糖鎖構造解析方法に適したアグリコンを有するグリコシド化合物
【課題】糖鎖の構造解析を行う際、参照となる糖鎖構造情報を効率よく生成するグリコシド化合物の提供を課題とする。
【解決手段】ＣＩＤ−ＭＳｎ測定において、目的とする任意のＢイオンおよび／またはＣイオンを生成するアグリコンを有するグリコシド化合物を提供することにより、上記課題を解決する。
【解決手段】ＣＩＤ−ＭＳｎ測定において、目的とする任意のＢイオンおよび／またはＣイオンを生成するアグリコンを有するグリコシド化合物を提供することにより、上記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、構造未知の糖鎖についてＣＩＤ−ＭＳｎ測定を行い、得られたデータをすでに取得されている参照データと比較することにより該糖鎖の構造解析を行う方法において、より効率的に糖鎖のフラグメントイオンを与える化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は主に細胞表面に糖タンパク質や糖脂質の一部として存在し、発生、分化誘導、受精、免疫、癌化、感染症等、様々な生命現象に深く関与している。このように多彩な機能を有する糖鎖の研究は近年盛んになっている。また、糖鎖は、タンパク質の翻訳後修飾の重要な部分を占め、今後の大きな研究対象である。糖タンパク質や糖脂質の機能は糖鎖により制御される場合があり、糖鎖の構造解析を極微量において達成する技術が必要である。しかし、糖鎖は生物工学的手法により増幅ができない分子種であるため、微量の物質のみで構造解析を達成することを可能とする新たな構造解析技術の開発が必要である。タンパク質の配列はゲノム配列が判明している場合、対応するタンパク質のアミノ酸配列も取得できるため、目的のタンパク質のアミノ酸配列は質量分析（例えば、ＭＳ／ＭＳ（ＭＳ２）法）により解析することができる。しかし、被修飾タンパク質の配列解析技術については今後の課題として残されている。特に、糖鎖によるタンパク質の修飾は極めて大きな分子の多様性を生み出している。したがって、糖鎖の構造解析技術の開発は必要不可欠である。
【０００３】
糖鎖は、核酸やタンパク質とは異なり配列以外の要因による構造異性体群を形成している。この理由の基本は、糖鎖を形成する単糖には反応点となる水酸基が複数存在するため結合位置異性体を形成する性質を有し、かつ、単糖間の結合の際にはアノメリック位の立体異性によるアノマー異性体を形成する性質を有しているためである。単糖間の結合は、生物体内においては糖鎖の合成に関わる酵素群の連続反応により行われるため、必ずしも組み合わせの原理に基づく糖鎖群を形成しているわけではない。しかし、酵素反応は副反応を伴うことが知られており、このような現象の生物における意味は解明されておらず、このような場合には遺伝情報によることのない全く新しい概念に基づく構造解析法が必要である。もちろん、遺伝情報が解明されていない、また、糖鎖の生合成経路が解明されていない生物種における糖鎖構造の解析についても新しい構造解析法が必要である。
【０００４】
現在用いられている糖鎖の構造解析技術としては、（１）核磁気共鳴分光法、（２）質量分析法、（３）多次元クロマトグラフィーによるマッピング法（非特許文献１を参照）、（４）加水分解酵素による特異的部分加水分解法（非特許文献２を参照）、（５）レクチンによるマッピング法（非特許文献２を参照）、及び（６）メチル化−加水分解-ガスクロマトグラフィーによる組成分析法（非特許文献２を参照）をあげることができ、通常はこれらを組み合わせて糖鎖の解析が行われている。
【０００５】
上記の中でも特に有効な糖鎖の解析手段としては、核磁気共鳴分光法及び質量分析法をあげることができるが、前者の問題点は解析に必要な量がμｇ以上であることであり、後者の問題点は立体異性体の解析が不可能なことである。これらの方法を含めいずれの解析法を用いるにせよ、糖鎖の構造解析は、得られた天然糖鎖構造の構造解析を直接行わなければならない(非特許文献３を参照)。
【０００６】
一方、異なる糖鎖を質量分析することにより、その結果が異なることが示されている。例えば、ステロイドの水酸基の立体異性体のＭＳ２測定によるフラグメント化を行うと、各フラグメント強度が異なること（非特許文献４を参照）や、合成された硫酸化糖鎖の構造異性体のＣＩＤ−ＭＳ２測定をＦＡＢ−q−Ｍａｓｓで行って、特定イオンの強度を測定すると、その値に差があること（非特許文献５を参照）が示されている。しかし、これらはいずれも具体的に糖鎖の構造解析方法を示すものではなかった。
【０００７】
質量分析装置を用いる糖鎖の構造解析技術において一般的な構造解析法としては、ｍ／ｚとそのピーク強度をパラメータとし、構造既知の糖鎖のそれと比較することで同一構造か否かの判定をする方法がある（非特許文献６および非特許文献７を参照）。この方法は、特定の一点の電圧におけるフラグメントのピーク強度を指標とし、各々のフラグメントの強度が総合的に一致するか否かをスコア化して判定する方法であり、参照とする化合物群のデータセット、あるいは、データベースが必要である。この方法の限界は、合否の判定をするだけで否の場合の構造予測が不可能な点であった。
【０００８】
構造的に類似性のある化合物群に対しては、多変量解析が、質量分析により得られたデータから構造的特徴を抽出するのに新たな可能性を与えることを示唆している報告があるが、２糖の構造予測に応用できることを報告しているにすぎず、長い糖鎖の構造予測の可能性については具体的には何も触れていない（非特許文献８を参照）。
さらに、質量分析法は極微量分析であり、検出される質量数（Ｈ、Ｎａ付加等）から物質の分子量が分かると共に、フラグメントイオンの解裂様式から、分子構造に関して重要な情報を得ることができるものの、サンプルに異性体（構造異性体、光学異性体）が混入して存在する場合、質量分析計のみではその混入物の存在すら識別できなかった。
【０００９】
以上の問題を解決するために、構造未知の糖鎖についてＣＩＤ−ＭＳｎ測定を行い、得られたデータをすでに取得されている参照データと比較することにより該糖鎖の構造解析を行う方法が発明された。特に、目的糖鎖および参照糖鎖のＣＩＤエネルギー依存曲線について、これらの曲線を特徴付ける数値で表した解裂イオンパラメータをそれぞれ作成し、これらのパラメータを統計的に解析することにより、目的糖鎖の構造決定又は構造推定を行う方法により、質量分析計のみを用いた糖鎖の構造異性体混合物を識別するための分析方法が提供された。
【００１０】
しかし、ここで参照しているデータを与える糖鎖を化学合成等の手法により提供する際、アグリコンとよばれる置換基を糖鎖の還元末端に配置する必要があり、従来のアグリコンではＢイオンおよびＣイオンを任意に生成することができず、効率的に構造情報を得ることが困難であった。
【非特許文献１】Royle, L. et al., Anal. Biochem. 2002,304,70-90
【非特許文献２】Chaplin, M.F et al., Carbohydrate Analysis, A Practical Approach, IRL Press, Oxford,1994
【非特許文献３】Dell, A., Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1987, 45, 19-72
【非特許文献４】Faretto, D. et al., J. Mass Spectrom. 1991,5, 240-244
【非特許文献５】Kurono, S. et al., J. Mass Spectrom. 1998, 33, 35-44
【非特許文献６】Viseux. N. et al., Anal. Chem. 1998, 70, 4951-4959
【非特許文献７】Kameyama, A. et al., Anal. Chem. 2005, 77, 4719-4725
【非特許文献８】Fangmark, I. et al., Anal. Chem. 1999, 71, 1105-1110
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、糖鎖の構造解析を行う際、参照となる糖鎖構造情報を効率よく生成するようなアグリコンを有するグリコシド化合物を提供することである。具体的には、糖鎖の質量分析において生成するＢイオンおよびＣイオンを効率よく生成することが可能なアグリコンを有するグリコシド化合物を提供することである。本発明の別の目的は、アグリコンの性質に依存することのない物質データを効率よく得ることができるアグリコンを有するグリコシド化合物を提供することである。さらに、本発明の別の目的は、目的糖鎖のデータと参照データを比較検討する際により多くの比較データを得ることができるアグリコンを有するグリコシド化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討を進めた結果、質量分析条件下ＣＩＤ−ＭＳｎ測定を行う際、効率よく脱離し、目的とするＢイオンおよび／またはＣイオンを生成するアグリコンを有するグリコシド化合物を発見することに成功した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
すなわち本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）アグリコンとしてブロモブチルオキシ基、アルキルフェニルオキシ基、アミノブチルオキシ基またはアルキルアミノブチルオキシ基を有するグリコシド化合物。
（２）アグリコンとしてアミノブチルオキシ基を有する、（１）に記載の化合物。
（３）アミノブチルオキシ基のアミノ基が保護基で保護されている、（２）に記載の化合物。
（４）保護基がカーバメート型アミノ保護基である、（３）に記載の化合物。
（５）カーバメート型アミノ保護基がt-ブチルオキシカルボニル基またはトリメチルシリルオキシカルボニル基である、（４）に記載の化合物。
（６）ＣＩＤ−ＭＳｎ測定において目的とする任意のＢイオンおよび／またはＣイオンを生成することができるアグリコンを有するグリコシド化合物。
（７）ＣＩＤ−ＭＳｎ測定により糖鎖の構造解析を行う方法において、（１）〜（６）のいずれかに記載のグリコシド化合物を参照糖鎖として使用することを特徴とする方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のグリコシド化合物は、ＣＩＤ−ＭＳｎ測定において、効率よく解離し、目的とする任意のＢイオンおよび／またはＣイオンを生成することができる。従って、本発明のグリコシド化合物は、ＣＩＤ−ＭＳｎ測定により糖鎖の構造解析を行う方法において、参照糖鎖として使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を更に詳細に説明するが、以下の構成要件の説明は、本発明の実施態様の代表例であり、本発明はこれらの内容のみに特定されるものではない。
以下の説明において、「ＣＩＤ−ＭＳｎ測定」とは、ＣＩＤ（Collision induced dissociation:衝突誘起解離）によるマススペクトルの取得を行うことを示し、「フラグメントイオン」とは、上記ＣＩＤ−ＭＳｎ測定により得られる各ｍ／ｚを有するイオンを示し、「ｍ／ｚ」とは、質量数（ｍ）と電荷（ｚ）の比を示し、「娘イオン」とは、フラグメントイオンを上記ＣＩＤ−ＭＳ２測定することにより得られる各ｍ／ｚを有するフラグメントイオンを示し、「総イオンカウント数」とは、各ｍ／ｚを有するすべてのフラグメントイオンのイオン強度の総和を示し、また、「ＣＩＤエネルギー」とは、ＣＩＤを起こすときに加えるエネルギーを一般的に示し、実際にはイオンを振動させるためのある周波数の電場の電圧を示す。注目するグリコシド結合に関わる酸素源原子の両端の結合の解裂に関し、「Ｂ−イオン」とは、非還元末端側結合の解裂に由来する非還元末端側フラグメントを指し、「Ｃ−イオン」とは、還元末端側結合の解裂に由来する非還元末端側フラグメントを指す（図１５、Domon, B. and Costello, C.E.(1988) Glycoconj. J. 5, 397-409）。
【００１５】
なお、ＣＩＤ−ＭＳｎ測定を行うことができる質量分析装置であれば、イオン化法としては、ＦＡＢ（高速原子衝撃法）、ＣＩ（化学イオン化法）、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化法）、ＭＡＬＤＩ（マトリクス支援レーザー脱離イオン化法）、ＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化法）等が用いられる。本発明においてはサンプル調製が容易で、かつ、マトリックス由来の夾雑イオンの影響がないＥＳＩ法を用いることが好ましい。しかし、上記ＣＩＤ−ＭＳｎ測定が可能であればイオン化法はこれらに限定されるものではない。また、ＥＳＩ法にはマイクロスプレー法とナノスプレー法があるが、サンプル使用量の面から本発明においてはナノスプレー法が好ましく用いられる。
【００１６】
