細胞定着液
【課題】接着性動物細胞を浮遊状態で正常に培養増殖させ、この培養増殖させた接着性動物細胞を所望の場所に再び定着させる方法を提供する。
【解決手段】本発明に係る細胞定着液は細胞培養液中にグリコサミノグリカンを含むものである。ここで、該細胞培養液は血清を５〜２０％の濃度範囲で含むものであり、グリコサミノグリカンとしては、例えばヘパリン又はコンドロイチン硫酸を挙げることができる。この細胞定着液は、別途特許出願している細胞定着法に使用することができる。この細胞定着法は、定着予定部に浮遊状態の接着性動物細胞を含む細胞液を入れ、その後該定着予定部の細胞液にこの細胞定着液を加えて該接着性動物細胞の浮遊効果を失効させ、該定着予定部に該接着性動物細胞を定着させるものである。
【解決手段】本発明に係る細胞定着液は細胞培養液中にグリコサミノグリカンを含むものである。ここで、該細胞培養液は血清を５〜２０％の濃度範囲で含むものであり、グリコサミノグリカンとしては、例えばヘパリン又はコンドロイチン硫酸を挙げることができる。この細胞定着液は、別途特許出願している細胞定着法に使用することができる。この細胞定着法は、定着予定部に浮遊状態の接着性動物細胞を含む細胞液を入れ、その後該定着予定部の細胞液にこの細胞定着液を加えて該接着性動物細胞の浮遊効果を失効させ、該定着予定部に該接着性動物細胞を定着させるものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養液中で浮遊培養した細胞を所定の場所に集合定着させるための細胞定着液に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近の医療技術や検査技術の進歩は著しく、新たな医療技術や新たな検査技術が次々と開発されてきている。新たな医療技術や新たな検査技術の開発では、細胞を用いた種々の実験・研究が行われている。
【０００３】
細胞を用いた種々の実験・研究では、その目的に応じて必要な細胞数や培養皿枚数を用意する必要があるので、無処置の細胞（マスター細胞）を絶えず継代的に培養し続けなければならない。
【０００４】
継代的に培養し続けたマスター細胞は、必要に応じて、培養皿から剥離後懸濁させ、一部は継代培養のために再度マスター細胞用の培養皿へ、また細胞懸濁液の残りは、実験・研究用に必要な細胞数を実験施行時までに満たすべく、増殖速度を計算しながら、それに適した大きさの、必要な枚数だけ、培養皿上に撒き、増殖させている。
【０００５】
マスター細胞を継代的に培養せず、毎回、液体窒素内で冷凍保存している細胞を起こして使用することも不可能ではないが、細胞を起こして実験に使えるように準備するのには時間がかかり過ぎるので、通常は上述したような継代的な培養方法が採られる。
【０００６】
目的の細胞数にまで増殖させた細胞は、その実験・研究の内容に合わせて利用する。ここで、増殖させた細胞は、培養皿上に接着させたまま利用する場合と、培養皿から剥離させて利用する場合がある。
【０００７】
培養皿から剥離させて利用する場合は、培養皿から細胞を剥離させなければならないが、培養皿から細胞を剥離させる方法としては、一般に、培養液中にトリプシンなどのタンパク質分解酵素を添加し、培養細胞の培養皿との結合部を溶かすことにより細胞を剥離させる方法が使用されている。そして、この方法において、剥離させる細胞に培養液の液流を吹き付けてフラッシングすることにより細胞を剥離させる方法も併せて採られることも有る。
【０００８】
しかし、トリプシンなどのタンパク質分解酵素を使用したり、培養液の液流を吹き付けてフラッシングをすると、培養細胞が損傷を受け、その機能回復に時間を要するという問題が有る。
【０００９】
また、種々の事情から、培養細胞を別の場所に輸送しなければならない場合が有る。培養細胞は培養器の内面から剥離すると死んでしまうので、輸送中に、細胞を培養したフラスコ内の培養液が揺れて培養細胞が剥離しないように、このフラスコに更に培養液を満たして培養液が揺れないようにしている。
【００１０】
しかし、このような対策を採っても、迅速に、しかも振動などの衝撃を加えないように注意して運搬しなければならないので、培養細胞の輸送は非常に面倒である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００４−７５５４７号公報
【特許文献２】特開平８−６６１８４号公報
【特許文献３】特許第２９４７４８８号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Biosci. Biotechnol. Biochem. (1992) vol.56, p. 965-966
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本願とは別に、接着性動物細胞を浮遊状態で培養増殖させる細胞培養法について特許出願をしているが、本願で解決しようとする課題は、浮遊状態で培養増殖させた接着性動物細胞を所望の場所に再び定着させる細胞定着液を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明に係る細胞定着液は培養液中にグリコサミノグリカンを含有していることを特徴とするものである。ここで、グリコサミノグリカンとしてはヘパリン又はコンドロイチン硫酸を使用することができる。また、細胞培養液は血清を５〜２０％の濃度範囲で含むものからなる。
【００１５】
なお、本発明に関連する発明として、細胞培養液中において接着性動物細胞を担体の表面に接着させた状態で培養し、その後ラクトフェリンを含む細胞遊離液と該細胞培養液とを混合して該担体から該接着性動物細胞を遊離させる細胞遊離法であって、該細胞培養液は血清を５〜２０％の濃度範囲で含み、該細胞遊離液は該細胞培養液と混合した時のラクトフェリンの濃度が１０〜５００μＭとなる濃度でラクトフェリンを含んでいることを特徴とする細胞遊離法を別途特許出願している。
【００１６】
ここで、血清の濃度を５〜２０％としたのは、血清の濃度が５％未満あるいは２０％を超えると細胞の増殖率が減少する不都合が生じるからである。また、ラクトフェリンの濃度を１０〜５００μＭとしたのは、ラクトフェリンの濃度が１０μＭ未満では細胞の遊離効果が少なく、５００μＭを超えると細胞の遊離効果が飽和してしまうからである。
【００１７】
また、前記細胞遊離液のラクトフェリンを除いた成分は、遊離させた細胞をそのまま培養させることができるという点で、前記細胞培養液の成分と略同一であることが好ましい。
【００１８】
また、この細胞遊離液は少なくともラクトフェリンを１〜１０ｍＭ含む細胞培養液からなることを特徴とするものである。ここで、前記培養液中のラクトフェリンの濃度を１〜１０ｍＭとしたのは、ラクトフェリンの濃度をこの範囲にすれば、使い易いからである。
【００１９】
また、本発明に関連する発明として、血清を５〜２０％、ラクトフェリンを１０〜５００μＭ含む細胞培養液中で接着性動物細胞を浮遊状態で培養することを特徴とする細胞培養法を別途特許出願している。ここで、前記培養液中のラクトフェリンの濃度は１０〜５００μＭが好ましい。ラクトフェリンの濃度を１０〜５００μＭとしたのは、ラクトフェリンの濃度が１０μＭ未満では細胞を浮遊培養する効果が少なくなって定着してしまい、５００μＭを超えると細胞を浮遊培養する効果が飽和してしまうからである。
