系統発生分析のための方法およびシステム
本発明は、生物特異的および/または操作的分類単位(OTU)特異的プローブを設計および使用するための方法およびシステムを開示する。本方法およびシステムは、プローブとの試料中の標的分子のハイブリダイゼーションまたは結合に基づいて、試料中の複数の生体分子または微生物を検出、同定、および定量化することを可能にする。いくつかの実施形態は、クラスタリングツリー上のノードに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを選択する方法を提供する。他の実施形態は、高い信頼度を伴って、試料中の複数の生物を正確に検出することにおいて使用するための生物特異的またはOTU特異的オリゴヌクレオチドプローブを選択する方法を提供する。いくつかの実施形態は、試料中の希有なOTUの存在を検出するための方法およびシステムを提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
1つのアッセイで、少なくとも10,000の異なる操作的分類単位(OTU)の存在、非存在、相対存在量、および/または量を判定することができる複数のプローブを備えるシステム。
【請求項２】
糞便汚染を示すバイオシグネチャーを生成するように構成される、請求項1に記載のシステム。
【請求項３】
前記プローブが、1つまたは複数の高度に保存されたポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズする、請求項1に記載のシステム。
【請求項４】
前記高度に保存されたポリヌクレオチドの1つまたは複数が、16S rRNA遺伝子、23S rRNA遺伝子、5S rRNA遺伝子、5.8S rRNA遺伝子、12S rRNA遺伝子、18S rRNA遺伝子、28S rRNA遺伝子、gyrB遺伝子、rpoB遺伝子、fusA遺伝子、recA遺伝子、cox1遺伝子、nifl3遺伝子、これらに由来するRNA分子、またはこれらの組合せである、請求項3に記載のシステム。
【請求項５】
前記プローブが基質に結合される、請求項1に記載のシステム。
【請求項６】
前記プローブがアレイを形成する、請求項5に記載のシステム。
【請求項７】
前記基質がビーズまたは微小球を含む、請求項5に記載のシステム。
【請求項８】
前記基質がガラス、プラスチック、またはシリコンを含む、請求項5に記載のシステム。
【請求項９】
複数の陽性対照プローブをさらに備える、請求項1に記載のシステム。
【請求項１０】
複数の陰性対照プローブをさらに備える、請求項1に記載のシステム。
【請求項１１】
前記陰性対照プローブが、高度に保存されたポリヌクレオチドに見出される配列と相補的でない配列を含む、請求項10に記載のシステム。
【請求項１２】
前記陽性対照プローブが、配列番号51〜100から選択されるポリヌクレオチドと相補的である配列を含む、請求項9に記載のシステム。
【請求項１３】
前記陽性対照プローブが、配列番号51〜100から選択される1つまたは複数の配列を含む、請求項9に記載のシステム。
【請求項１４】
前記OTUのそれぞれが細菌、古細菌、または真菌である、請求項1に記載のシステム。
【請求項１５】
前記保存されたポリヌクレオチドが単位複製配列である、請求項3に記載のシステム。
【請求項１６】
前記OTUの存在、非存在、相対存在量、および/または量についての最終コールを行う前に、前記インターロゲーションプローブの少なくとも1つのサブセットからデータを除去する、請求項1に記載のシステム。
【請求項１７】
前記データが、インターロゲーションプローブのクロスハイブリダイゼーション能に基づいて除去される、請求項16に記載のシステム。
【請求項１８】
前記OTUのそれぞれの同じ高度に保存された領域に対して、シークエンシング反応を実施することができる、請求項1に記載のシステム。
【請求項１９】
1つまたは複数の種特異的なプローブをさらに備える、請求項1に記載のシステム。
【請求項２０】
95%超の信頼度レベルおよび95%超の感度レベルを伴って、1つのアッセイで、存在する全核酸の1×10-3以下を含む1つまたは複数の第1の核酸配列を検出することができるシステムであって、1つまたは複数の第1の核酸配列と、残りの標的核酸のセットは、少なくとも95%相同であるシステム。
【請求項２１】
糞便汚染を示すバイオシグネチャーを生成するように構成される、請求項20に記載のシステム。
【請求項２２】
前記核酸配列の1つまたは複数が、16S rRNA遺伝子、23S rRNA遺伝子、5S rRNA遺伝子、5.8S rRNA遺伝子、12S rRNA遺伝子、18S rRNA遺伝子、28S rRNA遺伝子、gyrB遺伝子、rpoB遺伝子、fusA遺伝子、recA遺伝子、cox1遺伝子、nifl3遺伝子、これらに由来するRNA分子、またはこれらの組合せである、請求項20に記載のシステム。
【請求項２３】
前記核酸が単位複製配列を含む、請求項20に記載のシステム。
【請求項２４】
1つのアッセイで、複数の異なる操作的分類単位(OTU)の存在、非存在、相対存在量、および/または量を判定するためのシステムであって、複数のポリヌクレオチドインターロゲーションプローブ、複数のポリヌクレオチド陽性対照プローブ、および複数のポリヌクレオチド陰性対照プローブを含むシステム。
【請求項２５】
糞便汚染を示すバイオシグネチャーを生成するように構成される、請求項24に記載のシステム。
【請求項２６】
前記微生物の存在、非存在、相対存在量、および/または量についての最終コールを行う前に、前記インターロゲーションプローブの少なくとも1つのサブセットからデータを除去する、請求項24に記載のシステム。
【請求項２７】
前記データが、インターロゲーションプローブのクロスハイブリダイゼーション能に基づいて除去される、請求項26に記載のシステム。
【請求項２８】
95%超の信頼度を伴って、1つのアッセイで、1つのドメインの10,000を超える異なる操作的分類単位(OTU)の存在、非存在、相対存在量、および/または量を検出することができるシステム。
【請求項２９】
糞便汚染を示すバイオシグネチャーを生成するように構成される、請求項28に記載のシステム。
【請求項３０】
前記OTUのそれぞれにおける同じ高度に保存された領域と選択的にハイブリダイズする複数のプローブを備える、請求項28に記載のシステム。
【請求項３１】
前記OTUのそれぞれの同じ高度に保存された領域に対して、シークエンシング反応を実施することができる、請求項28に記載のシステム。
【請求項３２】
前記ドメインが細菌、古細菌、または真菌である、請求項28に記載のシステム。
【請求項３３】
前記高度に保存された配列とハイブリダイズしない種特異的プローブをさらに備える、請求項28に記載のシステム。
【請求項３４】
少なくとも100の種特異的プローブを備える、請求項33に記載のシステム。
【請求項３５】
