細胞培養基材、及び細胞培養基材の製造方法
【課題】細胞が接着及び増殖しやすく、取り扱いが容易な細胞培養繊維体、細胞培養基材、及び細胞培養基材の製造方法を提供する。
【解決手段】エレクトロスピニングにより形成されたキトサン繊維を溶媒に分散させ、これをホモジナイズしたスラリー液を、基板に塗布後、加熱または凍結乾燥させて、基板と一体となった繊維体からなる、細胞培養基材、及びその製造方法。該基材において、繊維体はメッシュ状であり、繊維径は５μｍ以下である。
【解決手段】エレクトロスピニングにより形成されたキトサン繊維を溶媒に分散させ、これをホモジナイズしたスラリー液を、基板に塗布後、加熱または凍結乾燥させて、基板と一体となった繊維体からなる、細胞培養基材、及びその製造方法。該基材において、繊維体はメッシュ状であり、繊維径は５μｍ以下である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を培養するための細胞培養繊維体、細胞培養基材、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養法は、医学、生物学の研究において最も汎用される方法の一つである。細胞培養法において用いられる細胞培養基材は、細胞を培養するのに好適なものであること、例えば、細胞が付着しやすい、細胞が増殖しやすいことが求められる。
【０００３】
そこで、例えば、少なくとも、微粒子と、親水性成分と、を含む微粒子含有親水性高分子ゲルからなることを特徴とする細胞培養基材が提案されている（特許文献１参照）。このような培養基材は、細胞の接着性がよく、簡便に回収できるものであるが、ゲル状であるため取り扱いにくく、また保存しにくいという問題がある。
【０００４】
また、酸性生体高分子と塩基性生体高分子との複合体を少なくともその表面に含む成形物よりなる軟骨細胞培養用の担体が提案されている（特許文献２参照）。しかしながら、特許文献２のような担体は、例えば、２４穴プレート等の非常に小さな基板上に置いて使用する場合、シートが非常に小さくなるために取り扱いにくいという問題があった。
【０００５】
また、細胞培養基材の製造方法としては、例えば、重量平均分子量１０万以上のポリ乳酸を、任意の割合で水に溶解しうる有機化合物を含有する溶媒に溶解する段階と、前記段階で製造された溶液を静電紡糸法にて紡糸する段階、および捕集基板に累積される繊維構造体を得る段階を含む細胞培養基材の製造方法が提案されている（特許文献３参照）。特許文献３の細胞培養基材の製造方法は、いわゆる静電紡糸法によるものであるが、均一な大きさ、及び厚さの繊維構造体を得にくいという問題があった。また、繊維体の大きさを自由に設定することができないという問題があった。
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−０２７５３２号公報（特許請求の範囲等）
【特許文献２】特開２００２−２９１４６１号公報（特許請求の範囲等）
【特許文献３】特開２００４−２９０１３３号公報（特許請求の範囲等）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はこのような事情に鑑み、細胞が接着及び増殖しやすく、取り扱いが容易な細胞培養繊維体、細胞培養基材、及び細胞培養基材の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決する本発明の第１の態様は、エレクトロスピニングにより形成されたキトサン繊維を溶媒に分散させ、これをホモジナイズしたスラリー液を乾燥させることにより得た繊維体からなることを特徴とする細胞培養繊維体にある。
【０００９】
かかる第１の態様では、キトサン繊維と溶媒とをホモジナイズしたスラリー液を乾燥させることにより得た繊維体からなることで、小さく均一な繊維径の繊維が絡み合った均質な細胞培養繊維体となり、細胞の接着性に優れ、且つ細胞が増殖しやすい細胞培養繊維体となる。また、取り扱いが容易であり、室温で保存することができる細胞培養繊維体となる。
【００１０】
本発明の第２の態様は、基板と、基板上に設けられた細胞培養繊維体とからなる細胞培養基材であって、前記細胞培養繊維体が、エレクトロスピニングにより形成されたキトサン繊維を溶媒に分散させ、これをホモジナイズしたスラリー液を前記基板に塗布して乾燥させることにより得られ、前記基板と一体となった繊維体からなることを特徴とする細胞培養基材にある。
【００１１】
かかる第２の態様では、スラリー液を基板に塗布して乾燥させることで、基板と一体で取り扱いが容易な細胞培養基材となる。小さく均一な繊維径の繊維が絡み合った均質な細胞培養繊維体を具備することで、細胞の接着性に優れ、且つ細胞が増殖しやすい細胞培養基材となる。また、室温で保存することができる細胞培養繊基材となる。
【００１２】
本発明の第３の態様は、第２の態様に記載の細胞培養基材において、前記細胞培養繊維体がメッシュ状であることを特徴とする細胞培養基材にある。
【００１３】
かかる第３の態様では、細胞培養繊維体がメッシュ状であることで、より細胞の接着性に優れ、且つ接着した細胞を安定して保持することができる細胞培養基材となる。
【００１４】
本発明の第４の態様は、第２又は３の態様に記載の細胞培養基材において、前記細胞培養繊維体が、繊維径が５μｍ以下の繊維からなることを特徴とする細胞培養基材にある。
【００１５】
かかる第４の態様では、繊維径が５μｍ以下の繊維からなることで、より細胞の接着性に優れ、且つ接着した細胞を安定して保持することができる細胞培養基材となる。
【００１６】
本発明の第５の態様は、基板と、基板上に設けられた細胞培養繊維体とからなる細胞培養基材の製造方法であって、キトサン類を含むキトサン溶液をエレクトロスピニングにより繊維化してキトサン繊維を形成する工程と、前記キトサン繊維と溶媒とをホモジナイズすることによりスラリー液を形成する工程と、前記スラリー液を前記基板に塗布して乾燥させることにより当該基板と一体となった繊維体を形成する工程とを具備することを特徴とする細胞培養基材の製造方法にある。
【００１７】
かかる第５の態様では、小さく均一な繊維径の繊維が絡み合った均質な細胞培養繊維体を有する細胞培養基材を製造することができる。これにより細胞の接着性に優れ、且つ細胞が増殖しやすい細胞培養基材を製造することができる。また、所望の大きさ、及び形状の細胞培養繊維体を有する細胞培養基材を製造することができる。さらに、例えば、均一な厚さの細胞培養繊維体を有する細胞培養基材を同時に製造することができる、又は異なる大きさや形状の細胞培養繊維体を有する細胞培養基材を同時に製造することができる。
【００１８】
本発明の第６の態様は、第５の態様に記載の細胞培養基材の製造方法において、前記乾燥が加熱乾燥であることを特徴とする細胞培養基材の製造方法にある。
【００１９】
かかる第６の態様では、加熱乾燥することにより、平板状の比較的厚さの薄い細胞培養繊維体を有する細胞培養基材を製造することができる。
【００２０】
本発明の第７の態様は、第５の態様に記載の細胞培養基材の製造方法において、前記乾燥が凍結乾燥であることを特徴とする細胞培養基材の製造方法にある。
【００２１】
かかる第７の態様では、凍結乾燥することにより、３次元構造の比較的厚みのある細胞培養繊維体を有する細胞培養基材を製造することができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、小さく均一な繊維径の繊維が絡み合った均質な細胞培養繊維体となる。また、細胞の接着性に優れ、且つ細胞が増殖しやすい細胞培養繊維体及び細胞培養基材となる。さらに、取り扱いが容易であり、室温で保存することができる細胞培養繊維体、及び細胞培養基材となる。
【００２３】