【００２０】
また、本発明に関連する発明として、血清を５〜２０％、ラクトフェリンを１０〜５００μＭ含むことを特徴とする細胞培養液を別途特許出願している。ここで、血清の濃度を５〜２０％としたのは、血清の濃度が５％未満あるいは２０％を超えると細胞の増殖率が減少する不都合が生じるからである。また、培養液中のラクトフェリンの濃度を１０〜５００μＭとしたのは、ラクトフェリンの濃度が１０μＭ未満では細胞を浮遊培養する効果が少なくなって定着してしまい、５００μＭを超えると細胞を浮遊培養する効果が飽和してしまうからである。
【００２１】
また、本発明に関連する発明として、血清を５〜２０％、ラクトフェリンを１０〜５００μＭ含み、接着性動物細胞を浮遊状態で含む細胞培養液からなることを特徴とする細胞液を別途特許出願している。ここで、血清の濃度を５〜２０％としたのは、血清の濃度が５％未満あるいは２０％を超えると細胞の生存率が減少する不都合が生じるからである。また、培養液中のラクトフェリンの濃度を１０〜５００μＭとしたのは、ラクトフェリンの濃度が１０μＭ未満では細胞を浮遊させる効果が少なくなって定着してしまい、５００μＭを超えると細胞を浮遊させる効果が飽和してしまうからである。
【００２２】
また、本発明に関連する発明として、注射筒と、該注射筒内に充填された細胞液とからなり、該細胞液は、血清を５〜２０％、ラクトフェリンを１０〜５００μＭ含み、更に接着性動物細胞を浮遊状態で含むことを特徴とする細胞液製剤を別途特許出願している。ここで、血清の濃度を５〜２０％としたのは、血清の濃度が５％未満あるいは２０％を超えると細胞の生存率が減少する不都合が生じるからである。また、培養液中のラクトフェリンの濃度を１０〜５００μＭとしたのは、ラクトフェリンの濃度が１０μＭ未満では細胞を浮遊させる効果が少なくなって定着してしまい、５００μＭを超えると細胞を浮遊させる効果が飽和してしまうからである。
【００２３】
また、本発明に関連する発明として、浮遊状態の接着性動物細胞及びラクトフェリンを含む細胞液を定着予定部に入れ、その後該定着予定部にラクトフェリンを含まない培養液を加えて該細胞液中のラクトフェリンの濃度を減じ、該定着予定部に該接着性動物細胞を定着させる細胞定着法であって、該細胞液が血清を５〜２０％、ラクトフェリンを１０〜５００μＭ含むことを特徴とする細胞定着法を別途特許出願している。
【００２４】
ここで、ラクトフェリンを含まない培養液で濃度を減じられた前記細胞液中のラクトフェリンの濃度は１０μＭ未満が好ましい。１０μＭ未満では浮遊細胞の定着が顕著だからである。
【００２５】
また、本発明に関連する発明として、定着予定部に浮遊状態の接着性動物細胞を含む細胞液を入れ、その後該定着予定部の細胞液に該接着性動物細胞の浮遊効果を失効させる失効物質を加えて、該定着予定部に該接着性動物細胞を定着させる細胞定着法であって、該細胞液が血清を５〜２０％、ラクトフェリンを１０〜５００μＭ含むことを特徴とする細胞定着法を別途特許出願している。
【００２６】
ここで、浮遊状態の前記接着性動物細胞を定着させる際の前記細胞液中のグリコサミノグリカンの濃度は１０〜５００μｇ／ｍｌが好ましい。グリコサミノグリカンの濃度が１０μｇ／ｍｌ未満では浮遊細胞を定着させる効果が不充分であり、５００μｇ／ｍｌを超えると浮遊細胞を定着させる効果が飽和してしまうからである。
【００２７】
また、本発明に関連する発明として、定着予定部に接着性動物細胞を定着させる定着物質を被覆し、その後浮遊状態の接着性動物細胞を含む細胞液を該定着予定部に入れ、該定着予定部に該接着性動物細胞を定着させる細胞定着法であって、該定着物質が細胞外マトリックスタンパク質であり、該細胞液が少なくとも血清を５〜２０％、ラクトフェリンを１０〜５００μＭ含むことを特徴とする細胞定着法を別途特許出願している。
【００２８】
ここで、前記失効剤としては細胞外マトリックスタンパク質を使用することができる。細胞外マトリックスタンパク質としては、例えば、浮遊細胞が神経細胞の場合、ラミニンを使用することができ、浮遊細胞が上皮系細胞や線維芽細胞といった他の細胞の場合、フィブロネクチンやコラーゲンを使用することができる。
【００２９】
なお、上記各発明において、培養器とは、培養皿、培養フラスコ等、細胞を保持して培養することができる全ての器をいう。また、上記各発明において、接着性動物細胞とは、例えば神経細胞、グリア細胞、上皮細胞、各種の未分化細胞（間葉系細胞、幹細胞等）、ガン細胞等をいう。また、上記各発明において、培養液には、細胞を増殖させる養分を含んだもののみならず、生理食塩水のような細胞を単に保持させるだけのものも含まれる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、培養させた接着性動物細胞を担体から損傷無く剥離させることができるという効果がある。また、遊離させた培養細胞に時間をかけて機能回復をさせる必要が無いので、損傷の無い培養細胞を迅速に得ることができるという効果がある。
【００３１】
また、本発明によれば、浮遊している細胞が接着している細胞と比べて細胞増殖能力が高く、しかも細胞を浮遊状態で正常に培養することができるので、損傷の無い正常な細胞を迅速且つ大量に得ることができるという効果がある。
【００３２】
また、本発明によれば、細胞を浮遊状態で培養することができるので、培養細胞を容易に輸送運搬することができるという効果がある。
【００３３】
また、本発明によれば、ラクトフェリンを希釈したり、ラミニンを被覆した培養器に培養液を移したり、グリコサミノグリカンを添加するだけという簡単な方法で、浮遊状態の細胞から定着状態の細胞を容易に得ることができるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】培養液中のウシラクトフェリン(bLf)の濃度（μＭ）と培養液の吸光度(O.D.)との関係を示すグラフである。
【図２】培養液中にウシラクトフェリン(bLf)を添加してからの経過時間と培養液の吸光度(O.D.)との関係を示すグラフである。
【図３】回収した細胞を別の培養皿培養液中にて培養を開始してからの時間と吸光度(O.D.)との関係を示すグラフである。
【図４】培養液中のウシラクトフェリン(bLf)の濃度（μＭ）と培養液の吸光度(O.D.)との関係を示すグラフである。
【図５】培養液中のウシラクトフェリン(bLf)の濃度（μＭ）と培養液の吸光度(O.D.)との関係を示すグラフである。
【図６】グリコサミノグリカンの添加量（μｇ／ｍｌ）と培養液の吸光度(O.D.)との関係を示すグラフである。
【図７】ラミニンの有無と培養液の吸光度(O.D.)との関係を示すグラフである。
【図８】ラミニンの有無及びフィブロネクチンの有無と培養液の吸光度(O.D.)との関係を示すグラフである。
【図９】ｂ−ｂＬｆと各濃度のｂＬｆあるいはＢＳＡ存在下で培養したＰＣ１２細胞を洗浄後可溶化し、電気泳動したときのｂ＋ｂＬｆの泳動パターンを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
接着性動物細胞を浮遊状態で培養増殖させ、これを再び所望の場所に定着させるという目的をラクトフェリンとグリコサミノグリカンを利用することにより実現した。
