細胞凝集塊の形成方法
【課題】接着性細胞の細胞凝集塊の形成方法、該方法を用いる物質のスクリーニング方法及び細胞の機能探索方法、細胞凝集塊並びに培養容器の提供。
【解決手段】細胞凝集塊用培養容器Ｄは、アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基が表面近傍に存在する領域と、一般式
で表される基を底面に有する。
【解決手段】細胞凝集塊用培養容器Ｄは、アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基が表面近傍に存在する領域と、一般式
で表される基を底面に有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞凝集塊の形成方法、物質のスクリーニング方法、細胞の機能探索方法、細胞凝集塊及び培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、接着性細胞及び非接着性細胞を培養することにより、細胞凝集塊が形成されている。
【０００３】
特許文献１には、多能性神経幹細胞を含む組織を少なくとも一種の幹細胞増殖因子を含む培地に懸濁し、神経幹細胞凝集塊形成用容器に播種、培養する事により神経幹細胞凝集塊を形成させる方法が開示されている。このとき、神経幹細胞凝集塊形成用容器は、内面に非水溶性硬化皮膜層を有し、水溶性樹脂を容器内面に被覆させて水溶性樹脂被覆層を形成した後に、水溶性樹脂被覆層を硬化させて非水溶性硬化皮膜層に変性することにより製造される。また、水溶性樹脂として、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと他のモノマー（例えば、ブチルメタクリレート等）との共重合体が例示されている。
【０００４】
しかしながら、このような神経幹細胞凝集塊形成用容器を用いて、接着性細胞を培養しても、非水溶性硬化皮膜層が接着性細胞の接着を阻害するため、接着性細胞が死滅し、接着性細胞の細胞凝集塊を形成することができないという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−２２０２０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記の従来技術が有する問題に鑑み、接着性細胞の細胞凝集塊を形成することが可能な細胞凝集塊の形成方法、該細胞凝集塊の形成方法を用いる物質のスクリーニング方法及び細胞の機能探索方法、細胞凝集塊並びに培養容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の細胞凝集塊の形成方法は、培養容器を用いて、接着性細胞を培養して細胞凝集塊を形成する方法であって、前記培養容器は、アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基と、一般式
【０００８】
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、炭素数が１以上６以下のアルキル基であり、ｍは、２以上６以下の整数である。）
で表される基が表面近傍に存在し、前記接着性細胞は、間葉系幹細胞、肝細胞又はガン細胞である。
【０００９】
本発明の物質のスクリーニング方法は、本発明の細胞凝集塊の形成方法を用いて、細胞凝集塊を形成する工程と、該細胞凝集塊を用いて物質をスクリーニングする工程を有する。
【００１０】
本発明の細胞の機能探索方法は、本発明の細胞凝集塊の形成方法を用いて、細胞凝集塊を形成する工程と、該細胞凝集塊を用いて細胞の機能を探索する工程を有する。
【００１１】
本発明の細胞凝集塊は、接着性細胞が増殖して自律的に凝集した細胞凝集塊であって、前記接着性細胞は、間葉系幹細胞、肝細胞又はガン細胞である。
【００１２】
本発明の培養容器は、アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基と、一般式
【００１３】
【化２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、炭素数が１以上６以下のアルキル基であり、ｍは、２以上６以下の整数である。）
で表される基が表面近傍に存在する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、接着性細胞の細胞凝集塊を形成することが可能な細胞凝集塊の形成方法、該細胞凝集塊の形成方法を用いる物質のスクリーニング方法及び細胞の機能探索方法、細胞凝集塊並びに培養容器を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】本発明の細胞凝集塊を形成する方法の一例を示す図（その１）である。
【図１Ｂ】本発明の細胞凝集塊を形成する方法の一例を示す図（その２）である。
【図２Ａ】実施例１の細胞凝集塊（２日間培養した場合）を示す光学顕微鏡写真である。
【図２Ｂ】実施例１の細胞凝集塊（５日間培養した場合）を示す光学顕微鏡写真である。
【図３】比較例１の培養細胞（５日間培養した場合）を示す光学顕微鏡写真である。
【図４Ａ】実施例１の細胞凝集塊のアルカリホスファターゼ活性の評価結果を示す光学顕微鏡写真である。
【図４Ｂ】比較例１の培養細胞のアルカリホスファターゼ活性の評価結果を示す光学顕微鏡写真である。
【図５】実施例１の細胞凝集塊の免疫二重染色の評価結果（その１）を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図６】実施例１の細胞凝集塊の免疫二重染色の評価結果（その２）を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図７】実施例１の細胞凝集塊の免疫二重染色の評価結果（その３）を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図８】実施例１の細胞凝集塊の免疫二重染色の評価結果（その４）を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図９】実施例２−１の細胞凝集塊（２日間培養した場合）を示す光学顕微鏡写真である。
【図１０】実施例２−２の細胞凝集塊（７日間培養した場合）を示す光学顕微鏡写真である。
【図１１】実施例２−３の細胞凝集塊（７日間培養した場合）を示す光学顕微鏡写真である。
【図１２】比較例２の培養細胞（７日間培養した場合）を示す光学顕微鏡写真である。
【図１３】実施例２−２の細胞凝集塊の免疫染色の評価結果を示す写真である。
【図１４】実施例３の細胞凝集塊（１１日間培養した場合）を示す光学顕微鏡写真である。
【図１５】比較例３の培養細胞（１１日間培養した場合）を示す光学顕微鏡写真である。
【図１６】実施例３の細胞凝集塊及び比較例３の培養細胞のアルブミンの産生量の評価結果を示す図である。
【図１７】実施例３の細胞凝集塊及び比較例３の培養細胞のＣＹＰ１Ａ１の活性の評価結果を示す図である。
【図１８】実施例３の細胞凝集塊及び比較例３の培養細胞の遺伝子発現の評価結果を示す図である。
【図１９】実施例４の細胞凝集塊（８日間培養した場合）を示す光学顕微鏡写真である。
【図２０】比較例４の培養細胞（８日間培養した場合）を示す光学顕微鏡写真である。
【図２１Ａ】実施例４の細胞凝集塊のアルカリホスファターゼ活性の評価結果を示す光学顕微鏡写真である。
【図２１Ｂ】比較例４の培養細胞のアルカリホスファターゼ活性の評価結果を示す光学顕微鏡写真である。
【図２２】実施例４の細胞凝集塊及び比較例４の培養細胞の遺伝子発現の評価結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
次に、本発明を実施するための形態を図面と共に説明する。
【００１７】
図１に、本発明の細胞凝集塊を形成する方法の一例を示す。
【００１８】
培養容器Ｄは、アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基が表面近傍に存在する領域Ｄ１と、一般式（１）で表される基が表面近傍に存在する領域Ｄ２を底面に有する。
【００１９】
培養容器Ｄに、接着性細胞Ｃ及び培地Ｍを添加すると、培養容器Ｄの底面に接着性細胞Ｃが接着する（図１Ａ参照）。これは、培養容器Ｄの底面のアミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基が表面近傍に存在する領域Ｄ１に接着性細胞Ｃが接着するためであると考えられる。次に、接着性細胞Ｃを培養すると、接着性細胞Ｃが増殖して自律的に凝集し、細胞凝集塊Ｃ'が形成される（図１Ｂ参照）。これは、培養容器Ｄの底面の一般式（１）で表される基が表面近傍に存在する領域Ｄ２は、接着性細胞Ｃの接着を抑制するため、接着性細胞Ｃ上に、増殖した接着性細胞Ｃが形成されるためであると考えられる。このため、培養容器Ｄを用いて、接着性細胞Ｃを培養すると、接着性細胞Ｃが増殖して自律的に凝集した細胞凝集塊Ｃ'を形成することができる。
【００２０】
接着性細胞Ｃとしては、特に限定されないが、間葉系幹細胞、肝細胞、肝幹細胞、心筋細胞、ガン細胞、ガン幹細胞、繊維芽細胞、神経細胞、血管内皮前駆細胞、上皮細胞等が挙げられる。
【００２１】
培養容器Ｄの形態としては、特に限定されないが、ディッシュ、マルチウェルプレート、フラスコ、ローラーボトル、細胞培養プロセスを有するデバイスのユニット等が挙げられる。
【００２２】
［培養容器Ｄの第一の実施形態］
培養容器Ｄの第一の実施形態は、カルボキシル基、アミノ基及びヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器に、カルボキシル基、アミノ基又はヒドロキシル基に対して反応性を有する基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤を反応させることにより製造されている。このとき、表面改質剤の分子量は、２２５〜６５０である。これにより、一般式（１）で表される基を高密度で導入することができる。
【００２３】
容器の表面近傍にアミノ基を導入する方法としては、特に限定されないが、窒素プラズマ処理、アンモニアプラズマ処理、表面処理剤を反応させる方法、シリコーン気相処理等が挙げられる。
【００２４】
窒素プラズマ処理では、窒素ガス雰囲気下、低温プラズマを発生させることにより、容器の表面近傍にアミノ基を導入する（例えば、Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ Ｃｏａｔｉｎｇｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１６−１１９（１９９９）８０２−８０７，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ａｓｐｅｃｔｓ １９５（２００１）８１−９５，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２００．９８９−９９６（１９９９）参照）。具体的には、容器を反応容器内に収容し、反応容器内を真空ポンプで真空にした後、窒素ガスを導入し、グロー放電を行う。
【００２５】
アンモニアプラズマ処理では、アンモニアガス雰囲気下、低温プラズマを発生させることにより、容器の表面近傍にアミノ基を導入する。具体的には、容器を反応容器内に収容し、反応容器内を真空ポンプで真空にした後、アンモニアガスを導入し、グロー放電を行う。
【００２６】
容器を構成する材料としては、特に限定されないが、ポリ塩化ビニル、アクリル樹脂、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、シクロオレフィン樹脂、ポリカーボネート、ガラス等が挙げられる。
【００２７】
表面処理剤を反応させる方法では、アミノ基を有するアルコキシシラン、クロロシラン、シラザン等の表面処理剤を用いて、アルコキシシリル基等の加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基、シラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器の表面近傍にアミノ基を導入する。具体的には、まず、容器内に水／２−プロパノール混合液を仕込み、３−アミノプロピルトリメトキシシランを添加した後、１００℃に加熱し、６時間反応させる。次に、室温に冷却した後、メタノールで洗浄し、乾燥する。
【００２８】
容器を構成する材料としては、特に限定されないが、メタクリル酸３−トリメトキシシリルプロピル−メタクリル酸メチル−ジビニルベンゼン共重合体、ポリ塩化ビニル、アクリル樹脂、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、シクロオレフィン樹脂、ポリカーボネート、シリカ、ガラス、アルミナ、タルク、クレー、マイカ、アスベスト、酸化チタン、亜鉛華、酸化鉄等が挙げられる。
【００２９】
シリコーン気相処理では、１，３，５，７−テトラメチルシクロテトラシロキサンを用いて、容器の表面近傍にヒドロシリル基を導入した後、アミノ基を有するアルケンを反応させることにより、容器の表面近傍にアミノ基を導入する（例えば、特公平１−５４３７９号公報、特公平１−５４３８０号公報、特公平１−５４３８１号公報参照）。具体的には、まず、１，３，５，７−テトラメチルシクロテトラシロキサンと、容器をデシケーター中に入れ、アスピレーターで脱気する。次に、８０℃で１６時間反応させた後、容器を取り出し、１２０℃で乾燥させる。さらに、得られた容器をエタノール中に浸し、アリルアミンを添加した後、塩化白金酸のエタノール溶液を添加し、６０℃で２時間攪拌する。反応が終了した後、エタノールで洗浄し、減圧乾燥する。
【００３０】
容器を構成する材料としては、特に限定されないが、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリ塩化ビニル、アクリル樹脂、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、シクロオレフィン樹脂、ポリカーボネート、マイカ、タルク、カオリン、アルミナ、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化鉄等が挙げられる。
【００３１】
アミノ基を有するアルケンとしては、アリルアミンに限定されず、ビニル基を有するアミン、アクリル基を有するアミン等であればよい。また、アミノ基は、ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等により保護されていてもよい。さらに、アミノ基を有するアルケンの代わりに、エポキシ基等の、例えば、ジアミンとの反応により、アミノ基を導入することが可能な基を有するアルケンを用いてもよい。
【００３２】
容器の表面近傍にカルボキシル基及び／又はヒドロキシル基を導入する方法としては、特に限定されないが、酸素プラズマ処理、オゾン処理、水蒸気プラズマ処理等が挙げられる。
【００３３】
酸素プラズマ処理では、酸素ガスの雰囲気下、低温プラズマを発生させることにより、容器の表面近傍にカルボキシル基及びヒドロキシル基を導入する。具体的には、容器を反応容器内に収容し、反応容器内を真空ポンプで真空にした後、酸素ガスを導入し、グロー放電する。
【００３４】
オゾン処理では、容器にオゾン水溶液を仕込むことにより、容器の表面近傍にカルボキシル基及びヒドロキシル基を導入する。具体的には、容器に４０ｐｐｍのオゾン水溶液を仕込み、室温で１５分間処理する。
【００３５】
水蒸気プラズマ処理では、水蒸気の雰囲気下、低温プラズマを発生させることにより、容器の表面近傍にヒドロキシル基を導入する。具体的には、容器を反応容器内に収容し、反応容器内を真空ポンプで真空にした後、水蒸気を導入し、グロー放電する。
【００３６】
容器を構成する材料としては、特に限定されないが、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエーテルエーテルケトン、シクロオレフィン樹脂、ポリカーボネート等が挙げられる。
【００３７】
容器の表面近傍にカルボキシル基を導入する方法としては、特に限定されないが、表面処理剤を反応させる方法、シリコーン気相処理等が挙げられる。
【００３８】
表面処理剤を反応させる方法では、カルボキシル基を有するアルコキシシラン、クロロシラン、シラザン等の表面処理剤を用いて、アルコキシシリル基等の加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基、シラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器の表面近傍にカルボキシル基を導入する。具体的には、まず、トリエトキシシリルプロピル無水コハク酸をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解させ、蒸留水と４−ジメチルアミノピリジンを添加し、１６時間室温で撹拌し、カルボンキシル基を有するシランカップリング剤を合成する。次に、容器に水／２−プロパノール混合液を仕込み、カルボキシル基を有するシランカップリング剤を添加した後、１００℃に加熱し、６時間反応させる。さらに、室温に冷却した後、メタノールで洗浄し、乾燥する。
【００３９】
容器を構成する材料としては、特に限定されないが、メタクリル酸３−トリメトキシシリルプロピル−メタクリル酸メチル−ジビニルベンゼン共重合体、シリカ、ガラス、アルミナ、タルク、クレー、マイカ、アスベスト、酸化チタン、亜鉛華、酸化鉄等が挙げられる。
【００４０】
シリコーン気相処理では、１，３，５，７−テトラメチルシクロテトラシロキサンを用いて、容器の表面近傍にヒドロシリル基を導入した後、カルボキシル基を有するアルケンを反応させることにより、容器の表面近傍にカルボキシル基を導入する（例えば、特公平１−５４３７９号公報、特公平１−５４３８０号公報、特公平１−５４３８１号公報参照）。具体的には、まず、１，３，５，７−テトラメチルシクロテトラシロキサンを入れた容器をデシケーター中に入れ、アスピレーターで脱気する。次に、８０℃で１６時間反応させた後、容器を取り出し、１２０℃で乾燥させる。さらに、得られた容器をエタノール中に浸し、アリルカルボン酸を添加した後、塩化白金酸のエタノール溶液を添加し、６０℃で２時間攪拌する。反応が終了した後、エタノールで洗浄し、減圧乾燥する。
【００４１】
容器を構成する材料としては、特に限定されないが、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、マイカ、タルク、カオリン、アルミナ、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化鉄等が挙げられる。
【００４２】
カルボキシル基を有するアルケンとしては、アリルカルボン酸に限定されず、ビニル基を有するカルボン酸、アクリル基を有するカルボン酸等であればよい。
【００４３】
容器の表面近傍にアミノ基、カルボキシル基及びヒドロキシル基を導入する方法としては、特に限定されないが、酸素ガス及びアンモニアガスを含む雰囲気下でプラズマ処理する方法等が挙げられる。具体的には、容器を反応容器内に収容し、反応容器内を真空ポンプで真空にした後、酸素ガス及びアンモニアガスを導入し、グロー放電を行い、低温プラズマを発生させる。
【００４４】
カルボキシル基に対して反応性を有する基としては、アミノ基、ヒドロキシル基等が挙げられるが、反応性が高いことから、アミノ基が好ましい。
【００４５】
