糖尿病の処置
【課題】真性糖尿病または膵臓の他の疾患の処置方法を提供すること。
【解決手段】複数の機能的成熟β細胞を含む哺乳動物膵臓細胞を得るための方法であって、該方法は、少なくとも１つのガストリンレセプターリガンドを、該前駆体哺乳動物膵臓細胞の分化を達成するために十分な量で有する、該前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団を提供する工程であって、該前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団は、前駆体哺乳動物膵臓細胞に関連する少なくとも１つのマーカーを発現する細胞において富化され、それにより、複数の機能的成熟β細胞が得られる工程、
を包含する、方法。
【解決手段】複数の機能的成熟β細胞を含む哺乳動物膵臓細胞を得るための方法であって、該方法は、少なくとも１つのガストリンレセプターリガンドを、該前駆体哺乳動物膵臓細胞の分化を達成するために十分な量で有する、該前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団を提供する工程であって、該前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団は、前駆体哺乳動物膵臓細胞に関連する少なくとも１つのマーカーを発現する細胞において富化され、それにより、複数の機能的成熟β細胞が得られる工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（導入）
（発明の分野）
本発明は、一般に、膵島前駆体細胞および成熟膵島細胞を得るための方法の、細胞生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、ガストリンレセプターリガンドおよびＥＧＦレセプターリガンドの１つまたは両方を提供することによる、膵島前駆体細胞に関連する１つ以上のマーカーを発現するヒト幹細胞または他の膵島前駆体細胞の機能的膵臓β細胞に方向付けられた分化、およびこの細胞を、膵臓疾患（真性糖尿病を含む）の処置を必要とする個体におけるこの疾患の処置において使用するための方法に関する。本方法は、（ａ）ヒト膵島細胞に、インビトロでガストリンレセプターリガンドを提供してこの細胞の移植前にインスリン産生を刺激する工程であって、この細胞には、必要に応じて、ＥＧＦレセプターリガンドが提供されて細胞数が増える工程、ならびに（ｂ）糖尿病についてのマウスモデル系において、ヒト膵島細胞の移植と、ガストリンレセプターリガンドおよびＥＧＦレセプターリガンドの１つまたは両方でインビボで処置し、移植された膵島細胞の増殖を促進しかつこの細胞によるインスリン産生を促進することとの組み合わせを使用する糖尿病のインビボでの処置により、例示される。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
糖尿病は、全ての年齢層および全ての集団にわたる、最も一般的な内分泌疾患の１つである。臨床的罹患率（ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）および臨床的死亡率に加え、糖尿病の経済費用は巨大であり、米国のみで年間９００億＄を超える。そして、糖尿病の有病率は、２０１０年までに２倍を超えて増加することが予測される。
【０００３】
真性糖尿病の２つの主要な形態が存在する：インスリン依存性（１型）真性糖尿病（ＩＤＤＭ）（全ての症例の５％〜１０％にのぼる）、およびインスリン非依存性（２型）真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）（症例のおよそ９０％を構成する）。２型糖尿病は、加齢と関連するが、ＮＩＤＤＭと診断される若い人々（いわゆる若年者の成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ））の数の増加傾向がある。１型および２型の両方の場合において、膵臓におけるβ細胞の破壊またはインスリンの不完全分泌またはインスリンの不完全産生を介して、インスリン分泌が減少する。ＮＩＤＤＭにおいて、患者は、代表的に、最適な食事、体重減少および運動のレジメンに従って、治療を開始する。薬物治療は、これらの手段が適切な代謝調節をもはや提供しなくなったときに開始される。最初の薬物治療としては、β細胞インスリン分泌を刺激するスルホニル尿素が挙げられるが、ビグアニド、βグルコシダーゼインヒビター、チアゾリデンジオンおよび併用治療もまた、挙げられ得る。しかし、２型糖尿病で作動する疾患メカニズムの進行性の性質を制御することが難しいことは、注目に値する。薬物処置した全ての糖尿病の５０％超が、投与された薬物に関わりなく、６年以内に芳しくない血糖制御を示す。インスリン治療は、多くの人から、２型糖尿病の処置における最後の手段と考えられており、そして、インスリンの使用に抵抗を覚える患者がいる。糖尿病の合併症としては、網膜、腎臓および神経における微小血管に影響するもの（微小血管合併症）、ならびに心臓、脳、および下肢に供給する大血管に影響するもの（大血管（ｍａｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ）合併症）が挙げられる。糖尿病微小血管合併症は、２０〜７４歳の人々における新規の失明の主な原因であり、そして網膜疾患の末期の新規の症例全ての３５％を含める。６０％を超える糖尿病患者が、神経障害によって影響を受ける。糖尿病は、主に糖尿病大血管疾患の結果として、米国における全ての非外傷性切断術の５０％を含む、そして糖尿病患者は、非糖尿病者の２．５倍の冠動脈疾患由来死亡率を有する。高血糖は、糖尿病大血管合併症の進行を開始し、加速すると考えられる。種々の
現行の処置レジメンの使用は、高血糖を適切には制御し得ず、従って、糖尿病合併症の進行を妨げも低減させもしない。
【０００４】
膵島は、胎児小管膵臓上皮に存在する内胚葉幹細胞から発達し、この胎児小管膵臓上皮はまた、外分泌膵臓へと発達する多能性幹細胞も含む。ＴｅｉｔｅｌｍａｎおよびＬｅｅ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２１：４５４−４６６（１９８７）；ＰｉｃｔｅｔおよびＲｕｔｔｅｒ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｓ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｒ．Ｏ．ＧｒｅｅｐおよびＥ．Ｂ．Ａｓｔｗｏｏｄ編（１９７２），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，２５−６６頁。膵島の発達は、胎児の妊娠の間、別個の発生段階を通して進み、これは、劇的な移行によって中断される。最初の期間は、多能性幹細胞の膵島細胞系列への方向付けによって特徴付けられる、始原分化状態（ｐｒｏｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｓｔａｔｅ）であり、始原分化細胞によるインスリンおよびグルカゴンの発現によって明らかになる。これらの始原分化細胞は、方向付けられた膵島前駆体細胞の集団を含み、この集団は、膵島特異的遺伝子産物を低レベルでのみ発現し、成熟膵島細胞の細胞分化を欠失する。ＰｉｃｔｅｔおよびＲｕｔｔｅｒ（前出）。マウスの妊娠１６日目頃、原始分化膵臓は、膵島細胞の細胞分化および膵島特異的遺伝子発現の数百倍の上昇によって特徴付けられる迅速な増殖期および分化期を開始する。組織学的には、膵島形成（新生）は、膵管からの増殖性膵島芽として明らかになる（膵島細胞症）。生まれる直前、膵島増殖速度は低下し、そして膵島新生および膵島細胞症は、ずっと目立たなくなる。これに伴い、膵島は、最高レベルのインスリン遺伝子発現を伴う、完全に分化した段階に到達する。従って、多くの器官に類似して、細胞性分化の完了は、再生能の低下を伴う；分化した生体の膵臓は、発生中の膵臓と同じ再生能も増殖能も有さない。
【０００５】
始原分化前駆体の分化は、膵臓の胎児発生後期の間に起こるため、膵島分化を調節する因子は、この時期の間の膵臓において発現されるようである。膵島発生の間に発現される遺伝子の１つは、胃腸管系のペプチドであるガストリンをコードする。ガストリンは、成体において酸分泌を調節する胃のホルモンとして作用するが、胎児におけるガストリン発現の主要部位は、膵島である。ＢｒａｎｄおよびＦｕｌｌｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２６３：５３４１−５３４７（１９８８）。膵島におけるガストリンの発現は、一過性である。これは、始原分化膵島前駆体が、分化した膵島を形成する期間に限定される。膵島発生における膵臓ガストリンの重要性は未知であるが、幾つかの臨床観察は、この膵島発生におけるガストリンの法則を、以下のように示唆する。例えば、ガストリン発現膵島細胞腫瘍および萎縮症胃炎によって引き起こされる高ガストリン血症は、分化段階の胎児膵島において見られるのと同様に、膵島細胞症に付随する。Ｓａｃｃｈｉ，ら，Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈｉｖ Ｂ，４８：２６１−２７６（１９８５）；およびＨｅｉｔｚら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２６：６３２−６４２（１９７７）。さらに、膵臓ガストリンの異常な持続が、乳児膵島細胞症の症例において考証されている。Ｈｏｌｌａｎｄｅら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，７１：２５１−２６２（１９７６）。しかし、どちらの観察も、膵島細胞症とガストリン刺激との間に樹立された因果関係ではなかった。
【０００６】
従って、膵島細胞の増殖および／または再生を刺激する薬剤を同定することは、初期ＩＤＤＭの処置における使用およびＮＩＤＤＭにおけるβ細胞欠損の予防における使用のために重要である。
【０００７】
（関連文献）
３つの増殖因子が、胎児膵臓の発生に関与する：ガストリン、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）および上皮増殖因子（ＥＧＦ）（ＢｒａｎｄおよびＦｕｌｌｅｒ
，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：５３４１−５３４７）。ＴＧＦ−αまたはガストリン単独を過剰発現するトランスジェニックマウスは、活性な膵島細胞増殖を実証しなかったが、両方の導入遺伝子を発現するマウスは、有意に増加した膵島細胞の量を示した（Ｗａｎｇら（１９９３）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９２：１３４９−１３５６）。ＢｏｕｗｅｎｓおよびＰｉｐｅｌｅｅｒｓ（１９９８）Ｄｉａｂｅｔｏｌｉｇｉａ ４１：６２９−６３３は、正常成体ヒト膵臓において出芽β細胞が高い割合で存在すること、および全β細胞の１５％が単一の単位として見出されたことを報告する。単一β細胞の病巣は、成体（未刺激）ラットの膵臓において、通常はみられない；Ｗａｎｇら（（１９９５）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ３８：１４０５−１４１１）は、全β細胞数の約１％の頻度を報告する。
【０００８】
被包性膵島移植後の１型糖尿病患者におけるインスリン非依存が、Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇら（１９９４）Ｌａｎｃｅｔ ３４３：９５０−５１において記載される。Ｓａｓａｋｉら（１９９８年６月１５日）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６５（１１）：１５１０−１５１２；Ｚｈｏｕら（１９９８年５月）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２７４（５
Ｐｔ １）：Ｃ１３５６−１３６２；Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇら（１９９０年６月）Ｐｏｓｔｇｒａｄ Ｍｅｄ ８７（８）：１３３−１３４；Ｋｅｎｄａｌｌら（１９９６年６月）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ ２２（３）：１５７−１６３；Ｓａｎｄｌｅｒら（１９９７年６月）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６３（１２）：１７１２−１７１８；Ｓｕｚｕｋｉら（１９９８年１月）Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ７（１）：４７−５２；Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇら（１９９３年６月）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０（１２）：５８４３−５８４７；Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇら（１９９２年１１月）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５４（５）：７６９−７７４；Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇら（１９９２年１０月）ＡＳＡＩＯ Ｊ ３８（４）：８５１−８５４；Ｂｅｎｈａｍｏｕら（１９９８年６月）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ ２４（３）：２１５−２２４；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎら（１９９４年１２月）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ７９（６）：１５６１−１５６９；Ｆｒａｇａら（１９９８年４月）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６５（８）：１０６０−１０６６；Ｋｏｒｓｇｒｅｎら（１９９３）Ｕｐｓ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ９８（１）：３９−５２；Ｎｅｗｇａｒｄら（１９９７年７月）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉｚ ４０（補遺）２：Ｓ４２−Ｓ４７もまた、参照のこと。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
真性糖尿病または膵臓の他の疾患を、その処置を必要とする患者において処置するための方法および組成物が、提供される。この方法および組成物において、膵島細胞再生および／または膵島細胞新生を刺激するために、ガストリンレセプターリガンドおよびＥＧＦレセプターリガンドの１つまたは両方が提供される。この組成物は、増殖性膵島細胞の集団を含有し、この集団は、細胞の集団を単離し、そして１つ以上の膵臓分化剤を前駆体細胞に提供して機能的膵島β細胞の集団を得る方法によって、得られる。必要に応じて、前駆体細胞はまた、概して分化剤による処置の前に、集団における細胞の数を増加させるために、１つ以上の細胞増殖剤が提供される。好ましくは、細胞の集団は、膵島前駆体細胞に関連する１つ以上のマーカーを発現する膵島前駆体細胞のより高い割合を含むように富化されており、これにより、機能的膵島β細胞の表現型特性（β細胞の形態的特徴、β細胞特有の表面マーカーを発現すること、ならびに膵臓機能に重要な酵素活性および生合成活性を有することが挙げられる）を有する細胞を高い割合で有する。膵臓分化剤組成物は、ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンド（例えば、ガストリン）を、膵島前駆体細胞を成熟インスリン分泌細胞に分化させるために十分な量で、含有する。細胞増殖剤組成物は、１つ以上の上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプターリガンドを、前駆体細胞の増殖を刺激す
るために十分な量で含有する。必要に応じて、これらの薬剤の両方は、増殖工程および分化工程の一方または両方で使用され得る。処置の方法は、未分化前駆体細胞を宿主動物に移植して、インビボで、膵臓分化剤を単独でまたは細胞増殖剤と組み合わせてのいずれかで提供する工程、あるいはエキソビボで１つまたは両方のいずれかのリガンドを提供した後で機能的膵島β細胞を宿主動物に移植する工程の、どちらかを包含する。この系は、種々の適用（例えば、薬物スクリーニング、および（特に糖尿病の）臨床処置と関連した膵臓機能の補充）のための機能的膵島β細胞の供給源を提供する。
上記に加えて、本発明は、以下を提供する：
（項目１）
複数の機能的成熟β細胞を含む哺乳動物膵臓細胞を得るための方法であって、該方法は、以下：
少なくとも１つのガストリンレセプターリガンドを、該前駆体哺乳動物膵臓細胞の分化を達成するために十分な量で有する、該前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団を提供する工程であって、該前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団は、前駆体哺乳動物膵臓細胞に関連する少なくとも１つのマーカーを発現する細胞において富化され、それにより、複数の機能的成熟β細胞が得られる工程、
を包含する、方法。
（項目２）
前記マーカーがＣＫ１９である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団が、前駆体哺乳動物膵臓細胞に関連する少なくとも１つのマーカーを発現する細胞において、ＦＡＣＳによって富化される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団が、複数の幹細胞または管上皮細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記幹細胞が、臍帯、胚、および樹立幹細胞株からなる群から選択される１つ以上の供給源由来である細胞を含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
１つ以上の膵島が、前記管上皮細胞を含む、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団が、不死化されている、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団が、前記前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団の増殖を達成するために十分な量の少なくとも１つのＥＧＦレセプターリガンドと共に提供される、項目１に記載の方法。
（項目９）
複数の機能的成熟β細胞を含む哺乳動物膵臓細胞集団を得るための方法であって、該方法は、以下：
前駆体哺乳動物膵臓細胞に関連する少なくとも１つのマーカーを発現する前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団を、該前駆体哺乳動物膵臓細胞の分化を達成するために十分な量の、少なくとも１つのガストリンレセプターリガンドと共に提供する工程であって、該細胞の約１０％〜約２０％が、該マーカーを発現し、それにより、複数の機能的成熟β細胞が得られる工程、
を包含する、方法。
（項目１０）
前記細胞が、機能的成熟β細胞の前記集団の、約２倍〜約５倍までの増殖を誘導するために十分な量の、少なくとも１つのＥＧＦレセプターリガンドと共に提供される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
増殖が、約３倍〜約４倍である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記提供が、インビトロであり、前記ＥＧＦレセプターリガンドの前記量が、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１．０μｇ／ｍｌであり、そして前記ガストリンレセプターリガンドの前記量が、約０．５μｇ／ｍｌ〜３μｇ／ｍｌである、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記提供が、インビトロであり、前記ＥＧＦレセプターリガンドの前記量が、約０．２μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌであり、そして前記ガストリンレセプターリガンドの前記量が、約０．６μｇ／ｍｌ〜約１．５μｇ／ｍｌである、項目９に記載の方法。
（項目１４）
前記複数の機能的成熟β細胞が、ＰＤＸ−１を発現する、項目９に記載の方法。
（項目１５）
前駆体哺乳動物膵臓細胞が、ヒト細胞またはブタ細胞である、項目９に記載の方法。
（項目１６）
前記ガストリンレセプターリガンドが、ヒトガストリン１−１７／Ｌｅｕ１５である、項目９に記載の方法。
（項目１７）
前記ＥＧＦレセプターリガンドが、ヒトＥＧＦ５１Ｎである、項目１０に記載の方法。
（項目１８）
以下：
複数の増殖性成熟膵臓β細胞を含む細胞培養物であって、該増殖性膵臓β細胞が、少なくとも１つのガストリンレセプターリガンドおよび少なくとも１つのＥＧＦレセプターリガンドを提供する方法によって得られ、ここで、該細胞培養物は、ＣＫ１９管細胞において富化され、そしてガストリンレセプターリガンドおよびＥＧＦレセプターリガンドと共に提供されない細胞と比較した場合、ＰＤＸ−１の発現が増加する、細胞培養物
を、含有する組成物。
（項目１９）
ＣＫ１９を発現する前駆体細胞を、少なくとも２０％含むように富化された、哺乳動物膵臓前駆体細胞の集団。
（項目２０）
膵島細胞分化を刺激する化合物をスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下：
哺乳動物膵臓前駆体細胞の集団を、該化合物および必要に応じて少なくとも１つのＥＧＦレセプターリガンドと共に提供する工程；および
ＰＤＸ−１の発現を、該化合物が膵島細胞分化を達成する指標として検出する工程、
を、包含する、方法。
【００１０】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、真性糖尿病および他の変性膵臓障害の処置を必要とする患者において、ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンド（例えば、ガストリン）および／またはＥＧＦレセプターリガンド（例えば、ＴＧＦ−αもしくはＥＧＦ）、あるいは両方の組み合わせを、膵島前駆体細胞の成熟インスリン分泌細胞への分化をもたらすために十分な量で提供することにより、真性糖尿病および他の変性膵臓障害を処置するための方法および組成物を提供する。この組成物が全身的に投与される場合、一般に注射によって、好ましくは静脈内に、生理学的に受容可能なキャリア中で提供される。この組成物がインサイチュで発現される場合、膵島前駆体細胞は、エキソビボまたはインビボのどちらかで、発現ベクター内の１つ以上の核酸発現構築物によって形質転換され、この核酸発現構築物は、膵島前駆体細胞において、所望のレセプターリガンドの発現を提供する。例として、発現構築物は、ＣＣＫレセプターリガンド（例えば、発現後にガストリンへとプロセシングされるプレプロ
ガストリン（ｐｒｅｐｒｏｇａｓｔｒｉｎ）ペプチド前駆体コード配列）またはＥＧＦレセプターリガンド（例えば、ＴＧＦ−α）についてのコード配列を、膵島前駆体細胞における発現を提供する転写調節領域および翻訳調節領域と共に含む。転写調節領域は、構成的であって、または例えば、インスリン遺伝子由来の転写調節領域のように、細胞内グルコース濃度の上昇によって誘導されてもよい。形質転換は、任意の適切な発現ベクター（例えば、アデノウイルス発現ベクター）を使用して実行される。エキソビボで形質転換が実行される場合、形質転換された細胞は、例えば、腎被膜を使用して、糖尿病患者に移植される。
【００１１】
あるいは、膵島細胞は、エキソビボで、糖尿病患者への移植前に、膵島内の前駆体膵臓β細胞の数を増加させるために、十分な量のガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドおよび／またはＥＧＦレセプターリガンドで処理される。要求に応じ、エキソビボ増殖後、前駆体膵臓β細胞の集団を、これらを少なくともガストリンレセプターリガンドに接触させることにより、移植前に培養物中で分化させる。増殖および／または分化が、移植前または移植後のどちらで行われようと、細胞は、膵島前駆体細胞についての１つ以上のマーカーを保有する細胞（例えば、幹細胞またはＣＫ １９を発現する管細胞）について、処理前に必要に応じて富化される。
【００１２】
