紫外線によるシワ防止効果評価方法とシワ防止効果表示皮膚外用剤
【課題】簡便で優れた紫外線によるシワ防止効果評価方法とシワ防止効果表示皮膚外用剤を提供する。
【解決手段】
コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際の硬度および／または弾力性を測定して、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果を評価する方法ならびにその結果に基づき、紫外線によるコラーゲンの弾力性低下すなわち紫外線によるシワに対する防止効果を表示することができることを特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤。また、簡便で優れたシワ防止効果評価方法に基づくシワ防止効果表示物である。
【解決手段】
コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際の硬度および／または弾力性を測定して、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果を評価する方法ならびにその結果に基づき、紫外線によるコラーゲンの弾力性低下すなわち紫外線によるシワに対する防止効果を表示することができることを特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤。また、簡便で優れたシワ防止効果評価方法に基づくシワ防止効果表示物である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、紫外線によるシワ防止効果評価方法とシワ防止効果表示皮膚外用剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は体のなかでは最も大きな器官である。そのなかで真皮は表皮の内側にある１．０〜３．０ｍｍの層で、コラーゲン線維とエラスチン線維、プロテオグリカン（ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸など）などの細胞外マトリックスでできており、皮膚に弾力性と強さを与えている。真皮の乾燥重量の約７０％のコラーゲン線維と１〜２％を占めるエラスチン線維による三次元ネットワーク構造により皮膚の弾力性が保たれている。
【０００３】
日光を長期間浴びると、長波長紫外線（ＵＶＡ；３２０ｎｍ〜４００ｎｍまたはＵＶＡ；３１５ｎｍ〜４００ｎｍまたはＵＶＡ；３１５ｎｍ〜３８０ｎｍ）の作用によって真皮のコラーゲン線維が変性し、皮膚の弾力性が低下し、しわが生じる原因になる。ＵＶＡの皮膚への影響についてヘアレスマウスを用いて研究した結果、日常的に浴びるＵＶＡ量を２か月間ヘアレスマウスに照射すると、皮膚の弾力性が半永久的に低下することを明らかにした（非特許文献１〜３参照）。
【０００４】
コラーゲンは代謝回転が遅いタンパク質であり、皮膚のコラーゲンのターンオーバーの半減期は１４．８年（９５％信頼区間；９．４−２２．３年）と算出されている（非特許文献４参照）。したがって、長期間のＵＶＡ曝露によってコラーゲンに障害が蓄積して、弾力性が低下するといえる。
【０００５】
このように、ＵＶＡによる皮膚の弾力性の低下には、長期間のＵＶＡ曝露が必要なため、皮膚外用剤のシワ防止効果のｉｎ ｖｉｖｏでの評価は困難である。そこで、コラーゲン線維モデルの弾力性と硬化因子を用いてシワ防止成分ならびにシワ防止皮膚外用剤を短期間で簡便に評価することを考えた。なお、シワは、しわ、皺、小ジワ、こじわ、小皺、リンクル、ｗｒｉｎｋｌｅと同義である。
【０００６】
現在、国内外のＵＶＡ防止効果の測定法としては、照射２時間後以降に皮膚の即時黒化を求める方法（ｉｎ ｖｉｖｏ法）、テープに塗布した試料の吸収曲線から求める方法（ｉｎ ｖｉｔｒｏ法）があるが、中波長紫外線（ＵＶＢ）とは異なり、真皮まで到達するＵＶＡによって引き起こされる主要な光老化（紫外線による皮膚の障害・ダメージ）である皮膚の弾力性低下に対する防止効果を評価できるＵＶＡ防止効果評価法はないのが現状である。
【０００７】
ＵＶＡによる即時黒化は３２０ｎｍから増加し、３４０ｎｍ〜３５０ｎｍをピークにして、長波長側の４００ｎｍまでゆるやかに低下する（非特許文献５参照）。しかしながら、コラーゲンの弾力性を低下させる波長は、即時黒化を引き起こす波長とは異なるので、現在用いられている皮膚の即時黒化（持続型即時黒化）を指標にしたＵＶＡ防止効果評価方法（ｉｎ ｖｉｖｏ法）で開発された紫外線防止製品が皮膚の弾力性低下をどの程度防止する効果があるかを評価し、表示することはできない。
【０００８】
すなわち、従来からの即時黒化（持続型即時黒化）を用いたＵＶＡ防止効果評価法では、紫外線防止製品の日光曝露による皮膚弾力性低下に対する防止効果、すなわち紫外線によるシワに対する防止効果を評価することは不可能であり、紫外線防止製品の日光曝露による皮膚弾力性低下に対する防止効果を知るためには、新たな方法が必要であることがわかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】 前田憲寿著 Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ６ ３５−４７ Ｔｒａｎｓｗｏｒｌｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｉｎｄｉａ ２００２
【非特許文献２】 前田憲寿著 Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ ７３−７５ １９９９
【非特許文献３】 前田憲寿著 Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ ５４ ７３７−７４０ １９９１
【非特許文献４】 Ｎｉｃｏｌｅ Ｖｅｒｚｉｊｌ著 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７５ ３９０２７−３９０３１ ２０００
【非特許文献５】 Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｉｒｗｉｎ著 Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ ５７ ５０４−５０７ １９９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
日常的に太陽光線を浴びる顔などでは、紫外線の影響により皮膚が硬くなり、弾力性が低下して、シワができやすくなる。このような光老化部位では真皮のコラーゲン線維が質的に変化している。一般的にＵＶＡは、皮膚に対する急性の障害はないが、長期間曝露するとコラーゲンに障害が蓄積して、弾力性を低下させる。従来、上記したＵＶＡの防止効果の指標としてＰＡ（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｇｒａｄｅ ｏｆ ＵＶＡ）が紫外線防止化粧品に表示されている。ＰＡは持続型即時黒化を指標にしたＵＶＡ防止効果ＰＦＡ（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ＵＶＡ）に基づき設定されている。しかしながら、紫外線が引き起こすコラーゲン弾力性低下スペクトルと持続型即時黒化スペクトルは異なるので、ＰＡ表示では紫外線が引き起こす皮膚のコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果、すなわちシワに対する防止効果を推察することができない。
【００１１】
本発明の目的は、紫外線によるコラーゲンの弾力性低下を短期間で簡便に評価する方法と、その評価結果に基づいたシワ防止効果指標を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、短期間で簡便に評価できる紫外線によるコラーゲンの弾力性低下すなわち紫外線によるシワに対する防止効果評価結果に基づいたシワ防止効果表示成分（シワ防止効果表示組成物）を提供することにある。
【００１３】
本発明の更に他の目的は、短期間で簡便に評価できる紫外線によるコラーゲンの弾力性低下すなわち紫外線によるシワに対する防止効果評価結果に基づいたシワ防止効果表示化粧品を提供することにある。
【００１４】
本発明の更に他の目的は、短期間で簡便に評価できる紫外線によるコラーゲンの弾力性低下すなわち紫外線によるシワに対する防止効果評価結果に基づいたシワ防止効果表示医薬部外品を提供することにある。
【００１５】
本発明の更に他の目的は、短期間で簡便に評価できる紫外線によるコラーゲンの弾力性低下すなわち紫外線によるシワに対する防止効果評価結果に基づいたシワ防止効果表示医薬品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意検討を重ねた結果、本願において本発明者は、以下に述べる研究成果から、上記の課題を解決することが可能であることを見出した。さらに、特許調査・文献調査を行った結果、本発明と同種・類似の特許・文献はなく、本発明に新規性・進歩性があることを見出した。
【００１７】
紫外線に引き起こされるコラーゲン弾力性低下の作用波長の解析と弾力性低下のメカニズムについて研究を行った。１０ｎｍバンドパスフィルタを用いて、３００ｎｍ〜３８０ｎｍの紫外線をコラーゲンゲルと摘出皮膚、再構成皮膚に同エネルギー量ずつ照射し、異なる測定機器で硬度・弾力性を測定した。次に、コラーゲンゲルに紫外線を照射したときの酢酸可溶性コラーゲンとジチロシンを測定した。さらに、ヘアレスマウスに長期間紫外線を照射した光老化モデル皮膚においても、同様に酢酸可溶性コラーゲンとジチロシンを測定した。
【００１８】
コラーゲン弾力性低下の作用波長を解析した結果、弾力性低下を引き起こす作用波長は３２０ｎｍ付近の紫外線であり、３００ｎｍと３５０ｎｍ以上のＵＶＡには弾力性低下の作用はなかった。また、紫外線を照射すると酸可溶性コラーゲンが減少し、酸不溶性コラーゲンが増加し、その不溶性分画にジチロシンが増加していた。紫外線を照射した摘出皮膚のコラーゲンにもジチロシンが増加していた。ヘアレスマウスに長期間紫外線を照射した光老化モデル皮膚でｉｎ ｖｉｖｏでも調べた結果、酢酸可溶性コラーゲンが減少し、不溶性コラーゲンが増加し、ジチロシンも増加していた。
【００１９】
３２０ｎｍ付近の紫外線によってコラーゲン中にジチロシンが形成されることによって、コラーゲンの弾力性が低下し、光老化皮膚に特徴的な弾力性低下を引き起こすことがわかった。また、日本の紫外線防止化粧品に表示されているＰＡ（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｇｒａｄｅ ｏｆ ＵＶＡ）は持続型即時黒化を指標にしたＵＶＡ防止効果ＰＦＡ（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ＵＶＡ）に基づき設定されているが、紫外線が引き起こすコラーゲン弾力性低下スペクトルと持続型即時黒化スペクトルは異なるので、持続型即時黒化を指標にしたＰＡ表示では紫外線が引き起こす皮膚のコラーゲンへの悪影響に対する防止効果、すなわちシワ防止効果を推察することはできない。
【００２０】
コラーゲンゲルに紫外線防止製品を直接または間接に塗布してから紫外線を照射して硬度または弾力性を測定してＵＶＡにより引き起こされるシワを評価する方法を鋭意研究して開発した。また、その結果に基づき紫外線（ＵＶＢとＵＶＡ）、特にＵＶＡにより引き起こされるシワに対する防止効果を短期間で簡便に評価する優れた方法を開発した。さらに、コラーゲンゲルに紫外線を照射したときの酢酸可溶性やジチロシンを測定しても同様に評価できる方法も開発した。
【００２１】
紫外線によってコラーゲン中にジチロシンが増加するにつれて、皮膚の弾力がなくなり、しわやたるみが増加して、皮膚の光老化が進行する。本発明は、コラーゲンゲルや摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止化粧品または紫外線防止製品を直接または間接に塗布してから硬度および／または弾力性を測定して、その結果に基づき紫外線（ＵＶＢとＵＶＡ）、特にＵＶＡにより引き起こされるシワに対する防止効果を定量できることを確認して、産業界の要請に対応する紫外線防止製品の評価方法とその評価結果に基づく表示方法を提供することにより上記の課題を解決することが可能であることを見出した。したがって、以下に示す発明を提供することができる。
【００２２】
請求項１において、コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際の硬度および／または弾力性を測定して、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果を評価する方法を提供する。
【００２３】
