納豆菌による高分子量ポリ−γ−グルタミン酸の生産方法
【課題】 γ−ＰＧＡの液体培地中への蓄積が、培地中のγ−ＰＧＡの蓄積量が一定しないことに起因して非常に不安定である納豆菌を用いて、遺伝子操作によらず、納豆菌が生産するγ−ＰＧＡ分解酵素群の生成を抑制することによって、高分子量のγ−ＰＧＡを安定して生産する方法を提案する。
【解決手段】 納豆の製造に供される納豆菌に、養分の枯渇と再投与、温度変動、酸素供給の有無、ｐＨ変動の何れかの外的ストレスを単独または組み合わせて与えることによって、ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素群の生成を抑制する高分子量（３００万以上）ポリ−γ−グルタミン酸の安定生産方法である。
【解決手段】 納豆の製造に供される納豆菌に、養分の枯渇と再投与、温度変動、酸素供給の有無、ｐＨ変動の何れかの外的ストレスを単独または組み合わせて与えることによって、ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素群の生成を抑制する高分子量（３００万以上）ポリ−γ−グルタミン酸の安定生産方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ポリ−γ−グルタミン酸（以下γ−ＰＧＡと称する）の生産方法、とくに、納豆菌による高分子量ポリ−γ−グルタミン酸の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バチルス属細菌がグルコースあるいはクエン酸などからγ−ＰＧＡを生産することは、非特許文献１にも記載されているようによく知られている。
【０００３】
しかし、長い食経験を有し、生体安全性の高い納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｎａｔｔｏ）によるγ−ＰＧＡの生産は、固体培養では安定するものの、大量生産に不可欠である液体培養では極めて不安定である。
【０００４】
これは、液体培養では培地中のγ−ＰＧＡの蓄積量が一定しないことに起因しており、同一の培養条件であってもγ−ＰＧＡをほとんど回収できない場合もある。
【０００５】
この不安定さは培養規模が拡大すると加速度的に増大し、５０リットル以上の培養規模では粘性がほとんど認められない割合が９割を越えることもあるなど、固体培養と同等の高分子量γ−ＰＧＡを安定して得ることは極めて困難である。このように、納豆菌において液体培養が不安定であることは、人体に対する安全性の面で不安のないγ−ＰＧＡを大量生産できないことを意味する。
【０００６】
納豆菌以外のバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）やバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）などのバチルス属細菌は比較的容易にγ−ＰＧＡを生産・蓄積できるため、これらの菌を用いて糖類を追加供給する方法が特許文献１に提案されている。
【０００７】
しかしながら、この方法は、不純物である多糖類の生成を防ぎつつ不足する養分を供給し、γ−ＰＧＡの収量を向上させることを目的としたものであり、糖類の濃度を２から３ｇ／ｌ以下に維持するように流加培養を行うものである。
【０００８】
ところが、糖類の濃度を望ましいレベルに維持することは、γ−ＰＧＡを蓄積する状態にあるバチルス属細菌には効果を示すが、培地中にγ−ＰＧＡを蓄積しない状態に陥った納豆菌には効果を示さない。
【０００９】
また、バチルス属細菌が生産するγ−ＰＧＡの平均分子量は、特許文献２〜５に記載のとおり、数千ないしは２００万のレベルであり、納豆菌が固体培養において生産するγ−ＰＧＡの平均分子量の３００万以上には及ばない。
【００１０】
加えて、これらのバチルス属細菌は生体安全性の検討が十分とは言えず、人体に与える影響の面で不安がある。
【００１１】
このγ−ＰＧＡの生産をコードする遺伝子はｐｇｓＢＣＡであり、その直下にＤ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸の結合を切断して分子量１０万から５０万に断片化するγ−ＰＧＡ分解酵素ＹｗｔＤをコードする遺伝子、ｙｗｔＤが存在することが非特許文献２と特許文献６に報告されている。
【００１２】
ＹｗｔＤ以外にも、特許文献７には、分子量１０万の断片に切断する酵素、ポリグルタミン酸ハイドラーゼ（以下ＰｇｈＡと表記する）が存在することが記載され、また、非特許文献３、４および特許文献８、９には、末端からグルタミン酸を順次切断する酵素、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（以下ＧＧＴと表記する）を有することも報告されている。
【００１３】
また、γ−ＰＧＡは将来の飢餓に備えた栄養源の蓄積と、アメーバなどの外敵から菌体自身を保護することを目的として生産されるものと考えられている。固体培養では菌体表面に存在する何らかの受容体が菌体が空気中に露出していることを認識し、上記のＹｗｔＤ、ＰｇｈＡやＧＧＴ等のγ−ＰＧＡ分解酵素群の生成が抑制されて、相当量のγ−ＰＧＡが蓄積される。
【００１４】
これに対して、液体培養では菌体表面が空気中に露出していないためγ−ＰＧＡ分解酵素群の生成が抑制されにくくなり、結果としてγ−ＰＧＡの蓄積が不安定になるものと考えられる。
【００１５】
これに対処することを目的として、下記特許文献１０と１１には、γ−ＰＧＡ分解酵素群に係わる遺伝子を欠損させることが提案されている。
【００１６】
しかし、遺伝子組み換え体を大量に培養することは、各省庁が定めるガイドラインの拘束を受けるため実施が困難であり、また、消費者に与えるイメージの点でも問題があった。
【特許文献１】大韓民国特許第３６３４３４号（ＰＣＴ／ＫＲ００／００７６１）
【特許文献２】特公昭４３−２４４７２号公報
【特許文献３】特開平１−１７４３９７号公報
【特許文献４】特開平３−４７０８７号公報
【特許文献５】特許第３０８１９０１号明細書