【００３６】
ここで、ラクトフェリン(Lactoferrin)は乳中から見いだされた分子量約８０ｋＤのタンパク質で、種々の糖鎖構造と親和性を有し、細胞表層のタンパク質やグリコサミノグリカンと結合する性質をもち、細菌、ウイルス、原虫などの微生物感染の抑制や抗炎症作用などの様々な効果を有することで注目されている。
【００３７】
本件発明者は、ラクトフェリンの神経細胞に対する影響を調べる目的で、神経細胞の研究に広く用いられているラット副腎髄質褐色細胞種腫由来のＰＣ１２細胞の培地にウシラクトフェリン(bLf)を添加しその影響について調べた。
【実施例１】
【００３８】
培養液を入れた複数の培養皿を準備し、培養皿一皿当たり７×１０４のＰＣ１２細胞を撒き、このＰＣ１２細胞を、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で７２時間培養した。ここで、培養液はＤＭＥＭ(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培地｛5%(v/v)非加熱horse serum、 5%(v/v)非加熱fetal bovine serum、 １×１０５units/l penicillin G Sodium、 １×１０５mg/l streptomycin sulfate、 0.044M NaHCO3｝を使用し、ＰＣ１２細胞は理化学研究所細胞開発銀行から分譲を受けたものを使用した。
【００３９】
７２時間培養後、培養皿の培養液にウシラクトフェリン(bLf)を培養液中の濃度が０μＭ〜５００μＭとなるように添加した。ここで、培養液に添加したウシラクトフェリン(bLf)は培養液で予め希釈したものを使用した。希釈液中のウシラクトフェリン(bLf)の濃度は１〜１０ｍＭのものが使い易い。なお、ラクトフェリンは培養液で希釈したものでなく、生理食塩水等、栄養分を含まない液で希釈したものを用いても良い。
【００４０】
ウシラクトフェリン(bLf)を添加して２４時間経過後、培養器内の培養液を顕微鏡で観察したところ、浮遊しているＰＣ１２細胞が観察された。そして、波長５７０ｎｍにおけるこの培養液の吸光度(O.D.)を細胞賦活評価試験（MTT assay）により測定して、培養液中に遊離している細胞の数｛細胞の数は吸光度(O.D.)に比例している｝を調べたところ、図１のグラフに示す通りであった。
【００４１】
図１に示す結果から、ウシラクトフェリン(bLf)は濃度が１０μＭを超えるとＰＣ１２細胞の培養皿上への接着を阻害し、細胞を遊離・浮遊させる作用を有することがわかる。また、培養液中に浮遊している細胞数はウシラクトフェリン(bLf)の濃度の増加に従って増加するが、濃度が５００μＭを超えるとその作用は飽和することがわかる。
【００４２】
なお、ウシラクトフェリン(bLf)は分子量約８０ｋＤで陽電荷に帯電することから、これらの物理的性質が上記の作用を及ぼしている可能性も考えられる。そこで、上記の作用がウシラクトフェリン(bLf)に特異的であることを確認するために、ウシラクトフェリン(bLf)の代わりにウシラクトフェリン(bLf)と同様に分子量の大きいタンパク質であるウシ血清アルブミン（６７ｋＤ）および陽電荷をもつタンパク質であるリゾチーム（１４ｋＤ）に対する影響についてもウシラクトフェリン(bLf)と同様に調べた。
【００４３】
しかし、ウシ血清アルブミン（６７ｋＤ）、リゾチーム（１４ｋＤ）にウシラクトフェリン(bLf)で認められたような細胞を培養皿から遊離させる作用は認められなかった。従って、ＰＣ１２細胞を培養皿から遊離させる作用はウシラクトフェリン(bLf)に特異的なもので、高分子量や電荷がもたらすものではないことがわかる。
【実施例２】
【００４４】
実施例１と同様にしてＰＣ１２細胞を７２時間培養し、その後培養皿の培養液にウシラクトフェリン(bLf)を培養液中の濃度が１００μＭとなるように添加し、更に１２時間培養し、波長５７０ｎｍにおけるこの培養液の吸光度(O.D.)をＭＴＴ ａｓｓａｙにより０．５ｈ、１ｈ、３ｈ、６ｈ、１２ｈと経時的に測定して、培養液中に遊離している細胞の数｛細胞の数は吸光度(O.D.)に比例している｝を時間毎に調べた。結果は図２に示す通りであった。
【００４５】
この図２に示された結果から、ウシラクトフェリン(bLf)の濃度１００μＭの条件下では、培養皿の底面に定着していた細胞はウシラクトフェリン(bLf)の働きにより０．５ｈ当たりから少し遊離し、３ｈでかなり遊離し、６ｈで殆どが遊離することがわかる。
【実施例３】
【００４６】
実施例１と同様にしてＰＣ１２細胞を７２時間培養し、その後培養皿の培養液にウシラクトフェリン(bLf)を培養液中の濃度が１００μＭとなるように添加し、２４時間経過させた。この経過によって培養皿の内面に定着した状態で増殖していた細胞は培養皿の内面から遊離し、培養液中に浮遊することになる。
【００４７】
次に、培養液中に浮遊している細胞を回収し、予め用意しておいた培養皿、すなわち培養液中にウシラクトフェリン(bLf)が１００μＭ濃度で存在する培養皿｛bLf(+)｝と、培養液中にウシラクトフェリン(bLf)が存在しない培養皿{bLf(-)}に、回収したこの細胞を移し、１４４時間まで更に培養し、波長５７０ｎｍにおけるこの培養液の吸光度(O.D.)をＭＴＴ ａｓｓａｙにより経時的に測定し、培養液中に遊離している細胞の数｛細胞の数は吸光度(O.D.)に比例している｝を調べた。結果は図３に示す通りであった。
【００４８】
図３のｂＬｆ（＋）に示す結果から、浮遊細胞はウシラクトフェリン(bLf)の濃度が１００μＭの環境下において、浮遊状態で時間と共に増殖することがわかる。
【００４９】
また、図３のｂＬｆ（＋）、ｂＬｆ（−）に示す結果から、ウシラクトフェリン(bLf)を含む培養液｛bLf(+)｝の吸光度(O.D.)とウシラクトフェリン(bLf)を含まない培養液{bLf(-)}の吸光度(O.D.)とを比較すると、ウシラクトフェリン(bLf)を含む培養液｛bLf(+)｝の吸光度(O.D.)が高いこと、すなわちウシラクトフェリン(bLf)を含む培養液｛bLf(+)｝中における細胞の方がウシラクトフェリン(bLf)を含まない培養液{bLf(-)}中における細胞より細胞増殖能力が高いことがわかる。
【００５０】
また、浮遊細胞を培養した培養液（以下、「細胞液」という。）を注射筒に充填し、これを３７℃で１２時間保持し、その後、波長５７０ｎｍにおけるこの培養液の吸光度(O.D.)をＭＴＴ ａｓｓａｙにより測定して、細胞液中に遊離している細胞の数｛細胞の数は吸光度(O.D.)に比例している｝を調べたところ、細胞は生存しており、その数は増殖により保持前と比べて１．１倍に増加していた。
【実施例４】
【００５１】
実施例１と同様にしてＰＣ１２細胞を７２時間培養し、その後培養皿の培養液にウシラクトフェリン(bLf)を培養液中の濃度が１００μＭとなるように添加し、２４時間経過させた。
【００５２】
次に、培養液中に浮遊している細胞を回収し、ウシラクトフェリン(bLf)の濃度が０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、５００μＭ、６００μＭの培養液を入れた各培養皿に移し、２４時間培養した。そして、波長５７０ｎｍにおけるこの各培養皿の培養液の吸光度(O.D.)をＭＴＴ ａｓｓａｙにより測定し、各培養皿の培養液中に浮遊している細胞の数｛細胞の数は吸光度(O.D.)に比例している｝を調べた。結果は図４に示す通りであった。
