細胞培養基質及びその製造方法
【課題】 複数種のペプチドを任意にコントロールした導入量で基質表面に固相化することを可能にし、またペプチド種の組み合わせによって細胞の接着・増殖・分化などをコントロールできるようにした、新規な細胞培養基質及びその製造方法を提供すること。
【解決手段】 疎水結合性吸着ポリマーに単一種のペプチドを導入したペプチド導入ポリマーを複数種細胞培養基質表面にコーティングする工程を有することを特徴とする細胞培養基質の製造方法であり、好ましくは疎水結合性吸着ポリマーが、分子内に疎水性を有する直鎖状炭素骨格とペプチドと反応しうる官能基とを有するものである細胞培養基質の製造方法。
【解決手段】 疎水結合性吸着ポリマーに単一種のペプチドを導入したペプチド導入ポリマーを複数種細胞培養基質表面にコーティングする工程を有することを特徴とする細胞培養基質の製造方法であり、好ましくは疎水結合性吸着ポリマーが、分子内に疎水性を有する直鎖状炭素骨格とペプチドと反応しうる官能基とを有するものである細胞培養基質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞培養に関する技術であり、さらに詳しくは、細胞培養基質及びその製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
通常の細胞培養の方法は均一な培養面を持つ培養基質を用いて行われる。具体的には、ガラスやポリスチレンなどの透明な材料を一定の形状に成型した容器を用いる。細胞の接着性を高めるため、ポリスチレンなど疎水性の材料については表面を親水化するなどの表面改質を施したものが用いられる。また塩基性の高分子（ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリリジン等）や細胞接着性蛋白質（フィブロネクチン、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン等）を表面にコートすることによって、より接着性を高める方法も多く用いられている。
【０００３】
上述のコラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、ラミニン等の蛋白質をコートした細胞培養基質は既に市販されており（例えば特許文献１参照）、それらの中にマトリゲル（Matrigel；Becton Dickinson社の登録商標）をコートしたものがある。マトリゲルは、Engelbreth-Holm-Swarm腫瘍マトリックスから抽出された基底膜調製物であり（例えば非特許文献１参照）、細胞外基質合成に影響を及ぼす可能性のある種々のサイトカインの他に、ラミニン−１、IV型コラーゲン、エンタクチン（ナイドジェン）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカン）などの蛋白質が混合物として含まれている。これらが細胞の機能維持に効力を発揮していると考えられているが、未確認の成分が存在するので、細胞を用いた再生医療等の用途においては、安全性や品質管理の面で問題があり、その使用は難しい。
【０００４】
一方、細胞接着に関するペプチドはすでに多くの種類が知られており、それらを培養基質に固相化したものについて、文献等が多数報告されている。例えば、フィブロネクチン蛋白質の細胞接着に関わる領域のペプチドであるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）アミノ酸配列は化学的に合成され、それを基質表面に化学結合で固相化した例が報告されている（例えば非特許文献２参照）。しかし、異なる複数種のペプチドをマトリゲルのように混合物として基質表面に固相化させようとした場合、反応性の関係上、その個々の導入量をコントロールすることは難しいという欠点があった。
【０００５】
【特許文献１】特開平６−９８７５７号公報
【非特許文献１】Biochemistry 21, 6188-6193, 1982
【非特許文献２】Nature 309, 30-33, 1984
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、背景技術の項で述べたように、化学結合法では難しかった、複数種のペプチドを任意にコントロールした導入量で基質表面に固相化することを可能にし、またペプチド種の組み合わせによって細胞の接着・増殖・分化などをコントロールできるようにした、新規な細胞培養基質及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち本発明は、（１）疎水結合性吸着ポリマーに単一種のペプチドを導入したペプチド導入ポリマーを複数種細胞培養基質表面にコーティングする工程を有することを特徴とする細胞培養基質の製造方法や、（２）ペプチドがフィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、シンデカン、カドヘリン、及びセレクチンから選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞接着に関わるペプチド領域からなる（１）記載の細胞培養基質の製造方法や、（３）ペプチドが上皮増殖因子、形質転換増殖因子、線維芽細胞増殖因子、インシュリン様増殖因子、及びインシュリンから選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞増殖に関わるペプチド領域からなることを特徴とする（１）又は（２）記載の細胞培養基質の製造方法や、（４）ペプチドがラミニン、上皮増殖因子、形質転換増殖因子、及び線維芽細胞増殖因子から選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞分化に関わるペプチド領域からなることを特徴とする（１）〜（３）いずれか記載の細胞培養基質の製造方法や、（５）疎水結合性吸着ポリマーが、分子内に疎水性を有する直鎖状炭素骨格とペプチドと反応しうる官能基とを有するものであることを特徴とする（１）〜（４）いずれか記載の細胞培養基質の製造方法や、（６）（１）〜（５）記載のいずれかの製造方法で作られることを特徴とする細胞培養基質に関する。
【０００８】
また、本発明は、（７）疎水結合性吸着ポリマーに、細胞接着に関わるペプチド、細胞増殖に関わるペプチド、細胞分化に関わるペプチドからなる群より選ばれるペプチドを導入したことを特徴とするペプチド導入ポリマーや、（８）単一種のペプチドを導入したことを特徴とする（７）記載のペプチド導入ポリマーや、（９）細胞接着に関わるペプチドが、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、シンデカン、カドヘリン、及びセレクチンから選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞接着に関わるペプチド領域からなることを特徴とする（７）又は（８）記載のペプチド導入ポリマーや、（１０）細胞増殖に関わるペプチドが、上皮増殖因子、形質転換増殖因子、線維芽細胞増殖因子、インシュリン様増殖因子、及びインシュリンから選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞増殖に関わるペプチド領域からなるからなることを特徴とする（７）〜（９）のいずれか記載のペプチド導入ポリマーや、（１１）細胞分化に関わるペプチドが、ラミニン、上皮増殖因子、形質転換増殖因子、及び線維芽細胞増殖因子から選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞分化に関わるペプチド領域からなるからなることを特徴とする（７）〜（１０）のいずれか記載のペプチド導入ポリマーや、（１２）疎水結合性吸着ポリマーが、分子内に疎水性を有する直鎖状炭素骨格とペプチドと反応しうる官能基とを有するものである（７）〜（１１）いずれか記載のペプチド導入ポリマーに関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の細胞培養基質及びその製造方法によれば、複数種のペプチドの導入量を任意にコントロールでき、マトリゲルのようにさまざまな機能分子の混合物を正体のわかっている人工物で作ることができるため、細胞の状態をin vitroでより生体に近い形で制御でき、細胞の接着・増殖・分化などのための優れた培養基質として利用ができ、ひいては感染等の規制が厳しくなるであろうと予想される再生医療等の分野で使用されることが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の細胞培養基質の製造方法としては、疎水結合性吸着ポリマーに単一種のペプチドを導入したペプチド導入ポリマーを複数種細胞培養基質表面にコーティングする工程を有する方法であれば特に制限されず、また、本発明の細胞培養基質としては、上記本発明の細胞培養基質の製造方法により得られるものであれば特に制限されず、さらに、本発明のペプチド導入ポリマーとしては、疎水結合性吸着ポリマーに、細胞接着に関わるペプチド、細胞増殖に関わるペプチド、細胞分化に関わるペプチドからなる群より選ばれるペプチドが導入されているポリマーであれば特に制限されない。上記本発明の細胞培養基質の製造方法において使用するペプチドとしては特に規定されるものではないが、細胞接着・増殖・分化など、細胞の機能に関わるものを用いるのが好ましい。
