Notice: Undefined variable: fterm_desc_sub in /mnt/www/biblio_conv.php on line 353
細胞培養物中のウイルス増殖
説明

細胞培養物中のウイルス増殖

【課題】細胞培養におけるウイルス増殖のための新規な方法を提供する。
【解決手段】細胞はウイルスで感染され、感染後にウイルスの増殖を可能にし、かつ少なくとも2倍の細胞の増殖を目的とする条件下で培養される。また、得られたウイルス及び発現されたタンパク質は薬物および診断剤の製造のために使用される。対象となるウイルスは、ssDNAウイルス、dsDNAウイルス、RNA(+)ウイルス、RNA(−)ウイルスまたはdsRNAウイルスであり、使用される細胞株はMDCK細胞(イヌ腎臓細胞)。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞培養物中のウイルス増殖のための方法に関し、ここで細胞はウイルスに
感染し、そして感染後、これらの細胞は、ウイルス増殖が可能でかつ同時に、少なくとも
2倍の、標的されたさらなる細胞増殖が可能な条件下で、細胞培養物中で培養される。本
発明はまた、薬物および診断剤の製造のための、そのように得られるウイルスまたはそれ
らのウイルスによって発現されるタンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
感染症、特にウイルス感染は、依然として医薬においてかなり重要である。従って、培
養物中でウイルスを増殖することができるよりよい方法を利用可能にして、ウイルスに関
する研究およびワクチンの製造を可能にする必要性は、不変的なままである。特に、ウイ
ルス感染に対するワクチンの製造は、通常、多量の対応するウイルスの増殖および単離を
必要とする。
【0003】
この対応するウイルスに依存して、ウイルス増殖のための種々の宿主系および培養条件
が、先行技術において使用されている。標準的な宿主動物、ニワトリ胚性卵、初代組織細
胞培養物または株化細胞系統が、宿主系として使用される(非特許文献1〜3)。
【0004】
ニワトリ胚性卵におけるウイルス増殖は、高コストおよび時間の損失につながっている
。この卵は、感染前にインキュベートされ、次いで、その胚の生存度について試験されな
ければならない。生存している胚のみが、ウイルスを増殖し得る。ウイルス感染後、増殖
が起こり、さらにインキュベートして、この胚は最終的に殺傷される。この卵から単離さ
れたウイルスは、汚染物質を含まず、濃縮されている。インキュベートした卵におけるウ
イルス増殖は、厳密に滅菌した条件下では不可能であるので、医薬用途または診断用途の
ために利用可能であるべきならば、汚染した病原性微生物が、その単離物から取り除かれ
なければならない。
【0005】
ニワトリの卵におけるウイルス増殖に対する代替物が、規定された細胞株の真核生物宿
主細胞によって提供される(Gregersen,J.P.,Pharmazeutis
che Biotechnologie,KayserおよびMuller(編)、20
00、257〜281)。しかし、多数の細胞株は、残留する外来性ウイルス汚染物質に
起因してか、またはウイルス実証がないこと、不明確な起源および経歴に起因して、ワク
チンまたは類似の医薬的に利用可能な調製物の製造に適していない。
【0006】
細胞培養物中でのウイルス増殖のために先行技術において使用される方法は全て、同じ
基本的なスキームを有し、ここで細胞は、ウイルスの非存在下で最初に増殖され、次いで
、細胞の有意な増殖が生じない条件下で、ウイルスが添加および増殖され、そしてその培
養物が、ウイルスの最大増殖後に回収される。
【0007】
例えば、サルの腎臓細胞由来のVero細胞は、ワクチン製造用の個々のウイルス(ポ
リオウイルス、狂犬病ウイルス)の増殖のために使用された。これらの細胞は、(Ame
rican Type Culture Collection,ATCCのような)種
々の細胞バンクにおいて利用可能であり、そしてまた、World Health Or
ganization(WHO)によって、医薬研究用の試験細胞バンクからも利用可能
になっている。
【0008】
これらのVero細胞は、接着系統であり、ガラスボトル、プラスチック培養プレート
またはプラスチックフラスコのような細胞増殖用の支持体表面を必要とする。いわゆるマ
イクロキャリアの増殖は、発酵槽(すなわち一般に、プラスチック製の小球体(この表面
上で、細胞が増殖し得る))中の対応する細胞の培養物中で生じる。
【0009】
接着性BHK(ベビーハムスターの腎臓)細胞および接着性MDCK(Mandine
Darbyのイヌ腎臓)細胞、ならびに他の細胞もまた、前述のVero細胞に加えて
、活発にウイルスを増殖し、これらは、薬学的生成物の生成のための基質として使用され
るか、またはそれらの使用が考慮される。インフルエンザウイルスに加えて、MDCK細
胞株ATCC CRL34(NBL−2)において、水疱性口内炎ウイルス、コクサッキ
ーウイルスB5(B3でもB4でもない)、レオウイルス2型および3型、アデノウイル
ス4型および5型、ならびにワクシニアウイルスもまた、実験によって増殖されている。
しかし、全ての対応する刊行物は、排他的に、接着性培養物に適合させている(ATCC
製品情報を参照のこと)。しかし、懸濁培養物が、多量の細胞増殖に好ましく、従って、
リンパ球および多数の形質転換細胞のみが、この系においてかなり増殖され得る(Lin
dl(編)、Cell and Tissue Culture,2000,pp.17
3ff)。タンパク質を含まない培養培地における懸濁物中で増殖し得るMDCK細胞株
が、WO 97/37000に開示される。対応する宿主細胞を使用するインフルエンザ
ウイルスの増殖もまた、記載される。
【0010】
適切な細胞または宿主系の選択に加えて、ウイルス系統が増殖される培養条件もまた、
受容可能に高い収率を達成するために、かなり有意である。従って、所望のウイルス系統
の収率を最大にするために、宿主系と培養条件との両方が、所望のウイルス系統のために
有利な環境条件を達成するために、特に適応されなければならない。従って、種々のウイ
ルス系統の高収率を達成するために、最適の増殖条件を生じる系が、必要とされる。多数
のウイルスは、特定の宿主系に制限され、これらのうちのいくらかは、ウイルス収率に関
して非常に非効率的である。効率的な生成系はしばしば、対応する培養系のウイルス集団
の適応に基づき、しばしば他の宿主系との中間状態を使用し、そしてタンパク質添加物(
大部分は、動物またはヒト起源の血清)を用いる。
【0011】
血清または他の増殖因子の添加を用いた初期増殖後のほとんど全ての培養物は、血清も
タンパク質添加物もなしで少なくとも特定の時間保たれ得ることがまた、研究者によって
知られている。例えば、任意の細胞培養物は、ウイルス感染の時点または回収直前に、血
清もタンパク質添加物も含まない培地に取り換えられ得(switched)、回収まで
保たれる。これは、外来性タンパク質を回避するかまたは低下させながら、ワクチンまた
は診断試験用のウイルス材料を得るための、長期にわたる慣習である。血清を添加した感
染段階の間に、この実施を行わずに保たれたワクチンおよび細胞培養物は、ヒトまたは動
物における使用を可能にする際の重要な問題を有する。なぜなら、この血清成分は、あま
り十分には排除され得ないからである(WHO奨励「Proposed require
ments for measles vaccine」(Live),Require
ments for Biological Substances No.12,19
78年改訂を参照のこと)。
【0012】
多くのウイルスは、タンパク質含有培地中でほとんどわずかにしか増殖され得ないかま
たは全く培養され得ないこともまた、知られている。培養系での増殖のためにタンパク質
分解酵素(プロテアーゼ)の活性化に頼るウイルスが、含まれる。これらのプロテアーゼ
は、培地へのタンパク質の添加によって競合的に阻害されるので、少なくとも感染期間ま
たは生成段階におけるタンパク質の添加は、ここで理論的に問うまでもない。プロテアー
ゼの添加によって通常増殖されるはずであり、それによって、可能ならば感染培地へのタ
ンパク質の添加なしで良好な収率を達成するウイルスの例は、インフルエンザウイルスお
よびロタウイルスである。パラミクソウイルスおよびレオウイルスのような他の型のウイ
ルスもまた、できる限りタンパク質の少ない培地からの増殖の間、有利である。(War
dら(1984),J.Clin.Microbiol.748−753、「Effic
iency of human rotavirus propagation in
cell culture」)。WO 96/15231は、通常のタンパク質添加物を
使用しない培養物が使用される細胞培養物中でのVero細胞または他の細胞の培養を提
唱している。
【0013】
他のウイルス(例えば、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、肺炎ウイルスまたはA型肝炎
ウイルス)は、培養組成物および培地条件に関わらず、不十分に増殖されることが知られ
ている(ProvostおよびHillemann、Proc.Soc.Exp.Bio
.Med.,160:213−221(1979);ならびにRolleおよびMayr
(前出))。
【0014】
ウイルスの増殖後、これは通常、培養物から単離される。多数の方法が、先行技術で知
られており、これによって、ウイルス、ウイルス発現産物または他のタンパク質が、増殖
後に培養物および/または細胞から単離され得る(Gregersen(前出);Rei
mer,Cら、Journal of Virology、1967年12月、1207
−1216頁;Navarro del Canizo,Aら、Applied Bio
chemistry and Biotechnology、第61巻、1996、39
9;Prior.Cら、BioPharm、1996年10月22日;Janson,J
an−C.およびRyden L.(編)、Protein Purification
,1997;ならびにDeutscher,M.(編)、Methods in Enz
ymology、第182巻、1990)。
【0015】
しかし、この方法のスキーム過程(細胞増殖、ウイルス増殖、回収)に基づいて、先行
技術において既知の方法は、制限されたウイルス増殖およびウイルス回収を可能にするの
みである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0016】
【非特許文献1】RolleおよびMayr(編)、Microbiology,Infection and Epidemic Science,1978
【非特許文献2】Mahy(編)、Virology,A Practical Approach,1985
【非特許文献3】Horzinek(編)、Compendium of General Virology,1985)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0017】
従って、本発明の根底にあるこの問題は、より大きいウイルス増殖および単純化された
多量の回収を可能にする、細胞培養物中のウイルス増殖のための方法を提供することから
なる。
【課題を解決するための手段】
【0018】
本発明は、例えば、以下を提供する:
(項目1)
細胞培養におけるウイルスの増殖のための方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)細胞をウイルスに感染させる工程;
(b)感染後に、該ウイルスの増殖を可能にし、かつ同時に、さらに少なくとも2倍の
該細胞の増殖を目的とした条件下で、該細胞を細胞培養において培養する工程、
を包含する、方法。
(項目2)
感染後に、少なくとも5倍、好ましくは少なくとも10倍の前記細胞の増殖を引き起こす
条件下で、該細胞が培養される、項目1に記載の方法。
(項目3)
感染後に、少なくとも7日間、21日間、または28日間、好ましくは少なくとも35日
間、細胞培養において前記細胞が培養される、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記ウイルスおよび細胞の目的とした増殖の間に、新鮮な培地、培地濃縮物または培地成
分が少なくとも1回添加されるか、あるいは該ウイルスおよび細胞の少なくとも一部分が
、新鮮な培地、培地濃縮物または培地成分を含む培養容器に移される、項目1〜3のい
ずれか1項に記載の方法。
(項目5)
前記培地、培地濃縮物もしくは培地成分の添加、または前記細胞およびウイルスの、別の
培養容器への移転が少なくとも1回繰り返される、項目1〜4のいずれか1項に記載の
方法。
(項目6)
前記培地、培地濃縮物もしくは培地成分の添加、または前記細胞およびウイルスの、別の
培養容器への移転が少なくとも数回繰り返される、項目1〜5のいずれか1項に記載の
方法。
(項目7)
前記培地が、前記ウイルスおよび細胞の増殖の間に取り除かれる、項目1〜6のいずれ
か1項に記載の方法。
(項目8)
前記ウイルスおよび細胞の増殖の間に、培地が連続的に取り除かれ、そして新鮮な培地、
培地濃縮物または培地成分が添加される、項目1〜7のいずれか1項に記載の方法。
(項目9)
前記細胞がMDCK細胞である、項目1〜8のいずれか1項に記載の方法。
(項目10)
感染前に、前記細胞が、接着培養されるか、または懸濁培養物として培養される、項目
1〜8のいずれか1項に記載の方法。
(項目11)
感染後に、前記細胞が、接着培養されるか、または懸濁培養物として培養される、項目
1〜10のいずれか1項に記載の方法。
(項目12)
前記MDCK細胞が、細胞株MDCK33016に由来する、項目1〜11のいずれか
1項に記載の方法。
(項目13)
前記ウイルスが、ssDNAウイルス、dsDNAウイルス、RNA(+)ウイルス、R
NA(−)ウイルスまたはdsRNAウイルスである、項目1〜12のいずれか1項に
記載の方法。
(項目14)
前記ウイルスが、アデノウイルス、オルトミクソウイルスもしくはパラミクソウイルス、
レオウイルス、ピコルナウイルス、エンテロウイルス、フラビウイルス、アレナウイルス
、ヘルペスウイルスまたはポックスウイルスから選択される、項目1〜13のいずれか
1項に記載の方法。
(項目15)
アデノウイルス、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、中央ヨーロッ
パ脳炎ウイルスおよび関連東部(ロシアまたは他の)形態、デングウイルス、黄熱病ウイ
ルス、C型肝炎ウイルス、風疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、RS
ウイルス、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、ラブドウイル
ス、肺炎ウイルス、レオウイルス、1型ヘルペス単純ウイルスまたは2型ヘルペス単純ウ
イルス、サイトメガロウイルス、水痘‐帯状疱疹ウイルス、イヌアデノウイルス、エプス
タイン‐バーウイルス、およびウシヘルペスウイルスもしくはブタヘルペスウイルス、B
HV−1様ウイルス、または仮性狂犬病ウイルスが、前記細胞の感染のために使用され、
ここで、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、肺炎ウイルスまたはA型肝炎ウイルスが特に好
ましい、項目14に記載の方法。
(項目16)
ウイルスゲノムが少なくとも10kdのサイズの異種機能性タンパク質をコードする配列
を有する、項目1〜15のいずれか1項に記載の方法。
(項目17)
前記培地が、血清を含まない、項目1〜16のいずれか1項に記載の方法。
(項目18)
前記培地が、化学的に規定された培地である、項目1〜17のいずれかに一項に記載の
方法。
(項目19)
前記培地が、タンパク質を含まない、項目1〜18のいずれか1項に記載の方法。
(項目20)
前記ウイルスの増殖が、灌流システムにおいて行なわれる、項目1〜19のいずれか1
項に記載の方法。
(項目21)
前記ウイルスの増殖が、バッチシステムにおいて行なわれる、項目1〜20のいずれか
1項に記載の方法。
(項目22)
前記MDCK細胞が、前記ウイルスの増殖のために30℃と40℃との間の温度で培養さ
れる、項目1〜21のいずれか1項に記載の方法。
(項目23)
前記MDCK細胞が、前記ウイルスの増殖のために35%と60%との間の酸素分圧で培
養される、項目1〜22のいずれか1項に記載の方法。
(項目24)
前記培地のpH値が、前記ウイルスの増殖のためにpH6.8とpH7.8との間である
、項目1〜23に記載の方法。
(項目25)
前記ウイルスが、10−8と10との間のMOI値での感染によって前記MDCK細胞に
導入される、項目1〜24のいずれか1項に記載の方法。
(項目26)
前記ウイルスまたはそれらによって発現されるタンパク質が、前記培養物の上清または回
収された細胞から単離される、項目1〜25のいずれか1項に記載の方法。
(項目27)
前記培養培地の少なくとも1部分が、前記ウイルスまたはタンパク質の単離のために、前
記MDCK細胞の少なくとも一部分から分離される、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記分離が、ディープベッドフィルタまたは分離器によって起こる、項目27に記載の
方法。
(項目29)
精製が、前記ウイルスの濃縮のための超遠心分離法を包含する、項目26〜28のいず
れか1項に記載の方法。
(項目30)
前記精製が、クロマトグラフィーを包含する、項目26〜29のいずれか1項に記載の
方法。
(項目31)
前記ウイルスが精製の間、不活性である、項目26〜30のいずれか1項に記載の方法