【００５３】
図４に示す結果から、培養液中のウシラクトフェリン(bLf)の濃度を高くすると細胞の増殖能力が高くなることがわかる。
【実施例５】
【００５４】
実施例１と同様にしてＰＣ１２細胞を７２時間培養し、その後培養皿の培養液にウシラクトフェリン(bLf)を培養液中の濃度が１００μＭとなるように添加し、２４時間経過させた。
【００５５】
次に、ウシラクトフェリン(bLf)の添加によって浮遊状態の細胞を含むようになった培養液を別の各培養皿に移し、そこにウシラクトフェリン(bLf)を含まない培養液を加え、ウシラクトフェリン(bLf)の濃度を１０〜１００μＭまで各々低減させ、更に３７℃で２４時間経過させた。この経過により培養皿の底面に細胞が定着しているのが目視で観察された。
【００５６】
次に、培養皿の培養液を捨て、培養皿の内面を洗浄液で洗い、波長５７０ｎｍにおけるこの洗浄液の吸光度(O.D.)を各培養皿毎にＭＴＴ ａｓｓａｙにより測定し、洗浄液中に遊離している細胞の数｛細胞の数は吸光度(O.D.)に比例している｝を調べたところ、図５に示す通りであった。
【００５７】
図５に示す結果から、ウシラクトフェリン(bLf)を含まない希釈液で希釈して培養液中のウシラクトフェリン(bLf)の濃度を減ずると、培養液中に浮遊していた細胞が培養皿の内面に再び定着することがわかる。
【実施例６】
【００５８】
実施例１と同様にしてＰＣ１２細胞を７２時間培養し、その後培養皿の培養液にウシラクトフェリン(bLf)を培養液中の濃度が１００μＭとなるように添加し、２４時間経過させた。
【００５９】
次に、ウシラクトフェリン(bLf)の添加によって浮遊状態の細胞を含むようになった培養液を別の培養皿に移し、そこにヘパリンやコンドロイチン硫酸Ａ，Ｃなどのグリコサミノグリカンを含む培養液（細胞定着液）を１〜５００μｇ／ｍｌの範囲で添加し、更に２４時間経過させた。この経過により培養皿の底面にＰＣ１２細胞が定着しているのが目視で観察された。
【００６０】
次に、波長５７０ｎｍにおけるこの培養皿中の培養液の吸光度(O.D.)を各培養皿毎にＭＴＴ ａｓｓａｙにより測定し、培養液中に遊離している細胞の数｛細胞の数は吸光度(O.D.)に比例している｝を調べたところ、図６に示す通りであった。
【００６１】
図６に示す結果から、ヘパリンやコンドロイチン硫酸などのグリコサミノグリカンを含む培養液（細胞定着液）を添加すると、培養液中に浮遊していた細胞数が減少すること、すなわち、培養液中に浮遊していた細胞が培養皿の内面に再び定着することがわかった。
【実施例７】
【００６２】
実施例１と同様にしてＰＣ１２細胞を７２時間培養し、その後培養皿の培養液にウシラクトフェリン(bLf)を培養液中の濃度が１００μＭとなるように添加し、２４時間経過させた。
【００６３】
次に、ウシラクトフェリン(bLf)の添加によって浮遊状態の細胞を含むようになった培養液を、予め用意したラミニンで内面を被覆した培養皿（Ｌａｍ＋）とラミニンで内面を被覆してない培養皿（Ｌａｍ−）に移し、更に２４時間経過させた。
【００６４】
次に、波長５７０ｎｍにおけるこの培養皿中の培養液の吸光度(O.D.)をＭＴＴ ａｓｓａｙにより経時的に測定し、培養液中に遊離している細胞の数｛細胞の数は吸光度(O.D.)に比例している｝を調べた。結果は図７に示す通りであった。
【００６５】
また、培養皿の内面を観察したところ、培養皿の内面にはＰＣ１２細胞が定着し、増殖しているのが確認された。以上のことから、培養液中に浮遊していた細胞はウシラクトフェリン(bLf)の存在下でラミニンの働きにより培養皿の底面に定着することがわかる。
【実施例８】
【００６６】
実施例１と同様にしてＰＣ１２細胞を７２時間培養し、その後培養皿の培養液にウシラクトフェリン(bLf)を培養液中の濃度が１００μＭとなるように添加し、２４時間経過させた。
【００６７】
次に、ウシラクトフェリン(bLf)の添加によって浮遊状態の細胞を含むようになった培養液を、予め用意したラミニンで内面を被覆した培養皿（Ｌａｍ＋）、フィブロネクチンで内面を被覆した培養皿（Ｌａｍ−）、何も被覆してない培養皿（non-coat)に移し、更に２４時間培養し、波長５７０ｎｍにおけるこの培養皿中の培養液の吸光度(O.D.)を各培養皿毎にＭＴＴ ａｓｓａｙにより測定し、培養液中に遊離している細胞の数｛細胞の数は吸光度(O.D.)に比例している｝を調べた。
【００６８】
結果は図８に示す通りであり、ラミニンを被覆した方の培養皿中の培養液中の浮遊細胞は大幅に減少しており、ラミニンを被覆してない方の培養液中の浮遊細胞は減少しなかった。また、培養皿の内面を観察したところ、培養皿の内面にはＰＣ１２細胞が定着し、増殖しているのが確認された。
【００６９】
ラミニンを被覆した培養皿に移した浮遊細胞は１００μＭのウシラクトフェリン(bLf)存在下にもかかわらず、浮遊細胞数が減少し、培養皿底面に定着して発育する細胞数が増加した(bLf+,Lam+)。ところが、フィブロネクチンを被覆した培養皿に移した浮遊細胞は、浮遊状態を維持し発育した(bLf+,FN+)。従って、ウシラクトフェリン(bLf)の神経細胞に対する接着抑制効果は、神経細胞に発現するインテグリンとラミニン間で形成されるインテグリン依存性の細胞接着には無効であることがわかる。
【実施例９】
【００７０】
ウシラクトフェリン(bLf)がＰＣ１２細胞に直接結合して作用していることを確認するために、ＰＣ１２細胞にビオチン化ｂＬｆ（ｂ−ｂＬｆ）を添加し、２４時間後に全細胞を回収・洗浄し、細胞を可溶化後、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳導に供し、さらにナイトロセルロース膜にブロットした後にｂ−ｂＬｆの結合を解析した。泳動パターンは図９に示す通りとなった。
【００７１】
図９において、（ａ）はｂ−ｂＬｆ単独処置、（ｂ）はｂ−ｂＬｆ＋ｂＬｆ 100 μM、（ｃ）はｂ−ｂＬｆ+ｂＬｆ ５００ μM、（ｄ）はｂ−ｂＬｆ＋ＢＳＡ１００ μM、（ｅ）はｂ−ｂＬｆ＋ＢＳＡ５００ μMである。
【００７２】
解析の結果、ｂ−ｂＬｆが検出され、ｂ−ｂＬｆがＰＣ１２細胞に直接結合して作用していることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
細胞の浮遊と定着の機構を制御する手段の研究を解明することにより、ヒトや動物の生体組織を再生させる用途にも適用できる可能性がある。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養液中で浮遊培養した細胞を所定の場所に集合定着させるための細胞定着液に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近の医療技術や検査技術の進歩は著しく、新たな医療技術や新たな検査技術が次々と開発されてきている。新たな医療技術や新たな検査技術の開発では、細胞を用いた種々の実験・研究が行われている。
【０００３】
