本発明は、顆粒球コロニー刺激因子とＰＥＧ部分との間のコンジュケートを提供する。コンジュゲートは、ペプチドと修飾基との間に挿入され、かつこれらと共有結合している無傷グリコシル連結基によって連結されている。コンジュゲートは、グリコシルトランスフェラーゼの作用によってグリコシル化と未グリコシル化ペプチドの両方から形成される。グリコシルトランスフェラーゼは、ペプチド上のアミノ酸またはグリコシル残基のいずれかに修飾糖部分をライゲートする。コンジュゲートを含む医薬製剤も提供される。コンジュゲートを調製するための方法も本発明の範囲内である。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
顆粒球コロニー刺激因子ペプチドであって、前記ペプチドのアミノ酸残基に結合したグリコシル連結基を含んで成り、前記グリコシル連結基が、式
【化１】

［式中、
Ｒ^２はＨ、ＣＨ_２ＯＲ^７、ＣＯＯＲ^７、またはＯＲ^７であり、
ここで
Ｒ^７は、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、または置換もしくは非置換へテロアルキルであり、
Ｒ^３およびＲ^４は、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、ＯＲ^８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^９から独立して選択されるメンバーであり、
ここで
Ｒ^８およびＲ^９は、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換へテロアルキル、またはシアル酸から独立して選択され、
Ｌ^ａは、結合、置換もしくは非置換アルキル、および置換もしくは非置換へテロアルキルから選択されるリンカーであり、
Ｒ^１６およびＲ^１７は、ポリマー腕から独立して選択され、
Ｘ^２およびＸ^４は、ポリマー部分Ｒ^１６およびＲ^１７をＣに結合する独立して選択されるリンケージ断片であり、
Ｘ^５は非反応基である］
を有する修飾シアリル残基を含んで成る、顆粒球コロニー刺激因子ペプチド。
【請求項２】
部分
【化２】

が、
【化３】

［式中、
Ｑは、Ｈ、および置換もしくは非置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキルから選択され、
ｅおよびｆは、１〜２５００から独立して選択される整数であり、かつ
ｑは、０〜２０の整数である］
から選択されるメンバーである式を有する請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記部分が、
【化４】

［式中、
Ｑは、Ｈ、および置換もしくは非置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキルから選択され、
ｅ、ｆおよびｆ’は、１〜２５００から独立して選択される整数であり、かつ
ｑおよびｑ’は、１〜２０から独立して選択される整数である］
から選択されるメンバーである式を有する、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記グリコシル連結基が、
【化５】

［式中、ｔは０または１である］
から選択される式を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記グリコシル連結基が、式
【化６】

［式中、ｔは０または１である］
を有する、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
前記アミノ酸に結合した前記グリコシル連結基が式
【化７】

［式中、ＡＡは前記ペプチドの前記アミノ酸残基である］
を有する、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
前記アミノ酸残基がセリンまたはトレオニンから選択されるメンバーである、請求項６に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【請求項９】
前記アミノ酸残基が、配列番号１の位置１３３でトレオニンである、請求項８に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドが、式
【化８】

［式中、
Ｒ^１５は前記修飾シアリル残基であり、かつ
ｐは１〜１０の整数である］
を有する基礎構造を含んで成る少なくとも１つのグリコシル連結基を含んで成る、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドのアミノ酸に結合した前記少なくとも１つのグリコシル連結基が、
【化９】

およびそれの組合せから選択される式
［式中、
ＡＡは前記ペプチドの前記アミノ酸残基であり、
ｔは０または１に等しい整数であり、
ｐは１〜１０の整数であり、
Ｒ^１５’は、Ｈ、ＯＨ、シアル酸、前記修飾シアリル残基、およびＳｉａ−Ｓｉａ^ｐから選択されるメンバーであり、
ここで、
Ｓｉａ^ｐは前記修飾シアリル残基であり、
ここで少なくとも１つのＲ^１５’が前記修飾シアリル残基およびＳｉａ−Ｓｉａ^ｐから選択される］
を有する、請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
前記アミノ酸残基がアスパラギン残基である、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
前記ペプチドが生物活性顆粒球コロニー刺激因子ペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１４】
（ａ）
【化１０】

から選択されるグリコシル部分を含んで成る基質顆粒球コロニー刺激因子ペプチドを、式
【化１１】

［式中、ａは０または１である］
を有するＰＥＧ−シアル酸ドナーと接触させるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの生成物を、前記ドナーから前記グリコシル部分のＧａｌへＰＥＧ−シアル酸を移動させる酵素と、前記移動に適切な条件下に接触させるステップと
を含んで成る、請求項１に記載のペプチドを調製する方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）の前に、
（ｂ）適切な宿主において前記基質顆粒球コロニー刺激因子ペプチドを発現させるステップ
をさらに含んで成る、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主が昆虫細胞および哺乳類細胞から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記昆虫細胞がスポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞系である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１に記載のペプチドを前記哺乳類に投与するステップを含んで成る、哺乳類における炎症性白血球産生を刺激する方法。
【請求項１９】
それを必要とする対象における感染を治療する方法であって、前記方法が、前記対象における前記状態を緩和するために有効な量の請求項１に記載のペプチドを前記対象に投与するステップを含んで成る方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の顆粒球コロニー刺激因子ペプチド、および医薬的に許容される担体を含んで成る医薬製剤。
【請求項２１】
顆粒球コロニー刺激因子ペプチドであって、前記ペプチドのアミノ酸残基に結合したグリコシル連結基を含んで成り、前記グリコシル連結基が、式
【化１２】