請求項２において、コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際の硬度および／または弾力性を測定することによる、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果の評価結果に基づき、紫外線によるコラーゲンの弾力性低下すなわち紫外線によるシワに対する防止効果を表示することを特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤を提供する。
【００２４】
請求項３において、コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際の硬度および／または弾力性を測定することによる、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果の評価結果に基づき、シワに対する防止効果を特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤を提供する。
【００２５】
請求項４において、コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際のジチロシンおよび／または酸不溶性コラーゲンを測定して、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果を評価する方法を提供する。
【００２６】
請求項５において、コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際のジチロシンおよび／または酸不溶性コラーゲンを測定することによる、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果の評価結果に基づき、紫外線によるコラーゲンの弾力性低下すなわち紫外線によるシワに対する防止効果を表示することを特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤を提供する。
【００２７】
請求項６において、コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際のジチロシンおよび／または酸不溶性コラーゲンを測定することによる、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果の評価結果に基づき、シワに対する防止効果を特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤を提供する。
【００２８】
請求項７において、紫外線防止製品または紫外線防止成分を塗布していない測定値と紫外線防止製品または紫外線防止成分を塗布した測定値との間の差、または紫外線防止製品または紫外線防止成分を塗布していない測定値の紫外線防止製品または紫外線防止成分を塗布した測定値に対する倍数から、この紫外線防止製品または紫外線防止成分の紫外線によるコラーゲンの弾力性低下すなわち紫外線によるシワに対する防止効果（指数）を求め、数値および／または記号および／または字句で表示することを特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明の実施の形態について説明する。本発明で用いられる機器類を以下に記す。紫外線照射装置としてクリニカル・サプライ株式会社製ＤＥＲＭＡＲＡＹ２００、浜松ホトニクス株式会社製ＬＩＧＨＴ ＴＨＩＮＧ ＣＵＲＥ ＬＣ６（１５０Ｗキセノンランプ Ｌ８２５３）を用いた。なお、紫外線照射に用いる機器は紫外線を放射する機器であれば、上記に挙げた機器に限定されるものではなく、太陽光シミュレーター等の他機器が利用可能である。
【００３０】
硬度計、弾力計としてインテグラル株式会社製Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＡ５８０、サン科学株式会社製ＲＨＥＯＴＥＸ ＳＤ−７００、ヤマキ電気株式会社モデラスを用いた。なお、測定に用いる機器は弾力性、硬度を測定する機器であれば、上記に挙げた機器に限定されるものではなく、利用可能である。
【００３１】
Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＡ５８０（陰圧吸引法）はプローブを皮表に押し当て、その内圧を減じて皮膚を隆起させ、その皮膚高の変位量を０．０１ｍｍ単位で測定することができ、急激な減圧、急激な解放を繰り返して変位の量を調べる機器である。一定陰圧で皮膚を吸引した時の吸引高さ（Ｕｆ）と、圧を解除した時の皮膚の戻り率（Ｕｒ，Ｕａ）により、皮膚の硬さと弾力性が測定できる。紫外線を長期間浴びた光老化部位では、被覆正常部に比べて、グラフの高さが低く、また、最高値から最低値までの差が小さく、光老化部位は皮膚の硬さが硬く、弾力性が低い。Ｕｒ／Ｕｆは瞬発的な戻り率、Ｕａ／Ｕｆは総合的な戻り率を表している。
【００３２】
ＲＨＥＯＴＥＸ ＳＤ−７００は、ゼリー、寒天、果物等の食品を初め、医薬品、化粧品、その他多くの工業製品の物理的性状を測定する。測定部位が一定の深さまで到達した時にアダプターが加える荷重によって硬さを測定することができる。
【００３３】
モデラスは、一定の外力で検体にわずかの変形（凹み）を与えて、その力を撤去した後の凹んだ検体が元に復元する応答挙動を測定し、弾性データを計算する。表面から約１．５ｍｍまでの「かたさ」を計測している。弾力の表示値は約０近くでプリン程度の柔らかさ、約１００近くで消しゴム程度のかたさを表わしている。
【００３４】
ＵＶＡ、ＵＶＢの照射は、ＤＥＲＭＡＲＡＹ２００を使用し、ＵＶＡはＦＬ２０Ｓ・ＢＬ／ＤＭＲランプ１０本、ＵＶＢはＴＬ２０Ｗ／１２ＲＳブロードバンドＵＶＢランプ５本で、ＤＥＲＭＡＲＡＹ２００のＵＶＡ強度（３６５ｎｍ）は８．２０ｍＷ／ｃｍ２であり、ＵＶＢ強度（３０５ｎｍ）は０．５３ｍＷ／ｃｍ２であった。摘出皮膚とコラーゲンゲルと再構成皮膚に１００分間、２００分間、３００分間ＵＶＡまたはＵＶＢを照射した。未照射の摘出皮膚とコラーゲンゲルと再構成皮膚には、アルミオイルで覆った摘出皮膚とコラーゲンゲルと再構成皮膚に、１００分間、２００分間、３００分間同様に照射したものを用いた。なお、照射強度、照射エネルギー量は上記に縛られることなく、自由に設定することができる。
【００３５】
それぞれのエネルギー量は、１００分間照射すると、ＵＶＢ ３．２Ｊ／ｃｍ２、ＵＶＡ ４９Ｊ／ｃｍ２、２００分間照射すると、ＵＶＢ６．４Ｊ／ｃｍ２、ＵＶＡ ９８Ｊ／ｃｍ２、３００分間照射すると、ＵＶＢ９．６Ｊ／ｃｍ２、ＵＶＡ１４７Ｊ／ｃｍ２であった。本照射量は真夏に１日２時間日光を浴びたとすると、紫外線の被曝量は、ＵＶＢ量が０．７５Ｊ／ｃｍ２、ＵＶＡ量が１５Ｊ／ｃｍ２であり、角層で５０％減弱され、さらに真皮に到達するのは、浴びた紫外線量の５％と考えると、真夏に１日２時間日光浴びたとすると、真皮には、ＵＶＢ量が０．０１８７５Ｊ／ｃｍ２、ＵＶＡ量が０．３７５Ｊ／ｃｍ２と推定される。１日２時間の日光を夏期に３０日間を４年間浴びたとすると、真皮には、ＵＶＢ量が２．２５Ｊ／ｃｍ２、ＵＶＡ量が４５Ｊ／ｃｍ２と算出される。１日２時間の日光を夏期に３０日間を８年間浴びたとすると、真皮には、ＵＶＢ量が４．５Ｊ／ｃｍ２、ＵＶＡ量が９０Ｊ／ｃｍ２と算出される。１日２時間の日光を夏期に３０日間を１２年間浴びたとすると、真皮には、ＵＶＢ量が６．７５Ｊ／ｃｍ２、ＵＶＡ量が１３５Ｊ／ｃｍ２と算出される。これらの算出結果をもとに、照射量を決定した。
【００３６】
摘出皮膚の硬さと弾力性の測定には、１ｃｍ×１ｃｍにカットした摘出した皮膚を用いた。ディッシュに摘出皮膚を置き、ＰＢＳを真皮が浸るぐらいまで入れ、ＤＥＲＭＡＲＡＹ２００でＵＶＡを４９Ｊ／ｃｍ２、１４７Ｊ／ｃｍ２照射した。ＵＶＢも同様に３．２Ｊ／ｃｍ２、９．６Ｊ／ｃｍ２照射した。Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＡ５８０（測定条件はＰｒｅｓｓｕｒｅ：３８０ｍｂａｒ、Ｐｒｏｂｅ ａｐｅｒｔｕｒｅ：２ｍｍ、ｏｎ−ｔｉｍｅ：２ｓｅｃｏｎｄｓ、ｏｆｆ−ｔｉｍｅ：３ｓｅｃｏｎｄｓ、ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎｓ：３、ｐｒｅｔｉｍｅ：５）、ＲＨＥＯＴＥＸ ＳＤ−７００（測定条件はＤｉｓｔａｎｃｅ：１．０ｍｍ、Ｗｅｉｇｈｔ：１５ｇ）、モデラスにより硬さと弾力性を測定した。なお摘出皮膚はヒト、豚、ラット、マウス等のいずれを用いてもよく、皮膚の大きさは適当な大きさにカットして実験に用いる。
【００３７】
コラーゲンゲルの硬さと弾力性の測定には、３５ｍｍディッシュに１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、精製水、コラーゲン溶液（０．３％）を加えて作成したコラーゲンゲルを用いた。ＤＥＲＭＡＲＡＹ２００でＵＶＡを４９Ｊ／ｃｍ２、９８Ｊ／ｃｍ２、１４７Ｊ／ｃｍ２照射した。ＵＶＢも同様に３．２Ｊ／ｃｍ２、６．４Ｊ／ｃｍ２、９．６Ｊ／ｃｍ２照射した。Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＡ５８０、ＲＨＥＯＴＥＸ ＳＤ−７００、モデラスによりコラーゲンゲルの硬さと弾力性を測定した。コラーゲンの濃度は０．００１％から１００％（純粋コラーゲン）まで用いてもよい。線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルでも同様の結果を得ており、線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルを用いてもよい。コラーゲンはヒト、豚、牛、魚等から得ることができ、いずれを用いてもよい。
【００３８】
再構成皮膚の硬さと弾力性の測定には、表皮層と真皮層からなる三次元皮膚モデルを用いた。再構成皮膚にＤＥＲＭＡＲＡＹ２００でＵＶＡを４９Ｊ／ｃｍ２、９８Ｊ／ｃｍ２、１４７Ｊ／ｃｍ２照射した。ＵＶＢも同様に３．２Ｊ／ｃｍ２、６．４Ｊ／ｃｍ２、９．６Ｊ／ｃｍ２照射した。Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＡ５８０、ＲＨＥＯＴＥＸ ＳＤ−７００、モデラスにより再構成皮膚の硬さと弾力性を測定した。再構成皮膚は自作の三次元皮膚モデルを用いても市販の三次元皮膚モデルを用いてもよい。
【００３９】
シワ防止製品の効果を、シワ防止製品を塗布したコラーゲンゲルにＵＶＡとＵＶＢを照射して調べた。３５ｍｍディッシュに１０倍濃度のＰＢＳ、ＮａＨＣＯ３、精製水、コラーゲン溶液（０．３％）を加え、コラーゲンゲルを作成した。ＵＶＡを４９Ｊ／ｃｍ２、９８Ｊ／ｃｍ２、１４７Ｊ／ｃｍ２照射し、Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＡ５８０、ＲＨＥＯＴＥＸ ＳＤ−７００、モデラスを用いて、シワ防止製品を塗布したコラーゲンゲルの硬さと弾力性を測定し、シワ防止製品を塗布していないコラーゲンゲルの硬さと弾力性と比較した。評価は摘出皮膚と再構成皮膚を用いても同様にできる。摘出皮膚とコラーゲンゲルと再構成皮膚へのシワ防止製品の塗布方法は、直接またはラップや石英板等の紫外線透過性のフィルムを通して間接に行うこともできるし、紫外線吸収成分を添加したコラーゲンゲルを用いてもよい。また、塗布量は２ｍｇ／ｃｍ２または２μＬ／ｃｍ２としたが、０．１ｍｇ／ｃｍ２〜２０ｍｇ／ｃｍ２または０．１μＬ／ｃｍ２〜２０μＬ／ｃｍ２の範囲で任意に設定してもよい。
【００４０】
ＵＶＡを照射したコラーゲンゲルの酢酸可溶性と酢酸不溶性の測定方法について記す。ＵＶＡを照射（１４７Ｊ／ｃｍ２）したコラーゲンゲルと未照射のコラーゲンゲルを５ｍｍデルマパンチで５個ずつ採取した。０．５Ｍ酢酸を入れ、酢酸可溶性コラーゲンと酢酸不溶性コラーゲンに分け、遠心型濃縮機で水分を除去後、６Ｍ塩酸で加水分解した。塩酸処理液２００μＬを２Ｍ ＮａＯＨ ３００μＬでｐＨ２に調製した。ＵＶＡを照射したコラーゲンゲルの酢酸不溶性分画の塩酸加水分解物、ＵＶＡを照射したコラーゲンゲルの酢酸可溶性分画の塩酸加水分解物、未照射のコラーゲンゲルの酢酸可溶性分画の塩酸加水分解物の蛍光強度を高速液体クロマトグラフィーで測定した。測定条件は、カラムにＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０（Ｃ１８カラム）４．６ｍｍｘ２５０ｍｍ、５μｍを使用し、流量を０．８ｍＬ／ｍｉｎ、注入量を５μＬとした。検出波長を吸光度２１０ｎｍ、蛍光強度 Ｅｘ：２８３ｎｍ、Ｅｍ：４１５ｎｍとした。移動相については、移動相Ａを０．５％酢酸、移動相Ｂをメタノールとし、Ａ：Ｂ＝９６：４とした。なお、不溶性コラーゲンの測定法については、上記に挙げた方法・測定条件に限定されるものではなく、その他の酸やグアニジン塩酸塩、尿素等のタンパク質可溶化剤が利用可能である。また、蛍光測定については、上記に挙げた方法・波長・測定条件に限定されるものではない。さらに、酸不溶性コラーゲン量と酸可溶性コラーゲン量は、分光光度計やマイクロプレートリーダーを用いて吸収度やアミノ酸量を測定したり、塩酸加水分解前の重量・タンパク質量や吸収度・蛍光強度を測定したりして比較することもできる。