細胞を用いた種々の実験・研究では、その目的に応じて必要な細胞数や培養皿枚数を用意する必要があるので、無処置の細胞（マスター細胞）を絶えず継代的に培養し続けなければならない。
【０００４】
継代的に培養し続けたマスター細胞は、必要に応じて、培養皿から剥離後懸濁させ、一部は継代培養のために再度マスター細胞用の培養皿へ、また細胞懸濁液の残りは、実験・研究用に必要な細胞数を実験施行時までに満たすべく、増殖速度を計算しながら、それに適した大きさの、必要な枚数だけ、培養皿上に撒き、増殖させている。
【０００５】
マスター細胞を継代的に培養せず、毎回、液体窒素内で冷凍保存している細胞を起こして使用することも不可能ではないが、細胞を起こして実験に使えるように準備するのには時間がかかり過ぎるので、通常は上述したような継代的な培養方法が採られる。
【０００６】
目的の細胞数にまで増殖させた細胞は、その実験・研究の内容に合わせて利用する。ここで、増殖させた細胞は、培養皿上に接着させたまま利用する場合と、培養皿から剥離させて利用する場合がある。
【０００７】
培養皿から剥離させて利用する場合は、培養皿から細胞を剥離させなければならないが、培養皿から細胞を剥離させる方法としては、一般に、培養液中にトリプシンなどのタンパク質分解酵素を添加し、培養細胞の培養皿との結合部を溶かすことにより細胞を剥離させる方法が使用されている。そして、この方法において、剥離させる細胞に培養液の液流を吹き付けてフラッシングすることにより細胞を剥離させる方法も併せて採られることも有る。
【０００８】
しかし、トリプシンなどのタンパク質分解酵素を使用したり、培養液の液流を吹き付けてフラッシングをすると、培養細胞が損傷を受け、その機能回復に時間を要するという問題が有る。
【０００９】
また、種々の事情から、培養細胞を別の場所に輸送しなければならない場合が有る。培養細胞は培養器の内面から剥離すると死んでしまうので、輸送中に、細胞を培養したフラスコ内の培養液が揺れて培養細胞が剥離しないように、このフラスコに更に培養液を満たして培養液が揺れないようにしている。
【００１０】
しかし、このような対策を採っても、迅速に、しかも振動などの衝撃を加えないように注意して運搬しなければならないので、培養細胞の輸送は非常に面倒である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００４−７５５４７号公報
【特許文献２】特開平８−６６１８４号公報
【特許文献３】特許第２９４７４８８号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Biosci. Biotechnol. Biochem. (1992) vol.56, p. 965-966
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本願とは別に、接着性動物細胞を浮遊状態で培養増殖させる細胞培養法について特許出願をしているが、本願で解決しようとする課題は、浮遊状態で培養増殖させた接着性動物細胞を所望の場所に再び定着させる細胞定着液を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明に係る細胞定着液は培養液中にグリコサミノグリカンを含有していることを特徴とするものである。ここで、グリコサミノグリカンとしてはヘパリン又はコンドロイチン硫酸を使用することができる。また、細胞培養液は血清を５〜２０％の濃度範囲で含むものからなる。
【００１５】
なお、本発明に関連する発明として、細胞培養液中において接着性動物細胞を担体の表面に接着させた状態で培養し、その後ラクトフェリンを含む細胞遊離液と該細胞培養液とを混合して該担体から該接着性動物細胞を遊離させる細胞遊離法であって、該細胞培養液は血清を５〜２０％の濃度範囲で含み、該細胞遊離液は該細胞培養液と混合した時のラクトフェリンの濃度が１０〜５００μＭとなる濃度でラクトフェリンを含んでいることを特徴とする細胞遊離法を別途特許出願している。
【００１６】
ここで、血清の濃度を５〜２０％としたのは、血清の濃度が５％未満あるいは２０％を超えると細胞の増殖率が減少する不都合が生じるからである。また、ラクトフェリンの濃度を１０〜５００μＭとしたのは、ラクトフェリンの濃度が１０μＭ未満では細胞の遊離効果が少なく、５００μＭを超えると細胞の遊離効果が飽和してしまうからである。
【００１７】
また、前記細胞遊離液のラクトフェリンを除いた成分は、遊離させた細胞をそのまま培養させることができるという点で、前記細胞培養液の成分と略同一であることが好ましい。
【００１８】
また、この細胞遊離液は少なくともラクトフェリンを１〜１０ｍＭ含む細胞培養液からなることを特徴とするものである。ここで、前記培養液中のラクトフェリンの濃度を１〜１０ｍＭとしたのは、ラクトフェリンの濃度をこの範囲にすれば、使い易いからである。
【００１９】
また、本発明に関連する発明として、血清を５〜２０％、ラクトフェリンを１０〜５００μＭ含む細胞培養液中で接着性動物細胞を浮遊状態で培養することを特徴とする細胞培養法を別途特許出願している。ここで、前記培養液中のラクトフェリンの濃度は１０〜５００μＭが好ましい。ラクトフェリンの濃度を１０〜５００μＭとしたのは、ラクトフェリンの濃度が１０μＭ未満では細胞を浮遊培養する効果が少なくなって定着してしまい、５００μＭを超えると細胞を浮遊培養する効果が飽和してしまうからである。
【００２０】
また、本発明に関連する発明として、血清を５〜２０％、ラクトフェリンを１０〜５００μＭ含むことを特徴とする細胞培養液を別途特許出願している。ここで、血清の濃度を５〜２０％としたのは、血清の濃度が５％未満あるいは２０％を超えると細胞の増殖率が減少する不都合が生じるからである。また、培養液中のラクトフェリンの濃度を１０〜５００μＭとしたのは、ラクトフェリンの濃度が１０μＭ未満では細胞を浮遊培養する効果が少なくなって定着してしまい、５００μＭを超えると細胞を浮遊培養する効果が飽和してしまうからである。
【００２１】
また、本発明に関連する発明として、血清を５〜２０％、ラクトフェリンを１０〜５００μＭ含み、接着性動物細胞を浮遊状態で含む細胞培養液からなることを特徴とする細胞液を別途特許出願している。ここで、血清の濃度を５〜２０％としたのは、血清の濃度が５％未満あるいは２０％を超えると細胞の生存率が減少する不都合が生じるからである。また、培養液中のラクトフェリンの濃度を１０〜５００μＭとしたのは、ラクトフェリンの濃度が１０μＭ未満では細胞を浮遊させる効果が少なくなって定着してしまい、５００μＭを超えると細胞を浮遊させる効果が飽和してしまうからである。
【００２２】
また、本発明に関連する発明として、注射筒と、該注射筒内に充填された細胞液とからなり、該細胞液は、血清を５〜２０％、ラクトフェリンを１０〜５００μＭ含み、更に接着性動物細胞を浮遊状態で含むことを特徴とする細胞液製剤を別途特許出願している。ここで、血清の濃度を５〜２０％としたのは、血清の濃度が５％未満あるいは２０％を超えると細胞の生存率が減少する不都合が生じるからである。また、培養液中のラクトフェリンの濃度を１０〜５００μＭとしたのは、ラクトフェリンの濃度が１０μＭ未満では細胞を浮遊させる効果が少なくなって定着してしまい、５００μＭを超えると細胞を浮遊させる効果が飽和してしまうからである。
