説明

細胞外マトリックス成分に結合する修飾タンパク質

【課題】治療遺伝子を損傷、疾患、または移植された血管へターゲティング運搬すること。
【解決手段】壁を有するプロテオリポソームであって、該プロテオリポソームの壁が細胞外マトリックス成分に結合する結合領域を含有するターゲティングポリペプチドを有する、プロテオリポソーム;およびベクター粒子を細胞外マトリックス成分へターゲティングさせる為の修飾ウイルス表面蛋白質を有するベクター粒子であって、該ウイルス表面蛋白質は細胞外マトリックス成分に結合する結合領域を含有するターゲティングポリペプチドを含むように修飾されている、ベクター粒子。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
【数1−1】

【0002】
【数2−1】

【背景技術】
【0003】
【数2−2】

【0004】
【数3】

【0005】
【数4−1】

【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Miller,et al.,Human Gene Therapy,Vol.1,pgs5−14(1990)
【非特許文献2】Ledley et al.,Molecular Genetics and Gene Therapy of Cardiovascular Diseases,Mockrin,ed.,Marcel Dekker.,Inc.,New York.467−485
【非特許文献3】Nabel,Circulation,Vol.91,pgs541−548
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
【数4−2】

【0008】
【数5−1】

【0009】
本発明により、さらに、以下が提供される。
【0010】
【数51】

【0011】
【数52】

【0012】
【数53】

【0013】
【数54】

【図面の簡単な説明】
【0014】
本発明を以下の図面に関して記載する。
【図1A】図1Aは、同種指向性gp70蛋白質(配列番号1)の受容体結合領域の模式図であり、アミノ酸残基18及び19の間へのコラーゲン結合ドメインを含むポリペプチドの挿入が示されている。
【図1B】図1Bは、リンカーアミノ酸残基が結合したコラーゲン結合ポリペプチドを、同種指向性gp70蛋白質のN末端領域内のBstEIIユニーク部位に挿入する為のクローニング戦略及びエンベロープ構造の模式図である。
【図2A】図2Aは、表面(SU)及び膜貫通(TM)ポリペプチド、並びにシグナルペプチド、追加のコラーゲン結合ドメイン、膜スパニング及びRペプチド領域が特定されているモロニーマウス白血病ウイルスのエンベロープ蛋白質を示す模式図である。
【図2B】図2Bは、コラーゲン結合ドメインを含むキメラエンベロープ蛋白質の発現、精製、及び再生(renaturation)を表すSDS−PAGEを示す。
【図2C】図2Cは、コラーゲン被覆マイクロタイターウェルにおける再生した組換えキメラエンベロープ蛋白質の結合を示す。
【図3A】図3Aは、gp70エンベロープ蛋白質に対して陽性染色を示さない偽(mock)トランスフェクションされた(コントロール)GPL細胞を示す。
【図3B】図3Bは、CEE+でトランスフェクションされた、野生型gp70を発現するGPL細胞を示す。
【図3C】図3Cは、キメラECB−CEE+プラスミドDNAでトランスフェクションされたGPL細胞を示す。
【図3D】図3Dは、キメラECB−CEE+エンベロープ蛋白質と、野生型CEE+エンベロープ蛋白質との共移動(co-migration)、及び30kda領域におけるgag蛋白質の共移動を示すウエスタンブロットである。
【図3E】図3Eは、マイクロタイターウエル中のコラーゲンマトリックスに対するキメラウイルスの選択的結合を示す。
【図4A】図4Aは、キメラECB−CEE+エンベロープ蛋白質を保有するウイルスで形質導入された培養物におけるβ−ガラクトシダーゼに対する陽性染色を示す細胞培養プレート、及び野生型CEE+で形質導入された培養物及び形質導入されなかった培養物における陰性染色を示す細胞培養プレートである。
【図4B】図4Bは、キメラECB−CEE+エンベロープを保有するコラーゲン結合ベクターによる形質導入後にβ−ガラクトシダーゼを発現するNIH3T3細胞の高倍率での写真である。
【図4C】図4Cは、キメラECB−CEE+蛋白質を保有するウイルスの正常ヒト血清存在下での形質導入効率を示すグラフである。
【図5A】図5Aは、カテーテルで傷つけられたマウス大動脈の未処置セグメントを示す。
【図5B】図5Bは、図5Aに示したカテーテルで傷つけられたマウス大動脈のセグメント部分を高倍率で示したものである。
【図5C】図5Cは、キメラECB−CEE+エンベロープ蛋白質のマウス大動脈の傷つけられたセグメントに対する結合を示したものである。
【図5D】図5Dは、キメラECB−CEE+エンベロープ蛋白質がマウス大動脈の傷つけられていないセグメントに対しては結合しないことを示したものである。
【図5E】図5Eは、キメラECB−CEE+エンベロープ蛋白質の下大静脈の傷つけられたセグメントに対する結合を示したものである。
【図5F】図5Fは、ECB−CEE+ウイルスによる軟骨細胞へのインビボ形質導入を、新生マウス尾内へのベクター上清の注射後の核標的β−ガラクトシダーゼの発現によって示したものである。
【図6A】図6Aはバルーンカテーテルによる損傷の9日後で、ECB−CEE+ベクター上清(力価:8×10cfu/ml)点滴2日後の、ラットの左総頚動脈(縦方向に切開)のセグメントの全体像を示す。括弧でくくられた領域が血管損傷及びインビボ形質導入の実際の部位を示す。括弧でくくられた領域の右側の動脈セグメントは傷を受けていないが、同じベクターに暴露された。右頚動脈の短いセグメントが、未損傷、未処置コントロールとして右下に示されている。
【図6B】図6Bは、X−ガル染色した後にホルマリン固定したラットの損傷総頚動脈の縦方向断面を低倍率(10×)で示したものである。ブルー染色核を有する多くの細胞(矢印)が中膜の長さに沿って見られる。
【図6C】図6Cは、核標的β−ガラクトシダーゼ導入遺伝子を発現する平滑筋細胞を示す動脈壁セグメント(図6Bにおける括弧でくくられた領域)を高倍率で示す(矢印が顕著なブルー核を有する細胞を示している)。
【図7】図7は、レトロウイルスベクターCEE+、ECB−CEE+、CAE、ECB−CEE.CAEに感染、又は偽感染(コントロール)した293T細胞の細胞溶解物のウエスタンブロットである。
【図8A】図8は、レトロウイルスベクターCEE+、ECB−CEE+、CAE、ECB−CEE+.CAEに感染、又は偽感染(コントロール)した293T細胞の蛍光活性化セルソーター(FACS)による結果を示す。
【図8B】図8は、レトロウイルスベクターCEE+、ECB−CEE+、CAE、ECB−CEE+.CAEに感染、又は偽感染(コントロール)した293T細胞の蛍光活性化セルソーター(FACS)による結果を示す。
【図9A】図9は、レトロウイルスベクターCEE+、ECB−CEE+、CAE、ECB−CEE+CAEに感染、又は偽感染(コントロール)した293T細胞及びCH010細胞の蛍光活性化セルソーター(FACS)による結果を示す。
【図9B】図9は、レトロウイルスベクターCEE+、ECB−CEE+、CAE、ECB−CEE+CAEに感染、又は偽感染(コントロール)した293T細胞及びCH010細胞の蛍光活性化セルソーター(FACS)による結果を示す。
【図9C】図9は、レトロウイルスベクターCEE+、ECB−CEE+、CAE、ECB−CEE+CAEに感染、又は偽感染(コントロール)した293T細胞及びCH010細胞の蛍光活性化セルソーター(FACS)による結果を示す。
【図10】図10は、CAE及びECB−CEE+.CAEベクターのコラーゲン結合アフィニティに関するELISAアッセイの結果を示す。
【図11A】図11は、レトロウイルスベクターCAE又はレトロウイルスベクターECB−CEE+.CAEで処理したマウスの左総頚動脈の断面を示す。
【図11B】図11は、レトロウイルスベクターCAE又はレトロウイルスベクターECB−CEE+.CAEで処理したマウスの左総頚動脈の断面を示す。
【図12A】図12は、CAE又はECB−CEE+.CAEで処理した損傷ヒト伏在静脈断面を示す。
【図12B】図12は、CAE又はECB−CEE+.CAEで処理した損傷ヒト伏在静脈断面を示す。
【図13A】図13A及びBは、キメラエンベロープ蛋白質SU−ECB−CEE+又は緩衝液(コントロール)で処理したヒトのアテローム性動脈硬化症プラークを示す。
【図13B】図13A及びBは、キメラエンベロープ蛋白質SU−ECB−CEE+又は緩衝液(コントロール)で処理したヒトのアテローム性動脈硬化症プラークを示す。
【発明を実施するための形態】
【0015】
【数9−1】

