細胞の低温保存
本発明は、形質転換細胞および非形質転換細胞の低温保存のための方法に関する。低温保存された細胞を回収する方法もまた本発明によって提供される。低温保存から首尾よく回収された細胞の培養物もまた提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本願は、２００４年１１月５日出願の米国仮出願第６０／６２５，４０１号の恩典を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、形質転換細胞および非形質転換細胞の低温保存のための方法に関する。低温保存された細胞を回収する方法もまた本発明によって提供される。低温保存から首尾よく回収された細胞の培養物もまた提供される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
バイオ医薬およびバイオ農芸化学品生産のための「マスターシード（ｍａｓｔｅｒ ｓｅｅｄ）」原理は、生きた生物を製造手順の一部として利用し、以下のいくつかの基本的信条に依存する：１）規定された起源および継代履歴の単一培養物が、細胞表現型および所望の製造特性の規定された特徴を有して保存され；２）保存、代表的には低温保存は、長期にわたり（数年以上にわたり）；３）細胞は「ワーキングシード（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｅｅｄ）」へ無限に回収、拡大、継代され、そして別の低温保存期間に供され（細胞の頑強さを必要とする原理）；そして４）細胞は規定された継代数の後に、最初の低温状態より前に見出された細胞の表現型および所望の製造特性の規定された特徴を失わない。
【０００４】
植物細胞の低温保存に関する技術は、バイオ医薬製造環境における生物学的物質の使用のために必要とされる特性に関する教示を欠いている。詳細には、生存生物学的物質の延長された貯蔵のために案出される任意の技術は、好ましくは以下の基準を満たすべきである：１）貯蔵方法は、長期間（数年）にわたって安定な生物学的物質を提供しなければならず、２）貯蔵条件は、製造プロセスに必要とされる生物学的物質を変化させるべきでなく、そして３）一旦貯蔵から取り出すと当該物質は容易に再増殖のために利用可能であり、再増殖させられ得るワーキングシードへ拡大可能であるべきである。
【０００５】
低温保存の長さ（しばしば月でまたは時間でさえも測定される）に関する先行技術において、情報はほとんど入手可能でなく、通常の培養条件下で無限にまたは少なくとも所望の継代数まで細胞が増殖させられ得るかどうかについての限られた情報が存在する。さらに、１次マスターシードストックおよび拡大され再低温保存されたワーキングシードストックの両方由来の、貯蔵からの取り出し後の延長された貯蔵または延長された培養の間での標的遺伝子または標的産物の遺伝子および産物安定性は、非常に少しのデータによってしか明らかにされていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、当該分野はマスターシード原理下でのバイオ製造標的成分の長期間増殖、再低温保存および安定性を提供する植物細胞の長期間貯蔵用の処理の方法またはセットを必要としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、形質転換細胞および非形質転換細胞の低温保存のための方法に関する。低温保存された細胞を回収する方法もまた本発明によって提供される。低温保存から首尾よく回収された細胞の培養物もまた提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は、形質転換または非形質転換細胞の低温保存のための方法を提供する。本発明の特定の実施態様において、方法は低温保存組成物の形成、および形質転換または非形質転換真核生物細胞を低温保存する方法を提供する。
【０００９】
従って、本発明の１つの実施態様は、形質転換（または非形質転換）真核生物細胞を含む低温保存組成物の形成方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：
ａ）選択可能培地の上／中で、形質転換（または非形質転換）細胞を増殖させる工程；
ｂ）培養培地を含む培養フラスコに細胞を接種して、液体培養物を形成し、そして形質転換（または非形質転換）細胞の液体培養物を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回継代する工程；
ｃ）継代された細胞を回収する工程；および
ｄ）回収された細胞を低温保存培地に添加して、低温保存組成物を形成する工程。
【００１０】
本発明の別の実施態様は、以下の工程を包含する、形質転換（または非形質転換）真核生物細胞の低温保存方法を提供する：
ａ）選択可能培地の上／中で、形質転換（または非形質転換）細胞を増殖させる工程；
ｂ）培養培地を含む培養フラスコに細胞を接種して、液体培養物を形成し、そして形質転換（または非形質転換）細胞の液体培養物を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回継代する工程；
ｃ）継代された細胞を回収する工程；
ｄ）回収された形質転換（または非形質転換）細胞を低温保存培地に添加して、低温保存組成物を形成する工程；および
ｅ）低温保存組成物を低温保存する工程。
【００１１】
さらに別の実施態様は、以下の工程を包含する、形質転換（または非形質転換）細胞の低温保存方法を提供する：
ａ）選択可能培地の上／中で、形質転換（または非形質転換）細胞を１〜１０日間増殖させる工程；
ｂ）培養培地を含む培養フラスコに細胞を接種して、液体培養物を形成する工程；
ｃ）液体培養物を、およそ対数増殖期中期まで培養する工程；
ｄ）液体培養物の第１の容量（ＶＯＬ１）を抜き取り、そしてそれを培養培地の第２の容量（ＶＯＬ２）を含む培養フラスコ中に接種する工程；
ｅ）工程ｄ）を少なくともさらに１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回繰り返す（細胞を継代する）工程；
ｆ）継代された細胞を回収する工程；
ｇ）継代された細胞を、第２の培地の１容量中に懸濁する工程；
ｈ）低温保存培地を、工程ｇ）において提供された懸濁された細胞に添加して、低温保存組成物を形成する工程；
ｉ）低温保存組成物を冷却する工程；および
ｊ）低温保存組成物を凍結する工程。
【００１２】
本発明によれば、１つの実施態様は植物細胞の低温保存を提供する。単子葉植物または双子葉植物由来の細胞は、本発明に従って低温保存され得る。従って、形質転換および非形質転換単子葉植物または双子葉植物細胞は、本明細書において教示される種々の方法を使用して低温保存され得る。本明細書において教示される発明の種々の実施態様において、トランスジェニックおよび非トランスジェニックタバコおよびイネ細胞は低温保存、貯蔵および回収されて、もとの培養物の遺伝子型および表現型を保持した、増殖細胞培養物を確立する。
【００１３】
従って、本発明は、形質転換植物細胞の低温保存（所望によりマスターシード原理下での）のための方法を提供する。本発明の特定の実施態様において、方法はマスターシード原理下で、ニコチナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉｎａ ｔａｂａｃｕｍ）（ＮＴ−１およびＢＹ−２）細胞ならびにＴ３０９イネ細胞の低温保存のための方法に適用される。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｅｄｓ． Ｔ． Ｎａｇａｔａ， Ｓ． Ｈａｓｅｚａｗａ， ａｎｄ Ｄ． Ｉｎｚｅ； Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ； Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ； ２００４を参照のこと。
【００１４】
Ｔ３０９イネ細胞株は、標準的な植物組織培養技術を使用して、市販のイネＴ３０９変種から調製された。本発明の実施に適切なさらなる形質転換および非形質転換植物細胞は、表１において提供される。
【００１５】
本発明の別の実施態様は、形質転換植物細胞を含む低温保存組成物の形成方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：
ａ）選択可能培地上で、カルス上の形質転換植物細胞を増殖させる工程；
ｂ）培養培地を含む培養フラスコにカルス由来の植物細胞を接種して、液体培養物を形成し、そして形質転換植物細胞の液体培養物を少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回継代する工程；