【特許文献６】特開２００３−２３５５６６号公報
【特許文献７】特開２００３−２３０３８４号公報
【特許文献８】特開２００３−２３０３８４号公報
【特許文献９】特開２００３−２３５５６６号公報
【特許文献１０】特開２００３−２３０３８４号公報
【特許文献１１】特開２００３−２３５５６６号公報
【非特許文献１】Ｆ．Ｂ．Ｏｐｐｅｒｍａｎｎ−Ｓａｎｉｏ ａｎｄ Ａ．Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ， Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ， Ｖｏｌ．８９， ｐｐ．１１−２２ （２００２）
【非特許文献２】Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ ａｎｄ Ｙ．Ｔａｈａｒａ， Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， Ｖｏｌ．１８５， Ｎｏ．７， ｐｐ．２３７９−２３８２ （２００３）
【非特許文献３】Ｙ．Ｏｇａｗａ， Ｈ．Ｈｏｓｏｙａｍａ， Ｍ．Ｈａｍａｎｏ ａｎｄ Ｈ．Ｍｏｔａｉ， Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ５５， ｐｐ．２９７１−２９７７ （１９９１）
【非特許文献４】Ｋ．Ｘｕ ａｎｄ Ｍ．Ａ．Ｓｔｒａｕｃｈ， Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７８， ｐｐ．４３１９−４３２２ （１９９６）
【非特許文献５】Ｔ．Ｎａｇａｉ， Ｌ．Ｓ．Ｐｈａｎ Ｔｒａｎ， Ｙ．Ｉｎａｔｓｕ ａｎｄ Ｙ．Ｉｔｏｈ， Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １８２， ｐｐ．２３８７−２３９２ （２０００）
【非特許文献６】Ｔ．Ｎａｇａｉ， Ｌ．−Ｓ． Ｐｈａｎ Ｔｒａｎ， Ｙ．Ｉｎａｔｓｕ， ａｎｄ Ｙ．Ｉｔｏｈ， Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １８２， ｐｐ．２３８７−２３９２ （２０００）
【非特許文献７】納豆試験法研究会， 納豆試験法， ｐｐ．６５−７３， 光琳 （１９９０）
【非特許文献８】Ａ．Ｇｏｔｏ ａｎｄ Ｍ．Ｋｕｎｉｏｋａ， Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５６， ｐｐ．１０３１−１０３５ （１９９２）
【非特許文献９】Ｍ．Ｋａｍｂｏｕｒｏｖａ， Ｍ．Ｔａｎｇｎｅｙ ａｎｄ Ｆ．Ｇ．Ｐｒｉｅｓｔ， Ａｐｐｌ．ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ．６７， Ｎｏ．２， ｐｐ．１００４−１００７ （２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
この発明が解決しようとする課題は、γ−ＰＧＡの液体培地中への蓄積が、培地中のγ−ＰＧＡの蓄積量が一定しないことに起因して非常に不安定である納豆菌を用いて、高分子量のγ−ＰＧＡを安定して生産する方法を提案するものである。
【００１８】
さらに詳しくは、液体培地を用いた納豆菌によるγ−ＰＧＡの生産が困難である要因はＹｗｔＤ、ＰｇｈＡやＧＧＴなどのγ−ＰＧＡ分解酵素群にある。分解酵素群が生成すると、納豆菌が生成したγ−ＰＧＡは即座に分解されて、培地中に蓄積されない。この発明は、遺伝子操作によらず、納豆菌が生産するγ−ＰＧＡ分解酵素群の生成を抑制する手法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
この発明は、γ−ＰＧＡの生産安定性はγ−ＰＧＡ分解酵素群の生成によって損なわれており、γ−ＰＧＡ分解酵素群の生成を抑制できれば安定生産が可能であることに着目し、菌体に外的ストレスを与えることによってγ−ＰＧＡ分解酵素群の生成を効果的に抑制できることを見出し、この知見に基づいて完成したものである。
【００２０】
この発明が対象とする納豆菌は市販の納豆の生産に供されるものを指す。市販の納豆製造には、γ−ＰＧＡの生産にビオチンを要求し、バチルス・ズブチリスに分類される菌株が用いられる。納豆の製造に用いられる代表的な納豆菌は、宮城野菌、高橋菌、成瀬菌であるが、これらは共通の菌株に由来することが分子遺伝学的手法によって確認されている（非特許文献５）。
【００２１】
γ−ＰＧＡの生産に供する菌株はこれらのいずれでも良く、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｎａｔｔｏとして登録されている、例えばＩＦＯ３００９、ＩＦＯ３０１３、ＩＦＯ３３３５、ＩＦＯ３３３６、ＩＦＯ３９３６、ＩＦＯ１３１６９、ＡＴＣＣ７０５８、ＡＴＣＣ７０５９、ＡＴＣＣ１５２４５のような任意の分譲菌株を用いることもできる。
【００２２】
ただし、非特許文献６にも記載のとおり、納豆菌は遺伝的に不安定であり、生産を安定させるためには、好ましくは市販納豆から高粘性発現株を選択したものを拡大培養して用いることが望ましい。この高粘性発現株は、非特許文献７にも記載の公知の手法によって取得できる。
【００２３】
この発明にいう外的ストレスとは、培地中の養分の枯渇、温度の変動、酸素供給の有無、ｐＨの変動など、γ−ＰＧＡ分解酵素群の生成に影響を与える種々の外的因子を指し、列挙した項目に限定されるものではない。これらの外的ストレスは単独で与えても組み合わせて与えてもよい。
【００２４】
外的ストレスによるγ−ＰＧＡ分解酵素群の生成抑制の機構は、外的ストレスの種類に関係なく類似している。
【００２５】
例えば、外的ストレスの一つとして、培地中の養分の枯渇についてのγ−ＰＧＡ分解酵素群の生成抑制の機構は以下のように考えられる。
【００２６】