糖鎖またはその分解物をイオン化する場合、微液滴を真空下溶媒を蒸発させることでイオン化するため水／メタノールあるいは水／アセトニトリル（１：１）を溶媒として用いることができるが、物質の性質に従い選択が可能でありこれに限られることはない。目的糖鎖またはその分解物は、この溶媒に対して０．０１〜１００ｎｍｏｌ／ｍｌ、より好ましくは０．５〜５ｎｍｏｌ／ｍｌ、さらに好ましくは１ｎｍｏｌ／ｍｌの濃度に溶解することが好ましい。
【００１７】
また、ＣＩＤ−ＭＳｎ測定を行なう装置は、これが可能であれば、機種を問うものではないが、本発明においては、ＣＩＤ−ＭＳｎ測定が可能な四重極イオントラップ型質量分析計を用いることが好ましい。このような装置としては、具体的には例えば、ｅｓｑｕｉｒｅ ３０００ ｐｌｕｓ（ブルカーダルトニクス社製）、ＬＣＱ ＤＥＣＡ（サーモフィニガン社製）、ＡＸＩＭＡ ＱＩＴ（島津社製）、ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ（島津社製）等が挙げられる。測定方法としては、各親フラグメントイオンから解離する娘イオンのイオン強度が測定できる方法であればいかなるものでもよいが、具体的には、例えば、熱キャピラリー温度２０〜３６５℃、キャピラリー電圧０〜６．０ｋＶ、ＣＩＤエネルギーが０〜２５Ｖ、ポジティブモードまたはネガティブモードのいずれか等で測定することができる。ポジティブモードを用いる場合には、プロトン、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、アンモニウム等の陽イオンを選択して用いることができる。
【００１８】
目的親フラグメントイオンについて、さらに上述のＣＩＤ−ＭＳｎ測定を行なう。該測定により得られたプロットから、特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数とＣＩＤエネルギーとの関係を示すＣＩＤエネルギー依存曲線を作成する（式１）。このうち、特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数を、該娘イオンの総イオンカウント数と、該娘イオンの総イオンカウント数と上記親イオンの総イオンカウント数の和との比で表すことが好ましい（式２）。なお、式１及び式２は、親イオンＡから娘イオンａ，ｂ，ｃ，ｄ，…，（ｉ），…ｎが生成する場合の関係式を示す。この比で娘イオン強度を表すことにより、微弱なその他のイオンカウント数に影響を受けず、正確なＣＩＤエネルギー依存曲線を作成することができる。特定のｍ／ｚの娘イオンとは、目的親フラグメントイオンから解離する何れの娘イオンでもよいし、その全てでもよい。
【００１９】
【数１】
【００２０】
【数２】
【００２１】
糖鎖の合成においては、還元末端にオクチルオキシ基をはじめとする置換基を導入したグリコシド体とすることがしばしばある。この理由は、１）天然物あるいはその部分構造の合成としての意義（例えばセラミドを導入したスフィンゴ糖脂質や糖ペプチド）や２）生化学的な研究を行う際のバイオプローブとしての理由（セラミドなどに代わる安定なグリコシドや糖鎖複合体を形成するための官能基を導入するため等の理由）である。しかしながら、構造解析の目的でオクチルグリコシドに代表されるアルキルグリコシドのＣＩＤ−ＭＳｎ分析をおこなうと、糖鎖の還元末端に導入したアルキル基を有するフラグメントが一般的にメインのピークとして検出される。天然糖鎖のＣＩＤ−ＭＳｎ情報と糖鎖ライブラリーのＭＳn情報の比較によって糖鎖の構造解析をおこなおうとする場合、任意のＢイオン、Ｃイオンを生成し、さらに、これらのＣＩＤ−ＭＳｎ分析を可能とする必要がある。本発明は、この問題を克服するために糖鎖フラグメントを効果的に与えるグリコシド化合物を提供する。
【００２２】
すなわち、本発明のグリコシド化合物は、ＣＩＤ−ＭＳｎ測定において、目的とする任意のＢイオンおよび／またはＣイオンを生成することができるアグリコンを有することを特徴とするものである。アグリコンとして、例えば、ブロモブチルオキシ基、アルキルフェニルオキシ基、アミノブチルオキシ基、アルキルアミノブチルオキシ基等を有するグリコシド化合物が挙げられる。具体的には、４-ブロモブチルグリコシド化合物、オクチルオキシフェニルグリコシド化合物、４-（n-オクチル）-アミノブチルオキシ基等が挙げられる。アグリコンとしてブロモブチルオキシ基またはアルキルフェニルオキシ基を有するグリコシド化合物は、ＣＩＤ−ＭＳｎ測定において目的とする任意のＢイオンを生成することができる。また、アグリコンとしてアミノブチルオキシ基またはアルキルアミノブチルオキシ基を有するグリコシド化合物は、ＣＩＤ−ＭＳｎ測定において目的とする任意のＣイオンを生成することができる。
また、アミノ基を有する化合物は、種々の物質と容易に結合することができる。したがって、本発明のアグリコンとしてアミノブチルオキシ基を有するグリコシド化合物は、タンパク質、蛍光分子、発光分子、様々な素材からなるビーズや基盤、また、磁性ビーズなどとの複合体を供給することができる。
【００２３】
本発明のグリコシド化合物は、公知の方法により合成することができる。化学合成の行程における選択的な脱保護の条件に対してブロモ基が不安定である等の理由から利用することができない場合、例えば、しばしば用いられる接触還元条件下、ブロモ基の還元反応が起こるため使用することができないため問題となる場合がある。このような場合には、アルキルオキシフェニルグリコシド等に代表されるフェニルグリコシド化合物を利用することができる。合成化学における保護基としてはＲ＝Ｍｅがよく知られているが、合成後の生成を容易にするためには、逆相カートリッジカラム等により迅速に単離が可能である、例えばＲ＝Ｃ８Ｈ１７を用いることが望ましい。
【００２４】
また、本発明のグリコシド化合物は、アグリコンが保護基で保護されているグリコシド化合物を前駆体として、この前駆体の保護基を脱保護することにより合成することができる。例えばアグリコンの保護基を有するアミノ基（−ＮＲ１Ｒ２）においては、保護基Ｒ１及びＲ２は、次に示す置換基群からそれぞれ独立に選択される組み合わせからなる。すなわち、Ｒ１は、水素、ケイ素官能基、アルキル基、ベンジル基、またはアルキル基を表し、ケイ素官能基、アラルキル基、ベンジル基およびアラルキル基においてはその一部がさらに置換されていてもよい。ケイ素官能基における置換基はアルキル基およびアラルキル基が代表的であり、tert-ブチルジメチルシリル、メチルジ-tert-ブチルシリル、イソプロピルジメチルシリル、メチルジイソプロピルシリル、(トリフェニルメチル)ジメチルシリル、及びtert-ブチルジフェニルシリル基が挙げられる。アルキル基、ベンジル基、またはアラルキル基における置換基としては、アルキル基、ベンジル基、アラルキル基、およびハロゲン、ヒドロキシル基、アルコキシ基、シアノ基、スルホニル基、ニトロ基、アジド基、アミノ基、あるいはアミノ保護基等である。またＲ２は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル基、アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、スルホニル基、あるいはアミノ保護基等を適宜使用することができる。具体的なアミノ保護基としては、“Protective Groups in Organic Synthesis” T. W. Greene, John Wiley & Sons、に記載されるカーバメート型アミノ保護基等を適宜選択することができる。Ｒ１またはＲ２は、好ましくは、t-ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）及びトリメチルシリルオキシカルボニル基（Ｔｅｏｃ基）であり、より好ましくはＢｏｃ基である。Ｒ１とＲ２は同じであっても異なっていてもよいが、反応過程においてBarton型反応に適したシアノ基およびニトロ基に代表される電子吸引性置換基が結合した置換アミノ基や、無保護の１級あるいは２級アミノ基を生成する組み合わせが好ましい。具体的には、アグリコンが保護基で保護されているグリコシド化合物として、アグリコンとしてのアミノブチルオキシ基のアミノ基がＢｏｃ基またはＴｅｏｃ基で保護されているグリコシド化合物が挙げられる。
【００２５】
さらに、前記の前駆体をＣＩＤすることによっても、本発明のグリコシド化合物を生成することができる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１：４-ブロモブチルグリコシド化合物の合成
（１）４-ブロモブチルグリコシド化合物の合成
４-ブロモブチルグリコシド化合物の合成経路を図１に示した。すなわち、ラクトースから容易に調製されるラクトースオクタアセチル化合物１をＢＦ３−Ｅｔ２Ｏの存在下ジクロロエタン中４−ブロモブタノールと反応させグリコシド化合物２とした。化合物２のアセチル基をＮａＯＭｅで除去し、化合物３をアノマー混合物として得た。これをＨＰＬＣにより分離精製すると化合物３Aおよび３Bが得られた。
【００２７】
（２）化合物２の合成
α,β-Lactose octaacetate (図１の１, 102mg, 0.150mmol, α/β=1/15)と4-bromobutanol (92μL, 0.60mmol)のDCE (3.0mL)溶液に、室温、窒素雰囲気、攪拌下でBF3-Et2O (38μL, 0.30mmol)を滴下し、70℃で一晩反応させた。反応終了後、EtOAcで希釈し、飽和NaHCO3 水溶液を注ぎ抽出し、有機相をさらに飽和NaHCO3水溶液、飽和食塩水で抽出し、MgSO4で乾燥後、濾過、濃縮した。残渣をシリカゲルカラム(Hex:EtOAc=1.7:1)で精製することで、化合物２ (図１の２, 14.8mg, 12.8%, α/β=10/1)をsyrupとして得た。Rf 0.15 (Hex:EtOAc=2:3); 1H NMR (CDCl3): 5.36 (d, 1H, J4’,5’ 2.9 Hz, H-4’), 5.21 (t, 1H, J3,4 9.5 Hz, H-3), 5.13 (dd, 1H, J2’,3’ 10.4 Hz, H-2’), 4.96 (dd, 1H, J3’,4’3.4 Hz, H-3’), 4.85 (d, 1H, J1,23.9 Hz, H-1), 4.51 (d, 1H, J1’,2’7.9 Hz, H-1’), 4.42 (dd, 1H, J5,6a 1.9 Hz, J6a,6b11.9 Hz, H-6a), 4.18 (dd, 1H, J5’,6a’ 6.0 Hz, J6a’,6b’11.1 Hz, H-6a’), 4.13 (dd, 1H, J5,6b 5.0 Hz, H-6b), 4.08 (dd, 1H, J5’,6b’ 7.8 Hz, H-6b’), 3.91-3.84 (m, 2H, H-5,5’), 3.76 [dt, 1H, J 6.4 Hz, J 9.9 Hz, OCH2(CH2)2CH2Br], 3.67 (t, 1H, J4,5 9.7 Hz, H-4), 3.57 (dd, 1H, J2,3 10.0 Hz, H-2), 3.51 [dt, 1H, J 6.7 Hz, J 10.2 Hz, OCH2(CH2)2CH2Br], 3.46 [t, 2H, J 6.5 Hz, OCH2(CH2)2CH2Br], 2.16 (s, 3H, CH3CO), 2.13 (s, 3H, CH3CO), 2.12 (s, 3H, CH3CO), 2.06 (s, 6H, CH3CO), 2.04 (s, 3H, CH3CO), 1.97 (s, 3H, CH3CO), 1.96 [m, 2H, O(CH2)2CH2CH2Br], 1.80 [m, 2H, OCH2CH2CH2CH2Br].
【００２８】
（３）化合物３の合成
化合物３ (14.8mg, 19.2μmol)のMeOH (2.0mL)溶液に、室温、攪拌下で1M NaOMe/MeOHを滴下した。反応終了後、濃縮し、得られた残渣を逆相カラム（C-18 Sep-Pak, MeOH）で精製することで、化合物3（9.0mg, 98%, α/β=11/1）を得た。Rf 0.11 (DCM:MeOH=3:1); 1H NMR (D2O)。合成したα／βの混合物は、HPLC-MSにより単離した。α体（図１の３Ａ）とβ体（図１の３Ｂ）の分離条件：Imtakt C18；240 mm L×100 mm I.D.；流速 1.0 ml/min；溶媒 H2O/CH3CN ＝ 92：8；カラム温度：25度；化合物３Ａの溶出時間：19.8分；化合物３Ｂの溶出時間：21.2分。
化合物３Ａ：1H NMR (D2O): 4.87 (d, 1H, J1, 2 3.8 Hz, H-1), 4.41 (d, 1H, J1’, 2’ 7.8 Hz, H-1’), 3.89-3.86 (m, 2H), 3.82-3.67 (m, 7H), 3.64-3.59 (m, 2H), 3.57-3.48 (m, 5H), 1.97-1.87 (m, 2H), 1.77-1.71 (m, 2H).
化合物３Ｂ：1H NMR (D2O): 4.45 (d, 1H, J1, 2 8.2 Hz, H-1), 4.41 (d, 1H, J1’, 2’ 7.8 Hz, H-1’), 3.95-3.88 (m, 3H), 3.78-3.48 (m, 12H), 3.26 (m, 1H), 1.97-1.87 (m, 2H), 1.77-1.70 (m, 2H).
