細胞性免疫原性が向上した抗ウイルスワクチン
本発明は、ウイルス感染症を治療又は予防するための組成物、方法、及びキットを提供する。本明細書に記載される多価（例えば、二価）ワクチンは、ワクチン接種を受けた対象において細胞性免疫応答の多様性又は幅及び深さを増加させることのできる、計算により最適化されたウイルスポリペプチドを組み込む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府助成研究に関する記載
本研究は、ＮＩＨ交付番号第Ｕ１９−ＡＩ０６６３０５号及び同第Ｕ１９−ＡＩ０７８５２６号から一部資金提供を受けている。政府は本発明に対して特定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ウイルス感染症を治療又は予防するための組成物、方法、及びキットを提供する。本明細書に記載される多価（例えば、二価）ワクチンは、ワクチン接種を受けた対象における細胞性免疫応答の多様性又は幅及び深さを増加させることのできる、計算により最適化されたウイルスポリペプチドを組み込む。
【背景技術】
【０００３】
ウイルスに対する細胞性免疫応答を誘発するワクチンは、ウイルス感染症を効果的に治療又は予防するため広域のウイルス多様性を反映しなければならない。例えば、強力で多様なＨＩＶ−１特異的Ｔ細胞応答の惹起は、有効なＨＩＶ−１ワクチンには極めて重要であると思われる。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答はヒトにおける疾患進行の遅延と相関し、非ヒト霊長類ワクチン接種モデルにおけるＣＴＬ応答の重要性は十分に確立されている。大きいばらつきのあるエンベロープ（Ｅｎｖ）がＨＩＶに対する中和抗体の一次標的であり、ワクチン抗原もまた、それらの抗体応答を誘発するように作ることが必要となり得るが、Ｔ細胞ワクチン成分は、より保存されているタンパク質を標的化し、交差反応する可能性がより高い応答を引き起こすことができる。しかし、最も保存されているＨＩＶ−１タンパク質でさえ、ばらつきが問題となり得るのに十分な多様性を有する。コンセンサス及び祖先ＨＩＶ−１配列などの人工的な中心配列のワクチン手法は、本質的に株間の「違いを分ける」もので、天然株ワクチンと比較して交差反応性が亢進した応答を刺激することができる。コンセンサス抗原は、あらゆる循環株の唯一最良の「平均」である合成抗原配列に相当する。こうした抗原は特異的細胞性免疫応答を誘発することができるが、その応答の幅及び強度は、これまでのワクチン戦略と比べて実質的に向上していない。ウイルス感染症を治療又は予防する次世代ワクチンの開発は、ワクチン接種が奏功する結果をもたらすことができるように、細胞性免疫の幅の増加を引き出すものでなければならない。かかるワクチンは、特にＨＩＶ−１の治療又は予防に差し迫って必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
第１の態様において、本発明は、少なくとも２個の別個の最適化ウイルスポリペプチド（例えば、２、３、４、５個、又はそれ以上の別個の最適化ウイルスポリペプチド）を含む、ヒトなどの哺乳動物におけるウイルス感染症を治療し、又はそのリスクを低減するワクチンを特徴とし、ここで最適化ウイルスポリペプチドは、同じウイルス遺伝子産物に対応する。一実施形態において、ウイルス感染症は、レトロウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、カリシウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、アストロウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、又はポリオーマウイルスにより引き起こされる。他の実施形態において、レトロウイルスはヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）であり、及びウイルス遺伝子産物は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、又はＶｐｕを含む。さらなる実施形態において、ワクチンは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、又はＶｐｕウイルス遺伝子産物のうちの１つに対応する最適化ウイルスポリペプチドを２個以下含む。別の実施形態において、ワクチンは、Ｇａｇ及びＮｅｆに対応する最適化ウイルスポリペプチドを含まない。さらに別の実施形態において、ワクチンは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、及びＶｐｕから選択される第１のウイルス遺伝子産物についての少なくとも２個の別個の最適化ウイルスポリペプチド（例えば、２、３、４、５個、又はそれ以上の別個の最適化ウイルスポリペプチド）と、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、及びＶｐｕから選択される第１のウイルス遺伝子産物と異なる第２のウイルス遺伝子産物についての１つ又は複数の別個の最適化ウイルスポリペプチド（例えば、２、３、４、５個、又はそれ以上の別個の最適化ウイルスポリペプチド）とを含む。
【０００５】
第２の態様において、本発明は、ヒトなどの哺乳動物におけるヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）感染症を治療し、又はそのリスクを低減するワクチンであって、配列番号１〜２９に示される配列のいずれか１つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００又はそれ以上の連続するアミノ酸長）を有する最適化ウイルスポリペプチドを含むワクチンを特徴とする。一実施形態において、最適化ウイルスポリペプチドは、配列番号１〜２９に示される配列のいずれか１つとアミノ酸配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００又はそれ以上の連続するアミノ酸長）を有する。別の実施形態において、最適化ウイルスポリペプチドは、配列番号１〜２９に示される配列のいずれか１つのアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、ワクチンは、ａ）〜ｋ）群の任意の１つ又は複数から選択される少なくとも２個の最適化ウイルスポリペプチドを含む：ａ）配列番号１及び２；ｂ）配列番号３、４、及び５；ｃ）配列番号６及び７；ｄ）配列番号８〜１２；ｅ）配列番号１３、１４、及び１５；ｆ）配列番号１６、１７、及び１８；ｇ）配列番号１９及び２０；ｈ）配列番号２１、２２、及び２３；ｉ）配列番号２４及び２５；ｊ）配列番号２６及び２７；並びにｋ）配列番号２１〜２２。別の実施形態において、ワクチンは、上記のａ）〜ｋ）群のいずれか１つから選択される最適化ウイルスポリペプチドと、同じ、又は異なるａ）〜ｋ）群からの１つ又は複数の異なる最適化ウイルスポリペプチドとの対を含むことができる。他の実施形態において、ワクチンは、ａ）〜ｋ）群の１つ又は複数からの少なくとも３個又は４個又はそれ以上の最適化ウイルスポリペプチドを含むことができる。
【０００６】
第３の態様において、本発明は、別個の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも２つの対を含む、ヒトなどの哺乳動物におけるウイルス感染症を治療し、又はそのリスクを低減するワクチンを特徴とし、ここで最適化ウイルスポリペプチドの各対は同じウイルス遺伝子産物に対応し、及びここでワクチンに組み込まれた２個以下の最適化ウイルスポリペプチドは、同じウイルス遺伝子産物に対応する。一実施形態において、ワクチンは、別個の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも３つの対を含む。別の実施形態において、ワクチンは、別個の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも４つの対を含む。一実施形態において、ウイルス感染症は、レトロウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、カリシウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、アストロウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、又はポリオーマウイルスにより引き起こされる。他の実施形態において、レトロウイルスはヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）であり、及びウイルス遺伝子産物は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、又はＶｐｕを含む。さらなる実施形態において、ワクチンは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、又はＶｐｕウイルス遺伝子産物のうちの１つに対応する最適化ウイルスポリペプチドを２個以下含む。別の実施形態において、ワクチンは、Ｇａｇ及びＮｅｆに対応する最適化ウイルスポリペプチドを含まない。さらなる実施形態において、ワクチンは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、又はＶｐｕウイルス遺伝子産物のうちの任意の３つに対応する別個の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも３つの対を含む。別の実施形態において、ワクチンは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、又はＶｐｕウイルス遺伝子産物のうちの任意の４つに対応する別個の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも４つの対を含む。
【０００７】
本発明の最初の３つの態様のうちの任意の一実施形態において、ワクチンは、ウイルス遺伝子産物に対する細胞性免疫応答を誘発する。別の実施形態において、ワクチンは、ＨＩＶ−１に対する細胞性免疫応答を誘発する。さらなる実施形態において、少なくとも１つの別個の最適化ウイルスポリペプチドのヌクレオチド配列は、核酸又はベクターによりコードされる。一実施形態において、ベクターは、アデノウイルス血清型２６（Ａｄ２６）、アデノウイルス血清型３４（Ａｄ３４）、アデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）、アデノウイルス血清型４８（Ａｄ４８）、又はアデノウイルス血清型５ ＨＶＲ４８（Ａｄ５ＨＶＲ４８）などの組換えアデノウイルスである。さらなる実施形態において、ワクチンは、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤と組み合わせたものである。
【０００８】
第４の態様において、本発明は、配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００又はそれ以上の連続するアミノ酸長）を有する最適化ウイルスポリペプチドのヌクレオチド配列を含む核酸を特徴とする。一実施形態において、最適化ウイルスポリペプチドは、配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００又はそれ以上の連続するアミノ酸長）を有する。別の実施形態において、最適化ウイルスポリペプチドは、配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを有する。さらなる実施形態において、核酸はベクターを含む。一実施形態において、ベクターは、アデノウイルス血清型２６（Ａｄ２６）、アデノウイルス血清型３４（Ａｄ３４）、アデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）、アデノウイルス血清型４８（Ａｄ４８）、又はアデノウイルス血清型５ ＨＶＲ４８（Ａｄ５ＨＶＲ４８）などの組換えアデノウイルスである。
【０００９】
第５の態様において、本発明は、配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００又はそれ以上の連続するアミノ酸長）を有する最適化ウイルスポリペプチドを特徴とする。一実施形態において、最適化ウイルスポリペプチドは、配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００又はそれ以上の連続するアミノ酸長）を有する。別の実施形態において、最適化ウイルスポリペプチドは、配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを有する。
【００１０】
第６の態様において、本発明は、本発明のワクチン又は核酸を投与することにより、ヒトなどの哺乳動物におけるウイルス感染症を治療し、又はそのリスクを低減する方法を特徴とする。一実施形態において、ウイルス感染症は、レトロウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、カリシウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、アストロウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、又はポリオーマウイルスにより引き起こされる。さらなる実施形態において、レトロウイルスはヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）であり、及びウイルス遺伝子産物は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、又はＶｐｕを含む。一実施形態において、ワクチン又は核酸は、ウイルス遺伝子産物に対する細胞性免疫応答を誘発する。
【００１１】
第７の態様において、本発明は、本発明のワクチンを合成することによる、ヒトなどの哺乳動物におけるウイルス感染症を治療し、又はそのリスクを低減するワクチンの製造方法を特徴とする。
【００１２】
第８の態様において、本発明は、本発明の核酸を細胞と接触させ、及び最適化ウイルスポリペプチドを単離することによる、ヒトなどの哺乳動物におけるウイルス感染症を治療し、又はそのリスクを低減するワクチンの製造方法を特徴とする。
【００１３】
本発明の第７又は第８の態様の一実施形態において、最適化ウイルスポリペプチドは、哺乳動物に投与されると細胞性免疫応答を誘発する。細胞性免疫応答は、ウイルス遺伝子産物に対するものであってよい。別の実施形態において、ウイルス感染症は、レトロウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、カリシウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、アストロウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、又はポリオーマウイルスにより引き起こされる。さらなる実施形態において、レトロウイルスはヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）であり、及びウイルス遺伝子産物は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、又はＶｐｕを含む。
【００１４】
第９の態様において、本発明は、キットであって、本発明のワクチンと、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤と、キットの使用説明書とを含むキットを特徴とする。一実施形態において、キットはアジュバントも含む。
【００１５】
最後の態様において、本発明は、キットであって、本発明の核酸と、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤と、キットの使用説明書とを含むキットを特徴とする。一実施形態において、キットはアジュバントも含む。
【００１６】
本発明の全ての態様のある実施形態では、最適化ウイルスポリペプチドは、ヒトでの発現用に最適化されている核酸配列によりコードされる（例えば、配列番号５、１０、１１、１２、１５、１８、及び２３のうちの任意の１つ）。
【００１７】
定義
「最適化ウイルスポリペプチド」又は「計算により最適化されたウイルスポリペプチド」とは、天然に存在するウイルスペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質ではない免疫原性ポリペプチドを意味する。最適化ウイルスポリペプチド配列は、最初は、哺乳動物（例えば、ヒト）の免疫後に（例えば、本発明のワクチンに組み込まれたときに）生じる抗ウイルス免疫応答（例えば、細胞性又は体液性免疫応答）の幅、強度、深さ、又は寿命を増加させるように、１つ又は複数の天然に存在するウイルス遺伝子産物（例えば、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質）のアミノ酸配列を修飾することによって生成される。従って、最適化ウイルスポリペプチドは「親」ウイルス遺伝子配列に対応し得る；或いは、最適化ウイルスポリペプチドは特定の「親」ウイルス遺伝子配列に対応しなくともよく、ウイルスの様々な株又は疑似種由来の類似配列に対応してもよい。最適化ウイルスポリペプチドに含めることのできるウイルス遺伝子配列に対する修飾としては、アミノ酸付加、置換、及び欠失が挙げられる。本発明の一実施形態において、最適化ウイルスポリペプチドは、２個以上の天然に存在するウイルス遺伝子産物（例えば、天然又は臨床ウイルス分離株）が複合した、又は合体したアミノ酸配列であり、ここでは潜在的な各エピトープ（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又はそれ以上のアミノ酸長の各連続又は重複するアミノ酸配列）が分析及び修飾され、得られる最適化ウイルスポリペプチドの免疫原性が向上している。異なるウイルス遺伝子産物に対応する最適化ウイルスポリペプチドはまた、融合することによって本発明のワクチンへの組み込みを促進することができる。最適化ウイルスポリペプチドの生成方法は、例えば、参照により本明細書に援用されるＦｉｓｈｅｒら「Ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ Ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｏｖｅｒａｇｅ ｏｆ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ Ｇｌｏｂａｌ ＨＩＶ−１ Ｖａｒｉａｎｔｓ」、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３（１）：１００−１０６頁（２００７年）及び国際公開第２００７／０２４９４１号パンフレットに記載される。最適化ウイルスポリペプチド配列が生成されると、標準的な技術（例えば、参照により本明細書に援用される国際公開第２００６／０４０３３０号パンフレット及び国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットに開示されるアデノウイルスベクターなどの組換えウイルスベクター）により対応するポリペプチドを産生し、又は投与することができる。
【００１８】
「薬学的に許容可能な担体」とは、それと共に投与される化合物の治療特性を維持しながら、治療を受ける哺乳動物にとって生理学的に許容可能である担体を意味する。例示的な薬学的に許容可能な担体の一つは生理食塩水である。他の生理学的に許容可能な担体及びそれらの製剤は当業者に公知であり、例えば、参照により本明細書に援用される「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９９０年、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）に記載されている。
【００１９】
「ベクター」とは、下流の遺伝子又はコード領域に作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡコンストラクト（例えば、ポリペプチド又はポリペプチド断片をコードするｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ断片）を意味する。ベクターをレシピエント細胞（例えば、原核又は真核細胞、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞、発現ベクター内のプロモーターに依存する）又は生体（例えばヒトを含む）に導入すると、細胞は、ベクターによってコードされるｍＲＮＡを発現することができ、次にそれが翻訳されて、コードされた本発明の最適化ウイルスポリペプチドとなる。インビトロ転写／翻訳用のベクターもまた当該技術分野において公知であり、本明細書においてさらに記載される。ベクターは、例えば、バクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、又はヘルペスウイルスに由来する遺伝的に改変されたプラスミド、ウイルス、又は人工染色体であってもよい。
【００２０】
「ウイルス遺伝子産物」とは、任意の天然に存在するウイルスペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質、又はその断片を意味する。本発明の一実施形態において、ウイルス遺伝子産物はヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）に由来する。ＨＩＶ−１ウイルス遺伝子産物は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、及びＶｐｕポリペプチドを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】計算により最適化されたＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖウイルスポリペプチドの、アカゲザルにおける全潜在的Ｔ細胞エピトープ（ＰＴＥ）ペプチドに対する幅の拡大を示す図である。最適化ウイルスポリペプチド（青色）で免疫した動物が、最大数のリコールペプチドプールと反応した。
【図２】計算により修飾されたＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖウイルスポリペプチドがエピトープ特異的細胞性免疫応答の幅を拡大することを示す図である。
【図３】本発明の計算により修飾されたウイルスポリペプチドから得られたＨＩＶ−１ウイルス遺伝子産物Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖで免疫した後のアカゲザル、並びにコンセンサスＨＩＶ−１抗原又はＨＩＶ−１クレードＣ分離株抗原で免疫した動物で検出された細胞性免疫応答の幅を示す。最適化ウイルスポリペプチド（青色）で免疫した動物が、最大数のリコールペプチドプールと反応した。動物は非近交系であるため、プールは動物ごとに異なる。Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖは、各々が多くの細胞性免疫応答を誘発し、共通の反応性パターンを有し得る。
【図４】ウイルスポリペプチド（Ｐｏｌ（図４Ａ）、Ｇａｇ（図４Ｂ）、及びＥｎｖ（図４Ｃ））ごとの、種々の試験ワクチン（二価モザイク（Ｍｏｓ２）、Ｍコンセンサス（Ｍｃｏｎ）、及び最適化クレードＣ（ＯｐｔＣ））の間で共有される潜在的エピトープを示すグラフである。図４Ａ〜図４Ｃは、種々のワクチン候補による現在のＨＩＶデータベース完全長ゲノムセット及びＰＴＥペプチドの相対的有効範囲を示す。
【図５】二価モザイク（Ｍｏｓ２）ワクチンに対するＰＴＥペプチド応答数（ここでは重複にかかわらず各応答が独立したイベントと見なされる）が、Ｍ群コンセンサス（Ｍｃｏｎ）ワクチン、及び最適な有効範囲のＭ群集合（ＯｐｔＣ）ワクチン抗原をもたらすように選択された天然ウイルス株ワクチン（最適化クレードＣ（Ｃ天然（最適））に対する応答数と比べて多いことを示すグラフである。図５は、タンパク質、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、及びＣＤ４＋ Ｔ細胞ごとに動物当たりのＰＴＥペプチド応答数を示す。統計的に、Ｍｏｓ２＞Ｍｃｏｎ〜ＯｐｔＣ（Ｍｃｏｎは、ＯｐｔＣより応答が多い傾向を示す）。Ｍｃｏｎと比較したＭｏｓ２のウィルコクソンｐ値：ｐ値＝０．００１０５８。
【図６】Ｔ細胞応答を引き起こすＰＴＥペプチド数を示す図である。ＣＤ８＋ Ｔ細胞において応答を引き起こす二価モザイク（Ｍｏｓ２）ワクチンのＰＴＥペプチドの中位数は１６（値域；１２〜２９）であり、一方、ＣＤ８＋ Ｔ細胞において応答を引き起こすＭｃｏｎペプチドの中位数は６（値域：０〜７）に過ぎず、及びＯｐｔＣペプチドの中位数は３ペプチド（値域：０〜３）に過ぎない。ＣＤ４＋ Ｔ細胞において応答を引き起こす二価モザイク（Ｍｏｓ２）ワクチンのＰＴＥペプチドの中位数は４（値域；２〜６）であり、一方、ＣＤ４＋ Ｔ細胞において応答を引き起こすＭｃｏｎペプチドの中位数は１（値域：０〜２）に過ぎず、及びＯｐｔＣペプチドの中位数は０．５ペプチド（値域：０〜２）に過ぎない。従って、応答の傾向はＭｏｓ２＞Ｍｃｏｎ＞ＯｐｔＣである。
【図７】被験動物の各々に由来するＴ細胞によって認識される全てのＣＤ８＋ Ｔ細胞Ｇａｇ ＰＴＥペプチドのマッピングを要約する概略図である（以下の実施例３を参照）。動物番号、ペプチドプール及びペプチド番号を、各反応性ペプチドの境界に表示する。記号は群を示す：＊、Ｍｏｓ２；￥、ＣｏｎＭ；±、ＯｐｔＣ。ここでは例としてＧａｇが挙げられる。動物が非近交系であっても、ＣＤ８応答はクラスタ化する傾向がある。モザイクは、単価ワクチンより有利である可能性がある。モザイクは、より多くの共通の変異体と反応する応答を刺激する確率がより高い。モザイクはまた、カクテル中に存在する種々の型に対する複数の応答を刺激する。従って、モザイクは共通のエスケープ経路を遮断する可能性を有する。本発明者らの研究では、モザイクワクチンは、より多くの重複ペプチドを認識するＴ細胞応答を刺激する傾向があった。反応性ペプチドが局在する多くのホットスポットがある。ＰＴＥペプチドは、ワクチンの評価に使用されるペプチド試薬におけるＨＩＶ−１ Ｍ群の潜在的エピトープ（又は９アミノ酸の連続するストレッチについての９−ｍｅｒ）の有効範囲を最大化するように設計される。必然的に、ＰＴＥペプチドには多数の重複が存在するが、そのアルゴリズムに起因して、重複は通常、いくらかのばらつきを伴う重複である。図７は配列番号４２を開示する。
【図８】被験動物の各々に由来するＴ細胞により認識されるＣＤ４＋ Ｔ細胞Ｇａｇ ＰＴＥペプチドのマッピングを要約する概略図である。図８は配列番号４３を開示する。
【図９】ＣｏｎＭワクチン又は最適天然ワクチンに対するＰＴＥ応答の典型的なパターンを示す図であり、応答を誘発するペプチドをワクチンの関連領域と整列させている。これらのワクチンに対する反応を実現するには、ワクチンと標的ＰＴＥペプチドとの間の途切れのない同一のストレッチによる良好なマッチが必要である。図９は、掲載順にそれぞれ配列番号４４〜５７を開示する。
【図１０】モザイクワクチンが、見かけ上の抗原競合なしに、且つ広範な局所的応答で、複数の変異重複ペプチドを認識する多くの応答を生じたことを示す図である。特に、４個の変異ＰＴＥペプチドが認識された。さらに、重複の領域では双方のモザイク型が、それら２つの組み合わせと同様に認識された。最後に、新規の型（Ｓ）が認識された。図１０は、掲載順にそれぞれ配列番号５８〜６３を開示する。
【図１１】モザイクワクチン接種を受けた動物（３６１−０７）におけるＣＤ８＋ ＰＴＥペプチド応答の典型的なパターンを示す図である。２２個のＰＴＥペプチドを試験し、８個のＣＤ８応答領域が同定された；５個の領域が、モザイクのいずれか１つのアミノ酸にマッチする変異ペプチドを含んだ。５個のＣＤ４応答領域が同定された。このように、モザイクに対するＴ細胞応答は、所与の領域においてより多くの変異ペプチドが分かる。これは、特にＣＤ８ Ｔ細胞応答に当てはまるように思われた。これは、エピトープの変異体を認識する複数のＴ細胞クローンをもたらし、それらが適応されるエスケープ経路を遮断し得る結果であり得る。より多くの応答があるのみならず、それらはより深く、且つより多くの変異体を網羅する。図１１は、掲載順にそれぞれ配列番号６４〜１０１としてＣＤ８応答を開示する。ＣＤ４応答は、掲載順にそれぞれ配列番号１０２〜１１７として開示される。