試料から1つまたは複数の微生物の存在、非存在、相対存在量、および/または量を判定するためのシステムであって、複数の操作的分類単位(OTU)を備え、1OTU当たりのプローブの中央値数は、26未満であるシステム。
【請求項３６】
糞便汚染を示すバイオシグネチャーを生成するように構成される、請求項35に記載のシステム。
【請求項３７】
試料から1つまたは複数の微生物の存在、非存在、相対存在量、および/または量を判定するためのシステムであって、複数の操作的分類単位(OTU)を備え、1プローブ当たりのクロスハイブリダイゼーションの中央値数は、20未満であるシステム。
【請求項３８】
糞便汚染を示すバイオシグネチャーを生成するように構成される、請求項37に記載のシステム。
【請求項３９】
試料の状態を判定するための方法であって、
a)前記試料を複数の異なるプローブと接触させるステップと、
b)前記プローブのそれぞれについてのハイブリダイゼーションシグナル強度を測定するステップであって、前記測定は、前記試料のバイオシグネチャーを確立するステップと、
c)前記試料のバイオシグネチャーを糞便汚染のバイオシグネチャーと比較するステップと
を含む方法。
【請求項４０】
試料中の微生物の存在、相対存在量、および/または量の確率を求めるための方法であって、
a)前記微生物中の高度に保存された配列と特異的にハイブリダイズしない陰性対照プローブのハイブリダイゼーションシグナル強度分布を求めるステップと、
b)陽性対照プローブのハイブリダイゼーションシグナル強度分布を求めるステップと、
c)複数の異なるインターロゲーションプローブについてのハイブリダイゼーションシグナル強度を求めるステップであって、インターロゲーションプローブのそれぞれは、前記高度に保存された配列内のセクションと相補的であるステップと、
d)陰性および陽性プローブのハイブリダイゼーションシグナル強度を使用することによって、異なるインターロゲーションプローブについてのハイブリダイゼーションシグナルが、前記微生物の存在、相対存在量、および/または量を表す確率を求めるステップと
を含む方法。
【請求項４１】
陰性および陽性プローブのハイブリダイゼーションシグナル強度の使用が、一連の陽性および陰性対照プローブとのハイブリダイゼーションを使用して、前記インターロゲーションプローブのハイブリダイゼーションデータを正規化またはフィッティングすることを伴う、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
前記インターロゲーションプローブのハイブリダイゼーションデータの正規化またはフィッティングが、前記陰性および陽性対照プローブのA+T含量、または正規分布およびγ分布を利用する、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
陰性対照プローブが、パーフェクトマッチおよびミスマッチプローブを含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４４】
陽性対照プローブが、パーフェクトマッチおよびミスマッチプローブを含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４５】
前記陰性および陽性対照プローブの正規分布およびγ分布が、前記プローブについてのペアディファレンススコアを計算することを伴う、請求項42に記載の方法。
【請求項４６】
前記複数の異なるインターロゲーションプローブのハイブリダイゼーションシグナル強度を、各プローブのG+C含量に基づいて減衰させるステップをさらに含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４７】
試料中のユニークな配列または微生物の存在または量の確率を求めるための方法であって、
a)前記試料を複数の異なるプローブと接触させるステップと、
b)前記プローブのそれぞれに対する、試料配列についてのハイブリダイゼーションシグナル強度を求めるステップと、
c)ハイブリダイゼーションシグナル強度データに基づく可能なリストからの1つの操作的分類単位(OTU)を分析から除去または希薄化し、それによって、残りのハイブリダイゼーションシグナル強度データの信頼度レベルを増大させるステップと
を含む方法
【請求項４８】
前記除去または希薄化するステップが、そのようなOTU内である特定の閾値強度をクリアする一定割合のプローブを有するOTUのみを分析して実施される、請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
ある特定の閾値をクリアするOTUのみがさらに分析される、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
除去または希薄化するステップが、OTUに由来するプローブの、他のOTUに由来する配列との潜在的なクロスハイブリダイゼーションに基づいて、前記OTUが試料中に存在する尤度にペナルティを課すことによって実施される、請求項47に記載の方法。
【請求項５１】
クロスハイブリダイゼーションの潜在性が大きいほど、ペナリゼーションが大きい、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
クロスハイブリダイゼーションに基づくペナリゼーションが、最低レベルから開始して、系統樹の各レベルで実施される、請求項50に記載の方法。
【請求項５３】
ハイブリダイゼーションシグナル強度閾値を超えるスコアを得ているペナルティを課されたOTUのみがさらに分析される、請求項50に記載の方法。
【請求項５４】
OTUを含む系統樹の一部のみが分析される、請求項52に記載の方法。
【請求項５５】
試料中の複数の異なる生物の存在または量を判定するための方法であって、各プローブのGC含量を求めるステップと、陽性対照プローブ強度および陰性対照プローブ強度に対する各プローブ強度を比較するdスコアを使用することによって、前記プローブの量を求めるステップとを含む方法。
【請求項５６】
一連の異なる生物からの1つまたは複数の生物が試料中に存在する確率を求めるためのコンピュータ実行可能ロジックであって、
a)陰性対照プローブおよび陽性対照プローブの強度との比較に基づいて、個々のインターロゲーションプローブ強度が正確である尤度を求めるための第1のプロセスと、
b)第1の変位値閾値をクリアする操作的分類単位(OTU)からのインターロゲーションプローブの強度に基づいて、個々のOTUが存在する尤度を求める第2のプロセスと、
c)前記OTUの配列を分析するプローブの、他のOTUからの配列とのクロスハイブリダイゼーションについての潜在性に基づいて、第1の変位値閾値をクリアした1つまたは複数のOTUにペナルティを課すための第3のプロセスと
を含むコンピュータ実行可能ロジック。
【請求項５７】