【００２３】
また、本発明に関連する発明として、浮遊状態の接着性動物細胞及びラクトフェリンを含む細胞液を定着予定部に入れ、その後該定着予定部にラクトフェリンを含まない培養液を加えて該細胞液中のラクトフェリンの濃度を減じ、該定着予定部に該接着性動物細胞を定着させる細胞定着法であって、該細胞液が血清を５〜２０％、ラクトフェリンを１０〜５００μＭ含むことを特徴とする細胞定着法を別途特許出願している。
【００２４】
ここで、ラクトフェリンを含まない培養液で濃度を減じられた前記細胞液中のラクトフェリンの濃度は１０μＭ未満が好ましい。１０μＭ未満では浮遊細胞の定着が顕著だからである。
【００２５】
また、本発明に関連する発明として、定着予定部に浮遊状態の接着性動物細胞を含む細胞液を入れ、その後該定着予定部の細胞液に該接着性動物細胞の浮遊効果を失効させる失効物質を加えて、該定着予定部に該接着性動物細胞を定着させる細胞定着法であって、該細胞液が血清を５〜２０％、ラクトフェリンを１０〜５００μＭ含むことを特徴とする細胞定着法を別途特許出願している。
【００２６】
ここで、浮遊状態の前記接着性動物細胞を定着させる際の前記細胞液中のグリコサミノグリカンの濃度は１０〜５００μｇ／ｍｌが好ましい。グリコサミノグリカンの濃度が１０μｇ／ｍｌ未満では浮遊細胞を定着させる効果が不充分であり、５００μｇ／ｍｌを超えると浮遊細胞を定着させる効果が飽和してしまうからである。
【００２７】
また、本発明に関連する発明として、定着予定部に接着性動物細胞を定着させる定着物質を被覆し、その後浮遊状態の接着性動物細胞を含む細胞液を該定着予定部に入れ、該定着予定部に該接着性動物細胞を定着させる細胞定着法であって、該定着物質が細胞外マトリックスタンパク質であり、該細胞液が少なくとも血清を５〜２０％、ラクトフェリンを１０〜５００μＭ含むことを特徴とする細胞定着法を別途特許出願している。
【００２８】
ここで、前記失効剤としては細胞外マトリックスタンパク質を使用することができる。細胞外マトリックスタンパク質としては、例えば、浮遊細胞が神経細胞の場合、ラミニンを使用することができ、浮遊細胞が上皮系細胞や線維芽細胞といった他の細胞の場合、フィブロネクチンやコラーゲンを使用することができる。
【００２９】
なお、上記各発明において、培養器とは、培養皿、培養フラスコ等、細胞を保持して培養することができる全ての器をいう。また、上記各発明において、接着性動物細胞とは、例えば神経細胞、グリア細胞、上皮細胞、各種の未分化細胞（間葉系細胞、幹細胞等）、ガン細胞等をいう。また、上記各発明において、培養液には、細胞を増殖させる養分を含んだもののみならず、生理食塩水のような細胞を単に保持させるだけのものも含まれる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、培養させた接着性動物細胞を担体から損傷無く剥離させることができるという効果がある。また、遊離させた培養細胞に時間をかけて機能回復をさせる必要が無いので、損傷の無い培養細胞を迅速に得ることができるという効果がある。
【００３１】
また、本発明によれば、浮遊している細胞が接着している細胞と比べて細胞増殖能力が高く、しかも細胞を浮遊状態で正常に培養することができるので、損傷の無い正常な細胞を迅速且つ大量に得ることができるという効果がある。
【００３２】
また、本発明によれば、細胞を浮遊状態で培養することができるので、培養細胞を容易に輸送運搬することができるという効果がある。
【００３３】
また、本発明によれば、ラクトフェリンを希釈したり、ラミニンを被覆した培養器に培養液を移したり、グリコサミノグリカンを添加するだけという簡単な方法で、浮遊状態の細胞から定着状態の細胞を容易に得ることができるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】培養液中のウシラクトフェリン(bLf)の濃度（μＭ）と培養液の吸光度(O.D.)との関係を示すグラフである。
【図２】培養液中にウシラクトフェリン(bLf)を添加してからの経過時間と培養液の吸光度(O.D.)との関係を示すグラフである。
【図３】回収した細胞を別の培養皿培養液中にて培養を開始してからの時間と吸光度(O.D.)との関係を示すグラフである。
【図４】培養液中のウシラクトフェリン(bLf)の濃度（μＭ）と培養液の吸光度(O.D.)との関係を示すグラフである。
【図５】培養液中のウシラクトフェリン(bLf)の濃度（μＭ）と培養液の吸光度(O.D.)との関係を示すグラフである。
【図６】グリコサミノグリカンの添加量（μｇ／ｍｌ）と培養液の吸光度(O.D.)との関係を示すグラフである。
【図７】ラミニンの有無と培養液の吸光度(O.D.)との関係を示すグラフである。
【図８】ラミニンの有無及びフィブロネクチンの有無と培養液の吸光度(O.D.)との関係を示すグラフである。
【図９】ｂ−ｂＬｆと各濃度のｂＬｆあるいはＢＳＡ存在下で培養したＰＣ１２細胞を洗浄後可溶化し、電気泳動したときのｂ＋ｂＬｆの泳動パターンを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
接着性動物細胞を浮遊状態で培養増殖させ、これを再び所望の場所に定着させるという目的をラクトフェリンとグリコサミノグリカンを利用することにより実現した。
【００３６】
ここで、ラクトフェリン(Lactoferrin)は乳中から見いだされた分子量約８０ｋＤのタンパク質で、種々の糖鎖構造と親和性を有し、細胞表層のタンパク質やグリコサミノグリカンと結合する性質をもち、細菌、ウイルス、原虫などの微生物感染の抑制や抗炎症作用などの様々な効果を有することで注目されている。
【００３７】
本件発明者は、ラクトフェリンの神経細胞に対する影響を調べる目的で、神経細胞の研究に広く用いられているラット副腎髄質褐色細胞種腫由来のＰＣ１２細胞の培地にウシラクトフェリン(bLf)を添加しその影響について調べた。
【実施例１】
【００３８】
培養液を入れた複数の培養皿を準備し、培養皿一皿当たり７×１０４のＰＣ１２細胞を撒き、このＰＣ１２細胞を、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で７２時間培養した。ここで、培養液はＤＭＥＭ(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培地｛5%(v/v)非加熱horse serum、 5%(v/v)非加熱fetal bovine serum、 １×１０５units/l penicillin G Sodium、 １×１０５mg/l streptomycin sulfate、 0.044M NaHCO3｝を使用し、ＰＣ１２細胞は理化学研究所細胞開発銀行から分譲を受けたものを使用した。
【００３９】
７２時間培養後、培養皿の培養液にウシラクトフェリン(bLf)を培養液中の濃度が０μＭ〜５００μＭとなるように添加した。ここで、培養液に添加したウシラクトフェリン(bLf)は培養液で予め希釈したものを使用した。希釈液中のウシラクトフェリン(bLf)の濃度は１〜１０ｍＭのものが使い易い。なお、ラクトフェリンは培養液で希釈したものでなく、生理食塩水等、栄養分を含まない液で希釈したものを用いても良い。