小さく均一な繊維径の繊維からなる均質な細胞培養繊維体を有する細胞培養基材を製造することができ、また、所望の大きさ、及び形状の細胞培養繊維体を有する細胞培養基材を製造することができる。さらに、均一な厚さの細胞培養基材を同時に製造することができる、又は異なる大きさや形状の細胞培養基材を同時に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明にかかる細胞培養繊維体は、エレクトロスピニングにより形成されたキトサン繊維と溶媒とをホモジナイズしたスラリー液を乾燥させることにより得た繊維体からなる。かかる細胞培養繊維体は、小さく均一な繊維径の繊維が絡み合った均質な繊維体である。ここでいう均質とは、厚さ方向及び平面方向に繊維が均一に存在している状態、すなわち繊維の密度が均一な状態のことを指す。このとき、繊維と繊維との隙間（開口）もほぼ均一な大きさで存在している。これは、キトサン繊維と溶媒とをホモジナイズしたスラリー液、すなわち均質化したスラリー液を乾燥させることにより実現されるものである。
【００２５】
本発明における細胞培養繊維体は、エレクトロスピニング（静電紡糸）により形成されたキトサン繊維を用いることで、非常に小さく均一な繊維径の繊維からなるものとすることができる。すなわち、本発明にかかる細胞培養繊維体は、エレクトロスピニング（静電紡糸）により得られる小さく均一な繊維径を保持した繊維からなる繊維体である。なお、繊維体は、繊維の繊維径が好ましくは５μｍ以下であり、さらに好ましくは０．０１〜３．０μｍ、特に好ましくは０．１〜１．０μｍである。細胞がひっかかる部分（繊維）や、繊維と繊維の間にできる細胞が入り込む開口が小さくなるため、細胞が付着しやすく、接着した細胞を安定して保持することができるものとなる。
【００２６】
また、本発明における細胞培養繊維体は、キトサン繊維と溶媒とをホモジナイズしたスラリー液を乾燥させることにより得たものであるので、上述したように均質なものとなる。ここで、ホモジナイズとは、凝集した状態のキトサン繊維をほぐしながら破砕して、キトサン繊維を均一化させながら溶媒中に分散させることをいう。これにより、エレクトロスピニングにより得られた繊維径を保持しつつ、ほぼ均一な長さからなるキトサン繊維が溶媒中に分散したスラリー液が得られる。このスラリー液を乾燥させることで、本発明の細胞培養基材は、ほぼ均一な長さの繊維が絡み合い、厚さ方向及び平面方向の繊維の密度がほぼ均一な状態、すなわち、均質なものとなる。このとき、繊維と繊維との間の開口はほぼ均一な大きさで存在するようになる。
【００２７】
本発明における細胞培養繊維体は、従来のエレクトロスピニングにより形成された細胞培養基材のように厚さ方向又は平面方向の繊維の密度が異なったり、繊維と繊維との間にできる開口の大きさが著しく異なったりする虞がない。このため、本発明の細胞培養繊維体、及び細胞培養基材は、付着した細胞を安定して保持しやすく、また付着した細胞が増殖しやすくなる。
【００２８】
また、本発明における細胞培養繊維体は、好ましくはメッシュ状である。メッシュ状とは、所望の開口を有する網目状のことである。本発明における繊維体は、ほぼ均一な長さの繊維が絡み合いながらメッシュ状となることで、繊維と繊維の間の開口から細胞が侵入しやすく、また繊維が絡んで網目状となっている部分に細胞がひっかかりやすいため、より細胞が付着しやすく、接着した細胞を安定して保持することができる。
【００２９】
本発明における細胞培養繊維体は、キトサン繊維を含むスラリー液から得るものである。ここでいうキトサン繊維は、キトサン類を主成分とする繊維である。すなわち、本発明における繊維体はキトサン類繊維からなるものである。このため、本発明の細胞培養繊維体は、細胞の接着性に優れ且つ細胞の増殖がしやすいものとなる。また、キトサン類繊維は蛍光化で細胞と区別できるため、本発明にかかる細胞培養繊維体は細胞の観察が容易である。
【００３０】
なお、キトサン類とは、キチン(β−ポリ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン)を脱アセチル化した生成物又はこの誘導体をいい、キトサン（β−ポリ−Ｄ−グルコサミン）及びその誘導体の他、未反応のキチン及びその誘導体を含有するものをいう。本発明で用いることができるキトサン類は、キチンの脱アセチル化度合、すなわち、キトサンの割合は特に限定されないが、５０％以上であることが好ましい。
【００３１】
本発明で用いるキトサン類の主成分は特に限定されず、例えば、キトサン、Ｎ−アリルキトサン、Ｎ−アルキルキトサン、ｏ−アリルキトサン、ｏ−アルキルキトサン、硫酸化キトサン、ニトロ化キトサン、カルボキシメチル化キトサン等が挙げられるが、キトサン、カルボキシメチル化キトサンが好ましい。
【００３２】
なお、繊維体は、キトサン類を含有するものであればよく、細胞の培養に好適な他の成分を含んでいてもよい。例えば、性能を最大限に発揮させるために必要に応じて、合成高分子や繊維の改質剤、生理活性物質（細胞接着活性因子、細胞増殖因子、繊維芽細胞成長因子、免疫活性因子、神経作用因子等）、血清成分、生物組織成分、界面活性剤等を加える。具体的には、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ乳酸、絹フィブロイン、プリテオグリカン、フィブロネクチン、ヴィトロネクチン、エンタネクチン、エラスチン、ラミニン、セレクチン、ガレクチン、レクチン（ＷＧＡ、コンカナバリンＡ等）、コラーゲン、ゼラチン、酵素（コラゲナーゼ、トリプシン、グルコシダーゼ、プロテインキナーゼ、ウロキナーゼ、ＳＯＤ等）、アルブミン、フィブリン、フィブリノーゲン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、細胞外マトリクスタンパク質、インテグリン、アミノ酸（グリシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、システイン、ロイシン、メチオニン等）、ジペプチド、トリペプチド、ペプチドタンパク質（チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン配列、アルギニン−グルタミン酸−アスパラギン酸−バリン配列、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列を含む）、グリコサミノグリカン、ムチン型結合糖鎖、アスパラギン型結合糖鎖、オリゴ糖（トレハロース、キチンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、フルクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、シクロデキストリン等）、単糖（マンノース、Ｎ-アセチル−Ｄ−グルコサミン、グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、シアル酸、ムラミン酸、グルコース、ガラクトース、ラクトース、フコース、アラビノース等）、ガングリオシド、スフィンゴ脂質、糖脂質（アルキルグリコシド、ガラクトシルセラミド等）、ショ糖脂肪酸エステル、脂肪酸エステル（ＤＨＡ、ＥＰＡ等）、長鎖脂肪酸（アラキドン酸、リノール酸、レチノイン酸等）、グリセロール、多価アルコール、コレステロール、スクアレン、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエン、ステロイド、インシュリン、トランスフェリン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、チロキシン、トリヨードチロシン、β-メルカプトエタノール、アセチルコリン、酸類（乳酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、グルコン酸、グルコロン酸、パントテン酸、ピルビン酸等）、グリチルリチン、ルチン、ステビオシド、サポニン、アルブチン、ポリフェノール（カテキン）、ＳＯＤ様活性物質、インターフェロン、インターロイキン、サイトカイン、ケモカイン、ＴＮＦ-α、モノクローナル抗体、補体因子、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アデニン、牛胎仔血清、ビタミン類、無機塩類、シリコン、セラミック、アパタイト、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、エチレンジアミンテトラ酢酸等が挙げられる。