【図１２】ワクチンにより誘発されたＴ細胞によって標的化される領域にわたる重複変異ＰＴＥペプチドの数を示すグラフである。
【図１３】２モザイク抗原ワクチンが、Ｍｃｏｎ及びＯｐｔＣワクチンと比べて、１つ又は複数の重複ＰＴＥペプチドを含む領域に対するより多くのＴ細胞応答をもたらすことを示すグラフである。図１３は図５と同様であり、サルが右から左に同じ順序で示されるが、単一のペプチドではなく１つ又は複数の重複ＰＴＥペプチドを含む領域に対する応答数を反映して尺度を変えている。
【図１４】二価モザイク（Ｍｏｓ２）、Ｍｃｏｎ、及びＯｐｔＣワクチンを投与した後の動物におけるＴ細胞応答数を示す図である。ＣＤ８＋ Ｔ細胞において二価モザイク（Ｍｏｓ２）ワクチンが引き起こす応答の中位数は８であり、一方、Ｍｃｏｎ及びＯｐｔＣワクチンにより引き起こされるＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の中位数は、それぞれ３ペプチド（値域：０〜６）及び１．５ペプチド（値域：０〜５）に過ぎない。ＣＤ４＋ Ｔ細胞において二価モザイク（Ｍｏｓ２）ワクチンが引き起こす応答の中位数は３（値域；２〜５）であり、一方、Ｍｃｏｎ及びＯｐｔＣワクチンにより引き起こされるＣＤ４＋ Ｔ細胞応答の中位数は、それぞれ１（値域：０〜２）及び０．５（値域：０〜２）に過ぎない。従って、応答の傾向はＭｏｓ２＞Ｍｃｏｎ＞ＯｐｔＣである。
【図１５】モザイクワクチンが、Ｃクレード天然ワクチンと比べて、Ｃクレード天然タンパク質と交差反応する応答をより多く誘発できることを示すグラフである：ＧＡＧプールペプチドが５個のタンパク質に相当する。Ｍ群コンセンサス又は最適な有効範囲のＣクレード天然タンパク質によるワクチン接種を受けた動物は、これらのタンパク質に由来するペプチドに対する０〜２つの応答を有したが、一方、モザイクワクチン接種を受けた動物は、１〜５つのペプチドプールに対して応答することができた。モザイクワクチンは、Ｍ ｃｏｎ又は最適Ｃのいずれと比べても、試験したタンパク質の各々に対するより多くの応答を誘発する。モザイクワクチンにより誘発されたＴ細胞応答はまた、実際のＧａｇタンパク質にわたるプールペプチドセットをより多く認識した。１０〜１２サブプール＝１０×１５ｍｅｒペプチド（５×２０ｍｅｒペプチドである９６ＺＭ Ｇａｇを除く）。
【図１６】モザイク設計が、時間の経過に伴うウイルスポリペプチドの変化に対してロバストであることを示すグラフである（例えば、Ｇａｇ Ｍ）。
【図１７】９−ｍｅｒ最適化を使用した有効範囲が、準（例えば、８〜１２ｍｅｒ）最適化長さと比べてロバストであることを示すグラフである（Ｇａｇを図示）。
【図１８】変異体数が増加すると有効範囲が大きくなるが、あくまでも収穫逓減を有することを示すグラフである（Ｇａｇを図示）。
【図１９】ＰＴＥペプチドに対するエピトープ特異的Ｔリンパ球応答の幅及び大きさを示すグラフである。図１９Ａは、モザイク（青色）、Ｍコンセンサス（緑色）、クレードＢ＋クレードＣ（紫色）、又は最適天然クレードＣ（赤色）ＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原を発現するｒＡｄ２６ベクターの単回免疫後の個々のＰＴＥペプチドに対するエピトープ特異的ＣＤ４＋（上側）及びＣＤ８＋（下側）Ｔリンパ球応答の数を示すグラフである。個々のサルをｘ軸上に示す。各色の異なる陰影は、異なる抗原（Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ）に対する応答を反映している。図１９Ｂは、ＣＤ４＋（上側）及びＣＤ８＋（下側）Ｔリンパ球応答領域の数を示すグラフである。
【図２０Ａ】ＨＩＶ−１ Ｇａｇ（図２０Ａ）（配列番号１１８）、Ｐｏｌ（図２０Ｂ）（配列番号１１９）、及びＥｎｖ（図２０Ｃ）（配列番号１２０）タンパク質配列にマッピングした免疫後４週目のＰＴＥペプチドに対するＣＤ８＋ Ｔリンパ球応答を示す概略図を示す。色は、モザイク（青色）、Ｍコンセンサス（緑色）、クレードＢ＋クレードＣ（紫色）、又は最適天然クレードＣ（赤色）ＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原の投与を受けたサルを示す。各エピトープについて、サル番号、抗原（Ｇ、Ｇａｇ；Ｐ、Ｐｏｌ；Ｅ、Ｅｎｖ）、サブプール番号、及び個々のＰＴＥペプチド番号が示される。
【図２０Ｂ−１】図２０Ａの続きである。
【図２０Ｂ−２】図２０Ｂ−１の続きである。
【図２０Ｃ】図２０Ｂ−２の続きである。
【図２１Ａ】ＨＩＶ−１ Ｇａｇ（図２１Ａ）（配列番号１２１）、Ｐｏｌ（図２１Ｂ）（配列番号１２２）、及びＥｎｖ（図２１Ｃ）（配列番号１２３）タンパク質配列にマッピングした免疫後４週目のＰＴＥペプチドに対するＣＤ４＋ Ｔリンパ球応答を示す概略図を示す。色は、モザイク（青色）、Ｍコンセンサス（緑色）、クレードＢ＋クレードＣ（紫色）、又は最適天然クレードＣ（赤色）ＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原の投与を受けたサルを示す。各エピトープについて、サル番号、抗原（Ｇ、Ｇａｇ；Ｐ、Ｐｏｌ；Ｅ、Ｅｎｖ）、サブプール番号、及び個々のＰＴＥペプチド番号が示される。
【図２１Ｂ】図２１Ａの続きである。
【図２１Ｃ】図２１Ｂの続きである。
【図２２−１】モザイク、Ｍコンセンサス、クレードＢ＋クレードＣ、又は最適天然クレードＣ ＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原を発現するｒＡｄ２６ベクターによる免疫後４週目の全てのサルにおけるワクチン配列の反応性ＰＴＥペプチドとのアラインメントを示す概略図である。各サルについて、ワクチン配列を一番上に示し、抗原（Ｇ、Ｇａｇ；Ｐ、Ｐｏｌ；Ｅ、Ｅｎｖ）及びＰＴＥペプチド番号により表される反応性ＰＴＥペプチドを、ワクチン配列の下に示す。最小重複領域は太字で示す。２つのモザイク又は２つのクレードＢ＋クレードＣ抗原の間の配列多型は青色で示す。ワクチン配列と反応性ＰＴＥペプチドとの間の違いは赤色で示す。図２２は、掲載順にそれぞれ配列番号１２４〜６４０を開示する。反応性ペプチドの間の重複が生じるときのその重複に基づき免疫応答エピトープを含む可能性があるペプチド内の最小領域は、ワクチンにおいて太字とする。重複ペプチドがない場合、エピトープがペプチドのどこにでもあり得ると仮定し、従って領域全体を太字とする。ペプチド内で種々の境界を有するエピトープを標的とする種々のＴ細胞応答、又は変異体が存在するときにばらつきを許容することのできるより雑多なクローン性Ｔ細胞応答の間を区別することはできない；いずれのシナリオも、ワクチン免疫応答において有利となり得る。標的化される領域の数は、データを考慮するのに必要な最小Ｔ細胞応答数に対応する。ワクチンとペプチドとがマッチしないアミノ酸は赤色で記す；アミノ酸がエピトープを含んでいる可能性のある領域内に収まる場合、それらは太字赤色とする。複数のペプチドが重複するときの重複領域外でのアミノ酸の違いは赤色で標示し、しかし太字にはしない。ワクチンが常に一番上である。各タンパク質の文字（ＧａｇはＧであり、ＰｏｌはＰであり、エンベロープはＥである）及びペプチド番号を用いて各反応性ＰＴＥペプチドを表示する。タンパク質及びＨＸＢ２番号が各ペプチドに続く。モザイク及びクレードＢ＋Ｃワクチンについては２個の抗原があり、各々が双方ともアラインメントに含まれる；ワクチンにおけるアミノ酸の違いは青色で指示し、及び反応性ペプチドが第２のモザイクに変異アミノ酸を含む場合、それも青色とする。２つのワクチン抗原が異なる位置の各々において反応性ペプチドをさらに太字で標示し、２つの変異が含まれているその位置がワクチン免疫応答に影響を与え、より大きい幅及び深さをもたらした可能性があることを示す。例えば、要約される最初のワクチンはクレードＢ＋Ｃワクチンであり、動物２８７−９５が、それについての応答が掲載される最初の動物である。ＰＴＥペプチドに対してＣＤ８応答が３つあり、ＣＤ４に対して１つあった。ＣＤ８ペプチドのうちの２つ、Ｅ２６及びＥ２８２は実質的な重複を示し、従って双方が同じＣＴＬ応答を標的とし得る；このように、２つのＣＤ８応答領域のみと、１つのＣＤ４応答領域とがあることも記載する。各応答領域について領域当たりの重複ペプチドの数を書き出すことで（例えば、ＣＤ８：１ ２ ＣＤ４：１）、応答の深さを評価する；２つは赤色とし、その重複の領域は反応性ペプチドにばらつきがあることを示す。ワクチンが異なる場合、２番目の反応性領域におけるＤ／Ｅのように、それを青色で標示する。重複の領域のみは太字である。Ｅ２８２におけるＨはいずれのワクチンにも認められなかったため、赤色で標示する；これは重複の領域内にあるため、太字としている。各反応性ペプチドは、そのタンパク質及び対応するＨＸＢ２番号を有し、右側に記載する。
【図２２−２】図２２−１の続きである。
【図２２−３】図２２−２の続きである。
【図２２−４】図２２−３の続きである。
【図２２−５】図２２−４の続きである。
【図２２−６】図２２−５の続きである。
【図２２−７】図２２−６の続きである。
【図２２−８】図２２−７の続きである。
【図２２−９】図２２−８の続きである。
【図２２−１０】図２２−９の続きである。
【図２２−１１】図２２−１０の続きである。
【図２２−１２】図２２−１１の続きである。
【図２２−１３】図２２−１２の続きである。
【図２２−１４】図２２−１３の続きである。
【図２２−１５】図２２−１４の続きである。
【図２２−１６】図２２−１５の続きである。
【図２２−１７】図２２−１６の続きである。
【図２２−１８】図２２−１７の続きである。
【図２３】全てのＧａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ特異的ＣＤ８＋（図２３Ａ及び図２３Ｂ）及びＣＤ４＋（図２３Ｃ）Ｔリンパ球応答の大きさを、最低値から最高値まで並べて示すグラフである。
【図２４Ａ−Ｂ】ＰＴＥペプチドに対するエピトープ特異的Ｔリンパ球応答の深さを示す。図２４Ａは、最適天然クレードＣ抗原の投与を受けたサル３６６におけるマッピングしたＴリンパ球応答の例を示す概略図である。図２４Ｂは、二価モザイク抗原の投与を受けたサル３６１におけるマッピングしたＴリンパ球応答の例を示す概略図である。図２４Ａ及び図２４Ｂでは、ワクチン配列を一番上に示し（ＯｐｔＣ；Ｍｏｓ１、Ｍｏｓ２）、抗原（Ｇ、Ｇａｇ；Ｐ、Ｐｏｌ；Ｅ、Ｅｎｖ）及びＰＴＥペプチド番号により表される反応性ＰＴＥペプチドを、ワクチン配列の下に示す。最小重複領域は太字で示す。２つのモザイク抗原間の配列多型は青色で示す。ワクチン配列と反応性ＰＴＥペプチドとの違いは赤色で示す。応答領域ごとにまとめた全ての陽性ペプチドの完全アラインメントは、図２２に示す。図２４Ｃは、モザイク、Ｍコンセンサス、クレードＢ＋クレードＣ、又は最適天然クレードＣ抗原を発現するｒＡｄ２６ベクターで免疫した後のＣＤ４＋（上側）及びＣＤ８＋（下側）Ｔリンパ球応答の深さを示すグラフである。個々のサルをｘ軸上に示す。各エピトープ領域について、１つの応答変異体（薄い陰影）又は１つより多い応答変異体（濃い陰影）を示す。図２４Ａは、掲載順にそれぞれ配列番号６４１〜６５０を開示する。図２４Ｂは、掲載順にそれぞれ配列番号６５１〜６８５を開示する。
【図２４Ｃ】図２４Ａ−Ｂの続きである。
【図２５】クレードＡ、Ｂ、及びＣ由来のＨＩＶ−１ Ｇａｇペプチドに対するエピトープ特異的Ｔリンパ球応答の幅を示すグラフである。細胞性免疫応答の幅を、以下のＨＩＶ−１ Ｇａｇ株由来の重複ペプチドのサブプールを利用して評価した：クレードＣ ＤＵ４２２、クレードＣ ＺＭ６５１、コンセンサスＣ、コンセンサスＡ、及びコンセンサスＢ。モザイク（青色）、Ｍコンセンサス（緑色）、クレードＢ＋クレードＣ（紫色）、又は最適天然クレードＣ（赤色）ＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原を発現するｒＡｄ２６ベクターの単回免疫後の陽性サブプールの数を示す。個々のサルをｘ軸上に示す。
【図２６Ａ−Ｂ】追加免疫後の細胞性及び体液性免疫応答を示すグラフである。各サルについてプライミング後４週目（各パネルの左側）及び追加免疫後４４週目（各パネルの右側）の個々のＴリンパ球応答の大きさ（図２６Ａ）及び幅（図２６Ｂ）を示す。サルは、０週目にｒＡｄ２６ベクターでプライミングし、４０週目に、モザイク、Ｍコンセンサス、又は最適天然クレードＣ ＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原を発現するｒＡｄ５ＨＶＲ４８ベクターで追加免疫した。個々のサルをｘ軸上に示す。図２６Ａでは、赤色はＣＤ８＋ Ｔリンパ球応答を表し、青色はＣＤ４＋ Ｔリンパ球応答を表し、線は双方の時間点で観察された応答を表し、及び点は一方の時間点でのみ観察された応答を表す。図２６Ｂでは、各色の異なる陰影が、異なる抗原（Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ）に対する応答を反映している。図２６Ｃは、０週目、４週目、及び４４週目におけるＥｎｖ特異的ＥＬＩＳＡエンドポイント力価を示すグラフである。図２６Ｄは、４４週目における第１層クレードＡ（ＤＪ２６３．８）、クレードＢ（ＳＦ１６２．ＬＳ）、及びクレードＣ（ＭＷ９６５．２６）ウイルスに対する中和抗体（ＮＡｂ）力価を示すグラフである。陰性対照としてのマウス白血病ウイルスに対するＮＡｂ力価は、いずれの試料についても２０未満であった。
【図２６Ｃ−Ｄ】図２６Ａ−Ｂの続きである。
【図２７】様々なワクチン抗原ごとのＰＴＥペプチドの理論的な有効範囲を示すグラフである。モザイク（青色）、Ｍコンセンサス（緑色）、クレードＢ＋クレードＣ（紫色）、又は最適天然クレードＣ（赤色）ＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原により網羅される９アミノ酸ＰＴＥペプチドのパーセンテージを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、天然に存在するウイルス遺伝子産物から計算により得られる最適化ウイルスポリペプチドを特徴とする。本発明の最適化ウイルスポリペプチドは、本発明の１つ若しくは複数の最適化ウイルスポリペプチド又は本発明の１つ若しくは複数の最適化ウイルスポリペプチドを組み込むワクチン（例えば、ベクター）で対象（例えば、ヒト）を免疫した後の、ウイルス特異的免疫（例えば、Ｔ細胞に基づく免疫応答などの細胞性免疫）の幅及び深さの増加を可能とする。本発明は、ウイルス感染症に感染した、又は感染するリスクがある対象（例えば、ヒト）に投与することのできるワクチンを提供する。本発明のワクチンは、代表される各対応するウイルス遺伝子産物についての少なくとも２個の別個の最適化ウイルスポリペプチドを組み込む。少なくとも２個の別個の最適化ウイルスポリペプチドを組み込むことにより、ワクチンにおける免疫原性エピトープの有効範囲及び代表性を高めることが可能となり、本発明者らが発見したこのことにより、対象のワクチン接種後にウイルス特異的免疫応答の総数の増加がもたらされる。本発明はまた、ワクチン、ベクター、及び最適化ウイルスポリペプチドを対象（例えば、ヒト）に投与する方法、及びそれらを製造する方法も提供する。本明細書に記載される組成物、方法、及びキットは、少なくとも２個の別個の最適化ウイルスポリペプチドを提供することによってウイルス特異的細胞性免疫応答の多様性、幅、及び／又は深さを実質的に増加させることができる。
【００２３】
本発明の最適化ウイルスポリペプチド
本発明は、自然に循環しているウイルス遺伝子産物に対応し、且つそれから得られる計算により最適化されたウイルスポリペプチドを組み込む多価（例えば、二価）ワクチンを提供する。多価モザイクタンパク質は、天然配列からインシリコ組換えにより構築され、所与の結合価に対する潜在的なＴ細胞エピトープ（ＰＴＥ）の最大の有効範囲を提供するように最適化される。モザイク抗原は、天然抗原の発現及びプロセシングを維持するように設計される完全長タンパク質である。
【００２４】
本発明者らは、単一のウイルス遺伝子産物に対応し、且つそれから得られる２つの別個の最適化ウイルスポリペプチド（すなわち、二価ワクチン）で免疫すると、同じウイルス遺伝子産物から得られる天然に存在するポリペプチド（例えば、臨床分離株に基づく配列）、又は同じウイルス遺伝子産物から得られるかかる天然に存在するポリペプチドのコンセンサス配列を組み込む従来の単価又は多価ワクチンより実質的に多い数の細胞性免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答）が誘発されることを発見した。従って、計算により最適化されたウイルスポリペプチドであって、その配列が循環ウイルス配列の希少でなく短いストレッチの最大有効範囲を提供する最適化ウイルスポリペプチドを組み込むワクチンは、免疫応答の幅及び深さを増加させることができる。
【００２５】
遺伝的アルゴリズムを使用して、入力として提供される天然に存在するウイルス遺伝子産物配列の任意のセットの断片の「モザイク」ブレンドとして最適化ウイルスポリペプチドのセットが作成される。この遺伝的アルゴリズム戦略は、入力データセットとして一般的なウイルス集団からの整列していないタンパク質配列を使用し、従って「アラインメントに依存しない」という長所を有する。これにより、自然界に見られるウイルスタンパク質に類似しているが、天然には存在しない人工的な最適化ウイルスポリペプチドが作り出される。遺伝的アルゴリズムは、目的とする標的の又は所望の免疫応答に応じて、種々の長さのウイルスポリペプチドを最適化するように調整することができる。ほとんどのＴ細胞エピトープは９アミノ酸長であるため、本発明の最適化ウイルスポリペプチドの設計に利用した遺伝的アルゴリズムは、所与のウイルス遺伝子産物（例えば、ＨＩＶ−１ Ｇａｇ）の各々の連続した９−ｍｅｒアミノ酸配列の最適化に基づいた。この手法に従えば、自然界に存在しない、又は極めて希少である９−ｍｅｒ（例えば）を除外することができる−これは、コンセンサス配列に基づくワクチン戦略と比べたとき、コンセンサス配列は、自然界にはまれにしか、又は全く存在しないいくつかの９−ｍｅｒ（例えば）を含み得るため、改良点である。遺伝的アルゴリズムに用いられる適応度の定義は、最も「適応する」多価カクテルが、集団中の全ての９ｍｅｒのなかで最良の有効範囲（最高の完全マッチ率）を与え、且つ集団に存在しない、又はまれである９ｍｅｒがないという制約を受ける入力ウイルス配列の組み合わせであることである。本発明の最適化ウイルスポリペプチドの生成に用いられる遺伝的アルゴリズムについては、参照により本明細書に援用される国際公開第２００７／０２４９４１号パンフレットにさらに記載されている。
【００２６】
一実施形態において、本発明は、単一の最適化されたＨＩＶ−１ポリペプチド（例えば、配列番号１〜２９に示されるポリペプチド）を組み込む多価（例えば、二価）ＨＩＶ−１ワクチンを提供する。別の実施形態において、本発明は、２個以上の最適化されたＨＩＶ−１ポリペプチドを組み込む多価ワクチンを特徴とする。いずれの場合も、最適化ＨＩＶ−１ポリペプチドは、ＨＩＶ−１メイン（Ｍ）群として知られる全体的循環における全てのＨＩＶ−１変異体に基づく。本発明者らは、遺伝子当たり２つの変異体（例えば、各々がＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、及びＶｐｕについての２つのポリペプチド配列）のみを利用するＭ群モザイク遺伝子に基づき細胞性免疫の幅及び深さを増大させる最適化ＨＩＶ−１ポリペプチドのセット（配列番号１〜２９）を生成した。本発明者らは、アカゲザルにおいて、多価（例えば、二価）ＨＩＶ−１ Ｍ群ワクチンにこれらの最適化ＨＩＶ−１ポリペプチドを使用すると、２つの他の有力なワクチン抗原戦略（Ｍコンセンサス抗原及び最適天然クレードＣ抗原）と比較したとき有意に大きい幅及び深さのＨＩＶ−１特異的細胞性免疫応答が誘発されるという新規の、且つ意外な結果を得た。
【００２７】
本発明は、異なるウイルス遺伝子産物に対応する最適化ウイルスポリペプチドの融合を提供する。上記の遺伝的アルゴリズムを用いて、本発明のワクチンに使用される融合ポリペプチドを生成することができる。例えば、Ｇａｇ／Ｎｅｆ（配列番号１９〜２０）と、Ｇａｇ／Ｐｏｌ（配列番号２１〜２７）と、Ｇａｇ／Ｐｏｌ／Ｎｅｆ（配列番号２８〜２９）との最適化ＨＩＶ−１ポリペプチド融合体を、ＨＩＶ−１に感染した、又は感染するリスクがある対象（例えば、ヒト）に投与するため本発明のベクターに組み込むことができる。本発明のワクチンは（ポリペプチド形態であろうと、又は核酸形態であろうと）、例えば、最適クレードＣ配列（配列番号３０〜３６）又はコンセンサス配列（配列番号３７〜３９）などの非「モザイク」ポリペプチド（又はそれぞれ、それをコードする配列）の１つ又は複数も含むことができる。
【００２８】
本発明に開示される最適化ウイルスポリペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９頁（１９６３年）によって記載されるものなどの化学合成技法により従来どおり調製することができる（また、例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒら、１６４ Ｇｅｎｅ ４９（１９９５年）も参照のこと）。例えば、ワクチンは、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いて容易に調製することができる。自動化された固相合成を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ ４３３Ａペプチドシンセサイザーなどの、数多くの周知されている市販の自動シンセサイザーのいずれか一つを使用して行うことができる。或いは、本発明の最適化ウイルスポリペプチドは、最適化ウイルスポリペプチドの細胞内発現を可能にする核酸又はベクター（例えば、アデノウイルスなどのウイルスベクター）を細胞又は生体にトランスフェクト又は形質導入することにより組換え産生することができる。本発明の最適化ウイルスポリペプチドのヌクレオチド配列をコードする核酸及びベクターは、本明細書に記載されるものを含めた公知の組換えＤＮＡ技法により合成することができる。
【００２９】
本発明のワクチン
本発明はまた、ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１）に感染した、又は感染するリスクがある患者に投与することのできるワクチンも特徴とする。本発明のワクチンは、本明細書において考察されるとおりの、本発明の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも１つを含む。本発明のワクチンは、本発明の２個以上の最適化ウイルスポリペプチドのヌクレオチド配列（例えば、組換えの（例えば、サブユニット）又は生体全体の（例えば、ウイルス全体）ウイルスベクターの免疫原性成分）をコードする核酸であってもよい。核酸は、本発明の２個以上の最適化ウイルスポリペプチドのヌクレオチド配列を組み込むベクター（例えば、アデノウイルスなどのウイルスベクター）を含む。本発明の最適化ウイルスポリペプチド、並びに最適化ウイルスポリペプチドを組み込むワクチン、核酸、及びベクターは、細胞若しくは生体において組換え発現させることができ、又はウイルスに感染した、若しくは感染するリスクがある対象（例えば、ヒト）に直接投与することができる。
【００３０】
本発明のベクター
本発明はまた、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドのヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）をコードするベクターも特徴とする。ベクターは、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む担体（例えば、リポソーム）、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体、又はウイルスであってもよい。ベクターは、いくつかの供給源由来のさらなる核酸配列を含むことができる。
【００３１】
本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドをコードするベクターは、当該技術分野において公知の任意の組換え分子生物学的技法を用いて作成することができる。ベクターは、標的細胞又は生体のトランスフェクション又は形質導入後、染色体外にあってもよく、又は宿主細胞の染色体に組み込まれてもよい。ベクターの核酸成分は、標的細胞当たりのコピー数が単一又は複数であってよく、及び直鎖状、環状、又はコンカテマー状であってよい。
【００３２】
本発明のベクターはまた、単一の核酸転写産物からの複数のペプチド鎖又はポリペプチド鎖の発現を可能にする内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列を含むこともできる。例えば、本発明のベクターは、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチド並びに別のポリペプチド（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの検出可能標識）をコードすることができる。
【００３３】
本発明のベクターは、本発明の最適化ウイルスポリペプチドの発現を促進する遺伝子発現エレメントをさらに含む。本発明の最適化ウイルスポリペプチドをコードするベクターの発現に有用な遺伝子発現エレメントとしては、限定はされないが、（ａ）ウイルス転写プロモーター並びにそのエンハンサーエレメント、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、及びモロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲなどの調節配列；（ｂ）ＳＶ４０後期領域に由来するものなどのスプライス領域及びポリアデニル化部位；及び（ｃ）ＳＶ４０などにおけるポリアデニル化部位が挙げられる。また、プラスミド複製起点、抗生物質耐性又は選択遺伝子、多重クローニング部位（例えば、制限酵素切断位置）、及び他のウイルス遺伝子配列（例えば、ＨＩＶ末端反復配列（ＬＴＲ）などの、ウイルスの構造、機能、又は調節エレメントをコードする配列）も含む。
【００３４】
本発明のベクターはまた、例えば、配列番号１１、１４〜１８、及び２３のいずれか一つなどの、ヒトにおける発現用に最適化されている本発明の最適化ウイルスポリペプチドを含むこともできる。
【００３５】
本発明のベクターはまた、以下の酵素切断部位：ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ−Ｋｏｚａｋ−Ｓｔａｒｔ．．．Ｓｔｏｐ−ＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩ；及び以下の配列：ＴＣＴＡＧＡ ＧＡＡＴＴＣ ＧＣＣＡＣＣ［ＡＴＧ遺伝子ＴＡＡ ＴＧＡ］ＧＧＡＴＣＣ ＧＣＴＡＧＣを有する多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含むように改変することもできる。このＭＣＳを有するベクターは、内部的なＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩ部位を有しないとともに、６個以上のＣ又はＧのストレッチを有しない最適化ウイルスポリペプチドと共に用いることができる。
【００３６】
生体内投与
本発明は、本発明の１つ又は複数のワクチン（例えば、本発明の２個以上の最適化ウイルスポリペプチドをコードするベクター）を対象（例えば、ヒト）に生体内投与して本発明の２個以上の最適化ウイルスポリペプチドの発現を促進する方法を特徴とする。ワクチンを対象に投与すると、ウイルス免疫原に対する防御的又は治療的免疫応答（例えば、細胞性又は体液性免疫応答）を誘発することのできる本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドが発現する。
【００３７】