試料中の1つまたは複数の微生物の存在を判定するためのコンピュータ実行可能ロジックであって、少なくとも10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、または60,000のユニークで高度に保存されたポリヌクレオチドのそれぞれに選択的に結合する一連のプローブからの強度を分析し、少なくとも99%の信頼度レベルを伴って、前記試料中に存在するすべての種のうちの少なくとも97%の存在を判定するためのロジックを含むコンピュータ実行可能ロジック。
【請求項５８】
試料中の1つまたは複数の微生物の存在を判定するためのコンピュータ実行可能ロジックであって、一連の少なくとも1000の異なるインターロゲーション完全プローブを分析するためのロジックと、前記判定を行うプロセスにおいて、前記インターロゲーション完全プローブの少なくとも10%から情報を廃棄するためのロジックとを含むコンピュータ実行可能ロジック。
【請求項５９】
プローブ選択の方法であって、
a)一連の高度に保存された核酸配列を選択するステップと、
b)前記複数の核酸配列を複数の標準核酸配列と比較することによって、キメラ配列を同定するステップと、
c)比較ステップにおいて同定されたキメラ配列を除去するステップと、
d)残りの核酸と相補的なプローブを選択するステップと
を含む方法。
【請求項６０】
少なくとも500,000の高度に保存された核酸配列が選択される、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
複数の核酸配列のメンバーが、これが複数の標準核酸配列のメンバーと95%超の類似性を共有する場合、キメラ配列でないとみなされる、請求項59に記載の方法。
【請求項６２】
前記複数の核酸配列を、これ自体と比較することによってキメラ配列を同定するステップをさらに含む、請求項59に記載の方法。
【請求項６３】
高度に保存された核酸配列が、16S rRNA遺伝子、23S rRNA遺伝子、5S RNA遺伝子、5.8S rRNA遺伝子、12S rRNA遺伝子、18S rRNA遺伝子、28S rRNA遺伝子、gyrB遺伝子、rpoB遺伝子、fusA遺伝子、recA遺伝子、cox1遺伝子、nifD遺伝子、またはこれらの組合せに由来する配列である、請求項59に記載の方法。
【請求項６４】
プローブ選択の方法であって、
a)複数の核酸配列を選択するステップと、
b)複数の核酸配列を、複数の標準核酸配列と整列させることによって、複数の核酸配列のそれぞれにおける挿入点を同定するステップと、
c)少なくとも50の挿入点を有するか、または長さが少なくとも100核酸である挿入を有する配列を除去するステップと、
d)残りの核酸と相補的なプローブを選択するステップと
を含む方法。
【請求項６５】
プローブ選択の方法であって、
a)複数の核酸配列を選択するステップと、
b)複数の核酸配列を選別するステップと、
c)残りの核酸配列に対して階層的クラスタリングを実施することによってガイドツリーを生成するステップと、
d)前記ガイドツリーにおける各ノードと相補的なプローブを選択するステップと
を含む方法。
【請求項６６】
複数の核酸配列を選別するステップが、PCRプライマー人工産物を含むと同定された配列を除去するステップ、挿入を含むと同定された配列を除去するステップ、キメラと同定された配列を除去するステップ、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項65に記載の方法。
【請求項６７】
1つの状態を示すマイクロバイオームシグネチャーを同定するための方法であって、
a)前記状態を伴わない対照試料および前記状態を伴う参照試料における少なくとも1,000の異なる操作的分類単位(OTU)の存在および任意選択により存在量を比較するステップと、
b)前記状態と関連する1つまたは複数のOTUを同定するステップと
を含む方法。
【請求項６８】
前記状態が油流出である、請求項67に記載の方法。
【請求項６９】
前記対照試料に対する、前記参照試料中の前記OTUの存在および任意選択により存在量における類似性の増大が、前記状態のレメディエーションを示す、請求項67に記載の方法。
【請求項７０】
前記対照試料に対する、前記参照試料中の前記OTUの存在および任意選択により存在量における類似性の程度の変化が、前記状態のレメディエーションの尺度として提供される、請求項67に記載の方法。
【請求項７１】
前記状態のレメディエーションの所定レベルに到達するまでの時間を予測するステップをさらに含む、請求項69に記載の方法。
【請求項７２】
試料中の状態をアッセイするためのプローブを選択するための方法であって、
a)前記状態を有する1つまたは複数の試験試料を、1つのドメインの少なくとも10,000の操作的分類単位(OTU)、または1つのドメインの各既知のOTUの存在または非存在の確率について同時にアッセイする検出システムに適用するステップと、
b)前記状態を有さない1つまたは複数の対照試料を、前記検出システムに適用することによって、前記対照試料中の前記OTUの存在または非存在の確率を求めるステップと、
c)対照試料と関連していない、試験試料と関連したOTUのパターンを求めるステップと
d)低密度プローブシステムにおいて使用するために、試験試料と関連したOTUを選択的に検出するプローブを同定するステップと
を含む方法。
【請求項７３】
前記ドメインが、細菌、古細菌、または真菌である、請求項72に記載の方法。
【請求項７４】
前記パターンが、最大200の異なるOTUからなる、請求項72に記載の方法。
【請求項７５】
試料が水試料であり、状態が、糞便汚染、毒性藻類ブルーム汚染、養魚場病原菌の存在、点源汚染、非点源汚染、またはこれらの組合せである、請求項72に記載の方法。
【請求項７６】
試料がヒトまたは動物試料である、請求項72に記載の方法。
【請求項７７】
試料が、腸、呼吸器系、口腔、洞、鼻孔、尿生殖路、皮膚、糞便、乳房、またはこれらの組合せから得られる、請求項76に記載の方法。
【請求項７８】
状態が、クローン病、過敏性腸症候群、癌、鼻炎、胃潰瘍、大腸炎、アトピー、喘息、新生仔の壊死性全腸炎、アクネ、食物アレルギー、胃食道逆流症、肥満症、または歯周病である、請求項76に記載の方法。
【請求項７９】
試料が食物試料である、請求項72に記載の方法。
【請求項８０】
試料が空気試料である、請求項72に記載の方法。
【請求項８１】
試料が、森林、工芸作物、または他の植物からのものである、請求項72に記載の方法。
【請求項８２】
状態についての少なくとも1つの新しいインジケータ種を同定するための方法であって、
a)前記状態を伴わない対照試料を、1つの実験においてアッセイすることによって、すべての既知の細菌、古細菌、または真菌の各操作的分類単位(OTU)の存在または非存在を判定するステップと、
b)前記状態を伴う試験試料を、1つの実験においてアッセイすることによって、すべての既知の細菌、古細菌、または真菌の各OTUの存在または非存在を判定するステップと、
