糖誘導体及びその製造方法
【課題】糖誘導体及びその製造方法を提供する。
【解決手段】マイセリゲネランス（Myceligenerans）属に属する微生物を、資化可能な炭素源を含む培地で培養し、培地中に下記式（１）で表される化合物を生成させることを特徴とする、下記式（１）で表される化合物の製造方法。
【解決手段】マイセリゲネランス（Myceligenerans）属に属する微生物を、資化可能な炭素源を含む培地で培養し、培地中に下記式（１）で表される化合物を生成させることを特徴とする、下記式（１）で表される化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な糖誘導体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化石燃料に代わり、再生可能なバイオマスを利用する研究が進められてきている。中でもセルロース系バイオマスである木質バイオマスは、食用用途と競合しない上、蓄積量、生産量ともに大きく、バイオマスとしての利用の促進が期待されている。木質バイオマスは、これを糖化（加水分解）処理して生成される糖（糖化糖）の割合が、グルコースなどのＣ６糖が約４０％、キシロースなどのＣ５糖が約２７％と、Ｃ５糖の比率が比較的高いことが特徴である。セルロース系バイオマスを糖化処理して得られるＣ６糖については、バイオエタノールの原料としての利用の他、グルコースを原料としたコハク酸の製造など（非特許文献１）種々の検討が進められてきている。一方、キシロース等のＣ５糖は、糖化処理に通常用いられる酵母などで醗酵できないこともあり、有効な利用法の開発が強く望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Journal of Environmental Biotechnology, 2004, 4, 63-67
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、微生物を用いて、グルコース等のＣ６糖やキシロース等のＣ５糖を利用し、新規な糖誘導体を製造する方法を提供することを課題とする。また、本発明は、前記製造方法に用いる微生物の提供を課題とする。さらに、本発明は、新規な糖誘導体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、セルロース系バイオマスの糖化処理により得られる少糖類や単糖類を原料として、新規な糖誘導体を得ることができれば、セルロース系バイオマスの有効利用につながり得ると考えた。
本発明者等は上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。その結果、マイセリゲネランス（Myceligenerans）属細菌が、グルコースやキシロース等を原料として下記式（１）で表される化合物を産生することを見い出した。本発明はこの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００６】
【化１】
【０００７】
本発明は、マイセリゲネランス（Myceligenerans）属に属する微生物を、資化可能な炭素源を含む培地で培養し、培地中に下記式（１）で表される化合物を生成させることを特徴とする、下記式（１）で表される化合物の製造方法に関する。
【０００８】
【化２】
【０００９】
また、マイセリゲネランス（Myceligenerans）属に属し、資化可能な炭素源からの前記式（１）で表される化合物の生産能を有する微生物に関する。
【００１０】
さらに、本発明は、前記式（１）で表される化合物に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、微生物を用いて、グルコース等のＣ６糖やキシロース等のＣ５糖を利用し、新規な糖誘導体を製造する方法を提供することができる。また、本発明によれば、前記製造方法に用いる微生物を提供することができる。さらに、本発明によれば、新規な糖誘導体を提供することができる。本発明により得られる糖誘導体は、化学／有機合成の出発材料として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】保持時間２０．０５分に培地に無い特徴的なピークをＨＰＬＣ分析で検出した図である。図１（ａ）はｐＨ８に調整したＬＢＸ培地で培養した培養上清のＨＰＬＣ分析結果を、図（ｂ）はｐＨ６に調整したＬＢＧ培地で培養した培養上清のＨＰＬＣ分析結果を、図（ｃ）はｐＨ８に調整したＬＢＧ培地で培養した培養上清のＨＰＬＣ分析結果を示す。
【図２】分取された特徴的なピークが精製されていることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の製造方法及び微生物について説明する。
本発明の製造方法は、マイセリゲネランス属に属する微生物を、資化可能な炭素源を含む培地に培養し、培地中に下記式（１）で表される化合物を生成させることを特徴とする。
【００１４】
【化３】
【００１５】
本発明の製造方法に用いられる微生物は、マイセリゲネランス属に属する微生物であって、前記式（１）で表される化合物を生成することができるものであれば特に制限はない。
【００１６】
本発明の製造方法においては、配列番号１に示す塩基配列、又は配列番号１に示す塩基配列と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく分子系統学上同等の塩基配列、を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、以下の菌学的性質を示す、前記式（１）で表される化合物の生産能を有するマイセリゲネランス属に属する微生物を用いることが好ましい。
【００１７】
（菌学的性質）
（１）グラム染色性 陽性
（２）菌の形状 球状
（３）運動性 無し
（４）胞子 形成
（５）分岐した菌糸の形成 形成する
（６）気中菌糸の形成 形成しない
【００１８】
本発明の製造方法に用いられる微生物は、前記式（１）で表される化合物の生産能を有するマイセリゲネランス属に属する微生物の中でも、前記式（１）で表される化合物の生成能が高いマイセリゲネランス・エスピー（Myceligenerans sp.）ＫＳＭ−ＴＢ８３９株であることが、更に好ましい。なお、マイセリゲネランス・エスピー（Myceligenerans sp.）ＫＳＭ−ＴＢ８３９株は、２００９年９月１７日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター中央第６）に、受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２１８５０として寄託された。
【００１９】
本発明に用いることができるマイセリゲネランス属に属する微生物は、例えば、生育阻害化合物資化性菌の中から取得することが出来る。生育阻害化合物としてフルフリルアルコール等が挙げられるが、これに制限するものではない。これら資化性を、例えば、フルフリルアルコールを唯一の炭素源とするＹｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）で培養し、以下に記載の菌学的性質を指標にして本発明に用いることができるマイセリゲネランス属に属する微生物を見出すことができる。
【００２０】
本発明の製造方法に特に好ましく用いることができるマイセリゲネランス・エスピー（Myceligenerans sp.）ＫＳＭ−ＴＢ８３９株（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２１８５０）の菌学的性質は、以下の通りである。
【００２１】
（ａ）培養的性質
１．ＤｉｆｃｏＴＭ Ｍａｒｉｎｅ Ａｇａｒ ２２１６培地 （ＢＤ社製）：２５℃、３日間で良好に生育