【００１１】
また、上記本発明のペプチド導入ポリマーとしては、２種類以上のペプチドを導入したものよりも、単一種のペプチドを導入したものが導入ペプチドの導入量の制御等の点で好ましく、単一種のペプチドを導入したペプチド導入ポリマーを、例えば混合することにより複数種用いることにより、細胞種等に応じて所望の細胞培養基質を簡便に作製することができる。
【００１２】
細胞接着に関わるペプチドとしては、細胞接着蛋白質のアミノ酸配列の中で、細胞接着に関わる領域のペプチドであればいずれでも用いることができ、細胞接着蛋白質としては、具体的にはフィブロネクチン（ＦＮ）、コラーゲン（Ｃｏｌ）、ラミニン（ＬＮ）、ビトロネクチン（ＶＮ）等が挙げられる。これらペプチドの長さとしては、３〜２０個、好ましくは６〜１５個のアミノ酸残基であり、これらペプチドは、通常のペプチド合成法により入手可能である。
【００１３】
具体例として、フィブロネクチンの細胞結合ドメインにあるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含むペプチドであるＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ（ＧＲＧＤＳＰ）等が挙げられる。
【００１４】
また、上皮細胞、血管内皮細胞、筋肉細胞、神経細胞（ニューロン）等の機能発現に特に重要と考えられているラミニンの細胞接着に関わる領域のペプチドとしては、α鎖のＧ領域（Ｇ−ｄｏｍａｉｎ）ペプチドが好ましく、例えば、マウスのＬＮ由来である、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ（ＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ；ＡＧ７３）、Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ（ＡＧ７３Ｔ）、Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ（ＡＧ７６．８）、Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ（ＡＧ７６．８Ｘ）、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ（ＡＧ８１．２）、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ（ＡＧ８１．２Ｘ）、Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ（Ａ２Ｇ７３）、Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ（Ａ３Ｇ７２）、Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ（Ａ４Ｇ７３）、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ（Ａ４Ｇ７８）、Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ（Ａ４Ｇ８２）、Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ（Ａ４Ｇ８２Ｘ）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ（Ａ５Ｇ７１）、Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（Ａ５Ｇ７３）、Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（Ａ５Ｇ７３Ｘ）、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ（Ａ５Ｇ７７）またはＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ａ５Ｇ７７ｆ）等が、また、ヒトＬＮ由来の、Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（ｈＡ３Ｇ７５）またはＧｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（ｈＡ３Ｇ８３）等が例示される。
【００１５】
細胞増殖蛋白質としては、具体的には上皮増殖因子（Epidermal Growth Factor；ＥＧＦ）、形質転換増殖因子（Transforming Growth Factor；ＴＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（Fibroblast Growth Factor；ＦＧＦ）、インシュリン様増殖因子（Insulin-like Growth Factor；ＩＧＦ）、またはインシュリン等が挙げられ、これらの蛋白質に含まれる細胞増殖に関わるペプチドとして、例えばＩＧＦに含まれるＧｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ（ＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ）等が挙げられる。
【００１６】
細胞分化蛋白質としては、具体的にはラミニン、上皮増殖因子、形質転換増殖因子、または線維芽細胞増殖因子等が挙げられ、これらの蛋白質に含まれる細胞分化に関わるペプチドとして、例えばＥＧＦに含まれるＣｙｓ（Ａｃｍ）−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）（Ｃ（Ａｃｍ）ＭＨＩＥＳＬＤＳＹＴＣ（Ａｃｍ））等が挙げられる。
【００１７】
本発明に使用するペプチドを導入させるポリマーは、細胞培養表面基質に吸着することができる疎水結合性吸着ポリマーであって、分子内に疎水性を有する直鎖状炭素骨格とペプチドと反応しうる官能基とを有するものが好ましい。特に分子内にポリアルキレン鎖あるいは直鎖アミノ酸ポリマー（ポリグリシン、ポリアラニン、ポリバリン、ポリロイシン、ポリフェニルアラニン等）やその誘導体などの疎水性の直鎖状骨格を持つ疎水結合性吸着ポリマーで、該疎水性の直鎖状骨格に直接、あるいはスペーサーを介してペプチドと反応できる反応性の官能基（反応基）とを有する疎水結合性吸着ポリマーを好適に用いることができる。代表例として、無水マレイン酸とスチレンとの交互共重合体（以下、ＭＡＳＴ（maleic anhydride / styrene copolymer）と呼ぶ）や、無水マレイン酸とメチルビニルエーテルとの交互共重合体（以下、ＭＭＡＣ（methyl vinyl ether / maleic anhydride copolymer）と呼ぶ）を挙げることができる。
【００１８】
また、ポリマーに化学処理を施してペプチドと反応しうる官能基を導入したものも使用することができる。例えば、ポリスチレン樹脂を酸素プラズマ処理することによりカルボキシル基を導入したもの、アンモニアプラズマ処理することによりアミノ基を導入したものなどが利用できる。