c)(a)および(b)からの結果を比較することによって、存在量が所定の割合で変化する少なくとも1つの微生物を同定するステップであって、同定される微生物種は、前記状態についての前記新しいインジケータ種を表すステップと
を含む方法。
【請求項８３】
所定の割合が、存在量の少なくとも2倍の変化である、請求項82に記載の方法。
【請求項８４】
所定の割合が、存在量の統計的に有意な変化である、請求項82に記載の方法。
【請求項８５】
前記微生物が、前記状態の存在下で存在量が減少する、請求項82に記載の方法。
【請求項８６】
前記微生物が、前記状態の存在下で存在量が増加する、請求項82に記載の方法。
【請求項８７】
95%超の信頼度レベルを伴って、1つのアッセイで、ある環境からの少なくとも10,000のOTUを含むマイクロバイオームシグネチャーを生成することができるシステム。
【請求項８８】
微生物汚染源を検出するための方法であって、1つのアッセイで、前記試料中に天然に存在しない少なくとも100の微生物のOTUの存在および量を判定するステップと、前記操作的分類単位(OTU)の存在および量のパターンを使用して前記汚染源を特定するステップとを含む方法。
【請求項８９】
1つのアッセイで、少なくとも50の異なる糞便の分類群の存在および量を検出することができるシステム。
【請求項９０】
前記検出が、複数のプローブの、検出される各生物から単離された、高度に保存された核酸との選択的ハイブリダイゼーションに基づく、請求項89に記載のシステム。
【請求項９１】
前記検出が、表4に列挙された生物または分類群を同定する複数のプローブから選択される複数のプローブの選択的ハイブリダイゼーションに基づく、請求項89に記載のシステム。
【請求項９２】
検出が、清潔な水の分類群を示す核酸と選択的にハイブリダイズする1つまたは複数のプローブのハイブリダイゼーションを検出するステップをさらに含み、前記プローブは、表11に列挙された生物または分類群を同定する複数のプローブから選択される、請求項91に記載のシステム。
【請求項９３】
水試料を試験するための方法であって、前記水試料中の桿菌、バクテロイデス、およびクロストリジウム種と、α-プロテオバクテリア種との比を計算するステップであって、1.0を超える値は、糞便汚染を示すステップを含む方法。
【請求項９４】
比を計算するステップが、培養、直接計数、PCRクローニング、配列決定、または遺伝子発現アレイの使用を利用しない、請求項93に記載の方法。
【請求項９５】
桿菌種が、表4に列挙された種を含む、請求項93に記載の方法。
【請求項９６】
バクテロイデス種が、表4に列挙された種を含む、請求項93に記載の方法。
【請求項９７】
クロストリジウム種が、表4に列挙された種を含む、請求項93に記載の方法。
【請求項９８】
α-プロテオバクテリア種が、表4に列挙された種を含む、請求項93に記載の方法。
【請求項９９】
計算するステップが、水試料を複数のプローブと接触させるステップを含む、請求項93に記載の方法。
【請求項１００】
複数のプローブが、高度に保存された遺伝子と相補的である、請求項99に記載の方法。
【請求項１０１】
毒性藻類ブルームの尤度を予測するための方法であって、
a)水試料を、表6から選択されるラン藻類に由来する核酸に選択的に結合する複数のプローブと接触させるステップと、
b)ハイブリダイゼーションデータを使用することによって、水試料中のラン藻類の量および組成を求めるステップと、
c)環境条件を測定するステップと、
d)ラン藻類の量および組成物、ならびに環境条件に基づいて毒性藻類ブルームの尤度を予測するステップと
を含む方法。
【請求項１０２】
ラン藻類の核酸に対するプローブが、表6に列挙された属を検出するために選択される、請求項101に記載の方法。
【請求項１０３】
環境条件が、水温、濁り、窒素濃度、酸素濃度、炭素濃度、リン酸濃度、および/または太陽光レベルを含む、請求項101に記載の方法。
【請求項１０４】
水の管理の決定を、毒性藻類ブルームの尤度に基づいて行うステップをさらに含む、請求項101に記載の方法。
【請求項１０５】
対象の状態または対象のための療法を判定するための方法であって、前記対象に由来する試料に対して1つの核酸アッセイを実施することによって、少なくとも1000の操作的分類単位(OTU)の存在および/または量を判定するステップを含む方法。
【請求項１０６】
試料の状態を予測するための方法であって、
a)前記試料中の微生物の少なくとも1,000のOTUの存在または非存在の確率として、微生物個体数データを求めるステップと、
b)前記試料中の前記微生物の1つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現データを求めるステップと、
c)前記発現データおよび個体数データを使用することによって、前記試料について予測を行うステップと
を含む方法。
【請求項１０７】
前記試料が土壌または水試料である、請求項106に記載の方法。
【請求項１０８】
油流出によって引き起こされた被害を評価するための方法であって、
(a)前記油流出によって影響されていない1つまたは複数の位置からの1つまたは複数の試料中の少なくとも1,000の操作的分類単位(OTU)の存在、非存在、および/または存在量を判定し、それによって無影響のバイオシグネチャーを確立するステップと、
(b)前記油流出によって影響された位置からの1つまたは複数の試料中の少なくとも1,000のOTUの存在、非存在、および/または存在量を判定し、それによって油流出に影響されたバイオシグネチャーを確立するステップと、
(c)前記無影響のバイオシグネチャーを、前記油流出に影響されたバイオシグネチャーと比較するステップであって、前記バイオシグネチャーの差異は、前記油流出によって影響された前記位置のマイクロバイオームに対する影響を示すステップと
を含む方法。
【請求項１０９】
ステップ(b)が、第1の時間および第2の時間で実施される、請求項108に記載の方法。
【請求項１１０】
前記第1の時間と前記第2の時間の間の前記バイオシグネチャーの前記差異の変化を使用することによって、油流出被害のレメディエーションの進行を追跡する、請求項109に記載の方法。
【請求項１】
1つのアッセイで、少なくとも10,000の異なる操作的分類単位(OTU)の存在、非存在、相対存在量、および/または量を判定することができる複数のプローブを備えるシステム。
【請求項２】
糞便汚染を示すバイオシグネチャーを生成するように構成される、請求項1に記載のシステム。
【請求項３】
前記プローブが、1つまたは複数の高度に保存されたポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズする、請求項1に記載のシステム。
【請求項４】