アミノ基又はヒドロキシル基に対して反応性を有する基としては、カルボキシル基、アルデヒド基等が挙げられるが、反応性が高いことから、カルボキシル基が好ましい。
【００４６】
また、表面改質剤は、カルボキシル基、アミノ基又はヒドロキシル基に対して反応性を有する基がスペーサーを介して、一般式（１）で表される基に結合されていることが好ましい。スペーサーとしては、特に限定されないが、メチレン基、オキシエチレン基、アミノ基を１個以上有するアルキレン基等が挙げられる。
【００４７】
次に、アミノ基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤について説明する。
【００４８】
アミノ基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤としては、特に限定されないが、特開２００６−７２０３号公報、特開２００６−７２０４号公報、特開２００８−１７４４９１号公報に開示されている化合物等が挙げられる。
【００４９】
容器の表面近傍に存在するカルボキシル基と、表面改質剤が有するアミノ基は、一般的な反応により縮合させると、アミド結合を形成する。具体的には、容器にＮ−ヒドロキシスクシンイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの溶液を仕込み、容器の表面近傍に存在するカルボキシル基を活性エステル化させた後、表面改質剤を容器に仕込む。
【００５０】
次に、ヒドロキシル基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤について説明する。
【００５１】
ヒドロキシル基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤としては、特に限定されないが、Ｌ−α−グリセロホスホリルコリン等が挙げられる。
【００５２】
容器の表面近傍に存在するカルボキシル基と、表面改質剤が有するヒドロキシル基は、一般的な反応により縮合させると、エステル結合を形成する。具体的には、臭化シアンを用いて、ヒドロキシル基を活性化させた表面改質剤を容器に仕込む。
【００５３】
次に、カルボキシル基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤について説明する。
【００５４】
カルボキシル基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤としては、特に限定されないが、特開２００６−１１３８１号公報に開示されている化合物等が挙げられる。
【００５５】
容器の表面近傍に存在するアミノ基と、表面改質剤が有するカルボキシル基は、一般的な反応によりを縮合させると、アミド結合を形成する。具体的には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの溶液を用いて、カルボキシル基を活性エステル化させた表面改質剤を容器に仕込む。
【００５６】
容器の表面近傍に存在するヒドロキシル基と、表面改質剤が有するカルボキシル基は、一般的な反応により縮合させると、エステル結合を形成する。具体的には、臭化シアンを用いて、容器の表面近傍に存在するヒドロキシル基を活性化させた後、表面改質剤を添加する。
【００５７】
次に、アルデヒド基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤について説明する。
【００５８】
アルデヒド基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤としては、特に限定されないが、特開２００６−１１３８３号公報に開示されている化合物等が挙げられる。
【００５９】
容器の表面近傍に存在するアミノ基と、表面改質剤が有するアルデヒド基は、一般的な反応により縮合させると、イミノ結合を形成する。具体的には、容器に表面改質剤及びメタノールを仕込み、室温で６時間放置した後、シアノトリヒドロホウ素酸ナトリウムを０℃で添加して、一晩加熱攪拌する。反応溶媒としては、メタノール以外にも、水、エタノール、２−プロパノール等のプロトン性溶媒を使用することができるが、メタノールを用いた場合の導入率が高い傾向にある。
【００６０】
容器の表面近傍に存在するヒドロキシル基と、表面改質剤が有するアルデヒド基は、一般的な反応により付加させると、アセタール結合を形成する。具体的には、容器に表面改質剤及びメタノールを仕込み、室温で６時間放置した後、シアノトリヒドロホウ素酸ナトリウムを０℃で添加して、一晩加熱攪拌する。反応溶媒としては、メタノール以外にも、水、エタノール、２−プロパノール等のプロトン性溶媒を使用することができるが、メタノールを用いた場合の導入率が高い傾向にある。
【００６１】
なお、カルボキシル基、アミノ基及びヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器の代わりに、アルデヒド基と、アミノ基及び／又はヒドロキシル基とが表面近傍に存在する容器を用いて、アルデヒド基に対して反応性を有する基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤を反応させてもよい。
【００６２】
容器の表面近傍にアルデヒド基を導入する方法としては、特に限定されないが、表面近傍にアミノ基が存在する容器にグルタルアルデヒドを反応させる方法等が挙げられる。
【００６３】
アルデヒド基に対して反応性を有する基としては、アミノ基、ヒドロキシル基等が挙げられるが、反応性が高いことから、アミノ基が好ましい。
【００６４】
また、表面改質剤は、アルデヒド基に対して反応性を有する基がスペーサーを介して、一般式（１）で表される基に結合されていることが好ましい。スペーサーとしては、特に限定されないが、メチレン基、オキシエチレン基、アミノ基を１個以上有するアルキレン基等が挙げられる。
【００６５】
次に、アミノ基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤について説明する。
【００６６】
アミノ基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤としては、特に限定されないが、特開２００６−７２０３号公報、特開２００６−７２０４号公報、特開２００８−１７４４９１号公報に開示されている化合物等が挙げられる。
【００６７】
容器の表面近傍に存在するアルデヒド基と、表面改質剤が有するアミノ基は、一般的な反応により縮合させると、イミノ結合を形成する。具体的には、容器に表面改質剤及びメタノールを仕込み、室温で６時間放置した後、シアノトリヒドロホウ素酸ナトリウムを０℃で添加して、一晩加熱攪拌する。反応溶媒としては、メタノール以外にも、水、エタノール、２−プロパノール等のプロトン性溶媒を使用することができるが、メタノールを用いた場合の導入率が高い傾向にある。
【００６８】
次に、ヒドロキシル基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤について説明する。
【００６９】
ヒドロキシル基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤としては、特に限定されないが、Ｌ−α−グリセロホスホリルコリン等が挙げられる。
【００７０】
容器の表面近傍に存在するアルデヒド基と、表面改質剤が有するヒドロキシル基は、一般的な反応により付加させると、アセタール結合を形成する。具体的には、容器に表面改質剤及びメタノールを仕込み、室温で６時間放置した後、シアノトリヒドロホウ素酸ナトリウムを０℃で添加して、一晩加熱攪拌する。反応溶媒としては、メタノール以外にも、水、エタノール、２−プロパノール等のプロトン性溶媒を使用することができるが、メタノールを用いた場合の導入率が高い傾向にある。
【００７１】
また、カルボキシル基、アミノ基及びヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器の代わりに、アミノ基又はヒドロキシル基と、カルボキシル基が表面近傍に存在する容器を用いて、アミノ基又はヒドロキシル基に対して反応性を有する基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤を反応させてもよい。
【００７２】
さらに、カルボキシル基、アミノ基及びヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器の代わりに、アミノ基及びヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器を用いて、アミノ基又はヒドロキシル基に対して反応性を有する基と、ホリルコリン類似基を有する表面改質剤を、容器の表面近傍に未反応のアミノ基及び／又はヒドロキシル基が残留するように反応させてもよい。
【００７３】
また、カルボキシル基、アミノ基及びヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器の代わりに、カルボキシル基、アミノ基又はヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器を用いて、カルボキシル基、アミノ基又はヒドロキシル基に対して反応性を有する基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤を、容器の表面近傍に未反応のカルボキシル基、アミノ基又はヒドロキシル基が残留するように反応させてもよい。
【００７４】
［培養容器Ｄの第二の実施形態］
培養容器Ｄの第二の実施形態は、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基、シラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器に、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基と、一般式（１）で表される基を有する第一の表面改質剤と、アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基と、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基を有する第二の表面改質剤を反応させることにより製造されている。このとき、第一の表面改質剤の分子量は、３１５〜６５０である。これにより、一般式（１）で表される基を高密度で導入することができる。
【００７５】
なお、接着性細胞Ｃが間葉系幹細胞である場合は、第一の表面改質剤が有する一般式（１）で表される基に対する第二の表面改質剤が有するアミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基のモル比は、０．００１〜２．４であることが好ましい。モル比が０．００１未満であると、細胞が接着しないことがあり、２．４を超えると、細胞が単層の状態で増殖し、凝集しないことがある。
【００７６】
容器の表面近傍に加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基及び／又はシラノール基を導入する方法としては、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基を有するポリマー（以下、加水分解性ポリマーという）と、アルコキシシランを含有する塗布液を容器に塗布する方法が挙げられる。
【００７７】
加水分解性ポリマーと、アルコキシシランを含有する塗布液を容器に塗布すると、加水分解性ポリマーとアルコキシシランが加水分解され、シラノール基が生成する。さらに、シラノール基同士の脱水縮合により、加水分解性ポリマーが架橋され、シラノール基が導入された架橋ポリマー層が形成される。具体的には、材料に塗布液を塗布した後に、水、酸又はアルカリを塗布したり、加熱したりする。また、水、酸又はアルカリを材料に塗布した後に、塗布液を塗布してもよい。さらに、塗布液に、水、酸又はアルカリを混合してもよい。この場合、塗布液中で加水分解が起こるため、塗布時に塗布液を適宜調製することが好ましい。なお、水、酸又はアルカリを用いる場合は、加熱してもよいが、通常、室温で十分反応が進行する。また、水、酸又はアルカリを用いなくても、大気中の水分により緩やかに反応が進行する。
【００７８】
加水分解に用いられる酸又はアルカリとしては、加水分解させることが可能なものであれば、特に限定されず、二種以上混合して用いることができ、水溶液として用いてもよい。
【００７９】
塗布液としては、有機溶媒中に、加水分解性ポリマーと、アルコキシシランを溶解又は分散させたものを用いることができる。有機溶媒としては、特に限定されないが、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、塩素化炭化水素、エーテル、炭素数が１〜４の１〜４価の脂肪族アルコール等のアルコール、エチルセロソルブ、ブチルセロソルブ等のセロソルブ、ジオキサン、酢酸メチル、ジホルムアミド等が挙げられ、二種以上併用してもよい。
【００８０】
塗布液中の加水分解性ポリマーの含有量は、通常、０．００１〜２０質量％であり、０．１〜５質量％が好ましい。塗布液中の加水分解性ポリマーの含有量が０．００１質量％未満であると、１回の塗布で十分な効果が得られないことがあり、２０質量％を超えると、塗布性が低下することがある。
【００８１】
また、アルコキシシランに対する加水分解性ポリマーの質量比は、通常、０．０１〜２０％であり、０．２〜５％が好ましい。アルコキシシランに対する加水分解性ポリマーの質量比が０．０１％未満であると、架橋ポリマー層の強度が不十分になることがあり、２０％を超えると、架橋ポリマー層に導入されるシラノール基の量が不十分になることがある。
【００８２】
塗布液を塗布する方法としては、特に限定されないが、浸漬塗布法、スプレー塗布法、スピンキャスト法等が挙げられる。
【００８３】
容器を構成する材料としては、特に限定されないが、ＰＰ（ポリプロピレン）、シクロオレフィン樹脂、ポリカーボネート、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＥＥＫ、フッ素系樹脂、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル等の有機材料；金、チタン、アルミ、鉄、銅、ステンレス、アルミナ、酸化チタン、酸化亜鉛等の無機材料等が挙げられる。
【００８４】
加水分解性ポリマーとしては、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基を有するポリマーであれば、特に限定されないが、一般式
【００８５】
【化３】
（式中、Ｒ１は、水素原子又はメチル基であり、Ｒ２は、炭素数が１〜６のアルキレン基、好ましくはプロピレン基であり、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、炭素数が１〜６のアルコキシル基、好ましくはメトキシル基又はエトキシル基である。）
で表されるモノマー（Ａ−１）を重合することにより得られるホモポリマー又はコポリマー（以下、ポリマー（Ａ）という）を用いることができる。このとき、モノマー（Ａ−１）を二種以上用いてもよい。
【００８６】
また、ポリマー（Ａ）を合成する際に、一般式
【００８７】
【化４】
（式中、Ｒ１は、水素原子又はメチル基であり、Ｒ２は、炭素数が１〜１８の直鎖状、分岐状又は環状のアルキル基、好ましくは炭素数１〜６のアルキル基、特に好ましくはメチル基である。）
で表されるモノマー（Ａ−２）を共重合してもよい。このとき、モノマー（Ａ−２）を二種以上用いてもよい。
【００８８】
また、ポリマー（Ａ）を合成する際に、一般式
【００８９】
【化５】
（式中、Ｒ１は、水素原子又はメチル基であり、Ｒ２は、炭素数が１〜６のアルキレン基、好ましくはエチレン基、プロピレン基又は２−ヒドロキシプロピレン基であり、Ｘは、一般式
【００９０】
【化６】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、炭素数が１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくはメチル基である。）
で表される基（Ｘ−１）、一般式
【００９１】
【化７】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、炭素数が１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくはメチル基であり、Ｒ７は、炭素数が１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくはブチル基であり、ｘは、正の整数である。）
で表される基（Ｘ−２）又は一般式
【００９２】
【化８】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、炭素数が１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくはメチル基であり、Ｒ７は、炭素数が１〜６のアルキレン基、好ましくはエチレン基、プロピレン基又は２−ヒドロキシプロピレン基であり、Ｒ８は、水素原子又はメチル基であり、ｙは、正の整数である。）
で表される基（Ｘ−３）である。）
で表されるモノマー（Ａ−３）を共重合してもよい。なお、Ｘが基（Ｘ−２）又は（Ｘ−３）である場合、モノマー（Ａ−３）は、分子量が１０００〜１０００００であることが好ましく、２０００〜２００００が特に好ましい。このとき、モノマー（Ａ−３）を二種以上用いてもよい。
【００９３】
また、ポリマー（Ａ）を合成する際に、一般式
【００９４】
【化９】
（式中、Ｒ１は、水素原子又はメチル基であり、Ｒ２は、炭素数が１〜６のアルキレン基、好ましくはエチレン基又はプロピレン基であり、Ｙは、一般式
【００９５】
【化１０】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、炭素数が１〜６のアルキル基、好ましくはメチル基であり、Ｚ−は、ハロゲン化物イオン又は有機酸若しくは無機酸の共役イオンである。）
で表される基（Ｙ−１）又は一般式
【００９６】
【化１１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、炭素数が１〜６のアルキル基、好ましくはメチル基である。）
で表される基（Ｙ−２）である。）
で表されるモノマー（Ａ−４）を共重合してもよい。このとき、モノマー（Ａ−４）を二種以上用いてもよい。
【００９７】
すなわち、ポリマー（Ａ）を合成する際に、モノマー（Ａ−１）と共に、モノマー（Ａ−２）、モノマー（Ａ−３）及び／又はモノマー（Ａ−４）を共重合してもよい。
【００９８】
ポリマー（Ａ）を合成する際に用いられる全モノマー中のモノマー（Ａ−１）の含有量が４０〜８５質量％であることが好ましい。全モノマー中のモノマー（Ａ−１）の含有量が４０質量％未満であると、架橋密度が低下して、親水化の効果が十分に持続しないことがあり、８５質量％を超えると、架橋ポリマー層の均一性が低下することがある。
【００９９】
また、ポリマー（Ａ）を合成する際に用いられる全モノマー中のモノマー（Ａ−２）の含有量は、通常、１〜７５質量％であり、１０〜６０質量％が好ましい。全モノマー中のモノマー（Ａ−２）の含有量が１質量％未満であると、架橋ポリマー層の耐水性が低下することがあり、７５質量％を超えると、ポリマー（Ａ）がアルコールに難溶性となることがある。