いくつかのタイプのベクターを用いて、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を対象（例えば、ヒト）に直接送達することができる。本発明のベクターとしては、ウイルス、ネイキッドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、カチオン性脂質（例えば、リポソーム）、カチオン性ポリマー（例えば、ポリソーム）、ビロソーム、及びデンドリマーが挙げられる。本発明は、細胞（例えば、血球細胞）のエキソビボでのトランスフェクション又は形質導入を提供し、続いてそれらの細胞をドナー対象に投与し戻すことで、免疫原特性を有する本発明の最適化ウイルスポリペプチドの発現が可能となる。本発明の方法により単離し、エキソビボでトランスフェクト又は形質導入することのできる細胞としては、限定はされないが、血球細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、肝実質細胞、前立腺上皮細胞、及び血管内皮細胞が挙げられる。幹細胞もまた、本発明のベクターの形質導入又はトランスフェクションに適した細胞である。本発明の方法によれば、骨髄前駆細胞及び造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む全能性、多能性、多分化能、又は単能性幹細胞を単離して、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドをコードするベクターをトランスフェクト又は形質導入し、対象に投与することができる。
【００３８】
本発明の最適化ウイルスベクターを発現させるために用いられるトランスフェクション又は形質導入の方法は、トランスフェクト又は形質導入細胞における、及びそれに続いて細胞の投与を受ける対象におけるタンパク質発現の強度及び寿命に強い影響を有する。本発明は、本質的に一時的なベクター（例えば、アデノウイルスベクター）又は長命のベクター（例えば、レトロウイルスベクター）を提供する。タンパク質発現の調節に用いることのできる調節配列（例えば、プロモーター及びエンハンサー）が、当該技術分野において公知である。トランスフェクト又は形質導入される細胞のタイプもまた、タンパク質発現の強度及び寿命と強い関連を有する。例えば、代謝回転速度が高い細胞型は、タンパク質発現の期間がより短いと予想され得る。
【００３９】
エキソビボトランスフェクション及び形質導入
本発明はまた、細胞（例えば、リンパ球などの血球細胞）をエキソビボでトランスフェクト及び形質導入し、続いてそれらの細胞を対象（例えば、ヒト）に投与する方法も特徴とする。一実施形態において、細胞は治療を受ける対象の自己由来である。細胞は、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドのヌクレオチド配列をコードする１つ又は複数のベクターをエキソビボでトランスフェクト又は形質導入することにより、治療対象における最適化ウイルスポリペプチドの一時的又は永久的な発現が可能なものとすることができる。このような修飾細胞を対象に投与すると、ウイルス免疫原に対する防御的又は治療的免疫応答（例えば、細胞性又は体液性免疫応答）を誘発することのできる本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスベクターが発現する。
【００４０】
いくつかのタイプのベクターを用いて、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を細胞（例えば、リンパ球などの血球細胞）に送達することができる。本発明のベクターとしては、ウイルス、ネイキッドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、カチオン性脂質（例えば、リポソーム）、カチオン性ポリマー（例えば、ポリソーム）、ビロソーム、及びデンドリマーが挙げられる。本発明は、細胞（例えば、血球細胞）のエキソビボでのトランスフェクション又は形質導入を提供し、続いてそれらの細胞をドナー対象に投与し戻すことで、免疫原特性を有する本発明の最適化ウイルスポリペプチドの発現が可能となる。本発明の方法により単離し、エキソビボでトランスフェクト又は形質導入することのできる細胞としては、限定はされないが、血球細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、肝実質細胞、前立腺上皮細胞、及び血管内皮細胞が挙げられる。幹細胞もまた、本発明のベクターの形質導入又はトランスフェクションに適した細胞である。本発明の方法によれば、骨髄前駆細胞及び造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む全能性、多能性、多分化能、又は単能性幹細胞を単離して、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドをコードするベクターをトランスフェクト又は形質導入し、対象に投与することができる。
【００４１】
本発明の最適化ウイルスベクターを発現させるために用いられるトランスフェクション又は形質導入の方法は、トランスフェクト又は形質導入細胞における、及びそれに続いて細胞の投与を受ける対象におけるタンパク質発現の強度及び寿命に強い影響を有する。本発明は、本質的に一時的なベクター（例えば、アデノウイルスベクター）又は長命のベクター（例えば、レトロウイルスベクター）を提供する。タンパク質発現の調節に用いることのできる調節配列（例えば、プロモーター及びエンハンサー）が、当該技術分野において公知である。トランスフェクト又は形質導入される細胞のタイプもまた、タンパク質発現の強度及び寿命と強い関連を有する。例えば、代謝回転速度が高い細胞型は、タンパク質発現の期間がより短いと予想され得る。
【００４２】
ウイルスベクター
本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドのヌクレオチド配列をコードするウイルスベクターは、本発明のワクチンとして使用することができる。例えば、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドのヌクレオチド配列は、対象の形質導入（例えば、生体内投与）又は対象から単離された細胞の形質導入（例えば、エキソビボ形質導入と、それに続く対象に細胞を戻す投与）に好適な天然の、又は修飾された（例えば、弱毒化された）ウイルスゲノムのヌクレオチド配列に組換え的に挿入することができる。ウイルスにさらなる修飾を加えることにより、感染力又はトロピズムを高め（例えば、シュードタイピング）、複製能を低下させ、若しくは除去し、又はウイルス成分の免疫原性（例えば、免疫原性ワクチン剤に関連しないあらゆる成分）を低下させることができる。本発明のベクターは形質導入細胞により発現し、細胞外空間に分泌されるか、又は発現細胞に（例えば、細胞内分子として、又は細胞表面に提示されて）留まることができる。キメラ又はシュードタイプのウイルスベクターを細胞の形質導入に使用して、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドの発現を可能にすることもできる。例示的ベクターを以下に記載する。
【００４３】
アデノウイルス
組換えアデノウイルスは、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドを発現させるベクターとしての使用に対し、いくつかの重要な利点を提供する。このウイルスは高力価に調製することができ、非複製細胞に感染することができ、及び標的細胞集団との接触後、エキソビボでの標的細胞の高効率の形質導入をもたらすことができる。さらに、アデノウイルスは、そのＤＮＡを宿主ゲノムに組み込むことがない。従って、それを発現ベクターとして使用すると、自発的増殖性疾患が惹起されるリスクが低減する。動物モデルでは、アデノウイルスベクターは、概して高レベル発現を約１週間にわたり媒介することが分かっている。導入遺伝子発現（本発明の最適化ウイルスポリペプチドをコードする核酸の発現）の持続期間は、細胞又は組織特異的プロモーターを使用することにより延ばすことができる。アデノウイルスベクターそれ自体の分子改変における他の改善点として、より持続的な導入遺伝子発現及び炎症低下がもたらされている。これは、さらなる初期アデノウイルス遺伝子に特異的突然変異を内包するいわゆる「第二世代」ベクター、及びＣｒｅ−Ｌｏｘ戦略を利用して事実上全てのウイルス遺伝子を欠失させる「ガットレス」ベクターに見られる（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：６１９６頁（１９９４年）及びＫｏｃｈａｎｅｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５７３１頁（１９９６年）、各々参照により本明細書に援用される）。
【００４４】
国際公開第２００６／０４０３３０号パンフレット及び国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレット（各々参照により本明細書に援用される）に開示されるまれな血清型及びキメラアデノウイルスベクターは、本発明のベクターとして特に有用である。例えば、組換えアデノウイルスｒＡｄ２６、ｒＡｄ３４、ｒＡｄ３５、ｒＡｄ４８、及びｒＡｄ５ＨＶＲ４８は、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドをコードすることができる。本発明の最適化ウイルスポリペプチドをコードする１つ又は複数の組換えウイルスベクターを対象に投与して、ウイルス感染症を治療又は予防することができる。
【００４５】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
非病原性パルボウイルスに由来するアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）もまた、そのベクターは抗ベクター細胞性免疫応答をほぼ誘起せず、及びほとんどの実験系において数ヶ月持続する導入遺伝子発現をもたらすため、本発明の最適化ウイルスポリペプチドの発現に使用することができる。
【００４６】
レトロウイルス
レトロウイルスは、本発明の最適化ウイルスポリペプチドの発現に有用である。アデノウイルスとは異なり、レトロウイルスゲノムはＲＮＡベースである。レトロウイルスは、細胞に感染すると、そのＲＮＡをいくつかの酵素と共に細胞に導入する。レトロウイルス由来のウイルスＲＮＡ分子は、逆転写と呼ばれる過程を介してプロウイルスと呼ばれる二本鎖ＤＮＡコピーを産生する。細胞核内に輸送された後、プロウイルスＤＮＡは宿主細胞の染色体に組み込まれ、形質導入細胞及びその細胞から派生し得る任意の子孫細胞のゲノムを永久的に変化させる。遺伝子を細胞又は生体に永久的に導入する能力は、遺伝子治療に使用されるレトロウイルスを特徴付ける特性である。レトロウイルスとしては、ウイルス感染及びプロウイルスの組み込みを促進するいくつかのアクセサリータンパク質を含むヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含むウイルスファミリーであるレンチウイルスが挙げられる。現在、「第三世代」レンチウイルスベクターは、完全な複製無能力、広いトロピズム、及び哺乳動物細胞に対する高い遺伝子導入能を特徴とする（例えば、Ｍａｎｇｅａｔ及びＴｒｏｎｏ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １６（８）：９１３頁（２００５年）及びＷｉｚｎｅｒｏｗｉｃｚ及びＴｒｏｎｏ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１）：４２頁（２００５年）（各々参照により本明細書に援用される）を参照）。
【００４７】
他のウイルスベクター
アデノウイルス及びレトロウイルスベクターに加えて、細胞（例えば、リンパ球などの血球細胞）又は対象（例えば、ヒト）における本発明の最適化ウイルスポリペプチドの発現に使用することのできる他のウイルスベクター及び技法が、当該技術分野において公知である。こうしたウイルスとしては、ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス及び修飾ワクシニアウイルスのアンカラすなわち（ＭＶＡ）；例えば、米国特許第４，６０３，１１２号明細書及び同第５，７６２，９３８号明細書（各々参照によって本明細書に援用される）を参照）、ヘルペスウイルス、トガウイルス（例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス；例えば、米国特許第５，６４３，５７６号明細書（参照によって本明細書に援用される）を参照）、ピコルナウイルス（例えば、ポリオウイルス；例えば、米国特許第５，６３９，６４９号明細書（参照によって本明細書に援用される）を参照）、バキュロウイルス、及びＷａｔｔａｎａｐｉｔａｙａｋｕｌ及びＢａｕｅｒにより記載される他のもの（Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．５４：４８７頁（２０００年）（参照によって本明細書に援用される））が挙げられる。
【００４８】
その他の発現ベクター：ネイキッドＤＮＡ及びオリゴヌクレオチド
本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドをコードするネイキッドＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドもまた、細胞（例えば、リンパ球などの血球細胞）又は対象（例えば、ヒト）におけるそうしたポリペプチドの発現に使用することができる。例えば、Ｃｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１６９１−１６９２頁（１９９３年）；Ｆｙｎａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：１１４７８頁（１９９３年）；及びＷｏｌｆｆら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：４７４４８５頁（１９９１年）（各々参照により本明細書に援用される）を参照のこと。これは、非ウイルス性のトランスフェクションの最も単純な方法である。電気穿孔、並びに高圧ガス及び担体粒子（例えば、金）を使用してＤＮＡコーティングされた金粒子を細胞に撃ち込む「遺伝子銃」の使用などの、ネイキッドＤＮＡを送達する効率的な方法が存在する。
【００４９】
リポプレックス及びポリプレックス
本発明の最適化ウイルスポリペプチドをコードする核酸の細胞又は対象への送達を向上させるため、リポプレックス（例えば、リポソーム）及びポリプレックスを使用して、トランスフェクション過程における望ましくない分解からベクターＤＮＡを保護することができる。プラスミドＤＮＡは、ミセル又はリポソームのように組織化された構造の脂質で被覆することができる。組織化された構造がＤＮＡと複合体を形成すると、リポプレックスと称される。３タイプの脂質、すなわちアニオン性（負に帯電している）、中性、又はカチオン性（正に帯電している）がある。カチオン性脂質を利用するリポプレックスは、遺伝子導入に有用であることが分かっている。カチオン性脂質は正電荷であるため、負に帯電したＤＮＡと自然に複合体を形成する。また、その電荷の結果として、カチオン性脂質は細胞膜と相互作用し、リポプレックスのエンドサイトーシスが起こり、細胞質中にＤＮＡが放出される。カチオン性脂質はまた、細胞によるＤＮＡの分解も保護する。
【００５０】
ポリマーのＤＮＡとの複合体はポリプレックスと称される。ほとんどのポリプレックスはカチオン性ポリマーからなり、その生成はイオン相互作用により調節される。ポリプレックスとリポプレックスとの働き方の一つの大きい違いは、ポリプレックスはそのＤＮＡ負荷を細胞質中に放出することができず、従ってそれを目的として不活化アデノウイルスなどのエンドソーム溶解剤のコトランスフェクションを（エンドサイトーシスの間に生じたエンドソームを溶解させるため）行わなければならない。しかしながら、必ずしもこれが常に該当するわけではない；ポリエチレンイミンなどのポリマーは、キトサン及びトリメチルキトサンがそうであるように、その独自のエンドソーム破壊方法を有する。
【００５１】
本発明の最適化ウイルスポリペプチドをコードする核酸と組み合わせてリポプレックス、又はポリプレックスを形成するために使用することのできる例示的なカチオン性脂質及びポリマーとしては、限定はされないが、ポリエチレンイミン、リポフェクチン、リポフェクタミン、ポリリジン、キトサン、トリメチルキトサン、及びアルギン酸塩が挙げられる。
【００５２】
ハイブリッド方法
遺伝子導入のいくつかのハイブリッド方法は、２つ以上の技法を組み合わせる。例えばビロソームは、リポプレックス（例えば、リポソーム）を不活化ウイルスと組み合わせる。この手法は、単独でのウイルスによる方法又はリポソームによる方法のいずれと比べても、呼吸上皮細胞においてより効率的な遺伝子導入をもたらすことが示されている。他の方法は、他のウイルスベクターをカチオン性脂質又はハイブリッド形成ウイルスと混合することを含む。これらの方法の各々を使用して、細胞（例えば、リンパ球などの血球細胞）又は対象（例えば、ヒト）への本発明の最適化ウイルスポリペプチドをコードする核酸の導入を促進することができる。
【００５３】
デンドリマー
また、デンドリマーを使用して、本発明の最適化ウイルスポリペプチドをコードする核酸を細胞（例えば、リンパ球などの血球細胞）又は対象（例えば、ヒト）に導入してもよい。デンドリマーは、球形状の高度に枝分かれした巨大分子である。粒子の表面は、多くの方法で機能化することができ、得られるコンストラクトの特性の多くが、その表面によって決定される。特に、カチオン性デンドリマー（すなわち正の表面電荷を有するもの）を作成することが可能である。ＤＮＡ又はＲＮＡなどの遺伝物質が存在するとき、電荷の相補性により核酸のカチオン性デンドリマーとの一時的な結合がもたらされる。その目標に達すると、次にデンドリマー−核酸複合体は、エンドサイトーシスを介して細胞に取り込まれる。
【００５４】
生体内投与
本発明はまた、対象（例えば、ヒト）を本発明のワクチンで免疫するためのインビボ方法も特徴とする。一実施形態において、本発明の１つ又は複数のワクチンを対象に直接投与して、ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１）に対する防御的又は治療的免疫応答（例えば、細胞性又は体液性免疫応答）を誘発することができる。或いは、上記のとおりの、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドをコードするベクターを対象に直接投与することにより、ウイルス感染症を予防又は治療することができる。１つ又は複数の細胞を生体内に効率的にトランスフェクト又は形質導入するベクター（例えば、ウイルスベクター）は、治療を受ける対象において広域で耐久性があり、且つ強力な免疫応答を誘発することができる。発現ベクターの核酸成分が宿主細胞（例えば、リンパ球などの血球細胞）に導入されると、宿主細胞は本発明のワクチンを産生して提示又は分泌し、次にそれが抗原提示細胞（ＡＰＣ）、Ｔ細胞、及びＢ細胞などの免疫系の成分を活性化する働きをし、その結果、免疫が構築される。
【００５５】
医薬組成物
本発明は、１つ又は複数の薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、緩衝剤、又は他の許容可能な担体と組み合わせた、本発明のワクチン、ベクター、及び最適化ウイルスポリペプチドを特徴とする。ワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドの製剤化は、有効量の最適化ウイルスポリペプチド免疫原の発現を利用し、又は可能にし得る。すなわち、そこには、後のウイルス（例えば、ＨＩＶ−１）に対する曝露からの防御を対象に提供し、又は既存のウイルス感染症を治療するための、特定の十分な免疫応答を治療対象（例えば、ヒト）に生じさせ得る量の抗原が含まれ得る。例えば、本発明のワクチンの製剤化により、広域の且つ特異的な細胞性免疫応答を対象に生じさせ得る量の抗原を発現させることが可能となり得る。本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドで治療される対象はまた、対象に防御的又は治療的利益を付与することのできる抗ウイルス抗体（例えば、中和抗体）を産生することもできる。本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドは、単独で、又は当該技術分野において公知の任意の薬学的に許容可能な担体、塩又は補助剤と組み合わせて、対象に直接投与することができる。
【００５６】
薬学的に許容可能な塩は、製薬業界で一般に用いられている非毒性の酸付加塩又は金属錯体を含み得る。酸付加塩の例としては、酢酸、乳酸、パモン酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、又はトリフルオロ酢酸などの有機酸；タンニン酸、カルボキシメチルセルロースなどのポリマー酸；及び塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸が挙げられる。金属錯体としては、亜鉛、鉄などが挙げられる。薬学的に許容可能な担体の例示的な一つは、生理食塩水である。他の生理学的に許容可能な担体及びその製剤は当業者に公知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、（第１８版）、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９９０年、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡに記載されている。
【００５７】
予防上又は治療上有効量の本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドの医薬製剤は、経口的に、非経口的に（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は皮下注射、吸入、皮内、点眼、又は植え込み）、経鼻的に、経膣的に、経直腸的に、舌下に、又は局所的に、投与経路に適合した薬学的に許容可能な担体と混合して投与することができる。製剤中における本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドの濃度は、約０．１〜１００ｗｔ．％まで様々であり得る。
【００５８】
本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドを含有する組成物の非経口投与製剤は、滅菌水性又は非水性溶液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。好適な媒体の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、ゼラチン、水素化ナフタレン、及び注射用の有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。かかる製剤はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤などの補助剤を含有してもよい。生体適合性、生分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、又はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーを使用して化合物の放出を制御してもよい。本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドを含有する組成物に潜在的に有用な他の非経口送達系としては、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、植込み型注入システム、及びリポソームが挙げられる。
【００５９】
液体製剤は、例えば、細菌保持フィルタを介したろ過によるか、組成物に滅菌剤を組み込むことによるか、又は組成物を照射若しくは加熱することにより、滅菌することができる。或いはまた、液体製剤は、使用直前に滅菌水又は他の何らかの無菌注射用媒質中に溶解することのできる無菌固形組成物の形態で製造されてもよい。
【００６０】
直腸投与又は経膣投与用の本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドを含有する組成物は、好ましくは、作用物質に加えてカカオ脂又は坐薬ワックスなどの賦形剤を含有し得る坐薬である。経鼻投与又は舌下投与用の組成物もまた、当該技術分野において公知の標準的な賦形剤と共に調製される。吸入用製剤は、賦形剤、例えばラクトースを含有してもよく、又は点鼻液若しくは鼻内スプレーの形態で、又はゲルとして投与するため、例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸塩及びデオキシコール酸塩を含有する水溶液であってもよく、又は油性溶液であってもよい。
【００６１】
本発明の組成物中における活性成分の量は様々であり得る。当業者は、投与されるペプチド、投与時間、投与経路、製剤の性質、排泄速度、対象の病態の性質、並びに患者の年齢、体重、健康状態、及び性別を含めた様々な要因に依存して、正確な個々の投薬量はいくらか調整され得ることを理解するであろう。加えて、ワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドによって治療される病態の重症度もまた、投薬量レベルに影響を有し得る。一般に、０．１μｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量レベルが、単回用量として、又は複数回用量に分割して毎日投与される。好ましくは、一般的な投薬量範囲は、１日当たり２５０μｇ／ｋｇ体重〜５．０ｍｇ／ｋｇ体重である。様々な投与経路の種々の効率にかんがみて、必要な投薬量は幅広く異なることが予想される。例えば、経口投与は、概して静脈注射による投与より高い投薬量レベルが要求されると予想され得る。このような種々の投薬量レベルは、当該技術分野において公知の最適化のための標準的な実験ルーチンを用いて調整することができる。一般に、正確な予防上又は治療上の有効投薬量は、担当臨床医が上記に特定した要因を考慮して決定することができる。
【００６２】
患者に投与される各用量中に存在する本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドの量は、患者の年齢、体重、性別、全般的な健康状態などの考慮事項に関連して選択される。患者において深刻な有害副作用なしに免疫応答（例えば、細胞性免疫応答）を誘起する、又は外因性効果を生じさせるために必要なワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドの量は、用いられる医薬組成物及びアジュバントの任意の存在に応じて異なる。場合により、初回用量に続き、所望の場合には追加免疫を繰り返すことができる。本方法は、本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドの長期投与を含むことができる。治療的用途又は予防的用途のため、年一回の追加免疫又は他の間隔での追加免疫など、免疫ワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドの反復投薬量が望ましいこともある。投与される投薬量は、当然ながら、特定のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドの薬力学的特性、並びにその投与様式及び経路；被投与者の年齢、健康状態、及び体重；症状の性質及び程度、併用治療の種類、治療頻度、及び所望の効果などの公知の要因に応じて異なり得る。本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドは、針刺しによる急性感染又は母体感染のリスクがある対象の長期治療において投与することができる。かかる「急性」感染についての投薬頻度は、約６週間の期間にわたる静脈内又は筋肉内による１日１回投薬から週１回又は２回の範囲であってもよい。ワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドはまた、ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１）による感染患者、又は感染が進行している患者の長期治療においても用いることができる。感染患者では、長期投与の頻度は、静脈内又は筋肉内で１日１回投薬から週１回又は２回の範囲であってもよく、本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチド中に存在する免疫原の半減期に依存し得る。