すなわち、納豆菌が生産するγ−ＰＧＡは、非特許文献８に記載のとおり、培地中に存在するグルタミン酸からではなく、グルコースなどの糖分やクエン酸などの有機酸を炭素源として、ＴＣＡ回路を経て合成される。納豆菌においてグルタミン酸はγ−ＰＧＡ合成経路の効率的な発現に必要であることが知られているが、非特許文献９に記載のとおり、グルコースの存在下では培養期間を通じてほとんど消費されない。培地中の炭素源が枯渇すると、グルタミン酸が栄養源としてＴＣＡ回路に取り込まれ、併せて菌体外に貯蔵したγ−ＰＧＡを利用するためにγ−ＰＧＡ分解酵素群が盛んに生産される。この時、炭素源としてグルコースなどの糖を使用していた場合には、グルタミン酸の消費が開始されると培地中の有機酸の消費と合わせてアンモニアの蓄積が始まるため、ｐＨが急激に上昇する。このｐＨの急激な上昇を指標とすることで、容易に炭素源の枯渇を検知し、自動的に炭素源を流加することが可能となる。
【００２７】
培地中の炭素源が枯渇した状態で炭素源を再度流加すると、ＴＣＡ回路へのグルタミン酸の取り込みは速やかに停止する。生成していたγ−ＰＧＡ分解酵素群はグルタミン酸の取り込みの停止と同時に生成が抑制され、γ−ＰＧＡが効率的に蓄積されることになる。
【００２８】
同様に、他の外的ストレスとして温度については４０℃から５０℃の範囲に置いたとき、また、酸素供給については供給を停止したとき、さらには、ｐＨについては５以上かつ６未満の範囲にしたとき、γ−ＰＧＡ分解酵素群の生成が促進される。なお、γ−ＰＧＡ分解酵素群の生成が抑制される条件は、温度については４０℃未満、酸素供給については酸素が供給されているとき、ｐＨについては６以上かつ８までの範囲である。
【００２９】
このように、いずれの外的ストレスの因子についても、酵素群の生成が促進される環境から抑制される環境に外的条件を切り替えることによって納豆菌に外的ストレスを与え、γ−ＰＧＡ分解酵素群の生成を抑制してγ−ＰＧＡの蓄積を促進する。
【００３０】
また、純粋なγ−ＰＧＡを得るためには、生産に用いる培地はグルタミン酸ナトリウム１水和物が１．０〜５．０（質量／容量）％（以下％は（質量／容量）％である）、グルコースが１．０〜５．０％、リン酸２水素カリウムが０．２５％、リン酸水素２ナトリウム１２水和物が０．１７％、塩化ナトリウムが０．０５％、硫酸マグネシウム７水和物が０．０５％、それに、ビオチンが０．１ｐｐｍから構成されるものが望ましい。
【００３１】
不純物であるフラクタンなどの多糖類が混入しても良い場合もあるが、この場合には、グルコースの替わりにサッカロースなどを用いても良い。同様の理由で、不純物が混入しても差し支えない場合には、上記組成の追加養分として、ポリペプトンＳやフィトンなどの大豆蛋白分解物を１．０％〜２．０％追加しても良い。
【００３２】
また、炭素源が存在する間は菌体外に排出される各種有機酸の影響でｐＨが低下する。このとき、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムやアンモニアなどのアルカリ溶液を添加することでｐＨを６．４〜７の間に保つと、納豆菌の活動を高いレベルに維持することが可能である。
【００３３】
なお、以上の説明においては、対象を納豆菌と特定して説明しているが、γ−ＰＧＡ分解酵素群によってγ−ＰＧＡを蓄積しない状態にある納豆菌以外のバチルス属細菌にも効果を発揮するもので、これらのバチルス属細菌も、この発明においては納豆菌に含まれる。
【００３４】
また、この発明においては、生産対象をγ−ＰＧＡと特定しているが、γ−ＰＧＡ以外の生体高分子の生産が、当該生体高分子分解酵素の生成によって阻害されている状態にある細菌においても効果を発揮する。この発明においては、このような細菌が生産する任意の生体高分子もγ−ＰＧＡに含まれるものとする。
【発明の効果】
【００３５】
この発明によって、生体安全性が食経験によって確認されている納豆菌によって、平均分子量３００万以上の高分子量γ−ＰＧＡを安定生産することができる。
【００３６】
また、この発明によって得られるγ−ＰＧＡは、従来提供されているものに比べて分子量が高く、生体安全性の面でも不安がないため、特に化粧品、医薬品や食品に関連する用途に適用できる。
【００３７】
これらの用途に積極的に利用できるγ−ＰＧＡを安定供給できる点で、産業上極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
γ−ＰＧＡ分解酵素群の生成の抑制効果は、培養液中のγ−ＰＧＡの蓄積量によって知ることができる。そして、培養液中のγ−ＰＧＡの蓄積量は、培養液の見掛け粘度と一義的な比例関係にある。
【００３９】
図１は、培養液の見掛け粘度とγ−ＰＧＡの蓄積量との関係を示す。この図から、培養液の見掛け粘度とγ−ＰＧＡの蓄積量は比例関係にあることが分かる。
【００４０】
以下に、この発明の実施の形態を実施例に示し、それぞれの培養液の見掛け粘度ｍＰａ・ｓとγ−ＰＧＡ濃度ｇ／ｌによって、γ−ＰＧＡ分解酵素群の生成の抑制効果を調べた。
【比較例】
【００４１】
γ−ＰＧＡ分解酵素群の生成の抑制効果の確認の基準として、ストレスを与えない従来法によってγ−ＰＧＡを培養した例を示す。
【００４２】
市販納豆表面の粘質物を白金耳でかき取ったものを滅菌水１０ｍｌに懸濁し、粘質物生産寒天培地に懸濁液１白金耳を連続して画線して、３７℃で２４時間培養した。
【００４３】
粘質物生産寒天培地としては、グルタミン酸ナトリウム１水和物２．０％、サッカロース３％、リン酸２水素カリウム０．２５％、リン酸水素２ナトリウム１２水和物０．１７％、塩化ナトリウム０．０５％、硫酸マグネシウム７水和物０．０５％、ビオチン０．１ｐｐｍ、寒天２％を含む培地をｐＨ６．８に調整したものを使用した。
【００４４】
培養後のコロニーに白金耳の先端を当て、もっとも強く糸を引くコロニーを単離した。単離した納豆菌は標準寒天培地で３７℃、３日間の培養を行い、胞子化した菌叢を得た。 この胞子化した菌叢を滅菌水１ｍｌあたり１白金耳となるように懸濁して、γ−ＰＧＡの生産に供するまで２０℃以下の環境に保存した。得られた胞子懸濁液は、１０８〜１０９ｃｆｕ／ｍｌの納豆菌胞子を含有するものであった。
【００４５】