【００２９】
実施例２：オクチル、ブチル、および、４-ブロモブチルグリコシド化合物のＣＩＤ−ＭＳｎ測定における比較／ブロモブチル基のＣＩＤ−ＭＳｎ解析における有用性
アグリコンがオクチルオキシ基のサンプルを分析すると、α-オクチル化合物はｍ／ｚ３４７、β-オクチル化合物はｍ／ｚ３１５が主たるフラグメントイオンとして検出された（図２Ａ、図３Ａ）。α-オクチル化合物で検出された主たるイオンはｍ／ｚ３４７でオクチルオキシ基が脱離したイオンである。一見効率良く目的のフラグメントが得られているようだが、絶対値で示したグラフにおいてプリカーサーイオンの元強度に対するフラグメントイオンの減衰が著しいことが明確である（イオン収率：＜１０％）（図２Ｂ、図３Ｂ）。これは、さらに詳細な構造情報を取得するため次のＣＩＤ−ＭＳｎ(ここではＭＳ3) 分析を行おうとする際、取得データの不安定化を引き起こすことに繋がり好ましくない。アグリコンがブチルオキシ基の場合でも同様の結果を得た（図４、図５）。すなわち、このような現象はアルキルグリコシドにおいて一般的であると言える。
【００３０】
構成糖がガラクトースとグルコースであり、結合位置が１−４、アグリコンがそれぞれオクチルオキシ基、ブチルオキシ基、ブロモブチルオキシ基である、Ｇａｌα１−４Ｇｌｃα／β−Ｏｃｔｙｌ、Ｇａｌα１−４Ｇｌｃα／β−Ｂｕｔｙｌ、Ｇａｌα１−４Ｇｌｃα／β−ＢｒｏｍｏＢｕｔｙｌの質量分析条件下における解裂に関する実験により比較検討した(図２〜図７)。
【００３１】
アグリコンがブロモブチルオキシ基のサンプルを分析すると、α体、β体共にｍ／ｚ 347（Ｂイオン）が主たるフラグメントイオンとして得られた（図６Ａ、図７Ａ）。また、絶対値でグラフ化したものをみると、プレカーサーイオンの減衰がほとんど無いことがわかる（イオン収率：＞９０％）（図６Ｂ、図７Ｂ）。これは、糖鎖のみのフラグメントを効率よく検出できるのみならず、次のＣＩＤ−ＭＳｎ(ここではＭＳ3)分析の際、データを安定に取得できると共に、ＭＳ4、ＭＳ5・・・、といった多段階分析を可能とするために有効である。すなわち、ブロモブチルグリコシド化合物は、糖由来のフラグメントイオン、特に、Ｂイオンを極めて効率よく生成することを特徴とする。したがって、本グリコシド化合物は、糖鎖の構造解析において重要な多くの構造情報を提供する。
【００３２】
実施例３：オクチルオキシフェニルグリコシド化合物の合成
実施例２に記載したブロモブチルグリコシド化合物は、糖由来のフラグメントイオン、特に、Ｂイオンを極めて効率よく生成することを特徴とする。したがって、本グリコシド化合物は、糖鎖の構造解析において重要な多くの構造情報を提供する。しかし、化学合成の行程における選択的な脱保護の条件に対してブロモ基が不安定である等の理由から利用することができない場合、例えば、しばしば用いられる接触還元条件下、ブロモ基の還元反応が起こるため使用することができないため問題となる場合がある。このような場合には、アルキルオキシフェニルグリコシド等に代表されるフェニルグリコシド化合物４（図８）を利用することができる。合成化学における保護基としてはＲ＝Ｍｅがよく知られているが、合成後の生成を容易にするためには、逆相カートリッジカラム等により迅速に単離が可能である、例えばＲ＝Ｃ８Ｈ１７を用いることが望まれる。
【００３３】
（１）4-n-Octyloxyphenyl Galの合成
容易に調製される化合物５をＢＦ３−Ｅｔ２Ｏ存在下ジクロロメタン中オクチルオキシフェノールと反応させ化合物６を合成した。この化合物を直ちにメタノールに溶解しＮａＯＭｅでアセチル基を脱保護して化合物７へと導いた（図９）。
（２）化合物６および７の合成
Phenyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (図９の５, 59.1 mg, 134 μmol)と4-n-Octyloxyphenol (60.3 mg, 263 μmol)のDCM (0.9 mL)溶液に、窒素雰囲気、０℃でBF3-Et2O (38μL, 0.30mmol)を滴下し、一晩反応させた。反応終了後、EtOAcで希釈し、飽和NaHCO3 水溶液を注ぎ抽出し、有機相をさらに飽和NaHCO3水溶液、飽和食塩水で抽出し、MgSO4で乾燥後、濾過、濃縮した。残渣を分取用TLC (Hex : EtOAc = 2.7 : 1)で精製することで化合物６をシロップとして得た。化合物６のMeOH (2.0 mL)溶液に、室温、攪拌下で1M NaOMe/MeOHを滴下した。反応終了後、濃縮し、得られた残渣を逆相カラム（C-18 Sep-Pak, MeOH）で精製することで、化合物７(5.0 mg, 9.7 %)をシロップとして得た。
化合物６; Rf 0.31 (Hex / EtOAc= 2.7 / 1); 1H NMR (CDCl3): 6.97 (d, 2H, J 9.1 Hz, aromatic proton), 6.82 (d, 2H, J 9.1 Hz, aromatic proton), 5.65 (d, 1H, J1, 2 3.6 Hz, H-1), 5.56 (dd, 1H, J3, 4 3.4 Hz, H-3), 5.53 (bd, 1H, J 3.1 Hz, H-4), 5.26 (dd, 1H, J2, 3 10.7 Hz, H-2), 4.39 (t, 1H, J6.7 Hz, H-5), 4.13 (dd, 1H, J5, 6 6.1 Hz, J6, 6’ 11.3 Hz, H-6), 4.08 (dd, 1H, J5, 6’ 7.1 Hz, H-6’), 3.90 {t, 2H, OCH2(CH2)6CH3}, 3.72 (dd, 1H, J5, 6 5.7 Hz, J6, 6’11.4 Hz, H-6), 3.68 (dd, 1H, J5, 6’ 6.5 Hz, H-6’), 2.17, 2.09, 2.03, 1.98 (s x 4, 12H, CH3CO), 1.76 [quintet, 2H, OCH2CH2(CH2)6CH3], 1.44 [quintet, 2H, O(CH2)2CH2(CH2)4CH3], 1.40-1.28 [m, 8H, O(CH2)3(CH2)4CH3], 0.89 [t, 3H, J 6.8 Hz, O(CH2)7CH3].
化合物７; Rf 0.18 (DCM / MeOH= 8 / 1); 1H NMR (CD3OD): 7.09 (d, 2H, J 9.1 Hz, aromatic proton), 6.82 (d, 2H, J 9.1 Hz, aromatic proton), 5.34 (d, 1H, J1, 2 3.0 Hz, H-1), 3.99-3.96 (m, 2H, H-5), 3.94-3.89 {m, 4H, H-2, OCH2(CH2)6CH3}, 3.72 (dd, 1H, J5, 6 5.7 Hz, J6, 6’11.4 Hz, H-6), 3.68 (dd, 1H, J5, 6’ 6.5 Hz, H-6’), 1.74 [quintet, 2H, OCH2CH2(CH2)6CH3], 1.46 [quintet, 2H, O(CH2)2CH2(CH2)4CH3], 1.40-1.27 [m, 8H, O(CH2)3(CH2)4CH3], 0.91 [t, 3H, J 6.8 Hz, O(CH2)7CH3].
【００３４】
実施例４：オクチルオキシフェニルグリコシド化合物のＣＩＤ−ＭＳｎ測定結果
得られる糖鎖フラグメントはＢイオンである。フェニルグリコシド化合物は、糖由来のフラグメントイオン、特に、Ｂイオンを良好な効率で生成（１２％）し、糖鎖の構造解析において重要な多くの構造情報を提供する（図１０）。
【００３５】
実施例５：Ｂｏｃ保護-４-アミノブチルグリコシド化合物の合成
糖鎖の質量分析法による構造解析において、重要な構造情報を与えるフラグメントイオンとして、Ｃイオンを挙げることができる。しかし、糖鎖の構造解析において一般的に観測されるにもかかわらず、Ｃイオンを任意に人為的に発生させる方法が無かった。そこで、この目的のために努力した結果、アミノブチルグリコシド化合物（図１１の１３）、あるいは、この等価体として、アミノ基の保護体（図１１の１２、１４）を用いることができることを発見した。
【００３６】
さらに、本アグリコンの別の目的は、糖鎖の機能、あるいは、医薬品探索の目的で糖鎖アレーの作成とこれに次ぐ機能スクリーニングをあげることができる。すなわち、糖鎖ライブラリーは、質量分析による糖鎖の極微量構造解析に有効なだけでなく、糖鎖アレーなどの応用展開による糖鎖機能解析の材料として有望である。その両条件を満足することができるグリコシドの構造を示唆する公知の情報は皆無であった。そのような観点から設計される糖鎖ライブラリーとして、還元末端にオクチルグリコシドを有する3糖を初期に設計していたが、より目的に応じた機能性グリコシドを探索した結果、４−保護アミノブチルグリコシドの発見に至った。
【００３７】
以下に、アミノ基を保護したアミノブチルグリコシド化合物の合成を詳細に説明する。３糖の還元末端に導入されるグリコシドに期待される効果としては、以下の３つを挙げることができる。１．効率的な単離精製を可能にする疎水性タグである。２．他の保護基の存在下に選択的に脱保護ができる。３．多段階質量分析において単糖間グリコシド結合より速やかに脱落し、ＢおよびＣイオンを与える。４．簡単な処理により他分子との結合が可能になる官能基を有する。
【００３８】
ここでこれまでに得た情報を総合すると以下のようである。１．オクチルグリコシドは疎水性タグとして優れていたが、他の２条件において必ずしも良好ではない。２．４−ブロモブチルグリコシドは３条件を満たすが、合成工程で還元条件が使用できない。３．オクチルオキシフェニルグリコシド化合物はここまですべての問題を解決するが、Ｃイオンが得られない。
【００３９】
質量分析時に見られた４−ブロモブチルグリコシドの高いアグリコン脱離能は、遠隔ラジカル開裂に起因するものと理解できるが、類似構造の４−置換ブチルグリコシドも同等あるいはそれ以上の性能を秘めている可能性があると考えた。また、将来的に他分子との結合を考慮して、４位の置換基としてアミノ基を有する化合物（図１１の１４）が有効であると考えられ、疎水性タグ性能を確保するためにそのアミノ基を保護した４−保護アミノブチルグリコシドを合成し、その可能性を検証した。
【００４０】
アミノ保護基として、トリフルオロ酢酸およびフッ化テトラブチルアンモニウムにより容易に除去が可能なＢｏｃ（tert-butyloxycarbonyl）基、および、Ｔｅｏｃ（2-trimethylsilyletnoxycarbonyl）基を選択し、ラクトースの４−Ｂｏｃアミノブチルグリコシド化合物（図１１の１１）、および、４−Ｔｅｏｃアミノブチルグリコシド化合物（図１１の１３）を調製した（図１１）。
【００４１】
（１）化合物９の合成
化合物８(1.0 g, 2.30 mmol)のDMF(11.5 mL)溶液に水素化ナトリウム(60% in oil, 0.92 g, 23.0 mmol)を加え、２０℃で１時間撹拌した。この溶液を０℃に冷却し、ベンジルブロミド(2.74 mL, 23.0 mmol)を加え、２０℃で１３時間撹拌した後、メタノール（ca. 2 mL）を加えて反応を停止した。この溶液を飽和食塩水にあけ酢酸エチルで抽出した有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラム（エーテル：ヘキサン＝１：４−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）にて精製して化合物９(2.3 g)を白色固体として得た（収率９４％）。化合物９：1H NMR (CDCl3): δ 7.56-7.09 (m, 40H, Ph), 5.08, 4.67 (each d, 2H, J 10.4 Hz, benzyl), 4.97, 4.54 (each d, 2H, J 11.4 Hz, benzyl), 4.81, 4.77 (each d, 2H, J 11.2 Hz, benzyl), 4.79 (s, 2H, benzyl), 4.72, 4.69 (each d, 2H, J 11.9 Hz, benzyl), 4.63 (d, 1H, J1,29.8 Hz, H-1), 4.52, 4.40 (each d, 2H, J11.9 Hz, benzyl), 4.45 (d, 1H, J1’,2’7.7 Hz, H-1’), 4.33, 4.23 (each d, 2H, J11.2 Hz, benzyl), 3.95 (t, 1H, J3,4= J4,5 9.5 Hz, H-4), 3.93 (d, 1H, J3’,4’ 2.8 Hz, H-4’), 3.82 (dd, 1H, J5,6a 4.4 Hz, J6a,6b11.0 Hz, H-6a), 3.77 (dd, 1H, J2’,3’ 9.6 Hz, H-2’), 3.77 (dd, 1H, J5,6b 1.6 Hz, H-6b), 3.61 (t, 1H, J2,3 8.9 Hz, H-3), 3.52 (t, 1H, J5’,6’a= J6’a,6’b 8.2 Hz, H-6’a), 3.46-3.32 (m, 5H, H-2,3’,5,5’,6’b).
【００４２】
（２）化合物１０の合成
化合物９(450 mg, 0.422 mmol) とN-Boc-amino-1-butanol (240 mg, 1.27 mmol) のジクロロエタン溶液（4.2 mL）にモレキュラーシーブス（AW-300, ca. 500 mg）を加え、窒素雰囲気下２０℃にて１時間撹拌した。０℃に冷却してこの溶液にNIS (145 mg, 0.634 mmol) を加えた後、TfOH (7.5 x 10-3mL, 84.5 x 10-3 mmol)を加えて１０分間反応させた。反応溶液に飽和重曹水を加えて反応を停止してセライトろ過した後、ジクロロメタン抽出した溶液を１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液および蒸留水で順次洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１〜２：１）にて精製して化合物１０を収率６６％(320 mg, α：β＝４５：５５)で得た。化合物１０(α：β = 60 : 40)：1H NMR (CDCl3): δ 7.38-7.10 (m, 35H, Ph), 5.05-4.68, 4.62-4.50, 4.39-4.22 (each m, 14H, benzyl), 4.66 (d, 0.6H, J1,2 3.7 Hz, H-1α), 4.43 (d, 0.4H, J1’,2’ 7.7 Hz, H-1’β), 4.35 (d, 0.4H, J1,2 8.7 Hz, H-1β), 4.32 (d, 0.6H, J1’,2’ 7.3 Hz, H-1’α), 3.94-3.88, 3.84-3.71, 3.66-3.46, 3.42-3.29 {each m, 15H, H-2,3,4,5,6a,6b,2’,3’,4’,5’,6’a,6’b,NH, OCH2(CH2)2CH2NHBoc}, 3.16-3.08 {m, 2H, OCH2(CH2)2CH2NHBoc}, 1.70-1.50 (m, 4H, OCH2(CH2)2CH2NHBoc), 1.43 (s, 9H, t-Bu). 13C NMR (CDCl3): δ・155.94, 155.89, 139.37, 139.04, 138.98, 138.97, 138.84, 138.70, 138.64, 138.51, 138.47, 138.43, 138.27, 138.08, 138.00, 137.99, 128.31, 128.28, 128.24, 128.22, 128.18, 128.16, 128.09, 128.02, 127.98, 127.93, 127.91, 127.87, 127.82, 127.78, 127.75, 127.67, 127.62, 127.52, 127.48, 127.45, 127.38, 127.35, 127.33, 127.28, 127.09, 127.02, 126.94, 103.42, 102.77, 102.72, 97.04, 82.93, 82.44, 82.41, 81.68, 80.20, 79.86, 79.00, 78.90, 75.32, 75.16, 75.07, 75.03, 74.91, 74.63, 73.52, 73.46, 73.44, 73.34, 73.31, 73.03, 72.99, 72.95, 72.86, 72.46, 72.42, 70.13, 69.37, 68.21, 68.06, 67.96, 67.66, 40.19, 40.13, 28.38, 26.89, 26.85, 26.45.