【００４１】
コラーゲンゲル中のジチロシン（チロシンダイマー）の測定方法について記す。ＵＶＡを照射（１４７Ｊ／ｃｍ２）したコラーゲンゲルと未照射のコラーゲンゲルを５ｍｍデルマパンチで５個ずつ採取し、６Ｍの塩酸で加水分解（１１０℃、２４時間）した。一方、Ｌ−チロシンを精製水で希釈して０．０１ｍｇ／ｍＬのチロシン水溶液にＵＶＡを照射（１４７Ｊ／ｃｍ２）した。ジチロシンは、チロシンにホースラディッシュペルオキシダーゼと過酸化水素水を反応させて合成した。すなわち、０．２Ｍのホウ酸塩バッファ（ｐＨ９．５）５０ｍＬ中に１５μｇ／ｍＬのホースラディッシュペルオキシダーゼ、５．２５ｍＭ過酸化水素、５ｍＭのＬ−チロシンを溶解し、３７℃で反応させた。塩酸で中和後、Ｃ１８カートリッジでジチロシンを吸着させ、未反応のチロシンとホースラディッシュペルオキシダーゼ、過酸化水素を２ｍＬの精製水で洗浄して除去した。ジチロシンは５ｍＬの２０％のメタノールで溶出した。ジチロシン溶液とＵＶＡを照射したチロシン溶液、ＵＶＡを照射したコラーゲンゲルの塩酸加水分解物、ＵＶＡ未照射のコラーゲンゲルの塩酸加水分解物のジチロシン量を高速液体クロマトグラフィーで測定した。測定条件は、カラムはＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０（Ｃ１８カラム）４．６ｍｍｘ２５０ｍｍ、５μｍを使用し、流量を０．８ｍＬ／ｍｉｎ、注入量を５μＬとした。検出波長を吸光度 ２１０ｎｍ、蛍光強度 Ｅｘ：２８３ｎｍ、Ｅｍ：４１５ｎｍとした。移動相については、移動相Ａを０．５％酢酸、移動相Ｂをメタノールとし、Ａ：Ｂ＝９６：４とした。なお、チロシンダイマーの測定法については、上記に挙げた方法・測定条件に限定されるものではなく、その他の波長での蛍光測定方法や抗ジチロシン抗体等のチロシンダイマーに対する抗体を用いた免疫学的測定方法が利用可能である。
【発明の効果】
【００４２】
コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射して硬度および／または弾力性を測定する方法は、短期間で簡便に紫外線（ＵＶＢとＵＶＡ）により引き起こされるシワに対する防止効果を評価することができ、その結果に基づき紫外線（ＵＶＢとＵＶＡ）、特にＵＶＡにより引き起こされるシワに対する防止効果を表示することができることを特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤を提供することができる。紫外線防止製品または紫外線防止成分のみならず、メーキャップ化粧品、スキンケア化粧品、ヘアケア・ボディケア化粧品、ボディソープ、ハンドソープ、クレンジング材、乳液、化粧水、美容液、パック、洗顔フォーム、固形石鹸、液体石鹸、クリーム状石鹸、シャンプー、リンス、シェービングクリーム等の化粧品、医薬部外品、医薬品に広く使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明において、評価され得る化粧水、乳液、クリーム、ファンデーション等の剤型のシワ防止製品ならびに紫外線防止成分は、本発明評価系において調べることが可能な限り特に限定されない。よって、以下に紫外線防止成分を列挙するが、これらの紫外線防止成分に本発明で用いられる化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤に配合可能な紫外線防止成分が限定されるものでないことは勿論である。
【００４４】
すなわち、サリチル酸ホモメンチル、２−シアノ−３，３−ジフェニルプロパ−２−エン酸２−エチルヘキシエステル（別名オクトクリレン）、ジパラメトキシケイ皮酸モノ−２−エチルヘキサン酸グリセリル、パラアミノ安息香酸及びそのエステル、４−ｔｅｒｔ−ブチル−４‘−メトキシジベンゾイルメタン（表示名称ｔ−ブチルジベンゾイルメタン）、４−（２−β−グルコピラノシロキサン）プロポキシ−２−ヒドロキシベンゾフェノン、サリチル酸オクチル、２，５−ジイソプロピルケイ皮酸メチル、２−［４−（ジエチルアミノ）−２−ヒドロキシベンゾイル］安息香酸ヘキシルエステル、シノキサート、ジヒドロキシジメトキシベンゾフェノン、ジヒドロキシジメトキシベンゾフェノンジスルホン酸ナトリウム、ジヒドロキシベンゾフェノン、ジメチルジエチルベンザルマロネート、１−（３，４−ジメトキシフェニル）−４，４−ジメチル−１，３−ペンタンジオン、ジメトキシベンジリデンジオキソイミダゾリジンプロピオン酸２−エチルヘキシル、テトラヒドロキシベンゾフェノン、テレフタリリデンジカンフルスルホン酸、２，４，６−トリス［４−（２−エチルヘキシルオキシカルボニル）アニリノ］−１，３，５−トリアジン、トリメトキシケイ皮酸メチルビス（トリメチルシロキシ）シリルイソペンチル、ドロメトリゾールトリシロキサン、パラジメチルアミノ安息香酸アミル、パラジメチルアミノ安息香酸２−エチルヘキシル（表示名称ジメチルＰＡＢＡエチルヘキシル）、パラメトキシケイ皮酸イソプロピル・ジイソプロピルケイ皮酸エステル混合物、パラメトキシケイ皮酸２−エチルヘキシル（表示名称メトキシケイヒ酸エチルヘキシル）、２，４−ビス−［｛４−（２−エチルヘキシルオキシ）−２−ヒドロキシ｝−フェニル］−６−（４−メトキシフェニル）１，３，５−トリアジン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（表示名称オキシベンゾン−３）、ヒドロキシメトキシベンゾフェノンスルホン酸及びその三水塩（表示名称オキシベンゾン−４）、ヒドロキシメトキシベンゾフェノンスルホン酸ナトリウム、フェニルベンズイミダゾールスルホン酸、フェルラ酸、２，２’−メチレンビス（６−（２Ｈ−ベンゾトリアゾール−２−イル）−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノール）、チノソープＳ、メギゾリルＸＬ、メギゾリルＳＸ等を挙げることができる。
【００４５】
さらに、紫外線散乱成分として、酸化チタン、被覆酸化チタン、微粒子酸化チタン、酸化亜鉛、被覆酸化亜鉛、微粒子酸化亜鉛、酸化鉄、酸化セリウム、リン酸セリウム、アロフェン、メソポーラスシリカ等を挙げることができる。酸化チタンと酸化亜鉛の被覆材としてシリカや水酸化アルミニウム、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、酸化アルミ、ステアリン酸、界面活性剤、シラン化合物、酸化ジルコニウム等が挙げられる。
【００４６】
以下、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４７】
摘出した豚皮膚を１ｃｍ×１ｃｍにカットした。摘出皮膚を１０個用意し、例数５で以下に記した評価を行い、平均値と標準偏差を求めた。ファンデーションを塗布した摘出皮膚と塗布していない摘出皮膚をディッシュに置き、ＰＢＳを真皮が浸るぐらいまで入れた。塗布量は２ｍｇ／ｃｍ２とした。Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＡ５８０を用いて真皮の硬さ（Ｕｆ； 値が低いほうが硬い）を測定した後に、ＤＥＲＭＡＲＡＹ２００を用いてＵＶＡを１５０Ｊ／ｃｍ２照射した。照射後にもう一度Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＡ５８０を用いて真皮の硬さ（Ｕｆ）を測定した。その結果、照射前のファンデーションを塗布していない摘出皮膚の硬さ（Ｕｆ）は０．３５±０．０１、照射後のファンデーションを塗布していない摘出皮膚の硬さ（Ｕｆ）は０．１５±０．０１であった。照射前のファンデーションを塗布した摘出皮膚の硬さ（Ｕｆ）は０．３５±０．０１、照射後のファンデーションを塗布した摘出皮膚の硬さ（Ｕｆ）は０．３３±０．０１であった。ファンデーションを塗布した摘出皮膚の硬さ（Ｕｆ）は塗布していない摘出皮膚の硬さ（Ｕｆ）に比べて有意に低く、ＵＶＡにより引き起こされるコラーゲンの弾力性低下（シワ）に対する防止効果を示した。また、ファンデーションを塗布していない摘出皮膚とファンデーションを塗布した摘出皮膚について、照射後の硬さ（Ｕｆ）と照射前の硬さ（Ｕｆ）の差（０．２０、０．０２）を求め、それを照射前の硬さ（Ｕｆ）で除した値（０．５７、０．０６）から、ファンデーションの効果を算出した。この場合、ファンデーションを塗布していない摘出皮膚の値（０．５７）は、ファンデーションを塗布した摘出皮膚の値（０．０６）の６．３倍なので、このファンデーションのＵＶＡにより引き起こされるシワに対する防止効果（指数）は９．５となる。また、数値を記号表示すると、例えば、１．５〜３．９を＋または☆、４．０〜６．９を＋＋または☆☆、７．０〜９．９を＋＋＋または☆☆☆、１０．０〜を＋＋＋＋または☆☆☆☆とすると、本製品のシワに対する防止効果（指数）は、＋＋＋または☆☆☆となる。さらに、数値を字句で表示すると、例えば、１．５〜３．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果が弱い。Ｗｅａｋ」、４．０〜６．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果がある。Ｍｏｄｅｒａｔｅ」、７．０〜９．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果が強い。Ｓｔｒｏｎｇ」、１０．０〜を「紫外線によるシワを防ぐ効果が非常に強い。Ｖｅｒｙ ｓｔｒｏｎｇ」とすると、本製品のシワに対する防止効果は、「紫外線によるシワを防ぐ効果が強い。Ｓｔｒｏｎｇ」となる。
【実施例２】
【００４８】
コラーゲンゲルを８個用意し、例数４で以下に記した評価を行い、平均値と標準偏差を求めた。紫外線防止化粧品を塗布したコラーゲンゲルと塗布していないコラーゲンゲルについて、ＲＨＥＯＴＥＸ ＳＤ−７００を用いて硬度を測定した後に、ＤＥＲＭＡＲＡＹ２００でＵＶＡを１００Ｊ／ｃｍ２照射した。塗布量は２ｍｇ／ｃｍ２とした。照射後にもう一度ＲＨＥＯＴＥＸ ＳＤ−７００を用いてコラーゲンゲルの硬度を測定した。その結果、照射前の紫外線防止化粧品を塗布していないコラーゲンゲルの硬度は３．２±０．１に対し、照射後の紫外線防止化粧品を塗布していないコラーゲンゲルの硬度は、６．４±０．２であり、照射前の紫外線防止化粧品を塗布したコラーゲンゲルの硬度は、３．３±０．１、照射後の紫外線防止化粧品を塗布したコラーゲンゲルの硬度は４．１±０．１であった。紫外線防止化粧品を塗布したコラーゲンゲルの硬度は塗布していないコラーゲンゲルの硬度に比べて有意に低く、ＵＶＡにより引き起こされるコラーゲンの弾力性低下（シワ）に対する防止効果を示した。また、紫外線防止化粧品を塗布していないコラーゲンゲルと紫外線防止化粧品を塗布したコラーゲンゲルについて、照射後の硬度と照射前の硬度の差（３．２、０．８）を求め、それを照射前の硬度で除した値（１．０、０．２４）から、紫外線防止化粧品の効果を算出した。この場合、紫外線防止化粧品を塗布していないコラーゲンゲルの値（１．０）は、紫外線防止化粧品を塗布したコラーゲンゲルの値（０．２４）の４．２倍なので、この紫外線防止化粧品のＵＶＡにより引き起こされるシワに対する防止効果（指数）は、４．２となる。また、数値を記号表示すると、例えば、１．５〜３．９を＋または☆、４．０〜６．９を＋＋または☆☆、７．０〜９．９を＋＋＋または☆☆☆、１０．０〜を＋＋＋＋または☆☆☆☆とすると、本製品のシワに対する防止効果（指数）は、＋＋または☆☆となる。さらに、数値を字句で表示すると、例えば、１．５〜３．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果が弱い。Ｗｅａｋ」、４．０〜６．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果がある。Ｍｏｄｅｒａｔｅ」、７．０〜９．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果が強い。Ｓｔｒｏｎｇ」、１０．０〜を「紫外線によるシワを防ぐ効果が非常に強い。Ｖｅｒｙ ｓｔｒｏｎｇ」とすると、本製品のシワに対する防止効果は、「紫外線によるシワを防ぐ効果がある。Ｍｏｄｅｒａｔｅ」となる。
【実施例３】
【００４９】