【０１００】
さらに、ポリマー（Ａ）を合成する際に用いられる全モノマー中のモノマー（Ａ−３）の含有量は、通常、１〜７０質量％であり、５〜６０質量％が好ましい。全モノマー中のモノマー（Ａ−３）の含有量が１質量％未満であると、架橋ポリマー層の耐水性が低下することがあり、７０質量％を超えると、ポリマー（Ａ）がアルコールに難溶性となることがある。
【０１０１】
また、モノマー（Ａ−１）、モノマー（Ａ−２）及びモノマー（Ａ−３）の総質量に対するモノマー（Ａ−４）の質量の比は、通常、０．０１〜１であり、０．０５〜０．５が好ましい。この比が０．０１未満であると、架橋ポリマー層の柔軟性が低下することがあり、１を超えると、架橋ポリマー層の耐水性が低下することがある。
【０１０２】
ポリマー（Ａ）の数平均分子量は２０００〜１５００００であることが好ましい。ポリマー（Ａ）の数平均分子量が２０００未満であると、架橋ポリマー層を形成する時間が長くなることがあり、１５００００を超えると、塗布液の粘度が高くなって、塗布性や作業性に劣ることがある。
【０１０３】
なお、ポリマー（Ａ）の具体例及び製造方法は、特開平１１−３０２１２９号公報等に開示されている。
【０１０４】
また、加水分解性ポリマーとしては、一般式
【０１０５】
【化１２】
（式中、Ｒ１は、炭素数が１〜２２のアルキル基又はフェニル基、好ましくは、メチル基である。）
で表される構成単位（Ｂ−１）を有するホモポリマー又はコポリマー（以下、ポリマー（Ｂ）という）を用いることができる。このとき、ポリマー（Ｂ）は、構成単位（Ｂ−１）を二種以上有してもよい。
【０１０６】
また、ポリマー（Ｂ）は、一般式
【０１０７】
【化１３】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、炭素数が１〜２２のアルキル基又はフェニル基、好ましくは、メチル基である。）
で表される構成単位（Ｂ−２）を有してもよい。このとき、ポリマー（Ｂ）は、構成単位（Ｂ−２）を二種以上有してもよい。
【０１０８】
ポリマー（Ｂ）は、構成単位（Ｂ−１）の含有量が１〜９０質量％であることが好ましい。構成単位（Ｂ−１）の含有量が１質量％未満であると、架橋密度が低下して、親水化の効果が十分に持続しないことがあり、９０質量％を超えると、架橋ポリマー層の均一性が低下することがある。
【０１０９】
さらに、ポリマー（Ｂ）は、構成単位（Ｂ−２）の含有量が１０〜９９質量％であることが好ましい。構成単位（Ｂ−２）の含有量が１０質量％未満であると、架橋ポリマー層の均一性が低下することがあり、９９質量％を超えると、架橋密度が低下して、親水化の効果が十分に持続しないことがある。
【０１１０】
ポリマー（Ｂ）の数平均分子量は２０００〜５０００００であることが好ましい。数平均分子量が２０００未満であると、架橋ポリマー層を形成する時間が長くなることがあり、５０００００を超えると、塗布液の粘度が高くなって、塗布性や作業性に劣ることがある。
【０１１１】
加水分解性ポリマーとして、ポリマー（Ａ）及びポリマー（Ｂ）を併用してもよいし、加水分解性ポリマーと非加水分解性ポリマーを併用してもよい。非加水分解性ポリマーとしては、特に限定されないが、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基を有さないポリマー（Ａ）、ポリマー（Ｂ）等が挙げられる。
【０１１２】
容器の表面近傍にシラノール基を導入する方法としては、特に限定されないが、シリコーン樹脂を含む塗布液を容器に塗布することにより、シラノール基を有するシリコーン樹脂を含む膜を形成する方法等が挙げられる。
【０１１３】
シラノール基を有するシリコーン樹脂を含む膜は、水の接触角が３〜８°であることが好ましい。水の接触角が３°未満である膜を形成することは困難であり、水の接触角が８°を超える膜を形成すると、一般式（１）で表される基を高密度で導入できなくなることがある。
【０１１４】
塗布液に含まれるシリコーン樹脂としては、特に限定されないが、一般式
（Ｒ１Ｏ）ｎＳｉ（Ｒ２）４−ｎ
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、炭素数が１〜８のアルキル基であり、ｎは、１〜４の整数であり、ｎが１又は２である場合、複数のＲ２は、同一であっても異なっていてもよく、ｎが２又は３である場合、複数のＲ１は、同一であっても異なっていてもよい。）
で表されるアルコキシシランを加水分解した後、縮合することにより得られる樹脂が挙げられ、二種以上併用してもよい。このとき、水の接触角が３〜８°である膜に含まれるシラノール基を有するシリコーン樹脂は、塗布液に含まれるシリコーン樹脂と同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【０１１５】
塗布液に含まれる有機溶媒としては、特に限定されないが、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、塩素化炭化水素、エーテル、炭素数が１〜４の１〜４価の脂肪族アルコール等のアルコール、エチルセロソルブ、ブチルセロソルブ等のセロソルブ、ジオキサン、酢酸メチル、ジホルムアミド等が挙げられ、二種以上併用してもよい。
【０１１６】
塗布液中のシリコーン樹脂の含有量は、通常、０．００１〜１質量％であり、０．１〜１質量％が好ましい。塗布液中のシリコーン樹脂の含有量が０．００１質量％未満であると、均一な膜が形成されないことがあり、２０質量％を超えると、塗布性が低下することがある。
【０１１７】
塗布液を塗布する方法としては、特に限定されないが、浸漬塗布法、スプレー塗布法、スピンキャスト法等が挙げられる。
【０１１８】
容器を構成する材料としては、特に限定されないが、ポリカーボネート、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ポリスチレン、アクリル樹脂等の有機材料；金、チタン、アルミ、鉄、銅、ステンレス、アルミナ、酸化チタン、酸化亜鉛等の無機材料等が挙げられる。
【０１１９】
また、シラノール基が表面近傍に存在する容器として、ガラス製の容器を用いてもよい。
【０１２０】
金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器を構成する金属酸化物としては、特に限定されないが、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化鉄、酸化クロム、酸化アルミニウム等が挙げられる。
【０１２１】
半金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器を構成する金属酸化物としては、特に限定されないが、酸化ゲルマニウム、酸化ヒ素、酸化ホウ素等が挙げられる。
【０１２２】
加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基、シラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基に対して反応性を有する基としては、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基が挙げられる。
【０１２３】
また、第一の表面改質剤は、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基がスペーサーを介して、一般式（１）で表される基に結合されていることが好ましい。スペーサーとしては、特に限定されないが、メチレン基、オキシエチレン基、アミノ基を１個以上有するアルキレン基等が挙げられる。
【０１２４】
加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基としては、ヒドロシリル基、アルコキシシリル基、ハロシリル基、アシルオキシシリル基、アミノシリル基等が挙げられるが、安定性、反応性等の点から、炭素数が１〜６のアルコキシシリル基又はヒドロシリル基が好ましい。
【０１２５】
第一の表面改質剤としては、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基と、一般式（１）で表される基を有していれば、特に限定されないが、特開２００６−１１３８０号公報に開示されている化合物が挙げられる。
【０１２６】
第二の表面改質剤としては、アミノ基、加水分解によりカルボキシル基を生成することが可能な基及び／又は加水分解によりヒドロキシル基を生成することが可能な基と、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基を有していれば、特に限定されないが、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、ｐ−アミノフェニルトリメトキシシラン等のアミノ基を有する化合物；３−（トリエトキシシリル）プロピルスクシニックアンハイドライド等の加水分解によりカルボキシル基を生成することが可能な基を有する化合物；３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン等の加水分解によりヒドロキシル基を生成することが可能な基を有する化合物等が挙げられ、二種以上併用してもよい。
【０１２７】
第二の表面改質剤が加水分解によりカルボキシル基及び／又はヒドロキシル基を生成することが可能な基を有する場合は、加水分解によりカルボキシル基及び／又はヒドロキシル基を生成することが可能な基を容器の表面近傍に導入した後に、加水分解によりカルボキシル基及び／又はヒドロキシル基を生成させればよい。
【０１２８】
なお、第二の表面改質剤が有するアミノ基は、保護基により保護されていてもよい。また、第二の表面改質剤は、加水分解によりカルボキシル基又はヒドロキシル基を生成することが可能な基の代わりに、加水分解以外の反応により脱保護することが可能な保護基により保護されているカルボキシル基又はヒドロキシル基を有していてもよい。
【０１２９】
第二の表面改質剤が保護基により保護されているアミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基を有する場合は、保護基により保護されているアミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基を容器の表面近傍に導入した後に、脱保護によりアミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基を生成させればよい。
【０１３０】
次に、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基、シラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器に、アミノ基、加水分解によりカルボキシル基を生成することが可能な基及び／又は加水分解によりヒドロキシル基を生成することが可能な基と、一般式（１）で表される基を導入する方法について説明する。
【０１３１】
まず、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基、シラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器に、第一の表面改質剤及び第二の表面改質剤を含む塗布液を塗布する。このとき、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基が加水分解され、シラノール基が生成する。さらに、容器の表面近傍に存在するシラノール基、半金属酸化物の加水分解により生成したヒドロキシル基及び／又は金属酸化物の加水分解により生成したヒドロキシル基と、表面改質剤の加水分解により生成したシラノール基の脱水縮合により、容器の表面が改質される。具体的には、容器に塗布液を塗布した後に、水、酸又はアルカリを塗布したり、加熱したりする。また、水、酸又はアルカリを容器に塗布した後に、塗布液を塗布してもよい。さらに、塗布液に、水、酸又はアルカリを混合してもよい。この場合、塗布液中で加水分解が起こるため、塗布時に塗布液を適宜調製することが好ましい。なお、水、酸又はアルカリを用いる場合は、加熱してもよいが、通常、室温で十分反応が進行する。また、水、酸又はアルカリを用いなくても、大気中の水分により緩やかに反応が進行する。
【０１３２】
酸又はアルカリとしては、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基を加水分解させることが可能であれば、特に限定されず、二種以上併用してもよい。なお、加水分解に用いられる酸又はアルカリは、水溶液として用いてもよい。
【０１３３】
塗布液としては、有機溶媒中に、第一の表面改質剤及び第二の表面処理剤を溶解又は分散させたものを用いることができる。有機溶媒としては、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、塩素化炭化水素、エーテル、炭素数が１〜４の１〜４価の脂肪族アルコール等のアルコール、エチルセロソルブ、ブチルセロソルブ等のセロソルブ、ジオキサン、酢酸メチル、ジホルムアミド等が挙げられる。
【０１３４】
塗布液中の第一の表面改質剤の含有量は、通常、０．１〜３０質量％であり、１〜１０質量％が好ましい。塗布液中の第一の表面改質剤の含有量が０．１質量％未満であると、１回の塗布で第一の表面改質剤を十分に塗布できないことがあり、３０質量％を超えると、塗布性が低下することがある。
【０１３５】
塗布液を塗布する方法としては、特に限定されないが、浸漬塗布法、スプレー塗布法、スピンキャスト法等が挙げられる。
【０１３６】
なお、第一の表面処理剤を含む塗布液及び第二の表面処理剤を含む塗布液を、それぞれ容器に塗布してもよい。
【０１３７】
また、容器の表面近傍に未反応のシラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基が残留するように、表面改質剤由来のシラノール基と、容器由来のシラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基を反応させてもよい。
【０１３８】
［培養容器Ｄの第三の実施形態］
培養容器Ｄの第三の実施形態は、アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基と、一般式（１）で表される基を有する樹脂を含む層が表面に形成されている。
【０１３９】
アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基と、一般式（１）で表される基を有する樹脂としては、特に限定されないが、一般式（１）で表される基を有するモノマーと、アミノ基を有するモノマー、カルボキシル基を有するモノマー及び／又はヒドロキシル基を有するモノマーを共重合することにより得られる樹脂が挙げられる（例えば、特開平７−１８４９９０号公報参照）。
【０１４０】
容器を構成する材料としては、特に限定されないが、シクロオレフィン樹脂、ポリカーボネート、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ポリスチレン、アクリル樹脂等の有機材料；金、チタン、アルミ、鉄、銅、ステンレス、アルミナ、酸化チタン、酸化亜鉛等の無機材料等が挙げられる。
【０１４１】
なお、有機材料から構成される容器を用いる場合、容器に対する接着性を考慮すると、一般式（１）で表される基を有するモノマーと、アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基を有するモノマーと、疎水性基を有するモノマーを共重合することにより得られる樹脂を用いることが好ましい。
【０１４２】
疎水性基を有するモノマーとしては、特に限定されないが、メタクリル酸ブチル等が挙げられる。
【０１４３】
容器の表面近傍に、アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基と、一般式（１）で表される基を有する樹脂を含む層を形成する方法としては、アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基と、一般式（１）で表される基を有する樹脂を含む塗布液を容器に塗布する方法が挙げられる。
【０１４４】
塗布液としては、有機溶媒中に、樹脂を溶解又は分散させたものを用いることができる。有機溶媒としては、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、塩素化炭化水素、エーテル、炭素数が１〜４の１〜４価の脂肪族アルコール等のアルコール、エチルセロソルブ、ブチルセロソルブ等のセロソルブ、ジオキサン、酢酸メチル、ジホルムアミド等が挙げられる。
【０１４５】
塗布液中の樹脂の含有量は、通常、０．１〜３０質量％であり、１〜１０質量％が好ましい。塗布液中の樹脂の含有量が０．１質量％未満であると、１回の塗布で樹脂を十分に塗布できないことがあり、３０質量％を超えると、塗布性が低下することがある。
【０１４６】
塗布液を塗布する方法としては、特に限定されないが、浸漬塗布法、スプレー塗布法、スピンキャスト法等が挙げられる。
【０１４７】
本発明の細胞凝集塊の形成方法に、ヒト、ラット、マウス、霊長類等の哺乳類に由来する接着性細胞を適用すると、後述する物質のスクリーニング方法及び細胞の機能探索方法に有用である。
【０１４８】
本発明において、接着性細胞を培養する方法としては、特に限定されず、接着性細胞に応じて、公知の条件を適用することができるが、１０質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ｍＭのグルタミン、適量の抗生物質を含むダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ）を用いて、５体積％の二酸化炭素を含む雰囲気下、３７℃で接着性細胞を培養する方法等が挙げられる。
【０１４９】
本発明の物質のスクリーニング方法は、本発明の細胞凝集塊の形成方法により形成されている細胞凝集塊を用いて物質をスクリーニングする。このとき、本発明の物質のスクリーニング方法は、肝細胞や心筋細胞を用いて物質の毒性を評価する方法、ガン細胞を用いて薬剤の効果を試験する方法等の公知の物質のスクリーニング方法に適用することができる。物質の毒性を評価する方法としては、ＭＴＴアッセイ、アラマーブルーアッセイ等の細胞増殖を基準とする方法が挙げられる。また、ＲＴ−ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ等の方法により、炎症性サイトカインの産生放出、癌化に関連する因子であるＳＤＦ−１、ＬＩＦ、ＥＧＦＲ等の量を定量することもできる。
【０１５０】
また、本発明の物質のスクリーニング方法は、個体毎の接着性細胞の細胞凝集塊を用いて物質をスクリーニングすることにより、テーラーメイド医療に応用することができる。
【０１５１】
本発明の細胞の機能探索方法は、本発明の細胞凝集塊の形成方法により形成されている細胞凝集塊を用いて細胞の機能を探索する。このとき、本発明の細胞の機能探索方法は、接着性細胞の生化学的機能を解明する方法、バイオマーカーを探索する方法等の公知の細胞の機能探索方法に適用することができる。
【実施例】
【０１５２】
［実施例１］
プライマリアディッシュ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１ｇ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド１ｇの１質量％水溶液を仕込んだ後、化学式