(項目32)
項目1〜32のいずれか1項に記載の方法を含む、薬物または診断剤の製造方法。
(項目33)
単離されたウイルスまたはタンパク質が、適切なアジュバント、補助剤、緩衝剤、希釈剤
または薬物キャリアと混合される、項目33に記載の薬物または診断剤の製造方法。
【発明を実施するための形態】
【0019】
ここで、この問題は、ウイルス増殖のための方法によって解決されており、この方法に
おいて;
(a)細胞をウイルスに感染させ;
(b)感染後に、該ウイルスの増殖を可能にし、かつ同時に、さらに少なくとも2倍の
該細胞の増殖を目的とした条件下で、該細胞を細胞培養において培養する。
【0020】
驚くべきことに、細胞培養物中でのウイルス増殖のための、有意に改善された方法は、
この方法の過程が根本的に変更される(すなわち、細胞増殖がまた、ウイルスの増殖の間
にも可能となる)場合に、得られる。このことは、有意により多くのウイルスがより短い
時間で得られ得るという利点を有する。細胞培養用の設備の産出量もまた、改善される。
【0021】
本発明に従って、細胞培養は、感染後に細胞が、少なくとも2倍または5倍、好ましく
は、少なくとも10倍増加するように、行われる。
【0022】
細胞増殖とはまた、培養が少なくとも感染後7日間にわたって行われ得ることを意味す
るが、好ましくは、細胞およびウイルスは、少なくとも21日間、28日間または35日
間にわたって細胞培養物中で増殖される。
【0023】
この方法に依存して、ウイルスおよび細胞の増殖の間に、新鮮な培地、培地濃縮物もし
くは培養成分を少なくとも1回、または少なくともウイルスおよび細胞の転移部分を、新
鮮な培地、培地濃縮物もしくは培養成分を含む培養容器に加えることが、有利であり得る
。しかし、ウイルスおよび細胞の増殖の間に少なくとも1回、新鮮な培地、培地濃縮物も
しくは培養成分を加えることが、好ましい。
【0024】
この培地、培地濃縮物または培養成分の添加は、好ましくは、少なくとも1回または少
なくとも数回、繰り返される。
【0025】
本発明の別の好ましい実施形態に従って、感染した細胞の培養の間、その培養培地は、
新鮮な培養培地に置き換えられるか、またはその培養容量は、新鮮な培養培地を加えるこ
とによって増加される。培養培地の交換または置き換えはまた、培地濃縮物または培養成
分(アミノ酸、ビタミン、脂質画分、リン酸および他の物質など)によって生じ得る。こ
れらの工程はまた、細胞培養の間、繰返し行われ得る。
【0026】
このことは、培養上清からの多重ウイルス回収によって、特に総培養容量を増加させる
ことによって、ウイルス収率の増加を可能にし、かつ新鮮な培地を加えることによる細胞
数の増加もまた可能にする。この系の収率は有意に改善されるので、対応する多重回収は
、本発明に従う方法の有意な利点を表わす。
【0027】
本発明の方法において、MDCK細胞は、好ましくは、ウイルス増殖のために使用され
る。
【0028】
本発明に従う方法において使用される細胞において、懸濁培養物中で増殖する特性を有
する細胞が含まれる。工業規模の発酵槽中で支持体粒子の非存在下でもまた増殖し得る細
胞は、他の細胞に対して、培養の操作、培養のスケールアップおよびウイルス増殖の間、
有意な利点を有することによって示される。MDCK細胞を懸濁培養物に適合させるため
の方法は、先行技術において公知である(WO 97/37000)。このMDCK細胞
は、細胞株MDCK 33016に由来し得る。
【0029】
本発明の別の実施形態に従って、感染前および感染後、接着性である特性および懸濁培
養物として増殖する特性の両方を有する細胞が、使用される。この実施形態は、細胞培養
系、従って研究室規模から工業的製造までの細胞の発育のための培地が使用され得るとい
う特別な利点を有する。個々の細胞培養系の安全性のみをチェックする必要があるので、
対応する系は、医薬品登録を有意に単純化する。
【0030】
ウイルスは、一本鎖デオキシリボ核酸(ssDNA)、二本鎖デオキシリボ核酸(ds
DNA)、二本鎖リボ核酸(dsRNA)または一本鎖リボ核酸由来のゲノムを有し得る
。この時、この一本鎖リボ核酸分子は、メッセンジャーRNAの極性(RNA(+))、
または反対の極性(RNA(−))を有し得る。
【0031】
ウイルスは、先行技術で公知の任意のウイルスであり得る。本発明に従う方法の文脈に
おいて使用されるウイルスは、ATCC(American Type Culture
Collection)またはECACC(European Collection
of Animal Cell Culture)のような種々の収集物から得られ得
る。細胞培養物中ですでに予め増殖されている、存在している産生系統またはウイルス系
統が、一般に用いられる。特定の単離体もまた、樹立され得るが、これらは、対応する用
途により適している。1つの実施形態に従って、この方法において使用されるウイルスは
、以下からなる群より選択される:アデノウイルス、オルトミクソウイルスおよびパラミ
クソウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、エンテロウイルス、フラビウイルス、
アレナウイルス、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルス。アデノウイルス、ポリオ
ウイルス、A型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、中央ヨーロッパ脳炎ウイルス、および
関連する東洋(ロシアまたは他国)形態、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、C型肝炎
ウイルス、風疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルス、ワク
シニアウイルス、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、ラブドウイルス、肺炎ウイル
ス、レオウイルス、単純疱疹ウイルス1または単純疱疹ウイルス2、サイトメガロウイル
ス、水痘帯状疱疹ウイルス、イヌアデノウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ならび
にウシヘルペスウイルスまたはブタヘルペスウイルス、類似のBHV−1または仮性狂犬
病ウイルスが使用され、ここで、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、肺炎ウイルスまたはA
型肝炎ウイルスが、特に好ましい。
【0032】
本発明の別の実施形態によると、ウイルスのゲノムは、少なくとも10kdのサイズを
有する、異種の機能性タンパク質をコードする核酸配列を含み得る。異種タンパク質の発
現のための多数のベクターが、先行技術において公知であり、それらは、例えば、ヘルペ
スゲノム、ワクシニアゲノムまたはアデノウイルスゲノム上のウイルス性ゲノムに基づく
(Galler,Rら、Braz.J.Med.Biol.Res.,1997年2月、
30(2):157〜68;Willemse,M.J.ら、Vaccine,1996
年11月、14(6):1511〜6;Efstathiou,S.,Minson,A
.C.,Br.Med.Bull.,1995年1月、51(1):45〜55;Ham
merschmidt,W.,Curr.Opin.Mol.Ther.,2000年1
0月、2(5):532〜9;Graham,Fl.,Prevec,L.,Mol,B
iotechnol.,1995年6月、3(3):207〜20;Carroll,M
.W.,Moss,B.,Curr.Opin.Biotechnol.,1997年1
0月,8(5):573〜7;Wojcik,J.,Acta.Microbiol.P
ol.,1995,44(2):191〜6;Ramirez,J.C.ら、J.Vir
ol.,2000年8月、74(16):7651〜5;Hagen,Annaら、Bi
otechnol.Prog.,1996,12,406〜408;Huyghe,Be
rnardら、Human Gene Therapy,1995年11月、6:140
3〜1416)。
【0033】
本発明の状況において、ウイルス性ゲノムが、配列の付加または置換によって改変され
た結果、このゲノムが、少なくとも10kdのサイズを有する異種の機能性タンパク質(
すなわち、ウイルスに元来属さない)をコードするそれらのウイルスの増殖のための方法
がまた、含まれる。本発明によると、タンパク質が、このタンパク質に対して免疫反応を
誘発することが少なくとも可能である場合に、タンパク質は、機能性タンパク質として参
照される。本来、タンパク質は、免疫学的活性に加えて付加的な生物学的活性(例えば、
酵素またはサイトカインとしての作用)を有し得る。
【0034】
本発明による方法において使用されるウイルスはまた、ウイルス性ゲノムにおける個々
の遺伝子の欠失を有し得る。例えば、病原性因子をコードするワクチンとして使用される
ウイルスの遺伝子は、故意に欠失され得る。対応する欠失は、好ましくは、多くても50
0個または多くても1000個のヌクレオチドを含む。
【0035】
本来、本発明に従う方法によって使用されるウイルスはまた、完全ウイルス性ゲノムを
含み得る。
【0036】
懸濁培養におけるウイルスの増殖は、培地において、血清の存在下または非存在下で本
発明の方法によって生じ得る。これらの細胞培養条件は、このように産生された産物の医
学的使用の登録をかなり簡易化するので、特別な利点は、血清の不在によって得られる。
培養培地へ血清を添加して調剤することによって、培地汚染を排除するための高価な精製
工程がまた、避けられる。産物の品質に対する改善が、それゆえにまた、達成され、そし
てコストはこの理由で避けられる。
【0037】
培地は、本発明の状況において、人または動物起源の血清に由来する添加物が全くない
、無血清培地として参照される。
【0038】
培養およびその後の使用への干渉効果を有さない特定のタンパク質が、対応する培養に
対して規定された量で添加され得る。この型の培養培地は、化学的に規定された培地とし
て参照される。マイトジェンペプチド、インシュリン、トランスフェリンまたはリポタン
パク質のような選択されたタンパク質が、この培地に添加され、これらは、当業者に公知
の異なるプロデューサーから得られ得る。本発明の状況におけるマイトジェンペプチドは
、好ましくは、植物性加水分解物(例えば、大豆タンパク質加水分解物または他の有用な
植物のタンパク質由来の溶解産物)を意味すると理解される。
【0039】
しかし、特定の好ましい実施形態によると、培地は、タンパク質を全く含まない。タン
パク質を全く含まないとは、細胞の増殖が、タンパク質、成長因子、他のタンパク質添加
物および非血清タンパク質を排除して生じる培養を意味すると理解される。このような培
養において増殖する細胞は、本来的に、タンパク質自身を含む。
【0040】
公知の無血清培地としては、Iscove培地、Ultra−CHO培地(Bio W
hittaker)またはEX−CELL(JRH Bioscience)が挙げられ
る。一般的な血清含有培地としては、以下が挙げられる:イーグル基礎培地(BME)ま
たは最小必須培地(MEM)(Eagle,Science,130,432(1959
))あるいはダルベッコ改変イーグル培地(DMEMまたはEDM)(これらは、10%
までの胎児ウシ血清または類似の添加物とともに、一般的に使用される)。PF−CHO
(JHR Bioscience)のようなタンパク質を全く含まない培地、ProCH
O 4CDM(Bio Whittaker)またはSMIF7(Gibco/BRL
Life Technologies)のような化学的に規定された培地、およびPri
mactone、PepticaseまたはHyPepTM(全てQuest Inte
rnationalから得られる)あるいはラクトアルブミン加水分解物(Gibcoお
よび他の製造者)のようなマイトジェンペプチドはまた、当該分野において周知である。
植物性加水分解物に基づく培地添加物は、ウイルス、マイコプラズマまたは未知の感染物
質による汚染が排除され得るという特別な利点を有する。
【0041】
本発明の好ましい実施形態によると、感染されたMDCK細胞の培養の間に、新鮮な培
地、培地濃縮物、あるいはアミノ酸、ビタミン、脂肪画分またはリン酸塩のような培地成
分が添加される。
【0042】
次いで、本発明による方法は、灌流システムまたはバッチシステムにおいて実施され得
る。培地が連続的に供給および排出される培養システムは、灌流システムとして参照され
る。これに代わるようなものとして、細胞はまた、システムが、接種から回収までの培地
を供給しないほぼ閉鎖されたシステムとして運転されるバッチシステムにおいて培養され
得る。
【0043】
所望の適用のために使用される細胞培養条件(温度、細胞密度、pH値など)は、本発
明に従って使用される細胞株の適合性に従って、非常に広範囲で変化し得、そしてその適
用の要件に適合され得る。以下の情報は、それゆえに、単にガイドラインを示すに過ぎな
い。
【0044】
感染前の細胞の増殖は、遠心分離またはろ過のような従来の支持方法を使用する灌流シ
ステムにおいて、種培養または小培養管から開始して実施され得る。このようなシステム
における細胞の初期培養の間に、培養培地を、発酵槽充填物を1日あたり3回までの割合
で交換することが有利であると証明されている。細胞は、2×10の細胞密度までこれ
らの条件下で増殖され得る。灌流速度の制御は、好ましくは、細胞数、グルタミン含有量
、グルコース含有量または乳酸塩含有量のような当業者に公知のパラメータによって、培
養の間に行われる。
【0045】
バッチシステムが使用される場合、約8×10〜25×10細胞/mLまでの細胞
密度は、37℃の温度および20〜30時間の生成時間で達成され得る。
【0046】
さらに、細胞は、感染の前に、供給バッチシステムにおいて、本発明に従って増殖され
得る。本発明の状況において、培養システムは、細胞が、バッチシステムにおいて初期に
培養され、そして培地中の栄養分(または栄養分の一部)の枯渇が、濃縮された栄養分の
制御された供給によって補われる供給バッチシステムとして参照される。供給バッチシス
テムにおいて、細胞は、約1×10〜10×10の細胞密度まで増殖され得る。
【0047】
感染前の細胞の増殖の間に、培地のpH値を、pH6.6〜pH7.8の間の値、そし
て特にpH7.2〜pH7.3の間の値に調節することが有利である点がまた証明されて
いる。
【0048】
感染前の細胞の培養は、好ましくは、30℃と40℃の間の温度、そして特に33℃と
37℃の間の温度で行われる。感染前の培養の間、酸素分圧は、好ましくは、25%と9
5%との間の値、そして特に35%と60%の間の値に調節される。本発明の状況におい
て記載される酸素分圧についての値は、空気中の飽和量に基づく。
【0049】
細胞の感染は、バッチシステムにおいては、好ましくは、約8×10〜25×10
細胞/mLの細胞密度で行うか、または灌流システムにおいては、好ましくは、約5×1
〜20×10細胞/mLの細胞密度で行うことが、本発明に従う方法に関して有利
であると証明されている。細胞は、10−8と10の間のウイルス投与量、好ましくは、
0.0001と0.5との間のウイルス投与量(MOI値、「感染多重度」;感染時にお
ける細胞あたりのウイルスユニットの数に対応する)で感染され得る。
【0050】
感染後の細胞の培養はまた、灌流システム、バッチシステムまたは供給バッチシステム
において行い得る。前記で使用された培養条件と同じ培養条件が、使用され得る(30℃
と40℃の間の温度、5%と100%との間の酸素分圧、pH6.6とpH7.8との間
の培地のpH値)。
【0051】
ウイルスまたはそれによって生成されたタンパク質の回収および単離を包含する方法は
また、本発明に従って利用可能となる。ウイルスまたはタンパク質の単離の間に、細胞は
、分離、ろ過または限外ろ過のような標準的な方法によって培養培地から分離される。次
いで、ウイルスまたはタンパク質は、勾配遠心分離、ろ過、沈殿、クロマトグラフィーな
どのような当業者に周知の方法に従って濃縮され、次いで、精製される。また、本発明に
従って、ウイルスは、精製中または精製後に不活性化されることが好ましい。ウイルスの
不活性化は、例えば、精製プロセス中の任意の時点で、β−プロピオラクトンまたはホル
ムアルデヒドによって行われ得る。
【0052】
本発明に従う方法は、薬物の生成に特に適しており、特に、ワクチン薬および診断薬の
生成に適している。
【0053】
薬物の生成は、ウイルスまたはそれによって産生されたタンパク質の増殖および単離、
ならびに、適当なアジュバント、補助剤、緩衝剤、希釈剤および/または薬物キャリアと
の混合を包含し得る。本発明の状況におけるアジュバントは、免疫応答を増強させる物質
を意味すると理解される。これらは、種々の金属の水酸化物(例えば、水酸化アルミニウ
ム)、細菌細胞壁の成分、オイルまたはサポニンを含む。ワクチンは、ウイルス感染の予
防処置または治療処置に特に適している。
【0054】
免疫原性および/または対応するワクチンの効能は、感染を負荷を伴う防御実験または
中和に必要な抗体力価の決定のような、当業者に公知の方法によって決定され得る。産生
されたウイルス量または抗体量の決定は、ウイルス力価測定、血球凝集試験、種々の型の
抗体決定またはタンパク質決定のような、当業者に周知の標準的な方法に従って、抗原の
力価または量の決定によって行われ得る。
【0055】
本発明に従う方法はまた、診断用組成物の生成に適している。組成物は、本発明の方法
から得られるウイルスまたは本発明の方法によって産生されるタンパク質を含み得る。先
行技術において一般的な添加物および検出剤との組み合わせにおいて、これらの組成物は
、ウイルス抗体またはアンチウイルス抗体の検出に適した診断試験として使用され得る。
【0056】
以下の実施例における全てのウイルス力価は、当業者に公知のSpearman−Ka
erberによる最終希釈法および統計的50%終沫点決定に従って決定した(Horz
inek,Compendium of General Virology,第2版、
1985,Parey Verlag,pp.22〜23を参照のこと)。8つの試験培
養物を、100μL量のウイルス希釈液でマイクロタイタープレートにおいて感染させ、
ここで、10−1〜10−8のウイルス物質の希釈を使用した。ウイルス力価測定の評価
を、試験培養物としての細胞変性効果によって顕微鏡的に、またはウイルス特異的抗体を
使用する免疫学的検出のいずれかによって行った。ウイルス特異的抗体の結合は、フルオ
レセイン標識された抗体を用いた免疫蛍光として可視化されるか、またはビオチン標識さ
れた二次的抗体およびストレプトアビジン/ビオチン/ペルオキシダーゼ増幅複合体、な
らびに沈殿可能な色素(Gregersenら、Med.Microbiol.Immu
nol.,177:91〜100)を使用して可視化される。ウイルス力価の単位は、培
養感染投与量50%(CID50)である。種々の型のウイルスに対して使用されるウイ
ルス特異的検出細胞および、適用可能であるならば、免疫学的検出法が、ウイルス特異的
な例において言及される。
【実施例】
【0057】
(実施例1:初期作業工程および研究室規模での懸濁系としての、細胞培養物系の取り
扱い)
液体窒素中に保存された種細胞由来のMDCK細胞を、水浴中での浸漬によって迅速に
解凍し、そして直後に、約1×10細胞/mLの細胞数で、培養培地(補充したUlt
ra CHO、BioWhittaker、標準培地)を用いて、一般に約1:100で
希釈した。次いで、これらの細胞を培地から分離し、再度の遠心分離(800Gで10分
間)によって新鮮な培養培地中にとり、そして攪拌培養ビン(100mLの作業容積、B
ellcoまたはTechne)中に注いだ。これらの培養物ロットを、磁気スターラー
を50〜60rpmで用いて37℃でインキュベートした。細胞増殖を、細胞数をチェッ
クすることによってモニタリングした。1.6×10細胞/mLの最大について、8×
10細胞/mLの細胞数に達したところで、この培養物を、新鮮な標準培地での細胞の
希釈によって移し、そして100〜1000mLの作業容積の新たな攪拌培養ビンに播種
し、そして最大の細胞密度または所望の細胞密度が上記のような攪拌の間に到達されるま
で、インキュベートした。これらの細胞継代において、最大の細胞数が、必要に応じて、
3〜5日間以内に達成されるように、1:4〜1:10の範囲で、対応する培養物の希釈
を細胞増殖の型に適合させた。あるいは、この型の細胞培養を、培地への補充物の添加な
しに試行し、そして少なくとも10継代にわたって、問題なく維持し得た。
【0058】
(実施例2:接着性培養物としての、細胞培養物系の取り扱い)
確立された懸濁培養物(実施例1を参照のこと)を、細胞数が約1×10細胞/mL
になるように、異なる培地で希釈し、次いで、種々の細胞培養容器に注いだ(表1を参照
のこと)。次いで、この細胞培養物容積を、対応する培養容器についての通常量(すなわ
ち、播種表面にわたって約4mmの培養培地、または培養物表面2.5cmについて約
1mLの培地)に対応させた。これらの培養物を、一般に、ほとんどの細胞培養物につい
て一般的な37℃の温度でインキュベートしたが、インキュベーション温度の有意な偏差
もまた、顕著な損失なしに可能であった(表1を参照のこと)。試験した培養物系、なら
びにこれらによって活性化される細胞増殖における結果は、表1に示され、これらの細胞
系が、種々の培地および培養物系において、ほぼ同じに、そして確実に挙動することを示
す。
【0059】
この方法で生成される単層培養物を、マイクロタイタープレート中でのウイルス収集物
の力価決定のため、および顕微鏡制御下でのウイルスの培養のために、または懸濁培養物
中よりも接着性単層培養物中でより良好に実施され得る免疫蛍光調査、血球吸着試験およ
び他のウイルス学的な標準方法もしくは免疫学的な標準方法のために、使用した。さらに
、このような培養物は、プラーク精製または希釈によって、純粋なウイルス株を回収する
ために、特に適切であった。最後に、接着性培養物をまた、小規模および大規模(ローラ
ービンでは、好ましくはより多い量)でのウイルス増殖のために使用した。
【0060】
(表1.種々の接着性培養物系における細胞増殖)
【0061】
【表1】