再構成皮膚を６個用意し、例数３で以下に記した評価を行い、平均値と標準偏差を求めた。乳液（医薬部外品）を塗布した再構成皮膚と塗布していない再構成皮膚をディッシュに置き、ＰＢＳを真皮モデルが浸るぐらいまで入れた。塗布量は２ｍｇ／ｃｍ２とした。Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＡ５８０を用いて弾力性（Ｕｒ／Ｕｆ）を測定した後に、ＤＥＲＭＡＲＡＹ２００でＵＶＡを５０Ｊ／ｃｍ２照射した。照射後にもう一度Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＡ５８０を用いて弾力性（Ｕｒ／Ｕｆ）を測定した。その結果、照射前の乳液（医薬部外品）を塗布していない再構成皮膚の弾力性（Ｕｒ／Ｕｆ）は、０．６７±０．０３、照射後の乳液（医薬部外品）を塗布していない再構成皮膚の弾力性（Ｕｒ／Ｕｆ）は０．４８±０．０２であった。照射前の乳液（医薬部外品）を塗布した再構成皮膚の弾力性（Ｕｒ／Ｕｆ）は０．６８±０．０１、照射後の乳液（医薬部外品）を塗布した再構成皮膚の弾力性（Ｕｒ／Ｕｆ）は０．５７±０．０２であった。乳液（医薬部外品）を塗布した再構成皮膚の弾力性（Ｕｒ／Ｕｆ）は、塗布していない再構成皮膚の弾力性（Ｕｒ／Ｕｆ）に比べて有意に高く、ＵＶＡにより引き起こされるコラーゲンの弾力性低下（シワ）に対する防止効果を示した。また、乳液（医薬部外品）を塗布していない再構成皮膚と乳液（医薬部外品）を塗布した再構成皮膚について、照射後の弾力性（Ｕｒ／Ｕｆ）と照射前の弾力性（Ｕｒ／Ｕｆ）の差（０．１９、０．１１）を求め、それを照射前の弾力性（Ｕｒ／Ｕｆ）で除した値（０．２８、０．１６）から、乳液（医薬部外品）の効果を算出した。この場合、乳液（医薬部外品）を塗布していない再構成皮膚の値（０．２８）は乳液（医薬部外品）を塗布した再構成皮膚の値（０．１６）の１．８倍なのでは、この乳液（医薬部外品）のＵＶＡにより引き起こされるシワに対する防止効果（指数）は、１．８となる。また、数値を記号表示すると、例えば、１．５〜３．９を＋または☆、４．０〜６．９を＋＋または☆☆、７．０〜９．９を＋＋＋または☆☆☆、１０．０〜を＋＋＋＋または☆☆☆☆とすると、本製品のシワに対する防止効果（指数）は、＋または☆となる。さらに、数値を字句で表示すると、例えば、１．５〜３．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果が弱い。Ｗｅａｋ」、４．０〜６．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果がある。Ｍｏｄｅｒａｔｅ」、７．０〜９．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果が強い。Ｓｔｒｏｎｇ」、１０．０〜を「紫外線によるシワを防ぐ効果が非常に強い。Ｖｅｒｙ ｓｔｒｏｎｇ」とすると、本製品のシワに対する防止効果は、「紫外線によるシワを防ぐ効果が弱い。Ｗｅａｋ」となる。
【実施例４】
【００５０】
線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルを８個用意し、例数４で以下に記した評価を行い、平均値と標準偏差を求めた。紫外線防止成分を塗布した線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルと塗布していない線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルについて、モデラスを用いて硬度を測定した後に、ＤＥＲＭＡＲＡＹ２００でＵＶＡを２０Ｊ／ｃｍ２照射した。塗布量は２ｍｇ／ｃｍ２とした。照射後にもう一度モデラスを用いて硬度を測定した。その結果、照射前の紫外線防止成分を塗布していない線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルの硬度は、３．１±０．４、照射後の紫外線防止成分を塗布していない線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルの硬度は、１０．５±０．９であった。照射前の紫外線防止成分を塗布した線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルの硬度は３．０±０．３、照射後の紫外線防止成分を塗布した線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルの硬度は４．５±０．６であった。紫外線防止成分を塗布した線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルの硬度は塗布していない線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルの硬度に比べて有意に低く、ＵＶＡにより引き起こされるコラーゲンの弾力性低下（シワ）に対する防止効果を示した。また、紫外線防止成分を塗布していない線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルと紫外線防止成分を塗布した線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルについて、照射後の硬度と照射前の硬度の差（７．４、１．５）を求め、それを照射前の硬度で除した値（２．４、０．５）から、紫外線防止成分の効果を算出した。この場合、紫外線防止成分を塗布していない線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルの値（２．４）は紫外線防止成分を塗布した線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルの値（０．５）の４．８倍なのでは、この紫外線防止成分のＵＶＡにより引き起こされるシワに対する防止効果（指数）は４．８となる。また、数値を記号表示すると、例えば、１．５〜３．９を＋または☆、４．０〜６．９を＋＋または☆☆、７．０〜９．９を＋＋＋または☆☆☆、１０．０〜を＋＋＋＋または☆☆☆☆とすると、本製品のシワに対する防止効果（指数）は、＋＋または☆☆となる。さらに、数値を字句で表示すると、例えば、１．５〜３．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果が弱い。Ｗｅａｋ」、４．０〜６．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果がある。Ｍｏｄｅｒａｔｅ」、７．０〜９．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果が強い。Ｓｔｒｏｎｇ」、１０．０〜を「紫外線によるシワを防ぐ効果が非常に強い。Ｖｅｒｙ ｓｔｒｏｎｇ」とすると、本製品のシワに対する防止効果は、「紫外線によるシワを防ぐ効果がある。Ｍｏｄｅｒａｔｅ」となる。
【実施例５】
【００５１】
コラーゲンゲルを８個用意し、例数４で以下に記した評価を行い、平均値と標準偏差を求めた。サンスクリーンを塗布したコラーゲンゲルと塗布していないコラーゲンゲルにＵＶＡを４００Ｊ／ｃｍ２照射した。塗布量は２ｍｇ／ｃｍ２とした。照射後にＨＰＬＣを用いてジチロシン量を測定した。その結果、照射後のサンスクリーンを塗布していないコラーゲンゲルのジチロシン量は２．１±０．２であり、照射後のサンスクリーン品を塗布したコラーゲンゲルのジチロシン量は０．２±０．１であった。サンスクリーンを塗布したコラーゲンゲルのジチロシン量は塗布していないコラーゲンゲルのジチロシン量に比べて有意に低く、ＵＶＡにより引き起こされるコラーゲンの弾力性低下（シワ）に対する防止効果を示した。また、サンスクリーンを塗布していないコラーゲンゲルと塗布したコラーゲンゲルのジチロシン量から、サンスクリーンの効果を算出した。この場合、サンスクリーンしていないコラーゲンゲルの値（２．１）はサンスクリーンを塗布したコラーゲンゲルの値は（０．２）の１０．５倍なのでは、このサンスクリーンをＵＶＡにより引き起こされるシワに対する防止効果（指数）は、１０．５となる。また、数値を記号表示すると、例えば、１．５〜３．９を＋または☆、４．０〜６．９を＋＋または☆☆、７．０〜９．９を＋＋＋または☆☆☆、１０．０〜を＋＋＋＋または☆☆☆☆とすると、本製品のシワに対する防止効果（指数）は、＋＋＋＋または☆☆☆☆となる。さらに、数値を字句で表示すると、例えば、１．５〜３．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果が弱い。Ｗｅａｋ」、４．０〜６．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果がある。Ｍｏｄｅｒａｔｅ」、７．０〜９．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果が強い。Ｓｔｒｏｎｇ」、１０．０〜を「紫外線によるシワを防ぐ効果が非常に強い。Ｖｅｒｙ ｓｔｒｏｎｇ」とすると、本製品のシワに対する防止効果は、「紫外線によるシワを防ぐ効果が非常に強い。Ｖｅｒｙ ｓｔｒｏｎｇ」となる。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明により算出される効果（指数）は、紫外線によるコラーゲンの弾力性低下を短期間で簡便に知ることができ、ひいては紫外線によって引き起こされるシワに対する防止効果を的確に表示することができる優れた表示物であり、紫外線防止効果を有する紫外線防止を有する化粧品・医薬部外品・医薬品等の皮膚外用剤に用いることができる。それらの皮膚外用剤に本発明が具備する機能を付与することができる。機能を具備する方法は、特に制限されず、皮膚外用剤の容器・外箱・印刷物・タッグ・ＰＯＰ（Ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｐｕｒｃｈａｓｅ ａｄｖｅｒｔｉｓｉｎｇ）広告、宣伝等に使用することができる。
【００５３】
本発明の紫外線防止製品、紫外線防止成分の形態は、固体、液体、気体を問わず、特に制限されない。また、本発明の紫外線防止製品、紫外線防止成分の用途は、特に制限されないが、ヒトの皮膚に直接触れるもの、特に紫外線に曝露する可能性のある用品が好適である。
【００５４】
皮膚外用剤（化粧料、医薬部外品、医薬品を含む）としては、例えば、化粧水、乳液、クリーム、ファンデーション、口紅、サンスクリーン、パック、制汗剤、ボディパウダー、ベビーパウダー、浴用剤、石鹸、ボディソープ、洗顔料等の皮膚化粧料、ヘアートリートメント、ヘアリキッド、整髪料、育毛料等の頭髪化粧料などの化粧料、軟膏や貼付剤などが挙げられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、紫外線によるシワ防止効果評価方法とシワ防止効果表示皮膚外用剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は体のなかでは最も大きな器官である。そのなかで真皮は表皮の内側にある１．０〜３．０ｍｍの層で、コラーゲン線維とエラスチン線維、プロテオグリカン（ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸など）などの細胞外マトリックスでできており、皮膚に弾力性と強さを与えている。真皮の乾燥重量の約７０％のコラーゲン線維と１〜２％を占めるエラスチン線維による三次元ネットワーク構造により皮膚の弾力性が保たれている。
【０００３】
日光を長期間浴びると、長波長紫外線（ＵＶＡ；３２０ｎｍ〜４００ｎｍまたはＵＶＡ；３１５ｎｍ〜４００ｎｍまたはＵＶＡ；３１５ｎｍ〜３８０ｎｍ）の作用によって真皮のコラーゲン線維が変性し、皮膚の弾力性が低下し、しわが生じる原因になる。ＵＶＡの皮膚への影響についてヘアレスマウスを用いて研究した結果、日常的に浴びるＵＶＡ量を２か月間ヘアレスマウスに照射すると、皮膚の弾力性が半永久的に低下することを明らかにした（非特許文献１〜３参照）。
【０００４】
コラーゲンは代謝回転が遅いタンパク質であり、皮膚のコラーゲンのターンオーバーの半減期は１４．８年（９５％信頼区間；９．４−２２．３年）と算出されている（非特許文献４参照）。したがって、長期間のＵＶＡ曝露によってコラーゲンに障害が蓄積して、弾力性が低下するといえる。
【０００５】
このように、ＵＶＡによる皮膚の弾力性の低下には、長期間のＵＶＡ曝露が必要なため、皮膚外用剤のシワ防止効果のｉｎ ｖｉｖｏでの評価は困難である。そこで、コラーゲン線維モデルの弾力性と硬化因子を用いてシワ防止成分ならびにシワ防止皮膚外用剤を短期間で簡便に評価することを考えた。なお、シワは、しわ、皺、小ジワ、こじわ、小皺、リンクル、ｗｒｉｎｋｌｅと同義である。
【０００６】
現在、国内外のＵＶＡ防止効果の測定法としては、照射２時間後以降に皮膚の即時黒化を求める方法（ｉｎ ｖｉｖｏ法）、テープに塗布した試料の吸収曲線から求める方法（ｉｎ ｖｉｔｒｏ法）があるが、中波長紫外線（ＵＶＢ）とは異なり、真皮まで到達するＵＶＡによって引き起こされる主要な光老化（紫外線による皮膚の障害・ダメージ）である皮膚の弾力性低下に対する防止効果を評価できるＵＶＡ防止効果評価法はないのが現状である。
【０００７】
ＵＶＡによる即時黒化は３２０ｎｍから増加し、３４０ｎｍ〜３５０ｎｍをピークにして、長波長側の４００ｎｍまでゆるやかに低下する（非特許文献５参照）。しかしながら、コラーゲンの弾力性を低下させる波長は、即時黒化を引き起こす波長とは異なるので、現在用いられている皮膚の即時黒化（持続型即時黒化）を指標にしたＵＶＡ防止効果評価方法（ｉｎ ｖｉｖｏ法）で開発された紫外線防止製品が皮膚の弾力性低下をどの程度防止する効果があるかを評価し、表示することはできない。