【００４３】
（３）化合物１１の合成
化合物１０(43 mg, 37.6 x 10-3 mmol)を酢酸エチル-メタノール混合溶液（１：１, 2 mL）に溶かし、20 wt%水酸化パラジウム/C（ca. 10 mg）存在下で水素添加して化合物１１を定量的収率（19.3 mg）で得た。化合物１１(α：β = 50 : 50)：1H NMR (D2O): δ 4.87 (d, 0.5H, J1,23.7 Hz, H-1α), 4.46 (d, 0.5H, J1,28.0 Hz, H-1β), 4.41 (d, 1H, J1’,2’7.8 Hz, H-1’), 3.95-3.49 {m, 12H, H-2,2’,3,3’,4,4’,5,5’,6a,6’a,6b,6’b,OCH2(CH2)2CH2NHBoc}, 3.56 (dd, 0.5H, J2,39.7 Hz, H-2α), 3.27 (m, 0.5H, H-2β), 3.06 {t, 2H, J 6.6 Hz, OCH2(CH2)2CH2NHBoc}, 1.65-1.47 {m, 4H, OCH2(CH2)2CH2NHBoc}, 1.39 (s, 9H, t-Bu). 13C NMR (D2O): δ 158.75, 103.28, 103.22, 102.39, 98.21, 81.19, 78.69, 75.73, 75.12, 74.78, 73.19, 72.92, 72.87, 72.12, 71.36, 71.33, 70.80, 70.51, 68.92, 68.31, 61.42, 61.40, 60.42, 60.24, 40.08, 28.06, 26.87, 26.41, 26.28, 26.19, 25.85, 20.28.
【００４４】
（４）化合物１３の合成
化合物１０(54 mg, 47.2 x 10-3 mmol)をジクロロメタン（1 mL）に溶かしトリフルオロ酢酸（1 mL）を加え室温で３０分間撹拌した後、濃縮して脱Boc体を得た。これをトリエチルアミン(ca. 200 mg)を含む1,4-ジオキサン（1 mL）に溶かし、1-[2-(トリメチルシリル)エトキシカルボニル]ピロリジン-2,5-ジオン（14.7 mg, 56.6 x 10-3 mmol）を加えて室温で３０分間撹拌した。反応溶液を濃縮して得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１〜３：１）にて精製して化合物５を２工程収率７３％（40.9 mg）で得た。この化合物５を酢酸エチル-メタノール混合溶液（１：１, 3 mL）に溶かし、20 wt%水酸化パラジウム/C（ca. 10 mg）存在下で水素添加して化合物１３を定量的収率（19.2 mg）で得た。化合物１３(α：β = 60 : 40)；1H NMR (D2O): δ 4.87 (d, 0.6H, J1,2 3.7 Hz, H-1α), 4.44 (d, 0.4H, J1,2 8.0 Hz, H-1β), 4.41 (d, 1H, J1’,2’7.8 Hz, H-1’), 4.15 (t, 2H, OCH2CH2TMS), 3.95-3.49 {m, 12H, H-2,2’,3,3’,4,4’,5,5’,6a,6’a,6b,6’b,OCH2(CH2)2CH2NHTeoc}, 3.56 (dd, 0.6H, J2,39.9 Hz, H-2α), 3.27 (m, 0.4H, H-2β), 3.11 {t, 2H, J 5.9 Hz, OCH2(CH2)2CH2NHTeoc}, 1.64-1.51 {m, 4H, OCH2(CH2)2CH2NHBoc}, 0.96 (t, 2H, OCH2CH2TMS), 0.00 (s, 9H, TMS). 13C NMR (D2O ): δ・159.36, 103.29, 103.22, 102.39, 98.22, 78.70, 75.74, 75.14, 74.80, 73.20, 72.92, 72.88, 72.12, 71.37, 71.33, 70.80, 70.50, 68.93, 68.31, 64.39, 61.43, 61.41, 60.43, 60.24, 40.38, 40.31, 26.38, 26.25, 26.19, 25.85, 25.54, 17.33, 0.20, -2.04, -2.24.
【００４５】
（５）化合物１４の合成
化合物１３(3.5 mg, 6.28 x 10-3 mmol)を水（20 x 10-3 mL）に溶かしフッ化テトラブチルアンモニウム（1 M テトラヒドロフラン溶液；19 x 10-3 mL : 3 equiv.）を加え室温で２０時間撹拌した後、溶液を濃縮して脱Teoc体１４を定量的収率で得た。化合物１４ (α：β = 60 : 40)；1H NMR (D2O): δ 4.87 (d, 0.6H, J1,2 3.8 Hz, H-1α), 4.45 (d, 0.4H, J1,2 8.0 Hz, H-1β), 4.41 (d, 1H, J1’,2’ 7.8 Hz, H-1’α), 4.40 (d, 1H, J1’,2’ 7.8 Hz, H-1’β), 3.96-3.48 {m, 14H, H-2,2’,3,3’,4,4’,5,5’,6a,6’a,6b,6’b,OCH2(CH2)2CH2NH2}, 3.00 {t, 2H, J 7.4 Hz, OCH2(CH2)2CH2NH2}, 1.77-1.60 {m, 4H, OCH2(CH2)2CH2NH2}.
【００４６】
実施例６：保護-４-アミノブチルグリコシド化合物（１１および１３）のＣＩＤ−ＭＳｎ測定結果
（１）化合物１３のＣＩＤ−ＭＳｎ測定
Ｔｅｏｃ保護-４-アミノブチルグリコシド化合物（図１１の１３）の分子イオンピークｍ／ｚ５８０．３をＣＩＤ−ＭＳ２分析した結果、Ｔｅｏｃ基の部分分解とそれによって生成するアミノブチルグリコシドの分子イオンピークｍ／ｚ４３６．１を確認した（図１２A）。得られたアミノブチルグリコシドの分子イオンピークｍ／ｚ４３６．１をさらにＣＩＤ−ＭＳ３分析した結果、ラクトースの分子イオンピークｍ／ｚ３６５．０とその脱水物ｍ／ｚ３４７．０が主生成することが確認された（図１２B）。
【００４７】
（２）化合物１１のＣＩＤ−ＭＳｎ測定
Ｂｏｃ保護-４-アミノブチルグリコシド化合物（図１１の１１）の分子イオンピークｍ／ｚ５３６．３をＣＩＤ−ＭＳ２分析した結果、Ｂｏｃ基のｔ−ｂｕｔｙｌ基の脱離によるフラグメントイオンｍ／ｚ４８０．１とＢｏｃ基の脱離したイオンである４−アミノブチルグリコシドｍ／ｚ４３６．１が確認された（図１３A）。得られた４−アミノブチルグリコシドｍ／ｚ４３６．１をさらにＣＩＤ−ＭＳ３分析するとラクトースｍ／ｚ３６５．０およびその脱水物ｍ／ｚ３４７．０の生成が確認された（図１３B）。Ｂｏｃ基のｔ−ｂｕｔｙｌ基脱離イオンｍ／ｚ４８０．１のＣＩＤ−ＭＳ3分析では、Ｂｏｃ脱離物である４−アミノブチルグリコシドｍ／ｚ４３６．１が確認された（図１３C）。得られたラクトースイオンｍ／ｚ３６５．０についてＣＩＤ−ＭＳ４分析すると、脱水物ｍ／ｚ３４７．０が確認された（図１３D）。ＭＳ3分析で得られた脱水物イオンｍ／ｚ３４７．０についてＣＩＤ−ＭＳ４分析すると、単糖間グリコシド結合の開裂に伴うイオンｍ／ｚ１８４．８が観測された（図１３E）。
【００４８】
（３）アミノブチルグリコシドの推定脱離機構
以上の事実から、４−Ｂｏｃアミノブチルグリコシド（図１１の１１）、および、４−Ｔｅｏｃアミノブチルグリコシド（図１１の１３）は、ＣＩＤ−ＭＳｎ解析において速やかに４−アミノブチルグリコシドへと変換され、これが単糖間グリコシド結合を損なうこと無く2糖の分子イオンピークを与えたものであると結論される。一連の分解過程は次の図１４に要約される。
【００４９】
通常の脂肪族アミンでは、窒素原子に続く炭素−炭素結合（αβ）開裂が観測されるが、長い鎖をもつアミンからは環状構造のフラグメントが生成することが示唆されており、４−アミノブチルグリコシドの場合は後者に属するものと考えられる。環状アミンをフラグメントとして生成するためには、グリコシド結合を構成する炭素−酸素結合ではなく、アグリコンに含まれる炭素−炭素結合が開裂することになり、ＣＩＤ−ＭＳｎ測定によって最終的に１−ＯＨ体（ｍ／ｚ３６５．０）が観測された事実は、そのようなアグリコン脱離機構を支持するものであると考えられる。
【００５０】
４−ブロモブチルグリコシドがＭＳ分析条件下において呈した遠隔ラジカル開裂に伴うアグリコン脱離では、グリコシド結合を構成する酸素原子がアグリコンに含まれるために、Ｂイオン情報の取得に有効であるが１−ＯＨ体が観測されない。すなわち、Ｃイオンに関する情報が得られない欠点がある。一方、４−アミノブチルグリコシドからは１−ＯＨ体が生成するので、オリゴ糖の還元末端を保持したＣイオン情報の取得に特に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、４-ブロモブチルグリコシド化合物の合成経路を示す。
【図２】図２は、アグリコンがオクチルオキシ基のグリコシド化合物（α体）をＣＩＤ−ＭＳｎ測定した結果を示す。Ａは、１００分率表示のERMS、Ｂは、イオン電流で表したERMSである。
【図３】図３は、アグリコンがオクチルオキシ基のグリコシド化合物（β体）をＣＩＤ−ＭＳｎ測定した結果を示す。Ａは、１００分率表示のERMS、Ｂは、イオン電流で表したERMSである。
【図４】図４は、アグリコンがブチルオキシ基のグリコシド化合物（α体）をＣＩＤ−ＭＳｎ測定した結果を示す。Ａは、１００分率表示のERMS、Ｂは、イオン電流で表したERMSである。
【図５】図５は、アグリコンがブチルオキシ基のグリコシド化合物（β体）をＣＩＤ−ＭＳｎ測定した結果を示す。Ａは、１００分率表示のERMS、Ｂは、イオン電流で表したERMSである。
【図６】図６は、アグリコンがブロモブチルオキシ基のグリコシド化合物（α体）をＣＩＤ−ＭＳｎ測定した結果を示す。Ａは、１００分率表示のERMS、Ｂは、イオン電流で表したERMSである。
【図７】図７は、アグリコンがブロモブチルオキシ基のグリコシド化合物（β体）をＣＩＤ−ＭＳｎ測定した結果を示す。Ａは、１００分率表示のERMS、Ｂは、イオン電流で表したERMSである。
【図８】図８は、アルキルオキシフェニルグリコシド化合物の化学構造式を示す。
【図９】図９は、４−ｎ−オクチルオキシフェニルグリコシド化合物の合成経路を示す。
【図１０】図１０は、オクチルオキシフェニルグリコシド化合物をＣＩＤ−ＭＳｎ測定した結果を示す。
【図１１】図１１は、Ｂｏｃ保護-４−アミノブチルグリコシド化合物およびＴｅｏｃ保護-４−アミノブチルグリコシド化合物の合成経路を示す。
【図１２】図１２は、Ｔｅｏｃ保護-４-アミノブチルグリコシド化合物をＣＩＤ−ＭＳｎ測定した結果を示す。
【図１３】図１３は、Ｂｏｃ保護-４-アミノブチルグリコシド化合物をＣＩＤ−ＭＳｎ測定した結果を示す。
【図１４】図１４は、アミノブチルグリコシドの推定脱離機構を示す。
【図１５】図１５は、Ｂ−イオンおよびＣ−イオンを説明する図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、構造未知の糖鎖についてＣＩＤ−ＭＳｎ測定を行い、得られたデータをすでに取得されている参照データと比較することにより該糖鎖の構造解析を行う方法において、より効率的に糖鎖のフラグメントイオンを与える化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は主に細胞表面に糖タンパク質や糖脂質の一部として存在し、発生、分化誘導、受精、免疫、癌化、感染症等、様々な生命現象に深く関与している。このように多彩な機能を有する糖鎖の研究は近年盛んになっている。また、糖鎖は、タンパク質の翻訳後修飾の重要な部分を占め、今後の大きな研究対象である。糖タンパク質や糖脂質の機能は糖鎖により制御される場合があり、糖鎖の構造解析を極微量において達成する技術が必要である。しかし、糖鎖は生物工学的手法により増幅ができない分子種であるため、微量の物質のみで構造解析を達成することを可能とする新たな構造解析技術の開発が必要である。タンパク質の配列はゲノム配列が判明している場合、対応するタンパク質のアミノ酸配列も取得できるため、目的のタンパク質のアミノ酸配列は質量分析（例えば、ＭＳ／ＭＳ（ＭＳ２）法）により解析することができる。しかし、被修飾タンパク質の配列解析技術については今後の課題として残されている。特に、糖鎖によるタンパク質の修飾は極めて大きな分子の多様性を生み出している。したがって、糖鎖の構造解析技術の開発は必要不可欠である。
【０００３】
糖鎖は、核酸やタンパク質とは異なり配列以外の要因による構造異性体群を形成している。この理由の基本は、糖鎖を形成する単糖には反応点となる水酸基が複数存在するため結合位置異性体を形成する性質を有し、かつ、単糖間の結合の際にはアノメリック位の立体異性によるアノマー異性体を形成する性質を有しているためである。単糖間の結合は、生物体内においては糖鎖の合成に関わる酵素群の連続反応により行われるため、必ずしも組み合わせの原理に基づく糖鎖群を形成しているわけではない。しかし、酵素反応は副反応を伴うことが知られており、このような現象の生物における意味は解明されておらず、このような場合には遺伝情報によることのない全く新しい概念に基づく構造解析法が必要である。もちろん、遺伝情報が解明されていない、また、糖鎖の生合成経路が解明されていない生物種における糖鎖構造の解析についても新しい構造解析法が必要である。
【０００４】
現在用いられている糖鎖の構造解析技術としては、（１）核磁気共鳴分光法、（２）質量分析法、（３）多次元クロマトグラフィーによるマッピング法（非特許文献１を参照）、（４）加水分解酵素による特異的部分加水分解法（非特許文献２を参照）、（５）レクチンによるマッピング法（非特許文献２を参照）、及び（６）メチル化−加水分解-ガスクロマトグラフィーによる組成分析法（非特許文献２を参照）をあげることができ、通常はこれらを組み合わせて糖鎖の解析が行われている。
【０００５】
上記の中でも特に有効な糖鎖の解析手段としては、核磁気共鳴分光法及び質量分析法をあげることができるが、前者の問題点は解析に必要な量がμｇ以上であることであり、後者の問題点は立体異性体の解析が不可能なことである。これらの方法を含めいずれの解析法を用いるにせよ、糖鎖の構造解析は、得られた天然糖鎖構造の構造解析を直接行わなければならない(非特許文献３を参照)。