この納豆菌胞子懸濁液をγ−ＰＧＡ生産培地３０リットルに１０４ｃｆｕ／ｍｌとなるように接種した。培養には丸菱バイオエンジ社ＭＳＪ−Ｕ２ ５０Ｌ型ファーメンターを使用した。
【００４６】
γ−ＰＧＡ生産培地は、グルタミン酸ナトリウム１水和物２．０％、グルコース２％、リン酸２水素カリウム０．２５％、リン酸水素２ナトリウム１２水和物０．１７％、塩化ナトリウム０．０５％、硫酸マグネシウム７水和物０．０５％、ビオチン０．１ｐｐｍからなり、接種前にｐＨ６．８に調整した。通気量１ＶＶＭ、撹拌速度１２０ｒｐｍに設定し、３７℃で培養を行ったところ、培養開始から３２時間経過後に炭素源であるグルコースの枯渇に伴うｐＨの上昇が観察された。このとき、培養液の見掛け粘度は１００ｍＰａ・ｓであり、そのγ−ＰＧＡ濃度は、６．１ｇ／ｌであった。見掛け粘度はＢ型粘度計によって計測し、測定回転数３０ｒｐｍ、使用ローターＮｏ．２の条件で見掛け粘度を得た。
【００４７】
γ−ＰＧＡは、γ−ＰＧＡ含有培養液に公知の分離方法であるアルコール沈殿法を施すことによって粗精製した。
【００４８】
この粗精製物を水に再溶解して透析を一夜行ったうえで凍結乾燥を行い、精製γ−ＰＧＡを得た。上記のγ−ＰＧＡ濃度は、このようにして得られた精製γ−ＰＧＡの濃度である。精製γ−ＰＧＡは白色の固体であり、９０％以上がグルタミン酸から構成され、多糖類は含まなかった。各γ−ＰＧＡ粉末粉末の分子量を検討したところ、平均分子量は３００万以上であった。
【００４９】
なお、平均分子量はゲルろ過カラムを用いた高速液体クロマトグラフによるもので、図２（ａ）に示すように保持時間約１０分でピークが見られ、図２（ｂ）に示す図から平均分子量が３００万以上であることが確認された。測定は、カラムにＴＳＫ−ＧＥＬ ＧＭＰＷＸＬ（内径７．８ｍｍ、長さ３００ｍｍ）、移動相に５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を使用し、カラム温度４０℃、流量０．５ｍｌ／ｍｉｎの条件で行った。ピークの検出にはＵＶ検出器を使用し、２１４ｎｍの吸収でγ−ＰＧＡに由来するピークを検出した。以下の実施例１〜３についても同様である。
【実施例１】
【００５０】
この実施例は、付与ストレスとして養分を枯渇させたのち、再投与する例を示す。
【００５１】
培養の条件は、上記比較例と同様とし、３２時間が経過したのち、ｐＨの上昇によってグルコースの枯渇が観察された時点でグルコース２％を流加した。流加直前の培養液粘度は、比較例と同様、１００ｍＰａ・ｓであった（Ｎｏ．２ローター、３０ｒｐｍ）。その後、４８時間が経過するまで培養を行ったところ、培養液の見掛け粘度は２，０００ｍＰａ・ｓ、そのγ−ＰＧＡ濃度は１５．４ｇ／ｌに達した（Ｎｏ．３ローター、３０ｒｐｍ）。そして、平均分子量は３００万以上であった。このように、この実施例の場合、ストレスを与えない比較例と対比して、その抑制効果は、ほぼ、２．５倍に達している。
【実施例２】
【００５２】
この実施例は、付与ストレスとして温度変化を与えた例を示す。
【００５３】
培養温度を４５℃に設定した以外は、上記比較例と同様の条件で培養を行った。７．５時間が経過して対数増殖期の中期から後期に差し掛かり、溶存酸素濃度が急減し始めた時点で、培養液温度を３７℃に変更した。培養開始から３０時間が経過すると、グルコースの枯渇に伴うｐＨの上昇が観察された。この時、培養液粘度は１，６００ｍＰａ・ｓに達し、そのγ−ＰＧＡ濃度は１２．２ｇ／ｌであった（Ｎｏ．３ローター、３０ｒｐｍ）。平均分子量は３００万以上であった。このように、この実施例の場合、ストレスを与えない比較例と対比して、その抑制効果は、ほぼ、２倍に達している。
【実施例３】
【００５４】
この実施例は、付与ストレスとして、養分の枯渇と再投与、それに温度変化を組み合わせた例を示す。
【００５５】
実施例２と同様の条件で培養を行い、３０時間が経過してグルコースの枯渇に伴うｐＨの上昇が観察された時点でグルコース２％を流加した。流加直前の培養液粘度は、実施例２と同様１，６００ｍＰａ・ｓであった。その後、４８時間が経過するまで培養を行ったところ、培養液粘度は３，５００ｍＰａ・ｓ、γ−ＰＧＡ濃度は２２．８ｇ／ｌに達した（Ｎｏ．３ローター、３０ｒｐｍ）。平均分子量は３００万以上であった。このように、この実施例の場合、ストレスを与えない比較例と対比して、その抑制効果は、ほぼ、３．７倍に達した。
【００５６】
表１は、上記各実施例及び比較例におけるγ−ＰＧＡ分解酵素群の生成の抑制効果を、まとめて比較したものである。
【表１】
【００５７】
同表から明かなとおり、この発明に基づいて培養中にストレスを付加した場合には、γ−ＰＧＡの蓄積量は、ストレスを付加しない場合と比較して著しく増大しており、また異なるストレスを複合して付加した場合、その効果は更に著しくなることが分かる。
【００５８】
また、実施例１から４の各培養液の粘度とγ−ＰＧＡの培地中への蓄積量の間には、図２に示すように良好な相関が認められ、γ−ＰＧＡ分解経路が抑制されたことによりγ−ＰＧＡが効果的に蓄積されたことと、異なるストレスを組み合わせて与えることで分解経路の抑制効果を増強できることを確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
この発明によって得られるγ−ＰＧＡは、化粧品、医薬品、食品の他に、水質浄化剤、コンクリートのひび割れ防止剤、砂漠緑化用保水材料、結露防止剤など幅広い用途に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】γ−ＰＧＡ蓄積量と培養液見掛け粘度の関係を示すグラフである。
【図２】（ａ）は高速液体クロマトグラフによる分子量分布測定結果を示すチャート、（ｂ）は保持時間と分子量の関係を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ポリ−γ−グルタミン酸（以下γ−ＰＧＡと称する）の生産方法、とくに、納豆菌による高分子量ポリ−γ−グルタミン酸の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バチルス属細菌がグルコースあるいはクエン酸などからγ−ＰＧＡを生産することは、非特許文献１にも記載されているようによく知られている。