２．フルフリルアルコールを０．５％含有するＹｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（ＹＮＢ）寒天培地における生育：２５℃、７日間で良好に生育
３．ＬＢ寒天培地（０．１２５％ ＬＢ培地「ダイゴ」（日本製薬）、０．９％ 人工海水、１．５％ 寒天、ｐＨ７における生育：２５℃、７日間で良好に生育
【００２２】
（ｂ）形態的性質
ＤｉｆｃｏＴＭ Ｍａｒｉｎｅ Ａｇａｒ ２２１６培地 （ＢＤ社製）における、２５℃、７２時間培養後のコロニー形態を示す。
１．直径：１．０−２．０ｍｍ
２．色調：黄色
３．形状：円形
４．隆起状態：レンズ状
５．周縁：糸状
６．表面形状：スムーズ
７．透明度：不透明
８．粘稠度：培地に固着
【００２３】
（ｃ）生理学的性質
１．生育温度試験
４５℃ 生育する
５０℃ 生育せず
２．カタラーゼ反応：陽性
３．オキシダーゼ反応：陰性
４．嫌気状態での生育：陰性
５．グルコースからの酸／ガス産生
酸産生：陰性
ガス産生：陰性
６．ＭＯＦ培地を用いたＯ／Ｆテスト
酸化：陰性
醗酵：陰性
７．ＡＰＩ１５０ＣＨＥを用いた酸化試験
グリセロール ：陰性
エリスリトール ：陰性
Ｄ−アラビノース ：陰性
Ｌ−アラビノース ：陽性
リボース ：陰性
Ｄ−キシロース ：陽性
Ｌ−キシロース ：陰性
アドニトール ：陰性
β−メチル−キシロシド ：陽性
ガラクトース ：陰性
グルコース ：陽性
フラクトース ：陰性
マンノース ：陽性
ソルボース ：陰性
ラムノース ：陰性
ズルシトール ：陰性
イノシトール ：陰性
マンニトール ：陰性
ソルビトール ：陰性
α−メチル−Ｄ−マンノシド：陰性
α−メチル−Ｄ−グルコシド：陽性
Ｎ−アセチルグルコサミン ：陰性
アミグダリン ：陰性
アルブチン ：陽性
エスクリン ：陽性
サリシン ：陰性
セロビオース ：陽性
マルトース ：陰性
ラクトース ：陰性
メリビオース ：陰性
サッカロース ：陽性
トレハロース ：陽性
イヌリン ：陰性
メレチトース ：陰性
ラフィノース ：陰性
でんぷん ：陰性
グリコーゲン ：陰性
キシリトール ：陰性
ゲンチオビオース ：陽性
Ｄ−ツラノース ：陽性
Ｄ−リキソース ：陽性
Ｄ−タガトース ：陰性
Ｄ−フコース ：陰性
Ｌ−フコース ：陰性
Ｄ−アラビトール ：陰性
Ｌ−アラビトール ：陰性
グルコネート ：陰性
２−ケトグルコネート ：陰性
５−ケトグルコネート ：陽性
８．最適生育温度範囲：２０〜３０℃
９．最適生育ｐＨ範囲：６〜８
１０．生育可能上限温度：４５℃
１１．生育可能ｐＨ範囲：４〜１３
【００２４】
（ｄ）化学分類学的性質
マイセリゲネランス・エスピー（Myceligenerans sp.）ＫＳＭ−ＴＢ８３９株の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列は、マイセリゲネランス・キシリゴエンス（Myceligenerans xiligouense）株（ＸＬＧ９Ａ１０．２）の１６Ｓ ｒＲＮＡとの間で９８．９ ％、イソプテリコーラ・ドクドネンシス（Isoptericola dokdonensis）株（ＤＱ３８７８６０）の１６Ｓ ｒＲＮＡとの間で９５．２ ％、の同一性を有する。
【００２５】
（ｅ）その他の特徴
上記に示した性質は、マイセリゲネランス・エスピー（Myceligenerans sp.）ＫＳＭ−ＴＢ８３９株が、マイセリゲネランス属であることを支持するが、これらの性質と完全に一致する菌種はマイセリゲネランス属の中に見当たらないことから、マイセリゲネランス・エスピーであると同定される。
【００２６】
本発明の製造方法において、マイセリゲネランス属に属し、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が、マイセリゲネランス・エスピーＫＳＭ−ＴＢ８３９株の１６Ｓ ｒＲＮＡが有する配列番号１に示す塩基配列と１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に基づく分子系統学上同等の塩基配列を含むと共に前記の菌学的性質を示し、資化可能な炭素源からの前記式（１）で表される化合物の生産能を有する微生物を好ましく用いることができる。
【００２７】
分子系統樹に基づいて生物や遺伝子の進化を研究する手法は、分子系統学として確立されている（例えば、木村資生編分子進化学入門（培風館）第１６４〜１８４頁、「７分子系統樹の作り方とその評価」参照）。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく分子系統樹は、対象の微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を、菌学的性質から同微生物と同種又は類縁と推定される公知の微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列とともに、多重アラインメント及び進化距離の計算を行い、得られた値に基づいて系統樹を作成することにより、得ることができる。分子系統樹の作成に用いる公知の微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、既存のデータベースの同一性検索によっても、取得することができる。ここで、進化距離とは、ある遺伝子間の座位（配列の長さ）あたりの変異の総数をいう。
本発明において、「分子系統学上同等」とは、前記分子系統樹において同属と認められる微生物を指すが、その中でも、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）が９７％以上であればより類縁であり、９９％以上であれば同一種である可能性が高いと認められる。ここで、塩基配列の同一性とは、比較する２つの塩基配列を必要に応じて間隙を導入して整列（アラインメント）させ、得られる最大の塩基配列の同一性（％）をいう。塩基配列の同一性を決定する目的のためのアラインメントは、通常の方法を用いて行うことができ、例えばＢＬＡＳＴのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアや、ＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株））並びにＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ゼネティックス）等の市販のソフトウェアを使用することもできる。
【００２８】
上記のようなマイセリゲネランス属に属する微生物を、資化可能な炭素源を含む培地に好気的条件下で培養することにより、同培養液中に前記式（１）で表される化合物を生成させることができる。マイセリゲネランス属に属する微生物は単独で使用することができるが、任意の１種又は２種以上の微生物を同時に使用してもよい。
【００２９】
本発明において、培地は、通常には液体培地が用いられる。このような培地の具体例として、Ｌｕｒｉａ-Ｂｅｒｔａｎｉ培地等が挙げられる。資化可能な炭素源としては、マイセリゲネランス属に属する微生物を好気的に培養したときに前記式（１）で表される化合物を生成するものであれば特に制限されないが、キシロース、グルコース、アラビノース、シュクロース等が挙げられ、キシロースが好ましい。資化可能な炭素源は、市販品を購入することや、当業者に周知の方法で合成することで入手することができる。
【００３０】
また、本発明の製造方法において、バイオマスの糖化により製造される少糖類や単糖類等の糖化糖を炭素源として用いることもできる。バイオマスの糖化糖は、資化可能な炭素源としてそのまま用いることができるし、当業者に周知の方法により分離、精製して用いてもよい。近年、バイオマスの利用は増加の一途にあり、糖化糖は今後も産生され続けることが予測される。このような糖化糖を原材料として有効利用できれば、環境面及び産業面において重要な意味がある。
【００３１】