本発明は、糖尿病患者についての現存する処置レジメンを超える利点を提供する。成熟膵臓細胞を刺激して再生させる手段を提供することにより、従来の薬物治療（２型）またはインスリン治療（１型および２型）の必要を減らすかまたはなくしさえするのみならず、正常血糖レベルの維持はまた、糖尿病のより衰弱性の合併症のうち幾つかを軽減し得る。膵島組織または他の膵島前駆体細胞の増殖および分化の１つまたは両方を、特により大きな膵島前駆体細胞の集団を含むために前駆体細胞集団を富化することと共に、移植前または移植後に使用することにより、移植に必要な不足している膵島数を低下させる手段を提供する。さらに、移植に使用される細胞集団の可変性が本発明の方法によって低下するだけでなく、移植された細胞の機能特性の再現性が上昇する。本発明の別の利点は、免疫拒絶を、例えば、ブタ膵島の異種移植によって低下させ得ることである。
【００１３】
本明細書中において使用される場合、用語「ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンド」とは、ガストリン／ＣＣＫレセプターを刺激する化合物を包含する。このようなガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドの例としては、種々の形態のガストリン（例えば、ガストリン３４（ビッグガストリン）、ガストリン１７（リトルガストリン）、およびガストリン８（ミニガストリン））；種々の形態のコレシストキニン（例えば、ＣＣＫ ５８、ＣＣＫ ３３、ＣＣＫ ２２、ＣＣＫ １２およびＣＣＫ ８）；ならびに単独またはＥＧＦレセプターリガンドと組み合わせた、成熟膵臓において細胞の分化を誘導してインスリンを分泌する膵島細胞を形成させる、他のガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドが挙げられる。上記のものの活性なアナログ、フラグメントおよび他の改変物のペプチドアゴニストおよび非ペプチドアゴニストの両方、または部分アゴニスト（ガストリン／ＣＣＫレセプター（例えば、Ａ７１３７８（Ｌｉｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５８（４ Ｐｔ １）：Ｇ６４８，１９９０））を含む）もまた企図され、これは、単独でまたはＥＧＦレセプターリガンドと組み合わせて、成熟膵臓における細胞の分化を誘導して、インスリンを分泌する膵島細胞を形成させる。特に興味深いのは、１５位でメチオニンの代わりに置換されたロイシンを有するガストリン誘導体である。米国特許第１０／０４４，０４８号（２００２年７月２５日公開）を、参照のこと。この開示は、本明細書中で参考として援用される。ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドはまた、内因性のガストリン、コレシストキニンまたは同様に活性なペプチドの、組織貯蔵部位からの分泌を増加させる化合物を包含する。これらの例は、ペプチド（例えば、ＥＧＦならびにそのアナログおよびフラグメント）、ならびに、非ペプチド低分子（例えば、オメプラゾール（これは、胃酸の分泌を阻害し、そして／またはガストリン／ＣＣＫレセプターの数を増加させる）、
およびダイズトリプシンインヒビター（これは、ＣＣＫ刺激を増加させる））である。
【００１４】
本明細書で使用する場合、用語「ＥＧＦレセプターリガンド」は、同じ組織または隣接する組織、あるいは同じ個体のガストリン／ＣＣＫレセプターも刺激される場合に、インスリン産生膵島細胞の新生が誘導されるようなＥＧＦレセプターを刺激する化合物を包含する。ガストリン／ＣＣＫレセプターの刺激は、ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドの提供によって直接的になされ得るか、または例えば、インビボで内因性および／または外因性の因子により、胃酸分泌を阻害することによって間接的になされ得る。ＥＧＦレセプターリガンドの例としては、ＥＧＦ１−５３、ならびにそのフラグメントおよび活性なアナログ（ＥＧＦ１−４８、ＥＧＦ１−５２、ＥＧＦ１−４９を含む）が挙げられる。例えば、米国特許第５，４３４，１３５号を参照のこと。目的の他のアナログとしては、Ｘの長さのアミノ酸配列を有するＥＧＦが挙げられ、Ｘは、少なくとも４８でかつ５３を超えない整数であり、このような配列は、（ｉ）ヒトＥＧＦの１位からヒトＥＧＦのＸ−１位までのアミノ酸配列の一部分と実質的に相同であり、そして（ｉｉ）Ｘ位に、ヒトＥＧＦにおいて見出されるアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有する。特に興味深いものは、ヒトＥＧＦのアナログであり、ここでＸは５１であり、そしてＸ位のアミノ酸残基は、グルタミン酸以外（例えば、中性アミノ酸、疎水性アミノ酸、または荷電アミノ酸）である。Ｘが５１である場合、目的の置換としては、アスパラギン、グルタミン、アラニン、およびセリンが挙げられる（２００３年５月１５日公開のＰＣＴ／ＵＳ０２／２３３０９７を参照のこと。この開示は、本明細書中で参考として援用される）。ＥＧＦレセプターリガンドの他の例としては、ＴＧＦ−αレセプターリガンド（１〜５０）ならびにそのフラグメントおよび活性なアナログ（１〜４８、１〜４７および他のＥＧＦレセプターリガンド（例えば、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）およびポックスウイルス増殖因子、ならびにガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドと同じ相乗活性を実証する、他のＥＧＦレセプターリガンド）が挙げられる）が、挙げられる。これらは、上記のものの活性なアナログ、フラグメントおよび他の改変物を含む。さらなる背景として、ＣａｒｐｅｎｔｅｒおよびＷａｈｌ，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ（ＳｐｏｒｎおよびＲｏｂｅｒｔｓ編）の第４章，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，（１９９０）を参照のこと。
【００１５】
本発明の主な局面は、真性糖尿病の処置を必要とする個体に、ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドおよび／またはＥＧＦレセプターリガンドを膵島前駆体細胞の成熟インスリン分泌細胞への分化を達成するために十分な量で含有する組成物を提供することによって、この個体において真性糖尿病を処置するための方法である。このようにして分化した細胞は、膵管における残留潜在型膵島前駆体細胞である。１つの実施形態は、好ましくは全身的に、分化を再生させる量のガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドおよびＥＧＦレセプターリガンド（好ましくは、置換ＥＧＦ−５１のようなＥＧＦ）を、単独または併用して、この個体に投与することを包含する。
【００１６】
糖尿病の処置はまた、精製した膵島または膵島前駆体細胞の移植を必要とする患者への、これらの移植によって達成され得る。移植のための細胞は、一般に、ドナー膵臓から得られるかまたは幹細胞（例えば、臍帯、胚または樹立培養幹細胞株から得られる）である。細胞は、器官（例えば、膵臓、腎臓または肝臓）への直接注射のような経路によって移植され得る。あるいは、細胞は、静脈内投与によって投与され、例えば、細胞は、例えば、門脈への経皮的経肝臓的注射によって、門脈または肝静脈に投与される。この細胞を、ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドおよび／またはＥＧＦレセプターリガンドを用いて、移植後（移植後の細胞に提供することによって）または移植前のどちらかで増殖させ得、そして／または機能的膵島細胞へと分化させ得る。
【００１７】
膵島前駆体細胞をエキソビボで分化させる場合、幹細胞または移植された膵臓組織のど
ちらであっても、膵臓組織を移植する前の以下の分化工程または増殖工程のどちらかのために、部分的または完全に分離された細胞に解離し得、宿主哺乳動物を刺激し得る。
【００１８】
移植された膵臓組織を分化増強組成物に接触させる前または接触させると同時に、細胞の集団、特に移植組織における膵島前駆体細胞を、十分な量のＥＧＦレセプターリガンドをガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドと併用してまたは併用せずに提供して有糸分裂誘発を誘導することにより、増殖させ得る。必要に応じて、移植膵臓組織を、まず膵島前駆体細胞（特に膵島前駆体細胞または管上皮細胞に関連するマーカータンパク質（例えばＣＫ１９、ネスチン、ＣＫ７、ＣＫ８、ＣＫ１８、炭酸脱水酵素ＩＩ、ＤＵ−ＰＡＮ２、炭水化物抗原１９−９およびムチンＭＵＣ１）を発現する細胞）内で富化し得る。必要に応じて、不死化膵島前駆体細胞が、当業者に公知の方法（例えば、ｈＴＥＲＴによる形質転換）を使用して調製され得る。このような細胞を、ＥＧＦレセプターリガンドでエキソビボで増殖させ得、次いで、移植の前に、ガストリンレセプターリガンドで刺激して、完全な成熟膵島細胞への分化過程を、インビボまたはエキソビボで完了させ得る。
【００１９】
別の実施形態において、ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンド刺激は、このような前駆体細胞に、トランスジェニックで導入したキメラインスリンプロモーター−ガストリン融合遺伝子構築物の発現によって引き起こされる。別の実施形態において、ＥＧＦレセプターリガンド刺激は、哺乳動物にトランスジェニックで導入したＥＧＦレセプターリガンド遺伝子の発現によって引き起こされる。ＥＧＦ遺伝子の配列は、米国特許第５，４３４，１３５号において提供される。
【００２０】
別の実施形態において、ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドおよびＥＧＦレセプターリガンドによる刺激は、哺乳動物に安定的に導入された、（ｉ）プレプロガストリンペプチド前駆体遺伝子と、（ｉｉ）ＥＧＦレセプターリガンド遺伝子との同時発現によって引き起こされる。
【００２１】
別の局面において、本発明は、このような細胞を、ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドとＥＧＦレセプターリガンドとの組み合わせで刺激することによって、哺乳動物の膵島前駆体細胞の分化を引き起こすための方法に関する。この局面の好ましい実施形態において、ガストリン刺激は、哺乳動物に安定的に導入されたプレプロガストリンペプチド前駆体遺伝子の発現によって引き起こされる。この発現は、インスリンプロモーターの制御下である。ＥＧＦレセプターリガンド（例えば、ＴＧＦ−α）刺激は、哺乳動物にトランスジェニックで導入されたＥＧＦレセプターリガンド遺伝子によって達成され得る。上記の促進において、ガストリンおよびＴＧＦ−αによる刺激は、好ましくは、哺乳動物に導入された、（ｉ）プレプロガストリンペプチド前駆体遺伝子と、（ｉｉ）ＥＧＦレセプターリガンドとの同時発現によって影響を及ぼされる。遺伝子の転写を指示し得る適切なプロモーターとしては、ウイルスプロモーターおよび細胞性プロモーターの両方が挙げられる。ウイルスプロモーターとしては、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１： ５２１−５３０）、ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら（１９８１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４−８６４）およびアデノウイルス２由来の主要な後期プロモーター（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１３０４−１３１９９）が、挙げられる。好ましくは、ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンド遺伝子およびＥＧＦレセプターリガンド遺伝子の１つまたは両方の発現は、インスリンプロモーターの制御下である。
【００２２】
本発明の別の局面は、核酸構築物である。この構築物は、プレプロガストリンペプチド前駆体をコードする核酸配列と、プレプロガストリンペプチド前駆体をコードする配列の転写を支持するのに効果的である、５’からのインスリン転写調節配列とを含む。好まし
くは、インスリン転写調節配列は、少なくとも１つのインスリンプロモーターを含む。好ましい実施形態において、プレプロガストリンペプチド前駆体をコードする核酸配列は、ヒトガストリン遺伝子のエキソン２およびエキソン３、ならびに必要に応じてイントロン１およびイントロン２をも含む、ポリヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
本発明の別の実施形態は、（ｉ）哺乳動物ＥＧＦレセプターリガンド（例えば、ＴＧＦ−α）をコードする核酸配列およびその転写調節配列；ならびに（ｉｉ）プレプロガストリンペプチド前駆体をコードする核酸配列およびその転写調節配列を含む、発現カセットである。好ましくは、ＥＧＦレセプターリガンドの転写調節配列は、強い組織非特異的プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）である。好ましくは、プレプロガストリンペプチド前駆体の転写調節配列は、インスリンプロモーターである。この実施形態の好ましい形態は、プレプロガストリンペプチド前駆体をコードする核酸配列は、ヒトガストリン遺伝子のイントロン１およびイントロン２ならびにエキソン２およびエキソン３を含むポリヌクレオチド配列を、含む。
【００２４】
本発明の別の局面は、プレプロガストリンペプチド前駆体コード配列を含む、発現カセットを含むベクターに関する。このベクターは、プラスミド（例えば、ｐＧｅｍ１）であり得るか、またはインスリンプロモーターを含む転写調節配列を有するファージであり得る。
【００２５】
本発明の別の局面は、（１）強い組織非特異的プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）の制御下に哺乳動物ＥＧＦレセプターリガンド（例えば、ＴＧＦ−αレセプターリガンド）をコードする核酸配列を有し；そして、インスリンプロモーター制御下にプレプロガストリンペプチド前駆体コード配列を有する、ベクターの組成物に関する。この局面において、各ベクターは、プラスミド（例えば、プラスミドｐＧｅｍ１）またはファージであり得る。あるいは、発現カセットまたはベクターはまた、適切な組織栄養機能を有するウイルスベクターにも挿入され得る。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスなどが挙げられる。Ｂｌｏｍｅｒら（１９９６）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５ Ｓｐｅｃ．Ｎｏ：１３９７−４０４；およびＲｏｂｂｉｎｓら（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：３５−４０を、参照のこと。アデノウイルス媒介性遺伝子治療は、首尾よく使用され、嚢胞性線維症を有する患者の鼻腔上皮の塩素輸送欠損を一時的に治している。Ｚａｂｎｅｒら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６を参照のこと。
【００２６】
本発明の別の局面は、安定的に組み込まれた遺伝子を発現可能な、非ヒト哺乳動物または哺乳動物組織（細胞を含む）であり、この組み込まれた遺伝子は、プレプロガストリンをコードする。この局面の別の実施形態は、（ｉ）プレプロガストリンペプチド前駆体遺伝子；および／または（ｉｉ）非ヒト哺乳動物、哺乳動物組織または哺乳動物細胞に安定的に組み込まれたＥＧＦレセプターリガンド（例えば、ＴＧＦ−α遺伝子）を同時発現可能な、非ヒト哺乳動物である。哺乳動物組織または哺乳動物細胞は、ヒト組織またはヒト細胞であり得る。
【００２７】
（治療投与および治療組成物）
投与様式としては、経皮経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。この化合物は、任意の便利な経路（例えば、上皮または粘膜裏層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜または腸管粘膜など）を通して吸収される、注入またはボーラス注射）で投与され得、そして、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与され得る。投与は、好ましくは、全身的である。
【００２８】
本発明はまた、薬学的組成物も提供する。このような組成物は、治療的有効量の、治療的かつ薬学的受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアとしては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが上げられるが、これらに限定されない。処方物は、投与様式に適するべきである。薬学的受容可能キャリアおよび本発明における使用のための処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，第１７版（１９８５）（本明細書中で参考として援用される）において見出される。薬物送達のための方法の簡潔な総説については、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００２９】
本発明の薬学的組成物の調製において、本発明の組成物を改変し、その薬物動態学および体内分布を変えることが望ましい。薬物動態学の一般的考察については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出，第３７〜３９章を、参照のこと。薬物動態学および体内分布を変えるための多くの方法が、当業者に公知である（例えば、Ｌａｎｇｅｒ，前出を参照のこと）。このような方法の例としては、タンパク質、脂質（例えば、リポソーム）、炭水化物、または合成ポリマーのような物質からなる小胞中での薬剤の保護が挙げられる。例えば、本発明の薬剤は、その薬物動態学および体内分布特性を拡大するために、リポソーム内に組み込まれ得る。リポソームを調製するために、種々の方法が使用可能である。これらの方法は、例えば、Ｓｚｏｋａら（１９８０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、および同第４，８３７，０２８号（これら全ては本明細書中で参考として援用される）に記載される。種々の他の送達系が公知であり、本発明の治療物（例えば、微小粒子、微小カプセルなど）を投与するために使用され得る。
【００３０】
この組成物はまた、所望される場合、微量の湿潤剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝化剤を含有し得る。この組成物は、液体溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性処方物、または散剤であり得る。この組成物は、従来の結合剤およびキャリア（例えば、トリグリセリド）を用いて、座剤として処方され得る。経口処方物は、標準的キャリア（例えば、薬学等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含有し得る。
【００３１】
好ましい実施形態において、この組成物は、慣用的手順（例えば、ヒトへの静脈内投与に適した薬学的組成物）に従って処方される。代表的に、静脈内投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、この組成物はまた、溶解補助剤および注射の部位でのあらゆる痛みを緩和する局所麻酔を含有し得る。一般に、成分は、例えば、密封容器内の凍結乾燥粉末または水非含有濃縮物（例えば、アンプルまたはサシェ（ｓａｃｈｅｔｔｅ）（活性薬剤の質を表す））として、別々に供給されるか、または単位投薬形態中に混合して供給されるかのどちらかである。組成物が注入によって投与されるべきである場合、組成物は、無菌薬学等級の水または生理食塩水を含む注入瓶で投与され得る。組成物が注射で投与される場合、注射のための滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得、成分が投与前に混合され得る。
【００３２】
本発明の治療物は、中性形態または塩形態で処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、遊離のアミノ基で形成される（例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する）塩、および遊離のカルボキシル基で形成される（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、および他の二価カチオン、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する）塩が、挙げられる。
【００３３】
本発明の治療物の、特定の障害または症状を処置するために効果的な量は、障害または症状の性質に依存し、標準的臨床技術によって決定され得る。処方物中に使用される正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重篤度にも依存し、そして臨床医の判断および各患者の環境に従って決定されるべきである。しかし、静脈内投与の適切な用量範囲は、ＥＧＦレセプターリガンドについては一般に体重１ｋｇあたり活性化合物約０．０１〜５００μｇであり、ガストリンレセプターリガンドについては一般に体重１ｋｇあたり活性化合物０．１〜５０００μｇである。有効用量は、インビトロ試験系または動物モデル試験系からの用量応答曲線から外挿され得る。座剤は、一般に、０．５重量％〜１０重量％の範囲の活性成分を含有し、経口処方物は、好ましくは１０％〜９５％の活性成分を含有する。
【００３４】
本発明の遺伝子治療方法において、インビボトランスフェクションは、治療物転写ベクターまたは治療物発現ベクターの哺乳動物宿主への、脂質キャリア（特にカチオン性脂質キャリア）と混合した裸の（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡまたはウイルスベクターへ挿入したＤＮＡ（例えば、組換えアデノウイルス）のどちらかとしての導入によって得られる。哺乳動物宿主への導入は、幾つかの経路（静脈内注射経路または腹腔内注射経路、気管内経路、くも膜下腔内経路、非経口経路、関節内経路、鼻腔内経路、筋肉内経路、局所的経路、経皮経路、任意の粘膜表面への適用、角膜導入（ｃｏｒｎｅａｌ ｉｎｓｔａｌｌａｔｉｏｎ）など）のいずれかによってなされ得る。特に興味深いのは、循環体液内または体の開口部もしくは体腔への治療物発現ベクターの導入である。従って、静脈内投与およびくも膜下腔内投与は、特に興味深い。なぜなら、ベクターは、このような経路の後に広範に散在し得、そしてエアロゾル投与は、体の開口部または体腔への導入による使用を見出すからである。特定の細胞および組織が、投与経路および投与部位に基づいて標的化され得る。例えば、血流の方向の注射の位置に近接した組織は、任意の特定の標的化の非存在下でトランスフェクトされ得る。脂質キャリアが使用される場合、これらは、部位特異的分子を使用して、細胞の特定の型の複合体を目指すように改変され得る。従って、特定のレセプターまたは他の細胞表面タンパク質についての抗体またはリガンドが、特定の表面タンパク質に関連する標的細胞に使用され得る。
【００３５】
任意の生理学的に受容可能な媒体（例えば、上述のように薬学的組成物のために、投与の経路に依存して、脱イオン水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、水中５％デキストロースなど）が、ＤＮＡ、組換えウイルスベクターまたは脂質キャリアを投与するために使用され得る。他の成分（例えば、緩衝液、安定剤、殺生剤など）が、処方物中に含有され得る。これらの成分は、文献において広範な例証を見出しており、ここで特に記載する必要はない。避けるべき複合体の凝集を引き起こすなんらかの希釈剤または希釈剤の成分としては、高濃度の塩、キレート剤などが挙げられる。
【００３６】
使用される治療物ベクターの量は、標的組織内における発現の治療レベルを提供するために十分な量である。発現の治療レベルは、血糖を正常レベルに減少するために十分な発現量である。加えて、使用される核酸ベクターの用量は、インビボの導入組織において、導入遺伝子発現の所望のレベルを生成するために十分でなければならない。他のＤＮＡ配列（例えば、アデノウイルスＶＡ遺伝子）は、投与媒体に含有され得、そして目的の遺伝子に同時トランスフェクトされ得る。アデノウイルスＶＡ遺伝子産物をコードする遺伝子の存在は、所望される場合、発現カセットから転写されるｍＲＮＡの翻訳を有意に増大し得る。
【００３７】