BME:基本培地イーグル;炭酸水素塩補充(5%ストック溶液の2〜2.5%)
MEM:最小必須培地;炭酸水素塩補充(5%ストック溶液の2〜2.5%)
EDM:ダルベッコ改変イーグル培地;炭酸水素塩補充(5%ストック溶液の2〜2.5
%)
FCS:胎仔ウシ血清
Supp.:Ultra CHO補充
#:調節した値;+2℃および−3℃の偏差を有する、実際に測定した値
*:製造業者:Bio−Whittaker
(実施例3:ウイルスの単離、回収、および種ウイルス調製物の生成)
初代単離体(ウイルス含有器官、組織または組織流体サンプル、咽喉スワブまたは便サ
ンプルなど)を、標準的な培地(任意の他の培地またはリン酸緩衝液も同様に可能である
)中で、氷浴中にて懸濁し、抗生物質(PSN:100U/mLのペニシリン、100μ
g/mLのストレプトマイシン、50μg/mLのネオマイシン)を添加し、必要に応じ
てホモジェナイズした(乳鉢、外科用メスの刃、あるいはいわゆるDouncerホモジ
ェナイザーまたはPotterホモジェナイザーで微細に破砕した)。得られた懸濁物を
、0.45μm(より小さい被覆を有さないウイルスの単離については、0.2μmも)
の細孔サイズを有する通常の実験室シリンジフィルタアダプタを用いて濾過した。濾液を
、新鮮な培養培地を含む小さい培養フラスコ(25cm、実施例2を参照のこと)中に
接種した。収率を増大させるために、100μL〜1mLの接種材料と共に提供し、次い
で37℃でインキュベートした。上部気道からのウイルスの単離のために、33℃のより
低いインキュベーション温度にて、さらなる培養物を調製することが推奨される。
【0062】
培養物中ですでに増殖した純粋なウイルス単離体を、実施例1または2に従って、本発
明に従う培養物系における直接的な感染のために使用した。しかし、より高いウイルス含
量のウイルス調製物が本明細書中で想定され得たので、100μL以下のより小さい接種
材料量を、一般に使用した。0.1および0.01のMOI(感染多重度)が、本発明に
従う培養物系におけるこのような第一の感染のために好んだ;10のファクターだけ減少
させる工程における10から0.0001までのMOIを用いた感染を、結果が不満足の
場合に、反復した。
【0063】
次いで、感染培養物をウイルス関連細胞損傷(CPE、細胞変性効果)について顕微鏡
で毎日試験し、そしてコントロール培養物と比較した。CPEを引き起こさないウイルス
における代替として、この培養物を、特定のウイルス抗原またはその遺伝子の存在につい
て試験した(例えば、ウイルスの型に依存する特定のHA試験;ELISA、PCR)。
3〜4日後、または陽性の知見(細胞の収縮、細胞死、接着性培地中の細胞層(lawn
)の円形化(rounding)および解離、プラーク形成)の後、無細胞遠心分離培養
物上清をサンプルとして凍結し、そして他方で、陰性または疑わしい知見の場合、培養物
全体を、1×10細胞の細胞数まで、新鮮な培地で調節し(懸濁培地の希釈、または接
着性培養物のトリプシン処理および引き続く個々の細胞の希釈)、そしてさらにインキュ
ベートして新たな培養物へと分配した。これは、1:4〜1:20の培養物の希釈まで、
ほとんどの培地において一致して、培養物の数の対数増殖を回避したので、第二のこのよ
うな培養物継代の後に、少なくとも可能な培養物の一部だけを、さらに維持した。3〜4
継代後、ウイルス単離体を、適切なウイルス含有出発物質から、首尾よく単離および検出
し得た。
【0064】
ほとんどのウイルス型について、出発物質のウイルス含量および品質に依存して、ウイ
ルス関連CPEが、インキュベーションの2〜7日後に見出された(ウイルス特異的な実
施例も参照のこと)。しかし、いくつかのウイルスは、非常にゆっくりと増殖するか、ま
たはCPEを示さず、従って、延長した継代およびインキュベーション時間または特定の
試験(必要な方法は、特定のウイルス実施例の下に列挙する)によって、検出されるはず
である。特別な検出系もまた必要とする、ゆっくりとした増殖を有する、CPEを有さな
いウイルスについての例として、A型肝炎ウイルスの特定の例が言及される。対応する血
清が使用される場合に、他のウイルス、特に、特定のCPEを有さないウイルスの検出に
適切な、記載された検出試験もまた存在する。
【0065】
具体的には、新たに単離されたウイルスは、3倍のプラーク精製、またはいわゆる限界
希釈技術による、純粋な単離体の調製の後にのみ、使用されるべきである。このために必
要な方法は、先行技術に従う専門教科書から取られ得る(例えば、B.W.Mahy:V
irology−A practical approach;IRL Press、O
xford、1985を参照のこと)。
【0066】
適切なウイルス調製物が、初代単離体から入手可能であるかまたは確立された株として
入手可能である場合、これらを、生成目的のための同種の種ウイルスを回収するために、
攪拌培養物の感染のために使用する。本発明の目的を本発明者らが限定することなく、第
一の感染は、10〜0.00001、好ましくは0.1〜0.0001のMOIを有する
100mLの培養培地を用いた、小さい攪拌培養物で、最初に推奨される。より迅速かつ
より高いウイルス値または収率を達成するために最も好ましい条件(特に、MOIおよび
回収時間に関して)を、規定された生成規模および生成試行の数に従って、さらなるウイ
ルス継代において、必要なサイズの培養物系で種ウイルスを生成するために、選択した。
達成されるウイルス収率および規定された生成時間に依存して、この種ウイルス継代につ
いての規模は、いくつかの攪拌培養物〜1000mLの規模〜小さい発酵槽〜ほぼ10L
以上の容積までであり得る。回収したウイルスを、濾過または遠心分離によって、任意の
細胞残留物を除去し、そして生成および可能な場合−70℃未満の温度での保存のために
適切な少量へと、分割した。
【0067】
(実施例4:生成目的のための、接着性マイクロキャリア培養物としての系の取り扱い

