糸状菌におけるリンゴ酸生成の改良方法
本発明は、（ａ）C4ジカルボン酸トランスポーターをコードする異種第１ポリヌクレオチド、リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする異種第２ポリヌクレオチド及びピルビン酸カルボキシラーゼをコードする異種第３ポリヌクレオチドから成る群から選択されたポリヌクレオチドを含む糸状菌宿主細胞を培養し、ここで前記糸状菌宿主細胞が、同じ条件下で培養される場合、前記異種ポリヌクレオチドを有さない糸状菌宿主細胞に比較して、高められたレベルのC4ジカルボン酸を分泌でき；そして（ｂ）C4ジカルボン酸を回収することを含む、C4ジカルボン酸を生成するための方法に関する。本発明はまた、C4ジカルボン酸生成を高めるための方法、糸状菌宿主細胞及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼ変異体にも関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
C4ジカルボン酸トランスポーターをコードする異種第１ポリヌクレオチドを含む糸状菌宿主細胞であって、前記C4ジカルボン酸トランスポーターが、
（ａ）配列番号8、34又は36と少なくとも60％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣ4ジカルボン酸トランスポーター；
（ｂ）配列番号7、33、35、37又はその完全な長さの相補的鎖と低緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるC4ジカルボン酸トランスポーター；
（ｃ）配列番号７、33、35又は37と少なくとも60％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるC4ジカルボン酸トランスポーター；
（ｄ）配列番号8、34又は36の成熟ポリペプチドの１又は数個（いくつかの）のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入を含むC4ジカルボン酸トランスポーター変異体；及び
（ｅ）C4ジカルボン酸トランスポーター活性を有する、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のC４ジカルボン酸トランスポーターのフラグメントから成る群から選択され；そして
前記糸状菌宿主細胞が、同じ条件下で培養される場合、前記C4ジカルボン酸トランスポーターをコードする異種第１ポリヌクレオチドを含まない糸状菌宿主細胞に比較して、高められたレベルのC4ジカルボン酸を分泌できることを特徴とする糸状菌宿主細胞。
【請求項２】
前記C4ジカルボン酸トランスポーターが、配列番号８、34又は36を含むか又はそれらから成る、請求項１に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項３】
前記C4ジカルボン酸トランスポーターをコードする異種第1ポリヌクレオチドが、第３ポリヌクレオチドに対して外来性のプロモーターに操作可能的に結合される、請求項１又は２に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項４】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする異種第２ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項５】
前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼが、
（ａ）配列番号18又は20と少なくとも60％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むリンゴ酸デヒドロゲナーゼ；
（ｂ）（i）配列番号17又は19、（ii）配列番号17又は19に含まれるcDNA配列；又は（iii）(i)又は（ii）の完全な長さの相補的鎖と、低緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ；
（ｃ）配列番号17又は19と少なくとも60％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ；
（ｄ）配列番号18又は20の成熟ポリペプチドの１又は数個（いくつか）のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入を含むリンゴ酸デヒドロゲナーゼ変異体；及び
（ｅ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する、（ａ）（ｂ）（ｃ）又は（ｄ）のリンゴ酸デヒドロゲナーゼのフラグメントから成る群から選択される、請求項４に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項６】
前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼが、配列番号18又は20を含むか又はそれらから成る、請求項４に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項７】
前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする異種第２ポリヌクレオチドが、第２ポリヌクレオチドに対して外来性のプロモーターに操作可能的に結合される、請求項４〜６の何れか一項に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項８】
前記糸状菌宿主細胞が、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする異種第３ポリヌクレオチドを含む、請求項１〜７の何れか一項に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項９】
前記ピルビン酸カルボキシラーゼが、
（ａ）配列番号27と少なくとも60％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むピルビン酸カルボキシラーゼ；
（ｂ）（i）配列番号26、（ii）配列番号26に含まれるcDNA配列；又は（iii）(i)又は（ii）の完全な長さの相補的鎖と、低緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるピルビン酸カルボキシラーゼ；
（ｃ）配列番号26と少なくとも60％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるピルビン酸カルボキシラーゼ；
（ｄ）配列番号27の成熟ポリペプチドの１又は数個（いくつか）のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入を含むピルビン酸カルボキシラーゼ変異体；及び
（ｅ）ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有する、（ａ）（ｂ）（ｃ）又は（ｄ）のピルビン酸カルボキシラーゼのフラグメントから成る群から選択される、請求項８に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１０】
前記ピルビン酸カルボキシラーゼが、配列番号27を含むか又はそれらから成る、請求項８に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１１】