【００６３】
アジュバント
ウイルスに対するワクチンを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）のワクチン接種に使用される本発明のワクチンは、ワクチンの免疫原性を高める１つ又は複数の薬学的に許容可能なアジュバントと同時に、又は連続して投与することができる。ヒトへの使用が承認されているアジュバントとしては、アルミニウム塩（ミョウバン）が挙げられる。こうしたアジュバントは、Ｂ型肝炎、ジフテリア、ポリオ、狂犬病、及びインフルエンザを含むいくつかのワクチンに有用となっている。他の有用なアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、ＭＤＰの合成類似体、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−［１，２−ジパルミトイル−ｓ−グリ−セロ−３−（ヒドロキシホスホリルオキシ）］エチルアミド（ＭＴＰ−ＰＥ）並びに代謝可能な油及び乳化剤であって、実質的に全てが直径１ミクロン未満の油滴を有する水中油エマルジョンの形態で存在する油及び乳化剤を含有する組成物が挙げられる。
【００６４】
キット
本発明は、本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を、ウイルス感染症の予防又は治療に治療上有効な量で含むキットを提供する。キットは、臨床従事者（例えば、医師又は看護師）がそこに含まれる組成物を投与することができるように説明書を含む。
【００６５】
好ましくは、キットは、本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドの有効量を含有する１つ又は複数の単回用量医薬組成物の複数のパッケージを含む。場合により、１つ又は複数の医薬組成物の投与に必要な器具又は装置がキットに含まれてもよい。例えば、本発明のキットは、本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドの有効量を含む１つ又は複数のプレフィルドシリンジを提供してもよい。さらに、キットはまた、ウイルスに感染した、又は感染するリスクがある患者が、本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドを含有する１つ又は複数の医薬組成物を使用するための説明書又は投与スケジュール表などのさらなる要素を含んでもよい。
【００６６】
当業者には、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく本発明の組成物、方法、及びキットに様々な修正及び変更を加え得ることは明らかであろう。従って、本発明は、本発明の修正及び変更を、それらが添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内に含まれることを条件として包含することが意図される。
【実施例】
【００６７】
以下の例により本発明を説明し、これらの例は、何ら本発明を限定することを意図するものではない。
【００６８】
〔実施例１〕
上記で考察される遺伝的アルゴリズムを使用してモザイク抗原Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ、及びＥｎｖ配列（配列番号１〜８）を作成した。次にそれらの配列をワクチン開発に実用的なものとするため、Ｅｎｖ（配列番号９〜１１）において切断／融合活性を除去し、Ｐｏｌ（配列番号１２〜１４）において触媒活性を除去し、Ｎｅｆ（配列番号１６〜１８）においてミリスチル化部位を除去し、及びＧａｇＮｅｆ、ＧａｇＰｏｌ、又はＧａｇＰｏｌＮｅｆ（配列番号１９〜２９）を含む融合コンストラクトを作成することにより修飾した。コンパレータ最適天然クレードＣ遺伝子もまた示される（配列番号３０〜３６）。
【００６９】
〔実施例２〕
Ｍコンセンサス（第１群）、二価Ｍモザイク（第２群）、又は最適天然クレードＣ（第３群）配列由来のＧａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ遺伝子を発現する３×１０１０個のｖｐ ｒＡｄ２６ベクターで２０匹のアカゲザルを免疫した。Ｍコンセンサス配列は、世界中の循環ウイルスの唯一最良の「平均」を表す合成配列に相当する。二価Ｍモザイク配列は上記に記載される。最適天然クレードＣ配列は、特性が最も「コンセンサス様」である実際のクレードＣ ＨＩＶ−１ウイルス由来の天然に存在する配列である。全潜在的Ｔ細胞エピトープ（ＰＴＥ）ペプチドセットからの応答ペプチド数を調べることにより、細胞性免疫幅を評価した。ＰＴＥペプチドは、全ＨＩＶ−１配列の８５％超に相当し、ＮＩＨから自由に入手することができる。
【００７０】
結果は、新規二価Ｍモザイク配列が、これらの他の２つの有力な抗原コンセプトより著しく優れていたことを示す。表１に示されるとおり、二価Ｍモザイク抗原は、Ｍコンセンサス抗原及び最適天然クレードＣ抗原と比較して、Ｇａｇ特異的、Ｅｎｖ特異的、Ｐｏｌ特異的、及び合計Ｔリンパ球の応答幅の有意な増加を誘発した。（平均値は、各サル群における平均エピトープ数を表す；ＳＥＭは平均値の標準誤差を表す）。
【表１】
【００７１】
〔実施例３〕
実施例２に記載されるＭコンセンサス（第１群；ｎ＝７）、二価Ｍモザイク（第２群；ｎ＝７）、又は最適天然クレードＣ（第３群；ｎ＝６）配列由来のＧａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ遺伝子を発現する３×１０１０個のｖｐ ｒＡｄ２６ベクターでマカクザルを筋肉内免疫した。全潜在的Ｔ細胞エピトープ（ＰＴＥ）ペプチドセットからの応答ペプチド数を調べることにより、細胞性免疫幅を評価した。
【００７２】
読み出す情報として、プールＰＴＥペプチドに対するＣＤ４／ＣＤ８ ＩＦＮγ Ｅｌｉｓｐｏｔ応答（大きさ）を評価した。１５ｍｅｒのＰＴＥペプチドを用いてエピトープを完全にマッピングし、陽性の数（陽性は、１０６個のＰＢＭＣ当たり５５個のスポット形成細胞（ＳＦＣ）及びバックグラウンドの４倍として定義した）を評価した。完全なタンパク質のセットと応答を比較するため、５個のＧａｇタンパク質にわたる重複ペプチドのプールセットも試験した。
【００７３】
結果は、二価Ｍモザイク配列が、他の２つの有力な抗原コンセプト（Ｍｃｏｎ及びＯｐｔＣ）より著しく優れていたことを示す。
【００７４】
〔実施例４〕
モデリングを使用して、Ｔ細胞応答がモザイクワクチンの結果として増加するという本発明者らの観察を検証した。反応性ペプチド数をワクチン、ポリペプチド、及びＴ細胞型の関数として予測し、次に交互作用のステップワイズ除去を行ったポアソン回帰モデルをフィットした。モザイクワクチンは陽性ＰＴＥ応答数の高度に有意な亢進をもたらしたが、それは、あらゆるポリタンパク質及びＴ細胞型にわたって多かれ少なかれ一様にもたらされたことが認められた。従って、動物が投与を受けるＴ細胞、ポリペプチド、及びワクチンのタイプに個別に依存する寄与分を合わせることにより、動物において陽性効果を有するペプチド数を予測し得る。
【００７５】
これらのモデルはまた、動物間のばらつきを考慮するため変量効果も含んだ。これは、モデルの予測力を適切に割り当てることによりｐ値の信頼性を高めるために設計される予防措置である。
【００７６】
以下の効果が認められた：
ａ）ＣＤ８応答はＣＤ４応答と比べてはるかに多く、４．３７倍である（ｐ＜２×１０−１６）；
ｂ）ｇｐ１６０ではｇａｇ又はｐｏｌと比べて応答が少なく、０．５４倍であり（ｐ＝０．０００８３０）、及びｇａｇとｐｏｌとの間に（ｐｏｌはＧａｇの２倍長く、従って応答する確率がより高いため、配列長さにより正規化した場合であっても）有意差はない；及び
ｃ）モザイクワクチンはＭｃｏｎと比べて有意により多くの陽性応答をもたらし（３．６倍、ｐ＝６．２６×１０−１１）、一方、ＯｐｔＣがもたらす応答はより少なく、但しＭｃｏｎ−ＯｐｔＣの差は有意ではない。
【００７７】
〔実施例５〕
ワクチンにより誘発され、ＰＴＥペプチドにより検出される最小応答数だけを考え、従って変異に関わらず８アミノ酸以上重複する全てのペプチドを１回のみ数える場合にも、モザイクワクチンはなお、別個の領域に対するより多い応答数をもたらす。
【００７８】
ＣＤ８について、各重複ペプチドセットを１回のみ数える：
統計概要：
Ｍｏｓ２＞Ｍｃｏｎ〜ＯｐｔＣ（ＭｃｏｎはＯｐｔＣより応答が多い傾向を示す）
Ｍｃｏｎと比較したＭｏｓ２についてのウィルコクソンｐ値：ｐ値＝０．０００９９９２
最適Ｃと比較したＭｃｏｎについてのウィルコクソンｐ値：ｐ値＝０．２３５１
【００７９】
【００８０】
ＣＤ４について、各重複ペプチドセットを１回のみ数える（ＣＤ４には重複はほとんどないため、これは最初のカウントとほぼ同じである）。
【００８１】
統計概要：
Ｍｏｓ２＞＞Ｍｃｏｎ〜ＯｐｔＣ（ＭｃｏｎはＯｐｔＣより応答が多い傾向を示す）
Ｍｃｏｎと比較したＭｏｓ２についてのウィルコクソンｐ値：ｐ値＝０．００１９８
最適Ｃと比較したＭｃｏｎについてのウィルコクソンｐ値：０．０９９
【００８２】
【００８３】
〔実施例６〕各重複ペプチドセットを１回のみ数えるポアソン回帰
重複ＰＴＥペプチドを使用して以下を決定したが、これは、各陽性ＰＴＥ応答を別のものとして数えた上記の実施例４で考察した結果と広く一致している：
ａ）ＣＤ８応答はＣＤ４応答と比べてはるかに多く、約２．８倍である（ｐ≒１×１０−７；
ｂ）モザイクワクチンはＭｃｏｎと比べて有意により多くの陽性応答をもたらし（２．８４倍、ｐ≒４．３×１０−７）、一方ＯｐｔＣがもたらす応答はより少なく、但しＭｃｏｎ−ＯｐｔＣの差は有意ではない；及び
ｃ）Ｇａｇに対する応答よりＰｏｌに対する応答が多く、及びｇｐ１６０に対する応答よりＧａｇに対する応答が多いが、有意であったのはＰｏｌ−ｇｐ１６０の差のみで、約２倍であった（ｐ＜０．００１）。
【００８４】
〔実施例７〕
以下の表は、２モザイク（Ｍｏｓ２）又はＭｃｏｎのワクチン接種を受けた７動物、及び最適天然Ｃクレード（ＯｐｔＣ）のワクチン接種を受けた６動物における３つのワクチンに対するＧａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ応答に対する応答合計の集計表である：
【００８５】
ＯｐｔＣワクチンは、全てのサルにわたり、タンパク質当たりのＣＤ８＋ Ｔ細胞応答より僅かに少ない平均応答をもたらした。Ｍｃｏｎワクチンは、タンパク質当たり約１つの応答を示した。Ｍｏｓ２に関してのみタンパク質の違いが認められ、ここでＥｎｖは、典型的にはＧａｇ又はＰｏｌのいずれと比べても応答が少ない。
【００８６】
Ｍｏｓ２ワクチン中のタンパク質の各々は多くの応答を誘発し、全般的な応答に寄与した。不活化ｐｏｌに対する修飾、並びにＥｎｖにおける切断及び融合ドメインの欠失後のコンセンサスタンパク質の相対的な長さは、以下のとおりであった：Ｅｎｖの６７１アミノ酸、Ｐｏｌの８５１、Ｇａｇの４９８（１．３５：１．７：１）。
【００８７】
要約
幅：２モザイクワクチンは、Ｍコンセンサス又は単一最適天然株よりはるかに多くのエピトープ領域の認識能を有するＴ細胞応答を誘発する。
【００８８】
深さ：認識されたＰＴＥペプチドの多様性は、２モザイクの双方の型が変異ペプチドに対する異なるＴ細胞応答を誘発し、交差反応の可能性が増加していることを示唆する。
【００８９】
〔実施例８〕
本発明のモザイクＨＩＶ−１ワクチンは、アカゲザルにおける細胞性免疫応答の幅及び深さを拡大する。ＨＩＶ−１ Ｍ群配列のＰＴＥ有効範囲を最適化したモザイクＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原を作成した。ＨＩＶ−１ Ｍ群配列は、ロスアラモスＨＩＶ−１配列データベース内の全ての主要なＨＩＶ−１クレード及び組換え系統を含む。二価モザイク戦略を利用して、理論的な有効範囲と実用性との競合問題について均衡をとった。二価モザイクＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原は、アカゲザルにおいてコンセンサス配列及び天然配列のＨＩＶ−１抗原を使用して観察される免疫応答と比べて、アカゲザルにおけるエピトープ特異的ＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔリンパ球応答の幅及び大きさ（深さ）を実質的に拡大した。
【００９０】
２７匹の非近交系アカゲザルを、以下の抗原を発現する組換えアデノウイルス血清型２６（ｒＡｄ２６）ベクターの単回注射で免疫した：（ｉ）二価モザイク（Ｎ＝７）、（ｉｉ）Ｍコンセンサス（Ｎ＝７）、（ｉｉｉ）クレードＢとクレードＣ（Ｎ＝７）とを組み合わせた二価、又は（ｉｖ）最適天然クレードＣ（Ｎ＝６）ＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原。これらの抗原を発現するｒＡｄ２６ベクターの３×１０１０個のウイルス粒子の全用量を各動物に１回筋肉内投与した。最適クレードＣ抗原は、ロスアラモスＨＩＶ−１配列データベースにおけるクレードＣ配列の最大ＰＴＥ有効範囲を提供するように選択した天然株配列であった（以下の「材料及び方法」で考察する）。ワクチンにより誘発されたＨＩＶ−１特異的Ｔリンパ球応答の幅及び大きさ（深さ）を、ＨＩＶ−１ Ｍ群配列の少なくとも１５％に存在する全てのＰＴＥを含むペプチドのプール及びサブプールを利用して、免疫後４週目にＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより評価した。全ての個々のペプチド応答を解析し、細胞枯渇ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施して、反応性ペプチドがＣＤ８＋又はＣＤ４＋ Ｔリンパ球エピトープに相当するかどうかを判断した。
【００９１】
モザイク抗原により誘発されたＰＴＥペプチドに対するＧａｇ特異的、Ｐｏｌ特異的、及びＥｎｖ特異的細胞性免疫応答の総数は、コンセンサス又は天然配列抗原により誘起された応答数と比べて３．８倍高かった（図１９Ａ；Ｐ＝１×１０−１１、モザイクを次に高い群のコンセンサス抗原との比較、ポアソン回帰モデルに基づく）。ＣＤ４＋ Ｔリンパ球応答と比べてＣＤ８＋は４．４倍多く（Ｐ＜１０−１１）、Ｇａｇ又はＰｏｌに対する応答と比べてＥｎｖに対する応答は少なかった（Ｐ＜０．０００７）。ＣＤ８＋ Ｔリンパ球応答の中位数はモザイクワクチンについて最も高く、それにコンセンサス、組み合わせのＢ＋Ｃ、及び天然クレードＣワクチンが続いた（それぞれ、各群における動物当たりの応答の中央値は１６、５、３、及び２）。全体ではＣＤ４＋ Ｔリンパ球応答はより少なかったが、ＣＤ４＋ Ｔリンパ球応答に関しても、最高数がモザイクワクチンに対するもので、それにコンセンサス、組み合わせのＢ＋Ｃ、及び天然クレードＣワクチンが続く、同じ相対的パターンが現れた（それぞれ、各群における動物当たりの応答の中央値は４、１、１、及び０．５）。コンセンサス、組み合わせのＢ＋Ｃ、及び天然クレードＣワクチンにより誘発されたＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔリンパ球応答の数は、統計的には区別できなかった。
【００９２】
ＰＴＥペプチドは、天然に存在するＨＩＶ−１配列多型を反映する複数の重複配列を含み、従ってＰＴＥペプチド応答は、特定のエピトープの認識（幅）と当該エピトープの変異体の交差認識（深さ）との双方を包含する。サル当たりの反応性エピトープ領域の数を評価することにより幅の保存分析を実施し、ここでは８個以上のアミノ酸が重複する全ての反応性ＰＴＥペプチドを１イベントとして数えた。この保存分析においてもなお、モザイク抗原が、コンセンサス抗原又は天然配列抗原と比較したとき３．１倍多いＧａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ反応性エピトープ領域数を誘発したことが観察された（図１９Ｂ；Ｐ＝１．６×１０−７、ポアソン回帰）。エピトープ領域は、高いエピトープ密度の領域によって明らかなとおり、動物にわたっていくらかのクラスタ化を示した（図２０Ａ〜図２０Ｃ及び図２１Ａ〜図２１Ｃ）。応答領域ごとに整理した全ての陽性ペプチドの完全アラインメントを図２２に示す。
【００９３】
これらのデータは、モザイク抗原が、Ｍコンセンサス及び天然クレードＣ抗原と比較したとき、細胞性免疫応答の幅を実質的に増加させたことを示す。二価モザイク抗原はまた、クレードＢ及びクレードＣ抗原の二価の組み合わせより優れていることも分かり（図１９Ａ及び図１９Ｂ）、幅の亢進がモザイク配列設計に起因したもので、単純にタンパク質当たりに２つの異なる抗原配列を使用したことを反映したものではないことが示された。モザイク抗原により誘起された幅の増加により応答の潜在能力が損なわれたかどうかを判断するため、全ての個々のＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔリンパ球応答の大きさを評価した。これらの応答の大きさはあらゆる群間で同程度であることが分かった（図２３；それぞれＰ＝０．５８及びＰ＝０．９９、コルモゴロフ−スミルノフの両側検定）。このように、モザイク抗原は、個々のエピトープ特異的応答の大きさを損なうことなく細胞性免疫幅を拡大し、抗原競合及び免疫優性の制約が、この試験のモザイク抗原の免疫原性を制限しなかったことが示された。
【００９４】
次に、様々なワクチンレジメンにより誘発された細胞性免疫応答の深さを特徴付けた。特定のエピトープ領域について同時に誘発された変異ＰＴＥペプチドの数として深さを定義した。複数の共通のエピトープ変異体に対する応答が誘起されると、感染ウイルス配列の免疫有効範囲は大きくなり、生体内で共通のエスケープ経路が遮断され、又は大きいフィットネスコストを被る三次エスケープ経路にウイルスが押し込まれ得る。コンセンサス及び天然配列抗原は、天然クレードＣ抗原の投与を受けたサル３６６における応答により例示されるとおりの、ワクチン配列と反応性ＰＴＥペプチドとの間の高度の配列同一性により特徴付けられる応答を誘発した（図２４Ａ；また図２２も参照）。対照的に、モザイク抗原は、特定のエピトープ領域における複数の反応性ＰＴＥペプチドにより特徴付けられる応答を誘発した。これらのペプチドは共通の変異体を表し、多くの場合に、サル３６１における応答により例示されるとおり、モザイクワクチン配列に含まれる多型を反映した（図２４Ｂ；また図２２も参照）。これらの動物における全てのエピトープ特異的応答についての要約から、コンセンサス又は天然配列抗原と比較したとき、モザイク抗原は、２個以上の標的化された変異体を有するペプチドに対する細胞性免疫応答の頻度を増加させたことが実証される（図２４Ｃ；Ｐ＝０．００１、モザイクを次に高い群のコンセンサス抗原と比較するウィルコクソン順位和検定）。
【００９５】
ＰＴＥペプチドを利用する分析を補足するため、５個の異なるＧａｇ配列：クレードＣ ＤＵ４２２、クレードＣ ＺＭ６５１、コンセンサスＣ、コンセンサスＡ、及びコンセンサスＢを包含する従来の重複ペプチドによるワクチン接種を受けたサルにおける細胞性免疫応答の幅も評価した。細胞性免疫幅は、各Ｇａｇ配列にわたる１０個の重複ペプチドのサブプールに対する反応性を評価することにより決定した。モザイク抗原は、コンセンサス又は天然配列抗原と比較したとき、試験した全てのＧａｇ配列に対してＴリンパ球応答の増幅を誘発した（図２５；Ｐ＝１×１０−７、二項回帰）。このように、モザイク抗原は、ＰＴＥペプチドに対するだけでなく、クレードＡ、Ｂ、及びＣ由来の実際のＧａｇペプチドに対する細胞性免疫幅も増大させた。モザイク抗原は、クレードＣ Ｇａｇペプチドに対する応答の誘起について最適天然クレードＣ抗原より優れていることまでもが分かった。さらに、モザイク抗原は複数のクレード由来のＧａｇペプチドに対する同程度の応答を誘発したが、一方、天然クレードＣ抗原は、クレードＡ及びクレードＢ Ｇａｇペプチドに対する応答の低下を示した（図２５）。
【００９６】
これらの観察の耐久性を評価するため、モザイク、コンセンサス、及び最適天然クレードＣ抗原の投与を受けたサルを、初回の免疫で利用された配列と一致するＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原を発現する異種ベクターｒＡｄ５ＨＶＲ４８の３×１０１０個のウイルス粒子の合計用量で４０週目に追加免疫した。１０個のＰＴＥペプチドのサブプールに対する反応性を４週目（プライミング後）及び４４週目（追加免疫後）に評価することにより、細胞性免疫幅を決定した。プライミング免疫後に観察されたＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔリンパ球応答の大部分が、追加免疫後に拡大し（図２６Ａ、赤色及び青色の線）、及び数多くの新規の応答も検出された（図２６Ａ、赤色及び青色の点）。４４週目、個々の細胞性免疫応答の大きさは群間で同程度であることが分かった（図２６Ａ）。しかしながら、モザイク抗原により誘発されたサブプール応答の数は（動物当たりの応答の中央値２７）、追加免疫後、コンセンサス抗原（動物当たりの応答の中央値１１）又は最適天然クレードＣ抗原（動物当たりの応答の中央値１０）により誘起されたサブプール応答の数と比べて実質的に高いままであった（図２６Ｂ）。追加免疫の前も、及び後も、モザイクワクチンにより誘発された動物当たりの応答は、コンセンサス又は天然クレードＣワクチンによるものより多かった（Ｐ＜０．００１、全てのペアワイズ比較についてのウィルコクソン順位和検定）。
【００９７】
また、追加免疫後、ＥＬＩＳＡ（図２６Ｃ）及びルシフェラーゼベースのシュードウイルス中和アッセイ（図２６Ｄ）によりＥｎｖ特異的体液性免疫応答も測定した。全ての群がクレードＣ ｇｐ１４０に対する同程度のＥＬＩＳＡ力価を示し、第１層クレードＣウイルスＭＷ９６５．２６に対する同程度の中和抗体（ＮＡｂ）応答を示した。モザイク抗原は、コンセンサス又は天然クレードＣ抗原と比較したとき、第１層クレードＢウイルスＳＦ１６２．ＬＳに対する僅かに高いＮａｂ応答を誘発したが（Ｐ＝０．０２、ウィルコクソン順位和検定）、しかしながらどの群においても、第２層ウイルスに対するＮＡｂ応答は検出されなかった。
【００９８】
本発明者らのデータは、モザイクＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原が、理論的予想と良好に一致して、アカゲザルにおいてコンセンサス又は天然配列抗原と比較したときにエピトープ特異的細胞性免疫応答の幅及び深さの双方を増大させたことを実証する（図２７）。この試験におけるモザイク抗原に関する顕著な結果は、ｒＡｄ２６ベクターが、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球応答の誘発に特に効率的であるという事実、並びにモザイク抗原がＣＤ８＋ Ｔリンパ球幅の増大に特に有効であるように思われるという事実を反映したものであり得る（図１９Ａ及び図１９Ｂ）。また、モザイク抗原に関してＣＤ４＋ Ｔリンパ球幅の亢進も認められたが、しかしながらそれらの応答数は実質的により少なかった。
【００９９】
Ｇａｇ特異的細胞性免疫応答の幅は、アカゲザルにおけるＳＩＶ制御及びヒトにおけるＨＩＶ−１制御にとって重要であることが示されている。さらに、第２ｂ相ＳＴＥＰ試験において、天然クレードＢ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＮｅｆ抗原を発現するｒＡｄ５ベースのＨＩＶ−１ワクチン候補は、限られた幅のＨＩＶ−１特異的細胞性免疫応答しか誘発せず、ワクチン有益性は認められなかった。ＳＴＥＰ試験のワクチン被接種体は、Ｇａｇに対するわずか１のエピトープ特異的応答の中央値を含め、わずか２〜３のエピトープ特異的Ｔリンパ球応答の中央値を生じ、この極めて狭い幅の細胞性免疫応答が、感染ウイルスの多様性の不十分な免疫有効範囲をもたらしたように思われる。ＣＤ８＋ Ｔリンパ球からのウイルスエスケープもまた、急性ＨＩＶ−１感染において急速に起こることが報告されており、従って共通のエピトープ変異体に対するワクチンにより誘発された細胞性免疫応答もまた重要であることが分かり得る。まとめると、以上の試験は、細胞性免疫の幅及び深さを増大させるＨＩＶ−１ワクチン戦略を開発する必要性を強調するものである。
【０１００】
本発明者らはこの試験においてモザイクＨＩＶ−１抗原を評価したため、ＳＩＶ攻撃誘発に対するこうしたワクチンレジメンの防御効力を評価することはできなかった。しかしながら、本発明者らは、ｒＡｄベクターにより誘発されたＳＩＶ特異的細胞性免疫応答の幅が、アカゲザルにおいてＳＩＶ攻撃誘発に対する防御効力と相関していることを以前報告している（Ｌｉｕら、Ｎａｔｕｒｅ ４５７：８７頁、２００９年）。本発明者らはまた、変異エピトープに対する細胞性免疫応答が、アカゲザルにおいてインビボでＳＩＶ突然変異進化を阻止することができることも示しており（Ｂａｒｏｕｃｈら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２４７頁、２００５年）、細胞性免疫の深さの拡大の生物学的関連性が示唆される。非ヒト霊長類におけるＳＩＶ攻撃誘発に対するモザイクワクチンの防御効力のモデリングには固有の限界があり、これは、ＳＩＶとＨＩＶ−１ Ｍ群配列とでは観察される多様性が実質的に異なり、影響を受ける基礎となる生物学が異なるためである。例えば、スーティーマンガベイなどの天然宿主におけるＣＤ８＋ Ｔリンパ球選択圧は、ヒトにおけるものと比べて実質的に低いものと思われる。従って、候補ＨＩＶ−１ワクチンとしてのモザイク抗原のさらなる評価には、臨床治験が役立ち得る。
【０１０１】
要約すれば、本発明者らは、アカゲザルにおいて二価モザイクＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原が細胞性免疫幅及び深さを実質的に拡大したことを実証する。全体的なウイルス多様性及び細胞性免疫応答からのウイルスのエスケープは、Ｔ細胞ベースのＨＩＶ−１ワクチンの開発における決定的な難関に相当するため、こうした知見は、ＨＩＶ−１ワクチン開発に対する重要な含意を有する。モザイク抗原の二価カクテルはまた、臨床開発が実際的及び潜在的に実現可能でもある。モザイク抗原の結合価が増加すると、有効範囲がさらに向上し得る。最後に、このモザイク抗原戦略は一般化可能であり、ＨＩＶ−１に加えて他の遺伝的に多様な病原体に利用される可能性がある。
【０１０２】
材料及び方法
抗原設計及びベクター産生。本質的に、ロスアラモスＨＩＶ−１配列データベースにおけるＨＩＶ−１ Ｍ群配列の最適な有効範囲を提供するように二価モザイクＧａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原を作成した。ロスアラモスＨＩＶ−１配列データベースにおける最適ＰＴＥ有効範囲のクレードＣ配列を提供する配列となるように最適天然クレードＣ抗原を選択した（Ｃ．ＩＮ．−．７０１７７ Ｇａｇ、Ｃ．ＺＡ．０４．０４ＺＡＳＫ２０８Ｂ１ Ｐｏｌ、Ｃ．ＳＮ．９０．９０ＳＥ＿３６４ Ｅｎｖ）。準コンセンサス又はコンセンサス配列となるようにクレードＢ抗原を選択し（Ｂ．ＣＡＭ−１ Ｇａｇ、Ｂ．ＩＩＩＢ Ｐｏｌ、Ｂ．Ｃｏｎ Ｅｎｖ）、それを用いて二価クレードＢ＋Ｃワクチン手法に対する最適クレードＣ抗原を補足した。Ｐｏｌ抗原はＲＴ及びＩＮを含んでＰＲを含まず、及び記載されるとおり触媒活性を除去する点突然変異を含んだ（Ｐｒｉｄｄｙら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ ４６：１７６９頁、２００８年）。Ｅｎｖ ｇｐ１４０抗原は、切断及び融合活性を除去する点突然変異を含んだ。ワクチン配列を図２７に示す。組換え複製無能アデノウイルス血清型２６（ｒＡｄ２６）及びそれらの抗原を発現するヘキソン−キメラｒＡｄ５ＨＶＲ４８ベクターをＰＥＲ．５５Ｋ細胞で成長させて、本質的に記載されるとおり二重ＣｓＣｌ勾配沈降により精製した（Ａｂｂｉｎｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：４６５４頁、２００７年、及びＲｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ４４１：２３９頁、２００６年）。