培地中に含まれる資化可能な炭素源の濃度は、マイセリゲネランス属に属する微生物が前記式（１）で表される化合物を産生することができれば特に制限はないが、０．１〜１０ｇ／ｄｌの範囲で使用されることが望ましい。資化可能な炭素源は段階的に培地中に追添することもできる。
【００３２】
さらに、必要に応じて本発明に用いるマイセリゲネランス属に属する微生物の生育に必要な窒素源、無機塩類、各種の有機物、無機物、界面活性剤あるいは通常用いられる消泡剤などを添加することができる。これらの培地成分も、必要に応じて培地中に追添することができる。
【００３３】
マイセリゲネランス属に属する微生物の培地へ接種は、例えば、生理食塩水等に懸濁したマイセリゲネランス属に属する微生物を生産培地に直接摂取する方法や、生産培地にマイセリゲネランス属に属する微生物を１白金耳直接接種することなどにより行うことができる。
【００３４】
本培養の培養温度は、マイセリゲネランス属に属する微生物が生育しうる範囲内、即ち通常２０〜４５℃で行われるが、好ましくは２０〜３０℃の範囲である。また、培地のｐＨは通常６〜８、好ましくは７の近傍で調節される。培養期間は使用する培地の種類及び炭素源の濃度により異なり、通常２４時間から１４日間程度である。本発明における培養は、培地の栄養源が最大限に利用され、かつ培養液中に生成する前記式（１）で表される化合物の蓄積量が最大に達した時点で培養を終了させることが好ましい。
【００３５】
なお、培養液中の前記式（１）で表される化合物の種類及び生成量は高速液体クロマトグラフィー、ＬＣ−ＭＳなどの通常の方法を用いて測定することができる。本発明により得られる前記式（１）で表される化合物は、当該分野において通常使用されている周知の手段、例えばろ過、遠心分離、真空濃縮、イオン交換又は吸着クロマトグラフィー、溶媒抽出、蒸留、結晶化などの操作を必要に応じて適宜組み合わせて用いることにより、培養液中から採取できるが、これらの方法に特に制限されることはない。
【００３６】
上述のように、本発明の製造方法及び微生物を用いることで、前記式（１）で表される化合物を製造することができる。前記式（１）で表される化合物は、新規な糖誘導体であるグルコース２、６サクシネートである。
前記式（１）で表されるグルコース２，６サクシネートは、グルコース骨格の２位と６位の水酸基がマスクされているので、グルコース骨格の１位の水酸基のみを特異的に反応させることができる。一般に、化学合成反応においては、糖分子の所望の位置の水酸基において反応を進行させるためには、他の位置の水酸基を何らかの方法でマスクし、反応できないようにする必要がある。このようなマスキング操作は、化学反応における選択性を向上させる上で重要である。例えば、糖における水酸基の反応性は１位、６位、２位、３位、４位の順に低くなっていることが知られているものの（非特許文献２）、１位のみを特異的にグルコシル化反応させるためには、少なくとも６位と２位をマスクする必要がある。言い換えれば、１位についで反応性の高い６位、及び２位が予めマスクされていれば、マスキング操作をしなくても１位のみを反応させることが容易となる。したがって、前記式（１）で表される化合物は医薬、化粧品、食品分野に代表される化学合成の分野における出発原料物質として有用である。
【００３７】
また、前記式（１）で表される化合物はこれまで報告されていない新規な化合物であり、分子それ自体の機能性も期待される。例えば、グルコースのアナログを例にとると、［１ｇＦ］−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコースは口腔癌のＰＥＴ診断に、３−メチルグルコースは糖の取り込み活性の評価に、２−デオキシグルコースは酵母の変異育種に、α−メチル−Ｄ−グルコピラノシドはウサギの腎臓での小胞グルコース輸送の検討に用いられている。そのため、本発明の前記式（１）で表される化合物についても、このような多岐にわたる用途が期待できる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
試験例
（１）菌株の取得
０．８５％（ｗ／ｖ）食塩水５ｍＬに土壌（千葉県坂田港の海底土壌）を適量加え、撹拌し、静置後、ｐＨ７に調整した０．６７％（ｗ／ｖ）ＹＮＢ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１．８％（ｗ／ｖ） ダイゴ人工海水（日本製薬）、０．５％（ｖ／ｖ）フルフリルアルコール（和光純薬）、１．５％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ Ａｇｅｒ（和光純薬）からなる寒天培地に適量塗抹し、２５℃にて３０日間培養した。生育してきた菌株をモノコロニー化し、ＫＳＭ−ＴＢ８３９株を取得した。
【００３９】
（２）菌株の同定
形態観察並びにＢＡＲＲＯＷらの方法（G.I.BARROW and R.K.A.FELTHAM: Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacteria,3rd edition,1993,Cambridge University Press参照）に基づきカタラーゼ反応、オキシダーゼ反応試験を行った。その結果、ＫＳＭ−ＴＢ８３９株が運動性を有さないグラム陽性糸状桿菌（菌糸幅：０．７−０．８μｍ）で、短鎖胞子を形成し、嫌気条件下で生育せず、４５℃で生育するが５０℃では生育しないこと、ＭＢ２２１６寒天培地上で黄色のコロニーを形成し、気中菌糸を形成せず、カタラーゼ反応に対し陽性を示し、オキシダーゼ反応に対し陰性を示した。
【００４０】
ＡＰＩ１５０ＣＨＥ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ， Ｌｙｏｎ， Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、酸化試験などの試験を行ったところ、エリスリトール、Ｄ−アラビノース及びリボースなどを酸化せず、Ｌ−アラビノース、β−メチル−Ｄ−キシロシド及びグルコースなどを酸化する性質を示した。
【００４１】
生理・生化学試験の結果からは、ＫＳＭ−ＴＢ８３９株が、マイセリゲネランス・キシリゴエンスの性状に類似性があるものの、β−メチル−Ｄ−キシロシド及びα−メチル−Ｄ−グルコシドの酸化する点、ラムノース、マンニトール、及びサリシンなどを酸化しない点で異なっておりマイセリゲネランス属細菌であることを支持するが、一致した属種は認められなかった。
【００４２】
ＫＳＭ−ＴＢ８３９株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、常法に従いＰＣＲを行い（中川恭好、川崎浩子：遺伝子解析法 １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列決定法、日本放線菌学会編 放線菌の分類と同定 ８８−１１７ｐｐ、日本化学会事務センター、２００１）、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする領域を増幅させた。得られた増幅断片の塩基配列を解読し、１６Ｓ ｒＲＮＡの部分配列（配列番号１：１４８４塩基）を決定した。
【００４３】
マイセリゲネランス・キシリゴエンス（Myceligenerans xiligouense）株（ＸＬＧ９Ａ１０．２）の１６Ｓ ｒＲＮＡとの間で９８．９ ％、イソプテリコーラ・ドクドネンシス（Isoptericola dokdonensis）株（ＤＱ３８７８６０）の１６Ｓ ｒＲＮＡとの間で９５．２ ％、の同一性を有していた。そのため、ＫＳＭ−ＴＢ８３９株、マイセリゲネランス・キシリゴエンスに帰属する可能性も考えられるが、それぞれ１４塩基の相違点が認められることから、異なる可能性が否定できない。
【００４４】
以上の結果から、ＫＳＭ−ＴＢ８３９株がマイセリゲネランス属に属するマイセリゲネランス・エスピーであると同定した。
【００４５】
実施例 糖誘導体の製造
１．キシロース変換物質及びグルコース変換物質の探索
