説明

細胞分取装置、細胞分取チップ及び細胞分取方法

【課題】分岐流路間で圧力差が生じることはなく、正確な細胞の分取を行うことができる細胞分取装置、細胞分取チップ及び細胞分取方法を提供すること。
【解決手段】
この細胞分取チップは、基板と、流路と、第1及び第2の分岐流路と、細胞保持部と、流出部とを具備する。流路は、基板に設けられ、細胞を含む流体が流れる。第1及び第2の分岐流路は、基板に設けられ、流路より分岐する。細胞保持部は、第1の分岐流路に設けられ、第1の分岐流路を流れる流体に含まれる細胞を保持する。流出部は、第1の分岐流路と第2の分岐流路とを結合し、第1の分岐流路及び第2の分岐流路より流れる液体を外部に流出させるためのものである。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、目的とする細胞を分取するための細胞分取装置、細胞分取チップ及び細胞分取方法に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞を分取する装置として、蛍光フローサイトメータやセルソータが知られている。これらの装置では、各細胞が適切な振動条件(一般には、出口流速は数m/sであり、振動数は数10kHzである。)の下で周囲流体によって吐出口にて気液界面に閉じ込めら、同時に各細胞には電荷を与えられる。各細胞は、静電場が印加された空中を荷電量に応じた方向へ液滴として飛翔し、最終的に流路外に設けた分取用容器内に分取される。
【0003】
この技術は流速が前述のように比較的速い場合において有用であるが、流速の遅いフローサイトメータや誘電サイトメータにおいては、液滴化および吐出条件を満足することは困難である。このため、むしろ分岐を設けた流路内で分取動作を行い、その後段で細胞を保持することが望ましい。
分岐後の細胞を容器に導入する方法として、例えば特許文献1に記載されているように、配管を介して細胞を含む流れを装置外に引き出す方法がある。
【0004】
しかしながら、配管を介して細胞を含む流れを装置外に引き出す場合には、一般に送液経路が長くなり容器に達するために長時間を要し、液量の消費量も大きい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特表2003−507739号公報(図38など参照)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
そこで、本発明者等は、何らかの細胞分別情報を基にして細胞の流路内分取を行う細胞分取方法を提唱している。この方法を実現する装置では、細胞分別情報を基に流路内に細胞の行路を変更して細胞を分取するために細胞に駆動力を印加する分取駆動力印加部を設ける。さらに、この装置では、分取駆動力印加部より下流に2つの分岐流路と、各分岐流路を流れる流体を滞留させる液溜部とを設けている。
【0007】
しかしながら、このような装置では、各液溜部での水頭差等が容易に発生し、この影響が分岐流路を介して取駆動力印加部にまで圧力変動として伝播し、取駆動力印加部による正確な細胞の分取を妨げてしまう可能性があった。
【0008】
本発明の目的は、分岐流路間で圧力差が生じることはなく、正確な細胞の分取を行うことができる細胞分取装置、細胞分取チップ及び細胞分取方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明に係る細胞分取装置は、分岐部と、結合部と、流出部とを具備する。
分岐部は、細胞を含む流体が流れる流路を第1の分岐流路と第2の分岐流路とに分岐する。
結合部は、第1の分岐流路と第2の分岐流路とを結合する。
流出部は、結合部により結合された第1の分岐流路及び第2の分岐流路より流れる液体を外部に流出させるためのものである。
【0010】
本発明では、一旦分岐した第1の分岐流路と第2の分岐流路とが再び結合部により結合されているので、第1の分岐流路及び第2の分岐流路より流れる液体を流出部より外部に流出させる際にこれらの分岐流路間で圧力差が生じることはなく、正確な細胞の分取を行うことができる。