ｃ）継代された植物細胞を回収する工程；および
ｄ）回収された形質転換植物細胞を低温保存培地に添加して、低温保存組成物を形成する工程。
【００１６】
本発明の別の実施態様は、形質転換植物細胞の低温保存方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する；
ａ）選択可能培地上で、カルス上の形質転換植物細胞を増殖させる工程；
ｂ）培養培地を含む培養フラスコにカルス由来の植物細胞を接種して、液体培養物を形成し、そして形質転換植物細胞の液体培養物を少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回継代する工程；
ｃ）継代された植物細胞を回収する工程；
ｄ）回収された形質転換植物細胞を低温保存培地に添加して、低温保存組成物を形成する工程；および
ｅ）低温保存組成物を低温保存する工程。
【００１７】
さらに別の形質転換植物細胞の低温保存方法は、以下の工程を包含する：
ａ）選択可能培地上で、カルス上の形質転換植物細胞を１〜１０日間増殖させる工程；
ｂ）培養培地を含む培養フラスコにカルス由来の植物細胞を接種して、液体培養物を形成する工程；
ｃ）液体培養物をおよそ対数増殖期中期まで培養する工程；
ｄ）およそ対数増殖期中期まで増殖した液体培養物の第１の容量（ＶＯＬ１）を抜き取り、培養培地の第２の容量（ＶＯＬ２）を含む培養フラスコ中に第１の容量を接種して、継代培養物を形成し、そして継代培養物をおよそ対数増殖期中期まで培養する工程；
ｅ）所望により、工程ｄ）を少なくともさらに１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回繰り返す工程；
ｆ）継代培養物から、植物細胞を回収する工程；
ｇ）植物細胞を第２の培地の容量（ＣＵＬＴ）中に懸濁する工程；
ｈ）低温保存培地の容量（ＣＲＹＯ）を、工程ｇ）において提供された懸濁された植物細胞に添加して、低温保存組成物を形成する工程；
ｉ）低温保存組成物を冷却する工程；および
ｊ）低温保存組成物を凍結する工程。
【００１８】
用語「継代」は、用語「短周期条件（ｓｈｏｒｔ ｃｙｃｌｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」と互換的に使用され得る。継代または短周期条件は、指数（対数）増殖期中期の間に細胞を収集する（抜き取る）こと；指数増殖期中期の細胞を新鮮な培養培地で希釈または分割すること、および希釈（分割）された細胞培養物を指数増殖期中期まで培養することとして記載される。
【００１９】
本発明の目的のために、用語「対数増殖期中期」および「指数増殖期中期」が指数増殖期の厳密な中間点をいうのではなく、むしろ数学的な中間点の周辺の範囲をいうことを、当業者は理解する。指数増殖期中期までの培養の各回は、１細胞継代と考えられる。懸濁物から低温保存されるべき細胞は、１短周期（継代）のみまたは２０短周期までで首尾よく低温保存され得る。３〜６短周期が好ましく、そして６短周期が最も好ましい。本発明者らは、６短周期（継代）が再培養のために低温保存された状態からの細胞の格別な回収を可能にすることを示している。さらに、１〜６回の短周期条件下で細胞が懸濁物中に置かれる限り、細胞は培養後複数回低温保存され得る。希釈または分割する工程において、新鮮な培地の容量（ＶＯＬ２）に添加される細胞の容量（ＶＯＬ１）は、ＶＯＬ２に対するＶＯＬ１の比率において変動し得る。ここで、ＶＯＬ１およびＶＯＬ２は独立して、１〜少なくとも２０；１〜少なくとも１０；または１〜少なくとも５（任意のこれらの値の間の端数値を含む）の範囲である。１つの実施態様において、ＶＯＬ１：ＶＯＬ２は１：３である。
【００２０】
以下で教示する各方法がさらなる方法工程を包含し得ることにさらに留意するべきである。例えば、低温保存された形質転換植物細胞を融解し、低温保存された細胞を培養培地中に懸濁し（または、固形選択可能培地上で細胞を増殖させてカルスを形成させ）、そしてバイオ製造プロセスにおける使用のためにそれを増殖させる（例えば、増殖容器（例えば、発酵槽、撹拌タンク反応器など）において細胞を培養する）ことが可能である。バイオ製造プロセス由来の細胞は、本発明の低温保存方法に供され得、そしてマスターシード原理に従って貯蔵され得る。
【００２１】
非形質転換および形質転換単子葉植物および双子葉植物細胞の増殖に適切な選択可能培地および培養培地は、当業者に公知であり、そして当業者により容易に利用可能である（例えば、Ｄｉｆｃｏ（登録商標）＆ ＢＢＬ（登録商標）Ｍａｎｕａｌ， Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａを参照のこと）。
【００２２】
低温保存組成物が形成されるべき場合、再懸濁された細胞を含む培養培地の種々の容量（ＣＵＬＴ）は、低温保存培地の種々の容量（ＣＲＹＯ）と混合され得る。これら混合物は、ＣＵＬＴ：ＣＲＹＯの比率で混合され、ここでＣＵＬＴは１〜１００（その端数値を含む）の範囲であり、そしてＣＲＹＯは１〜１００（その端数値を含む）の範囲である。いくつかの実施態様において、ＣＵＬＴおよびＣＲＹＯは、１〜１０の範囲である。他の実施態様において、等容量のＣＵＬＴおよびＣＲＹＯが混合されて、低温保存組成物が形成される。
【００２３】
本発明はまた、前記低温保存方法のいずれかによって作製される低温保存された細胞または細胞株を提供する。
【００２４】
本発明の種々の実施態様において、低温保存されるべき細胞は薬剤（例えば、米国特許第５，９６５，４３８号または同第６，１２７，１８１号（その開示の全体を出典明示で援用する、特に米国特許第５，９６５，４３８号の第６欄１６行目から第７欄３４行目および米国特許第６，１２７，１８１号の第６欄６０行目から第９欄２２行目）の教示に記載されるように、細胞によって培養培地中に分泌される有害物質を除去することによって、細胞の生存率を増加させる、安定剤）で「前処理」または「前培養」されない。’４３８特許において考察されるように、安定剤前処理は、増殖または細胞死の間に細胞によって分泌される有害物質の除去に関する。さらに、本発明は、培養条件下で細胞に添加される１つ以上の「浸透圧剤」、エチレン阻害剤および／または膜安定剤での前処理の使用を排除し得る。特に、安定剤、浸透圧剤、エチレン阻害剤および／または膜安定剤は、細胞が培養されている間に、前処理プロトコルにおいて本発明の既に調製された培養培地には添加されないが、’４３８または’１８１特許において同定される物質は、本発明による細胞の培養のために事前に調製された培地の成分であり得る。従って、安定剤、浸透圧剤、エチレン阻害剤および／または膜安定剤は、細胞の培養の間、’４３８または’１８１特許に記載されるようには培養培地に添加されない（必要応じて補充されない）（例えば、米国特許第５，９６５，４３８号の第７欄７〜１６行目および米国特許第６，１２７，１８１号の第９欄３６〜４７行目を参照のこと）。
【００２５】
従って、細胞が培養されている時に、以下の物質は培養培地に添加されず、また必要に応じて補充されない：安定剤（例えば、還元グルタチオン、１，１，３，３−テトラメチル尿素、１，１，３，３−テトラメチル−２−チオ尿素、チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸銀、ベタイン、ｎ，ｎ−ジメチルホルムアミド、ｎ−（２−メルカプトプロピオニル）グリシン、β−メルカプトエチルアミン、セレノメチオニン、チオ尿素、プロピルガレート、ジメルカプトプロパノール、アスコルビン酸、システイン、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム（sodium diethyl