前記ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする異種第３ポリヌクレオチドが、第３ポリヌクレオチドに対して外来性のプロモーターに操作可能的に結合される、請求項８〜10の何れか一項に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１２】
前記宿主細胞が、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギラス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ビジェルカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、 コプリナス（Coprinus）、コリオラス（Coriolus）、クリプトコーカス（Cryptococcus）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フサリウム（Fusarium）、ヒューミコラ（Humicola）、マグナポリス（Magnaporthe）、ムコル（Mucor）、ミセリオプソラ（Myceliophthora）、ネオカノマスチックス（Neocallimastix）、ネウロスポラ（Neurospora）、パエシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、フィレビア（Phlebia）、ピロマイセス（Piromyces）、プレウロタス（Pleurotus）、 リゾパス（Rhizopus）、シゾフィラム（Schizophyllum）、タラロマイセス（Talaromyces）、サーモアスカス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）及びトリコダーマ（Trichoderma）細胞から成る群から選択される、請求項１〜11の何れか一項に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞が、アスペルギラス宿主細胞である、請求項12に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１４】
前記宿主細胞が、アスペルギラス・オリザエである、請求項13に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１５】
宿主細胞が、同じ条件下で培養される場合、C4ジカルボン酸トランスポーターをコードするポリヌクレオチドを有さない糸状菌宿主細胞に比較して、少なくとも50％以上、C4ジカルボン酸を分泌することができる、請求項１〜14の何れか一項に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１６】
前記C4ジカルボン酸がリンゴ酸である、請求項１〜15の何れか一項に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１７】
（ａ）請求項１〜16のいずれか１項記載の糸状菌宿主細胞を培地において培養し；そして
（ｂ）C4ジカルボン酸を回収することを含んで成る、C4ジカルボン酸の生成方法。
【請求項１８】
（ａ）C4ジカルボン酸トランスポーターをコードする異種第１ポリヌクレオチドを用いて、糸状菌宿主細胞を形質転換し、請求項１〜16の何れか一項に記載の糸状菌宿主細胞をもたらし；
（ｂ）前記形質転換された糸状菌宿主細胞を培地において培養し；そして
（ｃ）C4ジカルボン酸を回収することを含んで成る、C4ジカルボン酸生成の増強方法。
【請求項１９】
前記生成されるC4ジカルボン酸が、150g/l以上の濃度で存在する、請求項17又は18に記載の方法。
【請求項２０】
前記培地のpHが6.0〜7.0である、請求項17〜19の何れか一項に記載の方法。
【請求項１】
C4ジカルボン酸トランスポーターをコードする異種第１ポリヌクレオチドを含む糸状菌宿主細胞であって、前記C4ジカルボン酸トランスポーターが、
（ａ）配列番号8、34又は36と少なくとも60％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣ4ジカルボン酸トランスポーター；
（ｂ）配列番号7、33、35、37又はその完全な長さの相補的鎖と低緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるC4ジカルボン酸トランスポーター；
（ｃ）配列番号７、33、35又は37と少なくとも60％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるC4ジカルボン酸トランスポーター；
（ｄ）配列番号8、34又は36の成熟ポリペプチドの１又は数個（いくつかの）のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入を含むC4ジカルボン酸トランスポーター変異体；及び
（ｅ）C4ジカルボン酸トランスポーター活性を有する、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のC４ジカルボン酸トランスポーターのフラグメントから成る群から選択され；そして
前記糸状菌宿主細胞が、同じ条件下で培養される場合、前記C4ジカルボン酸トランスポーターをコードする異種第１ポリヌクレオチドを含まない糸状菌宿主細胞に比較して、高められたレベルのC4ジカルボン酸を分泌できることを特徴とする糸状菌宿主細胞。
【請求項２】
前記C4ジカルボン酸トランスポーターが、配列番号８、34又は36を含むか又はそれらから成る、請求項１に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項３】
前記C4ジカルボン酸トランスポーターをコードする異種第1ポリヌクレオチドが、第３ポリヌクレオチドに対して外来性のプロモーターに操作可能的に結合される、請求項１又は２に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項４】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする異種第２ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項５】
前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼが、
（ａ）配列番号18又は20と少なくとも60％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むリンゴ酸デヒドロゲナーゼ；
（ｂ）（i）配列番号17又は19、（ii）配列番号17又は19に含まれるcDNA配列；又は（iii）(i)又は（ii）の完全な長さの相補的鎖と、低緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ；
（ｃ）配列番号17又は19と少なくとも60％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ；
（ｄ）配列番号18又は20の成熟ポリペプチドの１又は数個（いくつか）のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入を含むリンゴ酸デヒドロゲナーゼ変異体；及び
（ｅ）リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する、（ａ）（ｂ）（ｃ）又は（ｄ）のリンゴ酸デヒドロゲナーゼのフラグメントから成る群から選択される、請求項４に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項６】
前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼが、配列番号18又は20を含むか又はそれらから成る、請求項４に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項７】