接着性MDCK細胞の培養を、実施例2、表1に従って、BME+3%胎仔ウシ血清(
FCS)を用いて、ローラービン中で実施した。この系における培養後、細胞を、ローラ
ービンの表面から分離した。これは、当業者に公知の通常の方法を用いて、適切なトリプ
シン溶液を用いて、酵素的に実施した。代替として、実施例1に従って、懸濁細胞を、攪
拌培養物中で培養し、そしてマイクロキャリアを被覆するために直接使用した。
【0068】
生成発酵槽を、Cytodex 3型のマイクロキャリア(Pharmacia)で満
たした。このマイクロキャリア(単位体積当たりの重量5g/L)をオートクレーブし、
そして栄養培地で馴化した。この方法は、マイクロキャリアの表面への細胞の接着を保証
した。この様式で回収した細胞を、細胞密度が1×10細胞/mLになるように、生成
系に移した。細胞は、マイクロキャリアに接着し、そしてコンフルエンスになるまで、ま
たは3×10細胞/mLの細胞密度に達するまで、培養した。
【0069】
細胞培養期の後、存在する栄養培地を、新たな栄養培地で置換した。この目的のために
、タンパク質を含まない栄養培地を使用した。2回の洗浄サイクルを行った。洗浄サイク
ルは、攪拌器の停止、マイクロキャリアの設置、消費された栄養培地の除去、新たな栄養
培地の添加、およびマイクロキャリアの再懸濁からなった。洗浄工程の後、細胞培養物を
、トリプシン(2.5mg/L)と混合した。
【0070】
種ウイルスを用いた細胞培養物の感染を、次いで実施した。この種ウイルスを、実施例
3に従って獲得および使用した。次いで、MOIは、ウイルス特異的であり、そして0.
1と0.000001との間、好ましくは0.01と0.001との間にのぼった。一方
、感染期の終了後、その時間は、特定のウイルス(特定の実施例を参照のこと)によって
決定され、そして他方、選択されたMOIによっても決定され、攪拌器を停止させ、そし
てマイクロキャリアを堆積させた。ウイルス含有上清を取り出し、そして細胞残渣から、
適切な分離方法によって精製した。細胞分離のために、当業者に公知の通常の遠心分離ま
たは分離器、フィルタおよびクロスフロー濾過単位を、使用した。
【0071】
(実施例5:無血清培地を使用する、1000L規模での生成容積までの、懸濁培養物
としての系の取り扱い)
1000Lの生成容積についての懸濁培養物の培養を、1000mLの培養容積までの
小規模で、攪拌ビン(Techne Co.)を用いて実施した(実施例1を参照のこと
)。攪拌器中の細胞密度は、1×10細胞/mLであった。これらの細胞を、バッチプ
ロセスで培養し、そして1:10の比で新鮮な培地に単に希釈することによって、1×1
細胞/mLの細胞密度で移した。無血清培地(Ultra CHO、BioWhit
taker)を細胞培養のための培地として使用した。攪拌発酵器(1分当たり30回の
攪拌器回転数)の10Lの容積から、持続的な空気混和(alration)および温度
制御(細胞培養物について制御温度37℃)、pH値(制御範囲7.1〜7.3)、およ
び酸素分圧(45%〜55%のpO)を使用した(技術的詳細は表2中)。スケールア
ップ容積は、1:10の転移比(transfer ratio)に従って、10L、1
00L、1000Lであった。発酵器が1×10細胞/mLの最終細胞密度に、1×1
細胞/mLの開始細胞密度にて、3〜4日の時間で到達した。1000Lの規模で、
流加培養(fed−batch)を、細胞密度を3×10細胞/mLまで増大させるた
めに、グルコース溶液(100〜200g/L)を用いてさらに実施した。達成された細
胞収率を、表2に比較して示す。
【0072】
(実施例6:化学的に規定された培地を用いる、1000Lの容積までの生成容積につ
いての懸濁培地としての、この系の取り扱い)
1000Lの生成容積についての懸濁培養物の培養を、実施例5に記載されるように実
施した。他方、化学的に規定された培地(ProCHO4CDM)を、細胞培養のための
代替として使用した。この培地中での適合のために、3〜5継代を実施することが有利で
あることを証明した。達成された細胞収率を、表2において比較する。
【0073】
(実施例7:タンパク質を含まない培地を使用する、1000L規模についての生成容
積までの、懸濁培養物としてのこの系の取り扱い)
1000Lの生成容積についての懸濁培養物の培養を、実施例5に記載されるように実
施した。タンパク質を含まない培地(SMIF7、Life Technologies
)を、細胞培養のための培地として使用した。この培地中での適合のために、5〜10継
代を行うことが有利であることを証明した。達成された細胞収率を、表2において比較す
る。
【0074】
(表2.種々の方法および培地を使用する、発酵器中での生成規模についての細胞(M
DCK33016)の培養)
【0075】
【表2】