【０００３】
しかし、長い食経験を有し、生体安全性の高い納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｎａｔｔｏ）によるγ−ＰＧＡの生産は、固体培養では安定するものの、大量生産に不可欠である液体培養では極めて不安定である。
【０００４】
これは、液体培養では培地中のγ−ＰＧＡの蓄積量が一定しないことに起因しており、同一の培養条件であってもγ−ＰＧＡをほとんど回収できない場合もある。
【０００５】
この不安定さは培養規模が拡大すると加速度的に増大し、５０リットル以上の培養規模では粘性がほとんど認められない割合が９割を越えることもあるなど、固体培養と同等の高分子量γ−ＰＧＡを安定して得ることは極めて困難である。このように、納豆菌において液体培養が不安定であることは、人体に対する安全性の面で不安のないγ−ＰＧＡを大量生産できないことを意味する。
【０００６】
納豆菌以外のバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）やバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）などのバチルス属細菌は比較的容易にγ−ＰＧＡを生産・蓄積できるため、これらの菌を用いて糖類を追加供給する方法が特許文献１に提案されている。
【０００７】
しかしながら、この方法は、不純物である多糖類の生成を防ぎつつ不足する養分を供給し、γ−ＰＧＡの収量を向上させることを目的としたものであり、糖類の濃度を２から３ｇ／ｌ以下に維持するように流加培養を行うものである。
【０００８】
ところが、糖類の濃度を望ましいレベルに維持することは、γ−ＰＧＡを蓄積する状態にあるバチルス属細菌には効果を示すが、培地中にγ−ＰＧＡを蓄積しない状態に陥った納豆菌には効果を示さない。
【０００９】
また、バチルス属細菌が生産するγ−ＰＧＡの平均分子量は、特許文献２〜５に記載のとおり、数千ないしは２００万のレベルであり、納豆菌が固体培養において生産するγ−ＰＧＡの平均分子量の３００万以上には及ばない。
【００１０】
加えて、これらのバチルス属細菌は生体安全性の検討が十分とは言えず、人体に与える影響の面で不安がある。
【００１１】
このγ−ＰＧＡの生産をコードする遺伝子はｐｇｓＢＣＡであり、その直下にＤ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸の結合を切断して分子量１０万から５０万に断片化するγ−ＰＧＡ分解酵素ＹｗｔＤをコードする遺伝子、ｙｗｔＤが存在することが非特許文献２と特許文献６に報告されている。
【００１２】
ＹｗｔＤ以外にも、特許文献７には、分子量１０万の断片に切断する酵素、ポリグルタミン酸ハイドラーゼ（以下ＰｇｈＡと表記する）が存在することが記載され、また、非特許文献３、４および特許文献８、９には、末端からグルタミン酸を順次切断する酵素、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（以下ＧＧＴと表記する）を有することも報告されている。
【００１３】
また、γ−ＰＧＡは将来の飢餓に備えた栄養源の蓄積と、アメーバなどの外敵から菌体自身を保護することを目的として生産されるものと考えられている。固体培養では菌体表面に存在する何らかの受容体が菌体が空気中に露出していることを認識し、上記のＹｗｔＤ、ＰｇｈＡやＧＧＴ等のγ−ＰＧＡ分解酵素群の生成が抑制されて、相当量のγ−ＰＧＡが蓄積される。
【００１４】
これに対して、液体培養では菌体表面が空気中に露出していないためγ−ＰＧＡ分解酵素群の生成が抑制されにくくなり、結果としてγ−ＰＧＡの蓄積が不安定になるものと考えられる。
【００１５】
これに対処することを目的として、下記特許文献１０と１１には、γ−ＰＧＡ分解酵素群に係わる遺伝子を欠損させることが提案されている。
【００１６】
しかし、遺伝子組み換え体を大量に培養することは、各省庁が定めるガイドラインの拘束を受けるため実施が困難であり、また、消費者に与えるイメージの点でも問題があった。
【特許文献１】大韓民国特許第３６３４３４号（ＰＣＴ／ＫＲ００／００７６１）
【特許文献２】特公昭４３−２４４７２号公報
【特許文献３】特開平１−１７４３９７号公報
【特許文献４】特開平３−４７０８７号公報
【特許文献５】特許第３０８１９０１号明細書
【特許文献６】特開２００３−２３５５６６号公報
【特許文献７】特開２００３−２３０３８４号公報
【特許文献８】特開２００３−２３０３８４号公報
【特許文献９】特開２００３−２３５５６６号公報
【特許文献１０】特開２００３−２３０３８４号公報
【特許文献１１】特開２００３−２３５５６６号公報
【非特許文献１】Ｆ．Ｂ．Ｏｐｐｅｒｍａｎｎ−Ｓａｎｉｏ ａｎｄ Ａ．Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ， Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ， Ｖｏｌ．８９， ｐｐ．１１−２２ （２００２）
【非特許文献２】Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ ａｎｄ Ｙ．Ｔａｈａｒａ， Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， Ｖｏｌ．１８５， Ｎｏ．７， ｐｐ．２３７９−２３８２ （２００３）
【非特許文献３】Ｙ．Ｏｇａｗａ， Ｈ．Ｈｏｓｏｙａｍａ， Ｍ．Ｈａｍａｎｏ ａｎｄ Ｈ．Ｍｏｔａｉ， Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ５５， ｐｐ．２９７１−２９７７ （１９９１）
【非特許文献４】Ｋ．Ｘｕ ａｎｄ Ｍ．Ａ．Ｓｔｒａｕｃｈ， Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７８， ｐｐ．４３１９−４３２２ （１９９６）