前記高度に保存されたポリヌクレオチドの1つまたは複数が、16S rRNA遺伝子、23S rRNA遺伝子、5S rRNA遺伝子、5.8S rRNA遺伝子、12S rRNA遺伝子、18S rRNA遺伝子、28S rRNA遺伝子、gyrB遺伝子、rpoB遺伝子、fusA遺伝子、recA遺伝子、cox1遺伝子、nifl3遺伝子、これらに由来するRNA分子、またはこれらの組合せである、請求項3に記載のシステム。
【請求項５】
前記プローブが基質に結合される、請求項1に記載のシステム。
【請求項６】
前記プローブがアレイを形成する、請求項5に記載のシステム。
【請求項７】
前記基質がビーズまたは微小球を含む、請求項5に記載のシステム。
【請求項８】
前記基質がガラス、プラスチック、またはシリコンを含む、請求項5に記載のシステム。
【請求項９】
複数の陽性対照プローブをさらに備える、請求項1に記載のシステム。
【請求項１０】
複数の陰性対照プローブをさらに備える、請求項1に記載のシステム。
【請求項１１】
前記陰性対照プローブが、高度に保存されたポリヌクレオチドに見出される配列と相補的でない配列を含む、請求項10に記載のシステム。
【請求項１２】
前記陽性対照プローブが、配列番号51〜100から選択されるポリヌクレオチドと相補的である配列を含む、請求項9に記載のシステム。
【請求項１３】
前記陽性対照プローブが、配列番号51〜100から選択される1つまたは複数の配列を含む、請求項9に記載のシステム。
【請求項１４】
前記OTUのそれぞれが細菌、古細菌、または真菌である、請求項1に記載のシステム。
【請求項１５】
前記保存されたポリヌクレオチドが単位複製配列である、請求項3に記載のシステム。
【請求項１６】
前記OTUの存在、非存在、相対存在量、および/または量についての最終コールを行う前に、前記インターロゲーションプローブの少なくとも1つのサブセットからデータを除去する、請求項1に記載のシステム。
【請求項１７】
前記データが、インターロゲーションプローブのクロスハイブリダイゼーション能に基づいて除去される、請求項16に記載のシステム。
【請求項１８】
前記OTUのそれぞれの同じ高度に保存された領域に対して、シークエンシング反応を実施することができる、請求項1に記載のシステム。
【請求項１９】
1つまたは複数の種特異的なプローブをさらに備える、請求項1に記載のシステム。
【請求項２０】
95%超の信頼度レベルおよび95%超の感度レベルを伴って、1つのアッセイで、存在する全核酸の1×10-3以下を含む1つまたは複数の第1の核酸配列を検出することができるシステムであって、1つまたは複数の第1の核酸配列と、残りの標的核酸のセットは、少なくとも95%相同であるシステム。
【請求項２１】
糞便汚染を示すバイオシグネチャーを生成するように構成される、請求項20に記載のシステム。
【請求項２２】
前記核酸配列の1つまたは複数が、16S rRNA遺伝子、23S rRNA遺伝子、5S rRNA遺伝子、5.8S rRNA遺伝子、12S rRNA遺伝子、18S rRNA遺伝子、28S rRNA遺伝子、gyrB遺伝子、rpoB遺伝子、fusA遺伝子、recA遺伝子、cox1遺伝子、nifl3遺伝子、これらに由来するRNA分子、またはこれらの組合せである、請求項20に記載のシステム。
【請求項２３】
前記核酸が単位複製配列を含む、請求項20に記載のシステム。
【請求項２４】
1つのアッセイで、複数の異なる操作的分類単位(OTU)の存在、非存在、相対存在量、および/または量を判定するためのシステムであって、複数のポリヌクレオチドインターロゲーションプローブ、複数のポリヌクレオチド陽性対照プローブ、および複数のポリヌクレオチド陰性対照プローブを含むシステム。
【請求項２５】
糞便汚染を示すバイオシグネチャーを生成するように構成される、請求項24に記載のシステム。
【請求項２６】
前記微生物の存在、非存在、相対存在量、および/または量についての最終コールを行う前に、前記インターロゲーションプローブの少なくとも1つのサブセットからデータを除去する、請求項24に記載のシステム。
【請求項２７】
前記データが、インターロゲーションプローブのクロスハイブリダイゼーション能に基づいて除去される、請求項26に記載のシステム。
【請求項２８】
95%超の信頼度を伴って、1つのアッセイで、1つのドメインの10,000を超える異なる操作的分類単位(OTU)の存在、非存在、相対存在量、および/または量を検出することができるシステム。
【請求項２９】
糞便汚染を示すバイオシグネチャーを生成するように構成される、請求項28に記載のシステム。
【請求項３０】
前記OTUのそれぞれにおける同じ高度に保存された領域と選択的にハイブリダイズする複数のプローブを備える、請求項28に記載のシステム。
【請求項３１】
前記OTUのそれぞれの同じ高度に保存された領域に対して、シークエンシング反応を実施することができる、請求項28に記載のシステム。
【請求項３２】
前記ドメインが細菌、古細菌、または真菌である、請求項28に記載のシステム。
【請求項３３】
前記高度に保存された配列とハイブリダイズしない種特異的プローブをさらに備える、請求項28に記載のシステム。
【請求項３４】
少なくとも100の種特異的プローブを備える、請求項33に記載のシステム。
【請求項３５】
試料から1つまたは複数の微生物の存在、非存在、相対存在量、および/または量を判定するためのシステムであって、複数の操作的分類単位(OTU)を備え、1OTU当たりのプローブの中央値数は、26未満であるシステム。
【請求項３６】
糞便汚染を示すバイオシグネチャーを生成するように構成される、請求項35に記載のシステム。
【請求項３７】
試料から1つまたは複数の微生物の存在、非存在、相対存在量、および/または量を判定するためのシステムであって、複数の操作的分類単位(OTU)を備え、1プローブ当たりのクロスハイブリダイゼーションの中央値数は、20未満であるシステム。
【請求項３８】
糞便汚染を示すバイオシグネチャーを生成するように構成される、請求項37に記載のシステム。
【請求項３９】
試料の状態を判定するための方法であって、
a)前記試料を複数の異なるプローブと接触させるステップと、
b)前記プローブのそれぞれについてのハイブリダイゼーションシグナル強度を測定するステップであって、前記測定は、前記試料のバイオシグネチャーを確立するステップと、
c)前記試料のバイオシグネチャーを糞便汚染のバイオシグネチャーと比較するステップと
を含む方法。
【請求項４０】
試料中の微生物の存在、相対存在量、および/または量の確率を求めるための方法であって、
a)前記微生物中の高度に保存された配列と特異的にハイブリダイズしない陰性対照プローブのハイブリダイゼーションシグナル強度分布を求めるステップと、
b)陽性対照プローブのハイブリダイゼーションシグナル強度分布を求めるステップと、
