細胞におけるタンパク質の発現を増大させる方法
本発明は、タンパク質の核酸配列のコードおよび／または非コード領域におけるＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させることによって、細胞における、好ましくは真核細胞における該タンパク質の発現を増大させる方法に関する。さらに、本発明は、減少したＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を示す核酸配列に加えて、そのような配列から翻訳されたタンパク質に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の核酸配列のコードおよび／または非コード領域におけるＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させることによって、細胞における、好ましくは真核細胞における該タンパク質の発現を増大させる方法に関する。さらに、本発明は、減少したＲＮａｓｅ Ｌ切断部位数を示す核酸配列に加えて、そのような配列から翻訳されたタンパク質に関する。
【０００２】
一過性応答遺伝子は、細胞増殖、シグナル伝達事象、ならびに炎症性刺激、微生物、および放射線などの外因性因子に対する応答を含めた、重大な生物学的応答をレギュレーションする（Lai et al., 2006; Lal et al., 2004; Lopez de Silanes et al., 2005）。それらは、特異的配列エレメントなどのシス作用因子と、ある種のＲＮＡ結合タンパク質のようなトランス作用因子との両方によってコントロールされる。主として３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）における配列エレメントおよびＲＮＡ結合タンパク質によるモデュレーションは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の安定性およびタンパク質の翻訳に影響を及ぼすことがある。
【０００３】
かなりの数の遺伝子が、そのｍＲＮＡの３’ＵＴＲに不安定化配列エレメントを、主としてアデニル酸ウリジル酸（ＡＵ）リッチエレメント（ＡＲＥ）を有する。これらのＡＲＥは、タンパク質とｍＲＮＡとの相互作用に影響を及ぼすおそれのある不均一な群の配列クラスを含むことから、ｍＲＮＡの分解特性を左右する（Bakheet et al., 2006; Barreau et al., 2005）。細胞性ｍＲＮＡの安定化は、ＨｕＲタンパク質などのｍＲＮＡ安定化促進タンパク質の活性によって、またはジンクフィンガータンパク質であるトリステトラプロリン（ＴＴＰ）などのＲＮＡ分解促進タンパク質の不活性化によって起こる場合がある。
【０００４】
細胞性ｍＲＮＡに影響を及ぼすおそれのある、別のクラスのトランス作用因子は、普遍的細胞内酵素である、エンドリボヌクレアーゼのリボヌクレアーゼＬ（ＲＮａｓｅ Ｌ）であり、それは、以前はウイルスｍＲＮＡに特異的であると考えられていた。しかし、最近の研究は、ＲＮａｓｅ Ｌがある種の生物学的過程の一過性応答に関与する可能性があることを示した（Khabar et al., 2003a; Li et al., 2000）。ＲＮａｓｅ Ｌは、インターフェロン（ＩＦＮ）系の一部であると見なされている。ＩＦＮは、酵素オリゴアデニル酸シンターゼ（ＯＡＳ）の遺伝子発現を誘導し、それはウイルス二本鎖ＲＮＡ中間体に結合すると活性化し、短い２’−５’オリゴアデニル酸（２−５Ａ）を合成する。これらは、今度はウイルスｍＲＮＡを強力に分解するＲＮａｓｅ Ｌを活性化する。ＲＮａｓｅ Ｌは、ナノモル濃度以下のレベルの２−５Ａによって活性化され、優先的にウイルスｍＲＮＡのＵＵおよびＵＡジヌクレオチドの後でウイルスＲＮＡの１本鎖領域の切断を招く（Wrechester et al., 1981; Han et al., 2004）。さらに高いレベルでは、ＲＮａｓｅ Ｌは１８Ｓおよび２８ＳリボソームＲＮＡの切断などのより広い効果を誘導することがある（Wreschner et al., 1981）。
【０００５】
近年、選ばれた細胞性ｍＲＮＡの分解にＲＮａｓｅ Ｌが関与することが広く受け入れられるようになった（Bisbal et al., 2000; Chandrasekaran et al., 2004; Khabar et al., 2003b; Le Roy et al., 2001; Li et al., 2000）。具体的には、ＲＮａｓｅ Ｌは、ＰＫＲ ｍＲＮＡをダウンレギュレーションすることが示された（Khabar et al., 2003b）。正常細胞におけるＩＦＮ抗ウイルス応答中に、ＰＫＲ ｍＲＮＡの発現は一過性であるが、ＲＮａｓｅ Ｌ−ヌル細胞では、ｍＲＮＡの安定性増大が原因で長期動態のＰＫＲ ｍＲＮＡ発現が観察される（Khabar et al., 2003b）。その効果は、ウイルスタンパク質の合成阻害を誘導する過程である真核生物翻訳開始因子２サブユニット（ｅＩＦ２ａ）のＰＫＲ依存性リン酸化の延長を招く（Khabar et al., 2003b）。したがって、ＲＮａｓｅ Ｌは、ＰＫＲによって付与される翻訳停止が短時間であることを確実にするために、ＩＦＮ応答が一過性であることを担っている。ＲＮａｓｅ ＬがＩＦＮ応答をネガティブレギュレーションする同様の役割は、また、ＩＳＧ４３と呼ばれる４３ｋＤユビキチン特異的プロテアーゼをコードする新規なＩＦＮ活性化遺伝子がＲＮａｓｅ Ｌによってダウンレギュレーションされるという報告によって示唆されている（Li et al., 2000）。ＩＳＧ４３ ｍＲＮＡの半減期がＲＮａｓｅ Ｌ−ヌル細胞で増大することから、このレギュレーションは、ｍＲＮＡ安定性のレベルで起こる（Li et al., 2000）。ＲＮａｓｅ Ｌは、筋分化に不可欠な重要な転写因子をコードする、別の機能的に重要な細胞性ｍＲＮＡであるｍｙｏＤをダウンレギュレーションすることができる。ＲＮａｓｅ Ｌおよびその抑制因子ＲＬＩは、Ｃ２細胞系が筋芽細胞から筋管に分化する間に連続的に誘導される（Bisbal et al., 2000）。ＲＮａｓｅ Ｌの阻害または過剰発現は、ＭｙｏＤ ｍＲＮＡの半減期をそれぞれ延長または短縮する（Bisbal et al., 2000）。ＲＮａｓｅ Ｌ分子のプールがミトコンドリアに局在し、ＩＦＮ−α処置後に増大することから、ＣＹＴＢ、ＡＴＰａｓｅ ６（ＡＴＰ６）、およびチトクロームオキシダーゼＩＩ（ＣＯ）のｍＲＮＡなどのミトコンドリアｍＲＮＡのダウンレギュレーションにＲＮａｓｅ Ｌが果たす役割が、ＩＦＮの抗増殖作用のメカニズムとして提案されている（Le Roy et al., 2001）。これは、アンチセンス構築物の誘導を介してＲＮａｓｅ Ｌ活性を低下させることによって、または２−５ＡによってＲＮａｓｅ Ｌ活性を直接活性化することによって実証された（Le Roy et al., 2001）。ＲＮａｓｅ Ｌは、特に２−５Ａのレベルが限定的な条件で、非ウイルス性ｍＲＮＡに比べてウイルス、例えば脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）のｍＲＮＡに対して選択性を示す（Li et al., 1998a）。細胞性ｍＲＮＡに対するＲＮａｓｅ Ｌの効果は、特定のｍＲＮＡに大いに限定されると考えられる。というのも、この主題を扱った研究で細胞性ｍＲＮＡに対する全体的な効果が観察されないからである。さらに、上記研究のいずれによっても、細胞性ターゲットｍＲＮＡへのＲＮａｓｅ Ｌの直接結合も、ウイルスｍＲＮＡに対して示されたような配列特異性も実証されていない。したがって、非ウイルス性細胞性ｍＲＮＡに関連するＲＮａｓｅ Ｌ活性のメカニズムは、大部分が不明なままである。
【０００６】
以前にドミナントネガティブ型のＲＮａｓｅ Ｌが、アミノ酸置換または完全長タンパク質の短縮化のいずれかによって生成された。例えばドミナントネガティブＲＮａｓｅ ＬであるＺＢ１（カルボキシ末端の８９個のアミノ酸を欠如した短縮型マウスＲＮａｓｅ Ｌ）は、野生型ＲＮａｓｅ Ｌの抗ウイルス作用および抗増殖作用を阻害する（Hassel et al., 1993）。Dongら（2001）は、ＲＮａｓｅ Ｌの他の短縮化および点変異、例えばヌクレアーゼドメインにおける変異（Ｒ６６７Ａ）を記載している。
【０００７】
米国特許第６，７６２，０３８号は、トランスフェクションされた遺伝子の発現強化のために、ＲＮａｓｅ Ｌ遺伝子にホモ接合性破壊を有するマウスから作出された変異型胚性線維芽細胞系（ＭＥＦ）の使用を示唆している（Zhou et al., 1997）。しかし、発現強化の効果は、これらの特定の細胞系に限られる。さらに、新しいＲＮａｓｅ Ｌ−ヌル細胞系の創出は、非常に骨の折れる工程であって、全ての哺乳動物および／または真核生物発現系に容易に適用できるわけではない。
【０００８】
哺乳動物発現系は、治療用タンパク質および抗体の産生のための重要な手段となっており、原核生物発現系に比べて、例えばタンパク質の正しいフォールディングおよび解糖などの翻訳後修飾に関していくつかの利点を有する。しかし、多数の系においてタンパク質発現が低収率であることは、費用のかかる技術的障害となる。所望のタンパク質、例えばＧ−タンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）などの膜タンパク質、大型タンパク質、抗体、融合タンパク質、タンパク質複合体、ワクチン、および血漿タンパク質を発現させることが本質的に困難ならば、これは特に問題である。この困難の理由は、タンパク質自体の本質的な不安定性、ＡＵリッチエレメント含有ｍＲＮＡの場合のようなｍＲＮＡの本質的な不安定性、または弱いプロモーター活性であろう。
【０００９】
これらの問題に共通の解決は、ＣＭＶプロモーターなどの強力なプロモーター、およびＣＭＶのイントロンＡなどの特定種類のイントロンを含めた、そのプロモーターの上流または下流のエンハンサーエレメントを提供することによってタンパク質の発現を増大させることに焦点を当てていた。他の解決は、核および染色体の構築に重要な３００〜３０００塩基対長のＤＮＡエレメントであるクロマチンマトリックス付着領域（ＭＡＲ）を関与させた。これらのエレメントは、隣接クロマチンが導入遺伝子の発現に影響を及ぼすことを阻止し、そのことが、所望のレギュレーション性発現を示すクローンを単離する確率の増大を誘導すると提案された（米国特許第７，１２９，０６２号）。この特定のアプローチは、その効果を達成するためにいくつかの異なるベクター構築物を必要としうることから、潜在的に問題がある。これらのアプローチが利用可能であるにもかかわらず、上記のタンパク質のように、発現が困難なタンパク質のタンパク質発現をさらに増大させる必要性は、依然として存在する。
【００１０】
コドン最適化（またはコドン使用頻度最適化）は、タンパク質産生を押し上げるための、当技術分野において公知の別法である。それは、発現されるべきタンパク質をコードする核酸配列がホストによって稀に使用されるコドン（トリプレット）を有するならば、その発現レベルは最大ではないという観察に基づく。コドン最適化は、基本的にターゲット核酸配列における稀なコドンを変化させることにより、それらがホストのコドン使用頻度をより厳密に反映させることを含む。したがって、普通、最適化工程に使用される情報は、最適化されるＤＮＡまたはタンパク質配列、およびそれぞれのホストのコドン使用頻度表である（例えばヒトゲノムについては表１参照）。コドン使用頻度表は、所与の生物における特定のアミノ酸についてそれぞれの可能なコドンの相対頻度を一覧している。全ての生物におけるコドン使用頻度のバイアスの全一覧は、次のウェブサイトから見出すことができる：http://www.kazusa.or.jp/codon/。所与のホスト生物に対するコドン使用頻度のバイアスに基づいてコドンを最適化するために、いくつかのウェブベースのプログラムも利用可能である。コドン最適化は、非ヒトまたは非哺乳動物起源の遺伝子がヒトまたは他の哺乳動物ホスト細胞において発現される（またはその逆）一部の状況で成功することがある。しかし、コドン使用頻度は、タンパク質の発現レベルを左右する多数の要因のわずか一つであって、コドン最適化の効果は多くの場合に限定的である。
【００１１】
任意の生物の細胞において、好ましくは真核細胞において発現される、本質的に発現が困難なタンパク質を含めた内因性および外因性（リコンビナント）タンパク質の収率を顕著に改善する方法を提供することが、本発明の一目的であった。この方法は、時間および費用効率的であるべきであり、原核細胞および真核細胞を含めた任意の種類の生物の細胞におけるタンパク質の大規模産生を可能にするべきである。治療的に使用されるタンパク質の産生を可能にするために、使用される細胞系、リコンビナントタンパク質の特性、または外因性材料の使用などの、リコンビナントタンパク質を産生するために規制当局に認可された特徴を変更せずに、発現収率におけるこの改善を達成することが、本発明の別の目的であった。
【００１２】
本発明の目的は、タンパク質の核酸配列におけるＲＮａｓｅ Ｌ切断部位を減少させる工程を含む、細胞における、好ましくは真核細胞における該タンパク質の発現を増大させる方法によって解決される。一態様では、該細胞は原核細胞であり、別の態様では、該細胞は真核細胞である。
【００１３】
タンパク質の核酸配列は、コード領域および非コード領域、すなわちアミノ酸配列に翻訳される領域（エクソンとも呼ばれる）およびアミノ酸配列に翻訳されない領域の両方を含む。核酸配列の非コード領域は、例えば５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、およびイントロンである。これらのエレメントの全て（５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、イントロン、およびコード領域）は、遺伝子およびタンパク質の発現をコントロールすることができることから、上記方法に関するターゲットである。本発明により、ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる該工程は、コード領域または非コード領域のいずれかまたは両方における該数を減少させる。
【００１４】
一態様ではＲＮａｓｅ Ｌの該切断部位数は、（野生型核酸配列におけるＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数に比べて）少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、さらに好ましくは少なくとも５０％減少する。
【００１５】
好ましくは、該切断部位は、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドである。
【００１６】
ＲＮａｓｅ Ｌは、エンドリボヌクレアーゼであることから、ＲＮＡ（一次ＲＮＡ、すなわちスプライシングされていないＲＮＡおよびｍＲＮＡ、すなわちスプライシングされたＲＮＡ）レベルでのみ活性である。ＵＵおよびＵＡジヌクレオチドは、ＲＮＡレベルでのみ存在する。
【００１７】
しかし、該タンパク質の核酸配列におけるＲＮａｓｅ Ｌ切断部位数を減少させる該工程は、ＤＮＡレベルで行われることが好ましく、ＲＮＡ配列におけるＵＵおよびＵＡジヌクレオチドはＤＮＡ配列におけるＴＴおよびＴＡヌクレオチドに対応する。所与のＤＮＡ配列を特異的に変化させる技法は、当技術分野において周知であり、それには、非限定的に遺伝子合成、部位特異的変異誘発、制限酵素消化による欠失変異、および組換えによる変異導入が含まれる。遺伝子合成の技法は、本発明により特に好ましい。
【００１８】
本発明の一態様では、ＲＮａｓｅ Ｌ切断部位数を減少させる該工程は、該核酸配列のコード領域における該数を減少させる。
【００１９】
好ましくは、該核酸配列におけるＲＮａｓｅ Ｌ切断部位数を減少させる該工程は、該タンパク質のアミノ酸配列を変更せずに行われる。したがって、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、該工程によって変更されない。