dithiocarbomate）、スペルミン、スペルミジン、フェルラ酸、セサモール、レゾルシノール、プロピルガレート、ｍｄｌ−７１，８９７、カダベリン、プトレシン、１，３−および１，２−ジアミノプロパン、デオキシグルコース、尿酸、サリチル酸、３−および４−アミノ−１，２，４−トリアゾール、安息香酸、ヒドロキシルアミンならびにそのような薬剤の組み合わせおよび誘導体）；エチレン生合成および／またはエチレン作用を妨げるかまたは実質的に防止する薬剤（例えば：リゾビトキシン、メトキシルアミンＨＣｌ、ヒドロキシルアミンアナログ、α−カナリン、ＤＮＰ（２，４−ジニトロフェノール）、ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、スペルミン、スペルミジン、ＡＣＣアナログ、α−アミノイソ酪酸、ｎ−プロピルガレート、安息香酸およびその誘導体、フェルラ酸、サリチル酸およびその誘導体、サリチル酸、セサモール、カダベリン、ヒドロキノン、エイラー（alar）、アモ−１６１８（amo-1618）、ＢＨＡ（ブチル化ヒドロキシアニソール）、フェニルエチルアミン、ブラシノステロイド、ｐ−クロロ第二水銀安息香酸、ｎ−エチルマレイミド、ヨード酢酸、塩化コバルトおよび他のコバルト塩、ビピリジル、アミノオキシ酢酸、塩化第二水銀および他の第二水銀塩、サリチルアルコール、サリシン、塩化ニッケルおよび他のニッケル塩、カテコール、フロログルシノール（pffloroglucinol）、１，２−ジアミノプロパン、デスフェリオキサミン、インドメタシン、１，３−ジアミノプロパン、ベンジルイソチオシアネート、硫酸８−ヒドロキシキノリン、クエン酸８−ヒドロキシキノリン，２，５−ノルボルナジエン、ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン（trans-cyclootene）、７−ブロモ−５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン、ｃｉｓ−プロペニルホスホン酸、ジアゾシクロペンタジエン、メチルシクロプロパン、２−メチルシクロプロパン、カルボン酸、メチルシクロプロパンカルボキシレート、シクロオクタジエン、シクロオクトジン（cyclooctodine）（クロロメチル）シクロプロパンならびに／または銀塩（例えば、チオ硫酸銀、硝酸銀、塩化銀、酢酸銀、リン酸銀、クエン酸三銀塩、安息香酸銀、硫酸銀、酸化銀、亜硝酸銀、シアン酸銀、乳酸銀塩、ペンタフルオロプロピオン酸銀、ヘキサフルオロリン酸銀、トルエンスルホン酸の銀塩およびその組み合わせ））；膜安定剤（例えば、脂質二重層中にインターカレートする化合物（例えば、ステロール、リン脂質、糖脂質、糖タンパク質）または二価カチオン）。
【実施例】
【００２６】
実施例１：低温保存
本実施例において使用した培地および成分を、表２〜４に記載する。成分を供給する業者もまた示す。低温保存されるべき細胞を、ＮＴ１培地を含む２５℃の振盪フラスコ中で増殖させ；細胞を対数（指数）増殖期中期（培養フラスコの接種の後３〜４日）において、１：３分割（または３０％接種）で少なくとも１〜１０継代（１つの実施態様は、少なくとも６継代を意図する）継代する。フラスコの外側を、無菌バイオセーフティーキャビネット（ｂｉｏｓａｆｅｔｙ ｃａｂｉｎｅｔ）へ移す前に１％次亜塩素酸ナトリウム（sodium hyperchlorite）溶液を用いて浄化し、次いで細胞を無菌の２２５ｍｌ遠心チューブへ移す前に、フラスコの外側を無菌アルコールパッドを用いてぬぐう。細胞を１０００ＲＰＭで１分間、４℃で遠心分離し、そして上清を無菌ピペットを用いて除去する。細胞を適切な培養培地を用いて開始容量に再懸濁し、無菌の１リットル三角フラスコへ移し、ここで等容量の低温保存培地を懸濁物に添加し、穏やかに回旋する。
【００２７】
次いで、軌道振盪機中２〜７℃で１時間細胞懸濁物を穏やかに振盪（１３０ＲＰＭ）することによって細胞を低温保存し、次いで氷上でバイオセーフティーキャビネットへ移し、無菌アルコールパッドを用いてぬぐう。細胞を直ちに無菌条件下で自動ピペッターを使用してクリオバイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）へ分注する。各バイアルに２．５ｍｌの細胞懸濁物を入れ、そして直ちに液体窒素中での貯蔵に使用すべきケイン（ｃａｎｅ）中に入れる；ロードしたケインを凍結時まで２〜７℃で保持すべきである。次いで、ケインを速度制御フリーザーに移す。凍結プロセスを４℃、１５分で開始し、−０．５℃／分の速度で４℃から−４０℃までの温度の連続的な降下がそれに続く。次いで、ケインを取り出し、ドライアイス上で予備冷却した貯蔵ラックに入れ；全てのケインが貯蔵ラックにロードされるとすぐに、ラックを直ちに気相を使用する液体窒素貯蔵タンクに入れる。
【００２８】
種々のバイオプロセスにおける使用のために低温保存から細胞を回収するために、クリオバイアルを液体窒素貯蔵から取り出し、迅速に貯蔵ケインから取り出し、そして４５℃の水浴中に入れる。バイアルを約２．５分間回旋し、そしてバイアルを反転させることによって細胞を懸濁する。細胞が完全に懸濁されたら、バイアルをバイオハザードキャビネットに移し、無菌アルコールパッドを用いてバイアルをぬぐい、ペトリ皿中の１０枚の無菌Ｗｈａｔｍａｎペーパーを積み重ねたものの上に内容物を注ぎ；ペトリ皿を覆い、そして少なくとも２分間低温保存培地を細胞外に吸収させる。上部フィルターを、ふた付きのＮＴ１寒天培地を含むペトリ皿へ移し（Ｗｈａｔｍａｎペーパーと寒天との間に泡がないことを確実にする）、ＮＴ１寒天プレートに３Ｍ外科用テープを１回巻き付け、そして容器を２５℃で保持する。カルスの最小の増殖は、４〜５日後に検出可能であるはずである。表１は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）由来の赤血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質、トリインフルエンザ（ＡＩＶ）の赤血球凝集素（ＨＡ）、大腸菌の易熱性毒素および伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のＶＰ２タンパク質を発現するＮＴ１細胞のいくつかの異なるトランスジェニック細胞株を示す。発現される遺伝子または利用されるプロモーター系に関わらず、全てが成功した。さらに、プラスチックテープまたはフィルム（例えば、ＮＥＳＣＯフィルム）の使用と比較して、３Ｍ外科用テープを使用することが、ＮＴ１細胞の増殖に対して有意なインパクトを有することをデータが示した。
【００２９】
実施例２−低温保存されたタバコ細胞の融解
細胞を、個々のチューブまたはチューブのプールとして融解し得る。バイアルを貯蔵ユニットから取り出し、そしてドライアイス上に置く。それらを４５℃の水浴に浸し、浴中でチューブラックを穏やかに動かして、バイアルの迅速かつ均一な融解を補助、促進することによって融解する。〜２．５分後に（ちょうど融解されるまで）、バイアルを３回穏やかに反転して、チューブの底に沈んだ細胞を混合する。層流フードにおいて、プールされたバイアルまたは個々のチューブ由来の２ｍｌの細胞を無菌ペトリ皿中の８〜１０枚の無菌７０ｍｍ ＃４Ｗｈａｔｍａｎろ紙を積み重ねたものの上にピペッティングし、覆いそして２分間排液させる。
【００３０】
ＴＴＣ生存性染色を少量の細胞（〜０．５ｍｌ）に対してこの時点で行う。２分間排液した後、細胞を含む上部フィルターを半流動性ＮＴＢ１培地（ビアラホス選択無し）へ移す。次いで、培地プレートに３Ｍテープを巻き付け、そして暗所において２５℃で３日間インキュベートする。３日後に、３ＭテープをＮｅｓｃｏフィルムに交換する。７日目に、細胞を含むフィルターを新たなＮＴ１培地プレートに移し、そしてＮｅｓｃｏフィルムを巻き付ける。細胞増殖は、約７日のうちに明らかになる。さらなる７日の後、細胞をフィルターからビアラホス選択薬剤を含む新たな半流動性ＮＴ１プレート上に移す。一旦十分量の細胞が蓄積したら、必要に応じて懸濁を開始する。
【００３１】
第１セットの実験は、低温保存および最良融解後処理の後の細胞プレーティングの再現性を試験した。再現性を試験するために、８つのチューブの３つの反復を融解し、細胞を合し、そして８枚のプレート上にプレーティングした。試験した他のパラメーターは、細胞を含むフィルターの新鮮なプレートへの移行の頻度であった。参考文献は、より高頻度の移行が細胞の回収を増強し得る（抗凍結剤中の成分を除去することによって）ことを示唆している；しかし、抗凍結剤のいくつかの成分によって提供される保護効果も存在する。試験した３つの移行スキームは、「１日移行」（最初の３日間は毎日移し、３日後次いで週に１度移す）、「３日移行」（３日間隔で２回移し、それ以降は週に１度）、および「７日移行」（週に１度移す）を含んだ。実験の結果は、回収のレベルおよび２週間後の細胞の色に基づいて評価した（図１）。
【００３２】
異なる回数の排液を試験した全ての処理由来の細胞は、非常に迅速に回収された（５日）。プレートの主観的評価は、１または２分間排液した細胞が、差異は大きくなかったが、他の処理よりも良好に回収されたことを示した。
【００３３】
スケールアップのプロトコル