【００４０】
ウシラクトフェリン(bLf)を添加して２４時間経過後、培養器内の培養液を顕微鏡で観察したところ、浮遊しているＰＣ１２細胞が観察された。そして、波長５７０ｎｍにおけるこの培養液の吸光度(O.D.)を細胞賦活評価試験（MTT assay）により測定して、培養液中に遊離している細胞の数｛細胞の数は吸光度(O.D.)に比例している｝を調べたところ、図１のグラフに示す通りであった。
【００４１】
図１に示す結果から、ウシラクトフェリン(bLf)は濃度が１０μＭを超えるとＰＣ１２細胞の培養皿上への接着を阻害し、細胞を遊離・浮遊させる作用を有することがわかる。また、培養液中に浮遊している細胞数はウシラクトフェリン(bLf)の濃度の増加に従って増加するが、濃度が５００μＭを超えるとその作用は飽和することがわかる。
【００４２】
なお、ウシラクトフェリン(bLf)は分子量約８０ｋＤで陽電荷に帯電することから、これらの物理的性質が上記の作用を及ぼしている可能性も考えられる。そこで、上記の作用がウシラクトフェリン(bLf)に特異的であることを確認するために、ウシラクトフェリン(bLf)の代わりにウシラクトフェリン(bLf)と同様に分子量の大きいタンパク質であるウシ血清アルブミン（６７ｋＤ）および陽電荷をもつタンパク質であるリゾチーム（１４ｋＤ）に対する影響についてもウシラクトフェリン(bLf)と同様に調べた。
【００４３】
しかし、ウシ血清アルブミン（６７ｋＤ）、リゾチーム（１４ｋＤ）にウシラクトフェリン(bLf)で認められたような細胞を培養皿から遊離させる作用は認められなかった。従って、ＰＣ１２細胞を培養皿から遊離させる作用はウシラクトフェリン(bLf)に特異的なもので、高分子量や電荷がもたらすものではないことがわかる。
【実施例２】
【００４４】
実施例１と同様にしてＰＣ１２細胞を７２時間培養し、その後培養皿の培養液にウシラクトフェリン(bLf)を培養液中の濃度が１００μＭとなるように添加し、更に１２時間培養し、波長５７０ｎｍにおけるこの培養液の吸光度(O.D.)をＭＴＴ ａｓｓａｙにより０．５ｈ、１ｈ、３ｈ、６ｈ、１２ｈと経時的に測定して、培養液中に遊離している細胞の数｛細胞の数は吸光度(O.D.)に比例している｝を時間毎に調べた。結果は図２に示す通りであった。
【００４５】
この図２に示された結果から、ウシラクトフェリン(bLf)の濃度１００μＭの条件下では、培養皿の底面に定着していた細胞はウシラクトフェリン(bLf)の働きにより０．５ｈ当たりから少し遊離し、３ｈでかなり遊離し、６ｈで殆どが遊離することがわかる。
【実施例３】
【００４６】
実施例１と同様にしてＰＣ１２細胞を７２時間培養し、その後培養皿の培養液にウシラクトフェリン(bLf)を培養液中の濃度が１００μＭとなるように添加し、２４時間経過させた。この経過によって培養皿の内面に定着した状態で増殖していた細胞は培養皿の内面から遊離し、培養液中に浮遊することになる。
【００４７】
次に、培養液中に浮遊している細胞を回収し、予め用意しておいた培養皿、すなわち培養液中にウシラクトフェリン(bLf)が１００μＭ濃度で存在する培養皿｛bLf(+)｝と、培養液中にウシラクトフェリン(bLf)が存在しない培養皿{bLf(-)}に、回収したこの細胞を移し、１４４時間まで更に培養し、波長５７０ｎｍにおけるこの培養液の吸光度(O.D.)をＭＴＴ ａｓｓａｙにより経時的に測定し、培養液中に遊離している細胞の数｛細胞の数は吸光度(O.D.)に比例している｝を調べた。結果は図３に示す通りであった。
【００４８】
図３のｂＬｆ（＋）に示す結果から、浮遊細胞はウシラクトフェリン(bLf)の濃度が１００μＭの環境下において、浮遊状態で時間と共に増殖することがわかる。
【００４９】
また、図３のｂＬｆ（＋）、ｂＬｆ（−）に示す結果から、ウシラクトフェリン(bLf)を含む培養液｛bLf(+)｝の吸光度(O.D.)とウシラクトフェリン(bLf)を含まない培養液{bLf(-)}の吸光度(O.D.)とを比較すると、ウシラクトフェリン(bLf)を含む培養液｛bLf(+)｝の吸光度(O.D.)が高いこと、すなわちウシラクトフェリン(bLf)を含む培養液｛bLf(+)｝中における細胞の方がウシラクトフェリン(bLf)を含まない培養液{bLf(-)}中における細胞より細胞増殖能力が高いことがわかる。
【００５０】
また、浮遊細胞を培養した培養液（以下、「細胞液」という。）を注射筒に充填し、これを３７℃で１２時間保持し、その後、波長５７０ｎｍにおけるこの培養液の吸光度(O.D.)をＭＴＴ ａｓｓａｙにより測定して、細胞液中に遊離している細胞の数｛細胞の数は吸光度(O.D.)に比例している｝を調べたところ、細胞は生存しており、その数は増殖により保持前と比べて１．１倍に増加していた。
【実施例４】
【００５１】
実施例１と同様にしてＰＣ１２細胞を７２時間培養し、その後培養皿の培養液にウシラクトフェリン(bLf)を培養液中の濃度が１００μＭとなるように添加し、２４時間経過させた。
【００５２】
次に、培養液中に浮遊している細胞を回収し、ウシラクトフェリン(bLf)の濃度が０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、５００μＭ、６００μＭの培養液を入れた各培養皿に移し、２４時間培養した。そして、波長５７０ｎｍにおけるこの各培養皿の培養液の吸光度(O.D.)をＭＴＴ ａｓｓａｙにより測定し、各培養皿の培養液中に浮遊している細胞の数｛細胞の数は吸光度(O.D.)に比例している｝を調べた。結果は図４に示す通りであった。
【００５３】
図４に示す結果から、培養液中のウシラクトフェリン(bLf)の濃度を高くすると細胞の増殖能力が高くなることがわかる。
【実施例５】
【００５４】
実施例１と同様にしてＰＣ１２細胞を７２時間培養し、その後培養皿の培養液にウシラクトフェリン(bLf)を培養液中の濃度が１００μＭとなるように添加し、２４時間経過させた。
【００５５】
次に、ウシラクトフェリン(bLf)の添加によって浮遊状態の細胞を含むようになった培養液を別の各培養皿に移し、そこにウシラクトフェリン(bLf)を含まない培養液を加え、ウシラクトフェリン(bLf)の濃度を１０〜１００μＭまで各々低減させ、更に３７℃で２４時間経過させた。この経過により培養皿の底面に細胞が定着しているのが目視で観察された。
【００５６】
次に、培養皿の培養液を捨て、培養皿の内面を洗浄液で洗い、波長５７０ｎｍにおけるこの洗浄液の吸光度(O.D.)を各培養皿毎にＭＴＴ ａｓｓａｙにより測定し、洗浄液中に遊離している細胞の数｛細胞の数は吸光度(O.D.)に比例している｝を調べたところ、図５に示す通りであった。
【００５７】
図５に示す結果から、ウシラクトフェリン(bLf)を含まない希釈液で希釈して培養液中のウシラクトフェリン(bLf)の濃度を減ずると、培養液中に浮遊していた細胞が培養皿の内面に再び定着することがわかる。
【実施例６】
【００５８】
実施例１と同様にしてＰＣ１２細胞を７２時間培養し、その後培養皿の培養液にウシラクトフェリン(bLf)を培養液中の濃度が１００μＭとなるように添加し、２４時間経過させた。
【００５９】