【００３３】
本発明にかかる細胞培養繊維体及び細胞培養基材は、室温で保存することができ、使用する際には、細胞の培養に適した水等の溶媒を滴下又は含浸させることにより直ちに使用することができる。
【００３４】
本発明にかかる細胞培養基材は、細胞培養繊維体と基板とが一体となっている。ここでいう「基板と一体」とは、基板と接着している状態を指すが、基板から取り外すこともできる状態である。かかる細胞培養繊維体は、水やバッファー等に通しても基板から剥がれてしまうことがない。なお、細胞培養繊維体は、所望の基板と一体となることができる。基板としては、例えば、非常に小さなカバースリップ、ウェル、減菌シャーレ、培養フラスコ等を挙げることができる。このとき、細胞培養繊維体は基板の形状や大きさ等に左右されることなく均質なものとなる。かかる細胞培養基材は、細胞培養繊維体と基板とが一体となっていることにより、細胞培養繊維体が取り扱いの際に変形してしまったり、基板に載せるのが困難であったりすることがない。また、細胞培養基材は、細胞培養繊維体と基板とが一体となった状態で、室温で保存することができ、非常に取り扱いが容易である。
【００３５】
本発明にかかる細胞培養基材は、上述したような構成により、従来、培養が困難とされていた肝臓細胞、脂肪細胞、血球系細胞の培養や、神経節移植片の培養をすることができるものである。勿論、線維芽細胞等の他の細胞も好適に培養することができる。また、増殖アッセイも容易にできるものである。
【００３６】
本発明にかかる細胞培養基材の製造方法は、キトサン類を含むキトサン溶液をエレクトロスピニングにより繊維化してキトサン繊維を形成する工程と、キトサン繊維と溶媒とをホモジナイズすることによりスラリー液を形成する工程と、スラリー液を基板に塗布して乾燥させることにより当該基板と一体となった繊維体を形成する工程とを具備するものである。この製造方法によれば、小さく均一な繊維径の繊維が絡み合った均質な細胞培養繊維体を有する細胞培養基材を製造することができる。また、所望の大きさ、及び形状の細胞培繊維体を基板上に有する細胞培養基材を製造することができる。従来のように細胞培養繊維体を基板の形状に合わせて切ったりする必要がなく、例えば、基板の形状に合わせて形成することができる。すなわち、非常に小さなカバースリップやウェル等の上にも細胞培養繊維体を形成することができ、また、大きな基板上に継ぎ目等をつくることなく形成することもできる。さらに、均一な厚さの細胞培養繊維体を基板上に同時に複数個形成したり、異なる大きさや形状の複数の細胞培養繊維体を基板上に同時に形成したりすることができる。
【００３７】
ここで、細胞培養基材の製造方法を詳細に説明する。
【００３８】
まず、キトサン類をトリフルオロ酢酸等の溶媒に溶解させて、適宜ろ過等を行うことでキトサン溶液を調製する。このとき、キトサン溶液には細胞の培養に好適な他の成分を溶解させてもよい。
【００３９】
次に、キトサン溶液をエレクトロスピニング法（静電紡糸法）により繊維化することで例えば、繊維径が５μｍ以下のキトサン繊維を得る。
【００４０】
次に、得られたキトサン繊維と水等の溶媒とをホモジナイズすることによりスラリー液を形成する。なお、ここでいうホモジナイズとは、凝集した状態のキトサン繊維をほぐしながら破砕して、キトサン繊維を均一化させながら溶媒中に分散させることをいう。この工程において、キトサン繊維は、エレクトロスピニングにより得られた繊維径を保持しつつ、微砕化及び均一化され、溶媒中に分散する。
【００４１】
そして、得られたスラリー液を基板上に塗布する。なお、ここでいう塗布とは、スプレーや刷け塗りによる塗布だけでなく、滴下による塗布等を含むものである。また、基板に塗布するスラリー液の量は、濃度等により適宜調整する。
【００４２】
最後に、スラリー液を加熱乾燥させることで、基板上に平板状の細胞培養繊維体が一体となって設けられた細胞培養基材が得られる。
【００４３】
上述した方法により得られる細胞培養繊維体は、基板との接着性が高いものであり、取り扱いが容易である。
【００４４】
本実施形態では、スラリー液を１つの基板上に塗布して細胞培養繊維体を形成したが、例えば、２４穴ウェルなどの底部にそれぞれ等量ずつスラリー液を滴下（塗布）することで、均一な厚さの細胞培養繊維体を同時に複数個形成することもできる。また、それぞれ異なる大きさや形状の基板に塗布して、異なる大きさや形状の細胞培養繊維体を同時に形成することもできる。なお、スラリー液の塗布方法は特に限定されないが、例えば２４穴ウェル等のように筒状の底部にスラリー液を塗布する場合は、滴下による塗布が好ましい。壁面にスラリー液が付着する虞がなく、それぞれの穴に等量ずつ塗布することができるからである。
【００４５】
本発明にかかる細胞培養基材の製造方法では、乾燥方法を選択することにより所望の形状の細胞培養繊維体とすることができる。具体的には、加熱乾燥することにより、平板状の比較的厚さの薄い細胞培養繊維体を有する細胞培養基材を製造でき、凍結乾燥することにより、３次元構造の比較的厚さの厚い細胞培養繊維体を有する細胞培養基材を製造することができる。
【００４６】
本発明の細胞培養基材の製造方法によれば、キトサン溶液をエレクトロスピニングすることで小さく均一な繊維径からなるキトサン繊維を得られ、得られたキトサン繊維と溶媒とをホモジナイズしたスラリー液を塗布して乾燥することにより均質な細胞培養繊維体を得ることができるため、細胞の接着性に優れ、且つ接着した細胞を安定して保持することができる細胞培養基材を製造することができる。
【００４７】
以下、本発明を実施例に基づいて説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４８】
（実施例１）
＜キトサン溶液の調製＞
脱アセチル化度９３％のキトサン（北海道曹達株式会社製）１．６ｇをトリフルオロ酢酸（和光純薬工業株式会社製）２０ｍｌに５０℃で１２時間かけて溶解し、塩化メチレン５ｍｌを加え、ガラスフィルター（３Ｇ型−２、フィルター径３０ｍｍ、ポアサイズ４０〜１００μｍ；日本理化学器械株式会社製）でろ過してキトサントリフルオロ酢酸液を得た。
【００４９】
＜キトサン繊維の製造＞
キトサントリフルオロ酢酸液を注射器（テルモシリンジＳＳ−３０ＥＳＺ；テルモ株式会社製）に入れて針（シェアフィールドＳＶセット２２Ｇ；テルモ株式会社製）につなぎ、インフュージョンポンプ（１１Ｐｌｕｓ；ＨＡＲＶＡＲＤ ＡＰＰＲＡＴＵＳ製）にセットした。インフュージョンポンプの送液速度を２ｍｌ／時間とし、アルミニウムからなる電極板（５．５ｃｍ×５．５ｃｍ）と針との間に高圧直流電圧電源（ＨＳＰ−３０ｋ−２；日本スタビライザー株式会社製）により２７ｋＶの電圧をかけて、１時間かけて針から電極板へキトサントリフルオロ酢酸液を噴出することで、電極板にキトサン繊維を得た。
【００５０】
電極板からはがしたキトサン繊維を２８重量％のアンモニア水（和光純薬工業株式会社製）に室温で１時間浸漬させた後、蒸留水を室温で２時間連続的に供給して洗浄することで、キトサン繊維を得た。
【００５１】
＜細胞培養基材の製造＞