スケールアップを試験するために、手順中の工程を比例してスケールアップした。小スケールと大スケールとの間の主な差異は、抗凍結剤中の細胞の大容量、空気交換の制限の可能性、およびプロセス中の各工程のために必要とされるより長い時間である。スケールアップ実験において、短周期および長周期両方の細胞を試験した。細胞は、５つのチューブから融解およびプールし、そして５枚のプレート上にプレーティングするかまたは１５本のチューブを融解し、そして個別にプレーティングするかのいずれかであった。短周期細胞は、１００％の回収率で５日以内に回収された。回収するのにかなりより長くかかったが（２週間）、長周期細胞由来の全てのプレートが回収された。低温保存溶液中で延長した時間の間維持された細胞に対する可能な効果（多数のチューブに分注するために必要とされる時間に起因する）もまた試験した。この実験において、細胞をチューブ移し、サンプルの第１のセットの約２時間後に凍結した。２つの凍結由来の細胞の回収において、明らかな差異はなかった。
【００３４】
【表１−１】
【００３５】
【表１−２】
【００３６】
【表１−３】
【００３７】
【表２−１】
【００３８】
【表２−２】
【００３９】
【表３】
【００４０】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１Ａ〜２Ｂ。回収割合（図１Ｂ）および健康なカルスの割合（黄色カルス；図１Ａ）に対する細胞移入頻度の効果。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本願は、２００４年１１月５日出願の米国仮出願第６０／６２５，４０１号の恩典を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、形質転換細胞および非形質転換細胞の低温保存のための方法に関する。低温保存された細胞を回収する方法もまた本発明によって提供される。低温保存から首尾よく回収された細胞の培養物もまた提供される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
バイオ医薬およびバイオ農芸化学品生産のための「マスターシード（ｍａｓｔｅｒ ｓｅｅｄ）」原理は、生きた生物を製造手順の一部として利用し、以下のいくつかの基本的信条に依存する：１）規定された起源および継代履歴の単一培養物が、細胞表現型および所望の製造特性の規定された特徴を有して保存され；２）保存、代表的には低温保存は、長期にわたり（数年以上にわたり）；３）細胞は「ワーキングシード（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｅｅｄ）」へ無限に回収、拡大、継代され、そして別の低温保存期間に供され（細胞の頑強さを必要とする原理）；そして４）細胞は規定された継代数の後に、最初の低温状態より前に見出された細胞の表現型および所望の製造特性の規定された特徴を失わない。
【０００４】
植物細胞の低温保存に関する技術は、バイオ医薬製造環境における生物学的物質の使用のために必要とされる特性に関する教示を欠いている。詳細には、生存生物学的物質の延長された貯蔵のために案出される任意の技術は、好ましくは以下の基準を満たすべきである：１）貯蔵方法は、長期間（数年）にわたって安定な生物学的物質を提供しなければならず、２）貯蔵条件は、製造プロセスに必要とされる生物学的物質を変化させるべきでなく、そして３）一旦貯蔵から取り出すと当該物質は容易に再増殖のために利用可能であり、再増殖させられ得るワーキングシードへ拡大可能であるべきである。
【０００５】
低温保存の長さ（しばしば月でまたは時間でさえも測定される）に関する先行技術において、情報はほとんど入手可能でなく、通常の培養条件下で無限にまたは少なくとも所望の継代数まで細胞が増殖させられ得るかどうかについての限られた情報が存在する。さらに、１次マスターシードストックおよび拡大され再低温保存されたワーキングシードストックの両方由来の、貯蔵からの取り出し後の延長された貯蔵または延長された培養の間での標的遺伝子または標的産物の遺伝子および産物安定性は、非常に少しのデータによってしか明らかにされていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、当該分野はマスターシード原理下でのバイオ製造標的成分の長期間増殖、再低温保存および安定性を提供する植物細胞の長期間貯蔵用の処理の方法またはセットを必要としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、形質転換細胞および非形質転換細胞の低温保存のための方法に関する。低温保存された細胞を回収する方法もまた本発明によって提供される。低温保存から首尾よく回収された細胞の培養物もまた提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は、形質転換または非形質転換細胞の低温保存のための方法を提供する。本発明の特定の実施態様において、方法は低温保存組成物の形成、および形質転換または非形質転換真核生物細胞を低温保存する方法を提供する。
【０００９】
従って、本発明の１つの実施態様は、形質転換（または非形質転換）真核生物細胞を含む低温保存組成物の形成方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：
ａ）選択可能培地の上／中で、形質転換（または非形質転換）細胞を増殖させる工程；
ｂ）培養培地を含む培養フラスコに細胞を接種して、液体培養物を形成し、そして形質転換（または非形質転換）細胞の液体培養物を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回継代する工程；
ｃ）継代された細胞を回収する工程；および
ｄ）回収された細胞を低温保存培地に添加して、低温保存組成物を形成する工程。
【００１０】
本発明の別の実施態様は、以下の工程を包含する、形質転換（または非形質転換）真核生物細胞の低温保存方法を提供する：
ａ）選択可能培地の上／中で、形質転換（または非形質転換）細胞を増殖させる工程；
ｂ）培養培地を含む培養フラスコに細胞を接種して、液体培養物を形成し、そして形質転換（または非形質転換）細胞の液体培養物を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回継代する工程；
ｃ）継代された細胞を回収する工程；
ｄ）回収された形質転換（または非形質転換）細胞を低温保存培地に添加して、低温保存組成物を形成する工程；および
ｅ）低温保存組成物を低温保存する工程。
【００１１】
さらに別の実施態様は、以下の工程を包含する、形質転換（または非形質転換）細胞の低温保存方法を提供する：
ａ）選択可能培地の上／中で、形質転換（または非形質転換）細胞を１〜１０日間増殖させる工程；
ｂ）培養培地を含む培養フラスコに細胞を接種して、液体培養物を形成する工程；
ｃ）液体培養物を、およそ対数増殖期中期まで培養する工程；
ｄ）液体培養物の第１の容量（ＶＯＬ１）を抜き取り、そしてそれを培養培地の第２の容量（ＶＯＬ２）を含む培養フラスコ中に接種する工程；
ｅ）工程ｄ）を少なくともさらに１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回繰り返す（細胞を継代する）工程；
ｆ）継代された細胞を回収する工程；
ｇ）継代された細胞を、第２の培地の１容量中に懸濁する工程；
ｈ）低温保存培地を、工程ｇ）において提供された懸濁された細胞に添加して、低温保存組成物を形成する工程；
ｉ）低温保存組成物を冷却する工程；および
ｊ）低温保存組成物を凍結する工程。
【００１２】
本発明によれば、１つの実施態様は植物細胞の低温保存を提供する。単子葉植物または双子葉植物由来の細胞は、本発明に従って低温保存され得る。従って、形質転換および非形質転換単子葉植物または双子葉植物細胞は、本明細書において教示される種々の方法を使用して低温保存され得る。本明細書において教示される発明の種々の実施態様において、トランスジェニックおよび非トランスジェニックタバコおよびイネ細胞は低温保存、貯蔵および回収されて、もとの培養物の遺伝子型および表現型を保持した、増殖細胞培養物を確立する。
【００１３】
従って、本発明は、形質転換植物細胞の低温保存（所望によりマスターシード原理下での）のための方法を提供する。本発明の特定の実施態様において、方法はマスターシード原理下で、ニコチナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉｎａ ｔａｂａｃｕｍ）（ＮＴ−１およびＢＹ−２）細胞ならびにＴ３０９イネ細胞の低温保存のための方法に適用される。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｅｄｓ． Ｔ． Ｎａｇａｔａ， Ｓ． Ｈａｓｅｚａｗａ， ａｎｄ Ｄ． Ｉｎｚｅ； Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ； Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ； ２００４を参照のこと。