【００２０】
ＲＮａｓｅ Ｌ切断部位数を減少させる該工程における一態様では、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを含むコドンは、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを含まない、同じアミノ酸をコードする代替コドンに交換される。
【００２１】
ＲＮａｓｅ Ｌ切断部位数を減少させる該工程における一態様では、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを含む隣接コドン対がもはやＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを含まないように、該隣接コドン対の少なくとも一つのコドンが、同じアミノ酸をコードする代替コドンに交換される。
【００２２】
好ましくは、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを含む該隣接コドン対の第一のコドンが交換される。
【００２３】
一態様では、該代替コドンは、該細胞において、好ましくは該真核細胞において、より頻繁に使用されるコドンである。
【００２４】
本発明の一態様では、ＲＮａｓｅ Ｌ切断部位数を減少させる該工程は、該核酸配列の非コード領域における該数を減少させる。
【００２５】
好ましくは、該非コード領域は５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、またはイントロンである。
【００２６】
イントロンの例には、非限定的にＣＭＶイントロン、ＳＶ４０イントロン、ウサギβグロビンイントロン（ＲＢＴＧ）、および合成イントロンが含まれる。
【００２７】
一態様では、該核酸配列の非コード領域におけるＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる該工程は、ヌクレオチドの変異、欠失、または挿入によって行われる。
【００２８】
好ましくは、該核酸配列の非コード領域におけるＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる該工程は、開始コドン（ＡＴＧ）に近接した５’ＵＴＲにおける配列のように、非コード領域における機能的に重要なエレメントを変更しないが、それは、それらが、翻訳強化配列（例えばコザック）、３’ＵＴＲにおけるポリＡシグナル（例えばＡＡＵＡＡＡまたはＡＵＵＡＡＡ）またはポリアデニル化に使用される他の必要もしくは補助配列エレメント、イントロン−エクソン接合部／境界域、スプライシングブランチポイントおよびイントロンにおけるエクソンのスプライス供与／受容部位、およびスプライス受容部位からブランチポイント終点の間のＣＴリッチ領域を有する場合があるからである。例えば、強力なポリＡシグナル下流にＵ−リッチのヌクレオチド５０個の領域があるが、それは、可能ならば変更すべきでない（Legendre and Gautheret, 2003）。
【００２９】
好ましくは、非コード領域におけるＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる該工程は、（ａ）イントロンのＧＣ含量を８０％よりも大きく、かつその長さを８０％未満に変化させること、
（ｂ）５’ＵＴＲのＧＣ含量を８０％よりも大きく変化させること、および
（ｃ）３’ＵＴＲのＧＣ含量を８０％よりも大きく、かつその長さを８０％未満に変化させること
はない。
【００３０】
一態様では、上記方法はさらに、ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる該工程の前にコドン最適化の工程を含む。
【００３１】
一態様では、上記方法はさらに、ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる該工程の後に、発現活性ＰＣＲ産物の形のまたは発現ベクターに含まれる、該タンパク質の該核酸配列を、該細胞に、好ましくは該真核細胞にトランスフェクションする工程を含む。
【００３２】
本明細書に使用される「発現活性ＰＣＲ産物」という用語は、ｃＤＮＡ、オープンリーディングフレーム、または発現ベクターに含まれる遺伝子などの関心が持たれるＤＮＡ配列の隣接配列に相補的な２個のプライマーを使用したＰＣＲ増幅によって生成されるＰＣＲ産物を表すことを意図し、ここで、結果として生じるＰＣＲ産物は、プロモーター、関心が持たれるＤＮＡ配列および終結配列を含み、ホスト細胞にトランスフェクションされた場合に、関心が持たれるＤＮＡを発現させる（Al-Zoghaibi et al., 2007も参照されたい）。
【００３３】
本発明によると、任意の発現ベクターを使用することができるけれども、真核生物／哺乳動物発現ベクターが好ましい。哺乳動物発現ベクターは、タンパク質の生物学的機能を研究するための一般に普及したツールであり、様々な種類（例えばプラスミドベクターまたはウイルスベクター）が当技術分野において公知である。適切な発現ベクターは、特定のプロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、またはイントロンに限定されない。それらは、構成的発現型、誘導型、または抑制型またはレギュレーション可能型でありうる。
【００３４】
本発明によると、プロモーターが真核生物性であり、終結部位が、ポリアデニル化シグナルを有するポリＡ配列であることが好ましい。真核生物または哺乳動物プロモーターは、当技術分野において公知であり、それらには、非限定的にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、伸長因子（ＥＦ）プロモーター、ＲＳＶプロモーター、およびニワトリβ−アクチンプロモーターが含まれる。好ましい真核生物ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長因子（ＢＧＨ）ポリ部位、成長ホルモンポリＡ、ＳＶ４０ポリＡ、およびＨＳＫポリＡである（Foecking and Hofstetter, 1986; Kobayashi et al., 1997）。真核生物ターミネーターの例は、ウシ成長因子（ＢＧＨ）ポリＡ部位、ＳＶ４０ポリＡ、ＨＳＫポリＡ、および合成ポリＡである。
【００３５】
細胞にＤＮＡ／ベクターを一過性または安定的にトランスフェクションする方法は、当技術分野において周知である。これらには、非限定的にリン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、陽イオンポリマートランスフェクション、およびリポソーム介在性トランスフェクション（例えばリポフェクション）が含まれる。リポソーム介在性トランスフェクション用の試薬は、市販されており、例えばリポフェクタミン（Invitrogen）およびポリエチレンイミン（Sigma）である。細胞は、また、ウイルストランスフェクションによって、またはウイルスコート粒子を介してトランスフェクションすることができる。本発明により細胞をトランスフェクションする別の好ましい方法は、該発現活性ＰＣＲ産物または該発現ベクターをｉｎ ｖｉｖｏマイクロインジェクションすること、および該発現活性ＰＣＲ産物または該発現ベクターを有する細胞を選択薬の助けを借りてまたは借りずに選択的に成長させることである。したがって、本発明による発現活性ＰＣＲ産物または発現ベクターは、追加的に選択マーカーを含むことがある。安定な細胞系を産生させるために、クローンは、非限定的にネオマイシン、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ゼオシン（zeocin）、ハイグロマイシン、およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）が含まれる様々な選択マーカーを使用して選択することができる。
【００３６】
上記方法の全ての適切な真核生物／哺乳動物細胞（ホスト細胞）もまた、当技術分野において周知であって、それらには、非限定的にＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、およびＣＯＳ−７細胞が含まれる。
【００３７】
一態様では、上記方法は、さらに、該細胞における、好ましくは該真核細胞における該発現活性ＰＣＲ産物または発現ベクターから該タンパク質を翻訳させる工程を含む。
【００３８】
好ましくは、該タンパク質は、レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗体、ワクチン、膜タンパク質、融合タンパク質、血漿タンパク質、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、ケモカイン、およびＧＰＣＲを含む群より選択される。
【００３９】
本発明の目的は、また、ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数が（野生型核酸配列におけるＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数に比べて）少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、さらに好ましくは少なくとも５０％減少している核酸配列によって解決される。
【００４０】
好ましくは、該核酸配列は、上記方法によって産生される。
【００４１】
好ましくは、該核酸配列は、レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗体、ワクチン、膜タンパク質、融合タンパク質、血漿タンパク質、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、ケモカイン、およびＧＰＣＲを含む群より選択されるタンパク質の核酸配列である。
【００４２】
一態様では、該核酸配列は、配列番号：２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２３、２４、２６、２８、３０〜３６、好ましくは配列番号：９、１５、１７、２３、３０〜３６より選択される配列を有する。
【００４３】
本発明の目的は、また、上記核酸を含む発現活性ＰＣＲ産物または発現ベクターによって解決される。
【００４４】
本発明の目的は、さらに、上記の発現活性ＰＣＲ産物または発現ベクターを有するホスト細胞によって解決される。
【００４５】
最終的に、本発明の目的は、また、上記方法によって産生されるタンパク質であって、レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗体、ワクチン、膜タンパク質、融合タンパク質、血漿タンパク質、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、ケモカイン、およびＧＰＣＲを含む群より選択されるタンパク質によって解決される。
【００４６】
本発明によると、「治療用タンパク質」という用語は、抗体フラグメント、免疫グロブリン鎖、重鎖および軽鎖、Ｆａｂフラグメント、酵素、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、リンホカイン、接着分子、レセプターに加えて、その誘導体またはフラグメントなどの、薬学的に関連して使用されるタンパク質を包含することが意図される。
【００４７】
本発明によると、レポータータンパク質（単独または別のタンパク質と融合したもの）は、上記方法のために特に好ましい「ターゲット」である。（非限定的に）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色シアニン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ルシフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、分泌型ホルモン、分泌型サイトカイン、β−ガラクトシダーゼ、ならびに他の蛍光および生物発光タンパク質を含めた、多数の蛍光および非蛍光レポータータンパク質がある。レポータータンパク質の選択は、使用される細胞系（内因性活性）、実験の性質（例えば遺伝子発現の動力学およびトランスフェクション効率）、および選択された検出方法に対するアッセイの適応性に依存する（Naylor 1999）。迅速な応答および変化のなどのレポーター性能を改善するために、レポータータンパク質自体のいくつかの改変、例えば不安定化エレメントの使用が探究されている（Li et al., 1998b; Zhao et al., 1995）。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および他の蛍光タンパク質は、生組織、細胞および実験動物における遺伝子発現を非侵襲的にモニタリングするためにますます普及しつつある（Naylor 1999）。したがって、ＧＦＰ（およびＥＧＦＰなどのその誘導体）、他の蛍光タンパク質（上記参照）に加えて、蛍光タンパク質を含む融合タンパク質は、本発明による方法のためになおさらに好ましい「ターゲット」タンパク質である。
【００４８】
驚くことに本発明者らは、真核生物および／または哺乳動物発現系で発現されるべきタンパク質の核酸配列におけるＲＮａｓｅ Ｌの切断部位、好ましくはＵＵおよびＵＡジヌクレオチドの数を減少させることが、該タンパク質の発現および収率の顕著な改善を招くことを見出した。一定の理論に縛られることを望むわけではないが、ＲＮａｓｅ Ｌ切断部位の減少（すなわちこれらの部位の頻度減少）が、ホスト細胞において、好ましくは真核生物ホスト細胞において内因性ＲＮａｓｅ Ｌの攻撃を受けにくい（すなわち抵抗性が高い）核酸配列、すなわち（一次ＲＮＡおよびｍＲＮＡの両方の）ＲＮＡを生じ、ｍＲＮＡの安定性増大を、したがってタンパク質の発現増大を誘導すると考えられる。
【００４９】
関係する普遍的な概念のせいで、本発明は、任意の配列に適用することができる。さらに具体的には、本発明による方法は、内因性および外因性（リコンビナント）タンパク質／遺伝子の両方に、安定的に組み込まれた遺伝子および一過性発現遺伝子の両方に、発現が困難なタンパク質／遺伝子に、ならびに少量に内因性発現されるタンパク質／遺伝子にも適用可能である。それは、原核生物および真核生物系の両方に適用することができる。本明細書に記載されたアプローチは、タンパク質産生に費やされる時間およびコストの顕著な減少を誘導することから、エリスロポエチン、成長因子、インターフェロン、インスリン、治療用および診断用抗体、ならびにタンパク質またはペプチド系ワクチンなどの生物学的製剤として使用されるタンパク質／遺伝子のさらに効率的な産生を可能にするであろう。それは、大量に発現／産生させることが非常に困難であることが証明された遺伝子／タンパク質の発現に特に有用である。例には、非限定的にＧタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）などの膜タンパク質、大型タンパク質、抗体、融合タンパク質、タンパク質複合体、ワクチン、および血漿タンパク質が含まれる。それは、また、レポータータンパク質の、例えばＧＦＰまたはルシフェラーゼなどの蛍光タンパク質の発現および性能を顕著に改善することに役立つことから、そのようなレポータータンパク質を使用する方法の感度（蛍光または発光顕微鏡法、蛍光ベースのマイクロアレイ、細胞選別など）を増大することができる。さらにこのアプローチは、（非限定的に）ハムスターＣＨＯ１およびＨＥＫ２９３を含めた細胞系などの、生物工学工業に使用される任意の細胞系に適用可能であることから、特に実践的であり、かつ簡単である。
【００５０】
以下に、本発明にしたがってＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる工程の一般的原理を説明する。