【０１５３】
【化１４】
で表される化合物（Ａ）１ｇを水１００ｍｌに溶解させた溶液を添加し、アミド化した。次に、プライマリアディッシュから液を取り出し、室温で５時間乾燥させた後、水洗し、乾燥させ、培養容器を得た。なお、プライマリアディッシュは、酸素とアンモニアを含む雰囲気下でプラズマ処理されているポリスチレン製のディッシュである。
【０１５４】
培養容器に、ＭｅｎｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１０ｍｌ及び間葉系幹細胞としてのヒト脂肪由来幹細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１×１０６個／容器を添加し、ヒト脂肪由来幹細胞を培養したところ、細胞が増殖して自律的に凝集し、細胞凝集塊を形成した（図２Ａ及び図２Ｂ参照）。
【０１５５】
［比較例１］
表面処理されていないポリスチレン製のペトリディッシュ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）に、ＭｅｎｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１０ｍｌ及びヒト脂肪由来幹細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１×１０６個／ディッシュを添加し、ヒト脂肪由来幹細胞を培養したところ、細胞が単層の状態で増殖し、細胞凝集塊を形成しなかった（図３参照）。
【０１５６】
［アルカリホスファターゼ活性］
実施例１の細胞凝集塊及び比較例１の培養細胞に４質量％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液を添加して５分間処理した後、ＴＢＳ緩衝液及びＴＢＳＴ緩衝液を用いて洗浄した。次に、ＢＭパープルＡＰ基質（Ｒｏｃｈｅ社製）を添加して、３７℃で１時間反応させた後、ＴＢＳＴ緩衝液を用いて洗浄した。評価結果を図４Ａ及び図４Ｂに示す。図４Ａ及び図４Ｂから、実施例１の細胞凝集塊は、アルカリホスファターゼ活性が陽性であるが、比較例１の培養細胞は、アルカリホスファターゼ活性が陰性であることがわかる。
【０１５７】
［免疫二重染色］
実施例１の細胞凝集塊及び比較例１の培養細胞に４質量％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液を添加して５分間処理した後、ＴＢＳ緩衝液及びＴＢＳＴ緩衝液を用いて洗浄した。次に、第一の一次抗体を、カタログに記載されている方法で希釈し、細胞に反応させた後、第一のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を細胞に反応させ、ＴＢＳＴ緩衝液を用いて洗浄した。さらに、第二の一次抗体を、カタログに記載されている方法で希釈し、細胞に反応させた後、第二のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を細胞に反応させ、ＴＢＳＴ緩衝液を用いて洗浄した。評価結果を表１に示す。
【０１５８】
【表１】
なお、Ｎｅｓｔｉｎ（Ａｂｃａｍ社製）、ＣＤ２７１（Ａｂｃａｍ社製）及びＣＤ１３３（Ａｂｃａｍ社製）は、それぞれ神経由来幹細胞マーカー、脂肪由来幹細胞マーカー及び幹細胞マーカーであり、ＰＤＧＦＲａ（Ｒ＆Ｄ社製）及びＰＤＧＦＲｂ（Ｒ＆Ｄ社製）は、間葉系幹細胞マーカーである。また、実施例１の細胞凝集塊の評価結果を図５〜８に示す。表１から、実施例１の細胞凝集塊は、Ｎｅｓｔｉｎが陽性であるため、脂肪由来幹細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで神経由来幹細胞の性質を獲得できることがわかる。
【０１５９】
［実施例２−１］
３−アミノプロピルトリメトキシシランの０．１５ｍｏｌ／Ｌメタノール溶液０．０１ｍＬ、化学式
【０１６０】
【化１５】
で表される化合物（Ｂ）の０．１５ｍｏｌ／Ｌメタノール溶液９．９９ｍＬ及びメタノール１０ｍＬからなる塗布液を得た。
【０１６１】
得られた塗布液をガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業社製）に塗布し、室温で乾燥させた。次に、加熱乾燥し、室温で乾燥させた後、水洗し、乾燥させ、培養容器を得た。
【０１６２】
培養容器に、ＭｅｎｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）２．５ｍｌ及びヒト脂肪由来幹細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１×１０５個／容器を添加し、ヒト脂肪由来幹細胞を培養したところ、細胞が増殖して自律的に凝集し、細胞凝集塊を形成した（図９参照）。
【０１６３】
［実施例２−２］
３−アミノプロピルトリメトキシシランの０．１５ｍｏｌ／Ｌメタノール溶液０．５ｍＬ、化合物（Ｂ）の０．１５ｍｏｌ／Ｌメタノール溶液９．５ｍＬ及びメタノール１０ｍＬからなる塗布液を得た。
【０１６４】
得られた塗布液をガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業社製）に塗布し、室温で乾燥させた。次に、加熱乾燥し、室温で乾燥させた後、水洗し、乾燥させ、培養容器を得た。
【０１６５】
培養容器に、ＭｅｎｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）２．５ｍｌ及びヒト脂肪由来幹細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１×１０５個／容器を添加し、ヒト脂肪由来幹細胞を培養したところ、細胞が増殖して自律的に凝集し、細胞凝集塊を形成した（図１０参照）。
【０１６６】
［実施例２−３］
３−アミノプロピルトリメトキシシランの０．１５ｍｏｌ／Ｌメタノール溶液７ｍＬ、化合物（Ｂ）の０．１５ｍｏｌ／Ｌメタノール溶液３ｍＬ及びメタノール１０ｍＬからなる塗布液を得た。
【０１６７】
得られた塗布液をガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業社製）に塗布し、室温で乾燥させた。次に、加熱乾燥し、室温で乾燥させた後、水洗し、乾燥させ、培養容器を得た。
【０１６８】
培養容器に、ＭｅｎｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）２．５ｍｌ及びヒト脂肪由来幹細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１×１０５個／容器を添加し、ヒト脂肪由来幹細胞を培養したところ、細胞が増殖して自律的に凝集し、細胞凝集塊を形成した（図１１参照）。
【０１６９】
［比較例２］
表面処理されていないガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業社製）に、ＭｅｎｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）２．５ｍｌ及びヒト脂肪由来幹細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１×１０５個／ディッシュを添加し、ヒト脂肪由来幹細胞を培養したところ、細胞が単層の状態で増殖し、細胞凝集塊を形成しなかった（図１２参照）。
【０１７０】
［免疫染色］
実施例２−２の細胞凝集塊に４質量％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液を添加して５分間処理した後、０．２質量％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）／ＴＢＳ緩衝液及び０．２質量％Ｔｗｅｅｎ２０（東京化成工業社製）／ＴＢＳ緩衝液を用いて洗浄した。次に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ（ＤＡＫＯ社製）で非特異反応をブロッキングした。さらに、２００倍に希釈した一次抗体の抗ＣＤ２７１ラビットポリクローナル抗体（ａｂｃａｍ社製）及びＣＤ９０マウスモノクローナル抗体（ａｂｃａｍ社製）を細胞に一晩反応させた後、０．２質量％Ｔｗｅｅｎ２０（東京化成工業社製）／ＴＢＳ緩衝液を用いて洗浄した。次に、２５０倍に希釈したそれぞれ緑色及び赤色に発色する蛍光二次抗体のＡｌｅｘａ４８８ 抗ラビット抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びＡｌｅｘａ５９４ 抗マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を細胞に２時間反応させた後、０．２質量％Ｔｗｅｅｎ２０（東京化成工業社製）／ＴＢＳ緩衝液を用いて洗浄した。さらに、青色に発色するＶｅｃｔｏｒｓｈｉｅｌｄ−ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ社製）で核を染色した後、共焦点レーザー顕微鏡ＬＳＭ ５ ＰＡＳＣＡＬ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて観察した。その結果、実施例２−２の細胞凝集塊が緑色に発色していたことから、ＣＤ２７１が陽性であることがわかった（図１３参照）。
【０１７１】
なお、実施例２−１及び実施例２−３の細胞凝集塊も、実施例２−２の細胞凝集塊と同様に緑色に発色し、ＣＤ２７１が陽性であった。
【０１７２】
［実施例３］
プライマリアディッシュ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド８９ｍｇ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド１４９ｍｇを水１０ｍＬに溶解させた水溶液を仕込んだ後、化合物（Ａ）２００ｍｇを水１０ｍｌに溶解させた溶液を添加し、アミド化した。次に、プライマリアディッシュから液を取り出した後、水洗し、乾燥させ、培養容器を得た。
【０１７３】
培養容器に、１０質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）３ｍｌ及びガン細胞としてのヒト肝ガン細胞（プライマリーセル社製）１×１０５個／容器を添加し、ヒト肝ガン細胞を培養したところ、細胞が増殖して自律的に凝集し、細胞凝集塊を形成した（図１４参照）。
【０１７４】
［比較例３］
プライマリアディッシュ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）に、１０質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）３ｍｌ及びガン細胞としてのヒト肝ガン細胞（プライマリーセル社製）１×１０５個／容器を添加し、ヒト肝ガン細胞を培養したところ、細胞が単層の状態で増殖し、細胞凝集塊を形成しなかった（図１５参照）。
【０１７５】
［アルブミンの産生量］
実施例３及び比較例３のヒト肝ガン細胞を培養した培地中のアルブミンの産生量を、ヒトアルブミン定量キット（コスモバイオ社製）を用いて、ＥＬＩＳＡ法により定量した。評価結果を図１６に示す。図１６から、実施例３の細胞凝集塊は、アルブミンの産生量が比較例３の培養細胞よりも大きいことがわかる。
【０１７６】
［ＣＹＰ１Ａ１の活性］
実施例３の細胞凝集塊及び比較例３の培養細胞を１０質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、８μＭの７−エトキシレゾルフィン及び１０μＭのジクマロールを含むＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）中、３７℃で３０分間培養した。次に、培養上清に、β−グルクロニダーゼ及びアリルスルファターゼを含む酢酸緩衝液を添加して３７℃で２時間反応させた。さらに、溶液中のレゾルフィン量を蛍光測定（励起波長５３０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍ）により、定量し、細胞が産生したＣＹＰ１Ａ１の活性を評価した。評価結果を図１７に示す。図１７から、実施例３の細胞凝集塊は、ＣＹＰ１Ａ１の活性が比較例３の培養細胞よりも大きいことがわかる。
【０１７７】
［遺伝子発現］
実施例３の細胞凝集塊及び比較例３の培養細胞の遺伝子発現を、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０−ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、ＰＣＲ法により、定量した。評価結果を図１８に示す。図１８から、実施例３の細胞凝集塊は、ＣＹＰ１Ａ１、ＡＬＢ、ＬＤＬＲ、ＡＴＰ５１及びＣｏｌ１Ａ１の遺伝子発現が比較例３の培養細胞よりも大きいことがわかる。なお、内部標準としては、ＧＡＰＤＨを用いた。
【０１７８】
［実施例４］
ヒト肝ガン細胞（プライマリーセル社製）の代わりに、ヒト乳腺由来ガン細胞（理研ＢＲＣ製）を用いた以外は、実施例３と同様にして、ヒト乳腺由来ガン細胞を培養したところ、細胞が増殖して自律的に凝集し、細胞凝集塊を形成した（図１９参照）。
【０１７９】
［比較例４］
ヒト肝ガン細胞（プライマリーセル社製）の代わりに、ヒト乳腺由来ガン細胞（理研ＢＲＣ製）を用いた以外は、比較例３と同様にして、ヒト乳腺由来ガン細胞を培養したところ、細胞が単層の状態で増殖し、細胞凝集塊を形成しなかった（図２０参照）。
【０１８０】
［アルカリホスファターゼ活性］
実施例４の細胞凝集塊及び比較例４の培養細胞に４質量％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液を添加して５分間処理した後、ＴＢＳ緩衝液及びＴＢＳＴ緩衝液を用いて洗浄した。次に、ＢＭパープルＡＰ基質（Ｒｏｃｈｅ社製）を添加して、３７℃で１時間反応させた後、ＴＢＳＴ緩衝液を用いて洗浄した。評価結果を図２１Ａ及び図２１Ｂに示す。図２１Ａ及び図２１Ｂから、実施例４の細胞凝集塊は、アルカリホスファターゼ活性が陽性であるが、比較例４の培養細胞は、アルカリホスファターゼ活性が陰性であることがわかる。
【０１８１】
［遺伝子発現］
実施例４の細胞凝集塊及び比較例４の培養細胞の遺伝子発現を、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０−ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、ＰＣＲ法により、定量した。評価結果を図２２に示す。図２２から、実施例４の細胞凝集塊は、ＶＥＧＦ−Ａの遺伝子発現が比較例４の培養細胞よりも大きいことがわかる。なお、内部標準としては、ＧＡＰＤＨを用いた。
【符号の説明】
【０１８２】
Ｃ 接着性細胞
Ｃ' 細胞凝集塊
Ｄ 培養容器
Ｍ 培地
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞凝集塊の形成方法、物質のスクリーニング方法、細胞の機能探索方法、細胞凝集塊及び培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、接着性細胞及び非接着性細胞を培養することにより、細胞凝集塊が形成されている。
【０００３】
特許文献１には、多能性神経幹細胞を含む組織を少なくとも一種の幹細胞増殖因子を含む培地に懸濁し、神経幹細胞凝集塊形成用容器に播種、培養する事により神経幹細胞凝集塊を形成させる方法が開示されている。このとき、神経幹細胞凝集塊形成用容器は、内面に非水溶性硬化皮膜層を有し、水溶性樹脂を容器内面に被覆させて水溶性樹脂被覆層を形成した後に、水溶性樹脂被覆層を硬化させて非水溶性硬化皮膜層に変性することにより製造される。また、水溶性樹脂として、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと他のモノマー（例えば、ブチルメタクリレート等）との共重合体が例示されている。
【０００４】
しかしながら、このような神経幹細胞凝集塊形成用容器を用いて、接着性細胞を培養しても、非水溶性硬化皮膜層が接着性細胞の接着を阻害するため、接着性細胞が死滅し、接着性細胞の細胞凝集塊を形成することができないという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−２２０２０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記の従来技術が有する問題に鑑み、接着性細胞の細胞凝集塊を形成することが可能な細胞凝集塊の形成方法、該細胞凝集塊の形成方法を用いる物質のスクリーニング方法及び細胞の機能探索方法、細胞凝集塊並びに培養容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の細胞凝集塊の形成方法は、培養容器を用いて、接着性細胞を培養して細胞凝集塊を形成する方法であって、前記培養容器は、アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基と、一般式
【０００８】
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、炭素数が１以上６以下のアルキル基であり、ｍは、２以上６以下の整数である。）
で表される基が表面近傍に存在し、前記接着性細胞は、間葉系幹細胞、肝細胞又はガン細胞である。
【０００９】
本発明の物質のスクリーニング方法は、本発明の細胞凝集塊の形成方法を用いて、細胞凝集塊を形成する工程と、該細胞凝集塊を用いて物質をスクリーニングする工程を有する。
【００１０】
本発明の細胞の機能探索方法は、本発明の細胞凝集塊の形成方法を用いて、細胞凝集塊を形成する工程と、該細胞凝集塊を用いて細胞の機能を探索する工程を有する。
【００１１】
本発明の細胞凝集塊は、接着性細胞が増殖して自律的に凝集した細胞凝集塊であって、前記接着性細胞は、間葉系幹細胞、肝細胞又はガン細胞である。
【００１２】
本発明の培養容器は、アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基と、一般式
【００１３】
【化２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、炭素数が１以上６以下のアルキル基であり、ｍは、２以上６以下の整数である。）
で表される基が表面近傍に存在する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、接着性細胞の細胞凝集塊を形成することが可能な細胞凝集塊の形成方法、該細胞凝集塊の形成方法を用いる物質のスクリーニング方法及び細胞の機能探索方法、細胞凝集塊並びに培養容器を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】本発明の細胞凝集塊を形成する方法の一例を示す図（その１）である。
【図１Ｂ】本発明の細胞凝集塊を形成する方法の一例を示す図（その２）である。
【図２Ａ】実施例１の細胞凝集塊（２日間培養した場合）を示す光学顕微鏡写真である。
【図２Ｂ】実施例１の細胞凝集塊（５日間培養した場合）を示す光学顕微鏡写真である。
【図３】比較例１の培養細胞（５日間培養した場合）を示す光学顕微鏡写真である。
【図４Ａ】実施例１の細胞凝集塊のアルカリホスファターゼ活性の評価結果を示す光学顕微鏡写真である。