【０００６】
一方、異なる糖鎖を質量分析することにより、その結果が異なることが示されている。例えば、ステロイドの水酸基の立体異性体のＭＳ２測定によるフラグメント化を行うと、各フラグメント強度が異なること（非特許文献４を参照）や、合成された硫酸化糖鎖の構造異性体のＣＩＤ−ＭＳ２測定をＦＡＢ−q−Ｍａｓｓで行って、特定イオンの強度を測定すると、その値に差があること（非特許文献５を参照）が示されている。しかし、これらはいずれも具体的に糖鎖の構造解析方法を示すものではなかった。
【０００７】
質量分析装置を用いる糖鎖の構造解析技術において一般的な構造解析法としては、ｍ／ｚとそのピーク強度をパラメータとし、構造既知の糖鎖のそれと比較することで同一構造か否かの判定をする方法がある（非特許文献６および非特許文献７を参照）。この方法は、特定の一点の電圧におけるフラグメントのピーク強度を指標とし、各々のフラグメントの強度が総合的に一致するか否かをスコア化して判定する方法であり、参照とする化合物群のデータセット、あるいは、データベースが必要である。この方法の限界は、合否の判定をするだけで否の場合の構造予測が不可能な点であった。
【０００８】
構造的に類似性のある化合物群に対しては、多変量解析が、質量分析により得られたデータから構造的特徴を抽出するのに新たな可能性を与えることを示唆している報告があるが、２糖の構造予測に応用できることを報告しているにすぎず、長い糖鎖の構造予測の可能性については具体的には何も触れていない（非特許文献８を参照）。
さらに、質量分析法は極微量分析であり、検出される質量数（Ｈ、Ｎａ付加等）から物質の分子量が分かると共に、フラグメントイオンの解裂様式から、分子構造に関して重要な情報を得ることができるものの、サンプルに異性体（構造異性体、光学異性体）が混入して存在する場合、質量分析計のみではその混入物の存在すら識別できなかった。
【０００９】
以上の問題を解決するために、構造未知の糖鎖についてＣＩＤ−ＭＳｎ測定を行い、得られたデータをすでに取得されている参照データと比較することにより該糖鎖の構造解析を行う方法が発明された。特に、目的糖鎖および参照糖鎖のＣＩＤエネルギー依存曲線について、これらの曲線を特徴付ける数値で表した解裂イオンパラメータをそれぞれ作成し、これらのパラメータを統計的に解析することにより、目的糖鎖の構造決定又は構造推定を行う方法により、質量分析計のみを用いた糖鎖の構造異性体混合物を識別するための分析方法が提供された。
【００１０】
しかし、ここで参照しているデータを与える糖鎖を化学合成等の手法により提供する際、アグリコンとよばれる置換基を糖鎖の還元末端に配置する必要があり、従来のアグリコンではＢイオンおよびＣイオンを任意に生成することができず、効率的に構造情報を得ることが困難であった。
【非特許文献１】Royle, L. et al., Anal. Biochem. 2002,304,70-90
【非特許文献２】Chaplin, M.F et al., Carbohydrate Analysis, A Practical Approach, IRL Press, Oxford,1994
【非特許文献３】Dell, A., Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1987, 45, 19-72
【非特許文献４】Faretto, D. et al., J. Mass Spectrom. 1991,5, 240-244
【非特許文献５】Kurono, S. et al., J. Mass Spectrom. 1998, 33, 35-44
【非特許文献６】Viseux. N. et al., Anal. Chem. 1998, 70, 4951-4959
【非特許文献７】Kameyama, A. et al., Anal. Chem. 2005, 77, 4719-4725
【非特許文献８】Fangmark, I. et al., Anal. Chem. 1999, 71, 1105-1110
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、糖鎖の構造解析を行う際、参照となる糖鎖構造情報を効率よく生成するようなアグリコンを有するグリコシド化合物を提供することである。具体的には、糖鎖の質量分析において生成するＢイオンおよびＣイオンを効率よく生成することが可能なアグリコンを有するグリコシド化合物を提供することである。本発明の別の目的は、アグリコンの性質に依存することのない物質データを効率よく得ることができるアグリコンを有するグリコシド化合物を提供することである。さらに、本発明の別の目的は、目的糖鎖のデータと参照データを比較検討する際により多くの比較データを得ることができるアグリコンを有するグリコシド化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討を進めた結果、質量分析条件下ＣＩＤ−ＭＳｎ測定を行う際、効率よく脱離し、目的とするＢイオンおよび／またはＣイオンを生成するアグリコンを有するグリコシド化合物を発見することに成功した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
すなわち本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）アグリコンとしてブロモブチルオキシ基、アルキルフェニルオキシ基、アミノブチルオキシ基またはアルキルアミノブチルオキシ基を有するグリコシド化合物。
（２）アグリコンとしてアミノブチルオキシ基を有する、（１）に記載の化合物。
（３）アミノブチルオキシ基のアミノ基が保護基で保護されている、（２）に記載の化合物。
（４）保護基がカーバメート型アミノ保護基である、（３）に記載の化合物。
（５）カーバメート型アミノ保護基がt-ブチルオキシカルボニル基またはトリメチルシリルオキシカルボニル基である、（４）に記載の化合物。
（６）ＣＩＤ−ＭＳｎ測定において目的とする任意のＢイオンおよび／またはＣイオンを生成することができるアグリコンを有するグリコシド化合物。
（７）ＣＩＤ−ＭＳｎ測定により糖鎖の構造解析を行う方法において、（１）〜（６）のいずれかに記載のグリコシド化合物を参照糖鎖として使用することを特徴とする方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のグリコシド化合物は、ＣＩＤ−ＭＳｎ測定において、効率よく解離し、目的とする任意のＢイオンおよび／またはＣイオンを生成することができる。従って、本発明のグリコシド化合物は、ＣＩＤ−ＭＳｎ測定により糖鎖の構造解析を行う方法において、参照糖鎖として使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を更に詳細に説明するが、以下の構成要件の説明は、本発明の実施態様の代表例であり、本発明はこれらの内容のみに特定されるものではない。
以下の説明において、「ＣＩＤ−ＭＳｎ測定」とは、ＣＩＤ（Collision induced dissociation:衝突誘起解離）によるマススペクトルの取得を行うことを示し、「フラグメントイオン」とは、上記ＣＩＤ−ＭＳｎ測定により得られる各ｍ／ｚを有するイオンを示し、「ｍ／ｚ」とは、質量数（ｍ）と電荷（ｚ）の比を示し、「娘イオン」とは、フラグメントイオンを上記ＣＩＤ−ＭＳ２測定することにより得られる各ｍ／ｚを有するフラグメントイオンを示し、「総イオンカウント数」とは、各ｍ／ｚを有するすべてのフラグメントイオンのイオン強度の総和を示し、また、「ＣＩＤエネルギー」とは、ＣＩＤを起こすときに加えるエネルギーを一般的に示し、実際にはイオンを振動させるためのある周波数の電場の電圧を示す。注目するグリコシド結合に関わる酸素源原子の両端の結合の解裂に関し、「Ｂ−イオン」とは、非還元末端側結合の解裂に由来する非還元末端側フラグメントを指し、「Ｃ−イオン」とは、還元末端側結合の解裂に由来する非還元末端側フラグメントを指す（図１５、Domon, B. and Costello, C.E.(1988) Glycoconj. J. 5, 397-409）。
【００１５】
なお、ＣＩＤ−ＭＳｎ測定を行うことができる質量分析装置であれば、イオン化法としては、ＦＡＢ（高速原子衝撃法）、ＣＩ（化学イオン化法）、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化法）、ＭＡＬＤＩ（マトリクス支援レーザー脱離イオン化法）、ＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化法）等が用いられる。本発明においてはサンプル調製が容易で、かつ、マトリックス由来の夾雑イオンの影響がないＥＳＩ法を用いることが好ましい。しかし、上記ＣＩＤ−ＭＳｎ測定が可能であればイオン化法はこれらに限定されるものではない。また、ＥＳＩ法にはマイクロスプレー法とナノスプレー法があるが、サンプル使用量の面から本発明においてはナノスプレー法が好ましく用いられる。
【００１６】
糖鎖またはその分解物をイオン化する場合、微液滴を真空下溶媒を蒸発させることでイオン化するため水／メタノールあるいは水／アセトニトリル（１：１）を溶媒として用いることができるが、物質の性質に従い選択が可能でありこれに限られることはない。目的糖鎖またはその分解物は、この溶媒に対して０．０１〜１００ｎｍｏｌ／ｍｌ、より好ましくは０．５〜５ｎｍｏｌ／ｍｌ、さらに好ましくは１ｎｍｏｌ／ｍｌの濃度に溶解することが好ましい。
【００１７】
また、ＣＩＤ−ＭＳｎ測定を行なう装置は、これが可能であれば、機種を問うものではないが、本発明においては、ＣＩＤ−ＭＳｎ測定が可能な四重極イオントラップ型質量分析計を用いることが好ましい。このような装置としては、具体的には例えば、ｅｓｑｕｉｒｅ ３０００ ｐｌｕｓ（ブルカーダルトニクス社製）、ＬＣＱ ＤＥＣＡ（サーモフィニガン社製）、ＡＸＩＭＡ ＱＩＴ（島津社製）、ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ（島津社製）等が挙げられる。測定方法としては、各親フラグメントイオンから解離する娘イオンのイオン強度が測定できる方法であればいかなるものでもよいが、具体的には、例えば、熱キャピラリー温度２０〜３６５℃、キャピラリー電圧０〜６．０ｋＶ、ＣＩＤエネルギーが０〜２５Ｖ、ポジティブモードまたはネガティブモードのいずれか等で測定することができる。ポジティブモードを用いる場合には、プロトン、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、アンモニウム等の陽イオンを選択して用いることができる。
【００１８】
目的親フラグメントイオンについて、さらに上述のＣＩＤ−ＭＳｎ測定を行なう。該測定により得られたプロットから、特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数とＣＩＤエネルギーとの関係を示すＣＩＤエネルギー依存曲線を作成する（式１）。このうち、特定のｍ／ｚの娘イオンの総イオンカウント数を、該娘イオンの総イオンカウント数と、該娘イオンの総イオンカウント数と上記親イオンの総イオンカウント数の和との比で表すことが好ましい（式２）。なお、式１及び式２は、親イオンＡから娘イオンａ，ｂ，ｃ，ｄ，…，（ｉ），…ｎが生成する場合の関係式を示す。この比で娘イオン強度を表すことにより、微弱なその他のイオンカウント数に影響を受けず、正確なＣＩＤエネルギー依存曲線を作成することができる。特定のｍ／ｚの娘イオンとは、目的親フラグメントイオンから解離する何れの娘イオンでもよいし、その全てでもよい。
【００１９】
【数１】
【００２０】
【数２】
【００２１】
糖鎖の合成においては、還元末端にオクチルオキシ基をはじめとする置換基を導入したグリコシド体とすることがしばしばある。この理由は、１）天然物あるいはその部分構造の合成としての意義（例えばセラミドを導入したスフィンゴ糖脂質や糖ペプチド）や２）生化学的な研究を行う際のバイオプローブとしての理由（セラミドなどに代わる安定なグリコシドや糖鎖複合体を形成するための官能基を導入するため等の理由）である。しかしながら、構造解析の目的でオクチルグリコシドに代表されるアルキルグリコシドのＣＩＤ−ＭＳｎ分析をおこなうと、糖鎖の還元末端に導入したアルキル基を有するフラグメントが一般的にメインのピークとして検出される。天然糖鎖のＣＩＤ−ＭＳｎ情報と糖鎖ライブラリーのＭＳn情報の比較によって糖鎖の構造解析をおこなおうとする場合、任意のＢイオン、Ｃイオンを生成し、さらに、これらのＣＩＤ−ＭＳｎ分析を可能とする必要がある。本発明は、この問題を克服するために糖鎖フラグメントを効果的に与えるグリコシド化合物を提供する。
【００２２】
すなわち、本発明のグリコシド化合物は、ＣＩＤ−ＭＳｎ測定において、目的とする任意のＢイオンおよび／またはＣイオンを生成することができるアグリコンを有することを特徴とするものである。アグリコンとして、例えば、ブロモブチルオキシ基、アルキルフェニルオキシ基、アミノブチルオキシ基、アルキルアミノブチルオキシ基等を有するグリコシド化合物が挙げられる。具体的には、４-ブロモブチルグリコシド化合物、オクチルオキシフェニルグリコシド化合物、４-（n-オクチル）-アミノブチルオキシ基等が挙げられる。アグリコンとしてブロモブチルオキシ基またはアルキルフェニルオキシ基を有するグリコシド化合物は、ＣＩＤ−ＭＳｎ測定において目的とする任意のＢイオンを生成することができる。また、アグリコンとしてアミノブチルオキシ基またはアルキルアミノブチルオキシ基を有するグリコシド化合物は、ＣＩＤ−ＭＳｎ測定において目的とする任意のＣイオンを生成することができる。
また、アミノ基を有する化合物は、種々の物質と容易に結合することができる。したがって、本発明のアグリコンとしてアミノブチルオキシ基を有するグリコシド化合物は、タンパク質、蛍光分子、発光分子、様々な素材からなるビーズや基盤、また、磁性ビーズなどとの複合体を供給することができる。
【００２３】
