糖鎖の合成方法
本発明の目的は、ヌクレオチド（核酸）、ペプチド（タンパク質）、糖鎖に代表される生体分子を効率良く化学合成する方法を提供することである。本発明によれば、複数種の単糖ユニットを含む少なくとも１以上の糖鎖合成反応系において複数種の糖鎖を合成する糖鎖固相合成方法において、該糖鎖合成反応系の温度を、反応系中の副反応を低下させることを指標として決定した昇温率に従って変化させることを特徴とする、糖鎖固相合成方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、重要な機能を有する生体成分の一群をなす糖鎖の化学合成、特に糖鎖の固相合成に関する。
【背景技術】
化学合成によるオリゴ糖鎖及びその複合体の合成が報告されている（Ｐａｕｌｓｅｎ，Ｈ．（１９８２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２１，１５５−１７３；Ｔｏｓｈｉｍａ，Ｋ．，Ｔａｔｓｕｔａ，Ｋ．（１９９３）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９３，１５０３−１５３１；及びＢｏｏｎｓ，Ｇ．−Ｊ．（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５２，１０９５−１１２１）。しかしながら、現存の化学合成では、操作が煩雑で時間を要する反応後のクロマトグラフィーによる単離精製操作が必要不可欠であり、操作に習熟を要する（Ｋａｎｉｅ，Ｏ．，Ｈｉｎｄｓｇａｕｌ，Ｏ．（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．２，６７４−６８１）。その解決法の一つとして固相合成がある。固相合成法はペプチドやヌクレオチド合成でも使用され、その有用性は高い。オリゴ糖鎖の合成には、カップリング反応に伴う立体選択的なグリコシド結合形成と位置選択的なグリコシル化を行うための保護基の巧みな使い分けが必要不可欠であり、近年まで困難な課題と考えられてきたが、これまでの研究の結果、幾つかの成功例が報告されている（Ｆｒ▲ｅ▼ｃｈｅｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｃｈｕｅｒｃｈ，Ｃ．（１９７２）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２２，３９９−４１２；Ｃｈｉｕ，Ｓ．−Ｈ．Ｌ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．（１９７６）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．５０，２２７−２３８；Ｙａｎ，Ｌ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｇｏｏｄｎｏｗ，Ｒ．Ｊｒ．，Ｋａｈｎｅ，Ｄ．（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６，６９５３−６９５４；Ｒｅｄｅｍａｎｎ，Ｊ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．Ｒ．（１９９７）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２，３６５０−３６５３；Ｈｅｃｋｅｌ，Ａ．，Ｍｒｏｓｓ，Ｅ．，Ｊｕｎｇ，Ｋ．−Ｈ．，Ｒａｄｅｍａｎｎ，Ｊ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．Ｒ．（１９９８）Ｓｙｎｌｅｔｔ，１７１−１７３；Ｎｉｃｏｌａｏｕ，Ｋ．Ｃ．，Ｗｉｎｓｓｉｎｇｅｒ，Ｎ．，Ｐａｓｔｏｒ，Ｊ．，ＤｅＲｏｏｓｅ，Ｆ．（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９，４４９−４５０；Ｎｉｃｏｌａｏｕ，Ｋ．Ｃ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎ．，Ｌｉ，Ｊ．，Ｐａｓｔｏｒ，Ｊ．，Ｗｉｓｓｉｎｇｅｒ，Ｎ．（１９９８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３７，１５５９−１５６１；Ｒｏｄｅｂａｕｇｈ，Ｒ．，Ｊｏｓｈｉ，Ｓ．，Ｆｒａｓｅｒ−Ｒｅｉｄ，Ｂ．，Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．（１９９７）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２，５６６０−５６６１；Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ，Ｓ．Ｊ．，ＭｃＣｌｕｒｅ，Ｋ．Ｆ．，Ｒａｎｄｏｌｐｈ，Ｊ．Ｔ．，Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｒ．Ｂ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０，１３０７−１３０９；Ｚｈｅｎｇ，Ｃ．，Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ，Ｐ Ｈ．，Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ，Ｓ．Ｊ．（１９９８）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３，１１２６−１１３０；Ｉｔｏ，Ｙ．，Ｋａｎｉｅ，Ｏ．，Ｏｇａｗａ，Ｔ．（１９９６）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３５，２５１０−２５１２；Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｓ．Ｐ．，Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｄ．Ｍ．，Ｋｒｅｐｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７，２１１６−２１１７；Ｖｅｒｄｕｙｎ，Ｒ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｌｅｉｎ，Ｐ．Ａ．Ｍ．，Ｄｏｕｗｅｓ，Ｍ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａｒｅｌ，Ｇ．Ａ．，ｖａｎ Ｂｏｏｍ，Ｊ．Ｈ．（１９９３）Ｊ．Ｒ．Ｎｅｔｈ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２，４６４−４６６；Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｈ．，Ｉｔｏ，Ｙ．，Ｋａｎｉｅ，Ｏ．，Ｏｇａｗａ，Ｔ．（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．６，２８４１−２８４６；Ａｄｏｉｎｏｌｆｉ，Ｍ．，Ｂａｒｏｎｅ，Ｇ．，ＤｅＮａｐｏｌｉ，Ｌ．，Ｌａｄｏｎｉｓｉ，Ａ．，Ｐｉｃｃｉａｌｌｉ，Ｇ．（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７，５００７−５０１０；Ｓｅｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．Ｈ．，Ｂｅｅｂｅ，Ｘ．，Ｓｕｋｅｎｉｃｋ，Ｇ．Ｄ．，Ｐｏｃｈａｐｓｋｙ，Ｓ．，Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ，Ｓ．Ｊ．（１９９７）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３６，４９１−４９３；Ｋａｎｅｍｉｔｓｕ，Ｔ．，Ｋａｎｉｅ，Ｏ．，Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．（１９９８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３７，３４１５−３４１８；及び、ＷＯ０２／１６３８４号公報）。
そのような多数の知見に基づいて、糖鎖の合成を効率的に行うために有用と考えられている糖鎖ライブラリーの合成も数多く行われてきている。例えば、Ｈｉｎｄｓｇａｕｌらは、糖鎖化学の基礎を根底から見直し無保護の糖受容体に対するＢｎ保護された糖供与体（イミデート）によるグリコシル化反応（ランダムグリコシル化）を試し、その結果位置選択性の無いランダムな縮合物混合物が容易に得られることを見出した。この方法は単一化合物の合成を目的としていないが、シークエンスは反応の順に従っている。さらに、与えられた混合物が糖転移酵素によりスクリーニングされ、特異的に既知反応をピックアップすることが示された（Ｋａｎｉｅ，Ｏ．，Ｂａｒｒｅｓｉ，Ｆ．，Ｄｉｎｇ，Ｙ．，Ｌａｂｂｅ，Ｊ．，Ｏｔｔｅｒ，Ａ．，Ｆｏｒｓｂｅｒｇ，Ｌ．Ｓ．，Ｅｒｎｓｔ，Ｂ．，Ｈｉｎｄｓｇａｕｌ，Ｏ．（１９９５）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３４，２７２０−２７２２；及びＤｉｎｇ，Ｙ．，Ｋａｎｉｅ，Ｏ．，Ｌａｂｂｅ，Ｊ．，Ｐａｌｃｉｃ，Ｍ．Ｍ．，Ｅｒｎｓｔ，Ｂ．，Ｈｉｎｄｓｇａｕｌ，Ｏ．“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ”ｉｎ Ｇｌｙｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．ｂｙ Ａｌａｖｉ，Ａ．，Ａｘｆｏｒｄ，Ｊ．Ｓ．，（１９９５）Ａｖｄ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３７６，Ｐｌｅｎｕｍ ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２５９−２６９）。
固相上でグリコシル化とアミノ基の誘導化を行いｓｐｌｉｔ ａｎｄ ｍｉｘ法によるライブラリー合成もＫａｈｎｅ，Ｓｔｉｌｌらにより報告された。おのおののステップ毎にタッギングがなされ、固相上での脱保護の後、アッセイとデコーディングによりレクチンに対する既知リガンドよりも強力なリガンド構造が見い出された（Ｌｉａｎｇ，Ｒ．，Ｙａｎ，Ｌ．，Ｌｏｅｂａｃｈ，Ｊ．，Ｇｅ，Ｍ．，Ｕｏｚｕｍｉ，Ｙ．，Ｓｅｋａｎｉｎａ，Ｋ．，Ｈｏｒａｎ，Ｎ．，Ｇｉｌｄｅｒｓｌｅｅｖｅ，Ｊ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．，Ｓｍｉｔｈ，Ａ．，Ｂｉｓｗａｓ，Ｋ．，Ｓｔｉｌｌ，Ｗ．Ｃ．，Ｋａｈｎｅ，Ｄ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４，１５２０−１５２２）。アリル−ビニルの二重結合異性化を巧みに糖鎖合成に用いる合成法により、三糖ライブラリーがＢｏｏｎｓらにより合成され、今後への可能性が示された。ここでは溶液反応が用いられ、ｓｐｒｉｔ ａｎｄ ｍｉｘ法により糖結合位置の決定したライブラリーを得ることに成功している（Ｂｏｏｎｓ，Ｇ．−Ｊ．，Ｈｅｓｋａｍｐ，Ｂ．，Ｈｏｕｔ，Ｆ．（１９９６）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３５，２８４５−２８４７）。Ｂｏｏｎｓらはまた、固相上での化学種選択的なグリコシル化反応を試みるとともに、ライブラリー合成も行い１２の三糖のライブラリーを報告した（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．，Ａｒｌｅｓ，Ｃ．，Ｂｏｏｎｓ，Ｇ．−Ｊ．（１９９８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３９，９８０１−９８０４；及びＺｈｕ，Ｔ．，Ｂｏｏｎｓ，Ｇ．−Ｊ．（１９９８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３７，１８９８−１９００）。ＩｃｈｉｋａｗａらはグリカールをＩＤＣＰによって活性化し、無保護のジオール単糖受容体とカップリング、立体選択的であるが、位置選択性の無い２−ｄｅｏｘｙ糖三糖ライブラリーを合成した（Ｉｚｕｍｉ，Ｍ．，Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｙ．（１９９８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３９，２０７９−２０８２）。Ｗｏｎｇらは、オルトゴナル保護（Ｂａｒａｎａｙ，Ｇ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．，（１９７７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６，７３６３−７３６５）した単糖を母核とし保護基を欲しい順に脱保護することで直鎖三糖から高度に分岐した五糖保護糖のライブラリーを合成した（Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．，Ｙｅ，Ｘ．−Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｚ．（１９９８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０，７１３７−７１３８）。また、化学種選択的なグリコシル化反応におけるアノメリック位保護基（チオグリコシド）の反応性を精査し、Ａｒｍｅｄ−ｄｉｓａｒｍｅｄグリコシル化による。ｏｎｅ−ｐｏｔグリコシル化を完成、これに基づくコンピューターによる反応の選択、オルトゴナルな保護基の除去を通じ、糖鎖ライブラリーの自動化への道を開いた（Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｏｌｌｍａｎｎ，Ｉ．Ｒ．，Ｙｅ，Ｘ．−Ｓ．，Ｗｉｓｃｈｎａｔ，Ｒ．，Ｂａａｓｏｖ，Ｔ．，Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１，７３４−７５３）。Ａｒｍｓｔｒｏｎｇらは１９９４年いち早く糖鎖ライブラリーに着目し、末端にカルボン酸をもつジエン系のオスミウム酸化と還元的環化によりＣ−グリコシル二糖の還元末端相当糖の水酸基の立体異性体ライブラリーを発表した（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｒ．Ｗ．，Ｓｕｔｈｅｒｌｉｎ，Ｄ．Ｐ．（１９９４）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３５，７７４３−７７４５）。
また、ＷＯ９６／０６１０２号公報及びオーストラリア特許公報ＡＵ３３４６４９５号公報（発行日：１９９６年３月１６日）には糖鎖ライブラリーの構築法が記載されている。ＷＯ９６／０６１０２号公報及びオーストラリア特許公報ＡＵ３３４６４９５号公報（発行日：１９９６年３月１６日）においては、保護基を持たない糖受容体を用い、これに対して保護糖供与体を化学的に反応させることにより、位置ランダムの糖鎖ライブラリー合成を迅速に行っている。
また米国特許第５，７２１，０９９号公報には、レジン上に核酸、ペプチド、糖鎖等を有機合成化学的手法によって構築する方法が記載されている。米国特許第５，７２１，０９９号公報では、同一レジン上にモレキュラーコーディングを行う。ライブラリー合成はスプリット＆ミックス法で行われ、したがって、１レジン−１化合物のレジン混合物を与える。合成の最後に全ての脱保護を行い、タンパク質等のバイオ分子のスクリーニングに直接用いる。合成物質が極微量であるので、ヒットしたビーズのみのデコードを行って、ビーズ上の化合物の構造を特定する。
しかし、上記したような多数の糖鎖ライブラリーの合成例、構築例は、いずれも成功例とは言いがたい。その理由としては、例えば、立体選択的、位置選択的なグリコシル化反応を行うためには数多くの単糖ユニットを必要とするが、労力もコストも膨大に必要となることからそれらを網羅的に合成することは困難だったことが挙げられる。
このような理由から、十分な数の糖鎖を含む糖鎖ライブラリーの合成を簡便に行えるような、効率の良い糖鎖固相合成方法の確立が強く望まれている。
一方、糖鎖等の合成において繁用されている固相反応方法は、前記のとおり、ペプチドやヌクレオチド合成でも広く用いられ、その有用性は高く評価されている。すなわち、反応に固相を利用することによって、単離精製操作等が簡略化され、効率も良く、熟練者でなくても操作が可能であるほか、装置の開発等への貢献も大きい。
例えば、ペプチド合成及びヌクレオチド（核酸）合成においては、基本的な合成方法はほぼ確立しており、多数の合成装置が市販されている（例えば、米国特許第５４６２７４８号公報参照）。しかし、いずれの装置も大型で、溶液を多量に必要とすることから、装置の小型化、試薬の少量化やコストダウン等については未だ改良の余地がある。また、糖鎖については、未だに合成装置は市販されていない。いくつか試みられた例はある（例えば、ＷＯ０２／１６３８４号公報参照）が、いずれも何らかの問題点を有するものであり、実用化には至っていない。これらのことから、小型で必要とする液量が少なく、効率的に固相反応を行うことのできる方法及び装置の開発、特に糖鎖の合成装置の開発が強く望まれている。
【発明の開示】
本発明は、ヌクレオチド（核酸）、ペプチド（タンパク質）、糖鎖に代表される生体分子を効率良く化学合成する方法を提供することを解決すべき課題とした。特に、本発明は、市販の合成装置が無い糖鎖の合成装置の基礎となる方法を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、先ず、糖鎖の合成、さらには糖鎖のコンビナトリアルケミストリーの効率化を可能とする各種の単糖ユニットを合成した。次いで、合成した複数種の単糖ユニットを用いて複数種の糖鎖を合成する糖鎖固相合成を行う際に反応系の昇温率を制御することに着目し、糖鎖合成反応系の温度を、反応系中の副反応を低下させることを指標として決定した昇温率に従って変化させることにより、糖鎖を効率良く化学合成できることを見出した。さらに、本発明者らは、糖鎖等の生体分子の固相合成において撹拌等のプロセスを使用することなく、拡散支配による反応を行うことによって糖鎖の固相合成を効率良く行うことができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１） 複数種の単糖ユニットを含む少なくとも１以上の糖鎖合成反応系において複数種の糖鎖を合成する糖鎖固相合成方法において、該糖鎖合成反応系の温度を、反応系中の副反応を低下させることを指標として決定した昇温率に従って変化させることを特徴とする、糖鎖固相合成方法。
（２）糖鎖固相合成方法が以下の工程を含む、（１）に記載の糖鎖固相合成方法。
（ａ）下記式（１）：
Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ａ１−Ｘ （１）
（式中、Ｐは固相を示し、Ｌはリンカーを示し、Ｏは単糖の非還元末端の酸素原子を示し、Ａ１は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、Ｘは脱離基Ｙの活性化条件下で安定な脱離基を示す。）
の単糖ユニットに、下記式（２）：
ＨＯ−Ａ２−Ｙ （２）
（式中、Ａ２は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、Ｙは脱離基Ｘの活性化条件下で安定な脱離基を示す。）
の単糖ユニットを脱離基Ｘの活性化条件下で反応させて、下記式（３）：
Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ａ１−Ｏ−Ａ２−Ｙ （３）
の糖類を得る工程：及び
（ｂ）上記工程（ａ）で得た式（３）の糖類に、下記式（４）：
ＨＯ−Ａ３−Ｘ’ （４）
（式中、Ａ３は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、Ｘ’は脱離基Ｙの活性化条件下で安定な脱離基あるいは１位の水酸基または保護基を示す。）
の単糖ユニットを脱離基Ｙの活性化条件下で反応させて、式（５）：
Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ａ１−Ｏ−Ａ２−Ｏ−Ａ３−Ｘ’ （５）
の糖類を得る工程。
（３） 工程（ｂ）においてＸ’が１位の水酸基または保護基である式（４）の単糖ユニットを使用し、３つの糖が連結した糖鎖を合成する、（２）に記載の糖鎖固相合成方法。
（４） 工程（ｂ）で得た式（５）の糖類に対し、工程（ａ）と工程（ｂ）の反応を繰り返すことを含む、（２）に記載の糖鎖固相合成方法。
（５） 式（１）、（２）及び（４）の単糖ユニットを一反応系に同時に反応させて反応を行う、（２）から（４）の何れかに記載の糖鎖固相合成方法。
（６） 脱離基Ｘがフェニルチオ基又はフッ素基の片方であり、脱離基Ｙがフェニルチオ基又はフッ素基の他方である、（２）から（５）の何れかに記載の糖類固相合成方法。
（７） フェニルチオ基の活性化をＮ−ヨードサクシンイミド−トリフルオロメタンスルホン酸（ＮＩＳ−ＴｆＯＨ）またはジメチルメチルチオスルフォニウムトリフラート（ＤＭＴＳＴ）により行い、フッ素基の活性化をＳｎ（ＣｌＯ４）２、Ｓｎ（ＯＴｆ）２、Ｃｐ２Ｈｆ（ＣｌＯ４）２、またはＣｐ２Ｈｆ（ＯＴｆ）２により行う、（６）に記載の糖鎖固相合成方法。
（８） 保護基がベンジル基である、（２）から（７）の何れかに記載の糖鎖固相合成方法。
（９） Ａ１、Ａ２及びＡ３が示す単糖骨格が生体中に存在する単糖から選ばれる３種類の糖の単糖骨格である、（２）から（８）の何れかに記載の糖鎖固相合成方法。
（１０） Ａ１、Ａ２及びＡ３が示す単糖骨格が、マンノース、グルコース、ガラクトース、キシリトース、グルコサミン、ガラクトサミン、グルクロン酸、フルクトース又はシアル酸の単糖骨格である、（２）から（９）の何れかに記載の糖鎖固相合成方法。
（１１） フェニル１−チオ−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノピラノシド、フェニル１−チオ−２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノピラノシド、フェニル１−チオ−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノピラノシド、フェニル１−チオ−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノピラノシド、フェニル１−チオ−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル１−チオ−２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル１−チオ−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル１−チオ−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド、フェニル３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド、フェニル２，４−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド、フェニル１−チオ−２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−β−Ｌ−フコピラノシド、フェニル２−アジド−４，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル２−アジド−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル２−アジド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２−アジド−４，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２−アジド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２−アジド−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、
メチル（フェニル１−チオ−２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド）ウロネート、メチル（フェニル５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−２−チオ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシド）オネート、メチル（フェニル５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−２−チオ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシド）オネート、メチル（フェニル５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−２−チオ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシド）オネート、メチル（フェニル５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−２−チオ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシド）オネート、並びに上記化合物中のフェニルチオ基をフッ素基に置換した化合物から成る群から選択される少なくとも１以上の単糖誘導体を含む、（１）から（１０）の何れかに記載の糖鎖固相合成方法を行うための単糖ライブラリー。
（１２） 毛管現象を生じる大きさの固体細孔中で固相反応を行う方法において、固体の外表面に余剰の液相が存在しない状態で反応を行うことを特徴とする固相反応方法。
（１３） 反応が拡散混合により行われることを特徴とする（１２）に記載の固相反応方法。
（１４） 固体が、内部に細孔を有する樹脂粒子である、（１２）又は（１３）に記載の固相反応方法。
（１５） 固相反応が化学反応または生化学的反応である、（１２）から（１４）の何れかに記載の固相反応方法。
（１６） 固相反応が糖鎖合成反応である、（１２）から（１５）の何れかに記載の固相反応方法。
（１７） 固相反応が（１）から（１０）の何れかに記載の糖鎖固相合成反応である、（１２）から（１６）の何れかに記載の固相反応方法。
（１８） （１）から（１０）の何れかに記載の糖鎖固相合成方法または（１７）に記載の固相反応方法により合成された、生体中に存在する単糖から選ばれる３種類の糖の全ての組み合わせから成る糖鎖により構成されるライブラリー。
（１９） 生体中に存在する単糖が、マンノース、グルコース、ガラクトース、キシリトース、グルコサミン、ガラクトサミン、グルクロン酸、フルクトース又はシアル酸である、（１８）に記載のライブラリー。
（２０） 少なくとも以下の（１）と（２）とを含む、（１２）から（１７）の何れかに記載の固相反応方法を行うための反応装置。
（１）液相を注入又は吸引するための導入部を有し、かつ固体を収容する空間を有する、固相反応を行うための反応部、及び
（２）反応部の温度を調節するための温度調節部
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明で用いるオルトゴナル法の概要を示す。
図２は、本発明で用いる単糖誘導体ライブラリーを示す。
図３は、樹脂ビーズの細孔を示す。
図４は、従来法による固相反応法と本発明による拡散混合固相反応法の様子を示す。
図５は、２３通りのアノマー異性体を示す。
図６は、固相上でのグリコシルフルオリドの活性化によるグリコシル化反応において、３時間で−１５℃から１０℃への昇温（８．３℃／時間）を行った際のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの解析結果を示す。
図７は、固相上でのグリコシルフルオリドの活性化によるグリコシル化反応において、４．５時間で−１５℃から１０℃への昇温（５．６℃／時間）を行った際のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの解析結果を示す。
図８は、固相上でのグリコシルフルオリドの活性化によるグリコシル化反応において、６時間で−１５℃から１０℃への昇温（４．２℃／時間）を行った際のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの解析結果を示す。
図９は、固相上でのチオグリコシドの活性化によるグリコシル化反応において、４．５時間で−１５℃から１０℃への昇温（５．６℃／時間）を行った際のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの解析結果を示す。
図１０は、固相上でのチオグリコシドの活性化によるグリコシル化反応において、６時間で−１５℃から１０℃への昇温（４．２℃／時間）を行った際のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの解析結果を示す。
図１１は、固相上でのチオグリコシドの活性化によるグリコシル化反応において、１２時間で−１５℃から１０℃への昇温（２．１℃／時間）を行った際のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの解析結果を示す。
図１２は、供与体が結合した樹脂を受容体溶液で膨潤しプロモーターを加える方法でグリコシル化反応を行った場合の追跡結果を示す。
図１３は、供与体が結合した樹脂を受容体とプロモーターの混液により膨潤する方法でグリコシル化反応を行った場合の追跡結果を示す。
図１４は、樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→２）−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
図１５は、樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
図１６は、樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
図１７は、樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→６）−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
図１８は、固相上で合成した三糖誘導体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
図１９は、固相上で合成した三糖誘導体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
図２０は、固相上で合成した三糖誘導体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
図２１は、固相上で合成した三糖誘導体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
図２２は、固相上で合成した三糖誘導体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
図２３は、固相上で合成した三糖誘導体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
図２４は、固相上で合成した三糖誘導体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
図２５は、固相上で合成した三糖誘導体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明するが、以下の構成要件の説明は、本発明の実施態様の代表例であり、本発明はこれらの内容のみに特定されるものではない。なお、以下に記載する糖鎖固相合成反応、用いる固相、液相等は、特に例示した場合を除き、「固相合成ハンドブック（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社（Ｍｅｒｃｋ社）刊」等に記載の公知の方法から適宜選択して行うことができる。
（１）昇温率を制御した糖鎖固相合成方法
本発明の糖鎖固相合成方法は、複数種の単糖ユニットを含む少なくとも１以上の糖鎖合成反応系において複数種の糖鎖を合成する糖鎖固相合成方法において、該糖鎖合成反応系の温度を、反応系中の副反応を低下させることを指標として決定した昇温率に従って変化させることを特徴とする方法である。
従来糖鎖合成反応においては、反応させようとする糖によって至適な反応温度が異なるために、反応系の反応温度を細かく制御する必要があることは知られていた。反応温度の制御を十分に行わないと、未反応物、脱離物等が生じ、所望の反応生成物を十分量得ることができないためである。しかし、糖には多種多様なものが存在するだけでなく、それぞれが立体異性や位置異性を有しており、それらの要因によっても反応性が異なることから、反応を行うたびに用いる糖ごとに至適反応温度を決定するとなると膨大な検討が必要になってしまう。そこで、従来は、反応数が多い場合には用いる糖ごとに至適反応温度を検討することができず、ごく一般的と考えられる平均的な温度を設定して反応を行う等の方法を用いており、そのために十分量の反応生成物を得ることが困難なことが多かった。
本発明者らは、これらの問題を鋭意検討した結果、複数種の単糖ユニットを含む少なくとも１以上の糖鎖合成反応系、好ましくは、２以上の糖鎖合成反応系を用いて反応を行う場合に、これらの反応系の温度を、反応系中の副反応を低下させることを指標として決定した昇温率に従って変化させれば、各々の単糖ユニットごとに至適な反応温度を検討する必要なく、効率的に糖鎖固相合成反応を行えることを見出した。すなわち、反応温度を変化させることによって、各反応系中に含まれる単糖ユニットがそれぞれに至適な温度に到達した時点で反応し、糖鎖合成反応が行われることを見出した。また、本発明者らによる更なる検討の結果、前記昇温率を反応系中の副反応を低下させることを指標に決定すれば、さらに効率よく糖鎖固相合成反応を行えることも明らかになった。
かくして完成された本発明の糖鎖固相合成方法は、従来大きな課題であった糖鎖固相合成反応の反応温度を逐一検討する必要なく、効率的に多種類の糖鎖を合成することができるという大きな効果を奏するものである。
本発明で行う糖鎖合成反応自体は当業者に公知の手法で行うことができ、具体的には反応に不活性な適当な溶媒中で、固相に結合した第一の単糖ユニットに、第二の単糖ユニットを含む溶液、第三の単糖ユニットを含む溶液、並びに所望によりそれ以降の単糖ユニットを含む溶液を順次添加して反応させることにより、これらの単糖ユニットをそれぞれ順番に結合させていくことができる。なお、本明細書で単に糖鎖という場合には、単糖が２以上結合して鎖状になったものを意味する。
本発明で用いる複数種の単糖ユニットの種類は単糖類である限り特に限定されないが、好ましくは生体中に存在する単糖から選ばれる単糖骨格を含むものである。特に好ましい単糖骨格は、マンノース、グルコース、ガラクトース、キシリトース、グルコサミン、ガラクトサミン、グルクロン酸、フルクトース又はシアル酸の単糖骨格である。本発明ではこれらの単糖ユニットの複数を使用して、少なくとも１以上の糖鎖合成反応系において複数種の糖鎖を合成する。糖鎖合成反応系は１反応系でもよいし、２以上の複数の反応系でもよい。
１反応系で反応を行う場合には、１種又は２種以上の単糖ユニットを結合した固相を含む１反応系に、単糖ユニットを含む１種又は２種以上の溶液を添加して糖鎖合成反応を行って２つの単糖から成る糖鎖を合成する。次いで、この反応系に、単糖ユニットを含む１種又は２種以上の溶液を添加して、次の糖鎖合成反応を行い、３つの単糖から成る糖鎖を合成することができる。以下、これを繰り返すことにより所望の長さの糖鎖を合成することができる。ただし、このように一反応系で同時に複数種類の糖鎖を合成する場合には、反応の各段階において、もしくは最終段階において、各糖鎖を分離・精製する操作が必要である。
２以上の複数の反応系で反応を行う場合には、例えば、それぞれ異なる単糖ユニット（例えばＸ１とＸ２）を結合した固相を含む２種類の反応系をそれぞれ２個ずつ用意し（合計４個の反応系）、それぞれに異なる単糖ユニット（例えばＹ１とＹ２）を含む溶液を添加して糖鎖合成反応を行って２つの単糖から成る糖鎖を合成する。これにより、４個の反応系においてはそれぞれ、Ｘ１とＹ１から成る二糖、Ｘ１とＹ２から成る二糖、Ｘ２とＹ１から成る二糖、及びＸ２とＹ２から成る二糖が生成する。この反応生成物をさらに半分ずつに分割して、それぞれの反応系に、異なる単糖ユニット（例えばＺ１とＺ２）を含む溶液を添加して、糖鎖合成反応を行って３つの単糖から成る糖鎖を合成することができる。これにより、各反応系において、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｚ１、Ｚ２の全ての組み合わせの８通りの反応生成物を得ることができる。反応後に目的の糖鎖を分離・精製する必要がないことから、本発明においてはこの複数の反応系で反応を行う方法が好ましく用いられる。例えば、上記のように８種類の糖鎖を合成したい場合には１回目の反応では４つの反応系、２回目の反応では８つの反応系を予め用意し、好ましくはこれらを同時並行で反応させればよい。
本発明の特徴の一つは、上記した糖鎖合成反応系の温度を、反応系中の副反応を低下させることを指標として決定した昇温率に従って変化させることである。本明細書の実施例で示す通り、昇温率を大きくすると副生物が生成し、糖鎖合成反応の反応効率が低下することが判明した。従って、本発明においては、反応系中の副反応をできるだけ低下させることを指標にして決定した昇温率に従って糖鎖合成反応系の温度を変化させることにより、効率の良い糖鎖合成反応を行うことができる。
ここで、副反応とは、所望の糖鎖合成反応の反応効率を妨げるような副生物を生じる反応を意味し、副生物とは、例えば、脱離反応生成物（脱離物）、加水分解物等を意味する。脱離物とは、例えば、目的とする２分子間反応であるグリコシル化反応に代わって分子内反応が起こることにより生成するグリカール等である。すなわち、本発明において「副反応を低下させることを指標にする」とは、例えば、「副生物の存在または量が目的の反応を阻害しない程度に低いことを指標にすること」を意味する。特に、脱離物の量が十分に低いことが好ましい。また、反応の効率が悪いと未反応物が多く残存することから、この未反応物を低下させることもあわせて指標とすることがさらに好ましい。副生物の存在または量は、例えば、質量分析法（ＭＳ）、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、吸光度測定、旋光度測定等により検出し確認することができる。
温度の制御は、前記したような１反応系もしくは２以上の複数の反応系の温度を、決定した昇温率に従って変化させながら糖鎖合成反応を行うことのできる方法であればいかなる方法で行われてもよい。具体的には、温度の制御は、それ自体公知の通常用いられる化学反応等に利用可能な温度調節装置等を用いればよい。１反応系を用いる場合には、該反応系の温度を予め決定した昇温率に従って変化させればよい。２以上の複数の反応系を用いる場合には、各々の反応系の温度を予め決定した昇温率に従って変化させてもよいし、複数の反応系をまとめて一つの温度調節装置により温度制御してもよい。特に糖鎖ライブラリーの合成を行う場合等には、複数の反応系をまとめて一つの温度調節装置により温度制御し、同時並行で多数の糖鎖を合成する方法が好ましく用いられる。
昇温率や反応開始温度は、用いる単糖や脱離基により適宜設定される。反応温度が高いと副反応が進行しやすいが、反応開始温度や昇温率が低すぎると反応時間が長くなる。本発明の好ましい例では、脱離基としてフッ素基またはフェニルチオ基を有する単糖ユニットを、フッ素基またはフェニルチオ基の活性化条件下で水酸基を有する別の単糖ユニットと反応させる。このとき、昇温率は、たとえば、８℃／時間以下、好ましくは７℃／時間以下、より好ましくは５．６℃／時間以下である。好ましい昇温率の範囲は、用いる脱離基や単糖により異なるので、適宜確認実験を行い決定すればよい。反応開始温度は、用いる単糖ユニットにより異なるが、系に存在する単糖のうち、最も反応性の高い（副反応を生じやすい）単糖に合わせて設定し、その温度から昇温させればよい。たとえば、本発明において好ましい例として用いる生体内に存在する９種の単糖の中でもっとも反応性の高い（すなわち、反応温度を低く設定すべき）フコースの場合で、−３０℃〜−１５℃程度から開始させることができる。このように、各単糖に適した昇温率および反応開始温度を設定することにより、副反応をできるだけ低下させて、目的の糖鎖合成反応を高効率で行うことができる。
糖鎖は、核酸やタンパク質に次いで第３の生体高分子と捉えられ、細胞分化、免疫、癌化、感染症等、多細胞生物の生物機能に非常に重要な役目を果たしている。核酸、タンパク質については化学合成装置が販売され、科学の進歩・発展に大きく貢献しているが、糖鎖の化学合成装置は販売されておらず早期の開発が望まれている［Ｐｌａｎｔｅ，Ｏ．Ｊ．，Ｐａｌｍａｃｃｉ，Ｅ．Ｒ．，Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．Ｈ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１，１５２３−１５２７］。化学的手法による合成の基盤をなすのは固相合成であり、装置化の前段階としては素反応、また、総合的なプロセスの効率化を行う必要がある。この目的の達成のために本発明の糖鎖固相合成方法は非常に有用である。また、本発明の方法においては、前述の通り、糖鎖合成反応自体は公知の方法を用いることができるが、その中でも、反応性の独立性（相互選択性）を基礎とするオルトゴナルグリコシル化法（以下、これを「オルトゴナル法」と称することがある）が、最適な方法としてあげられる。［Ｋａｎｉｅ，Ｏ．，Ｉｔｏ，Ｙ．，Ｏｇａｗａ，Ｔ．，（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６，１２０７３−１２０７４．ｂ）Ｋａｎｉｅ，Ｏ．，Ｉｔｏ，Ｙ．，Ｏｇａｗａ，Ｔ．，（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３７，４５５１−４５５４．ｃ）Ｉｔｏ，Ｙ．，Ｋａｎｉｅ，Ｏ．，Ｏｇａｗａ，Ｔ．，（１９９６）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３５，２５１０−２５１２］
上記したオルトゴナルグリコシル化法による本発明における糖鎖固相合成反応の具体例としては、以下の工程を含む反応が挙げられる。また、その概要を図１に示す。
（ａ）下記式（１）：
Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ａ１−Ｘ （１）
（式中、Ｐは固相を示し、Ｌはリンカーを示し、Ｏは単糖の非還元末端の酸素原子を示し、Ａ１は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、Ｘは脱離基Ｙの活性化条件下で安定な脱離基を示す。）
の単糖ユニット（以下、これを「供与体」と称することがある）に、下記式（２）：
ＨＯ−Ａ２−Ｙ （２）
（式中、Ａ２は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、Ｙは脱離基Ｘの活性化条件下で安定な脱離基を示す。）
の単糖ユニット（以下、これを「受容体」と称することがある）を脱離基Ｘの活性化条件下で反応させて、下記式（３）：
Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ａ１−Ｏ−Ａ２−Ｙ （３）
の糖類を得る工程：及び
（ｂ）上記工程（ａ）で得た式（３）の糖類に、下記式（４）：
ＨＯ−Ａ３−Ｘ’ （４）
（式中、Ａ３は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、Ｘ’は脱離基Ｙの活性化条件下で安定な脱離基あるいは１位の水酸基または保護基を示す。）
の単糖ユニットを脱離基Ｙの活性化条件下で反応させて、式（５）：
Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ａ１−Ｏ−Ａ２−Ｏ−Ａ３−Ｘ’ （５）
の糖類を得る工程。
すなわち、オルトゴナル法とは、上記のように２種類（上記Ｘ及びＹ）の互いに活性化条件が異なり、かつ、他方の活性化条件下で安定な組み合わせの脱離基の性質を利用した、連続的かつ効率的な合成方法である。本明細書においては、このような２種類の脱離基を「オルトゴナルな関係にある」という。
上記の反応において、３つの糖が連結した糖鎖を合成する場合には、工程（ｂ）においてＸ’が１位の水酸基または保護基である式（４）の単糖ユニットを使用することができる。
また、上記の反応において、４つ以上の糖が連結した糖鎖を合成する場合には、工程（ｂ）で得た式（５）の糖類に対し、工程（ａ）の反応、さらに工程（ｂ）の反応を繰り返すことにより所望の長さの糖鎖を合成することができる。
Ｐが示す固相の具体例としては、糖鎖の固相合成に一般的に用いられるものであればよいが、各種の樹脂、たとえば、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ポリエーテル系樹脂、およびそれらの複合樹脂や、また、多孔性ガラス、ビーズ、微小流路（溶融シリカキャピラリー、マイクロチップ等）、セファロース等が挙げられる。これらはいずれも、固相合成に際してリンカーやスペーサー等を連結させるための足場となる、アミノ基、ブロモメチル基、水酸基、チオール基、カルボキシル基等の官能基を有しているものであって、さらに、適当な側鎖、修飾等を有するものでもよい。
Ｌが示すリンカーの具体例としては、固相と単糖の非還元末端の酸素原子とを連結できる基であって、合成反応の後に生成物に影響を与えないような温和な条件下で選択的に切り出すことが可能なものであればいかなるものでもよい。
Ｐが示す固相およびＬが示すリンカーは、より具体的には、たとえば、Ｋａｎｅｍｉｔｓｕ，Ｔ．ａｎｄ Ｋａｎｉｅ，Ｏ．，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，５，３３９−３６０（２００２）等に記載の糖鎖の合成反応に一般的に用いられる固相およびリンカーの中から、適当なものを選択して用いることができる。
Ａ１、Ａ２、及びＡ３は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、これらは互いに同一でも異なっていてもよい。単糖骨格の具体例は上記した通りである。水酸基の保護基としては、糖鎖合成反応の際に水酸基を保護できる基であれば特に限定されず、有機合成分野で当業者に公知の水酸基の保護基を適宜使用することができる。水酸基の保護基の具体例としては、以下のものが挙げられる。
（エーテル型）
メチル基、メトキシメチル基、メチルチオメチル基、ベンジルオキシメチル基、ｔ−ブトキシメチル基、２−メトキシエトキシメチル基、２，２，２−トリクロロエトキシメチル基、ビス（２−クロロエトキシ）メチル基、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル基、テトラヒドロピラニル基、３−ブロモテトラヒドロピラニル基、テトラヒドロチオピラニル基、４−メトキシテトラヒドロピラニル基、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル基、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルＳ，Ｓ−ジオキシド基、テトラヒドロフラニル基、テトラヒドロチオフラニル基；
１−エトキシエチル基、１−メチル−１−メトキシエチル基、１−（イソプロポキシ）エチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、２−（フェニルセレニル）エチル基、ｔ−ブチル基、アリル基、シンナミル基、ｐ−クロロフェニル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｏ−ニトロベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基、ｐ−ハロベンジル基、ｐ−シアノベンジル基、３−メチル−２−ピコリルＮ−オキシド基、ジフェニルメチル基、５−ジベンゾスベリル基、トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル基、ｐ−（ｐ’−ブロモフェナシルオキシ）フェニルジフェニルメチル基、９−アントリル基、９−（９−フェニル）キサンテニル基、９−（９−フェニル−１０−オキソ）アントリル基、ベンズイソチアゾリルＳ，Ｓ−ジオキシド基、；
トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ基）、（トリフェニルメチル）ジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ−ｔ−ブチルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ−ｐ−キシリルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリフェニルシリル基；
（エステル型）
ホルメート、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、ジクロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、フェノキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、２，６−ジクロロ−４−メチルフェノキシアセテート、２，６−ジクロロ−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシアセテート、２，４−ビス（１，１−ジメチルプロピル）フェノキシアセテート、クロロジフェニルアセテート、ｐ−フェニルアセテート、３−フェニルプロピオネート、３−ベンゾイルプロピオネート、イソブチレート、モノスクシノエート、４−オキソペンタノエート、ピバロエート、アダマントエート、クロトネート、４−メトキシクロトネート、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノエート、ベンゾエート、ｏ−（ジブロモメチル）ベンゾエート、ｏ−（メトキシカルボニル）ベンゾエート、ｐ−フェニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート、ｐ−ベンゾエート、α−ナフトエート；
（カーボネート型）
メチルカーボネート、エチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、イソブチルカーボネート、ビニルカーボネート、アリルカーボネート、シンナミルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、ベンジルカーボネート、ｐ−メトキシベンジルカーボネート、３，４−ジメトキシベンジルカーボネート、ｏ−ニトロベンジルカーボネート、ｐ−ニトロベンジルカーボネート、Ｓ−ベンジルチオカーボネート；
（その他）
Ｎ−フェニルカルバメート、Ｎ−イミダゾリルカルバメート、ボレート、ニトレート、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホロジアミダート、２，４−ジニトロフェニルスルフェネート：
なお、上記したような水酸基の保護基の導入法及び脱保護法は当業者に公知であり、例えば、Ｔｅｏｄｏｒａ，Ｗ．Ｇｒｅｅｎ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．（１９８１）などに記載されている。
本発明では特に好ましくは、ベンジル基を使用することができる。
Ｘ（及びＸ’）が示す脱離基Ｙの活性化条件下で安定な脱離基、並びにＹが示す脱離基Ｘの活性化条件下で安定な脱離基の組み合わせの具体例としては；
（１） 脱離基Ｘ（及びＸ’）がアリールチオ基又はアリールセレノ基、あるいはフッ素基の片方であり、脱離基Ｙがアリールチオ基又はアリールセレノ基、あるいはフッ素基の他方である場合、並びに
（２） 脱離基Ｘ（及びＸ’）がエチルチオ基（−ＳＣ２Ｈ５）であり、脱離基Ｙがピリジルスルホン基（−ＳＯ２Ｐｙｒ）である場合；
である。
ここでアリールチオ基（−Ｓ−Ａｒ）又はアリールセレノ基（−Ｓｅ−Ａｒ）におけるアリール（Ａｒ）部分は、活性化条件に適合する限り特に限定されないが、炭素数６以上のアリールが好ましく、例えば、フェニル又はナフタレンなどが挙げられ、フェニルが最も好ましい。
上記の中でも特に好ましいのは、（１）の場合であり、この場合、フェニルチオ基の活性化は、Ｎ−ヨードサクシンイミド−トリフルオロメタンスルホン酸（ＮＩＳ−ＴｆＯＨ）またはジメチルメチルチオスルフォニウムトリフラート（ＤＭＴＳＴ）等により行うことができる。ＮＩＳ及びＴｆＯＨを組み合わせた活性化剤（以下、これを「プロモーター」と称することがある）では、これらが反応して系内でヨードニウムイオン（Ｉ＋）を生成することにより活性化が行われ、高効率でヨードニウムイオンを発生することのできる組み合わせであれば、他の試薬の組み合わせも同様に活性化剤として用いることができる。ＤＭＴＳＴは、これをそのまま活性化剤として加えることもできるし、たとえば、ＭｅＳＳＭｅ（ジメチルジスルフィド）及びＭｅＯＴｆ（メチルトリフロロメタンスルホナート（メチルトリフラート））を加えることにより系内でＤＭＴＳＴを生成させることもできる。
また、フッ素基の活性化は、Ｓｎ（ＣｌＯ４）２（過ヨウ素酸第一スズ）、Ｓｎ（ＯＴｆ）２（トリフロロメタンスルホン酸スズ（ＩＩ））、Ｃｐ２Ｈｆ（ＣｌＯ４）２（過ヨウ素酸ハフノセン（ＩＩ））、またはＣｐ２Ｈｆ（ＯＴｆ）２（トリフロロメタンスルホン酸ハフノセン（ＩＩ））等により行うことができる。Ｓｎ（ＣｌＯ４）２はＳｎＣｌ２（塩化第一スズ）及びＡｇＣｌＯ４（過塩素酸銀）を、Ｓｎ（ＯＴｆ）２はＳｎＣｌ２及びＡｇＯＴｆ（銀トリフラート）を、Ｃｐ２Ｈｆ．（ＣｌＯ４）２はＣｐ２ＨｆＣｌ２（塩化ハフノセン（ＩＩ））及びびＡｇＣｌＯ４を、Ｃｐ２Ｈｆ（ＯＴｆ）２はＣｐ２ＨｆＣｌ２及びＡｇＯＴｆを加えることにより、それぞれ系内で生成させて活性化を行うことができる。
かくして合成される固相（Ｐ）に結合した糖鎖は、必要に応じて固相を適当な溶媒で洗浄し、適当な化合物、たとえばナトリウムメトキシド等により固相から切り出すことにより取得することができる。
上記したオルトゴナル法においては、カップリング反応に関与する２種の脱離基、例えば、Ｘ（アリールチオ基）はＮＩＳ−ＴｆＯＨ又はＤＭＴＳＴ等により、そしてＹ（フッ素基）はＳｎ（ＣｌＯ４）２、Ｓｎ（ＯＴｆ）２、Ｃｐ２Ｈｆ（ＣｌＯ４）２、またはＣｐ２Ｈｆ（ＯＴｆ）２等により、それぞれ選択的に活性化することができる（図１）。ここで、Ｘ及びＹは任意の順序で活性化することができる。このようなオルトゴナル法によれば、合成は生合成とは逆方向になされ、非還元末端から還元末端方向に行われる。この時、受容体側の脱離基は供与体の活性化条件下安定であるので、保護基は不必要である。また、オルトゴナル法によれば、カップリング生成物は既に次の反応のための脱離基を有しているので、糖鎖合成において最短の工程数を達成できるという利点を有している。
上記のオルトゴナル法は本発明の糖鎖固相合成方法に応用することにより、さらにその有効性を高めることができる。即ち、非還元末端からの合成法（Ａ法）と還元末端から合成を進める方法（Ｂ法）とを比較すれば、Ｂ法においては、カップリング反応における未反応物由来の官能基（水酸基）を保護（キャッピング）する必要があり、従って、１サイクルはカップリング、キャッピング、脱保護の３工程からなる。一方、Ａ法においてカップリング反応毎に副生物（加水分解物、脱離反応生成物）が固相上に蓄積するものの、それらは次のカップリング反応条件においては反応しないため、キャッピングの必要が無く、従って、固相反応においても１サイクルは１工程である。固相合成法はもともと高効率化の目的で開発された方法であり、本発明の糖鎖固相合成方法はそれをさらに効率良く改良したものであるので、オルトゴナル法を組み合わせて用いることによりさらなる総合的な反応プロセスの効率化が期待される。また、本明細書中以下に記載する拡散混合による固相反応方法とさらに組み合わせることにより、反応時間の短縮、溶媒の節約、節電等のメリットもあり、糖鎖の固相合成装置の開発にも有用である。
（２）単糖ライブラリー
生体内で多彩で重要な機能を果たす糖鎖を自在合成するためには、適当に保護された単糖ユニットが必要である。また、それらを多数含む単糖ライブラリーを作製しておくことは非常に有用である。上記の（１）で述べたように糖鎖の高効率合成には総合的なプロセスの効率化が重要であるので、どのような単糖ユニットを用いるかは重要である。
また、糖鎖の合成におけるカップリング反応においては立体異性体（α／β）が生じるが、通常の合成法では目的の立体異性体を選択的に合成する方法が一般的である。しかし、生体成分の再構築のための化学合成から脱却し、例えば、積極的に創薬等を目的としコンビナトリアルケミストリーを行おうとするような場合には、立体選択的カップリングのために必要な制御因子としての保護基の存在は、必要な単糖ユニット数を倍にするばかりでなく、そのような誘導体合成に要する反応工程を数倍とし、分子が複雑となるために用いることができる反応の種類にも制約を与える。従って、コンビナトリアルケミストリーにおいては、例えば、まずは立体非選択的な合成を行って、立体異性体混合物を効率良く合成し、その後、ＨＰＬＣ等により分離することが望ましい。本発明の方法や単糖ライブラリーは、このような手法にも好適である。
ライブラリーに含まれる単糖ユニットとしては、具体的には、例えば、本発明の糖鎖固相合成方法、中でもオルトゴナル法を組み合わせた方法においては、前記Ｘとしてフェニルチオ基を使用し、Ｙとしてフッ素基を使用し、反応に関与しない水酸基を全てベンジル基とすることが望ましい。また、ＸとＹはオルトゴナルな関係にあるので、より安定なフェニルチオグリコシド体として合成しておき、使用に際して適宜フルオリド体へと転換することが望ましい。使用する保護基は隣接基関与を示さないアルキル基が望ましく、有機合成反応で一般的に用いられるベンジル基が最も望ましい。２−アミノ糖の場合は、隣接基関与を示さないアジド基を用いて、２−アジド糖として与えることが望ましい。
糖鎖ライブラリーの合成を考慮して単糖ライブラリーを作製する場合、ヒトの糖鎖において多糖以外においては非還元末端にのみ存在しているシアル酸、グルクロン酸、フコースについては固相に保持させる位置の水酸基のみ遊離の誘導体を合成すればよい。その他の単糖、すなわち、グルコース、ガラクトース、マンノース、キシロース、グルコサミン、ガラクトサミンについては、単糖の各々の水酸基のみが遊離の誘導体をそれぞれ合成することができる。シアル酸、グルクロン酸、フコースについても他の単糖誘導体同様にそれぞれの水酸基を区別することもできる。
本発明者らによってデザインされ、本発明のオルトゴナル法と組み合わせた糖鎖の固相合成において活用される単糖ユニットの例（フェニルチオグリコシド体）を図２に示す。図２に記載の化合物（フェニルチオグリコシド体）、並びにこれらの化合物中のフェニルチオ基をフッ素基に置換した化合物（フルオリド体）から成る群から選択される少なくとも１以上の単糖ユニットを含む単糖ライブラリーは、上記（１）に記載した本発明の糖鎖固相合成方法を行うための単糖ライブラリーとして有用である。また、立体制御を行いたい場合にはアシル基に置換した化合物を任意に用いることもできる。図２に記載の単糖ユニットは、生体に存在する糖鎖を構成する９種の単糖について化学合成法で糖鎖やそれを含む糖鎖ライブラリーを構築するために必要不可欠な単糖ユニットである。
なお、図２に記載の単糖ユニット中、既知化合物について以下に論文を記載する。
Ｍａｎ−２−ＯＨ：Ｍａｒｚａｂａｄｉ，Ｃ．Ｈ．；Ｓｐｉｌｌｉｎｇ，Ｃ．Ｄ．（１９９３）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８，３７６１−６．
Ｍａｎ−３−ＯＨ：Ｏｓｈｉｔａｒｉ，Ｔ．；Ｓｈｉｂａｓａｋｉ，Ｍ．；Ｙｏｓｈｉｚａｗａ，Ｔ．；Ｔｏｍｉｔａ，Ｍ．；Ｔａｋａｏ，Ｋ．；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５３，１０９９３−１１００６
Ｍａｎ−４−ＯＨ：Ｌｅｍａｎｓｋｉ，Ｇ．；Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｔ．（２０００）Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８３，２６５５−２６７５．
Ｍａｎ−６−ＯＨ：Ｌｅｍａｎｓｋｉ，Ｇ．；Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｔ．（２０００）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５６，５６３−５７９．
Ｇａｌ−２−ＯＨ：Ｍａｒｚａｂａｄｉ，Ｃ．Ｈ．；Ｓｐｉｌｌｉｎｇ，Ｃ．Ｄ．（１９９３）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８，３７６１−６．
Ｇａｌ−３−ＯＨ：Ｋａｎｉｅ，Ｏ．；Ｉｔｏ，Ｙ．；Ｏｇａｗａ，Ｔ．（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７，４５５１−４５５４．
Ｇａｌ−４−ＯＨ：Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｗ．Ａ．；Ｐｒｉｅｓｔｌｅｙ，Ｅ．Ｓ．；Ｓｅａｒｓ，Ｐ．Ｓ．；Ａｌｐｅｒ，Ｐ．Ｂ．；Ｒｏｓｅｎｂｏｈｍ，Ｃ．；Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｍ．；Ｈｕｎｇ，Ｓ．−Ｃ．；Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１，６５２７−６５４１．
Ｇａｌ−６−ＯＨ：Ｍａｇａｕｄ，Ｄ．；Ｇｒａｎｊｅａｎ，Ｃ．；Ｄｏｕｔｈｅａｕ，Ａ．；Ａｎｋｅｒ，Ｄ．；Ｓｈｅｖｃｈｉｋ，Ｖ．；Ｃｏｔｔｅ−Ｐａｔｔａｔ，Ｎ．；Ｒｏｂｅｒｔ−Ｂａｕｄｏｕｙ，Ｊ．（１９９８）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３１４，１８９−１９９．
Ｇｌｃ−２−ＯＨ：Ｅｎｎｉｓ，Ｓ．Ｃ．；Ｃｕｍｐｓｔｅｙ，Ｉ．；Ｆａｉｒｂａｎｋｓ，Ａ．Ｊ．；Ｂｕｔｔｅｒｓ，Ｔ．Ｄ．；Ｍａｃｋｅｅｎ，Ｍ．；Ｗｏｒｍａｌｄ，Ｍ．Ｒ．（２００２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５８，９４０３−９４１１．