キトサン繊維９２ｍｇに蒸留水を３００ｍｌ加え、ホモジナイザー（Ｔ．Ｋ．ＨＯＭＯ ＭＩＸＥＲ；ＴＯＫＵＳＹＵ ＫＩＫＡ ＫＯＧＹＯ社製）により８０００ｒｐｍで１０分間ホモジナイズし、スラリー液を得た。なお、スラリー液は、乾燥減量（第１４改正日本薬局方 乾燥減量試験法）の値から求めたキトサン濃度は約０．３ｍｇ／ｍｌであった。得られたスラリー液をポリスチレン製２４ウェル透明培養プレート（ＣＯＳＴＡＲ３５２４；ＣＯＲＮＩＮＧ社製）の全２４ウェルに１ｍｌずつ分注し、５０℃で１時間乾燥させることで、２４ウェル透明培養プレートの底部上に白色でシート状の繊維体が一体となって設けられた実施例１の細胞培養基材を得た。写真を図１に示す。
【００５２】
（実施例２）
実施例１と同様の方法により得たキトサン繊維２３９ｍｇに蒸留水を２００ｍｌ加え、ホモジナイザー（Ｔ．Ｋ．ＨＯＭＯ ＭＩＸＥＲ；ＴＯＫＵＳＹＵ ＫＩＫＡ ＫＯＧＹＯ社製）により８０００ｒｐｍで２５分間ホモジナイズし、スラリー液を得た。なお、スラリー液は、乾燥減量（第１４改正日本薬局方 乾燥減量試験法）の値から求めたキトサン濃度は約１．２ｍｇ／ｍｌであった。得られたスラリー液をポリスチレン製２４ウェル透明培養プレート（ＣＯＳＴＡＲ３５２４；ＣＯＲＮＩＮＧ社製）の全２４ウェルに１ｍｌずつ分注し、−２５℃の冷凍庫に１晩入れて凍結させた。これを凍結乾燥機ＦＤＵ−１１００（東京理化器械株式会社製）にて−１０℃で４８時間かけて凍結乾燥することで、２４ウェル透明培養プレートの底部上に白色で厚さ０．３ｃｍの繊維体が一体となって設けられた実施例２の細胞培養基材を得た。写真を図２に示す。
【００５３】
（実施例３）
実施例２と同様の方法により得たスラリー液を直径１３ｍｍの円形マイクロカバーグラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ製）の片側表面上に１枚当り０．１３ｍｌずつ滴下し、５０℃で１時間乾燥させることで、マイクロカバーグラスの片側表面上に白色でシート状の繊維体が一体となって設けられた実施例３の細胞培養基材を得た。写真を図３に示す。
【００５４】
（比較例１）
ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製；１０μｇ/ｍｌ水溶液）をカバースリップに塗布させて比較例１の細胞培養基材を得た。
【００５５】
（比較例２）
ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉ（ＢＤ社製；１０％水溶液）をカバースリップに塗布させて比較例２の細胞培養基材を得た。
【００５６】
（試験例１）
実施例１〜３の細胞培養基材の繊維体を顕微鏡により観察した。写真をそれぞれ図４〜６に示す。
【００５７】
繊維の繊維径はいずれも１μｍ程度であり、加熱乾燥により得られた実施例１の繊維体（図４）及び実施例３の繊維体（図６）は曲線状の繊維がややランダムに固定化されており、凍結乾燥により得られた実施例２の繊維体（図５）は曲線状の繊維が比較的均一に固定化されていた。
【００５８】
（試験例２）
実施例３及び比較例１〜２の細胞培養基材に成体マウスから得られた後根神経節を移植片培養し、５％牛胎仔血清加ＤＭＥＭ培養液、５％ＣＯ2条件下で７日間培養した。これらを４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ，ｍｅｔｈａｎｏｌで固定したのち、ニューロンのマーカーであるｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ １６０Ｋに対するマウスモノクロナル抗体（Ｓｉｇｍａ社製）とシュワン細胞のマーカーであるＳ１００に対するウサギ・ポリクロナル抗体（ＤＡＫＯ社製）を用いて蛍光二重免疫染色を施行した。２次抗体として、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧをそれぞれ用い、蛍光顕微鏡（オリンパス社製）で観察した。実施例３の細胞培養基材の結果を図７（ａ）〜（ｆ）に示す。抗ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ １６０Ｋ抗体を用いた蛍光染色の結果を図７（ａ）及び（ｄ）、抗Ｓ１００抗体を用いた蛍光染色の結果を図７（ｂ）及び（ｅ）、ＵＶ励起による結果を図７（ｃ）及び（ｆ）に示す。なお、図７（ｄ）〜（ｆ）は図７（ａ）〜（ｃ）をさらに拡大した写真である。
【００５９】
ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅを塗布した比較例１の細胞培養基材、及びｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉを塗布した比較例２の細胞培養基材には、基本的に後根神経節が接着せず、ごく少数接着したものもその接着性が極めて弱く、神経節からの神経突起伸張も非常に軽微であった。
【００６０】
一方、実施例３の細胞培養基材では、移植片の接着性が極めて強固であった。図７（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）に示すように、移植片に含まれるシュワン細胞の遊走、及び後根神経節ニューロンの突起伸長が非常に良好であり、比較例１及び２に比べて１０倍以上長い突起伸張を認めた。なお、図７（ｃ）及び（ｆ）に示すように、キトサンはＵＶ波長で自家蛍光を発し、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＦＩＴＣの蛍光２重免疫染色と組み合わせて３重蛍光による同一視野の観察が可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】実施例１の細胞培養基材の写真である。
【図２】実施例２の細胞培養基材の写真である。
【図３】実施例３の細胞培養基材の写真である。
【図４】実施例１の繊維体の拡大写真である。
【図５】実施例２の繊維体の拡大写真である。
【図６】実施例３の繊維体の拡大写真である。
【図７】試験例２における実施例３の細胞培養基材の蛍光顕微鏡写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を培養するための細胞培養繊維体、細胞培養基材、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養法は、医学、生物学の研究において最も汎用される方法の一つである。細胞培養法において用いられる細胞培養基材は、細胞を培養するのに好適なものであること、例えば、細胞が付着しやすい、細胞が増殖しやすいことが求められる。
【０００３】
そこで、例えば、少なくとも、微粒子と、親水性成分と、を含む微粒子含有親水性高分子ゲルからなることを特徴とする細胞培養基材が提案されている（特許文献１参照）。このような培養基材は、細胞の接着性がよく、簡便に回収できるものであるが、ゲル状であるため取り扱いにくく、また保存しにくいという問題がある。
【０００４】
また、酸性生体高分子と塩基性生体高分子との複合体を少なくともその表面に含む成形物よりなる軟骨細胞培養用の担体が提案されている（特許文献２参照）。しかしながら、特許文献２のような担体は、例えば、２４穴プレート等の非常に小さな基板上に置いて使用する場合、シートが非常に小さくなるために取り扱いにくいという問題があった。
【０００５】
また、細胞培養基材の製造方法としては、例えば、重量平均分子量１０万以上のポリ乳酸を、任意の割合で水に溶解しうる有機化合物を含有する溶媒に溶解する段階と、前記段階で製造された溶液を静電紡糸法にて紡糸する段階、および捕集基板に累積される繊維構造体を得る段階を含む細胞培養基材の製造方法が提案されている（特許文献３参照）。特許文献３の細胞培養基材の製造方法は、いわゆる静電紡糸法によるものであるが、均一な大きさ、及び厚さの繊維構造体を得にくいという問題があった。また、繊維体の大きさを自由に設定することができないという問題があった。
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−０２７５３２号公報（特許請求の範囲等）