多くの因子が、トランスフェクトされた組織における発現の量に影響し、従って発現のレベルを改変して、特定の目的に合わせるために使用され得る。高レベルの発現が所望される場合、全ての因子を最適化し得、より少ない発現が所望される場合、１つ以上のパラ
メータを変えて所望の発現レベルを達成し得る。例えば、高い発現が治療濃度域を超える場合、最適条件未満を使用し得る。
【００３８】
組換え遺伝子の発現のレベルおよび組織は、上述のように、ｍＲＮＡレベル、および／またはポリペプチドもしくはタンパク質のレベルにおいて決定され得る。遺伝子産物は、組織におけるその生物学的活性を測定することによって定量され得る。例えば、タンパク質活性は、上述のイムノアッセイ、生物学的アッセイ（例えば、血糖）、または免疫染色技術（例えば、遺伝子産物または発現カセット内に存在するレポーター遺伝子産物を特異的に認識する抗体での探索）によるトランスフェクトされた細胞の遺伝子産物の同定によって、測定され得る。
【００３９】
代表的に、治療カセットは、患者のゲノム内に組み込まれない。必要な場合、処置は、達成された結果に依存して、非定型に繰り返され得る。処置が繰り返される場合、患者をモニターし、処置に有害な免疫応用または他の有害応答が存在しないことを確認し得る。
【００４０】
本発明はまた、膵臓β細胞の集団をインビトロで増殖するための方法を提供する。適切なドナーからの膵臓の単離に基づき、細胞を単離してインビトロで増殖させる。使用される細胞は、哺乳動物ドナー由来の組織サンプル（ヒト死体、ブタ胎児、または他の適切な膵臓細胞供給源が挙げられる）から得られる。ヒト細胞が使用される場合、可能であれば、細胞は、レシピエントに合った組織適合性が高い。細胞の精製は、単離した膵臓の酵素（例えば、コラゲナーゼ）分解後の、勾配分離によって達成され得る。精製した細胞を、細胞を生存させるために十分な栄養、およびインスリン分泌膵臓β細胞を形成するために十分な量のβ細胞増殖誘導組成物（ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドおよびＥＧＦレセプターリガンドを含む）を含有する培地内で増殖する。本発明に従って、刺激後、インスリン分泌膵臓β細胞を、培養物中で直接増殖し、その後移植を必要とする患者に移植し得るか、または、β細胞増殖誘導組成物による処置後、直接移植し得る。
【００４１】
移植の方法は、得られたインスリン分泌膵臓β細胞を、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン）と共にその移植を必要とする患者に移植する工程を包含する。インスリン産生細胞はまた、移植前に、半透性膜中にカプセル化され得る。このような膜は、カプセル化細胞からのインスリン分泌を許容し、一方で、細胞を免疫攻撃から保護する。移植するべき細胞の数は、患者１ｋｇあたりインスリン産生β細胞が１０，０００個と２０，０００個との間で見積もられる。繰り返しの移植が、インスリン分泌細胞の治療的有効数を維持するために、必要に応じて要求され得る。本発明に従い、移植レシピエントはまた、移植されたインスリン分泌β細胞の増殖を誘導するために、十分な量のガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドおよびＥＧＦレセプターリガンドを提供され得る。
【００４２】
糖尿病の処置の効果を、以下のように評価し得る。可能であれば、処置様式の生物学的効力および臨床的効力の両方を、評価する。例えば、疾患はそれ自体、血糖増加により発現し、従って、例えば、評価した血糖の正常値への回帰を観察することにより、処置の生物学的効力は評価され得る。臨床的効力（すなわち、効果の基礎を成す処置が疾患の経過の変化において有効であるか否か）を測定することは、より難しくあり得る。生物学的効力の評価は、臨床的効力の代用評価項目として貢献するが、決定的ではない。従って、たとえば６ヶ月の期間後のβ細胞再生の指標を与え得る臨床的終末点の測定は、処置レジメンの臨床的効力の指標を与え得る。
【００４３】
本組成物は、１つ以上の手順で使用のためのキットとして提供され得る。遺伝的治療のためのキットは、通常、ミトコンドリア標的配列ペプチドを有するかもしくは有さない裸のＤＮＡとして、組換えウイルスベクターとしてかまたは脂質キャリアと混合されるかのどちらかで、治療的ＤＮＡ構築物を含む。さらに、脂質キャリアは、提供されるＤＮＡと
混合するために、別の容器中に提供され得る。このキットは、使用前にさらに希釈され得る濃縮物（凍結乾燥組成物を含む）としての有効な薬剤か、または使用する濃度で提供され得る有効な薬剤のどちらかを含有する組成物を含み、バイアルは、１回以上の用量を含み得る。好都合なことに、キットにおいて単回用量は、滅菌バイアル中で提供され得、従って、医師は、バイアルが所望の量および濃度の薬剤を有する場合、バイアルを直接使用し得る。バイアルが、直接使用のための処方物を含む場合、通常、本方法と共に使用するための他の試薬は必要ない。このようなキットは、医薬品または生物学製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって定められた形態の通知（この医薬品または生物学製品の製造、使用または販売を規制する機関により、ヒト投与のための認可を反映する）に沿い得る。
【００４４】
以下の実施例は、例証の目的で提供され、限定の目的で提供されない。
【実施例】
【００４５】
（方法）
以下の方法が、別に述べない限り、以下に示す実施例において使用された。
【００４６】
（動物）
通常の飼料を適宜与え、水を自由に摂らせた正常なＷｉｓｔａｒラットおよびＺｕｃｋｅｒラットを、各実験の開始の一週間前に順応させた。体重１ｋｇあたり８０ｍｇの用量の新しく調製したストレプトゾトシンを、糖尿病の誘導の５日〜７日後に静脈内（Ｉ．Ｖ．）投与し、ラットを、その後の処理のためのグループに無作為に割り当てた。実施例１〜４において、ＴＧＦ−αおよびラットガストリンを、０．１％ＢＳＡ含有の滅菌正常食塩水中で再構築した。別々の実験についての所定の処置計画に従い、各動物に、ＴＧＦ−αもしくはガストリンを単独（４．０μｇ／ｋｇ体重）または１：１（ｗ／ｗ）混合物（計８．０μｇ／ｋｇ体重）での、あるいはＰＢＳの、単回の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を毎日１０日間の間与えた。
【００４７】
雌ＮＯＤマウスを、特定の病原体非含有条件下で餌を与え、無処理雌ＮＯＤマウスにおいてそして９８％の糖尿病発生率を得るように、適切に世話した。ＮＯＤ糖尿病マウスを、ＦＢＧによる糖尿についての毎朝の試験（１０週齢で開始）によって、糖尿病発生についてモニターした。糖尿が出た場合、空腹時血糖レベル（ＦＢＧ）を測定し、２日連続のＦＢＧ＞６．６ｍｍｏｌ／ｌを、糖尿病と定義した。最近発症したＮＯＤモデルについて（実施例７）、糖尿病マウスを、代表的に１４〜１８週で、使用のために選択した。慢性的ＮＯＤモデルについて、糖尿病マウスを、代表的に２５週齢で、使用のために選択した（ＦＢＧレベルは、代表的に３０ｍＭを超えた）（実施例５および６）。実施例８および実施例９における雌ＮＯＤ−ＳＣＩＤ（免疫不全（ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）と組み合わせた免疫不全切断（ｉｍｍｕｎｏｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｓｅｖｅｒ）マウスの処置を、マウスが５〜７週齢のときに行った。実施例８〜９において、マウスを、一般に、移植直後から始めて６〜８週間、３０μｇ／ｋｇのヒト変異体ＥＧＦ（５１アミノ酸残基を有し、５１位の残基はアスパラギンである）（出願番号第１０／０００，８４０に記載）、および３０〜１０００μｇ／ｋｇのヒトガストリンアナログであるｈＧａｓｔｒｉｎ１−１７Ｌｅｕｌ５の各用量を、生理食塩水／リン酸緩衝液中で、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって１日２回投与することにより、処置した。
【００４８】
（血糖）
処置期間の終わりに動物を、一晩絶食させ、そして静脈内（ｉ．ｖ．）または腹腔内（ｉ．ｐ．）のグルコース耐性試験を行った。絶食被験体からの血液サンプルを収集し、そしてグルコース注射後の異なった時間にサンプルを収集した。サンプルを、血糖濃度について分析し、次いで、必要な場合、特異的ラジオイムノアッセイによるヒトインスリンＣ
ペプチドレベルのアッセイのために調製した。このアッセイは、マウス由来のＣペプチドに対し、無視できる交差反応性を有した。
【００４９】
（組織インスリン分析）
各研究の最後に、動物を屠殺し、そして膵臓およびヒト膵島移植片（移植した場合）を取り出し、重さを量った。
【００５０】
小さな生検を、膵臓組織の全体に渡って別々の代表部位から取り、そして免疫組織化学測定、タンパク質測定、およびインスリン測定のために、液体窒素中で直ちに急速凍結した。急速凍結した膵臓サンプルを、迅速に融解し、脱イオン水中で超音波的に崩壊させて、アリコートをタンパク質測定のために取り、ホモジネートを酸／エタノール抽出に供した後でＲＩＡによってインスリン測定を行い、そして総膵島含量を計算した。
【００５１】
ヒト膵島移植片を、凍結し、抽出してインスリン含量をイムノアッセイによってアッセイするか、または、組織学的分析のためにホルマリン中で固定した。ヒト膵島移植片を、分析のために採取し、酸／エタノール中で抽出して、インスリン含量をイムノアッセイによってアッセイした。
【００５２】
（免疫組織化学分析）
ヒト膵島移植片を、採取し、解離させて細胞調製物とし、これをインスリン、グルカゴン、アミラーゼおよびサイトケラチン（ＣＫ）７およびＣＫ １９のそれぞれについて特異的な抗体で免疫染色した。免疫組織化学技術を、Ｓｕａｒｅｚ−Ｐｉｎｚｏｎ ＷＬら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４９：１８１０−１８１８，２０００）中に記載のように行った。移植組織および細胞調製物における各別々の細胞型の割合およびインスリン含量を、染色スライドおよびコード化スライドを計数することによって決定した。各スライドは、１サンプルにつき少なくとも１２，０００個の細胞を含み、そして各スライドを少なくとも３連で、明視野顕微鏡下で１００×液浸系対物レンズを使用して、実施した。１回の調製につき少なくとも６，０００個の細胞を計数し、そして計数を、目隠しコード様式で２回繰り返した。数値を、移植前に、移植細胞調製物中の換算値と比較した。
【００５３】
（ヒト膵島調製物および移植）
ヒト膵島を、上述したように、ヒトドナーの膵臓組織から以下のように調製した。ヒト膵臓からの膵島を、脳死した器官ドナーから、親族のインフォームドコンセントの下に得て単離した。病院の人間倫理委員会が組織獲得および実験的プロトコールを認可している。ドナーからの膵臓摘出および膵島単離手順を、Ｌａｋｅｙ ＪＲＴら（１９９９）Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ８：２８５−２９２、およびＲｉｃｏｒｄｉ Ｃ．ら（１９８８）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３７：４１３−４２０に従って行った。
【００５４】
ヒト膵島を、腎被膜下移植により、非糖尿病ＮＯＤ／マウスに移植した（２０００膵島当量）。代表的に、１人のヒトドナー膵臓を、約１０〜１２匹のマウスに移植するために使用した。
【００５５】
（実施例１）
（正常ラットにおけるＴＧＦ−αおよびガストリンでのインビボ処置の膵臓インスリン含量に対する効果）
この実験を、ＴＧＦ−α、ガストリン、またはＴＧＦ−αおよびガストリンの組み合わせで処置した非糖尿病動物における膵臓インスリン含量に対する効果を、コントロール動物（無処理）と比較して調べるために、設計した。正常Ｗｉｓｔａｒラットのグループ（ｎ＝５）を、以下の４つの処置グループの１つに割り当てた。
【００５６】
グループＩ：ＴＧＦ−α；組換えヒトＴＧＦ−αを、０．１％ＢＳＡ含有の滅菌生理食塩水中で再構築し、一日あたり０．８μｇの用量で１０日間、ｉ．ｐ．投与した。
【００５７】
グループＩＩ：ガストリン：合成ＲａｔガストリンＩを、かなり希釈した水酸化アンモニウム中に溶解し、そして０．１％ ＢＳＡ含有滅菌生理食塩水中で再構築した。これをｉ．ｐ．で、一日あたり０．８μｇの用量で１０日間投与した。
【００５８】
グループＩＩＩ：ＴＧＦ−α＋ガストリン：上記調製物の組み合わせを、ｉ．ｐ．で、上記の用量レベルで１０日間、投与した。
【００５９】
グループＩＶ：コントロール動物に、ビヒクルのみのｉ．ｐ．注射を１０日間与えた。
【００６０】
実験期間（１０日間）の最後に、全ての動物を屠殺し、そして膵臓のサンプルを以下のように得た：膵臓組織の５つの生検標本（１〜２ｍｇ）を、各ラット膵臓における別々の代表部位から得、そしてインスリン含量の分析のために液体窒素中で直ちに急速凍結した。膵臓インスリン含量の分析のために、急速凍結膵臓サンプルを迅速に融解し、蒸留水中で超音波的に崩壊させ、アリコートをタンパク質測定のために取り、そして酸／エタノール抽出して、その後インスリンラジオイムノアッセイを行った（Ｇｒｅｅｎら，（１９８３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３２：６８５−６９０）。膵臓インスリン含量値を、タンパク質含量に従って補正し、そして最後にμｇインスリン／ｍｇ膵臓タンパク質で表した。全ての値を、平均＋／−ＳＥＭで計算し、そして統計学的有意性を、スチューデント２サンプルｔ検定を使用して評価した。
【００６１】
【表１】
【００６２】
上の表１に示されるように、膵臓インスリン含量は、ＴＧＦ−α＋ガストリン処置動物において、コントロール動物と比較して有意に増加した（ｐ＝０．００７）；コントロール動物と比較して、膵臓インスリン含量においておよそ３倍の増加があった。これらのデータは、ＴＧＦ−αおよびガストリンの組み合わせは、機能的膵島β細胞容量を増加させるという仮定を支持する。この増加は、β細胞肥大（β細胞個々のサイズの増大）よりもむしろβ細胞過形成（数の増加）の全体条件を反映する。
【００６３】
（実施例２）
（糖尿病動物における、ＴＧＦ−αおよびガストリンの組み合わせによるインビボ処置の膵臓インスリン含量に対する効果）
この実験を、ＴＧＦ−αおよびガストリンの組み合わせが、糖尿病（ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処理）動物において、膵臓インスリン含量のレベルを正常（ＳＴＺ無処理）動物のレベルと比較して、増加し得るか否かを決定するために設計した。
【００６４】
正常Ｗｉｓｔａｒラットに、８０ｍｇ／Ｋｇ体重の用量のＳＴＺの単回Ｉ．Ｖ．注射を与えた。ＳＴＺのこの用量は、実験動物を糖尿病にするが、これらは機能的であるが減少した重量のβ細胞を保持することを確認することを意図した。ＳＴＺを、投与の直前に、氷冷した１０ｍＭクエン酸緩衝液に溶解した。この動物を、毎日モニターした；持続性の糖尿病を、糖尿によって示し、そして非空腹時血糖測定によって確認した。糖尿病導入の一週間後、ラットを無作為に２つのグループ（ｎ＝６）に以下のように割り当てた。
【００６５】
グループＩ：ＴＧＦ−α＋ガストリン：ＳＴＺ糖尿病ラットを、組換えヒトＴＧＦ−αと合成ラットガストリン１との組み合わせの単回のｉ．ｐ．注射により処置した；両方の調製物を、０．８μｇ／日の用量で１０日間投与した。
【００６６】
グループＩＩ：コントロール：ＳＴＺ糖尿病ラットに、ビヒクルのみのｉ．ｐ．注射を、１０日間与えた。
【００６７】
実験期間の最後に、全ての動物を屠殺し、そして膵臓のサンプルを採取して、実施例１に記載のように分析した；この結果を、表２に示す。
【００６８】
【表２】
【００６９】
ＳＴＺによる糖尿病の導入は成功し、そして中程度であるが持続性の高血糖を生じた。完全なインスリン欠損（ｉｎｓｕｌｉｎｏｐａｅｎｉａ）は見出されなかったため、従って、実験動物は、機能的であるが、重量の減少したβ細胞を保持していることを確認した。
【００７０】
上の表２において示されるように、コントロールストレプトゾトシン処置動物の膵臓インスリン含量は、ＳＴＺによるβ細胞の破壊の結果として、正常ラットの１／３未満であった（２０．６±６．０ｍｇインスリン／ｍｇタンパク質、上の表１参照）。ＴＧＦ−αとガストリンとの組み合わせで処置したＳＴＺ動物において、膵臓インスリン含量は、ＳＴＺのみを与えた動物の４倍を超え、正常ラットと統計的に同一であった（例えば、上の表１を参照）。
【００７１】
（実施例３）
（ＳＴＺ誘導性糖尿病動物における、ＴＧＦ−αおよびガストリンによるインビボ処置のＩＰＧＴＴに対する効果）
ＳＴＺ誘導性糖尿病Ｗｉｓｔａｒラットの２つのグループ（平均体重１０３ｇ）（ｎ＝６／グループ）を、ＴＧＦ−αとガストリンとの組み合わせまたはＰＢＳのどちらかのｉ．ｐ．注射により、１０日間毎日処置した。空腹時血糖を、全てのラットについて、０日目、６日目および１０日目に測定した。このインスリンが分泌されかつ機能的であること
を証明するため、ＩＰＧＴＴ試験を行った。１０日目に、腹腔内グルコース耐性試験（ＩＰＧＴＴ）を、一晩の絶食後に行った。血液サンプルを、２ｇ／ｋｇ体重の用量のｉ．ｐ．グルコース注射の前および３０分後、６０分後および１２０分後に、尾静脈から得た。血糖測定を、上記のように行った。血糖レベルは、時間０において両実験グループにおいて同様であったが、ｉ．ｐ．グルコースを与えた３０分後、６０分後、および１２０分後において、ＴＧＦαおよびガストリン処置ラットは、コントロールラットと比較して、血糖値の５０％低下を示した（図１）。
【００７２】
（実施例４）
（糖尿病傾向の動物におけるＴＧＦ−αおよびガストリンの体重上昇およびインスリン含量に対する効果）
Ｚｕｃｋｅｒラットを、３０日齢で、肥満の発達の約１０日〜１５日に得た。糖尿病傾向のＺｕｃｋｅｒラット（遺伝子型ｆａ／ｆａ、肥満および糖尿病について常染色体劣勢変異体）の他に、痩型非糖尿病の同腹仔（遺伝子型＋／＋）もまた、以下に記載するように実験に含めた。このラットを、肥満および糖尿病の発達について、体重および血糖レベルの測定により、毎日モニターした。Ｚｕｃｋｅｒラットにおける糖尿病の発症は、通常、４５〜５０日の間に開始し、血糖レベルにおける同齢の痩型コントロールのレベルと比較した有意な上昇によって、確認した。
【００７３】
各５匹のラットの５つのグループを含めた実験を、表３において記載する。グループ１およびグループ２（痩型、非糖尿病）を、それぞれＴＧＦ−αとガストリンとの組み合わせまたはＰＢＳで、０日目から１０日目まで処置した。グループ３、グループ４およびグループ５は、肥満、初期糖尿病Ｚｕｃｋｅｒラット、遺伝子型ｆａ／ｆａを含んだ。グループ３に、糖尿病の発症前に組み合わせ前処置を１５日間（−１５日〜０日）与え、そして糖尿病発症後さらに１０日間（０日目〜１０日目）与え続けた。グループ４を、ＴＧＦ−αおよびガストリンで、糖尿病の発症後１０日間処置し、そしてグループ５を、同じ期間にわたってＰＢＳで処置した。実験の最後に、ラットを屠殺し、膵臓を摘出した。小さな生検を、上述のように、別々の代表部位からタンパク質およびインスリンの測定のために採取した。
【００７４】
肥満糖尿病の、前処置したＺｕｃｋｅｒラット、処置のみをしたＺｕｃｋｅｒラット、または生理食塩水処置したＺｕｃｋｅｒラットにおける体重増加（表３におけるグループ３、グループ４およびグループ５）は、グループの間で任意の相違を示さなかった。ＴＧＦ−α＋ガストリンによる延長した処置（２５日、グループ３）でさえ、正常体重増加における効果がなかったことを述べることは、特に興味深い。誤差限度内で、体重増加は、全てのグループにおいて同一である。
【００７５】
肥満Ｚｕｃｋｅｒラットにおける空腹時血糖に対するＴＧＦ−α＋ガストリン処置の効果を、対応するＰＢＳコントロールと比較した。空腹時血糖は、１５日目まで有意に上昇し（４．０±０．６対５．０±０．２）、そしてこの時点を、ＴＧＦ−α＋ガストリンまたはＰＢＳコントロールで処置する１０日間処置の開始時期をして選択した。空腹時血糖レベルは、ＴＧＦ−α＋ガストリン処置またはＰＢＳにより、有意に変化しなかった。空腹時血糖値は、増殖因子またはＰＢＳで処置しようとするまいと、肥満動物と比較して、痩型においてより低かった。
【００７６】
これらの結果を、下の表３および図２に示す。
【００７７】
【表３】
【００７８】
（実施例５）
（慢性インスリン依存性糖尿病のＮＯＤマウスにおけるガストリンによるインビボ処置の空腹時血糖に対する用量依存性効果）
この実験の目的は、慢性インスリン依存性糖尿病のＮＯＤマウスにおいてガストリンのみで重篤な高血糖の発達および死を防ぎ得るか否かを決定することであった。慢性インスリン依存性糖尿病のインスリン治療で維持されたＮＯＤマウスを、以下で処置する、異なった処理グループに分配した：（ｉ）ビヒクル（ｎ＝４）；（ｉｉ）Ｇ１ １μｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｐ．によって２８日間にわたって１日２回（ｎ＝４）；（ｉｉｉ）Ｇ１ ５μｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｐ．によって２８日間にわたって１日２回（ｎ＝４）；（ｉｖ）Ｇ１
１０μｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｐ．によって２８日間にわたって１日２回（ｎ＝４）。インスリン治療を、Ｇ１による処置開始から１４日後に停止した。Ｇ１は、天然のガストリン分子と同じ長さであるが、１５位においてｍｅｔからｌｅｕへの１つのアミノ酸置換を含む、１７ａａガストリンアナログである。
【００７９】
０日から１４日まで、動物を、インスリン治療で維持し、全ての処置グループについて、空腹時血糖（ＦＢＧ）値は、１０μｇ／ｋｇ／日のＧ１で処置したグループ（ＦＢＧの減少を示した）を除き、０日目に記録したレベルの近くで維持された。２８日目（インスリン治療中止１４日後）に、ビヒクルグループの全ての動物は、糖尿病性ケトアシドーシス（ＤＫＡ）で死亡した。何故なら、これら全てのマウスは、完全にインスリン注射に依存していたからである。しかし、Ｇ１で処置した全てのマウスは、インスリン処置無しで２週間生き延びた。１μｇ／ｋｇ／日のＧ１で処置したマウスの空腹時血糖レベルは高いままだったが、Ｇ１の用量の増加に対応して、空腹時血糖レベルが低下した（それぞれ、５μｇ／ｋｇ／日および１０μｇ／ｋｇ／日）。図４を参照のこと。これらのデータは、ガストリンによる処置は、慢性的糖尿病インスリン依存性ＮＯＤマウスにおいて、インスリン治療の使用無しで、有意にグルコース制御を改善することを示す。
【００８０】
（実施例６）
（慢性的インスリン依存性糖尿病のＮＯＤマウスにおけるＥＧＦによるインビボ処置の空腹時血糖に対する用量依存的効果）
この実験の目的は、慢性的インスリン依存性糖尿病のＮＯＤマウスにおいて、ＥＧＦが、重篤な高血糖の発達および死亡を防ぎ得るか否か、そして膵臓インスリン含量を増加し得るか否かを決定することである。慢性的インスリン依存性糖尿病のインスリン治療で維持されたＮＯＤマウスを、以下で処置する、異なった処理グループに分配した：（ｉ）ビヒクル（ｎ＝４）；（ｉｉ）Ｅ１ ０．２５μｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｐ．によって２８日間
にわたって１日２回（ｎ＝４）；（ｉｉｉ）Ｅ１ １μｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｐ．によって２８日間にわたって１日２回（ｎ＝４）；（ｉｖ）Ｅ１ ３μｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｐ．によって２８日間にわたって１日２回（ｎ＝４）。インスリン治療を、Ｅ１による処置開始から１４日後に停止した。Ｅ１は、５１アミノ酸のＥＧＦアナログである。
【００８１】
０日から１４日まで、動物を、インスリン治療で維持し、Ｅ１で処置した全てのグループについて、空腹時血糖（ＦＢＧ）値は、用量の増加に依存して低下した。２８日目（インスリン治療中止１４日後）に、ビヒクルグループの全ての動物は、糖尿病性ケトアシドーシス（ＤＫＡ）で死亡した。何故なら、これら全てのマウスは、完全にインスリン注射に依存していたからである。対照的に、Ｅ１で処置した全てのＮＯＤマウスは、インスリン処置無しで２週間生き延びた。加えて、Ｅ１処置グループについてのＦＢＧの減少は、０．２５μｇ／ｋｇ／日のＥ１で処置したグループ（２８日目でＦＢＧが上昇したままだった）を除き、２週間前に観察されたレベルで安定し続けた。図５を参照のこと。これらのデータは、ＥＧＦによる処置は、慢性的糖尿病インスリン依存性ＮＯＤマウスにおいて、インスリン治療の使用無しで、有意にグルコース制御を改善することを示す。
【００８２】
（実施例７）
（最近糖尿病を発症したＮＯＤマウスにおける、ガストリンまたはＥＧＦによるインビボ処置の空腹時血糖および膵島インスリン含量に対する効果）