【図４Ｂ】比較例１の培養細胞のアルカリホスファターゼ活性の評価結果を示す光学顕微鏡写真である。
【図５】実施例１の細胞凝集塊の免疫二重染色の評価結果（その１）を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図６】実施例１の細胞凝集塊の免疫二重染色の評価結果（その２）を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図７】実施例１の細胞凝集塊の免疫二重染色の評価結果（その３）を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図８】実施例１の細胞凝集塊の免疫二重染色の評価結果（その４）を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図９】実施例２−１の細胞凝集塊（２日間培養した場合）を示す光学顕微鏡写真である。
【図１０】実施例２−２の細胞凝集塊（７日間培養した場合）を示す光学顕微鏡写真である。
【図１１】実施例２−３の細胞凝集塊（７日間培養した場合）を示す光学顕微鏡写真である。
【図１２】比較例２の培養細胞（７日間培養した場合）を示す光学顕微鏡写真である。
【図１３】実施例２−２の細胞凝集塊の免疫染色の評価結果を示す写真である。
【図１４】実施例３の細胞凝集塊（１１日間培養した場合）を示す光学顕微鏡写真である。
【図１５】比較例３の培養細胞（１１日間培養した場合）を示す光学顕微鏡写真である。
【図１６】実施例３の細胞凝集塊及び比較例３の培養細胞のアルブミンの産生量の評価結果を示す図である。
【図１７】実施例３の細胞凝集塊及び比較例３の培養細胞のＣＹＰ１Ａ１の活性の評価結果を示す図である。
【図１８】実施例３の細胞凝集塊及び比較例３の培養細胞の遺伝子発現の評価結果を示す図である。
【図１９】実施例４の細胞凝集塊（８日間培養した場合）を示す光学顕微鏡写真である。
【図２０】比較例４の培養細胞（８日間培養した場合）を示す光学顕微鏡写真である。
【図２１Ａ】実施例４の細胞凝集塊のアルカリホスファターゼ活性の評価結果を示す光学顕微鏡写真である。
【図２１Ｂ】比較例４の培養細胞のアルカリホスファターゼ活性の評価結果を示す光学顕微鏡写真である。
【図２２】実施例４の細胞凝集塊及び比較例４の培養細胞の遺伝子発現の評価結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
次に、本発明を実施するための形態を図面と共に説明する。
【００１７】
図１に、本発明の細胞凝集塊を形成する方法の一例を示す。
【００１８】
培養容器Ｄは、アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基が表面近傍に存在する領域Ｄ１と、一般式（１）で表される基が表面近傍に存在する領域Ｄ２を底面に有する。
【００１９】
培養容器Ｄに、接着性細胞Ｃ及び培地Ｍを添加すると、培養容器Ｄの底面に接着性細胞Ｃが接着する（図１Ａ参照）。これは、培養容器Ｄの底面のアミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基が表面近傍に存在する領域Ｄ１に接着性細胞Ｃが接着するためであると考えられる。次に、接着性細胞Ｃを培養すると、接着性細胞Ｃが増殖して自律的に凝集し、細胞凝集塊Ｃ'が形成される（図１Ｂ参照）。これは、培養容器Ｄの底面の一般式（１）で表される基が表面近傍に存在する領域Ｄ２は、接着性細胞Ｃの接着を抑制するため、接着性細胞Ｃ上に、増殖した接着性細胞Ｃが形成されるためであると考えられる。このため、培養容器Ｄを用いて、接着性細胞Ｃを培養すると、接着性細胞Ｃが増殖して自律的に凝集した細胞凝集塊Ｃ'を形成することができる。
【００２０】
接着性細胞Ｃとしては、特に限定されないが、間葉系幹細胞、肝細胞、肝幹細胞、心筋細胞、ガン細胞、ガン幹細胞、繊維芽細胞、神経細胞、血管内皮前駆細胞、上皮細胞等が挙げられる。
【００２１】
培養容器Ｄの形態としては、特に限定されないが、ディッシュ、マルチウェルプレート、フラスコ、ローラーボトル、細胞培養プロセスを有するデバイスのユニット等が挙げられる。
【００２２】
［培養容器Ｄの第一の実施形態］
培養容器Ｄの第一の実施形態は、カルボキシル基、アミノ基及びヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器に、カルボキシル基、アミノ基又はヒドロキシル基に対して反応性を有する基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤を反応させることにより製造されている。このとき、表面改質剤の分子量は、２２５〜６５０である。これにより、一般式（１）で表される基を高密度で導入することができる。
【００２３】
容器の表面近傍にアミノ基を導入する方法としては、特に限定されないが、窒素プラズマ処理、アンモニアプラズマ処理、表面処理剤を反応させる方法、シリコーン気相処理等が挙げられる。
【００２４】
窒素プラズマ処理では、窒素ガス雰囲気下、低温プラズマを発生させることにより、容器の表面近傍にアミノ基を導入する（例えば、Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ Ｃｏａｔｉｎｇｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１６−１１９（１９９９）８０２−８０７，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ａｓｐｅｃｔｓ １９５（２００１）８１−９５，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２００．９８９−９９６（１９９９）参照）。具体的には、容器を反応容器内に収容し、反応容器内を真空ポンプで真空にした後、窒素ガスを導入し、グロー放電を行う。
【００２５】
アンモニアプラズマ処理では、アンモニアガス雰囲気下、低温プラズマを発生させることにより、容器の表面近傍にアミノ基を導入する。具体的には、容器を反応容器内に収容し、反応容器内を真空ポンプで真空にした後、アンモニアガスを導入し、グロー放電を行う。
【００２６】
容器を構成する材料としては、特に限定されないが、ポリ塩化ビニル、アクリル樹脂、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、シクロオレフィン樹脂、ポリカーボネート、ガラス等が挙げられる。
【００２７】
表面処理剤を反応させる方法では、アミノ基を有するアルコキシシラン、クロロシラン、シラザン等の表面処理剤を用いて、アルコキシシリル基等の加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基、シラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器の表面近傍にアミノ基を導入する。具体的には、まず、容器内に水／２−プロパノール混合液を仕込み、３−アミノプロピルトリメトキシシランを添加した後、１００℃に加熱し、６時間反応させる。次に、室温に冷却した後、メタノールで洗浄し、乾燥する。
【００２８】
容器を構成する材料としては、特に限定されないが、メタクリル酸３−トリメトキシシリルプロピル−メタクリル酸メチル−ジビニルベンゼン共重合体、ポリ塩化ビニル、アクリル樹脂、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、シクロオレフィン樹脂、ポリカーボネート、シリカ、ガラス、アルミナ、タルク、クレー、マイカ、アスベスト、酸化チタン、亜鉛華、酸化鉄等が挙げられる。
【００２９】
シリコーン気相処理では、１，３，５，７−テトラメチルシクロテトラシロキサンを用いて、容器の表面近傍にヒドロシリル基を導入した後、アミノ基を有するアルケンを反応させることにより、容器の表面近傍にアミノ基を導入する（例えば、特公平１−５４３７９号公報、特公平１−５４３８０号公報、特公平１−５４３８１号公報参照）。具体的には、まず、１，３，５，７−テトラメチルシクロテトラシロキサンと、容器をデシケーター中に入れ、アスピレーターで脱気する。次に、８０℃で１６時間反応させた後、容器を取り出し、１２０℃で乾燥させる。さらに、得られた容器をエタノール中に浸し、アリルアミンを添加した後、塩化白金酸のエタノール溶液を添加し、６０℃で２時間攪拌する。反応が終了した後、エタノールで洗浄し、減圧乾燥する。
【００３０】
容器を構成する材料としては、特に限定されないが、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリ塩化ビニル、アクリル樹脂、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、シクロオレフィン樹脂、ポリカーボネート、マイカ、タルク、カオリン、アルミナ、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化鉄等が挙げられる。
【００３１】
アミノ基を有するアルケンとしては、アリルアミンに限定されず、ビニル基を有するアミン、アクリル基を有するアミン等であればよい。また、アミノ基は、ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等により保護されていてもよい。さらに、アミノ基を有するアルケンの代わりに、エポキシ基等の、例えば、ジアミンとの反応により、アミノ基を導入することが可能な基を有するアルケンを用いてもよい。
【００３２】
容器の表面近傍にカルボキシル基及び／又はヒドロキシル基を導入する方法としては、特に限定されないが、酸素プラズマ処理、オゾン処理、水蒸気プラズマ処理等が挙げられる。
【００３３】
酸素プラズマ処理では、酸素ガスの雰囲気下、低温プラズマを発生させることにより、容器の表面近傍にカルボキシル基及びヒドロキシル基を導入する。具体的には、容器を反応容器内に収容し、反応容器内を真空ポンプで真空にした後、酸素ガスを導入し、グロー放電する。
【００３４】
オゾン処理では、容器にオゾン水溶液を仕込むことにより、容器の表面近傍にカルボキシル基及びヒドロキシル基を導入する。具体的には、容器に４０ｐｐｍのオゾン水溶液を仕込み、室温で１５分間処理する。
【００３５】
水蒸気プラズマ処理では、水蒸気の雰囲気下、低温プラズマを発生させることにより、容器の表面近傍にヒドロキシル基を導入する。具体的には、容器を反応容器内に収容し、反応容器内を真空ポンプで真空にした後、水蒸気を導入し、グロー放電する。
【００３６】
容器を構成する材料としては、特に限定されないが、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエーテルエーテルケトン、シクロオレフィン樹脂、ポリカーボネート等が挙げられる。
【００３７】
容器の表面近傍にカルボキシル基を導入する方法としては、特に限定されないが、表面処理剤を反応させる方法、シリコーン気相処理等が挙げられる。
【００３８】
表面処理剤を反応させる方法では、カルボキシル基を有するアルコキシシラン、クロロシラン、シラザン等の表面処理剤を用いて、アルコキシシリル基等の加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基、シラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器の表面近傍にカルボキシル基を導入する。具体的には、まず、トリエトキシシリルプロピル無水コハク酸をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解させ、蒸留水と４−ジメチルアミノピリジンを添加し、１６時間室温で撹拌し、カルボンキシル基を有するシランカップリング剤を合成する。次に、容器に水／２−プロパノール混合液を仕込み、カルボキシル基を有するシランカップリング剤を添加した後、１００℃に加熱し、６時間反応させる。さらに、室温に冷却した後、メタノールで洗浄し、乾燥する。
【００３９】
容器を構成する材料としては、特に限定されないが、メタクリル酸３−トリメトキシシリルプロピル−メタクリル酸メチル−ジビニルベンゼン共重合体、シリカ、ガラス、アルミナ、タルク、クレー、マイカ、アスベスト、酸化チタン、亜鉛華、酸化鉄等が挙げられる。
【００４０】
シリコーン気相処理では、１，３，５，７−テトラメチルシクロテトラシロキサンを用いて、容器の表面近傍にヒドロシリル基を導入した後、カルボキシル基を有するアルケンを反応させることにより、容器の表面近傍にカルボキシル基を導入する（例えば、特公平１−５４３７９号公報、特公平１−５４３８０号公報、特公平１−５４３８１号公報参照）。具体的には、まず、１，３，５，７−テトラメチルシクロテトラシロキサンを入れた容器をデシケーター中に入れ、アスピレーターで脱気する。次に、８０℃で１６時間反応させた後、容器を取り出し、１２０℃で乾燥させる。さらに、得られた容器をエタノール中に浸し、アリルカルボン酸を添加した後、塩化白金酸のエタノール溶液を添加し、６０℃で２時間攪拌する。反応が終了した後、エタノールで洗浄し、減圧乾燥する。
【００４１】
容器を構成する材料としては、特に限定されないが、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、マイカ、タルク、カオリン、アルミナ、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化鉄等が挙げられる。
【００４２】
カルボキシル基を有するアルケンとしては、アリルカルボン酸に限定されず、ビニル基を有するカルボン酸、アクリル基を有するカルボン酸等であればよい。
【００４３】
容器の表面近傍にアミノ基、カルボキシル基及びヒドロキシル基を導入する方法としては、特に限定されないが、酸素ガス及びアンモニアガスを含む雰囲気下でプラズマ処理する方法等が挙げられる。具体的には、容器を反応容器内に収容し、反応容器内を真空ポンプで真空にした後、酸素ガス及びアンモニアガスを導入し、グロー放電を行い、低温プラズマを発生させる。
【００４４】
カルボキシル基に対して反応性を有する基としては、アミノ基、ヒドロキシル基等が挙げられるが、反応性が高いことから、アミノ基が好ましい。
【００４５】
アミノ基又はヒドロキシル基に対して反応性を有する基としては、カルボキシル基、アルデヒド基等が挙げられるが、反応性が高いことから、カルボキシル基が好ましい。
【００４６】
また、表面改質剤は、カルボキシル基、アミノ基又はヒドロキシル基に対して反応性を有する基がスペーサーを介して、一般式（１）で表される基に結合されていることが好ましい。スペーサーとしては、特に限定されないが、メチレン基、オキシエチレン基、アミノ基を１個以上有するアルキレン基等が挙げられる。
【００４７】
次に、アミノ基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤について説明する。
【００４８】
アミノ基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤としては、特に限定されないが、特開２００６−７２０３号公報、特開２００６−７２０４号公報、特開２００８−１７４４９１号公報に開示されている化合物等が挙げられる。
【００４９】
容器の表面近傍に存在するカルボキシル基と、表面改質剤が有するアミノ基は、一般的な反応により縮合させると、アミド結合を形成する。具体的には、容器にＮ−ヒドロキシスクシンイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの溶液を仕込み、容器の表面近傍に存在するカルボキシル基を活性エステル化させた後、表面改質剤を容器に仕込む。
【００５０】
次に、ヒドロキシル基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤について説明する。
【００５１】
ヒドロキシル基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤としては、特に限定されないが、Ｌ−α−グリセロホスホリルコリン等が挙げられる。
【００５２】
容器の表面近傍に存在するカルボキシル基と、表面改質剤が有するヒドロキシル基は、一般的な反応により縮合させると、エステル結合を形成する。具体的には、臭化シアンを用いて、ヒドロキシル基を活性化させた表面改質剤を容器に仕込む。
【００５３】
次に、カルボキシル基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤について説明する。
【００５４】
カルボキシル基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤としては、特に限定されないが、特開２００６−１１３８１号公報に開示されている化合物等が挙げられる。
【００５５】
容器の表面近傍に存在するアミノ基と、表面改質剤が有するカルボキシル基は、一般的な反応によりを縮合させると、アミド結合を形成する。具体的には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの溶液を用いて、カルボキシル基を活性エステル化させた表面改質剤を容器に仕込む。
【００５６】
容器の表面近傍に存在するヒドロキシル基と、表面改質剤が有するカルボキシル基は、一般的な反応により縮合させると、エステル結合を形成する。具体的には、臭化シアンを用いて、容器の表面近傍に存在するヒドロキシル基を活性化させた後、表面改質剤を添加する。
【００５７】
次に、アルデヒド基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤について説明する。
【００５８】
アルデヒド基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤としては、特に限定されないが、特開２００６−１１３８３号公報に開示されている化合物等が挙げられる。
【００５９】
容器の表面近傍に存在するアミノ基と、表面改質剤が有するアルデヒド基は、一般的な反応により縮合させると、イミノ結合を形成する。具体的には、容器に表面改質剤及びメタノールを仕込み、室温で６時間放置した後、シアノトリヒドロホウ素酸ナトリウムを０℃で添加して、一晩加熱攪拌する。反応溶媒としては、メタノール以外にも、水、エタノール、２−プロパノール等のプロトン性溶媒を使用することができるが、メタノールを用いた場合の導入率が高い傾向にある。
【００６０】
容器の表面近傍に存在するヒドロキシル基と、表面改質剤が有するアルデヒド基は、一般的な反応により付加させると、アセタール結合を形成する。具体的には、容器に表面改質剤及びメタノールを仕込み、室温で６時間放置した後、シアノトリヒドロホウ素酸ナトリウムを０℃で添加して、一晩加熱攪拌する。反応溶媒としては、メタノール以外にも、水、エタノール、２−プロパノール等のプロトン性溶媒を使用することができるが、メタノールを用いた場合の導入率が高い傾向にある。
【００６１】
なお、カルボキシル基、アミノ基及びヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器の代わりに、アルデヒド基と、アミノ基及び／又はヒドロキシル基とが表面近傍に存在する容器を用いて、アルデヒド基に対して反応性を有する基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤を反応させてもよい。
【００６２】