【特許文献２】特開２００２−２９１４６１号公報（特許請求の範囲等）
【特許文献３】特開２００４−２９０１３３号公報（特許請求の範囲等）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はこのような事情に鑑み、細胞が接着及び増殖しやすく、取り扱いが容易な細胞培養繊維体、細胞培養基材、及び細胞培養基材の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決する本発明の第１の態様は、エレクトロスピニングにより形成されたキトサン繊維を溶媒に分散させ、これをホモジナイズしたスラリー液を乾燥させることにより得た繊維体からなることを特徴とする細胞培養繊維体にある。
【０００９】
かかる第１の態様では、キトサン繊維と溶媒とをホモジナイズしたスラリー液を乾燥させることにより得た繊維体からなることで、小さく均一な繊維径の繊維が絡み合った均質な細胞培養繊維体となり、細胞の接着性に優れ、且つ細胞が増殖しやすい細胞培養繊維体となる。また、取り扱いが容易であり、室温で保存することができる細胞培養繊維体となる。
【００１０】
本発明の第２の態様は、基板と、基板上に設けられた細胞培養繊維体とからなる細胞培養基材であって、前記細胞培養繊維体が、エレクトロスピニングにより形成されたキトサン繊維を溶媒に分散させ、これをホモジナイズしたスラリー液を前記基板に塗布して乾燥させることにより得られ、前記基板と一体となった繊維体からなることを特徴とする細胞培養基材にある。
【００１１】
かかる第２の態様では、スラリー液を基板に塗布して乾燥させることで、基板と一体で取り扱いが容易な細胞培養基材となる。小さく均一な繊維径の繊維が絡み合った均質な細胞培養繊維体を具備することで、細胞の接着性に優れ、且つ細胞が増殖しやすい細胞培養基材となる。また、室温で保存することができる細胞培養繊基材となる。
【００１２】
本発明の第３の態様は、第２の態様に記載の細胞培養基材において、前記細胞培養繊維体がメッシュ状であることを特徴とする細胞培養基材にある。
【００１３】
かかる第３の態様では、細胞培養繊維体がメッシュ状であることで、より細胞の接着性に優れ、且つ接着した細胞を安定して保持することができる細胞培養基材となる。
【００１４】
本発明の第４の態様は、第２又は３の態様に記載の細胞培養基材において、前記細胞培養繊維体が、繊維径が５μｍ以下の繊維からなることを特徴とする細胞培養基材にある。
【００１５】
かかる第４の態様では、繊維径が５μｍ以下の繊維からなることで、より細胞の接着性に優れ、且つ接着した細胞を安定して保持することができる細胞培養基材となる。
【００１６】
本発明の第５の態様は、基板と、基板上に設けられた細胞培養繊維体とからなる細胞培養基材の製造方法であって、キトサン類を含むキトサン溶液をエレクトロスピニングにより繊維化してキトサン繊維を形成する工程と、前記キトサン繊維と溶媒とをホモジナイズすることによりスラリー液を形成する工程と、前記スラリー液を前記基板に塗布して乾燥させることにより当該基板と一体となった繊維体を形成する工程とを具備することを特徴とする細胞培養基材の製造方法にある。
【００１７】
かかる第５の態様では、小さく均一な繊維径の繊維が絡み合った均質な細胞培養繊維体を有する細胞培養基材を製造することができる。これにより細胞の接着性に優れ、且つ細胞が増殖しやすい細胞培養基材を製造することができる。また、所望の大きさ、及び形状の細胞培養繊維体を有する細胞培養基材を製造することができる。さらに、例えば、均一な厚さの細胞培養繊維体を有する細胞培養基材を同時に製造することができる、又は異なる大きさや形状の細胞培養繊維体を有する細胞培養基材を同時に製造することができる。
【００１８】
本発明の第６の態様は、第５の態様に記載の細胞培養基材の製造方法において、前記乾燥が加熱乾燥であることを特徴とする細胞培養基材の製造方法にある。
【００１９】
かかる第６の態様では、加熱乾燥することにより、平板状の比較的厚さの薄い細胞培養繊維体を有する細胞培養基材を製造することができる。
【００２０】
本発明の第７の態様は、第５の態様に記載の細胞培養基材の製造方法において、前記乾燥が凍結乾燥であることを特徴とする細胞培養基材の製造方法にある。
【００２１】
かかる第７の態様では、凍結乾燥することにより、３次元構造の比較的厚みのある細胞培養繊維体を有する細胞培養基材を製造することができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、小さく均一な繊維径の繊維が絡み合った均質な細胞培養繊維体となる。また、細胞の接着性に優れ、且つ細胞が増殖しやすい細胞培養繊維体及び細胞培養基材となる。さらに、取り扱いが容易であり、室温で保存することができる細胞培養繊維体、及び細胞培養基材となる。
【００２３】
小さく均一な繊維径の繊維からなる均質な細胞培養繊維体を有する細胞培養基材を製造することができ、また、所望の大きさ、及び形状の細胞培養繊維体を有する細胞培養基材を製造することができる。さらに、均一な厚さの細胞培養基材を同時に製造することができる、又は異なる大きさや形状の細胞培養基材を同時に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明にかかる細胞培養繊維体は、エレクトロスピニングにより形成されたキトサン繊維と溶媒とをホモジナイズしたスラリー液を乾燥させることにより得た繊維体からなる。かかる細胞培養繊維体は、小さく均一な繊維径の繊維が絡み合った均質な繊維体である。ここでいう均質とは、厚さ方向及び平面方向に繊維が均一に存在している状態、すなわち繊維の密度が均一な状態のことを指す。このとき、繊維と繊維との隙間（開口）もほぼ均一な大きさで存在している。これは、キトサン繊維と溶媒とをホモジナイズしたスラリー液、すなわち均質化したスラリー液を乾燥させることにより実現されるものである。
【００２５】
本発明における細胞培養繊維体は、エレクトロスピニング（静電紡糸）により形成されたキトサン繊維を用いることで、非常に小さく均一な繊維径の繊維からなるものとすることができる。すなわち、本発明にかかる細胞培養繊維体は、エレクトロスピニング（静電紡糸）により得られる小さく均一な繊維径を保持した繊維からなる繊維体である。なお、繊維体は、繊維の繊維径が好ましくは５μｍ以下であり、さらに好ましくは０．０１〜３．０μｍ、特に好ましくは０．１〜１．０μｍである。細胞がひっかかる部分（繊維）や、繊維と繊維の間にできる細胞が入り込む開口が小さくなるため、細胞が付着しやすく、接着した細胞を安定して保持することができるものとなる。
【００２６】
また、本発明における細胞培養繊維体は、キトサン繊維と溶媒とをホモジナイズしたスラリー液を乾燥させることにより得たものであるので、上述したように均質なものとなる。ここで、ホモジナイズとは、凝集した状態のキトサン繊維をほぐしながら破砕して、キトサン繊維を均一化させながら溶媒中に分散させることをいう。これにより、エレクトロスピニングにより得られた繊維径を保持しつつ、ほぼ均一な長さからなるキトサン繊維が溶媒中に分散したスラリー液が得られる。このスラリー液を乾燥させることで、本発明の細胞培養基材は、ほぼ均一な長さの繊維が絡み合い、厚さ方向及び平面方向の繊維の密度がほぼ均一な状態、すなわち、均質なものとなる。このとき、繊維と繊維との間の開口はほぼ均一な大きさで存在するようになる。
【００２７】
本発明における細胞培養繊維体は、従来のエレクトロスピニングにより形成された細胞培養基材のように厚さ方向又は平面方向の繊維の密度が異なったり、繊維と繊維との間にできる開口の大きさが著しく異なったりする虞がない。このため、本発明の細胞培養繊維体、及び細胞培養基材は、付着した細胞を安定して保持しやすく、また付着した細胞が増殖しやすくなる。
【００２８】