【００１９】
上記のペプチドの疎水結合性吸着ポリマーへの導入は、ポリマー鎖のペプチドと反応しうる官能基と該ペプチドとを、カップリング剤を用いて反応し化学結合させる。具体的には、ポリマー鎖に導入したカルボキシル基またはアミノ基と、ペプチドに含まれるアミノ基またはカルボキシル基との、水溶性カルボジイミドを用いた縮合結合、あるいはグルタルアルデヒドなどの二官能性架橋剤による架橋反応が挙げられる。
【００２０】
細胞培養基質の基材としては、例えば、プラスチック、合成ゴム、無機物および金属等を使用した細胞培養基質が挙げられるが、特に成型性に優れているプラスチックが好ましい。
【００２１】
プラスチックとしては、熱可塑性樹脂または熱硬化性樹脂のいずれの樹脂も使用することができ、熱可塑性樹脂としては、例えば、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリメチルペンテン樹脂、フッ素樹脂またはポリカーボネート等が、熱硬化性樹脂としては、例えば、フェノール樹脂、尿素樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂またはシリコン樹脂等が例示されるが、特に透明性の高さからポリスチレン樹脂が好ましい。また、自己蛍光の低さからフッ素樹脂も好適に用いることができる。
【００２２】
合成ゴムとしては、例えば、ブタジエンスチレンゴム、ブタジエンアクリロニトリルゴム、ブチルゴム、多硫化系合成ゴム、フッ素ゴムまたはシリコンゴム等が例示される。
【００２３】
無機物としては、ガラス、ヒドロキシアパタイト、シリコン等のＩＣ基材またはカーボンナノチューブ等が例示される。
【００２４】
金属としては、不活性（inert）な金、白金、チタンあるいはこれらの酸化物等が例示される。
【００２５】
単一のペプチド導入ポリマーを複数種コーティングする方法としては、複数種のペプチド導入ポリマーを溶液状態で混合させた後、基質にコーティングする方法と、１種類ずつのペプチド導入ポリマー溶液を順次コーティングする方法とがあり、どちらの方法も利用できる。いずれの方法とも、用いるペプチド導入ポリマー溶液の割合については、使用する実験系に応じて任意の割合でよい。例えば、単純に２種類の溶液を１：１で混合させてもよいし、用いる組織の細胞外マトリックスの組成比に合わせて混合することも可能である。
【００２６】
ペプチド導入ポリマーを基質にコーティングする方法としては、溶液を基質に分注し、一定時間静置後溶液を回収する方法と、分注した溶液をそのまま蒸発・乾固させる方法とがあり、どちらの方法も利用できる。前者に関しては、コーティング時間としては５分〜２４時間静置した後溶液を回収し、水で洗浄して乾燥させ保存する、あるいはそのまま乾燥・保存して使用直前に水、リン酸緩衝液または培地で洗浄して直ちに使用する。後者に関しては、溶媒が蒸発するまで静置しておくことになる。蒸発までの時間は溶媒の種類によって異なるが、おおむね１〜４８時間である。乾燥後は、水で洗浄した後再び乾燥させ保存する、あるいはそのまま保存して使用直前に水、リン酸緩衝液または培地で洗浄して直ちに使用する。
【００２７】
ペプチド導入ポリマーの濃度としては、１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、特に５〜５０μｇ／ｍｌが好ましい。コーティング溶液の分注量は、コーティング面の面積に依存するが、例えば３５φのシャーレであれば、０．２５〜２ｍｌ、特に０．５〜１ｍｌが好ましい。
【００２８】
コーティングに用いる溶媒としては、上記のペプチド導入ポリマーを溶かし、かつコートする基質を侵さないものである必要がある。例えば、細胞培養基質としてプラスチックを用い、ＭＡＳＴを塗布する場合は、極性溶媒でプラスチック表面を侵さないエタノールを用いるのが良い。その組成としては、エタノールと純水の混合溶媒が好適で、エタノールは任意の割合で用いることができるが、エタノール：純水＝１：１程度の割合が好ましい。
【００２９】
滅菌に関しては、細胞培養基質という性質上行わなければならないが、その方法は、無菌的な環境で、溶液をろ過滅菌した後コーティングを行う無菌生産の方法と、有菌的にコーティングを行った後、γ線、電子線等の放射線により滅菌処理を行う方法のいずれも用いることが可能である。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
疎水結合性吸収ポリマーである無水マレイン酸とスチレンの共重合体であるＭＡＳＴ２００ｍｇを１ＮのＮａＯＨ水溶液を少量づつ添加し、完全に溶解させた。これに、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ：1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimed, hydroch
loride）５０mgを加え２時間室温で反応させた後、ＧＲＧＤＳＰペプチド２０ｍｇを加えて、室温で２時間攪拌反応させた。反応終了後、水に透析してアルカリと低分子物質を除き、反応性生物を凍結乾燥しＭＡＳＴ−ＧＲＧＤＳＰを調製した。
【００３１】
さらに、ＭＡＳＴ２００ｍｇを１ＮのＮａＯＨ水溶液を少量づつ添加し、完全に溶解させた。これに、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）５０ｍｇを加え２時間室温で反応させた後、ＡＧ７３ペプチド２０ｍｇを加えて、室温で２時間攪拌反応させ、上記同様に透析、凍結乾燥しＭＡＳＴ−ＡＧ７３を調製した。
【００３２】
これ以降のすべての操作は無菌操作を前提とする。遠沈管に１０μｇ／ｍＬでＭＡＳＴ−ＧＲＧＤＳＰを水−エタノール溶媒（体積比１：１）に溶かした溶液と、１０μｇ／ｍＬでＭＡＳＴ−ＡＧ７３を水−エタノール溶媒（同１：１）に溶かした溶液を用意し、一方を他方の溶液に加えよく混合させた（混合比１：１）。次に、３５φシャーレ成型品（住友ベークライト(株)製）にこの混合溶液を１ｍＬ分注し、溶媒が蒸発するまで静置した。その後、シャーレに純水３ｍＬを加えて洗浄した後、容器を室温で乾燥させた。
【００３３】
（比較例１）
１０μｇ／ｍＬのＭＡＳＴ−ＧＲＧＤＳＰ溶液のみを実施例１と同様な方法でシャーレにコートしたものを作製した。
【００３４】
フラスコで培養したＰＣ−１２細胞（ラット副腎髄質褐色細胞腫由来）を０．２５％トリプシン溶液で剥がし、回収した細胞を無血清のＤＭＥＭ培養液（Ｇｉｂｃｏ、１１８８５−０８４）に分散し、遠心分離により細胞を分離、これを３回繰り返して無血清のＤＭＥＭで再分散した。細胞分散液を無血清のＤＭＥＭで２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、上記のコートしたシャーレに１ｍＬ加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２日間培養を行った。
【００３５】
顕微鏡下で培養状態を観察したところ、実施例１では細胞播種後１時間、４時間の時点で多くのＰＣ−１２細胞が接着・伸展をしており、播種後２４時間でも細胞は形態を維持していたが、比較例１では細胞播種後１時間、４時間で接着はしているものの伸展はせず、播種後２４時間では死んで浮いている細胞が多く見られた。これにより、細胞接着における、複数種のペプチド導入ポリマーを細胞培養基質にコートすることの効果が確認された。
【００３６】
（実施例２）
すべての操作は実施例１に準じて行った。実施例１同様に、ＭＡＳＴ２００ｍｇを１ＮのＮａＯＨ水溶液を用いて、完全に溶解させた。これに、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）５０ｍｇを加え２時間室温で反応させた後、Ａ５Ｇ７３Ｘペプチド２０ｍｇを加えて、室温で２時間攪拌反応させ、上記同様に透析、凍結乾燥しＭＡＳＴ−Ａ５Ｇ７３Ｘを調製した。
【００３７】
遠沈管に１０μｇ／ｍＬでＭＡＳＴ−ＧＲＧＤＳＰを水−エタノール溶媒（体積比１：１）に溶かした溶液と、１０μｇ／ｍＬでＭＡＳＴ−Ａ５Ｇ７３Xを水−エタノール溶媒（同１：１）に溶かした溶液を用意し、一方を他方の溶液に加えよく混合させた（混合比１：１）。次に、３５φシャーレ成型品（住友ベークライト(株)製）にこの混合溶液を１ｍＬ分注し、溶媒が蒸発するまで静置した。その後、シャーレに純水３ｍＬを加えて洗浄した後、容器を室温で乾燥させた。