本発明のグリコシド化合物は、公知の方法により合成することができる。化学合成の行程における選択的な脱保護の条件に対してブロモ基が不安定である等の理由から利用することができない場合、例えば、しばしば用いられる接触還元条件下、ブロモ基の還元反応が起こるため使用することができないため問題となる場合がある。このような場合には、アルキルオキシフェニルグリコシド等に代表されるフェニルグリコシド化合物を利用することができる。合成化学における保護基としてはＲ＝Ｍｅがよく知られているが、合成後の生成を容易にするためには、逆相カートリッジカラム等により迅速に単離が可能である、例えばＲ＝Ｃ８Ｈ１７を用いることが望ましい。
【００２４】
また、本発明のグリコシド化合物は、アグリコンが保護基で保護されているグリコシド化合物を前駆体として、この前駆体の保護基を脱保護することにより合成することができる。例えばアグリコンの保護基を有するアミノ基（−ＮＲ１Ｒ２）においては、保護基Ｒ１及びＲ２は、次に示す置換基群からそれぞれ独立に選択される組み合わせからなる。すなわち、Ｒ１は、水素、ケイ素官能基、アルキル基、ベンジル基、またはアルキル基を表し、ケイ素官能基、アラルキル基、ベンジル基およびアラルキル基においてはその一部がさらに置換されていてもよい。ケイ素官能基における置換基はアルキル基およびアラルキル基が代表的であり、tert-ブチルジメチルシリル、メチルジ-tert-ブチルシリル、イソプロピルジメチルシリル、メチルジイソプロピルシリル、(トリフェニルメチル)ジメチルシリル、及びtert-ブチルジフェニルシリル基が挙げられる。アルキル基、ベンジル基、またはアラルキル基における置換基としては、アルキル基、ベンジル基、アラルキル基、およびハロゲン、ヒドロキシル基、アルコキシ基、シアノ基、スルホニル基、ニトロ基、アジド基、アミノ基、あるいはアミノ保護基等である。またＲ２は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル基、アルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、スルホニル基、あるいはアミノ保護基等を適宜使用することができる。具体的なアミノ保護基としては、“Protective Groups in Organic Synthesis” T. W. Greene, John Wiley & Sons、に記載されるカーバメート型アミノ保護基等を適宜選択することができる。Ｒ１またはＲ２は、好ましくは、t-ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）及びトリメチルシリルオキシカルボニル基（Ｔｅｏｃ基）であり、より好ましくはＢｏｃ基である。Ｒ１とＲ２は同じであっても異なっていてもよいが、反応過程においてBarton型反応に適したシアノ基およびニトロ基に代表される電子吸引性置換基が結合した置換アミノ基や、無保護の１級あるいは２級アミノ基を生成する組み合わせが好ましい。具体的には、アグリコンが保護基で保護されているグリコシド化合物として、アグリコンとしてのアミノブチルオキシ基のアミノ基がＢｏｃ基またはＴｅｏｃ基で保護されているグリコシド化合物が挙げられる。
【００２５】
さらに、前記の前駆体をＣＩＤすることによっても、本発明のグリコシド化合物を生成することができる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１：４-ブロモブチルグリコシド化合物の合成
（１）４-ブロモブチルグリコシド化合物の合成
４-ブロモブチルグリコシド化合物の合成経路を図１に示した。すなわち、ラクトースから容易に調製されるラクトースオクタアセチル化合物１をＢＦ３−Ｅｔ２Ｏの存在下ジクロロエタン中４−ブロモブタノールと反応させグリコシド化合物２とした。化合物２のアセチル基をＮａＯＭｅで除去し、化合物３をアノマー混合物として得た。これをＨＰＬＣにより分離精製すると化合物３Aおよび３Bが得られた。
【００２７】
（２）化合物２の合成
α,β-Lactose octaacetate (図１の１, 102mg, 0.150mmol, α/β=1/15)と4-bromobutanol (92μL, 0.60mmol)のDCE (3.0mL)溶液に、室温、窒素雰囲気、攪拌下でBF3-Et2O (38μL, 0.30mmol)を滴下し、70℃で一晩反応させた。反応終了後、EtOAcで希釈し、飽和NaHCO3 水溶液を注ぎ抽出し、有機相をさらに飽和NaHCO3水溶液、飽和食塩水で抽出し、MgSO4で乾燥後、濾過、濃縮した。残渣をシリカゲルカラム(Hex:EtOAc=1.7:1)で精製することで、化合物２ (図１の２, 14.8mg, 12.8%, α/β=10/1)をsyrupとして得た。Rf 0.15 (Hex:EtOAc=2:3); 1H NMR (CDCl3): 5.36 (d, 1H, J4’,5’ 2.9 Hz, H-4’), 5.21 (t, 1H, J3,4 9.5 Hz, H-3), 5.13 (dd, 1H, J2’,3’ 10.4 Hz, H-2’), 4.96 (dd, 1H, J3’,4’3.4 Hz, H-3’), 4.85 (d, 1H, J1,23.9 Hz, H-1), 4.51 (d, 1H, J1’,2’7.9 Hz, H-1’), 4.42 (dd, 1H, J5,6a 1.9 Hz, J6a,6b11.9 Hz, H-6a), 4.18 (dd, 1H, J5’,6a’ 6.0 Hz, J6a’,6b’11.1 Hz, H-6a’), 4.13 (dd, 1H, J5,6b 5.0 Hz, H-6b), 4.08 (dd, 1H, J5’,6b’ 7.8 Hz, H-6b’), 3.91-3.84 (m, 2H, H-5,5’), 3.76 [dt, 1H, J 6.4 Hz, J 9.9 Hz, OCH2(CH2)2CH2Br], 3.67 (t, 1H, J4,5 9.7 Hz, H-4), 3.57 (dd, 1H, J2,3 10.0 Hz, H-2), 3.51 [dt, 1H, J 6.7 Hz, J 10.2 Hz, OCH2(CH2)2CH2Br], 3.46 [t, 2H, J 6.5 Hz, OCH2(CH2)2CH2Br], 2.16 (s, 3H, CH3CO), 2.13 (s, 3H, CH3CO), 2.12 (s, 3H, CH3CO), 2.06 (s, 6H, CH3CO), 2.04 (s, 3H, CH3CO), 1.97 (s, 3H, CH3CO), 1.96 [m, 2H, O(CH2)2CH2CH2Br], 1.80 [m, 2H, OCH2CH2CH2CH2Br].
【００２８】
（３）化合物３の合成
化合物３ (14.8mg, 19.2μmol)のMeOH (2.0mL)溶液に、室温、攪拌下で1M NaOMe/MeOHを滴下した。反応終了後、濃縮し、得られた残渣を逆相カラム（C-18 Sep-Pak, MeOH）で精製することで、化合物3（9.0mg, 98%, α/β=11/1）を得た。Rf 0.11 (DCM:MeOH=3:1); 1H NMR (D2O)。合成したα／βの混合物は、HPLC-MSにより単離した。α体（図１の３Ａ）とβ体（図１の３Ｂ）の分離条件：Imtakt C18；240 mm L×100 mm I.D.；流速 1.0 ml/min；溶媒 H2O/CH3CN ＝ 92：8；カラム温度：25度；化合物３Ａの溶出時間：19.8分；化合物３Ｂの溶出時間：21.2分。
化合物３Ａ：1H NMR (D2O): 4.87 (d, 1H, J1, 2 3.8 Hz, H-1), 4.41 (d, 1H, J1’, 2’ 7.8 Hz, H-1’), 3.89-3.86 (m, 2H), 3.82-3.67 (m, 7H), 3.64-3.59 (m, 2H), 3.57-3.48 (m, 5H), 1.97-1.87 (m, 2H), 1.77-1.71 (m, 2H).
化合物３Ｂ：1H NMR (D2O): 4.45 (d, 1H, J1, 2 8.2 Hz, H-1), 4.41 (d, 1H, J1’, 2’ 7.8 Hz, H-1’), 3.95-3.88 (m, 3H), 3.78-3.48 (m, 12H), 3.26 (m, 1H), 1.97-1.87 (m, 2H), 1.77-1.70 (m, 2H).
【００２９】
実施例２：オクチル、ブチル、および、４-ブロモブチルグリコシド化合物のＣＩＤ−ＭＳｎ測定における比較／ブロモブチル基のＣＩＤ−ＭＳｎ解析における有用性
アグリコンがオクチルオキシ基のサンプルを分析すると、α-オクチル化合物はｍ／ｚ３４７、β-オクチル化合物はｍ／ｚ３１５が主たるフラグメントイオンとして検出された（図２Ａ、図３Ａ）。α-オクチル化合物で検出された主たるイオンはｍ／ｚ３４７でオクチルオキシ基が脱離したイオンである。一見効率良く目的のフラグメントが得られているようだが、絶対値で示したグラフにおいてプリカーサーイオンの元強度に対するフラグメントイオンの減衰が著しいことが明確である（イオン収率：＜１０％）（図２Ｂ、図３Ｂ）。これは、さらに詳細な構造情報を取得するため次のＣＩＤ−ＭＳｎ(ここではＭＳ3) 分析を行おうとする際、取得データの不安定化を引き起こすことに繋がり好ましくない。アグリコンがブチルオキシ基の場合でも同様の結果を得た（図４、図５）。すなわち、このような現象はアルキルグリコシドにおいて一般的であると言える。
【００３０】
構成糖がガラクトースとグルコースであり、結合位置が１−４、アグリコンがそれぞれオクチルオキシ基、ブチルオキシ基、ブロモブチルオキシ基である、Ｇａｌα１−４Ｇｌｃα／β−Ｏｃｔｙｌ、Ｇａｌα１−４Ｇｌｃα／β−Ｂｕｔｙｌ、Ｇａｌα１−４Ｇｌｃα／β−ＢｒｏｍｏＢｕｔｙｌの質量分析条件下における解裂に関する実験により比較検討した(図２〜図７)。
【００３１】
アグリコンがブロモブチルオキシ基のサンプルを分析すると、α体、β体共にｍ／ｚ 347（Ｂイオン）が主たるフラグメントイオンとして得られた（図６Ａ、図７Ａ）。また、絶対値でグラフ化したものをみると、プレカーサーイオンの減衰がほとんど無いことがわかる（イオン収率：＞９０％）（図６Ｂ、図７Ｂ）。これは、糖鎖のみのフラグメントを効率よく検出できるのみならず、次のＣＩＤ−ＭＳｎ(ここではＭＳ3)分析の際、データを安定に取得できると共に、ＭＳ4、ＭＳ5・・・、といった多段階分析を可能とするために有効である。すなわち、ブロモブチルグリコシド化合物は、糖由来のフラグメントイオン、特に、Ｂイオンを極めて効率よく生成することを特徴とする。したがって、本グリコシド化合物は、糖鎖の構造解析において重要な多くの構造情報を提供する。
【００３２】
実施例３：オクチルオキシフェニルグリコシド化合物の合成
実施例２に記載したブロモブチルグリコシド化合物は、糖由来のフラグメントイオン、特に、Ｂイオンを極めて効率よく生成することを特徴とする。したがって、本グリコシド化合物は、糖鎖の構造解析において重要な多くの構造情報を提供する。しかし、化学合成の行程における選択的な脱保護の条件に対してブロモ基が不安定である等の理由から利用することができない場合、例えば、しばしば用いられる接触還元条件下、ブロモ基の還元反応が起こるため使用することができないため問題となる場合がある。このような場合には、アルキルオキシフェニルグリコシド等に代表されるフェニルグリコシド化合物４（図８）を利用することができる。合成化学における保護基としてはＲ＝Ｍｅがよく知られているが、合成後の生成を容易にするためには、逆相カートリッジカラム等により迅速に単離が可能である、例えばＲ＝Ｃ８Ｈ１７を用いることが望まれる。
【００３３】
（１）4-n-Octyloxyphenyl Galの合成
容易に調製される化合物５をＢＦ３−Ｅｔ２Ｏ存在下ジクロロメタン中オクチルオキシフェノールと反応させ化合物６を合成した。この化合物を直ちにメタノールに溶解しＮａＯＭｅでアセチル基を脱保護して化合物７へと導いた（図９）。
（２）化合物６および７の合成
Phenyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (図９の５, 59.1 mg, 134 μmol)と4-n-Octyloxyphenol (60.3 mg, 263 μmol)のDCM (0.9 mL)溶液に、窒素雰囲気、０℃でBF3-Et2O (38μL, 0.30mmol)を滴下し、一晩反応させた。反応終了後、EtOAcで希釈し、飽和NaHCO3 水溶液を注ぎ抽出し、有機相をさらに飽和NaHCO3水溶液、飽和食塩水で抽出し、MgSO4で乾燥後、濾過、濃縮した。残渣を分取用TLC (Hex : EtOAc = 2.7 : 1)で精製することで化合物６をシロップとして得た。化合物６のMeOH (2.0 mL)溶液に、室温、攪拌下で1M NaOMe/MeOHを滴下した。反応終了後、濃縮し、得られた残渣を逆相カラム（C-18 Sep-Pak, MeOH）で精製することで、化合物７(5.0 mg, 9.7 %)をシロップとして得た。
化合物６; Rf 0.31 (Hex / EtOAc= 2.7 / 1); 1H NMR (CDCl3): 6.97 (d, 2H, J 9.1 Hz, aromatic proton), 6.82 (d, 2H, J 9.1 Hz, aromatic proton), 5.65 (d, 1H, J1, 2 3.6 Hz, H-1), 5.56 (dd, 1H, J3, 4 3.4 Hz, H-3), 5.53 (bd, 1H, J 3.1 Hz, H-4), 5.26 (dd, 1H, J2, 3 10.7 Hz, H-2), 4.39 (t, 1H, J6.7 Hz, H-5), 4.13 (dd, 1H, J5, 6 6.1 Hz, J6, 6’ 11.3 Hz, H-6), 4.08 (dd, 1H, J5, 6’ 7.1 Hz, H-6’), 3.90 {t, 2H, OCH2(CH2)6CH3}, 3.72 (dd, 1H, J5, 6 5.7 Hz, J6, 6’11.4 Hz, H-6), 3.68 (dd, 1H, J5, 6’ 6.5 Hz, H-6’), 2.17, 2.09, 2.03, 1.98 (s x 4, 12H, CH3CO), 1.76 [quintet, 2H, OCH2CH2(CH2)6CH3], 1.44 [quintet, 2H, O(CH2)2CH2(CH2)4CH3], 1.40-1.28 [m, 8H, O(CH2)3(CH2)4CH3], 0.89 [t, 3H, J 6.8 Hz, O(CH2)7CH3].