ｐＨ６又はｐＨ８に調整したＬＢＸ培地（０．２５％ ＬＢ培地「ダイゴ」（日本製薬）、０．９％ 人工海水、０．５％ キシロース）又は、ｐＨ６又はｐＨ８に調整したＬＢＧ培地（０．２５％ ＬＢ培地「ダイゴ」（日本製薬）、０．９％ 人工海水、０．５％ グルコース）にマイセリゲネランス・エスピーＫＳＭ−ＴＢ８３９株を１白金耳植菌し、７日間振盪培養（３０℃、２５０ｒｐｍ）した。培養液を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、２０分）し、上清画分を分画した。
【００４６】
培養液上清中に含まれる化合物の分析は、ＣＡＰＣＥＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＡＱ（ＳＨＩＳＥＩＤＯ）を用い、日立ＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ装置（ＨＩＴＡＣＨＩ社）にて行った。サンプルを（０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸溶液）で適宜希釈し、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、流速； ０．５ ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度； ３０℃、サンプル注入量； １０μＬ、０．１％ギ酸溶液から３０％アセトニトリルを含む０．１％ギ酸溶液への濃度勾配条件（表１）にてＨＰＬＣを行い、ＣｏｒｏｎａＴＭ ＣＡＤＴＭ荷電化粒子検出器（ＥＳＡ社）及びＵＶ検出器（ＨＩＴＡＣＨＩ社）にて分析した。分析サンプルはいずれもＤＩＳＭＩＣ−１３ＣＰ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ａｃｅｔａｔｅ ０．２μｍ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）にてフィルター濾過処理して用いた。
【００４７】
【表１】
【００４８】
その結果、ｐＨ８に調整したＬＢＸ培地、ｐＨ６及びｐＨ８に調整したＬＢＧ培地の培養上清中に、培養しなかった培地には存在しない物質の特徴的なピーク（溶離時間２０．０５分）が認められた（図１）。
【００４９】
２．特徴的なピーク成分の精製
ｐＨ８に調整したＬＢＸ培地（０．２５％ ＬＢ培地「ダイゴ」（日本製薬）、０．９％ 人工海水、０．５％ キシロース）にマイセリゲネランス・エスピーＫＳＭ−ＴＢ８３９株を１白金耳植菌し、７日間振盪培養（３０℃、２５０ｒｐｍ）した。培養液を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、２０分）し、上清画分を分画した。分画した上清はＤＩＳＭＩＣ−１３ＣＰ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ａｃｅｔａｔｅ ０．２μｍ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）にてフィルター濾過処理した。
【００５０】
分画した上清を適宜濃縮し、移動層である３０％メタノールで安定化させたＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ３分取カラム（ジーエルサイエンス）を用い、流速７．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度４０℃、サンプル注入量２００μＬ、分析時間２０ｍｉｎの条件にてＨＰＬＣを行い、ＵＶ（２１０ｎｍ）検出器にて分析し、特徴的なピークを分取した。分取した画分は、実施例１の条件に従いＨＰＬＣ分析し、特徴的なピークが精製されていることを確認した（図２）。分取された特徴的なピークの化合物の重量から生産性が０．６ｇ／Ｌであることが判った。
【００５１】
３．特徴的なピーク成分の同定
特徴的なピークをＮＭＲにより解析した。ＮＭＲによる解析は、乾固したサンプル（４ｍｇ）を５００μＬの溶媒（混合比率、Ｄ２Ｏ ： ＣＤ３ＯＤ ＝ １：１）に溶解し、１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ）及び１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ）をＡＶ−６００（ＢＲＵＫＥＲ社）にて測定することで行った。その結果を表２に示す。
【００５２】
【表２】
【００５３】
測定結果を解析したところ、本化合物が下記式（１）で表されるグルコース２，６サクシネートであることが判った。
【００５４】
【化４】
本化合物の融点を融点測定器 ＭＰＡ-５０型（宮本理研工業株式会社）を用いて測定したところ、融点３０３．０〜３０５．０（分解温度）であることが判った。
【００５５】
これらの結果から、本発明の製造方法又は本発明の微生物により、キシロースやグルコース等を含む培地を用いて、前記式（１）で表される化合物を製造するできることがわかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な糖誘導体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化石燃料に代わり、再生可能なバイオマスを利用する研究が進められてきている。中でもセルロース系バイオマスである木質バイオマスは、食用用途と競合しない上、蓄積量、生産量ともに大きく、バイオマスとしての利用の促進が期待されている。木質バイオマスは、これを糖化（加水分解）処理して生成される糖（糖化糖）の割合が、グルコースなどのＣ６糖が約４０％、キシロースなどのＣ５糖が約２７％と、Ｃ５糖の比率が比較的高いことが特徴である。セルロース系バイオマスを糖化処理して得られるＣ６糖については、バイオエタノールの原料としての利用の他、グルコースを原料としたコハク酸の製造など（非特許文献１）種々の検討が進められてきている。一方、キシロース等のＣ５糖は、糖化処理に通常用いられる酵母などで醗酵できないこともあり、有効な利用法の開発が強く望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Journal of Environmental Biotechnology, 2004, 4, 63-67
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、微生物を用いて、グルコース等のＣ６糖やキシロース等のＣ５糖を利用し、新規な糖誘導体を製造する方法を提供することを課題とする。また、本発明は、前記製造方法に用いる微生物の提供を課題とする。さらに、本発明は、新規な糖誘導体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、セルロース系バイオマスの糖化処理により得られる少糖類や単糖類を原料として、新規な糖誘導体を得ることができれば、セルロース系バイオマスの有効利用につながり得ると考えた。
本発明者等は上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。その結果、マイセリゲネランス（Myceligenerans）属細菌が、グルコースやキシロース等を原料として下記式（１）で表される化合物を産生することを見い出した。本発明はこの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００６】
【化１】
【０００７】
本発明は、マイセリゲネランス（Myceligenerans）属に属する微生物を、資化可能な炭素源を含む培地で培養し、培地中に下記式（１）で表される化合物を生成させることを特徴とする、下記式（１）で表される化合物の製造方法に関する。
【０００８】
【化２】
【０００９】
また、マイセリゲネランス（Myceligenerans）属に属し、資化可能な炭素源からの前記式（１）で表される化合物の生産能を有する微生物に関する。