【００１４】
Ｔ３０９イネ細胞株は、標準的な植物組織培養技術を使用して、市販のイネＴ３０９変種から調製された。本発明の実施に適切なさらなる形質転換および非形質転換植物細胞は、表１において提供される。
【００１５】
本発明の別の実施態様は、形質転換植物細胞を含む低温保存組成物の形成方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：
ａ）選択可能培地上で、カルス上の形質転換植物細胞を増殖させる工程；
ｂ）培養培地を含む培養フラスコにカルス由来の植物細胞を接種して、液体培養物を形成し、そして形質転換植物細胞の液体培養物を少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回継代する工程；
ｃ）継代された植物細胞を回収する工程；および
ｄ）回収された形質転換植物細胞を低温保存培地に添加して、低温保存組成物を形成する工程。
【００１６】
本発明の別の実施態様は、形質転換植物細胞の低温保存方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する；
ａ）選択可能培地上で、カルス上の形質転換植物細胞を増殖させる工程；
ｂ）培養培地を含む培養フラスコにカルス由来の植物細胞を接種して、液体培養物を形成し、そして形質転換植物細胞の液体培養物を少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回継代する工程；
ｃ）継代された植物細胞を回収する工程；
ｄ）回収された形質転換植物細胞を低温保存培地に添加して、低温保存組成物を形成する工程；および
ｅ）低温保存組成物を低温保存する工程。
【００１７】
さらに別の形質転換植物細胞の低温保存方法は、以下の工程を包含する：
ａ）選択可能培地上で、カルス上の形質転換植物細胞を１〜１０日間増殖させる工程；
ｂ）培養培地を含む培養フラスコにカルス由来の植物細胞を接種して、液体培養物を形成する工程；
ｃ）液体培養物をおよそ対数増殖期中期まで培養する工程；
ｄ）およそ対数増殖期中期まで増殖した液体培養物の第１の容量（ＶＯＬ１）を抜き取り、培養培地の第２の容量（ＶＯＬ２）を含む培養フラスコ中に第１の容量を接種して、継代培養物を形成し、そして継代培養物をおよそ対数増殖期中期まで培養する工程；
ｅ）所望により、工程ｄ）を少なくともさらに１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回繰り返す工程；
ｆ）継代培養物から、植物細胞を回収する工程；
ｇ）植物細胞を第２の培地の容量（ＣＵＬＴ）中に懸濁する工程；
ｈ）低温保存培地の容量（ＣＲＹＯ）を、工程ｇ）において提供された懸濁された植物細胞に添加して、低温保存組成物を形成する工程；
ｉ）低温保存組成物を冷却する工程；および
ｊ）低温保存組成物を凍結する工程。
【００１８】
用語「継代」は、用語「短周期条件（ｓｈｏｒｔ ｃｙｃｌｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」と互換的に使用され得る。継代または短周期条件は、指数（対数）増殖期中期の間に細胞を収集する（抜き取る）こと；指数増殖期中期の細胞を新鮮な培養培地で希釈または分割すること、および希釈（分割）された細胞培養物を指数増殖期中期まで培養することとして記載される。
【００１９】
本発明の目的のために、用語「対数増殖期中期」および「指数増殖期中期」が指数増殖期の厳密な中間点をいうのではなく、むしろ数学的な中間点の周辺の範囲をいうことを、当業者は理解する。指数増殖期中期までの培養の各回は、１細胞継代と考えられる。懸濁物から低温保存されるべき細胞は、１短周期（継代）のみまたは２０短周期までで首尾よく低温保存され得る。３〜６短周期が好ましく、そして６短周期が最も好ましい。本発明者らは、６短周期（継代）が再培養のために低温保存された状態からの細胞の格別な回収を可能にすることを示している。さらに、１〜６回の短周期条件下で細胞が懸濁物中に置かれる限り、細胞は培養後複数回低温保存され得る。希釈または分割する工程において、新鮮な培地の容量（ＶＯＬ２）に添加される細胞の容量（ＶＯＬ１）は、ＶＯＬ２に対するＶＯＬ１の比率において変動し得る。ここで、ＶＯＬ１およびＶＯＬ２は独立して、１〜少なくとも２０；１〜少なくとも１０；または１〜少なくとも５（任意のこれらの値の間の端数値を含む）の範囲である。１つの実施態様において、ＶＯＬ１：ＶＯＬ２は１：３である。
【００２０】
以下で教示する各方法がさらなる方法工程を包含し得ることにさらに留意するべきである。例えば、低温保存された形質転換植物細胞を融解し、低温保存された細胞を培養培地中に懸濁し（または、固形選択可能培地上で細胞を増殖させてカルスを形成させ）、そしてバイオ製造プロセスにおける使用のためにそれを増殖させる（例えば、増殖容器（例えば、発酵槽、撹拌タンク反応器など）において細胞を培養する）ことが可能である。バイオ製造プロセス由来の細胞は、本発明の低温保存方法に供され得、そしてマスターシード原理に従って貯蔵され得る。
【００２１】
非形質転換および形質転換単子葉植物および双子葉植物細胞の増殖に適切な選択可能培地および培養培地は、当業者に公知であり、そして当業者により容易に利用可能である（例えば、Ｄｉｆｃｏ（登録商標）＆ ＢＢＬ（登録商標）Ｍａｎｕａｌ， Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａを参照のこと）。
【００２２】
低温保存組成物が形成されるべき場合、再懸濁された細胞を含む培養培地の種々の容量（ＣＵＬＴ）は、低温保存培地の種々の容量（ＣＲＹＯ）と混合され得る。これら混合物は、ＣＵＬＴ：ＣＲＹＯの比率で混合され、ここでＣＵＬＴは１〜１００（その端数値を含む）の範囲であり、そしてＣＲＹＯは１〜１００（その端数値を含む）の範囲である。いくつかの実施態様において、ＣＵＬＴおよびＣＲＹＯは、１〜１０の範囲である。他の実施態様において、等容量のＣＵＬＴおよびＣＲＹＯが混合されて、低温保存組成物が形成される。
【００２３】
本発明はまた、前記低温保存方法のいずれかによって作製される低温保存された細胞または細胞株を提供する。
【００２４】
本発明の種々の実施態様において、低温保存されるべき細胞は薬剤（例えば、米国特許第５，９６５，４３８号または同第６，１２７，１８１号（その開示の全体を出典明示で援用する、特に米国特許第５，９６５，４３８号の第６欄１６行目から第７欄３４行目および米国特許第６，１２７，１８１号の第６欄６０行目から第９欄２２行目）の教示に記載されるように、細胞によって培養培地中に分泌される有害物質を除去することによって、細胞の生存率を増加させる、安定剤）で「前処理」または「前培養」されない。’４３８特許において考察されるように、安定剤前処理は、増殖または細胞死の間に細胞によって分泌される有害物質の除去に関する。さらに、本発明は、培養条件下で細胞に添加される１つ以上の「浸透圧剤」、エチレン阻害剤および／または膜安定剤での前処理の使用を排除し得る。特に、安定剤、浸透圧剤、エチレン阻害剤および／または膜安定剤は、細胞が培養されている間に、前処理プロトコルにおいて本発明の既に調製された培養培地には添加されないが、’４３８または’１８１特許において同定される物質は、本発明による細胞の培養のために事前に調製された培地の成分であり得る。従って、安定剤、浸透圧剤、エチレン阻害剤および／または膜安定剤は、細胞の培養の間、’４３８または’１８１特許に記載されるようには培養培地に添加されない（必要応じて補充されない）（例えば、米国特許第５，９６５，４３８号の第７欄７〜１６行目および米国特許第６，１２７，１８１号の第９欄３６〜４７行目を参照のこと）。
【００２５】