化合物７; Rf 0.18 (DCM / MeOH= 8 / 1); 1H NMR (CD3OD): 7.09 (d, 2H, J 9.1 Hz, aromatic proton), 6.82 (d, 2H, J 9.1 Hz, aromatic proton), 5.34 (d, 1H, J1, 2 3.0 Hz, H-1), 3.99-3.96 (m, 2H, H-5), 3.94-3.89 {m, 4H, H-2, OCH2(CH2)6CH3}, 3.72 (dd, 1H, J5, 6 5.7 Hz, J6, 6’11.4 Hz, H-6), 3.68 (dd, 1H, J5, 6’ 6.5 Hz, H-6’), 1.74 [quintet, 2H, OCH2CH2(CH2)6CH3], 1.46 [quintet, 2H, O(CH2)2CH2(CH2)4CH3], 1.40-1.27 [m, 8H, O(CH2)3(CH2)4CH3], 0.91 [t, 3H, J 6.8 Hz, O(CH2)7CH3].
【００３４】
実施例４：オクチルオキシフェニルグリコシド化合物のＣＩＤ−ＭＳｎ測定結果
得られる糖鎖フラグメントはＢイオンである。フェニルグリコシド化合物は、糖由来のフラグメントイオン、特に、Ｂイオンを良好な効率で生成（１２％）し、糖鎖の構造解析において重要な多くの構造情報を提供する（図１０）。
【００３５】
実施例５：Ｂｏｃ保護-４-アミノブチルグリコシド化合物の合成
糖鎖の質量分析法による構造解析において、重要な構造情報を与えるフラグメントイオンとして、Ｃイオンを挙げることができる。しかし、糖鎖の構造解析において一般的に観測されるにもかかわらず、Ｃイオンを任意に人為的に発生させる方法が無かった。そこで、この目的のために努力した結果、アミノブチルグリコシド化合物（図１１の１３）、あるいは、この等価体として、アミノ基の保護体（図１１の１２、１４）を用いることができることを発見した。
【００３６】
さらに、本アグリコンの別の目的は、糖鎖の機能、あるいは、医薬品探索の目的で糖鎖アレーの作成とこれに次ぐ機能スクリーニングをあげることができる。すなわち、糖鎖ライブラリーは、質量分析による糖鎖の極微量構造解析に有効なだけでなく、糖鎖アレーなどの応用展開による糖鎖機能解析の材料として有望である。その両条件を満足することができるグリコシドの構造を示唆する公知の情報は皆無であった。そのような観点から設計される糖鎖ライブラリーとして、還元末端にオクチルグリコシドを有する3糖を初期に設計していたが、より目的に応じた機能性グリコシドを探索した結果、４−保護アミノブチルグリコシドの発見に至った。
【００３７】
以下に、アミノ基を保護したアミノブチルグリコシド化合物の合成を詳細に説明する。３糖の還元末端に導入されるグリコシドに期待される効果としては、以下の３つを挙げることができる。１．効率的な単離精製を可能にする疎水性タグである。２．他の保護基の存在下に選択的に脱保護ができる。３．多段階質量分析において単糖間グリコシド結合より速やかに脱落し、ＢおよびＣイオンを与える。４．簡単な処理により他分子との結合が可能になる官能基を有する。
【００３８】
ここでこれまでに得た情報を総合すると以下のようである。１．オクチルグリコシドは疎水性タグとして優れていたが、他の２条件において必ずしも良好ではない。２．４−ブロモブチルグリコシドは３条件を満たすが、合成工程で還元条件が使用できない。３．オクチルオキシフェニルグリコシド化合物はここまですべての問題を解決するが、Ｃイオンが得られない。
【００３９】
質量分析時に見られた４−ブロモブチルグリコシドの高いアグリコン脱離能は、遠隔ラジカル開裂に起因するものと理解できるが、類似構造の４−置換ブチルグリコシドも同等あるいはそれ以上の性能を秘めている可能性があると考えた。また、将来的に他分子との結合を考慮して、４位の置換基としてアミノ基を有する化合物（図１１の１４）が有効であると考えられ、疎水性タグ性能を確保するためにそのアミノ基を保護した４−保護アミノブチルグリコシドを合成し、その可能性を検証した。
【００４０】
アミノ保護基として、トリフルオロ酢酸およびフッ化テトラブチルアンモニウムにより容易に除去が可能なＢｏｃ（tert-butyloxycarbonyl）基、および、Ｔｅｏｃ（2-trimethylsilyletnoxycarbonyl）基を選択し、ラクトースの４−Ｂｏｃアミノブチルグリコシド化合物（図１１の１１）、および、４−Ｔｅｏｃアミノブチルグリコシド化合物（図１１の１３）を調製した（図１１）。
【００４１】
（１）化合物９の合成
化合物８(1.0 g, 2.30 mmol)のDMF(11.5 mL)溶液に水素化ナトリウム(60% in oil, 0.92 g, 23.0 mmol)を加え、２０℃で１時間撹拌した。この溶液を０℃に冷却し、ベンジルブロミド(2.74 mL, 23.0 mmol)を加え、２０℃で１３時間撹拌した後、メタノール（ca. 2 mL）を加えて反応を停止した。この溶液を飽和食塩水にあけ酢酸エチルで抽出した有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラム（エーテル：ヘキサン＝１：４−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）にて精製して化合物９(2.3 g)を白色固体として得た（収率９４％）。化合物９：1H NMR (CDCl3): δ 7.56-7.09 (m, 40H, Ph), 5.08, 4.67 (each d, 2H, J 10.4 Hz, benzyl), 4.97, 4.54 (each d, 2H, J 11.4 Hz, benzyl), 4.81, 4.77 (each d, 2H, J 11.2 Hz, benzyl), 4.79 (s, 2H, benzyl), 4.72, 4.69 (each d, 2H, J 11.9 Hz, benzyl), 4.63 (d, 1H, J1,29.8 Hz, H-1), 4.52, 4.40 (each d, 2H, J11.9 Hz, benzyl), 4.45 (d, 1H, J1’,2’7.7 Hz, H-1’), 4.33, 4.23 (each d, 2H, J11.2 Hz, benzyl), 3.95 (t, 1H, J3,4= J4,5 9.5 Hz, H-4), 3.93 (d, 1H, J3’,4’ 2.8 Hz, H-4’), 3.82 (dd, 1H, J5,6a 4.4 Hz, J6a,6b11.0 Hz, H-6a), 3.77 (dd, 1H, J2’,3’ 9.6 Hz, H-2’), 3.77 (dd, 1H, J5,6b 1.6 Hz, H-6b), 3.61 (t, 1H, J2,3 8.9 Hz, H-3), 3.52 (t, 1H, J5’,6’a= J6’a,6’b 8.2 Hz, H-6’a), 3.46-3.32 (m, 5H, H-2,3’,5,5’,6’b).
【００４２】
（２）化合物１０の合成
化合物９(450 mg, 0.422 mmol) とN-Boc-amino-1-butanol (240 mg, 1.27 mmol) のジクロロエタン溶液（4.2 mL）にモレキュラーシーブス（AW-300, ca. 500 mg）を加え、窒素雰囲気下２０℃にて１時間撹拌した。０℃に冷却してこの溶液にNIS (145 mg, 0.634 mmol) を加えた後、TfOH (7.5 x 10-3mL, 84.5 x 10-3 mmol)を加えて１０分間反応させた。反応溶液に飽和重曹水を加えて反応を停止してセライトろ過した後、ジクロロメタン抽出した溶液を１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液および蒸留水で順次洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥、濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１〜２：１）にて精製して化合物１０を収率６６％(320 mg, α：β＝４５：５５)で得た。化合物１０(α：β = 60 : 40)：1H NMR (CDCl3): δ 7.38-7.10 (m, 35H, Ph), 5.05-4.68, 4.62-4.50, 4.39-4.22 (each m, 14H, benzyl), 4.66 (d, 0.6H, J1,2 3.7 Hz, H-1α), 4.43 (d, 0.4H, J1’,2’ 7.7 Hz, H-1’β), 4.35 (d, 0.4H, J1,2 8.7 Hz, H-1β), 4.32 (d, 0.6H, J1’,2’ 7.3 Hz, H-1’α), 3.94-3.88, 3.84-3.71, 3.66-3.46, 3.42-3.29 {each m, 15H, H-2,3,4,5,6a,6b,2’,3’,4’,5’,6’a,6’b,NH, OCH2(CH2)2CH2NHBoc}, 3.16-3.08 {m, 2H, OCH2(CH2)2CH2NHBoc}, 1.70-1.50 (m, 4H, OCH2(CH2)2CH2NHBoc), 1.43 (s, 9H, t-Bu). 13C NMR (CDCl3): δ・155.94, 155.89, 139.37, 139.04, 138.98, 138.97, 138.84, 138.70, 138.64, 138.51, 138.47, 138.43, 138.27, 138.08, 138.00, 137.99, 128.31, 128.28, 128.24, 128.22, 128.18, 128.16, 128.09, 128.02, 127.98, 127.93, 127.91, 127.87, 127.82, 127.78, 127.75, 127.67, 127.62, 127.52, 127.48, 127.45, 127.38, 127.35, 127.33, 127.28, 127.09, 127.02, 126.94, 103.42, 102.77, 102.72, 97.04, 82.93, 82.44, 82.41, 81.68, 80.20, 79.86, 79.00, 78.90, 75.32, 75.16, 75.07, 75.03, 74.91, 74.63, 73.52, 73.46, 73.44, 73.34, 73.31, 73.03, 72.99, 72.95, 72.86, 72.46, 72.42, 70.13, 69.37, 68.21, 68.06, 67.96, 67.66, 40.19, 40.13, 28.38, 26.89, 26.85, 26.45.
【００４３】
（３）化合物１１の合成
化合物１０(43 mg, 37.6 x 10-3 mmol)を酢酸エチル-メタノール混合溶液（１：１, 2 mL）に溶かし、20 wt%水酸化パラジウム/C（ca. 10 mg）存在下で水素添加して化合物１１を定量的収率（19.3 mg）で得た。化合物１１(α：β = 50 : 50)：1H NMR (D2O): δ 4.87 (d, 0.5H, J1,23.7 Hz, H-1α), 4.46 (d, 0.5H, J1,28.0 Hz, H-1β), 4.41 (d, 1H, J1’,2’7.8 Hz, H-1’), 3.95-3.49 {m, 12H, H-2,2’,3,3’,4,4’,5,5’,6a,6’a,6b,6’b,OCH2(CH2)2CH2NHBoc}, 3.56 (dd, 0.5H, J2,39.7 Hz, H-2α), 3.27 (m, 0.5H, H-2β), 3.06 {t, 2H, J 6.6 Hz, OCH2(CH2)2CH2NHBoc}, 1.65-1.47 {m, 4H, OCH2(CH2)2CH2NHBoc}, 1.39 (s, 9H, t-Bu). 13C NMR (D2O): δ 158.75, 103.28, 103.22, 102.39, 98.21, 81.19, 78.69, 75.73, 75.12, 74.78, 73.19, 72.92, 72.87, 72.12, 71.36, 71.33, 70.80, 70.51, 68.92, 68.31, 61.42, 61.40, 60.42, 60.24, 40.08, 28.06, 26.87, 26.41, 26.28, 26.19, 25.85, 20.28.