Ｇｌｃ−４−ＯＨ：Ｍｏｔａｗｉａ，Ｍ．Ｓ．；Ｏｌｓｅｎ，Ｃ．Ｅ．；Ｅｎｅｖｏｌｄｓｅｎ，Ｋ．；Ｍａｒｃｕｓｓｅｎ，Ｊ．；Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ｂ．Ｌ．（１９９５）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２７７，１０９−２３．
Ｇｌｃ−６−ＯＨ：Ｐｆａｅｆｆｌｉ，Ｐ．Ｊ．；Ｈｉｘｓｏｎ，Ｓ．Ｈ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．（１９７２）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２３１，１９５−２０６．
ＧｌｃＮ−４−ＯＨ：Ｍａｒｔｉｎ−Ｌｏｍａｓ，Ｍ．；Ｆｌｏｒｅｓ−Ｍｏｓｑｕｅｒａ，Ｍ．；Ｃｈｉａｒａ，Ｊ．Ｌ．（２０００）Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１５４７−１５６２．
ＧｌｃＮ−６−ＯＨ：Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｓ．；Ｋｕｚｕｈａｒａ，Ｈ．；Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｍ．（２００１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５７，６９１５−６９２６．
Ｓｉａ：Ｍａｒｒａ，Ａ．；Ｓｉｎａｙ，Ｐ．（１９８９）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１８７ ３５−４２．
（３）拡散混合による固相反応方法
本発明はさらに、毛管現象を生じる大きさの固体細孔中で固相反応を行う方法において、固体の外表面に余剰の液相が存在しない状態で反応を行うことを特徴とする固相反応方法に関する。
固相合成は、ポリマー性生体分子、たとえば、ヌクレオチド、ペプチド、糖鎖等の合成に欠かすことのできない合成手法である。また、近年、迅速に医薬品リード化合物を合成する手法として注目を集めているコンビナトリアルケミストリーにおいても基礎となっている。固相合成の利点は、通常の溶液反応において反応行程毎に必要な反応処理とそれに続くカラムクロマトグラフィーの操作を、洗いの操作に置き換えることにより反応プロセスの簡略化を図り、結果として作業時間の短縮が達成されることである。
固相合成において反応の場を提供する固相の例として、樹脂は、無機あるいは有機ポリマーであり、実際の反応の場は内部の細孔である（図３）。細孔は広い表面積を与えるため反応の場となるが、この細孔中での分子の移動は拡散によっている。しかし、従来の固相合成においてはこのような認識はされておらず、固相合成反応は溶液反応の延長として過剰量の溶媒に樹脂を膨潤させ、撹拌、振盪、あるいは、送液化で反応を行っている（図４「従来法」）。例えば、反応剤の１つは固相に保持され、他の反応剤は溶液（液相）として与えられる。この時、液相の溶媒は樹脂が膨潤するのに必要な量に対して過剰量であるので、過剰な液相から反応剤の反応の場（固相）である樹脂の内部、すなわち細孔内へと拡散による移行が必要となる。さらに、液相として与えられる反応剤は均一であり、また、細孔中の分子の移動は拡散によっているので、撹拌等の外的物理力はおよばない。従来法では、これらのことが固相反応の反応効率を低下させていると考えられた。
そこで本発明者らは、上記したような、固相反応の実際の反応の場は細孔であるので反応は拡散により支配されると考えられること、及び、液相から細孔の内部への反応剤の移行も拡散に支配されているために過剰量の液相はかえって反応効率を下げると考えられること、の２点の問題について鋭意検討を行った。その結果、従来の固相反応は、上記の２点の改善により格段に効率化が達成されることを確認した。２つの改善点とは、（ａ）拡散支配による反応（拡散混合による固相反応）と、（ｂ）必要最低限量の溶媒による反応である。（ａ）による効果は、例えば、液量低下や、攪拌、振盪装置等が不要となることによる合成ロボットの小型化であり、（ｂ）による効果は、例えば、液相に含まれる反応剤の濃縮による反応時間短縮である。また、これらの改善を行うことにより、省エネルギー、廃液の削減、住（研究）環境の改善を同時に達成することができる。
これらの改善、検討の結果、本発明者らは、毛管現象を生じる大きさの固体細孔中で固相反応を行う方法において、固体の外表面に余剰の液体が存在しない状態で反応を行うことを特徴とする本発明の固相反応方法を確立した。該方法は、さらに、攪拌、振盪等による外的な力を必要とせず、拡散混合によってのみ反応を行うことを大きな特徴としている。
本発明における拡散混合による固相反応は固相反応の原理であり、糖関連の反応に限定されずにいかなる固相上の反応にも適応できる。上記した拡散混合による固相反応方法は、好ましくは化学反応または生化学的反応に適用することができる。具体的には、例えば、糖鎖合成反応、ペプチド合成反応、核酸合成反応、それらのアナログや複合体等の合成反応、有機化学合成反応、酵素反応等が挙げられ、さらに好ましくは糖鎖合成反応に適用することができ、特に好ましくは上記（１）に記載した本発明の糖鎖固相合成反応に適用することができる。
具体的には、例えば、糖鎖固相合成反応の場合には、固相に結合した第一の単糖に、第二の単糖を反応させて結合させる反応は、第一の単糖が結合している固相に第二の単糖を含む液相を添加して該固相と反応させることにより行われる。同様に、他の化学反応または生化学反応を行う場合にも、反応に関与する第一の物質をあらかじめ固相上に結合させておき、該固相に、これと反応させる第二の物質を含む液相を加えて反応を行えばよい。
本発明において固相として用いられる固体とは、その内部に毛管現象を生じる大きさの細孔を有し、その細孔中で前記したような固相反応が行えるものであればいかなるものでも用い得る。固体は、例えば糖鎖固相合成方法を行う場合には、好ましくはその表面に何らかの官能基を有しているものであって、さらにこの官能基に反応に関わる基質と結合し得るリンカーが結合している。官能基やリンカーとしては、前記（１）の糖鎖固相合成方法において詳述したもの等を用いることができる。固体の材質としても、前記（１）の糖鎖固相合成方法において詳述したもの等を用いることができ、具体的には、例えば、樹脂、シリカ、ガラス（多孔性ガラス）等が挙げられる。樹脂としては、例えば、ポリスチレン、ＴＧ（ＴｅｎｔａＧｅｌ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製））、ＰＥＧＡ（Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ−ＰＥＧ Ｃｏ−ｐｏｌｙｍｅｒ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製））等が挙げられ、これらが内部に適当な細孔を有するように成型されたものを好ましく用いることができる。これらの内部に存在する細孔の大きさは、毛管現象を生じる大きさであればよいが、適用する反応、溶媒等に鑑みて適当なものを選択して用いればよい。
固体の大きさや形状は、用いる反応容器や装置に応じて適当なものを選択すればよい。例えば、樹脂やシリカは、種々の形状に成型されたものが市販されているが、取扱いが容易である点から、ビーズ状（粒状）に成型された樹脂ビーズ等が好ましく用いられる。樹脂ビーズの場合、例えば、その粒径は１〜１０００μｍ程度である。また、不定形のものも用いることができる。それぞれ様々な粒径及び細孔径を有するものが市販されており、それらの中から目的の反応に適したものを選択して用いればよい。その一例を、後記表１に示す。
また、例えば、モノリス構造を有する固体も好ましく用いることができる。モノリス（ｍｏｎｏｌｉｔｈ）とは、つなぎ目のないもの、一枚岩のようなもの、との意味を持つ言葉であって、一定の質感をもつ単一の素材によって構成されている連続体を意味する。例えば、シリカで構成される「モノリスシリカ」の場合、シリカの骨格と空隙が一つの物体の中で連続構造をとっている。このような構造によって、モノリスシリカは、例えば真球状の粒子が充填されたものと比べて高い空隙率を有し、連続構造であるために多くの貫通孔を有するため、本発明の方法に好適である。ポリスチレンモノリス等、他の材質でもモノリス構造を有する固体の形成は可能である。このようなものも、用いる反応容器や装置に適した形状や大きさのものを選択して本発明に用い得る。
さらに、本発明においては、人工的に形成された細孔を有する物体も用いることができる。例えば、人工的に上述したような細孔と同様の効果を奏するように形成された流路等を有するもの等も、同様に用いることができる。より具体的には、例えば、微小流路構造（以下、これを「マイクロチャネル」と称することがある）や、これらが配設されたチップ等を利用することができる。
ここでマイクロチャネルとは、チャネル（流路）に液体を導入した時に、マイクロ効果が現れる、すなわち液体に何らかの挙動変化が現れる断面形状を持つチャネルを意味する。本発明においては、このマイクロ効果のうち、少なくとも毛管現象が生じるものを用いる。マイクロ効果の発現には、液相として用いる溶媒の物性によっても異なるが、断面形状、すなわちチャネルの主流方向に垂直な面の形状のうち、最も短い間隔（長方形なら短辺、楕円なら短径に相当する）の長さが通常５ｍｍ以下、好ましくは５００μｍ以下、より好ましくは２００μｍ以下であることが適当である。この長さの下限は特に限定されず、マイクロチャネルとしての機能を有する長さであればよい。また、チップとは、流路構造を含む部分の部材を意味する。またマイクロチップとは、上記マイクロチャネルよりなる微小流路構造を備えるチップを意味する。チップの大きさ、形状は特に限定されず、用途に応じて任意に設定することができ、それ自体公知の通常用いられる手法によって作製され得る。
上記いずれの形状のものであっても、本発明において用いられる固体としては、固体の内部に存在する細孔による空隙が大きいもの、すなわち、空隙率が高いものが好ましい。特に、細孔径が小さく空隙率が高いものが好ましい。本発明の方法は細孔中の固体表面において反応が行われるので、細孔径が一定であれば、一般に空隙率が高く表面積が大きいものほど反応の効率が高いためである。
本発明において、液体の外表面に余剰の液相が存在しない状態で反応を行うとは、必ずしも液相がまったく存在しないことを意味するものではなく、あくまでも余剰もしくは過剰量の液相を用いても反応効率が低下することから、不要であることを意味している。すなわち、目的に適う反応効率が十分に達成されるものであれば多少の余剰の液相が存在してもよく、攪拌、振盪、連続的な送液等の外的な力を与えずに拡散混合のみによって効率的に反応が行われるものをすべて包含する。
液相は、細孔中での拡散が十分に起こり得る程度に細孔を満たす液量が少なくとも必要である。すなわち、少なすぎても多すぎても反応効率は低下し、また、溶媒も無駄になるので、必要かつ最小限の液相を用いるのがよい。理論上、固体細孔がちょうど満たされる最大液量で反応を行うことが最も効率が良い。
固体細孔がちょうど満たされる最大液量は、例えば、シリカビーズやシリカモノリスのように液相が添加されても膨潤しない性質の固体については、その固体に存在する細孔の空隙の量（以下、これを「空隙量」と称することがある）と理論上同じである。空隙量は、それ自体公知の通常用いられる測定方法により求めることができる。一方、多くの樹脂ビーズのように液相が添加されると膨潤する性質の固体については、例えば、次に例示するような手法により必要な液量（以下、これを「膨潤液量」と称することがある）を簡便に決定することができる。前者の膨潤しない性質の固体についても、必ずしも測定や計算により求められた空隙量と実際に必要とされる液量が一致するとは限らない場合もあるため、同様の方法により最適な液量を確認することが好ましい。
樹脂を膨潤させるために必要な液量については、以下の表１や、Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（１９９１）３０，１１３．等を参考にして決定することができるが、次のようにして実験的に容易に確認し、知ることができる。
まず、一定量の樹脂を秤量し、これに使用する溶媒を滴下する。この時、滴下量を計測する。大まかな樹脂の膨潤は１０分程度で完了するのでこれを目安に滴下を行う。必要十分量以上の溶媒が添加された時、樹脂ビーズ間の摩擦力が低下し「液状化」現象が生じる。この時の溶媒量を反応に用いる溶媒量と決定すればよい。このとき、例えば樹脂ビーズをシリンダー等の適当な実験容器に秤量し、この中で溶媒の滴下を行うと、滴下にともなって樹脂ビーズは次第に膨潤するが、膨潤液量を過ぎると必要以上の余剰の溶媒が樹脂ビーズの層の上にただ重層されるだけとなる。このようにして、膨潤液量（すなわち、細孔中に溶媒が満たされ、これ以上膨潤しない点）は実験的に容易に確認することができる。
本発明者らの実験により、固相、例えば樹脂の膨潤液量に必要な反応剤（具体的には、例えば、糖鎖合成法の場合には、反応に関わる単糖ユニット、活性化剤等）を溶解することにより、反応剤量を同一とした場合には、反応の場である樹脂の細孔内部と過剰の液相との間で拡散による移行が不要となった結果、反応時間の短縮が達成された。また、反応剤が複数ある場合、反応剤の添加は全て同時に行うことも複数回に分けて行って、細孔中で混合させることもできる。
液相として用いる溶媒としては、それぞれの固相反応に適したものであればいかなるものでも用い得るが、それ自体が目的の反応に関与しないものであって、樹脂等の固相とも反応しないものを用いる。また、固相との組み合わせにより毛管現象が生じ易いものを選択することも好ましい。
かくして選択された固相と液相を用いて、本発明の固相反応方法を行うことができる。
固相反応自体は、それ自体公知の通常用いられる手法により行われるが、本発明の方法においては、攪拌、振盪、連続的な送液等の外的な力を加えず、好ましくは静置して行われる。静置することにより、反応は拡散混合により行われる。必要に応じて、温度調節機能、送液機能等を備えていることが好ましい。
反応容器（反応槽）としては、拡散混合及び反応自体が妨げられず、十分に進行できるような状態を維持できるものであればいかなるものでもよく、目的の反応、用いる固相、液相等に適したものを選択すればよい。液相の乾燥を防ぐ目的で適度に密閉が可能なものが好ましい。
例えば、固相として用いられる固体としてビーズ状（粒状）のものを用いる場合には、反応槽は、これらを適当な密度で充填した構造とすることができる。好ましくは、液相を添加、回収できる構造を有するものを用いる。具体的には、例えば、一般的に物質の精製・分離等に用いられているカラム類と類似の構造等が挙げられる（例えば、図４「本発明」）。また、モノリス構造を有する固体を用いる場合も、同様に固体の大きさや形状に適した反応槽に収容されることが好ましい。
一方、人工的に形成された細孔を有する物体、例えば、微小流路構造（マイクロチャネル）を有するチップ等を用いる場合には、チップ自体が反応槽として用いられることができ、これに配設された流路（チャネル）に毛管現象によって液相が流入し、反応後の液相を回収可能な構造となっていればよい。また、このような構造のチップの流路内に上記のようなビーズ状もしくはモノリス構造等の固体を充填することもできるし、流路内壁をコーティングすることもできる。
前記（１）に記載の糖鎖固相合成方法は、昇温率を制御して反応系の温度を変化させることにより高効率で糖鎖の固相合成を行う方法であるので、本法のように固相反応を少量の溶媒で効率良く行うことができる方法と組み合わせることにより、さらに効率的に合成を行うことができる。特に、例えば、前記したように、コンビナトリアルケミストリーにより糖鎖ライブラリーを構築しようとする場合等には、少量でも非常に多数の組み合わせで反応を行って多種類の糖鎖を合成する必要がある。この目的のために、一度に多数の反応を同時進行させることのできる前記（１）の糖鎖固相合成方法と、少量の液相で静置しておくだけで反応を行うことができる（攪拌、振盪、連続的な送液等に関わる装置が不要な）この固相反応方法とを組み合わせることは、非常に好適である。
以下に、本法と前記（１）に詳述した本発明の糖鎖固相合成方法を組み合わせて用いる場合を例に挙げて、さらに具体的に説明する。
まず単糖ユニット（供与体）が結合した樹脂（Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ａ１−Ｘ）を準備する。次に、たとえばこの樹脂を結合せしめる単糖ユニット（受容体；ＨＯ−Ａ２−Ｙ）を含む溶液で膨潤し、脱離基の活性化剤（プロモーター）を加えて反応させる方法（方法１）、又は、樹脂（Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ａ１−Ｘ）と結合せしめる単糖ユニット（ＨＯ−Ａ２−Ｙ）と脱離基の活性化剤の混液により膨潤して反応させる方法（方法２）を繰り返すことにより、樹脂上に任意の長さの糖鎖を合成することができる。方法１又は２は、反応の進行状態に応じて、いずれの方法でも任意に選択することができる。
かくして得られる糖鎖が結合した樹脂を、前記のとおり必要に応じて適当な溶媒で洗浄し、樹脂から糖鎖を切り出すことにより、目的の糖鎖を取得することができる。
本発明による拡散混合による固相反応方法によれば、固相反応において撹拌、振盪等物理的に混合のための操作を施す必要がない。すなわち、固相反応を樹脂細孔内の分子の拡散に委ねることにより、固相反応が達成される。これにより反応装置の小型化が達成できる。従来の合成装置が反応槽、温度調節器、分注器、撹拌装置、ガス置換装置から構成されているのに対し、本発明の方法を行うための反応装置としては、（ｉ）反応槽、温度調節器、分注器及びガス置換装置から成る装置、あるいは、（ｉｉ）反応槽、温度調節器、流路変換装置及び送液ポンプから成る装置などを利用できる。
即ち、本発明によれば、少なくとも以下の（１）と（２）とを含む、拡散混合による固相反応を行うための反応装置が提供される。
（１）液相を注入又は吸引するための導入部を有し、かつ固体を収容する空間を有する、固相反応を行うための反応部、及び
（２）反応部の温度を調節するための温度調節部
（４）本発明の糖鎖固相合成方法で得られるライブラリー
上記（１）に記載した本発明の糖鎖固相合成方法により合成された、生体中に存在する単糖から選ばれる３種類の糖の全ての組み合わせから成る糖鎖により構成されるライブラリーも本発明の範囲内である。生体中に存在する単糖としては、好ましくは、マンノース、グルコース、ガラクトース、キシリトース、グルコサミン、ガラクトサミン、グルクロン酸、フルクトース又はシアル酸を使用することができる。
糖鎖ライブラリーの重要性は今後増大すると考えられるが、そのターゲットとしては、生体に存在する９種類の単糖から任意に３種類を選択して得られる組み合わせから成る３糖ライブラリーとすることが望ましい。このようにして得られる糖鎖ライブラリーは、直接機能研究のためのプローブとして使用したり、または医薬リードとして用いたり、生体内の糖鎖を模したライブラリーとして医薬品のスクリーニング等にも用い得る。
生体内の糖鎖は、一般に１〜５個の単糖が連結したものであり、これらが免疫反応等における細胞間認識、ウィルスやバクテリアの認識等、複雑な認識現象にかかわっていることが知られている。本発明の生体内に存在する単糖から選ばれる３種類の糖のすべての組み合わせから成る糖鎖により構成されるライブラリーは、実際にヒトの生体内に存在する糖鎖を平均的に模したラブラリーとして有用である。９種の生体内に存在する単糖から成る３糖の組み合わせの数は１４０，８２４通りであるが、ライブラリーがカバーする範囲を限定することもできる。
本発明においては、本明細書中上記した任意の単糖ユニットを用い、本明細書中上記したオルトゴナルグリコシル化法に基づいて、本明細書中上記した拡散混合固相反応法に従い糖鎖の合成を行うことにより、アセタール（アノメリック）位の立体異性体（２３＝８）混合物が得られ、必要に応じてこれらをＨＰＬＣを用いて分離することができる。（図５）。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。なお、以下の実施例で用いる化学反応および糖鎖合成反応の一般的手法、試薬等は、「固相合成ハンドブック（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社（Ｍｅｒｃｋ社）刊」等の一般的実験書等に記載のものを用いることができる。
【実施例】
ＴＬＣはＭｅｒｋ Ａｒｔ ５７１５ Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０ Ｆ２５４を用い、検出はＵＶ吸収及び発色試薬（１０％Ｈ２ＳＯ４−エタノール）で行った。カラムクロマトグラフィーはＭｅｒｋ Ａｒｔ ７７３４ Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０ ７０−２３０ｍｅｓｈを用いた。１Ｈ及び１３Ｃ−ＮＭＲはＢＵＫＥＲ ＡＣＶＡＮＣＥ ５００あるいはＪＥＯＬ ＥＸ−２７０で測定し、ケミカルシフト値は内部標準物質（テトラメチルシラン）に対するδ値（ｐｐｍ）で示した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＡＳはＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅ ＶｏｙｇｅｒＴＭで測定し、ｍａｔｒｉｘには２，５−ジヒドロ安息香酸を用いた。ＦＴ−ＩＲはＨＯＲＩＢＡ ＦＴ７２０を使用した。ＲｅｓｉｎはＮｏｖａｓｙｎＲ ＴＧ ａｍｉｎｏ ｒｅｓｉｎ ＨＬ（０．２９ｍｍｏｌ／ｇ ｌｏａｄｉｎｇ）を使用した。反応に用いたＣ２Ｈ４Ｃｌ２はＡｌｄｒｉｃｈ １，２ｄｉｃｈｌｏｒｏｅｔｈａｎｅ ａｎｈｙｄｒｏｕｓ ９９．８％を用い、ＥｔＣＮはＣａＨ２により減圧蒸留した。固相反応にはＢｏｈｄａｎＲ ＭｉｎｉｂｌｏｃｋＴＭを用いた。
実施例１：保護単糖ライブラリー
図１に記載の単糖ライブラリー中、Ｍａｎ−２−ＯＨ、Ｍａｎ−３−ＯＨ、Ｍａｎ−４−ＯＨ、Ｍａｎ−６−ＯＨ、Ｇａｌ−２−ＯＨ、Ｇａｌ−３−ＯＨ、Ｇａｌ−４−ＯＨ、Ｇａｌ−６−ＯＨ、Ｇｌｃ−２−ＯＨ、Ｇｌｃ−４−ＯＨ、Ｇｌｃ−６−ＯＨ、ＧｌｃＮ−４−ＯＨ、ＧｌｃＮ−６−ＯＨ、Ｓｉａの１４種類については本明細書中上記した通り公知化合物である。
Ｍａｎ−２−ＯＨ、Ｍａｎ−３−ＯＨ、Ｍａｎ−４−ＯＨ、Ｍａｎ−６−ＯＨの合成については、Ｋａｍｅｔａｎｉ，Ｔ．；Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｋ．；Ｈｏｎｄａ，Ｔ．（１９８７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９，３０１０−１７；Ｌｅｍａｎｓｋｉ，Ｇ．；Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｔ．（２０００）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５６，５６３−５７９；Ｌｅｍａｎｓｋｉ，Ｇ．；Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｔ．（２０００）Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８３，２６５５−２６７５；Ｏｓｈｉｔａｒｉ，Ｔ．；Ｓｈｉｂａｓａｋｉ，Ｍ．；Ｙｏｓｈｉｚａｗａ，Ｔ．；Ｔｏｍｉｔａ，Ｍ．；Ｔａｋａｏ，Ｋ．；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５３，１０９９３−１１００６；Ｍａｒｚａｂａｄｉ，Ｃ．Ｈ．；Ｓｐｉｌｌｉｎｇ，Ｃ．Ｄ．（１９９３）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８，３７６１−６；Ｓｔｒｅｅｔ，Ｉ．Ｐ．；Ｗｉｔｈｅｒｓ，Ｓ．Ｇ．（１９８６）Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．６４，１４００−３；Ｍｕｒａｇａｔａ，Ｔ．；Ｋ．，Ｍａｓａｍｉ；Ｓ．，Ｙ．；Ｓ．，Ｈ．；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓ．；Ｏｇａｗａ，Ｔ Ｊｐｎ．Ｋｏｋａｉ Ｔｏｋｋｙｏ Ｋｏｈｏ（１９９４），４４ ｐｐ．ＣＯＤＥＮ：ＪＫＸＸＡＦ ＪＰ ０６２９３７９０ Ａ２ １９９４１０２１ Ｈｅｉｓｅｉ．Ｐａｔｅｎｔ ｗｒｉｔｔｅｎ ｉｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ：ＪＰ ９３−８１９５５ １９９３０４０８．ＣＡＮ １２３：８３９４３ ＡＮ １９９５：６６２３３２を参照できる。
Ｓｉａの合成については、Ｄａｓｇｕｐｔａ，Ｆ．（Ｇｌｙｃｏｍｅｄ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）．Ｕ．Ｓ．（１９９２），９ ｐｐ．ＣＯＤＥＮ：ＵＳＸＸＡＭ ＵＳ ５１３８０４４ Ａ １９９２０８１１ Ｐａｔｅｎｔ ｗｒｉｔｔｅｎ ｉｎ Ｅｎｇｌｉｓｈ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ：ＵＳ ９０−５６６６８２ １９９００８１３．ＣＡＮ １１８：８１３３５ ＡＮ １９９３：８１３３５ ＣＡＰＬＵＳ（Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ ２００３ ＡＣＳ）；Ｍａｒｒａ，Ａ．；Ｓｉｎａｙ，Ｐ．（１９８９）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１８７ ３５−４２；Ｓｈａｒｍａ，Ｎ．，Ｍ．；Ｅｂｙ，Ｒ．（１９８４）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１２７ ２０１−２１０を参照できる。
上記以外の単糖については以下の通り合成した。
（１）ガラクトース誘導体のフッ素化物の合成
フェニル２−Ｏ−クロロアセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−のベンジル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
化合物２８（３００ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（５．４ｍＬ）、ピリジン（０．３ｍＬ）に溶解させ、氷冷下でクロロアセチルｃｈｌｏｒｉｄｅ（８８μＬ，１．１１ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＨＣｌで洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１５：１）で精製し、化合物３８（３２３ｍｇ，０．５２ｍｍｏｌ）を９４％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．６２．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５０−７．２２（２０Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ４），５．４５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，Ｈ−２），４．９３，４．６８，４．６３，４．５６，４．５０，４．４３（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ３），４．６８（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１），４．００（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，Ｈ−４），３．９７（１Ｈ，ｄ，−ＣＨ２Ｃｌ），３．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ，−ＣＨ２Ｃｌ），３．６６−３．６３（３Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−５，Ｈ−６ａ），３．５８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，Ｈ−６ｂ）．
２−Ｏ−クロロアセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオリド（３９）
化合物３８（３０８ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）、をＣＨ２Ｃｌ２（４．０ｍＬ）に溶解させ、窒素気流下−１５℃でＤＡＳＴ（７９μＬ，０．６０ｍｍｏｌ）、ＮＢＳ（１０７ｍｇ，０．６０ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝２０：１）で精製し、化合物３９（１８０ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）を６８％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．６０．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ．６８−７．２６（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．８０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１，２＝２．８Ｈｚ，Ｊ１，Ｆ＝５４．６Ｈｚ，Ｈ−１），５．４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，Ｊ＝２５．０Ｈｚ，Ｈ−２），４．９３，４．７２，４．６３，４．５７，４．５０，４．４４（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ３），４．１３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），４．０８（１Ｈ，ｄ，Ｈ−４），４．０５−４．０１（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ２Ｃｌ），３．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，Ｈ−３），３．６０−３．５９（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６ａ，Ｈ−６ｂ）．
３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオリド（４０）
化合物３９（１４６ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）をピリジン（６．０ｍＬ）、エタノール（１．０ｍｌ）に溶解させ、チオ尿素（２１ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で１時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＨＣｌ、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１０：１）で精製し、化合物４０（９４ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）を７５％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．３１．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．４０−７．２２（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１，２＝２．８Ｈｚ，Ｊ１，Ｆ＝５４．７Ｈｚ，Ｈ−１），４．８７，４．７３，４．６１，４．５６，４．５１，４．４４（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，ベンジルメチレン×３），４．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，Ｊ＝２５．４Ｈｚ，Ｈ−２），４．１２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｈ−５），４．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，Ｈ−４），３．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ，Ｈ−３），３．６５−３．５７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６ａ，Ｈ−６ｂ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１０８．３，１０６．２，７．６，７４．７，７３．５，７３．１，７２．２，７１．９，６８．３，６０．７
フェニル３−Ｏ−クロロアセチル−２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（４１）
化合物３２（１４０ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２．７ｍＬ）、ピリジン（０．１５ｍＬ）に溶解させ、氷冷下でクロロアセチルクロライド（４１μＬ，０．５１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１．５時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＨＣｌで洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝２０：１）で精製し、化合物４１（１４５ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）を９１％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．７０．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５８−７．１５（２０Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ４），４．９８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，Ｈ−３），４．８３，４．６８，４．５７，４．５３，４．５２，４．４５（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，ベンジルメチレン×３），４．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−１），４．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，Ｈ−４），３．９５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，Ｈ−２），３．７４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ｈ−６ａ），３．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，−ＣＨ２Ｃｌ），３．５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，−ＣＨ２Ｃｌ），３．６３−３．５４（Ｈ−４，Ｈ−５，Ｈ−６ｂ）．
３−Ｏ−クロロアセチル−２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオリド（４２）
化合物４１（１３２ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）、をＣＨ２Ｃｌ２（２．５ｍＬ）に溶解させ、窒素気流下−１５℃でＤＡＳＴ（３４μＬ，０．２５ｍｍｏｌ）、ＮＢＳ（４６ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝２０：１）で精製し、化合物４２（１１０ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）を９８％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．６８．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．４０−７．１７（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，Ｊ＝５３．２Ｈｚ，Ｈ−１ｂ），５．２８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，Ｈ−３），５．０５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，Ｈ−１ｂ），４．８３，４．６９，４．６６，４．５８，４．５３，４．４６（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ３），４．２２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｈ−５），４．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，Ｈ−４），４．０４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，Ｈ−３），４．０１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，Ｈ−２），３．９４−３．８９（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６ａ，Ｈ−６ｂ），３．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．８Ｈｚ，ＣＨ２Ｃｌ），３．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．８Ｈｚ，ＣＨ２Ｃｌ）．
２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（４３）
方法１
化合物４２（１０１ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ）をピリジン（６．０ｍＬ）、エタノール（１．０ｍｌ）に溶解させ、チオ尿素（１６ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で１時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＨＣｌ、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１２：１）で精製し、化合物４３（６７ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）を７７％の収率で得た。
方法２
化合物３２（１９１ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）、をＣＨ２Ｃｌ２（２．５ｍＬ）に溶解させ、窒素気流下−１５℃でＤＡＳＴ（２３３μＬ，１．７２ｍｍｏｌ）、ＮＢＳ（６９ｍｇ，０．３９ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１２：１）で精製し、化合物４３（６０ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）を３８％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．４０．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．３５−７．１６（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１，２＝２．５Ｈｚ，Ｊ１，Ｆ＝５３．７Ｈｚ，Ｈ−１），４．８１，４．７３，４．６８，４．６２，４．５２，４．４３（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ３），４．１５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｈ−５），４．０７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，Ｈ−３），３．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，Ｈ−２），３．８０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，Ｊ＝２５．２Ｈｚ，Ｈ−２），３．６１−３．５８（１Ｈ，．ｍ，Ｈ−６ａ，Ｈ−６ｂ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１０８．１，１０４．３，７６．５，７５．９，７５．２，７３．４，７３．０，７１．６，６９．８，６８．２
フェニル４−Ｏ−クロロアセチル−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（４４）
化合物３４（１５０ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２．７ｍＬ）、ピリジン（０．１５ｍＬ）に溶解させ、氷冷下でクロロアセチルクロライド（４４μＬ，０．５５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＨＣｌで洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝２０：１）で精製し、化合物４４（１６０ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ）を９４％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．７０．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．６１−７．１３（２０Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ４），５．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，Ｈ−４），４．７６，４．７５，４．７２，４．６４，４．５３，４．５２（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，ベンジルメチレン ｘ ３），４．６０（１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−１），４．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．９Ｈｚ，−ＣＨ２Ｃｌ），３．９８（１ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．９Ｈｚ，−ＣＨ２Ｃｌ），３．７８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｈ−５），３．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，Ｈ−３），３．６３−３．５８（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６ａ，Ｈ−６ｂ），３．５１（１Ｈ，ｔ，Ｈ−２）．
４−Ｏ−クロロアセチル−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（４５）
化合物４４（１４６ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）、をＣＨ２Ｃｌ２（２．５ｍＬ）に溶解させ、窒素気流下−１５℃でＤＡＳＴ（３８μＬ，０．２８ｍｍｏｌ）、ＮＢＳ（５０ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝２０：１）で精製し、化合物４５（１１７ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）を９４％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．６９．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５１−７．２９（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．７３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｈ−４），５．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１，２＝２．６Ｈｚ，Ｊ１，Ｆ＝５３．０Ｈｚ，Ｈ−１），４．８２，４．７７，４．６７，４．５８，４．５４，４．３０（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，ベンジルメチレン×３），４．２７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｈ−５），４．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，−ＣＨ２Ｃｌ），３．９９−３．９４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３，−ＣＨ２Ｃｌ），３．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，Ｊ＝２５．３Ｈｚ，Ｈ−２），３．５４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｈ−６ａ），３．４５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，Ｈ−６ｂ）．
２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（４６）
方法１
化合物４５（１０８ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）をピリジン（６．０ｍＬ）、エタノール（１．０ｍｌ）に溶解させ、チオ尿素（１６ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で１時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＨＣｌ、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１２：１）で精製し、化合物４６（５１ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）を５５％の収率で得た。
方法２
化合物３４（１２０ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）、をＣＨ２Ｃｌ２（２．５ｍＬ）に溶解させ、窒素気流下−１５℃でＤＡＳＴ（１４６μＬ，１．１１ｍｍｏｌ）、ＮＢＳ（４３ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１２：１）で精製し、化合物４６（４０ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ）を４０％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．４７．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：７．３７−７．１７（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈｘ３），５．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１，２＝２．６Ｈｚ，Ｊ１，Ｆ＝５３．０Ｈｚ，Ｈ−１α），５．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｊ＝５２．７Ｈｚ，Ｈ−１β），４．８３，４．７８，４．７４，４．７１，４．６０，４．５５（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ３），４．０９（１Ｈ，ｓ，Ｈ−４），４．０７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，Ｈ−５），３．９１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，Ｈ−３），３．８１−３．６４（３Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−６ａ，Ｈ−６ｂ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１０８．１，１０４．３，７６．５，７５．９，７３．４，７３．０，７１．６，６９．８，６８．２．
フェニル６−Ｏ−クロロアセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（４７）
化合物３７（１５０ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２．７ｍＬ）、ピリジン（０．１５ｍＬ）に溶解させ、氷冷下でクロロアセチルクロライド（４４μＬ，０．５５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＨＣｌで洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１５：１）で精製し、化合物４７（１７１ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）を定量的に得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．５２．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５６−７．１８（２０Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ４），５．００，４．８３，４．７９，４．７４，４．６３，４．６２（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ３），４．７４（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１），４．３５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，Ｈ−６ａ），４．１３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），３．９５−３．８７（３Ｈ，ｍ，Ｈ−３，−ＣＨ２Ｃｌ），３．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｈ−４），３．６１−３．５９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−５）．
６−Ｏ−クロロアセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（４８）
化合物４７（１７１ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ）、をＣＨ２Ｃｌ２（２．５ｍＬ）に溶解させ、窒素気流下−１５℃でＤＡＳＴ（４４μＬ，０．３３ｍｍｏｌ）、ＮＢＳ（５９ｍｇ，０．３３ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝２０：１）で精製し、化合物４８（１１９ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）を８２％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．５０．
２，３，６−Ｔｒｉ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（４９）
化合物４８（１１９ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）をピリジン（６．０ｍＬ）、エタノール（１．０ｍｌ）に溶解させ、チオ尿素（２０．６ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で１時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＨＣｌ、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１０：１）で精製し、化合物４９（７８ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）を７６％の収率で得た。
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４９α：ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．４７．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．４１−７．１５（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，Ｊ＝５３．８Ｈｚ，Ｈ−１），４．９５，４．８８，４．８３，４．７２，４．６８，４．６４（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，ベンジルメチレン×３），４．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−２），４．０８−３．９１（３Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−４，Ｈ−５），３．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−６ａ），３．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，Ｈ−６ｂ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１０４．４（Ｃ−１），７８．３（Ｃ−２），７５．９，７３．７，７２．９，６１．９（Ｃ−６）．
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４９βＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．４０．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．３８−７．２５（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ｊ＝５３．１Ｈｚ，Ｈ−１），４．９４，４．８６，４．８５，４．８０，４．７４，４．６９，４．６４（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ３），３．９８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２），３．８７−３．８１（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４，Ｈ−６ａ），３．６０（１Ｈ，ｄ，Ｈ−３），３．５５−３．５０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５，Ｈ−６ｂ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１０８．５（Ｃ−１），８０．４，７９．１（Ｃ−２），７６．５，７２．５，６１．９（ｃ−６）
Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｗ．Ａ．；Ｐｒｉｅｓｔｌｅｙ，Ｅ．Ｓ．；Ｓｅａｒｓ，Ｐ．Ｓ．；Ａｌｐｅｒ，Ｐ．Ｂ．；Ｒｏｓｅｎｂｏｈｍ，Ｃ．；Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｍ．；Ｈｕｎｇ，Ｓ．−Ｃ．；Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１，６５２７−６５４１．
Ｋａｍｅｔａｎｉ，Ｔ．；Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｋ．；Ｈｏｎｄａ，Ｔ．（１９８７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９，３０１０−１７．
Ｌｅｍａｎｓｋｉ，Ｇ．；Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｔ．（２０００）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５６，５６３−５７９．
Ｌｉｐｔａｋ，Ａ．；Ｊｏｄａｌ，Ｉ．；Ｈａｒａｎｇｉ，Ｊ．；Ｎａｎａｓｉ，Ｐ．（１９８３）Ａｃｔａ Ｃｈｉｍ．Ｈｕｎｇ．１１３，４１５−４２２．
Ｌｅｍａｎｓｋｉ，Ｇ．；Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｔ．（２０００）Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８３，２６５５−２６７５．
Ｋａｎｉｅ，Ｏ．；Ｉｔｏ，Ｙ．；Ｏｇａｗａ，Ｔ．（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７，４５５１−４５５４．
Ｏｓｈｉｔａｒｉ，Ｔ．；Ｓｈｉｂａｓａｋｉ，Ｍ．；Ｙｏｓｈｉｚａｗａ，Ｔ．；Ｔｏｍｉｔａ，Ｍ．；Ｔａｋａｏ，Ｋ．；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５３，１０９９３−１１００６．
Ｍａｇａｕｄ，Ｄ．；Ｇｒａｎｊｅａｎ，Ｃ．；Ｄｏｕｔｈｅａｕ，Ａ．；Ａｎｋｅｒ，Ｄ．；Ｓｈｅｖｃｈｉｋ，Ｖ．；Ｃｏｔｔｅ−Ｐａｔｔａｔ，Ｎ．；Ｒｏｂｅｒｔ−Ｂａｕｄｏｕｙ，Ｊ．（１９９８）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３１４，１８９−１９９．
Ｍａｒｚａｂａｄｉ，Ｃ．Ｈ．；Ｓｐｉｌｌｉｎｇ，Ｃ．Ｄ．（１９９３）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８，３７６１−６．
Ｓｔｒｅｅｔ，Ｉ．Ｐ．；Ｗｉｔｈｅｒｓ，Ｓ．Ｇ．（１９８６）Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．６４，１４００−３．
Ｍｕｒａｇａｔａ，Ｔ．；Ｋａｎｅｋｏ，Ｍ．；Ｓａｉｔｏ，Ｙ．；Ｓａｉｔｏ，Ｈ．；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓ．；Ｏｇａｗａ，Ｔ．．Ｊｐｎ．Ｋｏｋａｉ Ｔｏｋｋｙｏ Ｋｏｈｏ（１９９４），４４ ｐｐ．ＣＯＤＥＮ：ＪＫＸＸＡＦ ＪＰ ０６２９３７９０ Ａ２ １９９４１０２１ Ｈｅｉｓｅｉ．Ｐａｔｅｎｔ ｗｒｉｔｔｅｎ ｉｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ：ＪＰ ９３−８１９５５ １９９３０４０８．ＣＡＮ １２３：８３９４３ ＡＮ １９９５：６６２３３２．
（２）キシロース誘導体の合成
フェニル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド（５０）
Ｄ−キシロース（１０ｇ，０．０６ｍｏｌ）をピリジン（３０ｍＬ）に溶解させ、氷冷下、Ａｃ２Ｏ（３０ｍＬ）を加え室温で１２時間撹拌した。反応終了後、トルエンを加えて減圧濃縮し、化合物５０（１７．６ｇ，０．０６ｍｏｌ）を定量的に得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．４２．
フェニル２，３，４−トリ−Ｏ−のアセチル−１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド（５１）
化合物５０（２３ｇ，０．０７ｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶解させ、ＰｈＳＨ（８．２ｍＬ，０．０８ｍｏｌ）とＢＦ３Ｅｔ２Ｏ（１８．３ｍＬ，０．１４ｍｏｌ）を窒素気流下で氷冷しながら加え、２時間攪拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製し、化合物５１（２２ｇ，０．０６４ｍｏｌ）を８３％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．５０．
フェニル１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド（５２）
化合物５１（２２ｇ，０．０６ｍｏｌ）をメタノール（５０ｍＬ）に溶解させ０．５Ｍ ＣＨ３ＯＮａ／メタノール（０．５ｍＬ）を加え、１時間攪拌した。反応終了後、イオン交換樹脂を加え中性に戻し、ｐＨ試験紙で確認後、ろ過をした。得られたろ液を減圧濃縮し、化合物５２（１４ｇ，０．０６ｍｏｌ）を定量的に得た。ＴＬＣ ＣＨ２Ｃｌ２：メタノールｔ＝４：１ Ｒｆ＝０．４９．
フェニル３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド（５３），フェニル２，４−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド（５４），及びフェニル２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド（５５）
化合物５２（３００ｍｇ，１．２ｍｍｏｌ）をトルエン（１０ｍＬ）に溶解させ、Ｂｕ２ＳｎＯ（３４０ｍｇ，１．３ｍｍｏｌ）を加え、３時間加熱還流した後、減圧濃縮した。得られた残渣をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶かし、ＣｓＦ（９００ｍｇ，７．２ｍｍｏｌ）とＢｎＢｒ（８００μＬ，７．２ｍｍｏｌ）を加え２時間攪拌した。反応終了後、酢酸エチルで抽出し、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１０：１）で精製し、化合物５３（１８０ｍｇ，３６．１％）、５４（２５０ｍｇ，５０．１％）、５５（２６ｍｇ，５．３％）が得られた。