本実験の目的は、ガストリンまたはＥＧＦのどちらかのみが、最近糖尿病を発症したＮＯＤマウスにおいて、糖尿病状態を改善し得るか否かを決定することであった。非肥満糖尿病（ＮＯＤ）雌マウスを、糖尿病の発達についてモニターした（空腹時血糖ＦＢＧ＞６．６ｍｍｏｌ／ｌ）。糖尿病発症後、マウスを、以下で処置した：（ｉ）ビヒクル（ｎ＝４）、（ｉｉ）Ｅ１ １μｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｐ．によって１４日間にわたって１日１回（ｎ＝５）；（ｉｉｉ）Ｇ１ １μｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｐ．によって１４日間にわたって１日１回（ｎ＝５）。マウスには、インスリン代替処置を与えなかった。空腹時血糖レベルおよび膵臓インスリンレベルを、モニターした。Ｅ１は、５１アミノ酸のＥＧＦアナログであり、一方Ｇ１は、天然のガストリンと同じ長さであるが１５位において１つのアミノ酸置換を含むガストリンアナログである。
【００８３】
ビヒクル処置コントロール動物において、空腹時血糖（ＦＢＧ）値は、３５日後に倍になった。Ｅ１またはＧ１のどちらかで処置した動物のＦＢＧ値は、この動物モデルにおける膵島細胞の破壊の進行にもかかわらず、糖尿病発症時（０日目）に記録した値の近くで維持された。膵島細胞新生は、これらの細胞の破壊の最小限の補償で、ＥＧＦまたはガストリンによって刺激された。図７を参照のこと。膵臓インスリンレベルもまた、全ての動物において測定した。ビヒクル処置コントロールにおける膵臓インスリンレベルは、β細胞の破壊に起因して３５日で低下したが、Ｅ１またはＧ１のどちらかで処置した動物は、処置前の値と比較して、有意に高いレベルの膵臓インスリンレベルを示した。図８を参照のこと。この研究は、ＮＯＤマウスにおける最近糖尿病を発症した後のＥ１またはＧ１のどちらかによる短期（１４日間）の処置が、治療停止後少なくとも３週間にわたって、膵臓インスリン含量を上昇させ、そして糖尿病状態の進行を防ぐことを実証した。
【００８４】
（実施例８）
（マウスに移植され、インビボでガストリンおよびＥＧＦで処置されたヒト膵島移植片の特徴付け）
マウスを、ヒト膵島（２０００膵島当量）で、腎被膜下に移植し、そして高血糖刺激として、１．５ｇ／ｋｇのグルコースをＩ．Ｖ．で投与した。血液サンプルを採取し、そして上述のようにアッセイした。このデータは、血糖濃度時間経過が、ＥＧＦ／ガストリンマウスとビヒクル処置マウスにおいて同様であることを示した（図８Ａ）。しかし、同じ高血糖刺激に応答して、ＥＧＦ／ガストリン処置マウスの血漿中に放出されるヒトＣ−ペ
プチド量は、ビヒクル処置マウスの血漿中より５倍を超えて高かった（それぞれ９．２ナノモル／Ｌ／分および１．８ナノモル／Ｌ／分；図８Ａおよび図８Ｂを参照のこと）。これは、処置が、移植されたヒト膵島におけるインスリン合成の刺激において有効であったことを示す。これらのデータはまた、移植されたヒトβ細胞の機能的重量は、ガストリン／ＥＧＦ処置マウスにおいて、ビヒクル処置コントロールと比較して有意に高かったことを示す。
【００８５】
ヒト膵島移植片のインスリン含量を、移植８週後に分析した。ガストリン／ＥＧＦによる処置は、ビヒクルで処置したマウスの膵島移植片におけるインスリン含量（移植片につき１．３４±０．２１μｇ、ｐ＞０．０２；図９）または移植前膵島（移植片につき、インスリン０．７μｇ未満）と比較して、インスリン含量において有意に増加した（移植片につき２．４２±０．２８μｇ）。
【００８６】
ヒト膵島移植片の免疫細胞化学試験は、ガストリン／ＥＧＦ処置が、ビヒクルで処置したマウスにおける膵島移植片におけるβ細胞の割合（１９．６±１．２％）と比較して、膵島移植片において観察されるβ細胞の割合を上昇させる（２９．７±１．２％；図１０）ことを示した。ＥＧＦ／ガストリン処置マウスからの移植片において観察されるβ細胞の総数（４．４±０．２×１０６個のβ細胞）もまた、ビヒクル処置マウスからの移植片において観察される（２．６±０．２×１０６個のβ細胞）よりも有意に高い。ビヒクル処置マウスからの移植片と比較したガストリン／ＥＧＦ処置マウスからの移植片におけるグルカゴン発現α細胞の分析は、ガストリン／ＥＧＦ処置への応答において、細胞の割合と細胞数の両方を上昇させることを明らかにした（表４）。さらに、ＣＫ１９染色した管細胞の割合が、ガストリン／ＥＧＦ処置移植片において上昇した。これは、ＣＫ１９／２０管細胞が、膵島新生の間に膵島細胞になる前駆体集団を含む（Ｇｍｙｒ，Ｖ．ら，２００１，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４９：１６７１−８０；Ｇｍｙｒ，Ｖ．ら，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００１，１０：１０９−１２１）と考えられるため、重要である。膵島は、膵島における細胞全体の約１／５〜１／３であるように多様に見積もられる、幹細胞の集団を含む。表４はまた、ガストリン／ＥＧＦ組成物による処置において、同定された細胞の割合が、主にβ分泌細胞およびα分泌細胞の割合における増加に起因して、約５３％または５９％〜約８４％まで増加することを例証し、ガストリン／ＥＧＦ処置が、膵島における幹細胞のインスリン分泌細胞への分化を刺激することを示す。
【００８７】
移植前の膵臓と比較して、移植８週間後までに、ガストリン／ＥＧＦ処置マウスおよびビヒクル処置マウスの両方において、腺房細胞数が減少した。全体で、ガストリン／ＥＧＦ移植片における細胞構成は、ビヒクル処置（２６％）および移植前組織（２０％）と比較して、膵島分化への移動を示す（６２％の膵島細胞およびＣＫ１９細胞）。
【００８８】
【表４】
【００８９】
ガストリン／ＥＧＦでの処置は、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに移植されたヒト膵島において、インスリン陽性β細胞の増加を誘導した。図１１において、上段パネル（インタクトな膵島移植片からの細胞からのデータ）は、インスリン染色β細胞が、ガストリン／ＥＧＦ治療を施したマウスからのヒト膵島移植片において、ビヒクルを投与したマウスからの移植片におけるよりも、より豊富であったことを示す。下段パネル（単離された膵島移植片細胞からのデータ）は、免疫ペルオキシダーゼによって検出されたインスリン染色細胞の数が、ガストリン／ＥＧＦで処置されたマウスから回収されたヒト膵島移植片からの解離細胞調製物において、ビヒクル処置マウスからと比較して、ずっと大きかったことを示した。
【００９０】
マウスのガストリン／ＥＧＦによる処置は、潜在的膵島β細胞についてのマーカーの発現の量を有意に増大し、そのマーカーは、ヒト膵島細胞において、前駆体転写因子ＰＤＸ１である（図１２および図１３）。このタンパク質は、膵臓および十二指腸のホメオボックス遺伝子１（ＰＤＸ−１）によってコードされ、膵臓発生および膵島機能調節の中心であり、そしてインスリン遺伝子発現を調節する。
【００９１】
両方の図において見られるように、ＰＤＸ１およびインスリンの発現の共存もまた観察された。これらのデータは、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに移植されたヒト膵島において、ガストリン／ＥＧＦが、ＰＤＸ１発現およびβ細胞量増加を誘導することを実証する。
【００９２】
（実施例９）
（低用量のガストリン／ＥＧＦの投与は、ヒト組織の移植片において、ヒトβ細胞増殖およびインスリン分泌応答を改善する）
実施例８（前出）の手順と同様に、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを、ビヒクルまたは低用量のガストリン／ＥＧＦ（ＥＧＦ、３０μｇ／ｋｇ／日、およびガストリン、３０μｇ／ｋｇ／日、６週間にわたって、１日１回用量で、腹腔内投与で与えた）のどちらかで処置し、インスリン分泌応答を測定した。
【００９３】
高血糖刺激としてＩＶグルコース１．５ｇ／ｋｇ投与後、ガストリン／ＥＧＦ処置マウスにおいて、血糖耐性に、僅かな改善しか観察されなかった（図１３）。しかし、ビヒクル処置マウスの血漿中におけるヒトＣ−ペプチドの放出と比較して、ガストリン／ＥＧＦ処置マウスの血漿中のヒトＣ−ペプチドのより大きな放出によって証明されるように、インスリン分泌応答において有意な改善が、ことによって観察された。従って、低用量のガ
ストリン／ＥＧＦでさえも、ガストリン／ＥＧＦ処置は、ヒト膵島移植片のインスリン分泌応答において、改善をもたらす。
【００９４】
（実施例１０）
（移植およびヒト幹細胞のインスリン分泌細胞への分化）
この実験の目的は、幹細胞（例えば、樹立細胞株、臍帯、または胚に由来する幹細胞）を、糖尿病患者への移植およびガストリン／ＥＧＦ処置によるインスリン分泌細胞への分化のために、膵島移植片の代わりに使用し得るか否かを決定することである。
【００９５】
細胞株から、または臍帯からの幹細胞を、近い血縁の新生児個体（子、従兄弟、姪または甥）から入手し、そして多くのＩ型糖尿病患者のそれぞれに移植する。この実施例の反復の初回において、実施例１におけるように、幹細胞を、腎被膜下に移植する。後の反復において、移植の他の方法は、Ｉ．Ｖ．投与（例えば、門脈血管内または肝静脈内）を含む。
【００９６】
レシピエントのグループを形成し、各レシピエントグループにおける患者に、全細胞数の２５％の膵島の幹細胞含量、または膵島１つあたり約２×１０６幹細胞を使用して、約５膵島（約１０７細胞）、約５０膵島（約１０８細胞）、約１００膵島（約２×１０８細胞）、約５００膵島（約１０９細胞）、約１０００膵島（約２×１０９細胞）、または約２０００膵島（約４×１０９細胞）、における幹細胞の概数に相当する幹細胞の用量を投与した（１膵島あたりのおよその全細胞数については表４を参照のこと）。
【００９７】
各移植レシピエントグループを、さらに、ビヒクル（生理食塩水／リン酸化緩衝液）のみを投与するコントロールグループと、処置グループに分ける。全ての患者に標準的ＩＲＢ病院検閲局臨床試験同意書を与え、そして患者は、偽薬を与えられ得る試験の一部であることに同意する。処置グループに、ガストリン／ＥＧＦ組成物の用量についての標準的ヒトプロトコール（約３μｇ／ｋｇのＥＧＦ５１Ｎ、および約１００μｇ／ｋｇのｈガストリン１−１７Ｌｅｕ１５）を、ｉ．ｐ．で、１日２回ビヒクル中で与える。インスリン治療を、全てのレシピエントグループにおいて約１ヶ月続け、次いで、量を減らして（例えば、通常用量の約５０％〜８０％）提供し、同時に、血中インスリンおよび血糖の、毎日多数回のモニタリングおよび記録を行う。さらなるインスリンを、任意の患者に必要に応じて投与し、正常血糖を維持し、そして全てのインスリン用量ならびにインスリンおよびグルコースの血中濃度を、記録する。
【００９８】
終点の決定は、ガストリン／ＥＧＦ処置グループにおいて、コントロールグループにおいて必要な幹細胞の数と比較して、より少ない数の幹細胞の最初の投与は、十分なインスリンを提供し得ることを示す。
【００９９】
（実施例１１）
（培養物中に維持される単離ヒト膵島のβ細胞個体集団における、ＥＧＦ（Ｅ１）およびガストリン（Ｇ１）の効果）
この実験の目的は、ＥＧＦおよびガストリンでの処置が、インビトロで、ヒト膵島のβ細胞個体集団を増加させ得るか否か、およびどのような機構で増加させ得るかを決定することであった。膵島細胞調製物を、ヒトドナー膵臓（ｎ＝５）から単離し、そして膵島細胞移植のためのヒト膵島の調製について使用される認可プロトコール（Ｌａｋｅｙ ＪＲＴら（１９９９）Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ８：２８５−２９２，およびＲｉｃｏｒｄｉ Ｃ．ら（１９８８）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３７：４１３−４２０）に従って調製した。膵島細胞を、シャーレ１枚につき１×１０６細胞の濃度で播種し、そして無血清ＭＥＭ培地のみの中で４週間にわたって培養するか、またはＥＧＦ（０．３μｇ／ｍｌ）、ガストリン（１．０μｇ／ｍｌ）、もしくはＥＧＦ＋ガストリンの組み合わせを補充した
無血清ＭＥＭ培地中で４週間にわたって培養し、そして培養物中でさらに４週間にわたって維持した。
【０１００】
処置に先立ち、これらの膵島の細胞組成を、免疫組織化学的抗体染色で決定した。これらの組成は、以下であった：７±２％グルカゴン＋α−細胞、２３±３％インスリン＋β細胞、１７±２％ ＣＫ７＋管細胞、６±１％ ＣＫ１９＋管細胞、３３±２％アミラーゼ＋腺房細胞、および１１±１％ビメンチン＋間充織細胞（平均±ＳＥ、ドナー膵臓ｎ＝５）。４週間後、β細胞重量は、ＥＧＦ＋ガストリン（＋１２８％、ｐ＜０．００１）、およびＥＧＦ（＋７７％、ｐ＜０．０１）によって増加したが、ガストリン（−１％）またはＥＧＦもガストリンも非含有の培地（−６０％、ｐ＜０．０１）によっては増加しなかった。
【０１０１】
ＥＧＦもガストリンも添加しないさらに４週間のインキュベーションのあと、ＥＧＦ＋ガストリン処置膵島において、β細胞重量は継続して増加した（＋２４４％、ｐ＜０．００１）（図１４）。ＥＧＦ＋ガストリン処置膵島調製物はまた、ＣＫ１９＋管細胞の増加、（＋５８０％、ｐ＜０．００１）（図１５）、ならびにＣＫ１９＋管細胞における膵島転写因子であるＰＤＸ−１の発現の増加も有した（培養前にはＰＤＸ発現はなく、そしてＥＧＦ＋ガストリンと共に行った培養のたった二週間後、８２±５％ ＰＤＸ−１＋に増加した）（図１６）。ＥＧＦ＋ガストリンはまた、膵島培養物においてα−細胞の割合を増加させ、一方、ＣＫ７＋管細胞および腺房細胞の割合は、減少した。
【０１０２】
Ｅ１とＧ１との同時刺激による処置の４週間後、β細胞の割合は、ビヒクル処置コントロール培養物と比較して、有意に増加した。両ペプチドの使用中止の４週間後、インスリン陽性β細胞の数は、さらに顕著に増加した（処置開始時のβ細胞数と比較してほぼ４倍が観察された）。Ｅ１のみまたはＧ１のみで処置した細胞と比較して、両因子で処置した細胞において、有意な増加が観察された。対照的に、ビヒクル処置膵島について、８週間後、β細胞個体集団における減少が観察された。
【０１０３】
この実験の結果は、ＥＧＦとガストリンとによる併用治療が、ヒト膵島のβ細胞個体数を、インビトロで有意に増加させることを実証する。４週間後にペプチドを使用中止した後でさえ、β細胞数は、ＥＧＦとガストリンとの同時刺激により処置されていた細胞において、進行的に増加した。このことは、ＥＧＦとガストリンとの同時刺激が、β細胞個体集団における相乗的かつ長期の効果を有することを示す。
【０１０４】
さらに、ヒト膵島において、ＥＧＦは、主にＣＫ１９＋管細胞個体数（前駆体細胞）を増加させ、一方、ガストリンは、主にＣＫ１９＋管細胞におけるＰＤＸ−１発現の誘導を担うことが、見出された（図１６）。膵臓および十二指腸のホメオボックス遺伝子１（ＰＤＸ−１）によってコードされるタンパク質は、膵臓発生および膵島細胞機能の調節の中心である。ＰＤＸ−１は、インスリン遺伝子発現を調節し、そして種々の遺伝子の膵島細胞特異的遺伝子発現に関係する。
【０１０５】
これらの発見は、ＥＧＦレセプターリガンドのみ（ＴＧＦ−α）で管細胞を刺激した場合、ＥＧＦレセプターリガンドによって開始された膵島新生のプロセスを完了させるためにガストリンの存在が必須であったという、本発明者らのトランスジェニックマウスデータと一致する。
【０１０６】
これらのデータは、Ｅ１およびＧ１が、糖尿病患者におけるさらなる移植のための、ヒト膵島細胞調製物を、インビトロで増殖させるために使用され得ることを、強く示唆する。
【０１０７】
真性糖尿病は、根底にある生理学的欠損が、自己免疫プロセスに起因するβ細胞の破壊または血中高濃度のグルコースからの慢性的刺激に起因して分裂するβ細胞の能力の消耗のどちらかの結果としてのβ細胞の欠乏である疾患である。後者は、最終的に、β細胞の再生および／または置換のプロセスが、全体のβ細胞が減少しそれに伴って膵臓のインスリン含量が減少する程度まで損なわれるときの状況に導く。上記の結果は、成熟β細胞の産生を刺激し、膵臓のインスリン含量を非糖尿病レベルまで回復させることにより、ＴＧＦ−αとガストリンとの組み合わせを、糖尿病を処置するために使用し得ることを実証する。
【０１０８】
本研究は、完全な膵島細胞新生が、哺乳動物の成体膵臓の管上皮において、ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンド（例えば、ガストリン）および／またはＥＧＦレセプターリガンド（例えば、ＴＧＦ−α）での刺激により、インビボで再活性化されることを上記が実証することを、本研究は報告した。すい臓におけるＴＧＦ−αおよびガストリンの過剰発現のトランスジェニックにおける研究を報告し、その研究は、膵臓ガストリン発現の膵島発生における役割を明らかにし、ＴＧＦ−αおよびガストリンがそれぞれ、膵島発生の調節において役割を果たすことを示す。従って、残りの多能性膵臓管細胞の、成熟インスリン分泌細胞への再生分化は、この因子の組み合わせまたはこれらの膵臓内でのインサイチュ発現を提供する組成物の治療的投与による糖尿病の処置についての実行可能な方法である。
【０１０９】
２型糖尿病のＺｕｃｋｅｒラットモデルにおけるＴＧＦ−αおよびガストリンでの処置の結果は、処置グループとコントロールグループとの間に血糖レベルの有意な違いがないことを示した。このことは、恐らく、長期の絶食（１８時間）後の一過性の低血糖効果を反映している。免疫組織化学的研究は、コントロール動物と比較したＴＧＦ−αおよびガストリンで処置した動物における、インスリン含有細胞の単一の病巣の数における有意な増加を明らかにした（図３）。これらの発見は、ＴＧＦ−αおよびガストリンでの処置後の、成体ラット膵臓における単一のβ細胞の増加を実証した。興味深いことに、このような単一のβ細胞病巣は、一般に、（刺激しない）成体ラット膵臓において見られない。これらの発見は、１型および２型糖尿病における、ＴＧＦ−αおよびガストリンの治療的役割を支持する。何故なら、処置は、β細胞の新生および複製の両方を標的化するからである。
【０１１０】
本発明は、本明細書中に記載の特定の実施形態によって限定されない。上述の記載および添付の図面から明らかになる改変は、特許請求の範囲内である。
【０１１１】
種々の刊行物が、本明細書中に挙げられ、その開示は、その全体が参照として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図１は、ＰＢＳ処理（塗りつぶし黒ひし形（ｓｏｌｉｄ ｂｌａｃｋ ｄｉａｍｏｎｄ））またはＴＧＦ−αおよびガストリンを併用して、１０日にわたって毎日腹腔内（ｉ．ｐ．）処置（塗りつぶし紫四角（ｓｏｌｉｄ ｐｕｒｐｌｅ ｓｑｕａｒｅ））した、ストレプトゾトシン誘導性糖尿病Ｗｉｓｔａｒラットにおける、グルコース耐性に対するＴＧＦ−αおよびガストリンの効果を示す。
【図２】図２は、実施例４に記載のように、処置したＺｕｃｋｅｒラットの３グループにおけるβ細胞新生に対するＴＧＦ−αおよびガストリンの処置の効果を、対応するＰＢＳコントロールと共に示す（１グループあたりｎ＝６匹）。淡青色のバーは痩型ＴＦＧ＋ガストリンを表し、マゼンタのバーは肥満ＴＦＧ＋ガストリンを表し、黄色のバーは肥満ＰＢＳコントロールを表し、暗青色のバーはＴＦＧ＋ガストリン処置前を表し、そして紫のバーは痩型ＰＢＳコントロールを表す。ＴＧＦ−αおよびガストリンは、ＰＢＳ処理コントロール動物と比較して、実験した全てのグループにおいて、単一β細胞病巣の相対的比率を有意に増加させた。グループ４とグループ５とは、有意に異なり（ｐ＜０．００１５）、グループ１と２ともまた異なる（ｐ＜０．００４１）。
【図３】図３は、痩型Ｚｕｃｋｅｒラットおよび肥満Ｚｕｃｋｅｒラットにおける、β細胞新生に対するＴＧＦ−αおよびガストリンの処置の効果を示す。β細胞新生を、総β細胞および新規に産生された単一β細胞病巣の差次的計数によって定量し、そして計数した総β細胞の百分率で表す。増殖因子で併用処置した痩型Ｚｕｃｋｅｒラットにおける単一β細胞病巣の百分率は、１０．５±０．９であり、対応するＰＢＳコントロールにおける３．９±１．１（ｐ＝０．００４）と比較される（図３Ａおよび図３Ｂ）。肥満Ｚｕｃｋｅｒラットにおいては、前処置グループにおける単一β細胞病巣の百分率は、８．７±１．３であり、これに対して、対応するコントロールグループにおいては４．２±１．１であった（ｐ＝０．００１５）（図３Ｃおよび図３Ｄ）。図３Ｅは、図３Ｃの管領域（矢印で示す）の４００×拡大図であり、β細胞新生に特有の、管上皮細胞からのインスリン含有β細胞の出芽の明らかな証拠を提供する。
【図４】図４は、慢性糖尿病インスリン依存性ＮＯＤマウスにおいて、Ｇ１による処置が、空腹時血糖レベルを低下させ、そしてインスリン治療中止１４日後の死を阻止することを示す。
【図５】図５は、慢性糖尿病インスリン依存性ＮＯＤマウスにおけるＥＧＦによる処置が、空腹時血糖レベルを低下させ、そしてインスリン治療中止１４日後の死を阻止することを示す。
【図６】図６は、最近糖尿病を発症したＮＯＤマウスにおいて、Ｅ１またはＧ１のいずれかによる処置が、空腹時血糖レベルの上昇を防ぐことを示す。
【図７】図７は、最近糖尿病を発症したＮＯＤマウスにおいて、Ｅ１またはＧ１のいずれかによる処置が、膵臓インスリン含量を増加させることを示す。
【図８】図８は、糖尿病マウスにおけるＥＧＦ／ガストリン処置の結果を示す。図８Ａは、ヒト膵島を移植し、そしてガストリン／ＥＧＦで処置したＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウス（ＥＧＦ、３０μｇ／ｋｇ、およびガストリン、１０００μｇ／ｋｇ、塗りつぶし記号（ｓｏｌｉｄ ｓｙｍｂｏｌ））、またはビヒクルのみを与えたコントロールマウス（中抜き記号（ｏｐｅｎ ｓｙｍｂｏｌ））におけるグルコース耐性試験の結果を示す、一組の折れ線グラフである。これらのグラフは、縦座標に血糖（左のグラフ）または血漿ヒトＣ−ペプチド（右のグラフ）を、横軸上の時間（１２０分まで）の関数として示す。右のグラフは、ガストリン／ＥＧＦがヒト組織のインスリン分泌応答を改善することを示す。図８Ｂは、血漿中のヒトＣ−ペプチドの含量が、ＥＧＦ／ガストリン処置マウスにおいて、ビヒクル処置マウスより高いことを示す、棒グラフである。
【図９】図９は、ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスに移植されたヒト膵島のインスリン含量をμｇ／移植片で示す、棒グラフである。このＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスは、ＥＧＦ＋ガストリン（淡灰色のバー）、またはビヒクル（白色のバー）を投与されたか、あるいは膵島移植前（暗灰色バー）である。このデータは、ガストリン／ＥＧＦが、処置したＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスに移植したヒト膵島のインスリン含量を、未処置ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスのものと比べて、増加させることを示す。
【図１０】図１０は、図２のようにマウスに移植されたヒト膵島におけるβ細胞のパーセント（左のグラフ）およびβ細胞の総数（右のグラフ）の棒グラフである。このデータは、ガストリン／ＥＧＦが、処置したＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに移植したヒト膵島において、β細胞新生を刺激することを示す。
【図１１】図１１は、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスのインタクトな膵島移植片または単離された膵島移植片細胞における、インスリン陽性細胞（濃く染まっている）の一組の顕微写真である。このデータは、ガストリン／ＥＧＦが、移植されたヒト膵島のインスリン陽性β細胞の含量における増加を誘導することを示す。
【図１２】図１２は、処理した細胞におけるＰＤＸ−１発現およびインスリン発現に関する。図１２Ａは、ＰＤＸ−１染色したヒト膵島細胞、ならびにガストリン／ＥＧＦ処理細胞およびビヒクル処理細胞の各々におけるＰＤＸ−１発現およびインスリン発現の共存を示す、一組の顕微写真である。図１２Ｂは、マウスをガストリン／ＥＧＦまたはビヒクルで処置する間の、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに移植したヒト膵島内での移植８週間後のＰＤＸ−１発現を示す棒グラフである。
【図１３】図１３は、ヒト膵島を移植され、低用量のガストリン／ＥＧＦ（ＥＧＦ、３０μｇ／ｋｇ、およびガストリン、３０μｇ／ｋｇ；四角記号）またはビヒクル（丸記号）で処置したＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおける、縦軸に示した血糖含量（左のパネル）または血漿ヒトＣ−ペプチド（右のパネル）についてグルコース耐性試験の結果を、横軸上に時間（１２０分まで）の関数として示す、一組の折れ線グラフである。このデータは、ガストリン／ＥＧＦが、低用量でさえ、ヒト組織のインスリン分泌応答を改善することを示す。
【図１４】図１４の説明なし。
【図１５】図１５の説明なし。
【図１６】図１６の説明なし。