［式中、
Ｒ^２はＨ、ＣＨ_２ＯＲ^７、ＣＯＯＲ^７、ＣＯＯ⁻またはＯＲ^７であり、
ここで
Ｒ^７は、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、または置換もしくは非置換へテロアルキルであり、
Ｒ^３およびＲ^４は、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、ＯＲ^８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^９から独立して選択されるメンバーであり、
ここで
Ｒ^８およびＲ^９は、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、または置換もしくは非置換へテロアルキル、またはシアル酸から独立して選択され、
ｓは１〜２０の整数であり、
ｆは１〜２５００の整数であり、かつ
ＱはＨおよび置換もしくは非置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキルから選択されるメンバーである］
を有する修飾シアリル残基を含んで成る、顆粒球コロニー刺激因子ペプチド。
【請求項２２】
前記修飾シアリル残基が式
【化１３】

を有する、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２３】
ＱがＨおよびＣＨ_３から選択される、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２４】
前記ペプチドが、式
【化１４】

［式中、
Ｒ^１５は前記修飾シアリル残基であり、かつ
ｐは１〜１０の整数である］
を有する基礎構造を含んで成る少なくとも１つのグリコシル連結基を含んで成る、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２５】
前記ペプチドのアミノ酸に結合した前記少なくとも１つのグリコシル連結基が、
【化１５】

およびそれの組合せから選択される式
［式中、
ＡＡは前記ペプチドの前記アミノ酸残基であり、
ｔは０または１に等しい整数であり、
ｐは１〜１０の整数であり、
Ｒ^１５’は、Ｈ、ＯＨ、シアル酸、前記修飾シアリル残基、およびＳｉａ−Ｓｉａ^ｐから選択されるメンバーであり、
ここで、
Ｓｉａ^ｐは前記修飾シアリル残基であり、
ここで少なくとも１つのＲ^１５’が前記修飾シアリル残基およびＳｉａ−Ｓｉａ^ｐから選択される］
を有する、請求項２４に記載のペプチド。
【請求項２６】
前記アミノ酸残基がアスパラギンである、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２７】
前記グリコシル連結基が式
【化１６】

［式中、ｂは０または１である］
を含んで成る、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２８】
ｓが１であり、ｆが約２００〜約３００の整数である、請求項２７に記載のペプチド。
【請求項２９】
前記アミノ酸残基がセリンまたはトレオニンから選択されるメンバーである、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項３０】
前記ペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項３１】
前記アミノ酸残基が配列番号１の位置１３３におけるトレオニンである、請求項３０に記載のペプチド。
【請求項３２】
前記ペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項３３】
前記アミノ酸残基が配列番号２の位置１３４におけるトレオニンである、請求項３２に記載のペプチド。
【請求項３４】
（ａ）
【化１７】

から選択されるグリコシル部分を含んで成る基質顆粒球コロニー刺激因子ペプチドを、式
【化１８】

［式中、ａは０または１である］
を有するＰＥＧ−シアル酸ドナーと接触させるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの生成物を、前記ドナーから前記グリコシル部分のＧａｌＮａｃ、Ｇａｌ、またはＳｉａへＰＥＧ−シアル酸を移動させる酵素と、前記移動に適切な条件下に接触させるステップと
を含んで成る、請求項２１に記載の顆粒球コロニー刺激因子ペプチドを調製する方法。
【請求項３５】
ステップ（ａ）の前に、
（ｂ）適切な宿主において前記基質顆粒球コロニー刺激因子ペプチドを発現させるステップ
をさらに含んで成る、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記宿主が昆虫細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記昆虫細胞が、スポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞系である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ペプチドをメチオニンと接触させるステップをさらに含んで成る、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
ステップ（ｂ）の後に、前記ペプチドを精製するステップをさらに含んで成り、遊離メチオニンが前記精製するステップ中に存在する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
哺乳類における炎症性白血球産生を刺激する方法であって、前記方法が前記哺乳類に請求項２１に記載のペプチドを投与するステップを含んで成る方法。
【請求項４１】
それを必要とする対象における感染を治療方法であって、前記方法が、前記対象における前記状態を緩和する有効な量の請求項２１に記載のペプチドを前記対象に投与するステップを含んで成る方法。
【請求項４２】
請求項２１に記載の顆粒球コロニー刺激因子ペプチド、および医薬的に許容される担体を含んで成る医薬製剤。

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図７Ｃ】

【図７Ｄ】

【図７Ｅ】

【図７Ｆ】

【図７Ｇ】

【図７Ｈ】

【図７Ｉ】

【図７Ｊ】

【図７Ｋ】

【図７Ｌ】

【図７Ｍ】

【図７Ｎ】

【公表番号】特表２００９−５０１１２７（Ｐ２００９−５０１１２７Ａ）
【公表日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５０５７０（Ｐ２００７−５５０５７０）
【出願日】平成１８年１月１０日（２００６．１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０００８７０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７４４６７
【国際公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【出願人】（５０００６２２５４）ネオス　テクノロジーズ　インコーポレイテッド (19)
【Ｆターム（参考）】