【００５１】
コード領域におけるＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチド数の減少
表２および表３は、引き起こすことのできる変化を示す。これらの改変は、所与の生物におけるそれらのコドンバイアス（コドン使用頻度）に基づきタンパク質発現のためにコドンを最適化するために使用されるコドン使用頻度表（比較のために表１参照）と全く別であることに留意することが重要である。本方法は、コドン使用頻度に基づいてではなく、ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位／ターゲット（ＵＵおよびＵＡジヌクレオチド）数を減少させるためにコドンを変化させることを対象とする。さらに、本発明による方法は、「生物依存的」ではなく、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドの数／頻度は、対応するアミノ酸配列が変更されないままである限り（表２および３参照）、任意の生物由来の任意の遺伝子（核酸配列）において減少させることができる。さらに、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチド数の減少は、また、所望の生物についての古典的コドン使用頻度最適化（例えば表１参照）と組み合わせることができ、可能性があることには、いっそうさらなる発現増大を招く。
【００５２】
表２は、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを有するコドンに加えて、それらの非ＵＵ／ＵＡ含有代替物を示す。フェニルアラニン（Ｐｈｅ）についてＵＵまたはＵＡを完全に欠如した他のコドンがないことから、フェニルアラニンをコードするＵＵＵは、ＵＵＣだけに変化させることができる。これは、ＵＡＣだけに変化させることができるチロシン（ＵＡＵ）の場合も同様である。いったん表２により変化を加えたら、表３により、ＵＵまたはＵＡを形成するジ−トリプレット、すなわちＮＮＵ ＵＮＮまたはＮＮＵ ＡＮＮ（Ｎは任意のヌクレオチドである）を変化させる。代替物が１個を超えて存在する場合は、それぞれの生物または高発現される遺伝子において最も高頻度に使用されるコドンを優先する。
【００５３】
コード領域におけるＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを減少させるための工程：
１． 表２によりコドンを変化させる。
２． 代替コドンが１個を超えて存在する場合は、所望の生物においてより高頻度に使用されるコドンを使用する（随意）。
３． 表３により、一緒になってＵＵまたはＵＡジヌクレオチドを形成するジ−トリプレット（ＮＮＵ ＵＮＮ、ＮＮＵ ＡＮＮ）の最初のコドンを変化させる。
４． １個を超える代替コドンが存在する場合は、所望の生物においてより高頻度に使用されるコドンまたは発現が最強のコドンを使用する（随意、表４および５参照）。
５． 古典的コドン使用頻度最適化（ホスト細胞生物、または高発現遺伝子において最も高頻度に使用されるコドンの一覧に基づく）を、所望により、そして好ましくはＵＵおよびＵＡ減少の前に行うことができる。
【００５４】
イントロンにおけるＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチド数の減少
イントロンにおけるＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを減少させるための工程：
１． ＵＵ／ＵＡジヌクレオチドにおける２個のヌクレオチドのうち１個または２個を変異または欠失させる：ＵＵまたはＵＡをＵＣ、ＵＧ、ＧＡ、ＣＡ、またはＴＡにする。または１個のヌクレオチドを挿入する。
２． イントロンの全ＧＣ含量は、８０％を超えるべきではなく、かつ長さはその本来の長さの８０％未満に変化させるべきではない。
３． エクソンのスプライス供与部位および受容部位ならびにブランチポイントを含めたエクソン−イントロン境界部を変化させてはならない。スプライスアクセプター部位からブランチポイント終末にわたるＣＴ−リッチ領域を破壊することを避ける。
【００５５】
５’ＵＴＲにおけるＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチド数の減少
５’ＵＴＲにおけるＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを減少させる工程：
１． ＵＵまたはＵＡをＵＣ、ＵＧ、ＧＡ、ＣＡ、またはＴＡに変異させる。
２． ５’ＵＴＲの全ＧＣ含量は、８０％を超えるべきではない。
３． コンテクスト配列はコザックなどの翻訳強化配列を有することがあるため、開始コドンＡＴＧ近くのコンテクスト配列を避ける。
【００５６】
３’ＵＴＲにおけるＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチド数の減少
３’ＵＴＲにおけるＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを減少させる工程：
１． ＵＵ／ＵＡジヌクレオチドにおける２個のヌクレオチドのうち１個または２個を変異または欠失させる：すなわちＵＵまたはＵＡからＵＣ、ＵＧ、ＧＡ、ＣＡ、またはＴＡにする。または、１個のヌクレオチドを挿入する。
２． ３’ＵＴＲの全ＧＣ含量は８０％を超えるべきではなく、かつ長さはその本来の長さの８０％未満に変化させるべきではない。
３． ＡＡＵＡＡＡまたはＡＵＵＡＡＡなどのポリＡシグナルを変化させてはならず、ポリアデニル化に使用される任意の必要または補助配列エレメントが認められる場合は、それを変更することを避ける。
【００５７】
非コード領域における可能性のある変化
１． 変異：ＮＵＵＮまたはＮＵＡＮからＮＵＳＮへ（ＳはＧまたはＣであり、Ｎは任意のヌクレオチドである）
２． 挿入：ＮＵＵＮまたはＮＵＡＮからＮＵＳＵＮまたはＮＵＳＡへ（ＳはＧまたはＣであり、Ｎは任意のヌクレオチドである）
３． 欠失：ＮＵＵＮからＮＵＳへ（ＳはＧまたはＣであり、Ｎは任意のヌクレオチドである）
４． 欠失：ＮＵＡＮからＮＡＮまたはＮＵＳへ（ＳはＧまたはＣであり、Ｎは任意のヌクレオチドである）
【００５８】
表
【００５９】
【表１】
【００６０】
【表２】
【００６１】
【表３】
【００６２】
【表４】
【００６３】
【表５】
【００６４】
これから以下の図を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】哺乳動物発現系におけるＥＧＦＰの発現に及ぼすＵＵおよびＵＡジヌクレオチドの減少の効果を野生型配列と比べて示すグラフである。
【図２】ＲＮａｓｅ Ｌの同時過剰発現を伴う哺乳動物発現系におけるＥＧＦＰの発現に及ぼすＵＵおよびＵＡジヌクレオチドの減少の効果を、野生型配列と比べて示すグラフである。
【図３】ＵＵ／ＵＡ減少型改変ＥＧＦＰ配列または野生型ＥＧＦＰ配列を有するＰＣＲ産物をトランスフェクションされた哺乳動物細胞におけるＧＦＰ蛍光を示すグラフである。
【図４】野生型または改変（すなわちＵＵ／ＡＧを減少させた）ホタルルシフェラーゼ発現ベクターのいずれかをトランスフェクションされたＨｅｋ２９３細胞におけるルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図５】野生型またはＵＵ／ＵＡ減少型ホタルルシフェラーゼ発現ベクターから生成した異なるＰＣＲ産物を、トランスフェクションされたＨｕｈ７細胞におけるルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図６】野生型またはＵＵ／ＵＡ減少型Ｂ型肝炎表面抗原発現ベクターをトランスフェクションされたＨｅｋ２９３細胞におけるＢ型肝炎表面抗原の発現を示すグラフである。
【図７】ＭＯＤＣで不安定化された野生型およびＭＯＤＣで不安定化されたＵＵ／ＵＡ減少型緑色蛍光タンパク質をトランスフェクションされたＨｅｋ２９３細胞における様々な緑色蛍光タンパク質の発現を示すグラフである。
【００６６】
これから以下の実施例を参照して本発明をさらに説明するが、それらの実施例は、例示であって、本発明の範囲を限定するつもりはない。
【００６７】
実施例１：イントロンにおけるＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドの減少
／＝スプライシング部位
下線＝コンセンサス機能的部位
太字の下線付き斜体＝ブランチポイント
【００６８】
配列番号：１： 野生型ウサギβグロビン−イントロン１（ＲＢＴＧ１）：
【００６９】
【化１】
【００７０】
配列番号：２： ＵＵ／ＵＡ減少型ＲＢＴＧ１（ＣＴリッチ領域にＵＵ／ＵＡ減少を有さず）：
【００７１】
【化２】
【００７２】
配列番号：３： ＵＵ／ＵＡ減少型ＲＢＴＧ１（ＣＴリッチ領域に最低限のＵＵ／ＵＡ減少を有する）：
【００７３】
【化３】
【００７４】
実施例２： ３’ＵＴＲにおけるＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドの減少
．＝欠失
下線＝突然変異
太字の下線付き＝ポリＡシグナル
【００７５】
配列番号：４： 野生型ＳＶ４０ ３’ＵＴＲ
【００７６】
【化４】
【００７７】
配列番号：５： ＵＵ／ＵＡ減少型ＳＶ４０ ３’ＵＴＲ
【００７８】
【化５】
【００７９】
配列番号：６： 野生型ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）３’ＵＴＲ
【００８０】
【化６】
【００８１】
配列番号：７： ＵＵ／ＵＡ減少型ＢＧＨ ３’ＵＴＲ
【００８２】
【化７】
【００８３】
実施例３： コード領域におけるＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドの減少
配列番号：８： 野生型の強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）
【００８４】
【化８】
【００８５】
配列番号：９： ＵＵ／ＵＡ減少型ＥＧＦＰ（「スーパーＧＦＰ」）
【００８６】
【化９】
【００８７】
配列番号：１０
MONTASTREA CAVERNOSA由来野生型ＧＦＰ配列
【００８８】
【化１０】
【００８９】
配列番号：１１
ＭＯＮＳＴＥＲ−ＯＭ：ＵＵ／ＵＡジヌクレオチド数を減少させることによる改変型の配列番号：１０
【００９０】
【化１１】
【００９１】
配列番号：１２
CLAVULARIA種 − 野生型配列
【００９２】
【化１２】
【００９３】
配列番号：１３
CLAVULARIA種−ＯＭ：改変（ＵＵ／ＵＡ減少）
【００９４】
【化１３】
【００９５】
配列番号：１４
ホタルルシフェラーゼ＋：野生型配列：
【００９６】
【化１４】
【００９７】
配列番号：１５
ＬＵＣ＋ＤＵ（ＳｕｐｅｒＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ）：（ＵＵ／ＵＡ減少型）
【００９８】
【化１５】
【００９９】
配列番号：１６
ホタルＬＵＣ２ルシフェラーゼ野生型：
【０１００】
【化１６】
【０１０１】
配列番号：１７
ＬＵＣ２ＯＭ：ＬＵＣ２改変ＳｕｐｅｒＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ２（ＵＵ／ＵＡ減少型）
【０１０２】
【化１７】
【０１０３】
配列番号：１８
Puntellina Plumate（ＧＦＰ）野生型：
【０１０４】
【化１８】
【０１０５】
配列番号：１９
Puntellina Plumate（ＧＦＰ）：改変配列（ＵＵ／ＵＡ減少型）
【０１０６】
【化１９】
【０１０７】
配列番号：２０
Discosoma野生型配列由来赤色蛍光タンパク質
【０１０８】
【化２０】
【０１０９】
配列番号：２１
赤色蛍光タンパク質の改変配列
【０１１０】
【化２１】
【０１１１】
配列番号：２２
Ｂ型肝炎表面抗原野生型、ａｄｒＢ型肝炎ウイルス株：
【０１１２】
【化２２】
【０１１３】
配列番号：２３
ＨＢＳＡＧＯＭ：Ｂ型肝炎表面抗原改変配列：
【０１１４】
【化２３】
【０１１５】
配列番号：２４
ＨＢＳＡＧＭ：ＨＢＳＡＧＯＭ： Ｂ型肝炎表面抗原改変配列２
【０１１６】
【化２４】
【０１１７】
この配列は、ＵＵ／ＵＡ減少およびヒト化の両方を含む。
【０１１８】
配列番号：２５
ＩＦＮ−α、ヒト
【０１１９】
【化２５】
【０１２０】
配列番号：２６
ＩＦＮ−αＯＭ：改変配列
【０１２１】
【化２６】
【０１２２】
配列番号：２７
ＣＳＦ３Ｍコロニー刺激因子野生型配列、ヒト：
【０１２３】
【化２７】
【０１２４】
配列番号：２８
ＣＳＦ３Ｍコロニー刺激因子改変配列：
【０１２５】
【化２８】
【０１２６】
配列番号：２９
ＭＯＤＣ野生型配列（マウスオルニチンデカルボキシラーゼ）
【０１２７】
【化２９】
【０１２８】
配列番号：３０
ＭＯＤＣ改変配列：
【０１２９】
【化３０】
【０１３０】
不安定化および配列改変されたレポーター：
不安定化および改変されたレポーター配列の例：
配列番号：３１
MONTASTRAEA CAVERNOSA
【０１３１】
【化３１】
ＭＯＤＣ配列は太字
【０１３２】
配列番号：３２
Clavulariidae Clavularia−ＯＭ：改変
【０１３３】
【化３２】
【０１３４】
配列番号：３３
ホタルＬＵＣ＋ＤＵ（ＳｕｐｅｒＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ）：
【０１３５】
【化３３】
【０１３６】
配列番号：３４
ホタルＬＵＣ２ＯＭ：ＬＵＣ２改変ＳｕｐｅｒＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ２
【０１３７】
【化３４】
【０１３８】
配列番号：３５
Puntellina Plumate ＧＦＰ：改変配列
【０１３９】
【化３５】
【０１４０】
配列番号：３６
赤色蛍光タンパク質の改変配列
【０１４１】
【化３６】
【０１４２】
実施例４：ＵＵ／ＵＡ減少型ＥＧＦＰのｉｎ ｖｉｖｏ分析
（１）改変ＥＧＦＰ配列は、遺伝子合成会社によってカスタム合成され、隣接するＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ部位を有するようにｐＵＣ１９ベクター中に供給した。０．１μg/ml ＢＳＡを含有する緩衝液中に１０ユニットのＳａｌＩで、１０μgのベクターを３７℃で１時間消化させ、続いてＢａｍＨＩ緩衝液中のＢａｍＨＩで３７℃でさらに１時間消化させた。消化されたＤＮＡをフェノール−クロロホルム法を用いて抽出し、続いてエタノール沈殿を行った。ＣＭＶプロモーターおよびＢＨＧ ３’ＵＴＲを有する発現ベクターを同じ制限酵素（ＳａｌＩおよびＸｂａＩ）で消化しておいたものにに合成ＥＧＦＰ−コード領域をライゲーションし、フェノール−クロロホルム抽出によって精製し、続いてエタノール沈澱を行った。発現ベクターへのＥＧＦＰ−ＤＮＡのクローニングは、以下のライゲーション反応を用いて行った：消化されたベクターＤＮＡ ３０μgを消化されたＥＧＦＰ−ＤＮＡ ９０μｇと共に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを含有する反応液１０μl中で混合した。ライゲーション産物を使用して、ＤＨ５αコンピテントE. coli細胞をトランスフォーメーションし、続いて結果として得られたコロニーを細菌培養培地中でエクスパンションさせた。Qiagenプラスミド精製キット（Qiagen, Germany）を使用してリコンビナントＤＮＡを抽出した。挿入物を有するベクターのサイズは、ゲル電気泳動を用いて検証した。野生型ＤＮＡを有するベクターに加えて、ＵＵ／ＵＡ減少型改変コード領域を有する、結果として得られた発現ベクターを機能的実験に使用して、コードされたタンパク質の発現を確認した。１０％ ＦＢＳおよび抗生物質（Invitrogen）を補充したＤＭＥＭ培地中で標準培養条件（３７℃、５％ ＣＯ２）でＨＥＫ２９３細胞を成長させた。９６ウェルプレートのウェル１個あたり２．５×１０４個の細胞に、ＥＧＦＰのＵＵ／ＵＡ減少型改変コード領域を有するベクターまたは野生型ＥＧＦＰ−ＤＮＡを有するベクター１００ngをトランスフェクションした。Lipofectamine 2000（Invitrogen）を使用して無血清培地中でトランスフェクションを５時間行い、続いて培地を血清補充培地に置換した。約２４または４８時間後に、プレートをイメージングし、ＢＤハイコンテントイメージング装置を使用して定量した。定量は、Proxcellイメージングアルゴリズムを用いて行った。