【技術分野】
【０００１】
（導入）
（発明の分野）
本発明は、一般に、膵島前駆体細胞および成熟膵島細胞を得るための方法の、細胞生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、ガストリンレセプターリガンドおよびＥＧＦレセプターリガンドの１つまたは両方を提供することによる、膵島前駆体細胞に関連する１つ以上のマーカーを発現するヒト幹細胞または他の膵島前駆体細胞の機能的膵臓β細胞に方向付けられた分化、およびこの細胞を、膵臓疾患（真性糖尿病を含む）の処置を必要とする個体におけるこの疾患の処置において使用するための方法に関する。本方法は、（ａ）ヒト膵島細胞に、インビトロでガストリンレセプターリガンドを提供してこの細胞の移植前にインスリン産生を刺激する工程であって、この細胞には、必要に応じて、ＥＧＦレセプターリガンドが提供されて細胞数が増える工程、ならびに（ｂ）糖尿病についてのマウスモデル系において、ヒト膵島細胞の移植と、ガストリンレセプターリガンドおよびＥＧＦレセプターリガンドの１つまたは両方でインビボで処置し、移植された膵島細胞の増殖を促進しかつこの細胞によるインスリン産生を促進することとの組み合わせを使用する糖尿病のインビボでの処置により、例示される。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
糖尿病は、全ての年齢層および全ての集団にわたる、最も一般的な内分泌疾患の１つである。臨床的罹患率（ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）および臨床的死亡率に加え、糖尿病の経済費用は巨大であり、米国のみで年間９００億＄を超える。そして、糖尿病の有病率は、２０１０年までに２倍を超えて増加することが予測される。
【０００３】
真性糖尿病の２つの主要な形態が存在する：インスリン依存性（１型）真性糖尿病（ＩＤＤＭ）（全ての症例の５％〜１０％にのぼる）、およびインスリン非依存性（２型）真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）（症例のおよそ９０％を構成する）。２型糖尿病は、加齢と関連するが、ＮＩＤＤＭと診断される若い人々（いわゆる若年者の成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ））の数の増加傾向がある。１型および２型の両方の場合において、膵臓におけるβ細胞の破壊またはインスリンの不完全分泌またはインスリンの不完全産生を介して、インスリン分泌が減少する。ＮＩＤＤＭにおいて、患者は、代表的に、最適な食事、体重減少および運動のレジメンに従って、治療を開始する。薬物治療は、これらの手段が適切な代謝調節をもはや提供しなくなったときに開始される。最初の薬物治療としては、β細胞インスリン分泌を刺激するスルホニル尿素が挙げられるが、ビグアニド、βグルコシダーゼインヒビター、チアゾリデンジオンおよび併用治療もまた、挙げられ得る。しかし、２型糖尿病で作動する疾患メカニズムの進行性の性質を制御することが難しいことは、注目に値する。薬物処置した全ての糖尿病の５０％超が、投与された薬物に関わりなく、６年以内に芳しくない血糖制御を示す。インスリン治療は、多くの人から、２型糖尿病の処置における最後の手段と考えられており、そして、インスリンの使用に抵抗を覚える患者がいる。糖尿病の合併症としては、網膜、腎臓および神経における微小血管に影響するもの（微小血管合併症）、ならびに心臓、脳、および下肢に供給する大血管に影響するもの（大血管（ｍａｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ）合併症）が挙げられる。糖尿病微小血管合併症は、２０〜７４歳の人々における新規の失明の主な原因であり、そして網膜疾患の末期の新規の症例全ての３５％を含める。６０％を超える糖尿病患者が、神経障害によって影響を受ける。糖尿病は、主に糖尿病大血管疾患の結果として、米国における全ての非外傷性切断術の５０％を含む、そして糖尿病患者は、非糖尿病者の２．５倍の冠動脈疾患由来死亡率を有する。高血糖は、糖尿病大血管合併症の進行を開始し、加速すると考えられる。種々の
現行の処置レジメンの使用は、高血糖を適切には制御し得ず、従って、糖尿病合併症の進行を妨げも低減させもしない。
【０００４】
膵島は、胎児小管膵臓上皮に存在する内胚葉幹細胞から発達し、この胎児小管膵臓上皮はまた、外分泌膵臓へと発達する多能性幹細胞も含む。ＴｅｉｔｅｌｍａｎおよびＬｅｅ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２１：４５４−４６６（１９８７）；ＰｉｃｔｅｔおよびＲｕｔｔｅｒ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｓ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｒ．Ｏ．ＧｒｅｅｐおよびＥ．Ｂ．Ａｓｔｗｏｏｄ編（１９７２），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，２５−６６頁。膵島の発達は、胎児の妊娠の間、別個の発生段階を通して進み、これは、劇的な移行によって中断される。最初の期間は、多能性幹細胞の膵島細胞系列への方向付けによって特徴付けられる、始原分化状態（ｐｒｏｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｓｔａｔｅ）であり、始原分化細胞によるインスリンおよびグルカゴンの発現によって明らかになる。これらの始原分化細胞は、方向付けられた膵島前駆体細胞の集団を含み、この集団は、膵島特異的遺伝子産物を低レベルでのみ発現し、成熟膵島細胞の細胞分化を欠失する。ＰｉｃｔｅｔおよびＲｕｔｔｅｒ（前出）。マウスの妊娠１６日目頃、原始分化膵臓は、膵島細胞の細胞分化および膵島特異的遺伝子発現の数百倍の上昇によって特徴付けられる迅速な増殖期および分化期を開始する。組織学的には、膵島形成（新生）は、膵管からの増殖性膵島芽として明らかになる（膵島細胞症）。生まれる直前、膵島増殖速度は低下し、そして膵島新生および膵島細胞症は、ずっと目立たなくなる。これに伴い、膵島は、最高レベルのインスリン遺伝子発現を伴う、完全に分化した段階に到達する。従って、多くの器官に類似して、細胞性分化の完了は、再生能の低下を伴う；分化した生体の膵臓は、発生中の膵臓と同じ再生能も増殖能も有さない。
【０００５】
始原分化前駆体の分化は、膵臓の胎児発生後期の間に起こるため、膵島分化を調節する因子は、この時期の間の膵臓において発現されるようである。膵島発生の間に発現される遺伝子の１つは、胃腸管系のペプチドであるガストリンをコードする。ガストリンは、成体において酸分泌を調節する胃のホルモンとして作用するが、胎児におけるガストリン発現の主要部位は、膵島である。ＢｒａｎｄおよびＦｕｌｌｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２６３：５３４１−５３４７（１９８８）。膵島におけるガストリンの発現は、一過性である。これは、始原分化膵島前駆体が、分化した膵島を形成する期間に限定される。膵島発生における膵臓ガストリンの重要性は未知であるが、幾つかの臨床観察は、この膵島発生におけるガストリンの法則を、以下のように示唆する。例えば、ガストリン発現膵島細胞腫瘍および萎縮症胃炎によって引き起こされる高ガストリン血症は、分化段階の胎児膵島において見られるのと同様に、膵島細胞症に付随する。Ｓａｃｃｈｉ，ら，Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈｉｖ Ｂ，４８：２６１−２７６（１９８５）；およびＨｅｉｔｚら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２６：６３２−６４２（１９７７）。さらに、膵臓ガストリンの異常な持続が、乳児膵島細胞症の症例において考証されている。Ｈｏｌｌａｎｄｅら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，７１：２５１−２６２（１９７６）。しかし、どちらの観察も、膵島細胞症とガストリン刺激との間に樹立された因果関係ではなかった。
【０００６】
従って、膵島細胞の増殖および／または再生を刺激する薬剤を同定することは、初期ＩＤＤＭの処置における使用およびＮＩＤＤＭにおけるβ細胞欠損の予防における使用のために重要である。
【０００７】
（関連文献）
３つの増殖因子が、胎児膵臓の発生に関与する：ガストリン、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）および上皮増殖因子（ＥＧＦ）（ＢｒａｎｄおよびＦｕｌｌｅｒ
，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：５３４１−５３４７）。ＴＧＦ−αまたはガストリン単独を過剰発現するトランスジェニックマウスは、活性な膵島細胞増殖を実証しなかったが、両方の導入遺伝子を発現するマウスは、有意に増加した膵島細胞の量を示した（Ｗａｎｇら（１９９３）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９２：１３４９−１３５６）。ＢｏｕｗｅｎｓおよびＰｉｐｅｌｅｅｒｓ（１９９８）Ｄｉａｂｅｔｏｌｉｇｉａ ４１：６２９−６３３は、正常成体ヒト膵臓において出芽β細胞が高い割合で存在すること、および全β細胞の１５％が単一の単位として見出されたことを報告する。単一β細胞の病巣は、成体（未刺激）ラットの膵臓において、通常はみられない；Ｗａｎｇら（（１９９５）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ３８：１４０５−１４１１）は、全β細胞数の約１％の頻度を報告する。
【０００８】
被包性膵島移植後の１型糖尿病患者におけるインスリン非依存が、Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇら（１９９４）Ｌａｎｃｅｔ ３４３：９５０−５１において記載される。Ｓａｓａｋｉら（１９９８年６月１５日）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６５（１１）：１５１０−１５１２；Ｚｈｏｕら（１９９８年５月）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２７４（５
Ｐｔ １）：Ｃ１３５６−１３６２；Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇら（１９９０年６月）Ｐｏｓｔｇｒａｄ Ｍｅｄ ８７（８）：１３３−１３４；Ｋｅｎｄａｌｌら（１９９６年６月）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ ２２（３）：１５７−１６３；Ｓａｎｄｌｅｒら（１９９７年６月）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６３（１２）：１７１２−１７１８；Ｓｕｚｕｋｉら（１９９８年１月）Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ７（１）：４７−５２；Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇら（１９９３年６月）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０（１２）：５８４３−５８４７；Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇら（１９９２年１１月）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５４（５）：７６９−７７４；Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇら（１９９２年１０月）ＡＳＡＩＯ Ｊ ３８（４）：８５１−８５４；Ｂｅｎｈａｍｏｕら（１９９８年６月）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ ２４（３）：２１５−２２４；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎら（１９９４年１２月）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ７９（６）：１５６１−１５６９；Ｆｒａｇａら（１９９８年４月）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６５（８）：１０６０−１０６６；Ｋｏｒｓｇｒｅｎら（１９９３）Ｕｐｓ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ９８（１）：３９−５２；Ｎｅｗｇａｒｄら（１９９７年７月）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉｚ ４０（補遺）２：Ｓ４２−Ｓ４７もまた、参照のこと。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
真性糖尿病または膵臓の他の疾患を、その処置を必要とする患者において処置するための方法および組成物が、提供される。この方法および組成物において、膵島細胞再生および／または膵島細胞新生を刺激するために、ガストリンレセプターリガンドおよびＥＧＦレセプターリガンドの１つまたは両方が提供される。この組成物は、増殖性膵島細胞の集団を含有し、この集団は、細胞の集団を単離し、そして１つ以上の膵臓分化剤を前駆体細胞に提供して機能的膵島β細胞の集団を得る方法によって、得られる。必要に応じて、前駆体細胞はまた、概して分化剤による処置の前に、集団における細胞の数を増加させるために、１つ以上の細胞増殖剤が提供される。好ましくは、細胞の集団は、膵島前駆体細胞に関連する１つ以上のマーカーを発現する膵島前駆体細胞のより高い割合を含むように富化されており、これにより、機能的膵島β細胞の表現型特性（β細胞の形態的特徴、β細胞特有の表面マーカーを発現すること、ならびに膵臓機能に重要な酵素活性および生合成活性を有することが挙げられる）を有する細胞を高い割合で有する。膵臓分化剤組成物は、ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンド（例えば、ガストリン）を、膵島前駆体細胞を成熟インスリン分泌細胞に分化させるために十分な量で、含有する。細胞増殖剤組成物は、１つ以上の上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプターリガンドを、前駆体細胞の増殖を刺激す
るために十分な量で含有する。必要に応じて、これらの薬剤の両方は、増殖工程および分化工程の一方または両方で使用され得る。処置の方法は、未分化前駆体細胞を宿主動物に移植して、インビボで、膵臓分化剤を単独でまたは細胞増殖剤と組み合わせてのいずれかで提供する工程、あるいはエキソビボで１つまたは両方のいずれかのリガンドを提供した後で機能的膵島β細胞を宿主動物に移植する工程の、どちらかを包含する。この系は、種々の適用（例えば、薬物スクリーニング、および（特に糖尿病の）臨床処置と関連した膵臓機能の補充）のための機能的膵島β細胞の供給源を提供する。
上記に加えて、本発明は、以下を提供する：
（項目１）
複数の機能的成熟β細胞を含む哺乳動物膵臓細胞を得るための方法であって、該方法は、以下：
少なくとも１つのガストリンレセプターリガンドを、該前駆体哺乳動物膵臓細胞の分化を達成するために十分な量で有する、該前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団を提供する工程であって、該前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団は、前駆体哺乳動物膵臓細胞に関連する少なくとも１つのマーカーを発現する細胞において富化され、それにより、複数の機能的成熟β細胞が得られる工程、
を包含する、方法。
（項目２）
前記マーカーがＣＫ１９である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団が、前駆体哺乳動物膵臓細胞に関連する少なくとも１つのマーカーを発現する細胞において、ＦＡＣＳによって富化される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団が、複数の幹細胞または管上皮細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記幹細胞が、臍帯、胚、および樹立幹細胞株からなる群から選択される１つ以上の供給源由来である細胞を含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
１つ以上の膵島が、前記管上皮細胞を含む、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団が、不死化されている、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団が、前記前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団の増殖を達成するために十分な量の少なくとも１つのＥＧＦレセプターリガンドと共に提供される、項目１に記載の方法。
（項目９）
複数の機能的成熟β細胞を含む哺乳動物膵臓細胞集団を得るための方法であって、該方法は、以下：
前駆体哺乳動物膵臓細胞に関連する少なくとも１つのマーカーを発現する前駆体哺乳動物膵臓細胞の集団を、該前駆体哺乳動物膵臓細胞の分化を達成するために十分な量の、少なくとも１つのガストリンレセプターリガンドと共に提供する工程であって、該細胞の約１０％〜約２０％が、該マーカーを発現し、それにより、複数の機能的成熟β細胞が得られる工程、
を包含する、方法。
（項目１０）
前記細胞が、機能的成熟β細胞の前記集団の、約２倍〜約５倍までの増殖を誘導するために十分な量の、少なくとも１つのＥＧＦレセプターリガンドと共に提供される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
増殖が、約３倍〜約４倍である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記提供が、インビトロであり、前記ＥＧＦレセプターリガンドの前記量が、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１．０μｇ／ｍｌであり、そして前記ガストリンレセプターリガンドの前記量が、約０．５μｇ／ｍｌ〜３μｇ／ｍｌである、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記提供が、インビトロであり、前記ＥＧＦレセプターリガンドの前記量が、約０．２μｇ／ｍｌ〜約０．５μｇ／ｍｌであり、そして前記ガストリンレセプターリガンドの前記量が、約０．６μｇ／ｍｌ〜約１．５μｇ／ｍｌである、項目９に記載の方法。
（項目１４）
前記複数の機能的成熟β細胞が、ＰＤＸ−１を発現する、項目９に記載の方法。
（項目１５）
前駆体哺乳動物膵臓細胞が、ヒト細胞またはブタ細胞である、項目９に記載の方法。
（項目１６）
前記ガストリンレセプターリガンドが、ヒトガストリン１−１７／Ｌｅｕ１５である、項目９に記載の方法。
（項目１７）
前記ＥＧＦレセプターリガンドが、ヒトＥＧＦ５１Ｎである、項目１０に記載の方法。
（項目１８）
以下：
複数の増殖性成熟膵臓β細胞を含む細胞培養物であって、該増殖性膵臓β細胞が、少なくとも１つのガストリンレセプターリガンドおよび少なくとも１つのＥＧＦレセプターリガンドを提供する方法によって得られ、ここで、該細胞培養物は、ＣＫ１９管細胞において富化され、そしてガストリンレセプターリガンドおよびＥＧＦレセプターリガンドと共に提供されない細胞と比較した場合、ＰＤＸ−１の発現が増加する、細胞培養物
を、含有する組成物。
（項目１９）
ＣＫ１９を発現する前駆体細胞を、少なくとも２０％含むように富化された、哺乳動物膵臓前駆体細胞の集団。
（項目２０）
膵島細胞分化を刺激する化合物をスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下：
哺乳動物膵臓前駆体細胞の集団を、該化合物および必要に応じて少なくとも１つのＥＧＦレセプターリガンドと共に提供する工程；および
ＰＤＸ−１の発現を、該化合物が膵島細胞分化を達成する指標として検出する工程、
を、包含する、方法。
【００１０】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、真性糖尿病および他の変性膵臓障害の処置を必要とする患者において、ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンド（例えば、ガストリン）および／またはＥＧＦレセプターリガンド（例えば、ＴＧＦ−αもしくはＥＧＦ）、あるいは両方の組み合わせを、膵島前駆体細胞の成熟インスリン分泌細胞への分化をもたらすために十分な量で提供することにより、真性糖尿病および他の変性膵臓障害を処置するための方法および組成物を提供する。この組成物が全身的に投与される場合、一般に注射によって、好ましくは静脈内に、生理学的に受容可能なキャリア中で提供される。この組成物がインサイチュで発現される場合、膵島前駆体細胞は、エキソビボまたはインビボのどちらかで、発現ベクター内の１つ以上の核酸発現構築物によって形質転換され、この核酸発現構築物は、膵島前駆体細胞において、所望のレセプターリガンドの発現を提供する。例として、発現構築物は、ＣＣＫレセプターリガンド（例えば、発現後にガストリンへとプロセシングされるプレプロ
ガストリン（ｐｒｅｐｒｏｇａｓｔｒｉｎ）ペプチド前駆体コード配列）またはＥＧＦレセプターリガンド（例えば、ＴＧＦ−α）についてのコード配列を、膵島前駆体細胞における発現を提供する転写調節領域および翻訳調節領域と共に含む。転写調節領域は、構成的であって、または例えば、インスリン遺伝子由来の転写調節領域のように、細胞内グルコース濃度の上昇によって誘導されてもよい。形質転換は、任意の適切な発現ベクター（例えば、アデノウイルス発現ベクター）を使用して実行される。エキソビボで形質転換が実行される場合、形質転換された細胞は、例えば、腎被膜を使用して、糖尿病患者に移植される。
【００１１】
あるいは、膵島細胞は、エキソビボで、糖尿病患者への移植前に、膵島内の前駆体膵臓β細胞の数を増加させるために、十分な量のガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドおよび／またはＥＧＦレセプターリガンドで処理される。要求に応じ、エキソビボ増殖後、前駆体膵臓β細胞の集団を、これらを少なくともガストリンレセプターリガンドに接触させることにより、移植前に培養物中で分化させる。増殖および／または分化が、移植前または移植後のどちらで行われようと、細胞は、膵島前駆体細胞についての１つ以上のマーカーを保有する細胞（例えば、幹細胞またはＣＫ １９を発現する管細胞）について、処理前に必要に応じて富化される。
【００１２】
本発明は、糖尿病患者についての現存する処置レジメンを超える利点を提供する。成熟膵臓細胞を刺激して再生させる手段を提供することにより、従来の薬物治療（２型）またはインスリン治療（１型および２型）の必要を減らすかまたはなくしさえするのみならず、正常血糖レベルの維持はまた、糖尿病のより衰弱性の合併症のうち幾つかを軽減し得る。膵島組織または他の膵島前駆体細胞の増殖および分化の１つまたは両方を、特により大きな膵島前駆体細胞の集団を含むために前駆体細胞集団を富化することと共に、移植前または移植後に使用することにより、移植に必要な不足している膵島数を低下させる手段を提供する。さらに、移植に使用される細胞集団の可変性が本発明の方法によって低下するだけでなく、移植された細胞の機能特性の再現性が上昇する。本発明の別の利点は、免疫拒絶を、例えば、ブタ膵島の異種移植によって低下させ得ることである。
【００１３】