【００３８】
（比較例２）
１０μｇ／ｍＬのＭＡＳＴ−ＧＲＧＤＳＰ溶液のみ、または１０μｇ／ｍＬでＭＡＳＴ−Ａ５Ｇ７３X溶液のみを実施例２と同様な方法でシャーレにコートしたものを作製した。
【００３９】
フラスコで培養したＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌細胞由来）を０．２５％トリプシン溶液で剥がし、回収した細胞を無血清のＤＭＥＭ培養液（Ｇｉｂｃｏ、１１８８５−０８４）に分散し、遠心分離により細胞を分離、これを３回繰り返して無血清のＤＭＥＭで再分散した。細胞分散液を無血清のＤＭＥＭで５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、上記のコートしたシャーレに１ｍＬ加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２日間培養を行った。
【００４０】
顕微鏡下で培養状態を観察したところ、実施例２では細胞播種後４時間の時点で多くのＨｅｐＧ２細胞が接着・伸展をしており、播種後２４時間でも細胞は形態を維持していたが、比較例２では細胞播種後４時間で接着はしているものの伸展はせず、播種後２４時間でも伸展している細胞数が少なかった。これにより、細胞接着における、複数種のペプチド導入ポリマーを細胞培養基質にコートすることの効果が確認された。
【００４１】
（実施例３）
すべての操作は実施例１に準じて行った。実施例１同様に、ＭＡＳＴ２００ｍｇを１ＮのＮａＯＨ水溶液を用いて、完全に溶解させた。これに、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）５０ｍｇを加え２時間室温で反応させた後、Ａ４Ｇ８２Ｘペプチド２０ｍｇを加えて、室温で２時間攪拌反応させ、上記同様に透析、凍結乾燥しＭＡＳＴ−Ａ４Ｇ８２Ｘを調製した。
【００４２】
遠沈管に１０μｇ／ｍＬでＭＡＳＴ−Ａ４Ｇ８２Ｘを水−エタノール溶媒（体積比１：１）に溶かした溶液と、１０μｇ／ｍＬでＭＡＳＴ−Ａ５Ｇ７３Ｘを水−エタノール溶媒（同１：１）に溶かした溶液を用意し、一方を他方の溶液に加えよく混合させた（混合比１：１）。次に、３５φシャーレ成型品（住友ベークライト(株)製）にこの混合溶液を１ｍＬ分注し、溶媒が蒸発するまで静置した。その後、シャーレに純水３ｍＬを加えて洗浄した後、容器を室温で乾燥させた。
【００４３】
（比較例３）
比較例として１０μｇ／ｍＬのＭＡＳＴ−Ａ４Ｇ８２溶液、またはＭＡＳＴ−Ａ５Ｇ７３Ｘのみを実施例と同様な方法でシャーレにコートしたものを作成した。
【００４４】
フラスコで培養した正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、クラボウ製、ＫＥ−４１０１）を０．２５％トリプシン溶液で剥がし、回収した細胞を血管内非細胞増殖用培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２、クラボウ製、ＫＥ−２１５０Ｓ）に分散し、遠心分離により細胞を分離、さらに血管内非細胞増殖用培地からウシ胎児血清（ＦＢＳ）を抜いたものに細胞を分散させ遠心分離し血清成分を除去する操作を３回繰り返して、最終的に無血清の血管内非細胞増殖用培地で再分散した。細胞数を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、上記のコートしたシャーレに１ｍＬ加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２日間培養を行った。
【００４５】
顕微鏡下で培養状態を観察したところ、実施例では細胞播種後１時間、４時間の時点で多くの正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞細胞が接着・伸展をしており、播種後２４時間でも細胞は形態を維持していた。これに対し比較例では細胞播種後１時間、４時間で接着はしているもの伸展は見られたが細胞が十分伸展しておらず小さいサイズのままであった。さらに播種後２４時間では細胞の状態に変化は見られずむしろ死んでシャーレより剥がれ浮いている細胞が多く見られた。これにより、細胞接着における、複数種のペプチド導入ポリマーを細胞培養基質にコートすることの効果が確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞培養に関する技術であり、さらに詳しくは、細胞培養基質及びその製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
通常の細胞培養の方法は均一な培養面を持つ培養基質を用いて行われる。具体的には、ガラスやポリスチレンなどの透明な材料を一定の形状に成型した容器を用いる。細胞の接着性を高めるため、ポリスチレンなど疎水性の材料については表面を親水化するなどの表面改質を施したものが用いられる。また塩基性の高分子（ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリリジン等）や細胞接着性蛋白質（フィブロネクチン、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン等）を表面にコートすることによって、より接着性を高める方法も多く用いられている。
【０００３】
上述のコラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、ラミニン等の蛋白質をコートした細胞培養基質は既に市販されており（例えば特許文献１参照）、それらの中にマトリゲル（Matrigel；Becton Dickinson社の登録商標）をコートしたものがある。マトリゲルは、Engelbreth-Holm-Swarm腫瘍マトリックスから抽出された基底膜調製物であり（例えば非特許文献１参照）、細胞外基質合成に影響を及ぼす可能性のある種々のサイトカインの他に、ラミニン−１、IV型コラーゲン、エンタクチン（ナイドジェン）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカン）などの蛋白質が混合物として含まれている。これらが細胞の機能維持に効力を発揮していると考えられているが、未確認の成分が存在するので、細胞を用いた再生医療等の用途においては、安全性や品質管理の面で問題があり、その使用は難しい。
【０００４】
一方、細胞接着に関するペプチドはすでに多くの種類が知られており、それらを培養基質に固相化したものについて、文献等が多数報告されている。例えば、フィブロネクチン蛋白質の細胞接着に関わる領域のペプチドであるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）アミノ酸配列は化学的に合成され、それを基質表面に化学結合で固相化した例が報告されている（例えば非特許文献２参照）。しかし、異なる複数種のペプチドをマトリゲルのように混合物として基質表面に固相化させようとした場合、反応性の関係上、その個々の導入量をコントロールすることは難しいという欠点があった。
【０００５】
【特許文献１】特開平６−９８７５７号公報
【非特許文献１】Biochemistry 21, 6188-6193, 1982
【非特許文献２】Nature 309, 30-33, 1984