従って、細胞が培養されている時に、以下の物質は培養培地に添加されず、また必要に応じて補充されない：安定剤（例えば、還元グルタチオン、１，１，３，３−テトラメチル尿素、１，１，３，３−テトラメチル−２−チオ尿素、チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸銀、ベタイン、ｎ，ｎ−ジメチルホルムアミド、ｎ−（２−メルカプトプロピオニル）グリシン、β−メルカプトエチルアミン、セレノメチオニン、チオ尿素、プロピルガレート、ジメルカプトプロパノール、アスコルビン酸、システイン、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム（sodium diethyl dithiocarbomate）、スペルミン、スペルミジン、フェルラ酸、セサモール、レゾルシノール、プロピルガレート、ｍｄｌ−７１，８９７、カダベリン、プトレシン、１，３−および１，２−ジアミノプロパン、デオキシグルコース、尿酸、サリチル酸、３−および４−アミノ−１，２，４−トリアゾール、安息香酸、ヒドロキシルアミンならびにそのような薬剤の組み合わせおよび誘導体）；エチレン生合成および／またはエチレン作用を妨げるかまたは実質的に防止する薬剤（例えば：リゾビトキシン、メトキシルアミンＨＣｌ、ヒドロキシルアミンアナログ、α−カナリン、ＤＮＰ（２，４−ジニトロフェノール）、ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、スペルミン、スペルミジン、ＡＣＣアナログ、α−アミノイソ酪酸、ｎ−プロピルガレート、安息香酸およびその誘導体、フェルラ酸、サリチル酸およびその誘導体、サリチル酸、セサモール、カダベリン、ヒドロキノン、エイラー（alar）、アモ−１６１８（amo-1618）、ＢＨＡ（ブチル化ヒドロキシアニソール）、フェニルエチルアミン、ブラシノステロイド、ｐ−クロロ第二水銀安息香酸、ｎ−エチルマレイミド、ヨード酢酸、塩化コバルトおよび他のコバルト塩、ビピリジル、アミノオキシ酢酸、塩化第二水銀および他の第二水銀塩、サリチルアルコール、サリシン、塩化ニッケルおよび他のニッケル塩、カテコール、フロログルシノール（pffloroglucinol）、１，２−ジアミノプロパン、デスフェリオキサミン、インドメタシン、１，３−ジアミノプロパン、ベンジルイソチオシアネート、硫酸８−ヒドロキシキノリン、クエン酸８−ヒドロキシキノリン，２，５−ノルボルナジエン、ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン（trans-cyclootene）、７−ブロモ−５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン、ｃｉｓ−プロペニルホスホン酸、ジアゾシクロペンタジエン、メチルシクロプロパン、２−メチルシクロプロパン、カルボン酸、メチルシクロプロパンカルボキシレート、シクロオクタジエン、シクロオクトジン（cyclooctodine）（クロロメチル）シクロプロパンならびに／または銀塩（例えば、チオ硫酸銀、硝酸銀、塩化銀、酢酸銀、リン酸銀、クエン酸三銀塩、安息香酸銀、硫酸銀、酸化銀、亜硝酸銀、シアン酸銀、乳酸銀塩、ペンタフルオロプロピオン酸銀、ヘキサフルオロリン酸銀、トルエンスルホン酸の銀塩およびその組み合わせ））；膜安定剤（例えば、脂質二重層中にインターカレートする化合物（例えば、ステロール、リン脂質、糖脂質、糖タンパク質）または二価カチオン）。
【実施例】
【００２６】
実施例１：低温保存
本実施例において使用した培地および成分を、表２〜４に記載する。成分を供給する業者もまた示す。低温保存されるべき細胞を、ＮＴ１培地を含む２５℃の振盪フラスコ中で増殖させ；細胞を対数（指数）増殖期中期（培養フラスコの接種の後３〜４日）において、１：３分割（または３０％接種）で少なくとも１〜１０継代（１つの実施態様は、少なくとも６継代を意図する）継代する。フラスコの外側を、無菌バイオセーフティーキャビネット（ｂｉｏｓａｆｅｔｙ ｃａｂｉｎｅｔ）へ移す前に１％次亜塩素酸ナトリウム（sodium hyperchlorite）溶液を用いて浄化し、次いで細胞を無菌の２２５ｍｌ遠心チューブへ移す前に、フラスコの外側を無菌アルコールパッドを用いてぬぐう。細胞を１０００ＲＰＭで１分間、４℃で遠心分離し、そして上清を無菌ピペットを用いて除去する。細胞を適切な培養培地を用いて開始容量に再懸濁し、無菌の１リットル三角フラスコへ移し、ここで等容量の低温保存培地を懸濁物に添加し、穏やかに回旋する。
【００２７】
次いで、軌道振盪機中２〜７℃で１時間細胞懸濁物を穏やかに振盪（１３０ＲＰＭ）することによって細胞を低温保存し、次いで氷上でバイオセーフティーキャビネットへ移し、無菌アルコールパッドを用いてぬぐう。細胞を直ちに無菌条件下で自動ピペッターを使用してクリオバイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）へ分注する。各バイアルに２．５ｍｌの細胞懸濁物を入れ、そして直ちに液体窒素中での貯蔵に使用すべきケイン（ｃａｎｅ）中に入れる；ロードしたケインを凍結時まで２〜７℃で保持すべきである。次いで、ケインを速度制御フリーザーに移す。凍結プロセスを４℃、１５分で開始し、−０．５℃／分の速度で４℃から−４０℃までの温度の連続的な降下がそれに続く。次いで、ケインを取り出し、ドライアイス上で予備冷却した貯蔵ラックに入れ；全てのケインが貯蔵ラックにロードされるとすぐに、ラックを直ちに気相を使用する液体窒素貯蔵タンクに入れる。
【００２８】
種々のバイオプロセスにおける使用のために低温保存から細胞を回収するために、クリオバイアルを液体窒素貯蔵から取り出し、迅速に貯蔵ケインから取り出し、そして４５℃の水浴中に入れる。バイアルを約２．５分間回旋し、そしてバイアルを反転させることによって細胞を懸濁する。細胞が完全に懸濁されたら、バイアルをバイオハザードキャビネットに移し、無菌アルコールパッドを用いてバイアルをぬぐい、ペトリ皿中の１０枚の無菌Ｗｈａｔｍａｎペーパーを積み重ねたものの上に内容物を注ぎ；ペトリ皿を覆い、そして少なくとも２分間低温保存培地を細胞外に吸収させる。上部フィルターを、ふた付きのＮＴ１寒天培地を含むペトリ皿へ移し（Ｗｈａｔｍａｎペーパーと寒天との間に泡がないことを確実にする）、ＮＴ１寒天プレートに３Ｍ外科用テープを１回巻き付け、そして容器を２５℃で保持する。カルスの最小の増殖は、４〜５日後に検出可能であるはずである。表１は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）由来の赤血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質、トリインフルエンザ（ＡＩＶ）の赤血球凝集素（ＨＡ）、大腸菌の易熱性毒素および伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のＶＰ２タンパク質を発現するＮＴ１細胞のいくつかの異なるトランスジェニック細胞株を示す。発現される遺伝子または利用されるプロモーター系に関わらず、全てが成功した。さらに、プラスチックテープまたはフィルム（例えば、ＮＥＳＣＯフィルム）の使用と比較して、３Ｍ外科用テープを使用することが、ＮＴ１細胞の増殖に対して有意なインパクトを有することをデータが示した。
【００２９】
実施例２−低温保存されたタバコ細胞の融解
細胞を、個々のチューブまたはチューブのプールとして融解し得る。バイアルを貯蔵ユニットから取り出し、そしてドライアイス上に置く。それらを４５℃の水浴に浸し、浴中でチューブラックを穏やかに動かして、バイアルの迅速かつ均一な融解を補助、促進することによって融解する。〜２．５分後に（ちょうど融解されるまで）、バイアルを３回穏やかに反転して、チューブの底に沈んだ細胞を混合する。層流フードにおいて、プールされたバイアルまたは個々のチューブ由来の２ｍｌの細胞を無菌ペトリ皿中の８〜１０枚の無菌７０ｍｍ ＃４Ｗｈａｔｍａｎろ紙を積み重ねたものの上にピペッティングし、覆いそして２分間排液させる。
【００３０】
ＴＴＣ生存性染色を少量の細胞（〜０．５ｍｌ）に対してこの時点で行う。２分間排液した後、細胞を含む上部フィルターを半流動性ＮＴＢ１培地（ビアラホス選択無し）へ移す。次いで、培地プレートに３Ｍテープを巻き付け、そして暗所において２５℃で３日間インキュベートする。３日後に、３ＭテープをＮｅｓｃｏフィルムに交換する。７日目に、細胞を含むフィルターを新たなＮＴ１培地プレートに移し、そしてＮｅｓｃｏフィルムを巻き付ける。細胞増殖は、約７日のうちに明らかになる。さらなる７日の後、細胞をフィルターからビアラホス選択薬剤を含む新たな半流動性ＮＴ１プレート上に移す。一旦十分量の細胞が蓄積したら、必要に応じて懸濁を開始する。
【００３１】
第１セットの実験は、低温保存および最良融解後処理の後の細胞プレーティングの再現性を試験した。再現性を試験するために、８つのチューブの３つの反復を融解し、細胞を合し、そして８枚のプレート上にプレーティングした。試験した他のパラメーターは、細胞を含むフィルターの新鮮なプレートへの移行の頻度であった。参考文献は、より高頻度の移行が細胞の回収を増強し得る（抗凍結剤中の成分を除去することによって）ことを示唆している；しかし、抗凍結剤のいくつかの成分によって提供される保護効果も存在する。試験した３つの移行スキームは、「１日移行」（最初の３日間は毎日移し、３日後次いで週に１度移す）、「３日移行」（３日間隔で２回移し、それ以降は週に１度）、および「７日移行」（週に１度移す）を含んだ。実験の結果は、回収のレベルおよび２週間後の細胞の色に基づいて評価した（図１）。