【００１０】
さらに、本発明は、前記式（１）で表される化合物に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、微生物を用いて、グルコース等のＣ６糖やキシロース等のＣ５糖を利用し、新規な糖誘導体を製造する方法を提供することができる。また、本発明によれば、前記製造方法に用いる微生物を提供することができる。さらに、本発明によれば、新規な糖誘導体を提供することができる。本発明により得られる糖誘導体は、化学／有機合成の出発材料として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】保持時間２０．０５分に培地に無い特徴的なピークをＨＰＬＣ分析で検出した図である。図１（ａ）はｐＨ８に調整したＬＢＸ培地で培養した培養上清のＨＰＬＣ分析結果を、図（ｂ）はｐＨ６に調整したＬＢＧ培地で培養した培養上清のＨＰＬＣ分析結果を、図（ｃ）はｐＨ８に調整したＬＢＧ培地で培養した培養上清のＨＰＬＣ分析結果を示す。
【図２】分取された特徴的なピークが精製されていることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の製造方法及び微生物について説明する。
本発明の製造方法は、マイセリゲネランス属に属する微生物を、資化可能な炭素源を含む培地に培養し、培地中に下記式（１）で表される化合物を生成させることを特徴とする。
【００１４】
【化３】
【００１５】
本発明の製造方法に用いられる微生物は、マイセリゲネランス属に属する微生物であって、前記式（１）で表される化合物を生成することができるものであれば特に制限はない。
【００１６】
本発明の製造方法においては、配列番号１に示す塩基配列、又は配列番号１に示す塩基配列と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく分子系統学上同等の塩基配列、を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、以下の菌学的性質を示す、前記式（１）で表される化合物の生産能を有するマイセリゲネランス属に属する微生物を用いることが好ましい。
【００１７】
（菌学的性質）
（１）グラム染色性 陽性
（２）菌の形状 球状
（３）運動性 無し
（４）胞子 形成
（５）分岐した菌糸の形成 形成する
（６）気中菌糸の形成 形成しない
【００１８】
本発明の製造方法に用いられる微生物は、前記式（１）で表される化合物の生産能を有するマイセリゲネランス属に属する微生物の中でも、前記式（１）で表される化合物の生成能が高いマイセリゲネランス・エスピー（Myceligenerans sp.）ＫＳＭ−ＴＢ８３９株であることが、更に好ましい。なお、マイセリゲネランス・エスピー（Myceligenerans sp.）ＫＳＭ−ＴＢ８３９株は、２００９年９月１７日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター中央第６）に、受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２１８５０として寄託された。
【００１９】
本発明に用いることができるマイセリゲネランス属に属する微生物は、例えば、生育阻害化合物資化性菌の中から取得することが出来る。生育阻害化合物としてフルフリルアルコール等が挙げられるが、これに制限するものではない。これら資化性を、例えば、フルフリルアルコールを唯一の炭素源とするＹｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）で培養し、以下に記載の菌学的性質を指標にして本発明に用いることができるマイセリゲネランス属に属する微生物を見出すことができる。
【００２０】
本発明の製造方法に特に好ましく用いることができるマイセリゲネランス・エスピー（Myceligenerans sp.）ＫＳＭ−ＴＢ８３９株（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２１８５０）の菌学的性質は、以下の通りである。
【００２１】
（ａ）培養的性質
１．ＤｉｆｃｏＴＭ Ｍａｒｉｎｅ Ａｇａｒ ２２１６培地 （ＢＤ社製）：２５℃、３日間で良好に生育
２．フルフリルアルコールを０．５％含有するＹｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（ＹＮＢ）寒天培地における生育：２５℃、７日間で良好に生育
３．ＬＢ寒天培地（０．１２５％ ＬＢ培地「ダイゴ」（日本製薬）、０．９％ 人工海水、１．５％ 寒天、ｐＨ７における生育：２５℃、７日間で良好に生育
【００２２】
（ｂ）形態的性質
ＤｉｆｃｏＴＭ Ｍａｒｉｎｅ Ａｇａｒ ２２１６培地 （ＢＤ社製）における、２５℃、７２時間培養後のコロニー形態を示す。
１．直径：１．０−２．０ｍｍ
２．色調：黄色
３．形状：円形
４．隆起状態：レンズ状
５．周縁：糸状
６．表面形状：スムーズ
７．透明度：不透明
８．粘稠度：培地に固着
【００２３】
（ｃ）生理学的性質
１．生育温度試験
４５℃ 生育する
５０℃ 生育せず
２．カタラーゼ反応：陽性
３．オキシダーゼ反応：陰性
４．嫌気状態での生育：陰性
５．グルコースからの酸／ガス産生
酸産生：陰性
ガス産生：陰性
６．ＭＯＦ培地を用いたＯ／Ｆテスト
酸化：陰性
醗酵：陰性
７．ＡＰＩ１５０ＣＨＥを用いた酸化試験
グリセロール ：陰性
エリスリトール ：陰性
Ｄ−アラビノース ：陰性
Ｌ−アラビノース ：陽性
リボース ：陰性
Ｄ−キシロース ：陽性
Ｌ−キシロース ：陰性
アドニトール ：陰性
β−メチル−キシロシド ：陽性
ガラクトース ：陰性
グルコース ：陽性
フラクトース ：陰性
マンノース ：陽性
ソルボース ：陰性
ラムノース ：陰性
ズルシトール ：陰性
イノシトール ：陰性
マンニトール ：陰性
ソルビトール ：陰性
α−メチル−Ｄ−マンノシド：陰性
α−メチル−Ｄ−グルコシド：陽性
Ｎ−アセチルグルコサミン ：陰性
アミグダリン ：陰性
アルブチン ：陽性
エスクリン ：陽性
サリシン ：陰性
セロビオース ：陽性
マルトース ：陰性
ラクトース ：陰性
メリビオース ：陰性
サッカロース ：陽性
トレハロース ：陽性
イヌリン ：陰性
メレチトース ：陰性
ラフィノース ：陰性
でんぷん ：陰性
グリコーゲン ：陰性
キシリトール ：陰性
ゲンチオビオース ：陽性
Ｄ−ツラノース ：陽性
Ｄ−リキソース ：陽性
Ｄ−タガトース ：陰性
Ｄ−フコース ：陰性
Ｌ−フコース ：陰性
Ｄ−アラビトール ：陰性
Ｌ−アラビトール ：陰性
グルコネート ：陰性
２−ケトグルコネート ：陰性
５−ケトグルコネート ：陽性
８．最適生育温度範囲：２０〜３０℃
９．最適生育ｐＨ範囲：６〜８
１０．生育可能上限温度：４５℃
１１．生育可能ｐＨ範囲：４〜１３
【００２４】
（ｄ）化学分類学的性質
マイセリゲネランス・エスピー（Myceligenerans sp.）ＫＳＭ−ＴＢ８３９株の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列は、マイセリゲネランス・キシリゴエンス（Myceligenerans xiligouense）株（ＸＬＧ９Ａ１０．２）の１６Ｓ ｒＲＮＡとの間で９８．９ ％、イソプテリコーラ・ドクドネンシス（Isoptericola dokdonensis）株（ＤＱ３８７８６０）の１６Ｓ ｒＲＮＡとの間で９５．２ ％、の同一性を有する。
【００２５】
（ｅ）その他の特徴
上記に示した性質は、マイセリゲネランス・エスピー（Myceligenerans sp.）ＫＳＭ−ＴＢ８３９株が、マイセリゲネランス属であることを支持するが、これらの性質と完全に一致する菌種はマイセリゲネランス属の中に見当たらないことから、マイセリゲネランス・エスピーであると同定される。
【００２６】