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、背景技術の項で述べたように、化学結合法では難しかった、複数種のペプチドを任意にコントロールした導入量で基質表面に固相化することを可能にし、またペプチド種の組み合わせによって細胞の接着・増殖・分化などをコントロールできるようにした、新規な細胞培養基質及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち本発明は、（１）疎水結合性吸着ポリマーに単一種のペプチドを導入したペプチド導入ポリマーを複数種細胞培養基質表面にコーティングする工程を有することを特徴とする細胞培養基質の製造方法や、（２）ペプチドがフィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、シンデカン、カドヘリン、及びセレクチンから選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞接着に関わるペプチド領域からなる（１）記載の細胞培養基質の製造方法や、（３）ペプチドが上皮増殖因子、形質転換増殖因子、線維芽細胞増殖因子、インシュリン様増殖因子、及びインシュリンから選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞増殖に関わるペプチド領域からなることを特徴とする（１）又は（２）記載の細胞培養基質の製造方法や、（４）ペプチドがラミニン、上皮増殖因子、形質転換増殖因子、及び線維芽細胞増殖因子から選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞分化に関わるペプチド領域からなることを特徴とする（１）〜（３）いずれか記載の細胞培養基質の製造方法や、（５）疎水結合性吸着ポリマーが、分子内に疎水性を有する直鎖状炭素骨格とペプチドと反応しうる官能基とを有するものであることを特徴とする（１）〜（４）いずれか記載の細胞培養基質の製造方法や、（６）（１）〜（５）記載のいずれかの製造方法で作られることを特徴とする細胞培養基質に関する。
【０００８】
また、本発明は、（７）疎水結合性吸着ポリマーに、細胞接着に関わるペプチド、細胞増殖に関わるペプチド、細胞分化に関わるペプチドからなる群より選ばれるペプチドを導入したことを特徴とするペプチド導入ポリマーや、（８）単一種のペプチドを導入したことを特徴とする（７）記載のペプチド導入ポリマーや、（９）細胞接着に関わるペプチドが、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、シンデカン、カドヘリン、及びセレクチンから選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞接着に関わるペプチド領域からなることを特徴とする（７）又は（８）記載のペプチド導入ポリマーや、（１０）細胞増殖に関わるペプチドが、上皮増殖因子、形質転換増殖因子、線維芽細胞増殖因子、インシュリン様増殖因子、及びインシュリンから選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞増殖に関わるペプチド領域からなるからなることを特徴とする（７）〜（９）のいずれか記載のペプチド導入ポリマーや、（１１）細胞分化に関わるペプチドが、ラミニン、上皮増殖因子、形質転換増殖因子、及び線維芽細胞増殖因子から選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞分化に関わるペプチド領域からなるからなることを特徴とする（７）〜（１０）のいずれか記載のペプチド導入ポリマーや、（１２）疎水結合性吸着ポリマーが、分子内に疎水性を有する直鎖状炭素骨格とペプチドと反応しうる官能基とを有するものである（７）〜（１１）いずれか記載のペプチド導入ポリマーに関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の細胞培養基質及びその製造方法によれば、複数種のペプチドの導入量を任意にコントロールでき、マトリゲルのようにさまざまな機能分子の混合物を正体のわかっている人工物で作ることができるため、細胞の状態をin vitroでより生体に近い形で制御でき、細胞の接着・増殖・分化などのための優れた培養基質として利用ができ、ひいては感染等の規制が厳しくなるであろうと予想される再生医療等の分野で使用されることが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の細胞培養基質の製造方法としては、疎水結合性吸着ポリマーに単一種のペプチドを導入したペプチド導入ポリマーを複数種細胞培養基質表面にコーティングする工程を有する方法であれば特に制限されず、また、本発明の細胞培養基質としては、上記本発明の細胞培養基質の製造方法により得られるものであれば特に制限されず、さらに、本発明のペプチド導入ポリマーとしては、疎水結合性吸着ポリマーに、細胞接着に関わるペプチド、細胞増殖に関わるペプチド、細胞分化に関わるペプチドからなる群より選ばれるペプチドが導入されているポリマーであれば特に制限されない。上記本発明の細胞培養基質の製造方法において使用するペプチドとしては特に規定されるものではないが、細胞接着・増殖・分化など、細胞の機能に関わるものを用いるのが好ましい。
【００１１】
また、上記本発明のペプチド導入ポリマーとしては、２種類以上のペプチドを導入したものよりも、単一種のペプチドを導入したものが導入ペプチドの導入量の制御等の点で好ましく、単一種のペプチドを導入したペプチド導入ポリマーを、例えば混合することにより複数種用いることにより、細胞種等に応じて所望の細胞培養基質を簡便に作製することができる。
【００１２】
細胞接着に関わるペプチドとしては、細胞接着蛋白質のアミノ酸配列の中で、細胞接着に関わる領域のペプチドであればいずれでも用いることができ、細胞接着蛋白質としては、具体的にはフィブロネクチン（ＦＮ）、コラーゲン（Ｃｏｌ）、ラミニン（ＬＮ）、ビトロネクチン（ＶＮ）等が挙げられる。これらペプチドの長さとしては、３〜２０個、好ましくは６〜１５個のアミノ酸残基であり、これらペプチドは、通常のペプチド合成法により入手可能である。
【００１３】
具体例として、フィブロネクチンの細胞結合ドメインにあるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を含むペプチドであるＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ（ＧＲＧＤＳＰ）等が挙げられる。
【００１４】
また、上皮細胞、血管内皮細胞、筋肉細胞、神経細胞（ニューロン）等の機能発現に特に重要と考えられているラミニンの細胞接着に関わる領域のペプチドとしては、α鎖のＧ領域（Ｇ−ｄｏｍａｉｎ）ペプチドが好ましく、例えば、マウスのＬＮ由来である、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ（ＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ；ＡＧ７３）、Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ（ＡＧ７３Ｔ）、Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ（ＡＧ７６．８）、Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ（ＡＧ７６．８Ｘ）、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ（ＡＧ８１．２）、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ（ＡＧ８１．２Ｘ）、Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ（Ａ２Ｇ７３）、Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ（Ａ３Ｇ７２）、Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ（Ａ４Ｇ７３）、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ（Ａ４Ｇ７８）、Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ（Ａ４Ｇ８２）、Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ（Ａ４Ｇ８２Ｘ）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ（Ａ５Ｇ７１）、Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（Ａ５Ｇ７３）、Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（Ａ５Ｇ７３Ｘ）、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ（Ａ５Ｇ７７）またはＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（Ａ５Ｇ７７ｆ）等が、また、ヒトＬＮ由来の、Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（ｈＡ３Ｇ７５）またはＧｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（ｈＡ３Ｇ８３）等が例示される。