【非特許文献５】Ｔ．Ｎａｇａｉ， Ｌ．Ｓ．Ｐｈａｎ Ｔｒａｎ， Ｙ．Ｉｎａｔｓｕ ａｎｄ Ｙ．Ｉｔｏｈ， Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １８２， ｐｐ．２３８７−２３９２ （２０００）
【非特許文献６】Ｔ．Ｎａｇａｉ， Ｌ．−Ｓ． Ｐｈａｎ Ｔｒａｎ， Ｙ．Ｉｎａｔｓｕ， ａｎｄ Ｙ．Ｉｔｏｈ， Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １８２， ｐｐ．２３８７−２３９２ （２０００）
【非特許文献７】納豆試験法研究会， 納豆試験法， ｐｐ．６５−７３， 光琳 （１９９０）
【非特許文献８】Ａ．Ｇｏｔｏ ａｎｄ Ｍ．Ｋｕｎｉｏｋａ， Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５６， ｐｐ．１０３１−１０３５ （１９９２）
【非特許文献９】Ｍ．Ｋａｍｂｏｕｒｏｖａ， Ｍ．Ｔａｎｇｎｅｙ ａｎｄ Ｆ．Ｇ．Ｐｒｉｅｓｔ， Ａｐｐｌ．ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ．６７， Ｎｏ．２， ｐｐ．１００４−１００７ （２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
この発明が解決しようとする課題は、γ−ＰＧＡの液体培地中への蓄積が、培地中のγ−ＰＧＡの蓄積量が一定しないことに起因して非常に不安定である納豆菌を用いて、高分子量のγ−ＰＧＡを安定して生産する方法を提案するものである。
【００１８】
さらに詳しくは、液体培地を用いた納豆菌によるγ−ＰＧＡの生産が困難である要因はＹｗｔＤ、ＰｇｈＡやＧＧＴなどのγ−ＰＧＡ分解酵素群にある。分解酵素群が生成すると、納豆菌が生成したγ−ＰＧＡは即座に分解されて、培地中に蓄積されない。この発明は、遺伝子操作によらず、納豆菌が生産するγ−ＰＧＡ分解酵素群の生成を抑制する手法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
この発明は、γ−ＰＧＡの生産安定性はγ−ＰＧＡ分解酵素群の生成によって損なわれており、γ−ＰＧＡ分解酵素群の生成を抑制できれば安定生産が可能であることに着目し、菌体に外的ストレスを与えることによってγ−ＰＧＡ分解酵素群の生成を効果的に抑制できることを見出し、この知見に基づいて完成したものである。
【００２０】
この発明が対象とする納豆菌は市販の納豆の生産に供されるものを指す。市販の納豆製造には、γ−ＰＧＡの生産にビオチンを要求し、バチルス・ズブチリスに分類される菌株が用いられる。納豆の製造に用いられる代表的な納豆菌は、宮城野菌、高橋菌、成瀬菌であるが、これらは共通の菌株に由来することが分子遺伝学的手法によって確認されている（非特許文献５）。
【００２１】
γ−ＰＧＡの生産に供する菌株はこれらのいずれでも良く、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｎａｔｔｏとして登録されている、例えばＩＦＯ３００９、ＩＦＯ３０１３、ＩＦＯ３３３５、ＩＦＯ３３３６、ＩＦＯ３９３６、ＩＦＯ１３１６９、ＡＴＣＣ７０５８、ＡＴＣＣ７０５９、ＡＴＣＣ１５２４５のような任意の分譲菌株を用いることもできる。
【００２２】
ただし、非特許文献６にも記載のとおり、納豆菌は遺伝的に不安定であり、生産を安定させるためには、好ましくは市販納豆から高粘性発現株を選択したものを拡大培養して用いることが望ましい。この高粘性発現株は、非特許文献７にも記載の公知の手法によって取得できる。
【００２３】
この発明にいう外的ストレスとは、培地中の養分の枯渇、温度の変動、酸素供給の有無、ｐＨの変動など、γ−ＰＧＡ分解酵素群の生成に影響を与える種々の外的因子を指し、列挙した項目に限定されるものではない。これらの外的ストレスは単独で与えても組み合わせて与えてもよい。
【００２４】
外的ストレスによるγ−ＰＧＡ分解酵素群の生成抑制の機構は、外的ストレスの種類に関係なく類似している。
【００２５】
例えば、外的ストレスの一つとして、培地中の養分の枯渇についてのγ−ＰＧＡ分解酵素群の生成抑制の機構は以下のように考えられる。
【００２６】
すなわち、納豆菌が生産するγ−ＰＧＡは、非特許文献８に記載のとおり、培地中に存在するグルタミン酸からではなく、グルコースなどの糖分やクエン酸などの有機酸を炭素源として、ＴＣＡ回路を経て合成される。納豆菌においてグルタミン酸はγ−ＰＧＡ合成経路の効率的な発現に必要であることが知られているが、非特許文献９に記載のとおり、グルコースの存在下では培養期間を通じてほとんど消費されない。培地中の炭素源が枯渇すると、グルタミン酸が栄養源としてＴＣＡ回路に取り込まれ、併せて菌体外に貯蔵したγ−ＰＧＡを利用するためにγ−ＰＧＡ分解酵素群が盛んに生産される。この時、炭素源としてグルコースなどの糖を使用していた場合には、グルタミン酸の消費が開始されると培地中の有機酸の消費と合わせてアンモニアの蓄積が始まるため、ｐＨが急激に上昇する。このｐＨの急激な上昇を指標とすることで、容易に炭素源の枯渇を検知し、自動的に炭素源を流加することが可能となる。
【００２７】
培地中の炭素源が枯渇した状態で炭素源を再度流加すると、ＴＣＡ回路へのグルタミン酸の取り込みは速やかに停止する。生成していたγ−ＰＧＡ分解酵素群はグルタミン酸の取り込みの停止と同時に生成が抑制され、γ−ＰＧＡが効率的に蓄積されることになる。
【００２８】
同様に、他の外的ストレスとして温度については４０℃から５０℃の範囲に置いたとき、また、酸素供給については供給を停止したとき、さらには、ｐＨについては５以上かつ６未満の範囲にしたとき、γ−ＰＧＡ分解酵素群の生成が促進される。なお、γ−ＰＧＡ分解酵素群の生成が抑制される条件は、温度については４０℃未満、酸素供給については酸素が供給されているとき、ｐＨについては６以上かつ８までの範囲である。
【００２９】