【0011】
本発明の一形態として、さらに、前記第1の分岐流路に設けられ、前記細胞を保持する細胞保持部を具備し、前記細胞が前記細胞保持部を通過する間に前記細胞が沈降する距離が前記第1の分岐流路の高さよりも大きくなるよう、前記細胞保持部の長さ及び前記細胞保持部の平均断面積と前記第1の分岐流路の平均断面積との比が設定されていてもよい。
【0012】
本発明では、このように設定することにより、分取した目的とする細胞が流出部に流れることなく細胞保持部により保持されるので、分取した細胞を細胞保持部から確実に外部に取り出すことが可能となる。
本発明に係る細胞分取チップは、基板と、流路と、第1及び第2の分岐流路と、細胞保持部と、流出部とを具備する。
流路は、基板に設けられ、細胞を含む流体が流れる。
第1及び第2の分岐流路は、基板に設けられ、流路より分岐する。
細胞保持部は、第1の分岐流路に設けられ、第1の分岐流路を流れる流体に含まれる細胞を保持する。
流出部は、第1の分岐流路と第2の分岐流路とを結合し、第1の分岐流路及び第2の分岐流路より流れる液体を外部に流出させるためのものである。
【0013】
本発明では、一旦分岐した第1の分岐流路と第2の分岐流路とが再び結合しているので、第1の分岐流路及び第2の分岐流路より流れる液体を流出部より外部に流出させる際にこれらの分岐流路間で圧力差が生じることはなく、正確な細胞の分取を行うことができ、分取した細胞を細胞保持部から外部に取り出すことが可能となる。
【0014】
本発明の一形態として、細胞保持部は、外部より穿孔可能な膜状の部位を有していてもよい。
本発明では、細胞保持部が外部より穿孔可能な膜状の部位を有するので、膜状の部位を介して細胞保持部内へピペットを差し込む等により、細胞保持部に保持された細胞をピペット等により簡単に外部に取り出すことが可能である。
【0015】
本発明に係る細胞分取方法は、細胞を含む流体が流れる流路を第1の分岐流路と第2の分岐流路とに分岐する。
次に、記第1の分岐流路と第2の分岐流路とを結合する。
そして、記結合された第1の分岐流路及び第2の分岐流路より流れる液体を外部に流出させる。
本発明では、一旦分岐した第1の分岐流路と第2の分岐流路とが再び結合しているので、第1の分岐流路及び第2の分岐流路より流れる液体を外部に流出させる際にこれらの分岐流路間で圧力差が生じることはなく、正確な細胞の分取を行うことができる。
【発明の効果】
【0016】
本発明によれば、一旦分岐した第1の分岐流路と第2の分岐流路とが再び結合しているので、分岐流路間で圧力差が生じることはなく、正確な細胞の分取を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】本発明に係る細胞機能分析・分取システムの概念的な図である。
【図2】図1に示した細胞機能分析・分取システムに適用することが可能な細胞分取チップの構成を示す斜視図である。
【図3】図2に示した分取部の構成(分取信号オフ)を示す平面図である。
【図4】図3のA−A断面図である。
【図5】図2に示した分取部の構成(分取信号オン)を示す平面図である。
【図6】図2に示した細胞保持部及び流出部の構成を示す平面図である。
【図7】図6のA−A断面図である。
【図8】図6に示した細胞保持部の概略断面図である。
【図9】本発明に関連する作用効果を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づき説明する。
(細胞機能分析・分取システムの概略)
図1は本発明の一実施形態に係る細胞機能分析・分取システムの概念的な図である。
【0019】
図1に示すように、細胞機能分析・分取システム1は、マイクロ流路(以下、単に「流路」と呼ぶ。)2に沿って、その上流より投入部3、測定部4、分取部5、細胞保持部6、7、流出部10が設けられている。分取部5は、電場印加部8と、分岐部9とを有する。
Cは、サンプリングされた細胞Cを含む液体が例えばポンプなどを使った圧力容器(図示を省略)を介して投入される。
【0020】