【００１５】
細胞増殖蛋白質としては、具体的には上皮増殖因子（Epidermal Growth Factor；ＥＧＦ）、形質転換増殖因子（Transforming Growth Factor；ＴＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（Fibroblast Growth Factor；ＦＧＦ）、インシュリン様増殖因子（Insulin-like Growth Factor；ＩＧＦ）、またはインシュリン等が挙げられ、これらの蛋白質に含まれる細胞増殖に関わるペプチドとして、例えばＩＧＦに含まれるＧｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ（ＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ）等が挙げられる。
【００１６】
細胞分化蛋白質としては、具体的にはラミニン、上皮増殖因子、形質転換増殖因子、または線維芽細胞増殖因子等が挙げられ、これらの蛋白質に含まれる細胞分化に関わるペプチドとして、例えばＥＧＦに含まれるＣｙｓ（Ａｃｍ）−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）（Ｃ（Ａｃｍ）ＭＨＩＥＳＬＤＳＹＴＣ（Ａｃｍ））等が挙げられる。
【００１７】
本発明に使用するペプチドを導入させるポリマーは、細胞培養表面基質に吸着することができる疎水結合性吸着ポリマーであって、分子内に疎水性を有する直鎖状炭素骨格とペプチドと反応しうる官能基とを有するものが好ましい。特に分子内にポリアルキレン鎖あるいは直鎖アミノ酸ポリマー（ポリグリシン、ポリアラニン、ポリバリン、ポリロイシン、ポリフェニルアラニン等）やその誘導体などの疎水性の直鎖状骨格を持つ疎水結合性吸着ポリマーで、該疎水性の直鎖状骨格に直接、あるいはスペーサーを介してペプチドと反応できる反応性の官能基（反応基）とを有する疎水結合性吸着ポリマーを好適に用いることができる。代表例として、無水マレイン酸とスチレンとの交互共重合体（以下、ＭＡＳＴ（maleic anhydride / styrene copolymer）と呼ぶ）や、無水マレイン酸とメチルビニルエーテルとの交互共重合体（以下、ＭＭＡＣ（methyl vinyl ether / maleic anhydride copolymer）と呼ぶ）を挙げることができる。
【００１８】
また、ポリマーに化学処理を施してペプチドと反応しうる官能基を導入したものも使用することができる。例えば、ポリスチレン樹脂を酸素プラズマ処理することによりカルボキシル基を導入したもの、アンモニアプラズマ処理することによりアミノ基を導入したものなどが利用できる。
【００１９】
上記のペプチドの疎水結合性吸着ポリマーへの導入は、ポリマー鎖のペプチドと反応しうる官能基と該ペプチドとを、カップリング剤を用いて反応し化学結合させる。具体的には、ポリマー鎖に導入したカルボキシル基またはアミノ基と、ペプチドに含まれるアミノ基またはカルボキシル基との、水溶性カルボジイミドを用いた縮合結合、あるいはグルタルアルデヒドなどの二官能性架橋剤による架橋反応が挙げられる。
【００２０】
細胞培養基質の基材としては、例えば、プラスチック、合成ゴム、無機物および金属等を使用した細胞培養基質が挙げられるが、特に成型性に優れているプラスチックが好ましい。
【００２１】
プラスチックとしては、熱可塑性樹脂または熱硬化性樹脂のいずれの樹脂も使用することができ、熱可塑性樹脂としては、例えば、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリメチルペンテン樹脂、フッ素樹脂またはポリカーボネート等が、熱硬化性樹脂としては、例えば、フェノール樹脂、尿素樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂またはシリコン樹脂等が例示されるが、特に透明性の高さからポリスチレン樹脂が好ましい。また、自己蛍光の低さからフッ素樹脂も好適に用いることができる。
【００２２】
合成ゴムとしては、例えば、ブタジエンスチレンゴム、ブタジエンアクリロニトリルゴム、ブチルゴム、多硫化系合成ゴム、フッ素ゴムまたはシリコンゴム等が例示される。
【００２３】
無機物としては、ガラス、ヒドロキシアパタイト、シリコン等のＩＣ基材またはカーボンナノチューブ等が例示される。
【００２４】
金属としては、不活性（inert）な金、白金、チタンあるいはこれらの酸化物等が例示される。
【００２５】
単一のペプチド導入ポリマーを複数種コーティングする方法としては、複数種のペプチド導入ポリマーを溶液状態で混合させた後、基質にコーティングする方法と、１種類ずつのペプチド導入ポリマー溶液を順次コーティングする方法とがあり、どちらの方法も利用できる。いずれの方法とも、用いるペプチド導入ポリマー溶液の割合については、使用する実験系に応じて任意の割合でよい。例えば、単純に２種類の溶液を１：１で混合させてもよいし、用いる組織の細胞外マトリックスの組成比に合わせて混合することも可能である。
【００２６】
ペプチド導入ポリマーを基質にコーティングする方法としては、溶液を基質に分注し、一定時間静置後溶液を回収する方法と、分注した溶液をそのまま蒸発・乾固させる方法とがあり、どちらの方法も利用できる。前者に関しては、コーティング時間としては５分〜２４時間静置した後溶液を回収し、水で洗浄して乾燥させ保存する、あるいはそのまま乾燥・保存して使用直前に水、リン酸緩衝液または培地で洗浄して直ちに使用する。後者に関しては、溶媒が蒸発するまで静置しておくことになる。蒸発までの時間は溶媒の種類によって異なるが、おおむね１〜４８時間である。乾燥後は、水で洗浄した後再び乾燥させ保存する、あるいはそのまま保存して使用直前に水、リン酸緩衝液または培地で洗浄して直ちに使用する。
【００２７】
ペプチド導入ポリマーの濃度としては、１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、特に５〜５０μｇ／ｍｌが好ましい。コーティング溶液の分注量は、コーティング面の面積に依存するが、例えば３５φのシャーレであれば、０．２５〜２ｍｌ、特に０．５〜１ｍｌが好ましい。
【００２８】
コーティングに用いる溶媒としては、上記のペプチド導入ポリマーを溶かし、かつコートする基質を侵さないものである必要がある。例えば、細胞培養基質としてプラスチックを用い、ＭＡＳＴを塗布する場合は、極性溶媒でプラスチック表面を侵さないエタノールを用いるのが良い。その組成としては、エタノールと純水の混合溶媒が好適で、エタノールは任意の割合で用いることができるが、エタノール：純水＝１：１程度の割合が好ましい。
【００２９】
滅菌に関しては、細胞培養基質という性質上行わなければならないが、その方法は、無菌的な環境で、溶液をろ過滅菌した後コーティングを行う無菌生産の方法と、有菌的にコーティングを行った後、γ線、電子線等の放射線により滅菌処理を行う方法のいずれも用いることが可能である。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
疎水結合性吸収ポリマーである無水マレイン酸とスチレンの共重合体であるＭＡＳＴ２００ｍｇを１ＮのＮａＯＨ水溶液を少量づつ添加し、完全に溶解させた。これに、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ：1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimed, hydroch