次に、ウシラクトフェリン(bLf)の添加によって浮遊状態の細胞を含むようになった培養液を別の培養皿に移し、そこにヘパリンやコンドロイチン硫酸Ａ，Ｃなどのグリコサミノグリカンを含む培養液（細胞定着液）を１〜５００μｇ／ｍｌの範囲で添加し、更に２４時間経過させた。この経過により培養皿の底面にＰＣ１２細胞が定着しているのが目視で観察された。
【００６０】
次に、波長５７０ｎｍにおけるこの培養皿中の培養液の吸光度(O.D.)を各培養皿毎にＭＴＴ ａｓｓａｙにより測定し、培養液中に遊離している細胞の数｛細胞の数は吸光度(O.D.)に比例している｝を調べたところ、図６に示す通りであった。
【００６１】
図６に示す結果から、ヘパリンやコンドロイチン硫酸などのグリコサミノグリカンを含む培養液（細胞定着液）を添加すると、培養液中に浮遊していた細胞数が減少すること、すなわち、培養液中に浮遊していた細胞が培養皿の内面に再び定着することがわかった。
【実施例７】
【００６２】
実施例１と同様にしてＰＣ１２細胞を７２時間培養し、その後培養皿の培養液にウシラクトフェリン(bLf)を培養液中の濃度が１００μＭとなるように添加し、２４時間経過させた。
【００６３】
次に、ウシラクトフェリン(bLf)の添加によって浮遊状態の細胞を含むようになった培養液を、予め用意したラミニンで内面を被覆した培養皿（Ｌａｍ＋）とラミニンで内面を被覆してない培養皿（Ｌａｍ−）に移し、更に２４時間経過させた。
【００６４】
次に、波長５７０ｎｍにおけるこの培養皿中の培養液の吸光度(O.D.)をＭＴＴ ａｓｓａｙにより経時的に測定し、培養液中に遊離している細胞の数｛細胞の数は吸光度(O.D.)に比例している｝を調べた。結果は図７に示す通りであった。
【００６５】
また、培養皿の内面を観察したところ、培養皿の内面にはＰＣ１２細胞が定着し、増殖しているのが確認された。以上のことから、培養液中に浮遊していた細胞はウシラクトフェリン(bLf)の存在下でラミニンの働きにより培養皿の底面に定着することがわかる。
【実施例８】
【００６６】
実施例１と同様にしてＰＣ１２細胞を７２時間培養し、その後培養皿の培養液にウシラクトフェリン(bLf)を培養液中の濃度が１００μＭとなるように添加し、２４時間経過させた。
【００６７】
次に、ウシラクトフェリン(bLf)の添加によって浮遊状態の細胞を含むようになった培養液を、予め用意したラミニンで内面を被覆した培養皿（Ｌａｍ＋）、フィブロネクチンで内面を被覆した培養皿（Ｌａｍ−）、何も被覆してない培養皿（non-coat)に移し、更に２４時間培養し、波長５７０ｎｍにおけるこの培養皿中の培養液の吸光度(O.D.)を各培養皿毎にＭＴＴ ａｓｓａｙにより測定し、培養液中に遊離している細胞の数｛細胞の数は吸光度(O.D.)に比例している｝を調べた。
【００６８】
結果は図８に示す通りであり、ラミニンを被覆した方の培養皿中の培養液中の浮遊細胞は大幅に減少しており、ラミニンを被覆してない方の培養液中の浮遊細胞は減少しなかった。また、培養皿の内面を観察したところ、培養皿の内面にはＰＣ１２細胞が定着し、増殖しているのが確認された。
【００６９】
ラミニンを被覆した培養皿に移した浮遊細胞は１００μＭのウシラクトフェリン(bLf)存在下にもかかわらず、浮遊細胞数が減少し、培養皿底面に定着して発育する細胞数が増加した(bLf+,Lam+)。ところが、フィブロネクチンを被覆した培養皿に移した浮遊細胞は、浮遊状態を維持し発育した(bLf+,FN+)。従って、ウシラクトフェリン(bLf)の神経細胞に対する接着抑制効果は、神経細胞に発現するインテグリンとラミニン間で形成されるインテグリン依存性の細胞接着には無効であることがわかる。
【実施例９】
【００７０】
ウシラクトフェリン(bLf)がＰＣ１２細胞に直接結合して作用していることを確認するために、ＰＣ１２細胞にビオチン化ｂＬｆ（ｂ−ｂＬｆ）を添加し、２４時間後に全細胞を回収・洗浄し、細胞を可溶化後、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳導に供し、さらにナイトロセルロース膜にブロットした後にｂ−ｂＬｆの結合を解析した。泳動パターンは図９に示す通りとなった。
【００７１】
図９において、（ａ）はｂ−ｂＬｆ単独処置、（ｂ）はｂ−ｂＬｆ＋ｂＬｆ 100 μM、（ｃ）はｂ−ｂＬｆ+ｂＬｆ ５００ μM、（ｄ）はｂ−ｂＬｆ＋ＢＳＡ１００ μM、（ｅ）はｂ−ｂＬｆ＋ＢＳＡ５００ μMである。
【００７２】
解析の結果、ｂ−ｂＬｆが検出され、ｂ−ｂＬｆがＰＣ１２細胞に直接結合して作用していることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
細胞の浮遊と定着の機構を制御する手段の研究を解明することにより、ヒトや動物の生体組織を再生させる用途にも適用できる可能性がある。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコサミノグリカンを含む細胞培養液からなることを特徴とする細胞定着液。
【請求項２】
前記グリコサミノグリカンがヘパリン又はコンドロイチン硫酸であることを特徴とする請求項１に記載の細胞定着液。
【請求項３】
前記細胞培養液は血清を５〜２０％の濃度範囲で含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞定着液。
【請求項１】
グリコサミノグリカンを含む細胞培養液からなることを特徴とする細胞定着液。
【請求項２】
前記グリコサミノグリカンがヘパリン又はコンドロイチン硫酸であることを特徴とする請求項１に記載の細胞定着液。
【請求項３】
前記細胞培養液は血清を５〜２０％の濃度範囲で含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞定着液。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１１−１１０７７（Ｐ２０１１−１１０７７Ａ）
【公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２２６１４１（Ｐ２０１０−２２６１４１）
【出願日】平成２２年１０月６日（２０１０．１０．６）
【分割の表示】特願２００７−５１２４１０（Ｐ２００７−５１２４１０）の分割
【原出願日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１７年３月１日 第１３９回日本獣医学会学術集会発行の「第１３９回日本獣医学会学術集会 講演要旨集」に発表
【出願人】（５０４３０００８８）国立大学法人帯広畜産大学 (96)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月６日（２０１０．１０．６）
【分割の表示】特願２００７−５１２４１０（Ｐ２００７−５１２４１０）の分割
【原出願日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１７年３月１日 第１３９回日本獣医学会学術集会発行の「第１３９回日本獣医学会学術集会 講演要旨集」に発表
【出願人】（５０４３０００８８）国立大学法人帯広畜産大学 (96)
【Ｆターム（参考）】
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