流路2は、投入部3より投入された液体が流れる。流路2は、分岐部9において分岐流路2aと分岐流路2bとに分岐される。一旦分岐された分岐流路2aと分岐流路2bとは、流出部10において再度結合される。流出部10は、このような結合部としての機能を有するが、結合部が流出部と別に設けられていても構わない。細胞保持部6は分岐流路2aの途中に設けられ、細胞保持部7は分岐流路2bの途中に設けられている。
【0021】
測定部4は、流路2中を流れる一個一個の細胞Cに対して、細胞Cの誘電緩和現象が起こる周波数範囲(例えば0.1 MHzから50 MHz)の多点周波数(3点以上、典型的には10から20点程度)にわたり、それらの細胞Cの複素誘電率を測定する。測定部4は、測定した細胞Cの複素誘電率に基づき分取すべき細胞Cかを判断し、分取すべき細胞Cの場合には分取信号を出力する。測定部4ではなく、例えば電極対から構成される信号検出部と、検出された信号に基づき細胞Cの機能を分析する細胞機能分析部とから構成してもよい。
分取部5は、投入部3から投入された複数種類の細胞Cのうち、所望とする細胞Cを細胞保持部5に、それ以外の細胞Cを細胞保持部6に分取する。
【0022】
電場印加部8は、流体が流れる方向Xとは異なる方向、例えばX方向とは直交するY方向に勾配を有する電場を印加することが可能である。例えば、電場印加部8は、分取信号を入力されていないときには電場を印加しないが、分取信号を入力すると、電場を印加する。
【0023】
分岐部9は、電場印加部8で電場が印加されない細胞Cについては細胞保持部7に流れるように分岐し、電場印加部8で電場が印加された細胞Cについては細胞保持部6に流れるように分岐する。
細胞保持部6、7を通過した液体は流出部10より例えばポンプを使った圧力容器を介して外部に排出される。投入部3の加圧と流出部10の減圧によって、流路2に圧力差が生じるようになっている。
【0024】
この細胞機能分析・分取システム1では、予め何らかの別の手法による測定部ないし測定値解析部から発せられる分取信号に応じて、電場をオン・オフまたは振幅変調して印加し、細胞径や物性にばらつきを持った細胞群であっても、分取対象である細胞Cについてのみ、十分な誘電泳動力によって分取する。
【0025】
(細胞機能分析・分取用のチップ)
図2は図1に示した細胞機能分析・分取システムに適用する細胞分取チップの構成を示す斜視図である。
図2に示すように、チップ11は、基板12及び高分子膜等からなるシート状の部材13を有する。基板12には、流路2、投入部3としての液体投入部3a、分岐部9、細胞保持部6、7、流出部10が設けられている。これらは、基板12の表面に溝などを形成し、その表面をシート状の部材13で覆うことで構成される。細胞Cを含め液体が投入される細胞投入部3bは、シート状の部材13の微細な孔を設けて構成され、その上にピペットで細胞Cを含む液体を垂らすと、微細な孔を介して流路2を流れる液体に巻き込まれるように流路2の下流に流れていく。微細な孔であることから、細胞Cは複数まとめて流路2に流れ込むことなく、1個ずつ流路2に流れ込んでいく。
【0026】
微細な孔を挟むように一対の信号検出電極4a、4bが設けれている。一方の信号検出電極4aはシート状の部材13の表面に、他方の信号検出電極4bはシート状の部材13の裏面に設けられている。電場印加部8を構成する電極対(後述する)もシート状の部材13の裏面に設けられている。
【0027】
細胞保持部6、7はその上部が外部より穿孔可能な膜状の部位としてのシート状の部材13により覆われているが、シート状の部材13にピペットを刺してピペットを介して細胞Cが取り出される。
【0028】
電極パッド14は信号検出電極4a、4bで検出された信号を外部に取り出す。取り出された信号は例えば細胞機能分析部(図示を省略する。)に送られる。電極パット15は細胞機能分析部から出力される分取信号が入力される。入力された分取信号は電場印加部8を構成する電極対に送られる。
貫通孔26は、チップ11が細胞機能分析部等を有する装置本体に装着されたときの位置決め用の孔である。
【0029】
(分取部の構成)
図3は図2に示した分取部5の構成を示す平面図、図4は図3の断面図である。