また、本発明における細胞培養繊維体は、好ましくはメッシュ状である。メッシュ状とは、所望の開口を有する網目状のことである。本発明における繊維体は、ほぼ均一な長さの繊維が絡み合いながらメッシュ状となることで、繊維と繊維の間の開口から細胞が侵入しやすく、また繊維が絡んで網目状となっている部分に細胞がひっかかりやすいため、より細胞が付着しやすく、接着した細胞を安定して保持することができる。
【００２９】
本発明における細胞培養繊維体は、キトサン繊維を含むスラリー液から得るものである。ここでいうキトサン繊維は、キトサン類を主成分とする繊維である。すなわち、本発明における繊維体はキトサン類繊維からなるものである。このため、本発明の細胞培養繊維体は、細胞の接着性に優れ且つ細胞の増殖がしやすいものとなる。また、キトサン類繊維は蛍光化で細胞と区別できるため、本発明にかかる細胞培養繊維体は細胞の観察が容易である。
【００３０】
なお、キトサン類とは、キチン(β−ポリ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン)を脱アセチル化した生成物又はこの誘導体をいい、キトサン（β−ポリ−Ｄ−グルコサミン）及びその誘導体の他、未反応のキチン及びその誘導体を含有するものをいう。本発明で用いることができるキトサン類は、キチンの脱アセチル化度合、すなわち、キトサンの割合は特に限定されないが、５０％以上であることが好ましい。
【００３１】
本発明で用いるキトサン類の主成分は特に限定されず、例えば、キトサン、Ｎ−アリルキトサン、Ｎ−アルキルキトサン、ｏ−アリルキトサン、ｏ−アルキルキトサン、硫酸化キトサン、ニトロ化キトサン、カルボキシメチル化キトサン等が挙げられるが、キトサン、カルボキシメチル化キトサンが好ましい。
【００３２】
なお、繊維体は、キトサン類を含有するものであればよく、細胞の培養に好適な他の成分を含んでいてもよい。例えば、性能を最大限に発揮させるために必要に応じて、合成高分子や繊維の改質剤、生理活性物質（細胞接着活性因子、細胞増殖因子、繊維芽細胞成長因子、免疫活性因子、神経作用因子等）、血清成分、生物組織成分、界面活性剤等を加える。具体的には、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ乳酸、絹フィブロイン、プリテオグリカン、フィブロネクチン、ヴィトロネクチン、エンタネクチン、エラスチン、ラミニン、セレクチン、ガレクチン、レクチン（ＷＧＡ、コンカナバリンＡ等）、コラーゲン、ゼラチン、酵素（コラゲナーゼ、トリプシン、グルコシダーゼ、プロテインキナーゼ、ウロキナーゼ、ＳＯＤ等）、アルブミン、フィブリン、フィブリノーゲン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、細胞外マトリクスタンパク質、インテグリン、アミノ酸（グリシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン酸、スレオニン、システイン、ロイシン、メチオニン等）、ジペプチド、トリペプチド、ペプチドタンパク質（チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン配列、アルギニン−グルタミン酸−アスパラギン酸−バリン配列、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列を含む）、グリコサミノグリカン、ムチン型結合糖鎖、アスパラギン型結合糖鎖、オリゴ糖（トレハロース、キチンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、フルクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、シクロデキストリン等）、単糖（マンノース、Ｎ-アセチル−Ｄ−グルコサミン、グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、シアル酸、ムラミン酸、グルコース、ガラクトース、ラクトース、フコース、アラビノース等）、ガングリオシド、スフィンゴ脂質、糖脂質（アルキルグリコシド、ガラクトシルセラミド等）、ショ糖脂肪酸エステル、脂肪酸エステル（ＤＨＡ、ＥＰＡ等）、長鎖脂肪酸（アラキドン酸、リノール酸、レチノイン酸等）、グリセロール、多価アルコール、コレステロール、スクアレン、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエン、ステロイド、インシュリン、トランスフェリン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、チロキシン、トリヨードチロシン、β-メルカプトエタノール、アセチルコリン、酸類（乳酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、グルコン酸、グルコロン酸、パントテン酸、ピルビン酸等）、グリチルリチン、ルチン、ステビオシド、サポニン、アルブチン、ポリフェノール（カテキン）、ＳＯＤ様活性物質、インターフェロン、インターロイキン、サイトカイン、ケモカイン、ＴＮＦ-α、モノクローナル抗体、補体因子、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アデニン、牛胎仔血清、ビタミン類、無機塩類、シリコン、セラミック、アパタイト、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、エチレンジアミンテトラ酢酸等が挙げられる。
【００３３】
本発明にかかる細胞培養繊維体及び細胞培養基材は、室温で保存することができ、使用する際には、細胞の培養に適した水等の溶媒を滴下又は含浸させることにより直ちに使用することができる。
【００３４】
本発明にかかる細胞培養基材は、細胞培養繊維体と基板とが一体となっている。ここでいう「基板と一体」とは、基板と接着している状態を指すが、基板から取り外すこともできる状態である。かかる細胞培養繊維体は、水やバッファー等に通しても基板から剥がれてしまうことがない。なお、細胞培養繊維体は、所望の基板と一体となることができる。基板としては、例えば、非常に小さなカバースリップ、ウェル、減菌シャーレ、培養フラスコ等を挙げることができる。このとき、細胞培養繊維体は基板の形状や大きさ等に左右されることなく均質なものとなる。かかる細胞培養基材は、細胞培養繊維体と基板とが一体となっていることにより、細胞培養繊維体が取り扱いの際に変形してしまったり、基板に載せるのが困難であったりすることがない。また、細胞培養基材は、細胞培養繊維体と基板とが一体となった状態で、室温で保存することができ、非常に取り扱いが容易である。
【００３５】
本発明にかかる細胞培養基材は、上述したような構成により、従来、培養が困難とされていた肝臓細胞、脂肪細胞、血球系細胞の培養や、神経節移植片の培養をすることができるものである。勿論、線維芽細胞等の他の細胞も好適に培養することができる。また、増殖アッセイも容易にできるものである。
【００３６】
本発明にかかる細胞培養基材の製造方法は、キトサン類を含むキトサン溶液をエレクトロスピニングにより繊維化してキトサン繊維を形成する工程と、キトサン繊維と溶媒とをホモジナイズすることによりスラリー液を形成する工程と、スラリー液を基板に塗布して乾燥させることにより当該基板と一体となった繊維体を形成する工程とを具備するものである。この製造方法によれば、小さく均一な繊維径の繊維が絡み合った均質な細胞培養繊維体を有する細胞培養基材を製造することができる。また、所望の大きさ、及び形状の細胞培繊維体を基板上に有する細胞培養基材を製造することができる。従来のように細胞培養繊維体を基板の形状に合わせて切ったりする必要がなく、例えば、基板の形状に合わせて形成することができる。すなわち、非常に小さなカバースリップやウェル等の上にも細胞培養繊維体を形成することができ、また、大きな基板上に継ぎ目等をつくることなく形成することもできる。さらに、均一な厚さの細胞培養繊維体を基板上に同時に複数個形成したり、異なる大きさや形状の複数の細胞培養繊維体を基板上に同時に形成したりすることができる。