【０００８】
すなわち、従来からの即時黒化（持続型即時黒化）を用いたＵＶＡ防止効果評価法では、紫外線防止製品の日光曝露による皮膚弾力性低下に対する防止効果、すなわち紫外線によるシワに対する防止効果を評価することは不可能であり、紫外線防止製品の日光曝露による皮膚弾力性低下に対する防止効果を知るためには、新たな方法が必要であることがわかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】 前田憲寿著 Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ６ ３５−４７ Ｔｒａｎｓｗｏｒｌｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｉｎｄｉａ ２００２
【非特許文献２】 前田憲寿著 Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｐｈｏｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ ７３−７５ １９９９
【非特許文献３】 前田憲寿著 Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ ５４ ７３７−７４０ １９９１
【非特許文献４】 Ｎｉｃｏｌｅ Ｖｅｒｚｉｊｌ著 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７５ ３９０２７−３９０３１ ２０００
【非特許文献５】 Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｉｒｗｉｎ著 Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ ５７ ５０４−５０７ １９９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
日常的に太陽光線を浴びる顔などでは、紫外線の影響により皮膚が硬くなり、弾力性が低下して、シワができやすくなる。このような光老化部位では真皮のコラーゲン線維が質的に変化している。一般的にＵＶＡは、皮膚に対する急性の障害はないが、長期間曝露するとコラーゲンに障害が蓄積して、弾力性を低下させる。従来、上記したＵＶＡの防止効果の指標としてＰＡ（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｇｒａｄｅ ｏｆ ＵＶＡ）が紫外線防止化粧品に表示されている。ＰＡは持続型即時黒化を指標にしたＵＶＡ防止効果ＰＦＡ（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ＵＶＡ）に基づき設定されている。しかしながら、紫外線が引き起こすコラーゲン弾力性低下スペクトルと持続型即時黒化スペクトルは異なるので、ＰＡ表示では紫外線が引き起こす皮膚のコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果、すなわちシワに対する防止効果を推察することができない。
【００１１】
本発明の目的は、紫外線によるコラーゲンの弾力性低下を短期間で簡便に評価する方法と、その評価結果に基づいたシワ防止効果指標を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、短期間で簡便に評価できる紫外線によるコラーゲンの弾力性低下すなわち紫外線によるシワに対する防止効果評価結果に基づいたシワ防止効果表示成分（シワ防止効果表示組成物）を提供することにある。
【００１３】
本発明の更に他の目的は、短期間で簡便に評価できる紫外線によるコラーゲンの弾力性低下すなわち紫外線によるシワに対する防止効果評価結果に基づいたシワ防止効果表示化粧品を提供することにある。
【００１４】
本発明の更に他の目的は、短期間で簡便に評価できる紫外線によるコラーゲンの弾力性低下すなわち紫外線によるシワに対する防止効果評価結果に基づいたシワ防止効果表示医薬部外品を提供することにある。
【００１５】
本発明の更に他の目的は、短期間で簡便に評価できる紫外線によるコラーゲンの弾力性低下すなわち紫外線によるシワに対する防止効果評価結果に基づいたシワ防止効果表示医薬品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意検討を重ねた結果、本願において本発明者は、以下に述べる研究成果から、上記の課題を解決することが可能であることを見出した。さらに、特許調査・文献調査を行った結果、本発明と同種・類似の特許・文献はなく、本発明に新規性・進歩性があることを見出した。
【００１７】
紫外線に引き起こされるコラーゲン弾力性低下の作用波長の解析と弾力性低下のメカニズムについて研究を行った。１０ｎｍバンドパスフィルタを用いて、３００ｎｍ〜３８０ｎｍの紫外線をコラーゲンゲルと摘出皮膚、再構成皮膚に同エネルギー量ずつ照射し、異なる測定機器で硬度・弾力性を測定した。次に、コラーゲンゲルに紫外線を照射したときの酢酸可溶性コラーゲンとジチロシンを測定した。さらに、ヘアレスマウスに長期間紫外線を照射した光老化モデル皮膚においても、同様に酢酸可溶性コラーゲンとジチロシンを測定した。
【００１８】
コラーゲン弾力性低下の作用波長を解析した結果、弾力性低下を引き起こす作用波長は３２０ｎｍ付近の紫外線であり、３００ｎｍと３５０ｎｍ以上のＵＶＡには弾力性低下の作用はなかった。また、紫外線を照射すると酸可溶性コラーゲンが減少し、酸不溶性コラーゲンが増加し、その不溶性分画にジチロシンが増加していた。紫外線を照射した摘出皮膚のコラーゲンにもジチロシンが増加していた。ヘアレスマウスに長期間紫外線を照射した光老化モデル皮膚でｉｎ ｖｉｖｏでも調べた結果、酢酸可溶性コラーゲンが減少し、不溶性コラーゲンが増加し、ジチロシンも増加していた。
【００１９】
３２０ｎｍ付近の紫外線によってコラーゲン中にジチロシンが形成されることによって、コラーゲンの弾力性が低下し、光老化皮膚に特徴的な弾力性低下を引き起こすことがわかった。また、日本の紫外線防止化粧品に表示されているＰＡ（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｇｒａｄｅ ｏｆ ＵＶＡ）は持続型即時黒化を指標にしたＵＶＡ防止効果ＰＦＡ（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ＵＶＡ）に基づき設定されているが、紫外線が引き起こすコラーゲン弾力性低下スペクトルと持続型即時黒化スペクトルは異なるので、持続型即時黒化を指標にしたＰＡ表示では紫外線が引き起こす皮膚のコラーゲンへの悪影響に対する防止効果、すなわちシワ防止効果を推察することはできない。
【００２０】
コラーゲンゲルに紫外線防止製品を直接または間接に塗布してから紫外線を照射して硬度または弾力性を測定してＵＶＡにより引き起こされるシワを評価する方法を鋭意研究して開発した。また、その結果に基づき紫外線（ＵＶＢとＵＶＡ）、特にＵＶＡにより引き起こされるシワに対する防止効果を短期間で簡便に評価する優れた方法を開発した。さらに、コラーゲンゲルに紫外線を照射したときの酢酸可溶性やジチロシンを測定しても同様に評価できる方法も開発した。
【００２１】
紫外線によってコラーゲン中にジチロシンが増加するにつれて、皮膚の弾力がなくなり、しわやたるみが増加して、皮膚の光老化が進行する。本発明は、コラーゲンゲルや摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止化粧品または紫外線防止製品を直接または間接に塗布してから硬度および／または弾力性を測定して、その結果に基づき紫外線（ＵＶＢとＵＶＡ）、特にＵＶＡにより引き起こされるシワに対する防止効果を定量できることを確認して、産業界の要請に対応する紫外線防止製品の評価方法とその評価結果に基づく表示方法を提供することにより上記の課題を解決することが可能であることを見出した。したがって、以下に示す発明を提供することができる。
【００２２】
請求項１において、コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際の硬度および／または弾力性を測定して、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果を評価する方法を提供する。
【００２３】
請求項２において、コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際の硬度および／または弾力性を測定することによる、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果の評価結果に基づき、紫外線によるコラーゲンの弾力性低下すなわち紫外線によるシワに対する防止効果を表示することを特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤を提供する。
【００２４】
請求項３において、コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際の硬度および／または弾力性を測定することによる、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果の評価結果に基づき、シワに対する防止効果を特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤を提供する。
【００２５】
請求項４において、コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際のジチロシンおよび／または酸不溶性コラーゲンを測定して、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果を評価する方法を提供する。
【００２６】
請求項５において、コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際のジチロシンおよび／または酸不溶性コラーゲンを測定することによる、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果の評価結果に基づき、紫外線によるコラーゲンの弾力性低下すなわち紫外線によるシワに対する防止効果を表示することを特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤を提供する。
【００２７】
請求項６において、コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際のジチロシンおよび／または酸不溶性コラーゲンを測定することによる、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果の評価結果に基づき、シワに対する防止効果を特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤を提供する。
【００２８】
請求項７において、紫外線防止製品または紫外線防止成分を塗布していない測定値と紫外線防止製品または紫外線防止成分を塗布した測定値との間の差、または紫外線防止製品または紫外線防止成分を塗布していない測定値の紫外線防止製品または紫外線防止成分を塗布した測定値に対する倍数から、この紫外線防止製品または紫外線防止成分の紫外線によるコラーゲンの弾力性低下すなわち紫外線によるシワに対する防止効果（指数）を求め、数値および／または記号および／または字句で表示することを特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明の実施の形態について説明する。本発明で用いられる機器類を以下に記す。紫外線照射装置としてクリニカル・サプライ株式会社製ＤＥＲＭＡＲＡＹ２００、浜松ホトニクス株式会社製ＬＩＧＨＴ ＴＨＩＮＧ ＣＵＲＥ ＬＣ６（１５０Ｗキセノンランプ Ｌ８２５３）を用いた。なお、紫外線照射に用いる機器は紫外線を放射する機器であれば、上記に挙げた機器に限定されるものではなく、太陽光シミュレーター等の他機器が利用可能である。
【００３０】
硬度計、弾力計としてインテグラル株式会社製Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＡ５８０、サン科学株式会社製ＲＨＥＯＴＥＸ ＳＤ−７００、ヤマキ電気株式会社モデラスを用いた。なお、測定に用いる機器は弾力性、硬度を測定する機器であれば、上記に挙げた機器に限定されるものではなく、利用可能である。
【００３１】
Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＡ５８０（陰圧吸引法）はプローブを皮表に押し当て、その内圧を減じて皮膚を隆起させ、その皮膚高の変位量を０．０１ｍｍ単位で測定することができ、急激な減圧、急激な解放を繰り返して変位の量を調べる機器である。一定陰圧で皮膚を吸引した時の吸引高さ（Ｕｆ）と、圧を解除した時の皮膚の戻り率（Ｕｒ，Ｕａ）により、皮膚の硬さと弾力性が測定できる。紫外線を長期間浴びた光老化部位では、被覆正常部に比べて、グラフの高さが低く、また、最高値から最低値までの差が小さく、光老化部位は皮膚の硬さが硬く、弾力性が低い。Ｕｒ／Ｕｆは瞬発的な戻り率、Ｕａ／Ｕｆは総合的な戻り率を表している。
【００３２】
ＲＨＥＯＴＥＸ ＳＤ−７００は、ゼリー、寒天、果物等の食品を初め、医薬品、化粧品、その他多くの工業製品の物理的性状を測定する。測定部位が一定の深さまで到達した時にアダプターが加える荷重によって硬さを測定することができる。
【００３３】
モデラスは、一定の外力で検体にわずかの変形（凹み）を与えて、その力を撤去した後の凹んだ検体が元に復元する応答挙動を測定し、弾性データを計算する。表面から約１．５ｍｍまでの「かたさ」を計測している。弾力の表示値は約０近くでプリン程度の柔らかさ、約１００近くで消しゴム程度のかたさを表わしている。
【００３４】
ＵＶＡ、ＵＶＢの照射は、ＤＥＲＭＡＲＡＹ２００を使用し、ＵＶＡはＦＬ２０Ｓ・ＢＬ／ＤＭＲランプ１０本、ＵＶＢはＴＬ２０Ｗ／１２ＲＳブロードバンドＵＶＢランプ５本で、ＤＥＲＭＡＲＡＹ２００のＵＶＡ強度（３６５ｎｍ）は８．２０ｍＷ／ｃｍ２であり、ＵＶＢ強度（３０５ｎｍ）は０．５３ｍＷ／ｃｍ２であった。摘出皮膚とコラーゲンゲルと再構成皮膚に１００分間、２００分間、３００分間ＵＶＡまたはＵＶＢを照射した。未照射の摘出皮膚とコラーゲンゲルと再構成皮膚には、アルミオイルで覆った摘出皮膚とコラーゲンゲルと再構成皮膚に、１００分間、２００分間、３００分間同様に照射したものを用いた。なお、照射強度、照射エネルギー量は上記に縛られることなく、自由に設定することができる。
【００３５】
それぞれのエネルギー量は、１００分間照射すると、ＵＶＢ ３．２Ｊ／ｃｍ２、ＵＶＡ ４９Ｊ／ｃｍ２、２００分間照射すると、ＵＶＢ６．４Ｊ／ｃｍ２、ＵＶＡ ９８Ｊ／ｃｍ２、３００分間照射すると、ＵＶＢ９．６Ｊ／ｃｍ２、ＵＶＡ１４７Ｊ／ｃｍ２であった。本照射量は真夏に１日２時間日光を浴びたとすると、紫外線の被曝量は、ＵＶＢ量が０．７５Ｊ／ｃｍ２、ＵＶＡ量が１５Ｊ／ｃｍ２であり、角層で５０％減弱され、さらに真皮に到達するのは、浴びた紫外線量の５％と考えると、真夏に１日２時間日光浴びたとすると、真皮には、ＵＶＢ量が０．０１８７５Ｊ／ｃｍ２、ＵＶＡ量が０．３７５Ｊ／ｃｍ２と推定される。１日２時間の日光を夏期に３０日間を４年間浴びたとすると、真皮には、ＵＶＢ量が２．２５Ｊ／ｃｍ２、ＵＶＡ量が４５Ｊ／ｃｍ２と算出される。１日２時間の日光を夏期に３０日間を８年間浴びたとすると、真皮には、ＵＶＢ量が４．５Ｊ／ｃｍ２、ＵＶＡ量が９０Ｊ／ｃｍ２と算出される。１日２時間の日光を夏期に３０日間を１２年間浴びたとすると、真皮には、ＵＶＢ量が６．７５Ｊ／ｃｍ２、ＵＶＡ量が１３５Ｊ／ｃｍ２と算出される。これらの算出結果をもとに、照射量を決定した。
【００３６】
摘出皮膚の硬さと弾力性の測定には、１ｃｍ×１ｃｍにカットした摘出した皮膚を用いた。ディッシュに摘出皮膚を置き、ＰＢＳを真皮が浸るぐらいまで入れ、ＤＥＲＭＡＲＡＹ２００でＵＶＡを４９Ｊ／ｃｍ２、１４７Ｊ／ｃｍ２照射した。ＵＶＢも同様に３．２Ｊ／ｃｍ２、９．６Ｊ／ｃｍ２照射した。Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＡ５８０（測定条件はＰｒｅｓｓｕｒｅ：３８０ｍｂａｒ、Ｐｒｏｂｅ ａｐｅｒｔｕｒｅ：２ｍｍ、ｏｎ−ｔｉｍｅ：２ｓｅｃｏｎｄｓ、ｏｆｆ−ｔｉｍｅ：３ｓｅｃｏｎｄｓ、ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎｓ：３、ｐｒｅｔｉｍｅ：５）、ＲＨＥＯＴＥＸ ＳＤ−７００（測定条件はＤｉｓｔａｎｃｅ：１．０ｍｍ、Ｗｅｉｇｈｔ：１５ｇ）、モデラスにより硬さと弾力性を測定した。なお摘出皮膚はヒト、豚、ラット、マウス等のいずれを用いてもよく、皮膚の大きさは適当な大きさにカットして実験に用いる。
【００３７】
コラーゲンゲルの硬さと弾力性の測定には、３５ｍｍディッシュに１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、精製水、コラーゲン溶液（０．３％）を加えて作成したコラーゲンゲルを用いた。ＤＥＲＭＡＲＡＹ２００でＵＶＡを４９Ｊ／ｃｍ２、９８Ｊ／ｃｍ２、１４７Ｊ／ｃｍ２照射した。ＵＶＢも同様に３．２Ｊ／ｃｍ２、６．４Ｊ／ｃｍ２、９．６Ｊ／ｃｍ２照射した。Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＡ５８０、ＲＨＥＯＴＥＸ ＳＤ−７００、モデラスによりコラーゲンゲルの硬さと弾力性を測定した。コラーゲンの濃度は０．００１％から１００％（純粋コラーゲン）まで用いてもよい。線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルでも同様の結果を得ており、線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルを用いてもよい。コラーゲンはヒト、豚、牛、魚等から得ることができ、いずれを用いてもよい。
【００３８】
再構成皮膚の硬さと弾力性の測定には、表皮層と真皮層からなる三次元皮膚モデルを用いた。再構成皮膚にＤＥＲＭＡＲＡＹ２００でＵＶＡを４９Ｊ／ｃｍ２、９８Ｊ／ｃｍ２、１４７Ｊ／ｃｍ２照射した。ＵＶＢも同様に３．２Ｊ／ｃｍ２、６．４Ｊ／ｃｍ２、９．６Ｊ／ｃｍ２照射した。Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＡ５８０、ＲＨＥＯＴＥＸ ＳＤ−７００、モデラスにより再構成皮膚の硬さと弾力性を測定した。再構成皮膚は自作の三次元皮膚モデルを用いても市販の三次元皮膚モデルを用いてもよい。
【００３９】
シワ防止製品の効果を、シワ防止製品を塗布したコラーゲンゲルにＵＶＡとＵＶＢを照射して調べた。３５ｍｍディッシュに１０倍濃度のＰＢＳ、ＮａＨＣＯ３、精製水、コラーゲン溶液（０．３％）を加え、コラーゲンゲルを作成した。ＵＶＡを４９Ｊ／ｃｍ２、９８Ｊ／ｃｍ２、１４７Ｊ／ｃｍ２照射し、Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＡ５８０、ＲＨＥＯＴＥＸ ＳＤ−７００、モデラスを用いて、シワ防止製品を塗布したコラーゲンゲルの硬さと弾力性を測定し、シワ防止製品を塗布していないコラーゲンゲルの硬さと弾力性と比較した。評価は摘出皮膚と再構成皮膚を用いても同様にできる。摘出皮膚とコラーゲンゲルと再構成皮膚へのシワ防止製品の塗布方法は、直接またはラップや石英板等の紫外線透過性のフィルムを通して間接に行うこともできるし、紫外線吸収成分を添加したコラーゲンゲルを用いてもよい。また、塗布量は２ｍｇ／ｃｍ２または２μＬ／ｃｍ２としたが、０．１ｍｇ／ｃｍ２〜２０ｍｇ／ｃｍ２または０．１μＬ／ｃｍ２〜２０μＬ／ｃｍ２の範囲で任意に設定してもよい。
【００４０】
ＵＶＡを照射したコラーゲンゲルの酢酸可溶性と酢酸不溶性の測定方法について記す。ＵＶＡを照射（１４７Ｊ／ｃｍ２）したコラーゲンゲルと未照射のコラーゲンゲルを５ｍｍデルマパンチで５個ずつ採取した。０．５Ｍ酢酸を入れ、酢酸可溶性コラーゲンと酢酸不溶性コラーゲンに分け、遠心型濃縮機で水分を除去後、６Ｍ塩酸で加水分解した。塩酸処理液２００μＬを２Ｍ ＮａＯＨ ３００μＬでｐＨ２に調製した。ＵＶＡを照射したコラーゲンゲルの酢酸不溶性分画の塩酸加水分解物、ＵＶＡを照射したコラーゲンゲルの酢酸可溶性分画の塩酸加水分解物、未照射のコラーゲンゲルの酢酸可溶性分画の塩酸加水分解物の蛍光強度を高速液体クロマトグラフィーで測定した。測定条件は、カラムにＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０（Ｃ１８カラム）４．６ｍｍｘ２５０ｍｍ、５μｍを使用し、流量を０．８ｍＬ／ｍｉｎ、注入量を５μＬとした。検出波長を吸光度２１０ｎｍ、蛍光強度 Ｅｘ：２８３ｎｍ、Ｅｍ：４１５ｎｍとした。移動相については、移動相Ａを０．５％酢酸、移動相Ｂをメタノールとし、Ａ：Ｂ＝９６：４とした。なお、不溶性コラーゲンの測定法については、上記に挙げた方法・測定条件に限定されるものではなく、その他の酸やグアニジン塩酸塩、尿素等のタンパク質可溶化剤が利用可能である。また、蛍光測定については、上記に挙げた方法・波長・測定条件に限定されるものではない。さらに、酸不溶性コラーゲン量と酸可溶性コラーゲン量は、分光光度計やマイクロプレートリーダーを用いて吸収度やアミノ酸量を測定したり、塩酸加水分解前の重量・タンパク質量や吸収度・蛍光強度を測定したりして比較することもできる。
【００４１】
コラーゲンゲル中のジチロシン（チロシンダイマー）の測定方法について記す。ＵＶＡを照射（１４７Ｊ／ｃｍ２）したコラーゲンゲルと未照射のコラーゲンゲルを５ｍｍデルマパンチで５個ずつ採取し、６Ｍの塩酸で加水分解（１１０℃、２４時間）した。一方、Ｌ−チロシンを精製水で希釈して０．０１ｍｇ／ｍＬのチロシン水溶液にＵＶＡを照射（１４７Ｊ／ｃｍ２）した。ジチロシンは、チロシンにホースラディッシュペルオキシダーゼと過酸化水素水を反応させて合成した。すなわち、０．２Ｍのホウ酸塩バッファ（ｐＨ９．５）５０ｍＬ中に１５μｇ／ｍＬのホースラディッシュペルオキシダーゼ、５．２５ｍＭ過酸化水素、５ｍＭのＬ−チロシンを溶解し、３７℃で反応させた。塩酸で中和後、Ｃ１８カートリッジでジチロシンを吸着させ、未反応のチロシンとホースラディッシュペルオキシダーゼ、過酸化水素を２ｍＬの精製水で洗浄して除去した。ジチロシンは５ｍＬの２０％のメタノールで溶出した。ジチロシン溶液とＵＶＡを照射したチロシン溶液、ＵＶＡを照射したコラーゲンゲルの塩酸加水分解物、ＵＶＡ未照射のコラーゲンゲルの塩酸加水分解物のジチロシン量を高速液体クロマトグラフィーで測定した。測定条件は、カラムはＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０（Ｃ１８カラム）４．６ｍｍｘ２５０ｍｍ、５μｍを使用し、流量を０．８ｍＬ／ｍｉｎ、注入量を５μＬとした。検出波長を吸光度 ２１０ｎｍ、蛍光強度 Ｅｘ：２８３ｎｍ、Ｅｍ：４１５ｎｍとした。移動相については、移動相Ａを０．５％酢酸、移動相Ｂをメタノールとし、Ａ：Ｂ＝９６：４とした。なお、チロシンダイマーの測定法については、上記に挙げた方法・測定条件に限定されるものではなく、その他の波長での蛍光測定方法や抗ジチロシン抗体等のチロシンダイマーに対する抗体を用いた免疫学的測定方法が利用可能である。
【発明の効果】
【００４２】
コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射して硬度および／または弾力性を測定する方法は、短期間で簡便に紫外線（ＵＶＢとＵＶＡ）により引き起こされるシワに対する防止効果を評価することができ、その結果に基づき紫外線（ＵＶＢとＵＶＡ）、特にＵＶＡにより引き起こされるシワに対する防止効果を表示することができることを特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤を提供することができる。紫外線防止製品または紫外線防止成分のみならず、メーキャップ化粧品、スキンケア化粧品、ヘアケア・ボディケア化粧品、ボディソープ、ハンドソープ、クレンジング材、乳液、化粧水、美容液、パック、洗顔フォーム、固形石鹸、液体石鹸、クリーム状石鹸、シャンプー、リンス、シェービングクリーム等の化粧品、医薬部外品、医薬品に広く使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明において、評価され得る化粧水、乳液、クリーム、ファンデーション等の剤型のシワ防止製品ならびに紫外線防止成分は、本発明評価系において調べることが可能な限り特に限定されない。よって、以下に紫外線防止成分を列挙するが、これらの紫外線防止成分に本発明で用いられる化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤に配合可能な紫外線防止成分が限定されるものでないことは勿論である。
【００４４】