c)複数の異なるインターロゲーションプローブについてのハイブリダイゼーションシグナル強度を求めるステップであって、インターロゲーションプローブのそれぞれは、前記高度に保存された配列内のセクションと相補的であるステップと、
d)陰性および陽性プローブのハイブリダイゼーションシグナル強度を使用することによって、異なるインターロゲーションプローブについてのハイブリダイゼーションシグナルが、前記微生物の存在、相対存在量、および/または量を表す確率を求めるステップと
を含む方法。
【請求項４１】
陰性および陽性プローブのハイブリダイゼーションシグナル強度の使用が、一連の陽性および陰性対照プローブとのハイブリダイゼーションを使用して、前記インターロゲーションプローブのハイブリダイゼーションデータを正規化またはフィッティングすることを伴う、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
前記インターロゲーションプローブのハイブリダイゼーションデータの正規化またはフィッティングが、前記陰性および陽性対照プローブのA+T含量、または正規分布およびγ分布を利用する、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
陰性対照プローブが、パーフェクトマッチおよびミスマッチプローブを含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４４】
陽性対照プローブが、パーフェクトマッチおよびミスマッチプローブを含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４５】
前記陰性および陽性対照プローブの正規分布およびγ分布が、前記プローブについてのペアディファレンススコアを計算することを伴う、請求項42に記載の方法。
【請求項４６】
前記複数の異なるインターロゲーションプローブのハイブリダイゼーションシグナル強度を、各プローブのG+C含量に基づいて減衰させるステップをさらに含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４７】
試料中のユニークな配列または微生物の存在または量の確率を求めるための方法であって、
a)前記試料を複数の異なるプローブと接触させるステップと、
b)前記プローブのそれぞれに対する、試料配列についてのハイブリダイゼーションシグナル強度を求めるステップと、
c)ハイブリダイゼーションシグナル強度データに基づく可能なリストからの1つの操作的分類単位(OTU)を分析から除去または希薄化し、それによって、残りのハイブリダイゼーションシグナル強度データの信頼度レベルを増大させるステップと
を含む方法
【請求項４８】
前記除去または希薄化するステップが、そのようなOTU内である特定の閾値強度をクリアする一定割合のプローブを有するOTUのみを分析して実施される、請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
ある特定の閾値をクリアするOTUのみがさらに分析される、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
除去または希薄化するステップが、OTUに由来するプローブの、他のOTUに由来する配列との潜在的なクロスハイブリダイゼーションに基づいて、前記OTUが試料中に存在する尤度にペナルティを課すことによって実施される、請求項47に記載の方法。
【請求項５１】
クロスハイブリダイゼーションの潜在性が大きいほど、ペナリゼーションが大きい、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
クロスハイブリダイゼーションに基づくペナリゼーションが、最低レベルから開始して、系統樹の各レベルで実施される、請求項50に記載の方法。
【請求項５３】
ハイブリダイゼーションシグナル強度閾値を超えるスコアを得ているペナルティを課されたOTUのみがさらに分析される、請求項50に記載の方法。
【請求項５４】
OTUを含む系統樹の一部のみが分析される、請求項52に記載の方法。
【請求項５５】
試料中の複数の異なる生物の存在または量を判定するための方法であって、各プローブのGC含量を求めるステップと、陽性対照プローブ強度および陰性対照プローブ強度に対する各プローブ強度を比較するdスコアを使用することによって、前記プローブの量を求めるステップとを含む方法。
【請求項５６】
一連の異なる生物からの1つまたは複数の生物が試料中に存在する確率を求めるためのコンピュータ実行可能ロジックであって、
a)陰性対照プローブおよび陽性対照プローブの強度との比較に基づいて、個々のインターロゲーションプローブ強度が正確である尤度を求めるための第1のプロセスと、
b)第1の変位値閾値をクリアする操作的分類単位(OTU)からのインターロゲーションプローブの強度に基づいて、個々のOTUが存在する尤度を求める第2のプロセスと、
c)前記OTUの配列を分析するプローブの、他のOTUからの配列とのクロスハイブリダイゼーションについての潜在性に基づいて、第1の変位値閾値をクリアした1つまたは複数のOTUにペナルティを課すための第3のプロセスと
を含むコンピュータ実行可能ロジック。
【請求項５７】
試料中の1つまたは複数の微生物の存在を判定するためのコンピュータ実行可能ロジックであって、少なくとも10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、または60,000のユニークで高度に保存されたポリヌクレオチドのそれぞれに選択的に結合する一連のプローブからの強度を分析し、少なくとも99%の信頼度レベルを伴って、前記試料中に存在するすべての種のうちの少なくとも97%の存在を判定するためのロジックを含むコンピュータ実行可能ロジック。
【請求項５８】
試料中の1つまたは複数の微生物の存在を判定するためのコンピュータ実行可能ロジックであって、一連の少なくとも1000の異なるインターロゲーション完全プローブを分析するためのロジックと、前記判定を行うプロセスにおいて、前記インターロゲーション完全プローブの少なくとも10%から情報を廃棄するためのロジックとを含むコンピュータ実行可能ロジック。
【請求項５９】
プローブ選択の方法であって、
a)一連の高度に保存された核酸配列を選択するステップと、
b)前記複数の核酸配列を複数の標準核酸配列と比較することによって、キメラ配列を同定するステップと、
c)比較ステップにおいて同定されたキメラ配列を除去するステップと、
d)残りの核酸と相補的なプローブを選択するステップと
を含む方法。
【請求項６０】
少なくとも500,000の高度に保存された核酸配列が選択される、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
複数の核酸配列のメンバーが、これが複数の標準核酸配列のメンバーと95%超の類似性を共有する場合、キメラ配列でないとみなされる、請求項59に記載の方法。