本発明の製造方法において、マイセリゲネランス属に属し、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が、マイセリゲネランス・エスピーＫＳＭ−ＴＢ８３９株の１６Ｓ ｒＲＮＡが有する配列番号１に示す塩基配列と１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に基づく分子系統学上同等の塩基配列を含むと共に前記の菌学的性質を示し、資化可能な炭素源からの前記式（１）で表される化合物の生産能を有する微生物を好ましく用いることができる。
【００２７】
分子系統樹に基づいて生物や遺伝子の進化を研究する手法は、分子系統学として確立されている（例えば、木村資生編分子進化学入門（培風館）第１６４〜１８４頁、「７分子系統樹の作り方とその評価」参照）。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく分子系統樹は、対象の微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を、菌学的性質から同微生物と同種又は類縁と推定される公知の微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列とともに、多重アラインメント及び進化距離の計算を行い、得られた値に基づいて系統樹を作成することにより、得ることができる。分子系統樹の作成に用いる公知の微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、既存のデータベースの同一性検索によっても、取得することができる。ここで、進化距離とは、ある遺伝子間の座位（配列の長さ）あたりの変異の総数をいう。
本発明において、「分子系統学上同等」とは、前記分子系統樹において同属と認められる微生物を指すが、その中でも、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）が９７％以上であればより類縁であり、９９％以上であれば同一種である可能性が高いと認められる。ここで、塩基配列の同一性とは、比較する２つの塩基配列を必要に応じて間隙を導入して整列（アラインメント）させ、得られる最大の塩基配列の同一性（％）をいう。塩基配列の同一性を決定する目的のためのアラインメントは、通常の方法を用いて行うことができ、例えばＢＬＡＳＴのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアや、ＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング（株））並びにＧＥＮＥＴＹＸ（（株）ゼネティックス）等の市販のソフトウェアを使用することもできる。
【００２８】
上記のようなマイセリゲネランス属に属する微生物を、資化可能な炭素源を含む培地に好気的条件下で培養することにより、同培養液中に前記式（１）で表される化合物を生成させることができる。マイセリゲネランス属に属する微生物は単独で使用することができるが、任意の１種又は２種以上の微生物を同時に使用してもよい。
【００２９】
本発明において、培地は、通常には液体培地が用いられる。このような培地の具体例として、Ｌｕｒｉａ-Ｂｅｒｔａｎｉ培地等が挙げられる。資化可能な炭素源としては、マイセリゲネランス属に属する微生物を好気的に培養したときに前記式（１）で表される化合物を生成するものであれば特に制限されないが、キシロース、グルコース、アラビノース、シュクロース等が挙げられ、キシロースが好ましい。資化可能な炭素源は、市販品を購入することや、当業者に周知の方法で合成することで入手することができる。
【００３０】
また、本発明の製造方法において、バイオマスの糖化により製造される少糖類や単糖類等の糖化糖を炭素源として用いることもできる。バイオマスの糖化糖は、資化可能な炭素源としてそのまま用いることができるし、当業者に周知の方法により分離、精製して用いてもよい。近年、バイオマスの利用は増加の一途にあり、糖化糖は今後も産生され続けることが予測される。このような糖化糖を原材料として有効利用できれば、環境面及び産業面において重要な意味がある。
【００３１】
培地中に含まれる資化可能な炭素源の濃度は、マイセリゲネランス属に属する微生物が前記式（１）で表される化合物を産生することができれば特に制限はないが、０．１〜１０ｇ／ｄｌの範囲で使用されることが望ましい。資化可能な炭素源は段階的に培地中に追添することもできる。
【００３２】
さらに、必要に応じて本発明に用いるマイセリゲネランス属に属する微生物の生育に必要な窒素源、無機塩類、各種の有機物、無機物、界面活性剤あるいは通常用いられる消泡剤などを添加することができる。これらの培地成分も、必要に応じて培地中に追添することができる。
【００３３】
マイセリゲネランス属に属する微生物の培地へ接種は、例えば、生理食塩水等に懸濁したマイセリゲネランス属に属する微生物を生産培地に直接摂取する方法や、生産培地にマイセリゲネランス属に属する微生物を１白金耳直接接種することなどにより行うことができる。
【００３４】
本培養の培養温度は、マイセリゲネランス属に属する微生物が生育しうる範囲内、即ち通常２０〜４５℃で行われるが、好ましくは２０〜３０℃の範囲である。また、培地のｐＨは通常６〜８、好ましくは７の近傍で調節される。培養期間は使用する培地の種類及び炭素源の濃度により異なり、通常２４時間から１４日間程度である。本発明における培養は、培地の栄養源が最大限に利用され、かつ培養液中に生成する前記式（１）で表される化合物の蓄積量が最大に達した時点で培養を終了させることが好ましい。
【００３５】
なお、培養液中の前記式（１）で表される化合物の種類及び生成量は高速液体クロマトグラフィー、ＬＣ−ＭＳなどの通常の方法を用いて測定することができる。本発明により得られる前記式（１）で表される化合物は、当該分野において通常使用されている周知の手段、例えばろ過、遠心分離、真空濃縮、イオン交換又は吸着クロマトグラフィー、溶媒抽出、蒸留、結晶化などの操作を必要に応じて適宜組み合わせて用いることにより、培養液中から採取できるが、これらの方法に特に制限されることはない。
【００３６】
上述のように、本発明の製造方法及び微生物を用いることで、前記式（１）で表される化合物を製造することができる。前記式（１）で表される化合物は、新規な糖誘導体であるグルコース２、６サクシネートである。
前記式（１）で表されるグルコース２，６サクシネートは、グルコース骨格の２位と６位の水酸基がマスクされているので、グルコース骨格の１位の水酸基のみを特異的に反応させることができる。一般に、化学合成反応においては、糖分子の所望の位置の水酸基において反応を進行させるためには、他の位置の水酸基を何らかの方法でマスクし、反応できないようにする必要がある。このようなマスキング操作は、化学反応における選択性を向上させる上で重要である。例えば、糖における水酸基の反応性は１位、６位、２位、３位、４位の順に低くなっていることが知られているものの（非特許文献２）、１位のみを特異的にグルコシル化反応させるためには、少なくとも６位と２位をマスクする必要がある。言い換えれば、１位についで反応性の高い６位、及び２位が予めマスクされていれば、マスキング操作をしなくても１位のみを反応させることが容易となる。したがって、前記式（１）で表される化合物は医薬、化粧品、食品分野に代表される化学合成の分野における出発原料物質として有用である。
【００３７】
また、前記式（１）で表される化合物はこれまで報告されていない新規な化合物であり、分子それ自体の機能性も期待される。例えば、グルコースのアナログを例にとると、［１ｇＦ］−フルオロ−２−デオキシ−Ｄ−グルコースは口腔癌のＰＥＴ診断に、３−メチルグルコースは糖の取り込み活性の評価に、２−デオキシグルコースは酵母の変異育種に、α−メチル−Ｄ−グルコピラノシドはウサギの腎臓での小胞グルコース輸送の検討に用いられている。そのため、本発明の前記式（１）で表される化合物についても、このような多岐にわたる用途が期待できる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