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（５３）：ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝２：１ Ｒｆ＝０．７３．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：７．５１−７．２３（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝４．７Ｈｚ，Ｈ−１），４．７９，４．７５，４．６４，４．６０（４Ｈ，ｄ．ベンジル メチレン ｘ ２），４．４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ４，５ａ＝１１．９Ｈｚ，Ｊ５ａ５ｂ＝１１．９Ｈｚ，Ｈ−５ａ），３．７１（１Ｈ，ｔ，Ｊ２，３＝４．９Ｈｚ，Ｈ−２），３．６４（１Ｈ，ｑ，Ｈ−４），３．５１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ４，５ｂ＝５．２Ｈｚ，Ｊ５ａ，５ｂ＝１１．５Ｈｚ，Ｈ−５ｂ），３．１０（１Ｈ，ｄ，Ｈ−３）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：８６．７，７７．８，７３．５，７３．４，７１．９，６８．０，６５．４，６４．７．
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（５４）：ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝２：１ Ｒｆ＝０．７９．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：７．５４−７．２１（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），４．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝６．２Ｈｚ，Ｈ−１），４．８３，４．７６，４．６５，４．６１（４Ｈ，ｄ，ベンジルメチレン ｘ ２），４．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ４，５ａ＝１１．８Ｈｚ，Ｊ５ａ，５ｂ＝３．１Ｈｚ，Ｈ−５ａ），３．７２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９０Ｈｚ，Ｈ−２），３．６２（１Ｈ，ｔ，Ｊ３，４＝６．１Ｈｚ，Ｈ−３），３．５８（１Ｈ，ｑ，Ｈ−４），３．５７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ４，５ｂ＝６．０Ｈｚ，Ｊ５ａ，５ｂ＝２．９Ｈｚ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：８８．１，８０．４，７７．９，７７．３，７６．７，７５．２，７３．１，６７．５．
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（５５）：ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝２：１ Ｒｆ＝０．７５．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：７．５４−７．２１（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），４．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝５．１Ｈｚ），４．９２，４．７４，４．６８，４．６１（４Ｈ，ｄ，ベンジルメチレン ｘ ２），４．０４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ４，５ａ＝５．０Ｈｚ，Ｊ５ａ，５ｂ＝１１．６Ｈｚ，Ｈ−５ａ），３．７２（１Ｈ，ｔ，Ｊ２，３＝８．８Ｈｚ，Ｈ−２），３．５１（１Ｈ，ｑ，Ｈ−４），３．３０（１Ｈ，ｔ，Ｊ３，４＝９．３Ｈｚ，Ｈ−３），３．２０（１Ｈ，ｔ，Ｊ５ａ，５ｂ＝１１．１Ｈｚ，Ｈ−５ｂ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：８８．９，７９．２，７５．９，７３．９，７２．４，７０．８．
Ｌｅｅ，Ｅ．；Ｂｒｕｚｚｉ，Ａ．；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｅ．；Ｏ’Ｃｏｌｌａ，Ｐ．Ｓ．（１９７９）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．７１，３３１−４．
Ｌｏｐｅｚ，Ｒ．；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍａｙｏｒａｌａｓ，Ａ．（１９９４）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９，７３７−４５．
（３）フコース誘導体の合成
１，２，３，４，６−ペンタ−Ｏ−アセチルβ−Ｌ−フコピラノシド（５６）
Ｌ−フコース（１０ｇ，０．０６ｍｏｌ）をピリジン（３０ｍＬ）に溶解させ、氷冷下、Ａｃ２Ｏ（３０ｍＬ）を加え室温で１２時間撹拌した。反応終了後、トルエンを加えて減圧濃縮し、化合物５６（１７．６ｇ，０．０６ｍｏｌ）を定量的に得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．４２．
フェニル２，３，４，６−ｔｅｒｔａ−Ｏ−アセチル−１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド（５７）
化合物５６（２２ｇ，０．０７６ｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）に溶解させ、ＰｈＳＨ（８．６ｍＬ，０．０８３ｍｏｌ）とＢＦ３Ｅｔ２Ｏ（１９．３ｍＬ，０．１５２ｍｏｌ）を窒素気流下で氷冷しながら加え、２時間攪拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、化合物５７（２２ｇ，０．０６４ｍｏｌ）を８５％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．５０．
フェニル１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド（５８）
化合物５７（１８ｇ，０．０４７ｍｏｌ）をメタノール（５０ｍＬ）に溶解させ、ナトリウムメトキシド／メタノールを加え、１時間攪拌した。反応終了後、イオン交換樹脂を加え中性に戻し、ｐＨ試験紙で確認後、ろ過をした。得られたろ液を減圧濃縮し、化合物５８（１２ｇ，０．０４７ｍｏｌ）を定量的に得た。ＴＬＣ ＣＨ２Ｃｌ２：メタノールｔ＝４：１ Ｒｆ＝０．４９．
フェニル３，４−Ｏ−ベンジリデン−１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド（５９）
化合物５８（２．０ｇ，５．９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（７．０ｍＬ）に溶解させ、ベンズアルデヒドジメチルアセタール（１．３３ｍＬ，８．９ｍｍｏｌ）とＴｓＯＨ（１１２ｍｇ，０．５９ｍｍｏｌ）を加え、４５℃で１時間攪拌した。反応終了後、トリエチルアミンで中和し、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で精製し，化合物５９（１．８４ｇ（ａ，ｂ ｍｉｘｔｕｒｅ），５．１ｍｍｏｌ）を８７％の収率で得た。
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ５９ａ：ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．５２．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５４−７．２６（１０Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ２），６．１９（１Ｈ，ｓ，ベンジリデンメチン），５．１７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，Ｈ−２），４．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，Ｈ−１），４．４８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，Ｈ−４），４．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，Ｈ−３），３．８７（１Ｈ，ｑ，Ｈ−５），１．３８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｈ−６）．
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ５９ｂ：ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．４９．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．８９−７．２７（１０Ｈ，ｍ，Ｐｈｘ２），５．８９（１Ｈ，ｓ，ベンジリデンメチン），５．０６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，Ｈ−２），４．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，Ｈ−１），４．３６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，Ｈ−４），４．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−３），３．９８（１Ｈ，ｑ，Ｈ−５），１．３８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，Ｈ−６）．
フェニル２−Ｏ−ベンジル−３，４−Ｏ−ベンジリデン−１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド（６０）
化合物５９（１．１ｇ（ａ，ｂ ｍｉｘｔｕｒｅ），３．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解させ、ＢｎＢｒ（７６０μＬ，６．１ｍｍｏｌ）を加え、氷冷しながらＮａＨ（８．８ｍｇ，０．６１ｍｍｏｌ）を加え、１．５時間攪拌した。反応終了後、酢酸エチルで抽出し、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製し、化合物６０（７８３ｍｇ（ａ，ｂ ｍｉｘｔｕｒｅ），１．７４ｍｍｏｌ）を５８％の収率で得た。
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ６０ａ：１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５９−７．２２（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．９９（１Ｈ，ｓ，ベンジリデンメチン），４．８８，４．７８（２Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，ベンジルメチレン），４．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，Ｈ−１），４．５５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−４），４．０７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈ−３），３．７７（１Ｈ，ｑ，Ｈ−５），３．６４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，Ｈ−２），１．４１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｈ−６）．
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ６０ｂ：１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５８−７．２２（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．８９（１Ｈ，ｓ，ベンジリデンメチン），４．７３，４．５６（２Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，ベンジルメチレン），４．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，Ｈ−１），４．３７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−４），４．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，Ｈ−３），３．９１（１Ｈ，ｑ，Ｈ−５），３．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，Ｈ−２），１．４６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｈ−６）．
フェニル２，３−ｄｉ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド（６１）及びフェニル２，４−ｄｉ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド（６２）
化合物６０（９０ｍｇ（６０ａ，ｂ ｍｉｘｔｕｒｅ），０．０２１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１．４ｍＬ）に溶解させ、ＭＳ３Ａ（５００ｍｇ）を加え、窒素気流下でＮａＢＨ３ＣＮ／ＴＨＦ（１１０ｍＬ，０．１７ｍｍｏｌ）を加え、２時間攪拌し、ＨＣｌ／ジエチルエーテル（５．０ｍＬ）を加えた。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製し、化合物６１（４５ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ，５０％）、６２（２５ｍｇ，０．００６ｍｍｏｌ，２７％）をで得た。
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ６１：ＴＬＣヘキサン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．８９．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５９−７．１５（２０Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ４），４．８５，４．７５，４．７０，４．６１（６Ｈ，ｅａｃｈ，ｄ，ベンジルメチレン ｘ ２），４．６１（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１），３．８１（１Ｈ，ｔ，Ｈ−４），３．６９（１Ｈ，ｔ，Ｊ２−３＝９．２４Ｈｚ，Ｈ−２），３．５９−３．１２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−５），１．３６（３Ｈ，ｄ，Ｊ６−５＝６．３Ｈｚ，Ｈ−６），５．２７（１Ｈ，ｓ，ＯＨ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ８７．５（Ｃ−１），８２．８（Ｃ−３），７７．５（Ｃ−５），７６．５（Ｃ−２），７４．２（Ｃ−５），１６．９（Ｃ−６）．
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ６２：１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５８−７．１８（２０Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ４），４．８９，４．７６，４．７２，４．６１（６Ｈ，ｅａｃｈ，ｄ，ベンジルメチレン ｘ ２），４．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝８．５Ｈｚ，Ｈ−１），３．７０−３．６３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−４），３．５９−３．５２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−５），１．３６（３Ｈ，ｄ，Ｊ６−５＝６．３，Ｈ−６），５．２６（１Ｈ，ｓ，ＯＨ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ８７．１（Ｃ−１），７９．３（Ｃ−３），７７．９（Ｃ−５），７６．０（Ｃ−２），７４．５（Ｃ−５），１６．６（Ｃ−６）．
フェニル２−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド（６３）
化合物６０（２．７ｇ（ｍｉｘ），６．１ｍｍｏｌ）を酢酸（８０ｍＬ）に溶解させ、その後に水（２０ｍＬ）を１滴ずつ加え、４５℃で５時間撹拌した。反応終了後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：メタノール＝１００：１）で精製し、化合物６３（１．９ｇ，５．６ｍｍｏｌ）を９１％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．２２．
フェニル２，３−ｄｉ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド（６１）
化合物６３（１．９ｇ，５．６ｍｍｏｌ）をトルエン（３０ｍＬ）に溶解させ、Ｂｕ２ＳｎＯ（１．６６ｇ，６．６ｍｍｏｌ）を加え、３時間加熱還流した後、減圧濃縮した。得られた残渣をＤＭＦ（３０ｍＬ）に溶かし、ＣｓＦ １．１ｇ，６．６ｍｍｏｌ）とＢｎＢｒ（８２０μＬ，６．６ｍｍｏｌ）を加え３時間攪拌した。反応終了後、酢酸エチルで抽出し、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１０：１）で精製し、化合物６１（１．９ｇ，２．４ｍｍｏｌ）を８９％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．５１．
フェニル２，３−ｄｉ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−スクシノイル−１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド（６４）
化合物６１（４９２ｍｇ，１．１３ｍｍｏｌ）をピリジン（５．０ｍＬ）、ＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）に溶解させ、ＤＭＡＰ ２７８ｍｇ，２．２５ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（２２５ｍｇ，２．２５ｍｍｏｌ）を加えて室温で１２時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＨＣｌで洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、化合物６４（５５６ｍｇ，１．０２ｍｍｏｌ）を９２％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝２：１ Ｒｆ＝０．３２．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５９−７．２５（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．３８（１Ｈ，ｄ，Ｈ−４），４．６３（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１），４．７８，４．７４，４．７１，４．５０（４Ｈ，ｅａｃｈ，ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ２），３．７０−３．３１（３Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−３，Ｈ−５），２．７４（４Ｈ，ｍ，ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ），１．２４（３Ｈ，ｄ，Ｊ６−５＝６．３Ｈｚ，Ｈ−６）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１７７．５（ＣＯ），１７１．８（ＣＯ），８７．４（Ｃ−１），７０．２（Ｃ−４），１６．８（Ｃ−６），８１．１，７６．３，７１．８．
Ｌｅｅ，Ｅ．；Ｂｒｕｚｚｉ，Ａ．；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｅ．；Ｏ’Ｃｏｌｌａ，Ｐ．Ｓ．（１９７９）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．７１，３３１−４．
Ｌｏｐｅｚ，Ｒ．；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍａｙｏｒａｌａｓ，Ａ．（１９９４）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９，７３７−４５．
（４）ガラクトサミン誘導体の合成
フェニル２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２）
化合物１（１．０ｇ，２．６ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）溶液にＰｈＳＨ（０．２ｍｌ，２．６ｍｍｏｌ）、ＳｎＣｌ４（０．２ｍｌ，１．７ｍｍｏｌ）を加え外温５０℃で一晩還流した。室温に戻し酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え酢酸エチル抽出し、Ｈ２Ｏで洗いＭｇＳＯ４で脱水し溶媒留去した。得られた結晶を酢酸エチル−ヘキサンを用いて再結晶し化合物２（０．５３ｇ，４６．９％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５３−７．５０（ｍ，２Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｈ），７．３０−７．２８（ｍ，３Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｈ），５．７４（ｂｒ．ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，ＮＨ），５．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，Ｈ−４），５．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．３，１０．７Ｈｚ，Ｈ−３），４．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，Ｈ−１），４．２６−４．０８（ｍ，３Ｈ，Ｈ−２ ａｎｄ Ｈ−６），３．９５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｈ−５），２．１３，２．０３，１．９９，１．９７（ｅａｃｈ ３Ｈ，ｓ，ＣＯＣＨ３）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ８７．０６（Ｃ−１），７４．３９（Ｃ−５），７１．０７（Ｃ−３），６６．９６（Ｃ−４），６１．８５（Ｃ−６），４９．７４（Ｃ−２），２３．３６，２０．６１（ＣＨ３）．
フェニル ２−アジド−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（３）
飽和水酸化バリウム水溶液（１５０ｍｌ）に化合物２（１．０ｇ，２．４ｍｍｏｌ）を加え外温１２０℃で２４時間還流した後、ＣＯ２ガスをｂｕｂｂｌｉｎｇしガラスフィルターろ過しろ液を溶媒留去した。残さをメタノール（５０ｍｌ）に溶解し、ＤＭＡＰ（０．３２ｇ，２．６ｍｍｏｌ），０．４Ｍ ＴｆＮ３ ＣＨ２Ｃｌ２溶液（１５ｍｌ，０．６ｍｍｏｌ）を加え窒素気流下２日間室温で撹拌し溶媒留去した。残さをシカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２０ｇ）に付し、酢酸エチル溶出部より化合物３（０．９２ｇ，ｑｕａｎｔ．ｉｎ ２ｓｔｅｐｓ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ７．５９−７．５５（ｍ，２Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｈ），７．３３−７．２６（ｍ，３Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｈ），４．５１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，Ｈ−１），３．８５（ｂｒ．ｓ，１Ｈ，Ｈ−４），３．７７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５，１１．３Ｈｚ，Ｈ−６），３．７０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０，１１．３Ｈｚ，Ｈ−６），３．５４−３．４９（ｍ，３Ｈ，Ｈ−２，３ ａｎｄ ５Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ８８．１２（Ｃ−１），８０．６４（Ｃ−３），７５．２２（Ｃ−５），６９．７２（Ｃ−４），６４．５２（Ｃ−２），６２．７４（Ｃ−６）．
フェニル ２−アジド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（４）
化合物３（３７ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍｌ）溶液にベンズアルデヒドジメチルアセタール（４０μｌ，０．２７ｍｍｏｌ）ＣＳＡ（ミクロスパーテル１杯）を加え外温６０℃にて３時間撹拌した。氷冷した飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に反応液を注ぎ、酢酸エチル抽出し、ｂｒｉｎｅで洗い、ＭｇＳＯ４で脱水し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ）に付し、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１溶出部より化合物４（４７ｍｇ，９７．６％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ５．５１（ｓ，１Ｈ，ＣＨＰｈ），４．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，Ｈ−１），４．３７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０，１２．５Ｈｚ，Ｈ−６），４．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，Ｈ−４），４．００（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８，１２．６Ｈｚ，Ｈ−６），３．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，Ｈ−２）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１０１．３１（ＣＨＰｈ），８５．０７（Ｃ−１），７４．４１（Ｃ−４），７３．０８（Ｃ−３ ｏｒ Ｃ−５），６９．８２（Ｃ−３ ｏｒ Ｃ−５），６９．１５（Ｃ−６），６２．０３（Ｃ−２）．
フェニル ２−アジド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（５）
化合物４（０．３８ｇ，０．９９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（８ｍｌ）溶液に６０％ＮａＨ（５１ｍｇ，１．２８ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間撹拌後ＰＭＢＣｌ（１５０μｌ，１．１ｍｍｏｌ）を加え室温で一晩撹拌した。氷を加えた後酢酸エチル抽出し、ｂｒｉｎｅで洗いＭｇＳＯ４で脱水し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ）に付しｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１溶出部より化合物５（０．３５ｇ，７０．８％）、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１溶出部より化合物４（０．９ｇ，２３．１％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ５．４６（ｓ，１Ｈ，ＣＨＰｈ），４．６４（ｓ，２Ｈ，ベンジルメチレン），４．３９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，Ｈ−１），４．３５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５，１２．２Ｈｚ，Ｈ−６），４．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，Ｈ−４），３．９７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５，１２．２Ｈｚ，Ｈ−６），３．８０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，Ｈ−２），３．８０（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３），３．４４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．３，９．４Ｈｚ，Ｈ−３），３．３７（ｂｒ．ｓ，１Ｈ，Ｈ−５）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１０１．０６（ＣＨＰｈ），８５．１４（Ｃ−１），７９．０８（Ｃ−３），７２．０９（Ｃ−４），７１．１２（ベンジルメチレン），６９．８１（Ｃ−５），６９．２６（Ｃ−６），５９．７３（Ｃ−２），５５．１８（ＣＨ３）．
フェニル ２−アジド−２−デオキシ−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（６）
化合物５（０．１７ｇ，０．３０ｍｍｏｌ）を９０％酢酸水溶液に溶解し外温５０℃で４時間撹拌し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ）に付し、トルエン：酢酸エチル＝９：１溶出部より化合物５（０．１３ｇ，７．３％），トルエン：酢酸エチル＝１：１溶出部より化合物６（０．１０ｇ，８４．９％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ４．６３（ｓ，２Ｈ，ベンジルメチレン），４．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，Ｈ−１），４．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｈ−４），３．９５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−６），３．８１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），３．６２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，Ｈ−２），３．４６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，Ｈ−５），３．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０，９．５Ｈｚ，Ｈ−３）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８６．１９（Ｃ−１），８０．５５（Ｃ−３），７８．１５（Ｃ−５），７１．７７（ベンジルメチレン），６６．０３（Ｃ−３），６２．６３（Ｃ−６），６０．９２（Ｃ−２）．
フェニル ２−アジド−４，６−ジ−Ｏ−のベンジル−２−デオキシ−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（７）
化合物６（０．１９ｇ，０．４５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４ｍｌ）溶液に６０％ＮａＨ（０．０９ｇ，２．２ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間撹拌後ＢｎＢｒ（２６０μｌ，２．２ｍｍｏｌ）を加え室温で一晩撹拌した。氷を加え酢酸エチル希釈し、Ｈ２Ｏ，ｂｒｉｎｅで洗いＭｇＳＯ４で脱水し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ）に付しｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１溶出部より化合物７（０．１７ｇ，６３．４％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ４．８７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，ベンジルメチレン），４．６６−４．３５（ｍ，５Ｈ，ベンジルメチレン），４．３９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，Ｈ−１），３．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，Ｈ−４），３．８１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，Ｈ−２），３．７７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），３．６４−６．６１（ｍ，２Ｈ，Ｈ−６），３．５７−３．５２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５），３．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，９．８Ｈｚ，Ｈ−３）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８６．３１（Ｃ−１），８２．０５（Ｃ−３），７７．３２（Ｃ−５），７４．３２ ７３．５０ ａｎｄ ７１．９９（ベンジルメチレン），７２．１３（Ｃ−４），６８．４８（Ｃ−６），６１．４０（Ｃ−２），５５．１９（ＣＨ３）．
フェニル ２−アジド−４，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（８）
化合物８（０．１６ｇ，０．２７ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２−Ｈ２Ｏ（１９：１，２ｍｌ）に溶解し氷冷下ＤＤＱ（０．０７ｇ，０．３２ｍｍｏｌ）を加え室温で２時間撹拌し、セライトろ過し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ）に付しトルエン：酢酸エチル＝９：１溶出部より化合物８（０．１０ｇ，８０．７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ４．６９（ｓ，２Ｈ，ベンジルメチレン），４．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，ベンジルメチレン），４．４８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，ベンジルメチレン），４．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，Ｈ−１），３．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，Ｈ−４），３．７３−３．６６（ｍ，３Ｈ），３．５８−３．５５（ｍ，２Ｈ），２．２４（ｂｒ．ｓ，１Ｈ，３−ＯＨ）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８５．４０（Ｃ−１），７７．３６（Ｃ−３ ｏｒ Ｃ−５），７５．２５（Ｃ−４），７４．３０（Ｃ−３ ｏｒ Ｃ−５），７４．９９ ａｎｄ ７３．５０（ベンジルメチレン），６８．１４（Ｃ−６），６３．３３（Ｃ−２）．
フェニル ２−アジド−３−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（９）
化合物４（０．５８ｇ，１．５０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液に６０％ＮａＨ（０．１０ｇ，２．４ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間撹拌後ＢｎＢｒ（０．２６μｌ，２．１ｍｍｏｌ）を加え室温で一晩撹拌した。氷を加えた後酢酸エチル抽出し、ｂｒｉｎｅで洗いＭｇＳＯ４で脱水し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２０ｇ）に付しｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１溶出部より化合物９（０．５５ｇ，７７．２％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ５．４３（ｓ，１Ｈ，ＣＨＰｈ），４．６８（ｓ，２Ｈ，ベンジルメチレン），４．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，Ｈ−１），４．３２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，１２．５Ｈｚ，Ｈ−６），４．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，Ｈ−４），３．９３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５，１２．５Ｈｚ，Ｈ−６），３．７９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，Ｈ−２），３．４３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．１，９．６Ｈｚ，Ｈ−３），３．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝０．８Ｈｚ，Ｈ−５）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣ３）δ１０１．０３（ＣＨＰｈ），８５．１０（Ｃ−１），７９．４６（Ｃ−３），７１．９９（Ｃ−４），７１．４８（ベンジルメチレン），６９．７４（Ｃ−５），６９．２４（Ｃ−６），５９．７３（Ｃ−２）
Ｈｏｒｔｏｎ，Ｄ．；Ｒｏｄｅｍｅｙｅｒ，Ｇ．；Ｓａｅｋｉ，Ｈ．（１９７７）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．５９，６０７−１１．
Ｍｉｙａｊｉｍａ，Ｋ．；Ｎｅｋａｄｏ，Ｔ．；Ｉｋｅｄａ，Ｋ．；Ａｃｈｉｗａ，Ｋ．（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４６，１６７６−１６８２．
Ｍｕｋａｉｙａｍａ，Ｔ．；Ｉｋｅｇａｉ，Ｋ．；Ｊｏｎａ，Ｈ．；Ｈａｓｈｉｈａｙａｔａ，Ｔ．；Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｋ．（２００１）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８４０−８４１．
（５）グルコース誘導体の合成
フェニル ４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（２）
化合物１（１２０ｍｇ，０．３３ｍｍｏｌ）のｔｏｌｕｅｎｅ（４ｍｌ）溶液にＢｕ２ＳｎＯ（８５ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）を加え窒素雰囲気下、外温１５０℃で３時間ｒｅｆｌｕｘし溶媒留去した。残さをＤＭＦ（３．３ｍｌ）に溶解しＰＭＢＣｌ（５４μｌ，４１ｍｍｏｌ）、ＣｓＦ（６４ｍｇ，４２ｍｍｏｌ）を加え室温で一晩撹拌した。ＡｃＯＥｔ抽出し、ｂｒｉｎｅで洗いＮａ２ＳＯ４で脱水し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１１ｇ）に付しＴｏｌｕｅｎｅ／ＡｃＯＥｔ＝２０／１溶出部より化合物２（１１０ｍｇ，７５％）を得た。
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．５３−６．８２（ｍ，１４Ｈ，Ｐｈ，ＳＰｈ，ＰＭＢ），５．５５（ｓ，１Ｈ，ＣＨＰｈ），４．８７（ｄ，１Ｈ，ｂｅｎｚｙｌｍｅｔｈｌｅｎｅ），４．７１（ｄ，１Ｈ，ｂｅｎｚｙｌｍｅｔｈｌｅｎｅ），４．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝９．７Ｈｚ，Ｈ−１），４．３７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ５，６’＝５．０Ｈｚ，Ｊ６．６’＝１０．５Ｈｚ，Ｈ−６’），３．７９−３．７５（ｍ，４Ｈ，Ｊ６，６’＝１０．５Ｈｚ，Ｈ−６，ＣＨ３），３．６７−３．６０（ｍ，２Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−４），３．５０−３．４６（ｍ，２Ｈ，Ｊ１，２＝９．７Ｈｚ，Ｈ−２，Ｊ５，６’＝１０．５Ｈｚ，Ｈ−５）；１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）１５９．４５，１３７．３０，１３３．１９，１３１．４７，１２９．８３，１２９．０５，１２８．３４，１２８．２９，１２６．０７，１１３．９５（ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｃ），１０１．２９（ＣＨＰｈ），８８．４５（Ｃ−１），８１．３０，８１．１７，７４．４８（ｂｅｎｚｙｌｍｅｔｈｙｌｅｎｅ），７２．２５（Ｃ−２），７０．７９（Ｃ−５），６８．６７（Ｃ−６），５５．２８（ＣＨ３）．
フェニル ３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（３）
化合物２（７８ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）の９０％ＡｃＯＨ水溶液に溶解し外温５０℃で３時間撹拌し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ）に付しＴｏｌｕｅｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝１：１溶出部より化合物３（５６ｍｇ，８８％）を得た。
１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）７．５３−６．８６（ｍ，９Ｈ，ＳＰｈ，ＰＭＢ），４．８５（ｄ，１Ｈ，ｂｅｎｚｙｌｍｅｔｈｌｅｎｅ），４．６８（ｄ，１Ｈ，ｂｅｎｚｙｌｍｅｔｈｌｅｎｅ），４．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝９．７Ｈｚ，Ｈ−１），３．８５−３．６２（ｍ，５Ｈ，Ｈ−６’，Ｈ−６，ＣＨ３），３．３３−３．２６（ｍ，４Ｈ，Ｈ−２，Ｈ−３，Ｈ−４，Ｈ−５），２．５９（ｓ，２Ｈ，ＯＨ）；１３ＣＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）１３２．７１，１３０．７３，１２９．８６，１２８．３１，１１４．５７（ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｃ），８９．６３（Ｃ−１），８７．５６，８２．０４，７５．９６，７３．９１，７１．２１，６２．８１（Ｃ−６），５５．６７（ＣＨ３）
フェニル ２，４，６−ｔｒｉ−Ｏ−ベンジル−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（４）
化合物３（０．６３ｍｇ，１．６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍｌ）溶液に６０％ＮａＨ（０．２１ｍｇ，５．２ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間撹拌後ＢｎＢｒ（０．７ｍｌ，５．７ｍｍｏｌ）を加え一晩撹拌した。氷を加えた後ＡｃＯＥｔ抽出し、ｂｒｉｎｅで洗いＭｇＳＯ４で脱水し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル４０ｇ）に付しＡｃＯＥｔ：Ｈｅｘ＝１：５溶出部より化合物４（０．８７ｍｇ，８２％）を得た。
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．６２−６．８２（ｍ，２４Ｈ，Ｐｈ，ＳＰｈ，ＰＭＢ），４．９２−４．５２（ｍ，９Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）３．７６−３．４８（ｍ，５Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）１５９．１９，１３８．２４，１３８．０６，１３３．７６，１３１．８６，１３０．４９，１２９．４３，１２８．８１，１２８．３６，１２８．２７，１２８．０７，１２７．７８，１２７．７１，１２７．５７，１２７．４８，１２７．３３，１２６．９９，１２６．８６，１１３．８０（ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｃ），８７．３５（Ｃ−１），８６．４０，８０．７９，７９．０３，７６．８２，７６．５３，７５．４５，７５．２９，７４．９２，７３．３２（ｂｅｎｚｙｌｍｅｔｈｙｌｅｎｅ），６８．９７（Ｃ−６），５５．１７（ＣＨ３）
フェニル ２，４，６−ｔｒｉ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（５）
化合物４（９３ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２−Ｈ２Ｏ（１９：１，１ｍｌ）に溶解し氷冷下ＤＤＱ（３４ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）を加え室温で２時間撹拌した。セライトろ過し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ）に付しＴｏｌｕｅｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝４９：１溶出部より化合物５（６８ｍｇ，８９％）を得た。
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．５８−７．１５（ｍ，２０Ｈ，Ｐｈ，ＳＰｈ），４．９４−４．５０（ｍ，７Ｈ，Ｈ−１，ｂｅｎｚｙｌｍｅｔｈｌｅｎｅ），３．８５−３．６８（ｍ，３Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−６，Ｈ−６’），３．５６−３．４８（ｍ，２Ｈ，Ｈ−４，Ｈ−５），３．３６（ｔ，１Ｈ，Ｊ２，３＝Ｊ３，４＝９．０Ｈｚ，Ｈ−３）；１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）１３８．２０，１３８．０６，１３３．８０，１３１．７３，１３１．６１，１２８．９９，１２８．８６，１２８．７３，１２８．５４，１２８．４３，１２８．２８，１２８．１６，１２７．９８，１２７．８９，１２７．７８，１２７．６６，１２７．５３，１２７．３７（ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｃ），８７．０１（Ｃ−１），８０．５８（Ｃ−２），７８．７６，７８．５８（Ｃ−３），７７．３４，７５．０４，７４．５６，７３．３７（ｂｅｎｚｙｌｍｅｔｈｙｌｅｎｅ），６９．０４（Ｃ−６）
Ｐｆａｅｆｆｌｉ，Ｐ．Ｊ．；Ｈｉｘｓｏｎ，Ｓ．Ｈ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．（１９７２）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２３１，１９５−２０６．
Ｍｏｔａｗｉａ，Ｍ．Ｓ．；Ｏｌｓｅｎ，Ｃ．Ｅ．；Ｅｎｅｖｏｌｄｓｅｎ，Ｋ．；Ｍａｒｃｕｓｓｅｎ，Ｊ．；Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ｂ．Ｌ．（１９９５）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２７７，１０９−２３．
Ｂｏｕｓｑｕｅｔ，Ｅ．；Ｋｈｉｔｒｉ，Ｍ．；Ｌａｙ，Ｌ．；Ｎｉｃｏｔｒａ，Ｆ．；Ｐａｎｚａ，Ｌ．；Ｒｕｓｓｏ，Ｇ．（１９９８）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３１１，１７１−１８１．
Ｅｎｎｉｓ，Ｓ．Ｃ．；Ｃｕｍｐｓｔｅｙ，Ｉ．；Ｆａｉｒｂａｎｋｓ，Ａ．Ｊ．；Ｂｕｔｔｅｒｓ，Ｔ．Ｄ．；Ｍａｃｋｅｅｎ，Ｍ．；Ｗｏｒｍａｌｄ，Ｍ．Ｒ．（２００２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５８，９４０３−９４１１．
Ｇｏｒｄｏｎ，Ｄ．Ｍ．；Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ，Ｓ．Ｊ．（１９９０）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２０６，３６１−６
Ｍｉｃｈｅｅｌ，Ｆ．；Ｋｒｅｕｔｚｅｒ，Ｕ．（１９６９）Ｊｕｓｔｕｓ Ｌｉｅｂｉｇ．Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．７２２，２２８−３１．
Ｍｕｋａｉｙａｍａ，Ｔ．；Ｃｈｉｂａ，Ｈ．；Ｆｕｎａｓａｋａ，Ｓ．（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．３９２−３９３．
（６）グルコサミン誘導体の合成
フェニル ２−アジド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（２）
化合物１（９０ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２．５ｍｌ）溶液に６０％ＮａＨ（１８ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間撹拌後ＰＭＢＣｌ（３８μｌ，０．２８ｍｍｏｌ）を加え１時間撹拌した。氷を加えた後酢酸エチル抽出し、ｂｒｉｎｅで洗いＮａ２ＳＯ４で脱水し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル７０ｇ）に付しトルエン溶出部より化合物２（９８ｍｇ，８３％）を得た。
化合物２：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．５６−７．２５（ｍ，１４Ｈ，Ｐｈ，ＳＰｈ，ＰＭＢ），５．５６（ｓ，１Ｈ，ＣＨＰｈ），４．８３（ｄ，１Ｈ，ベンジルメチレン），４．７２（ｄ，１Ｈ，ベンジルメチレン），４．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝１０．２Ｈｚ，Ｈ−１），４．３８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ５，６’＝５．０Ｈｚ，Ｊ６，６’＝１０．５Ｈｚ，Ｈ−６’），３．８０−３．７６（ｍ，４Ｈ，Ｊ６，６’＝１０．５Ｈｚ，Ｈ−６，ＣＨ３），３．６５−３．５９（ｍ，２Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−４），３．４５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５），３．３４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１，２＝１０．２Ｈｚ，Ｊ２，３＝８．７Ｈｚ，Ｈ−２）．１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１５９．５４，１３７．１３，１３３．９７，１３０．６３，１３０．０６，１２９．７０，１２９．１３，１２８．７５，１２８．３２，１２６．００，１１３．８９（ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｃ），１０１．３０（ＣＨＰｈ），８６．６１（Ｃ−１），８１．３４（Ｃ−３），８０．５８（Ｃ−４），７４．８５（ベンジルメチレン），７０．５５（Ｃ−５），６８．５３（Ｃ−６），６４．６７（Ｃ−２），５５．２８（ＣＨ３）．
フェニル ２−アジド−２−デオキシ−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（３）
化合物２（０．２１ｇ，０．４２ｍｍｏｌ）の９０％水溶液に溶解し外温５０℃で３時間撹拌し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１８ｇ）に付しトルエン：酢酸エチル＝１：１溶出部より化合物３（０．１２ｇ，６７％）を得た。
化合物３：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．５３−６．８６（ｍ，９Ｈ，ＳＰｈ，ＰＭＢ），４．８５（ｄ，１Ｈ，ベンジルメチレン），４．６８（ｄ，１Ｈ，ベンジルメチレン），４．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝９．７Ｈｚ，Ｈ−１），３．８５−３．６２（ｍ，５Ｈ，Ｈ−６’，Ｈ−６，ＣＨ３），３．５１（ｔ，１Ｈ，Ｈ−３），３．３３−３．２６（ｍ，３Ｈ，Ｈ−２，Ｈ−４，Ｈ−５），２．５９（ｓ，２Ｈ，ＯＨ）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１５９．５４，１３３．１６，１３１．２６，１２９．８２，１２９．８０，１２９．０７，１２８．４０，１１４．０８（ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｃ），８６．３４（Ｃ−１），８４．２６（Ｃ−５），７９．４０（Ｃ−４），７５．０５（ベンジルメチレン），７０．０８（Ｃ−３），６４．８５（Ｃ−２），６２．２５（Ｃ−６），５５．２２（ＣＨ３）．
フェニル ２−アジド−４，６−ｄｉ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（４）
化合物３（９１ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２．２ｍｌ）溶液に６０％ＮａＨ（３４ｍｇ，０．５６ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間撹拌後ＢｎＢｒ（６１μｌ，０．５２ｍｍｏｌ）を加え３時間撹拌した。氷を加えた後酢酸エチル抽出し、ｂｒｉｎｅで洗いＮａ２ＳＯ４で脱水し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１２ｇ）に付しトルエン溶出部より化合物４（１００ｍｇ，８１％）を得た。
化合物４：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．６０−６．８２（ｍ，１９Ｈ，Ｐｈ，ＳＰｈ，ＰＭＢ），４．８１−４．５１（ｍ，６Ｈ，ベンジル ｍｅｔｈｌｅｎｅ），４．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝１０．１Ｈｚ，Ｈ−１），３．７７−３．７１（ｍ，５Ｈ，Ｈ−６，Ｈ−６’，ＣＨ３），３．５８（ｍ，１Ｈ，Ｊ２，３＝Ｊ３，４＝９．４Ｈｚ，Ｈ−３），３．５１−３．４４（ｍ，２Ｈ，Ｊ３，４＝９．４Ｈｚ，Ｈ−４，Ｈ−５），３．３２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１，２＝１０．１Ｈｚ，Ｊ２，３＝９．４Ｈｚ，Ｈ−２）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１５９．５５，１３８．３０，１３８．０２，１３３．７０，１３１．２７，１２９．９６，１２９．８７，１２９．０２，１２８．５１，１２８．４１，１２８．３８，１２７．９０，１２７．８２，１２７．６４，１２７．６０，１１４．００（ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｃ），８５．９５（Ｃ−１），８４．８０（Ｃ−４），７９．４４（Ｃ−５），７７．３７（Ｃ−３），７５．５７，７５．０３，７３．４８（ベンジル メチレン），６８．８４（Ｃ−２），６５．１４（Ｃ−６），５５．３０（ＣＨ３）．
フェニル ２−アジド−４，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（５）
化合物４（０．１０ｇ，０．１２ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２−Ｈ２Ｏ（１９：１，１．８ｍｌ）に溶解し氷冷下ＤＤＱ（０．０５ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）を加え室温で４時間撹拌した。セライトろ過し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ）に付しトルエン溶出部より化合物５（０．０５ｇ，５８％）を得た。
化合物５：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．６１−７．２２（ｍ，１５Ｈ，Ｐｈ，ＳＰｈ），４．７１−４．５５（ｄ，４Ｈ，ベンジルメチレン），４．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝１０．１Ｈｚ，Ｈ−１），３．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ５，６’＝２．０Ｈｚ，Ｊ６，６’＝１１．０Ｈｚ，Ｈ−６’），３．７６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ５，６＝４．０Ｈｚ，Ｊ６，６’＝１１．０Ｈｚ，Ｈ−６），３．５９（ｔ，１Ｈ，Ｈ−３），３．５１（ｔ，１Ｈ，Ｈ−４），３．４５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５），３．２８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１，２＝１０．１Ｈｚ，Ｈ−２）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１３８．１５，１３７．９８，１３３．３９，１３１．４９，１２８．４０，１２８．２９，１２８．１２，１２８．００，１２７．６５（ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｃ），８６．１０（Ｃ−１），７９．１１（Ｃ−５），７７．３４（Ｃ−３），７７．２６（Ｃ−４），７３．５３（ベンジルメチレン），６８．８１（Ｃ−６），６５．００（Ｃ−２）．
Ｂｅｎａｋｌｉ，Ｋ．；Ｚｈａ，Ｃ．；Ｋｅｒｎｓ，Ｒ．Ｊ．（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３，９４６１−９４６２．
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Ｍａｒｔｉｎ−Ｌｏｍａｓ，Ｍ．；Ｆｌｏｒｅｓ−Ｍｏｓｑｕｅｒａ，Ｍ．；Ｃｈｉａｒａ，Ｊ．Ｌ．（２０００）Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１５４７−１５６２．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｓ．；Ｋｕｚｕｈａｒａ，Ｈ．；Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｍ．（２００１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５７，６９１５−６９２６．
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（７）フェニル ２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（７０）
化合物６８（１．９ｇ，３．３ｍｍｏｌ）を酢酸（１２０ｍＬ）に溶解させ、その後に水（２４ｍＬ）を１滴ずつ加え、４５℃で４時間撹拌した。反応終了後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：メタノール＝２００：１）で精製し，化合物７０（１．３ｇ，２．７ｍｍｏｌ）を８１％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝１：１ Ｒｆ＝０．２０．１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５２−７．２６（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），４．９７−４．６９（５Ｈ，ｍ，Ｈ−１，ベンジルメチレン ｘ ２），３．９１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−６ａ），３．７６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｈ−４），３．５９（１Ｈ，ｔ，Ｈ−６ｂ），３．５３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｈ−３），３．４８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，Ｈ−２），３．３４（１Ｈ，ｑ，Ｈ−５）．