【０１０３】
動物及び免疫化。ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子Ｍａｍｕ−Ａ＊０１を発現しなかった２７匹の非近交系アカゲザルをＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＥＰＲＣ）、Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡで飼育した。免疫化は、モザイク、Ｍコンセンサス、クレードＢ＋クレードＣ、又は最適天然クレードＣ ＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原を発現する３×１０１０個のウイルス粒子ｒＡｄ２６又はｒＡｄ５ＨＶＲ４８ベクターを、１ｍｌの筋肉内注射として０週目及び４０週目に双方の大腿四頭筋に送達することを含んだ。全ての動物試験は、本発明者らの研究機関内の動物の管理及び使用に関する委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ：ＩＡＣＵＣ）により承認された。
【０１０４】
ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。ワクチン接種を受けたサルにおけるＨＩＶ−１特異的細胞性免疫応答を、本質的に記載されるとおりインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより評価した（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ４４１：２３９頁、２００６年、及びＬｉｕら、Ｎａｔｕｒｅ ４５７：８７頁、２００９年）。ＨＩＶ−１ Ｍ群配列の少なくとも１５％に存在するＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖの潜在的Ｔ細胞エピトープ（ＰＴＥ）ペプチド、並びにクレードＣ ＤＵ４２２、クレードＣ ＺＭ６５１、コンセンサスＣ、コンセンサスＡ、及びコンセンサスＢ株由来のＨＩＶ−１ Ｇａｇペプチドを、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍから入手した。９６ウェルマルチスクリーンプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、エンドトキシンフリーのダルベッコＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）中の１０μｇ／ｍｌ抗ヒトＩＦＮ−γ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の１００μｌ／ウェルで一晩コートした。次にプレートを０．２５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有Ｄ−ＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄し、３７℃で５％ＦＢＳ含有Ｄ−ＰＢＳにより２時間ブロックし、Ｄ−ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０でリンスしてＴｗｅｅｎ−２０を取り除き、１００μｌの反応量で３通りに各２μｇ／ｍｌのペプチド及び２×１０５ＰＢＭＣと共にインキュベートした。３７℃で１８時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで９回及び蒸留水で１回洗浄した。次にプレートを、２μｇ／ｍｌのビオチン化抗ヒトＩＦＮ−γ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで６回洗浄し、１：５００希釈のストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）と共に２時間インキュベートした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで５回及びＰＢＳで１回洗浄した後、プレートをニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸色原体（Ｐｉｅｒｃｅ）で展開し、水道水で洗浄することにより停止させ、風乾し、ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ）を使用して読み取った。１０６個のＰＢＭＣ当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）を計算した。媒質バックグラウンドは、典型的には１０６ＰＢＭＣ当たり１５ＳＦＣ未満であった。陽性応答は、１０６個のＰＢＭＣ当たり５５個より多いＳＦＣ、且つバックグラウンドの４倍超として定義した。
【０１０５】
エピトープマッピング。ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍから入手したＧａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ ＰＴＥペプチドを利用して、包括的なＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔリンパ球エピトープマッピングを実施した。最初に完全ペプチドプールで、並びに１０個のＰＴＥペプチドを含むサブプールで免疫した後４週目に、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。陽性応答を有する全てのペプチドサブプールをデコンボリューション処理し、個々の１５アミノ酸ＰＴＥペプチドでエピトープが確認された。次に細胞枯渇ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施して、反応性ペプチドがＣＤ８＋又はＣＤ４＋ Ｔリンパ球エピトープに相当するかどうかを判断した。追加免疫の４週間後４４週目にＰＴＥサブプールを利用した部分的エピトープマッピングもまた実施した。ボーダーラインの応答は全て再試験し、確認された場合にのみ陽性と見なした。１０個の重複Ｇａｇペプチドを含むサブプールを利用した部分的エピトープマッピングもまた実施し、様々なクレード由来のＨＩＶ−１ Ｇａｇの幅を評価した。
【０１０６】
体液性免疫アッセイ。本質的に記載されるとおり、ＨＩＶ−１クレードＣ Ｅｎｖ ｇｐ１４０及びルシフェラーゼベースのシュードウイルス中和アッセイを利用する直接ＥＬＩＳＡにより、Ｅｎｖ特異的体液性免疫応答について調べた（Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ、「Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＨＩＶ， ＳＩＶ ａｎｄ ＳＨＩＶ ｉｎ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ａｓｓａｙｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｓｔｒｏｂｅｒ、及びＣｏｉｃｏ編（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、２００４年、１〜１５頁）。
【０１０７】
統計分析。全ての統計分析はパッケージＲ（Ｔｅａｍ、Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、Ｖｉｅｎｎａ、オーストリア、２００９年）を使用して行った。細胞性免疫応答の幅を分析してＰＴＥペプチドをマッピングするため（図１９Ａ）、ワクチン群、抗原（Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ）、及びリンパ球部分母集団（ＣＤ４、ＣＤ８）の関数として反応性ペプチドの数を予想するポアソン回帰モデルをフィットさせた。本発明者らのモデルでは、動物間のばらつきに対応するため変量効果を含め、パッケージＲのｌｍｅ４ライブラリ（Ｐｉｎｈｅｉｒｏ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００年））によりフィットさせた。データはモデルを良好にフィットし（分散パラメータ１．０）、３個の説明因子間に有意な交互作用はなかった。例えば、モザイク抗原の投与を受けたサルによって認識されたＰＴＥペプチド数が、コンセンサス又は天然配列抗原の投与を受けた場合と比較したとき３．８倍亢進したことは（図１９Ａ）、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ由来のＰＴＥに等しく当てはまり、ＣＤ８＋並びにＣＤ４＋ Ｔリンパ球による応答について維持された。反応性エピトープ領域数の分析（図１９Ｂ）にもまた変量効果を伴うポアソン回帰モデルを含め、これもまた有意な交互作用なしに良好にフィットした（分散パラメータ０．８７）。コルモゴロフ−スミルノフの両側検定を利用してＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔリンパ球応答の大きさの比較（図２３）を実施した。サル当たりの応答の幅及び深さを種々のワクチン間で比較するノンパラメトリック検定もまた実施した（図１９Ａ及び図２４Ｃ）。本発明者らは、４つのワクチン群間に違いがあるかどうかを判断するため最初にクラスカル・ワリス検定を用いた。いずれの場合も、これは高度に有意であったとともに、次に本発明者らはウィルコクソン順位和検定を使用して４つのワクチン群間の全てのペアワイズ比較を評価した。これらの比較の各々において、モザイクワクチンが誘発したサル当たりの応答は、他の３つのワクチンと比べて有意に多かった。様々なクレード由来のＨＩＶ−１ Ｇａｇに対する応答の幅を分析するため（図２５）、データを二項回帰モデルにフィットさせた。これらのモデルでは説明変数としてワクチン群を使用し、動物間及び株間のばらつきを考慮するため変量効果を含めた。データは僅かに過小分散であったが、モザイクワクチンの投与を受けた動物はなお有意により多い応答数を誘発した。ロスアラモスＨＩＶ−１配列データベースで利用可能なツールを使用してＰＴＥ有効範囲の評価を実施した。
【０１０８】
配列別添資料
Ｉ．二価ＭモザイクＥＮＶ ＧＰ１６０、ＧＡＧ、ＰＯＬ、ＮＥＦ配列
モザイクＥＮＶ１ ＧＰ１６０（アミノ酸配列）
配列番号１
【０１０９】
モザイクＥＮＶ２ ＧＰ１６０（アミノ酸配列）
配列番号２
【０１１０】
モザイクＧＡＧ１（アミノ酸配列）
配列番号３
【０１１１】
モザイクＧＡＧ２（アミノ酸配列）
配列番号４
【０１１２】
モザイクＰＯＬ１（アミノ酸配列）
配列番号５
【０１１３】
モザイクＰＯＬ２（アミノ酸配列）
配列番号６
【０１１４】
モザイクＮＥＦ１（アミノ酸配列）
配列番号７
【０１１５】
モザイクＮＥＦ２（アミノ酸配列）
配列番号８
【０１１６】
ＩＩ．二価ＭモザイクＥＮＶ ＧＰ１４０配列（切断／融合欠損）
モザイクＥＮＶ１ ＧＰ１４０（アミノ酸配列）
配列番号９
【０１１７】
【０１１８】
モザイクＥＮＶ２ ＧＰ１４０（アミノ酸配列）
配列番号１０
【０１１９】
ＭＯＳ３ ＥＮＶ ＧＰ１４０（アミノ酸配列）
６７８アミノ酸
配列番号１１
【０１２０】
ＩＩＩ．二価ＭモザイクＰＯＬ配列（広範囲に不活化、ＰＲ欠失、９個のＡの不活化突然変異による触媒活性の除去）
モザイクＰＯＬ１（アミノ酸配列）
配列番号１２
【０１２１】
モザイクＰＯＬ２（アミノ酸配列）
配列番号１３
【０１２２】
ＭＯＳ３ ＰＯＬ Ｖ３（アミノ酸配列）
８５１アミノ酸
配列番号１４
【０１２３】
ＩＶ．二価ＭモザイクＧＡＧ配列
ＭＯＳ３ ＧＡＧ（アミノ酸配列）
５０８アミノ酸
配列番号１５
【０１２４】
Ｖ．二価ＭモザイクＮＥＦ配列（２位のＧをＡにすることによるミリスチル化部位の欠失）
ＭＯＳ１ ＮＥＦ
（２０６アミノ酸）
配列番号１６
【０１２５】
ＭＯＳ２ ＮＥＦ
（２０６アミノ酸）−２位のＧをＡにすることによるミリスチル化部位の欠失
配列番号１７
【０１２６】
ＭＯＳ３ ＮＥＦ
（２０８アミノ酸）
配列番号１８
【０１２７】
ＶＩ．二価ＭモザイクＧＡＧＮＥＦ融合配列
モザイクＧＡＧＮＥＦ１（アミノ酸配列）
配列番号１９
【０１２８】
モザイクＧＡＧＮＥＦ２（アミノ酸配列）
配列番号２０
【０１２９】
【０１３０】
ＶＩＩ．二価ＭモザイクＧＡＧＰＯＬ融合配列（バージョン３；ＰＯＬは広範囲に不活化、ＰＲ欠失、９個のＡの不活化突然変異による触媒活性の除去）
モザイクＧＡＧＰＯＬ１ Ｖ３（アミノ酸配列）
配列番号２１
【０１３１】
モザイクＧＡＧＰＯＬ２ Ｖ３（アミノ酸配列）
配列番号２２
【０１３２】
【０１３３】
ＭＯＳ３ ＧＡＧ−ＰＯＬ Ｖ３（アミノ酸配列）
１３５９アミノ酸−完全ＧＡＧと修飾ＰＯＬとのＧＡＧ−ＰＯＬ融合
配列番号２３
【０１３４】
【０１３５】
ＶＩＩＩ．二価ＭモザイクＧＡＧＰＯＬ融合配列（バージョン４；ＰＯＬは最小限の不活化、完全なＰＲ−ＲＴ−ＩＮ）
モザイクＧＡＧＰＯＬ１ Ｖ４（アミノ酸配列）
配列番号２４
【０１３６】
モザイクＧＡＧＰＯＬ２ Ｖ４（アミノ酸配列）
配列番号２５
【０１３７】
【０１３８】
ＩＸ．二価ＭモザイクＧＡＧＰＯＬ融合配列（バージョン５；ＰＯＬは最小限の不活化、ＰＲ欠失）
モザイクＧＡＧＰＯＬ１ Ｖ５（アミノ酸配列）
配列番号２６
【０１３９】
【０１４０】
モザイクＧＡＧＰＯＬ２ Ｖ５（アミノ酸配列）
配列番号２７
【０１４１】
Ｘ．二価ＭモザイクＧＡＧＰＯＬＮＥＦ融合配列（ＰＯＬは広範囲に不活化、ＰＲ欠失）
モザイクＧａｇＰｏｌＮｅｆ１（アミノ酸配列）
配列番号２８
【０１４２】
【０１４３】
モザイクＧＡＧＰＯＬＮＥＦ２（アミノ酸配列）
配列番号２９
【０１４４】
【０１４５】
ＸＩ．最適クレードＣ ＥＮＶ ＧＰ１６０、ＧＡＧ、ＰＯＬ、ＮＥＦ配列
最適クレードＣ ＥＮＶ ＧＰ１６０（ＳＮ９０．９０．ＳＥ３６４）（アミノ酸配列）
配列番号３０
【０１４６】
最適クレードＣ ＧＡＧ（ＩＮ．７０１７７）（アミノ酸配列）
配列番号３１
【０１４７】
最適クレードＣ ＰＯＬ（ＺＡ．０４．０４ＺＡＳＫ２０８Ｂ１）（アミノ酸配列）
配列番号３２
【０１４８】
【０１４９】
最適クレードＣ ＮＥＦ（ＺＡ００．１１７０ＭＢ）（アミノ酸配列）
配列番号３３
【０１５０】
ＸＩＩ．最適クレードＣ ＥＮＶ ＧＰ１４０配列（切断／融合欠損）
最適クレードＣ ＥＮＶ ＧＰ１４０（ＳＮ９０．９０．ＳＥ３６４）（アミノ酸配列）
配列番号３４
【０１５１】
ＸＩＩＩ．最適クレードＣ ＰＯＬ 配列（広範囲に不活化、ＰＲ欠失）
最適クレードＣ ＰＯＬ（ＺＡ．０４．０４ＺＡＳＫ２０８Ｂ１）（アミノ酸配列）
配列番号３５
【０１５２】
ＸＩＶ．最適クレードＣ ＧＡＧＮＥＦ融合配列
最適クレードＣ ＧＡＧＮＥＦ（ＩＮ．７０１７７−ＺＡ００．１１７０ＭＢ）（アミノ酸配列）
配列番号３６
【０１５３】
ＸＶ．コンセンサス配列
ＭコンセンサスＥＮＶ
配列番号３７
【０１５４】
ＭコンセンサスＧＡＧ
配列番号３８
【０１５５】
ＭコンセンサスＰＯＬ
配列番号３９
【０１５６】
【０１５７】
他の実施形態
本発明はその特定の実施形態に関連して記載されているが、さらなる変更が可能であり、及び本願が、概して本発明の原理に従い、且つ本発明が関係する技術分野のなかの公知の又は通常の実施の範囲内に含まれるとともに本明細書で以上に示された本質的な特徴に該当し得る本開示からのかかる逸脱を含む本発明の任意の変形例、使用、又は適応を包含することを意図していることは理解されるであろう。
【０１５８】
本明細書において言及される全ての刊行物及び特許出願は、あたかも各々の独立した刊行物又は特許出願が、全体として参照により援用されるように具体的且つ個別的に示されたのと同じ程度まで、参照により本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００１】
連邦政府助成研究に関する記載
本研究は、ＮＩＨ交付番号第Ｕ１９−ＡＩ０６６３０５号及び同第Ｕ１９−ＡＩ０７８５２６号から一部資金提供を受けている。政府は本発明に対して特定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ウイルス感染症を治療又は予防するための組成物、方法、及びキットを提供する。本明細書に記載される多価（例えば、二価）ワクチンは、ワクチン接種を受けた対象における細胞性免疫応答の多様性又は幅及び深さを増加させることのできる、計算により最適化されたウイルスポリペプチドを組み込む。
【背景技術】
【０００３】
ウイルスに対する細胞性免疫応答を誘発するワクチンは、ウイルス感染症を効果的に治療又は予防するため広域のウイルス多様性を反映しなければならない。例えば、強力で多様なＨＩＶ−１特異的Ｔ細胞応答の惹起は、有効なＨＩＶ−１ワクチンには極めて重要であると思われる。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答はヒトにおける疾患進行の遅延と相関し、非ヒト霊長類ワクチン接種モデルにおけるＣＴＬ応答の重要性は十分に確立されている。大きいばらつきのあるエンベロープ（Ｅｎｖ）がＨＩＶに対する中和抗体の一次標的であり、ワクチン抗原もまた、それらの抗体応答を誘発するように作ることが必要となり得るが、Ｔ細胞ワクチン成分は、より保存されているタンパク質を標的化し、交差反応する可能性がより高い応答を引き起こすことができる。しかし、最も保存されているＨＩＶ−１タンパク質でさえ、ばらつきが問題となり得るのに十分な多様性を有する。コンセンサス及び祖先ＨＩＶ−１配列などの人工的な中心配列のワクチン手法は、本質的に株間の「違いを分ける」もので、天然株ワクチンと比較して交差反応性が亢進した応答を刺激することができる。コンセンサス抗原は、あらゆる循環株の唯一最良の「平均」である合成抗原配列に相当する。こうした抗原は特異的細胞性免疫応答を誘発することができるが、その応答の幅及び強度は、これまでのワクチン戦略と比べて実質的に向上していない。ウイルス感染症を治療又は予防する次世代ワクチンの開発は、ワクチン接種が奏功する結果をもたらすことができるように、細胞性免疫の幅の増加を引き出すものでなければならない。かかるワクチンは、特にＨＩＶ−１の治療又は予防に差し迫って必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
第１の態様において、本発明は、少なくとも２個の別個の最適化ウイルスポリペプチド（例えば、２、３、４、５個、又はそれ以上の別個の最適化ウイルスポリペプチド）を含む、ヒトなどの哺乳動物におけるウイルス感染症を治療し、又はそのリスクを低減するワクチンを特徴とし、ここで最適化ウイルスポリペプチドは、同じウイルス遺伝子産物に対応する。一実施形態において、ウイルス感染症は、レトロウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、カリシウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、アストロウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、又はポリオーマウイルスにより引き起こされる。他の実施形態において、レトロウイルスはヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）であり、及びウイルス遺伝子産物は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、又はＶｐｕを含む。さらなる実施形態において、ワクチンは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、又はＶｐｕウイルス遺伝子産物のうちの１つに対応する最適化ウイルスポリペプチドを２個以下含む。別の実施形態において、ワクチンは、Ｇａｇ及びＮｅｆに対応する最適化ウイルスポリペプチドを含まない。さらに別の実施形態において、ワクチンは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、及びＶｐｕから選択される第１のウイルス遺伝子産物についての少なくとも２個の別個の最適化ウイルスポリペプチド（例えば、２、３、４、５個、又はそれ以上の別個の最適化ウイルスポリペプチド）と、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、及びＶｐｕから選択される第１のウイルス遺伝子産物と異なる第２のウイルス遺伝子産物についての１つ又は複数の別個の最適化ウイルスポリペプチド（例えば、２、３、４、５個、又はそれ以上の別個の最適化ウイルスポリペプチド）とを含む。
【０００５】
第２の態様において、本発明は、ヒトなどの哺乳動物におけるヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）感染症を治療し、又はそのリスクを低減するワクチンであって、配列番号１〜２９に示される配列のいずれか１つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００又はそれ以上の連続するアミノ酸長）を有する最適化ウイルスポリペプチドを含むワクチンを特徴とする。一実施形態において、最適化ウイルスポリペプチドは、配列番号１〜２９に示される配列のいずれか１つとアミノ酸配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００又はそれ以上の連続するアミノ酸長）を有する。別の実施形態において、最適化ウイルスポリペプチドは、配列番号１〜２９に示される配列のいずれか１つのアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、ワクチンは、ａ）〜ｋ）群の任意の１つ又は複数から選択される少なくとも２個の最適化ウイルスポリペプチドを含む：ａ）配列番号１及び２；ｂ）配列番号３、４、及び５；ｃ）配列番号６及び７；ｄ）配列番号８〜１２；ｅ）配列番号１３、１４、及び１５；ｆ）配列番号１６、１７、及び１８；ｇ）配列番号１９及び２０；ｈ）配列番号２１、２２、及び２３；ｉ）配列番号２４及び２５；ｊ）配列番号２６及び２７；並びにｋ）配列番号２１〜２２。別の実施形態において、ワクチンは、上記のａ）〜ｋ）群のいずれか１つから選択される最適化ウイルスポリペプチドと、同じ、又は異なるａ）〜ｋ）群からの１つ又は複数の異なる最適化ウイルスポリペプチドとの対を含むことができる。他の実施形態において、ワクチンは、ａ）〜ｋ）群の１つ又は複数からの少なくとも３個又は４個又はそれ以上の最適化ウイルスポリペプチドを含むことができる。
【０００６】
第３の態様において、本発明は、別個の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも２つの対を含む、ヒトなどの哺乳動物におけるウイルス感染症を治療し、又はそのリスクを低減するワクチンを特徴とし、ここで最適化ウイルスポリペプチドの各対は同じウイルス遺伝子産物に対応し、及びここでワクチンに組み込まれた２個以下の最適化ウイルスポリペプチドは、同じウイルス遺伝子産物に対応する。一実施形態において、ワクチンは、別個の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも３つの対を含む。別の実施形態において、ワクチンは、別個の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも４つの対を含む。一実施形態において、ウイルス感染症は、レトロウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、カリシウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、アストロウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、又はポリオーマウイルスにより引き起こされる。他の実施形態において、レトロウイルスはヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）であり、及びウイルス遺伝子産物は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、又はＶｐｕを含む。さらなる実施形態において、ワクチンは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、又はＶｐｕウイルス遺伝子産物のうちの１つに対応する最適化ウイルスポリペプチドを２個以下含む。別の実施形態において、ワクチンは、Ｇａｇ及びＮｅｆに対応する最適化ウイルスポリペプチドを含まない。さらなる実施形態において、ワクチンは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、又はＶｐｕウイルス遺伝子産物のうちの任意の３つに対応する別個の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも３つの対を含む。別の実施形態において、ワクチンは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、又はＶｐｕウイルス遺伝子産物のうちの任意の４つに対応する別個の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも４つの対を含む。
【０００７】
本発明の最初の３つの態様のうちの任意の一実施形態において、ワクチンは、ウイルス遺伝子産物に対する細胞性免疫応答を誘発する。別の実施形態において、ワクチンは、ＨＩＶ−１に対する細胞性免疫応答を誘発する。さらなる実施形態において、少なくとも１つの別個の最適化ウイルスポリペプチドのヌクレオチド配列は、核酸又はベクターによりコードされる。一実施形態において、ベクターは、アデノウイルス血清型２６（Ａｄ２６）、アデノウイルス血清型３４（Ａｄ３４）、アデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）、アデノウイルス血清型４８（Ａｄ４８）、又はアデノウイルス血清型５ ＨＶＲ４８（Ａｄ５ＨＶＲ４８）などの組換えアデノウイルスである。さらなる実施形態において、ワクチンは、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤と組み合わせたものである。
【０００８】
第４の態様において、本発明は、配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００又はそれ以上の連続するアミノ酸長）を有する最適化ウイルスポリペプチドのヌクレオチド配列を含む核酸を特徴とする。一実施形態において、最適化ウイルスポリペプチドは、配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００又はそれ以上の連続するアミノ酸長）を有する。別の実施形態において、最適化ウイルスポリペプチドは、配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを有する。さらなる実施形態において、核酸はベクターを含む。一実施形態において、ベクターは、アデノウイルス血清型２６（Ａｄ２６）、アデノウイルス血清型３４（Ａｄ３４）、アデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）、アデノウイルス血清型４８（Ａｄ４８）、又はアデノウイルス血清型５ ＨＶＲ４８（Ａｄ５ＨＶＲ４８）などの組換えアデノウイルスである。
【０００９】
第５の態様において、本発明は、配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００又はそれ以上の連続するアミノ酸長）を有する最適化ウイルスポリペプチドを特徴とする。一実施形態において、最適化ウイルスポリペプチドは、配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００又はそれ以上の連続するアミノ酸長）を有する。別の実施形態において、最適化ウイルスポリペプチドは、配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを有する。
