法の相関を示すグラフである。
【図１０】本発明の実施例２３に基づく糖化蛋白質測定試薬の反応曲線である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ及びフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いて糖化ヘモグロビンを測定する組成物において、プロテアーゼと下記１）が共存することを特徴とする糖化ヘモグロビン測定用組成物；
1)デオキシコール酸、ビスグルコナミドプロピルデオキシコーラミド、硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパン、硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハイドロキシ-1-プロパン若しくはビスグルコナミドプロピルコーラミド、オクチルグルコシド、第四級アンモニウム塩、塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウム、ラウリルジメチルアミンオキサイド、もしくはコンカナバリンＡのなかから選択される１種以上。
【請求項２】
ピペラジン-1,4-ビス（2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸）(POPSO)、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）又は燐酸を共存させることを特徴とする請求項１に記載の糖化ヘモグロビンを測定するための組成物。
【請求項３】
ジメチルスルホオキシド、エタノール、プロパノール、エチレングリコール若しくはグリセリン、水溶性カルシウム塩、食塩、ラウリル硫酸トリエタノールアミン若しくは塩化ラウリルトリメチルアンモニウムより選ばれるプロテアーゼ安定化剤をさらに含有する、請求項１〜２のいずれかに記載の組成物。
【請求項４】
糖アルコール、スクロース、水溶性マグネシウム塩、水溶性カルシウム塩、硫安、アミノ酸、ザルコシンより選ばれるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ安定化剤をさらに含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
プロテアーゼがバチルス属由来のプロテアーゼである請求項第１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが配列表配列番号１のアミノ酸配列の３７２番目のリジンを下記１）〜９）のいずれかのアミノ酸に置換することにより糖化バリン反応性を著しく低下させた変異型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼである請求項１〜５のいずれかに記載の組成物；
１）アルギニン、
２）トリプトファン、
３）メチオニン、
４）スレオニン、
５）バリン、
６）アラニン、
７）セリン、
８）システイン、又は
９）グリシン。
【請求項７】
組成物が液状品である請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
プロテアーゼ及びフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いて糖化ヘモグロビンを測定する方法において、プロテアーゼ反応時に、下記１）を共存させることにより、プロテアーゼのグロブリン成分への作用を低下し、糖化ヘモグロビンを測定する方法。
1)デオキシコール酸、ビスグルコナミドプロピルデオキシコーラミド、硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパン、硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハイドロキシ-1-プロパン若しくはビスグルコナミドプロピルコーラミド、第四級アンモニウム塩、塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウム、ラウリルジメチルアミンオキサイド、コンカナバリンＡ、もしくはオクチルグルコシドから選択される１種以上
【請求項９】
ピペラジン-1,4-ビス（2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸）(POPSO)、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）又は燐酸を共存させることにより、蛋白質の断片化とアスコルビン酸の消去を同時に行う、請求項８に記載の糖化ヘモグロビンを測定する方法。
【請求項１０】
プロテアーゼにジメチルスルホオキシド、エタノール、プロパノール、エチレングリコール若しくはグリセリン、水溶性カルシウム塩、食塩、又はラウリル硫酸トリエタノールアミン若しくは塩化ラウリルトリメチルアンモニウムより選ばれるプロテアーゼ安定化剤を添加する請求項８〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼに糖アルコール、スクロース、水溶性マグネシウム塩、水溶性カルシウム塩、硫安、アミノ酸、ザルコシンより選ばれる安定化剤を添加する請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
プロテアーゼがバチルス属由来のプロテアーゼである請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが配列表配列番号１のアミノ酸配列３７２番目のリジンを下記１）〜９）のいずれかに置換することにより糖化バリン反応性を著しく低下させた変異型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼである請求項８〜１２のいずれかに記載の方法；
１）アルギニン、
２）トリプトファン、
３）メチオニン、
４）スレオニン、
５）バリン、
６）アラニン、
７）セリン、
８）システイン、又は
９）グリシン。
【請求項１４】
組成物が液状品である請求項８〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
プロテアーゼ及びフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いて糖化ヘモグロビンを測定する組成物において、プロテアーゼと下記１）が共存することを特徴とする糖化ヘモグロビン測定用組成物；