【0016】
【数10】

【0017】
【数11】

【0018】
【数12】

【0019】
【数13】

【0020】
【数14】

【0021】
【数15】

【0022】
【数16】

【0023】
【数17】

【0024】
【数18】

【0025】
【数19】

【0026】
【数20】

【0027】
【数21】

【0028】
【数22】

【0029】
【数23】

【0030】
【数24】

【0031】
【数25】

【0032】
【数26】

【0033】
【数27】

【0034】
【数28】

【0035】
【数29】

【0036】
【数30】

【0037】
【数31】

【0038】
【数32】

【0039】
【数33】

【0040】
【数34】

【0041】
【数35】

【0042】
【数36】

【0043】
【数37】

【0044】
【数38】

【0045】
【数39】

【0046】
【数40】

【0047】
【数41】

【0048】
【数42】

【0049】
【数43】

【0050】
【数44】

【0051】
【数45】

【0052】
【数46】

【0053】
【数47】

【0054】
【数48】

【0055】
【数49】

【0056】
【数50】


【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書中に記載の発明。

【図1A】
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【図3A】
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【図3B】
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【図3C】
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【図4B】
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【図5A】
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【図5B】
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【図5C】
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【図5D】
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【図5E】
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【図5F】
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【図6A】
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【図6B】
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【図6C】
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【図7】
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【図8B】
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【図11A】
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【図11B】
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【図12A】
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【図12B】
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【図13A】
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【図13B】
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【図1B】
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【図2A】
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【図2B】
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【図2C】
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【図3D】
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【図3E】
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【図4A】
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【図4C】
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【図8A】
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【図9A】
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【図9B】
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【図9C】
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【図10】
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【公開番号】特開2011−234740(P2011−234740A)
【公開日】平成23年11月24日(2011.11.24)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2011−176306(P2011−176306)
【出願日】平成23年8月11日(2011.8.11)
【分割の表示】特願2007−261428(P2007−261428)の分割
【原出願日】平成10年4月8日(1998.4.8)
【出願人】(592048844)ユニバーシティ オブ サザン カリフォルニア (26)
【Fターム(参考)】