【００１０】
第６の態様において、本発明は、本発明のワクチン又は核酸を投与することにより、ヒトなどの哺乳動物におけるウイルス感染症を治療し、又はそのリスクを低減する方法を特徴とする。一実施形態において、ウイルス感染症は、レトロウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、カリシウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、アストロウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、又はポリオーマウイルスにより引き起こされる。さらなる実施形態において、レトロウイルスはヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）であり、及びウイルス遺伝子産物は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、又はＶｐｕを含む。一実施形態において、ワクチン又は核酸は、ウイルス遺伝子産物に対する細胞性免疫応答を誘発する。
【００１１】
第７の態様において、本発明は、本発明のワクチンを合成することによる、ヒトなどの哺乳動物におけるウイルス感染症を治療し、又はそのリスクを低減するワクチンの製造方法を特徴とする。
【００１２】
第８の態様において、本発明は、本発明の核酸を細胞と接触させ、及び最適化ウイルスポリペプチドを単離することによる、ヒトなどの哺乳動物におけるウイルス感染症を治療し、又はそのリスクを低減するワクチンの製造方法を特徴とする。
【００１３】
本発明の第７又は第８の態様の一実施形態において、最適化ウイルスポリペプチドは、哺乳動物に投与されると細胞性免疫応答を誘発する。細胞性免疫応答は、ウイルス遺伝子産物に対するものであってよい。別の実施形態において、ウイルス感染症は、レトロウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、カリシウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、アストロウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、又はポリオーマウイルスにより引き起こされる。さらなる実施形態において、レトロウイルスはヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）であり、及びウイルス遺伝子産物は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、又はＶｐｕを含む。
【００１４】
第９の態様において、本発明は、キットであって、本発明のワクチンと、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤と、キットの使用説明書とを含むキットを特徴とする。一実施形態において、キットはアジュバントも含む。
【００１５】
最後の態様において、本発明は、キットであって、本発明の核酸と、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤と、キットの使用説明書とを含むキットを特徴とする。一実施形態において、キットはアジュバントも含む。
【００１６】
本発明の全ての態様のある実施形態では、最適化ウイルスポリペプチドは、ヒトでの発現用に最適化されている核酸配列によりコードされる（例えば、配列番号５、１０、１１、１２、１５、１８、及び２３のうちの任意の１つ）。
【００１７】
定義
「最適化ウイルスポリペプチド」又は「計算により最適化されたウイルスポリペプチド」とは、天然に存在するウイルスペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質ではない免疫原性ポリペプチドを意味する。最適化ウイルスポリペプチド配列は、最初は、哺乳動物（例えば、ヒト）の免疫後に（例えば、本発明のワクチンに組み込まれたときに）生じる抗ウイルス免疫応答（例えば、細胞性又は体液性免疫応答）の幅、強度、深さ、又は寿命を増加させるように、１つ又は複数の天然に存在するウイルス遺伝子産物（例えば、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質）のアミノ酸配列を修飾することによって生成される。従って、最適化ウイルスポリペプチドは「親」ウイルス遺伝子配列に対応し得る；或いは、最適化ウイルスポリペプチドは特定の「親」ウイルス遺伝子配列に対応しなくともよく、ウイルスの様々な株又は疑似種由来の類似配列に対応してもよい。最適化ウイルスポリペプチドに含めることのできるウイルス遺伝子配列に対する修飾としては、アミノ酸付加、置換、及び欠失が挙げられる。本発明の一実施形態において、最適化ウイルスポリペプチドは、２個以上の天然に存在するウイルス遺伝子産物（例えば、天然又は臨床ウイルス分離株）が複合した、又は合体したアミノ酸配列であり、ここでは潜在的な各エピトープ（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又はそれ以上のアミノ酸長の各連続又は重複するアミノ酸配列）が分析及び修飾され、得られる最適化ウイルスポリペプチドの免疫原性が向上している。異なるウイルス遺伝子産物に対応する最適化ウイルスポリペプチドはまた、融合することによって本発明のワクチンへの組み込みを促進することができる。最適化ウイルスポリペプチドの生成方法は、例えば、参照により本明細書に援用されるＦｉｓｈｅｒら「Ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ Ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｏｖｅｒａｇｅ ｏｆ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ Ｇｌｏｂａｌ ＨＩＶ−１ Ｖａｒｉａｎｔｓ」、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３（１）：１００−１０６頁（２００７年）及び国際公開第２００７／０２４９４１号パンフレットに記載される。最適化ウイルスポリペプチド配列が生成されると、標準的な技術（例えば、参照により本明細書に援用される国際公開第２００６／０４０３３０号パンフレット及び国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットに開示されるアデノウイルスベクターなどの組換えウイルスベクター）により対応するポリペプチドを産生し、又は投与することができる。
【００１８】
「薬学的に許容可能な担体」とは、それと共に投与される化合物の治療特性を維持しながら、治療を受ける哺乳動物にとって生理学的に許容可能である担体を意味する。例示的な薬学的に許容可能な担体の一つは生理食塩水である。他の生理学的に許容可能な担体及びそれらの製剤は当業者に公知であり、例えば、参照により本明細書に援用される「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９９０年、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）に記載されている。
【００１９】
「ベクター」とは、下流の遺伝子又はコード領域に作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡコンストラクト（例えば、ポリペプチド又はポリペプチド断片をコードするｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ断片）を意味する。ベクターをレシピエント細胞（例えば、原核又は真核細胞、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞、発現ベクター内のプロモーターに依存する）又は生体（例えばヒトを含む）に導入すると、細胞は、ベクターによってコードされるｍＲＮＡを発現することができ、次にそれが翻訳されて、コードされた本発明の最適化ウイルスポリペプチドとなる。インビトロ転写／翻訳用のベクターもまた当該技術分野において公知であり、本明細書においてさらに記載される。ベクターは、例えば、バクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、又はヘルペスウイルスに由来する遺伝的に改変されたプラスミド、ウイルス、又は人工染色体であってもよい。
【００２０】
「ウイルス遺伝子産物」とは、任意の天然に存在するウイルスペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質、又はその断片を意味する。本発明の一実施形態において、ウイルス遺伝子産物はヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）に由来する。ＨＩＶ−１ウイルス遺伝子産物は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、及びＶｐｕポリペプチドを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】計算により最適化されたＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖウイルスポリペプチドの、アカゲザルにおける全潜在的Ｔ細胞エピトープ（ＰＴＥ）ペプチドに対する幅の拡大を示す図である。最適化ウイルスポリペプチド（青色）で免疫した動物が、最大数のリコールペプチドプールと反応した。
【図２】計算により修飾されたＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖウイルスポリペプチドがエピトープ特異的細胞性免疫応答の幅を拡大することを示す図である。
【図３】本発明の計算により修飾されたウイルスポリペプチドから得られたＨＩＶ−１ウイルス遺伝子産物Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖで免疫した後のアカゲザル、並びにコンセンサスＨＩＶ−１抗原又はＨＩＶ−１クレードＣ分離株抗原で免疫した動物で検出された細胞性免疫応答の幅を示す。最適化ウイルスポリペプチド（青色）で免疫した動物が、最大数のリコールペプチドプールと反応した。動物は非近交系であるため、プールは動物ごとに異なる。Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖは、各々が多くの細胞性免疫応答を誘発し、共通の反応性パターンを有し得る。
【図４】ウイルスポリペプチド（Ｐｏｌ（図４Ａ）、Ｇａｇ（図４Ｂ）、及びＥｎｖ（図４Ｃ））ごとの、種々の試験ワクチン（二価モザイク（Ｍｏｓ２）、Ｍコンセンサス（Ｍｃｏｎ）、及び最適化クレードＣ（ＯｐｔＣ））の間で共有される潜在的エピトープを示すグラフである。図４Ａ〜図４Ｃは、種々のワクチン候補による現在のＨＩＶデータベース完全長ゲノムセット及びＰＴＥペプチドの相対的有効範囲を示す。
【図５】二価モザイク（Ｍｏｓ２）ワクチンに対するＰＴＥペプチド応答数（ここでは重複にかかわらず各応答が独立したイベントと見なされる）が、Ｍ群コンセンサス（Ｍｃｏｎ）ワクチン、及び最適な有効範囲のＭ群集合（ＯｐｔＣ）ワクチン抗原をもたらすように選択された天然ウイルス株ワクチン（最適化クレードＣ（Ｃ天然（最適））に対する応答数と比べて多いことを示すグラフである。図５は、タンパク質、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、及びＣＤ４＋ Ｔ細胞ごとに動物当たりのＰＴＥペプチド応答数を示す。統計的に、Ｍｏｓ２＞Ｍｃｏｎ〜ＯｐｔＣ（Ｍｃｏｎは、ＯｐｔＣより応答が多い傾向を示す）。Ｍｃｏｎと比較したＭｏｓ２のウィルコクソンｐ値：ｐ値＝０．００１０５８。
【図６】Ｔ細胞応答を引き起こすＰＴＥペプチド数を示す図である。ＣＤ８＋ Ｔ細胞において応答を引き起こす二価モザイク（Ｍｏｓ２）ワクチンのＰＴＥペプチドの中位数は１６（値域；１２〜２９）であり、一方、ＣＤ８＋ Ｔ細胞において応答を引き起こすＭｃｏｎペプチドの中位数は６（値域：０〜７）に過ぎず、及びＯｐｔＣペプチドの中位数は３ペプチド（値域：０〜３）に過ぎない。ＣＤ４＋ Ｔ細胞において応答を引き起こす二価モザイク（Ｍｏｓ２）ワクチンのＰＴＥペプチドの中位数は４（値域；２〜６）であり、一方、ＣＤ４＋ Ｔ細胞において応答を引き起こすＭｃｏｎペプチドの中位数は１（値域：０〜２）に過ぎず、及びＯｐｔＣペプチドの中位数は０．５ペプチド（値域：０〜２）に過ぎない。従って、応答の傾向はＭｏｓ２＞Ｍｃｏｎ＞ＯｐｔＣである。
【図７】被験動物の各々に由来するＴ細胞によって認識される全てのＣＤ８＋ Ｔ細胞Ｇａｇ ＰＴＥペプチドのマッピングを要約する概略図である（以下の実施例３を参照）。動物番号、ペプチドプール及びペプチド番号を、各反応性ペプチドの境界に表示する。記号は群を示す：＊、Ｍｏｓ２；￥、ＣｏｎＭ；±、ＯｐｔＣ。ここでは例としてＧａｇが挙げられる。動物が非近交系であっても、ＣＤ８応答はクラスタ化する傾向がある。モザイクは、単価ワクチンより有利である可能性がある。モザイクは、より多くの共通の変異体と反応する応答を刺激する確率がより高い。モザイクはまた、カクテル中に存在する種々の型に対する複数の応答を刺激する。従って、モザイクは共通のエスケープ経路を遮断する可能性を有する。本発明者らの研究では、モザイクワクチンは、より多くの重複ペプチドを認識するＴ細胞応答を刺激する傾向があった。反応性ペプチドが局在する多くのホットスポットがある。ＰＴＥペプチドは、ワクチンの評価に使用されるペプチド試薬におけるＨＩＶ−１ Ｍ群の潜在的エピトープ（又は９アミノ酸の連続するストレッチについての９−ｍｅｒ）の有効範囲を最大化するように設計される。必然的に、ＰＴＥペプチドには多数の重複が存在するが、そのアルゴリズムに起因して、重複は通常、いくらかのばらつきを伴う重複である。図７は配列番号４２を開示する。
【図８】被験動物の各々に由来するＴ細胞により認識されるＣＤ４＋ Ｔ細胞Ｇａｇ ＰＴＥペプチドのマッピングを要約する概略図である。図８は配列番号４３を開示する。
【図９】ＣｏｎＭワクチン又は最適天然ワクチンに対するＰＴＥ応答の典型的なパターンを示す図であり、応答を誘発するペプチドをワクチンの関連領域と整列させている。これらのワクチンに対する反応を実現するには、ワクチンと標的ＰＴＥペプチドとの間の途切れのない同一のストレッチによる良好なマッチが必要である。図９は、掲載順にそれぞれ配列番号４４〜５７を開示する。
【図１０】モザイクワクチンが、見かけ上の抗原競合なしに、且つ広範な局所的応答で、複数の変異重複ペプチドを認識する多くの応答を生じたことを示す図である。特に、４個の変異ＰＴＥペプチドが認識された。さらに、重複の領域では双方のモザイク型が、それら２つの組み合わせと同様に認識された。最後に、新規の型（Ｓ）が認識された。図１０は、掲載順にそれぞれ配列番号５８〜６３を開示する。
【図１１】モザイクワクチン接種を受けた動物（３６１−０７）におけるＣＤ８＋ ＰＴＥペプチド応答の典型的なパターンを示す図である。２２個のＰＴＥペプチドを試験し、８個のＣＤ８応答領域が同定された；５個の領域が、モザイクのいずれか１つのアミノ酸にマッチする変異ペプチドを含んだ。５個のＣＤ４応答領域が同定された。このように、モザイクに対するＴ細胞応答は、所与の領域においてより多くの変異ペプチドが分かる。これは、特にＣＤ８ Ｔ細胞応答に当てはまるように思われた。これは、エピトープの変異体を認識する複数のＴ細胞クローンをもたらし、それらが適応されるエスケープ経路を遮断し得る結果であり得る。より多くの応答があるのみならず、それらはより深く、且つより多くの変異体を網羅する。図１１は、掲載順にそれぞれ配列番号６４〜１０１としてＣＤ８応答を開示する。ＣＤ４応答は、掲載順にそれぞれ配列番号１０２〜１１７として開示される。
【図１２】ワクチンにより誘発されたＴ細胞によって標的化される領域にわたる重複変異ＰＴＥペプチドの数を示すグラフである。
【図１３】２モザイク抗原ワクチンが、Ｍｃｏｎ及びＯｐｔＣワクチンと比べて、１つ又は複数の重複ＰＴＥペプチドを含む領域に対するより多くのＴ細胞応答をもたらすことを示すグラフである。図１３は図５と同様であり、サルが右から左に同じ順序で示されるが、単一のペプチドではなく１つ又は複数の重複ＰＴＥペプチドを含む領域に対する応答数を反映して尺度を変えている。
【図１４】二価モザイク（Ｍｏｓ２）、Ｍｃｏｎ、及びＯｐｔＣワクチンを投与した後の動物におけるＴ細胞応答数を示す図である。ＣＤ８＋ Ｔ細胞において二価モザイク（Ｍｏｓ２）ワクチンが引き起こす応答の中位数は８であり、一方、Ｍｃｏｎ及びＯｐｔＣワクチンにより引き起こされるＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の中位数は、それぞれ３ペプチド（値域：０〜６）及び１．５ペプチド（値域：０〜５）に過ぎない。ＣＤ４＋ Ｔ細胞において二価モザイク（Ｍｏｓ２）ワクチンが引き起こす応答の中位数は３（値域；２〜５）であり、一方、Ｍｃｏｎ及びＯｐｔＣワクチンにより引き起こされるＣＤ４＋ Ｔ細胞応答の中位数は、それぞれ１（値域：０〜２）及び０．５（値域：０〜２）に過ぎない。従って、応答の傾向はＭｏｓ２＞Ｍｃｏｎ＞ＯｐｔＣである。
【図１５】モザイクワクチンが、Ｃクレード天然ワクチンと比べて、Ｃクレード天然タンパク質と交差反応する応答をより多く誘発できることを示すグラフである：ＧＡＧプールペプチドが５個のタンパク質に相当する。Ｍ群コンセンサス又は最適な有効範囲のＣクレード天然タンパク質によるワクチン接種を受けた動物は、これらのタンパク質に由来するペプチドに対する０〜２つの応答を有したが、一方、モザイクワクチン接種を受けた動物は、１〜５つのペプチドプールに対して応答することができた。モザイクワクチンは、Ｍ ｃｏｎ又は最適Ｃのいずれと比べても、試験したタンパク質の各々に対するより多くの応答を誘発する。モザイクワクチンにより誘発されたＴ細胞応答はまた、実際のＧａｇタンパク質にわたるプールペプチドセットをより多く認識した。１０〜１２サブプール＝１０×１５ｍｅｒペプチド（５×２０ｍｅｒペプチドである９６ＺＭ Ｇａｇを除く）。
【図１６】モザイク設計が、時間の経過に伴うウイルスポリペプチドの変化に対してロバストであることを示すグラフである（例えば、Ｇａｇ Ｍ）。
【図１７】９−ｍｅｒ最適化を使用した有効範囲が、準（例えば、８〜１２ｍｅｒ）最適化長さと比べてロバストであることを示すグラフである（Ｇａｇを図示）。
【図１８】変異体数が増加すると有効範囲が大きくなるが、あくまでも収穫逓減を有することを示すグラフである（Ｇａｇを図示）。
【図１９】ＰＴＥペプチドに対するエピトープ特異的Ｔリンパ球応答の幅及び大きさを示すグラフである。図１９Ａは、モザイク（青色）、Ｍコンセンサス（緑色）、クレードＢ＋クレードＣ（紫色）、又は最適天然クレードＣ（赤色）ＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原を発現するｒＡｄ２６ベクターの単回免疫後の個々のＰＴＥペプチドに対するエピトープ特異的ＣＤ４＋（上側）及びＣＤ８＋（下側）Ｔリンパ球応答の数を示すグラフである。個々のサルをｘ軸上に示す。各色の異なる陰影は、異なる抗原（Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ）に対する応答を反映している。図１９Ｂは、ＣＤ４＋（上側）及びＣＤ８＋（下側）Ｔリンパ球応答領域の数を示すグラフである。
【図２０Ａ】ＨＩＶ−１ Ｇａｇ（図２０Ａ）（配列番号１１８）、Ｐｏｌ（図２０Ｂ）（配列番号１１９）、及びＥｎｖ（図２０Ｃ）（配列番号１２０）タンパク質配列にマッピングした免疫後４週目のＰＴＥペプチドに対するＣＤ８＋ Ｔリンパ球応答を示す概略図を示す。色は、モザイク（青色）、Ｍコンセンサス（緑色）、クレードＢ＋クレードＣ（紫色）、又は最適天然クレードＣ（赤色）ＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原の投与を受けたサルを示す。各エピトープについて、サル番号、抗原（Ｇ、Ｇａｇ；Ｐ、Ｐｏｌ；Ｅ、Ｅｎｖ）、サブプール番号、及び個々のＰＴＥペプチド番号が示される。
【図２０Ｂ−１】図２０Ａの続きである。
【図２０Ｂ−２】図２０Ｂ−１の続きである。
【図２０Ｃ】図２０Ｂ−２の続きである。
【図２１Ａ】ＨＩＶ−１ Ｇａｇ（図２１Ａ）（配列番号１２１）、Ｐｏｌ（図２１Ｂ）（配列番号１２２）、及びＥｎｖ（図２１Ｃ）（配列番号１２３）タンパク質配列にマッピングした免疫後４週目のＰＴＥペプチドに対するＣＤ４＋ Ｔリンパ球応答を示す概略図を示す。色は、モザイク（青色）、Ｍコンセンサス（緑色）、クレードＢ＋クレードＣ（紫色）、又は最適天然クレードＣ（赤色）ＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原の投与を受けたサルを示す。各エピトープについて、サル番号、抗原（Ｇ、Ｇａｇ；Ｐ、Ｐｏｌ；Ｅ、Ｅｎｖ）、サブプール番号、及び個々のＰＴＥペプチド番号が示される。
【図２１Ｂ】図２１Ａの続きである。
【図２１Ｃ】図２１Ｂの続きである。
【図２２−１】モザイク、Ｍコンセンサス、クレードＢ＋クレードＣ、又は最適天然クレードＣ ＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原を発現するｒＡｄ２６ベクターによる免疫後４週目の全てのサルにおけるワクチン配列の反応性ＰＴＥペプチドとのアラインメントを示す概略図である。各サルについて、ワクチン配列を一番上に示し、抗原（Ｇ、Ｇａｇ；Ｐ、Ｐｏｌ；Ｅ、Ｅｎｖ）及びＰＴＥペプチド番号により表される反応性ＰＴＥペプチドを、ワクチン配列の下に示す。最小重複領域は太字で示す。２つのモザイク又は２つのクレードＢ＋クレードＣ抗原の間の配列多型は青色で示す。ワクチン配列と反応性ＰＴＥペプチドとの間の違いは赤色で示す。図２２は、掲載順にそれぞれ配列番号１２４〜６４０を開示する。反応性ペプチドの間の重複が生じるときのその重複に基づき免疫応答エピトープを含む可能性があるペプチド内の最小領域は、ワクチンにおいて太字とする。重複ペプチドがない場合、エピトープがペプチドのどこにでもあり得ると仮定し、従って領域全体を太字とする。ペプチド内で種々の境界を有するエピトープを標的とする種々のＴ細胞応答、又は変異体が存在するときにばらつきを許容することのできるより雑多なクローン性Ｔ細胞応答の間を区別することはできない；いずれのシナリオも、ワクチン免疫応答において有利となり得る。標的化される領域の数は、データを考慮するのに必要な最小Ｔ細胞応答数に対応する。ワクチンとペプチドとがマッチしないアミノ酸は赤色で記す；アミノ酸がエピトープを含んでいる可能性のある領域内に収まる場合、それらは太字赤色とする。複数のペプチドが重複するときの重複領域外でのアミノ酸の違いは赤色で標示し、しかし太字にはしない。ワクチンが常に一番上である。各タンパク質の文字（ＧａｇはＧであり、ＰｏｌはＰであり、エンベロープはＥである）及びペプチド番号を用いて各反応性ＰＴＥペプチドを表示する。タンパク質及びＨＸＢ２番号が各ペプチドに続く。モザイク及びクレードＢ＋Ｃワクチンについては２個の抗原があり、各々が双方ともアラインメントに含まれる；ワクチンにおけるアミノ酸の違いは青色で指示し、及び反応性ペプチドが第２のモザイクに変異アミノ酸を含む場合、それも青色とする。２つのワクチン抗原が異なる位置の各々において反応性ペプチドをさらに太字で標示し、２つの変異が含まれているその位置がワクチン免疫応答に影響を与え、より大きい幅及び深さをもたらした可能性があることを示す。例えば、要約される最初のワクチンはクレードＢ＋Ｃワクチンであり、動物２８７−９５が、それについての応答が掲載される最初の動物である。ＰＴＥペプチドに対してＣＤ８応答が３つあり、ＣＤ４に対して１つあった。ＣＤ８ペプチドのうちの２つ、Ｅ２６及びＥ２８２は実質的な重複を示し、従って双方が同じＣＴＬ応答を標的とし得る；このように、２つのＣＤ８応答領域のみと、１つのＣＤ４応答領域とがあることも記載する。各応答領域について領域当たりの重複ペプチドの数を書き出すことで（例えば、ＣＤ８：１ ２ ＣＤ４：１）、応答の深さを評価する；２つは赤色とし、その重複の領域は反応性ペプチドにばらつきがあることを示す。ワクチンが異なる場合、２番目の反応性領域におけるＤ／Ｅのように、それを青色で標示する。重複の領域のみは太字である。Ｅ２８２におけるＨはいずれのワクチンにも認められなかったため、赤色で標示する；これは重複の領域内にあるため、太字としている。各反応性ペプチドは、そのタンパク質及び対応するＨＸＢ２番号を有し、右側に記載する。
【図２２−２】図２２−１の続きである。
【図２２−３】図２２−２の続きである。
【図２２−４】図２２−３の続きである。
【図２２−５】図２２−４の続きである。
【図２２−６】図２２−５の続きである。
【図２２−７】図２２−６の続きである。
【図２２−８】図２２−７の続きである。
【図２２−９】図２２−８の続きである。
【図２２−１０】図２２−９の続きである。
【図２２−１１】図２２−１０の続きである。
【図２２−１２】図２２−１１の続きである。
【図２２−１３】図２２−１２の続きである。
【図２２−１４】図２２−１３の続きである。
【図２２−１５】図２２−１４の続きである。
【図２２−１６】図２２−１５の続きである。
【図２２−１７】図２２−１６の続きである。
【図２２−１８】図２２−１７の続きである。
【図２３】全てのＧａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ特異的ＣＤ８＋（図２３Ａ及び図２３Ｂ）及びＣＤ４＋（図２３Ｃ）Ｔリンパ球応答の大きさを、最低値から最高値まで並べて示すグラフである。
【図２４Ａ−Ｂ】ＰＴＥペプチドに対するエピトープ特異的Ｔリンパ球応答の深さを示す。図２４Ａは、最適天然クレードＣ抗原の投与を受けたサル３６６におけるマッピングしたＴリンパ球応答の例を示す概略図である。図２４Ｂは、二価モザイク抗原の投与を受けたサル３６１におけるマッピングしたＴリンパ球応答の例を示す概略図である。図２４Ａ及び図２４Ｂでは、ワクチン配列を一番上に示し（ＯｐｔＣ；Ｍｏｓ１、Ｍｏｓ２）、抗原（Ｇ、Ｇａｇ；Ｐ、Ｐｏｌ；Ｅ、Ｅｎｖ）及びＰＴＥペプチド番号により表される反応性ＰＴＥペプチドを、ワクチン配列の下に示す。最小重複領域は太字で示す。２つのモザイク抗原間の配列多型は青色で示す。ワクチン配列と反応性ＰＴＥペプチドとの違いは赤色で示す。応答領域ごとにまとめた全ての陽性ペプチドの完全アラインメントは、図２２に示す。図２４Ｃは、モザイク、Ｍコンセンサス、クレードＢ＋クレードＣ、又は最適天然クレードＣ抗原を発現するｒＡｄ２６ベクターで免疫した後のＣＤ４＋（上側）及びＣＤ８＋（下側）Ｔリンパ球応答の深さを示すグラフである。個々のサルをｘ軸上に示す。各エピトープ領域について、１つの応答変異体（薄い陰影）又は１つより多い応答変異体（濃い陰影）を示す。図２４Ａは、掲載順にそれぞれ配列番号６４１〜６５０を開示する。図２４Ｂは、掲載順にそれぞれ配列番号６５１〜６８５を開示する。
【図２４Ｃ】図２４Ａ−Ｂの続きである。
【図２５】クレードＡ、Ｂ、及びＣ由来のＨＩＶ−１ Ｇａｇペプチドに対するエピトープ特異的Ｔリンパ球応答の幅を示すグラフである。細胞性免疫応答の幅を、以下のＨＩＶ−１ Ｇａｇ株由来の重複ペプチドのサブプールを利用して評価した：クレードＣ ＤＵ４２２、クレードＣ ＺＭ６５１、コンセンサスＣ、コンセンサスＡ、及びコンセンサスＢ。モザイク（青色）、Ｍコンセンサス（緑色）、クレードＢ＋クレードＣ（紫色）、又は最適天然クレードＣ（赤色）ＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原を発現するｒＡｄ２６ベクターの単回免疫後の陽性サブプールの数を示す。個々のサルをｘ軸上に示す。