【０１４３】
データは、ＥＧＦＰのＵＵ／ＵＡ減少型コード領域の使用が、野生型ＥＧＦＰ−ＤＮＡに比べて真核細胞におけるＥＧＦＰの有意に高い発現（２．５〜３倍）を可能にすることを明らかに示している（図１）。
【０１４４】
（２）１０％ ＦＢＳおよび抗生物質（Invitrogen）を補充したＤＭＥＭ培地中で標準培養条件（３７℃、５％ ＣＯ２）でＨＥＫ２９３細胞を成長させた。９６ウェルプレートのウェル１個あたり２．５×１０４個の細胞に、ＥＧＦＰのＵＵ／ＵＡ減少型改変コード領域を有するベクターまたは野生型ＥＧＦＰ−ＤＮＡを有するベクター１００ngをトランスフェクションした。また細胞に、空の対照ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）またはＲＮａｓｅ Ｌベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）のいずれかを同時トランスフェクションした。トランスフェクションは、Lipofectamine 2000（Invitrogen）を用いて無血清培地中で５時間行い、続いて培地を血清補充培地と置換した。約２４または４８時間後に、プレートをイメージングし、ＢＤハイコンテントイメージング装置を使用して定量した。定量は、Proxcellイメージングアルゴリズムを用いて行った。
【０１４５】
データは、野生型ＥＧＦＰ配列に比べて／対照的に、改変ＥＧＦＰ配列の使用がより高い発現を招き、それがＲＮａｓｅ Ｌの同時発現によって制約されなかったことを示している（図２）。
【０１４６】
（３）フォワード（５’）プライマーがＣＭＶプロモーター領域の開始部またはＣＭＶプロモーター上流の配列に相補性であって、リバース（３’）プライマーがＢＧＨポリＡ部位またはこの部位の下流の配列に相補的な、プライマーを使用することによって、発現活性ＰＣＲ産物を生成させた。１００μｌの反応液中でＴａｑおよびＰｆｕポリメラーゼ混合物を使用して以下のサイクル条件でＰＣＲを実施した：９５℃、１２分（ホットスタートポリメラーゼを活性化する）、９４℃、１分；５２℃、１分；７２℃、４分を３２サイクル、および７２℃で７分の最終伸長。プライマー、小型ＰＣＲ産物、緩衝剤、および酵素を除去するためにQiagen ＰＣＲ精製カラムを使用してＰＣＲ産物を精製し、滅菌水に溶出した。１０％ ＦＢＳおよび抗生物質（Invitrogen）を補充したＤＭＥＭ培地中で標準培養条件（３７℃、５％ ＣＯ２）でＨＥＫ２９３細胞を成長させた。９６ウェルプレートのウェル１個あたり２．５×１０４個の細胞に、野生型または改変配列を有するＥＧＦＰ発現ベクターから生成した精製ＰＣＲ産物１００ngをトランスフェクションした。トランスフェクションは、Lipofectamine 2000（Invitrogen）を使用して無血清培地中で５時間行い、続いて培地を血清補充培地と置換した。約２４または４８時間後に、プレートをイメージングし、ＢＤハイコンテントイメージング装置を使用して定量した。定量は、Proxcellイメージングアルゴリズムを用いて行った。
【０１４７】
データは、ＥＧＦＰのＵＵ／ＵＡ減少型コード領域を有するＰＣＲ産物が、野生型配列を有するＰＣＲ産物よりも高いＥＧＦＰ発現（５〜１０倍の増大）を誘導したことを示している（図３）。
【０１４８】
（４）（２）および（３）に記載したものと同じ方法を用いて、野生型またはＵＵ／ＵＡを減少させたホタルルシフェラーゼ発現ベクター（「ＳｕｐｅｒＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ」、配列番号：１５）をＨｅｋ２９３細胞にトランスフェクションした。ルシフェラーゼの活性レベルは、ルミノメーターによって定量した。データは、２回の独立した実験の中で約５倍および約１００倍の差があったことを示している（図４）。
【０１４９】
同様に、上記（３）に概略した方法によって野生型または改変ホタルルシフェラーゼ発現ベクター（「ＳｕｐｅｒＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ」、配列番号：１５）から生成した異なるＰＣＲ産物をＨｕｈ７細胞にトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性レベルは、今回もルミノメーターで定量した。そのデータは、ＳｕｐｅｒＬｕｃｉｆｅｒａｓｅのＵＵ／ＵＡ減少型コード領域を有するＰＣＲ産物が野生型配列を有するＰＣＲ産物よりも実質的に高いルシフェラーゼの発現（２０〜１００倍の増大）を誘導したことを示している（図５）。これは、本発明による方法が、真に多様なレポータータンパク質で有効であることを実証している。
【０１５０】
同様に、上記（２）と同じ方法を用いて野生型またはＵＵ／ＵＡ減少型Ｂ型肝炎表面（配列番号：２３）抗原発現ベクターをＨｅｋ２９３細胞にトランスフェクションした。発現されたタンパク質をmIU/mlとして定量した。約４倍の差があった（図６）が、これは、おそらく独立した実験ではいっそう高い場合があるであろう。
【０１５１】
これは、本発明による方法が、改変された、すなわちコード配列がＵＵ／ＵＡ減少型である治療用タンパク質、抗体およびワクチンでもまた有効であり、このことが実質的な発現増大を誘導することの一例である。
【０１５２】
（５）転写変化およびその後のレポートされたタンパク質レベルに対する効果を反映させるために、ＰＥＳＴ配列（＝プロリン、グルタミン酸、セリンおよびトレオニンに富むペプチド配列）を含むタンパク質不安定化アミノ酸領域を使用して、様々なレポータータンパク質の半減期を短縮した。ＰＥＳＴ配列は、短い細胞内半減期を有するタンパク質と関連する。Liら（J. Biol. Chem., 1998, 273, pp. 34970-34975）は、ＥＧＦＰを不安定化するためのＭＯＤＣのＰＥＳＴ配列の使用を記載し、Leclercら（Biotechniques, 2000, 29, pp. 590-591, pp. 594-596は、ホタルルシフェラーゼのタンパク質半減期を短縮するためにＰＥＳＴ配列を使用した。
【０１５３】
そのようなＭＯＤＣドメイン（マウスオルニチンデカルボキシラーゼ）、さらに具体的には高度不安定性ＭＯＤＣの分解ドメインのアミノ酸４２２〜４６１を使用して、本発明者らは、いくつかのレポーター遺伝子を前記ＭＯＤＣドメインと融合させることによって不安定にした。さらに、本発明者らは、Aequorea Victoria、Montastrea Cavernosa、ClavulariaおよびPuntelina Plumate由来ＥＧＦＰに関して、本発明にしたがってレポーター遺伝子およびＭＯＤＣドメインの両方におけるＵＵ／ＵＡジヌクレオチド数を減少させることによって、そのような融合体を改変した。ＵＵ／ＵＡジヌクレオチド数は、融合体のＥＧＦＰ部およびＭＯＤＣ部の両方で減少させた。
【０１５４】
それぞれフォワードおよびリバースプライマーにＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位を有する特異的プライマーを使用して、マウス線維芽細胞のゲノムＤＮＡからＭＯＤＣドメインを増幅させた。同じ制限部位を使用して、増幅したｃＤＮＡを、ＧＦＰコード領域を有するフレーム内にクローニングした。図７に示すように、Ｈｅｋ２９３細胞に不安定化されたＧＦＰをトランスフェクションした。イメージング装置およびソフトウェアによって蛍光強度を定量した。Aequorea Victoria由来の不安定化野生型ＥＧＦＰに比べて（すなわち評価の基準は、野生型ＭＯＤＣ（配列番号：２９）と融合した野生型ＥＧＦＰ（配列番号：８）であった）、改変Aequorea Victoria由来蛍光からは２倍の増大、改変Montastrea Cavernosa緑色蛍光タンパク質からは８倍の増大、改変Clavularia緑色蛍光タンパク質からは４倍の増大、および改変Puntelina Plumate緑色蛍光タンパク質からは７倍の増大があった（図７参照）。本明細書における「改変」という用語は、「ＵＵ／ＵＡ減少型であって、ＭＯＤＣ（それ自体もＵＵ／ＵＡ減少型）と融合された」ことを意味する。
【０１５５】
結果として、このことは、通常発現シグナルがより弱い状況でも本発明が有効であり、そのような状況で本発明が発現の増大倍率を改善することを示している。
【０１５６】
【表６】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の核酸配列のコードおよび／または非コード領域におけるＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させることによって、細胞における、好ましくは真核細胞における該タンパク質の発現を増大させる方法に関する。さらに、本発明は、減少したＲＮａｓｅ Ｌ切断部位数を示す核酸配列に加えて、そのような配列から翻訳されたタンパク質に関する。
【０００２】
一過性応答遺伝子は、細胞増殖、シグナル伝達事象、ならびに炎症性刺激、微生物、および放射線などの外因性因子に対する応答を含めた、重大な生物学的応答をレギュレーションする（Lai et al., 2006; Lal et al., 2004; Lopez de Silanes et al., 2005）。それらは、特異的配列エレメントなどのシス作用因子と、ある種のＲＮＡ結合タンパク質のようなトランス作用因子との両方によってコントロールされる。主として３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）における配列エレメントおよびＲＮＡ結合タンパク質によるモデュレーションは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の安定性およびタンパク質の翻訳に影響を及ぼすことがある。
【０００３】
かなりの数の遺伝子が、そのｍＲＮＡの３’ＵＴＲに不安定化配列エレメントを、主としてアデニル酸ウリジル酸（ＡＵ）リッチエレメント（ＡＲＥ）を有する。これらのＡＲＥは、タンパク質とｍＲＮＡとの相互作用に影響を及ぼすおそれのある不均一な群の配列クラスを含むことから、ｍＲＮＡの分解特性を左右する（Bakheet et al., 2006; Barreau et al., 2005）。細胞性ｍＲＮＡの安定化は、ＨｕＲタンパク質などのｍＲＮＡ安定化促進タンパク質の活性によって、またはジンクフィンガータンパク質であるトリステトラプロリン（ＴＴＰ）などのＲＮＡ分解促進タンパク質の不活性化によって起こる場合がある。
【０００４】
細胞性ｍＲＮＡに影響を及ぼすおそれのある、別のクラスのトランス作用因子は、普遍的細胞内酵素である、エンドリボヌクレアーゼのリボヌクレアーゼＬ（ＲＮａｓｅ Ｌ）であり、それは、以前はウイルスｍＲＮＡに特異的であると考えられていた。しかし、最近の研究は、ＲＮａｓｅ Ｌがある種の生物学的過程の一過性応答に関与する可能性があることを示した（Khabar et al., 2003a; Li et al., 2000）。ＲＮａｓｅ Ｌは、インターフェロン（ＩＦＮ）系の一部であると見なされている。ＩＦＮは、酵素オリゴアデニル酸シンターゼ（ＯＡＳ）の遺伝子発現を誘導し、それはウイルス二本鎖ＲＮＡ中間体に結合すると活性化し、短い２’−５’オリゴアデニル酸（２−５Ａ）を合成する。これらは、今度はウイルスｍＲＮＡを強力に分解するＲＮａｓｅ Ｌを活性化する。ＲＮａｓｅ Ｌは、ナノモル濃度以下のレベルの２−５Ａによって活性化され、優先的にウイルスｍＲＮＡのＵＵおよびＵＡジヌクレオチドの後でウイルスＲＮＡの１本鎖領域の切断を招く（Wrechester et al., 1981; Han et al., 2004）。さらに高いレベルでは、ＲＮａｓｅ Ｌは１８Ｓおよび２８ＳリボソームＲＮＡの切断などのより広い効果を誘導することがある（Wreschner et al., 1981）。
【０００５】
近年、選ばれた細胞性ｍＲＮＡの分解にＲＮａｓｅ Ｌが関与することが広く受け入れられるようになった（Bisbal et al., 2000; Chandrasekaran et al., 2004; Khabar et al., 2003b; Le Roy et al., 2001; Li et al., 2000）。具体的には、ＲＮａｓｅ Ｌは、ＰＫＲ ｍＲＮＡをダウンレギュレーションすることが示された（Khabar et al., 2003b）。正常細胞におけるＩＦＮ抗ウイルス応答中に、ＰＫＲ ｍＲＮＡの発現は一過性であるが、ＲＮａｓｅ Ｌ−ヌル細胞では、ｍＲＮＡの安定性増大が原因で長期動態のＰＫＲ ｍＲＮＡ発現が観察される（Khabar et al., 2003b）。その効果は、ウイルスタンパク質の合成阻害を誘導する過程である真核生物翻訳開始因子２サブユニット（ｅＩＦ２ａ）のＰＫＲ依存性リン酸化の延長を招く（Khabar et al., 2003b）。したがって、ＲＮａｓｅ Ｌは、ＰＫＲによって付与される翻訳停止が短時間であることを確実にするために、ＩＦＮ応答が一過性であることを担っている。ＲＮａｓｅ ＬがＩＦＮ応答をネガティブレギュレーションする同様の役割は、また、ＩＳＧ４３と呼ばれる４３ｋＤユビキチン特異的プロテアーゼをコードする新規なＩＦＮ活性化遺伝子がＲＮａｓｅ Ｌによってダウンレギュレーションされるという報告によって示唆されている（Li et al., 2000）。ＩＳＧ４３ ｍＲＮＡの半減期がＲＮａｓｅ Ｌ−ヌル細胞で増大することから、このレギュレーションは、ｍＲＮＡ安定性のレベルで起こる（Li et al., 2000）。ＲＮａｓｅ Ｌは、筋分化に不可欠な重要な転写因子をコードする、別の機能的に重要な細胞性ｍＲＮＡであるｍｙｏＤをダウンレギュレーションすることができる。ＲＮａｓｅ Ｌおよびその抑制因子ＲＬＩは、Ｃ２細胞系が筋芽細胞から筋管に分化する間に連続的に誘導される（Bisbal et al., 2000）。ＲＮａｓｅ Ｌの阻害または過剰発現は、ＭｙｏＤ ｍＲＮＡの半減期をそれぞれ延長または短縮する（Bisbal et al., 2000）。ＲＮａｓｅ Ｌ分子のプールがミトコンドリアに局在し、ＩＦＮ−α処置後に増大することから、ＣＹＴＢ、ＡＴＰａｓｅ ６（ＡＴＰ６）、およびチトクロームオキシダーゼＩＩ（ＣＯ）のｍＲＮＡなどのミトコンドリアｍＲＮＡのダウンレギュレーションにＲＮａｓｅ Ｌが果たす役割が、ＩＦＮの抗増殖作用のメカニズムとして提案されている（Le Roy et al., 2001）。これは、アンチセンス構築物の誘導を介してＲＮａｓｅ Ｌ活性を低下させることによって、または２−５ＡによってＲＮａｓｅ Ｌ活性を直接活性化することによって実証された（Le Roy et al., 2001）。ＲＮａｓｅ Ｌは、特に２−５Ａのレベルが限定的な条件で、非ウイルス性ｍＲＮＡに比べてウイルス、例えば脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）のｍＲＮＡに対して選択性を示す（Li et al., 1998a）。細胞性ｍＲＮＡに対するＲＮａｓｅ Ｌの効果は、特定のｍＲＮＡに大いに限定されると考えられる。というのも、この主題を扱った研究で細胞性ｍＲＮＡに対する全体的な効果が観察されないからである。さらに、上記研究のいずれによっても、細胞性ターゲットｍＲＮＡへのＲＮａｓｅ Ｌの直接結合も、ウイルスｍＲＮＡに対して示されたような配列特異性も実証されていない。したがって、非ウイルス性細胞性ｍＲＮＡに関連するＲＮａｓｅ Ｌ活性のメカニズムは、大部分が不明なままである。