:開始細胞密度
:最終細胞密度
N/T/pO/pH:攪拌速度、温度、酸素分圧、pH値。
【0076】
(実施例8:無血清培地での発現期における系操作)
実施例5に従って、発現スケールまで懸濁培地を培養した後、細胞を、等容積の3つの
発酵槽(3×1000L)に分配し、新鮮な培地で満たした。各発酵槽は、1/3容積の
前培養液および2/3容積の新鮮な培地を受容した。培養期と同じ培地を使用した(Ul
traCHO,BioWhittaker)。充填の後、細胞培養液を、10mg/Lの
トリプシンと混合した。次いで、種ウイルス(インフルエンザB/Harbin/7/9
4)での細胞培養液の感染を、0.001のMOIで生じ、さらに、細胞培養中と同じ発
酵条件下であるが、33℃で96時間を超えて、インキュベーションした。次いで、細胞
含有上清を取り除き、次いで、細胞を、分離機で分離した。さらなる濾過工程を、0.4
5μmの孔径のカートリッジフィルタを通して生じ、さらに微小な粒子を分離した。
【0077】
ウイルス採取物を、0.5%ニワトリ赤血球を用いたHA試験における標準的方法で、
接着性MDCK細胞におけるウイルス滴定によって、ウイルス含量について試験した。測
定されたHA含量は、1024Uであり、ウイルス力価は、108.2CID50/ml
であった。
【0078】
(実施例9:化学的に規定された培地での発現期における系の操作)
発現細胞の調製を、実施例8に記載されるように生じた。しかし、化学的に規定された
培地(ProCHO4CDM,BioWhittaker)を、新鮮な培地として使用し
た。充填後、細胞培養液を、2.5mg/Lのトリプシンと混合した。続いての感染を、
実施例8に記載されるように実施した。
【0079】
測定されたHA含量は、1024Uであり、ウイルス力価は、107.5CID50
mlであった。
【0080】
(実施例10:無タンパク質培地での発現期における系の操作)
発現細胞の調製は、実施例8に記載されるように生じた。しかし、無タンパク質培地(
SMIF7,Life Technologies)を、新鮮な培地として使用した。充
填後、細胞培養液を、2.5mg/Lのトリプシンと混合した。
【0081】
続いての感染を、実施例8に記載されるように実施した。測定されたHA含量は、10
24Uであり、ウイルス力価は、107.9CID50/mlであった。
【0082】
(実施例11:化学的に規定された培地での培養および感染)
細胞の培養を、実施例6に記載されるように生じ、感染を実施例9に記載されるように
生じた。従って、培養から感染の採取への全細胞培養物は、化学的に規定された培地中で
生じた。
【0083】
(実施例12:化学的に規定された培地での培養および無タンパク質培地中での感染)
細胞の培養は、実施例6に記載されるように化学的に規定された培地中で生じ、感染は
、実施例10に記載されるように無タンパク質培地中で生じた。
【0084】
(実施例13:無タンパク質培地中での培養および感染)
細胞の培養は、実施例7に記載されるように生じ、感染は、実施例10に記載されるよ
うに生じた。培養から感染の採取までの全細胞培養物は、無タンパク質培地中で生じた。
【0085】
(実施例14:ウイルス精製の一般的な記載)
ウイルス増殖期の終了後、細胞培養物の採取を0.45または0.5μmの孔径を有す
るディープベッドフィルタ(Tiefenfilters)を通して濾過し、細胞および
細胞フラグメントを分離した。代替として、この分離を、分離機を用いて実施した。浄化
された採取物に含まれるウイルスを、濃縮し、必要に応じて限外濾過によって精製し、こ
こで、50,000と1,000,000との間(好ましくは、100,000〜500
,000)の排除限界を有する膜を使用した。得られたウイルス濃縮物を、CS(Cel
lufine Sulfate,Millipore)を充填したクロマトグラフィーカ
ラム上にロードした。緩衝液での洗浄による夾雑物の除去後、このウイルスを、0.3〜
3MのNaCl溶液で溶出した。溶出物を、限外濾過で脱塩し、さらに濃縮した。クロマ
トグラフィー精製の代替として、またはクロマトグラフィー精製と組み合わせて、さらな
る精製効果を、限外濾過によって達成し得た。ほとんどのウイルスをまた、スクロース勾
配中の超遠心分離によるこれらの浮遊密度に従って精製し得、続いて、この勾配によって
分画した。ホルムアルデヒドまたはβ−プロピオラクトンでウイルス不活性化を、精製プ
ロセス内の任意の点で実施し得るが、好ましくは、濃縮または精製後に使用する。なぜな
ら、この容積は、不活性化され、次いで、既に実質的に減少されるからである。
【0086】
(実施例15:ワクチンの処方のための不活性化ウイルス調製物の回収)
フラビウイルス(Central European encelphalitis
virus、K23株)を、実施例5、6および7に従って、0.2MOIの播種量(詳
細は、実施例22を参照のこと)で異なる培地中で培養した。
【0087】
採取されたウイルス含有培養培地を、遠心分離によって存在する任意の細胞残存物を除
去し、0.45μmの孔径を有するフィルタを用いて濾過した。安全性のために、濾過後
に、1:2000または1:2500の希釈度でβ−プロピオラクトンを添加し、そして
2〜8℃で24時間インキュベーションすることによって、この物質を、既に不活性化し
た。37℃での不活性化剤の加水分解の2時間後の不活性化された調製物の細胞培養試験
は、0.03感染単位/mL未満の検出限界まで活性なウイルスが存在しないことを示し
た。
【0088】
続いて記載される精製工程の分析について、BCA[ビシンコニン酸(bicinch
oninic acid)]アッセイ(Pierce)を、使用して総タンパク質含量を
決定した。特定の抗原含量を、サンドイッチELISAを用いて、E−糖タンパク質に対
する特定のモノクローナル抗体を使用して決定し(Niedrigら、1994,Act
a Virologica 38:141−149)、内部ポリクローナル抗血清を、ウ
サギから精製されたウイルスに対して産生した。次いで、不活性化された開始物質に対す
る値を、参照値(100%に対応)として使用した。
【0089】
(勾配遠心分離による精製:)
不活性化された細胞調製物を、公知の方法に従って、80,000Gでの密度勾配超遠
心分離(15〜60%スクロース)によって精製した。次いで、勾配を分画し、画分のサ
ンプルにおける、280nmの吸光度を決定し、ウイルスのピークを同定した。吸光度の
急激な上昇を、30%と40%との間のスクロース濃度の領域に見出し、そして、最大値
は、34%および35%であった。この領域から、特定のウイルスタンパク質の最大含量
および最大純度(ウイルスタンパク質の全タンパク質に対する比として決定される)をま
た、測定した。全体的に、開始物質中に測定された50%より多くの特定の抗原含量が、
これらのピーク画分に回収された。
【0090】
(クロマトグラフィー精製:)
不活性化されたウイルス調製物(上記を参照のこと)を、あらかじめ、5カラム容量の
50mMリン酸緩衝液(pH7.5)で平衡化した、CSカラムに適用した。次いで、こ
のカラムを、結合しない材料を除去するために、10カラム容積のリン酸緩衝液で洗浄し
た。次いで、結合した材料を、連続的に3M NaClを添加した漸増量の同じ緩衝液と
混合された、同じリン酸緩衝液で溶出した。3.2%と3.9%との間の特定の抗原およ
び79〜83%の全タンパク質を、ウイルス物質の適用の間、流れ中に分析的に回収した
。洗浄緩衝液において、6〜11%の全タンパク質および0〜2.3%の抗原を見出した
。従って、95%を超える抗原を、カラム物質に結合する。0.6〜1.8MのNaCl
での溶出の間、約60.0%の抗原を回収し、最大純度を、1.2M NaClの溶出の
間達成した。3M NaClまでのより高い塩濃度は、さらに、少量(<15%)のより
小さい比純度を有する抗原を溶出した。
【0091】
(クロマトグラフィーと超遠心との組み合わせによる精製:)
0.6および1.2MのNaClの溶出後の合わせた溶出物を、上記のようにクロマト
グラフィー精製から80,000Gで2.5時間、超遠心分離に供した。ウイルスペレッ
トを、50mM リン酸緩衝液(pH7.5)に再懸濁し、そして分析した。この調製物
の全タンパク質濃度を、初期含量の0.7%まで減少し、純度を、この工程によって10
倍増加した。
【0092】
このウイルス調製物を、上記のように勾配精製に供した。直接勾配精製の後に達成され
るように、分画後、非常に類似した勾配プロフィールを見出した。しかし、ウイルスピー
クの先端は、わずかにシフトし、ここでそれは、37%スクロースであった。
【0093】
(実施例16:ヒトヘルペスウイルスのウイルス単離物の回収およびウイルス増殖)
ツベルクリンシリンジでの水疱段階(陰唇ヘルペス水疱)における新鮮なヘルペス風解
の滅菌穿刺によって、最少量の組織液を得、実施例3に従って抗生物質を添加した標準培
地中に懸濁し、そして0.45μmの孔径を有するフィルタを使用して濾過した。濾過物
を、標準培地中の接着性MDCK33016細胞で、25cmの培養表面を有する培養
フラスコ中に播種し、37℃で培養した。4日後に上清のサンプルを取り、7日後に、培
養物の全上清を取り、−70℃未満で凍結した。4日後に取られたサンプルを、1:10
に希釈し、次いで、10μg/mLトリプシンを含む標準培地中の10の工程において;
100μLのこれらの希釈物を、標準培地中のMDCK33016細胞に導入した。37
℃でのインキュベーションの13日後、CPEを、第1の希釈工程のわずかな培養物中に
見出した。これらの培養物の上清を採取し、再度希釈し、そして新規の培養液に播種した
。6〜9日後、漸増的な、より異なるCPEを、代表的なヘルペスウイルスプラークとし
て、この第3ウイルス継代の種々の希釈工程において見出した。175cmの培養表面
での同じ開始物質と平行の直接感染培養物はまた、排他的に同じ代表的なプラークを示し
た。ウイルスのさらなるクローニングのために、希釈プロセスを繰り返し、ここで、最後
のポジティブな希釈物の細胞培養物中の上清を使用した。細胞培養物の採取に加えて、残
存細胞を、3%ホルムアルデヒド溶液で16時間固定し、次いで、1% Triton
X−100で30分間インキュベートし、次いで、特定の、HSV−1に対するFITC
標識モノクローナル抗体(Biosoft 製品番号17−088)を用いて、標準的な
方法に従って、免疫蛍光調査に供した。プラークの近傍の細胞のみが免疫蛍光を有するこ
とを見出した。この実証および特定のPCRの実証によって、単離物は、単純疱疹ウイル
スIとして明確に同定した。
【0094】
クローン化したウイルスを、さらに、懸濁培養物中の標準培地中で増加し、実施例3に
記載されるような十分なウイルス力価(>10感染単位/mL)で、種ウイルス産生に
使用した。種ウイルス調製物は、10CID50/mLと10CID50/mLとの
間のウイルス力価を規則的に含んだ。ウイルス力価の決定は、HEP−2またはVero
細胞の当業者に公知である標準的な方法に従って生じたが、接着性MDCK細胞において
もまた生じ得、ここで、力価の評価は、代表的なプラークを参照して実施される。種ウイ
ルス調製物を、−70℃でアリコート化するか、またはそれ未満で凍結され、発現細胞の
感染のために使用した。後の発現のために、同じMDCK細胞ならびに培地および添加物
が同じ培養条件を使用する可能性は、重要な利点である。なぜなら、対応する生成物の記
録の間の文書化の必要性が、有意に減少し、種ウイルスの受容性が改善されるからである