容器の表面近傍にアルデヒド基を導入する方法としては、特に限定されないが、表面近傍にアミノ基が存在する容器にグルタルアルデヒドを反応させる方法等が挙げられる。
【００６３】
アルデヒド基に対して反応性を有する基としては、アミノ基、ヒドロキシル基等が挙げられるが、反応性が高いことから、アミノ基が好ましい。
【００６４】
また、表面改質剤は、アルデヒド基に対して反応性を有する基がスペーサーを介して、一般式（１）で表される基に結合されていることが好ましい。スペーサーとしては、特に限定されないが、メチレン基、オキシエチレン基、アミノ基を１個以上有するアルキレン基等が挙げられる。
【００６５】
次に、アミノ基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤について説明する。
【００６６】
アミノ基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤としては、特に限定されないが、特開２００６−７２０３号公報、特開２００６−７２０４号公報、特開２００８−１７４４９１号公報に開示されている化合物等が挙げられる。
【００６７】
容器の表面近傍に存在するアルデヒド基と、表面改質剤が有するアミノ基は、一般的な反応により縮合させると、イミノ結合を形成する。具体的には、容器に表面改質剤及びメタノールを仕込み、室温で６時間放置した後、シアノトリヒドロホウ素酸ナトリウムを０℃で添加して、一晩加熱攪拌する。反応溶媒としては、メタノール以外にも、水、エタノール、２−プロパノール等のプロトン性溶媒を使用することができるが、メタノールを用いた場合の導入率が高い傾向にある。
【００６８】
次に、ヒドロキシル基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤について説明する。
【００６９】
ヒドロキシル基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤としては、特に限定されないが、Ｌ−α−グリセロホスホリルコリン等が挙げられる。
【００７０】
容器の表面近傍に存在するアルデヒド基と、表面改質剤が有するヒドロキシル基は、一般的な反応により付加させると、アセタール結合を形成する。具体的には、容器に表面改質剤及びメタノールを仕込み、室温で６時間放置した後、シアノトリヒドロホウ素酸ナトリウムを０℃で添加して、一晩加熱攪拌する。反応溶媒としては、メタノール以外にも、水、エタノール、２−プロパノール等のプロトン性溶媒を使用することができるが、メタノールを用いた場合の導入率が高い傾向にある。
【００７１】
また、カルボキシル基、アミノ基及びヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器の代わりに、アミノ基又はヒドロキシル基と、カルボキシル基が表面近傍に存在する容器を用いて、アミノ基又はヒドロキシル基に対して反応性を有する基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤を反応させてもよい。
【００７２】
さらに、カルボキシル基、アミノ基及びヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器の代わりに、アミノ基及びヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器を用いて、アミノ基又はヒドロキシル基に対して反応性を有する基と、ホリルコリン類似基を有する表面改質剤を、容器の表面近傍に未反応のアミノ基及び／又はヒドロキシル基が残留するように反応させてもよい。
【００７３】
また、カルボキシル基、アミノ基及びヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器の代わりに、カルボキシル基、アミノ基又はヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器を用いて、カルボキシル基、アミノ基又はヒドロキシル基に対して反応性を有する基と、一般式（１）で表される基を有する表面改質剤を、容器の表面近傍に未反応のカルボキシル基、アミノ基又はヒドロキシル基が残留するように反応させてもよい。
【００７４】
［培養容器Ｄの第二の実施形態］
培養容器Ｄの第二の実施形態は、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基、シラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器に、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基と、一般式（１）で表される基を有する第一の表面改質剤と、アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基と、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基を有する第二の表面改質剤を反応させることにより製造されている。このとき、第一の表面改質剤の分子量は、３１５〜６５０である。これにより、一般式（１）で表される基を高密度で導入することができる。
【００７５】
なお、接着性細胞Ｃが間葉系幹細胞である場合は、第一の表面改質剤が有する一般式（１）で表される基に対する第二の表面改質剤が有するアミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基のモル比は、０．００１〜２．４であることが好ましい。モル比が０．００１未満であると、細胞が接着しないことがあり、２．４を超えると、細胞が単層の状態で増殖し、凝集しないことがある。
【００７６】
容器の表面近傍に加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基及び／又はシラノール基を導入する方法としては、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基を有するポリマー（以下、加水分解性ポリマーという）と、アルコキシシランを含有する塗布液を容器に塗布する方法が挙げられる。
【００７７】
加水分解性ポリマーと、アルコキシシランを含有する塗布液を容器に塗布すると、加水分解性ポリマーとアルコキシシランが加水分解され、シラノール基が生成する。さらに、シラノール基同士の脱水縮合により、加水分解性ポリマーが架橋され、シラノール基が導入された架橋ポリマー層が形成される。具体的には、材料に塗布液を塗布した後に、水、酸又はアルカリを塗布したり、加熱したりする。また、水、酸又はアルカリを材料に塗布した後に、塗布液を塗布してもよい。さらに、塗布液に、水、酸又はアルカリを混合してもよい。この場合、塗布液中で加水分解が起こるため、塗布時に塗布液を適宜調製することが好ましい。なお、水、酸又はアルカリを用いる場合は、加熱してもよいが、通常、室温で十分反応が進行する。また、水、酸又はアルカリを用いなくても、大気中の水分により緩やかに反応が進行する。
【００７８】
加水分解に用いられる酸又はアルカリとしては、加水分解させることが可能なものであれば、特に限定されず、二種以上混合して用いることができ、水溶液として用いてもよい。
【００７９】
塗布液としては、有機溶媒中に、加水分解性ポリマーと、アルコキシシランを溶解又は分散させたものを用いることができる。有機溶媒としては、特に限定されないが、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、塩素化炭化水素、エーテル、炭素数が１〜４の１〜４価の脂肪族アルコール等のアルコール、エチルセロソルブ、ブチルセロソルブ等のセロソルブ、ジオキサン、酢酸メチル、ジホルムアミド等が挙げられ、二種以上併用してもよい。
【００８０】
塗布液中の加水分解性ポリマーの含有量は、通常、０．００１〜２０質量％であり、０．１〜５質量％が好ましい。塗布液中の加水分解性ポリマーの含有量が０．００１質量％未満であると、１回の塗布で十分な効果が得られないことがあり、２０質量％を超えると、塗布性が低下することがある。
【００８１】
また、アルコキシシランに対する加水分解性ポリマーの質量比は、通常、０．０１〜２０％であり、０．２〜５％が好ましい。アルコキシシランに対する加水分解性ポリマーの質量比が０．０１％未満であると、架橋ポリマー層の強度が不十分になることがあり、２０％を超えると、架橋ポリマー層に導入されるシラノール基の量が不十分になることがある。
【００８２】
塗布液を塗布する方法としては、特に限定されないが、浸漬塗布法、スプレー塗布法、スピンキャスト法等が挙げられる。
【００８３】
容器を構成する材料としては、特に限定されないが、ＰＰ（ポリプロピレン）、シクロオレフィン樹脂、ポリカーボネート、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＥＥＫ、フッ素系樹脂、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル等の有機材料；金、チタン、アルミ、鉄、銅、ステンレス、アルミナ、酸化チタン、酸化亜鉛等の無機材料等が挙げられる。
【００８４】
加水分解性ポリマーとしては、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基を有するポリマーであれば、特に限定されないが、一般式
【００８５】
【化３】
（式中、Ｒ１は、水素原子又はメチル基であり、Ｒ２は、炭素数が１〜６のアルキレン基、好ましくはプロピレン基であり、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、炭素数が１〜６のアルコキシル基、好ましくはメトキシル基又はエトキシル基である。）
で表されるモノマー（Ａ−１）を重合することにより得られるホモポリマー又はコポリマー（以下、ポリマー（Ａ）という）を用いることができる。このとき、モノマー（Ａ−１）を二種以上用いてもよい。
【００８６】
また、ポリマー（Ａ）を合成する際に、一般式
【００８７】
【化４】
（式中、Ｒ１は、水素原子又はメチル基であり、Ｒ２は、炭素数が１〜１８の直鎖状、分岐状又は環状のアルキル基、好ましくは炭素数１〜６のアルキル基、特に好ましくはメチル基である。）
で表されるモノマー（Ａ−２）を共重合してもよい。このとき、モノマー（Ａ−２）を二種以上用いてもよい。
【００８８】
また、ポリマー（Ａ）を合成する際に、一般式
【００８９】
【化５】
（式中、Ｒ１は、水素原子又はメチル基であり、Ｒ２は、炭素数が１〜６のアルキレン基、好ましくはエチレン基、プロピレン基又は２−ヒドロキシプロピレン基であり、Ｘは、一般式
【００９０】
【化６】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立に、炭素数が１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくはメチル基である。）
で表される基（Ｘ−１）、一般式
【００９１】
【化７】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、炭素数が１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくはメチル基であり、Ｒ７は、炭素数が１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくはブチル基であり、ｘは、正の整数である。）
で表される基（Ｘ−２）又は一般式
【００９２】
【化８】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、炭素数が１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくはメチル基であり、Ｒ７は、炭素数が１〜６のアルキレン基、好ましくはエチレン基、プロピレン基又は２−ヒドロキシプロピレン基であり、Ｒ８は、水素原子又はメチル基であり、ｙは、正の整数である。）
で表される基（Ｘ−３）である。）
で表されるモノマー（Ａ−３）を共重合してもよい。なお、Ｘが基（Ｘ−２）又は（Ｘ−３）である場合、モノマー（Ａ−３）は、分子量が１０００〜１０００００であることが好ましく、２０００〜２００００が特に好ましい。このとき、モノマー（Ａ−３）を二種以上用いてもよい。
【００９３】
また、ポリマー（Ａ）を合成する際に、一般式
【００９４】
【化９】
（式中、Ｒ１は、水素原子又はメチル基であり、Ｒ２は、炭素数が１〜６のアルキレン基、好ましくはエチレン基又はプロピレン基であり、Ｙは、一般式
【００９５】
【化１０】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、炭素数が１〜６のアルキル基、好ましくはメチル基であり、Ｚ−は、ハロゲン化物イオン又は有機酸若しくは無機酸の共役イオンである。）
で表される基（Ｙ−１）又は一般式
【００９６】
【化１１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、炭素数が１〜６のアルキル基、好ましくはメチル基である。）
で表される基（Ｙ−２）である。）
で表されるモノマー（Ａ−４）を共重合してもよい。このとき、モノマー（Ａ−４）を二種以上用いてもよい。
【００９７】
すなわち、ポリマー（Ａ）を合成する際に、モノマー（Ａ−１）と共に、モノマー（Ａ−２）、モノマー（Ａ−３）及び／又はモノマー（Ａ−４）を共重合してもよい。
【００９８】
ポリマー（Ａ）を合成する際に用いられる全モノマー中のモノマー（Ａ−１）の含有量が４０〜８５質量％であることが好ましい。全モノマー中のモノマー（Ａ−１）の含有量が４０質量％未満であると、架橋密度が低下して、親水化の効果が十分に持続しないことがあり、８５質量％を超えると、架橋ポリマー層の均一性が低下することがある。
【００９９】
また、ポリマー（Ａ）を合成する際に用いられる全モノマー中のモノマー（Ａ−２）の含有量は、通常、１〜７５質量％であり、１０〜６０質量％が好ましい。全モノマー中のモノマー（Ａ−２）の含有量が１質量％未満であると、架橋ポリマー層の耐水性が低下することがあり、７５質量％を超えると、ポリマー（Ａ）がアルコールに難溶性となることがある。
【０１００】
さらに、ポリマー（Ａ）を合成する際に用いられる全モノマー中のモノマー（Ａ−３）の含有量は、通常、１〜７０質量％であり、５〜６０質量％が好ましい。全モノマー中のモノマー（Ａ−３）の含有量が１質量％未満であると、架橋ポリマー層の耐水性が低下することがあり、７０質量％を超えると、ポリマー（Ａ）がアルコールに難溶性となることがある。
【０１０１】
また、モノマー（Ａ−１）、モノマー（Ａ−２）及びモノマー（Ａ−３）の総質量に対するモノマー（Ａ−４）の質量の比は、通常、０．０１〜１であり、０．０５〜０．５が好ましい。この比が０．０１未満であると、架橋ポリマー層の柔軟性が低下することがあり、１を超えると、架橋ポリマー層の耐水性が低下することがある。
【０１０２】
ポリマー（Ａ）の数平均分子量は２０００〜１５００００であることが好ましい。ポリマー（Ａ）の数平均分子量が２０００未満であると、架橋ポリマー層を形成する時間が長くなることがあり、１５００００を超えると、塗布液の粘度が高くなって、塗布性や作業性に劣ることがある。
【０１０３】
なお、ポリマー（Ａ）の具体例及び製造方法は、特開平１１−３０２１２９号公報等に開示されている。
【０１０４】
また、加水分解性ポリマーとしては、一般式
【０１０５】
【化１２】
（式中、Ｒ１は、炭素数が１〜２２のアルキル基又はフェニル基、好ましくは、メチル基である。）
で表される構成単位（Ｂ−１）を有するホモポリマー又はコポリマー（以下、ポリマー（Ｂ）という）を用いることができる。このとき、ポリマー（Ｂ）は、構成単位（Ｂ−１）を二種以上有してもよい。
【０１０６】
また、ポリマー（Ｂ）は、一般式
【０１０７】
【化１３】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、炭素数が１〜２２のアルキル基又はフェニル基、好ましくは、メチル基である。）
で表される構成単位（Ｂ−２）を有してもよい。このとき、ポリマー（Ｂ）は、構成単位（Ｂ−２）を二種以上有してもよい。
【０１０８】
ポリマー（Ｂ）は、構成単位（Ｂ−１）の含有量が１〜９０質量％であることが好ましい。構成単位（Ｂ−１）の含有量が１質量％未満であると、架橋密度が低下して、親水化の効果が十分に持続しないことがあり、９０質量％を超えると、架橋ポリマー層の均一性が低下することがある。
【０１０９】
さらに、ポリマー（Ｂ）は、構成単位（Ｂ−２）の含有量が１０〜９９質量％であることが好ましい。構成単位（Ｂ−２）の含有量が１０質量％未満であると、架橋ポリマー層の均一性が低下することがあり、９９質量％を超えると、架橋密度が低下して、親水化の効果が十分に持続しないことがある。
【０１１０】
ポリマー（Ｂ）の数平均分子量は２０００〜５０００００であることが好ましい。数平均分子量が２０００未満であると、架橋ポリマー層を形成する時間が長くなることがあり、５０００００を超えると、塗布液の粘度が高くなって、塗布性や作業性に劣ることがある。
【０１１１】
加水分解性ポリマーとして、ポリマー（Ａ）及びポリマー（Ｂ）を併用してもよいし、加水分解性ポリマーと非加水分解性ポリマーを併用してもよい。非加水分解性ポリマーとしては、特に限定されないが、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基を有さないポリマー（Ａ）、ポリマー（Ｂ）等が挙げられる。
【０１１２】
容器の表面近傍にシラノール基を導入する方法としては、特に限定されないが、シリコーン樹脂を含む塗布液を容器に塗布することにより、シラノール基を有するシリコーン樹脂を含む膜を形成する方法等が挙げられる。
【０１１３】
シラノール基を有するシリコーン樹脂を含む膜は、水の接触角が３〜８°であることが好ましい。水の接触角が３°未満である膜を形成することは困難であり、水の接触角が８°を超える膜を形成すると、一般式（１）で表される基を高密度で導入できなくなることがある。
【０１１４】
塗布液に含まれるシリコーン樹脂としては、特に限定されないが、一般式
（Ｒ１Ｏ）ｎＳｉ（Ｒ２）４−ｎ
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、炭素数が１〜８のアルキル基であり、ｎは、１〜４の整数であり、ｎが１又は２である場合、複数のＲ２は、同一であっても異なっていてもよく、ｎが２又は３である場合、複数のＲ１は、同一であっても異なっていてもよい。）
で表されるアルコキシシランを加水分解した後、縮合することにより得られる樹脂が挙げられ、二種以上併用してもよい。このとき、水の接触角が３〜８°である膜に含まれるシラノール基を有するシリコーン樹脂は、塗布液に含まれるシリコーン樹脂と同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【０１１５】
塗布液に含まれる有機溶媒としては、特に限定されないが、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、塩素化炭化水素、エーテル、炭素数が１〜４の１〜４価の脂肪族アルコール等のアルコール、エチルセロソルブ、ブチルセロソルブ等のセロソルブ、ジオキサン、酢酸メチル、ジホルムアミド等が挙げられ、二種以上併用してもよい。
【０１１６】