【請求項６２】
前記複数の核酸配列を、これ自体と比較することによってキメラ配列を同定するステップをさらに含む、請求項59に記載の方法。
【請求項６３】
高度に保存された核酸配列が、16S rRNA遺伝子、23S rRNA遺伝子、5S RNA遺伝子、5.8S rRNA遺伝子、12S rRNA遺伝子、18S rRNA遺伝子、28S rRNA遺伝子、gyrB遺伝子、rpoB遺伝子、fusA遺伝子、recA遺伝子、cox1遺伝子、nifD遺伝子、またはこれらの組合せに由来する配列である、請求項59に記載の方法。
【請求項６４】
プローブ選択の方法であって、
a)複数の核酸配列を選択するステップと、
b)複数の核酸配列を、複数の標準核酸配列と整列させることによって、複数の核酸配列のそれぞれにおける挿入点を同定するステップと、
c)少なくとも50の挿入点を有するか、または長さが少なくとも100核酸である挿入を有する配列を除去するステップと、
d)残りの核酸と相補的なプローブを選択するステップと
を含む方法。
【請求項６５】
プローブ選択の方法であって、
a)複数の核酸配列を選択するステップと、
b)複数の核酸配列を選別するステップと、
c)残りの核酸配列に対して階層的クラスタリングを実施することによってガイドツリーを生成するステップと、
d)前記ガイドツリーにおける各ノードと相補的なプローブを選択するステップと
を含む方法。
【請求項６６】
複数の核酸配列を選別するステップが、PCRプライマー人工産物を含むと同定された配列を除去するステップ、挿入を含むと同定された配列を除去するステップ、キメラと同定された配列を除去するステップ、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項65に記載の方法。
【請求項６７】
1つの状態を示すマイクロバイオームシグネチャーを同定するための方法であって、
a)前記状態を伴わない対照試料および前記状態を伴う参照試料における少なくとも1,000の異なる操作的分類単位(OTU)の存在および任意選択により存在量を比較するステップと、
b)前記状態と関連する1つまたは複数のOTUを同定するステップと
を含む方法。
【請求項６８】
前記状態が油流出である、請求項67に記載の方法。
【請求項６９】
前記対照試料に対する、前記参照試料中の前記OTUの存在および任意選択により存在量における類似性の増大が、前記状態のレメディエーションを示す、請求項67に記載の方法。
【請求項７０】
前記対照試料に対する、前記参照試料中の前記OTUの存在および任意選択により存在量における類似性の程度の変化が、前記状態のレメディエーションの尺度として提供される、請求項67に記載の方法。
【請求項７１】
前記状態のレメディエーションの所定レベルに到達するまでの時間を予測するステップをさらに含む、請求項69に記載の方法。
【請求項７２】
試料中の状態をアッセイするためのプローブを選択するための方法であって、
a)前記状態を有する1つまたは複数の試験試料を、1つのドメインの少なくとも10,000の操作的分類単位(OTU)、または1つのドメインの各既知のOTUの存在または非存在の確率について同時にアッセイする検出システムに適用するステップと、
b)前記状態を有さない1つまたは複数の対照試料を、前記検出システムに適用することによって、前記対照試料中の前記OTUの存在または非存在の確率を求めるステップと、
c)対照試料と関連していない、試験試料と関連したOTUのパターンを求めるステップと
d)低密度プローブシステムにおいて使用するために、試験試料と関連したOTUを選択的に検出するプローブを同定するステップと
を含む方法。
【請求項７３】
前記ドメインが、細菌、古細菌、または真菌である、請求項72に記載の方法。
【請求項７４】
前記パターンが、最大200の異なるOTUからなる、請求項72に記載の方法。
【請求項７５】
試料が水試料であり、状態が、糞便汚染、毒性藻類ブルーム汚染、養魚場病原菌の存在、点源汚染、非点源汚染、またはこれらの組合せである、請求項72に記載の方法。
【請求項７６】
試料がヒトまたは動物試料である、請求項72に記載の方法。
【請求項７７】
試料が、腸、呼吸器系、口腔、洞、鼻孔、尿生殖路、皮膚、糞便、乳房、またはこれらの組合せから得られる、請求項76に記載の方法。
【請求項７８】
状態が、クローン病、過敏性腸症候群、癌、鼻炎、胃潰瘍、大腸炎、アトピー、喘息、新生仔の壊死性全腸炎、アクネ、食物アレルギー、胃食道逆流症、肥満症、または歯周病である、請求項76に記載の方法。
【請求項７９】
試料が食物試料である、請求項72に記載の方法。
【請求項８０】
試料が空気試料である、請求項72に記載の方法。
【請求項８１】
試料が、森林、工芸作物、または他の植物からのものである、請求項72に記載の方法。
【請求項８２】
状態についての少なくとも1つの新しいインジケータ種を同定するための方法であって、
a)前記状態を伴わない対照試料を、1つの実験においてアッセイすることによって、すべての既知の細菌、古細菌、または真菌の各操作的分類単位(OTU)の存在または非存在を判定するステップと、
b)前記状態を伴う試験試料を、1つの実験においてアッセイすることによって、すべての既知の細菌、古細菌、または真菌の各OTUの存在または非存在を判定するステップと、
c)(a)および(b)からの結果を比較することによって、存在量が所定の割合で変化する少なくとも1つの微生物を同定するステップであって、同定される微生物種は、前記状態についての前記新しいインジケータ種を表すステップと
を含む方法。
【請求項８３】
所定の割合が、存在量の少なくとも2倍の変化である、請求項82に記載の方法。
【請求項８４】
所定の割合が、存在量の統計的に有意な変化である、請求項82に記載の方法。
【請求項８５】
前記微生物が、前記状態の存在下で存在量が減少する、請求項82に記載の方法。
【請求項８６】
前記微生物が、前記状態の存在下で存在量が増加する、請求項82に記載の方法。
【請求項８７】
95%超の信頼度レベルを伴って、1つのアッセイで、ある環境からの少なくとも10,000のOTUを含むマイクロバイオームシグネチャーを生成することができるシステム。
【請求項８８】
微生物汚染源を検出するための方法であって、1つのアッセイで、前記試料中に天然に存在しない少なくとも100の微生物のOTUの存在および量を判定するステップと、前記操作的分類単位(OTU)の存在および量のパターンを使用して前記汚染源を特定するステップとを含む方法。
【請求項８９】
1つのアッセイで、少なくとも50の異なる糞便の分類群の存在および量を検出することができるシステム。
【請求項９０】
前記検出が、複数のプローブの、検出される各生物から単離された、高度に保存された核酸との選択的ハイブリダイゼーションに基づく、請求項89に記載のシステム。
【請求項９１】