【００３７】
ここで、細胞培養基材の製造方法を詳細に説明する。
【００３８】
まず、キトサン類をトリフルオロ酢酸等の溶媒に溶解させて、適宜ろ過等を行うことでキトサン溶液を調製する。このとき、キトサン溶液には細胞の培養に好適な他の成分を溶解させてもよい。
【００３９】
次に、キトサン溶液をエレクトロスピニング法（静電紡糸法）により繊維化することで例えば、繊維径が５μｍ以下のキトサン繊維を得る。
【００４０】
次に、得られたキトサン繊維と水等の溶媒とをホモジナイズすることによりスラリー液を形成する。なお、ここでいうホモジナイズとは、凝集した状態のキトサン繊維をほぐしながら破砕して、キトサン繊維を均一化させながら溶媒中に分散させることをいう。この工程において、キトサン繊維は、エレクトロスピニングにより得られた繊維径を保持しつつ、微砕化及び均一化され、溶媒中に分散する。
【００４１】
そして、得られたスラリー液を基板上に塗布する。なお、ここでいう塗布とは、スプレーや刷け塗りによる塗布だけでなく、滴下による塗布等を含むものである。また、基板に塗布するスラリー液の量は、濃度等により適宜調整する。
【００４２】
最後に、スラリー液を加熱乾燥させることで、基板上に平板状の細胞培養繊維体が一体となって設けられた細胞培養基材が得られる。
【００４３】
上述した方法により得られる細胞培養繊維体は、基板との接着性が高いものであり、取り扱いが容易である。
【００４４】
本実施形態では、スラリー液を１つの基板上に塗布して細胞培養繊維体を形成したが、例えば、２４穴ウェルなどの底部にそれぞれ等量ずつスラリー液を滴下（塗布）することで、均一な厚さの細胞培養繊維体を同時に複数個形成することもできる。また、それぞれ異なる大きさや形状の基板に塗布して、異なる大きさや形状の細胞培養繊維体を同時に形成することもできる。なお、スラリー液の塗布方法は特に限定されないが、例えば２４穴ウェル等のように筒状の底部にスラリー液を塗布する場合は、滴下による塗布が好ましい。壁面にスラリー液が付着する虞がなく、それぞれの穴に等量ずつ塗布することができるからである。
【００４５】
本発明にかかる細胞培養基材の製造方法では、乾燥方法を選択することにより所望の形状の細胞培養繊維体とすることができる。具体的には、加熱乾燥することにより、平板状の比較的厚さの薄い細胞培養繊維体を有する細胞培養基材を製造でき、凍結乾燥することにより、３次元構造の比較的厚さの厚い細胞培養繊維体を有する細胞培養基材を製造することができる。
【００４６】
本発明の細胞培養基材の製造方法によれば、キトサン溶液をエレクトロスピニングすることで小さく均一な繊維径からなるキトサン繊維を得られ、得られたキトサン繊維と溶媒とをホモジナイズしたスラリー液を塗布して乾燥することにより均質な細胞培養繊維体を得ることができるため、細胞の接着性に優れ、且つ接着した細胞を安定して保持することができる細胞培養基材を製造することができる。
【００４７】
以下、本発明を実施例に基づいて説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４８】
（実施例１）
＜キトサン溶液の調製＞
脱アセチル化度９３％のキトサン（北海道曹達株式会社製）１．６ｇをトリフルオロ酢酸（和光純薬工業株式会社製）２０ｍｌに５０℃で１２時間かけて溶解し、塩化メチレン５ｍｌを加え、ガラスフィルター（３Ｇ型−２、フィルター径３０ｍｍ、ポアサイズ４０〜１００μｍ；日本理化学器械株式会社製）でろ過してキトサントリフルオロ酢酸液を得た。
【００４９】
＜キトサン繊維の製造＞
キトサントリフルオロ酢酸液を注射器（テルモシリンジＳＳ−３０ＥＳＺ；テルモ株式会社製）に入れて針（シェアフィールドＳＶセット２２Ｇ；テルモ株式会社製）につなぎ、インフュージョンポンプ（１１Ｐｌｕｓ；ＨＡＲＶＡＲＤ ＡＰＰＲＡＴＵＳ製）にセットした。インフュージョンポンプの送液速度を２ｍｌ／時間とし、アルミニウムからなる電極板（５．５ｃｍ×５．５ｃｍ）と針との間に高圧直流電圧電源（ＨＳＰ−３０ｋ−２；日本スタビライザー株式会社製）により２７ｋＶの電圧をかけて、１時間かけて針から電極板へキトサントリフルオロ酢酸液を噴出することで、電極板にキトサン繊維を得た。
【００５０】
電極板からはがしたキトサン繊維を２８重量％のアンモニア水（和光純薬工業株式会社製）に室温で１時間浸漬させた後、蒸留水を室温で２時間連続的に供給して洗浄することで、キトサン繊維を得た。
【００５１】
＜細胞培養基材の製造＞
キトサン繊維９２ｍｇに蒸留水を３００ｍｌ加え、ホモジナイザー（Ｔ．Ｋ．ＨＯＭＯ ＭＩＸＥＲ；ＴＯＫＵＳＹＵ ＫＩＫＡ ＫＯＧＹＯ社製）により８０００ｒｐｍで１０分間ホモジナイズし、スラリー液を得た。なお、スラリー液は、乾燥減量（第１４改正日本薬局方 乾燥減量試験法）の値から求めたキトサン濃度は約０．３ｍｇ／ｍｌであった。得られたスラリー液をポリスチレン製２４ウェル透明培養プレート（ＣＯＳＴＡＲ３５２４；ＣＯＲＮＩＮＧ社製）の全２４ウェルに１ｍｌずつ分注し、５０℃で１時間乾燥させることで、２４ウェル透明培養プレートの底部上に白色でシート状の繊維体が一体となって設けられた実施例１の細胞培養基材を得た。写真を図１に示す。
【００５２】
（実施例２）
実施例１と同様の方法により得たキトサン繊維２３９ｍｇに蒸留水を２００ｍｌ加え、ホモジナイザー（Ｔ．Ｋ．ＨＯＭＯ ＭＩＸＥＲ；ＴＯＫＵＳＹＵ ＫＩＫＡ ＫＯＧＹＯ社製）により８０００ｒｐｍで２５分間ホモジナイズし、スラリー液を得た。なお、スラリー液は、乾燥減量（第１４改正日本薬局方 乾燥減量試験法）の値から求めたキトサン濃度は約１．２ｍｇ／ｍｌであった。得られたスラリー液をポリスチレン製２４ウェル透明培養プレート（ＣＯＳＴＡＲ３５２４；ＣＯＲＮＩＮＧ社製）の全２４ウェルに１ｍｌずつ分注し、−２５℃の冷凍庫に１晩入れて凍結させた。これを凍結乾燥機ＦＤＵ−１１００（東京理化器械株式会社製）にて−１０℃で４８時間かけて凍結乾燥することで、２４ウェル透明培養プレートの底部上に白色で厚さ０．３ｃｍの繊維体が一体となって設けられた実施例２の細胞培養基材を得た。写真を図２に示す。
【００５３】
（実施例３）
実施例２と同様の方法により得たスラリー液を直径１３ｍｍの円形マイクロカバーグラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ製）の片側表面上に１枚当り０．１３ｍｌずつ滴下し、５０℃で１時間乾燥させることで、マイクロカバーグラスの片側表面上に白色でシート状の繊維体が一体となって設けられた実施例３の細胞培養基材を得た。写真を図３に示す。
【００５４】
（比較例１）
ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製；１０μｇ/ｍｌ水溶液）をカバースリップに塗布させて比較例１の細胞培養基材を得た。
【００５５】
（比較例２）
ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉ（ＢＤ社製；１０％水溶液）をカバースリップに塗布させて比較例２の細胞培養基材を得た。
【００５６】
（試験例１）
実施例１〜３の細胞培養基材の繊維体を顕微鏡により観察した。写真をそれぞれ図４〜６に示す。
【００５７】
繊維の繊維径はいずれも１μｍ程度であり、加熱乾燥により得られた実施例１の繊維体（図４）及び実施例３の繊維体（図６）は曲線状の繊維がややランダムに固定化されており、凍結乾燥により得られた実施例２の繊維体（図５）は曲線状の繊維が比較的均一に固定化されていた。
【００５８】
（試験例２）