塗布液中のシリコーン樹脂の含有量は、通常、０．００１〜１質量％であり、０．１〜１質量％が好ましい。塗布液中のシリコーン樹脂の含有量が０．００１質量％未満であると、均一な膜が形成されないことがあり、２０質量％を超えると、塗布性が低下することがある。
【０１１７】
塗布液を塗布する方法としては、特に限定されないが、浸漬塗布法、スプレー塗布法、スピンキャスト法等が挙げられる。
【０１１８】
容器を構成する材料としては、特に限定されないが、ポリカーボネート、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ポリスチレン、アクリル樹脂等の有機材料；金、チタン、アルミ、鉄、銅、ステンレス、アルミナ、酸化チタン、酸化亜鉛等の無機材料等が挙げられる。
【０１１９】
また、シラノール基が表面近傍に存在する容器として、ガラス製の容器を用いてもよい。
【０１２０】
金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器を構成する金属酸化物としては、特に限定されないが、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化鉄、酸化クロム、酸化アルミニウム等が挙げられる。
【０１２１】
半金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器を構成する金属酸化物としては、特に限定されないが、酸化ゲルマニウム、酸化ヒ素、酸化ホウ素等が挙げられる。
【０１２２】
加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基、シラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基に対して反応性を有する基としては、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基が挙げられる。
【０１２３】
また、第一の表面改質剤は、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基がスペーサーを介して、一般式（１）で表される基に結合されていることが好ましい。スペーサーとしては、特に限定されないが、メチレン基、オキシエチレン基、アミノ基を１個以上有するアルキレン基等が挙げられる。
【０１２４】
加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基としては、ヒドロシリル基、アルコキシシリル基、ハロシリル基、アシルオキシシリル基、アミノシリル基等が挙げられるが、安定性、反応性等の点から、炭素数が１〜６のアルコキシシリル基又はヒドロシリル基が好ましい。
【０１２５】
第一の表面改質剤としては、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基と、一般式（１）で表される基を有していれば、特に限定されないが、特開２００６−１１３８０号公報に開示されている化合物が挙げられる。
【０１２６】
第二の表面改質剤としては、アミノ基、加水分解によりカルボキシル基を生成することが可能な基及び／又は加水分解によりヒドロキシル基を生成することが可能な基と、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基を有していれば、特に限定されないが、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、ｐ−アミノフェニルトリメトキシシラン等のアミノ基を有する化合物；３−（トリエトキシシリル）プロピルスクシニックアンハイドライド等の加水分解によりカルボキシル基を生成することが可能な基を有する化合物；３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン等の加水分解によりヒドロキシル基を生成することが可能な基を有する化合物等が挙げられ、二種以上併用してもよい。
【０１２７】
第二の表面改質剤が加水分解によりカルボキシル基及び／又はヒドロキシル基を生成することが可能な基を有する場合は、加水分解によりカルボキシル基及び／又はヒドロキシル基を生成することが可能な基を容器の表面近傍に導入した後に、加水分解によりカルボキシル基及び／又はヒドロキシル基を生成させればよい。
【０１２８】
なお、第二の表面改質剤が有するアミノ基は、保護基により保護されていてもよい。また、第二の表面改質剤は、加水分解によりカルボキシル基又はヒドロキシル基を生成することが可能な基の代わりに、加水分解以外の反応により脱保護することが可能な保護基により保護されているカルボキシル基又はヒドロキシル基を有していてもよい。
【０１２９】
第二の表面改質剤が保護基により保護されているアミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基を有する場合は、保護基により保護されているアミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基を容器の表面近傍に導入した後に、脱保護によりアミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基を生成させればよい。
【０１３０】
次に、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基、シラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器に、アミノ基、加水分解によりカルボキシル基を生成することが可能な基及び／又は加水分解によりヒドロキシル基を生成することが可能な基と、一般式（１）で表される基を導入する方法について説明する。
【０１３１】
まず、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基、シラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器に、第一の表面改質剤及び第二の表面改質剤を含む塗布液を塗布する。このとき、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基が加水分解され、シラノール基が生成する。さらに、容器の表面近傍に存在するシラノール基、半金属酸化物の加水分解により生成したヒドロキシル基及び／又は金属酸化物の加水分解により生成したヒドロキシル基と、表面改質剤の加水分解により生成したシラノール基の脱水縮合により、容器の表面が改質される。具体的には、容器に塗布液を塗布した後に、水、酸又はアルカリを塗布したり、加熱したりする。また、水、酸又はアルカリを容器に塗布した後に、塗布液を塗布してもよい。さらに、塗布液に、水、酸又はアルカリを混合してもよい。この場合、塗布液中で加水分解が起こるため、塗布時に塗布液を適宜調製することが好ましい。なお、水、酸又はアルカリを用いる場合は、加熱してもよいが、通常、室温で十分反応が進行する。また、水、酸又はアルカリを用いなくても、大気中の水分により緩やかに反応が進行する。
【０１３２】
酸又はアルカリとしては、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基を加水分解させることが可能であれば、特に限定されず、二種以上併用してもよい。なお、加水分解に用いられる酸又はアルカリは、水溶液として用いてもよい。
【０１３３】
塗布液としては、有機溶媒中に、第一の表面改質剤及び第二の表面処理剤を溶解又は分散させたものを用いることができる。有機溶媒としては、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、塩素化炭化水素、エーテル、炭素数が１〜４の１〜４価の脂肪族アルコール等のアルコール、エチルセロソルブ、ブチルセロソルブ等のセロソルブ、ジオキサン、酢酸メチル、ジホルムアミド等が挙げられる。
【０１３４】
塗布液中の第一の表面改質剤の含有量は、通常、０．１〜３０質量％であり、１〜１０質量％が好ましい。塗布液中の第一の表面改質剤の含有量が０．１質量％未満であると、１回の塗布で第一の表面改質剤を十分に塗布できないことがあり、３０質量％を超えると、塗布性が低下することがある。
【０１３５】
塗布液を塗布する方法としては、特に限定されないが、浸漬塗布法、スプレー塗布法、スピンキャスト法等が挙げられる。
【０１３６】
なお、第一の表面処理剤を含む塗布液及び第二の表面処理剤を含む塗布液を、それぞれ容器に塗布してもよい。
【０１３７】
また、容器の表面近傍に未反応のシラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基が残留するように、表面改質剤由来のシラノール基と、容器由来のシラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基を反応させてもよい。
【０１３８】
［培養容器Ｄの第三の実施形態］
培養容器Ｄの第三の実施形態は、アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基と、一般式（１）で表される基を有する樹脂を含む層が表面に形成されている。
【０１３９】
アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基と、一般式（１）で表される基を有する樹脂としては、特に限定されないが、一般式（１）で表される基を有するモノマーと、アミノ基を有するモノマー、カルボキシル基を有するモノマー及び／又はヒドロキシル基を有するモノマーを共重合することにより得られる樹脂が挙げられる（例えば、特開平７−１８４９９０号公報参照）。
【０１４０】
容器を構成する材料としては、特に限定されないが、シクロオレフィン樹脂、ポリカーボネート、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ポリスチレン、アクリル樹脂等の有機材料；金、チタン、アルミ、鉄、銅、ステンレス、アルミナ、酸化チタン、酸化亜鉛等の無機材料等が挙げられる。
【０１４１】
なお、有機材料から構成される容器を用いる場合、容器に対する接着性を考慮すると、一般式（１）で表される基を有するモノマーと、アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基を有するモノマーと、疎水性基を有するモノマーを共重合することにより得られる樹脂を用いることが好ましい。
【０１４２】
疎水性基を有するモノマーとしては、特に限定されないが、メタクリル酸ブチル等が挙げられる。
【０１４３】
容器の表面近傍に、アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基と、一般式（１）で表される基を有する樹脂を含む層を形成する方法としては、アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基と、一般式（１）で表される基を有する樹脂を含む塗布液を容器に塗布する方法が挙げられる。
【０１４４】
塗布液としては、有機溶媒中に、樹脂を溶解又は分散させたものを用いることができる。有機溶媒としては、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、塩素化炭化水素、エーテル、炭素数が１〜４の１〜４価の脂肪族アルコール等のアルコール、エチルセロソルブ、ブチルセロソルブ等のセロソルブ、ジオキサン、酢酸メチル、ジホルムアミド等が挙げられる。
【０１４５】
塗布液中の樹脂の含有量は、通常、０．１〜３０質量％であり、１〜１０質量％が好ましい。塗布液中の樹脂の含有量が０．１質量％未満であると、１回の塗布で樹脂を十分に塗布できないことがあり、３０質量％を超えると、塗布性が低下することがある。
【０１４６】
塗布液を塗布する方法としては、特に限定されないが、浸漬塗布法、スプレー塗布法、スピンキャスト法等が挙げられる。
【０１４７】
本発明の細胞凝集塊の形成方法に、ヒト、ラット、マウス、霊長類等の哺乳類に由来する接着性細胞を適用すると、後述する物質のスクリーニング方法及び細胞の機能探索方法に有用である。
【０１４８】
本発明において、接着性細胞を培養する方法としては、特に限定されず、接着性細胞に応じて、公知の条件を適用することができるが、１０質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ｍＭのグルタミン、適量の抗生物質を含むダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ）を用いて、５体積％の二酸化炭素を含む雰囲気下、３７℃で接着性細胞を培養する方法等が挙げられる。
【０１４９】
本発明の物質のスクリーニング方法は、本発明の細胞凝集塊の形成方法により形成されている細胞凝集塊を用いて物質をスクリーニングする。このとき、本発明の物質のスクリーニング方法は、肝細胞や心筋細胞を用いて物質の毒性を評価する方法、ガン細胞を用いて薬剤の効果を試験する方法等の公知の物質のスクリーニング方法に適用することができる。物質の毒性を評価する方法としては、ＭＴＴアッセイ、アラマーブルーアッセイ等の細胞増殖を基準とする方法が挙げられる。また、ＲＴ−ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ等の方法により、炎症性サイトカインの産生放出、癌化に関連する因子であるＳＤＦ−１、ＬＩＦ、ＥＧＦＲ等の量を定量することもできる。
【０１５０】
また、本発明の物質のスクリーニング方法は、個体毎の接着性細胞の細胞凝集塊を用いて物質をスクリーニングすることにより、テーラーメイド医療に応用することができる。
【０１５１】
本発明の細胞の機能探索方法は、本発明の細胞凝集塊の形成方法により形成されている細胞凝集塊を用いて細胞の機能を探索する。このとき、本発明の細胞の機能探索方法は、接着性細胞の生化学的機能を解明する方法、バイオマーカーを探索する方法等の公知の細胞の機能探索方法に適用することができる。
【実施例】
【０１５２】
［実施例１］
プライマリアディッシュ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１ｇ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド１ｇの１質量％水溶液を仕込んだ後、化学式
【０１５３】
【化１４】
で表される化合物（Ａ）１ｇを水１００ｍｌに溶解させた溶液を添加し、アミド化した。次に、プライマリアディッシュから液を取り出し、室温で５時間乾燥させた後、水洗し、乾燥させ、培養容器を得た。なお、プライマリアディッシュは、酸素とアンモニアを含む雰囲気下でプラズマ処理されているポリスチレン製のディッシュである。
【０１５４】
培養容器に、ＭｅｎｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１０ｍｌ及び間葉系幹細胞としてのヒト脂肪由来幹細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１×１０６個／容器を添加し、ヒト脂肪由来幹細胞を培養したところ、細胞が増殖して自律的に凝集し、細胞凝集塊を形成した（図２Ａ及び図２Ｂ参照）。
【０１５５】
［比較例１］
表面処理されていないポリスチレン製のペトリディッシュ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）に、ＭｅｎｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１０ｍｌ及びヒト脂肪由来幹細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１×１０６個／ディッシュを添加し、ヒト脂肪由来幹細胞を培養したところ、細胞が単層の状態で増殖し、細胞凝集塊を形成しなかった（図３参照）。
【０１５６】
［アルカリホスファターゼ活性］
実施例１の細胞凝集塊及び比較例１の培養細胞に４質量％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液を添加して５分間処理した後、ＴＢＳ緩衝液及びＴＢＳＴ緩衝液を用いて洗浄した。次に、ＢＭパープルＡＰ基質（Ｒｏｃｈｅ社製）を添加して、３７℃で１時間反応させた後、ＴＢＳＴ緩衝液を用いて洗浄した。評価結果を図４Ａ及び図４Ｂに示す。図４Ａ及び図４Ｂから、実施例１の細胞凝集塊は、アルカリホスファターゼ活性が陽性であるが、比較例１の培養細胞は、アルカリホスファターゼ活性が陰性であることがわかる。
【０１５７】
［免疫二重染色］
実施例１の細胞凝集塊及び比較例１の培養細胞に４質量％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液を添加して５分間処理した後、ＴＢＳ緩衝液及びＴＢＳＴ緩衝液を用いて洗浄した。次に、第一の一次抗体を、カタログに記載されている方法で希釈し、細胞に反応させた後、第一のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を細胞に反応させ、ＴＢＳＴ緩衝液を用いて洗浄した。さらに、第二の一次抗体を、カタログに記載されている方法で希釈し、細胞に反応させた後、第二のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を細胞に反応させ、ＴＢＳＴ緩衝液を用いて洗浄した。評価結果を表１に示す。
【０１５８】
【表１】
なお、Ｎｅｓｔｉｎ（Ａｂｃａｍ社製）、ＣＤ２７１（Ａｂｃａｍ社製）及びＣＤ１３３（Ａｂｃａｍ社製）は、それぞれ神経由来幹細胞マーカー、脂肪由来幹細胞マーカー及び幹細胞マーカーであり、ＰＤＧＦＲａ（Ｒ＆Ｄ社製）及びＰＤＧＦＲｂ（Ｒ＆Ｄ社製）は、間葉系幹細胞マーカーである。また、実施例１の細胞凝集塊の評価結果を図５〜８に示す。表１から、実施例１の細胞凝集塊は、Ｎｅｓｔｉｎが陽性であるため、脂肪由来幹細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで神経由来幹細胞の性質を獲得できることがわかる。
【０１５９】
［実施例２−１］
３−アミノプロピルトリメトキシシランの０．１５ｍｏｌ／Ｌメタノール溶液０．０１ｍＬ、化学式
【０１６０】
【化１５】
で表される化合物（Ｂ）の０．１５ｍｏｌ／Ｌメタノール溶液９．９９ｍＬ及びメタノール１０ｍＬからなる塗布液を得た。
【０１６１】
得られた塗布液をガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業社製）に塗布し、室温で乾燥させた。次に、加熱乾燥し、室温で乾燥させた後、水洗し、乾燥させ、培養容器を得た。
【０１６２】
培養容器に、ＭｅｎｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）２．５ｍｌ及びヒト脂肪由来幹細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１×１０５個／容器を添加し、ヒト脂肪由来幹細胞を培養したところ、細胞が増殖して自律的に凝集し、細胞凝集塊を形成した（図９参照）。
【０１６３】
［実施例２−２］
３−アミノプロピルトリメトキシシランの０．１５ｍｏｌ／Ｌメタノール溶液０．５ｍＬ、化合物（Ｂ）の０．１５ｍｏｌ／Ｌメタノール溶液９．５ｍＬ及びメタノール１０ｍＬからなる塗布液を得た。
【０１６４】
得られた塗布液をガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業社製）に塗布し、室温で乾燥させた。次に、加熱乾燥し、室温で乾燥させた後、水洗し、乾燥させ、培養容器を得た。