フェニル ２，３−ジ−Ｏ−のベンジル−６−Ｏ−トリチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（７１）
化合物７０（６９６ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）をピリジン（６．０ｍＬ）に溶解させ、ＴｒＣｌ（８５８ｍｇ，３．１ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（１８８ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）を加え、５５℃で１２時間攪拌した。反応終了後、メタノールを加え、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝６：１）で精製し、化合物７１（１．２４ｇ，２．２ｍｍｏｌ）を７２％に得た。ＴＬＣヘキサン：酢酸エチル＝３：１ Ｒｆ＝０．４９．１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．６６−７．２１（３０Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ６），４．９８，４．８８，４．７６，４．７４（４Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ２），４．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，Ｈ−１），３．６５（１Ｈ，ｔ，），３．４８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，Ｈ−２），３．４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，Ｈ−６ａ），３．４１−３．１８（４Ｈ，ｍ，−３，Ｈ−４，Ｈ−５，Ｈ−６ｂ）．
フェニル ４−Ｏ−クロロアセチル−２，３−ｄｉ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（７２）
化合物７１（５５０ｍｇ，０．９７ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（７．２ｍＬ）、ピリジン（０．４ｍＬ）に溶解させ、氷冷下でクロロアセチルクロライド（１５４ｍＬ，１．９４ｍｍｏｌ）を加え、１２時間撹拌した。その後、メタノール（３．０ｍＬ）加えて反応を終了させ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＨＣｌ、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。得られた残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）、メタノール（２．５ｍＬ）に溶解させ、ＴｓＯＨ（３３ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）を加え室温で３時間攪拌した。反応終了後、トリエチルアミンで中性に戻し、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝６：１）で精製し、化合物７２（４４０ｍｇ，０．７８ｍｍｏｌ）を８８％（２ｓｔｅｐｓ）の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．５１．１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５５−７．２２（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．００（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，Ｈ−４），４．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝８．０Ｈｚ，Ｈ−１），４．８７，４．８３，４．７５，４．６５（４Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ２），３．７９−３．５８（５Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−６ａ，Ｈ−６ｂ，−ＯＣＨ２Ｃｌ），３．５３（１Ｈ，ｔ，Ｈ−２），３．４２（１Ｈ，ｑ，Ｈ−５）．
メチル（フェニル ４−Ｏ−クロロアセチル−２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド）ウロネート（７３）
化合物７２（３９０ｍｇ，０．７４ｍｍｏｌ）をアセトン（１０ｍＬ）に溶解させ、Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７（４０９ｍｇ，１．３９ｍｍｏｌ）、３．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４（１．６ｍＬ）を加えて、５５℃で１時間撹拌した後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出、ＭｇＳＯ４で脱水し、減圧濃縮した。この残渣をＨＣｌ−メタノール（２０ｍＬ）に溶解させ、室温で２時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝７：１）で精製し、化合物７３（４７４ｍｇ，０．４９ｍｍｏｌ）を６６％で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．８０．１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．６１−７．２２（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．１８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，Ｈ−４），４．７０ １Ｈ，ｄ，Ｈ−１），４．９０，４．８３，４．７２，４．６４（４Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ２），３．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，−ＯＣＨ２Ｃｌ），３．８５−３．７１（３Ｈ，ｍ，Ｈ−４，Ｈ−５，−ＯＣＨ２Ｃｌ），３．７４（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ），３．６８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，Ｈ−３），３．５８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，Ｈ−２）．
メチル（フェニル ２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド）ウロネート（７４）
化合物７３（５００ｍｇ，０．９２ｍｍｏｌ）をピリジン（１０．３ｍＬ）、エタノール（１．７ｍＬ）に溶解させ、チオ尿素（７０．２ｍｇ，９．２ｍｍｏｌ）を加えて、８０℃で１時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＨＣｌ、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝３：１）で精製し、化合物７４（４２０ｍｇ，０．９２ｍｍｏｌ）を定量的に得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．５８．１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５８−７．２４（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），４．７０（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１），４．８９，４．８３，４．７２，４．６６（４Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ２），３．８７（１Ｈ，Ｈ−４），３．８０（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ），３．５７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，Ｈ−３），３．５１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，Ｈ−２），３．０２（１Ｈ，ｄ，Ｈ−５）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１６９．５（Ｃ−６），８８．４（Ｃ−１），８５．２（Ｃ−３），７９．５（Ｃ−２），７７．２（Ｃ−５），７１．８（Ｃ−４），５２．８（ＯＣＨ３）．
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実施例２：拡散混合固相反応
本発明においては、必要かつ最小限の液量で樹脂を膨潤させて反応を行うことを特徴としている。樹脂を膨潤させるための液量については、前記表１等を参考にした。かつ、実際に秤量した一定量の樹脂に、これに使用する溶媒を滴下して樹脂ビーズ間の摩擦力が低下し「液状化」現象が生じる液量を確認し、決定した。
（１）アミノレジンへのカルボン酸化合物の導入（アミド化反応）
樹脂に結合したマンノシル供与体の拡散混合固相反応法による合成
フェニル ２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−スクシノイル−１−チオ−β−Ｄ−マンノピラノシド（２９５ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣ（１０８μＬ，０．６９ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）（７４．５ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）を溶解したＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍｌ）をＮｏｖａＳｙｎ ａｍｉｎｏ ＴＧ ｒｅｓｉｎ（５１１ｍｇ，１５．０μｍｏｌ ｌｏａｄｉｎｇ）に加え、室温で１４時間放置した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＤＭＦ、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。同一行程を２回繰り返し樹脂を減圧乾固した。Ａｃ２Ｏ（３．０ｍＬ）、ピリジン（３．０ｍＬ）を加え室温で１２時間放置した後、ＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固することでキャッピングを行い樹脂（５３０ｍｇ）を得た。
ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ｃｍ−１ １７３９．４（ＯＣ＝Ｏ），１６７１．９（ＮＨＣ＝Ｏ）．
収率の算出は、切り出し反応を行って決定した。樹脂（４９．０ｍｇ）をとりだし、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）で膨潤させ、０．５Ｍナトリウムメトキシド−メタノール（０．１ｍＬ）を加え室温で１時間放置した。その後、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ １２０Ｂ＋で中和し、吸引ろ過したろ液を減圧濃縮することでフェニル １−チオ−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノピラノシド（４．８ｍｇ，７．７μｍｏｌ，６２％）を得た。
樹脂に結合したフコシル供与体の拡散混合固相反応法による合成
フェニル ２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−スクシノイル−１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド（３１６ｍｇ，０．５９ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣ（１３８μＬ，０．８８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（９６ｍｇ，０．７１ｍｍｏｌ）を溶解したＤＭＦ（６．０ｍｌ）をＮｏｖａＳｙｎ ａｍｉｎｏ ＴＧ ｒｅｓｉｎ（９８２ｍｇ，０．２９ｍｍｏｌ ｌｏａｄｉｎｇ）に加え、室温で４８時間放置した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。Ａｃ２Ｏ（３．０ｍＬ）、ピリジン（３．０ｍＬ）を加え室温で１２時間放置した後、ＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固することでキャッピングを行い樹脂（１．０５ｇ）が得られた。
ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ｃｍ−１ １７３９．４（ＯＣ＝Ｏ），１６７１．９（ＮＨＣ＝Ｏ）．
収率の算出は、切り出し反応を行って決定した。樹脂（３０．０ｍｇ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）で膨潤させ、０．５Ｍナトリウムメトキシド−メタノール（０．１ｍＬ）を加え、室温で２時間放置し、その後、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ １２０Ｂ＋で中和し、吸引ろ過したろ液を減圧濃縮し、フェニル ２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド（３．０ｍｇ，６．９μｍｏｌ，８５％）を得た。
（２）固相上でのチオグリコシド体のフルオリド体への拡散混合固相反応法による変換反応
樹脂に結合したＬ−フコピラノシルフルオライド
ＤＡＳＴ（２６ｍＬ，０．１９ｍｍｏｌ）、ＮＢＳ（３５ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ）をＣ２Ｈ４Ｃｌ２（１．５ｍＬ）に溶解し、樹脂の結合したフェニルチオ−Ｌ−フコピラノシド（３００ｍｇ，３５ｍｇ：ｆｕｃ）に−１５℃で加え１時間放置した後、１時間かけて０℃まで温度をあげ、０℃で８時間放置した。反応の進行は樹脂を一部取りだし、ＩＲで測定後、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）に加え、０．５Ｍナトリウムメトキシド（１０μＬ）を滴下して室温で１時間放置することで固相から切り出し、これをＴＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで観測した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。
ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ｃｍ−１ １７３７．５（ＯＣ＝Ｏ），１６７３．９（ＮＨＣ＝Ｏ），１０４１．４（Ｃ−Ｆ）．
（３）固相上でのグリコシルフルオリドの活性化によるグリコシル化反応
樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→６）−フェニル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド
フェニル ２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２４．０ｍｇ，４４μｍｏｌ）をＥｔＣＮ（０．２５ｍＬ）に溶解し、ＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）を加え窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した。別にＡｇＯＴｆ（３３．８ｍｇ，０．１３２ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（０．２５ｍＬ）に溶解し、ＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）を加え窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した後、これにＣｐ２ＨｆＣｌ２（２５ｍｇ，０．０６６ｍｍｏｌ）を加え５分間攪拌した。これらを−１５℃で樹脂に結合したＬ−フコピラノシルフルオライド（１００ｍｇ，９．８ｍｇ：Ｆｕｃ）に加え、反応温度を１０℃まで徐々に上げた。反応の進行は樹脂を一部取りだし、ＩＲで測定後、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）に加え、０．５Ｍ ＮａＯＭｅ（１０μＬ）を滴下して室温で１時間放置することで固相から切り出し、これをＴＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで観測した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。
ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ｃｍ−１ １７３７．５（ＯＣ＝Ｏ），１６７３．９（ＮＨＣ＝Ｏ）．
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３３Ｈ３６Ｏ９：ｍ／ｚ ８６８．３ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ８９１［Ｍ＋Ｎａ］＋．
反応温度を−１５℃から１０℃へと徐々に変化させた場合の反応を行い、昇温率について検討した。結果を表２と図６〜図８に示す。
その結果、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの解析結果（図６〜図８）から、８．３℃／ｈでは脱離物（Ｆｗ：３１６）が僅かに存在していたのに対し、昇温率を下げるとグリコシル化反応が優先的に進行することが判明した。グリコシルフルオリドの活性化によるグリコシル化反応においては、このような昇温率を用いることができる。
（４）固相上でのチオグリコシドの活性化によるグリコシル化反応
樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→６）−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド
２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（２３．０ｍｇ，５１．６μｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（０．２５ｍＬ）、ＥｔＣＮ（０．２５ｍＬ）に溶解し、ＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）を加え窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した後、０℃でＭｅＳＳＭｅ（６．９μＬ，７７．２μｍｏｌ）、ＭｅＯＴｆ（８．７μＬ，７７．２μｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌した。この溶液を−１５℃で樹脂に結合したＬ−フコピラノシド（８８ｍｇ，１４ｍｇ：Ｆｕｃ）に加え、１０℃まで徐々に加温した。反応の進行は樹脂を一部取りだし、ＩＲで測定後、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）に加え、０．５Ｍ ＮａＯＭｅ（１０μＬ）を滴下して室温で１時間放置することで固相から切り出し、これをＴＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで観測した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。
ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ｃｍ−１ １７３５．６（ＯＣ＝Ｏ），１６７１．９（ＮＨＣ＝Ｏ），１０２９．８（Ｃ−Ｆ），６３６．９．
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４７Ｈ５１ＦＯ９：ｍ／ｚ ７７８．９ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ８０２．５［Ｍ＋Ｎａ］＋．
これまでチオグリコシドの活性化によるグリコシル化反応を固相上で行う際、供与体１．０に対してＤＭＴＳＴを８．０当量加えていた。しかし同様の反応を液相で行った場合ではＤＭＴＳＴは２．０当量で充分であることから、８．０当量以下でも反応が進行するのではないかと考えた。そこで今回、樹脂による立体的な影響を考慮して供与体に対しＤＭＴＳＴの当量を３．０に固定し、グリコシル化反応の検討を行った。反応温度を−１５℃から１０℃へと徐々にした場合の反応について、昇温率について検討した（表３及び図９〜図１１）。質量分析データの解析結果（図９〜図１１）から、チオグリコシドのＤＭＴＳＴによる活性化においては、昇温率が大きい場合においても副反応は進行せず、生成物量は時間に依存することが判明した。３．０当量のＤＭＴＳＴを用いた場合、反応時間が本実験では不十分であったが、少なくとも糖供与体であるチオグリコシドが糖受容体であるフッ化グリコシルの存在下選択的に活性化されることが示された。また、オルトゴナルグリコシル化反応に用いることができることが明確に示された。また、反応時間に関しては、より過剰のＤＭＴＳＴの添加により達成する、あるいは、さらに強力なプロモーター（例えばＮＩＳ−ＴｆＯＨ）の使用により克服できる。
（５）拡散混合固相反応法を基礎とするグリコシル化反応における反応剤の導入順序
（方法１）供与体が結合した樹脂を受容体とプロモーターの混液により膨潤する方法
樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→６）−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド
２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（１６．８ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）をＣ２Ｈ４Ｃｌ２（０．２ｍＬ）、ＥｔＣＮ（０．２ｍＬ）に溶解し、ＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）を加え窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した後、０℃でＭｅＳＳＭｅ（１３．４μＬ，０．１５ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＴｆ（１６．９μＬ，０．１５ｍｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌した。この溶液部を０℃で樹脂に結合したフェニルチオ−Ｌ−フコピラノシド（７９ｍｇ，１０ｍｇ：Ｆｕｃ）に加え、１２時間放置した。反応の進行は樹脂を一部取りだし、ＩＲで測定後、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）に加え、０．５Ｍナトリウムメトキシド（１０μＬ）を滴下して室温で１時間放置することで固相から切り出し、これをＴＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで観測した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。
ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ｃｍ−１ １７３５．６（ＯＣ＝Ｏ），１６７１．９（ＮＨＣ＝Ｏ），１０２９．８（Ｃ−Ｆ），６３６．９．
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４７Ｈ５１ＦＯ９：ｍ／ｚ ７７８．９ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ８０２．５［Ｍ＋Ｎａ］＋．
このグリコシル化反応の追跡結果は図１２の通りであり、８当量のＤＭＴＳＴを用いた場合６時間で反応が完結し、収率も満足のいくものであった。
（方法２）供与体が結合した樹脂を受容体溶液で膨潤しプロモーターを加える方法
樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→６）−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド
２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（７７．０ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）をＣ２Ｈ４Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、ＥｔＣＮ（０．５ｍＬ）に溶解し、ＭＳ４Ａ（２００ｍｇ）を加え窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した後、溶液部（上清）を樹脂に結合したフェニルチオ−Ｌ−フコピラノシド（３４０ｍｇ，４６ｍｇ：Ｆｕｃ）をＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、ＥｔＣＮ（０．５ｍＬ）で膨潤させた懸濁液に加えた。ここに０℃でＭｅＳＳＭｅ（６１．７μＬ，０．５６ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＴｆ（７７．７μＬ，０．５６ｍｍｏｌ）を加え、１２時間放置した。反応の進行は樹脂を一部取りだし、ＩＲで測定後、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）に加え、０．５Ｍ ＮａＯＭｅ（１０μＬ）を滴下して室温で１時間放置することで固相から切り出し、これをＴＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで観測した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。
このグリコシル化反応の追跡結果は図１３の通りであり、方法１の場合との相違点はプロモーターを同時に加えるか別途加えるかのみであるが、反応には１２時間を要した。
方法１および方法２の反応時間の差は、反応剤を順序立てて加えることによる２番目以降の反応剤が添加点から全体に拡散するのに要した時間と解釈できる。
これらの実験結果より、マイクロチャンネル（樹脂内部の細孔）内で進行する固相反応の性質上、可能な限り全ての反応剤は１つの溶液として樹脂に加え膨潤するのが良い。また、反応剤のみの混合を避ける必要がある場合には、別々に加えることもできる。
この２つの方法の検討結果、方法１、２共に同様に有効であることが判明した。従って、反応剤を予め混合すると反応する場合には、順次反応剤を加える方法１を、反応剤の混合が可能な場合には方法２を用いることができる。
（６）本発明の拡散による固相反応方法と従来の固相反応方法の比較
本発明の拡散固相反応方法の有用性を確認するため、拡散によらない攪拌等の外的な力を利用した従来法との比較を行った。
それぞれの反応方法においては、比較のために濃度条件と撹拌の有無意外の条件を同一にした。また、あえて反応が完結する前に反応を止めて収率を比較した。本発明の方法（拡散固相反応方法）においては、樹脂の膨潤に必要最低限の量の溶媒を用いて撹拌などを一切行わず静置した。一方、従来法（撹拌を行う固相反応方法）では同量の溶媒では撹拌することができないので、使用した試薬量を同一とし、溶液量は倍とした。
Ｏｃｔｙｌ ２，３−Ｄｉ−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ−α，β−Ｌ−ｆｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ
ＭｅＳＳＭｅ（９．２μＬ，１０１μｍｏｌ）に窒素雰囲気下、ＭｅＯＴｆ（１１．６μＬ，１０１μｍｏｌ）を加え室温で５分間攪拌した。これにＤＣＥ（３００μＬ）、ＭｅＣＮ（３００μＬ）を加え、０．１６９Ｍ−ＤＭＴＳＴストック溶液を調製した。次にこの溶液にＡｃｃｅｐｔｏｒ：１−Ｏｃｔａｎｏｌ（１０．４μＬ，６５．４μｍｏｌ）を加え、０．１０９Ｍ−Ａｃｃｅｐｔｏｒ／０．１６９Ｍ−ＤＭＴＳＴストック溶液を調製した。
［拡散固相反応方法］
０．１０９Ｍ−Ａｃｃｅｐｔｏｒ／０．１６９Ｍ−ＤＭＴＳＴストック溶液（２００μＬ，Ａｃｃｅｐｔｏｒ：２１．８μｍｏｌ，ＤＭＴＳＴ：３３．８μｍｏｌ）をＲｅｓｉｎ−ｂｏｕｎｄ−Ｐｈｅｎｙｌ−１−ｔｈｉｏ−Ｌ−ｆｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（４０．５ｍｇ，１１．２μｍｏｌ）に窒素雰囲気下、−３０℃で加え、１５分間膨潤反応させた。反応終了後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した。次に樹脂にｓａｔ．ＮａＯＭｅ−ＭｅＯＨ／ＴＨＦ＝１／４（２００μＬ）で室温、１時間放置することで固相から切り出し、ＤＣＭで洗浄後、減圧乾燥し、得られた残渣を１Ｈ ＮＭＲで観測した。
［撹拌を行う固相反応方法（従来法）］
０．１０９Ｍ−Ａｃｃｅｐｔｏｒ／０．１６９Ｍ−ＤＭＴＳＴストック溶液をＤＣＥ／ＭｅＣＮ＝１／１溶液で倍希釈し、０．０５５Ｍ−Ａｃｃｅｐｔｏｒ／０．０８５Ｍ−ＤＭＴＳＴストック溶液とし、この溶液（４００μＬ，Ａｃｃｅｐｔｏｒ：２２μｍｏｌ，ＤＭＴＳＴ：３４μｍｏｌ）をＲｅｓｉｎ−ｂｏｕｎｄ−Ｐｈｅｎｙｌ−１−ｔｈｉｏ−Ｌ−ｆｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（４０．４ｍｇ，１１．２μｍｏｌ）に窒素雰囲気下、−３０℃で加え、１５分間攪拌反応させた。以下、上記拡散固相反応方法と同様に行った。
１Ｈ ＮＭＲより、４．３２ｐｍ，１．３５ｐｐｍ付近のダブレットは主生成物のＯｃｔｙｌ β−ｆｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、４．２８ｐｐｍ，１．１８ｐｐｍ付近のダブレットは副生成物のＦｕｃｏｓｅ−ｄｉｍｅｒである。Ｆｕｃｏｓｅ−ｄｉｍｅｒは反応後処理の際に混入した水による加水分解物であり、また原料であるＰｈｅｎｙｌ β−ｆｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅは完全に消失している。これより原料由来である生成物はＯｃｔｙｌ β−ｆｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅとＦｕｃｏｓｅ−ｄｉｍｅｒであるので、反応の進行度は、主生成物のＯｃｔｙｌ β−ｆｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅと原料由来物との比により計算できる。
本発明の拡散固相反応方法： １．００／（１．００＋０．６１）＝６２．１％
撹拌を行う固相反応方法（従来法）： １．００／（１．００＋１．３０）＝４３．５％
この結果より、本発明の拡散固相反応方法の方が従来法よりも明らかに有利であることがわかった。すなわち、結果より、本発明の方法の方が反応が１４３％早いことが示された。これは、同じ試薬量で反応を行おうとする場合、必要最低限の量で攪拌等を行わずに静置して反応を行えば、非常に効率的に反応が行えることを意味している。また、もし濃度を同一とする場合には、従来法では本発明の方法の２倍の試薬が必要になり、非効率である。さらに、本発明の方法では撹拌が不要であることから、固相である樹脂を静置しておく反応容器の他は特別な装置等も不要である。
これらのことから、本発明の拡散固相反応法が非常に効率的な方法であることが示された。
実施例３：オルトゴナルグリコシル化法に基づく拡散混合固相反応法による糖鎖の合成
（１）チオグリコシドの活性化による二糖の合成
樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→２）−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド
３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（３５．３ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）をＣ２Ｈ４Ｃｌ２（０．４５ｍＬ）、ＥｔＣＮ（０．４５ｍＬ）に溶解し、ＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）を加え窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した後、０℃でＭｅＳＳＭｅ（２７．０μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＴｆ（３４．０μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌した。この溶液部を０℃で樹脂に結合したフェニルチオ−Ｌ−フコピラノシド（１６９ｍｇ，２０ｍｇ：Ｆｕｃ）に加え、１２時間放置した。反応の進行は樹脂を一部取りだし、ＩＲで測定後、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）に加え、０．５Ｍナトリウムメトキシド（１０μＬ）を滴下して室温で１時間放置することで固相から切り出し、これをＴＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで観測した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。
ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ｃｍ−１ １７３５．６（ＯＣ＝Ｏ），１６７１．９（ＮＨＣ＝Ｏ），１０２９．８（Ｃ−Ｆ），６３６．４．
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４７Ｈ５１ＦＯ９：ｍ／ｚ ７７８．９ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ８０２．５［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図１４）
（２）チオグリコシドの活性化による二糖の合成
樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド
２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（３５．０ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（０．４５ｍＬ）、ＥｔＣＮ（０．４５ｍＬ）に溶解し、ＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）を加え窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した後、０℃でＭｅＳＳＭｅ（２７．０μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＴｆ（３４．０μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌した。この溶液部を０℃で樹脂に結合したフェニルチオ−Ｌ−フコピラノシド（１６９ｍｇ，２０ｍｇ：Ｆｕｃ）に加え、１２時間放置した。反応の進行は樹脂を一部取りだし、ＩＲで測定後、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）に加え、０．５Ｍ ＮａＯＭｅ（１０μＬ）を滴下して室温で１時間放置することで固相から切り出し、これをＴＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで観測した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。
ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ｃｍ−１ １７３５．６（ＯＣ＝Ｏ），１６７１．９（ＮＨＣ＝Ｏ），１０２９．８（Ｃ−Ｆ），６３６．４．
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４７Ｈ５１ＦＯ９：ｍ／ｚ ７７８．９ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ８０２．５［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図１５）
（３）チオグリコシドの活性化による二糖の合成
樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド
２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（３４．８ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（０．４５ｍＬ）、ＥｔＣＮ（０．４５ｍＬ）に溶解し、ＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）を加え窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した後、０℃でＭｅＳＳＭｅ（２７．０μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＴｆ（３４．０μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌した。この溶液部を０℃で樹脂に結合したフェニルチオ−Ｌ−フコピラノシド（１６９ｍｇ，２０ｍｇ：Ｆｕｃ）に加え、１２時間放置した。反応の進行は樹脂を一部取りだし、ＩＲで測定後、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）に加え、０．５Ｍナトリウムメトキシド（１０μＬ）を滴下して室温で１時間放置することで固相から切り出し、これをＴＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで観測した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。
ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ｃｍ−１ １７３５．６（ＯＣ＝Ｏ），１６７１．９（ＮＨＣ＝Ｏ），１０２９．８（Ｃ−Ｆ），６３６．３．
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４７Ｈ５１ＦＯ９：ｍ／ｚ ７７８．９ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ８０２．５［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図１６）
（４）チオグリコシドの活性化による二糖の合成
樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→６）−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド
２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（３４．６ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（０．４５ｍＬ）、ＥｔＣＮ（０．４５ｍＬ）に溶解し、ＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）を加え窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した後、０℃でＭｅＳＳＭｅ（２７．０μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＴｆ（３４．０μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌した。この溶液部を０℃で樹脂に結合したフェニルチオ−Ｌ−フコピラノシド（１６９ｍｇ，２０ｍｇ：Ｆｕｃ）に加え、１２時間放置した。反応の進行は樹脂を一部取りだし、ＩＲで測定後、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）に加え、０．５Ｍナトリウムメトキシド（１０μＬ）を滴下して室温で１時間放置することで固相から切り出し、これをＴＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで観測した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。
ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ｃｍ−１ １７３５．６（ＯＣ＝Ｏ），１６７１．９（ＮＨＣ＝Ｏ），１０２９．８（Ｃ−Ｆ），６３６．９．
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４７Ｈ５１ＦＯ９：ｍ／ｚ ７７８．９ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ８０２．５［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図１７）
（５）固相上での三糖誘導体の合成
フェニル ２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（４１．０ｍｇ，０．０７４ｍｍｏｌ）をＥｔＣＮ（０．４５ｍＬ）に溶解し、ＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）を加え窒素気流下、室温で３時間撹拌した（Ａ液）。別にＡｇＯＴｆ（５７．０ｍｇ，０．２２２ｍｍｏｌ）、ＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）をＣＨ２Ｃｌ２（０．４５ｍＬ）に加え窒素気流下、室温で３時間撹拌した後、０℃でＣｐ２ＨｆＣｌ２（４２．０ｍｇ，０．１１１ｍｍｏｌ）を加え、５分間撹拌した（Ｂ液）。調製したＡ、Ｂ液を合し窒素気流下、−１５℃で樹脂に結合したジサッカライド（１６９ｍｇ，０．０３７ｍｍｏｌ）に加え、６時間かけて１０℃まで上昇させた後、３時間放置した。反応の進行は樹脂を一部取りだし、ＩＲで測定後、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）に加え、０．５Ｍナトリウムメトキシド（１０μＬ）を滴下して室温で１時間放置することで固相から切り出し、これをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで観測した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、ＥｔＣＮ、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。
今回、先に合成した４種類の化合物について同様の操作を行った。それぞれのスキームとＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳのチャートを以下及び図１８から２１に示す。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８０Ｈ８４Ｏ１４Ｓ：ｍ／ｚ １３０１．６ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ １３２５．６［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図１８）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８０Ｈ８４Ｏ１４Ｓ：ｍ／ｚ １３０１．６ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ １３２５．６［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図１９）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８０Ｈ８４Ｏ１４Ｓ：ｍ／ｚ １３０１．６ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ １３２６．３［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図２０）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８０Ｈ８４Ｏ１４Ｓ：ｍ／ｚ １３０１．６ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ １３２５．６［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図２１）
図１８から図２１のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳのチャートより、４種類の反応全てにおいて目的化合物由来の擬親ピークが確認されたことでグリコシル化反応が進行したことが明らかである。反応温度勾配を一定とし、最終到達温度を１０℃高く設定することで反応を完結することができる。
１−オクタノール（９２．８μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（０．４５ｍＬ）、ＥｔＣＮ（０．４５ｍＬ）に溶解させ、ＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）を加え窒素気流下、室温で３時間撹拌した後、０℃でＭｅＳＳＭｅ（２６．６μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＴｆ（３３．５μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌した。この溶液を−１５℃で樹脂に結合したトリサッカライド（１６９ｍｇ，２０ｍｇ：Ｆｕｃ）に加え、６．５時間かけて２０℃まで上昇させた後、８時間放置した。反応の進行は樹脂を一部取りだし、ＩＲで測定後、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）に加え、０．５Ｍ ＮａＯＭｅ（１０μＬ）を滴下して室温で１時間放置することで固相から切り出し、これをＴＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで観測した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。
今回、既に合成した４種類の三糖誘導体について同様の操作を行った。それぞれのスキームとＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳのチャートを以下に示す。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８２Ｈ９５Ｏ１５：ｍ／ｚ １３２０．７ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ １３４３．８［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図２２）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８２Ｈ９５Ｏ１５：ｍ／ｚ １３２０．７ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ １３４３．８［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図２３）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８２Ｈ９５Ｏ１５：ｍ／ｚ １３２０．７ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ １３４３．８［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図２４）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８２Ｈ９５Ｏ１５：ｍ／ｚ １３２０．７ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ １３４３．８［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図２５）
図２２から図２５のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳのチャートより、４種類とも目的化合物由来のピーク（ＦＷ：１３０１）が確認されたことでグリコシル化反応が進行したことが明らかとなった。しかし、１３６７、９１２、６９４、４８０付近に副生成物と考えられるピークが多く見られることから更なる条件の最適化が必要とされる。
実施例４：オルトゴナルグリコシル化法に基づく拡散混合固相反応法による糖鎖ライブラリーの合成
実施例１から３の結果を用いれば、糖鎖ライブラリーの合成が可能である。
すなわち、適当に保護された生体を構成する９種の主立った単糖（実施例１）は、糖鎖ライブラリーの化学合成を達成するために必須である。さらに、糖鎖合成においてグリコシル化反応における立体制御は極めて困難な問題であり、ライブラリー合成において全てのグリコシル化反応を制御することは不可能である。従って、糖鎖ライブラリーの構築にあっては立体非選択の方法論が適している。このために、保護単糖の２位は隣接気関与の無い置換基とすることが望ましい。本実施例では、このように設計された保護単糖を安定なチオグリコシドとして合成し、必要に応じてグリコシルフルオリドへと変換可能とした。
このような単糖誘導体を用い、任意の組み合わせで反応することにより糖鎖ライブラリーが合成可能である。ライブラリー合成を行うためには適当な固相合成法が必要であるが、その１つが本発明の拡散混合による固相反応方法を利用した固相合成法である（実施例２）。本法によれば、固相反応の場である樹脂の膨潤に必要最低限の量の溶媒に反応剤を溶解し、この溶液で樹脂を膨潤することにより、反応の場である細孔内部へのすみやかな反応剤の導入を達成し、また、拡散に基づいて反応が進行するため撹拌等の物理的手段による装置からも解放されることを示した。
固相におけるオルトゴナルグリコシル化法は、糖鎖の固相合成を最短行程で達成する方法である。実施例３においては、上記実施例２でその有用性が示された拡散による固相反応方法を用いて、このオルトゴナルグリコシル化反応を行い、良好な結果を得た。
特に、実施例２および３においては、拡散混合固相反応法および固相オルトゴナルグリコシル化法を実証するのみならず、（α／β）Ｆｕｃ（１−２／３／４／６）（α／β）Ｇａｌ（１−４）（α／β）Ｇｌｃ−Ｏｃｔｙｌのライブラリー合成（２ｘ４ｘ２ｘ２＝３２）をも同時に達成した。これらの結果より、本発明の方法によれば、さらに大きなライブラリーの合成が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
本発明によりヌクレオチド、ペプチド、糖鎖に代表される生体分子を効率良く化学合成する方法が提供される。昇温率を制御して反応系の温度を変化させることにより高効率で糖鎖の固相合成を行うことのできる本発明の糖鎖固相合成方法と、固相反応を少量の溶媒で効率良く行うことができる拡散による固相反応方法は、いずれも前記生体分子の化学合成に有用であり、コンビナトリアルケミストリー等においては特に有用である。また、従来合成を制御することが難しく市販の合成装置の無い糖鎖の合成には特に有用である。
本出願は、２００３年６月３０日付の日本特許出願（特願２００３−１８７８７８）に基づく優先権を主張する出願であり、その内容は本明細書中に参照として取り込まれる。また、本明細書にて引用した文献の内容も本明細書中に参照として取り込まれる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【技術分野】
本発明は、重要な機能を有する生体成分の一群をなす糖鎖の化学合成、特に糖鎖の固相合成に関する。
【背景技術】
化学合成によるオリゴ糖鎖及びその複合体の合成が報告されている（Ｐａｕｌｓｅｎ，Ｈ．（１９８２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２１，１５５−１７３；Ｔｏｓｈｉｍａ，Ｋ．，Ｔａｔｓｕｔａ，Ｋ．（１９９３）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９３，１５０３−１５３１；及びＢｏｏｎｓ，Ｇ．−Ｊ．（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５２，１０９５−１１２１）。しかしながら、現存の化学合成では、操作が煩雑で時間を要する反応後のクロマトグラフィーによる単離精製操作が必要不可欠であり、操作に習熟を要する（Ｋａｎｉｅ，Ｏ．，Ｈｉｎｄｓｇａｕｌ，Ｏ．（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．２，６７４−６８１）。その解決法の一つとして固相合成がある。固相合成法はペプチドやヌクレオチド合成でも使用され、その有用性は高い。オリゴ糖鎖の合成には、カップリング反応に伴う立体選択的なグリコシド結合形成と位置選択的なグリコシル化を行うための保護基の巧みな使い分けが必要不可欠であり、近年まで困難な課題と考えられてきたが、これまでの研究の結果、幾つかの成功例が報告されている（Ｆｒ▲ｅ▼ｃｈｅｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｃｈｕｅｒｃｈ，Ｃ．（１９７２）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２２，３９９−４１２；Ｃｈｉｕ，Ｓ．−Ｈ．Ｌ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．（１９７６）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．５０，２２７−２３８；Ｙａｎ，Ｌ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｇｏｏｄｎｏｗ，Ｒ．Ｊｒ．，Ｋａｈｎｅ，Ｄ．（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６，６９５３−６９５４；Ｒｅｄｅｍａｎｎ，Ｊ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．Ｒ．（１９９７）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２，３６５０−３６５３；Ｈｅｃｋｅｌ，Ａ．，Ｍｒｏｓｓ，Ｅ．，Ｊｕｎｇ，Ｋ．−Ｈ．，Ｒａｄｅｍａｎｎ，Ｊ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．Ｒ．（１９９８）Ｓｙｎｌｅｔｔ，１７１−１７３；Ｎｉｃｏｌａｏｕ，Ｋ．Ｃ．，Ｗｉｎｓｓｉｎｇｅｒ，Ｎ．，Ｐａｓｔｏｒ，Ｊ．，ＤｅＲｏｏｓｅ，Ｆ．（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９，４４９−４５０；Ｎｉｃｏｌａｏｕ，Ｋ．Ｃ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎ．，Ｌｉ，Ｊ．，Ｐａｓｔｏｒ，Ｊ．，Ｗｉｓｓｉｎｇｅｒ，Ｎ．（１９９８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３７，１５５９−１５６１；Ｒｏｄｅｂａｕｇｈ，Ｒ．，Ｊｏｓｈｉ，Ｓ．，Ｆｒａｓｅｒ−Ｒｅｉｄ，Ｂ．，Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．（１９９７）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２，５６６０−５６６１；Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ，Ｓ．Ｊ．，ＭｃＣｌｕｒｅ，Ｋ．Ｆ．，Ｒａｎｄｏｌｐｈ，Ｊ．Ｔ．，Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｒ．Ｂ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０，１３０７−１３０９；Ｚｈｅｎｇ，Ｃ．，Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ，Ｐ Ｈ．，Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ，Ｓ．Ｊ．（１９９８）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３，１１２６−１１３０；Ｉｔｏ，Ｙ．，Ｋａｎｉｅ，Ｏ．，Ｏｇａｗａ，Ｔ．（１９９６）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３５，２５１０−２５１２；Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｓ．Ｐ．，Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，Ｄ．Ｍ．，Ｋｒｅｐｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７，２１１６−２１１７；Ｖｅｒｄｕｙｎ，Ｒ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｌｅｉｎ，Ｐ．Ａ．Ｍ．，Ｄｏｕｗｅｓ，Ｍ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａｒｅｌ，Ｇ．Ａ．，ｖａｎ Ｂｏｏｍ，Ｊ．Ｈ．（１９９３）Ｊ．Ｒ．Ｎｅｔｈ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２，４６４−４６６；Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｈ．，Ｉｔｏ，Ｙ．，Ｋａｎｉｅ，Ｏ．，Ｏｇａｗａ，Ｔ．（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．６，２８４１−２８４６；Ａｄｏｉｎｏｌｆｉ，Ｍ．，Ｂａｒｏｎｅ，Ｇ．，ＤｅＮａｐｏｌｉ，Ｌ．，Ｌａｄｏｎｉｓｉ，Ａ．，Ｐｉｃｃｉａｌｌｉ，Ｇ．（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７，５００７−５０１０；Ｓｅｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．Ｈ．，Ｂｅｅｂｅ，Ｘ．，Ｓｕｋｅｎｉｃｋ，Ｇ．Ｄ．，Ｐｏｃｈａｐｓｋｙ，Ｓ．，Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ，Ｓ．Ｊ．（１９９７）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３６，４９１−４９３；Ｋａｎｅｍｉｔｓｕ，Ｔ．，Ｋａｎｉｅ，Ｏ．，Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．（１９９８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３７，３４１５−３４１８；及び、ＷＯ０２／１６３８４号公報）。
そのような多数の知見に基づいて、糖鎖の合成を効率的に行うために有用と考えられている糖鎖ライブラリーの合成も数多く行われてきている。例えば、Ｈｉｎｄｓｇａｕｌらは、糖鎖化学の基礎を根底から見直し無保護の糖受容体に対するＢｎ保護された糖供与体（イミデート）によるグリコシル化反応（ランダムグリコシル化）を試し、その結果位置選択性の無いランダムな縮合物混合物が容易に得られることを見出した。この方法は単一化合物の合成を目的としていないが、シークエンスは反応の順に従っている。さらに、与えられた混合物が糖転移酵素によりスクリーニングされ、特異的に既知反応をピックアップすることが示された（Ｋａｎｉｅ，Ｏ．，Ｂａｒｒｅｓｉ，Ｆ．，Ｄｉｎｇ，Ｙ．，Ｌａｂｂｅ，Ｊ．，Ｏｔｔｅｒ，Ａ．，Ｆｏｒｓｂｅｒｇ，Ｌ．Ｓ．，Ｅｒｎｓｔ，Ｂ．，Ｈｉｎｄｓｇａｕｌ，Ｏ．（１９９５）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３４，２７２０−２７２２；及びＤｉｎｇ，Ｙ．，Ｋａｎｉｅ，Ｏ．，Ｌａｂｂｅ，Ｊ．，Ｐａｌｃｉｃ，Ｍ．Ｍ．，Ｅｒｎｓｔ，Ｂ．，Ｈｉｎｄｓｇａｕｌ，Ｏ．“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ”ｉｎ Ｇｌｙｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．ｂｙ Ａｌａｖｉ，Ａ．，Ａｘｆｏｒｄ，Ｊ．Ｓ．，（１９９５）Ａｖｄ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３７６，Ｐｌｅｎｕｍ ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２５９−２６９）。