すなわち、サリチル酸ホモメンチル、２−シアノ−３，３−ジフェニルプロパ−２−エン酸２−エチルヘキシエステル（別名オクトクリレン）、ジパラメトキシケイ皮酸モノ−２−エチルヘキサン酸グリセリル、パラアミノ安息香酸及びそのエステル、４−ｔｅｒｔ−ブチル−４‘−メトキシジベンゾイルメタン（表示名称ｔ−ブチルジベンゾイルメタン）、４−（２−β−グルコピラノシロキサン）プロポキシ−２−ヒドロキシベンゾフェノン、サリチル酸オクチル、２，５−ジイソプロピルケイ皮酸メチル、２−［４−（ジエチルアミノ）−２−ヒドロキシベンゾイル］安息香酸ヘキシルエステル、シノキサート、ジヒドロキシジメトキシベンゾフェノン、ジヒドロキシジメトキシベンゾフェノンジスルホン酸ナトリウム、ジヒドロキシベンゾフェノン、ジメチルジエチルベンザルマロネート、１−（３，４−ジメトキシフェニル）−４，４−ジメチル−１，３−ペンタンジオン、ジメトキシベンジリデンジオキソイミダゾリジンプロピオン酸２−エチルヘキシル、テトラヒドロキシベンゾフェノン、テレフタリリデンジカンフルスルホン酸、２，４，６−トリス［４−（２−エチルヘキシルオキシカルボニル）アニリノ］−１，３，５−トリアジン、トリメトキシケイ皮酸メチルビス（トリメチルシロキシ）シリルイソペンチル、ドロメトリゾールトリシロキサン、パラジメチルアミノ安息香酸アミル、パラジメチルアミノ安息香酸２−エチルヘキシル（表示名称ジメチルＰＡＢＡエチルヘキシル）、パラメトキシケイ皮酸イソプロピル・ジイソプロピルケイ皮酸エステル混合物、パラメトキシケイ皮酸２−エチルヘキシル（表示名称メトキシケイヒ酸エチルヘキシル）、２，４−ビス−［｛４−（２−エチルヘキシルオキシ）−２−ヒドロキシ｝−フェニル］−６−（４−メトキシフェニル）１，３，５−トリアジン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（表示名称オキシベンゾン−３）、ヒドロキシメトキシベンゾフェノンスルホン酸及びその三水塩（表示名称オキシベンゾン−４）、ヒドロキシメトキシベンゾフェノンスルホン酸ナトリウム、フェニルベンズイミダゾールスルホン酸、フェルラ酸、２，２’−メチレンビス（６−（２Ｈ−ベンゾトリアゾール−２−イル）−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノール）、チノソープＳ、メギゾリルＸＬ、メギゾリルＳＸ等を挙げることができる。
【００４５】
さらに、紫外線散乱成分として、酸化チタン、被覆酸化チタン、微粒子酸化チタン、酸化亜鉛、被覆酸化亜鉛、微粒子酸化亜鉛、酸化鉄、酸化セリウム、リン酸セリウム、アロフェン、メソポーラスシリカ等を挙げることができる。酸化チタンと酸化亜鉛の被覆材としてシリカや水酸化アルミニウム、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、酸化アルミ、ステアリン酸、界面活性剤、シラン化合物、酸化ジルコニウム等が挙げられる。
【００４６】
以下、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４７】
摘出した豚皮膚を１ｃｍ×１ｃｍにカットした。摘出皮膚を１０個用意し、例数５で以下に記した評価を行い、平均値と標準偏差を求めた。ファンデーションを塗布した摘出皮膚と塗布していない摘出皮膚をディッシュに置き、ＰＢＳを真皮が浸るぐらいまで入れた。塗布量は２ｍｇ／ｃｍ２とした。Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＡ５８０を用いて真皮の硬さ（Ｕｆ； 値が低いほうが硬い）を測定した後に、ＤＥＲＭＡＲＡＹ２００を用いてＵＶＡを１５０Ｊ／ｃｍ２照射した。照射後にもう一度Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＡ５８０を用いて真皮の硬さ（Ｕｆ）を測定した。その結果、照射前のファンデーションを塗布していない摘出皮膚の硬さ（Ｕｆ）は０．３５±０．０１、照射後のファンデーションを塗布していない摘出皮膚の硬さ（Ｕｆ）は０．１５±０．０１であった。照射前のファンデーションを塗布した摘出皮膚の硬さ（Ｕｆ）は０．３５±０．０１、照射後のファンデーションを塗布した摘出皮膚の硬さ（Ｕｆ）は０．３３±０．０１であった。ファンデーションを塗布した摘出皮膚の硬さ（Ｕｆ）は塗布していない摘出皮膚の硬さ（Ｕｆ）に比べて有意に低く、ＵＶＡにより引き起こされるコラーゲンの弾力性低下（シワ）に対する防止効果を示した。また、ファンデーションを塗布していない摘出皮膚とファンデーションを塗布した摘出皮膚について、照射後の硬さ（Ｕｆ）と照射前の硬さ（Ｕｆ）の差（０．２０、０．０２）を求め、それを照射前の硬さ（Ｕｆ）で除した値（０．５７、０．０６）から、ファンデーションの効果を算出した。この場合、ファンデーションを塗布していない摘出皮膚の値（０．５７）は、ファンデーションを塗布した摘出皮膚の値（０．０６）の６．３倍なので、このファンデーションのＵＶＡにより引き起こされるシワに対する防止効果（指数）は９．５となる。また、数値を記号表示すると、例えば、１．５〜３．９を＋または☆、４．０〜６．９を＋＋または☆☆、７．０〜９．９を＋＋＋または☆☆☆、１０．０〜を＋＋＋＋または☆☆☆☆とすると、本製品のシワに対する防止効果（指数）は、＋＋＋または☆☆☆となる。さらに、数値を字句で表示すると、例えば、１．５〜３．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果が弱い。Ｗｅａｋ」、４．０〜６．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果がある。Ｍｏｄｅｒａｔｅ」、７．０〜９．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果が強い。Ｓｔｒｏｎｇ」、１０．０〜を「紫外線によるシワを防ぐ効果が非常に強い。Ｖｅｒｙ ｓｔｒｏｎｇ」とすると、本製品のシワに対する防止効果は、「紫外線によるシワを防ぐ効果が強い。Ｓｔｒｏｎｇ」となる。
【実施例２】
【００４８】
コラーゲンゲルを８個用意し、例数４で以下に記した評価を行い、平均値と標準偏差を求めた。紫外線防止化粧品を塗布したコラーゲンゲルと塗布していないコラーゲンゲルについて、ＲＨＥＯＴＥＸ ＳＤ−７００を用いて硬度を測定した後に、ＤＥＲＭＡＲＡＹ２００でＵＶＡを１００Ｊ／ｃｍ２照射した。塗布量は２ｍｇ／ｃｍ２とした。照射後にもう一度ＲＨＥＯＴＥＸ ＳＤ−７００を用いてコラーゲンゲルの硬度を測定した。その結果、照射前の紫外線防止化粧品を塗布していないコラーゲンゲルの硬度は３．２±０．１に対し、照射後の紫外線防止化粧品を塗布していないコラーゲンゲルの硬度は、６．４±０．２であり、照射前の紫外線防止化粧品を塗布したコラーゲンゲルの硬度は、３．３±０．１、照射後の紫外線防止化粧品を塗布したコラーゲンゲルの硬度は４．１±０．１であった。紫外線防止化粧品を塗布したコラーゲンゲルの硬度は塗布していないコラーゲンゲルの硬度に比べて有意に低く、ＵＶＡにより引き起こされるコラーゲンの弾力性低下（シワ）に対する防止効果を示した。また、紫外線防止化粧品を塗布していないコラーゲンゲルと紫外線防止化粧品を塗布したコラーゲンゲルについて、照射後の硬度と照射前の硬度の差（３．２、０．８）を求め、それを照射前の硬度で除した値（１．０、０．２４）から、紫外線防止化粧品の効果を算出した。この場合、紫外線防止化粧品を塗布していないコラーゲンゲルの値（１．０）は、紫外線防止化粧品を塗布したコラーゲンゲルの値（０．２４）の４．２倍なので、この紫外線防止化粧品のＵＶＡにより引き起こされるシワに対する防止効果（指数）は、４．２となる。また、数値を記号表示すると、例えば、１．５〜３．９を＋または☆、４．０〜６．９を＋＋または☆☆、７．０〜９．９を＋＋＋または☆☆☆、１０．０〜を＋＋＋＋または☆☆☆☆とすると、本製品のシワに対する防止効果（指数）は、＋＋または☆☆となる。さらに、数値を字句で表示すると、例えば、１．５〜３．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果が弱い。Ｗｅａｋ」、４．０〜６．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果がある。Ｍｏｄｅｒａｔｅ」、７．０〜９．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果が強い。Ｓｔｒｏｎｇ」、１０．０〜を「紫外線によるシワを防ぐ効果が非常に強い。Ｖｅｒｙ ｓｔｒｏｎｇ」とすると、本製品のシワに対する防止効果は、「紫外線によるシワを防ぐ効果がある。Ｍｏｄｅｒａｔｅ」となる。
【実施例３】
【００４９】
再構成皮膚を６個用意し、例数３で以下に記した評価を行い、平均値と標準偏差を求めた。乳液（医薬部外品）を塗布した再構成皮膚と塗布していない再構成皮膚をディッシュに置き、ＰＢＳを真皮モデルが浸るぐらいまで入れた。塗布量は２ｍｇ／ｃｍ２とした。Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＡ５８０を用いて弾力性（Ｕｒ／Ｕｆ）を測定した後に、ＤＥＲＭＡＲＡＹ２００でＵＶＡを５０Ｊ／ｃｍ２照射した。照射後にもう一度Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＡ５８０を用いて弾力性（Ｕｒ／Ｕｆ）を測定した。その結果、照射前の乳液（医薬部外品）を塗布していない再構成皮膚の弾力性（Ｕｒ／Ｕｆ）は、０．６７±０．０３、照射後の乳液（医薬部外品）を塗布していない再構成皮膚の弾力性（Ｕｒ／Ｕｆ）は０．４８±０．０２であった。照射前の乳液（医薬部外品）を塗布した再構成皮膚の弾力性（Ｕｒ／Ｕｆ）は０．６８±０．０１、照射後の乳液（医薬部外品）を塗布した再構成皮膚の弾力性（Ｕｒ／Ｕｆ）は０．５７±０．０２であった。乳液（医薬部外品）を塗布した再構成皮膚の弾力性（Ｕｒ／Ｕｆ）は、塗布していない再構成皮膚の弾力性（Ｕｒ／Ｕｆ）に比べて有意に高く、ＵＶＡにより引き起こされるコラーゲンの弾力性低下（シワ）に対する防止効果を示した。また、乳液（医薬部外品）を塗布していない再構成皮膚と乳液（医薬部外品）を塗布した再構成皮膚について、照射後の弾力性（Ｕｒ／Ｕｆ）と照射前の弾力性（Ｕｒ／Ｕｆ）の差（０．１９、０．１１）を求め、それを照射前の弾力性（Ｕｒ／Ｕｆ）で除した値（０．２８、０．１６）から、乳液（医薬部外品）の効果を算出した。この場合、乳液（医薬部外品）を塗布していない再構成皮膚の値（０．２８）は乳液（医薬部外品）を塗布した再構成皮膚の値（０．１６）の１．８倍なのでは、この乳液（医薬部外品）のＵＶＡにより引き起こされるシワに対する防止効果（指数）は、１．８となる。また、数値を記号表示すると、例えば、１．５〜３．９を＋または☆、４．０〜６．９を＋＋または☆☆、７．０〜９．９を＋＋＋または☆☆☆、１０．０〜を＋＋＋＋または☆☆☆☆とすると、本製品のシワに対する防止効果（指数）は、＋または☆となる。さらに、数値を字句で表示すると、例えば、１．５〜３．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果が弱い。Ｗｅａｋ」、４．０〜６．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果がある。Ｍｏｄｅｒａｔｅ」、７．０〜９．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果が強い。Ｓｔｒｏｎｇ」、１０．０〜を「紫外線によるシワを防ぐ効果が非常に強い。Ｖｅｒｙ ｓｔｒｏｎｇ」とすると、本製品のシワに対する防止効果は、「紫外線によるシワを防ぐ効果が弱い。Ｗｅａｋ」となる。
【実施例４】
【００５０】
線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルを８個用意し、例数４で以下に記した評価を行い、平均値と標準偏差を求めた。紫外線防止成分を塗布した線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルと塗布していない線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルについて、モデラスを用いて硬度を測定した後に、ＤＥＲＭＡＲＡＹ２００でＵＶＡを２０Ｊ／ｃｍ２照射した。塗布量は２ｍｇ／ｃｍ２とした。照射後にもう一度モデラスを用いて硬度を測定した。その結果、照射前の紫外線防止成分を塗布していない線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルの硬度は、３．１±０．４、照射後の紫外線防止成分を塗布していない線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルの硬度は、１０．５±０．９であった。照射前の紫外線防止成分を塗布した線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルの硬度は３．０±０．３、照射後の紫外線防止成分を塗布した線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルの硬度は４．５±０．６であった。紫外線防止成分を塗布した線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルの硬度は塗布していない線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルの硬度に比べて有意に低く、ＵＶＡにより引き起こされるコラーゲンの弾力性低下（シワ）に対する防止効果を示した。また、紫外線防止成分を塗布していない線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルと紫外線防止成分を塗布した線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルについて、照射後の硬度と照射前の硬度の差（７．４、１．５）を求め、それを照射前の硬度で除した値（２．４、０．５）から、紫外線防止成分の効果を算出した。この場合、紫外線防止成分を塗布していない線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルの値（２．４）は紫外線防止成分を塗布した線維芽細胞を培養したコラーゲンゲルの値（０．５）の４．８倍なのでは、この紫外線防止成分のＵＶＡにより引き起こされるシワに対する防止効果（指数）は４．８となる。また、数値を記号表示すると、例えば、１．５〜３．９を＋または☆、４．０〜６．９を＋＋または☆☆、７．０〜９．９を＋＋＋または☆☆☆、１０．０〜を＋＋＋＋または☆☆☆☆とすると、本製品のシワに対する防止効果（指数）は、＋＋または☆☆となる。さらに、数値を字句で表示すると、例えば、１．５〜３．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果が弱い。Ｗｅａｋ」、４．０〜６．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果がある。Ｍｏｄｅｒａｔｅ」、７．０〜９．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果が強い。Ｓｔｒｏｎｇ」、１０．０〜を「紫外線によるシワを防ぐ効果が非常に強い。Ｖｅｒｙ ｓｔｒｏｎｇ」とすると、本製品のシワに対する防止効果は、「紫外線によるシワを防ぐ効果がある。Ｍｏｄｅｒａｔｅ」となる。