【0095】
(実施例17:ヒトヘルペスウイルスの産生)
実施例8〜13に従う単純疱疹ウイルス1(前記実施例に記載される単離物)を用いる
発現細胞の感染について、0.1または0.01のMOIおよび採取後48〜96時間の
インキュベーション時間を選択する。しかし、より長いインキュベーション時間またはよ
り短いインキュベーション時間に対応して、より低いMOIまたはより高いMOIがまた
使用され得、ここで収率は、いくらか変化する。なぜなら、最適な採取時間は、いつも見
いだされないからである。しかし、通常、前述の条件が、好ましく、その結果、経済的な
理由のために続いてのワークアップの容易さのために培養収率は、10の50%培養物
感染単位/mL(CID50/mL)未満には有意に見出されない。このこと以上に、こ
の時間スキームは、正常な仕事のリズムに好ましく適合され得る。0.0001未満の過
度に低いMOIおよび延ばされたインキュベーション時間は、ほとんどいつも、より低い
収率をもたらし、従って、最適下限である。
【0096】
(実施例18:フラビウイルスの増幅)
1〜1.5×10細胞/mLの細胞密度を有するMDCK33016の細胞の懸濁細
胞培養液を、標準条件(標準培地、37℃の培養温度および感染温度)下で、Centr
al European encephalitis virus(K23株、Nied
rigら、1994,Acta Virologica 38:141−149)で感染
した。以前の実施例から外れて、強く変化するMOIを感染のために使用した。さらに、
感染培養物を、化学的に規定された培地中に一部維持したか、またはタンパク質含有添加
物を有さない培地中に一部維持した。異なる培養物および採取方法を使用し、これは、種
々のパラメーターが変化される場合でさえ、高い収率が、この系を用いて達成され得、さ
らに複数の採取が可能であることを示す。これらの変化は、表3に要約される。ウイルス
滴定をA549細胞(ECACC第86012804)において生じ、そしてCPEを参
照して5日後に評価した。同じ培養物の繰り返しの採取が、培養培地の交換によって達成
され、その結果、各採取の間、細胞に新規の培地を供給し、従って、さらに増殖されると
いう事実は、注目に値する。これらの採取なしに、培養物は、より長い期間にわたって、
生存せずそして生産的のままではない。短い間隔での頻繁な培地交換は、培養物の高い代
謝生産を補償しないので、さらなる培地の補充および培養物の増加が、感染時間の4また
は5日後に生じた。
【0097】
(表3.種々のMOIを使用する標準培地および代替培地中でのCEEウイルス/MD
CK 33016培養液中のK23の増殖ならびに改変体の回収)
【0098】
【表3】