実施例３及び比較例１〜２の細胞培養基材に成体マウスから得られた後根神経節を移植片培養し、５％牛胎仔血清加ＤＭＥＭ培養液、５％ＣＯ2条件下で７日間培養した。これらを４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ，ｍｅｔｈａｎｏｌで固定したのち、ニューロンのマーカーであるｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ １６０Ｋに対するマウスモノクロナル抗体（Ｓｉｇｍａ社製）とシュワン細胞のマーカーであるＳ１００に対するウサギ・ポリクロナル抗体（ＤＡＫＯ社製）を用いて蛍光二重免疫染色を施行した。２次抗体として、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧをそれぞれ用い、蛍光顕微鏡（オリンパス社製）で観察した。実施例３の細胞培養基材の結果を図７（ａ）〜（ｆ）に示す。抗ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ １６０Ｋ抗体を用いた蛍光染色の結果を図７（ａ）及び（ｄ）、抗Ｓ１００抗体を用いた蛍光染色の結果を図７（ｂ）及び（ｅ）、ＵＶ励起による結果を図７（ｃ）及び（ｆ）に示す。なお、図７（ｄ）〜（ｆ）は図７（ａ）〜（ｃ）をさらに拡大した写真である。
【００５９】
ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅを塗布した比較例１の細胞培養基材、及びｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉを塗布した比較例２の細胞培養基材には、基本的に後根神経節が接着せず、ごく少数接着したものもその接着性が極めて弱く、神経節からの神経突起伸張も非常に軽微であった。
【００６０】
一方、実施例３の細胞培養基材では、移植片の接着性が極めて強固であった。図７（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）に示すように、移植片に含まれるシュワン細胞の遊走、及び後根神経節ニューロンの突起伸長が非常に良好であり、比較例１及び２に比べて１０倍以上長い突起伸張を認めた。なお、図７（ｃ）及び（ｆ）に示すように、キトサンはＵＶ波長で自家蛍光を発し、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＦＩＴＣの蛍光２重免疫染色と組み合わせて３重蛍光による同一視野の観察が可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】実施例１の細胞培養基材の写真である。
【図２】実施例２の細胞培養基材の写真である。
【図３】実施例３の細胞培養基材の写真である。
【図４】実施例１の繊維体の拡大写真である。
【図５】実施例２の繊維体の拡大写真である。
【図６】実施例３の繊維体の拡大写真である。
【図７】試験例２における実施例３の細胞培養基材の蛍光顕微鏡写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エレクトロスピニングにより形成されたキトサン繊維を溶媒に分散させ、これをホモジナイズしたスラリー液を乾燥させることにより得た繊維体からなることを特徴とする細胞培養繊維体。
【請求項２】
基板と、基板上に設けられた細胞培養繊維体とからなる細胞培養基材であって、前記細胞培養繊維体が、エレクトロスピニングにより形成されたキトサン繊維を溶媒に分散させ、これをホモジナイズしたスラリー液を前記基板に塗布して乾燥させることにより得られ、前記基板と一体となった繊維体からなることを特徴とする細胞培養基材。
【請求項３】
請求項２に記載の細胞培養基材において、前記細胞培養繊維体がメッシュ状であることを特徴とする細胞培養基材。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の細胞培養基材において、前記細胞培養繊維体が、繊維径が５μｍ以下の繊維からなることを特徴とする細胞培養基材。
【請求項５】
基板と、基板上に設けられた細胞培養繊維体とからなる細胞培養基材の製造方法であって、キトサン類を含むキトサン溶液をエレクトロスピニングにより繊維化してキトサン繊維を形成する工程と、前記キトサン繊維と溶媒とをホモジナイズすることによりスラリー液を形成する工程と、前記スラリー液を前記基板に塗布して乾燥させることにより当該基板と一体となった繊維体を形成する工程とを具備することを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の細胞培養基材の製造方法において、前記乾燥が加熱乾燥であることを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
【請求項７】
請求項５に記載の細胞培養基材の製造方法において、前記乾燥が凍結乾燥であることを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
【請求項１】
エレクトロスピニングにより形成されたキトサン繊維を溶媒に分散させ、これをホモジナイズしたスラリー液を乾燥させることにより得た繊維体からなることを特徴とする細胞培養繊維体。
【請求項２】
基板と、基板上に設けられた細胞培養繊維体とからなる細胞培養基材であって、前記細胞培養繊維体が、エレクトロスピニングにより形成されたキトサン繊維を溶媒に分散させ、これをホモジナイズしたスラリー液を前記基板に塗布して乾燥させることにより得られ、前記基板と一体となった繊維体からなることを特徴とする細胞培養基材。
【請求項３】
請求項２に記載の細胞培養基材において、前記細胞培養繊維体がメッシュ状であることを特徴とする細胞培養基材。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の細胞培養基材において、前記細胞培養繊維体が、繊維径が５μｍ以下の繊維からなることを特徴とする細胞培養基材。
【請求項５】
基板と、基板上に設けられた細胞培養繊維体とからなる細胞培養基材の製造方法であって、キトサン類を含むキトサン溶液をエレクトロスピニングにより繊維化してキトサン繊維を形成する工程と、前記キトサン繊維と溶媒とをホモジナイズすることによりスラリー液を形成する工程と、前記スラリー液を前記基板に塗布して乾燥させることにより当該基板と一体となった繊維体を形成する工程とを具備することを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の細胞培養基材の製造方法において、前記乾燥が加熱乾燥であることを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
【請求項７】
請求項５に記載の細胞培養基材の製造方法において、前記乾燥が凍結乾燥であることを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００８−１１３５８０（Ｐ２００８−１１３５８０Ａ）
【公開日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２９８２３０（Ｐ２００６−２９８２３０）
【出願日】平成１８年１１月１日（２００６．１１．１）
【出願人】（３９００２１３９３）北海道曹達株式会社 (7)
【出願人】（５９１０６３３９４）財団法人 東京都医学研究機構 (69)
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月１日（２００６．１１．１）
【出願人】（３９００２１３９３）北海道曹達株式会社 (7)
【出願人】（５９１０６３３９４）財団法人 東京都医学研究機構 (69)
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]