前記検出が、表4に列挙された生物または分類群を同定する複数のプローブから選択される複数のプローブの選択的ハイブリダイゼーションに基づく、請求項89に記載のシステム。
【請求項９２】
検出が、清潔な水の分類群を示す核酸と選択的にハイブリダイズする1つまたは複数のプローブのハイブリダイゼーションを検出するステップをさらに含み、前記プローブは、表11に列挙された生物または分類群を同定する複数のプローブから選択される、請求項91に記載のシステム。
【請求項９３】
水試料を試験するための方法であって、前記水試料中の桿菌、バクテロイデス、およびクロストリジウム種と、α-プロテオバクテリア種との比を計算するステップであって、1.0を超える値は、糞便汚染を示すステップを含む方法。
【請求項９４】
比を計算するステップが、培養、直接計数、PCRクローニング、配列決定、または遺伝子発現アレイの使用を利用しない、請求項93に記載の方法。
【請求項９５】
桿菌種が、表4に列挙された種を含む、請求項93に記載の方法。
【請求項９６】
バクテロイデス種が、表4に列挙された種を含む、請求項93に記載の方法。
【請求項９７】
クロストリジウム種が、表4に列挙された種を含む、請求項93に記載の方法。
【請求項９８】
α-プロテオバクテリア種が、表4に列挙された種を含む、請求項93に記載の方法。
【請求項９９】
計算するステップが、水試料を複数のプローブと接触させるステップを含む、請求項93に記載の方法。
【請求項１００】
複数のプローブが、高度に保存された遺伝子と相補的である、請求項99に記載の方法。
【請求項１０１】
毒性藻類ブルームの尤度を予測するための方法であって、
a)水試料を、表6から選択されるラン藻類に由来する核酸に選択的に結合する複数のプローブと接触させるステップと、
b)ハイブリダイゼーションデータを使用することによって、水試料中のラン藻類の量および組成を求めるステップと、
c)環境条件を測定するステップと、
d)ラン藻類の量および組成物、ならびに環境条件に基づいて毒性藻類ブルームの尤度を予測するステップと
を含む方法。
【請求項１０２】
ラン藻類の核酸に対するプローブが、表6に列挙された属を検出するために選択される、請求項101に記載の方法。
【請求項１０３】
環境条件が、水温、濁り、窒素濃度、酸素濃度、炭素濃度、リン酸濃度、および/または太陽光レベルを含む、請求項101に記載の方法。
【請求項１０４】
水の管理の決定を、毒性藻類ブルームの尤度に基づいて行うステップをさらに含む、請求項101に記載の方法。
【請求項１０５】
対象の状態または対象のための療法を判定するための方法であって、前記対象に由来する試料に対して1つの核酸アッセイを実施することによって、少なくとも1000の操作的分類単位(OTU)の存在および/または量を判定するステップを含む方法。
【請求項１０６】
試料の状態を予測するための方法であって、
a)前記試料中の微生物の少なくとも1,000のOTUの存在または非存在の確率として、微生物個体数データを求めるステップと、
b)前記試料中の前記微生物の1つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現データを求めるステップと、
c)前記発現データおよび個体数データを使用することによって、前記試料について予測を行うステップと
を含む方法。
【請求項１０７】
前記試料が土壌または水試料である、請求項106に記載の方法。
【請求項１０８】
油流出によって引き起こされた被害を評価するための方法であって、
(a)前記油流出によって影響されていない1つまたは複数の位置からの1つまたは複数の試料中の少なくとも1,000の操作的分類単位(OTU)の存在、非存在、および/または存在量を判定し、それによって無影響のバイオシグネチャーを確立するステップと、
(b)前記油流出によって影響された位置からの1つまたは複数の試料中の少なくとも1,000のOTUの存在、非存在、および/または存在量を判定し、それによって油流出に影響されたバイオシグネチャーを確立するステップと、
(c)前記無影響のバイオシグネチャーを、前記油流出に影響されたバイオシグネチャーと比較するステップであって、前記バイオシグネチャーの差異は、前記油流出によって影響された前記位置のマイクロバイオームに対する影響を示すステップと
を含む方法。
【請求項１０９】
ステップ(b)が、第1の時間および第2の時間で実施される、請求項108に記載の方法。
【請求項１１０】
前記第1の時間と前記第2の時間の間の前記バイオシグネチャーの前記差異の変化を使用することによって、油流出被害のレメディエーションの進行を追跡する、請求項109に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
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【図１３】
【図１４】
【図１５】
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【図１７】
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【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【公表番号】特表２０１２−５３１２１１（Ｐ２０１２−５３１２１１Ａ）
【公表日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１７８０４（Ｐ２０１２−５１７８０４）
【出願日】平成２２年６月２５日（２０１０．６．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４０１０６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１５１８４２
【国際公開日】平成２２年１２月２９日（２０１０．１２．２９）
【出願人】（５０６１１５５１４）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (87)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２５日（２０１０．６．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４０１０６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１５１８４２
【国際公開日】平成２２年１２月２９日（２０１０．１２．２９）
【出願人】（５０６１１５５１４）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (87)
【Ｆターム（参考）】
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