本明細書中において使用される場合、用語「ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンド」とは、ガストリン／ＣＣＫレセプターを刺激する化合物を包含する。このようなガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドの例としては、種々の形態のガストリン（例えば、ガストリン３４（ビッグガストリン）、ガストリン１７（リトルガストリン）、およびガストリン８（ミニガストリン））；種々の形態のコレシストキニン（例えば、ＣＣＫ ５８、ＣＣＫ ３３、ＣＣＫ ２２、ＣＣＫ １２およびＣＣＫ ８）；ならびに単独またはＥＧＦレセプターリガンドと組み合わせた、成熟膵臓において細胞の分化を誘導してインスリンを分泌する膵島細胞を形成させる、他のガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドが挙げられる。上記のものの活性なアナログ、フラグメントおよび他の改変物のペプチドアゴニストおよび非ペプチドアゴニストの両方、または部分アゴニスト（ガストリン／ＣＣＫレセプター（例えば、Ａ７１３７８（Ｌｉｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５８（４ Ｐｔ １）：Ｇ６４８，１９９０））を含む）もまた企図され、これは、単独でまたはＥＧＦレセプターリガンドと組み合わせて、成熟膵臓における細胞の分化を誘導して、インスリンを分泌する膵島細胞を形成させる。特に興味深いのは、１５位でメチオニンの代わりに置換されたロイシンを有するガストリン誘導体である。米国特許第１０／０４４，０４８号（２００２年７月２５日公開）を、参照のこと。この開示は、本明細書中で参考として援用される。ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドはまた、内因性のガストリン、コレシストキニンまたは同様に活性なペプチドの、組織貯蔵部位からの分泌を増加させる化合物を包含する。これらの例は、ペプチド（例えば、ＥＧＦならびにそのアナログおよびフラグメント）、ならびに、非ペプチド低分子（例えば、オメプラゾール（これは、胃酸の分泌を阻害し、そして／またはガストリン／ＣＣＫレセプターの数を増加させる）、
およびダイズトリプシンインヒビター（これは、ＣＣＫ刺激を増加させる））である。
【００１４】
本明細書で使用する場合、用語「ＥＧＦレセプターリガンド」は、同じ組織または隣接する組織、あるいは同じ個体のガストリン／ＣＣＫレセプターも刺激される場合に、インスリン産生膵島細胞の新生が誘導されるようなＥＧＦレセプターを刺激する化合物を包含する。ガストリン／ＣＣＫレセプターの刺激は、ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドの提供によって直接的になされ得るか、または例えば、インビボで内因性および／または外因性の因子により、胃酸分泌を阻害することによって間接的になされ得る。ＥＧＦレセプターリガンドの例としては、ＥＧＦ１−５３、ならびにそのフラグメントおよび活性なアナログ（ＥＧＦ１−４８、ＥＧＦ１−５２、ＥＧＦ１−４９を含む）が挙げられる。例えば、米国特許第５，４３４，１３５号を参照のこと。目的の他のアナログとしては、Ｘの長さのアミノ酸配列を有するＥＧＦが挙げられ、Ｘは、少なくとも４８でかつ５３を超えない整数であり、このような配列は、（ｉ）ヒトＥＧＦの１位からヒトＥＧＦのＸ−１位までのアミノ酸配列の一部分と実質的に相同であり、そして（ｉｉ）Ｘ位に、ヒトＥＧＦにおいて見出されるアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有する。特に興味深いものは、ヒトＥＧＦのアナログであり、ここでＸは５１であり、そしてＸ位のアミノ酸残基は、グルタミン酸以外（例えば、中性アミノ酸、疎水性アミノ酸、または荷電アミノ酸）である。Ｘが５１である場合、目的の置換としては、アスパラギン、グルタミン、アラニン、およびセリンが挙げられる（２００３年５月１５日公開のＰＣＴ／ＵＳ０２／２３３０９７を参照のこと。この開示は、本明細書中で参考として援用される）。ＥＧＦレセプターリガンドの他の例としては、ＴＧＦ−αレセプターリガンド（１〜５０）ならびにそのフラグメントおよび活性なアナログ（１〜４８、１〜４７および他のＥＧＦレセプターリガンド（例えば、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）およびポックスウイルス増殖因子、ならびにガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドと同じ相乗活性を実証する、他のＥＧＦレセプターリガンド）が挙げられる）が、挙げられる。これらは、上記のものの活性なアナログ、フラグメントおよび他の改変物を含む。さらなる背景として、ＣａｒｐｅｎｔｅｒおよびＷａｈｌ，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ（ＳｐｏｒｎおよびＲｏｂｅｒｔｓ編）の第４章，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，（１９９０）を参照のこと。
【００１５】
本発明の主な局面は、真性糖尿病の処置を必要とする個体に、ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドおよび／またはＥＧＦレセプターリガンドを膵島前駆体細胞の成熟インスリン分泌細胞への分化を達成するために十分な量で含有する組成物を提供することによって、この個体において真性糖尿病を処置するための方法である。このようにして分化した細胞は、膵管における残留潜在型膵島前駆体細胞である。１つの実施形態は、好ましくは全身的に、分化を再生させる量のガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドおよびＥＧＦレセプターリガンド（好ましくは、置換ＥＧＦ−５１のようなＥＧＦ）を、単独または併用して、この個体に投与することを包含する。
【００１６】
糖尿病の処置はまた、精製した膵島または膵島前駆体細胞の移植を必要とする患者への、これらの移植によって達成され得る。移植のための細胞は、一般に、ドナー膵臓から得られるかまたは幹細胞（例えば、臍帯、胚または樹立培養幹細胞株から得られる）である。細胞は、器官（例えば、膵臓、腎臓または肝臓）への直接注射のような経路によって移植され得る。あるいは、細胞は、静脈内投与によって投与され、例えば、細胞は、例えば、門脈への経皮的経肝臓的注射によって、門脈または肝静脈に投与される。この細胞を、ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドおよび／またはＥＧＦレセプターリガンドを用いて、移植後（移植後の細胞に提供することによって）または移植前のどちらかで増殖させ得、そして／または機能的膵島細胞へと分化させ得る。
【００１７】
膵島前駆体細胞をエキソビボで分化させる場合、幹細胞または移植された膵臓組織のど
ちらであっても、膵臓組織を移植する前の以下の分化工程または増殖工程のどちらかのために、部分的または完全に分離された細胞に解離し得、宿主哺乳動物を刺激し得る。
【００１８】
移植された膵臓組織を分化増強組成物に接触させる前または接触させると同時に、細胞の集団、特に移植組織における膵島前駆体細胞を、十分な量のＥＧＦレセプターリガンドをガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドと併用してまたは併用せずに提供して有糸分裂誘発を誘導することにより、増殖させ得る。必要に応じて、移植膵臓組織を、まず膵島前駆体細胞（特に膵島前駆体細胞または管上皮細胞に関連するマーカータンパク質（例えばＣＫ１９、ネスチン、ＣＫ７、ＣＫ８、ＣＫ１８、炭酸脱水酵素ＩＩ、ＤＵ−ＰＡＮ２、炭水化物抗原１９−９およびムチンＭＵＣ１）を発現する細胞）内で富化し得る。必要に応じて、不死化膵島前駆体細胞が、当業者に公知の方法（例えば、ｈＴＥＲＴによる形質転換）を使用して調製され得る。このような細胞を、ＥＧＦレセプターリガンドでエキソビボで増殖させ得、次いで、移植の前に、ガストリンレセプターリガンドで刺激して、完全な成熟膵島細胞への分化過程を、インビボまたはエキソビボで完了させ得る。
【００１９】
別の実施形態において、ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンド刺激は、このような前駆体細胞に、トランスジェニックで導入したキメラインスリンプロモーター−ガストリン融合遺伝子構築物の発現によって引き起こされる。別の実施形態において、ＥＧＦレセプターリガンド刺激は、哺乳動物にトランスジェニックで導入したＥＧＦレセプターリガンド遺伝子の発現によって引き起こされる。ＥＧＦ遺伝子の配列は、米国特許第５，４３４，１３５号において提供される。
【００２０】
別の実施形態において、ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドおよびＥＧＦレセプターリガンドによる刺激は、哺乳動物に安定的に導入された、（ｉ）プレプロガストリンペプチド前駆体遺伝子と、（ｉｉ）ＥＧＦレセプターリガンド遺伝子との同時発現によって引き起こされる。
【００２１】
別の局面において、本発明は、このような細胞を、ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドとＥＧＦレセプターリガンドとの組み合わせで刺激することによって、哺乳動物の膵島前駆体細胞の分化を引き起こすための方法に関する。この局面の好ましい実施形態において、ガストリン刺激は、哺乳動物に安定的に導入されたプレプロガストリンペプチド前駆体遺伝子の発現によって引き起こされる。この発現は、インスリンプロモーターの制御下である。ＥＧＦレセプターリガンド（例えば、ＴＧＦ−α）刺激は、哺乳動物にトランスジェニックで導入されたＥＧＦレセプターリガンド遺伝子によって達成され得る。上記の促進において、ガストリンおよびＴＧＦ−αによる刺激は、好ましくは、哺乳動物に導入された、（ｉ）プレプロガストリンペプチド前駆体遺伝子と、（ｉｉ）ＥＧＦレセプターリガンドとの同時発現によって影響を及ぼされる。遺伝子の転写を指示し得る適切なプロモーターとしては、ウイルスプロモーターおよび細胞性プロモーターの両方が挙げられる。ウイルスプロモーターとしては、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１： ５２１−５３０）、ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら（１９８１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４−８６４）およびアデノウイルス２由来の主要な後期プロモーター（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１３０４−１３１９９）が、挙げられる。好ましくは、ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンド遺伝子およびＥＧＦレセプターリガンド遺伝子の１つまたは両方の発現は、インスリンプロモーターの制御下である。
【００２２】
本発明の別の局面は、核酸構築物である。この構築物は、プレプロガストリンペプチド前駆体をコードする核酸配列と、プレプロガストリンペプチド前駆体をコードする配列の転写を支持するのに効果的である、５’からのインスリン転写調節配列とを含む。好まし
くは、インスリン転写調節配列は、少なくとも１つのインスリンプロモーターを含む。好ましい実施形態において、プレプロガストリンペプチド前駆体をコードする核酸配列は、ヒトガストリン遺伝子のエキソン２およびエキソン３、ならびに必要に応じてイントロン１およびイントロン２をも含む、ポリヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
本発明の別の実施形態は、（ｉ）哺乳動物ＥＧＦレセプターリガンド（例えば、ＴＧＦ−α）をコードする核酸配列およびその転写調節配列；ならびに（ｉｉ）プレプロガストリンペプチド前駆体をコードする核酸配列およびその転写調節配列を含む、発現カセットである。好ましくは、ＥＧＦレセプターリガンドの転写調節配列は、強い組織非特異的プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）である。好ましくは、プレプロガストリンペプチド前駆体の転写調節配列は、インスリンプロモーターである。この実施形態の好ましい形態は、プレプロガストリンペプチド前駆体をコードする核酸配列は、ヒトガストリン遺伝子のイントロン１およびイントロン２ならびにエキソン２およびエキソン３を含むポリヌクレオチド配列を、含む。
【００２４】
本発明の別の局面は、プレプロガストリンペプチド前駆体コード配列を含む、発現カセットを含むベクターに関する。このベクターは、プラスミド（例えば、ｐＧｅｍ１）であり得るか、またはインスリンプロモーターを含む転写調節配列を有するファージであり得る。
【００２５】
本発明の別の局面は、（１）強い組織非特異的プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）の制御下に哺乳動物ＥＧＦレセプターリガンド（例えば、ＴＧＦ−αレセプターリガンド）をコードする核酸配列を有し；そして、インスリンプロモーター制御下にプレプロガストリンペプチド前駆体コード配列を有する、ベクターの組成物に関する。この局面において、各ベクターは、プラスミド（例えば、プラスミドｐＧｅｍ１）またはファージであり得る。あるいは、発現カセットまたはベクターはまた、適切な組織栄養機能を有するウイルスベクターにも挿入され得る。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスなどが挙げられる。Ｂｌｏｍｅｒら（１９９６）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５ Ｓｐｅｃ．Ｎｏ：１３９７−４０４；およびＲｏｂｂｉｎｓら（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：３５−４０を、参照のこと。アデノウイルス媒介性遺伝子治療は、首尾よく使用され、嚢胞性線維症を有する患者の鼻腔上皮の塩素輸送欠損を一時的に治している。Ｚａｂｎｅｒら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６を参照のこと。
【００２６】
本発明の別の局面は、安定的に組み込まれた遺伝子を発現可能な、非ヒト哺乳動物または哺乳動物組織（細胞を含む）であり、この組み込まれた遺伝子は、プレプロガストリンをコードする。この局面の別の実施形態は、（ｉ）プレプロガストリンペプチド前駆体遺伝子；および／または（ｉｉ）非ヒト哺乳動物、哺乳動物組織または哺乳動物細胞に安定的に組み込まれたＥＧＦレセプターリガンド（例えば、ＴＧＦ−α遺伝子）を同時発現可能な、非ヒト哺乳動物である。哺乳動物組織または哺乳動物細胞は、ヒト組織またはヒト細胞であり得る。
【００２７】
（治療投与および治療組成物）
投与様式としては、経皮経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。この化合物は、任意の便利な経路（例えば、上皮または粘膜裏層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜または腸管粘膜など）を通して吸収される、注入またはボーラス注射）で投与され得、そして、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与され得る。投与は、好ましくは、全身的である。
【００２８】
本発明はまた、薬学的組成物も提供する。このような組成物は、治療的有効量の、治療的かつ薬学的受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアとしては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが上げられるが、これらに限定されない。処方物は、投与様式に適するべきである。薬学的受容可能キャリアおよび本発明における使用のための処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，第１７版（１９８５）（本明細書中で参考として援用される）において見出される。薬物送達のための方法の簡潔な総説については、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００２９】
本発明の薬学的組成物の調製において、本発明の組成物を改変し、その薬物動態学および体内分布を変えることが望ましい。薬物動態学の一般的考察については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出，第３７〜３９章を、参照のこと。薬物動態学および体内分布を変えるための多くの方法が、当業者に公知である（例えば、Ｌａｎｇｅｒ，前出を参照のこと）。このような方法の例としては、タンパク質、脂質（例えば、リポソーム）、炭水化物、または合成ポリマーのような物質からなる小胞中での薬剤の保護が挙げられる。例えば、本発明の薬剤は、その薬物動態学および体内分布特性を拡大するために、リポソーム内に組み込まれ得る。リポソームを調製するために、種々の方法が使用可能である。これらの方法は、例えば、Ｓｚｏｋａら（１９８０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、および同第４，８３７，０２８号（これら全ては本明細書中で参考として援用される）に記載される。種々の他の送達系が公知であり、本発明の治療物（例えば、微小粒子、微小カプセルなど）を投与するために使用され得る。
【００３０】
この組成物はまた、所望される場合、微量の湿潤剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝化剤を含有し得る。この組成物は、液体溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性処方物、または散剤であり得る。この組成物は、従来の結合剤およびキャリア（例えば、トリグリセリド）を用いて、座剤として処方され得る。経口処方物は、標準的キャリア（例えば、薬学等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含有し得る。
【００３１】
好ましい実施形態において、この組成物は、慣用的手順（例えば、ヒトへの静脈内投与に適した薬学的組成物）に従って処方される。代表的に、静脈内投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、この組成物はまた、溶解補助剤および注射の部位でのあらゆる痛みを緩和する局所麻酔を含有し得る。一般に、成分は、例えば、密封容器内の凍結乾燥粉末または水非含有濃縮物（例えば、アンプルまたはサシェ（ｓａｃｈｅｔｔｅ）（活性薬剤の質を表す））として、別々に供給されるか、または単位投薬形態中に混合して供給されるかのどちらかである。組成物が注入によって投与されるべきである場合、組成物は、無菌薬学等級の水または生理食塩水を含む注入瓶で投与され得る。組成物が注射で投与される場合、注射のための滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得、成分が投与前に混合され得る。
【００３２】
本発明の治療物は、中性形態または塩形態で処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、遊離のアミノ基で形成される（例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する）塩、および遊離のカルボキシル基で形成される（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、および他の二価カチオン、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する）塩が、挙げられる。
【００３３】
本発明の治療物の、特定の障害または症状を処置するために効果的な量は、障害または症状の性質に依存し、標準的臨床技術によって決定され得る。処方物中に使用される正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重篤度にも依存し、そして臨床医の判断および各患者の環境に従って決定されるべきである。しかし、静脈内投与の適切な用量範囲は、ＥＧＦレセプターリガンドについては一般に体重１ｋｇあたり活性化合物約０．０１〜５００μｇであり、ガストリンレセプターリガンドについては一般に体重１ｋｇあたり活性化合物０．１〜５０００μｇである。有効用量は、インビトロ試験系または動物モデル試験系からの用量応答曲線から外挿され得る。座剤は、一般に、０．５重量％〜１０重量％の範囲の活性成分を含有し、経口処方物は、好ましくは１０％〜９５％の活性成分を含有する。
【００３４】
本発明の遺伝子治療方法において、インビボトランスフェクションは、治療物転写ベクターまたは治療物発現ベクターの哺乳動物宿主への、脂質キャリア（特にカチオン性脂質キャリア）と混合した裸の（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡまたはウイルスベクターへ挿入したＤＮＡ（例えば、組換えアデノウイルス）のどちらかとしての導入によって得られる。哺乳動物宿主への導入は、幾つかの経路（静脈内注射経路または腹腔内注射経路、気管内経路、くも膜下腔内経路、非経口経路、関節内経路、鼻腔内経路、筋肉内経路、局所的経路、経皮経路、任意の粘膜表面への適用、角膜導入（ｃｏｒｎｅａｌ ｉｎｓｔａｌｌａｔｉｏｎ）など）のいずれかによってなされ得る。特に興味深いのは、循環体液内または体の開口部もしくは体腔への治療物発現ベクターの導入である。従って、静脈内投与およびくも膜下腔内投与は、特に興味深い。なぜなら、ベクターは、このような経路の後に広範に散在し得、そしてエアロゾル投与は、体の開口部または体腔への導入による使用を見出すからである。特定の細胞および組織が、投与経路および投与部位に基づいて標的化され得る。例えば、血流の方向の注射の位置に近接した組織は、任意の特定の標的化の非存在下でトランスフェクトされ得る。脂質キャリアが使用される場合、これらは、部位特異的分子を使用して、細胞の特定の型の複合体を目指すように改変され得る。従って、特定のレセプターまたは他の細胞表面タンパク質についての抗体またはリガンドが、特定の表面タンパク質に関連する標的細胞に使用され得る。
【００３５】
任意の生理学的に受容可能な媒体（例えば、上述のように薬学的組成物のために、投与の経路に依存して、脱イオン水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、水中５％デキストロースなど）が、ＤＮＡ、組換えウイルスベクターまたは脂質キャリアを投与するために使用され得る。他の成分（例えば、緩衝液、安定剤、殺生剤など）が、処方物中に含有され得る。これらの成分は、文献において広範な例証を見出しており、ここで特に記載する必要はない。避けるべき複合体の凝集を引き起こすなんらかの希釈剤または希釈剤の成分としては、高濃度の塩、キレート剤などが挙げられる。
【００３６】
使用される治療物ベクターの量は、標的組織内における発現の治療レベルを提供するために十分な量である。発現の治療レベルは、血糖を正常レベルに減少するために十分な発現量である。加えて、使用される核酸ベクターの用量は、インビボの導入組織において、導入遺伝子発現の所望のレベルを生成するために十分でなければならない。他のＤＮＡ配列（例えば、アデノウイルスＶＡ遺伝子）は、投与媒体に含有され得、そして目的の遺伝子に同時トランスフェクトされ得る。アデノウイルスＶＡ遺伝子産物をコードする遺伝子の存在は、所望される場合、発現カセットから転写されるｍＲＮＡの翻訳を有意に増大し得る。
【００３７】
多くの因子が、トランスフェクトされた組織における発現の量に影響し、従って発現のレベルを改変して、特定の目的に合わせるために使用され得る。高レベルの発現が所望される場合、全ての因子を最適化し得、より少ない発現が所望される場合、１つ以上のパラ
メータを変えて所望の発現レベルを達成し得る。例えば、高い発現が治療濃度域を超える場合、最適条件未満を使用し得る。
【００３８】
組換え遺伝子の発現のレベルおよび組織は、上述のように、ｍＲＮＡレベル、および／またはポリペプチドもしくはタンパク質のレベルにおいて決定され得る。遺伝子産物は、組織におけるその生物学的活性を測定することによって定量され得る。例えば、タンパク質活性は、上述のイムノアッセイ、生物学的アッセイ（例えば、血糖）、または免疫染色技術（例えば、遺伝子産物または発現カセット内に存在するレポーター遺伝子産物を特異的に認識する抗体での探索）によるトランスフェクトされた細胞の遺伝子産物の同定によって、測定され得る。
【００３９】
代表的に、治療カセットは、患者のゲノム内に組み込まれない。必要な場合、処置は、達成された結果に依存して、非定型に繰り返され得る。処置が繰り返される場合、患者をモニターし、処置に有害な免疫応用または他の有害応答が存在しないことを確認し得る。
【００４０】