(M+30)は、示された日の培養液体積の+30%の培地の補充を意味する。
【0099】
(実施例19:ピコルナウイルスの増殖)
接着性MDCK 33016培養物を、5%ウシ胎児血清および重炭酸塩を添加したM
EM培地中で、A型肝炎ウイルス(HAV、HM175株、ATCC VR−1358)
での感染のために培養した(実施例2を参照のこと)。この実験の文脈において、さらな
る「Munich」ウイルス単離物を、使用した(Frosnerら、1979、Inf
ection 7:303−305)。希釈ウイルスを、新たに調製された培養液に播種
し、培養液を37℃でインキュベートした。培養液を、3〜4日の交互回転中で、1:4
のさらなる継代に供した。
【0100】
MDCK 33016の懸濁培養物を、実施例1に従う標準培養液中で培養し、HM1
75を播種し、33℃でインキュベートし、次いで、毎週1:10の継代に供した。懸濁
培養液中の接着細胞を、感染後35日間までさらに維持した。次いで、活性なウイルス複
製の検出は、CPE(株HM175)によってか、または既に記載された方法(Greg
ersenら、1988;Med.Microbiol.Immunol.177:91
−100におけるVirus titration、第93頁を参照のこと)に従って生
じた。精製されたIgGとしてのヒト抗HAV抗体(名称F86012、Dade Be
hringによって親切に供給された)を、異常物としてのウイルス特異的抗体として使
用した。製品番号39015(Sigma Co.)を、ビオチン標識を有する抗ヒトI
gG抗体として使用した。この系を用いる活性なウイルス増殖の特異的検知によって、顕
微鏡において低倍率で容易に認識される茶色がかったピンク色の細胞が得られる。他方、
ウイルス陰性細胞は、無色に見えるかまたはほんのわずかな色を有する。調製3週間後に
おけるウイルス滴定はまた、同じ検出法で評価され、この方法のために、ヒト二倍体細胞
(MRC−5)を、培養系として使用した。
【0101】
上記の感染ロットの全てにおいて、そして使用される両方のウイルス単離物で、活性な
HAV複製は、MDCK細胞において検出され得る。驚くべき迅速なウイルス増殖を、懸
濁培養液中のHM175株で検出した。感染後7日目に、上清中で測定されたウイルス力
価は、105.4CID50/mLであった;この培養物を、毎週、単純な希釈によって
1:10の継代に供し、7日後に得られた培養物において同様のウイルス力価を得た。培
養の最後および2回のさらなる細胞継代の後に、無細胞培地の1つのサンプル中のウイル
ス力価を決定した。全培養物のサンプルをまた取り、その中に含まれる細胞を、−20℃
での2回の凍結によって破砕し、そして解凍した。細胞成分を、遠心分離によって除去し
、その後、サンプルを滴定した。このロットから得られたウイルス収量は、表4に要約さ
れ、このウイルス収量は、特定の収量に対する有害な効果なしに、毎週10倍の培養物の
増殖が可能であり、ここで、体積単位当たりの良好なウイルス力価が、かなりの量の増加
に関わらず、回収され得る。従って、有意な割合のウイルスが上清中に見出され得、この
ことはまた、この強力な細胞結合ウイルスに対して驚くべきことである(表4を参照のこ
と)。
【0102】
(表4.連続的増殖および培養液量の増加に対するMDCK 33016懸濁培養液中
のA型肝炎ウイルス(HM175株)の増殖)
【0103】
【表4】


n.d.決定されず
(実施例20:ラブドウイルスの増殖)
細胞培養フラスコにおいて、実施例1に従う標準培地中の懸濁培養物を、培地1mL当
たり1×10細胞の細胞密度で播種した。培養物の増殖の後、2つの培養物を、0.0
1のMOIを有する狂犬病ウイルス(Pitman−Moore株、ワクチンウイルス株
)で感染し、1つの培養物を、0.001のMOIを有する狂犬病ウイルスで感染した。
これらの培養物を37℃でインキュベートし、4日ごとまたは3日ごとにトリプシンを用
いて解離し、そして1:10比(4日後)または1:8比(3日後)で継代に供し、この
方法で18日間維持した(表5を参照のこと)。感染の成功を、各継代で追跡した。培養
物に、3.5%のホルマリン溶液を提供し、この溶液中で、室温で3日間インキュベート
し、ウイルスの不活性化を達成した。ホルマリン溶液の除去後、培養物をPBSで洗浄し
、PBS中の1%Triton X100と共に、室温で25分間インキュベーションし
た。溶液の除去後、この培養物を、PBSで3回洗浄し、狂犬病ウイルスに対するFIT
C標識抗体(50μL 1:400希釈狂犬病抗体IgG FITC、Dade Beh
ring,OSHY 005)を適用した。37℃での90分のインキュベーション後、
この培養物を、PBSで再び洗浄し、そしてこの培養物を、倒立蛍光顕微鏡下で評価した