【０００６】
以前にドミナントネガティブ型のＲＮａｓｅ Ｌが、アミノ酸置換または完全長タンパク質の短縮化のいずれかによって生成された。例えばドミナントネガティブＲＮａｓｅ ＬであるＺＢ１（カルボキシ末端の８９個のアミノ酸を欠如した短縮型マウスＲＮａｓｅ Ｌ）は、野生型ＲＮａｓｅ Ｌの抗ウイルス作用および抗増殖作用を阻害する（Hassel et al., 1993）。Dongら（2001）は、ＲＮａｓｅ Ｌの他の短縮化および点変異、例えばヌクレアーゼドメインにおける変異（Ｒ６６７Ａ）を記載している。
【０００７】
米国特許第６，７６２，０３８号は、トランスフェクションされた遺伝子の発現強化のために、ＲＮａｓｅ Ｌ遺伝子にホモ接合性破壊を有するマウスから作出された変異型胚性線維芽細胞系（ＭＥＦ）の使用を示唆している（Zhou et al., 1997）。しかし、発現強化の効果は、これらの特定の細胞系に限られる。さらに、新しいＲＮａｓｅ Ｌ−ヌル細胞系の創出は、非常に骨の折れる工程であって、全ての哺乳動物および／または真核生物発現系に容易に適用できるわけではない。
【０００８】
哺乳動物発現系は、治療用タンパク質および抗体の産生のための重要な手段となっており、原核生物発現系に比べて、例えばタンパク質の正しいフォールディングおよび解糖などの翻訳後修飾に関していくつかの利点を有する。しかし、多数の系においてタンパク質発現が低収率であることは、費用のかかる技術的障害となる。所望のタンパク質、例えばＧ−タンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）などの膜タンパク質、大型タンパク質、抗体、融合タンパク質、タンパク質複合体、ワクチン、および血漿タンパク質を発現させることが本質的に困難ならば、これは特に問題である。この困難の理由は、タンパク質自体の本質的な不安定性、ＡＵリッチエレメント含有ｍＲＮＡの場合のようなｍＲＮＡの本質的な不安定性、または弱いプロモーター活性であろう。
【０００９】
これらの問題に共通の解決は、ＣＭＶプロモーターなどの強力なプロモーター、およびＣＭＶのイントロンＡなどの特定種類のイントロンを含めた、そのプロモーターの上流または下流のエンハンサーエレメントを提供することによってタンパク質の発現を増大させることに焦点を当てていた。他の解決は、核および染色体の構築に重要な３００〜３０００塩基対長のＤＮＡエレメントであるクロマチンマトリックス付着領域（ＭＡＲ）を関与させた。これらのエレメントは、隣接クロマチンが導入遺伝子の発現に影響を及ぼすことを阻止し、そのことが、所望のレギュレーション性発現を示すクローンを単離する確率の増大を誘導すると提案された（米国特許第７，１２９，０６２号）。この特定のアプローチは、その効果を達成するためにいくつかの異なるベクター構築物を必要としうることから、潜在的に問題がある。これらのアプローチが利用可能であるにもかかわらず、上記のタンパク質のように、発現が困難なタンパク質のタンパク質発現をさらに増大させる必要性は、依然として存在する。
【００１０】
コドン最適化（またはコドン使用頻度最適化）は、タンパク質産生を押し上げるための、当技術分野において公知の別法である。それは、発現されるべきタンパク質をコードする核酸配列がホストによって稀に使用されるコドン（トリプレット）を有するならば、その発現レベルは最大ではないという観察に基づく。コドン最適化は、基本的にターゲット核酸配列における稀なコドンを変化させることにより、それらがホストのコドン使用頻度をより厳密に反映させることを含む。したがって、普通、最適化工程に使用される情報は、最適化されるＤＮＡまたはタンパク質配列、およびそれぞれのホストのコドン使用頻度表である（例えばヒトゲノムについては表１参照）。コドン使用頻度表は、所与の生物における特定のアミノ酸についてそれぞれの可能なコドンの相対頻度を一覧している。全ての生物におけるコドン使用頻度のバイアスの全一覧は、次のウェブサイトから見出すことができる：http://www.kazusa.or.jp/codon/。所与のホスト生物に対するコドン使用頻度のバイアスに基づいてコドンを最適化するために、いくつかのウェブベースのプログラムも利用可能である。コドン最適化は、非ヒトまたは非哺乳動物起源の遺伝子がヒトまたは他の哺乳動物ホスト細胞において発現される（またはその逆）一部の状況で成功することがある。しかし、コドン使用頻度は、タンパク質の発現レベルを左右する多数の要因のわずか一つであって、コドン最適化の効果は多くの場合に限定的である。
【００１１】
任意の生物の細胞において、好ましくは真核細胞において発現される、本質的に発現が困難なタンパク質を含めた内因性および外因性（リコンビナント）タンパク質の収率を顕著に改善する方法を提供することが、本発明の一目的であった。この方法は、時間および費用効率的であるべきであり、原核細胞および真核細胞を含めた任意の種類の生物の細胞におけるタンパク質の大規模産生を可能にするべきである。治療的に使用されるタンパク質の産生を可能にするために、使用される細胞系、リコンビナントタンパク質の特性、または外因性材料の使用などの、リコンビナントタンパク質を産生するために規制当局に認可された特徴を変更せずに、発現収率におけるこの改善を達成することが、本発明の別の目的であった。
【００１２】
本発明の目的は、タンパク質の核酸配列におけるＲＮａｓｅ Ｌ切断部位を減少させる工程を含む、細胞における、好ましくは真核細胞における該タンパク質の発現を増大させる方法によって解決される。一態様では、該細胞は原核細胞であり、別の態様では、該細胞は真核細胞である。
【００１３】
タンパク質の核酸配列は、コード領域および非コード領域、すなわちアミノ酸配列に翻訳される領域（エクソンとも呼ばれる）およびアミノ酸配列に翻訳されない領域の両方を含む。核酸配列の非コード領域は、例えば５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、およびイントロンである。これらのエレメントの全て（５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、イントロン、およびコード領域）は、遺伝子およびタンパク質の発現をコントロールすることができることから、上記方法に関するターゲットである。本発明により、ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる該工程は、コード領域または非コード領域のいずれかまたは両方における該数を減少させる。
【００１４】
一態様ではＲＮａｓｅ Ｌの該切断部位数は、（野生型核酸配列におけるＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数に比べて）少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、さらに好ましくは少なくとも５０％減少する。
【００１５】
好ましくは、該切断部位は、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドである。
【００１６】
ＲＮａｓｅ Ｌは、エンドリボヌクレアーゼであることから、ＲＮＡ（一次ＲＮＡ、すなわちスプライシングされていないＲＮＡおよびｍＲＮＡ、すなわちスプライシングされたＲＮＡ）レベルでのみ活性である。ＵＵおよびＵＡジヌクレオチドは、ＲＮＡレベルでのみ存在する。
【００１７】
しかし、該タンパク質の核酸配列におけるＲＮａｓｅ Ｌ切断部位数を減少させる該工程は、ＤＮＡレベルで行われることが好ましく、ＲＮＡ配列におけるＵＵおよびＵＡジヌクレオチドはＤＮＡ配列におけるＴＴおよびＴＡヌクレオチドに対応する。所与のＤＮＡ配列を特異的に変化させる技法は、当技術分野において周知であり、それには、非限定的に遺伝子合成、部位特異的変異誘発、制限酵素消化による欠失変異、および組換えによる変異導入が含まれる。遺伝子合成の技法は、本発明により特に好ましい。
【００１８】
本発明の一態様では、ＲＮａｓｅ Ｌ切断部位数を減少させる該工程は、該核酸配列のコード領域における該数を減少させる。
【００１９】
好ましくは、該核酸配列におけるＲＮａｓｅ Ｌ切断部位数を減少させる該工程は、該タンパク質のアミノ酸配列を変更せずに行われる。したがって、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、該工程によって変更されない。
【００２０】
ＲＮａｓｅ Ｌ切断部位数を減少させる該工程における一態様では、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを含むコドンは、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを含まない、同じアミノ酸をコードする代替コドンに交換される。
【００２１】
ＲＮａｓｅ Ｌ切断部位数を減少させる該工程における一態様では、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを含む隣接コドン対がもはやＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを含まないように、該隣接コドン対の少なくとも一つのコドンが、同じアミノ酸をコードする代替コドンに交換される。
【００２２】
好ましくは、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを含む該隣接コドン対の第一のコドンが交換される。
【００２３】
一態様では、該代替コドンは、該細胞において、好ましくは該真核細胞において、より頻繁に使用されるコドンである。
【００２４】
本発明の一態様では、ＲＮａｓｅ Ｌ切断部位数を減少させる該工程は、該核酸配列の非コード領域における該数を減少させる。
【００２５】
好ましくは、該非コード領域は５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、またはイントロンである。
【００２６】
イントロンの例には、非限定的にＣＭＶイントロン、ＳＶ４０イントロン、ウサギβグロビンイントロン（ＲＢＴＧ）、および合成イントロンが含まれる。
【００２７】
一態様では、該核酸配列の非コード領域におけるＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる該工程は、ヌクレオチドの変異、欠失、または挿入によって行われる。
【００２８】
好ましくは、該核酸配列の非コード領域におけるＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる該工程は、開始コドン（ＡＴＧ）に近接した５’ＵＴＲにおける配列のように、非コード領域における機能的に重要なエレメントを変更しないが、それは、それらが、翻訳強化配列（例えばコザック）、３’ＵＴＲにおけるポリＡシグナル（例えばＡＡＵＡＡＡまたはＡＵＵＡＡＡ）またはポリアデニル化に使用される他の必要もしくは補助配列エレメント、イントロン−エクソン接合部／境界域、スプライシングブランチポイントおよびイントロンにおけるエクソンのスプライス供与／受容部位、およびスプライス受容部位からブランチポイント終点の間のＣＴリッチ領域を有する場合があるからである。例えば、強力なポリＡシグナル下流にＵ−リッチのヌクレオチド５０個の領域があるが、それは、可能ならば変更すべきでない（Legendre and Gautheret, 2003）。
【００２９】
好ましくは、非コード領域におけるＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる該工程は、（ａ）イントロンのＧＣ含量を８０％よりも大きく、かつその長さを８０％未満に変化させること、
（ｂ）５’ＵＴＲのＧＣ含量を８０％よりも大きく変化させること、および
（ｃ）３’ＵＴＲのＧＣ含量を８０％よりも大きく、かつその長さを８０％未満に変化させること
はない。
【００３０】
一態様では、上記方法はさらに、ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる該工程の前にコドン最適化の工程を含む。
【００３１】
一態様では、上記方法はさらに、ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる該工程の後に、発現活性ＰＣＲ産物の形のまたは発現ベクターに含まれる、該タンパク質の該核酸配列を、該細胞に、好ましくは該真核細胞にトランスフェクションする工程を含む。
【００３２】
本明細書に使用される「発現活性ＰＣＲ産物」という用語は、ｃＤＮＡ、オープンリーディングフレーム、または発現ベクターに含まれる遺伝子などの関心が持たれるＤＮＡ配列の隣接配列に相補的な２個のプライマーを使用したＰＣＲ増幅によって生成されるＰＣＲ産物を表すことを意図し、ここで、結果として生じるＰＣＲ産物は、プロモーター、関心が持たれるＤＮＡ配列および終結配列を含み、ホスト細胞にトランスフェクションされた場合に、関心が持たれるＤＮＡを発現させる（Al-Zoghaibi et al., 2007も参照されたい）。
【００３３】
本発明によると、任意の発現ベクターを使用することができるけれども、真核生物／哺乳動物発現ベクターが好ましい。哺乳動物発現ベクターは、タンパク質の生物学的機能を研究するための一般に普及したツールであり、様々な種類（例えばプラスミドベクターまたはウイルスベクター）が当技術分野において公知である。適切な発現ベクターは、特定のプロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、またはイントロンに限定されない。それらは、構成的発現型、誘導型、または抑制型またはレギュレーション可能型でありうる。
【００３４】
本発明によると、プロモーターが真核生物性であり、終結部位が、ポリアデニル化シグナルを有するポリＡ配列であることが好ましい。真核生物または哺乳動物プロモーターは、当技術分野において公知であり、それらには、非限定的にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、伸長因子（ＥＦ）プロモーター、ＲＳＶプロモーター、およびニワトリβ−アクチンプロモーターが含まれる。好ましい真核生物ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長因子（ＢＧＨ）ポリ部位、成長ホルモンポリＡ、ＳＶ４０ポリＡ、およびＨＳＫポリＡである（Foecking and Hofstetter, 1986; Kobayashi et al., 1997）。真核生物ターミネーターの例は、ウシ成長因子（ＢＧＨ）ポリＡ部位、ＳＶ４０ポリＡ、ＨＳＫポリＡ、および合成ポリＡである。
【００３５】
細胞にＤＮＡ／ベクターを一過性または安定的にトランスフェクションする方法は、当技術分野において周知である。これらには、非限定的にリン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、陽イオンポリマートランスフェクション、およびリポソーム介在性トランスフェクション（例えばリポフェクション）が含まれる。リポソーム介在性トランスフェクション用の試薬は、市販されており、例えばリポフェクタミン（Invitrogen）およびポリエチレンイミン（Sigma）である。細胞は、また、ウイルストランスフェクションによって、またはウイルスコート粒子を介してトランスフェクションすることができる。本発明により細胞をトランスフェクションする別の好ましい方法は、該発現活性ＰＣＲ産物または該発現ベクターをｉｎ ｖｉｖｏマイクロインジェクションすること、および該発現活性ＰＣＲ産物または該発現ベクターを有する細胞を選択薬の助けを借りてまたは借りずに選択的に成長させることである。したがって、本発明による発現活性ＰＣＲ産物または発現ベクターは、追加的に選択マーカーを含むことがある。安定な細胞系を産生させるために、クローンは、非限定的にネオマイシン、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ゼオシン（zeocin）、ハイグロマイシン、およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）が含まれる様々な選択マーカーを使用して選択することができる。