このように、いずれの外的ストレスの因子についても、酵素群の生成が促進される環境から抑制される環境に外的条件を切り替えることによって納豆菌に外的ストレスを与え、γ−ＰＧＡ分解酵素群の生成を抑制してγ−ＰＧＡの蓄積を促進する。
【００３０】
また、純粋なγ−ＰＧＡを得るためには、生産に用いる培地はグルタミン酸ナトリウム１水和物が１．０〜５．０（質量／容量）％（以下％は（質量／容量）％である）、グルコースが１．０〜５．０％、リン酸２水素カリウムが０．２５％、リン酸水素２ナトリウム１２水和物が０．１７％、塩化ナトリウムが０．０５％、硫酸マグネシウム７水和物が０．０５％、それに、ビオチンが０．１ｐｐｍから構成されるものが望ましい。
【００３１】
不純物であるフラクタンなどの多糖類が混入しても良い場合もあるが、この場合には、グルコースの替わりにサッカロースなどを用いても良い。同様の理由で、不純物が混入しても差し支えない場合には、上記組成の追加養分として、ポリペプトンＳやフィトンなどの大豆蛋白分解物を１．０％〜２．０％追加しても良い。
【００３２】
また、炭素源が存在する間は菌体外に排出される各種有機酸の影響でｐＨが低下する。このとき、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムやアンモニアなどのアルカリ溶液を添加することでｐＨを６．４〜７の間に保つと、納豆菌の活動を高いレベルに維持することが可能である。
【００３３】
なお、以上の説明においては、対象を納豆菌と特定して説明しているが、γ−ＰＧＡ分解酵素群によってγ−ＰＧＡを蓄積しない状態にある納豆菌以外のバチルス属細菌にも効果を発揮するもので、これらのバチルス属細菌も、この発明においては納豆菌に含まれる。
【００３４】
また、この発明においては、生産対象をγ−ＰＧＡと特定しているが、γ−ＰＧＡ以外の生体高分子の生産が、当該生体高分子分解酵素の生成によって阻害されている状態にある細菌においても効果を発揮する。この発明においては、このような細菌が生産する任意の生体高分子もγ−ＰＧＡに含まれるものとする。
【発明の効果】
【００３５】
この発明によって、生体安全性が食経験によって確認されている納豆菌によって、平均分子量３００万以上の高分子量γ−ＰＧＡを安定生産することができる。
【００３６】
また、この発明によって得られるγ−ＰＧＡは、従来提供されているものに比べて分子量が高く、生体安全性の面でも不安がないため、特に化粧品、医薬品や食品に関連する用途に適用できる。
【００３７】
これらの用途に積極的に利用できるγ−ＰＧＡを安定供給できる点で、産業上極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
γ−ＰＧＡ分解酵素群の生成の抑制効果は、培養液中のγ−ＰＧＡの蓄積量によって知ることができる。そして、培養液中のγ−ＰＧＡの蓄積量は、培養液の見掛け粘度と一義的な比例関係にある。
【００３９】
図１は、培養液の見掛け粘度とγ−ＰＧＡの蓄積量との関係を示す。この図から、培養液の見掛け粘度とγ−ＰＧＡの蓄積量は比例関係にあることが分かる。
【００４０】
以下に、この発明の実施の形態を実施例に示し、それぞれの培養液の見掛け粘度ｍＰａ・ｓとγ−ＰＧＡ濃度ｇ／ｌによって、γ−ＰＧＡ分解酵素群の生成の抑制効果を調べた。
【比較例】
【００４１】
γ−ＰＧＡ分解酵素群の生成の抑制効果の確認の基準として、ストレスを与えない従来法によってγ−ＰＧＡを培養した例を示す。
【００４２】
市販納豆表面の粘質物を白金耳でかき取ったものを滅菌水１０ｍｌに懸濁し、粘質物生産寒天培地に懸濁液１白金耳を連続して画線して、３７℃で２４時間培養した。
【００４３】
粘質物生産寒天培地としては、グルタミン酸ナトリウム１水和物２．０％、サッカロース３％、リン酸２水素カリウム０．２５％、リン酸水素２ナトリウム１２水和物０．１７％、塩化ナトリウム０．０５％、硫酸マグネシウム７水和物０．０５％、ビオチン０．１ｐｐｍ、寒天２％を含む培地をｐＨ６．８に調整したものを使用した。
【００４４】
培養後のコロニーに白金耳の先端を当て、もっとも強く糸を引くコロニーを単離した。単離した納豆菌は標準寒天培地で３７℃、３日間の培養を行い、胞子化した菌叢を得た。 この胞子化した菌叢を滅菌水１ｍｌあたり１白金耳となるように懸濁して、γ−ＰＧＡの生産に供するまで２０℃以下の環境に保存した。得られた胞子懸濁液は、１０８〜１０９ｃｆｕ／ｍｌの納豆菌胞子を含有するものであった。
【００４５】
この納豆菌胞子懸濁液をγ−ＰＧＡ生産培地３０リットルに１０４ｃｆｕ／ｍｌとなるように接種した。培養には丸菱バイオエンジ社ＭＳＪ−Ｕ２ ５０Ｌ型ファーメンターを使用した。
【００４６】
γ−ＰＧＡ生産培地は、グルタミン酸ナトリウム１水和物２．０％、グルコース２％、リン酸２水素カリウム０．２５％、リン酸水素２ナトリウム１２水和物０．１７％、塩化ナトリウム０．０５％、硫酸マグネシウム７水和物０．０５％、ビオチン０．１ｐｐｍからなり、接種前にｐＨ６．８に調整した。通気量１ＶＶＭ、撹拌速度１２０ｒｐｍに設定し、３７℃で培養を行ったところ、培養開始から３２時間経過後に炭素源であるグルコースの枯渇に伴うｐＨの上昇が観察された。このとき、培養液の見掛け粘度は１００ｍＰａ・ｓであり、そのγ−ＰＧＡ濃度は、６．１ｇ／ｌであった。見掛け粘度はＢ型粘度計によって計測し、測定回転数３０ｒｐｍ、使用ローターＮｏ．２の条件で見掛け粘度を得た。
【００４７】
γ−ＰＧＡは、γ−ＰＧＡ含有培養液に公知の分離方法であるアルコール沈殿法を施すことによって粗精製した。
【００４８】
この粗精製物を水に再溶解して透析を一夜行ったうえで凍結乾燥を行い、精製γ−ＰＧＡを得た。上記のγ−ＰＧＡ濃度は、このようにして得られた精製γ−ＰＧＡの濃度である。精製γ−ＰＧＡは白色の固体であり、９０％以上がグルタミン酸から構成され、多糖類は含まなかった。各γ−ＰＧＡ粉末粉末の分子量を検討したところ、平均分子量は３００万以上であった。
【００４９】