【００３２】
異なる回数の排液を試験した全ての処理由来の細胞は、非常に迅速に回収された（５日）。プレートの主観的評価は、１または２分間排液した細胞が、差異は大きくなかったが、他の処理よりも良好に回収されたことを示した。
【００３３】
スケールアップのプロトコル
スケールアップを試験するために、手順中の工程を比例してスケールアップした。小スケールと大スケールとの間の主な差異は、抗凍結剤中の細胞の大容量、空気交換の制限の可能性、およびプロセス中の各工程のために必要とされるより長い時間である。スケールアップ実験において、短周期および長周期両方の細胞を試験した。細胞は、５つのチューブから融解およびプールし、そして５枚のプレート上にプレーティングするかまたは１５本のチューブを融解し、そして個別にプレーティングするかのいずれかであった。短周期細胞は、１００％の回収率で５日以内に回収された。回収するのにかなりより長くかかったが（２週間）、長周期細胞由来の全てのプレートが回収された。低温保存溶液中で延長した時間の間維持された細胞に対する可能な効果（多数のチューブに分注するために必要とされる時間に起因する）もまた試験した。この実験において、細胞をチューブ移し、サンプルの第１のセットの約２時間後に凍結した。２つの凍結由来の細胞の回収において、明らかな差異はなかった。
【００３４】
【表１−１】
【００３５】
【表１−２】
【００３６】
【表１−３】
【００３７】
【表２−１】
【００３８】
【表２−２】
【００３９】
【表３】
【００４０】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１Ａ〜２Ｂ。回収割合（図１Ｂ）および健康なカルスの割合（黄色カルス；図１Ａ）に対する細胞移入頻度の効果。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を包含する、低温保存された植物細胞の作製方法：
ａ）少なくとも１継代、細胞をおよそ対数増殖期中期まで継代する工程；
ｂ）継代された細胞を濃縮する工程；および
ｃ）濃縮、継代された細胞に低温保存培地を添加して、低温保存組成物を形成する工程。
【請求項２】
低温保存組成物を冷却する工程をさらに包含する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
低温保存組成物を凍結する工程をさらに包含する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
低温保存組成物を凍結する工程をさらに包含する、請求項２記載の方法。
【請求項５】
細胞が形質転換されている、請求項１記載の方法。
【請求項６】
細胞が表１中の細胞からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
以下の工程を包含する、低温保存組成物の形成方法：
ａ）選択可能培地の中または上で、形質転換または非形質転換細胞を増殖させる工程；
ｂ）培養培地を含む培養フラスコに細胞を接種して、液体培養物を形成し、そして形質転換または非形質転換細胞の液体培養物を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回継代する工程；
ｃ）継代された細胞を回収する工程；および
ｄ）回収された細胞を低温保存培地に添加して、低温保存組成物を形成する工程。
【請求項８】
細胞が単子葉植物または双子葉植物細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
細胞が形質転換されている、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
細胞が植物細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
細胞がタバコ細胞である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
細胞がイネ細胞である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
低温保存培地が水中に処方され、そしてスクロース３４２．２７ｇ／Ｌ、グリセロール４６．０６ｇ／Ｌ、ＤＭＳＯ ３５．５ｍＬ／ＬおよびＮＴ１ ＶＰ培地、ＶＰ培地またはＴ３０９培地から選択される群より選択される培地２２６．６４ｍＬを含む、請求項７記載の方法。
【請求項１４】
以下の工程を包含する、形質転換植物細胞の低温保存方法：
ａ）選択可能培地上で、カルス上の形質転換植物細胞を増殖させる工程；
ｂ）培養培地を含む培養フラスコに、カルス由来の植物細胞を接種して、液体培養物を形成する工程；
ｃ）液体培養物を、およそ対数増殖期中期まで培養する工程；
ｄ）およそ対数増殖期中期まで増殖した液体培養物の第１の容量（ＶＯＬ１）を抜き取り、培養培地の第２の容量（ＶＯＬ２）を含む培養フラスコ中に第１の容量を接種して、継代培養物を形成し、そして継代培養物をおよそ対数増殖期中期まで培養する工程；
ｅ）工程ｄ）を少なくともさらに１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回繰り返してもよい工程；
ｆ）継代培養物から植物細胞を回収する工程；
ｇ）植物細胞を第２の培地の容量（ＣＵＬＴ）中に懸濁する工程；
ｈ）低温保存培地の容量（ＣＲＹＯ）を、工程ｇ）において提供された懸濁された植物細胞に添加して、低温保存組成物を形成する工程；
ｉ）低温保存組成物を冷却する工程；および
ｊ）低温保存組成物を凍結する工程。
【請求項１５】
工程ｄ）を少なくともさらに１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回繰り返す、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
植物細胞がタバコまたはイネである、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
植物細胞がタバコまたはイネである、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
ＶＯＬ１およびＶＯＬ２が独立して１〜少なくとも２０；１〜少なくとも１０；または１〜少なくとも５（任意のこれらの値の間の端数値を含む）の範囲である、請求項１４、１５、１６または１７記載の方法。
【請求項１９】
ＶＯＬ１：ＶＯＬ２が１：３である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ＣＵＬＴ：ＣＲＹＯの比率を一緒にまとめて、ＣＵＬＴが１〜１００の範囲でありそしてＣＲＹＯが１〜１００の範囲である、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
ＣＵＬＴ：ＣＲＹＯが１：１である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ＣＵＬＴ：ＣＲＹＯの比率を一緒にまとめて、ＣＵＬＴが１〜１００の範囲でありそしてＣＲＹＯが１〜１００の範囲である、請求項１５記載の方法。
【請求項２３】
ＣＵＬＴ：ＣＲＹＯが１：１である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
低温保存組成物を融解する工程をさらに包含する、請求項１４記載の方法。
【請求項２５】
低温保存組成物から細胞を回収しそして培養する工程をさらに包含する、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
低温保存組成物を融解する工程をさらに包含する、請求項１８記載の方法。
【請求項２７】
低温保存組成物から細胞を回収しそして培養する工程をさらに包含する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
低温保存組成物を融解する工程をさらに包含する、請求項２０記載の方法。
【請求項２９】
低温保存組成物から細胞を回収しそして培養する工程をさらに包含する、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
低温保存組成物を融解する工程をさらに包含する、請求項２２記載の方法。
【請求項３１】
低温保存組成物から細胞を回収しそして培養する工程をさらに包含する、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