【００３６】
上記方法の全ての適切な真核生物／哺乳動物細胞（ホスト細胞）もまた、当技術分野において周知であって、それらには、非限定的にＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、およびＣＯＳ−７細胞が含まれる。
【００３７】
一態様では、上記方法は、さらに、該細胞における、好ましくは該真核細胞における該発現活性ＰＣＲ産物または発現ベクターから該タンパク質を翻訳させる工程を含む。
【００３８】
好ましくは、該タンパク質は、レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗体、ワクチン、膜タンパク質、融合タンパク質、血漿タンパク質、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、ケモカイン、およびＧＰＣＲを含む群より選択される。
【００３９】
本発明の目的は、また、ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数が（野生型核酸配列におけるＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数に比べて）少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、さらに好ましくは少なくとも５０％減少している核酸配列によって解決される。
【００４０】
好ましくは、該核酸配列は、上記方法によって産生される。
【００４１】
好ましくは、該核酸配列は、レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗体、ワクチン、膜タンパク質、融合タンパク質、血漿タンパク質、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、ケモカイン、およびＧＰＣＲを含む群より選択されるタンパク質の核酸配列である。
【００４２】
一態様では、該核酸配列は、配列番号：２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２３、２４、２６、２８、３０〜３６、好ましくは配列番号：９、１５、１７、２３、３０〜３６より選択される配列を有する。
【００４３】
本発明の目的は、また、上記核酸を含む発現活性ＰＣＲ産物または発現ベクターによって解決される。
【００４４】
本発明の目的は、さらに、上記の発現活性ＰＣＲ産物または発現ベクターを有するホスト細胞によって解決される。
【００４５】
最終的に、本発明の目的は、また、上記方法によって産生されるタンパク質であって、レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗体、ワクチン、膜タンパク質、融合タンパク質、血漿タンパク質、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、ケモカイン、およびＧＰＣＲを含む群より選択されるタンパク質によって解決される。
【００４６】
本発明によると、「治療用タンパク質」という用語は、抗体フラグメント、免疫グロブリン鎖、重鎖および軽鎖、Ｆａｂフラグメント、酵素、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、リンホカイン、接着分子、レセプターに加えて、その誘導体またはフラグメントなどの、薬学的に関連して使用されるタンパク質を包含することが意図される。
【００４７】
本発明によると、レポータータンパク質（単独または別のタンパク質と融合したもの）は、上記方法のために特に好ましい「ターゲット」である。（非限定的に）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色シアニン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ルシフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、分泌型ホルモン、分泌型サイトカイン、β−ガラクトシダーゼ、ならびに他の蛍光および生物発光タンパク質を含めた、多数の蛍光および非蛍光レポータータンパク質がある。レポータータンパク質の選択は、使用される細胞系（内因性活性）、実験の性質（例えば遺伝子発現の動力学およびトランスフェクション効率）、および選択された検出方法に対するアッセイの適応性に依存する（Naylor 1999）。迅速な応答および変化のなどのレポーター性能を改善するために、レポータータンパク質自体のいくつかの改変、例えば不安定化エレメントの使用が探究されている（Li et al., 1998b; Zhao et al., 1995）。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および他の蛍光タンパク質は、生組織、細胞および実験動物における遺伝子発現を非侵襲的にモニタリングするためにますます普及しつつある（Naylor 1999）。したがって、ＧＦＰ（およびＥＧＦＰなどのその誘導体）、他の蛍光タンパク質（上記参照）に加えて、蛍光タンパク質を含む融合タンパク質は、本発明による方法のためになおさらに好ましい「ターゲット」タンパク質である。
【００４８】
驚くことに本発明者らは、真核生物および／または哺乳動物発現系で発現されるべきタンパク質の核酸配列におけるＲＮａｓｅ Ｌの切断部位、好ましくはＵＵおよびＵＡジヌクレオチドの数を減少させることが、該タンパク質の発現および収率の顕著な改善を招くことを見出した。一定の理論に縛られることを望むわけではないが、ＲＮａｓｅ Ｌ切断部位の減少（すなわちこれらの部位の頻度減少）が、ホスト細胞において、好ましくは真核生物ホスト細胞において内因性ＲＮａｓｅ Ｌの攻撃を受けにくい（すなわち抵抗性が高い）核酸配列、すなわち（一次ＲＮＡおよびｍＲＮＡの両方の）ＲＮＡを生じ、ｍＲＮＡの安定性増大を、したがってタンパク質の発現増大を誘導すると考えられる。
【００４９】
関係する普遍的な概念のせいで、本発明は、任意の配列に適用することができる。さらに具体的には、本発明による方法は、内因性および外因性（リコンビナント）タンパク質／遺伝子の両方に、安定的に組み込まれた遺伝子および一過性発現遺伝子の両方に、発現が困難なタンパク質／遺伝子に、ならびに少量に内因性発現されるタンパク質／遺伝子にも適用可能である。それは、原核生物および真核生物系の両方に適用することができる。本明細書に記載されたアプローチは、タンパク質産生に費やされる時間およびコストの顕著な減少を誘導することから、エリスロポエチン、成長因子、インターフェロン、インスリン、治療用および診断用抗体、ならびにタンパク質またはペプチド系ワクチンなどの生物学的製剤として使用されるタンパク質／遺伝子のさらに効率的な産生を可能にするであろう。それは、大量に発現／産生させることが非常に困難であることが証明された遺伝子／タンパク質の発現に特に有用である。例には、非限定的にＧタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）などの膜タンパク質、大型タンパク質、抗体、融合タンパク質、タンパク質複合体、ワクチン、および血漿タンパク質が含まれる。それは、また、レポータータンパク質の、例えばＧＦＰまたはルシフェラーゼなどの蛍光タンパク質の発現および性能を顕著に改善することに役立つことから、そのようなレポータータンパク質を使用する方法の感度（蛍光または発光顕微鏡法、蛍光ベースのマイクロアレイ、細胞選別など）を増大することができる。さらにこのアプローチは、（非限定的に）ハムスターＣＨＯ１およびＨＥＫ２９３を含めた細胞系などの、生物工学工業に使用される任意の細胞系に適用可能であることから、特に実践的であり、かつ簡単である。
【００５０】
以下に、本発明にしたがってＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる工程の一般的原理を説明する。
【００５１】
コード領域におけるＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチド数の減少
表２および表３は、引き起こすことのできる変化を示す。これらの改変は、所与の生物におけるそれらのコドンバイアス（コドン使用頻度）に基づきタンパク質発現のためにコドンを最適化するために使用されるコドン使用頻度表（比較のために表１参照）と全く別であることに留意することが重要である。本方法は、コドン使用頻度に基づいてではなく、ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位／ターゲット（ＵＵおよびＵＡジヌクレオチド）数を減少させるためにコドンを変化させることを対象とする。さらに、本発明による方法は、「生物依存的」ではなく、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドの数／頻度は、対応するアミノ酸配列が変更されないままである限り（表２および３参照）、任意の生物由来の任意の遺伝子（核酸配列）において減少させることができる。さらに、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチド数の減少は、また、所望の生物についての古典的コドン使用頻度最適化（例えば表１参照）と組み合わせることができ、可能性があることには、いっそうさらなる発現増大を招く。
【００５２】
表２は、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを有するコドンに加えて、それらの非ＵＵ／ＵＡ含有代替物を示す。フェニルアラニン（Ｐｈｅ）についてＵＵまたはＵＡを完全に欠如した他のコドンがないことから、フェニルアラニンをコードするＵＵＵは、ＵＵＣだけに変化させることができる。これは、ＵＡＣだけに変化させることができるチロシン（ＵＡＵ）の場合も同様である。いったん表２により変化を加えたら、表３により、ＵＵまたはＵＡを形成するジ−トリプレット、すなわちＮＮＵ ＵＮＮまたはＮＮＵ ＡＮＮ（Ｎは任意のヌクレオチドである）を変化させる。代替物が１個を超えて存在する場合は、それぞれの生物または高発現される遺伝子において最も高頻度に使用されるコドンを優先する。
【００５３】
コード領域におけるＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを減少させるための工程：
１． 表２によりコドンを変化させる。
２． 代替コドンが１個を超えて存在する場合は、所望の生物においてより高頻度に使用されるコドンを使用する（随意）。
３． 表３により、一緒になってＵＵまたはＵＡジヌクレオチドを形成するジ−トリプレット（ＮＮＵ ＵＮＮ、ＮＮＵ ＡＮＮ）の最初のコドンを変化させる。
４． １個を超える代替コドンが存在する場合は、所望の生物においてより高頻度に使用されるコドンまたは発現が最強のコドンを使用する（随意、表４および５参照）。
５． 古典的コドン使用頻度最適化（ホスト細胞生物、または高発現遺伝子において最も高頻度に使用されるコドンの一覧に基づく）を、所望により、そして好ましくはＵＵおよびＵＡ減少の前に行うことができる。
【００５４】
イントロンにおけるＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチド数の減少
イントロンにおけるＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを減少させるための工程：
１． ＵＵ／ＵＡジヌクレオチドにおける２個のヌクレオチドのうち１個または２個を変異または欠失させる：ＵＵまたはＵＡをＵＣ、ＵＧ、ＧＡ、ＣＡ、またはＴＡにする。または１個のヌクレオチドを挿入する。
２． イントロンの全ＧＣ含量は、８０％を超えるべきではなく、かつ長さはその本来の長さの８０％未満に変化させるべきではない。
３． エクソンのスプライス供与部位および受容部位ならびにブランチポイントを含めたエクソン−イントロン境界部を変化させてはならない。スプライスアクセプター部位からブランチポイント終末にわたるＣＴ−リッチ領域を破壊することを避ける。
【００５５】
５’ＵＴＲにおけるＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチド数の減少
５’ＵＴＲにおけるＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを減少させる工程：
１． ＵＵまたはＵＡをＵＣ、ＵＧ、ＧＡ、ＣＡ、またはＴＡに変異させる。
２． ５’ＵＴＲの全ＧＣ含量は、８０％を超えるべきではない。
３． コンテクスト配列はコザックなどの翻訳強化配列を有することがあるため、開始コドンＡＴＧ近くのコンテクスト配列を避ける。
【００５６】
３’ＵＴＲにおけるＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチド数の減少
３’ＵＴＲにおけるＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを減少させる工程：
１． ＵＵ／ＵＡジヌクレオチドにおける２個のヌクレオチドのうち１個または２個を変異または欠失させる：すなわちＵＵまたはＵＡからＵＣ、ＵＧ、ＧＡ、ＣＡ、またはＴＡにする。または、１個のヌクレオチドを挿入する。
２． ３’ＵＴＲの全ＧＣ含量は８０％を超えるべきではなく、かつ長さはその本来の長さの８０％未満に変化させるべきではない。
３． ＡＡＵＡＡＡまたはＡＵＵＡＡＡなどのポリＡシグナルを変化させてはならず、ポリアデニル化に使用される任意の必要または補助配列エレメントが認められる場合は、それを変更することを避ける。
【００５７】
非コード領域における可能性のある変化
１． 変異：ＮＵＵＮまたはＮＵＡＮからＮＵＳＮへ（ＳはＧまたはＣであり、Ｎは任意のヌクレオチドである）
２． 挿入：ＮＵＵＮまたはＮＵＡＮからＮＵＳＵＮまたはＮＵＳＡへ（ＳはＧまたはＣであり、Ｎは任意のヌクレオチドである）
３． 欠失：ＮＵＵＮからＮＵＳへ（ＳはＧまたはＣであり、Ｎは任意のヌクレオチドである）
４． 欠失：ＮＵＡＮからＮＡＮまたはＮＵＳへ（ＳはＧまたはＣであり、Ｎは任意のヌクレオチドである）
【００５８】
表
【００５９】
【表１】
【００６０】
【表２】
【００６１】
【表３】
【００６２】
【表４】
【００６３】
【表５】
【００６４】
これから以下の図を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】哺乳動物発現系におけるＥＧＦＰの発現に及ぼすＵＵおよびＵＡジヌクレオチドの減少の効果を野生型配列と比べて示すグラフである。
【図２】ＲＮａｓｅ Ｌの同時過剰発現を伴う哺乳動物発現系におけるＥＧＦＰの発現に及ぼすＵＵおよびＵＡジヌクレオチドの減少の効果を、野生型配列と比べて示すグラフである。
【図３】ＵＵ／ＵＡ減少型改変ＥＧＦＰ配列または野生型ＥＧＦＰ配列を有するＰＣＲ産物をトランスフェクションされた哺乳動物細胞におけるＧＦＰ蛍光を示すグラフである。
【図４】野生型または改変（すなわちＵＵ／ＡＧを減少させた）ホタルルシフェラーゼ発現ベクターのいずれかをトランスフェクションされたＨｅｋ２９３細胞におけるルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図５】野生型またはＵＵ／ＵＡ減少型ホタルルシフェラーゼ発現ベクターから生成した異なるＰＣＲ産物を、トランスフェクションされたＨｕｈ７細胞におけるルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図６】野生型またはＵＵ／ＵＡ減少型Ｂ型肝炎表面抗原発現ベクターをトランスフェクションされたＨｅｋ２９３細胞におけるＢ型肝炎表面抗原の発現を示すグラフである。