試験例
（１）菌株の取得
０．８５％（ｗ／ｖ）食塩水５ｍＬに土壌（千葉県坂田港の海底土壌）を適量加え、撹拌し、静置後、ｐＨ７に調整した０．６７％（ｗ／ｖ）ＹＮＢ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１．８％（ｗ／ｖ） ダイゴ人工海水（日本製薬）、０．５％（ｖ／ｖ）フルフリルアルコール（和光純薬）、１．５％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ Ａｇｅｒ（和光純薬）からなる寒天培地に適量塗抹し、２５℃にて３０日間培養した。生育してきた菌株をモノコロニー化し、ＫＳＭ−ＴＢ８３９株を取得した。
【００３９】
（２）菌株の同定
形態観察並びにＢＡＲＲＯＷらの方法（G.I.BARROW and R.K.A.FELTHAM: Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacteria,3rd edition,1993,Cambridge University Press参照）に基づきカタラーゼ反応、オキシダーゼ反応試験を行った。その結果、ＫＳＭ−ＴＢ８３９株が運動性を有さないグラム陽性糸状桿菌（菌糸幅：０．７−０．８μｍ）で、短鎖胞子を形成し、嫌気条件下で生育せず、４５℃で生育するが５０℃では生育しないこと、ＭＢ２２１６寒天培地上で黄色のコロニーを形成し、気中菌糸を形成せず、カタラーゼ反応に対し陽性を示し、オキシダーゼ反応に対し陰性を示した。
【００４０】
ＡＰＩ１５０ＣＨＥ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ， Ｌｙｏｎ， Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、酸化試験などの試験を行ったところ、エリスリトール、Ｄ−アラビノース及びリボースなどを酸化せず、Ｌ−アラビノース、β−メチル−Ｄ−キシロシド及びグルコースなどを酸化する性質を示した。
【００４１】
生理・生化学試験の結果からは、ＫＳＭ−ＴＢ８３９株が、マイセリゲネランス・キシリゴエンスの性状に類似性があるものの、β−メチル−Ｄ−キシロシド及びα−メチル−Ｄ−グルコシドの酸化する点、ラムノース、マンニトール、及びサリシンなどを酸化しない点で異なっておりマイセリゲネランス属細菌であることを支持するが、一致した属種は認められなかった。
【００４２】
ＫＳＭ−ＴＢ８３９株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、常法に従いＰＣＲを行い（中川恭好、川崎浩子：遺伝子解析法 １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列決定法、日本放線菌学会編 放線菌の分類と同定 ８８−１１７ｐｐ、日本化学会事務センター、２００１）、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする領域を増幅させた。得られた増幅断片の塩基配列を解読し、１６Ｓ ｒＲＮＡの部分配列（配列番号１：１４８４塩基）を決定した。
【００４３】
マイセリゲネランス・キシリゴエンス（Myceligenerans xiligouense）株（ＸＬＧ９Ａ１０．２）の１６Ｓ ｒＲＮＡとの間で９８．９ ％、イソプテリコーラ・ドクドネンシス（Isoptericola dokdonensis）株（ＤＱ３８７８６０）の１６Ｓ ｒＲＮＡとの間で９５．２ ％、の同一性を有していた。そのため、ＫＳＭ−ＴＢ８３９株、マイセリゲネランス・キシリゴエンスに帰属する可能性も考えられるが、それぞれ１４塩基の相違点が認められることから、異なる可能性が否定できない。
【００４４】
以上の結果から、ＫＳＭ−ＴＢ８３９株がマイセリゲネランス属に属するマイセリゲネランス・エスピーであると同定した。
【００４５】
実施例 糖誘導体の製造
１．キシロース変換物質及びグルコース変換物質の探索
ｐＨ６又はｐＨ８に調整したＬＢＸ培地（０．２５％ ＬＢ培地「ダイゴ」（日本製薬）、０．９％ 人工海水、０．５％ キシロース）又は、ｐＨ６又はｐＨ８に調整したＬＢＧ培地（０．２５％ ＬＢ培地「ダイゴ」（日本製薬）、０．９％ 人工海水、０．５％ グルコース）にマイセリゲネランス・エスピーＫＳＭ−ＴＢ８３９株を１白金耳植菌し、７日間振盪培養（３０℃、２５０ｒｐｍ）した。培養液を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、２０分）し、上清画分を分画した。
【００４６】
培養液上清中に含まれる化合物の分析は、ＣＡＰＣＥＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＡＱ（ＳＨＩＳＥＩＤＯ）を用い、日立ＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ装置（ＨＩＴＡＣＨＩ社）にて行った。サンプルを（０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸溶液）で適宜希釈し、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、流速； ０．５ ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度； ３０℃、サンプル注入量； １０μＬ、０．１％ギ酸溶液から３０％アセトニトリルを含む０．１％ギ酸溶液への濃度勾配条件（表１）にてＨＰＬＣを行い、ＣｏｒｏｎａＴＭ ＣＡＤＴＭ荷電化粒子検出器（ＥＳＡ社）及びＵＶ検出器（ＨＩＴＡＣＨＩ社）にて分析した。分析サンプルはいずれもＤＩＳＭＩＣ−１３ＣＰ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ａｃｅｔａｔｅ ０．２μｍ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）にてフィルター濾過処理して用いた。
【００４７】
【表１】
【００４８】
その結果、ｐＨ８に調整したＬＢＸ培地、ｐＨ６及びｐＨ８に調整したＬＢＧ培地の培養上清中に、培養しなかった培地には存在しない物質の特徴的なピーク（溶離時間２０．０５分）が認められた（図１）。
【００４９】
２．特徴的なピーク成分の精製
ｐＨ８に調整したＬＢＸ培地（０．２５％ ＬＢ培地「ダイゴ」（日本製薬）、０．９％ 人工海水、０．５％ キシロース）にマイセリゲネランス・エスピーＫＳＭ−ＴＢ８３９株を１白金耳植菌し、７日間振盪培養（３０℃、２５０ｒｐｍ）した。培養液を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、２０分）し、上清画分を分画した。分画した上清はＤＩＳＭＩＣ−１３ＣＰ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ａｃｅｔａｔｅ ０．２μｍ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）にてフィルター濾過処理した。
【００５０】
分画した上清を適宜濃縮し、移動層である３０％メタノールで安定化させたＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ３分取カラム（ジーエルサイエンス）を用い、流速７．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度４０℃、サンプル注入量２００μＬ、分析時間２０ｍｉｎの条件にてＨＰＬＣを行い、ＵＶ（２１０ｎｍ）検出器にて分析し、特徴的なピークを分取した。分取した画分は、実施例１の条件に従いＨＰＬＣ分析し、特徴的なピークが精製されていることを確認した（図２）。分取された特徴的なピークの化合物の重量から生産性が０．６ｇ／Ｌであることが判った。