工程ｄ）を６回繰り返す、請求項１４記載の方法。
【請求項１】
以下の工程を包含する、低温保存された植物細胞の作製方法：
ａ）少なくとも１継代、細胞をおよそ対数増殖期中期まで継代する工程；
ｂ）継代された細胞を濃縮する工程；および
ｃ）濃縮、継代された細胞に低温保存培地を添加して、低温保存組成物を形成する工程。
【請求項２】
低温保存組成物を冷却する工程をさらに包含する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
低温保存組成物を凍結する工程をさらに包含する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
低温保存組成物を凍結する工程をさらに包含する、請求項２記載の方法。
【請求項５】
細胞が形質転換されている、請求項１記載の方法。
【請求項６】
細胞が表１中の細胞からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
以下の工程を包含する、低温保存組成物の形成方法：
ａ）選択可能培地の中または上で、形質転換または非形質転換細胞を増殖させる工程；
ｂ）培養培地を含む培養フラスコに細胞を接種して、液体培養物を形成し、そして形質転換または非形質転換細胞の液体培養物を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回継代する工程；
ｃ）継代された細胞を回収する工程；および
ｄ）回収された細胞を低温保存培地に添加して、低温保存組成物を形成する工程。
【請求項８】
細胞が単子葉植物または双子葉植物細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
細胞が形質転換されている、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
細胞が植物細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
細胞がタバコ細胞である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
細胞がイネ細胞である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
低温保存培地が水中に処方され、そしてスクロース３４２．２７ｇ／Ｌ、グリセロール４６．０６ｇ／Ｌ、ＤＭＳＯ ３５．５ｍＬ／ＬおよびＮＴ１ ＶＰ培地、ＶＰ培地またはＴ３０９培地から選択される群より選択される培地２２６．６４ｍＬを含む、請求項７記載の方法。
【請求項１４】
以下の工程を包含する、形質転換植物細胞の低温保存方法：
ａ）選択可能培地上で、カルス上の形質転換植物細胞を増殖させる工程；
ｂ）培養培地を含む培養フラスコに、カルス由来の植物細胞を接種して、液体培養物を形成する工程；
ｃ）液体培養物を、およそ対数増殖期中期まで培養する工程；
ｄ）およそ対数増殖期中期まで増殖した液体培養物の第１の容量（ＶＯＬ１）を抜き取り、培養培地の第２の容量（ＶＯＬ２）を含む培養フラスコ中に第１の容量を接種して、継代培養物を形成し、そして継代培養物をおよそ対数増殖期中期まで培養する工程；
ｅ）工程ｄ）を少なくともさらに１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回繰り返してもよい工程；
ｆ）継代培養物から植物細胞を回収する工程；
ｇ）植物細胞を第２の培地の容量（ＣＵＬＴ）中に懸濁する工程；
ｈ）低温保存培地の容量（ＣＲＹＯ）を、工程ｇ）において提供された懸濁された植物細胞に添加して、低温保存組成物を形成する工程；
ｉ）低温保存組成物を冷却する工程；および
ｊ）低温保存組成物を凍結する工程。
【請求項１５】
工程ｄ）を少なくともさらに１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回繰り返す、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
植物細胞がタバコまたはイネである、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
植物細胞がタバコまたはイネである、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
ＶＯＬ１およびＶＯＬ２が独立して１〜少なくとも２０；１〜少なくとも１０；または１〜少なくとも５（任意のこれらの値の間の端数値を含む）の範囲である、請求項１４、１５、１６または１７記載の方法。
【請求項１９】
ＶＯＬ１：ＶＯＬ２が１：３である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ＣＵＬＴ：ＣＲＹＯの比率を一緒にまとめて、ＣＵＬＴが１〜１００の範囲でありそしてＣＲＹＯが１〜１００の範囲である、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
ＣＵＬＴ：ＣＲＹＯが１：１である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ＣＵＬＴ：ＣＲＹＯの比率を一緒にまとめて、ＣＵＬＴが１〜１００の範囲でありそしてＣＲＹＯが１〜１００の範囲である、請求項１５記載の方法。
【請求項２３】
ＣＵＬＴ：ＣＲＹＯが１：１である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
低温保存組成物を融解する工程をさらに包含する、請求項１４記載の方法。
【請求項２５】
低温保存組成物から細胞を回収しそして培養する工程をさらに包含する、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
低温保存組成物を融解する工程をさらに包含する、請求項１８記載の方法。
【請求項２７】
低温保存組成物から細胞を回収しそして培養する工程をさらに包含する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
低温保存組成物を融解する工程をさらに包含する、請求項２０記載の方法。
【請求項２９】
低温保存組成物から細胞を回収しそして培養する工程をさらに包含する、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
低温保存組成物を融解する工程をさらに包含する、請求項２２記載の方法。
【請求項３１】
低温保存組成物から細胞を回収しそして培養する工程をさらに包含する、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
工程ｄ）を６回繰り返す、請求項１４記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００８−５１８６２５（Ｐ２００８−５１８６２５Ａ）
【公表日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４０１１０（Ｐ２００７−５４０１１０）
【出願日】平成１７年１１月４日（２００５．１１．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４０１８３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５２８３５
【国際公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【出願人】（３９００３９１９２）ダウ・アグロサイエンス・エル・エル・シー (20)
【氏名又は名称原語表記】Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月４日（２００５．１１．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４０１８３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５２８３５
【国際公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【出願人】（３９００３９１９２）ダウ・アグロサイエンス・エル・エル・シー (20)
【氏名又は名称原語表記】Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
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