【図７】ＭＯＤＣで不安定化された野生型およびＭＯＤＣで不安定化されたＵＵ／ＵＡ減少型緑色蛍光タンパク質をトランスフェクションされたＨｅｋ２９３細胞における様々な緑色蛍光タンパク質の発現を示すグラフである。
【００６６】
これから以下の実施例を参照して本発明をさらに説明するが、それらの実施例は、例示であって、本発明の範囲を限定するつもりはない。
【００６７】
実施例１：イントロンにおけるＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドの減少
／＝スプライシング部位
下線＝コンセンサス機能的部位
太字の下線付き斜体＝ブランチポイント
【００６８】
配列番号：１： 野生型ウサギβグロビン−イントロン１（ＲＢＴＧ１）：
【００６９】
【化１】
【００７０】
配列番号：２： ＵＵ／ＵＡ減少型ＲＢＴＧ１（ＣＴリッチ領域にＵＵ／ＵＡ減少を有さず）：
【００７１】
【化２】
【００７２】
配列番号：３： ＵＵ／ＵＡ減少型ＲＢＴＧ１（ＣＴリッチ領域に最低限のＵＵ／ＵＡ減少を有する）：
【００７３】
【化３】
【００７４】
実施例２： ３’ＵＴＲにおけるＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドの減少
．＝欠失
下線＝突然変異
太字の下線付き＝ポリＡシグナル
【００７５】
配列番号：４： 野生型ＳＶ４０ ３’ＵＴＲ
【００７６】
【化４】
【００７７】
配列番号：５： ＵＵ／ＵＡ減少型ＳＶ４０ ３’ＵＴＲ
【００７８】
【化５】
【００７９】
配列番号：６： 野生型ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）３’ＵＴＲ
【００８０】
【化６】
【００８１】
配列番号：７： ＵＵ／ＵＡ減少型ＢＧＨ ３’ＵＴＲ
【００８２】
【化７】
【００８３】
実施例３： コード領域におけるＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドの減少
配列番号：８： 野生型の強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）
【００８４】
【化８】
【００８５】
配列番号：９： ＵＵ／ＵＡ減少型ＥＧＦＰ（「スーパーＧＦＰ」）
【００８６】
【化９】
【００８７】
配列番号：１０
MONTASTREA CAVERNOSA由来野生型ＧＦＰ配列
【００８８】
【化１０】
【００８９】
配列番号：１１
ＭＯＮＳＴＥＲ−ＯＭ：ＵＵ／ＵＡジヌクレオチド数を減少させることによる改変型の配列番号：１０
【００９０】
【化１１】
【００９１】
配列番号：１２
CLAVULARIA種 − 野生型配列
【００９２】
【化１２】
【００９３】
配列番号：１３
CLAVULARIA種−ＯＭ：改変（ＵＵ／ＵＡ減少）
【００９４】
【化１３】
【００９５】
配列番号：１４
ホタルルシフェラーゼ＋：野生型配列：
【００９６】
【化１４】
【００９７】
配列番号：１５
ＬＵＣ＋ＤＵ（ＳｕｐｅｒＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ）：（ＵＵ／ＵＡ減少型）
【００９８】
【化１５】
【００９９】
配列番号：１６
ホタルＬＵＣ２ルシフェラーゼ野生型：
【０１００】
【化１６】
【０１０１】
配列番号：１７
ＬＵＣ２ＯＭ：ＬＵＣ２改変ＳｕｐｅｒＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ２（ＵＵ／ＵＡ減少型）
【０１０２】
【化１７】
【０１０３】
配列番号：１８
Puntellina Plumate（ＧＦＰ）野生型：
【０１０４】
【化１８】
【０１０５】
配列番号：１９
Puntellina Plumate（ＧＦＰ）：改変配列（ＵＵ／ＵＡ減少型）
【０１０６】
【化１９】
【０１０７】
配列番号：２０
Discosoma野生型配列由来赤色蛍光タンパク質
【０１０８】
【化２０】
【０１０９】
配列番号：２１
赤色蛍光タンパク質の改変配列
【０１１０】
【化２１】
【０１１１】
配列番号：２２
Ｂ型肝炎表面抗原野生型、ａｄｒＢ型肝炎ウイルス株：
【０１１２】
【化２２】
【０１１３】
配列番号：２３
ＨＢＳＡＧＯＭ：Ｂ型肝炎表面抗原改変配列：
【０１１４】
【化２３】
【０１１５】
配列番号：２４
ＨＢＳＡＧＭ：ＨＢＳＡＧＯＭ： Ｂ型肝炎表面抗原改変配列２
【０１１６】
【化２４】
【０１１７】
この配列は、ＵＵ／ＵＡ減少およびヒト化の両方を含む。
【０１１８】
配列番号：２５
ＩＦＮ−α、ヒト
【０１１９】
【化２５】
【０１２０】
配列番号：２６
ＩＦＮ−αＯＭ：改変配列
【０１２１】
【化２６】
【０１２２】
配列番号：２７
ＣＳＦ３Ｍコロニー刺激因子野生型配列、ヒト：
【０１２３】
【化２７】
【０１２４】
配列番号：２８
ＣＳＦ３Ｍコロニー刺激因子改変配列：
【０１２５】
【化２８】
【０１２６】
配列番号：２９
ＭＯＤＣ野生型配列（マウスオルニチンデカルボキシラーゼ）
【０１２７】
【化２９】
【０１２８】
配列番号：３０
ＭＯＤＣ改変配列：
【０１２９】
【化３０】
【０１３０】
不安定化および配列改変されたレポーター：
不安定化および改変されたレポーター配列の例：
配列番号：３１
MONTASTRAEA CAVERNOSA
【０１３１】
【化３１】
ＭＯＤＣ配列は太字
【０１３２】
配列番号：３２
Clavulariidae Clavularia−ＯＭ：改変
【０１３３】
【化３２】
【０１３４】
配列番号：３３
ホタルＬＵＣ＋ＤＵ（ＳｕｐｅｒＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ）：
【０１３５】
【化３３】
【０１３６】
配列番号：３４
ホタルＬＵＣ２ＯＭ：ＬＵＣ２改変ＳｕｐｅｒＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ２
【０１３７】
【化３４】
【０１３８】
配列番号：３５
Puntellina Plumate ＧＦＰ：改変配列
【０１３９】
【化３５】
【０１４０】
配列番号：３６
赤色蛍光タンパク質の改変配列
【０１４１】
【化３６】
【０１４２】
実施例４：ＵＵ／ＵＡ減少型ＥＧＦＰのｉｎ ｖｉｖｏ分析
（１）改変ＥＧＦＰ配列は、遺伝子合成会社によってカスタム合成され、隣接するＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ部位を有するようにｐＵＣ１９ベクター中に供給した。０．１μg/ml ＢＳＡを含有する緩衝液中に１０ユニットのＳａｌＩで、１０μgのベクターを３７℃で１時間消化させ、続いてＢａｍＨＩ緩衝液中のＢａｍＨＩで３７℃でさらに１時間消化させた。消化されたＤＮＡをフェノール−クロロホルム法を用いて抽出し、続いてエタノール沈殿を行った。ＣＭＶプロモーターおよびＢＨＧ ３’ＵＴＲを有する発現ベクターを同じ制限酵素（ＳａｌＩおよびＸｂａＩ）で消化しておいたものにに合成ＥＧＦＰ−コード領域をライゲーションし、フェノール−クロロホルム抽出によって精製し、続いてエタノール沈澱を行った。発現ベクターへのＥＧＦＰ−ＤＮＡのクローニングは、以下のライゲーション反応を用いて行った：消化されたベクターＤＮＡ ３０μgを消化されたＥＧＦＰ−ＤＮＡ ９０μｇと共に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを含有する反応液１０μl中で混合した。ライゲーション産物を使用して、ＤＨ５αコンピテントE. coli細胞をトランスフォーメーションし、続いて結果として得られたコロニーを細菌培養培地中でエクスパンションさせた。Qiagenプラスミド精製キット（Qiagen, Germany）を使用してリコンビナントＤＮＡを抽出した。挿入物を有するベクターのサイズは、ゲル電気泳動を用いて検証した。野生型ＤＮＡを有するベクターに加えて、ＵＵ／ＵＡ減少型改変コード領域を有する、結果として得られた発現ベクターを機能的実験に使用して、コードされたタンパク質の発現を確認した。１０％ ＦＢＳおよび抗生物質（Invitrogen）を補充したＤＭＥＭ培地中で標準培養条件（３７℃、５％ ＣＯ２）でＨＥＫ２９３細胞を成長させた。９６ウェルプレートのウェル１個あたり２．５×１０４個の細胞に、ＥＧＦＰのＵＵ／ＵＡ減少型改変コード領域を有するベクターまたは野生型ＥＧＦＰ−ＤＮＡを有するベクター１００ngをトランスフェクションした。Lipofectamine 2000（Invitrogen）を使用して無血清培地中でトランスフェクションを５時間行い、続いて培地を血清補充培地に置換した。約２４または４８時間後に、プレートをイメージングし、ＢＤハイコンテントイメージング装置を使用して定量した。定量は、Proxcellイメージングアルゴリズムを用いて行った。
【０１４３】
データは、ＥＧＦＰのＵＵ／ＵＡ減少型コード領域の使用が、野生型ＥＧＦＰ−ＤＮＡに比べて真核細胞におけるＥＧＦＰの有意に高い発現（２．５〜３倍）を可能にすることを明らかに示している（図１）。
【０１４４】
（２）１０％ ＦＢＳおよび抗生物質（Invitrogen）を補充したＤＭＥＭ培地中で標準培養条件（３７℃、５％ ＣＯ２）でＨＥＫ２９３細胞を成長させた。９６ウェルプレートのウェル１個あたり２．５×１０４個の細胞に、ＥＧＦＰのＵＵ／ＵＡ減少型改変コード領域を有するベクターまたは野生型ＥＧＦＰ−ＤＮＡを有するベクター１００ngをトランスフェクションした。また細胞に、空の対照ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）またはＲＮａｓｅ Ｌベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）のいずれかを同時トランスフェクションした。トランスフェクションは、Lipofectamine 2000（Invitrogen）を用いて無血清培地中で５時間行い、続いて培地を血清補充培地と置換した。約２４または４８時間後に、プレートをイメージングし、ＢＤハイコンテントイメージング装置を使用して定量した。定量は、Proxcellイメージングアルゴリズムを用いて行った。
【０１４５】
データは、野生型ＥＧＦＰ配列に比べて／対照的に、改変ＥＧＦＰ配列の使用がより高い発現を招き、それがＲＮａｓｅ Ｌの同時発現によって制約されなかったことを示している（図２）。
【０１４６】
（３）フォワード（５’）プライマーがＣＭＶプロモーター領域の開始部またはＣＭＶプロモーター上流の配列に相補性であって、リバース（３’）プライマーがＢＧＨポリＡ部位またはこの部位の下流の配列に相補的な、プライマーを使用することによって、発現活性ＰＣＲ産物を生成させた。１００μｌの反応液中でＴａｑおよびＰｆｕポリメラーゼ混合物を使用して以下のサイクル条件でＰＣＲを実施した：９５℃、１２分（ホットスタートポリメラーゼを活性化する）、９４℃、１分；５２℃、１分；７２℃、４分を３２サイクル、および７２℃で７分の最終伸長。プライマー、小型ＰＣＲ産物、緩衝剤、および酵素を除去するためにQiagen ＰＣＲ精製カラムを使用してＰＣＲ産物を精製し、滅菌水に溶出した。１０％ ＦＢＳおよび抗生物質（Invitrogen）を補充したＤＭＥＭ培地中で標準培養条件（３７℃、５％ ＣＯ２）でＨＥＫ２９３細胞を成長させた。９６ウェルプレートのウェル１個あたり２．５×１０４個の細胞に、野生型または改変配列を有するＥＧＦＰ発現ベクターから生成した精製ＰＣＲ産物１００ngをトランスフェクションした。トランスフェクションは、Lipofectamine 2000（Invitrogen）を使用して無血清培地中で５時間行い、続いて培地を血清補充培地と置換した。約２４または４８時間後に、プレートをイメージングし、ＢＤハイコンテントイメージング装置を使用して定量した。定量は、Proxcellイメージングアルゴリズムを用いて行った。
【０１４７】
データは、ＥＧＦＰのＵＵ／ＵＡ減少型コード領域を有するＰＣＲ産物が、野生型配列を有するＰＣＲ産物よりも高いＥＧＦＰ発現（５〜１０倍の増大）を誘導したことを示している（図３）。
【０１４８】
（４）（２）および（３）に記載したものと同じ方法を用いて、野生型またはＵＵ／ＵＡを減少させたホタルルシフェラーゼ発現ベクター（「ＳｕｐｅｒＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ」、配列番号：１５）をＨｅｋ２９３細胞にトランスフェクションした。ルシフェラーゼの活性レベルは、ルミノメーターによって定量した。データは、２回の独立した実験の中で約５倍および約１００倍の差があったことを示している（図４）。
【０１４９】
同様に、上記（３）に概略した方法によって野生型または改変ホタルルシフェラーゼ発現ベクター（「ＳｕｐｅｒＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ」、配列番号：１５）から生成した異なるＰＣＲ産物をＨｕｈ７細胞にトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性レベルは、今回もルミノメーターで定量した。そのデータは、ＳｕｐｅｒＬｕｃｉｆｅｒａｓｅのＵＵ／ＵＡ減少型コード領域を有するＰＣＲ産物が野生型配列を有するＰＣＲ産物よりも実質的に高いルシフェラーゼの発現（２０〜１００倍の増大）を誘導したことを示している（図５）。これは、本発明による方法が、真に多様なレポータータンパク質で有効であることを実証している。
【０１５０】
同様に、上記（２）と同じ方法を用いて野生型またはＵＵ／ＵＡ減少型Ｂ型肝炎表面（配列番号：２３）抗原発現ベクターをＨｅｋ２９３細胞にトランスフェクションした。発現されたタンパク質をmIU/mlとして定量した。約４倍の差があった（図６）が、これは、おそらく独立した実験ではいっそう高い場合があるであろう。
【０１５１】
これは、本発明による方法が、改変された、すなわちコード配列がＵＵ／ＵＡ減少型である治療用タンパク質、抗体およびワクチンでもまた有効であり、このことが実質的な発現増大を誘導することの一例である。
【０１５２】
（５）転写変化およびその後のレポートされたタンパク質レベルに対する効果を反映させるために、ＰＥＳＴ配列（＝プロリン、グルタミン酸、セリンおよびトレオニンに富むペプチド配列）を含むタンパク質不安定化アミノ酸領域を使用して、様々なレポータータンパク質の半減期を短縮した。ＰＥＳＴ配列は、短い細胞内半減期を有するタンパク質と関連する。Liら（J. Biol. Chem., 1998, 273, pp. 34970-34975）は、ＥＧＦＰを不安定化するためのＭＯＤＣのＰＥＳＴ配列の使用を記載し、Leclercら（Biotechniques, 2000, 29, pp. 590-591, pp. 594-596は、ホタルルシフェラーゼのタンパク質半減期を短縮するためにＰＥＳＴ配列を使用した。
【０１５３】
そのようなＭＯＤＣドメイン（マウスオルニチンデカルボキシラーゼ）、さらに具体的には高度不安定性ＭＯＤＣの分解ドメインのアミノ酸４２２〜４６１を使用して、本発明者らは、いくつかのレポーター遺伝子を前記ＭＯＤＣドメインと融合させることによって不安定にした。さらに、本発明者らは、Aequorea Victoria、Montastrea Cavernosa、ClavulariaおよびPuntelina Plumate由来ＥＧＦＰに関して、本発明にしたがってレポーター遺伝子およびＭＯＤＣドメインの両方におけるＵＵ／ＵＡジヌクレオチド数を減少させることによって、そのような融合体を改変した。ＵＵ／ＵＡジヌクレオチド数は、融合体のＥＧＦＰ部およびＭＯＤＣ部の両方で減少させた。
【０１５４】
それぞれフォワードおよびリバースプライマーにＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位を有する特異的プライマーを使用して、マウス線維芽細胞のゲノムＤＮＡからＭＯＤＣドメインを増幅させた。同じ制限部位を使用して、増幅したｃＤＮＡを、ＧＦＰコード領域を有するフレーム内にクローニングした。図７に示すように、Ｈｅｋ２９３細胞に不安定化されたＧＦＰをトランスフェクションした。イメージング装置およびソフトウェアによって蛍光強度を定量した。Aequorea Victoria由来の不安定化野生型ＥＧＦＰに比べて（すなわち評価の基準は、野生型ＭＯＤＣ（配列番号：２９）と融合した野生型ＥＧＦＰ（配列番号：８）であった）、改変Aequorea Victoria由来蛍光からは２倍の増大、改変Montastrea Cavernosa緑色蛍光タンパク質からは８倍の増大、改変Clavularia緑色蛍光タンパク質からは４倍の増大、および改変Puntelina Plumate緑色蛍光タンパク質からは７倍の増大があった（図７参照）。本明細書における「改変」という用語は、「ＵＵ／ＵＡ減少型であって、ＭＯＤＣ（それ自体もＵＵ／ＵＡ減少型）と融合された」ことを意味する。
【０１５５】
結果として、このことは、通常発現シグナルがより弱い状況でも本発明が有効であり、そのような状況で本発明が発現の増大倍率を改善することを示している。
【０１５６】
【表６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の核酸配列におけるＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる工程を含む、細胞における、好ましくは真核細胞における該タンパク質の発現を増大させる方法。
【請求項２】
ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数が、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、さらに好ましくは少なくとも５０％減少される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
切断部位が、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる工程が、核酸配列のコード領域における該数を減少させる、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
核酸配列におけるＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる工程が、タンパク質のアミノ酸配列を変更せずに行われる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる工程において、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを含むコドンが、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを含まず、同じアミノ酸をコードする代替コドンに交換される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる工程において、該隣接コドン対の少なくとも一つのコドンが、同じアミノ酸をコードする代替コドンに交換され、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを含む隣接コドン対がもはやＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを含まない、請求項５記載の方法。
【請求項８】
代替コドンが、細胞において、好ましくは真核細胞において、より頻繁に使用されるコドンである、請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる工程が、核酸配列の非コード領域における該数を減少させる、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
非コード領域が、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、またはイントロンである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる工程が、ヌクレオチドの突然変異、欠失、または挿入によって行われる、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる工程の前に、コドン最適化の工程をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる工程の後に、細胞内に、好ましくは真核細胞内に、発現活性ＰＣＲ産物の形のまたは発現ベクターに含まれる、タンパク質の核酸配列をトランスフェクションする工程をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
細胞において、好ましくは真核細胞において発現活性ＰＣＲ産物または発現ベクターからタンパク質を翻訳させる工程をさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質が、レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗体、ワクチン、膜タンパク質、融合タンパク質、血漿タンパク質、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、ケモカイン、およびＧＰＣＲを含む群より選択される、請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数が、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、さらに好ましくは少なくとも５０％減少している、核酸配列。
【請求項１７】
レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗体、ワクチン、膜タンパク質、融合タンパク質、血漿タンパク質、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、ケモカイン、およびＧＰＣＲを含む群より選択されるタンパク質の核酸配列である、請求項１６記載の核酸配列。
【請求項１８】
配列番号：２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２３、２４、２６、２８、３０〜３６より選択される配列を有する、請求項１６記載の核酸配列。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれか記載の核酸配列を含む、発現活性ＰＣＲ産物または発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９記載の発現活性ＰＣＲ産物または発現ベクターを有する任意の生物のホスト細胞。
【請求項２１】
レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗体、ワクチン、膜タンパク質、融合タンパク質、血漿タンパク質、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、ケモカイン、およびＧＰＣＲを含む群より選択される、請求項１４記載の方法によって産生されたタンパク質。
【請求項１】
タンパク質の核酸配列におけるＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる工程を含む、細胞における、好ましくは真核細胞における該タンパク質の発現を増大させる方法。
【請求項２】
ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数が、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、さらに好ましくは少なくとも５０％減少される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
切断部位が、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる工程が、核酸配列のコード領域における該数を減少させる、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
核酸配列におけるＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる工程が、タンパク質のアミノ酸配列を変更せずに行われる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる工程において、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを含むコドンが、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを含まず、同じアミノ酸をコードする代替コドンに交換される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる工程において、該隣接コドン対の少なくとも一つのコドンが、同じアミノ酸をコードする代替コドンに交換され、ＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを含む隣接コドン対がもはやＵＵおよび／またはＵＡジヌクレオチドを含まない、請求項５記載の方法。
【請求項８】
代替コドンが、細胞において、好ましくは真核細胞において、より頻繁に使用されるコドンである、請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる工程が、核酸配列の非コード領域における該数を減少させる、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
非コード領域が、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、またはイントロンである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる工程が、ヌクレオチドの突然変異、欠失、または挿入によって行われる、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる工程の前に、コドン最適化の工程をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数を減少させる工程の後に、細胞内に、好ましくは真核細胞内に、発現活性ＰＣＲ産物の形のまたは発現ベクターに含まれる、タンパク質の核酸配列をトランスフェクションする工程をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
細胞において、好ましくは真核細胞において発現活性ＰＣＲ産物または発現ベクターからタンパク質を翻訳させる工程をさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質が、レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗体、ワクチン、膜タンパク質、融合タンパク質、血漿タンパク質、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、ケモカイン、およびＧＰＣＲを含む群より選択される、請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
ＲＮａｓｅ Ｌの切断部位数が、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、さらに好ましくは少なくとも５０％減少している、核酸配列。
【請求項１７】
レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗体、ワクチン、膜タンパク質、融合タンパク質、血漿タンパク質、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、ケモカイン、およびＧＰＣＲを含む群より選択されるタンパク質の核酸配列である、請求項１６記載の核酸配列。
【請求項１８】
配列番号：２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２３、２４、２６、２８、３０〜３６より選択される配列を有する、請求項１６記載の核酸配列。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれか記載の核酸配列を含む、発現活性ＰＣＲ産物または発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９記載の発現活性ＰＣＲ産物または発現ベクターを有する任意の生物のホスト細胞。
【請求項２１】
レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗体、ワクチン、膜タンパク質、融合タンパク質、血漿タンパク質、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、ケモカイン、およびＧＰＣＲを含む群より選択される、請求項１４記載の方法によって産生されたタンパク質。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５１４９８６（Ｐ２０１２−５１４９８６Ａ）
【公表日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４５６９７（Ｐ２０１１−５４５６９７）
【出願日】平成２２年１月１９日（２０１０．１．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０００２７１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８１７４１
【国際公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【出願人】（５１１１７４４６５）
【氏名又は名称原語表記】ＫＩＮＧ ＦＡＩＳＡＬ ＳＰＥＣＩＡＬＩＳＴ ＨＯＳＰＩＴＡＬ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＥＮＴＲＥ
【出願人】（５１１１７４４７６）テラマーク・マーケンクリエーション・ゲーエムベーハー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＥＲＲＡＭＡＲＫ ＭＡＲＫＥＮＣＲＥＡＴＩＯＮ ＧＭＢＨ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月１９日（２０１０．１．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０００２７１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８１７４１
【国際公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【出願人】（５１１１７４４６５）
【氏名又は名称原語表記】ＫＩＮＧ ＦＡＩＳＡＬ ＳＰＥＣＩＡＬＩＳＴ ＨＯＳＰＩＴＡＬ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＥＮＴＲＥ
【出願人】（５１１１７４４７６）テラマーク・マーケンクリエーション・ゲーエムベーハー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＥＲＲＡＭＡＲＫ ＭＡＲＫＥＮＣＲＥＡＴＩＯＮ ＧＭＢＨ
【Ｆターム（参考）】
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