図3及び図4に示すように、分取部5は、電場印加部8と、分岐部9とを有する。
電場印加部8は、流路2の所定の位置に設けられた電極16、17を有する。電極16と電極17とが流路2を流れる流体の方向(X方向)とは異なる例えばY方向に流路2を挟むように対向して配置されている。電極16、17は、シート状の部材13の裏面(流路2内の天面)に設けられている。電極16は、例えば信号が印加される電極で、電極17に向けて多数の電極指16aが突出するように構成される。電極17は、例えばコモン電極で、電極16に対して凹凸を持たないように構成される。以下では、一つの電極指16aと電極17との組み合わせを電極対18と呼ぶ。このように電極対18を構成することで、電極16、17に信号が印加されたときに、各電極対18でそれぞれY方向に勾配を有する電場が印加される。
【0030】
分岐部9は、流路2の電場印加部8より下流の所定の位置で、電場印加部8により電場が印加されて誘電泳動力によって流れ方向が変わった細胞Cを分岐流路2aと分岐流路2bとに分岐する。分岐部9は、流路2がY字状に分岐して構成され、一つは分岐流路2aを介して細胞保持部6に向けて分岐し、もう一つは分岐流路2bを介して細胞保持部7に向けて分岐する。例えば、投入部3においては細胞Cが細胞保持部7側の偏った位置に投入される。このように細胞保持部7側の偏った位置に投入された細胞Cは、分取対象でない細胞Cが電場印加部8を通過するときには電場印加部8で電場が印加されず(non−active)、図3に示したように、流路2をその偏った位置側を流れそのまま細胞保持部7に流れる。しかし、分取対象の細胞Cが電場印加部8を通過するときには電場印加部8で電場が印加され(active)て細胞Cに誘電泳動力が与えられ、図5に示すように、細胞Cの流れ方向が細胞保持部6側に変わり、その分取対象の細胞Cは分岐部9により細胞保持部6側に分岐される。
【0031】
このように構成された電場印加部8では、各電極対18でそれぞれY方向に勾配を有する電場が印加されるので、電場印加部8を通過する細胞Cが徐々に行路を変えて細胞保持部6側に分岐することが可能となる。
【0032】
(細胞保持部及び流出部の構成)
図6は細胞保持部及び流出部の構成を示す平面図、図7はその断面図である。
図6及び図7に示すように、分岐流路2aの途中には、細胞保持部6が設けれ、分岐流路2bの途中には細胞保持部7が設けられている。分岐流路2aの終端と分岐流路2bの終端とは、流出部10において再び結合している。従って、分岐流路2aを流れる液体は、細胞保持部6を通り流出部10流れ、分岐流路2bを流れる液体は、細胞保持部7を通り流出部10に流れるようになっている。
各細胞保持部6、7は、流路急拡大部として作用し、細胞Cが流出部10に流れ込むことはなくこれらの細胞保持部6、7に保持される。
【0033】
例えば各細胞保持部6、7は、分岐流路2a、2bよりも十分に深さが深く、しかも分岐流路2a、2bの幅よりも十分に直径の大きい円筒形状の有底孔によって構成される。
【0034】
このように、細胞保持部6、7は、液体の流れ方向(X方向)に垂直な面の平均的な断面積が分岐流路2a、2bの流れ方向に垂直な面の断面積に対して十分に大きいため、流れ方向への細胞Cの流速uに比して細胞Cの沈降速度vが大きくなる。
【0035】
細胞保持部6、7を適切に設計することにより、流体自体は常に流出部10から装置外の容器へと流れ出るにもかかわらず、細胞保持部6、7に沈降した細胞Cは細胞保持部6、7に発生する再循環領域や死水領域に留まり、流出部10へと流れ出ることはない。すなわち、そのためには、細胞Cが細胞保持部6、7を通過する間に細胞Cが沈降する距離が分岐流路2a、2bの高さよりも大きくなるよう、細胞保持部6、7の長さ及び細胞保持部6、7の平均断面積と分岐流路2a、2bの平均断面積との比が設定されていればよい。
【0036】