1)デオキシコール酸、ビスグルコナミドプロピルデオキシコーラミド、硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパン、硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハイドロキシ-1-プロパン若しくはビスグルコナミドプロピルコーラミド、オクチルグルコシド、第四級アンモニウム塩、塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウム、ラウリルジメチルアミンオキサイド、もしくはコンカナバリンＡのなかから選択される１種以上。
【請求項２】
ピペラジン-1,4-ビス（2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸）(POPSO)、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）又は燐酸を共存させることを特徴とする請求項１に記載の糖化ヘモグロビンを測定するための組成物。
【請求項３】
ジメチルスルホオキシド、エタノール、プロパノール、エチレングリコール若しくはグリセリン、水溶性カルシウム塩、食塩、ラウリル硫酸トリエタノールアミン若しくは塩化ラウリルトリメチルアンモニウムより選ばれるプロテアーゼ安定化剤をさらに含有する、請求項１〜２のいずれかに記載の組成物。
【請求項４】
糖アルコール、スクロース、水溶性マグネシウム塩、水溶性カルシウム塩、硫安、アミノ酸、ザルコシンより選ばれるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ安定化剤をさらに含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
プロテアーゼがバチルス属由来のプロテアーゼである請求項第１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが配列表配列番号１のアミノ酸配列の３７２番目のリジンを下記１）〜９）のいずれかのアミノ酸に置換することにより糖化バリン反応性を著しく低下させた変異型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼである請求項１〜５のいずれかに記載の組成物；
１）アルギニン、
２）トリプトファン、
３）メチオニン、
４）スレオニン、
５）バリン、
６）アラニン、
７）セリン、
８）システイン、又は
９）グリシン。
【請求項７】
組成物が液状品である請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
プロテアーゼ及びフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いて糖化ヘモグロビンを測定する方法において、プロテアーゼ反応時に、下記１）を共存させることにより、プロテアーゼのグロブリン成分への作用を低下し、糖化ヘモグロビンを測定する方法。
1)デオキシコール酸、ビスグルコナミドプロピルデオキシコーラミド、硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパン、硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハイドロキシ-1-プロパン若しくはビスグルコナミドプロピルコーラミド、第四級アンモニウム塩、塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウム、ラウリルジメチルアミンオキサイド、コンカナバリンＡ、もしくはオクチルグルコシドから選択される１種以上
【請求項９】
ピペラジン-1,4-ビス（2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸）(POPSO)、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）又は燐酸を共存させることにより、蛋白質の断片化とアスコルビン酸の消去を同時に行う、請求項８に記載の糖化ヘモグロビンを測定する方法。
【請求項１０】
プロテアーゼにジメチルスルホオキシド、エタノール、プロパノール、エチレングリコール若しくはグリセリン、水溶性カルシウム塩、食塩、又はラウリル硫酸トリエタノールアミン若しくは塩化ラウリルトリメチルアンモニウムより選ばれるプロテアーゼ安定化剤を添加する請求項８〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼに糖アルコール、スクロース、水溶性マグネシウム塩、水溶性カルシウム塩、硫安、アミノ酸、ザルコシンより選ばれる安定化剤を添加する請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
プロテアーゼがバチルス属由来のプロテアーゼである請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが配列表配列番号１のアミノ酸配列３７２番目のリジンを下記１）〜９）のいずれかに置換することにより糖化バリン反応性を著しく低下させた変異型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼである請求項８〜１２のいずれかに記載の方法；
１）アルギニン、
２）トリプトファン、
３）メチオニン、
４）スレオニン、
５）バリン、
６）アラニン、
７）セリン、
８）システイン、又は
９）グリシン。
【請求項１４】
組成物が液状品である請求項８〜１３のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００９−１５９９８９（Ｐ２００９−１５９９８９Ａ）
【公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１０１８０９（Ｐ２００９−１０１８０９）
【出願日】平成２１年４月２０日（２００９．４．２０）
【分割の表示】特願２００２−５６１０５４（Ｐ２００２−５６１０５４）の分割
【原出願日】平成１４年１月３０日（２００２．１．３０）
【出願人】（３０３０４６２９９）旭化成ファーマ株式会社 (105)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月２０日（２００９．４．２０）
【分割の表示】特願２００２−５６１０５４（Ｐ２００２−５６１０５４）の分割
【原出願日】平成１４年１月３０日（２００２．１．３０）
【出願人】（３０３０４６２９９）旭化成ファーマ株式会社 (105)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]