【図２６Ａ−Ｂ】追加免疫後の細胞性及び体液性免疫応答を示すグラフである。各サルについてプライミング後４週目（各パネルの左側）及び追加免疫後４４週目（各パネルの右側）の個々のＴリンパ球応答の大きさ（図２６Ａ）及び幅（図２６Ｂ）を示す。サルは、０週目にｒＡｄ２６ベクターでプライミングし、４０週目に、モザイク、Ｍコンセンサス、又は最適天然クレードＣ ＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原を発現するｒＡｄ５ＨＶＲ４８ベクターで追加免疫した。個々のサルをｘ軸上に示す。図２６Ａでは、赤色はＣＤ８＋ Ｔリンパ球応答を表し、青色はＣＤ４＋ Ｔリンパ球応答を表し、線は双方の時間点で観察された応答を表し、及び点は一方の時間点でのみ観察された応答を表す。図２６Ｂでは、各色の異なる陰影が、異なる抗原（Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ）に対する応答を反映している。図２６Ｃは、０週目、４週目、及び４４週目におけるＥｎｖ特異的ＥＬＩＳＡエンドポイント力価を示すグラフである。図２６Ｄは、４４週目における第１層クレードＡ（ＤＪ２６３．８）、クレードＢ（ＳＦ１６２．ＬＳ）、及びクレードＣ（ＭＷ９６５．２６）ウイルスに対する中和抗体（ＮＡｂ）力価を示すグラフである。陰性対照としてのマウス白血病ウイルスに対するＮＡｂ力価は、いずれの試料についても２０未満であった。
【図２６Ｃ−Ｄ】図２６Ａ−Ｂの続きである。
【図２７】様々なワクチン抗原ごとのＰＴＥペプチドの理論的な有効範囲を示すグラフである。モザイク（青色）、Ｍコンセンサス（緑色）、クレードＢ＋クレードＣ（紫色）、又は最適天然クレードＣ（赤色）ＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原により網羅される９アミノ酸ＰＴＥペプチドのパーセンテージを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、天然に存在するウイルス遺伝子産物から計算により得られる最適化ウイルスポリペプチドを特徴とする。本発明の最適化ウイルスポリペプチドは、本発明の１つ若しくは複数の最適化ウイルスポリペプチド又は本発明の１つ若しくは複数の最適化ウイルスポリペプチドを組み込むワクチン（例えば、ベクター）で対象（例えば、ヒト）を免疫した後の、ウイルス特異的免疫（例えば、Ｔ細胞に基づく免疫応答などの細胞性免疫）の幅及び深さの増加を可能とする。本発明は、ウイルス感染症に感染した、又は感染するリスクがある対象（例えば、ヒト）に投与することのできるワクチンを提供する。本発明のワクチンは、代表される各対応するウイルス遺伝子産物についての少なくとも２個の別個の最適化ウイルスポリペプチドを組み込む。少なくとも２個の別個の最適化ウイルスポリペプチドを組み込むことにより、ワクチンにおける免疫原性エピトープの有効範囲及び代表性を高めることが可能となり、本発明者らが発見したこのことにより、対象のワクチン接種後にウイルス特異的免疫応答の総数の増加がもたらされる。本発明はまた、ワクチン、ベクター、及び最適化ウイルスポリペプチドを対象（例えば、ヒト）に投与する方法、及びそれらを製造する方法も提供する。本明細書に記載される組成物、方法、及びキットは、少なくとも２個の別個の最適化ウイルスポリペプチドを提供することによってウイルス特異的細胞性免疫応答の多様性、幅、及び／又は深さを実質的に増加させることができる。
【００２３】
本発明の最適化ウイルスポリペプチド
本発明は、自然に循環しているウイルス遺伝子産物に対応し、且つそれから得られる計算により最適化されたウイルスポリペプチドを組み込む多価（例えば、二価）ワクチンを提供する。多価モザイクタンパク質は、天然配列からインシリコ組換えにより構築され、所与の結合価に対する潜在的なＴ細胞エピトープ（ＰＴＥ）の最大の有効範囲を提供するように最適化される。モザイク抗原は、天然抗原の発現及びプロセシングを維持するように設計される完全長タンパク質である。
【００２４】
本発明者らは、単一のウイルス遺伝子産物に対応し、且つそれから得られる２つの別個の最適化ウイルスポリペプチド（すなわち、二価ワクチン）で免疫すると、同じウイルス遺伝子産物から得られる天然に存在するポリペプチド（例えば、臨床分離株に基づく配列）、又は同じウイルス遺伝子産物から得られるかかる天然に存在するポリペプチドのコンセンサス配列を組み込む従来の単価又は多価ワクチンより実質的に多い数の細胞性免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答）が誘発されることを発見した。従って、計算により最適化されたウイルスポリペプチドであって、その配列が循環ウイルス配列の希少でなく短いストレッチの最大有効範囲を提供する最適化ウイルスポリペプチドを組み込むワクチンは、免疫応答の幅及び深さを増加させることができる。
【００２５】
遺伝的アルゴリズムを使用して、入力として提供される天然に存在するウイルス遺伝子産物配列の任意のセットの断片の「モザイク」ブレンドとして最適化ウイルスポリペプチドのセットが作成される。この遺伝的アルゴリズム戦略は、入力データセットとして一般的なウイルス集団からの整列していないタンパク質配列を使用し、従って「アラインメントに依存しない」という長所を有する。これにより、自然界に見られるウイルスタンパク質に類似しているが、天然には存在しない人工的な最適化ウイルスポリペプチドが作り出される。遺伝的アルゴリズムは、目的とする標的の又は所望の免疫応答に応じて、種々の長さのウイルスポリペプチドを最適化するように調整することができる。ほとんどのＴ細胞エピトープは９アミノ酸長であるため、本発明の最適化ウイルスポリペプチドの設計に利用した遺伝的アルゴリズムは、所与のウイルス遺伝子産物（例えば、ＨＩＶ−１ Ｇａｇ）の各々の連続した９−ｍｅｒアミノ酸配列の最適化に基づいた。この手法に従えば、自然界に存在しない、又は極めて希少である９−ｍｅｒ（例えば）を除外することができる−これは、コンセンサス配列に基づくワクチン戦略と比べたとき、コンセンサス配列は、自然界にはまれにしか、又は全く存在しないいくつかの９−ｍｅｒ（例えば）を含み得るため、改良点である。遺伝的アルゴリズムに用いられる適応度の定義は、最も「適応する」多価カクテルが、集団中の全ての９ｍｅｒのなかで最良の有効範囲（最高の完全マッチ率）を与え、且つ集団に存在しない、又はまれである９ｍｅｒがないという制約を受ける入力ウイルス配列の組み合わせであることである。本発明の最適化ウイルスポリペプチドの生成に用いられる遺伝的アルゴリズムについては、参照により本明細書に援用される国際公開第２００７／０２４９４１号パンフレットにさらに記載されている。
【００２６】
一実施形態において、本発明は、単一の最適化されたＨＩＶ−１ポリペプチド（例えば、配列番号１〜２９に示されるポリペプチド）を組み込む多価（例えば、二価）ＨＩＶ−１ワクチンを提供する。別の実施形態において、本発明は、２個以上の最適化されたＨＩＶ−１ポリペプチドを組み込む多価ワクチンを特徴とする。いずれの場合も、最適化ＨＩＶ−１ポリペプチドは、ＨＩＶ−１メイン（Ｍ）群として知られる全体的循環における全てのＨＩＶ−１変異体に基づく。本発明者らは、遺伝子当たり２つの変異体（例えば、各々がＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、及びＶｐｕについての２つのポリペプチド配列）のみを利用するＭ群モザイク遺伝子に基づき細胞性免疫の幅及び深さを増大させる最適化ＨＩＶ−１ポリペプチドのセット（配列番号１〜２９）を生成した。本発明者らは、アカゲザルにおいて、多価（例えば、二価）ＨＩＶ−１ Ｍ群ワクチンにこれらの最適化ＨＩＶ−１ポリペプチドを使用すると、２つの他の有力なワクチン抗原戦略（Ｍコンセンサス抗原及び最適天然クレードＣ抗原）と比較したとき有意に大きい幅及び深さのＨＩＶ−１特異的細胞性免疫応答が誘発されるという新規の、且つ意外な結果を得た。
【００２７】
本発明は、異なるウイルス遺伝子産物に対応する最適化ウイルスポリペプチドの融合を提供する。上記の遺伝的アルゴリズムを用いて、本発明のワクチンに使用される融合ポリペプチドを生成することができる。例えば、Ｇａｇ／Ｎｅｆ（配列番号１９〜２０）と、Ｇａｇ／Ｐｏｌ（配列番号２１〜２７）と、Ｇａｇ／Ｐｏｌ／Ｎｅｆ（配列番号２８〜２９）との最適化ＨＩＶ−１ポリペプチド融合体を、ＨＩＶ−１に感染した、又は感染するリスクがある対象（例えば、ヒト）に投与するため本発明のベクターに組み込むことができる。本発明のワクチンは（ポリペプチド形態であろうと、又は核酸形態であろうと）、例えば、最適クレードＣ配列（配列番号３０〜３６）又はコンセンサス配列（配列番号３７〜３９）などの非「モザイク」ポリペプチド（又はそれぞれ、それをコードする配列）の１つ又は複数も含むことができる。
【００２８】
本発明に開示される最適化ウイルスポリペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９頁（１９６３年）によって記載されるものなどの化学合成技法により従来どおり調製することができる（また、例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒら、１６４ Ｇｅｎｅ ４９（１９９５年）も参照のこと）。例えば、ワクチンは、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いて容易に調製することができる。自動化された固相合成を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ ４３３Ａペプチドシンセサイザーなどの、数多くの周知されている市販の自動シンセサイザーのいずれか一つを使用して行うことができる。或いは、本発明の最適化ウイルスポリペプチドは、最適化ウイルスポリペプチドの細胞内発現を可能にする核酸又はベクター（例えば、アデノウイルスなどのウイルスベクター）を細胞又は生体にトランスフェクト又は形質導入することにより組換え産生することができる。本発明の最適化ウイルスポリペプチドのヌクレオチド配列をコードする核酸及びベクターは、本明細書に記載されるものを含めた公知の組換えＤＮＡ技法により合成することができる。
【００２９】
本発明のワクチン
本発明はまた、ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１）に感染した、又は感染するリスクがある患者に投与することのできるワクチンも特徴とする。本発明のワクチンは、本明細書において考察されるとおりの、本発明の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも１つを含む。本発明のワクチンは、本発明の２個以上の最適化ウイルスポリペプチドのヌクレオチド配列（例えば、組換えの（例えば、サブユニット）又は生体全体の（例えば、ウイルス全体）ウイルスベクターの免疫原性成分）をコードする核酸であってもよい。核酸は、本発明の２個以上の最適化ウイルスポリペプチドのヌクレオチド配列を組み込むベクター（例えば、アデノウイルスなどのウイルスベクター）を含む。本発明の最適化ウイルスポリペプチド、並びに最適化ウイルスポリペプチドを組み込むワクチン、核酸、及びベクターは、細胞若しくは生体において組換え発現させることができ、又はウイルスに感染した、若しくは感染するリスクがある対象（例えば、ヒト）に直接投与することができる。
【００３０】
本発明のベクター
本発明はまた、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドのヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）をコードするベクターも特徴とする。ベクターは、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む担体（例えば、リポソーム）、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体、又はウイルスであってもよい。ベクターは、いくつかの供給源由来のさらなる核酸配列を含むことができる。
【００３１】
本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドをコードするベクターは、当該技術分野において公知の任意の組換え分子生物学的技法を用いて作成することができる。ベクターは、標的細胞又は生体のトランスフェクション又は形質導入後、染色体外にあってもよく、又は宿主細胞の染色体に組み込まれてもよい。ベクターの核酸成分は、標的細胞当たりのコピー数が単一又は複数であってよく、及び直鎖状、環状、又はコンカテマー状であってよい。
【００３２】
本発明のベクターはまた、単一の核酸転写産物からの複数のペプチド鎖又はポリペプチド鎖の発現を可能にする内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列を含むこともできる。例えば、本発明のベクターは、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチド並びに別のポリペプチド（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの検出可能標識）をコードすることができる。
【００３３】
本発明のベクターは、本発明の最適化ウイルスポリペプチドの発現を促進する遺伝子発現エレメントをさらに含む。本発明の最適化ウイルスポリペプチドをコードするベクターの発現に有用な遺伝子発現エレメントとしては、限定はされないが、（ａ）ウイルス転写プロモーター並びにそのエンハンサーエレメント、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、及びモロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲなどの調節配列；（ｂ）ＳＶ４０後期領域に由来するものなどのスプライス領域及びポリアデニル化部位；及び（ｃ）ＳＶ４０などにおけるポリアデニル化部位が挙げられる。また、プラスミド複製起点、抗生物質耐性又は選択遺伝子、多重クローニング部位（例えば、制限酵素切断位置）、及び他のウイルス遺伝子配列（例えば、ＨＩＶ末端反復配列（ＬＴＲ）などの、ウイルスの構造、機能、又は調節エレメントをコードする配列）も含む。
【００３４】
本発明のベクターはまた、例えば、配列番号１１、１４〜１８、及び２３のいずれか一つなどの、ヒトにおける発現用に最適化されている本発明の最適化ウイルスポリペプチドを含むこともできる。
【００３５】
本発明のベクターはまた、以下の酵素切断部位：ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ−Ｋｏｚａｋ−Ｓｔａｒｔ．．．Ｓｔｏｐ−ＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩ；及び以下の配列：ＴＣＴＡＧＡ ＧＡＡＴＴＣ ＧＣＣＡＣＣ［ＡＴＧ遺伝子ＴＡＡ ＴＧＡ］ＧＧＡＴＣＣ ＧＣＴＡＧＣを有する多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含むように改変することもできる。このＭＣＳを有するベクターは、内部的なＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩ部位を有しないとともに、６個以上のＣ又はＧのストレッチを有しない最適化ウイルスポリペプチドと共に用いることができる。
【００３６】
生体内投与
本発明は、本発明の１つ又は複数のワクチン（例えば、本発明の２個以上の最適化ウイルスポリペプチドをコードするベクター）を対象（例えば、ヒト）に生体内投与して本発明の２個以上の最適化ウイルスポリペプチドの発現を促進する方法を特徴とする。ワクチンを対象に投与すると、ウイルス免疫原に対する防御的又は治療的免疫応答（例えば、細胞性又は体液性免疫応答）を誘発することのできる本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドが発現する。
【００３７】
いくつかのタイプのベクターを用いて、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を対象（例えば、ヒト）に直接送達することができる。本発明のベクターとしては、ウイルス、ネイキッドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、カチオン性脂質（例えば、リポソーム）、カチオン性ポリマー（例えば、ポリソーム）、ビロソーム、及びデンドリマーが挙げられる。本発明は、細胞（例えば、血球細胞）のエキソビボでのトランスフェクション又は形質導入を提供し、続いてそれらの細胞をドナー対象に投与し戻すことで、免疫原特性を有する本発明の最適化ウイルスポリペプチドの発現が可能となる。本発明の方法により単離し、エキソビボでトランスフェクト又は形質導入することのできる細胞としては、限定はされないが、血球細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、肝実質細胞、前立腺上皮細胞、及び血管内皮細胞が挙げられる。幹細胞もまた、本発明のベクターの形質導入又はトランスフェクションに適した細胞である。本発明の方法によれば、骨髄前駆細胞及び造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む全能性、多能性、多分化能、又は単能性幹細胞を単離して、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドをコードするベクターをトランスフェクト又は形質導入し、対象に投与することができる。
【００３８】
本発明の最適化ウイルスベクターを発現させるために用いられるトランスフェクション又は形質導入の方法は、トランスフェクト又は形質導入細胞における、及びそれに続いて細胞の投与を受ける対象におけるタンパク質発現の強度及び寿命に強い影響を有する。本発明は、本質的に一時的なベクター（例えば、アデノウイルスベクター）又は長命のベクター（例えば、レトロウイルスベクター）を提供する。タンパク質発現の調節に用いることのできる調節配列（例えば、プロモーター及びエンハンサー）が、当該技術分野において公知である。トランスフェクト又は形質導入される細胞のタイプもまた、タンパク質発現の強度及び寿命と強い関連を有する。例えば、代謝回転速度が高い細胞型は、タンパク質発現の期間がより短いと予想され得る。
【００３９】
エキソビボトランスフェクション及び形質導入
本発明はまた、細胞（例えば、リンパ球などの血球細胞）をエキソビボでトランスフェクト及び形質導入し、続いてそれらの細胞を対象（例えば、ヒト）に投与する方法も特徴とする。一実施形態において、細胞は治療を受ける対象の自己由来である。細胞は、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドのヌクレオチド配列をコードする１つ又は複数のベクターをエキソビボでトランスフェクト又は形質導入することにより、治療対象における最適化ウイルスポリペプチドの一時的又は永久的な発現が可能なものとすることができる。このような修飾細胞を対象に投与すると、ウイルス免疫原に対する防御的又は治療的免疫応答（例えば、細胞性又は体液性免疫応答）を誘発することのできる本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスベクターが発現する。
【００４０】
いくつかのタイプのベクターを用いて、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を細胞（例えば、リンパ球などの血球細胞）に送達することができる。本発明のベクターとしては、ウイルス、ネイキッドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、カチオン性脂質（例えば、リポソーム）、カチオン性ポリマー（例えば、ポリソーム）、ビロソーム、及びデンドリマーが挙げられる。本発明は、細胞（例えば、血球細胞）のエキソビボでのトランスフェクション又は形質導入を提供し、続いてそれらの細胞をドナー対象に投与し戻すことで、免疫原特性を有する本発明の最適化ウイルスポリペプチドの発現が可能となる。本発明の方法により単離し、エキソビボでトランスフェクト又は形質導入することのできる細胞としては、限定はされないが、血球細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、肝実質細胞、前立腺上皮細胞、及び血管内皮細胞が挙げられる。幹細胞もまた、本発明のベクターの形質導入又はトランスフェクションに適した細胞である。本発明の方法によれば、骨髄前駆細胞及び造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む全能性、多能性、多分化能、又は単能性幹細胞を単離して、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドをコードするベクターをトランスフェクト又は形質導入し、対象に投与することができる。
【００４１】
本発明の最適化ウイルスベクターを発現させるために用いられるトランスフェクション又は形質導入の方法は、トランスフェクト又は形質導入細胞における、及びそれに続いて細胞の投与を受ける対象におけるタンパク質発現の強度及び寿命に強い影響を有する。本発明は、本質的に一時的なベクター（例えば、アデノウイルスベクター）又は長命のベクター（例えば、レトロウイルスベクター）を提供する。タンパク質発現の調節に用いることのできる調節配列（例えば、プロモーター及びエンハンサー）が、当該技術分野において公知である。トランスフェクト又は形質導入される細胞のタイプもまた、タンパク質発現の強度及び寿命と強い関連を有する。例えば、代謝回転速度が高い細胞型は、タンパク質発現の期間がより短いと予想され得る。
【００４２】
ウイルスベクター
本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドのヌクレオチド配列をコードするウイルスベクターは、本発明のワクチンとして使用することができる。例えば、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドのヌクレオチド配列は、対象の形質導入（例えば、生体内投与）又は対象から単離された細胞の形質導入（例えば、エキソビボ形質導入と、それに続く対象に細胞を戻す投与）に好適な天然の、又は修飾された（例えば、弱毒化された）ウイルスゲノムのヌクレオチド配列に組換え的に挿入することができる。ウイルスにさらなる修飾を加えることにより、感染力又はトロピズムを高め（例えば、シュードタイピング）、複製能を低下させ、若しくは除去し、又はウイルス成分の免疫原性（例えば、免疫原性ワクチン剤に関連しないあらゆる成分）を低下させることができる。本発明のベクターは形質導入細胞により発現し、細胞外空間に分泌されるか、又は発現細胞に（例えば、細胞内分子として、又は細胞表面に提示されて）留まることができる。キメラ又はシュードタイプのウイルスベクターを細胞の形質導入に使用して、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドの発現を可能にすることもできる。例示的ベクターを以下に記載する。
【００４３】
アデノウイルス
組換えアデノウイルスは、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドを発現させるベクターとしての使用に対し、いくつかの重要な利点を提供する。このウイルスは高力価に調製することができ、非複製細胞に感染することができ、及び標的細胞集団との接触後、エキソビボでの標的細胞の高効率の形質導入をもたらすことができる。さらに、アデノウイルスは、そのＤＮＡを宿主ゲノムに組み込むことがない。従って、それを発現ベクターとして使用すると、自発的増殖性疾患が惹起されるリスクが低減する。動物モデルでは、アデノウイルスベクターは、概して高レベル発現を約１週間にわたり媒介することが分かっている。導入遺伝子発現（本発明の最適化ウイルスポリペプチドをコードする核酸の発現）の持続期間は、細胞又は組織特異的プロモーターを使用することにより延ばすことができる。アデノウイルスベクターそれ自体の分子改変における他の改善点として、より持続的な導入遺伝子発現及び炎症低下がもたらされている。これは、さらなる初期アデノウイルス遺伝子に特異的突然変異を内包するいわゆる「第二世代」ベクター、及びＣｒｅ−Ｌｏｘ戦略を利用して事実上全てのウイルス遺伝子を欠失させる「ガットレス」ベクターに見られる（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：６１９６頁（１９９４年）及びＫｏｃｈａｎｅｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５７３１頁（１９９６年）、各々参照により本明細書に援用される）。
【００４４】
国際公開第２００６／０４０３３０号パンフレット及び国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレット（各々参照により本明細書に援用される）に開示されるまれな血清型及びキメラアデノウイルスベクターは、本発明のベクターとして特に有用である。例えば、組換えアデノウイルスｒＡｄ２６、ｒＡｄ３４、ｒＡｄ３５、ｒＡｄ４８、及びｒＡｄ５ＨＶＲ４８は、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドをコードすることができる。本発明の最適化ウイルスポリペプチドをコードする１つ又は複数の組換えウイルスベクターを対象に投与して、ウイルス感染症を治療又は予防することができる。
【００４５】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
非病原性パルボウイルスに由来するアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）もまた、そのベクターは抗ベクター細胞性免疫応答をほぼ誘起せず、及びほとんどの実験系において数ヶ月持続する導入遺伝子発現をもたらすため、本発明の最適化ウイルスポリペプチドの発現に使用することができる。
【００４６】
レトロウイルス
レトロウイルスは、本発明の最適化ウイルスポリペプチドの発現に有用である。アデノウイルスとは異なり、レトロウイルスゲノムはＲＮＡベースである。レトロウイルスは、細胞に感染すると、そのＲＮＡをいくつかの酵素と共に細胞に導入する。レトロウイルス由来のウイルスＲＮＡ分子は、逆転写と呼ばれる過程を介してプロウイルスと呼ばれる二本鎖ＤＮＡコピーを産生する。細胞核内に輸送された後、プロウイルスＤＮＡは宿主細胞の染色体に組み込まれ、形質導入細胞及びその細胞から派生し得る任意の子孫細胞のゲノムを永久的に変化させる。遺伝子を細胞又は生体に永久的に導入する能力は、遺伝子治療に使用されるレトロウイルスを特徴付ける特性である。レトロウイルスとしては、ウイルス感染及びプロウイルスの組み込みを促進するいくつかのアクセサリータンパク質を含むヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含むウイルスファミリーであるレンチウイルスが挙げられる。現在、「第三世代」レンチウイルスベクターは、完全な複製無能力、広いトロピズム、及び哺乳動物細胞に対する高い遺伝子導入能を特徴とする（例えば、Ｍａｎｇｅａｔ及びＴｒｏｎｏ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １６（８）：９１３頁（２００５年）及びＷｉｚｎｅｒｏｗｉｃｚ及びＴｒｏｎｏ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１）：４２頁（２００５年）（各々参照により本明細書に援用される）を参照）。
【００４７】
他のウイルスベクター
アデノウイルス及びレトロウイルスベクターに加えて、細胞（例えば、リンパ球などの血球細胞）又は対象（例えば、ヒト）における本発明の最適化ウイルスポリペプチドの発現に使用することのできる他のウイルスベクター及び技法が、当該技術分野において公知である。こうしたウイルスとしては、ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス及び修飾ワクシニアウイルスのアンカラすなわち（ＭＶＡ）；例えば、米国特許第４，６０３，１１２号明細書及び同第５，７６２，９３８号明細書（各々参照によって本明細書に援用される）を参照）、ヘルペスウイルス、トガウイルス（例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス；例えば、米国特許第５，６４３，５７６号明細書（参照によって本明細書に援用される）を参照）、ピコルナウイルス（例えば、ポリオウイルス；例えば、米国特許第５，６３９，６４９号明細書（参照によって本明細書に援用される）を参照）、バキュロウイルス、及びＷａｔｔａｎａｐｉｔａｙａｋｕｌ及びＢａｕｅｒにより記載される他のもの（Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．５４：４８７頁（２０００年）（参照によって本明細書に援用される））が挙げられる。