【0104】
代替として、培養上清のウイルス滴定を、MRC−5細胞における標準的方法に従って
実施し、この培養上清をまた、ホルマリン/Triton前処理の後、上記のような免疫
蛍光によって評価した。この系で達成されるウイルス力価によって、対応する生成法にお
いての収量に対する大まかな補正を、認定されたヒトワクチン(Rabivac)に対す
るMRC−5培養物を使用して実施し、このワクチンは、どれだけの量のワクチン抗原が
、1mL当たりの培養収集物に含まれるかについての方向付けを可能にする(表5を参照
のこと)。
【0105】
ほんの4日後、両方のロット(MOI0.01および0.001)が、ポジティブな結
果を示し、次いで同様の感染経路を示したが、低いMOIで、感染経路(11日目まで、
約1.2〜0.5logCID50までのより低いウイルス力価において認識され得る)
は、わずかに遅らされた。11日目の培養物の第3の継代から、初期細胞破砕に伴う非常
に強い特定の免疫蛍光が全ての培養物において見出され、次いで、ほとんどの細胞が、1
8日目の第5継代によって完全に破砕され、感染が終了するまで、この免疫蛍光は、さら
に増加した。特定のウイルス含量は、14日目まで連続的に増加し、次いで、細胞破砕の
増加の結果として再び減少する。この感染経路の結果は、以下の表において要約され、そ
して(狂犬病ウイルスの公知の遅いウイルス増殖において測定される)調節されない非常
に迅速なウイルス増殖が、これらの細胞において予測され、ここで良好な抗原収量が、規
則的な間隔で繰り返し、細胞が継続的に再増殖するにも関わらず、回収され得る。
【0106】
(表5.培養体積の連続的増加の間のMDCK 33016培養液中の狂犬病ウイルス
の増殖)
【0107】
【表5】


類似する様式で、同じウイルスを、実施例1に従う懸濁培養液中に直接播種し、ここで
、0.0001のMOIを、さらに使用する。標準培地を、全感染経路について再び独占
的に使用し、培養物をまた、1:8または1:10で1週間に2回移した。移動は、細胞
の新鮮な培地中への単純な希釈および新たな播種によってのみ生じた。ここで、感染の成
功を、上記のように、MRC−5細胞中でのウイルス力価滴定のみを参照して追跡した。
3つ全てのMOIでのほんの4日後の感染は、培養上清におけるポジティブなウイルス力
価を生じた。ウイルス力価は、継代の間の7日目の後の最初の希釈損失の後、指数関数的
希釈が再び継続的に実施されたにも関わらず、上昇したが、懸濁培養液中での大量の細胞
破砕物をもたらさなかった。感染を、第8継代(感染後、28日目)まで追跡し、次いで
、中断した。
【0108】
これらの感染由来のウイルスサンプルを、種ウイルスとして凍結し、100mLから始
められる懸濁培養液の新規の感染のために使用され、標準培地において、そして上記され
る同じ継代条件下で使用された。この場合、MOIは、0.000025まで減少される
。感染を、6細胞継代(21日)にわたって維持した。転換され、培養上清1mL当たり
約0.3ワクチン用量を与えるウイルス力価は、かなりの継代希釈に関わらず、この感染
経路の終わりに、ゆっくりとウイルス力価を上昇することによって測定される。ほんの一
部ではなく全培養体積がさらなる継代に供される場合、培養液の約500Lは、6回の継
代後、回収され得、これは、約150,000ワクチン用量に対応するウイルス収量であ
る。
【0109】
(実施例21:パラミクソウイルスの増殖)
パラミクソウイルスの代表として、ATCC VR−288株を使用した。第3日目を
、回収時間として選択した。なぜなら、ウイルス複製が非常に迅速であるからである。M
DCK 33016細胞はまた、血清もタンパク質も有さないが、重炭酸塩を添加したM
EM培地中でのより効率的なウイルス複製を伴うパラミクソウイルスについての非常に適
切な滴定系として示された。
【0110】
評価および滴定は、5日後に生じた。37℃での感染後にさらにインキュベーションさ
れた培養物は、107.4CID50/mLを生じた;感染温度が感染時点から33℃ま
で低下された場合、同じ力価が測定された。
【0111】
このウイルスを用いた、接着性培養物と懸濁培養物との間の直接の比較を、実施した。
接着系における最大収率は、感染時の96時間後で106.6CID50/mLあり、懸
濁培養系は、72時間後に、比較的、より良好かつより迅速な収量を、107.3CID
50/mL生じた。
【0112】
代替として、実施例2に従う接着性MDCK 33016細胞を、同じファミリーの別
のウイルス(PI−3,ATCC VR−93)で、5%FCSを含むMEMで感染した
。37℃での1週間のインキュベーションの後、上清は、滴定後、CV−1細胞(ECA
CC 87032605)中に、少なくとも10CID50/mLを含み、モルモット
赤血球を用いてポジティブな赤血球凝集反応を示し、特定の抗体(Biosoft Co
.製の抗PI−3 MAb−FITC)でポジティブな免疫蛍光を示した。
【0113】
同じウイルス株(PI−3,ATCC VR−93)をまた、MDCK 33016培
地中での感染のために、実施例12と類似した様式での化学的に規定された培地および無
タンパク質培地下で使用した。感染3日目、5日目、9日目および12日目において、培
養体積の22%を除去し、そして新鮮な培地と入れ換えた。7日目において、細胞を含む
培養堆積の50%を除去し、新鮮な培地で置換する。感染の間の全培養体積を、1回より
多く完全に入れ換え、そして希釈に従って、培地の補充による、さらなる細胞の増殖のた
めの機会を提供した。使用された方法は、培養液の全部から大体1:2.4継代までに対
応し、ここでわずかな超過量を除去した。非常により高い培養液の継代または希釈は、特
に開始期において可能であり、ここではっきりと完全に使用されたわけではなかった。
【0114】
以下のウイルス収率を測定した。
感染日 : 3 5 7 9 12 14
logCID50/mL:7.9 8.05 8.25 7.45 6.7 7.0
(2連の試験からの平均値)
(実施例22:レオウイルスの増殖)
標準培地において、MDCK 33016細胞の懸濁培養物を、3型レオウイルス(B
io Doc,Hannoverから得た)を用いて0.01のMOIで感染し、そして
33℃または37℃で3日間または5日間さらにインキュベートした。培養上清のサンプ
ルを、5日後および7日後に取り、3% FCSを含むMEM培地中のBHK細胞を使用
して供給された系において滴定した。滴定の評価は、7日後に生じた。
【0115】
5日後の懸濁培養物のウイルス収量は、37℃で108.1CID50/mLであり、
33℃で108.0CID50/mLであった。7日後の、両温度ロットにおける滴定は
、108.0CID50/mLであった。
【0116】
同じウイルス株を、0.01のMOIでの感染のために、MDCK 33016培養物
中で、実施例12に類似した化学的に規定された培地および無タンパク質培地下で使用し
た。感染3日目、7日目、および10日目において、培養体積の22%を除去し、新鮮な
培地によって入れ換えた。7日目において、細胞を含む培養体積の50%を、除去し、新
鮮な培地で置換した。従って、感染の間の全培養体積を、ほぼ完全に交換し、希釈に従っ
て、培地補充によってさらに増幅するための機会を細胞に提供した。使用された方法は、
培養液の大体1:2継代に対応し、ここでわずかな超過量を除去した。非常により高い培
養液の継代または希釈は、特に開始期において可能であり、ここではっきりと完全に使用
されたわけではなかった。
【0117】
以下のウイルス収率を測定した。
感染日 : 3 7 10 14
logCID50/mL:5.4 7.1 6.6 6.6
(2連の試験からの平均値)
(実施例23:肺炎ウイルス属の増殖)
5%FCSおよび重炭酸塩の添加されたMEM培地中の接着性MDCK33016培養
物(実施例2を参照のこと)を、ヒトRSV−A(株A−2;ATCC VR−1302
)での感染のために使用した。このウイルスを、1:100に希釈し、そして新しく調製
した培地に播種し、次いでその培地を37℃でインキュベートした。1週間後、1mLの
培養上清を新しい培地に取替え、そして再び7日間インキュベートした。MA−104細
胞(ECACC 85102918)の、回収した培養上清は、CPEによる力価評価の
間に、105.5CID50/mLのウイルス力価を示す。
【0118】
MDCK−33016培養物において、ウイルス株A−2(ATCC VR−1302
)を、実施例12と類似した、化学的に規定されかつタンパク質を含まない培地での感染
のために使用した。感染の3日目、5日目、7日目、9日目および12日目に、培養物体
積の22%をとり、そして新鮮な培地と交換した。7日目に、細胞を含む培養物体積の5
0%を取り出し、そして新しい培地と交換した。全てにおいて、感染の間の培養物の体積
は、完全に一回より多く交換され、これらの細胞が希釈によってさらに増えるように培地
補充の機会を与えた。使用した方法は、培養物のおおよそ1:2.4の継代に全体的に一
致し、ここで、過剰な量だけを除去した。特に開始段階において可能性のある、有意に高
い培養物の継代または希釈は、ここでは十分に活用されなかった。
【0119】
以下のウイルス収量を測定した:
【0120】
【表6】


(二重の試験からの平均値)n.t.:試験していないサンプル、いくぶん非滅菌
ウイルス株RSV−B(ATCC VR−1401)を、同じロットにおいて試験した
。ウイルス力価測定のために、Hep−2細胞(亜株Hep−2C、Paul Ehrl
ich Institute(以前は、Frankfurtによって好意で提供された)
を使用した。なぜなら、代表的なウイルス合胞体は、力価測定により良く開発され、従っ
て評価が容易であるからである。
【0121】
以下のウイルス収量を測定した:
【0122】
【表7】


(二重の試験からの平均値)

【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の方法。

【公開番号】特開2010−246559(P2010−246559A)
【公開日】平成22年11月4日(2010.11.4)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2010−145663(P2010−145663)
【出願日】平成22年6月25日(2010.6.25)
【分割の表示】特願2003−527090(P2003−527090)の分割
【原出願日】平成14年9月11日(2002.9.11)
【出願人】(597125955)ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス ゲーエムベーハー アンド カンパニー カーゲー (17)
【Fターム(参考)】