【実施例５】
【００５１】
コラーゲンゲルを８個用意し、例数４で以下に記した評価を行い、平均値と標準偏差を求めた。サンスクリーンを塗布したコラーゲンゲルと塗布していないコラーゲンゲルにＵＶＡを４００Ｊ／ｃｍ２照射した。塗布量は２ｍｇ／ｃｍ２とした。照射後にＨＰＬＣを用いてジチロシン量を測定した。その結果、照射後のサンスクリーンを塗布していないコラーゲンゲルのジチロシン量は２．１±０．２であり、照射後のサンスクリーン品を塗布したコラーゲンゲルのジチロシン量は０．２±０．１であった。サンスクリーンを塗布したコラーゲンゲルのジチロシン量は塗布していないコラーゲンゲルのジチロシン量に比べて有意に低く、ＵＶＡにより引き起こされるコラーゲンの弾力性低下（シワ）に対する防止効果を示した。また、サンスクリーンを塗布していないコラーゲンゲルと塗布したコラーゲンゲルのジチロシン量から、サンスクリーンの効果を算出した。この場合、サンスクリーンしていないコラーゲンゲルの値（２．１）はサンスクリーンを塗布したコラーゲンゲルの値は（０．２）の１０．５倍なのでは、このサンスクリーンをＵＶＡにより引き起こされるシワに対する防止効果（指数）は、１０．５となる。また、数値を記号表示すると、例えば、１．５〜３．９を＋または☆、４．０〜６．９を＋＋または☆☆、７．０〜９．９を＋＋＋または☆☆☆、１０．０〜を＋＋＋＋または☆☆☆☆とすると、本製品のシワに対する防止効果（指数）は、＋＋＋＋または☆☆☆☆となる。さらに、数値を字句で表示すると、例えば、１．５〜３．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果が弱い。Ｗｅａｋ」、４．０〜６．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果がある。Ｍｏｄｅｒａｔｅ」、７．０〜９．９を「紫外線によるシワを防ぐ効果が強い。Ｓｔｒｏｎｇ」、１０．０〜を「紫外線によるシワを防ぐ効果が非常に強い。Ｖｅｒｙ ｓｔｒｏｎｇ」とすると、本製品のシワに対する防止効果は、「紫外線によるシワを防ぐ効果が非常に強い。Ｖｅｒｙ ｓｔｒｏｎｇ」となる。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明により算出される効果（指数）は、紫外線によるコラーゲンの弾力性低下を短期間で簡便に知ることができ、ひいては紫外線によって引き起こされるシワに対する防止効果を的確に表示することができる優れた表示物であり、紫外線防止効果を有する紫外線防止を有する化粧品・医薬部外品・医薬品等の皮膚外用剤に用いることができる。それらの皮膚外用剤に本発明が具備する機能を付与することができる。機能を具備する方法は、特に制限されず、皮膚外用剤の容器・外箱・印刷物・タッグ・ＰＯＰ（Ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｐｕｒｃｈａｓｅ ａｄｖｅｒｔｉｓｉｎｇ）広告、宣伝等に使用することができる。
【００５３】
本発明の紫外線防止製品、紫外線防止成分の形態は、固体、液体、気体を問わず、特に制限されない。また、本発明の紫外線防止製品、紫外線防止成分の用途は、特に制限されないが、ヒトの皮膚に直接触れるもの、特に紫外線に曝露する可能性のある用品が好適である。
【００５４】
皮膚外用剤（化粧料、医薬部外品、医薬品を含む）としては、例えば、化粧水、乳液、クリーム、ファンデーション、口紅、サンスクリーン、パック、制汗剤、ボディパウダー、ベビーパウダー、浴用剤、石鹸、ボディソープ、洗顔料等の皮膚化粧料、ヘアートリートメント、ヘアリキッド、整髪料、育毛料等の頭髪化粧料などの化粧料、軟膏や貼付剤などが挙げられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際の硬度および／または弾力性を測定して、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果を評価する方法。
【請求項２】
コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際の硬度および／または弾力性を測定することによる、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果の評価結果に基づき、紫外線によるコラーゲンの弾力性低下すなわち紫外線によるシワに対する防止効果を表示することを特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤。
【請求項３】
コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際の硬度および／または弾力性を測定することによる、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果の評価結果に基づき、シワに対する防止効果を特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤。
【請求項４】
コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際のジチロシンおよび／または酸不溶性コラーゲンを測定して、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果を評価する方法。
【請求項５】
コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際のジチロシンおよび／または酸不溶性コラーゲンを測定することによる、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果の評価結果に基づき、紫外線によるコラーゲンの弾力性低下すなわち紫外線によるシワに対する防止効果を表示することを特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤。
【請求項６】
コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際のジチロシンおよび／または酸不溶性コラーゲンを測定することによる、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果の評価結果に基づき、シワに対する防止効果を特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤。
【請求項７】
紫外線防止製品または紫外線防止成分を塗布していない測定値と紫外線防止製品または紫外線防止成分を塗布した測定値との間の差、または紫外線防止製品または紫外線防止成分を塗布していない測定値の紫外線防止製品または紫外線防止成分を塗布した測定値に対する倍数から、この紫外線防止製品または紫外線防止成分の紫外線によるコラーゲンの弾力性低下すなわち紫外線によるシワに対する防止効果（指数）を求め、数値および／または記号および／または字句で表示することを特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤。
【請求項１】
コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際の硬度および／または弾力性を測定して、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果を評価する方法。
【請求項２】
コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際の硬度および／または弾力性を測定することによる、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果の評価結果に基づき、紫外線によるコラーゲンの弾力性低下すなわち紫外線によるシワに対する防止効果を表示することを特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤。
【請求項３】
コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際の硬度および／または弾力性を測定することによる、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果の評価結果に基づき、シワに対する防止効果を特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤。
【請求項４】
コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際のジチロシンおよび／または酸不溶性コラーゲンを測定して、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果を評価する方法。
【請求項５】
コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際のジチロシンおよび／または酸不溶性コラーゲンを測定することによる、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果の評価結果に基づき、紫外線によるコラーゲンの弾力性低下すなわち紫外線によるシワに対する防止効果を表示することを特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤。
【請求項６】
コラーゲンゲルおよび／または摘出皮膚および／または再構成皮膚に紫外線防止製品または紫外線防止成分を直接または間接に塗布してから紫外線を照射した際のジチロシンおよび／または酸不溶性コラーゲンを測定することによる、紫外線により引き起こされるコラーゲンの弾力性低下に対する防止効果の評価結果に基づき、シワに対する防止効果を特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤。
【請求項７】
紫外線防止製品または紫外線防止成分を塗布していない測定値と紫外線防止製品または紫外線防止成分を塗布した測定値との間の差、または紫外線防止製品または紫外線防止成分を塗布していない測定値の紫外線防止製品または紫外線防止成分を塗布した測定値に対する倍数から、この紫外線防止製品または紫外線防止成分の紫外線によるコラーゲンの弾力性低下すなわち紫外線によるシワに対する防止効果（指数）を求め、数値および／または記号および／または字句で表示することを特徴とする化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤。
【公開番号】特開２０１２−１７７６７０（Ｐ２０１２−１７７６７０Ａ）
【公開日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５７２０４（Ｐ２０１１−５７２０４）
【出願日】平成２３年２月２５日（２０１１．２．２５）
【出願人】（３１１００２７０２）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２５日（２０１１．２．２５）
【出願人】（３１１００２７０２）
【Ｆターム（参考）】
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