本発明はまた、膵臓β細胞の集団をインビトロで増殖するための方法を提供する。適切なドナーからの膵臓の単離に基づき、細胞を単離してインビトロで増殖させる。使用される細胞は、哺乳動物ドナー由来の組織サンプル（ヒト死体、ブタ胎児、または他の適切な膵臓細胞供給源が挙げられる）から得られる。ヒト細胞が使用される場合、可能であれば、細胞は、レシピエントに合った組織適合性が高い。細胞の精製は、単離した膵臓の酵素（例えば、コラゲナーゼ）分解後の、勾配分離によって達成され得る。精製した細胞を、細胞を生存させるために十分な栄養、およびインスリン分泌膵臓β細胞を形成するために十分な量のβ細胞増殖誘導組成物（ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドおよびＥＧＦレセプターリガンドを含む）を含有する培地内で増殖する。本発明に従って、刺激後、インスリン分泌膵臓β細胞を、培養物中で直接増殖し、その後移植を必要とする患者に移植し得るか、または、β細胞増殖誘導組成物による処置後、直接移植し得る。
【００４１】
移植の方法は、得られたインスリン分泌膵臓β細胞を、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン）と共にその移植を必要とする患者に移植する工程を包含する。インスリン産生細胞はまた、移植前に、半透性膜中にカプセル化され得る。このような膜は、カプセル化細胞からのインスリン分泌を許容し、一方で、細胞を免疫攻撃から保護する。移植するべき細胞の数は、患者１ｋｇあたりインスリン産生β細胞が１０，０００個と２０，０００個との間で見積もられる。繰り返しの移植が、インスリン分泌細胞の治療的有効数を維持するために、必要に応じて要求され得る。本発明に従い、移植レシピエントはまた、移植されたインスリン分泌β細胞の増殖を誘導するために、十分な量のガストリン／ＣＣＫレセプターリガンドおよびＥＧＦレセプターリガンドを提供され得る。
【００４２】
糖尿病の処置の効果を、以下のように評価し得る。可能であれば、処置様式の生物学的効力および臨床的効力の両方を、評価する。例えば、疾患はそれ自体、血糖増加により発現し、従って、例えば、評価した血糖の正常値への回帰を観察することにより、処置の生物学的効力は評価され得る。臨床的効力（すなわち、効果の基礎を成す処置が疾患の経過の変化において有効であるか否か）を測定することは、より難しくあり得る。生物学的効力の評価は、臨床的効力の代用評価項目として貢献するが、決定的ではない。従って、たとえば６ヶ月の期間後のβ細胞再生の指標を与え得る臨床的終末点の測定は、処置レジメンの臨床的効力の指標を与え得る。
【００４３】
本組成物は、１つ以上の手順で使用のためのキットとして提供され得る。遺伝的治療のためのキットは、通常、ミトコンドリア標的配列ペプチドを有するかもしくは有さない裸のＤＮＡとして、組換えウイルスベクターとしてかまたは脂質キャリアと混合されるかのどちらかで、治療的ＤＮＡ構築物を含む。さらに、脂質キャリアは、提供されるＤＮＡと
混合するために、別の容器中に提供され得る。このキットは、使用前にさらに希釈され得る濃縮物（凍結乾燥組成物を含む）としての有効な薬剤か、または使用する濃度で提供され得る有効な薬剤のどちらかを含有する組成物を含み、バイアルは、１回以上の用量を含み得る。好都合なことに、キットにおいて単回用量は、滅菌バイアル中で提供され得、従って、医師は、バイアルが所望の量および濃度の薬剤を有する場合、バイアルを直接使用し得る。バイアルが、直接使用のための処方物を含む場合、通常、本方法と共に使用するための他の試薬は必要ない。このようなキットは、医薬品または生物学製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって定められた形態の通知（この医薬品または生物学製品の製造、使用または販売を規制する機関により、ヒト投与のための認可を反映する）に沿い得る。
【００４４】
以下の実施例は、例証の目的で提供され、限定の目的で提供されない。
【実施例】
【００４５】
（方法）
以下の方法が、別に述べない限り、以下に示す実施例において使用された。
【００４６】
（動物）
通常の飼料を適宜与え、水を自由に摂らせた正常なＷｉｓｔａｒラットおよびＺｕｃｋｅｒラットを、各実験の開始の一週間前に順応させた。体重１ｋｇあたり８０ｍｇの用量の新しく調製したストレプトゾトシンを、糖尿病の誘導の５日〜７日後に静脈内（Ｉ．Ｖ．）投与し、ラットを、その後の処理のためのグループに無作為に割り当てた。実施例１〜４において、ＴＧＦ−αおよびラットガストリンを、０．１％ＢＳＡ含有の滅菌正常食塩水中で再構築した。別々の実験についての所定の処置計画に従い、各動物に、ＴＧＦ−αもしくはガストリンを単独（４．０μｇ／ｋｇ体重）または１：１（ｗ／ｗ）混合物（計８．０μｇ／ｋｇ体重）での、あるいはＰＢＳの、単回の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を毎日１０日間の間与えた。
【００４７】
雌ＮＯＤマウスを、特定の病原体非含有条件下で餌を与え、無処理雌ＮＯＤマウスにおいてそして９８％の糖尿病発生率を得るように、適切に世話した。ＮＯＤ糖尿病マウスを、ＦＢＧによる糖尿についての毎朝の試験（１０週齢で開始）によって、糖尿病発生についてモニターした。糖尿が出た場合、空腹時血糖レベル（ＦＢＧ）を測定し、２日連続のＦＢＧ＞６．６ｍｍｏｌ／ｌを、糖尿病と定義した。最近発症したＮＯＤモデルについて（実施例７）、糖尿病マウスを、代表的に１４〜１８週で、使用のために選択した。慢性的ＮＯＤモデルについて、糖尿病マウスを、代表的に２５週齢で、使用のために選択した（ＦＢＧレベルは、代表的に３０ｍＭを超えた）（実施例５および６）。実施例８および実施例９における雌ＮＯＤ−ＳＣＩＤ（免疫不全（ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）と組み合わせた免疫不全切断（ｉｍｍｕｎｏｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｓｅｖｅｒ）マウスの処置を、マウスが５〜７週齢のときに行った。実施例８〜９において、マウスを、一般に、移植直後から始めて６〜８週間、３０μｇ／ｋｇのヒト変異体ＥＧＦ（５１アミノ酸残基を有し、５１位の残基はアスパラギンである）（出願番号第１０／０００，８４０に記載）、および３０〜１０００μｇ／ｋｇのヒトガストリンアナログであるｈＧａｓｔｒｉｎ１−１７Ｌｅｕｌ５の各用量を、生理食塩水／リン酸緩衝液中で、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって１日２回投与することにより、処置した。
【００４８】
（血糖）
処置期間の終わりに動物を、一晩絶食させ、そして静脈内（ｉ．ｖ．）または腹腔内（ｉ．ｐ．）のグルコース耐性試験を行った。絶食被験体からの血液サンプルを収集し、そしてグルコース注射後の異なった時間にサンプルを収集した。サンプルを、血糖濃度について分析し、次いで、必要な場合、特異的ラジオイムノアッセイによるヒトインスリンＣ
ペプチドレベルのアッセイのために調製した。このアッセイは、マウス由来のＣペプチドに対し、無視できる交差反応性を有した。
【００４９】
（組織インスリン分析）
各研究の最後に、動物を屠殺し、そして膵臓およびヒト膵島移植片（移植した場合）を取り出し、重さを量った。
【００５０】
小さな生検を、膵臓組織の全体に渡って別々の代表部位から取り、そして免疫組織化学測定、タンパク質測定、およびインスリン測定のために、液体窒素中で直ちに急速凍結した。急速凍結した膵臓サンプルを、迅速に融解し、脱イオン水中で超音波的に崩壊させて、アリコートをタンパク質測定のために取り、ホモジネートを酸／エタノール抽出に供した後でＲＩＡによってインスリン測定を行い、そして総膵島含量を計算した。
【００５１】
ヒト膵島移植片を、凍結し、抽出してインスリン含量をイムノアッセイによってアッセイするか、または、組織学的分析のためにホルマリン中で固定した。ヒト膵島移植片を、分析のために採取し、酸／エタノール中で抽出して、インスリン含量をイムノアッセイによってアッセイした。
【００５２】
（免疫組織化学分析）
ヒト膵島移植片を、採取し、解離させて細胞調製物とし、これをインスリン、グルカゴン、アミラーゼおよびサイトケラチン（ＣＫ）７およびＣＫ １９のそれぞれについて特異的な抗体で免疫染色した。免疫組織化学技術を、Ｓｕａｒｅｚ−Ｐｉｎｚｏｎ ＷＬら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４９：１８１０−１８１８，２０００）中に記載のように行った。移植組織および細胞調製物における各別々の細胞型の割合およびインスリン含量を、染色スライドおよびコード化スライドを計数することによって決定した。各スライドは、１サンプルにつき少なくとも１２，０００個の細胞を含み、そして各スライドを少なくとも３連で、明視野顕微鏡下で１００×液浸系対物レンズを使用して、実施した。１回の調製につき少なくとも６，０００個の細胞を計数し、そして計数を、目隠しコード様式で２回繰り返した。数値を、移植前に、移植細胞調製物中の換算値と比較した。
【００５３】
（ヒト膵島調製物および移植）
ヒト膵島を、上述したように、ヒトドナーの膵臓組織から以下のように調製した。ヒト膵臓からの膵島を、脳死した器官ドナーから、親族のインフォームドコンセントの下に得て単離した。病院の人間倫理委員会が組織獲得および実験的プロトコールを認可している。ドナーからの膵臓摘出および膵島単離手順を、Ｌａｋｅｙ ＪＲＴら（１９９９）Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ８：２８５−２９２、およびＲｉｃｏｒｄｉ Ｃ．ら（１９８８）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３７：４１３−４２０に従って行った。
【００５４】
ヒト膵島を、腎被膜下移植により、非糖尿病ＮＯＤ／マウスに移植した（２０００膵島当量）。代表的に、１人のヒトドナー膵臓を、約１０〜１２匹のマウスに移植するために使用した。
【００５５】
（実施例１）
（正常ラットにおけるＴＧＦ−αおよびガストリンでのインビボ処置の膵臓インスリン含量に対する効果）
この実験を、ＴＧＦ−α、ガストリン、またはＴＧＦ−αおよびガストリンの組み合わせで処置した非糖尿病動物における膵臓インスリン含量に対する効果を、コントロール動物（無処理）と比較して調べるために、設計した。正常Ｗｉｓｔａｒラットのグループ（ｎ＝５）を、以下の４つの処置グループの１つに割り当てた。
【００５６】
グループＩ：ＴＧＦ−α；組換えヒトＴＧＦ−αを、０．１％ＢＳＡ含有の滅菌生理食塩水中で再構築し、一日あたり０．８μｇの用量で１０日間、ｉ．ｐ．投与した。
【００５７】
グループＩＩ：ガストリン：合成ＲａｔガストリンＩを、かなり希釈した水酸化アンモニウム中に溶解し、そして０．１％ ＢＳＡ含有滅菌生理食塩水中で再構築した。これをｉ．ｐ．で、一日あたり０．８μｇの用量で１０日間投与した。
【００５８】
グループＩＩＩ：ＴＧＦ−α＋ガストリン：上記調製物の組み合わせを、ｉ．ｐ．で、上記の用量レベルで１０日間、投与した。
【００５９】
グループＩＶ：コントロール動物に、ビヒクルのみのｉ．ｐ．注射を１０日間与えた。
【００６０】
実験期間（１０日間）の最後に、全ての動物を屠殺し、そして膵臓のサンプルを以下のように得た：膵臓組織の５つの生検標本（１〜２ｍｇ）を、各ラット膵臓における別々の代表部位から得、そしてインスリン含量の分析のために液体窒素中で直ちに急速凍結した。膵臓インスリン含量の分析のために、急速凍結膵臓サンプルを迅速に融解し、蒸留水中で超音波的に崩壊させ、アリコートをタンパク質測定のために取り、そして酸／エタノール抽出して、その後インスリンラジオイムノアッセイを行った（Ｇｒｅｅｎら，（１９８３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３２：６８５−６９０）。膵臓インスリン含量値を、タンパク質含量に従って補正し、そして最後にμｇインスリン／ｍｇ膵臓タンパク質で表した。全ての値を、平均＋／−ＳＥＭで計算し、そして統計学的有意性を、スチューデント２サンプルｔ検定を使用して評価した。
【００６１】
【表１】
【００６２】
上の表１に示されるように、膵臓インスリン含量は、ＴＧＦ−α＋ガストリン処置動物において、コントロール動物と比較して有意に増加した（ｐ＝０．００７）；コントロール動物と比較して、膵臓インスリン含量においておよそ３倍の増加があった。これらのデータは、ＴＧＦ−αおよびガストリンの組み合わせは、機能的膵島β細胞容量を増加させるという仮定を支持する。この増加は、β細胞肥大（β細胞個々のサイズの増大）よりもむしろβ細胞過形成（数の増加）の全体条件を反映する。
【００６３】
（実施例２）
（糖尿病動物における、ＴＧＦ−αおよびガストリンの組み合わせによるインビボ処置の膵臓インスリン含量に対する効果）
この実験を、ＴＧＦ−αおよびガストリンの組み合わせが、糖尿病（ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処理）動物において、膵臓インスリン含量のレベルを正常（ＳＴＺ無処理）動物のレベルと比較して、増加し得るか否かを決定するために設計した。
【００６４】
正常Ｗｉｓｔａｒラットに、８０ｍｇ／Ｋｇ体重の用量のＳＴＺの単回Ｉ．Ｖ．注射を与えた。ＳＴＺのこの用量は、実験動物を糖尿病にするが、これらは機能的であるが減少した重量のβ細胞を保持することを確認することを意図した。ＳＴＺを、投与の直前に、氷冷した１０ｍＭクエン酸緩衝液に溶解した。この動物を、毎日モニターした；持続性の糖尿病を、糖尿によって示し、そして非空腹時血糖測定によって確認した。糖尿病導入の一週間後、ラットを無作為に２つのグループ（ｎ＝６）に以下のように割り当てた。
【００６５】
グループＩ：ＴＧＦ−α＋ガストリン：ＳＴＺ糖尿病ラットを、組換えヒトＴＧＦ−αと合成ラットガストリン１との組み合わせの単回のｉ．ｐ．注射により処置した；両方の調製物を、０．８μｇ／日の用量で１０日間投与した。
【００６６】
グループＩＩ：コントロール：ＳＴＺ糖尿病ラットに、ビヒクルのみのｉ．ｐ．注射を、１０日間与えた。
【００６７】
実験期間の最後に、全ての動物を屠殺し、そして膵臓のサンプルを採取して、実施例１に記載のように分析した；この結果を、表２に示す。
【００６８】
【表２】
【００６９】
ＳＴＺによる糖尿病の導入は成功し、そして中程度であるが持続性の高血糖を生じた。完全なインスリン欠損（ｉｎｓｕｌｉｎｏｐａｅｎｉａ）は見出されなかったため、従って、実験動物は、機能的であるが、重量の減少したβ細胞を保持していることを確認した。
【００７０】
上の表２において示されるように、コントロールストレプトゾトシン処置動物の膵臓インスリン含量は、ＳＴＺによるβ細胞の破壊の結果として、正常ラットの１／３未満であった（２０．６±６．０ｍｇインスリン／ｍｇタンパク質、上の表１参照）。ＴＧＦ−αとガストリンとの組み合わせで処置したＳＴＺ動物において、膵臓インスリン含量は、ＳＴＺのみを与えた動物の４倍を超え、正常ラットと統計的に同一であった（例えば、上の表１を参照）。
【００７１】
（実施例３）
（ＳＴＺ誘導性糖尿病動物における、ＴＧＦ−αおよびガストリンによるインビボ処置のＩＰＧＴＴに対する効果）
ＳＴＺ誘導性糖尿病Ｗｉｓｔａｒラットの２つのグループ（平均体重１０３ｇ）（ｎ＝６／グループ）を、ＴＧＦ−αとガストリンとの組み合わせまたはＰＢＳのどちらかのｉ．ｐ．注射により、１０日間毎日処置した。空腹時血糖を、全てのラットについて、０日目、６日目および１０日目に測定した。このインスリンが分泌されかつ機能的であること
を証明するため、ＩＰＧＴＴ試験を行った。１０日目に、腹腔内グルコース耐性試験（ＩＰＧＴＴ）を、一晩の絶食後に行った。血液サンプルを、２ｇ／ｋｇ体重の用量のｉ．ｐ．グルコース注射の前および３０分後、６０分後および１２０分後に、尾静脈から得た。血糖測定を、上記のように行った。血糖レベルは、時間０において両実験グループにおいて同様であったが、ｉ．ｐ．グルコースを与えた３０分後、６０分後、および１２０分後において、ＴＧＦαおよびガストリン処置ラットは、コントロールラットと比較して、血糖値の５０％低下を示した（図１）。
【００７２】
（実施例４）
（糖尿病傾向の動物におけるＴＧＦ−αおよびガストリンの体重上昇およびインスリン含量に対する効果）
Ｚｕｃｋｅｒラットを、３０日齢で、肥満の発達の約１０日〜１５日に得た。糖尿病傾向のＺｕｃｋｅｒラット（遺伝子型ｆａ／ｆａ、肥満および糖尿病について常染色体劣勢変異体）の他に、痩型非糖尿病の同腹仔（遺伝子型＋／＋）もまた、以下に記載するように実験に含めた。このラットを、肥満および糖尿病の発達について、体重および血糖レベルの測定により、毎日モニターした。Ｚｕｃｋｅｒラットにおける糖尿病の発症は、通常、４５〜５０日の間に開始し、血糖レベルにおける同齢の痩型コントロールのレベルと比較した有意な上昇によって、確認した。
【００７３】
各５匹のラットの５つのグループを含めた実験を、表３において記載する。グループ１およびグループ２（痩型、非糖尿病）を、それぞれＴＧＦ−αとガストリンとの組み合わせまたはＰＢＳで、０日目から１０日目まで処置した。グループ３、グループ４およびグループ５は、肥満、初期糖尿病Ｚｕｃｋｅｒラット、遺伝子型ｆａ／ｆａを含んだ。グループ３に、糖尿病の発症前に組み合わせ前処置を１５日間（−１５日〜０日）与え、そして糖尿病発症後さらに１０日間（０日目〜１０日目）与え続けた。グループ４を、ＴＧＦ−αおよびガストリンで、糖尿病の発症後１０日間処置し、そしてグループ５を、同じ期間にわたってＰＢＳで処置した。実験の最後に、ラットを屠殺し、膵臓を摘出した。小さな生検を、上述のように、別々の代表部位からタンパク質およびインスリンの測定のために採取した。
【００７４】
肥満糖尿病の、前処置したＺｕｃｋｅｒラット、処置のみをしたＺｕｃｋｅｒラット、または生理食塩水処置したＺｕｃｋｅｒラットにおける体重増加（表３におけるグループ３、グループ４およびグループ５）は、グループの間で任意の相違を示さなかった。ＴＧＦ−α＋ガストリンによる延長した処置（２５日、グループ３）でさえ、正常体重増加における効果がなかったことを述べることは、特に興味深い。誤差限度内で、体重増加は、全てのグループにおいて同一である。
【００７５】
肥満Ｚｕｃｋｅｒラットにおける空腹時血糖に対するＴＧＦ−α＋ガストリン処置の効果を、対応するＰＢＳコントロールと比較した。空腹時血糖は、１５日目まで有意に上昇し（４．０±０．６対５．０±０．２）、そしてこの時点を、ＴＧＦ−α＋ガストリンまたはＰＢＳコントロールで処置する１０日間処置の開始時期をして選択した。空腹時血糖レベルは、ＴＧＦ−α＋ガストリン処置またはＰＢＳにより、有意に変化しなかった。空腹時血糖値は、増殖因子またはＰＢＳで処置しようとするまいと、肥満動物と比較して、痩型においてより低かった。
【００７６】
これらの結果を、下の表３および図２に示す。
【００７７】
【表３】
【００７８】
（実施例５）
（慢性インスリン依存性糖尿病のＮＯＤマウスにおけるガストリンによるインビボ処置の空腹時血糖に対する用量依存性効果）
この実験の目的は、慢性インスリン依存性糖尿病のＮＯＤマウスにおいてガストリンのみで重篤な高血糖の発達および死を防ぎ得るか否かを決定することであった。慢性インスリン依存性糖尿病のインスリン治療で維持されたＮＯＤマウスを、以下で処置する、異なった処理グループに分配した：（ｉ）ビヒクル（ｎ＝４）；（ｉｉ）Ｇ１ １μｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｐ．によって２８日間にわたって１日２回（ｎ＝４）；（ｉｉｉ）Ｇ１ ５μｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｐ．によって２８日間にわたって１日２回（ｎ＝４）；（ｉｖ）Ｇ１
１０μｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｐ．によって２８日間にわたって１日２回（ｎ＝４）。インスリン治療を、Ｇ１による処置開始から１４日後に停止した。Ｇ１は、天然のガストリン分子と同じ長さであるが、１５位においてｍｅｔからｌｅｕへの１つのアミノ酸置換を含む、１７ａａガストリンアナログである。
【００７９】
０日から１４日まで、動物を、インスリン治療で維持し、全ての処置グループについて、空腹時血糖（ＦＢＧ）値は、１０μｇ／ｋｇ／日のＧ１で処置したグループ（ＦＢＧの減少を示した）を除き、０日目に記録したレベルの近くで維持された。２８日目（インスリン治療中止１４日後）に、ビヒクルグループの全ての動物は、糖尿病性ケトアシドーシス（ＤＫＡ）で死亡した。何故なら、これら全てのマウスは、完全にインスリン注射に依存していたからである。しかし、Ｇ１で処置した全てのマウスは、インスリン処置無しで２週間生き延びた。１μｇ／ｋｇ／日のＧ１で処置したマウスの空腹時血糖レベルは高いままだったが、Ｇ１の用量の増加に対応して、空腹時血糖レベルが低下した（それぞれ、５μｇ／ｋｇ／日および１０μｇ／ｋｇ／日）。図４を参照のこと。これらのデータは、ガストリンによる処置は、慢性的糖尿病インスリン依存性ＮＯＤマウスにおいて、インスリン治療の使用無しで、有意にグルコース制御を改善することを示す。
【００８０】
（実施例６）
（慢性的インスリン依存性糖尿病のＮＯＤマウスにおけるＥＧＦによるインビボ処置の空腹時血糖に対する用量依存的効果）
この実験の目的は、慢性的インスリン依存性糖尿病のＮＯＤマウスにおいて、ＥＧＦが、重篤な高血糖の発達および死亡を防ぎ得るか否か、そして膵臓インスリン含量を増加し得るか否かを決定することである。慢性的インスリン依存性糖尿病のインスリン治療で維持されたＮＯＤマウスを、以下で処置する、異なった処理グループに分配した：（ｉ）ビヒクル（ｎ＝４）；（ｉｉ）Ｅ１ ０．２５μｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｐ．によって２８日間
にわたって１日２回（ｎ＝４）；（ｉｉｉ）Ｅ１ １μｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｐ．によって２８日間にわたって１日２回（ｎ＝４）；（ｉｖ）Ｅ１ ３μｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｐ．によって２８日間にわたって１日２回（ｎ＝４）。インスリン治療を、Ｅ１による処置開始から１４日後に停止した。Ｅ１は、５１アミノ酸のＥＧＦアナログである。
【００８１】
０日から１４日まで、動物を、インスリン治療で維持し、Ｅ１で処置した全てのグループについて、空腹時血糖（ＦＢＧ）値は、用量の増加に依存して低下した。２８日目（インスリン治療中止１４日後）に、ビヒクルグループの全ての動物は、糖尿病性ケトアシドーシス（ＤＫＡ）で死亡した。何故なら、これら全てのマウスは、完全にインスリン注射に依存していたからである。対照的に、Ｅ１で処置した全てのＮＯＤマウスは、インスリン処置無しで２週間生き延びた。加えて、Ｅ１処置グループについてのＦＢＧの減少は、０．２５μｇ／ｋｇ／日のＥ１で処置したグループ（２８日目でＦＢＧが上昇したままだった）を除き、２週間前に観察されたレベルで安定し続けた。図５を参照のこと。これらのデータは、ＥＧＦによる処置は、慢性的糖尿病インスリン依存性ＮＯＤマウスにおいて、インスリン治療の使用無しで、有意にグルコース制御を改善することを示す。
【００８２】
（実施例７）
（最近糖尿病を発症したＮＯＤマウスにおける、ガストリンまたはＥＧＦによるインビボ処置の空腹時血糖および膵島インスリン含量に対する効果）
本実験の目的は、ガストリンまたはＥＧＦのどちらかのみが、最近糖尿病を発症したＮＯＤマウスにおいて、糖尿病状態を改善し得るか否かを決定することであった。非肥満糖尿病（ＮＯＤ）雌マウスを、糖尿病の発達についてモニターした（空腹時血糖ＦＢＧ＞６．６ｍｍｏｌ／ｌ）。糖尿病発症後、マウスを、以下で処置した：（ｉ）ビヒクル（ｎ＝４）、（ｉｉ）Ｅ１ １μｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｐ．によって１４日間にわたって１日１回（ｎ＝５）；（ｉｉｉ）Ｇ１ １μｇ／ｋｇ／日、ｉ．ｐ．によって１４日間にわたって１日１回（ｎ＝５）。マウスには、インスリン代替処置を与えなかった。空腹時血糖レベルおよび膵臓インスリンレベルを、モニターした。Ｅ１は、５１アミノ酸のＥＧＦアナログであり、一方Ｇ１は、天然のガストリンと同じ長さであるが１５位において１つのアミノ酸置換を含むガストリンアナログである。
【００８３】
ビヒクル処置コントロール動物において、空腹時血糖（ＦＢＧ）値は、３５日後に倍になった。Ｅ１またはＧ１のどちらかで処置した動物のＦＢＧ値は、この動物モデルにおける膵島細胞の破壊の進行にもかかわらず、糖尿病発症時（０日目）に記録した値の近くで維持された。膵島細胞新生は、これらの細胞の破壊の最小限の補償で、ＥＧＦまたはガストリンによって刺激された。図７を参照のこと。膵臓インスリンレベルもまた、全ての動物において測定した。ビヒクル処置コントロールにおける膵臓インスリンレベルは、β細胞の破壊に起因して３５日で低下したが、Ｅ１またはＧ１のどちらかで処置した動物は、処置前の値と比較して、有意に高いレベルの膵臓インスリンレベルを示した。図８を参照のこと。この研究は、ＮＯＤマウスにおける最近糖尿病を発症した後のＥ１またはＧ１のどちらかによる短期（１４日間）の処置が、治療停止後少なくとも３週間にわたって、膵臓インスリン含量を上昇させ、そして糖尿病状態の進行を防ぐことを実証した。