固相上でグリコシル化とアミノ基の誘導化を行いｓｐｌｉｔ ａｎｄ ｍｉｘ法によるライブラリー合成もＫａｈｎｅ，Ｓｔｉｌｌらにより報告された。おのおののステップ毎にタッギングがなされ、固相上での脱保護の後、アッセイとデコーディングによりレクチンに対する既知リガンドよりも強力なリガンド構造が見い出された（Ｌｉａｎｇ，Ｒ．，Ｙａｎ，Ｌ．，Ｌｏｅｂａｃｈ，Ｊ．，Ｇｅ，Ｍ．，Ｕｏｚｕｍｉ，Ｙ．，Ｓｅｋａｎｉｎａ，Ｋ．，Ｈｏｒａｎ，Ｎ．，Ｇｉｌｄｅｒｓｌｅｅｖｅ，Ｊ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．，Ｓｍｉｔｈ，Ａ．，Ｂｉｓｗａｓ，Ｋ．，Ｓｔｉｌｌ，Ｗ．Ｃ．，Ｋａｈｎｅ，Ｄ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４，１５２０−１５２２）。アリル−ビニルの二重結合異性化を巧みに糖鎖合成に用いる合成法により、三糖ライブラリーがＢｏｏｎｓらにより合成され、今後への可能性が示された。ここでは溶液反応が用いられ、ｓｐｒｉｔ ａｎｄ ｍｉｘ法により糖結合位置の決定したライブラリーを得ることに成功している（Ｂｏｏｎｓ，Ｇ．−Ｊ．，Ｈｅｓｋａｍｐ，Ｂ．，Ｈｏｕｔ，Ｆ．（１９９６）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３５，２８４５−２８４７）。Ｂｏｏｎｓらはまた、固相上での化学種選択的なグリコシル化反応を試みるとともに、ライブラリー合成も行い１２の三糖のライブラリーを報告した（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．，Ａｒｌｅｓ，Ｃ．，Ｂｏｏｎｓ，Ｇ．−Ｊ．（１９９８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３９，９８０１−９８０４；及びＺｈｕ，Ｔ．，Ｂｏｏｎｓ，Ｇ．−Ｊ．（１９９８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３７，１８９８−１９００）。ＩｃｈｉｋａｗａらはグリカールをＩＤＣＰによって活性化し、無保護のジオール単糖受容体とカップリング、立体選択的であるが、位置選択性の無い２−ｄｅｏｘｙ糖三糖ライブラリーを合成した（Ｉｚｕｍｉ，Ｍ．，Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｙ．（１９９８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３９，２０７９−２０８２）。Ｗｏｎｇらは、オルトゴナル保護（Ｂａｒａｎａｙ，Ｇ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．，（１９７７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６，７３６３−７３６５）した単糖を母核とし保護基を欲しい順に脱保護することで直鎖三糖から高度に分岐した五糖保護糖のライブラリーを合成した（Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．，Ｙｅ，Ｘ．−Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｚ．（１９９８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０，７１３７−７１３８）。また、化学種選択的なグリコシル化反応におけるアノメリック位保護基（チオグリコシド）の反応性を精査し、Ａｒｍｅｄ−ｄｉｓａｒｍｅｄグリコシル化による。ｏｎｅ−ｐｏｔグリコシル化を完成、これに基づくコンピューターによる反応の選択、オルトゴナルな保護基の除去を通じ、糖鎖ライブラリーの自動化への道を開いた（Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｏｌｌｍａｎｎ，Ｉ．Ｒ．，Ｙｅ，Ｘ．−Ｓ．，Ｗｉｓｃｈｎａｔ，Ｒ．，Ｂａａｓｏｖ，Ｔ．，Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１，７３４−７５３）。Ａｒｍｓｔｒｏｎｇらは１９９４年いち早く糖鎖ライブラリーに着目し、末端にカルボン酸をもつジエン系のオスミウム酸化と還元的環化によりＣ−グリコシル二糖の還元末端相当糖の水酸基の立体異性体ライブラリーを発表した（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｒ．Ｗ．，Ｓｕｔｈｅｒｌｉｎ，Ｄ．Ｐ．（１９９４）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３５，７７４３−７７４５）。
また、ＷＯ９６／０６１０２号公報及びオーストラリア特許公報ＡＵ３３４６４９５号公報（発行日：１９９６年３月１６日）には糖鎖ライブラリーの構築法が記載されている。ＷＯ９６／０６１０２号公報及びオーストラリア特許公報ＡＵ３３４６４９５号公報（発行日：１９９６年３月１６日）においては、保護基を持たない糖受容体を用い、これに対して保護糖供与体を化学的に反応させることにより、位置ランダムの糖鎖ライブラリー合成を迅速に行っている。
また米国特許第５，７２１，０９９号公報には、レジン上に核酸、ペプチド、糖鎖等を有機合成化学的手法によって構築する方法が記載されている。米国特許第５，７２１，０９９号公報では、同一レジン上にモレキュラーコーディングを行う。ライブラリー合成はスプリット＆ミックス法で行われ、したがって、１レジン−１化合物のレジン混合物を与える。合成の最後に全ての脱保護を行い、タンパク質等のバイオ分子のスクリーニングに直接用いる。合成物質が極微量であるので、ヒットしたビーズのみのデコードを行って、ビーズ上の化合物の構造を特定する。
しかし、上記したような多数の糖鎖ライブラリーの合成例、構築例は、いずれも成功例とは言いがたい。その理由としては、例えば、立体選択的、位置選択的なグリコシル化反応を行うためには数多くの単糖ユニットを必要とするが、労力もコストも膨大に必要となることからそれらを網羅的に合成することは困難だったことが挙げられる。
このような理由から、十分な数の糖鎖を含む糖鎖ライブラリーの合成を簡便に行えるような、効率の良い糖鎖固相合成方法の確立が強く望まれている。
一方、糖鎖等の合成において繁用されている固相反応方法は、前記のとおり、ペプチドやヌクレオチド合成でも広く用いられ、その有用性は高く評価されている。すなわち、反応に固相を利用することによって、単離精製操作等が簡略化され、効率も良く、熟練者でなくても操作が可能であるほか、装置の開発等への貢献も大きい。
例えば、ペプチド合成及びヌクレオチド（核酸）合成においては、基本的な合成方法はほぼ確立しており、多数の合成装置が市販されている（例えば、米国特許第５４６２７４８号公報参照）。しかし、いずれの装置も大型で、溶液を多量に必要とすることから、装置の小型化、試薬の少量化やコストダウン等については未だ改良の余地がある。また、糖鎖については、未だに合成装置は市販されていない。いくつか試みられた例はある（例えば、ＷＯ０２／１６３８４号公報参照）が、いずれも何らかの問題点を有するものであり、実用化には至っていない。これらのことから、小型で必要とする液量が少なく、効率的に固相反応を行うことのできる方法及び装置の開発、特に糖鎖の合成装置の開発が強く望まれている。
【発明の開示】
本発明は、ヌクレオチド（核酸）、ペプチド（タンパク質）、糖鎖に代表される生体分子を効率良く化学合成する方法を提供することを解決すべき課題とした。特に、本発明は、市販の合成装置が無い糖鎖の合成装置の基礎となる方法を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、先ず、糖鎖の合成、さらには糖鎖のコンビナトリアルケミストリーの効率化を可能とする各種の単糖ユニットを合成した。次いで、合成した複数種の単糖ユニットを用いて複数種の糖鎖を合成する糖鎖固相合成を行う際に反応系の昇温率を制御することに着目し、糖鎖合成反応系の温度を、反応系中の副反応を低下させることを指標として決定した昇温率に従って変化させることにより、糖鎖を効率良く化学合成できることを見出した。さらに、本発明者らは、糖鎖等の生体分子の固相合成において撹拌等のプロセスを使用することなく、拡散支配による反応を行うことによって糖鎖の固相合成を効率良く行うことができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１） 複数種の単糖ユニットを含む少なくとも１以上の糖鎖合成反応系において複数種の糖鎖を合成する糖鎖固相合成方法において、該糖鎖合成反応系の温度を、反応系中の副反応を低下させることを指標として決定した昇温率に従って変化させることを特徴とする、糖鎖固相合成方法。
（２）糖鎖固相合成方法が以下の工程を含む、（１）に記載の糖鎖固相合成方法。
（ａ）下記式（１）：
Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ａ１−Ｘ （１）
（式中、Ｐは固相を示し、Ｌはリンカーを示し、Ｏは単糖の非還元末端の酸素原子を示し、Ａ１は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、Ｘは脱離基Ｙの活性化条件下で安定な脱離基を示す。）
の単糖ユニットに、下記式（２）：
ＨＯ−Ａ２−Ｙ （２）
（式中、Ａ２は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、Ｙは脱離基Ｘの活性化条件下で安定な脱離基を示す。）
の単糖ユニットを脱離基Ｘの活性化条件下で反応させて、下記式（３）：
Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ａ１−Ｏ−Ａ２−Ｙ （３）
の糖類を得る工程：及び
（ｂ）上記工程（ａ）で得た式（３）の糖類に、下記式（４）：
ＨＯ−Ａ３−Ｘ’ （４）
（式中、Ａ３は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、Ｘ’は脱離基Ｙの活性化条件下で安定な脱離基あるいは１位の水酸基または保護基を示す。）
の単糖ユニットを脱離基Ｙの活性化条件下で反応させて、式（５）：
Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ａ１−Ｏ−Ａ２−Ｏ−Ａ３−Ｘ’ （５）
の糖類を得る工程。
（３） 工程（ｂ）においてＸ’が１位の水酸基または保護基である式（４）の単糖ユニットを使用し、３つの糖が連結した糖鎖を合成する、（２）に記載の糖鎖固相合成方法。
（４） 工程（ｂ）で得た式（５）の糖類に対し、工程（ａ）と工程（ｂ）の反応を繰り返すことを含む、（２）に記載の糖鎖固相合成方法。
（５） 式（１）、（２）及び（４）の単糖ユニットを一反応系に同時に反応させて反応を行う、（２）から（４）の何れかに記載の糖鎖固相合成方法。
（６） 脱離基Ｘがフェニルチオ基又はフッ素基の片方であり、脱離基Ｙがフェニルチオ基又はフッ素基の他方である、（２）から（５）の何れかに記載の糖類固相合成方法。
（７） フェニルチオ基の活性化をＮ−ヨードサクシンイミド−トリフルオロメタンスルホン酸（ＮＩＳ−ＴｆＯＨ）またはジメチルメチルチオスルフォニウムトリフラート（ＤＭＴＳＴ）により行い、フッ素基の活性化をＳｎ（ＣｌＯ４）２、Ｓｎ（ＯＴｆ）２、Ｃｐ２Ｈｆ（ＣｌＯ４）２、またはＣｐ２Ｈｆ（ＯＴｆ）２により行う、（６）に記載の糖鎖固相合成方法。
（８） 保護基がベンジル基である、（２）から（７）の何れかに記載の糖鎖固相合成方法。
（９） Ａ１、Ａ２及びＡ３が示す単糖骨格が生体中に存在する単糖から選ばれる３種類の糖の単糖骨格である、（２）から（８）の何れかに記載の糖鎖固相合成方法。
（１０） Ａ１、Ａ２及びＡ３が示す単糖骨格が、マンノース、グルコース、ガラクトース、キシリトース、グルコサミン、ガラクトサミン、グルクロン酸、フルクトース又はシアル酸の単糖骨格である、（２）から（９）の何れかに記載の糖鎖固相合成方法。
（１１） フェニル１−チオ−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノピラノシド、フェニル１−チオ−２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノピラノシド、フェニル１−チオ−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノピラノシド、フェニル１−チオ−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノピラノシド、フェニル１−チオ−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル１−チオ−２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル１−チオ−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル１−チオ−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド、フェニル３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド、フェニル２，４−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド、フェニル１−チオ−２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−β−Ｌ−フコピラノシド、フェニル２−アジド−４，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル２−アジド−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル２−アジド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２−アジド−４，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２−アジド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２−アジド−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、
メチル（フェニル１−チオ−２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド）ウロネート、メチル（フェニル５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−２−チオ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシド）オネート、メチル（フェニル５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−２−チオ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシド）オネート、メチル（フェニル５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−２−チオ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシド）オネート、メチル（フェニル５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−２−チオ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシド）オネート、並びに上記化合物中のフェニルチオ基をフッ素基に置換した化合物から成る群から選択される少なくとも１以上の単糖誘導体を含む、（１）から（１０）の何れかに記載の糖鎖固相合成方法を行うための単糖ライブラリー。
（１２） 毛管現象を生じる大きさの固体細孔中で固相反応を行う方法において、固体の外表面に余剰の液相が存在しない状態で反応を行うことを特徴とする固相反応方法。
（１３） 反応が拡散混合により行われることを特徴とする（１２）に記載の固相反応方法。
（１４） 固体が、内部に細孔を有する樹脂粒子である、（１２）又は（１３）に記載の固相反応方法。
（１５） 固相反応が化学反応または生化学的反応である、（１２）から（１４）の何れかに記載の固相反応方法。
（１６） 固相反応が糖鎖合成反応である、（１２）から（１５）の何れかに記載の固相反応方法。
（１７） 固相反応が（１）から（１０）の何れかに記載の糖鎖固相合成反応である、（１２）から（１６）の何れかに記載の固相反応方法。
（１８） （１）から（１０）の何れかに記載の糖鎖固相合成方法または（１７）に記載の固相反応方法により合成された、生体中に存在する単糖から選ばれる３種類の糖の全ての組み合わせから成る糖鎖により構成されるライブラリー。
（１９） 生体中に存在する単糖が、マンノース、グルコース、ガラクトース、キシリトース、グルコサミン、ガラクトサミン、グルクロン酸、フルクトース又はシアル酸である、（１８）に記載のライブラリー。
（２０） 少なくとも以下の（１）と（２）とを含む、（１２）から（１７）の何れかに記載の固相反応方法を行うための反応装置。
（１）液相を注入又は吸引するための導入部を有し、かつ固体を収容する空間を有する、固相反応を行うための反応部、及び
（２）反応部の温度を調節するための温度調節部
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明で用いるオルトゴナル法の概要を示す。
図２は、本発明で用いる単糖誘導体ライブラリーを示す。
図３は、樹脂ビーズの細孔を示す。
図４は、従来法による固相反応法と本発明による拡散混合固相反応法の様子を示す。
図５は、２３通りのアノマー異性体を示す。
図６は、固相上でのグリコシルフルオリドの活性化によるグリコシル化反応において、３時間で−１５℃から１０℃への昇温（８．３℃／時間）を行った際のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの解析結果を示す。
図７は、固相上でのグリコシルフルオリドの活性化によるグリコシル化反応において、４．５時間で−１５℃から１０℃への昇温（５．６℃／時間）を行った際のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの解析結果を示す。
図８は、固相上でのグリコシルフルオリドの活性化によるグリコシル化反応において、６時間で−１５℃から１０℃への昇温（４．２℃／時間）を行った際のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの解析結果を示す。
図９は、固相上でのチオグリコシドの活性化によるグリコシル化反応において、４．５時間で−１５℃から１０℃への昇温（５．６℃／時間）を行った際のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの解析結果を示す。
図１０は、固相上でのチオグリコシドの活性化によるグリコシル化反応において、６時間で−１５℃から１０℃への昇温（４．２℃／時間）を行った際のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの解析結果を示す。
図１１は、固相上でのチオグリコシドの活性化によるグリコシル化反応において、１２時間で−１５℃から１０℃への昇温（２．１℃／時間）を行った際のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの解析結果を示す。
図１２は、供与体が結合した樹脂を受容体溶液で膨潤しプロモーターを加える方法でグリコシル化反応を行った場合の追跡結果を示す。
図１３は、供与体が結合した樹脂を受容体とプロモーターの混液により膨潤する方法でグリコシル化反応を行った場合の追跡結果を示す。
図１４は、樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→２）−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
図１５は、樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
図１６は、樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
図１７は、樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→６）−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
図１８は、固相上で合成した三糖誘導体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
図１９は、固相上で合成した三糖誘導体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
図２０は、固相上で合成した三糖誘導体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
図２１は、固相上で合成した三糖誘導体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
図２２は、固相上で合成した三糖誘導体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
図２３は、固相上で合成した三糖誘導体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
図２４は、固相上で合成した三糖誘導体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
図２５は、固相上で合成した三糖誘導体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明するが、以下の構成要件の説明は、本発明の実施態様の代表例であり、本発明はこれらの内容のみに特定されるものではない。なお、以下に記載する糖鎖固相合成反応、用いる固相、液相等は、特に例示した場合を除き、「固相合成ハンドブック（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社（Ｍｅｒｃｋ社）刊」等に記載の公知の方法から適宜選択して行うことができる。
（１）昇温率を制御した糖鎖固相合成方法
本発明の糖鎖固相合成方法は、複数種の単糖ユニットを含む少なくとも１以上の糖鎖合成反応系において複数種の糖鎖を合成する糖鎖固相合成方法において、該糖鎖合成反応系の温度を、反応系中の副反応を低下させることを指標として決定した昇温率に従って変化させることを特徴とする方法である。
従来糖鎖合成反応においては、反応させようとする糖によって至適な反応温度が異なるために、反応系の反応温度を細かく制御する必要があることは知られていた。反応温度の制御を十分に行わないと、未反応物、脱離物等が生じ、所望の反応生成物を十分量得ることができないためである。しかし、糖には多種多様なものが存在するだけでなく、それぞれが立体異性や位置異性を有しており、それらの要因によっても反応性が異なることから、反応を行うたびに用いる糖ごとに至適反応温度を決定するとなると膨大な検討が必要になってしまう。そこで、従来は、反応数が多い場合には用いる糖ごとに至適反応温度を検討することができず、ごく一般的と考えられる平均的な温度を設定して反応を行う等の方法を用いており、そのために十分量の反応生成物を得ることが困難なことが多かった。
本発明者らは、これらの問題を鋭意検討した結果、複数種の単糖ユニットを含む少なくとも１以上の糖鎖合成反応系、好ましくは、２以上の糖鎖合成反応系を用いて反応を行う場合に、これらの反応系の温度を、反応系中の副反応を低下させることを指標として決定した昇温率に従って変化させれば、各々の単糖ユニットごとに至適な反応温度を検討する必要なく、効率的に糖鎖固相合成反応を行えることを見出した。すなわち、反応温度を変化させることによって、各反応系中に含まれる単糖ユニットがそれぞれに至適な温度に到達した時点で反応し、糖鎖合成反応が行われることを見出した。また、本発明者らによる更なる検討の結果、前記昇温率を反応系中の副反応を低下させることを指標に決定すれば、さらに効率よく糖鎖固相合成反応を行えることも明らかになった。
かくして完成された本発明の糖鎖固相合成方法は、従来大きな課題であった糖鎖固相合成反応の反応温度を逐一検討する必要なく、効率的に多種類の糖鎖を合成することができるという大きな効果を奏するものである。
本発明で行う糖鎖合成反応自体は当業者に公知の手法で行うことができ、具体的には反応に不活性な適当な溶媒中で、固相に結合した第一の単糖ユニットに、第二の単糖ユニットを含む溶液、第三の単糖ユニットを含む溶液、並びに所望によりそれ以降の単糖ユニットを含む溶液を順次添加して反応させることにより、これらの単糖ユニットをそれぞれ順番に結合させていくことができる。なお、本明細書で単に糖鎖という場合には、単糖が２以上結合して鎖状になったものを意味する。
本発明で用いる複数種の単糖ユニットの種類は単糖類である限り特に限定されないが、好ましくは生体中に存在する単糖から選ばれる単糖骨格を含むものである。特に好ましい単糖骨格は、マンノース、グルコース、ガラクトース、キシリトース、グルコサミン、ガラクトサミン、グルクロン酸、フルクトース又はシアル酸の単糖骨格である。本発明ではこれらの単糖ユニットの複数を使用して、少なくとも１以上の糖鎖合成反応系において複数種の糖鎖を合成する。糖鎖合成反応系は１反応系でもよいし、２以上の複数の反応系でもよい。
１反応系で反応を行う場合には、１種又は２種以上の単糖ユニットを結合した固相を含む１反応系に、単糖ユニットを含む１種又は２種以上の溶液を添加して糖鎖合成反応を行って２つの単糖から成る糖鎖を合成する。次いで、この反応系に、単糖ユニットを含む１種又は２種以上の溶液を添加して、次の糖鎖合成反応を行い、３つの単糖から成る糖鎖を合成することができる。以下、これを繰り返すことにより所望の長さの糖鎖を合成することができる。ただし、このように一反応系で同時に複数種類の糖鎖を合成する場合には、反応の各段階において、もしくは最終段階において、各糖鎖を分離・精製する操作が必要である。
２以上の複数の反応系で反応を行う場合には、例えば、それぞれ異なる単糖ユニット（例えばＸ１とＸ２）を結合した固相を含む２種類の反応系をそれぞれ２個ずつ用意し（合計４個の反応系）、それぞれに異なる単糖ユニット（例えばＹ１とＹ２）を含む溶液を添加して糖鎖合成反応を行って２つの単糖から成る糖鎖を合成する。これにより、４個の反応系においてはそれぞれ、Ｘ１とＹ１から成る二糖、Ｘ１とＹ２から成る二糖、Ｘ２とＹ１から成る二糖、及びＸ２とＹ２から成る二糖が生成する。この反応生成物をさらに半分ずつに分割して、それぞれの反応系に、異なる単糖ユニット（例えばＺ１とＺ２）を含む溶液を添加して、糖鎖合成反応を行って３つの単糖から成る糖鎖を合成することができる。これにより、各反応系において、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｚ１、Ｚ２の全ての組み合わせの８通りの反応生成物を得ることができる。反応後に目的の糖鎖を分離・精製する必要がないことから、本発明においてはこの複数の反応系で反応を行う方法が好ましく用いられる。例えば、上記のように８種類の糖鎖を合成したい場合には１回目の反応では４つの反応系、２回目の反応では８つの反応系を予め用意し、好ましくはこれらを同時並行で反応させればよい。
本発明の特徴の一つは、上記した糖鎖合成反応系の温度を、反応系中の副反応を低下させることを指標として決定した昇温率に従って変化させることである。本明細書の実施例で示す通り、昇温率を大きくすると副生物が生成し、糖鎖合成反応の反応効率が低下することが判明した。従って、本発明においては、反応系中の副反応をできるだけ低下させることを指標にして決定した昇温率に従って糖鎖合成反応系の温度を変化させることにより、効率の良い糖鎖合成反応を行うことができる。
ここで、副反応とは、所望の糖鎖合成反応の反応効率を妨げるような副生物を生じる反応を意味し、副生物とは、例えば、脱離反応生成物（脱離物）、加水分解物等を意味する。脱離物とは、例えば、目的とする２分子間反応であるグリコシル化反応に代わって分子内反応が起こることにより生成するグリカール等である。すなわち、本発明において「副反応を低下させることを指標にする」とは、例えば、「副生物の存在または量が目的の反応を阻害しない程度に低いことを指標にすること」を意味する。特に、脱離物の量が十分に低いことが好ましい。また、反応の効率が悪いと未反応物が多く残存することから、この未反応物を低下させることもあわせて指標とすることがさらに好ましい。副生物の存在または量は、例えば、質量分析法（ＭＳ）、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、吸光度測定、旋光度測定等により検出し確認することができる。
温度の制御は、前記したような１反応系もしくは２以上の複数の反応系の温度を、決定した昇温率に従って変化させながら糖鎖合成反応を行うことのできる方法であればいかなる方法で行われてもよい。具体的には、温度の制御は、それ自体公知の通常用いられる化学反応等に利用可能な温度調節装置等を用いればよい。１反応系を用いる場合には、該反応系の温度を予め決定した昇温率に従って変化させればよい。２以上の複数の反応系を用いる場合には、各々の反応系の温度を予め決定した昇温率に従って変化させてもよいし、複数の反応系をまとめて一つの温度調節装置により温度制御してもよい。特に糖鎖ライブラリーの合成を行う場合等には、複数の反応系をまとめて一つの温度調節装置により温度制御し、同時並行で多数の糖鎖を合成する方法が好ましく用いられる。
昇温率や反応開始温度は、用いる単糖や脱離基により適宜設定される。反応温度が高いと副反応が進行しやすいが、反応開始温度や昇温率が低すぎると反応時間が長くなる。本発明の好ましい例では、脱離基としてフッ素基またはフェニルチオ基を有する単糖ユニットを、フッ素基またはフェニルチオ基の活性化条件下で水酸基を有する別の単糖ユニットと反応させる。このとき、昇温率は、たとえば、８℃／時間以下、好ましくは７℃／時間以下、より好ましくは５．６℃／時間以下である。好ましい昇温率の範囲は、用いる脱離基や単糖により異なるので、適宜確認実験を行い決定すればよい。反応開始温度は、用いる単糖ユニットにより異なるが、系に存在する単糖のうち、最も反応性の高い（副反応を生じやすい）単糖に合わせて設定し、その温度から昇温させればよい。たとえば、本発明において好ましい例として用いる生体内に存在する９種の単糖の中でもっとも反応性の高い（すなわち、反応温度を低く設定すべき）フコースの場合で、−３０℃〜−１５℃程度から開始させることができる。このように、各単糖に適した昇温率および反応開始温度を設定することにより、副反応をできるだけ低下させて、目的の糖鎖合成反応を高効率で行うことができる。
糖鎖は、核酸やタンパク質に次いで第３の生体高分子と捉えられ、細胞分化、免疫、癌化、感染症等、多細胞生物の生物機能に非常に重要な役目を果たしている。核酸、タンパク質については化学合成装置が販売され、科学の進歩・発展に大きく貢献しているが、糖鎖の化学合成装置は販売されておらず早期の開発が望まれている［Ｐｌａｎｔｅ，Ｏ．Ｊ．，Ｐａｌｍａｃｃｉ，Ｅ．Ｒ．，Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．Ｈ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１，１５２３−１５２７］。化学的手法による合成の基盤をなすのは固相合成であり、装置化の前段階としては素反応、また、総合的なプロセスの効率化を行う必要がある。この目的の達成のために本発明の糖鎖固相合成方法は非常に有用である。また、本発明の方法においては、前述の通り、糖鎖合成反応自体は公知の方法を用いることができるが、その中でも、反応性の独立性（相互選択性）を基礎とするオルトゴナルグリコシル化法（以下、これを「オルトゴナル法」と称することがある）が、最適な方法としてあげられる。［Ｋａｎｉｅ，Ｏ．，Ｉｔｏ，Ｙ．，Ｏｇａｗａ，Ｔ．，（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６，１２０７３−１２０７４．ｂ）Ｋａｎｉｅ，Ｏ．，Ｉｔｏ，Ｙ．，Ｏｇａｗａ，Ｔ．，（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３７，４５５１−４５５４．ｃ）Ｉｔｏ，Ｙ．，Ｋａｎｉｅ，Ｏ．，Ｏｇａｗａ，Ｔ．，（１９９６）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３５，２５１０−２５１２］
上記したオルトゴナルグリコシル化法による本発明における糖鎖固相合成反応の具体例としては、以下の工程を含む反応が挙げられる。また、その概要を図１に示す。
（ａ）下記式（１）：
Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ａ１−Ｘ （１）
（式中、Ｐは固相を示し、Ｌはリンカーを示し、Ｏは単糖の非還元末端の酸素原子を示し、Ａ１は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、Ｘは脱離基Ｙの活性化条件下で安定な脱離基を示す。）
の単糖ユニット（以下、これを「供与体」と称することがある）に、下記式（２）：
ＨＯ−Ａ２−Ｙ （２）
（式中、Ａ２は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、Ｙは脱離基Ｘの活性化条件下で安定な脱離基を示す。）
の単糖ユニット（以下、これを「受容体」と称することがある）を脱離基Ｘの活性化条件下で反応させて、下記式（３）：
Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ａ１−Ｏ−Ａ２−Ｙ （３）
の糖類を得る工程：及び
（ｂ）上記工程（ａ）で得た式（３）の糖類に、下記式（４）：
ＨＯ−Ａ３−Ｘ’ （４）
（式中、Ａ３は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、Ｘ’は脱離基Ｙの活性化条件下で安定な脱離基あるいは１位の水酸基または保護基を示す。）
の単糖ユニットを脱離基Ｙの活性化条件下で反応させて、式（５）：
Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ａ１−Ｏ−Ａ２−Ｏ−Ａ３−Ｘ’ （５）
の糖類を得る工程。
すなわち、オルトゴナル法とは、上記のように２種類（上記Ｘ及びＹ）の互いに活性化条件が異なり、かつ、他方の活性化条件下で安定な組み合わせの脱離基の性質を利用した、連続的かつ効率的な合成方法である。本明細書においては、このような２種類の脱離基を「オルトゴナルな関係にある」という。
上記の反応において、３つの糖が連結した糖鎖を合成する場合には、工程（ｂ）においてＸ’が１位の水酸基または保護基である式（４）の単糖ユニットを使用することができる。
また、上記の反応において、４つ以上の糖が連結した糖鎖を合成する場合には、工程（ｂ）で得た式（５）の糖類に対し、工程（ａ）の反応、さらに工程（ｂ）の反応を繰り返すことにより所望の長さの糖鎖を合成することができる。
Ｐが示す固相の具体例としては、糖鎖の固相合成に一般的に用いられるものであればよいが、各種の樹脂、たとえば、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ポリエーテル系樹脂、およびそれらの複合樹脂や、また、多孔性ガラス、ビーズ、微小流路（溶融シリカキャピラリー、マイクロチップ等）、セファロース等が挙げられる。これらはいずれも、固相合成に際してリンカーやスペーサー等を連結させるための足場となる、アミノ基、ブロモメチル基、水酸基、チオール基、カルボキシル基等の官能基を有しているものであって、さらに、適当な側鎖、修飾等を有するものでもよい。
Ｌが示すリンカーの具体例としては、固相と単糖の非還元末端の酸素原子とを連結できる基であって、合成反応の後に生成物に影響を与えないような温和な条件下で選択的に切り出すことが可能なものであればいかなるものでもよい。
Ｐが示す固相およびＬが示すリンカーは、より具体的には、たとえば、Ｋａｎｅｍｉｔｓｕ，Ｔ．ａｎｄ Ｋａｎｉｅ，Ｏ．，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，５，３３９−３６０（２００２）等に記載の糖鎖の合成反応に一般的に用いられる固相およびリンカーの中から、適当なものを選択して用いることができる。
Ａ１、Ａ２、及びＡ３は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、これらは互いに同一でも異なっていてもよい。単糖骨格の具体例は上記した通りである。水酸基の保護基としては、糖鎖合成反応の際に水酸基を保護できる基であれば特に限定されず、有機合成分野で当業者に公知の水酸基の保護基を適宜使用することができる。水酸基の保護基の具体例としては、以下のものが挙げられる。
（エーテル型）
メチル基、メトキシメチル基、メチルチオメチル基、ベンジルオキシメチル基、ｔ−ブトキシメチル基、２−メトキシエトキシメチル基、２，２，２−トリクロロエトキシメチル基、ビス（２−クロロエトキシ）メチル基、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル基、テトラヒドロピラニル基、３−ブロモテトラヒドロピラニル基、テトラヒドロチオピラニル基、４−メトキシテトラヒドロピラニル基、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル基、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルＳ，Ｓ−ジオキシド基、テトラヒドロフラニル基、テトラヒドロチオフラニル基；
１−エトキシエチル基、１−メチル−１−メトキシエチル基、１−（イソプロポキシ）エチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、２−（フェニルセレニル）エチル基、ｔ−ブチル基、アリル基、シンナミル基、ｐ−クロロフェニル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｏ−ニトロベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基、ｐ−ハロベンジル基、ｐ−シアノベンジル基、３−メチル−２−ピコリルＮ−オキシド基、ジフェニルメチル基、５−ジベンゾスベリル基、トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル基、ｐ−（ｐ’−ブロモフェナシルオキシ）フェニルジフェニルメチル基、９−アントリル基、９−（９−フェニル）キサンテニル基、９−（９−フェニル−１０−オキソ）アントリル基、ベンズイソチアゾリルＳ，Ｓ−ジオキシド基、；
トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ基）、（トリフェニルメチル）ジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ−ｔ−ブチルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ−ｐ−キシリルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリフェニルシリル基；
（エステル型）
ホルメート、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、ジクロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、フェノキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、２，６−ジクロロ−４−メチルフェノキシアセテート、２，６−ジクロロ−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシアセテート、２，４−ビス（１，１−ジメチルプロピル）フェノキシアセテート、クロロジフェニルアセテート、ｐ−フェニルアセテート、３−フェニルプロピオネート、３−ベンゾイルプロピオネート、イソブチレート、モノスクシノエート、４−オキソペンタノエート、ピバロエート、アダマントエート、クロトネート、４−メトキシクロトネート、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノエート、ベンゾエート、ｏ−（ジブロモメチル）ベンゾエート、ｏ−（メトキシカルボニル）ベンゾエート、ｐ−フェニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート、ｐ−ベンゾエート、α−ナフトエート；
（カーボネート型）
メチルカーボネート、エチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、イソブチルカーボネート、ビニルカーボネート、アリルカーボネート、シンナミルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、ベンジルカーボネート、ｐ−メトキシベンジルカーボネート、３，４−ジメトキシベンジルカーボネート、ｏ−ニトロベンジルカーボネート、ｐ−ニトロベンジルカーボネート、Ｓ−ベンジルチオカーボネート；
（その他）
Ｎ−フェニルカルバメート、Ｎ−イミダゾリルカルバメート、ボレート、ニトレート、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホロジアミダート、２，４−ジニトロフェニルスルフェネート：
なお、上記したような水酸基の保護基の導入法及び脱保護法は当業者に公知であり、例えば、Ｔｅｏｄｏｒａ，Ｗ．Ｇｒｅｅｎ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．（１９８１）などに記載されている。
本発明では特に好ましくは、ベンジル基を使用することができる。
Ｘ（及びＸ’）が示す脱離基Ｙの活性化条件下で安定な脱離基、並びにＹが示す脱離基Ｘの活性化条件下で安定な脱離基の組み合わせの具体例としては；
（１） 脱離基Ｘ（及びＸ’）がアリールチオ基又はアリールセレノ基、あるいはフッ素基の片方であり、脱離基Ｙがアリールチオ基又はアリールセレノ基、あるいはフッ素基の他方である場合、並びに
（２） 脱離基Ｘ（及びＸ’）がエチルチオ基（−ＳＣ２Ｈ５）であり、脱離基Ｙがピリジルスルホン基（−ＳＯ２Ｐｙｒ）である場合；
である。
ここでアリールチオ基（−Ｓ−Ａｒ）又はアリールセレノ基（−Ｓｅ−Ａｒ）におけるアリール（Ａｒ）部分は、活性化条件に適合する限り特に限定されないが、炭素数６以上のアリールが好ましく、例えば、フェニル又はナフタレンなどが挙げられ、フェニルが最も好ましい。
上記の中でも特に好ましいのは、（１）の場合であり、この場合、フェニルチオ基の活性化は、Ｎ−ヨードサクシンイミド−トリフルオロメタンスルホン酸（ＮＩＳ−ＴｆＯＨ）またはジメチルメチルチオスルフォニウムトリフラート（ＤＭＴＳＴ）等により行うことができる。ＮＩＳ及びＴｆＯＨを組み合わせた活性化剤（以下、これを「プロモーター」と称することがある）では、これらが反応して系内でヨードニウムイオン（Ｉ＋）を生成することにより活性化が行われ、高効率でヨードニウムイオンを発生することのできる組み合わせであれば、他の試薬の組み合わせも同様に活性化剤として用いることができる。ＤＭＴＳＴは、これをそのまま活性化剤として加えることもできるし、たとえば、ＭｅＳＳＭｅ（ジメチルジスルフィド）及びＭｅＯＴｆ（メチルトリフロロメタンスルホナート（メチルトリフラート））を加えることにより系内でＤＭＴＳＴを生成させることもできる。
また、フッ素基の活性化は、Ｓｎ（ＣｌＯ４）２（過ヨウ素酸第一スズ）、Ｓｎ（ＯＴｆ）２（トリフロロメタンスルホン酸スズ（ＩＩ））、Ｃｐ２Ｈｆ（ＣｌＯ４）２（過ヨウ素酸ハフノセン（ＩＩ））、またはＣｐ２Ｈｆ（ＯＴｆ）２（トリフロロメタンスルホン酸ハフノセン（ＩＩ））等により行うことができる。Ｓｎ（ＣｌＯ４）２はＳｎＣｌ２（塩化第一スズ）及びＡｇＣｌＯ４（過塩素酸銀）を、Ｓｎ（ＯＴｆ）２はＳｎＣｌ２及びＡｇＯＴｆ（銀トリフラート）を、Ｃｐ２Ｈｆ．（ＣｌＯ４）２はＣｐ２ＨｆＣｌ２（塩化ハフノセン（ＩＩ））及びびＡｇＣｌＯ４を、Ｃｐ２Ｈｆ（ＯＴｆ）２はＣｐ２ＨｆＣｌ２及びＡｇＯＴｆを加えることにより、それぞれ系内で生成させて活性化を行うことができる。
かくして合成される固相（Ｐ）に結合した糖鎖は、必要に応じて固相を適当な溶媒で洗浄し、適当な化合物、たとえばナトリウムメトキシド等により固相から切り出すことにより取得することができる。
上記したオルトゴナル法においては、カップリング反応に関与する２種の脱離基、例えば、Ｘ（アリールチオ基）はＮＩＳ−ＴｆＯＨ又はＤＭＴＳＴ等により、そしてＹ（フッ素基）はＳｎ（ＣｌＯ４）２、Ｓｎ（ＯＴｆ）２、Ｃｐ２Ｈｆ（ＣｌＯ４）２、またはＣｐ２Ｈｆ（ＯＴｆ）２等により、それぞれ選択的に活性化することができる（図１）。ここで、Ｘ及びＹは任意の順序で活性化することができる。このようなオルトゴナル法によれば、合成は生合成とは逆方向になされ、非還元末端から還元末端方向に行われる。この時、受容体側の脱離基は供与体の活性化条件下安定であるので、保護基は不必要である。また、オルトゴナル法によれば、カップリング生成物は既に次の反応のための脱離基を有しているので、糖鎖合成において最短の工程数を達成できるという利点を有している。
上記のオルトゴナル法は本発明の糖鎖固相合成方法に応用することにより、さらにその有効性を高めることができる。即ち、非還元末端からの合成法（Ａ法）と還元末端から合成を進める方法（Ｂ法）とを比較すれば、Ｂ法においては、カップリング反応における未反応物由来の官能基（水酸基）を保護（キャッピング）する必要があり、従って、１サイクルはカップリング、キャッピング、脱保護の３工程からなる。一方、Ａ法においてカップリング反応毎に副生物（加水分解物、脱離反応生成物）が固相上に蓄積するものの、それらは次のカップリング反応条件においては反応しないため、キャッピングの必要が無く、従って、固相反応においても１サイクルは１工程である。固相合成法はもともと高効率化の目的で開発された方法であり、本発明の糖鎖固相合成方法はそれをさらに効率良く改良したものであるので、オルトゴナル法を組み合わせて用いることによりさらなる総合的な反応プロセスの効率化が期待される。また、本明細書中以下に記載する拡散混合による固相反応方法とさらに組み合わせることにより、反応時間の短縮、溶媒の節約、節電等のメリットもあり、糖鎖の固相合成装置の開発にも有用である。
（２）単糖ライブラリー
生体内で多彩で重要な機能を果たす糖鎖を自在合成するためには、適当に保護された単糖ユニットが必要である。また、それらを多数含む単糖ライブラリーを作製しておくことは非常に有用である。上記の（１）で述べたように糖鎖の高効率合成には総合的なプロセスの効率化が重要であるので、どのような単糖ユニットを用いるかは重要である。
また、糖鎖の合成におけるカップリング反応においては立体異性体（α／β）が生じるが、通常の合成法では目的の立体異性体を選択的に合成する方法が一般的である。しかし、生体成分の再構築のための化学合成から脱却し、例えば、積極的に創薬等を目的としコンビナトリアルケミストリーを行おうとするような場合には、立体選択的カップリングのために必要な制御因子としての保護基の存在は、必要な単糖ユニット数を倍にするばかりでなく、そのような誘導体合成に要する反応工程を数倍とし、分子が複雑となるために用いることができる反応の種類にも制約を与える。従って、コンビナトリアルケミストリーにおいては、例えば、まずは立体非選択的な合成を行って、立体異性体混合物を効率良く合成し、その後、ＨＰＬＣ等により分離することが望ましい。本発明の方法や単糖ライブラリーは、このような手法にも好適である。
ライブラリーに含まれる単糖ユニットとしては、具体的には、例えば、本発明の糖鎖固相合成方法、中でもオルトゴナル法を組み合わせた方法においては、前記Ｘとしてフェニルチオ基を使用し、Ｙとしてフッ素基を使用し、反応に関与しない水酸基を全てベンジル基とすることが望ましい。また、ＸとＹはオルトゴナルな関係にあるので、より安定なフェニルチオグリコシド体として合成しておき、使用に際して適宜フルオリド体へと転換することが望ましい。使用する保護基は隣接基関与を示さないアルキル基が望ましく、有機合成反応で一般的に用いられるベンジル基が最も望ましい。２−アミノ糖の場合は、隣接基関与を示さないアジド基を用いて、２−アジド糖として与えることが望ましい。
糖鎖ライブラリーの合成を考慮して単糖ライブラリーを作製する場合、ヒトの糖鎖において多糖以外においては非還元末端にのみ存在しているシアル酸、グルクロン酸、フコースについては固相に保持させる位置の水酸基のみ遊離の誘導体を合成すればよい。その他の単糖、すなわち、グルコース、ガラクトース、マンノース、キシロース、グルコサミン、ガラクトサミンについては、単糖の各々の水酸基のみが遊離の誘導体をそれぞれ合成することができる。シアル酸、グルクロン酸、フコースについても他の単糖誘導体同様にそれぞれの水酸基を区別することもできる。
本発明者らによってデザインされ、本発明のオルトゴナル法と組み合わせた糖鎖の固相合成において活用される単糖ユニットの例（フェニルチオグリコシド体）を図２に示す。図２に記載の化合物（フェニルチオグリコシド体）、並びにこれらの化合物中のフェニルチオ基をフッ素基に置換した化合物（フルオリド体）から成る群から選択される少なくとも１以上の単糖ユニットを含む単糖ライブラリーは、上記（１）に記載した本発明の糖鎖固相合成方法を行うための単糖ライブラリーとして有用である。また、立体制御を行いたい場合にはアシル基に置換した化合物を任意に用いることもできる。図２に記載の単糖ユニットは、生体に存在する糖鎖を構成する９種の単糖について化学合成法で糖鎖やそれを含む糖鎖ライブラリーを構築するために必要不可欠な単糖ユニットである。
なお、図２に記載の単糖ユニット中、既知化合物について以下に論文を記載する。
Ｍａｎ−２−ＯＨ：Ｍａｒｚａｂａｄｉ，Ｃ．Ｈ．；Ｓｐｉｌｌｉｎｇ，Ｃ．Ｄ．（１９９３）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８，３７６１−６．
Ｍａｎ−３−ＯＨ：Ｏｓｈｉｔａｒｉ，Ｔ．；Ｓｈｉｂａｓａｋｉ，Ｍ．；Ｙｏｓｈｉｚａｗａ，Ｔ．；Ｔｏｍｉｔａ，Ｍ．；Ｔａｋａｏ，Ｋ．；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５３，１０９９３−１１００６
Ｍａｎ−４−ＯＨ：Ｌｅｍａｎｓｋｉ，Ｇ．；Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｔ．（２０００）Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８３，２６５５−２６７５．
Ｍａｎ−６−ＯＨ：Ｌｅｍａｎｓｋｉ，Ｇ．；Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｔ．（２０００）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５６，５６３−５７９．
Ｇａｌ−２−ＯＨ：Ｍａｒｚａｂａｄｉ，Ｃ．Ｈ．；Ｓｐｉｌｌｉｎｇ，Ｃ．Ｄ．（１９９３）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８，３７６１−６．
Ｇａｌ−３−ＯＨ：Ｋａｎｉｅ，Ｏ．；Ｉｔｏ，Ｙ．；Ｏｇａｗａ，Ｔ．（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７，４５５１−４５５４．
Ｇａｌ−４−ＯＨ：Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｗ．Ａ．；Ｐｒｉｅｓｔｌｅｙ，Ｅ．Ｓ．；Ｓｅａｒｓ，Ｐ．Ｓ．；Ａｌｐｅｒ，Ｐ．Ｂ．；Ｒｏｓｅｎｂｏｈｍ，Ｃ．；Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｍ．；Ｈｕｎｇ，Ｓ．−Ｃ．；Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１，６５２７−６５４１．
Ｇａｌ−６−ＯＨ：Ｍａｇａｕｄ，Ｄ．；Ｇｒａｎｊｅａｎ，Ｃ．；Ｄｏｕｔｈｅａｕ，Ａ．；Ａｎｋｅｒ，Ｄ．；Ｓｈｅｖｃｈｉｋ，Ｖ．；Ｃｏｔｔｅ−Ｐａｔｔａｔ，Ｎ．；Ｒｏｂｅｒｔ−Ｂａｕｄｏｕｙ，Ｊ．（１９９８）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３１４，１８９−１９９．
Ｇｌｃ−２−ＯＨ：Ｅｎｎｉｓ，Ｓ．Ｃ．；Ｃｕｍｐｓｔｅｙ，Ｉ．；Ｆａｉｒｂａｎｋｓ，Ａ．Ｊ．；Ｂｕｔｔｅｒｓ，Ｔ．Ｄ．；Ｍａｃｋｅｅｎ，Ｍ．；Ｗｏｒｍａｌｄ，Ｍ．Ｒ．（２００２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５８，９４０３−９４１１．
Ｇｌｃ−４−ＯＨ：Ｍｏｔａｗｉａ，Ｍ．Ｓ．；Ｏｌｓｅｎ，Ｃ．Ｅ．；Ｅｎｅｖｏｌｄｓｅｎ，Ｋ．；Ｍａｒｃｕｓｓｅｎ，Ｊ．；Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ｂ．Ｌ．（１９９５）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２７７，１０９−２３．
Ｇｌｃ−６−ＯＨ：Ｐｆａｅｆｆｌｉ，Ｐ．Ｊ．；Ｈｉｘｓｏｎ，Ｓ．Ｈ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．（１９７２）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２３１，１９５−２０６．
ＧｌｃＮ−４−ＯＨ：Ｍａｒｔｉｎ−Ｌｏｍａｓ，Ｍ．；Ｆｌｏｒｅｓ−Ｍｏｓｑｕｅｒａ，Ｍ．；Ｃｈｉａｒａ，Ｊ．Ｌ．（２０００）Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１５４７−１５６２．
ＧｌｃＮ−６−ＯＨ：Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｓ．；Ｋｕｚｕｈａｒａ，Ｈ．；Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｍ．（２００１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５７，６９１５−６９２６．
Ｓｉａ：Ｍａｒｒａ，Ａ．；Ｓｉｎａｙ，Ｐ．（１９８９）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１８７ ３５−４２．
（３）拡散混合による固相反応方法
本発明はさらに、毛管現象を生じる大きさの固体細孔中で固相反応を行う方法において、固体の外表面に余剰の液相が存在しない状態で反応を行うことを特徴とする固相反応方法に関する。
固相合成は、ポリマー性生体分子、たとえば、ヌクレオチド、ペプチド、糖鎖等の合成に欠かすことのできない合成手法である。また、近年、迅速に医薬品リード化合物を合成する手法として注目を集めているコンビナトリアルケミストリーにおいても基礎となっている。固相合成の利点は、通常の溶液反応において反応行程毎に必要な反応処理とそれに続くカラムクロマトグラフィーの操作を、洗いの操作に置き換えることにより反応プロセスの簡略化を図り、結果として作業時間の短縮が達成されることである。
固相合成において反応の場を提供する固相の例として、樹脂は、無機あるいは有機ポリマーであり、実際の反応の場は内部の細孔である（図３）。細孔は広い表面積を与えるため反応の場となるが、この細孔中での分子の移動は拡散によっている。しかし、従来の固相合成においてはこのような認識はされておらず、固相合成反応は溶液反応の延長として過剰量の溶媒に樹脂を膨潤させ、撹拌、振盪、あるいは、送液化で反応を行っている（図４「従来法」）。例えば、反応剤の１つは固相に保持され、他の反応剤は溶液（液相）として与えられる。この時、液相の溶媒は樹脂が膨潤するのに必要な量に対して過剰量であるので、過剰な液相から反応剤の反応の場（固相）である樹脂の内部、すなわち細孔内へと拡散による移行が必要となる。さらに、液相として与えられる反応剤は均一であり、また、細孔中の分子の移動は拡散によっているので、撹拌等の外的物理力はおよばない。従来法では、これらのことが固相反応の反応効率を低下させていると考えられた。
そこで本発明者らは、上記したような、固相反応の実際の反応の場は細孔であるので反応は拡散により支配されると考えられること、及び、液相から細孔の内部への反応剤の移行も拡散に支配されているために過剰量の液相はかえって反応効率を下げると考えられること、の２点の問題について鋭意検討を行った。その結果、従来の固相反応は、上記の２点の改善により格段に効率化が達成されることを確認した。２つの改善点とは、（ａ）拡散支配による反応（拡散混合による固相反応）と、（ｂ）必要最低限量の溶媒による反応である。（ａ）による効果は、例えば、液量低下や、攪拌、振盪装置等が不要となることによる合成ロボットの小型化であり、（ｂ）による効果は、例えば、液相に含まれる反応剤の濃縮による反応時間短縮である。また、これらの改善を行うことにより、省エネルギー、廃液の削減、住（研究）環境の改善を同時に達成することができる。
これらの改善、検討の結果、本発明者らは、毛管現象を生じる大きさの固体細孔中で固相反応を行う方法において、固体の外表面に余剰の液体が存在しない状態で反応を行うことを特徴とする本発明の固相反応方法を確立した。該方法は、さらに、攪拌、振盪等による外的な力を必要とせず、拡散混合によってのみ反応を行うことを大きな特徴としている。
本発明における拡散混合による固相反応は固相反応の原理であり、糖関連の反応に限定されずにいかなる固相上の反応にも適応できる。上記した拡散混合による固相反応方法は、好ましくは化学反応または生化学的反応に適用することができる。具体的には、例えば、糖鎖合成反応、ペプチド合成反応、核酸合成反応、それらのアナログや複合体等の合成反応、有機化学合成反応、酵素反応等が挙げられ、さらに好ましくは糖鎖合成反応に適用することができ、特に好ましくは上記（１）に記載した本発明の糖鎖固相合成反応に適用することができる。
具体的には、例えば、糖鎖固相合成反応の場合には、固相に結合した第一の単糖に、第二の単糖を反応させて結合させる反応は、第一の単糖が結合している固相に第二の単糖を含む液相を添加して該固相と反応させることにより行われる。同様に、他の化学反応または生化学反応を行う場合にも、反応に関与する第一の物質をあらかじめ固相上に結合させておき、該固相に、これと反応させる第二の物質を含む液相を加えて反応を行えばよい。
本発明において固相として用いられる固体とは、その内部に毛管現象を生じる大きさの細孔を有し、その細孔中で前記したような固相反応が行えるものであればいかなるものでも用い得る。固体は、例えば糖鎖固相合成方法を行う場合には、好ましくはその表面に何らかの官能基を有しているものであって、さらにこの官能基に反応に関わる基質と結合し得るリンカーが結合している。官能基やリンカーとしては、前記（１）の糖鎖固相合成方法において詳述したもの等を用いることができる。固体の材質としても、前記（１）の糖鎖固相合成方法において詳述したもの等を用いることができ、具体的には、例えば、樹脂、シリカ、ガラス（多孔性ガラス）等が挙げられる。樹脂としては、例えば、ポリスチレン、ＴＧ（ＴｅｎｔａＧｅｌ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製））、ＰＥＧＡ（Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ−ＰＥＧ Ｃｏ−ｐｏｌｙｍｅｒ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社製））等が挙げられ、これらが内部に適当な細孔を有するように成型されたものを好ましく用いることができる。これらの内部に存在する細孔の大きさは、毛管現象を生じる大きさであればよいが、適用する反応、溶媒等に鑑みて適当なものを選択して用いればよい。
固体の大きさや形状は、用いる反応容器や装置に応じて適当なものを選択すればよい。例えば、樹脂やシリカは、種々の形状に成型されたものが市販されているが、取扱いが容易である点から、ビーズ状（粒状）に成型された樹脂ビーズ等が好ましく用いられる。樹脂ビーズの場合、例えば、その粒径は１〜１０００μｍ程度である。また、不定形のものも用いることができる。それぞれ様々な粒径及び細孔径を有するものが市販されており、それらの中から目的の反応に適したものを選択して用いればよい。その一例を、後記表１に示す。
また、例えば、モノリス構造を有する固体も好ましく用いることができる。モノリス（ｍｏｎｏｌｉｔｈ）とは、つなぎ目のないもの、一枚岩のようなもの、との意味を持つ言葉であって、一定の質感をもつ単一の素材によって構成されている連続体を意味する。例えば、シリカで構成される「モノリスシリカ」の場合、シリカの骨格と空隙が一つの物体の中で連続構造をとっている。このような構造によって、モノリスシリカは、例えば真球状の粒子が充填されたものと比べて高い空隙率を有し、連続構造であるために多くの貫通孔を有するため、本発明の方法に好適である。ポリスチレンモノリス等、他の材質でもモノリス構造を有する固体の形成は可能である。このようなものも、用いる反応容器や装置に適した形状や大きさのものを選択して本発明に用い得る。
さらに、本発明においては、人工的に形成された細孔を有する物体も用いることができる。例えば、人工的に上述したような細孔と同様の効果を奏するように形成された流路等を有するもの等も、同様に用いることができる。より具体的には、例えば、微小流路構造（以下、これを「マイクロチャネル」と称することがある）や、これらが配設されたチップ等を利用することができる。
ここでマイクロチャネルとは、チャネル（流路）に液体を導入した時に、マイクロ効果が現れる、すなわち液体に何らかの挙動変化が現れる断面形状を持つチャネルを意味する。本発明においては、このマイクロ効果のうち、少なくとも毛管現象が生じるものを用いる。マイクロ効果の発現には、液相として用いる溶媒の物性によっても異なるが、断面形状、すなわちチャネルの主流方向に垂直な面の形状のうち、最も短い間隔（長方形なら短辺、楕円なら短径に相当する）の長さが通常５ｍｍ以下、好ましくは５００μｍ以下、より好ましくは２００μｍ以下であることが適当である。この長さの下限は特に限定されず、マイクロチャネルとしての機能を有する長さであればよい。また、チップとは、流路構造を含む部分の部材を意味する。またマイクロチップとは、上記マイクロチャネルよりなる微小流路構造を備えるチップを意味する。チップの大きさ、形状は特に限定されず、用途に応じて任意に設定することができ、それ自体公知の通常用いられる手法によって作製され得る。
上記いずれの形状のものであっても、本発明において用いられる固体としては、固体の内部に存在する細孔による空隙が大きいもの、すなわち、空隙率が高いものが好ましい。特に、細孔径が小さく空隙率が高いものが好ましい。本発明の方法は細孔中の固体表面において反応が行われるので、細孔径が一定であれば、一般に空隙率が高く表面積が大きいものほど反応の効率が高いためである。
本発明において、液体の外表面に余剰の液相が存在しない状態で反応を行うとは、必ずしも液相がまったく存在しないことを意味するものではなく、あくまでも余剰もしくは過剰量の液相を用いても反応効率が低下することから、不要であることを意味している。すなわち、目的に適う反応効率が十分に達成されるものであれば多少の余剰の液相が存在してもよく、攪拌、振盪、連続的な送液等の外的な力を与えずに拡散混合のみによって効率的に反応が行われるものをすべて包含する。