前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする異種第２ポリヌクレオチドが、第２ポリヌクレオチドに対して外来性のプロモーターに操作可能的に結合される、請求項４〜６の何れか一項に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項８】
前記糸状菌宿主細胞が、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする異種第３ポリヌクレオチドを含む、請求項１〜７の何れか一項に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項９】
前記ピルビン酸カルボキシラーゼが、
（ａ）配列番号27と少なくとも60％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むピルビン酸カルボキシラーゼ；
（ｂ）（i）配列番号26、（ii）配列番号26に含まれるcDNA配列；又は（iii）(i)又は（ii）の完全な長さの相補的鎖と、低緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるピルビン酸カルボキシラーゼ；
（ｃ）配列番号26と少なくとも60％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるピルビン酸カルボキシラーゼ；
（ｄ）配列番号27の成熟ポリペプチドの１又は数個（いくつか）のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入を含むピルビン酸カルボキシラーゼ変異体；及び
（ｅ）ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有する、（ａ）（ｂ）（ｃ）又は（ｄ）のピルビン酸カルボキシラーゼのフラグメントから成る群から選択される、請求項８に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１０】
前記ピルビン酸カルボキシラーゼが、配列番号27を含むか又はそれらから成る、請求項８に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１１】
前記ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする異種第３ポリヌクレオチドが、第３ポリヌクレオチドに対して外来性のプロモーターに操作可能的に結合される、請求項８〜10の何れか一項に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１２】
前記宿主細胞が、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギラス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ビジェルカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、 コプリナス（Coprinus）、コリオラス（Coriolus）、クリプトコーカス（Cryptococcus）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フサリウム（Fusarium）、ヒューミコラ（Humicola）、マグナポリス（Magnaporthe）、ムコル（Mucor）、ミセリオプソラ（Myceliophthora）、ネオカノマスチックス（Neocallimastix）、ネウロスポラ（Neurospora）、パエシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、フィレビア（Phlebia）、ピロマイセス（Piromyces）、プレウロタス（Pleurotus）、 リゾパス（Rhizopus）、シゾフィラム（Schizophyllum）、タラロマイセス（Talaromyces）、サーモアスカス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）及びトリコダーマ（Trichoderma）細胞から成る群から選択される、請求項１〜11の何れか一項に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞が、アスペルギラス宿主細胞である、請求項12に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１４】
前記宿主細胞が、アスペルギラス・オリザエである、請求項13に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１５】
宿主細胞が、同じ条件下で培養される場合、C4ジカルボン酸トランスポーターをコードするポリヌクレオチドを有さない糸状菌宿主細胞に比較して、少なくとも50％以上、C4ジカルボン酸を分泌することができる、請求項１〜14の何れか一項に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１６】
前記C4ジカルボン酸がリンゴ酸である、請求項１〜15の何れか一項に記載の糸状菌宿主細胞。
【請求項１７】
（ａ）請求項１〜16のいずれか１項記載の糸状菌宿主細胞を培地において培養し；そして
（ｂ）C4ジカルボン酸を回収することを含んで成る、C4ジカルボン酸の生成方法。
【請求項１８】
（ａ）C4ジカルボン酸トランスポーターをコードする異種第１ポリヌクレオチドを用いて、糸状菌宿主細胞を形質転換し、請求項１〜16の何れか一項に記載の糸状菌宿主細胞をもたらし；
（ｂ）前記形質転換された糸状菌宿主細胞を培地において培養し；そして
（ｃ）C4ジカルボン酸を回収することを含んで成る、C4ジカルボン酸生成の増強方法。
【請求項１９】
前記生成されるC4ジカルボン酸が、150g/l以上の濃度で存在する、請求項17又は18に記載の方法。
【請求項２０】
前記培地のpHが6.0〜7.0である、請求項17〜19の何れか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【公表番号】特表２０１３−５０３６３１（Ｐ２０１３−５０３６３１Ａ）
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２７９４３（Ｐ２０１２−５２７９４３）
【出願日】平成２２年８月２７日（２０１０．８．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４７００２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２８６４３
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５００１７５６０２）ノボザイムス，インコーポレイティド (26)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２７日（２０１０．８．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４７００２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２８６４３
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５００１７５６０２）ノボザイムス，インコーポレイティド (26)
【Ｆターム（参考）】
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