【００５１】
３．特徴的なピーク成分の同定
特徴的なピークをＮＭＲにより解析した。ＮＭＲによる解析は、乾固したサンプル（４ｍｇ）を５００μＬの溶媒（混合比率、Ｄ２Ｏ ： ＣＤ３ＯＤ ＝ １：１）に溶解し、１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ）及び１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ）をＡＶ−６００（ＢＲＵＫＥＲ社）にて測定することで行った。その結果を表２に示す。
【００５２】
【表２】
【００５３】
測定結果を解析したところ、本化合物が下記式（１）で表されるグルコース２，６サクシネートであることが判った。
【００５４】
【化４】
本化合物の融点を融点測定器 ＭＰＡ-５０型（宮本理研工業株式会社）を用いて測定したところ、融点３０３．０〜３０５．０（分解温度）であることが判った。
【００５５】
これらの結果から、本発明の製造方法又は本発明の微生物により、キシロースやグルコース等を含む培地を用いて、前記式（１）で表される化合物を製造するできることがわかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイセリゲネランス（Myceligenerans）属に属する微生物を、資化可能な炭素源を含む培地で培養し、培地中に下記式（１）で表される化合物を生成させることを特徴とする、下記式（１）で表される化合物の製造方法。
【化１】
【請求項２】
前記資化可能な炭素源がキシロース又はグルコースであることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記マイセリゲネランス（Myceligenerans）属に属する微生物が、配列番号１に示す塩基配列、又は配列番号１に示す塩基配列と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく分子系統学上同等の塩基配列、を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、以下の菌学的性質を示し、資化可能な炭素源からの下記式（１）で表される化合物の生産能を有する微生物である、請求項１又は２記載の製造方法。
（１）グラム染色性 陽性
（２）菌の形状 球状
（３）運動性 無し
（４）胞子 形成
（５）分岐した菌糸の形成 形成する
（６）気中菌糸の形成 形成しない
【化２】
【請求項４】
前記マイセリゲネランス（Myceligenerans）属に属する微生物がマイセリゲネランス・エスピー（Myceligenerans sp.）ＫＳＭ−ＴＢ８３９株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８５０）である請求項１〜３のいずれか記載の製造方法。
【請求項５】
マイセリゲネランス（Myceligenerans）属に属し、資化可能な炭素源からの下記式（１）で表される化合物の生産能を有する微生物。
【化３】
【請求項６】
前記資化可能な炭素源がキシロース又はグルコースであることを特徴とする請求項５記載の微生物。
【請求項７】
配列番号１に示す塩基配列、又は配列番号１に示す塩基配列と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく分子系統学上同等の塩基配列、を含む１６ ＳｒＲＮＡ遺伝子を有し、以下の菌学的性質を示すことを特徴とする請求項５又は６記載の微生物。
（１）グラム染色性 陽性
（２）菌の形状 球状
（３）運動性 無し
（４）胞子 形成
（５）分岐した菌糸の形成 形成する
（６）気中菌糸の形成 形成しない
【請求項８】
マイセリゲネランス・エスピー（Myceligenerans sp.）ＫＳＭ−ＴＢ８３９株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８５０）。
【請求項９】
下記式（１）で表される化合物。
【化４】
【請求項１】
マイセリゲネランス（Myceligenerans）属に属する微生物を、資化可能な炭素源を含む培地で培養し、培地中に下記式（１）で表される化合物を生成させることを特徴とする、下記式（１）で表される化合物の製造方法。
【化１】
【請求項２】
前記資化可能な炭素源がキシロース又はグルコースであることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記マイセリゲネランス（Myceligenerans）属に属する微生物が、配列番号１に示す塩基配列、又は配列番号１に示す塩基配列と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく分子系統学上同等の塩基配列、を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、以下の菌学的性質を示し、資化可能な炭素源からの下記式（１）で表される化合物の生産能を有する微生物である、請求項１又は２記載の製造方法。
（１）グラム染色性 陽性
（２）菌の形状 球状
（３）運動性 無し
（４）胞子 形成
（５）分岐した菌糸の形成 形成する
（６）気中菌糸の形成 形成しない
【化２】
【請求項４】
前記マイセリゲネランス（Myceligenerans）属に属する微生物がマイセリゲネランス・エスピー（Myceligenerans sp.）ＫＳＭ−ＴＢ８３９株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８５０）である請求項１〜３のいずれか記載の製造方法。
【請求項５】
マイセリゲネランス（Myceligenerans）属に属し、資化可能な炭素源からの下記式（１）で表される化合物の生産能を有する微生物。
【化３】
【請求項６】
前記資化可能な炭素源がキシロース又はグルコースであることを特徴とする請求項５記載の微生物。
【請求項７】
配列番号１に示す塩基配列、又は配列番号１に示す塩基配列と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく分子系統学上同等の塩基配列、を含む１６ ＳｒＲＮＡ遺伝子を有し、以下の菌学的性質を示すことを特徴とする請求項５又は６記載の微生物。
（１）グラム染色性 陽性
（２）菌の形状 球状
（３）運動性 無し
（４）胞子 形成
（５）分岐した菌糸の形成 形成する
（６）気中菌糸の形成 形成しない
【請求項８】
マイセリゲネランス・エスピー（Myceligenerans sp.）ＫＳＭ−ＴＢ８３９株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８５０）。
【請求項９】
下記式（１）で表される化合物。
【化４】
【図２】
【図１】
【図１】
【公開番号】特開２０１１−２５４７８０（Ｐ２０１１−２５４７８０Ａ）
【公開日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１３３９５８（Ｐ２０１０−１３３９５８）
【出願日】平成２２年６月１１日（２０１０．６．１１）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【出願人】（５０４１９６３００）国立大学法人東京海洋大学 (83)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１１日（２０１０．６．１１）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【出願人】（５０４１９６３００）国立大学法人東京海洋大学 (83)
【Ｆターム（参考）】
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