液相は、細孔中での拡散が十分に起こり得る程度に細孔を満たす液量が少なくとも必要である。すなわち、少なすぎても多すぎても反応効率は低下し、また、溶媒も無駄になるので、必要かつ最小限の液相を用いるのがよい。理論上、固体細孔がちょうど満たされる最大液量で反応を行うことが最も効率が良い。
固体細孔がちょうど満たされる最大液量は、例えば、シリカビーズやシリカモノリスのように液相が添加されても膨潤しない性質の固体については、その固体に存在する細孔の空隙の量（以下、これを「空隙量」と称することがある）と理論上同じである。空隙量は、それ自体公知の通常用いられる測定方法により求めることができる。一方、多くの樹脂ビーズのように液相が添加されると膨潤する性質の固体については、例えば、次に例示するような手法により必要な液量（以下、これを「膨潤液量」と称することがある）を簡便に決定することができる。前者の膨潤しない性質の固体についても、必ずしも測定や計算により求められた空隙量と実際に必要とされる液量が一致するとは限らない場合もあるため、同様の方法により最適な液量を確認することが好ましい。
樹脂を膨潤させるために必要な液量については、以下の表１や、Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（１９９１）３０，１１３．等を参考にして決定することができるが、次のようにして実験的に容易に確認し、知ることができる。
まず、一定量の樹脂を秤量し、これに使用する溶媒を滴下する。この時、滴下量を計測する。大まかな樹脂の膨潤は１０分程度で完了するのでこれを目安に滴下を行う。必要十分量以上の溶媒が添加された時、樹脂ビーズ間の摩擦力が低下し「液状化」現象が生じる。この時の溶媒量を反応に用いる溶媒量と決定すればよい。このとき、例えば樹脂ビーズをシリンダー等の適当な実験容器に秤量し、この中で溶媒の滴下を行うと、滴下にともなって樹脂ビーズは次第に膨潤するが、膨潤液量を過ぎると必要以上の余剰の溶媒が樹脂ビーズの層の上にただ重層されるだけとなる。このようにして、膨潤液量（すなわち、細孔中に溶媒が満たされ、これ以上膨潤しない点）は実験的に容易に確認することができる。
本発明者らの実験により、固相、例えば樹脂の膨潤液量に必要な反応剤（具体的には、例えば、糖鎖合成法の場合には、反応に関わる単糖ユニット、活性化剤等）を溶解することにより、反応剤量を同一とした場合には、反応の場である樹脂の細孔内部と過剰の液相との間で拡散による移行が不要となった結果、反応時間の短縮が達成された。また、反応剤が複数ある場合、反応剤の添加は全て同時に行うことも複数回に分けて行って、細孔中で混合させることもできる。
液相として用いる溶媒としては、それぞれの固相反応に適したものであればいかなるものでも用い得るが、それ自体が目的の反応に関与しないものであって、樹脂等の固相とも反応しないものを用いる。また、固相との組み合わせにより毛管現象が生じ易いものを選択することも好ましい。
かくして選択された固相と液相を用いて、本発明の固相反応方法を行うことができる。
固相反応自体は、それ自体公知の通常用いられる手法により行われるが、本発明の方法においては、攪拌、振盪、連続的な送液等の外的な力を加えず、好ましくは静置して行われる。静置することにより、反応は拡散混合により行われる。必要に応じて、温度調節機能、送液機能等を備えていることが好ましい。
反応容器（反応槽）としては、拡散混合及び反応自体が妨げられず、十分に進行できるような状態を維持できるものであればいかなるものでもよく、目的の反応、用いる固相、液相等に適したものを選択すればよい。液相の乾燥を防ぐ目的で適度に密閉が可能なものが好ましい。
例えば、固相として用いられる固体としてビーズ状（粒状）のものを用いる場合には、反応槽は、これらを適当な密度で充填した構造とすることができる。好ましくは、液相を添加、回収できる構造を有するものを用いる。具体的には、例えば、一般的に物質の精製・分離等に用いられているカラム類と類似の構造等が挙げられる（例えば、図４「本発明」）。また、モノリス構造を有する固体を用いる場合も、同様に固体の大きさや形状に適した反応槽に収容されることが好ましい。
一方、人工的に形成された細孔を有する物体、例えば、微小流路構造（マイクロチャネル）を有するチップ等を用いる場合には、チップ自体が反応槽として用いられることができ、これに配設された流路（チャネル）に毛管現象によって液相が流入し、反応後の液相を回収可能な構造となっていればよい。また、このような構造のチップの流路内に上記のようなビーズ状もしくはモノリス構造等の固体を充填することもできるし、流路内壁をコーティングすることもできる。
前記（１）に記載の糖鎖固相合成方法は、昇温率を制御して反応系の温度を変化させることにより高効率で糖鎖の固相合成を行う方法であるので、本法のように固相反応を少量の溶媒で効率良く行うことができる方法と組み合わせることにより、さらに効率的に合成を行うことができる。特に、例えば、前記したように、コンビナトリアルケミストリーにより糖鎖ライブラリーを構築しようとする場合等には、少量でも非常に多数の組み合わせで反応を行って多種類の糖鎖を合成する必要がある。この目的のために、一度に多数の反応を同時進行させることのできる前記（１）の糖鎖固相合成方法と、少量の液相で静置しておくだけで反応を行うことができる（攪拌、振盪、連続的な送液等に関わる装置が不要な）この固相反応方法とを組み合わせることは、非常に好適である。
以下に、本法と前記（１）に詳述した本発明の糖鎖固相合成方法を組み合わせて用いる場合を例に挙げて、さらに具体的に説明する。
まず単糖ユニット（供与体）が結合した樹脂（Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ａ１−Ｘ）を準備する。次に、たとえばこの樹脂を結合せしめる単糖ユニット（受容体；ＨＯ−Ａ２−Ｙ）を含む溶液で膨潤し、脱離基の活性化剤（プロモーター）を加えて反応させる方法（方法１）、又は、樹脂（Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ａ１−Ｘ）と結合せしめる単糖ユニット（ＨＯ−Ａ２−Ｙ）と脱離基の活性化剤の混液により膨潤して反応させる方法（方法２）を繰り返すことにより、樹脂上に任意の長さの糖鎖を合成することができる。方法１又は２は、反応の進行状態に応じて、いずれの方法でも任意に選択することができる。
かくして得られる糖鎖が結合した樹脂を、前記のとおり必要に応じて適当な溶媒で洗浄し、樹脂から糖鎖を切り出すことにより、目的の糖鎖を取得することができる。
本発明による拡散混合による固相反応方法によれば、固相反応において撹拌、振盪等物理的に混合のための操作を施す必要がない。すなわち、固相反応を樹脂細孔内の分子の拡散に委ねることにより、固相反応が達成される。これにより反応装置の小型化が達成できる。従来の合成装置が反応槽、温度調節器、分注器、撹拌装置、ガス置換装置から構成されているのに対し、本発明の方法を行うための反応装置としては、（ｉ）反応槽、温度調節器、分注器及びガス置換装置から成る装置、あるいは、（ｉｉ）反応槽、温度調節器、流路変換装置及び送液ポンプから成る装置などを利用できる。
即ち、本発明によれば、少なくとも以下の（１）と（２）とを含む、拡散混合による固相反応を行うための反応装置が提供される。
（１）液相を注入又は吸引するための導入部を有し、かつ固体を収容する空間を有する、固相反応を行うための反応部、及び
（２）反応部の温度を調節するための温度調節部
（４）本発明の糖鎖固相合成方法で得られるライブラリー
上記（１）に記載した本発明の糖鎖固相合成方法により合成された、生体中に存在する単糖から選ばれる３種類の糖の全ての組み合わせから成る糖鎖により構成されるライブラリーも本発明の範囲内である。生体中に存在する単糖としては、好ましくは、マンノース、グルコース、ガラクトース、キシリトース、グルコサミン、ガラクトサミン、グルクロン酸、フルクトース又はシアル酸を使用することができる。
糖鎖ライブラリーの重要性は今後増大すると考えられるが、そのターゲットとしては、生体に存在する９種類の単糖から任意に３種類を選択して得られる組み合わせから成る３糖ライブラリーとすることが望ましい。このようにして得られる糖鎖ライブラリーは、直接機能研究のためのプローブとして使用したり、または医薬リードとして用いたり、生体内の糖鎖を模したライブラリーとして医薬品のスクリーニング等にも用い得る。
生体内の糖鎖は、一般に１〜５個の単糖が連結したものであり、これらが免疫反応等における細胞間認識、ウィルスやバクテリアの認識等、複雑な認識現象にかかわっていることが知られている。本発明の生体内に存在する単糖から選ばれる３種類の糖のすべての組み合わせから成る糖鎖により構成されるライブラリーは、実際にヒトの生体内に存在する糖鎖を平均的に模したラブラリーとして有用である。９種の生体内に存在する単糖から成る３糖の組み合わせの数は１４０，８２４通りであるが、ライブラリーがカバーする範囲を限定することもできる。
本発明においては、本明細書中上記した任意の単糖ユニットを用い、本明細書中上記したオルトゴナルグリコシル化法に基づいて、本明細書中上記した拡散混合固相反応法に従い糖鎖の合成を行うことにより、アセタール（アノメリック）位の立体異性体（２３＝８）混合物が得られ、必要に応じてこれらをＨＰＬＣを用いて分離することができる。（図５）。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。なお、以下の実施例で用いる化学反応および糖鎖合成反応の一般的手法、試薬等は、「固相合成ハンドブック（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社（Ｍｅｒｃｋ社）刊」等の一般的実験書等に記載のものを用いることができる。
【実施例】
ＴＬＣはＭｅｒｋ Ａｒｔ ５７１５ Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０ Ｆ２５４を用い、検出はＵＶ吸収及び発色試薬（１０％Ｈ２ＳＯ４−エタノール）で行った。カラムクロマトグラフィーはＭｅｒｋ Ａｒｔ ７７３４ Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０ ７０−２３０ｍｅｓｈを用いた。１Ｈ及び１３Ｃ−ＮＭＲはＢＵＫＥＲ ＡＣＶＡＮＣＥ ５００あるいはＪＥＯＬ ＥＸ−２７０で測定し、ケミカルシフト値は内部標準物質（テトラメチルシラン）に対するδ値（ｐｐｍ）で示した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＡＳはＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅ ＶｏｙｇｅｒＴＭで測定し、ｍａｔｒｉｘには２，５−ジヒドロ安息香酸を用いた。ＦＴ−ＩＲはＨＯＲＩＢＡ ＦＴ７２０を使用した。ＲｅｓｉｎはＮｏｖａｓｙｎＲ ＴＧ ａｍｉｎｏ ｒｅｓｉｎ ＨＬ（０．２９ｍｍｏｌ／ｇ ｌｏａｄｉｎｇ）を使用した。反応に用いたＣ２Ｈ４Ｃｌ２はＡｌｄｒｉｃｈ １，２ｄｉｃｈｌｏｒｏｅｔｈａｎｅ ａｎｈｙｄｒｏｕｓ ９９．８％を用い、ＥｔＣＮはＣａＨ２により減圧蒸留した。固相反応にはＢｏｈｄａｎＲ ＭｉｎｉｂｌｏｃｋＴＭを用いた。
実施例１：保護単糖ライブラリー
図１に記載の単糖ライブラリー中、Ｍａｎ−２−ＯＨ、Ｍａｎ−３−ＯＨ、Ｍａｎ−４−ＯＨ、Ｍａｎ−６−ＯＨ、Ｇａｌ−２−ＯＨ、Ｇａｌ−３−ＯＨ、Ｇａｌ−４−ＯＨ、Ｇａｌ−６−ＯＨ、Ｇｌｃ−２−ＯＨ、Ｇｌｃ−４−ＯＨ、Ｇｌｃ−６−ＯＨ、ＧｌｃＮ−４−ＯＨ、ＧｌｃＮ−６−ＯＨ、Ｓｉａの１４種類については本明細書中上記した通り公知化合物である。
Ｍａｎ−２−ＯＨ、Ｍａｎ−３−ＯＨ、Ｍａｎ−４−ＯＨ、Ｍａｎ−６−ＯＨの合成については、Ｋａｍｅｔａｎｉ，Ｔ．；Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｋ．；Ｈｏｎｄａ，Ｔ．（１９８７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９，３０１０−１７；Ｌｅｍａｎｓｋｉ，Ｇ．；Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｔ．（２０００）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５６，５６３−５７９；Ｌｅｍａｎｓｋｉ，Ｇ．；Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｔ．（２０００）Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８３，２６５５−２６７５；Ｏｓｈｉｔａｒｉ，Ｔ．；Ｓｈｉｂａｓａｋｉ，Ｍ．；Ｙｏｓｈｉｚａｗａ，Ｔ．；Ｔｏｍｉｔａ，Ｍ．；Ｔａｋａｏ，Ｋ．；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５３，１０９９３−１１００６；Ｍａｒｚａｂａｄｉ，Ｃ．Ｈ．；Ｓｐｉｌｌｉｎｇ，Ｃ．Ｄ．（１９９３）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８，３７６１−６；Ｓｔｒｅｅｔ，Ｉ．Ｐ．；Ｗｉｔｈｅｒｓ，Ｓ．Ｇ．（１９８６）Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．６４，１４００−３；Ｍｕｒａｇａｔａ，Ｔ．；Ｋ．，Ｍａｓａｍｉ；Ｓ．，Ｙ．；Ｓ．，Ｈ．；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓ．；Ｏｇａｗａ，Ｔ Ｊｐｎ．Ｋｏｋａｉ Ｔｏｋｋｙｏ Ｋｏｈｏ（１９９４），４４ ｐｐ．ＣＯＤＥＮ：ＪＫＸＸＡＦ ＪＰ ０６２９３７９０ Ａ２ １９９４１０２１ Ｈｅｉｓｅｉ．Ｐａｔｅｎｔ ｗｒｉｔｔｅｎ ｉｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ：ＪＰ ９３−８１９５５ １９９３０４０８．ＣＡＮ １２３：８３９４３ ＡＮ １９９５：６６２３３２を参照できる。
Ｓｉａの合成については、Ｄａｓｇｕｐｔａ，Ｆ．（Ｇｌｙｃｏｍｅｄ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）．Ｕ．Ｓ．（１９９２），９ ｐｐ．ＣＯＤＥＮ：ＵＳＸＸＡＭ ＵＳ ５１３８０４４ Ａ １９９２０８１１ Ｐａｔｅｎｔ ｗｒｉｔｔｅｎ ｉｎ Ｅｎｇｌｉｓｈ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ：ＵＳ ９０−５６６６８２ １９９００８１３．ＣＡＮ １１８：８１３３５ ＡＮ １９９３：８１３３５ ＣＡＰＬＵＳ（Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ ２００３ ＡＣＳ）；Ｍａｒｒａ，Ａ．；Ｓｉｎａｙ，Ｐ．（１９８９）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１８７ ３５−４２；Ｓｈａｒｍａ，Ｎ．，Ｍ．；Ｅｂｙ，Ｒ．（１９８４）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１２７ ２０１−２１０を参照できる。
上記以外の単糖については以下の通り合成した。
（１）ガラクトース誘導体のフッ素化物の合成
フェニル２−Ｏ−クロロアセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−のベンジル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
化合物２８（３００ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（５．４ｍＬ）、ピリジン（０．３ｍＬ）に溶解させ、氷冷下でクロロアセチルｃｈｌｏｒｉｄｅ（８８μＬ，１．１１ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＨＣｌで洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１５：１）で精製し、化合物３８（３２３ｍｇ，０．５２ｍｍｏｌ）を９４％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．６２．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５０−７．２２（２０Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ４），５．４５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，Ｈ−２），４．９３，４．６８，４．６３，４．５６，４．５０，４．４３（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ３），４．６８（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１），４．００（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，Ｈ−４），３．９７（１Ｈ，ｄ，−ＣＨ２Ｃｌ），３．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ，−ＣＨ２Ｃｌ），３．６６−３．６３（３Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−５，Ｈ−６ａ），３．５８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，Ｈ−６ｂ）．
２−Ｏ−クロロアセチル−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオリド（３９）
化合物３８（３０８ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）、をＣＨ２Ｃｌ２（４．０ｍＬ）に溶解させ、窒素気流下−１５℃でＤＡＳＴ（７９μＬ，０．６０ｍｍｏｌ）、ＮＢＳ（１０７ｍｇ，０．６０ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝２０：１）で精製し、化合物３９（１８０ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）を６８％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．６０．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ．６８−７．２６（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．８０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１，２＝２．８Ｈｚ，Ｊ１，Ｆ＝５４．６Ｈｚ，Ｈ−１），５．４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，Ｊ＝２５．０Ｈｚ，Ｈ−２），４．９３，４．７２，４．６３，４．５７，４．５０，４．４４（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ３），４．１３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），４．０８（１Ｈ，ｄ，Ｈ−４），４．０５−４．０１（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ２Ｃｌ），３．９６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，Ｈ−３），３．６０−３．５９（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６ａ，Ｈ−６ｂ）．
３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオリド（４０）
化合物３９（１４６ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）をピリジン（６．０ｍＬ）、エタノール（１．０ｍｌ）に溶解させ、チオ尿素（２１ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で１時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＨＣｌ、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１０：１）で精製し、化合物４０（９４ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）を７５％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．３１．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．４０−７．２２（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１，２＝２．８Ｈｚ，Ｊ１，Ｆ＝５４．７Ｈｚ，Ｈ−１），４．８７，４．７３，４．６１，４．５６，４．５１，４．４４（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，ベンジルメチレン×３），４．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，Ｊ＝２５．４Ｈｚ，Ｈ−２），４．１２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｈ−５），４．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，Ｈ−４），３．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ，Ｈ−３），３．６５−３．５７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６ａ，Ｈ−６ｂ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１０８．３，１０６．２，７．６，７４．７，７３．５，７３．１，７２．２，７１．９，６８．３，６０．７
フェニル３−Ｏ−クロロアセチル−２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（４１）
化合物３２（１４０ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２．７ｍＬ）、ピリジン（０．１５ｍＬ）に溶解させ、氷冷下でクロロアセチルクロライド（４１μＬ，０．５１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１．５時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＨＣｌで洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝２０：１）で精製し、化合物４１（１４５ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）を９１％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．７０．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５８−７．１５（２０Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ４），４．９８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，Ｈ−３），４．８３，４．６８，４．５７，４．５３，４．５２，４．４５（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，ベンジルメチレン×３），４．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｈ−１），４．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，Ｈ−４），３．９５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，Ｈ−２），３．７４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ｈ−６ａ），３．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，−ＣＨ２Ｃｌ），３．５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，−ＣＨ２Ｃｌ），３．６３−３．５４（Ｈ−４，Ｈ−５，Ｈ−６ｂ）．
３−Ｏ−クロロアセチル−２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオリド（４２）
化合物４１（１３２ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）、をＣＨ２Ｃｌ２（２．５ｍＬ）に溶解させ、窒素気流下−１５℃でＤＡＳＴ（３４μＬ，０．２５ｍｍｏｌ）、ＮＢＳ（４６ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝２０：１）で精製し、化合物４２（１１０ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）を９８％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．６８．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．４０−７．１７（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，Ｊ＝５３．２Ｈｚ，Ｈ−１ｂ），５．２８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，Ｈ−３），５．０５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，Ｈ−１ｂ），４．８３，４．６９，４．６６，４．５８，４．５３，４．４６（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ３），４．２２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｈ−５），４．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，Ｈ−４），４．０４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，Ｈ−３），４．０１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，Ｈ−２），３．９４−３．８９（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６ａ，Ｈ−６ｂ），３．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．８Ｈｚ，ＣＨ２Ｃｌ），３．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．８Ｈｚ，ＣＨ２Ｃｌ）．
２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（４３）
方法１
化合物４２（１０１ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ）をピリジン（６．０ｍＬ）、エタノール（１．０ｍｌ）に溶解させ、チオ尿素（１６ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で１時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＨＣｌ、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１２：１）で精製し、化合物４３（６７ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）を７７％の収率で得た。
方法２
化合物３２（１９１ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ）、をＣＨ２Ｃｌ２（２．５ｍＬ）に溶解させ、窒素気流下−１５℃でＤＡＳＴ（２３３μＬ，１．７２ｍｍｏｌ）、ＮＢＳ（６９ｍｇ，０．３９ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１２：１）で精製し、化合物４３（６０ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）を３８％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．４０．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．３５−７．１６（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１，２＝２．５Ｈｚ，Ｊ１，Ｆ＝５３．７Ｈｚ，Ｈ−１），４．８１，４．７３，４．６８，４．６２，４．５２，４．４３（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ３），４．１５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｈ−５），４．０７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，Ｈ−３），３．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，Ｈ−２），３．８０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，Ｊ＝２５．２Ｈｚ，Ｈ−２），３．６１−３．５８（１Ｈ，．ｍ，Ｈ−６ａ，Ｈ−６ｂ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１０８．１，１０４．３，７６．５，７５．９，７５．２，７３．４，７３．０，７１．６，６９．８，６８．２
フェニル４−Ｏ−クロロアセチル−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（４４）
化合物３４（１５０ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２．７ｍＬ）、ピリジン（０．１５ｍＬ）に溶解させ、氷冷下でクロロアセチルクロライド（４４μＬ，０．５５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＨＣｌで洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝２０：１）で精製し、化合物４４（１６０ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ）を９４％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．７０．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．６１−７．１３（２０Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ４），５．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，Ｈ−４），４．７６，４．７５，４．７２，４．６４，４．５３，４．５２（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，ベンジルメチレン ｘ ３），４．６０（１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−１），４．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．９Ｈｚ，−ＣＨ２Ｃｌ），３．９８（１ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．９Ｈｚ，−ＣＨ２Ｃｌ），３．７８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｈ−５），３．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，Ｈ−３），３．６３−３．５８（２Ｈ，ｍ，Ｈ−６ａ，Ｈ−６ｂ），３．５１（１Ｈ，ｔ，Ｈ−２）．
４−Ｏ−クロロアセチル−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（４５）
化合物４４（１４６ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）、をＣＨ２Ｃｌ２（２．５ｍＬ）に溶解させ、窒素気流下−１５℃でＤＡＳＴ（３８μＬ，０．２８ｍｍｏｌ）、ＮＢＳ（５０ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝２０：１）で精製し、化合物４５（１１７ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）を９４％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．６９．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５１−７．２９（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．７３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｈ−４），５．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１，２＝２．６Ｈｚ，Ｊ１，Ｆ＝５３．０Ｈｚ，Ｈ−１），４．８２，４．７７，４．６７，４．５８，４．５４，４．３０（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，ベンジルメチレン×３），４．２７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｈ−５），４．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，−ＣＨ２Ｃｌ），３．９９−３．９４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３，−ＣＨ２Ｃｌ），３．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，Ｊ＝２５．３Ｈｚ，Ｈ−２），３．５４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｈ−６ａ），３．４５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，Ｈ−６ｂ）．
２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（４６）
方法１
化合物４５（１０８ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）をピリジン（６．０ｍＬ）、エタノール（１．０ｍｌ）に溶解させ、チオ尿素（１６ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で１時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＨＣｌ、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１２：１）で精製し、化合物４６（５１ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）を５５％の収率で得た。
方法２
化合物３４（１２０ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）、をＣＨ２Ｃｌ２（２．５ｍＬ）に溶解させ、窒素気流下−１５℃でＤＡＳＴ（１４６μＬ，１．１１ｍｍｏｌ）、ＮＢＳ（４３ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１２：１）で精製し、化合物４６（４０ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ）を４０％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．４７．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：７．３７−７．１７（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈｘ３），５．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１，２＝２．６Ｈｚ，Ｊ１，Ｆ＝５３．０Ｈｚ，Ｈ−１α），５．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｊ＝５２．７Ｈｚ，Ｈ−１β），４．８３，４．７８，４．７４，４．７１，４．６０，４．５５（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ３），４．０９（１Ｈ，ｓ，Ｈ−４），４．０７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，Ｈ−５），３．９１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，Ｈ−３），３．８１−３．６４（３Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−６ａ，Ｈ−６ｂ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１０８．１，１０４．３，７６．５，７５．９，７３．４，７３．０，７１．６，６９．８，６８．２．
フェニル６−Ｏ−クロロアセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（４７）
化合物３７（１５０ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２．７ｍＬ）、ピリジン（０．１５ｍＬ）に溶解させ、氷冷下でクロロアセチルクロライド（４４μＬ，０．５５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＨＣｌで洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１５：１）で精製し、化合物４７（１７１ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）を定量的に得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．５２．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５６−７．１８（２０Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ４），５．００，４．８３，４．７９，４．７４，４．６３，４．６２（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ３），４．７４（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１），４．３５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，Ｈ−６ａ），４．１３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），３．９５−３．８７（３Ｈ，ｍ，Ｈ−３，−ＣＨ２Ｃｌ），３．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｈ−４），３．６１−３．５９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−５）．
６−Ｏ−クロロアセチル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（４８）
化合物４７（１７１ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ）、をＣＨ２Ｃｌ２（２．５ｍＬ）に溶解させ、窒素気流下−１５℃でＤＡＳＴ（４４μＬ，０．３３ｍｍｏｌ）、ＮＢＳ（５９ｍｇ，０．３３ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝２０：１）で精製し、化合物４８（１１９ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）を８２％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．５０．
２，３，６−Ｔｒｉ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（４９）
化合物４８（１１９ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）をピリジン（６．０ｍＬ）、エタノール（１．０ｍｌ）に溶解させ、チオ尿素（２０．６ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で１時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＨＣｌ、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１０：１）で精製し、化合物４９（７８ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）を７６％の収率で得た。
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４９α：ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．４７．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．４１−７．１５（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．６０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，Ｊ＝５３．８Ｈｚ，Ｈ−１），４．９５，４．８８，４．８３，４．７２，４．６８，４．６４（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，ベンジルメチレン×３），４．１２（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−２），４．０８−３．９１（３Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−４，Ｈ−５），３．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−６ａ），３．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，Ｈ−６ｂ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１０４．４（Ｃ−１），７８．３（Ｃ−２），７５．９，７３．７，７２．９，６１．９（Ｃ−６）．
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４９βＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝６：１ Ｒｆ＝０．４０．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．３８−７．２５（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ｊ＝５３．１Ｈｚ，Ｈ−１），４．９４，４．８６，４．８５，４．８０，４．７４，４．６９，４．６４（６Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ３），３．９８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２），３．８７−３．８１（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４，Ｈ−６ａ），３．６０（１Ｈ，ｄ，Ｈ−３），３．５５−３．５０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５，Ｈ−６ｂ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１０８．５（Ｃ−１），８０．４，７９．１（Ｃ−２），７６．５，７２．５，６１．９（ｃ−６）
Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｗ．Ａ．；Ｐｒｉｅｓｔｌｅｙ，Ｅ．Ｓ．；Ｓｅａｒｓ，Ｐ．Ｓ．；Ａｌｐｅｒ，Ｐ．Ｂ．；Ｒｏｓｅｎｂｏｈｍ，Ｃ．；Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｍ．；Ｈｕｎｇ，Ｓ．−Ｃ．；Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１，６５２７−６５４１．
Ｋａｍｅｔａｎｉ，Ｔ．；Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｋ．；Ｈｏｎｄａ，Ｔ．（１９８７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９，３０１０−１７．
Ｌｅｍａｎｓｋｉ，Ｇ．；Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｔ．（２０００）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５６，５６３−５７９．
Ｌｉｐｔａｋ，Ａ．；Ｊｏｄａｌ，Ｉ．；Ｈａｒａｎｇｉ，Ｊ．；Ｎａｎａｓｉ，Ｐ．（１９８３）Ａｃｔａ Ｃｈｉｍ．Ｈｕｎｇ．１１３，４１５−４２２．
Ｌｅｍａｎｓｋｉ，Ｇ．；Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｔ．（２０００）Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８３，２６５５−２６７５．
Ｋａｎｉｅ，Ｏ．；Ｉｔｏ，Ｙ．；Ｏｇａｗａ，Ｔ．（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７，４５５１−４５５４．
Ｏｓｈｉｔａｒｉ，Ｔ．；Ｓｈｉｂａｓａｋｉ，Ｍ．；Ｙｏｓｈｉｚａｗａ，Ｔ．；Ｔｏｍｉｔａ，Ｍ．；Ｔａｋａｏ，Ｋ．；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５３，１０９９３−１１００６．
Ｍａｇａｕｄ，Ｄ．；Ｇｒａｎｊｅａｎ，Ｃ．；Ｄｏｕｔｈｅａｕ，Ａ．；Ａｎｋｅｒ，Ｄ．；Ｓｈｅｖｃｈｉｋ，Ｖ．；Ｃｏｔｔｅ−Ｐａｔｔａｔ，Ｎ．；Ｒｏｂｅｒｔ−Ｂａｕｄｏｕｙ，Ｊ．（１９９８）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３１４，１８９−１９９．
Ｍａｒｚａｂａｄｉ，Ｃ．Ｈ．；Ｓｐｉｌｌｉｎｇ，Ｃ．Ｄ．（１９９３）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８，３７６１−６．
Ｓｔｒｅｅｔ，Ｉ．Ｐ．；Ｗｉｔｈｅｒｓ，Ｓ．Ｇ．（１９８６）Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．６４，１４００−３．
Ｍｕｒａｇａｔａ，Ｔ．；Ｋａｎｅｋｏ，Ｍ．；Ｓａｉｔｏ，Ｙ．；Ｓａｉｔｏ，Ｈ．；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓ．；Ｏｇａｗａ，Ｔ．．Ｊｐｎ．Ｋｏｋａｉ Ｔｏｋｋｙｏ Ｋｏｈｏ（１９９４），４４ ｐｐ．ＣＯＤＥＮ：ＪＫＸＸＡＦ ＪＰ ０６２９３７９０ Ａ２ １９９４１０２１ Ｈｅｉｓｅｉ．Ｐａｔｅｎｔ ｗｒｉｔｔｅｎ ｉｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ：ＪＰ ９３−８１９５５ １９９３０４０８．ＣＡＮ １２３：８３９４３ ＡＮ １９９５：６６２３３２．
（２）キシロース誘導体の合成
フェニル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド（５０）
Ｄ−キシロース（１０ｇ，０．０６ｍｏｌ）をピリジン（３０ｍＬ）に溶解させ、氷冷下、Ａｃ２Ｏ（３０ｍＬ）を加え室温で１２時間撹拌した。反応終了後、トルエンを加えて減圧濃縮し、化合物５０（１７．６ｇ，０．０６ｍｏｌ）を定量的に得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．４２．
フェニル２，３，４−トリ−Ｏ−のアセチル−１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド（５１）
化合物５０（２３ｇ，０．０７ｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶解させ、ＰｈＳＨ（８．２ｍＬ，０．０８ｍｏｌ）とＢＦ３Ｅｔ２Ｏ（１８．３ｍＬ，０．１４ｍｏｌ）を窒素気流下で氷冷しながら加え、２時間攪拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製し、化合物５１（２２ｇ，０．０６４ｍｏｌ）を８３％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．５０．
フェニル１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド（５２）
化合物５１（２２ｇ，０．０６ｍｏｌ）をメタノール（５０ｍＬ）に溶解させ０．５Ｍ ＣＨ３ＯＮａ／メタノール（０．５ｍＬ）を加え、１時間攪拌した。反応終了後、イオン交換樹脂を加え中性に戻し、ｐＨ試験紙で確認後、ろ過をした。得られたろ液を減圧濃縮し、化合物５２（１４ｇ，０．０６ｍｏｌ）を定量的に得た。ＴＬＣ ＣＨ２Ｃｌ２：メタノールｔ＝４：１ Ｒｆ＝０．４９．
フェニル３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド（５３），フェニル２，４−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド（５４），及びフェニル２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド（５５）
化合物５２（３００ｍｇ，１．２ｍｍｏｌ）をトルエン（１０ｍＬ）に溶解させ、Ｂｕ２ＳｎＯ（３４０ｍｇ，１．３ｍｍｏｌ）を加え、３時間加熱還流した後、減圧濃縮した。得られた残渣をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶かし、ＣｓＦ（９００ｍｇ，７．２ｍｍｏｌ）とＢｎＢｒ（８００μＬ，７．２ｍｍｏｌ）を加え２時間攪拌した。反応終了後、酢酸エチルで抽出し、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１０：１）で精製し、化合物５３（１８０ｍｇ，３６．１％）、５４（２５０ｍｇ，５０．１％）、５５（２６ｍｇ，５．３％）が得られた。
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（５３）：ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝２：１ Ｒｆ＝０．７３．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：７．５１−７．２３（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝４．７Ｈｚ，Ｈ−１），４．７９，４．７５，４．６４，４．６０（４Ｈ，ｄ．ベンジル メチレン ｘ ２），４．４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ４，５ａ＝１１．９Ｈｚ，Ｊ５ａ５ｂ＝１１．９Ｈｚ，Ｈ−５ａ），３．７１（１Ｈ，ｔ，Ｊ２，３＝４．９Ｈｚ，Ｈ−２），３．６４（１Ｈ，ｑ，Ｈ−４），３．５１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ４，５ｂ＝５．２Ｈｚ，Ｊ５ａ，５ｂ＝１１．５Ｈｚ，Ｈ−５ｂ），３．１０（１Ｈ，ｄ，Ｈ−３）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：８６．７，７７．８，７３．５，７３．４，７１．９，６８．０，６５．４，６４．７．
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（５４）：ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝２：１ Ｒｆ＝０．７９．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：７．５４−７．２１（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），４．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝６．２Ｈｚ，Ｈ−１），４．８３，４．７６，４．６５，４．６１（４Ｈ，ｄ，ベンジルメチレン ｘ ２），４．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ４，５ａ＝１１．８Ｈｚ，Ｊ５ａ，５ｂ＝３．１Ｈｚ，Ｈ−５ａ），３．７２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９０Ｈｚ，Ｈ−２），３．６２（１Ｈ，ｔ，Ｊ３，４＝６．１Ｈｚ，Ｈ−３），３．５８（１Ｈ，ｑ，Ｈ−４），３．５７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ４，５ｂ＝６．０Ｈｚ，Ｊ５ａ，５ｂ＝２．９Ｈｚ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：８８．１，８０．４，７７．９，７７．３，７６．７，７５．２，７３．１，６７．５．
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（５５）：ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝２：１ Ｒｆ＝０．７５．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：７．５４−７．２１（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），４．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝５．１Ｈｚ），４．９２，４．７４，４．６８，４．６１（４Ｈ，ｄ，ベンジルメチレン ｘ ２），４．０４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ４，５ａ＝５．０Ｈｚ，Ｊ５ａ，５ｂ＝１１．６Ｈｚ，Ｈ−５ａ），３．７２（１Ｈ，ｔ，Ｊ２，３＝８．８Ｈｚ，Ｈ−２），３．５１（１Ｈ，ｑ，Ｈ−４），３．３０（１Ｈ，ｔ，Ｊ３，４＝９．３Ｈｚ，Ｈ−３），３．２０（１Ｈ，ｔ，Ｊ５ａ，５ｂ＝１１．１Ｈｚ，Ｈ−５ｂ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：８８．９，７９．２，７５．９，７３．９，７２．４，７０．８．
Ｌｅｅ，Ｅ．；Ｂｒｕｚｚｉ，Ａ．；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｅ．；Ｏ’Ｃｏｌｌａ，Ｐ．Ｓ．（１９７９）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．７１，３３１−４．
Ｌｏｐｅｚ，Ｒ．；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍａｙｏｒａｌａｓ，Ａ．（１９９４）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９，７３７−４５．
（３）フコース誘導体の合成
１，２，３，４，６−ペンタ−Ｏ−アセチルβ−Ｌ−フコピラノシド（５６）
Ｌ−フコース（１０ｇ，０．０６ｍｏｌ）をピリジン（３０ｍＬ）に溶解させ、氷冷下、Ａｃ２Ｏ（３０ｍＬ）を加え室温で１２時間撹拌した。反応終了後、トルエンを加えて減圧濃縮し、化合物５６（１７．６ｇ，０．０６ｍｏｌ）を定量的に得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．４２．
フェニル２，３，４，６−ｔｅｒｔａ−Ｏ−アセチル−１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド（５７）
化合物５６（２２ｇ，０．０７６ｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）に溶解させ、ＰｈＳＨ（８．６ｍＬ，０．０８３ｍｏｌ）とＢＦ３Ｅｔ２Ｏ（１９．３ｍＬ，０．１５２ｍｏｌ）を窒素気流下で氷冷しながら加え、２時間攪拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、化合物５７（２２ｇ，０．０６４ｍｏｌ）を８５％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．５０．
フェニル１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド（５８）
化合物５７（１８ｇ，０．０４７ｍｏｌ）をメタノール（５０ｍＬ）に溶解させ、ナトリウムメトキシド／メタノールを加え、１時間攪拌した。反応終了後、イオン交換樹脂を加え中性に戻し、ｐＨ試験紙で確認後、ろ過をした。得られたろ液を減圧濃縮し、化合物５８（１２ｇ，０．０４７ｍｏｌ）を定量的に得た。ＴＬＣ ＣＨ２Ｃｌ２：メタノールｔ＝４：１ Ｒｆ＝０．４９．
フェニル３，４−Ｏ−ベンジリデン−１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド（５９）
化合物５８（２．０ｇ，５．９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（７．０ｍＬ）に溶解させ、ベンズアルデヒドジメチルアセタール（１．３３ｍＬ，８．９ｍｍｏｌ）とＴｓＯＨ（１１２ｍｇ，０．５９ｍｍｏｌ）を加え、４５℃で１時間攪拌した。反応終了後、トリエチルアミンで中和し、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で精製し，化合物５９（１．８４ｇ（ａ，ｂ ｍｉｘｔｕｒｅ），５．１ｍｍｏｌ）を８７％の収率で得た。
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ５９ａ：ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．５２．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５４−７．２６（１０Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ２），６．１９（１Ｈ，ｓ，ベンジリデンメチン），５．１７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，Ｈ−２），４．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，Ｈ−１），４．４８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，Ｈ−４），４．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，Ｈ−３），３．８７（１Ｈ，ｑ，Ｈ−５），１．３８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｈ−６）．
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ５９ｂ：ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．４９．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．８９−７．２７（１０Ｈ，ｍ，Ｐｈｘ２），５．８９（１Ｈ，ｓ，ベンジリデンメチン），５．０６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，Ｈ−２），４．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，Ｈ−１），４．３６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，Ｈ−４），４．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−３），３．９８（１Ｈ，ｑ，Ｈ−５），１．３８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，Ｈ−６）．
フェニル２−Ｏ−ベンジル−３，４−Ｏ−ベンジリデン−１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド（６０）