【００８４】
（実施例８）
（マウスに移植され、インビボでガストリンおよびＥＧＦで処置されたヒト膵島移植片の特徴付け）
マウスを、ヒト膵島（２０００膵島当量）で、腎被膜下に移植し、そして高血糖刺激として、１．５ｇ／ｋｇのグルコースをＩ．Ｖ．で投与した。血液サンプルを採取し、そして上述のようにアッセイした。このデータは、血糖濃度時間経過が、ＥＧＦ／ガストリンマウスとビヒクル処置マウスにおいて同様であることを示した（図８Ａ）。しかし、同じ高血糖刺激に応答して、ＥＧＦ／ガストリン処置マウスの血漿中に放出されるヒトＣ−ペ
プチド量は、ビヒクル処置マウスの血漿中より５倍を超えて高かった（それぞれ９．２ナノモル／Ｌ／分および１．８ナノモル／Ｌ／分；図８Ａおよび図８Ｂを参照のこと）。これは、処置が、移植されたヒト膵島におけるインスリン合成の刺激において有効であったことを示す。これらのデータはまた、移植されたヒトβ細胞の機能的重量は、ガストリン／ＥＧＦ処置マウスにおいて、ビヒクル処置コントロールと比較して有意に高かったことを示す。
【００８５】
ヒト膵島移植片のインスリン含量を、移植８週後に分析した。ガストリン／ＥＧＦによる処置は、ビヒクルで処置したマウスの膵島移植片におけるインスリン含量（移植片につき１．３４±０．２１μｇ、ｐ＞０．０２；図９）または移植前膵島（移植片につき、インスリン０．７μｇ未満）と比較して、インスリン含量において有意に増加した（移植片につき２．４２±０．２８μｇ）。
【００８６】
ヒト膵島移植片の免疫細胞化学試験は、ガストリン／ＥＧＦ処置が、ビヒクルで処置したマウスにおける膵島移植片におけるβ細胞の割合（１９．６±１．２％）と比較して、膵島移植片において観察されるβ細胞の割合を上昇させる（２９．７±１．２％；図１０）ことを示した。ＥＧＦ／ガストリン処置マウスからの移植片において観察されるβ細胞の総数（４．４±０．２×１０６個のβ細胞）もまた、ビヒクル処置マウスからの移植片において観察される（２．６±０．２×１０６個のβ細胞）よりも有意に高い。ビヒクル処置マウスからの移植片と比較したガストリン／ＥＧＦ処置マウスからの移植片におけるグルカゴン発現α細胞の分析は、ガストリン／ＥＧＦ処置への応答において、細胞の割合と細胞数の両方を上昇させることを明らかにした（表４）。さらに、ＣＫ１９染色した管細胞の割合が、ガストリン／ＥＧＦ処置移植片において上昇した。これは、ＣＫ１９／２０管細胞が、膵島新生の間に膵島細胞になる前駆体集団を含む（Ｇｍｙｒ，Ｖ．ら，２００１，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４９：１６７１−８０；Ｇｍｙｒ，Ｖ．ら，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００１，１０：１０９−１２１）と考えられるため、重要である。膵島は、膵島における細胞全体の約１／５〜１／３であるように多様に見積もられる、幹細胞の集団を含む。表４はまた、ガストリン／ＥＧＦ組成物による処置において、同定された細胞の割合が、主にβ分泌細胞およびα分泌細胞の割合における増加に起因して、約５３％または５９％〜約８４％まで増加することを例証し、ガストリン／ＥＧＦ処置が、膵島における幹細胞のインスリン分泌細胞への分化を刺激することを示す。
【００８７】
移植前の膵臓と比較して、移植８週間後までに、ガストリン／ＥＧＦ処置マウスおよびビヒクル処置マウスの両方において、腺房細胞数が減少した。全体で、ガストリン／ＥＧＦ移植片における細胞構成は、ビヒクル処置（２６％）および移植前組織（２０％）と比較して、膵島分化への移動を示す（６２％の膵島細胞およびＣＫ１９細胞）。
【００８８】
【表４】
【００８９】
ガストリン／ＥＧＦでの処置は、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに移植されたヒト膵島において、インスリン陽性β細胞の増加を誘導した。図１１において、上段パネル（インタクトな膵島移植片からの細胞からのデータ）は、インスリン染色β細胞が、ガストリン／ＥＧＦ治療を施したマウスからのヒト膵島移植片において、ビヒクルを投与したマウスからの移植片におけるよりも、より豊富であったことを示す。下段パネル（単離された膵島移植片細胞からのデータ）は、免疫ペルオキシダーゼによって検出されたインスリン染色細胞の数が、ガストリン／ＥＧＦで処置されたマウスから回収されたヒト膵島移植片からの解離細胞調製物において、ビヒクル処置マウスからと比較して、ずっと大きかったことを示した。
【００９０】
マウスのガストリン／ＥＧＦによる処置は、潜在的膵島β細胞についてのマーカーの発現の量を有意に増大し、そのマーカーは、ヒト膵島細胞において、前駆体転写因子ＰＤＸ１である（図１２および図１３）。このタンパク質は、膵臓および十二指腸のホメオボックス遺伝子１（ＰＤＸ−１）によってコードされ、膵臓発生および膵島機能調節の中心であり、そしてインスリン遺伝子発現を調節する。
【００９１】
両方の図において見られるように、ＰＤＸ１およびインスリンの発現の共存もまた観察された。これらのデータは、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに移植されたヒト膵島において、ガストリン／ＥＧＦが、ＰＤＸ１発現およびβ細胞量増加を誘導することを実証する。
【００９２】
（実施例９）
（低用量のガストリン／ＥＧＦの投与は、ヒト組織の移植片において、ヒトβ細胞増殖およびインスリン分泌応答を改善する）
実施例８（前出）の手順と同様に、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを、ビヒクルまたは低用量のガストリン／ＥＧＦ（ＥＧＦ、３０μｇ／ｋｇ／日、およびガストリン、３０μｇ／ｋｇ／日、６週間にわたって、１日１回用量で、腹腔内投与で与えた）のどちらかで処置し、インスリン分泌応答を測定した。
【００９３】
高血糖刺激としてＩＶグルコース１．５ｇ／ｋｇ投与後、ガストリン／ＥＧＦ処置マウスにおいて、血糖耐性に、僅かな改善しか観察されなかった（図１３）。しかし、ビヒクル処置マウスの血漿中におけるヒトＣ−ペプチドの放出と比較して、ガストリン／ＥＧＦ処置マウスの血漿中のヒトＣ−ペプチドのより大きな放出によって証明されるように、インスリン分泌応答において有意な改善が、ことによって観察された。従って、低用量のガ
ストリン／ＥＧＦでさえも、ガストリン／ＥＧＦ処置は、ヒト膵島移植片のインスリン分泌応答において、改善をもたらす。
【００９４】
（実施例１０）
（移植およびヒト幹細胞のインスリン分泌細胞への分化）
この実験の目的は、幹細胞（例えば、樹立細胞株、臍帯、または胚に由来する幹細胞）を、糖尿病患者への移植およびガストリン／ＥＧＦ処置によるインスリン分泌細胞への分化のために、膵島移植片の代わりに使用し得るか否かを決定することである。
【００９５】
細胞株から、または臍帯からの幹細胞を、近い血縁の新生児個体（子、従兄弟、姪または甥）から入手し、そして多くのＩ型糖尿病患者のそれぞれに移植する。この実施例の反復の初回において、実施例１におけるように、幹細胞を、腎被膜下に移植する。後の反復において、移植の他の方法は、Ｉ．Ｖ．投与（例えば、門脈血管内または肝静脈内）を含む。
【００９６】
レシピエントのグループを形成し、各レシピエントグループにおける患者に、全細胞数の２５％の膵島の幹細胞含量、または膵島１つあたり約２×１０６幹細胞を使用して、約５膵島（約１０７細胞）、約５０膵島（約１０８細胞）、約１００膵島（約２×１０８細胞）、約５００膵島（約１０９細胞）、約１０００膵島（約２×１０９細胞）、または約２０００膵島（約４×１０９細胞）、における幹細胞の概数に相当する幹細胞の用量を投与した（１膵島あたりのおよその全細胞数については表４を参照のこと）。
【００９７】
各移植レシピエントグループを、さらに、ビヒクル（生理食塩水／リン酸化緩衝液）のみを投与するコントロールグループと、処置グループに分ける。全ての患者に標準的ＩＲＢ病院検閲局臨床試験同意書を与え、そして患者は、偽薬を与えられ得る試験の一部であることに同意する。処置グループに、ガストリン／ＥＧＦ組成物の用量についての標準的ヒトプロトコール（約３μｇ／ｋｇのＥＧＦ５１Ｎ、および約１００μｇ／ｋｇのｈガストリン１−１７Ｌｅｕ１５）を、ｉ．ｐ．で、１日２回ビヒクル中で与える。インスリン治療を、全てのレシピエントグループにおいて約１ヶ月続け、次いで、量を減らして（例えば、通常用量の約５０％〜８０％）提供し、同時に、血中インスリンおよび血糖の、毎日多数回のモニタリングおよび記録を行う。さらなるインスリンを、任意の患者に必要に応じて投与し、正常血糖を維持し、そして全てのインスリン用量ならびにインスリンおよびグルコースの血中濃度を、記録する。
【００９８】
終点の決定は、ガストリン／ＥＧＦ処置グループにおいて、コントロールグループにおいて必要な幹細胞の数と比較して、より少ない数の幹細胞の最初の投与は、十分なインスリンを提供し得ることを示す。
【００９９】
（実施例１１）
（培養物中に維持される単離ヒト膵島のβ細胞個体集団における、ＥＧＦ（Ｅ１）およびガストリン（Ｇ１）の効果）
この実験の目的は、ＥＧＦおよびガストリンでの処置が、インビトロで、ヒト膵島のβ細胞個体集団を増加させ得るか否か、およびどのような機構で増加させ得るかを決定することであった。膵島細胞調製物を、ヒトドナー膵臓（ｎ＝５）から単離し、そして膵島細胞移植のためのヒト膵島の調製について使用される認可プロトコール（Ｌａｋｅｙ ＪＲＴら（１９９９）Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ８：２８５−２９２，およびＲｉｃｏｒｄｉ Ｃ．ら（１９８８）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３７：４１３−４２０）に従って調製した。膵島細胞を、シャーレ１枚につき１×１０６細胞の濃度で播種し、そして無血清ＭＥＭ培地のみの中で４週間にわたって培養するか、またはＥＧＦ（０．３μｇ／ｍｌ）、ガストリン（１．０μｇ／ｍｌ）、もしくはＥＧＦ＋ガストリンの組み合わせを補充した
無血清ＭＥＭ培地中で４週間にわたって培養し、そして培養物中でさらに４週間にわたって維持した。
【０１００】
処置に先立ち、これらの膵島の細胞組成を、免疫組織化学的抗体染色で決定した。これらの組成は、以下であった：７±２％グルカゴン＋α−細胞、２３±３％インスリン＋β細胞、１７±２％ ＣＫ７＋管細胞、６±１％ ＣＫ１９＋管細胞、３３±２％アミラーゼ＋腺房細胞、および１１±１％ビメンチン＋間充織細胞（平均±ＳＥ、ドナー膵臓ｎ＝５）。４週間後、β細胞重量は、ＥＧＦ＋ガストリン（＋１２８％、ｐ＜０．００１）、およびＥＧＦ（＋７７％、ｐ＜０．０１）によって増加したが、ガストリン（−１％）またはＥＧＦもガストリンも非含有の培地（−６０％、ｐ＜０．０１）によっては増加しなかった。
【０１０１】
ＥＧＦもガストリンも添加しないさらに４週間のインキュベーションのあと、ＥＧＦ＋ガストリン処置膵島において、β細胞重量は継続して増加した（＋２４４％、ｐ＜０．００１）（図１４）。ＥＧＦ＋ガストリン処置膵島調製物はまた、ＣＫ１９＋管細胞の増加、（＋５８０％、ｐ＜０．００１）（図１５）、ならびにＣＫ１９＋管細胞における膵島転写因子であるＰＤＸ−１の発現の増加も有した（培養前にはＰＤＸ発現はなく、そしてＥＧＦ＋ガストリンと共に行った培養のたった二週間後、８２±５％ ＰＤＸ−１＋に増加した）（図１６）。ＥＧＦ＋ガストリンはまた、膵島培養物においてα−細胞の割合を増加させ、一方、ＣＫ７＋管細胞および腺房細胞の割合は、減少した。
【０１０２】
Ｅ１とＧ１との同時刺激による処置の４週間後、β細胞の割合は、ビヒクル処置コントロール培養物と比較して、有意に増加した。両ペプチドの使用中止の４週間後、インスリン陽性β細胞の数は、さらに顕著に増加した（処置開始時のβ細胞数と比較してほぼ４倍が観察された）。Ｅ１のみまたはＧ１のみで処置した細胞と比較して、両因子で処置した細胞において、有意な増加が観察された。対照的に、ビヒクル処置膵島について、８週間後、β細胞個体集団における減少が観察された。
【０１０３】
この実験の結果は、ＥＧＦとガストリンとによる併用治療が、ヒト膵島のβ細胞個体数を、インビトロで有意に増加させることを実証する。４週間後にペプチドを使用中止した後でさえ、β細胞数は、ＥＧＦとガストリンとの同時刺激により処置されていた細胞において、進行的に増加した。このことは、ＥＧＦとガストリンとの同時刺激が、β細胞個体集団における相乗的かつ長期の効果を有することを示す。
【０１０４】
さらに、ヒト膵島において、ＥＧＦは、主にＣＫ１９＋管細胞個体数（前駆体細胞）を増加させ、一方、ガストリンは、主にＣＫ１９＋管細胞におけるＰＤＸ−１発現の誘導を担うことが、見出された（図１６）。膵臓および十二指腸のホメオボックス遺伝子１（ＰＤＸ−１）によってコードされるタンパク質は、膵臓発生および膵島細胞機能の調節の中心である。ＰＤＸ−１は、インスリン遺伝子発現を調節し、そして種々の遺伝子の膵島細胞特異的遺伝子発現に関係する。
【０１０５】
これらの発見は、ＥＧＦレセプターリガンドのみ（ＴＧＦ−α）で管細胞を刺激した場合、ＥＧＦレセプターリガンドによって開始された膵島新生のプロセスを完了させるためにガストリンの存在が必須であったという、本発明者らのトランスジェニックマウスデータと一致する。
【０１０６】
これらのデータは、Ｅ１およびＧ１が、糖尿病患者におけるさらなる移植のための、ヒト膵島細胞調製物を、インビトロで増殖させるために使用され得ることを、強く示唆する。
【０１０７】
真性糖尿病は、根底にある生理学的欠損が、自己免疫プロセスに起因するβ細胞の破壊または血中高濃度のグルコースからの慢性的刺激に起因して分裂するβ細胞の能力の消耗のどちらかの結果としてのβ細胞の欠乏である疾患である。後者は、最終的に、β細胞の再生および／または置換のプロセスが、全体のβ細胞が減少しそれに伴って膵臓のインスリン含量が減少する程度まで損なわれるときの状況に導く。上記の結果は、成熟β細胞の産生を刺激し、膵臓のインスリン含量を非糖尿病レベルまで回復させることにより、ＴＧＦ−αとガストリンとの組み合わせを、糖尿病を処置するために使用し得ることを実証する。
【０１０８】
本研究は、完全な膵島細胞新生が、哺乳動物の成体膵臓の管上皮において、ガストリン／ＣＣＫレセプターリガンド（例えば、ガストリン）および／またはＥＧＦレセプターリガンド（例えば、ＴＧＦ−α）での刺激により、インビボで再活性化されることを上記が実証することを、本研究は報告した。すい臓におけるＴＧＦ−αおよびガストリンの過剰発現のトランスジェニックにおける研究を報告し、その研究は、膵臓ガストリン発現の膵島発生における役割を明らかにし、ＴＧＦ−αおよびガストリンがそれぞれ、膵島発生の調節において役割を果たすことを示す。従って、残りの多能性膵臓管細胞の、成熟インスリン分泌細胞への再生分化は、この因子の組み合わせまたはこれらの膵臓内でのインサイチュ発現を提供する組成物の治療的投与による糖尿病の処置についての実行可能な方法である。
【０１０９】
２型糖尿病のＺｕｃｋｅｒラットモデルにおけるＴＧＦ−αおよびガストリンでの処置の結果は、処置グループとコントロールグループとの間に血糖レベルの有意な違いがないことを示した。このことは、恐らく、長期の絶食（１８時間）後の一過性の低血糖効果を反映している。免疫組織化学的研究は、コントロール動物と比較したＴＧＦ−αおよびガストリンで処置した動物における、インスリン含有細胞の単一の病巣の数における有意な増加を明らかにした（図３）。これらの発見は、ＴＧＦ−αおよびガストリンでの処置後の、成体ラット膵臓における単一のβ細胞の増加を実証した。興味深いことに、このような単一のβ細胞病巣は、一般に、（刺激しない）成体ラット膵臓において見られない。これらの発見は、１型および２型糖尿病における、ＴＧＦ−αおよびガストリンの治療的役割を支持する。何故なら、処置は、β細胞の新生および複製の両方を標的化するからである。
【０１１０】
本発明は、本明細書中に記載の特定の実施形態によって限定されない。上述の記載および添付の図面から明らかになる改変は、特許請求の範囲内である。
【０１１１】
種々の刊行物が、本明細書中に挙げられ、その開示は、その全体が参照として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図１は、ＰＢＳ処理（塗りつぶし黒ひし形（ｓｏｌｉｄ ｂｌａｃｋ ｄｉａｍｏｎｄ））またはＴＧＦ−αおよびガストリンを併用して、１０日にわたって毎日腹腔内（ｉ．ｐ．）処置（塗りつぶし紫四角（ｓｏｌｉｄ ｐｕｒｐｌｅ ｓｑｕａｒｅ））した、ストレプトゾトシン誘導性糖尿病Ｗｉｓｔａｒラットにおける、グルコース耐性に対するＴＧＦ−αおよびガストリンの効果を示す。
【図２】図２は、実施例４に記載のように、処置したＺｕｃｋｅｒラットの３グループにおけるβ細胞新生に対するＴＧＦ−αおよびガストリンの処置の効果を、対応するＰＢＳコントロールと共に示す（１グループあたりｎ＝６匹）。淡青色のバーは痩型ＴＦＧ＋ガストリンを表し、マゼンタのバーは肥満ＴＦＧ＋ガストリンを表し、黄色のバーは肥満ＰＢＳコントロールを表し、暗青色のバーはＴＦＧ＋ガストリン処置前を表し、そして紫のバーは痩型ＰＢＳコントロールを表す。ＴＧＦ−αおよびガストリンは、ＰＢＳ処理コントロール動物と比較して、実験した全てのグループにおいて、単一β細胞病巣の相対的比率を有意に増加させた。グループ４とグループ５とは、有意に異なり（ｐ＜０．００１５）、グループ１と２ともまた異なる（ｐ＜０．００４１）。
【図３】図３は、痩型Ｚｕｃｋｅｒラットおよび肥満Ｚｕｃｋｅｒラットにおける、β細胞新生に対するＴＧＦ−αおよびガストリンの処置の効果を示す。β細胞新生を、総β細胞および新規に産生された単一β細胞病巣の差次的計数によって定量し、そして計数した総β細胞の百分率で表す。増殖因子で併用処置した痩型Ｚｕｃｋｅｒラットにおける単一β細胞病巣の百分率は、１０．５±０．９であり、対応するＰＢＳコントロールにおける３．９±１．１（ｐ＝０．００４）と比較される（図３Ａおよび図３Ｂ）。肥満Ｚｕｃｋｅｒラットにおいては、前処置グループにおける単一β細胞病巣の百分率は、８．７±１．３であり、これに対して、対応するコントロールグループにおいては４．２±１．１であった（ｐ＝０．００１５）（図３Ｃおよび図３Ｄ）。図３Ｅは、図３Ｃの管領域（矢印で示す）の４００×拡大図であり、β細胞新生に特有の、管上皮細胞からのインスリン含有β細胞の出芽の明らかな証拠を提供する。
【図４】図４は、慢性糖尿病インスリン依存性ＮＯＤマウスにおいて、Ｇ１による処置が、空腹時血糖レベルを低下させ、そしてインスリン治療中止１４日後の死を阻止することを示す。
【図５】図５は、慢性糖尿病インスリン依存性ＮＯＤマウスにおけるＥＧＦによる処置が、空腹時血糖レベルを低下させ、そしてインスリン治療中止１４日後の死を阻止することを示す。
【図６】図６は、最近糖尿病を発症したＮＯＤマウスにおいて、Ｅ１またはＧ１のいずれかによる処置が、空腹時血糖レベルの上昇を防ぐことを示す。
【図７】図７は、最近糖尿病を発症したＮＯＤマウスにおいて、Ｅ１またはＧ１のいずれかによる処置が、膵臓インスリン含量を増加させることを示す。
【図８】図８は、糖尿病マウスにおけるＥＧＦ／ガストリン処置の結果を示す。図８Ａは、ヒト膵島を移植し、そしてガストリン／ＥＧＦで処置したＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウス（ＥＧＦ、３０μｇ／ｋｇ、およびガストリン、１０００μｇ／ｋｇ、塗りつぶし記号（ｓｏｌｉｄ ｓｙｍｂｏｌ））、またはビヒクルのみを与えたコントロールマウス（中抜き記号（ｏｐｅｎ ｓｙｍｂｏｌ））におけるグルコース耐性試験の結果を示す、一組の折れ線グラフである。これらのグラフは、縦座標に血糖（左のグラフ）または血漿ヒトＣ−ペプチド（右のグラフ）を、横軸上の時間（１２０分まで）の関数として示す。右のグラフは、ガストリン／ＥＧＦがヒト組織のインスリン分泌応答を改善することを示す。図８Ｂは、血漿中のヒトＣ−ペプチドの含量が、ＥＧＦ／ガストリン処置マウスにおいて、ビヒクル処置マウスより高いことを示す、棒グラフである。
【図９】図９は、ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスに移植されたヒト膵島のインスリン含量をμｇ／移植片で示す、棒グラフである。このＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスは、ＥＧＦ＋ガストリン（淡灰色のバー）、またはビヒクル（白色のバー）を投与されたか、あるいは膵島移植前（暗灰色バー）である。このデータは、ガストリン／ＥＧＦが、処置したＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスに移植したヒト膵島のインスリン含量を、未処置ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウスのものと比べて、増加させることを示す。
【図１０】図１０は、図２のようにマウスに移植されたヒト膵島におけるβ細胞のパーセント（左のグラフ）およびβ細胞の総数（右のグラフ）の棒グラフである。このデータは、ガストリン／ＥＧＦが、処置したＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに移植したヒト膵島において、β細胞新生を刺激することを示す。
【図１１】図１１は、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスのインタクトな膵島移植片または単離された膵島移植片細胞における、インスリン陽性細胞（濃く染まっている）の一組の顕微写真である。このデータは、ガストリン／ＥＧＦが、移植されたヒト膵島のインスリン陽性β細胞の含量における増加を誘導することを示す。
【図１２】図１２は、処理した細胞におけるＰＤＸ−１発現およびインスリン発現に関する。図１２Ａは、ＰＤＸ−１染色したヒト膵島細胞、ならびにガストリン／ＥＧＦ処理細胞およびビヒクル処理細胞の各々におけるＰＤＸ−１発現およびインスリン発現の共存を示す、一組の顕微写真である。図１２Ｂは、マウスをガストリン／ＥＧＦまたはビヒクルで処置する間の、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに移植したヒト膵島内での移植８週間後のＰＤＸ−１発現を示す棒グラフである。
【図１３】図１３は、ヒト膵島を移植され、低用量のガストリン／ＥＧＦ（ＥＧＦ、３０μｇ／ｋｇ、およびガストリン、３０μｇ／ｋｇ；四角記号）またはビヒクル（丸記号）で処置したＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおける、縦軸に示した血糖含量（左のパネル）または血漿ヒトＣ−ペプチド（右のパネル）についてグルコース耐性試験の結果を、横軸上に時間（１２０分まで）の関数として示す、一組の折れ線グラフである。このデータは、ガストリン／ＥＧＦが、低用量でさえ、ヒト組織のインスリン分泌応答を改善することを示す。
【図１４】図１４の説明なし。
【図１５】図１５の説明なし。
【図１６】図１６の説明なし。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図３】
【図２】
【図４】
【図５】
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【図１０】
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【図１４】
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【図１６】
【図３】
【公開番号】特開２００９−２２３００（Ｐ２００９−２２３００Ａ）
【公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２６０１６３（Ｐ２００８−２６０１６３）
【出願日】平成２０年１０月６日（２００８．１０．６）
【分割の表示】特願２００４−５０８２６６（Ｐ２００４−５０８２６６）の分割
【原出願日】平成１５年５月２７日（２００３．５．２７）
【出願人】（５０４４３０９７２）ワラタ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (15)
【出願人】（５０４４３０９９４）ユニバーシティー オブ アルバータ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月６日（２００８．１０．６）
【分割の表示】特願２００４−５０８２６６（Ｐ２００４−５０８２６６）の分割
【原出願日】平成１５年５月２７日（２００３．５．２７）
【出願人】（５０４４３０９７２）ワラタ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (15)
【出願人】（５０４４３０９９４）ユニバーシティー オブ アルバータ (2)
【Ｆターム（参考）】
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