なお、平均分子量はゲルろ過カラムを用いた高速液体クロマトグラフによるもので、図２（ａ）に示すように保持時間約１０分でピークが見られ、図２（ｂ）に示す図から平均分子量が３００万以上であることが確認された。測定は、カラムにＴＳＫ−ＧＥＬ ＧＭＰＷＸＬ（内径７．８ｍｍ、長さ３００ｍｍ）、移動相に５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を使用し、カラム温度４０℃、流量０．５ｍｌ／ｍｉｎの条件で行った。ピークの検出にはＵＶ検出器を使用し、２１４ｎｍの吸収でγ−ＰＧＡに由来するピークを検出した。以下の実施例１〜３についても同様である。
【実施例１】
【００５０】
この実施例は、付与ストレスとして養分を枯渇させたのち、再投与する例を示す。
【００５１】
培養の条件は、上記比較例と同様とし、３２時間が経過したのち、ｐＨの上昇によってグルコースの枯渇が観察された時点でグルコース２％を流加した。流加直前の培養液粘度は、比較例と同様、１００ｍＰａ・ｓであった（Ｎｏ．２ローター、３０ｒｐｍ）。その後、４８時間が経過するまで培養を行ったところ、培養液の見掛け粘度は２，０００ｍＰａ・ｓ、そのγ−ＰＧＡ濃度は１５．４ｇ／ｌに達した（Ｎｏ．３ローター、３０ｒｐｍ）。そして、平均分子量は３００万以上であった。このように、この実施例の場合、ストレスを与えない比較例と対比して、その抑制効果は、ほぼ、２．５倍に達している。
【実施例２】
【００５２】
この実施例は、付与ストレスとして温度変化を与えた例を示す。
【００５３】
培養温度を４５℃に設定した以外は、上記比較例と同様の条件で培養を行った。７．５時間が経過して対数増殖期の中期から後期に差し掛かり、溶存酸素濃度が急減し始めた時点で、培養液温度を３７℃に変更した。培養開始から３０時間が経過すると、グルコースの枯渇に伴うｐＨの上昇が観察された。この時、培養液粘度は１，６００ｍＰａ・ｓに達し、そのγ−ＰＧＡ濃度は１２．２ｇ／ｌであった（Ｎｏ．３ローター、３０ｒｐｍ）。平均分子量は３００万以上であった。このように、この実施例の場合、ストレスを与えない比較例と対比して、その抑制効果は、ほぼ、２倍に達している。
【実施例３】
【００５４】
この実施例は、付与ストレスとして、養分の枯渇と再投与、それに温度変化を組み合わせた例を示す。
【００５５】
実施例２と同様の条件で培養を行い、３０時間が経過してグルコースの枯渇に伴うｐＨの上昇が観察された時点でグルコース２％を流加した。流加直前の培養液粘度は、実施例２と同様１，６００ｍＰａ・ｓであった。その後、４８時間が経過するまで培養を行ったところ、培養液粘度は３，５００ｍＰａ・ｓ、γ−ＰＧＡ濃度は２２．８ｇ／ｌに達した（Ｎｏ．３ローター、３０ｒｐｍ）。平均分子量は３００万以上であった。このように、この実施例の場合、ストレスを与えない比較例と対比して、その抑制効果は、ほぼ、３．７倍に達した。
【００５６】
表１は、上記各実施例及び比較例におけるγ−ＰＧＡ分解酵素群の生成の抑制効果を、まとめて比較したものである。
【表１】
【００５７】
同表から明かなとおり、この発明に基づいて培養中にストレスを付加した場合には、γ−ＰＧＡの蓄積量は、ストレスを付加しない場合と比較して著しく増大しており、また異なるストレスを複合して付加した場合、その効果は更に著しくなることが分かる。
【００５８】
また、実施例１から４の各培養液の粘度とγ−ＰＧＡの培地中への蓄積量の間には、図２に示すように良好な相関が認められ、γ−ＰＧＡ分解経路が抑制されたことによりγ−ＰＧＡが効果的に蓄積されたことと、異なるストレスを組み合わせて与えることで分解経路の抑制効果を増強できることを確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
この発明によって得られるγ−ＰＧＡは、化粧品、医薬品、食品の他に、水質浄化剤、コンクリートのひび割れ防止剤、砂漠緑化用保水材料、結露防止剤など幅広い用途に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】γ−ＰＧＡ蓄積量と培養液見掛け粘度の関係を示すグラフである。
【図２】（ａ）は高速液体クロマトグラフによる分子量分布測定結果を示すチャート、（ｂ）は保持時間と分子量の関係を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
納豆の製造に供される納豆菌に外的ストレスを与えることによってポリ−γ−グルタミン酸分解酵素群の生成を抑制する、高分子量ポリ−γ−グルタミン酸の安定生産方法。
【請求項２】
外的ストレスが、養分の枯渇と再投与、温度変動、酸素供給の有無、ｐＨ変動の何れかの単独または組み合わせである請求項１に記載の高分子量ポリ−γ−グルタミン酸の安定生産方法。
【請求項１】
納豆の製造に供される納豆菌に外的ストレスを与えることによってポリ−γ−グルタミン酸分解酵素群の生成を抑制する、高分子量ポリ−γ−グルタミン酸の安定生産方法。
【請求項２】
外的ストレスが、養分の枯渇と再投与、温度変動、酸素供給の有無、ｐＨ変動の何れかの単独または組み合わせである請求項１に記載の高分子量ポリ−γ−グルタミン酸の安定生産方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−４２６１７（Ｐ２００６−４２６１７Ａ）
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２２４４７２（Ｐ２００４−２２４４７２）
【出願日】平成１６年７月３０日（２００４．７．３０）
【出願人】（５９１０６５５４９）福岡県 (121)
【出願人】（５９１０２７９２７）福岡県醤油醸造協同組合 (11)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月３０日（２００４．７．３０）
【出願人】（５９１０６５５４９）福岡県 (121)
【出願人】（５９１０２７９２７）福岡県醤油醸造協同組合 (11)
【Ｆターム（参考）】
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