【０１６５】
培養容器に、ＭｅｎｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）２．５ｍｌ及びヒト脂肪由来幹細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１×１０５個／容器を添加し、ヒト脂肪由来幹細胞を培養したところ、細胞が増殖して自律的に凝集し、細胞凝集塊を形成した（図１０参照）。
【０１６６】
［実施例２−３］
３−アミノプロピルトリメトキシシランの０．１５ｍｏｌ／Ｌメタノール溶液７ｍＬ、化合物（Ｂ）の０．１５ｍｏｌ／Ｌメタノール溶液３ｍＬ及びメタノール１０ｍＬからなる塗布液を得た。
【０１６７】
得られた塗布液をガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業社製）に塗布し、室温で乾燥させた。次に、加熱乾燥し、室温で乾燥させた後、水洗し、乾燥させ、培養容器を得た。
【０１６８】
培養容器に、ＭｅｎｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）２．５ｍｌ及びヒト脂肪由来幹細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１×１０５個／容器を添加し、ヒト脂肪由来幹細胞を培養したところ、細胞が増殖して自律的に凝集し、細胞凝集塊を形成した（図１１参照）。
【０１６９】
［比較例２］
表面処理されていないガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業社製）に、ＭｅｎｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）２．５ｍｌ及びヒト脂肪由来幹細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１×１０５個／ディッシュを添加し、ヒト脂肪由来幹細胞を培養したところ、細胞が単層の状態で増殖し、細胞凝集塊を形成しなかった（図１２参照）。
【０１７０】
［免疫染色］
実施例２−２の細胞凝集塊に４質量％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液を添加して５分間処理した後、０．２質量％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）／ＴＢＳ緩衝液及び０．２質量％Ｔｗｅｅｎ２０（東京化成工業社製）／ＴＢＳ緩衝液を用いて洗浄した。次に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ（ＤＡＫＯ社製）で非特異反応をブロッキングした。さらに、２００倍に希釈した一次抗体の抗ＣＤ２７１ラビットポリクローナル抗体（ａｂｃａｍ社製）及びＣＤ９０マウスモノクローナル抗体（ａｂｃａｍ社製）を細胞に一晩反応させた後、０．２質量％Ｔｗｅｅｎ２０（東京化成工業社製）／ＴＢＳ緩衝液を用いて洗浄した。次に、２５０倍に希釈したそれぞれ緑色及び赤色に発色する蛍光二次抗体のＡｌｅｘａ４８８ 抗ラビット抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びＡｌｅｘａ５９４ 抗マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を細胞に２時間反応させた後、０．２質量％Ｔｗｅｅｎ２０（東京化成工業社製）／ＴＢＳ緩衝液を用いて洗浄した。さらに、青色に発色するＶｅｃｔｏｒｓｈｉｅｌｄ−ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ社製）で核を染色した後、共焦点レーザー顕微鏡ＬＳＭ ５ ＰＡＳＣＡＬ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて観察した。その結果、実施例２−２の細胞凝集塊が緑色に発色していたことから、ＣＤ２７１が陽性であることがわかった（図１３参照）。
【０１７１】
なお、実施例２−１及び実施例２−３の細胞凝集塊も、実施例２−２の細胞凝集塊と同様に緑色に発色し、ＣＤ２７１が陽性であった。
【０１７２】
［実施例３］
プライマリアディッシュ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド８９ｍｇ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド１４９ｍｇを水１０ｍＬに溶解させた水溶液を仕込んだ後、化合物（Ａ）２００ｍｇを水１０ｍｌに溶解させた溶液を添加し、アミド化した。次に、プライマリアディッシュから液を取り出した後、水洗し、乾燥させ、培養容器を得た。
【０１７３】
培養容器に、１０質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）３ｍｌ及びガン細胞としてのヒト肝ガン細胞（プライマリーセル社製）１×１０５個／容器を添加し、ヒト肝ガン細胞を培養したところ、細胞が増殖して自律的に凝集し、細胞凝集塊を形成した（図１４参照）。
【０１７４】
［比較例３］
プライマリアディッシュ（日本ベクトン・ディッキンソン社製）に、１０質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）３ｍｌ及びガン細胞としてのヒト肝ガン細胞（プライマリーセル社製）１×１０５個／容器を添加し、ヒト肝ガン細胞を培養したところ、細胞が単層の状態で増殖し、細胞凝集塊を形成しなかった（図１５参照）。
【０１７５】
［アルブミンの産生量］
実施例３及び比較例３のヒト肝ガン細胞を培養した培地中のアルブミンの産生量を、ヒトアルブミン定量キット（コスモバイオ社製）を用いて、ＥＬＩＳＡ法により定量した。評価結果を図１６に示す。図１６から、実施例３の細胞凝集塊は、アルブミンの産生量が比較例３の培養細胞よりも大きいことがわかる。
【０１７６】
［ＣＹＰ１Ａ１の活性］
実施例３の細胞凝集塊及び比較例３の培養細胞を１０質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、８μＭの７−エトキシレゾルフィン及び１０μＭのジクマロールを含むＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）中、３７℃で３０分間培養した。次に、培養上清に、β−グルクロニダーゼ及びアリルスルファターゼを含む酢酸緩衝液を添加して３７℃で２時間反応させた。さらに、溶液中のレゾルフィン量を蛍光測定（励起波長５３０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍ）により、定量し、細胞が産生したＣＹＰ１Ａ１の活性を評価した。評価結果を図１７に示す。図１７から、実施例３の細胞凝集塊は、ＣＹＰ１Ａ１の活性が比較例３の培養細胞よりも大きいことがわかる。
【０１７７】
［遺伝子発現］
実施例３の細胞凝集塊及び比較例３の培養細胞の遺伝子発現を、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０−ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、ＰＣＲ法により、定量した。評価結果を図１８に示す。図１８から、実施例３の細胞凝集塊は、ＣＹＰ１Ａ１、ＡＬＢ、ＬＤＬＲ、ＡＴＰ５１及びＣｏｌ１Ａ１の遺伝子発現が比較例３の培養細胞よりも大きいことがわかる。なお、内部標準としては、ＧＡＰＤＨを用いた。
【０１７８】
［実施例４］
ヒト肝ガン細胞（プライマリーセル社製）の代わりに、ヒト乳腺由来ガン細胞（理研ＢＲＣ製）を用いた以外は、実施例３と同様にして、ヒト乳腺由来ガン細胞を培養したところ、細胞が増殖して自律的に凝集し、細胞凝集塊を形成した（図１９参照）。
【０１７９】
［比較例４］
ヒト肝ガン細胞（プライマリーセル社製）の代わりに、ヒト乳腺由来ガン細胞（理研ＢＲＣ製）を用いた以外は、比較例３と同様にして、ヒト乳腺由来ガン細胞を培養したところ、細胞が単層の状態で増殖し、細胞凝集塊を形成しなかった（図２０参照）。
【０１８０】
［アルカリホスファターゼ活性］
実施例４の細胞凝集塊及び比較例４の培養細胞に４質量％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液を添加して５分間処理した後、ＴＢＳ緩衝液及びＴＢＳＴ緩衝液を用いて洗浄した。次に、ＢＭパープルＡＰ基質（Ｒｏｃｈｅ社製）を添加して、３７℃で１時間反応させた後、ＴＢＳＴ緩衝液を用いて洗浄した。評価結果を図２１Ａ及び図２１Ｂに示す。図２１Ａ及び図２１Ｂから、実施例４の細胞凝集塊は、アルカリホスファターゼ活性が陽性であるが、比較例４の培養細胞は、アルカリホスファターゼ活性が陰性であることがわかる。
【０１８１】
［遺伝子発現］
実施例４の細胞凝集塊及び比較例４の培養細胞の遺伝子発現を、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０−ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、ＰＣＲ法により、定量した。評価結果を図２２に示す。図２２から、実施例４の細胞凝集塊は、ＶＥＧＦ−Ａの遺伝子発現が比較例４の培養細胞よりも大きいことがわかる。なお、内部標準としては、ＧＡＰＤＨを用いた。
【符号の説明】
【０１８２】
Ｃ 接着性細胞
Ｃ' 細胞凝集塊
Ｄ 培養容器
Ｍ 培地
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器を用いて、接着性細胞を培養して細胞凝集塊を形成する方法であって、
前記培養容器は、アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基と、一般式
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、炭素数が１以上６以下のアルキル基であり、ｍは、２以上６以下の整数である。）
で表される基が表面近傍に存在し、
前記接着性細胞は、間葉系幹細胞、肝細胞又はガン細胞であることを特徴とする細胞凝集塊の形成方法。
【請求項２】
前記培養容器は、カルボキシル基、アミノ基及びヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器に、カルボキシル基、アミノ基又はヒドロキシル基に対して反応性を有する基と、前記一般式で表される基を有し、分子量が２２５以上６５０以下である化合物を反応させることにより製造されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞凝集塊の形成方法。
【請求項３】
前記カルボキシル基、アミノ基及びヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器は、酸素、オゾン及び／又は水蒸気と、アンモニア及び／又は窒素を含む雰囲気下でプラズマ処理することにより製造されていることを特徴とする請求項２に記載の細胞凝集塊の形成方法。
【請求項４】
前記培養容器は、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基、シラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器に、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基と、前記一般式で表される基を有し、分子量が３１５以上６５０以下である第一の化合物と、アミノ基、加水分解によりカルボキシル基を生成することが可能な基及び／又は加水分解によりヒドロキシル基を生成することが可能な基と、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基を有する第二の化合物を反応させることにより製造されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞凝集塊の形成方法。
【請求項５】
前記培養容器は、アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基と、前記一般式で表される基を有する樹脂を含む層が表面に形成されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞凝集塊の形成方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載の細胞凝集塊の形成方法を用いて、細胞凝集塊を形成する工程と、
該細胞凝集塊を用いて物質をスクリーニングする工程を有することを特徴とする物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載の細胞凝集塊の形成方法を用いて、細胞凝集塊を形成する工程と、
該細胞凝集塊を用いて細胞の機能を探索する工程を有することを特徴とする細胞の機能探索方法。
【請求項８】
接着性細胞が増殖して自律的に凝集した細胞凝集塊であって、
前記接着性細胞は、間葉系幹細胞、肝細胞又はガン細胞であることを特徴とする細胞凝集塊。
【請求項９】
アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基と、一般式
【化２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、炭素数が１以上６以下のアルキル基であり、ｍは、２以上６以下の整数である。）
で表される基が表面近傍に存在することを特徴とする培養容器。
【請求項１】
培養容器を用いて、接着性細胞を培養して細胞凝集塊を形成する方法であって、
前記培養容器は、アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基と、一般式
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、炭素数が１以上６以下のアルキル基であり、ｍは、２以上６以下の整数である。）
で表される基が表面近傍に存在し、
前記接着性細胞は、間葉系幹細胞、肝細胞又はガン細胞であることを特徴とする細胞凝集塊の形成方法。
【請求項２】
前記培養容器は、カルボキシル基、アミノ基及びヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器に、カルボキシル基、アミノ基又はヒドロキシル基に対して反応性を有する基と、前記一般式で表される基を有し、分子量が２２５以上６５０以下である化合物を反応させることにより製造されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞凝集塊の形成方法。
【請求項３】
前記カルボキシル基、アミノ基及びヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器は、酸素、オゾン及び／又は水蒸気と、アンモニア及び／又は窒素を含む雰囲気下でプラズマ処理することにより製造されていることを特徴とする請求項２に記載の細胞凝集塊の形成方法。
【請求項４】
前記培養容器は、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基、シラノール基、半金属酸化物由来のヒドロキシル基及び／又は金属酸化物由来のヒドロキシル基が表面近傍に存在する容器に、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基と、前記一般式で表される基を有し、分子量が３１５以上６５０以下である第一の化合物と、アミノ基、加水分解によりカルボキシル基を生成することが可能な基及び／又は加水分解によりヒドロキシル基を生成することが可能な基と、加水分解によりシラノール基を生成することが可能な基を有する第二の化合物を反応させることにより製造されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞凝集塊の形成方法。
【請求項５】
前記培養容器は、アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基と、前記一般式で表される基を有する樹脂を含む層が表面に形成されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞凝集塊の形成方法。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載の細胞凝集塊の形成方法を用いて、細胞凝集塊を形成する工程と、
該細胞凝集塊を用いて物質をスクリーニングする工程を有することを特徴とする物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載の細胞凝集塊の形成方法を用いて、細胞凝集塊を形成する工程と、
該細胞凝集塊を用いて細胞の機能を探索する工程を有することを特徴とする細胞の機能探索方法。
【請求項８】
接着性細胞が増殖して自律的に凝集した細胞凝集塊であって、
前記接着性細胞は、間葉系幹細胞、肝細胞又はガン細胞であることを特徴とする細胞凝集塊。
【請求項９】
アミノ基、カルボキシル基及び／又はヒドロキシル基と、一般式
【化２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、炭素数が１以上６以下のアルキル基であり、ｍは、２以上６以下の整数である。）
で表される基が表面近傍に存在することを特徴とする培養容器。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２２】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１９】
【図２０】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図１Ｂ】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２２】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１９】
【図２０】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【公開番号】特開２０１２−１８７０９７（Ｐ２０１２−１８７０９７Ａ）
【公開日】平成２４年１０月４日（２０１２．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２６５２１０（Ｐ２０１１−２６５２１０）
【出願日】平成２３年１２月２日（２０１１．１２．２）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社 資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月４日（２０１２．１０．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１２月２日（２０１１．１２．２）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社 資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
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