ここで、図8に示すように、細胞Cが細胞保持部6、7を通過する時間をt、細胞Cの分岐流路2a、2b内の主流方向(X方向)の平均流速をu、高さ方向(Z方向(重力方向を正とする))の平均流速をv1、細胞Cの細胞保持部6、7内の主流方向(X方向)の平均流速をu、高さ方向(Z方向(重力方向を正とする))の平均流速をvとする。また、主流方向(X方向)に垂直な面について、分岐流路2a、2bの平均断面積をA、細胞保持部6、7の平均断面積をAとし、分岐流路2a、2b内の流路高さをh、細胞保持部6、7の主流方向長さをLとする。
【0037】
重力方向への沈降速度は、ストークスの式、より厳密には一様流中での球に働く抗力から求められ、これをvとすると、vは主流方向の流速に因らないのでv=v=vである。
さて、細胞Cが細胞保持部6、7を通過するために必要な時間tは次のように求まる。
t=L/u=L/u・A/A
このとき、tの間に細胞Cが沈降する距離zは次のようになる。
=v
【0038】
が流路高さhよりも大きければ、細胞Cは細胞保持部6、7の下方に存在する循環流や死水域に捕捉され、流出部10へと流れずに細胞保持部6、7に留まる。すなわち、その条件は、
=vt>h
であればよい。
さらに具体的な数値を用いて説明する。
【0039】
細胞Cの例としての白血球の比重ρcellは、1.063〜1.085であり、その代表値を1.07とする。この細胞Cの径を10(μm)、つまり細胞Cの半径rは5(μm)とする。
流体の例としての水の密度ρH2Oは、20(℃)において、1000(kg/m)、粘性係数μは、20(℃)において、0.001Pa・Sとする。
そうすると、重力方向への沈降速度vは、ストークスの式から、
=2/9・(ρcell−ρH2O)gr/μ
=2.2(μm/s)
となる。
また、重力方向への沈降速度vは、より一般的な球の抗力式から、
=3.8(μm/s)
となる。
ここで、細胞保持部6、7の主流方向長さLを、L=5(mm)、
分岐流路2a、2bの平均断面積Aと細胞保持部6、7の平均断面積Aとの比S(A:A)を、S=100、
細胞Cの分岐流路2a、2b内の主流方向(X方向)の平均流速uを、u=10(μm/s)のとき、
分岐流路2a、2b内の流路高さhは、h=50(μm)、
細胞Cが細胞保持部6、7を通過する時間tは、t=50(s)であるとすると、
このt時間の間に細胞Cが沈降する距離zは、z=vt=3.8(μm/s)*50(s)=190(μm)となり、
【0040】
これは、z>hであるので、細胞Cは細胞保持部6、7の下方に存在する循環流や死水域に捕捉され、流出部10へと流れずに細胞保持部6、7に留まる。また、細胞径のばらつきを±2(μm)としても、最小径細胞について同様に計算しても、z=130(μm)>hとなり、この場合であっても細胞Cは細胞保持部6、7の下方に存在する循環流や死水域に捕捉され、流出部10へと流れずに細胞保持部6、7に留まる。
以上より、チップ11の実用上の寸法と、この装置で用いる分取速度を考慮した場合、達成可能な設計解が存在することが分かる。
(作用効果)
【0041】
図9に示すように、何らかの細胞分別情報を基にして細胞の流路内分取を行うためには、流路2内に少なくとも分取部5、その下流に分岐流路2a、2b、流出部10a、10bを備えている必要がある。また、予め安定的な送液が実現されている必要がある。
ポンプ等を使った圧力容器を用いて圧力差により流路内に流体を送出する方法は、密閉構造にすることにより外気圧から隔離できるため、本質的に脈動の存在するポンプによる送液に比して、安定的な送液が可能である。この場合、分岐部9から各流出部10a、10bへと流出する流体に関して、各流出部10a、10bでの静圧は安定であり、かつ各流出部10a、10bにおける静圧は等しく、または所望の比率に、常に厳密に保たれなければなければならない。なぜならば、各流出部10a、10bでの静圧が変化すると、主流から分岐部9を経て各分岐流路2a、2bへと流れ込む各流量は、分岐部9における静圧と各流出部10a、10bにおける静圧との差圧の比率に応じて変化するからである。各流量が変化してしまえば細胞の流れ込む分岐流路2a、2bは容易に移ろい、如何に分岐部9手前で細胞そのももあるいは細胞を含む流体全体に対して分取のための駆動力を印加しようとも、最早所望の流出部10a、10bへと細胞を送り込むことは不可能である。