【００４４】
（４）化合物１３の合成
化合物１０(54 mg, 47.2 x 10-3 mmol)をジクロロメタン（1 mL）に溶かしトリフルオロ酢酸（1 mL）を加え室温で３０分間撹拌した後、濃縮して脱Boc体を得た。これをトリエチルアミン(ca. 200 mg)を含む1,4-ジオキサン（1 mL）に溶かし、1-[2-(トリメチルシリル)エトキシカルボニル]ピロリジン-2,5-ジオン（14.7 mg, 56.6 x 10-3 mmol）を加えて室温で３０分間撹拌した。反応溶液を濃縮して得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ヘキサン：酢酸エチル＝５：１〜３：１）にて精製して化合物５を２工程収率７３％（40.9 mg）で得た。この化合物５を酢酸エチル-メタノール混合溶液（１：１, 3 mL）に溶かし、20 wt%水酸化パラジウム/C（ca. 10 mg）存在下で水素添加して化合物１３を定量的収率（19.2 mg）で得た。化合物１３(α：β = 60 : 40)；1H NMR (D2O): δ 4.87 (d, 0.6H, J1,2 3.7 Hz, H-1α), 4.44 (d, 0.4H, J1,2 8.0 Hz, H-1β), 4.41 (d, 1H, J1’,2’7.8 Hz, H-1’), 4.15 (t, 2H, OCH2CH2TMS), 3.95-3.49 {m, 12H, H-2,2’,3,3’,4,4’,5,5’,6a,6’a,6b,6’b,OCH2(CH2)2CH2NHTeoc}, 3.56 (dd, 0.6H, J2,39.9 Hz, H-2α), 3.27 (m, 0.4H, H-2β), 3.11 {t, 2H, J 5.9 Hz, OCH2(CH2)2CH2NHTeoc}, 1.64-1.51 {m, 4H, OCH2(CH2)2CH2NHBoc}, 0.96 (t, 2H, OCH2CH2TMS), 0.00 (s, 9H, TMS). 13C NMR (D2O ): δ・159.36, 103.29, 103.22, 102.39, 98.22, 78.70, 75.74, 75.14, 74.80, 73.20, 72.92, 72.88, 72.12, 71.37, 71.33, 70.80, 70.50, 68.93, 68.31, 64.39, 61.43, 61.41, 60.43, 60.24, 40.38, 40.31, 26.38, 26.25, 26.19, 25.85, 25.54, 17.33, 0.20, -2.04, -2.24.
【００４５】
（５）化合物１４の合成
化合物１３(3.5 mg, 6.28 x 10-3 mmol)を水（20 x 10-3 mL）に溶かしフッ化テトラブチルアンモニウム（1 M テトラヒドロフラン溶液；19 x 10-3 mL : 3 equiv.）を加え室温で２０時間撹拌した後、溶液を濃縮して脱Teoc体１４を定量的収率で得た。化合物１４ (α：β = 60 : 40)；1H NMR (D2O): δ 4.87 (d, 0.6H, J1,2 3.8 Hz, H-1α), 4.45 (d, 0.4H, J1,2 8.0 Hz, H-1β), 4.41 (d, 1H, J1’,2’ 7.8 Hz, H-1’α), 4.40 (d, 1H, J1’,2’ 7.8 Hz, H-1’β), 3.96-3.48 {m, 14H, H-2,2’,3,3’,4,4’,5,5’,6a,6’a,6b,6’b,OCH2(CH2)2CH2NH2}, 3.00 {t, 2H, J 7.4 Hz, OCH2(CH2)2CH2NH2}, 1.77-1.60 {m, 4H, OCH2(CH2)2CH2NH2}.
【００４６】
実施例６：保護-４-アミノブチルグリコシド化合物（１１および１３）のＣＩＤ−ＭＳｎ測定結果
（１）化合物１３のＣＩＤ−ＭＳｎ測定
Ｔｅｏｃ保護-４-アミノブチルグリコシド化合物（図１１の１３）の分子イオンピークｍ／ｚ５８０．３をＣＩＤ−ＭＳ２分析した結果、Ｔｅｏｃ基の部分分解とそれによって生成するアミノブチルグリコシドの分子イオンピークｍ／ｚ４３６．１を確認した（図１２A）。得られたアミノブチルグリコシドの分子イオンピークｍ／ｚ４３６．１をさらにＣＩＤ−ＭＳ３分析した結果、ラクトースの分子イオンピークｍ／ｚ３６５．０とその脱水物ｍ／ｚ３４７．０が主生成することが確認された（図１２B）。
【００４７】
（２）化合物１１のＣＩＤ−ＭＳｎ測定
Ｂｏｃ保護-４-アミノブチルグリコシド化合物（図１１の１１）の分子イオンピークｍ／ｚ５３６．３をＣＩＤ−ＭＳ２分析した結果、Ｂｏｃ基のｔ−ｂｕｔｙｌ基の脱離によるフラグメントイオンｍ／ｚ４８０．１とＢｏｃ基の脱離したイオンである４−アミノブチルグリコシドｍ／ｚ４３６．１が確認された（図１３A）。得られた４−アミノブチルグリコシドｍ／ｚ４３６．１をさらにＣＩＤ−ＭＳ３分析するとラクトースｍ／ｚ３６５．０およびその脱水物ｍ／ｚ３４７．０の生成が確認された（図１３B）。Ｂｏｃ基のｔ−ｂｕｔｙｌ基脱離イオンｍ／ｚ４８０．１のＣＩＤ−ＭＳ3分析では、Ｂｏｃ脱離物である４−アミノブチルグリコシドｍ／ｚ４３６．１が確認された（図１３C）。得られたラクトースイオンｍ／ｚ３６５．０についてＣＩＤ−ＭＳ４分析すると、脱水物ｍ／ｚ３４７．０が確認された（図１３D）。ＭＳ3分析で得られた脱水物イオンｍ／ｚ３４７．０についてＣＩＤ−ＭＳ４分析すると、単糖間グリコシド結合の開裂に伴うイオンｍ／ｚ１８４．８が観測された（図１３E）。
【００４８】
（３）アミノブチルグリコシドの推定脱離機構
以上の事実から、４−Ｂｏｃアミノブチルグリコシド（図１１の１１）、および、４−Ｔｅｏｃアミノブチルグリコシド（図１１の１３）は、ＣＩＤ−ＭＳｎ解析において速やかに４−アミノブチルグリコシドへと変換され、これが単糖間グリコシド結合を損なうこと無く2糖の分子イオンピークを与えたものであると結論される。一連の分解過程は次の図１４に要約される。
【００４９】
通常の脂肪族アミンでは、窒素原子に続く炭素−炭素結合（αβ）開裂が観測されるが、長い鎖をもつアミンからは環状構造のフラグメントが生成することが示唆されており、４−アミノブチルグリコシドの場合は後者に属するものと考えられる。環状アミンをフラグメントとして生成するためには、グリコシド結合を構成する炭素−酸素結合ではなく、アグリコンに含まれる炭素−炭素結合が開裂することになり、ＣＩＤ−ＭＳｎ測定によって最終的に１−ＯＨ体（ｍ／ｚ３６５．０）が観測された事実は、そのようなアグリコン脱離機構を支持するものであると考えられる。
【００５０】
４−ブロモブチルグリコシドがＭＳ分析条件下において呈した遠隔ラジカル開裂に伴うアグリコン脱離では、グリコシド結合を構成する酸素原子がアグリコンに含まれるために、Ｂイオン情報の取得に有効であるが１−ＯＨ体が観測されない。すなわち、Ｃイオンに関する情報が得られない欠点がある。一方、４−アミノブチルグリコシドからは１−ＯＨ体が生成するので、オリゴ糖の還元末端を保持したＣイオン情報の取得に特に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、４-ブロモブチルグリコシド化合物の合成経路を示す。
【図２】図２は、アグリコンがオクチルオキシ基のグリコシド化合物（α体）をＣＩＤ−ＭＳｎ測定した結果を示す。Ａは、１００分率表示のERMS、Ｂは、イオン電流で表したERMSである。
【図３】図３は、アグリコンがオクチルオキシ基のグリコシド化合物（β体）をＣＩＤ−ＭＳｎ測定した結果を示す。Ａは、１００分率表示のERMS、Ｂは、イオン電流で表したERMSである。
【図４】図４は、アグリコンがブチルオキシ基のグリコシド化合物（α体）をＣＩＤ−ＭＳｎ測定した結果を示す。Ａは、１００分率表示のERMS、Ｂは、イオン電流で表したERMSである。
【図５】図５は、アグリコンがブチルオキシ基のグリコシド化合物（β体）をＣＩＤ−ＭＳｎ測定した結果を示す。Ａは、１００分率表示のERMS、Ｂは、イオン電流で表したERMSである。
【図６】図６は、アグリコンがブロモブチルオキシ基のグリコシド化合物（α体）をＣＩＤ−ＭＳｎ測定した結果を示す。Ａは、１００分率表示のERMS、Ｂは、イオン電流で表したERMSである。
【図７】図７は、アグリコンがブロモブチルオキシ基のグリコシド化合物（β体）をＣＩＤ−ＭＳｎ測定した結果を示す。Ａは、１００分率表示のERMS、Ｂは、イオン電流で表したERMSである。
【図８】図８は、アルキルオキシフェニルグリコシド化合物の化学構造式を示す。
【図９】図９は、４−ｎ−オクチルオキシフェニルグリコシド化合物の合成経路を示す。
【図１０】図１０は、オクチルオキシフェニルグリコシド化合物をＣＩＤ−ＭＳｎ測定した結果を示す。
【図１１】図１１は、Ｂｏｃ保護-４−アミノブチルグリコシド化合物およびＴｅｏｃ保護-４−アミノブチルグリコシド化合物の合成経路を示す。
【図１２】図１２は、Ｔｅｏｃ保護-４-アミノブチルグリコシド化合物をＣＩＤ−ＭＳｎ測定した結果を示す。
【図１３】図１３は、Ｂｏｃ保護-４-アミノブチルグリコシド化合物をＣＩＤ−ＭＳｎ測定した結果を示す。
【図１４】図１４は、アミノブチルグリコシドの推定脱離機構を示す。
【図１５】図１５は、Ｂ−イオンおよびＣ−イオンを説明する図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アグリコンとしてブロモブチルオキシ基、アルキルフェニルオキシ基、アミノブチルオキシ基またはアルキルアミノブチルオキシ基を有するグリコシド化合物。
【請求項２】
アグリコンとしてアミノブチルオキシ基を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
アミノブチルオキシ基のアミノ基が保護基で保護されている、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
保護基がカーバメート型アミノ保護基である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
カーバメート型アミノ保護基がt-ブチルオキシカルボニル基またはトリメチルシリルオキシカルボニル基である、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
ＣＩＤ−ＭＳｎ測定において目的とする任意のＢイオンおよび／またはＣイオンを生成することができるアグリコンを有するグリコシド化合物。
【請求項７】
ＣＩＤ−ＭＳｎ測定により糖鎖の構造解析を行う方法において、請求項１〜６のいずれかに記載のグリコシド化合物を参照糖鎖として使用することを特徴とする方法。
【請求項１】
アグリコンとしてブロモブチルオキシ基、アルキルフェニルオキシ基、アミノブチルオキシ基またはアルキルアミノブチルオキシ基を有するグリコシド化合物。
【請求項２】
アグリコンとしてアミノブチルオキシ基を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
アミノブチルオキシ基のアミノ基が保護基で保護されている、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
保護基がカーバメート型アミノ保護基である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
カーバメート型アミノ保護基がt-ブチルオキシカルボニル基またはトリメチルシリルオキシカルボニル基である、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
ＣＩＤ−ＭＳｎ測定において目的とする任意のＢイオンおよび／またはＣイオンを生成することができるアグリコンを有するグリコシド化合物。
【請求項７】
ＣＩＤ−ＭＳｎ測定により糖鎖の構造解析を行う方法において、請求項１〜６のいずれかに記載のグリコシド化合物を参照糖鎖として使用することを特徴とする方法。
【図１】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１２】
【図１３】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２００８−２７３８８４（Ｐ２００８−２７３８８４Ａ）
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１２００６２（Ｐ２００７−１２００６２）
【出願日】平成１９年４月２７日（２００７．４．２７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１５年度新エネルギー・産業技術総合開発機構「基盤技術研究促進事業（民間基盤技術研究支援制度）／糖鎖の極微量構造解析技術開発研究」、平成１６年度及び平成１７年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「基盤技術研究促進事業（民間基盤技術研究支援制度）／糖鎖の極微量構造解析技術開発研究」、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願）
【出願人】（０００００５９６８）三菱化学株式会社 (4,356)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月２７日（２００７．４．２７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１５年度新エネルギー・産業技術総合開発機構「基盤技術研究促進事業（民間基盤技術研究支援制度）／糖鎖の極微量構造解析技術開発研究」、平成１６年度及び平成１７年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「基盤技術研究促進事業（民間基盤技術研究支援制度）／糖鎖の極微量構造解析技術開発研究」、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願）
【出願人】（０００００５９６８）三菱化学株式会社 (4,356)
【Ｆターム（参考）】
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