化合物５９（１．１ｇ（ａ，ｂ ｍｉｘｔｕｒｅ），３．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解させ、ＢｎＢｒ（７６０μＬ，６．１ｍｍｏｌ）を加え、氷冷しながらＮａＨ（８．８ｍｇ，０．６１ｍｍｏｌ）を加え、１．５時間攪拌した。反応終了後、酢酸エチルで抽出し、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製し、化合物６０（７８３ｍｇ（ａ，ｂ ｍｉｘｔｕｒｅ），１．７４ｍｍｏｌ）を５８％の収率で得た。
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ６０ａ：１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５９−７．２２（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．９９（１Ｈ，ｓ，ベンジリデンメチン），４．８８，４．７８（２Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，ベンジルメチレン），４．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，Ｈ−１），４．５５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ−４），４．０７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈ−３），３．７７（１Ｈ，ｑ，Ｈ−５），３．６４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，Ｈ−２），１．４１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｈ−６）．
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ６０ｂ：１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５８−７．２２（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．８９（１Ｈ，ｓ，ベンジリデンメチン），４．７３，４．５６（２Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，ベンジルメチレン），４．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，Ｈ−１），４．３７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−４），４．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，Ｈ−３），３．９１（１Ｈ，ｑ，Ｈ−５），３．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，Ｈ−２），１．４６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｈ−６）．
フェニル２，３−ｄｉ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド（６１）及びフェニル２，４−ｄｉ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド（６２）
化合物６０（９０ｍｇ（６０ａ，ｂ ｍｉｘｔｕｒｅ），０．０２１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１．４ｍＬ）に溶解させ、ＭＳ３Ａ（５００ｍｇ）を加え、窒素気流下でＮａＢＨ３ＣＮ／ＴＨＦ（１１０ｍＬ，０．１７ｍｍｏｌ）を加え、２時間攪拌し、ＨＣｌ／ジエチルエーテル（５．０ｍＬ）を加えた。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製し、化合物６１（４５ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ，５０％）、６２（２５ｍｇ，０．００６ｍｍｏｌ，２７％）をで得た。
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ６１：ＴＬＣヘキサン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．８９．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５９−７．１５（２０Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ４），４．８５，４．７５，４．７０，４．６１（６Ｈ，ｅａｃｈ，ｄ，ベンジルメチレン ｘ ２），４．６１（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１），３．８１（１Ｈ，ｔ，Ｈ−４），３．６９（１Ｈ，ｔ，Ｊ２−３＝９．２４Ｈｚ，Ｈ−２），３．５９−３．１２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−５），１．３６（３Ｈ，ｄ，Ｊ６−５＝６．３Ｈｚ，Ｈ−６），５．２７（１Ｈ，ｓ，ＯＨ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ８７．５（Ｃ−１），８２．８（Ｃ−３），７７．５（Ｃ−５），７６．５（Ｃ−２），７４．２（Ｃ−５），１６．９（Ｃ−６）．
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ６２：１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５８−７．１８（２０Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ４），４．８９，４．７６，４．７２，４．６１（６Ｈ，ｅａｃｈ，ｄ，ベンジルメチレン ｘ ２），４．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝８．５Ｈｚ，Ｈ−１），３．７０−３．６３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−４），３．５９−３．５２（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−５），１．３６（３Ｈ，ｄ，Ｊ６−５＝６．３，Ｈ−６），５．２６（１Ｈ，ｓ，ＯＨ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ８７．１（Ｃ−１），７９．３（Ｃ−３），７７．９（Ｃ−５），７６．０（Ｃ−２），７４．５（Ｃ−５），１６．６（Ｃ−６）．
フェニル２−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド（６３）
化合物６０（２．７ｇ（ｍｉｘ），６．１ｍｍｏｌ）を酢酸（８０ｍＬ）に溶解させ、その後に水（２０ｍＬ）を１滴ずつ加え、４５℃で５時間撹拌した。反応終了後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：メタノール＝１００：１）で精製し、化合物６３（１．９ｇ，５．６ｍｍｏｌ）を９１％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．２２．
フェニル２，３−ｄｉ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド（６１）
化合物６３（１．９ｇ，５．６ｍｍｏｌ）をトルエン（３０ｍＬ）に溶解させ、Ｂｕ２ＳｎＯ（１．６６ｇ，６．６ｍｍｏｌ）を加え、３時間加熱還流した後、減圧濃縮した。得られた残渣をＤＭＦ（３０ｍＬ）に溶かし、ＣｓＦ １．１ｇ，６．６ｍｍｏｌ）とＢｎＢｒ（８２０μＬ，６．６ｍｍｏｌ）を加え３時間攪拌した。反応終了後、酢酸エチルで抽出し、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１０：１）で精製し、化合物６１（１．９ｇ，２．４ｍｍｏｌ）を８９％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．５１．
フェニル２，３−ｄｉ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−スクシノイル−１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド（６４）
化合物６１（４９２ｍｇ，１．１３ｍｍｏｌ）をピリジン（５．０ｍＬ）、ＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）に溶解させ、ＤＭＡＰ ２７８ｍｇ，２．２５ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（２２５ｍｇ，２．２５ｍｍｏｌ）を加えて室温で１２時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＨＣｌで洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、化合物６４（５５６ｍｇ，１．０２ｍｍｏｌ）を９２％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝２：１ Ｒｆ＝０．３２．１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５９−７．２５（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．３８（１Ｈ，ｄ，Ｈ−４），４．６３（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１），４．７８，４．７４，４．７１，４．５０（４Ｈ，ｅａｃｈ，ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ２），３．７０−３．３１（３Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−３，Ｈ−５），２．７４（４Ｈ，ｍ，ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ），１．２４（３Ｈ，ｄ，Ｊ６−５＝６．３Ｈｚ，Ｈ−６）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１７７．５（ＣＯ），１７１．８（ＣＯ），８７．４（Ｃ−１），７０．２（Ｃ−４），１６．８（Ｃ−６），８１．１，７６．３，７１．８．
Ｌｅｅ，Ｅ．；Ｂｒｕｚｚｉ，Ａ．；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｅ．；Ｏ’Ｃｏｌｌａ，Ｐ．Ｓ．（１９７９）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．７１，３３１−４．
Ｌｏｐｅｚ，Ｒ．；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍａｙｏｒａｌａｓ，Ａ．（１９９４）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９，７３７−４５．
（４）ガラクトサミン誘導体の合成
フェニル２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２）
化合物１（１．０ｇ，２．６ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）溶液にＰｈＳＨ（０．２ｍｌ，２．６ｍｍｏｌ）、ＳｎＣｌ４（０．２ｍｌ，１．７ｍｍｏｌ）を加え外温５０℃で一晩還流した。室温に戻し酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え酢酸エチル抽出し、Ｈ２Ｏで洗いＭｇＳＯ４で脱水し溶媒留去した。得られた結晶を酢酸エチル−ヘキサンを用いて再結晶し化合物２（０．５３ｇ，４６．９％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５３−７．５０（ｍ，２Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｈ），７．３０−７．２８（ｍ，３Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｈ），５．７４（ｂｒ．ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，ＮＨ），５．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，Ｈ−４），５．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．３，１０．７Ｈｚ，Ｈ−３），４．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，Ｈ−１），４．２６−４．０８（ｍ，３Ｈ，Ｈ−２ ａｎｄ Ｈ−６），３．９５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｈ−５），２．１３，２．０３，１．９９，１．９７（ｅａｃｈ ３Ｈ，ｓ，ＣＯＣＨ３）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ８７．０６（Ｃ−１），７４．３９（Ｃ−５），７１．０７（Ｃ−３），６６．９６（Ｃ−４），６１．８５（Ｃ−６），４９．７４（Ｃ−２），２３．３６，２０．６１（ＣＨ３）．
フェニル ２−アジド−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（３）
飽和水酸化バリウム水溶液（１５０ｍｌ）に化合物２（１．０ｇ，２．４ｍｍｏｌ）を加え外温１２０℃で２４時間還流した後、ＣＯ２ガスをｂｕｂｂｌｉｎｇしガラスフィルターろ過しろ液を溶媒留去した。残さをメタノール（５０ｍｌ）に溶解し、ＤＭＡＰ（０．３２ｇ，２．６ｍｍｏｌ），０．４Ｍ ＴｆＮ３ ＣＨ２Ｃｌ２溶液（１５ｍｌ，０．６ｍｍｏｌ）を加え窒素気流下２日間室温で撹拌し溶媒留去した。残さをシカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２０ｇ）に付し、酢酸エチル溶出部より化合物３（０．９２ｇ，ｑｕａｎｔ．ｉｎ ２ｓｔｅｐｓ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ７．５９−７．５５（ｍ，２Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｈ），７．３３−７．２６（ｍ，３Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｈ），４．５１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，Ｈ−１），３．８５（ｂｒ．ｓ，１Ｈ，Ｈ−４），３．７７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５，１１．３Ｈｚ，Ｈ−６），３．７０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０，１１．３Ｈｚ，Ｈ−６），３．５４−３．４９（ｍ，３Ｈ，Ｈ−２，３ ａｎｄ ５Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ８８．１２（Ｃ−１），８０．６４（Ｃ−３），７５．２２（Ｃ−５），６９．７２（Ｃ−４），６４．５２（Ｃ−２），６２．７４（Ｃ−６）．
フェニル ２−アジド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（４）
化合物３（３７ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍｌ）溶液にベンズアルデヒドジメチルアセタール（４０μｌ，０．２７ｍｍｏｌ）ＣＳＡ（ミクロスパーテル１杯）を加え外温６０℃にて３時間撹拌した。氷冷した飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に反応液を注ぎ、酢酸エチル抽出し、ｂｒｉｎｅで洗い、ＭｇＳＯ４で脱水し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ）に付し、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１溶出部より化合物４（４７ｍｇ，９７．６％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ５．５１（ｓ，１Ｈ，ＣＨＰｈ），４．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，Ｈ−１），４．３７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０，１２．５Ｈｚ，Ｈ−６），４．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，Ｈ−４），４．００（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８，１２．６Ｈｚ，Ｈ−６），３．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，Ｈ−２）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１０１．３１（ＣＨＰｈ），８５．０７（Ｃ−１），７４．４１（Ｃ−４），７３．０８（Ｃ−３ ｏｒ Ｃ−５），６９．８２（Ｃ−３ ｏｒ Ｃ−５），６９．１５（Ｃ−６），６２．０３（Ｃ−２）．
フェニル ２−アジド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（５）
化合物４（０．３８ｇ，０．９９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（８ｍｌ）溶液に６０％ＮａＨ（５１ｍｇ，１．２８ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間撹拌後ＰＭＢＣｌ（１５０μｌ，１．１ｍｍｏｌ）を加え室温で一晩撹拌した。氷を加えた後酢酸エチル抽出し、ｂｒｉｎｅで洗いＭｇＳＯ４で脱水し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ）に付しｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１溶出部より化合物５（０．３５ｇ，７０．８％）、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１溶出部より化合物４（０．９ｇ，２３．１％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ５．４６（ｓ，１Ｈ，ＣＨＰｈ），４．６４（ｓ，２Ｈ，ベンジルメチレン），４．３９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，Ｈ−１），４．３５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５，１２．２Ｈｚ，Ｈ−６），４．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，Ｈ−４），３．９７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５，１２．２Ｈｚ，Ｈ−６），３．８０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，Ｈ−２），３．８０（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３），３．４４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．３，９．４Ｈｚ，Ｈ−３），３．３７（ｂｒ．ｓ，１Ｈ，Ｈ−５）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１０１．０６（ＣＨＰｈ），８５．１４（Ｃ−１），７９．０８（Ｃ−３），７２．０９（Ｃ−４），７１．１２（ベンジルメチレン），６９．８１（Ｃ−５），６９．２６（Ｃ−６），５９．７３（Ｃ−２），５５．１８（ＣＨ３）．
フェニル ２−アジド−２−デオキシ−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（６）
化合物５（０．１７ｇ，０．３０ｍｍｏｌ）を９０％酢酸水溶液に溶解し外温５０℃で４時間撹拌し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ）に付し、トルエン：酢酸エチル＝９：１溶出部より化合物５（０．１３ｇ，７．３％），トルエン：酢酸エチル＝１：１溶出部より化合物６（０．１０ｇ，８４．９％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ４．６３（ｓ，２Ｈ，ベンジルメチレン），４．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，Ｈ−１），４．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｈ−４），３．９５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，Ｈ−６），３．８１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），３．６２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，Ｈ−２），３．４６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，Ｈ−５），３．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０，９．５Ｈｚ，Ｈ−３）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８６．１９（Ｃ−１），８０．５５（Ｃ−３），７８．１５（Ｃ−５），７１．７７（ベンジルメチレン），６６．０３（Ｃ−３），６２．６３（Ｃ−６），６０．９２（Ｃ−２）．
フェニル ２−アジド−４，６−ジ−Ｏ−のベンジル−２−デオキシ−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（７）
化合物６（０．１９ｇ，０．４５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４ｍｌ）溶液に６０％ＮａＨ（０．０９ｇ，２．２ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間撹拌後ＢｎＢｒ（２６０μｌ，２．２ｍｍｏｌ）を加え室温で一晩撹拌した。氷を加え酢酸エチル希釈し、Ｈ２Ｏ，ｂｒｉｎｅで洗いＭｇＳＯ４で脱水し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ）に付しｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１溶出部より化合物７（０．１７ｇ，６３．４％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ４．８７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，ベンジルメチレン），４．６６−４．３５（ｍ，５Ｈ，ベンジルメチレン），４．３９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，Ｈ−１），３．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，Ｈ−４），３．８１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，Ｈ−２），３．７７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），３．６４−６．６１（ｍ，２Ｈ，Ｈ−６），３．５７−３．５２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５），３．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，９．８Ｈｚ，Ｈ−３）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８６．３１（Ｃ−１），８２．０５（Ｃ−３），７７．３２（Ｃ−５），７４．３２ ７３．５０ ａｎｄ ７１．９９（ベンジルメチレン），７２．１３（Ｃ−４），６８．４８（Ｃ−６），６１．４０（Ｃ−２），５５．１９（ＣＨ３）．
フェニル ２−アジド−４，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（８）
化合物８（０．１６ｇ，０．２７ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２−Ｈ２Ｏ（１９：１，２ｍｌ）に溶解し氷冷下ＤＤＱ（０．０７ｇ，０．３２ｍｍｏｌ）を加え室温で２時間撹拌し、セライトろ過し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ）に付しトルエン：酢酸エチル＝９：１溶出部より化合物８（０．１０ｇ，８０．７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ４．６９（ｓ，２Ｈ，ベンジルメチレン），４．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，ベンジルメチレン），４．４８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，ベンジルメチレン），４．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，Ｈ−１），３．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，Ｈ−４），３．７３−３．６６（ｍ，３Ｈ），３．５８−３．５５（ｍ，２Ｈ），２．２４（ｂｒ．ｓ，１Ｈ，３−ＯＨ）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ８５．４０（Ｃ−１），７７．３６（Ｃ−３ ｏｒ Ｃ−５），７５．２５（Ｃ−４），７４．３０（Ｃ−３ ｏｒ Ｃ−５），７４．９９ ａｎｄ ７３．５０（ベンジルメチレン），６８．１４（Ｃ−６），６３．３３（Ｃ−２）．
フェニル ２−アジド−３−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（９）
化合物４（０．５８ｇ，１．５０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液に６０％ＮａＨ（０．１０ｇ，２．４ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間撹拌後ＢｎＢｒ（０．２６μｌ，２．１ｍｍｏｌ）を加え室温で一晩撹拌した。氷を加えた後酢酸エチル抽出し、ｂｒｉｎｅで洗いＭｇＳＯ４で脱水し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２０ｇ）に付しｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１溶出部より化合物９（０．５５ｇ，７７．２％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ５．４３（ｓ，１Ｈ，ＣＨＰｈ），４．６８（ｓ，２Ｈ，ベンジルメチレン），４．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，Ｈ−１），４．３２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．１，１２．５Ｈｚ，Ｈ−６），４．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，Ｈ−４），３．９３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５，１２．５Ｈｚ，Ｈ−６），３．７９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，Ｈ−２），３．４３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．１，９．６Ｈｚ，Ｈ−３），３．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝０．８Ｈｚ，Ｈ−５）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣ３）δ１０１．０３（ＣＨＰｈ），８５．１０（Ｃ−１），７９．４６（Ｃ−３），７１．９９（Ｃ−４），７１．４８（ベンジルメチレン），６９．７４（Ｃ−５），６９．２４（Ｃ−６），５９．７３（Ｃ−２）
Ｈｏｒｔｏｎ，Ｄ．；Ｒｏｄｅｍｅｙｅｒ，Ｇ．；Ｓａｅｋｉ，Ｈ．（１９７７）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．５９，６０７−１１．
Ｍｉｙａｊｉｍａ，Ｋ．；Ｎｅｋａｄｏ，Ｔ．；Ｉｋｅｄａ，Ｋ．；Ａｃｈｉｗａ，Ｋ．（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４６，１６７６−１６８２．
Ｍｕｋａｉｙａｍａ，Ｔ．；Ｉｋｅｇａｉ，Ｋ．；Ｊｏｎａ，Ｈ．；Ｈａｓｈｉｈａｙａｔａ，Ｔ．；Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｋ．（２００１）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８４０−８４１．
（５）グルコース誘導体の合成
フェニル ４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（２）
化合物１（１２０ｍｇ，０．３３ｍｍｏｌ）のｔｏｌｕｅｎｅ（４ｍｌ）溶液にＢｕ２ＳｎＯ（８５ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）を加え窒素雰囲気下、外温１５０℃で３時間ｒｅｆｌｕｘし溶媒留去した。残さをＤＭＦ（３．３ｍｌ）に溶解しＰＭＢＣｌ（５４μｌ，４１ｍｍｏｌ）、ＣｓＦ（６４ｍｇ，４２ｍｍｏｌ）を加え室温で一晩撹拌した。ＡｃＯＥｔ抽出し、ｂｒｉｎｅで洗いＮａ２ＳＯ４で脱水し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１１ｇ）に付しＴｏｌｕｅｎｅ／ＡｃＯＥｔ＝２０／１溶出部より化合物２（１１０ｍｇ，７５％）を得た。
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．５３−６．８２（ｍ，１４Ｈ，Ｐｈ，ＳＰｈ，ＰＭＢ），５．５５（ｓ，１Ｈ，ＣＨＰｈ），４．８７（ｄ，１Ｈ，ｂｅｎｚｙｌｍｅｔｈｌｅｎｅ），４．７１（ｄ，１Ｈ，ｂｅｎｚｙｌｍｅｔｈｌｅｎｅ），４．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝９．７Ｈｚ，Ｈ−１），４．３７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ５，６’＝５．０Ｈｚ，Ｊ６．６’＝１０．５Ｈｚ，Ｈ−６’），３．７９−３．７５（ｍ，４Ｈ，Ｊ６，６’＝１０．５Ｈｚ，Ｈ−６，ＣＨ３），３．６７−３．６０（ｍ，２Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−４），３．５０−３．４６（ｍ，２Ｈ，Ｊ１，２＝９．７Ｈｚ，Ｈ−２，Ｊ５，６’＝１０．５Ｈｚ，Ｈ−５）；１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）１５９．４５，１３７．３０，１３３．１９，１３１．４７，１２９．８３，１２９．０５，１２８．３４，１２８．２９，１２６．０７，１１３．９５（ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｃ），１０１．２９（ＣＨＰｈ），８８．４５（Ｃ−１），８１．３０，８１．１７，７４．４８（ｂｅｎｚｙｌｍｅｔｈｙｌｅｎｅ），７２．２５（Ｃ−２），７０．７９（Ｃ−５），６８．６７（Ｃ−６），５５．２８（ＣＨ３）．
フェニル ３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（３）
化合物２（７８ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）の９０％ＡｃＯＨ水溶液に溶解し外温５０℃で３時間撹拌し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ）に付しＴｏｌｕｅｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝１：１溶出部より化合物３（５６ｍｇ，８８％）を得た。
１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）７．５３−６．８６（ｍ，９Ｈ，ＳＰｈ，ＰＭＢ），４．８５（ｄ，１Ｈ，ｂｅｎｚｙｌｍｅｔｈｌｅｎｅ），４．６８（ｄ，１Ｈ，ｂｅｎｚｙｌｍｅｔｈｌｅｎｅ），４．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝９．７Ｈｚ，Ｈ−１），３．８５−３．６２（ｍ，５Ｈ，Ｈ−６’，Ｈ−６，ＣＨ３），３．３３−３．２６（ｍ，４Ｈ，Ｈ−２，Ｈ−３，Ｈ−４，Ｈ−５），２．５９（ｓ，２Ｈ，ＯＨ）；１３ＣＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）１３２．７１，１３０．７３，１２９．８６，１２８．３１，１１４．５７（ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｃ），８９．６３（Ｃ−１），８７．５６，８２．０４，７５．９６，７３．９１，７１．２１，６２．８１（Ｃ−６），５５．６７（ＣＨ３）
フェニル ２，４，６−ｔｒｉ−Ｏ−ベンジル−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（４）
化合物３（０．６３ｍｇ，１．６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍｌ）溶液に６０％ＮａＨ（０．２１ｍｇ，５．２ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間撹拌後ＢｎＢｒ（０．７ｍｌ，５．７ｍｍｏｌ）を加え一晩撹拌した。氷を加えた後ＡｃＯＥｔ抽出し、ｂｒｉｎｅで洗いＭｇＳＯ４で脱水し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル４０ｇ）に付しＡｃＯＥｔ：Ｈｅｘ＝１：５溶出部より化合物４（０．８７ｍｇ，８２％）を得た。
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．６２−６．８２（ｍ，２４Ｈ，Ｐｈ，ＳＰｈ，ＰＭＢ），４．９２−４．５２（ｍ，９Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）３．７６−３．４８（ｍ，５Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）１５９．１９，１３８．２４，１３８．０６，１３３．７６，１３１．８６，１３０．４９，１２９．４３，１２８．８１，１２８．３６，１２８．２７，１２８．０７，１２７．７８，１２７．７１，１２７．５７，１２７．４８，１２７．３３，１２６．９９，１２６．８６，１１３．８０（ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｃ），８７．３５（Ｃ−１），８６．４０，８０．７９，７９．０３，７６．８２，７６．５３，７５．４５，７５．２９，７４．９２，７３．３２（ｂｅｎｚｙｌｍｅｔｈｙｌｅｎｅ），６８．９７（Ｃ−６），５５．１７（ＣＨ３）
フェニル ２，４，６−ｔｒｉ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（５）
化合物４（９３ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２−Ｈ２Ｏ（１９：１，１ｍｌ）に溶解し氷冷下ＤＤＱ（３４ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）を加え室温で２時間撹拌した。セライトろ過し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ）に付しＴｏｌｕｅｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝４９：１溶出部より化合物５（６８ｍｇ，８９％）を得た。
１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．５８−７．１５（ｍ，２０Ｈ，Ｐｈ，ＳＰｈ），４．９４−４．５０（ｍ，７Ｈ，Ｈ−１，ｂｅｎｚｙｌｍｅｔｈｌｅｎｅ），３．８５−３．６８（ｍ，３Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−６，Ｈ−６’），３．５６−３．４８（ｍ，２Ｈ，Ｈ−４，Ｈ−５），３．３６（ｔ，１Ｈ，Ｊ２，３＝Ｊ３，４＝９．０Ｈｚ，Ｈ−３）；１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）１３８．２０，１３８．０６，１３３．８０，１３１．７３，１３１．６１，１２８．９９，１２８．８６，１２８．７３，１２８．５４，１２８．４３，１２８．２８，１２８．１６，１２７．９８，１２７．８９，１２７．７８，１２７．６６，１２７．５３，１２７．３７（ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｃ），８７．０１（Ｃ−１），８０．５８（Ｃ−２），７８．７６，７８．５８（Ｃ−３），７７．３４，７５．０４，７４．５６，７３．３７（ｂｅｎｚｙｌｍｅｔｈｙｌｅｎｅ），６９．０４（Ｃ−６）
Ｐｆａｅｆｆｌｉ，Ｐ．Ｊ．；Ｈｉｘｓｏｎ，Ｓ．Ｈ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．（１９７２）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２３１，１９５−２０６．
Ｍｏｔａｗｉａ，Ｍ．Ｓ．；Ｏｌｓｅｎ，Ｃ．Ｅ．；Ｅｎｅｖｏｌｄｓｅｎ，Ｋ．；Ｍａｒｃｕｓｓｅｎ，Ｊ．；Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ｂ．Ｌ．（１９９５）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２７７，１０９−２３．
Ｂｏｕｓｑｕｅｔ，Ｅ．；Ｋｈｉｔｒｉ，Ｍ．；Ｌａｙ，Ｌ．；Ｎｉｃｏｔｒａ，Ｆ．；Ｐａｎｚａ，Ｌ．；Ｒｕｓｓｏ，Ｇ．（１９９８）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３１１，１７１−１８１．
Ｅｎｎｉｓ，Ｓ．Ｃ．；Ｃｕｍｐｓｔｅｙ，Ｉ．；Ｆａｉｒｂａｎｋｓ，Ａ．Ｊ．；Ｂｕｔｔｅｒｓ，Ｔ．Ｄ．；Ｍａｃｋｅｅｎ，Ｍ．；Ｗｏｒｍａｌｄ，Ｍ．Ｒ．（２００２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５８，９４０３−９４１１．
Ｇｏｒｄｏｎ，Ｄ．Ｍ．；Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ，Ｓ．Ｊ．（１９９０）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２０６，３６１−６
Ｍｉｃｈｅｅｌ，Ｆ．；Ｋｒｅｕｔｚｅｒ，Ｕ．（１９６９）Ｊｕｓｔｕｓ Ｌｉｅｂｉｇ．Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．７２２，２２８−３１．
Ｍｕｋａｉｙａｍａ，Ｔ．；Ｃｈｉｂａ，Ｈ．；Ｆｕｎａｓａｋａ，Ｓ．（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．３９２−３９３．
（６）グルコサミン誘導体の合成
フェニル ２−アジド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（２）
化合物１（９０ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２．５ｍｌ）溶液に６０％ＮａＨ（１８ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間撹拌後ＰＭＢＣｌ（３８μｌ，０．２８ｍｍｏｌ）を加え１時間撹拌した。氷を加えた後酢酸エチル抽出し、ｂｒｉｎｅで洗いＮａ２ＳＯ４で脱水し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル７０ｇ）に付しトルエン溶出部より化合物２（９８ｍｇ，８３％）を得た。
化合物２：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．５６−７．２５（ｍ，１４Ｈ，Ｐｈ，ＳＰｈ，ＰＭＢ），５．５６（ｓ，１Ｈ，ＣＨＰｈ），４．８３（ｄ，１Ｈ，ベンジルメチレン），４．７２（ｄ，１Ｈ，ベンジルメチレン），４．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝１０．２Ｈｚ，Ｈ−１），４．３８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ５，６’＝５．０Ｈｚ，Ｊ６，６’＝１０．５Ｈｚ，Ｈ−６’），３．８０−３．７６（ｍ，４Ｈ，Ｊ６，６’＝１０．５Ｈｚ，Ｈ−６，ＣＨ３），３．６５−３．５９（ｍ，２Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−４），３．４５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５），３．３４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１，２＝１０．２Ｈｚ，Ｊ２，３＝８．７Ｈｚ，Ｈ−２）．１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１５９．５４，１３７．１３，１３３．９７，１３０．６３，１３０．０６，１２９．７０，１２９．１３，１２８．７５，１２８．３２，１２６．００，１１３．８９（ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｃ），１０１．３０（ＣＨＰｈ），８６．６１（Ｃ−１），８１．３４（Ｃ−３），８０．５８（Ｃ−４），７４．８５（ベンジルメチレン），７０．５５（Ｃ−５），６８．５３（Ｃ−６），６４．６７（Ｃ−２），５５．２８（ＣＨ３）．
フェニル ２−アジド−２−デオキシ−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（３）
化合物２（０．２１ｇ，０．４２ｍｍｏｌ）の９０％水溶液に溶解し外温５０℃で３時間撹拌し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１８ｇ）に付しトルエン：酢酸エチル＝１：１溶出部より化合物３（０．１２ｇ，６７％）を得た。
化合物３：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．５３−６．８６（ｍ，９Ｈ，ＳＰｈ，ＰＭＢ），４．８５（ｄ，１Ｈ，ベンジルメチレン），４．６８（ｄ，１Ｈ，ベンジルメチレン），４．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝９．７Ｈｚ，Ｈ−１），３．８５−３．６２（ｍ，５Ｈ，Ｈ−６’，Ｈ−６，ＣＨ３），３．５１（ｔ，１Ｈ，Ｈ−３），３．３３−３．２６（ｍ，３Ｈ，Ｈ−２，Ｈ−４，Ｈ−５），２．５９（ｓ，２Ｈ，ＯＨ）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１５９．５４，１３３．１６，１３１．２６，１２９．８２，１２９．８０，１２９．０７，１２８．４０，１１４．０８（ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｃ），８６．３４（Ｃ−１），８４．２６（Ｃ−５），７９．４０（Ｃ−４），７５．０５（ベンジルメチレン），７０．０８（Ｃ−３），６４．８５（Ｃ−２），６２．２５（Ｃ−６），５５．２２（ＣＨ３）．
フェニル ２−アジド−４，６−ｄｉ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−３−Ｏ−ｐ−メトキシベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（４）
化合物３（９１ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２．２ｍｌ）溶液に６０％ＮａＨ（３４ｍｇ，０．５６ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間撹拌後ＢｎＢｒ（６１μｌ，０．５２ｍｍｏｌ）を加え３時間撹拌した。氷を加えた後酢酸エチル抽出し、ｂｒｉｎｅで洗いＮａ２ＳＯ４で脱水し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１２ｇ）に付しトルエン溶出部より化合物４（１００ｍｇ，８１％）を得た。
化合物４：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．６０−６．８２（ｍ，１９Ｈ，Ｐｈ，ＳＰｈ，ＰＭＢ），４．８１−４．５１（ｍ，６Ｈ，ベンジル ｍｅｔｈｌｅｎｅ），４．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝１０．１Ｈｚ，Ｈ−１），３．７７−３．７１（ｍ，５Ｈ，Ｈ−６，Ｈ−６’，ＣＨ３），３．５８（ｍ，１Ｈ，Ｊ２，３＝Ｊ３，４＝９．４Ｈｚ，Ｈ−３），３．５１−３．４４（ｍ，２Ｈ，Ｊ３，４＝９．４Ｈｚ，Ｈ−４，Ｈ−５），３．３２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１，２＝１０．１Ｈｚ，Ｊ２，３＝９．４Ｈｚ，Ｈ−２）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１５９．５５，１３８．３０，１３８．０２，１３３．７０，１３１．２７，１２９．９６，１２９．８７，１２９．０２，１２８．５１，１２８．４１，１２８．３８，１２７．９０，１２７．８２，１２７．６４，１２７．６０，１１４．００（ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｃ），８５．９５（Ｃ−１），８４．８０（Ｃ−４），７９．４４（Ｃ−５），７７．３７（Ｃ−３），７５．５７，７５．０３，７３．４８（ベンジル メチレン），６８．８４（Ｃ−２），６５．１４（Ｃ−６），５５．３０（ＣＨ３）．
フェニル ２−アジド−４，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（５）
化合物４（０．１０ｇ，０．１２ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２−Ｈ２Ｏ（１９：１，１．８ｍｌ）に溶解し氷冷下ＤＤＱ（０．０５ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）を加え室温で４時間撹拌した。セライトろ過し溶媒留去した。残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ）に付しトルエン溶出部より化合物５（０．０５ｇ，５８％）を得た。
化合物５：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．６１−７．２２（ｍ，１５Ｈ，Ｐｈ，ＳＰｈ），４．７１−４．５５（ｄ，４Ｈ，ベンジルメチレン），４．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝１０．１Ｈｚ，Ｈ−１），３．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ５，６’＝２．０Ｈｚ，Ｊ６，６’＝１１．０Ｈｚ，Ｈ−６’），３．７６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ５，６＝４．０Ｈｚ，Ｊ６，６’＝１１．０Ｈｚ，Ｈ−６），３．５９（ｔ，１Ｈ，Ｈ−３），３．５１（ｔ，１Ｈ，Ｈ−４），３．４５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５），３．２８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１，２＝１０．１Ｈｚ，Ｈ−２）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１３８．１５，１３７．９８，１３３．３９，１３１．４９，１２８．４０，１２８．２９，１２８．１２，１２８．００，１２７．６５（ａｒｏｍａｔｉｃ−Ｃ），８６．１０（Ｃ−１），７９．１１（Ｃ−５），７７．３４（Ｃ−３），７７．２６（Ｃ−４），７３．５３（ベンジルメチレン），６８．８１（Ｃ−６），６５．００（Ｃ−２）．
Ｂｅｎａｋｌｉ，Ｋ．；Ｚｈａ，Ｃ．；Ｋｅｒｎｓ，Ｒ．Ｊ．（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３，９４６１−９４６２．
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Ｍａｒｔｉｎ−Ｌｏｍａｓ，Ｍ．；Ｆｌｏｒｅｓ−Ｍｏｓｑｕｅｒａ，Ｍ．；Ｃｈｉａｒａ，Ｊ．Ｌ．（２０００）Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１５４７−１５６２．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｓ．；Ｋｕｚｕｈａｒａ，Ｈ．；Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｍ．（２００１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５７，６９１５−６９２６．
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（７）フェニル ２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（７０）
化合物６８（１．９ｇ，３．３ｍｍｏｌ）を酢酸（１２０ｍＬ）に溶解させ、その後に水（２４ｍＬ）を１滴ずつ加え、４５℃で４時間撹拌した。反応終了後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：メタノール＝２００：１）で精製し，化合物７０（１．３ｇ，２．７ｍｍｏｌ）を８１％の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝１：１ Ｒｆ＝０．２０．１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５２−７．２６（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），４．９７−４．６９（５Ｈ，ｍ，Ｈ−１，ベンジルメチレン ｘ ２），３．９１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−６ａ），３．７６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｈ−４），３．５９（１Ｈ，ｔ，Ｈ−６ｂ），３．５３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｈ−３），３．４８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，Ｈ−２），３．３４（１Ｈ，ｑ，Ｈ−５）．
フェニル ２，３−ジ−Ｏ−のベンジル−６−Ｏ−トリチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（７１）
化合物７０（６９６ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）をピリジン（６．０ｍＬ）に溶解させ、ＴｒＣｌ（８５８ｍｇ，３．１ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（１８８ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）を加え、５５℃で１２時間攪拌した。反応終了後、メタノールを加え、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝６：１）で精製し、化合物７１（１．２４ｇ，２．２ｍｍｏｌ）を７２％に得た。ＴＬＣヘキサン：酢酸エチル＝３：１ Ｒｆ＝０．４９．１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．６６−７．２１（３０Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ６），４．９８，４．８８，４．７６，４．７４（４Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ２），４．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，Ｈ−１），３．６５（１Ｈ，ｔ，），３．４８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，Ｈ−２），３．４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，Ｈ−６ａ），３．４１−３．１８（４Ｈ，ｍ，−３，Ｈ−４，Ｈ−５，Ｈ−６ｂ）．
フェニル ４−Ｏ−クロロアセチル−２，３−ｄｉ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（７２）
化合物７１（５５０ｍｇ，０．９７ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（７．２ｍＬ）、ピリジン（０．４ｍＬ）に溶解させ、氷冷下でクロロアセチルクロライド（１５４ｍＬ，１．９４ｍｍｏｌ）を加え、１２時間撹拌した。その後、メタノール（３．０ｍＬ）加えて反応を終了させ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＨＣｌ、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。得られた残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）、メタノール（２．５ｍＬ）に溶解させ、ＴｓＯＨ（３３ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）を加え室温で３時間攪拌した。反応終了後、トリエチルアミンで中性に戻し、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝６：１）で精製し、化合物７２（４４０ｍｇ，０．７８ｍｍｏｌ）を８８％（２ｓｔｅｐｓ）の収率で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．５１．１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５５−７．２２（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．００（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，Ｈ−４），４．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ１，２＝８．０Ｈｚ，Ｈ−１），４．８７，４．８３，４．７５，４．６５（４Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ２），３．７９−３．５８（５Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−６ａ，Ｈ−６ｂ，−ＯＣＨ２Ｃｌ），３．５３（１Ｈ，ｔ，Ｈ−２），３．４２（１Ｈ，ｑ，Ｈ−５）．
メチル（フェニル ４−Ｏ−クロロアセチル−２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド）ウロネート（７３）
化合物７２（３９０ｍｇ，０．７４ｍｍｏｌ）をアセトン（１０ｍＬ）に溶解させ、Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７（４０９ｍｇ，１．３９ｍｍｏｌ）、３．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４（１．６ｍＬ）を加えて、５５℃で１時間撹拌した後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出、ＭｇＳＯ４で脱水し、減圧濃縮した。この残渣をＨＣｌ−メタノール（２０ｍＬ）に溶解させ、室温で２時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝７：１）で精製し、化合物７３（４７４ｍｇ，０．４９ｍｍｏｌ）を６６％で得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．８０．１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．６１−７．２２（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），５．１８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，Ｈ−４），４．７０ １Ｈ，ｄ，Ｈ−１），４．９０，４．８３，４．７２，４．６４（４Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ２），３．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，−ＯＣＨ２Ｃｌ），３．８５−３．７１（３Ｈ，ｍ，Ｈ−４，Ｈ−５，−ＯＣＨ２Ｃｌ），３．７４（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ），３．６８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，Ｈ−３），３．５８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，Ｈ−２）．
メチル（フェニル ２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド）ウロネート（７４）
化合物７３（５００ｍｇ，０．９２ｍｍｏｌ）をピリジン（１０．３ｍＬ）、エタノール（１．７ｍＬ）に溶解させ、チオ尿素（７０．２ｍｇ，９．２ｍｍｏｌ）を加えて、８０℃で１時間撹拌した。反応終了後、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＨＣｌ、ＮａＨＣＯ３で洗浄、ＭｇＳＯ４で脱水した後、減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝３：１）で精製し、化合物７４（４２０ｍｇ，０．９２ｍｍｏｌ）を定量的に得た。ＴＬＣトルエン：酢酸エチル＝４：１ Ｒｆ＝０．５８．１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５８−７．２４（１５Ｈ，ｍ，Ｐｈ ｘ ３），４．７０（１Ｈ，ｄ，Ｈ−１），４．８９，４．８３，４．７２，４．６６（４Ｈ，ｅａｃｈ ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，ベンジルメチレン ｘ ２），３．８７（１Ｈ，Ｈ−４），３．８０（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ），３．５７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，Ｈ−３），３．５１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，Ｈ−２），３．０２（１Ｈ，ｄ，Ｈ−５）．１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１６９．５（Ｃ−６），８８．４（Ｃ−１），８５．２（Ｃ−３），７９．５（Ｃ−２），７７．２（Ｃ−５），７１．８（Ｃ−４），５２．８（ＯＣＨ３）．
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実施例２：拡散混合固相反応
本発明においては、必要かつ最小限の液量で樹脂を膨潤させて反応を行うことを特徴としている。樹脂を膨潤させるための液量については、前記表１等を参考にした。かつ、実際に秤量した一定量の樹脂に、これに使用する溶媒を滴下して樹脂ビーズ間の摩擦力が低下し「液状化」現象が生じる液量を確認し、決定した。
（１）アミノレジンへのカルボン酸化合物の導入（アミド化反応）
樹脂に結合したマンノシル供与体の拡散混合固相反応法による合成