そこで、本実施形態では、圧力駆動する場合、各流出部を一に結合し、低圧側圧力容器に外部に排出することによって、圧力変動のない安定的な送液が可能となる。すなわち、本実施形態によれば、各分岐流路2a、2b間で圧力差が生じず、流路2内での細胞分取に必須である安定的な送液を容易に実現できる。また、チップ11内の細胞保持部6、7に分取後の細胞Cが留まり、空中を飛ばすことはおろか、別途配管や容器を準備する必要さえないため、コンタミフリーを容易かつ安価に実現でき、再生医療への応用が可能である。
なお、本発明は、上記の実施形態には限定されず、その技術思想の範囲内で様々な変形が可能あり、その変形の範囲も本発明の技術的範囲に属するものである。
【0042】
例えば、上記の実施形態では、結合部と流出部とが一体になった例を示したが、結合部と流出部とが別に存在してもよい。例えば、2つの分岐流路を一旦結合部で結合し、共通の流路を介して流出部につながるように構成しても構わない。
上記の実施形態では、分岐流路が2つの場合を例示しが、3つ以上の分岐流路を設けても構わない。
上記の実施形態では、細胞保持部を各分岐流路に設けた例を示したが、細胞の分取を行う分岐流路のみに細胞保持部を設けるように構成しても構わない。
細胞保持部の形状や大きさ等は、上記実施形態に限定されず、もちろん様々な態様にて実施可能である。
【符号の説明】
【0043】
2 流路
2a、2b 分岐流路
6、7 細胞保持部
9 分岐部
10 流出部
11 細胞分取チップ
12 基板
13 シート状の部材
C 細胞

【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞を含む流体が流れる流路を第1の分岐流路と第2の分岐流路とに分岐する分岐部と、
前記第1の分岐流路と前記第2の分岐流路とを結合する結合部と、
前記結合部により結合された前記第1の分岐流路及び前記第2の分岐流路より流れる液体を外部に流出させるための流出部と
を具備する細胞分取装置。
【請求項2】
請求項1に記載の細胞分取装置であって、さらに、
前記第1の分岐流路に設けられ、前記細胞を保持する細胞保持部を具備し、
前記細胞が前記細胞保持部を通過する間に前記細胞が沈降する距離が前記第1の分岐流路の高さよりも大きくなるよう、前記細胞保持部の長さ及び前記細胞保持部の平均断面積と前記第1の分岐流路の平均断面積との比が設定されている
細胞分取装置。
【請求項3】
基板と、
基板に設けられ、細胞を含む流体が流れる流路と、
前記基板に設けられ、前記流路より分岐する第1及び第2の分岐流路と、
前記第1の分岐流路に設けられ、前記第1の分岐流路を流れる流体に含まれる細胞を保持する細胞保持部と、
前記第1の分岐流路と前記第2の分岐流路とを結合し、前記第1の分岐流路及び前記第2の分岐流路より流れる液体を外部に流出させるための流出部と
を具備する細胞分取チップ。
【請求項4】
請求項3に記載の細胞分取チップであって、
前記細胞保持部は、外部より穿孔可能な膜状の部位を有する
細胞分取チップ。
【請求項5】
細胞を含む流体が流れる流路を第1の分岐流路と第2の分岐流路とに分岐し、
前記第1の分岐流路と前記第2の分岐流路とを結合し、
前記結合された前記第1の分岐流路及び前記第2の分岐流路より流れる液体を外部に流出させる
細胞分取方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【図9】
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【公開番号】特開2012−95550(P2012−95550A)
【公開日】平成24年5月24日(2012.5.24)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2010−244004(P2010−244004)
【出願日】平成22年10月29日(2010.10.29)
【出願人】(000002185)ソニー株式会社 (34,172)
【Fターム(参考)】