loride）５０mgを加え２時間室温で反応させた後、ＧＲＧＤＳＰペプチド２０ｍｇを加えて、室温で２時間攪拌反応させた。反応終了後、水に透析してアルカリと低分子物質を除き、反応性生物を凍結乾燥しＭＡＳＴ−ＧＲＧＤＳＰを調製した。
【００３１】
さらに、ＭＡＳＴ２００ｍｇを１ＮのＮａＯＨ水溶液を少量づつ添加し、完全に溶解させた。これに、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）５０ｍｇを加え２時間室温で反応させた後、ＡＧ７３ペプチド２０ｍｇを加えて、室温で２時間攪拌反応させ、上記同様に透析、凍結乾燥しＭＡＳＴ−ＡＧ７３を調製した。
【００３２】
これ以降のすべての操作は無菌操作を前提とする。遠沈管に１０μｇ／ｍＬでＭＡＳＴ−ＧＲＧＤＳＰを水−エタノール溶媒（体積比１：１）に溶かした溶液と、１０μｇ／ｍＬでＭＡＳＴ−ＡＧ７３を水−エタノール溶媒（同１：１）に溶かした溶液を用意し、一方を他方の溶液に加えよく混合させた（混合比１：１）。次に、３５φシャーレ成型品（住友ベークライト(株)製）にこの混合溶液を１ｍＬ分注し、溶媒が蒸発するまで静置した。その後、シャーレに純水３ｍＬを加えて洗浄した後、容器を室温で乾燥させた。
【００３３】
（比較例１）
１０μｇ／ｍＬのＭＡＳＴ−ＧＲＧＤＳＰ溶液のみを実施例１と同様な方法でシャーレにコートしたものを作製した。
【００３４】
フラスコで培養したＰＣ−１２細胞（ラット副腎髄質褐色細胞腫由来）を０．２５％トリプシン溶液で剥がし、回収した細胞を無血清のＤＭＥＭ培養液（Ｇｉｂｃｏ、１１８８５−０８４）に分散し、遠心分離により細胞を分離、これを３回繰り返して無血清のＤＭＥＭで再分散した。細胞分散液を無血清のＤＭＥＭで２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、上記のコートしたシャーレに１ｍＬ加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２日間培養を行った。
【００３５】
顕微鏡下で培養状態を観察したところ、実施例１では細胞播種後１時間、４時間の時点で多くのＰＣ−１２細胞が接着・伸展をしており、播種後２４時間でも細胞は形態を維持していたが、比較例１では細胞播種後１時間、４時間で接着はしているものの伸展はせず、播種後２４時間では死んで浮いている細胞が多く見られた。これにより、細胞接着における、複数種のペプチド導入ポリマーを細胞培養基質にコートすることの効果が確認された。
【００３６】
（実施例２）
すべての操作は実施例１に準じて行った。実施例１同様に、ＭＡＳＴ２００ｍｇを１ＮのＮａＯＨ水溶液を用いて、完全に溶解させた。これに、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）５０ｍｇを加え２時間室温で反応させた後、Ａ５Ｇ７３Ｘペプチド２０ｍｇを加えて、室温で２時間攪拌反応させ、上記同様に透析、凍結乾燥しＭＡＳＴ−Ａ５Ｇ７３Ｘを調製した。
【００３７】
遠沈管に１０μｇ／ｍＬでＭＡＳＴ−ＧＲＧＤＳＰを水−エタノール溶媒（体積比１：１）に溶かした溶液と、１０μｇ／ｍＬでＭＡＳＴ−Ａ５Ｇ７３Xを水−エタノール溶媒（同１：１）に溶かした溶液を用意し、一方を他方の溶液に加えよく混合させた（混合比１：１）。次に、３５φシャーレ成型品（住友ベークライト(株)製）にこの混合溶液を１ｍＬ分注し、溶媒が蒸発するまで静置した。その後、シャーレに純水３ｍＬを加えて洗浄した後、容器を室温で乾燥させた。
【００３８】
（比較例２）
１０μｇ／ｍＬのＭＡＳＴ−ＧＲＧＤＳＰ溶液のみ、または１０μｇ／ｍＬでＭＡＳＴ−Ａ５Ｇ７３X溶液のみを実施例２と同様な方法でシャーレにコートしたものを作製した。
【００３９】
フラスコで培養したＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌細胞由来）を０．２５％トリプシン溶液で剥がし、回収した細胞を無血清のＤＭＥＭ培養液（Ｇｉｂｃｏ、１１８８５−０８４）に分散し、遠心分離により細胞を分離、これを３回繰り返して無血清のＤＭＥＭで再分散した。細胞分散液を無血清のＤＭＥＭで５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、上記のコートしたシャーレに１ｍＬ加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２日間培養を行った。
【００４０】
顕微鏡下で培養状態を観察したところ、実施例２では細胞播種後４時間の時点で多くのＨｅｐＧ２細胞が接着・伸展をしており、播種後２４時間でも細胞は形態を維持していたが、比較例２では細胞播種後４時間で接着はしているものの伸展はせず、播種後２４時間でも伸展している細胞数が少なかった。これにより、細胞接着における、複数種のペプチド導入ポリマーを細胞培養基質にコートすることの効果が確認された。
【００４１】
（実施例３）
すべての操作は実施例１に準じて行った。実施例１同様に、ＭＡＳＴ２００ｍｇを１ＮのＮａＯＨ水溶液を用いて、完全に溶解させた。これに、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）５０ｍｇを加え２時間室温で反応させた後、Ａ４Ｇ８２Ｘペプチド２０ｍｇを加えて、室温で２時間攪拌反応させ、上記同様に透析、凍結乾燥しＭＡＳＴ−Ａ４Ｇ８２Ｘを調製した。
【００４２】
遠沈管に１０μｇ／ｍＬでＭＡＳＴ−Ａ４Ｇ８２Ｘを水−エタノール溶媒（体積比１：１）に溶かした溶液と、１０μｇ／ｍＬでＭＡＳＴ−Ａ５Ｇ７３Ｘを水−エタノール溶媒（同１：１）に溶かした溶液を用意し、一方を他方の溶液に加えよく混合させた（混合比１：１）。次に、３５φシャーレ成型品（住友ベークライト(株)製）にこの混合溶液を１ｍＬ分注し、溶媒が蒸発するまで静置した。その後、シャーレに純水３ｍＬを加えて洗浄した後、容器を室温で乾燥させた。
【００４３】
（比較例３）
比較例として１０μｇ／ｍＬのＭＡＳＴ−Ａ４Ｇ８２溶液、またはＭＡＳＴ−Ａ５Ｇ７３Ｘのみを実施例と同様な方法でシャーレにコートしたものを作成した。
【００４４】
フラスコで培養した正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、クラボウ製、ＫＥ−４１０１）を０．２５％トリプシン溶液で剥がし、回収した細胞を血管内非細胞増殖用培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２、クラボウ製、ＫＥ−２１５０Ｓ）に分散し、遠心分離により細胞を分離、さらに血管内非細胞増殖用培地からウシ胎児血清（ＦＢＳ）を抜いたものに細胞を分散させ遠心分離し血清成分を除去する操作を３回繰り返して、最終的に無血清の血管内非細胞増殖用培地で再分散した。細胞数を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、上記のコートしたシャーレに１ｍＬ加え、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２日間培養を行った。
【００４５】
顕微鏡下で培養状態を観察したところ、実施例では細胞播種後１時間、４時間の時点で多くの正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞細胞が接着・伸展をしており、播種後２４時間でも細胞は形態を維持していた。これに対し比較例では細胞播種後１時間、４時間で接着はしているもの伸展は見られたが細胞が十分伸展しておらず小さいサイズのままであった。さらに播種後２４時間では細胞の状態に変化は見られずむしろ死んでシャーレより剥がれ浮いている細胞が多く見られた。これにより、細胞接着における、複数種のペプチド導入ポリマーを細胞培養基質にコートすることの効果が確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水結合性吸着ポリマーに単一種のペプチドを導入したペプチド導入ポリマーを複数種細胞培養基質表面にコーティングする工程を有することを特徴とする細胞培養基質の製造方法。
【請求項２】
ペプチドがフィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、シンデカン、カドヘリン、及びセレクチンから選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞接着に関わるペプチド領域からなることを特徴とする請求項１記載の細胞培養基質の製造方法。
【請求項３】
ペプチドが上皮増殖因子、形質転換増殖因子、線維芽細胞増殖因子、インシュリン様増殖因子、及びインシュリンから選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞増殖に関わるペプチド領域からなることを特徴とする請求項１又は２記載の細胞培養基質の製造方法。
【請求項４】
ペプチドがラミニン、上皮増殖因子、形質転換増殖因子、及び線維芽細胞増殖因子から選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞分化に関わるペプチド領域からなることを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の細胞培養基質の製造方法。
【請求項５】
疎水結合性吸着ポリマーが、分子内に疎水性を有する直鎖状炭素骨格とペプチドと反応しうる官能基とを有するものであることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の細胞培養基質の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５記載のいずれかの製造方法で作られることを特徴とする細胞培養基質。
【請求項７】
疎水結合性吸着ポリマーに、細胞接着に関わるペプチド、細胞増殖に関わるペプチド、細胞分化に関わるペプチドからなる群より選ばれるペプチドを導入したことを特徴とするペプチド導入ポリマー。
【請求項８】
単一種のペプチドを導入したことを特徴とする請求項７記載のペプチド導入ポリマー。
【請求項９】
細胞接着に関わるペプチドが、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、シンデカン、カドヘリン、及びセレクチンから選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞接着に関わるペプチド領域からなることを特徴とする請求項７又は８記載のペプチド導入ポリマー。
【請求項１０】
細胞増殖に関わるペプチドが、上皮増殖因子、形質転換増殖因子、線維芽細胞増殖因子、インシュリン様増殖因子、及びインシュリンから選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞増殖に関わるペプチド領域からなるからなることを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載のペプチド導入ポリマー。
【請求項１１】
細胞分化に関わるペプチドが、ラミニン、上皮増殖因子、形質転換増殖因子、及び線維芽細胞増殖因子から選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞分化に関わるペプチド領域からなるからなることを特徴とする請求項７〜１０のいずれか記載のペプチド導入ポリマー。
【請求項１２】
疎水結合性吸着ポリマーが、分子内に疎水性を有する直鎖状炭素骨格とペプチドと反応しうる官能基とを有するものである請求項７〜１１いずれか記載のペプチド導入ポリマー。
【請求項１】
疎水結合性吸着ポリマーに単一種のペプチドを導入したペプチド導入ポリマーを複数種細胞培養基質表面にコーティングする工程を有することを特徴とする細胞培養基質の製造方法。
【請求項２】
ペプチドがフィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、シンデカン、カドヘリン、及びセレクチンから選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞接着に関わるペプチド領域からなることを特徴とする請求項１記載の細胞培養基質の製造方法。
【請求項３】
ペプチドが上皮増殖因子、形質転換増殖因子、線維芽細胞増殖因子、インシュリン様増殖因子、及びインシュリンから選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞増殖に関わるペプチド領域からなることを特徴とする請求項１又は２記載の細胞培養基質の製造方法。
【請求項４】
ペプチドがラミニン、上皮増殖因子、形質転換増殖因子、及び線維芽細胞増殖因子から選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞分化に関わるペプチド領域からなることを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の細胞培養基質の製造方法。
【請求項５】
疎水結合性吸着ポリマーが、分子内に疎水性を有する直鎖状炭素骨格とペプチドと反応しうる官能基とを有するものであることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の細胞培養基質の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５記載のいずれかの製造方法で作られることを特徴とする細胞培養基質。
【請求項７】
疎水結合性吸着ポリマーに、細胞接着に関わるペプチド、細胞増殖に関わるペプチド、細胞分化に関わるペプチドからなる群より選ばれるペプチドを導入したことを特徴とするペプチド導入ポリマー。
【請求項８】
単一種のペプチドを導入したことを特徴とする請求項７記載のペプチド導入ポリマー。
【請求項９】
細胞接着に関わるペプチドが、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、シンデカン、カドヘリン、及びセレクチンから選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞接着に関わるペプチド領域からなることを特徴とする請求項７又は８記載のペプチド導入ポリマー。
【請求項１０】
細胞増殖に関わるペプチドが、上皮増殖因子、形質転換増殖因子、線維芽細胞増殖因子、インシュリン様増殖因子、及びインシュリンから選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞増殖に関わるペプチド領域からなるからなることを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載のペプチド導入ポリマー。
【請求項１１】
細胞分化に関わるペプチドが、ラミニン、上皮増殖因子、形質転換増殖因子、及び線維芽細胞増殖因子から選ばれる少なくとも一つの蛋白中の細胞分化に関わるペプチド領域からなるからなることを特徴とする請求項７〜１０のいずれか記載のペプチド導入ポリマー。
【請求項１２】
疎水結合性吸着ポリマーが、分子内に疎水性を有する直鎖状炭素骨格とペプチドと反応しうる官能基とを有するものである請求項７〜１１いずれか記載のペプチド導入ポリマー。
【公開番号】特開２００６−８７３９６（Ｐ２００６−８７３９６Ａ）
【公開日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２７９８９３（Ｐ２００４−２７９８９３）
【出願日】平成１６年９月２７日（２００４．９．２７）
【出願人】（５０１２７３８８６）独立行政法人国立環境研究所 (30)
【出願人】（５０３１０８８８３）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月６日（２００６．４．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月２７日（２００４．９．２７）
【出願人】（５０１２７３８８６）独立行政法人国立環境研究所 (30)
【出願人】（５０３１０８８８３）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
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