フェニル ２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−スクシノイル−１−チオ−β−Ｄ−マンノピラノシド（２９５ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣ（１０８μＬ，０．６９ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）（７４．５ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）を溶解したＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍｌ）をＮｏｖａＳｙｎ ａｍｉｎｏ ＴＧ ｒｅｓｉｎ（５１１ｍｇ，１５．０μｍｏｌ ｌｏａｄｉｎｇ）に加え、室温で１４時間放置した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＤＭＦ、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。同一行程を２回繰り返し樹脂を減圧乾固した。Ａｃ２Ｏ（３．０ｍＬ）、ピリジン（３．０ｍＬ）を加え室温で１２時間放置した後、ＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固することでキャッピングを行い樹脂（５３０ｍｇ）を得た。
ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ｃｍ−１ １７３９．４（ＯＣ＝Ｏ），１６７１．９（ＮＨＣ＝Ｏ）．
収率の算出は、切り出し反応を行って決定した。樹脂（４９．０ｍｇ）をとりだし、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）で膨潤させ、０．５Ｍナトリウムメトキシド−メタノール（０．１ｍＬ）を加え室温で１時間放置した。その後、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ １２０Ｂ＋で中和し、吸引ろ過したろ液を減圧濃縮することでフェニル １−チオ−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノピラノシド（４．８ｍｇ，７．７μｍｏｌ，６２％）を得た。
樹脂に結合したフコシル供与体の拡散混合固相反応法による合成
フェニル ２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−スクシノイル−１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド（３１６ｍｇ，０．５９ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＣ（１３８μＬ，０．８８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（９６ｍｇ，０．７１ｍｍｏｌ）を溶解したＤＭＦ（６．０ｍｌ）をＮｏｖａＳｙｎ ａｍｉｎｏ ＴＧ ｒｅｓｉｎ（９８２ｍｇ，０．２９ｍｍｏｌ ｌｏａｄｉｎｇ）に加え、室温で４８時間放置した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。Ａｃ２Ｏ（３．０ｍＬ）、ピリジン（３．０ｍＬ）を加え室温で１２時間放置した後、ＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固することでキャッピングを行い樹脂（１．０５ｇ）が得られた。
ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ｃｍ−１ １７３９．４（ＯＣ＝Ｏ），１６７１．９（ＮＨＣ＝Ｏ）．
収率の算出は、切り出し反応を行って決定した。樹脂（３０．０ｍｇ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）で膨潤させ、０．５Ｍナトリウムメトキシド−メタノール（０．１ｍＬ）を加え、室温で２時間放置し、その後、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ １２０Ｂ＋で中和し、吸引ろ過したろ液を減圧濃縮し、フェニル ２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド（３．０ｍｇ，６．９μｍｏｌ，８５％）を得た。
（２）固相上でのチオグリコシド体のフルオリド体への拡散混合固相反応法による変換反応
樹脂に結合したＬ−フコピラノシルフルオライド
ＤＡＳＴ（２６ｍＬ，０．１９ｍｍｏｌ）、ＮＢＳ（３５ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ）をＣ２Ｈ４Ｃｌ２（１．５ｍＬ）に溶解し、樹脂の結合したフェニルチオ−Ｌ−フコピラノシド（３００ｍｇ，３５ｍｇ：ｆｕｃ）に−１５℃で加え１時間放置した後、１時間かけて０℃まで温度をあげ、０℃で８時間放置した。反応の進行は樹脂を一部取りだし、ＩＲで測定後、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）に加え、０．５Ｍナトリウムメトキシド（１０μＬ）を滴下して室温で１時間放置することで固相から切り出し、これをＴＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで観測した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。
ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ｃｍ−１ １７３７．５（ＯＣ＝Ｏ），１６７３．９（ＮＨＣ＝Ｏ），１０４１．４（Ｃ−Ｆ）．
（３）固相上でのグリコシルフルオリドの活性化によるグリコシル化反応
樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→６）−フェニル−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド
フェニル ２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２４．０ｍｇ，４４μｍｏｌ）をＥｔＣＮ（０．２５ｍＬ）に溶解し、ＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）を加え窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した。別にＡｇＯＴｆ（３３．８ｍｇ，０．１３２ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（０．２５ｍＬ）に溶解し、ＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）を加え窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した後、これにＣｐ２ＨｆＣｌ２（２５ｍｇ，０．０６６ｍｍｏｌ）を加え５分間攪拌した。これらを−１５℃で樹脂に結合したＬ−フコピラノシルフルオライド（１００ｍｇ，９．８ｍｇ：Ｆｕｃ）に加え、反応温度を１０℃まで徐々に上げた。反応の進行は樹脂を一部取りだし、ＩＲで測定後、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）に加え、０．５Ｍ ＮａＯＭｅ（１０μＬ）を滴下して室温で１時間放置することで固相から切り出し、これをＴＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで観測した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。
ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ｃｍ−１ １７３７．５（ＯＣ＝Ｏ），１６７３．９（ＮＨＣ＝Ｏ）．
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３３Ｈ３６Ｏ９：ｍ／ｚ ８６８．３ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ８９１［Ｍ＋Ｎａ］＋．
反応温度を−１５℃から１０℃へと徐々に変化させた場合の反応を行い、昇温率について検討した。結果を表２と図６〜図８に示す。
その結果、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの解析結果（図６〜図８）から、８．３℃／ｈでは脱離物（Ｆｗ：３１６）が僅かに存在していたのに対し、昇温率を下げるとグリコシル化反応が優先的に進行することが判明した。グリコシルフルオリドの活性化によるグリコシル化反応においては、このような昇温率を用いることができる。
（４）固相上でのチオグリコシドの活性化によるグリコシル化反応
樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→６）−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド
２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（２３．０ｍｇ，５１．６μｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（０．２５ｍＬ）、ＥｔＣＮ（０．２５ｍＬ）に溶解し、ＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）を加え窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した後、０℃でＭｅＳＳＭｅ（６．９μＬ，７７．２μｍｏｌ）、ＭｅＯＴｆ（８．７μＬ，７７．２μｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌した。この溶液を−１５℃で樹脂に結合したＬ−フコピラノシド（８８ｍｇ，１４ｍｇ：Ｆｕｃ）に加え、１０℃まで徐々に加温した。反応の進行は樹脂を一部取りだし、ＩＲで測定後、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）に加え、０．５Ｍ ＮａＯＭｅ（１０μＬ）を滴下して室温で１時間放置することで固相から切り出し、これをＴＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで観測した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。
ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ｃｍ−１ １７３５．６（ＯＣ＝Ｏ），１６７１．９（ＮＨＣ＝Ｏ），１０２９．８（Ｃ−Ｆ），６３６．９．
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４７Ｈ５１ＦＯ９：ｍ／ｚ ７７８．９ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ８０２．５［Ｍ＋Ｎａ］＋．
これまでチオグリコシドの活性化によるグリコシル化反応を固相上で行う際、供与体１．０に対してＤＭＴＳＴを８．０当量加えていた。しかし同様の反応を液相で行った場合ではＤＭＴＳＴは２．０当量で充分であることから、８．０当量以下でも反応が進行するのではないかと考えた。そこで今回、樹脂による立体的な影響を考慮して供与体に対しＤＭＴＳＴの当量を３．０に固定し、グリコシル化反応の検討を行った。反応温度を−１５℃から１０℃へと徐々にした場合の反応について、昇温率について検討した（表３及び図９〜図１１）。質量分析データの解析結果（図９〜図１１）から、チオグリコシドのＤＭＴＳＴによる活性化においては、昇温率が大きい場合においても副反応は進行せず、生成物量は時間に依存することが判明した。３．０当量のＤＭＴＳＴを用いた場合、反応時間が本実験では不十分であったが、少なくとも糖供与体であるチオグリコシドが糖受容体であるフッ化グリコシルの存在下選択的に活性化されることが示された。また、オルトゴナルグリコシル化反応に用いることができることが明確に示された。また、反応時間に関しては、より過剰のＤＭＴＳＴの添加により達成する、あるいは、さらに強力なプロモーター（例えばＮＩＳ−ＴｆＯＨ）の使用により克服できる。
（５）拡散混合固相反応法を基礎とするグリコシル化反応における反応剤の導入順序
（方法１）供与体が結合した樹脂を受容体とプロモーターの混液により膨潤する方法
樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→６）−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド
２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（１６．８ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）をＣ２Ｈ４Ｃｌ２（０．２ｍＬ）、ＥｔＣＮ（０．２ｍＬ）に溶解し、ＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）を加え窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した後、０℃でＭｅＳＳＭｅ（１３．４μＬ，０．１５ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＴｆ（１６．９μＬ，０．１５ｍｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌した。この溶液部を０℃で樹脂に結合したフェニルチオ−Ｌ−フコピラノシド（７９ｍｇ，１０ｍｇ：Ｆｕｃ）に加え、１２時間放置した。反応の進行は樹脂を一部取りだし、ＩＲで測定後、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）に加え、０．５Ｍナトリウムメトキシド（１０μＬ）を滴下して室温で１時間放置することで固相から切り出し、これをＴＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで観測した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。
ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ｃｍ−１ １７３５．６（ＯＣ＝Ｏ），１６７１．９（ＮＨＣ＝Ｏ），１０２９．８（Ｃ−Ｆ），６３６．９．
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４７Ｈ５１ＦＯ９：ｍ／ｚ ７７８．９ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ８０２．５［Ｍ＋Ｎａ］＋．
このグリコシル化反応の追跡結果は図１２の通りであり、８当量のＤＭＴＳＴを用いた場合６時間で反応が完結し、収率も満足のいくものであった。
（方法２）供与体が結合した樹脂を受容体溶液で膨潤しプロモーターを加える方法
樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→６）−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド
２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（７７．０ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）をＣ２Ｈ４Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、ＥｔＣＮ（０．５ｍＬ）に溶解し、ＭＳ４Ａ（２００ｍｇ）を加え窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した後、溶液部（上清）を樹脂に結合したフェニルチオ−Ｌ−フコピラノシド（３４０ｍｇ，４６ｍｇ：Ｆｕｃ）をＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、ＥｔＣＮ（０．５ｍＬ）で膨潤させた懸濁液に加えた。ここに０℃でＭｅＳＳＭｅ（６１．７μＬ，０．５６ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＴｆ（７７．７μＬ，０．５６ｍｍｏｌ）を加え、１２時間放置した。反応の進行は樹脂を一部取りだし、ＩＲで測定後、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）に加え、０．５Ｍ ＮａＯＭｅ（１０μＬ）を滴下して室温で１時間放置することで固相から切り出し、これをＴＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで観測した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。
このグリコシル化反応の追跡結果は図１３の通りであり、方法１の場合との相違点はプロモーターを同時に加えるか別途加えるかのみであるが、反応には１２時間を要した。
方法１および方法２の反応時間の差は、反応剤を順序立てて加えることによる２番目以降の反応剤が添加点から全体に拡散するのに要した時間と解釈できる。
これらの実験結果より、マイクロチャンネル（樹脂内部の細孔）内で進行する固相反応の性質上、可能な限り全ての反応剤は１つの溶液として樹脂に加え膨潤するのが良い。また、反応剤のみの混合を避ける必要がある場合には、別々に加えることもできる。
この２つの方法の検討結果、方法１、２共に同様に有効であることが判明した。従って、反応剤を予め混合すると反応する場合には、順次反応剤を加える方法１を、反応剤の混合が可能な場合には方法２を用いることができる。
（６）本発明の拡散による固相反応方法と従来の固相反応方法の比較
本発明の拡散固相反応方法の有用性を確認するため、拡散によらない攪拌等の外的な力を利用した従来法との比較を行った。
それぞれの反応方法においては、比較のために濃度条件と撹拌の有無意外の条件を同一にした。また、あえて反応が完結する前に反応を止めて収率を比較した。本発明の方法（拡散固相反応方法）においては、樹脂の膨潤に必要最低限の量の溶媒を用いて撹拌などを一切行わず静置した。一方、従来法（撹拌を行う固相反応方法）では同量の溶媒では撹拌することができないので、使用した試薬量を同一とし、溶液量は倍とした。
Ｏｃｔｙｌ ２，３−Ｄｉ−Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ−α，β−Ｌ−ｆｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ
ＭｅＳＳＭｅ（９．２μＬ，１０１μｍｏｌ）に窒素雰囲気下、ＭｅＯＴｆ（１１．６μＬ，１０１μｍｏｌ）を加え室温で５分間攪拌した。これにＤＣＥ（３００μＬ）、ＭｅＣＮ（３００μＬ）を加え、０．１６９Ｍ−ＤＭＴＳＴストック溶液を調製した。次にこの溶液にＡｃｃｅｐｔｏｒ：１−Ｏｃｔａｎｏｌ（１０．４μＬ，６５．４μｍｏｌ）を加え、０．１０９Ｍ−Ａｃｃｅｐｔｏｒ／０．１６９Ｍ−ＤＭＴＳＴストック溶液を調製した。
［拡散固相反応方法］
０．１０９Ｍ−Ａｃｃｅｐｔｏｒ／０．１６９Ｍ−ＤＭＴＳＴストック溶液（２００μＬ，Ａｃｃｅｐｔｏｒ：２１．８μｍｏｌ，ＤＭＴＳＴ：３３．８μｍｏｌ）をＲｅｓｉｎ−ｂｏｕｎｄ−Ｐｈｅｎｙｌ−１−ｔｈｉｏ−Ｌ−ｆｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（４０．５ｍｇ，１１．２μｍｏｌ）に窒素雰囲気下、−３０℃で加え、１５分間膨潤反応させた。反応終了後、樹脂をＤＣＭ、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した。次に樹脂にｓａｔ．ＮａＯＭｅ−ＭｅＯＨ／ＴＨＦ＝１／４（２００μＬ）で室温、１時間放置することで固相から切り出し、ＤＣＭで洗浄後、減圧乾燥し、得られた残渣を１Ｈ ＮＭＲで観測した。
［撹拌を行う固相反応方法（従来法）］
０．１０９Ｍ−Ａｃｃｅｐｔｏｒ／０．１６９Ｍ−ＤＭＴＳＴストック溶液をＤＣＥ／ＭｅＣＮ＝１／１溶液で倍希釈し、０．０５５Ｍ−Ａｃｃｅｐｔｏｒ／０．０８５Ｍ−ＤＭＴＳＴストック溶液とし、この溶液（４００μＬ，Ａｃｃｅｐｔｏｒ：２２μｍｏｌ，ＤＭＴＳＴ：３４μｍｏｌ）をＲｅｓｉｎ−ｂｏｕｎｄ−Ｐｈｅｎｙｌ−１−ｔｈｉｏ−Ｌ−ｆｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（４０．４ｍｇ，１１．２μｍｏｌ）に窒素雰囲気下、−３０℃で加え、１５分間攪拌反応させた。以下、上記拡散固相反応方法と同様に行った。
１Ｈ ＮＭＲより、４．３２ｐｍ，１．３５ｐｐｍ付近のダブレットは主生成物のＯｃｔｙｌ β−ｆｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、４．２８ｐｐｍ，１．１８ｐｐｍ付近のダブレットは副生成物のＦｕｃｏｓｅ−ｄｉｍｅｒである。Ｆｕｃｏｓｅ−ｄｉｍｅｒは反応後処理の際に混入した水による加水分解物であり、また原料であるＰｈｅｎｙｌ β−ｆｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅは完全に消失している。これより原料由来である生成物はＯｃｔｙｌ β−ｆｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅとＦｕｃｏｓｅ−ｄｉｍｅｒであるので、反応の進行度は、主生成物のＯｃｔｙｌ β−ｆｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅと原料由来物との比により計算できる。
本発明の拡散固相反応方法： １．００／（１．００＋０．６１）＝６２．１％
撹拌を行う固相反応方法（従来法）： １．００／（１．００＋１．３０）＝４３．５％
この結果より、本発明の拡散固相反応方法の方が従来法よりも明らかに有利であることがわかった。すなわち、結果より、本発明の方法の方が反応が１４３％早いことが示された。これは、同じ試薬量で反応を行おうとする場合、必要最低限の量で攪拌等を行わずに静置して反応を行えば、非常に効率的に反応が行えることを意味している。また、もし濃度を同一とする場合には、従来法では本発明の方法の２倍の試薬が必要になり、非効率である。さらに、本発明の方法では撹拌が不要であることから、固相である樹脂を静置しておく反応容器の他は特別な装置等も不要である。
これらのことから、本発明の拡散固相反応法が非常に効率的な方法であることが示された。
実施例３：オルトゴナルグリコシル化法に基づく拡散混合固相反応法による糖鎖の合成
（１）チオグリコシドの活性化による二糖の合成
樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→２）−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド
３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（３５．３ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）をＣ２Ｈ４Ｃｌ２（０．４５ｍＬ）、ＥｔＣＮ（０．４５ｍＬ）に溶解し、ＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）を加え窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した後、０℃でＭｅＳＳＭｅ（２７．０μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＴｆ（３４．０μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌した。この溶液部を０℃で樹脂に結合したフェニルチオ−Ｌ−フコピラノシド（１６９ｍｇ，２０ｍｇ：Ｆｕｃ）に加え、１２時間放置した。反応の進行は樹脂を一部取りだし、ＩＲで測定後、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）に加え、０．５Ｍナトリウムメトキシド（１０μＬ）を滴下して室温で１時間放置することで固相から切り出し、これをＴＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで観測した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。
ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ｃｍ−１ １７３５．６（ＯＣ＝Ｏ），１６７１．９（ＮＨＣ＝Ｏ），１０２９．８（Ｃ−Ｆ），６３６．４．
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４７Ｈ５１ＦＯ９：ｍ／ｚ ７７８．９ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ８０２．５［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図１４）
（２）チオグリコシドの活性化による二糖の合成
樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→３）−２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド
２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（３５．０ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（０．４５ｍＬ）、ＥｔＣＮ（０．４５ｍＬ）に溶解し、ＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）を加え窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した後、０℃でＭｅＳＳＭｅ（２７．０μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＴｆ（３４．０μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌した。この溶液部を０℃で樹脂に結合したフェニルチオ−Ｌ−フコピラノシド（１６９ｍｇ，２０ｍｇ：Ｆｕｃ）に加え、１２時間放置した。反応の進行は樹脂を一部取りだし、ＩＲで測定後、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）に加え、０．５Ｍ ＮａＯＭｅ（１０μＬ）を滴下して室温で１時間放置することで固相から切り出し、これをＴＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで観測した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。
ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ｃｍ−１ １７３５．６（ＯＣ＝Ｏ），１６７１．９（ＮＨＣ＝Ｏ），１０２９．８（Ｃ−Ｆ），６３６．４．
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４７Ｈ５１ＦＯ９：ｍ／ｚ ７７８．９ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ８０２．５［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図１５）
（３）チオグリコシドの活性化による二糖の合成
樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド
２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（３４．８ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（０．４５ｍＬ）、ＥｔＣＮ（０．４５ｍＬ）に溶解し、ＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）を加え窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した後、０℃でＭｅＳＳＭｅ（２７．０μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＴｆ（３４．０μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌した。この溶液部を０℃で樹脂に結合したフェニルチオ−Ｌ−フコピラノシド（１６９ｍｇ，２０ｍｇ：Ｆｕｃ）に加え、１２時間放置した。反応の進行は樹脂を一部取りだし、ＩＲで測定後、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）に加え、０．５Ｍナトリウムメトキシド（１０μＬ）を滴下して室温で１時間放置することで固相から切り出し、これをＴＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで観測した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。
ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ｃｍ−１ １７３５．６（ＯＣ＝Ｏ），１６７１．９（ＮＨＣ＝Ｏ），１０２９．８（Ｃ−Ｆ），６３６．３．
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４７Ｈ５１ＦＯ９：ｍ／ｚ ７７８．９ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ８０２．５［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図１６）
（４）チオグリコシドの活性化による二糖の合成
樹脂に結合した２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−フコピラノシル−（１→６）−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド
２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルフルオライド（３４．６ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（０．４５ｍＬ）、ＥｔＣＮ（０．４５ｍＬ）に溶解し、ＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）を加え窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した後、０℃でＭｅＳＳＭｅ（２７．０μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＴｆ（３４．０μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌した。この溶液部を０℃で樹脂に結合したフェニルチオ−Ｌ−フコピラノシド（１６９ｍｇ，２０ｍｇ：Ｆｕｃ）に加え、１２時間放置した。反応の進行は樹脂を一部取りだし、ＩＲで測定後、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）に加え、０．５Ｍナトリウムメトキシド（１０μＬ）を滴下して室温で１時間放置することで固相から切り出し、これをＴＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで観測した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。
ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ｃｍ−１ １７３５．６（ＯＣ＝Ｏ），１６７１．９（ＮＨＣ＝Ｏ），１０２９．８（Ｃ−Ｆ），６３６．９．
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４７Ｈ５１ＦＯ９：ｍ／ｚ ７７８．９ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ８０２．５［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図１７）
（５）固相上での三糖誘導体の合成
フェニル ２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド（４１．０ｍｇ，０．０７４ｍｍｏｌ）をＥｔＣＮ（０．４５ｍＬ）に溶解し、ＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）を加え窒素気流下、室温で３時間撹拌した（Ａ液）。別にＡｇＯＴｆ（５７．０ｍｇ，０．２２２ｍｍｏｌ）、ＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）をＣＨ２Ｃｌ２（０．４５ｍＬ）に加え窒素気流下、室温で３時間撹拌した後、０℃でＣｐ２ＨｆＣｌ２（４２．０ｍｇ，０．１１１ｍｍｏｌ）を加え、５分間撹拌した（Ｂ液）。調製したＡ、Ｂ液を合し窒素気流下、−１５℃で樹脂に結合したジサッカライド（１６９ｍｇ，０．０３７ｍｍｏｌ）に加え、６時間かけて１０℃まで上昇させた後、３時間放置した。反応の進行は樹脂を一部取りだし、ＩＲで測定後、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）に加え、０．５Ｍナトリウムメトキシド（１０μＬ）を滴下して室温で１時間放置することで固相から切り出し、これをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで観測した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、ＥｔＣＮ、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。
今回、先に合成した４種類の化合物について同様の操作を行った。それぞれのスキームとＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳのチャートを以下及び図１８から２１に示す。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８０Ｈ８４Ｏ１４Ｓ：ｍ／ｚ １３０１．６ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ １３２５．６［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図１８）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８０Ｈ８４Ｏ１４Ｓ：ｍ／ｚ １３０１．６ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ １３２５．６［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図１９）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８０Ｈ８４Ｏ１４Ｓ：ｍ／ｚ １３０１．６ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ １３２６．３［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図２０）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８０Ｈ８４Ｏ１４Ｓ：ｍ／ｚ １３０１．６ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ １３２５．６［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図２１）
図１８から図２１のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳのチャートより、４種類の反応全てにおいて目的化合物由来の擬親ピークが確認されたことでグリコシル化反応が進行したことが明らかである。反応温度勾配を一定とし、最終到達温度を１０℃高く設定することで反応を完結することができる。
１−オクタノール（９２．８μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（０．４５ｍＬ）、ＥｔＣＮ（０．４５ｍＬ）に溶解させ、ＭＳ４Ａ（２０ｍｇ）を加え窒素気流下、室温で３時間撹拌した後、０℃でＭｅＳＳＭｅ（２６．６μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＴｆ（３３．５μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌した。この溶液を−１５℃で樹脂に結合したトリサッカライド（１６９ｍｇ，２０ｍｇ：Ｆｕｃ）に加え、６．５時間かけて２０℃まで上昇させた後、８時間放置した。反応の進行は樹脂を一部取りだし、ＩＲで測定後、ＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）、メタノール（０．５ｍＬ）に加え、０．５Ｍ ＮａＯＭｅ（１０μＬ）を滴下して室温で１時間放置することで固相から切り出し、これをＴＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで観測した。反応終了後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、減圧乾固した。
今回、既に合成した４種類の三糖誘導体について同様の操作を行った。それぞれのスキームとＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳのチャートを以下に示す。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８２Ｈ９５Ｏ１５：ｍ／ｚ １３２０．７ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ １３４３．８［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図２２）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８２Ｈ９５Ｏ１５：ｍ／ｚ １３２０．７ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ １３４３．８［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図２３）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８２Ｈ９５Ｏ１５：ｍ／ｚ １３２０．７ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ １３４３．８［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図２４）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８２Ｈ９５Ｏ１５：ｍ／ｚ １３２０．７ Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ １３４３．８［Ｍ＋Ｎａ］＋．
（図２５）
図２２から図２５のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳのチャートより、４種類とも目的化合物由来のピーク（ＦＷ：１３０１）が確認されたことでグリコシル化反応が進行したことが明らかとなった。しかし、１３６７、９１２、６９４、４８０付近に副生成物と考えられるピークが多く見られることから更なる条件の最適化が必要とされる。
実施例４：オルトゴナルグリコシル化法に基づく拡散混合固相反応法による糖鎖ライブラリーの合成
実施例１から３の結果を用いれば、糖鎖ライブラリーの合成が可能である。
すなわち、適当に保護された生体を構成する９種の主立った単糖（実施例１）は、糖鎖ライブラリーの化学合成を達成するために必須である。さらに、糖鎖合成においてグリコシル化反応における立体制御は極めて困難な問題であり、ライブラリー合成において全てのグリコシル化反応を制御することは不可能である。従って、糖鎖ライブラリーの構築にあっては立体非選択の方法論が適している。このために、保護単糖の２位は隣接気関与の無い置換基とすることが望ましい。本実施例では、このように設計された保護単糖を安定なチオグリコシドとして合成し、必要に応じてグリコシルフルオリドへと変換可能とした。
このような単糖誘導体を用い、任意の組み合わせで反応することにより糖鎖ライブラリーが合成可能である。ライブラリー合成を行うためには適当な固相合成法が必要であるが、その１つが本発明の拡散混合による固相反応方法を利用した固相合成法である（実施例２）。本法によれば、固相反応の場である樹脂の膨潤に必要最低限の量の溶媒に反応剤を溶解し、この溶液で樹脂を膨潤することにより、反応の場である細孔内部へのすみやかな反応剤の導入を達成し、また、拡散に基づいて反応が進行するため撹拌等の物理的手段による装置からも解放されることを示した。
固相におけるオルトゴナルグリコシル化法は、糖鎖の固相合成を最短行程で達成する方法である。実施例３においては、上記実施例２でその有用性が示された拡散による固相反応方法を用いて、このオルトゴナルグリコシル化反応を行い、良好な結果を得た。
特に、実施例２および３においては、拡散混合固相反応法および固相オルトゴナルグリコシル化法を実証するのみならず、（α／β）Ｆｕｃ（１−２／３／４／６）（α／β）Ｇａｌ（１−４）（α／β）Ｇｌｃ−Ｏｃｔｙｌのライブラリー合成（２ｘ４ｘ２ｘ２＝３２）をも同時に達成した。これらの結果より、本発明の方法によれば、さらに大きなライブラリーの合成が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
本発明によりヌクレオチド、ペプチド、糖鎖に代表される生体分子を効率良く化学合成する方法が提供される。昇温率を制御して反応系の温度を変化させることにより高効率で糖鎖の固相合成を行うことのできる本発明の糖鎖固相合成方法と、固相反応を少量の溶媒で効率良く行うことができる拡散による固相反応方法は、いずれも前記生体分子の化学合成に有用であり、コンビナトリアルケミストリー等においては特に有用である。また、従来合成を制御することが難しく市販の合成装置の無い糖鎖の合成には特に有用である。
本出願は、２００３年６月３０日付の日本特許出願（特願２００３−１８７８７８）に基づく優先権を主張する出願であり、その内容は本明細書中に参照として取り込まれる。また、本明細書にて引用した文献の内容も本明細書中に参照として取り込まれる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種の単糖ユニットを含む少なくとも１以上の糖鎖合成反応系において複数種の糖鎖を合成する糖鎖固相合成方法において、該糖鎖合成反応系の温度を、反応系中の副反応を低下させることを指標として決定した昇温率に従って変化させることを特徴とする、糖鎖固相合成方法。
【請求項２】
糖鎖固相合成方法が以下の工程を含む、請求項１に記載の糖鎖固相合成方法。
（ａ）下記式（１）：
Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ａ１−Ｘ （１）
（式中、Ｐは固相を示し、Ｌはリンカーを示し、Ｏは単糖の非還元末端の酸素原子を示し、Ａ１は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、Ｘは脱離基Ｙの活性化条件下で安定な脱離基を示す。）
の単糖ユニットに、下記式（２）：
ＨＯ−Ａ２−Ｙ （２）
（式中、Ａ２は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、Ｙは脱離基Ｘの活性化条件下で安定な脱離基を示す。）
の単糖ユニットを脱離基Ｘの活性化条件下で反応させて、下記式（３）：
Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ａ１−Ｏ−Ａ２−Ｙ （３）
の糖類を得る工程：及び
（ｂ）上記工程（ａ）で得た式（３）の糖類に、下記式（４）：
ＨＯ−Ａ３−Ｘ’ （４）
（式中、Ａ３は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、Ｘ’は脱離基Ｙの活性化条件下で安定な脱離基あるいは１位の水酸基または保護基を示す。）
の単糖ユニットを脱離基Ｙの活性化条件下で反応させて、式（５）：
Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ａ１−Ｏ−Ａ２−Ｏ−Ａ３−Ｘ’ （５）
の糖類を得る工程。
【請求項３】
工程（ｂ）においてＸ’が１位の水酸基または保護基である式（４）の単糖ユニットを使用し、３つの糖が連結した糖鎖を合成する、請求項２に記載の糖鎖固相合成方法。
【請求項４】
工程（ｂ）で得た式（５）の糖類に対し、工程（ａ）と工程（ｂ）の反応を繰り返すことを含む、請求項２に記載の糖鎖固相合成方法。
【請求項５】
式（１）、（２）及び（４）の単糖ユニットを一反応系に同時に反応させて反応を行う、請求項２から４の何れかに記載の糖鎖固相合成方法。
【請求項６】
脱離基Ｘがフェニルチオ基又はフッ素基の片方であり、脱離基Ｙがフェニルチオ基又はフッ素基の他方である、請求項２から５の何れかに記載の糖類固相合成方法。
【請求項７】
フェニルチオ基の活性化をＮ−ヨードサクシンイミド−トリフルオロメタンスルホン酸（ＮＩＳ−ＴｆＯＨ）またはジメチルメチルチオスルフォニウムトリフラート（ＤＭＴＳＴ）により行い、フッ素基の活性化をＳｎ（ＣｌＯ４）２、Ｓｎ（ＯＴｆ）２、Ｃｐ２Ｈｆ（ＣｌＯ４）２、またはＣｐ２Ｈｆ（ＯＴｆ）２により行う、請求項６に記載の糖鎖固相合成方法。
【請求項８】
保護基がベンジル基である、請求項２から７の何れかに記載の糖鎖固相合成方法。
【請求項９】
Ａ１、Ａ２及びＡ３が示す単糖骨格が生体中に存在する単糖から選ばれる３種類の糖の単糖骨格である、請求項２から８の何れかに記載の糖鎖固相合成方法。
【請求項１０】
Ａ１、Ａ２及びＡ３が示す単糖骨格が、マンノース、グルコース、ガラクトース、キシリトース、グルコサミン、ガラクトサミン、グルクロン酸、フルクトース又はシアル酸の単糖骨格である、請求項２から９の何れかに記載の糖鎖固相合成方法。
【請求項１１】
フェニル１−チオ−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノピラノシド、フェニル１−チオ−２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノピラノシド、フェニル１−チオ−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノピラノシド、フェニル１−チオ−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノピラノシド、フェニル１−チオ−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル１−チオ−２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル１−チオ−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル１−チオ−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド、フェニル３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド、フェニル２，４−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド、フェニル１−チオ−２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−β−Ｌ−フコピラノシド、フェニル２−アジド−４，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル２−アジド−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル２−アジド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２−アジド−４，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２−アジド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２−アジド−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、
メチル（フェニル１−チオ−２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド）ウロネート、メチル（フェニル５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−２−チオ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシド）オネート、メチル（フェニル５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−２−チオ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシド）オネート、メチル（フェニル５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−２−チオ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシド）オネート、メチル（フェニル５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−２−チオ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシド）オネート、並びに上記化合物中のフェニルチオ基をフッ素基に置換した化合物から成る群から選択される少なくとも１以上の単糖誘導体を含む、請求項１から１０の何れかに記載の糖鎖固相合成方法を行うための単糖ライブラリー。
【請求項１２】
毛管現象を生じる大きさの固体細孔中で固相反応を行う方法において、固体の外表面に余剰の液相が存在しない状態で反応を行うことを特徴とする固相反応方法。
【請求項１３】
反応が拡散混合により行われることを特徴とする請求項１２に記載の固相反応方法。
【請求項１４】
固体が、内部に細孔を有する樹脂粒子である、請求項１２又は１３に記載の固相反応方法。
【請求項１５】
固相反応が化学反応または生化学的反応である、請求項１２から１４の何れかに記載の固相反応方法。
【請求項１６】
固相反応が糖鎖合成反応である、請求項１２から１５の何れかに記載の固相反応方法。
【請求項１７】
固相反応が請求項１から１０の何れかに記載の糖鎖固相合成反応である、請求項１２から１６の何れかに記載の固相反応方法。
【請求項１８】
請求項１から１０の何れかに記載の糖鎖固相合成方法または請求項１７に記載の固相反応方法により合成された、生体中に存在する単糖から選ばれる３種類の糖の全ての組み合わせから成る糖鎖により構成されるライブラリー。
【請求項１９】
生体中に存在する単糖が、マンノース、グルコース、ガラクトース、キシリトース、グルコサミン、ガラクトサミン、グルクロン酸、フルクトース又はシアル酸である、請求項１８に記載のライブラリー。
【請求項２０】
少なくとも以下の（１）と（２）とを含む、請求項１２から１７の何れかに記載の固相反応方法を行うための反応装置。
（１）液相を注入又は吸引するための導入部を有し、かつ固体を収容する空間を有する、固相反応を行うための反応部、及び
（２）反応部の温度を調節するための温度調節部
【請求項１】
複数種の単糖ユニットを含む少なくとも１以上の糖鎖合成反応系において複数種の糖鎖を合成する糖鎖固相合成方法において、該糖鎖合成反応系の温度を、反応系中の副反応を低下させることを指標として決定した昇温率に従って変化させることを特徴とする、糖鎖固相合成方法。
【請求項２】
糖鎖固相合成方法が以下の工程を含む、請求項１に記載の糖鎖固相合成方法。
（ａ）下記式（１）：
Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ａ１−Ｘ （１）
（式中、Ｐは固相を示し、Ｌはリンカーを示し、Ｏは単糖の非還元末端の酸素原子を示し、Ａ１は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、Ｘは脱離基Ｙの活性化条件下で安定な脱離基を示す。）
の単糖ユニットに、下記式（２）：
ＨＯ−Ａ２−Ｙ （２）
（式中、Ａ２は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、Ｙは脱離基Ｘの活性化条件下で安定な脱離基を示す。）
の単糖ユニットを脱離基Ｘの活性化条件下で反応させて、下記式（３）：
Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ａ１−Ｏ−Ａ２−Ｙ （３）
の糖類を得る工程：及び
（ｂ）上記工程（ａ）で得た式（３）の糖類に、下記式（４）：
ＨＯ−Ａ３−Ｘ’ （４）
（式中、Ａ３は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、Ｘ’は脱離基Ｙの活性化条件下で安定な脱離基あるいは１位の水酸基または保護基を示す。）
の単糖ユニットを脱離基Ｙの活性化条件下で反応させて、式（５）：
Ｐ−Ｌ−Ｏ−Ａ１−Ｏ−Ａ２−Ｏ−Ａ３−Ｘ’ （５）
の糖類を得る工程。
【請求項３】
工程（ｂ）においてＸ’が１位の水酸基または保護基である式（４）の単糖ユニットを使用し、３つの糖が連結した糖鎖を合成する、請求項２に記載の糖鎖固相合成方法。
【請求項４】
工程（ｂ）で得た式（５）の糖類に対し、工程（ａ）と工程（ｂ）の反応を繰り返すことを含む、請求項２に記載の糖鎖固相合成方法。
【請求項５】
式（１）、（２）及び（４）の単糖ユニットを一反応系に同時に反応させて反応を行う、請求項２から４の何れかに記載の糖鎖固相合成方法。
【請求項６】
脱離基Ｘがフェニルチオ基又はフッ素基の片方であり、脱離基Ｙがフェニルチオ基又はフッ素基の他方である、請求項２から５の何れかに記載の糖類固相合成方法。
【請求項７】
フェニルチオ基の活性化をＮ−ヨードサクシンイミド−トリフルオロメタンスルホン酸（ＮＩＳ−ＴｆＯＨ）またはジメチルメチルチオスルフォニウムトリフラート（ＤＭＴＳＴ）により行い、フッ素基の活性化をＳｎ（ＣｌＯ４）２、Ｓｎ（ＯＴｆ）２、Ｃｐ２Ｈｆ（ＣｌＯ４）２、またはＣｐ２Ｈｆ（ＯＴｆ）２により行う、請求項６に記載の糖鎖固相合成方法。
【請求項８】
保護基がベンジル基である、請求項２から７の何れかに記載の糖鎖固相合成方法。
【請求項９】
Ａ１、Ａ２及びＡ３が示す単糖骨格が生体中に存在する単糖から選ばれる３種類の糖の単糖骨格である、請求項２から８の何れかに記載の糖鎖固相合成方法。
【請求項１０】
Ａ１、Ａ２及びＡ３が示す単糖骨格が、マンノース、グルコース、ガラクトース、キシリトース、グルコサミン、ガラクトサミン、グルクロン酸、フルクトース又はシアル酸の単糖骨格である、請求項２から９の何れかに記載の糖鎖固相合成方法。
【請求項１１】
フェニル１−チオ−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノピラノシド、フェニル１−チオ−２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノピラノシド、フェニル１−チオ−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノピラノシド、フェニル１−チオ−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−マンノピラノシド、フェニル１−チオ−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル１−チオ−２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル１−チオ−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル１−チオ−２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド、フェニル３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド、フェニル２，４−ジ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−キシロピラノシド、フェニル１−チオ−２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−β−Ｌ−フコピラノシド、フェニル２−アジド−４，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル２−アジド−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル２−アジド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェニル３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２−アジド−４，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２−アジド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル２−アジド−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド、
メチル（フェニル１−チオ−２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド）ウロネート、メチル（フェニル５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−２−チオ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシド）オネート、メチル（フェニル５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−２−チオ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシド）オネート、メチル（フェニル５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−２−チオ−β−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシド）オネート、メチル（フェニル５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−２−チオ−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシド）オネート、並びに上記化合物中のフェニルチオ基をフッ素基に置換した化合物から成る群から選択される少なくとも１以上の単糖誘導体を含む、請求項１から１０の何れかに記載の糖鎖固相合成方法を行うための単糖ライブラリー。
【請求項１２】
毛管現象を生じる大きさの固体細孔中で固相反応を行う方法において、固体の外表面に余剰の液相が存在しない状態で反応を行うことを特徴とする固相反応方法。
【請求項１３】
反応が拡散混合により行われることを特徴とする請求項１２に記載の固相反応方法。
【請求項１４】
固体が、内部に細孔を有する樹脂粒子である、請求項１２又は１３に記載の固相反応方法。
【請求項１５】
固相反応が化学反応または生化学的反応である、請求項１２から１４の何れかに記載の固相反応方法。
【請求項１６】
固相反応が糖鎖合成反応である、請求項１２から１５の何れかに記載の固相反応方法。
【請求項１７】
固相反応が請求項１から１０の何れかに記載の糖鎖固相合成反応である、請求項１２から１６の何れかに記載の固相反応方法。
【請求項１８】
請求項１から１０の何れかに記載の糖鎖固相合成方法または請求項１７に記載の固相反応方法により合成された、生体中に存在する単糖から選ばれる３種類の糖の全ての組み合わせから成る糖鎖により構成されるライブラリー。
【請求項１９】
生体中に存在する単糖が、マンノース、グルコース、ガラクトース、キシリトース、グルコサミン、ガラクトサミン、グルクロン酸、フルクトース又はシアル酸である、請求項１８に記載のライブラリー。
【請求項２０】
少なくとも以下の（１）と（２）とを含む、請求項１２から１７の何れかに記載の固相反応方法を行うための反応装置。
（１）液相を注入又は吸引するための導入部を有し、かつ固体を収容する空間を有する、固相反応を行うための反応部、及び
（２）反応部の温度を調節するための温度調節部
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０００８６１
【国際公開日】平成１７年１月６日（２００５．１．６）
【発行日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１１１５２（Ｐ２００５−５１１１５２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００９５２３
【国際出願日】平成１６年６月２９日（２００４．６．２９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１５年度新エネルギー・産業技術総合開発機構糖鎖合成関連遺伝子ライブラリーの構築に係る委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００５９６８）三菱化学株式会社 (4,356)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年１月６日（２００５．１．６）
【発行日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００９５２３
【国際出願日】平成１６年６月２９日（２００４．６．２９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１５年度新エネルギー・産業技術総合開発機構糖鎖合成関連遺伝子ライブラリーの構築に係る委託研究、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００５９６８）三菱化学株式会社 (4,356)
【Ｆターム（参考）】
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