【００４８】
その他の発現ベクター：ネイキッドＤＮＡ及びオリゴヌクレオチド
本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドをコードするネイキッドＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドもまた、細胞（例えば、リンパ球などの血球細胞）又は対象（例えば、ヒト）におけるそうしたポリペプチドの発現に使用することができる。例えば、Ｃｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１６９１−１６９２頁（１９９３年）；Ｆｙｎａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：１１４７８頁（１９９３年）；及びＷｏｌｆｆら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：４７４４８５頁（１９９１年）（各々参照により本明細書に援用される）を参照のこと。これは、非ウイルス性のトランスフェクションの最も単純な方法である。電気穿孔、並びに高圧ガス及び担体粒子（例えば、金）を使用してＤＮＡコーティングされた金粒子を細胞に撃ち込む「遺伝子銃」の使用などの、ネイキッドＤＮＡを送達する効率的な方法が存在する。
【００４９】
リポプレックス及びポリプレックス
本発明の最適化ウイルスポリペプチドをコードする核酸の細胞又は対象への送達を向上させるため、リポプレックス（例えば、リポソーム）及びポリプレックスを使用して、トランスフェクション過程における望ましくない分解からベクターＤＮＡを保護することができる。プラスミドＤＮＡは、ミセル又はリポソームのように組織化された構造の脂質で被覆することができる。組織化された構造がＤＮＡと複合体を形成すると、リポプレックスと称される。３タイプの脂質、すなわちアニオン性（負に帯電している）、中性、又はカチオン性（正に帯電している）がある。カチオン性脂質を利用するリポプレックスは、遺伝子導入に有用であることが分かっている。カチオン性脂質は正電荷であるため、負に帯電したＤＮＡと自然に複合体を形成する。また、その電荷の結果として、カチオン性脂質は細胞膜と相互作用し、リポプレックスのエンドサイトーシスが起こり、細胞質中にＤＮＡが放出される。カチオン性脂質はまた、細胞によるＤＮＡの分解も保護する。
【００５０】
ポリマーのＤＮＡとの複合体はポリプレックスと称される。ほとんどのポリプレックスはカチオン性ポリマーからなり、その生成はイオン相互作用により調節される。ポリプレックスとリポプレックスとの働き方の一つの大きい違いは、ポリプレックスはそのＤＮＡ負荷を細胞質中に放出することができず、従ってそれを目的として不活化アデノウイルスなどのエンドソーム溶解剤のコトランスフェクションを（エンドサイトーシスの間に生じたエンドソームを溶解させるため）行わなければならない。しかしながら、必ずしもこれが常に該当するわけではない；ポリエチレンイミンなどのポリマーは、キトサン及びトリメチルキトサンがそうであるように、その独自のエンドソーム破壊方法を有する。
【００５１】
本発明の最適化ウイルスポリペプチドをコードする核酸と組み合わせてリポプレックス、又はポリプレックスを形成するために使用することのできる例示的なカチオン性脂質及びポリマーとしては、限定はされないが、ポリエチレンイミン、リポフェクチン、リポフェクタミン、ポリリジン、キトサン、トリメチルキトサン、及びアルギン酸塩が挙げられる。
【００５２】
ハイブリッド方法
遺伝子導入のいくつかのハイブリッド方法は、２つ以上の技法を組み合わせる。例えばビロソームは、リポプレックス（例えば、リポソーム）を不活化ウイルスと組み合わせる。この手法は、単独でのウイルスによる方法又はリポソームによる方法のいずれと比べても、呼吸上皮細胞においてより効率的な遺伝子導入をもたらすことが示されている。他の方法は、他のウイルスベクターをカチオン性脂質又はハイブリッド形成ウイルスと混合することを含む。これらの方法の各々を使用して、細胞（例えば、リンパ球などの血球細胞）又は対象（例えば、ヒト）への本発明の最適化ウイルスポリペプチドをコードする核酸の導入を促進することができる。
【００５３】
デンドリマー
また、デンドリマーを使用して、本発明の最適化ウイルスポリペプチドをコードする核酸を細胞（例えば、リンパ球などの血球細胞）又は対象（例えば、ヒト）に導入してもよい。デンドリマーは、球形状の高度に枝分かれした巨大分子である。粒子の表面は、多くの方法で機能化することができ、得られるコンストラクトの特性の多くが、その表面によって決定される。特に、カチオン性デンドリマー（すなわち正の表面電荷を有するもの）を作成することが可能である。ＤＮＡ又はＲＮＡなどの遺伝物質が存在するとき、電荷の相補性により核酸のカチオン性デンドリマーとの一時的な結合がもたらされる。その目標に達すると、次にデンドリマー−核酸複合体は、エンドサイトーシスを介して細胞に取り込まれる。
【００５４】
生体内投与
本発明はまた、対象（例えば、ヒト）を本発明のワクチンで免疫するためのインビボ方法も特徴とする。一実施形態において、本発明の１つ又は複数のワクチンを対象に直接投与して、ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１）に対する防御的又は治療的免疫応答（例えば、細胞性又は体液性免疫応答）を誘発することができる。或いは、上記のとおりの、本発明の１つ又は複数の最適化ウイルスポリペプチドをコードするベクターを対象に直接投与することにより、ウイルス感染症を予防又は治療することができる。１つ又は複数の細胞を生体内に効率的にトランスフェクト又は形質導入するベクター（例えば、ウイルスベクター）は、治療を受ける対象において広域で耐久性があり、且つ強力な免疫応答を誘発することができる。発現ベクターの核酸成分が宿主細胞（例えば、リンパ球などの血球細胞）に導入されると、宿主細胞は本発明のワクチンを産生して提示又は分泌し、次にそれが抗原提示細胞（ＡＰＣ）、Ｔ細胞、及びＢ細胞などの免疫系の成分を活性化する働きをし、その結果、免疫が構築される。
【００５５】
医薬組成物
本発明は、１つ又は複数の薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、緩衝剤、又は他の許容可能な担体と組み合わせた、本発明のワクチン、ベクター、及び最適化ウイルスポリペプチドを特徴とする。ワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドの製剤化は、有効量の最適化ウイルスポリペプチド免疫原の発現を利用し、又は可能にし得る。すなわち、そこには、後のウイルス（例えば、ＨＩＶ−１）に対する曝露からの防御を対象に提供し、又は既存のウイルス感染症を治療するための、特定の十分な免疫応答を治療対象（例えば、ヒト）に生じさせ得る量の抗原が含まれ得る。例えば、本発明のワクチンの製剤化により、広域の且つ特異的な細胞性免疫応答を対象に生じさせ得る量の抗原を発現させることが可能となり得る。本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドで治療される対象はまた、対象に防御的又は治療的利益を付与することのできる抗ウイルス抗体（例えば、中和抗体）を産生することもできる。本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドは、単独で、又は当該技術分野において公知の任意の薬学的に許容可能な担体、塩又は補助剤と組み合わせて、対象に直接投与することができる。
【００５６】
薬学的に許容可能な塩は、製薬業界で一般に用いられている非毒性の酸付加塩又は金属錯体を含み得る。酸付加塩の例としては、酢酸、乳酸、パモン酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、又はトリフルオロ酢酸などの有機酸；タンニン酸、カルボキシメチルセルロースなどのポリマー酸；及び塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸が挙げられる。金属錯体としては、亜鉛、鉄などが挙げられる。薬学的に許容可能な担体の例示的な一つは、生理食塩水である。他の生理学的に許容可能な担体及びその製剤は当業者に公知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、（第１８版）、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９９０年、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡに記載されている。
【００５７】
予防上又は治療上有効量の本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドの医薬製剤は、経口的に、非経口的に（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は皮下注射、吸入、皮内、点眼、又は植え込み）、経鼻的に、経膣的に、経直腸的に、舌下に、又は局所的に、投与経路に適合した薬学的に許容可能な担体と混合して投与することができる。製剤中における本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドの濃度は、約０．１〜１００ｗｔ．％まで様々であり得る。
【００５８】
本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドを含有する組成物の非経口投与製剤は、滅菌水性又は非水性溶液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。好適な媒体の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、ゼラチン、水素化ナフタレン、及び注射用の有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。かかる製剤はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤などの補助剤を含有してもよい。生体適合性、生分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、又はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーを使用して化合物の放出を制御してもよい。本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドを含有する組成物に潜在的に有用な他の非経口送達系としては、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、植込み型注入システム、及びリポソームが挙げられる。
【００５９】
液体製剤は、例えば、細菌保持フィルタを介したろ過によるか、組成物に滅菌剤を組み込むことによるか、又は組成物を照射若しくは加熱することにより、滅菌することができる。或いはまた、液体製剤は、使用直前に滅菌水又は他の何らかの無菌注射用媒質中に溶解することのできる無菌固形組成物の形態で製造されてもよい。
【００６０】
直腸投与又は経膣投与用の本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドを含有する組成物は、好ましくは、作用物質に加えてカカオ脂又は坐薬ワックスなどの賦形剤を含有し得る坐薬である。経鼻投与又は舌下投与用の組成物もまた、当該技術分野において公知の標準的な賦形剤と共に調製される。吸入用製剤は、賦形剤、例えばラクトースを含有してもよく、又は点鼻液若しくは鼻内スプレーの形態で、又はゲルとして投与するため、例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸塩及びデオキシコール酸塩を含有する水溶液であってもよく、又は油性溶液であってもよい。
【００６１】
本発明の組成物中における活性成分の量は様々であり得る。当業者は、投与されるペプチド、投与時間、投与経路、製剤の性質、排泄速度、対象の病態の性質、並びに患者の年齢、体重、健康状態、及び性別を含めた様々な要因に依存して、正確な個々の投薬量はいくらか調整され得ることを理解するであろう。加えて、ワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドによって治療される病態の重症度もまた、投薬量レベルに影響を有し得る。一般に、０．１μｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量レベルが、単回用量として、又は複数回用量に分割して毎日投与される。好ましくは、一般的な投薬量範囲は、１日当たり２５０μｇ／ｋｇ体重〜５．０ｍｇ／ｋｇ体重である。様々な投与経路の種々の効率にかんがみて、必要な投薬量は幅広く異なることが予想される。例えば、経口投与は、概して静脈注射による投与より高い投薬量レベルが要求されると予想され得る。このような種々の投薬量レベルは、当該技術分野において公知の最適化のための標準的な実験ルーチンを用いて調整することができる。一般に、正確な予防上又は治療上の有効投薬量は、担当臨床医が上記に特定した要因を考慮して決定することができる。
【００６２】
患者に投与される各用量中に存在する本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドの量は、患者の年齢、体重、性別、全般的な健康状態などの考慮事項に関連して選択される。患者において深刻な有害副作用なしに免疫応答（例えば、細胞性免疫応答）を誘起する、又は外因性効果を生じさせるために必要なワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドの量は、用いられる医薬組成物及びアジュバントの任意の存在に応じて異なる。場合により、初回用量に続き、所望の場合には追加免疫を繰り返すことができる。本方法は、本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドの長期投与を含むことができる。治療的用途又は予防的用途のため、年一回の追加免疫又は他の間隔での追加免疫など、免疫ワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドの反復投薬量が望ましいこともある。投与される投薬量は、当然ながら、特定のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドの薬力学的特性、並びにその投与様式及び経路；被投与者の年齢、健康状態、及び体重；症状の性質及び程度、併用治療の種類、治療頻度、及び所望の効果などの公知の要因に応じて異なり得る。本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドは、針刺しによる急性感染又は母体感染のリスクがある対象の長期治療において投与することができる。かかる「急性」感染についての投薬頻度は、約６週間の期間にわたる静脈内又は筋肉内による１日１回投薬から週１回又は２回の範囲であってもよい。ワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドはまた、ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１）による感染患者、又は感染が進行している患者の長期治療においても用いることができる。感染患者では、長期投与の頻度は、静脈内又は筋肉内で１日１回投薬から週１回又は２回の範囲であってもよく、本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチド中に存在する免疫原の半減期に依存し得る。
【００６３】
アジュバント
ウイルスに対するワクチンを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト）のワクチン接種に使用される本発明のワクチンは、ワクチンの免疫原性を高める１つ又は複数の薬学的に許容可能なアジュバントと同時に、又は連続して投与することができる。ヒトへの使用が承認されているアジュバントとしては、アルミニウム塩（ミョウバン）が挙げられる。こうしたアジュバントは、Ｂ型肝炎、ジフテリア、ポリオ、狂犬病、及びインフルエンザを含むいくつかのワクチンに有用となっている。他の有用なアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、ＭＤＰの合成類似体、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−［１，２−ジパルミトイル−ｓ−グリ−セロ−３−（ヒドロキシホスホリルオキシ）］エチルアミド（ＭＴＰ−ＰＥ）並びに代謝可能な油及び乳化剤であって、実質的に全てが直径１ミクロン未満の油滴を有する水中油エマルジョンの形態で存在する油及び乳化剤を含有する組成物が挙げられる。
【００６４】
キット
本発明は、本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を、ウイルス感染症の予防又は治療に治療上有効な量で含むキットを提供する。キットは、臨床従事者（例えば、医師又は看護師）がそこに含まれる組成物を投与することができるように説明書を含む。
【００６５】
好ましくは、キットは、本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドの有効量を含有する１つ又は複数の単回用量医薬組成物の複数のパッケージを含む。場合により、１つ又は複数の医薬組成物の投与に必要な器具又は装置がキットに含まれてもよい。例えば、本発明のキットは、本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドの有効量を含む１つ又は複数のプレフィルドシリンジを提供してもよい。さらに、キットはまた、ウイルスに感染した、又は感染するリスクがある患者が、本発明のワクチン、ベクター、又は最適化ウイルスポリペプチドを含有する１つ又は複数の医薬組成物を使用するための説明書又は投与スケジュール表などのさらなる要素を含んでもよい。
【００６６】
当業者には、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく本発明の組成物、方法、及びキットに様々な修正及び変更を加え得ることは明らかであろう。従って、本発明は、本発明の修正及び変更を、それらが添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内に含まれることを条件として包含することが意図される。
【実施例】
【００６７】
以下の例により本発明を説明し、これらの例は、何ら本発明を限定することを意図するものではない。
【００６８】
〔実施例１〕
上記で考察される遺伝的アルゴリズムを使用してモザイク抗原Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ、及びＥｎｖ配列（配列番号１〜８）を作成した。次にそれらの配列をワクチン開発に実用的なものとするため、Ｅｎｖ（配列番号９〜１１）において切断／融合活性を除去し、Ｐｏｌ（配列番号１２〜１４）において触媒活性を除去し、Ｎｅｆ（配列番号１６〜１８）においてミリスチル化部位を除去し、及びＧａｇＮｅｆ、ＧａｇＰｏｌ、又はＧａｇＰｏｌＮｅｆ（配列番号１９〜２９）を含む融合コンストラクトを作成することにより修飾した。コンパレータ最適天然クレードＣ遺伝子もまた示される（配列番号３０〜３６）。
【００６９】
〔実施例２〕
Ｍコンセンサス（第１群）、二価Ｍモザイク（第２群）、又は最適天然クレードＣ（第３群）配列由来のＧａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ遺伝子を発現する３×１０１０個のｖｐ ｒＡｄ２６ベクターで２０匹のアカゲザルを免疫した。Ｍコンセンサス配列は、世界中の循環ウイルスの唯一最良の「平均」を表す合成配列に相当する。二価Ｍモザイク配列は上記に記載される。最適天然クレードＣ配列は、特性が最も「コンセンサス様」である実際のクレードＣ ＨＩＶ−１ウイルス由来の天然に存在する配列である。全潜在的Ｔ細胞エピトープ（ＰＴＥ）ペプチドセットからの応答ペプチド数を調べることにより、細胞性免疫幅を評価した。ＰＴＥペプチドは、全ＨＩＶ−１配列の８５％超に相当し、ＮＩＨから自由に入手することができる。
【００７０】
結果は、新規二価Ｍモザイク配列が、これらの他の２つの有力な抗原コンセプトより著しく優れていたことを示す。表１に示されるとおり、二価Ｍモザイク抗原は、Ｍコンセンサス抗原及び最適天然クレードＣ抗原と比較して、Ｇａｇ特異的、Ｅｎｖ特異的、Ｐｏｌ特異的、及び合計Ｔリンパ球の応答幅の有意な増加を誘発した。（平均値は、各サル群における平均エピトープ数を表す；ＳＥＭは平均値の標準誤差を表す）。
【表１】
【００７１】
〔実施例３〕
実施例２に記載されるＭコンセンサス（第１群；ｎ＝７）、二価Ｍモザイク（第２群；ｎ＝７）、又は最適天然クレードＣ（第３群；ｎ＝６）配列由来のＧａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ遺伝子を発現する３×１０１０個のｖｐ ｒＡｄ２６ベクターでマカクザルを筋肉内免疫した。全潜在的Ｔ細胞エピトープ（ＰＴＥ）ペプチドセットからの応答ペプチド数を調べることにより、細胞性免疫幅を評価した。
【００７２】
読み出す情報として、プールＰＴＥペプチドに対するＣＤ４／ＣＤ８ ＩＦＮγ Ｅｌｉｓｐｏｔ応答（大きさ）を評価した。１５ｍｅｒのＰＴＥペプチドを用いてエピトープを完全にマッピングし、陽性の数（陽性は、１０６個のＰＢＭＣ当たり５５個のスポット形成細胞（ＳＦＣ）及びバックグラウンドの４倍として定義した）を評価した。完全なタンパク質のセットと応答を比較するため、５個のＧａｇタンパク質にわたる重複ペプチドのプールセットも試験した。
【００７３】
結果は、二価Ｍモザイク配列が、他の２つの有力な抗原コンセプト（Ｍｃｏｎ及びＯｐｔＣ）より著しく優れていたことを示す。
【００７４】
〔実施例４〕
モデリングを使用して、Ｔ細胞応答がモザイクワクチンの結果として増加するという本発明者らの観察を検証した。反応性ペプチド数をワクチン、ポリペプチド、及びＴ細胞型の関数として予測し、次に交互作用のステップワイズ除去を行ったポアソン回帰モデルをフィットした。モザイクワクチンは陽性ＰＴＥ応答数の高度に有意な亢進をもたらしたが、それは、あらゆるポリタンパク質及びＴ細胞型にわたって多かれ少なかれ一様にもたらされたことが認められた。従って、動物が投与を受けるＴ細胞、ポリペプチド、及びワクチンのタイプに個別に依存する寄与分を合わせることにより、動物において陽性効果を有するペプチド数を予測し得る。
【００７５】
これらのモデルはまた、動物間のばらつきを考慮するため変量効果も含んだ。これは、モデルの予測力を適切に割り当てることによりｐ値の信頼性を高めるために設計される予防措置である。
【００７６】
以下の効果が認められた：
ａ）ＣＤ８応答はＣＤ４応答と比べてはるかに多く、４．３７倍である（ｐ＜２×１０−１６）；
ｂ）ｇｐ１６０ではｇａｇ又はｐｏｌと比べて応答が少なく、０．５４倍であり（ｐ＝０．０００８３０）、及びｇａｇとｐｏｌとの間に（ｐｏｌはＧａｇの２倍長く、従って応答する確率がより高いため、配列長さにより正規化した場合であっても）有意差はない；及び
ｃ）モザイクワクチンはＭｃｏｎと比べて有意により多くの陽性応答をもたらし（３．６倍、ｐ＝６．２６×１０−１１）、一方、ＯｐｔＣがもたらす応答はより少なく、但しＭｃｏｎ−ＯｐｔＣの差は有意ではない。
【００７７】
〔実施例５〕
ワクチンにより誘発され、ＰＴＥペプチドにより検出される最小応答数だけを考え、従って変異に関わらず８アミノ酸以上重複する全てのペプチドを１回のみ数える場合にも、モザイクワクチンはなお、別個の領域に対するより多い応答数をもたらす。
【００７８】
ＣＤ８について、各重複ペプチドセットを１回のみ数える：
統計概要：
Ｍｏｓ２＞Ｍｃｏｎ〜ＯｐｔＣ（ＭｃｏｎはＯｐｔＣより応答が多い傾向を示す）
Ｍｃｏｎと比較したＭｏｓ２についてのウィルコクソンｐ値：ｐ値＝０．０００９９９２
最適Ｃと比較したＭｃｏｎについてのウィルコクソンｐ値：ｐ値＝０．２３５１
【００７９】
【００８０】
ＣＤ４について、各重複ペプチドセットを１回のみ数える（ＣＤ４には重複はほとんどないため、これは最初のカウントとほぼ同じである）。
【００８１】
統計概要：
Ｍｏｓ２＞＞Ｍｃｏｎ〜ＯｐｔＣ（ＭｃｏｎはＯｐｔＣより応答が多い傾向を示す）
Ｍｃｏｎと比較したＭｏｓ２についてのウィルコクソンｐ値：ｐ値＝０．００１９８
最適Ｃと比較したＭｃｏｎについてのウィルコクソンｐ値：０．０９９
【００８２】
【００８３】
〔実施例６〕各重複ペプチドセットを１回のみ数えるポアソン回帰
重複ＰＴＥペプチドを使用して以下を決定したが、これは、各陽性ＰＴＥ応答を別のものとして数えた上記の実施例４で考察した結果と広く一致している：
ａ）ＣＤ８応答はＣＤ４応答と比べてはるかに多く、約２．８倍である（ｐ≒１×１０−７；
ｂ）モザイクワクチンはＭｃｏｎと比べて有意により多くの陽性応答をもたらし（２．８４倍、ｐ≒４．３×１０−７）、一方ＯｐｔＣがもたらす応答はより少なく、但しＭｃｏｎ−ＯｐｔＣの差は有意ではない；及び
ｃ）Ｇａｇに対する応答よりＰｏｌに対する応答が多く、及びｇｐ１６０に対する応答よりＧａｇに対する応答が多いが、有意であったのはＰｏｌ−ｇｐ１６０の差のみで、約２倍であった（ｐ＜０．００１）。
【００８４】
〔実施例７〕
以下の表は、２モザイク（Ｍｏｓ２）又はＭｃｏｎのワクチン接種を受けた７動物、及び最適天然Ｃクレード（ＯｐｔＣ）のワクチン接種を受けた６動物における３つのワクチンに対するＧａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ応答に対する応答合計の集計表である：
【００８５】
ＯｐｔＣワクチンは、全てのサルにわたり、タンパク質当たりのＣＤ８＋ Ｔ細胞応答より僅かに少ない平均応答をもたらした。Ｍｃｏｎワクチンは、タンパク質当たり約１つの応答を示した。Ｍｏｓ２に関してのみタンパク質の違いが認められ、ここでＥｎｖは、典型的にはＧａｇ又はＰｏｌのいずれと比べても応答が少ない。
【００８６】
Ｍｏｓ２ワクチン中のタンパク質の各々は多くの応答を誘発し、全般的な応答に寄与した。不活化ｐｏｌに対する修飾、並びにＥｎｖにおける切断及び融合ドメインの欠失後のコンセンサスタンパク質の相対的な長さは、以下のとおりであった：Ｅｎｖの６７１アミノ酸、Ｐｏｌの８５１、Ｇａｇの４９８（１．３５：１．７：１）。
【００８７】
要約
幅：２モザイクワクチンは、Ｍコンセンサス又は単一最適天然株よりはるかに多くのエピトープ領域の認識能を有するＴ細胞応答を誘発する。
【００８８】
深さ：認識されたＰＴＥペプチドの多様性は、２モザイクの双方の型が変異ペプチドに対する異なるＴ細胞応答を誘発し、交差反応の可能性が増加していることを示唆する。
【００８９】
〔実施例８〕
本発明のモザイクＨＩＶ−１ワクチンは、アカゲザルにおける細胞性免疫応答の幅及び深さを拡大する。ＨＩＶ−１ Ｍ群配列のＰＴＥ有効範囲を最適化したモザイクＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原を作成した。ＨＩＶ−１ Ｍ群配列は、ロスアラモスＨＩＶ−１配列データベース内の全ての主要なＨＩＶ−１クレード及び組換え系統を含む。二価モザイク戦略を利用して、理論的な有効範囲と実用性との競合問題について均衡をとった。二価モザイクＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原は、アカゲザルにおいてコンセンサス配列及び天然配列のＨＩＶ−１抗原を使用して観察される免疫応答と比べて、アカゲザルにおけるエピトープ特異的ＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔリンパ球応答の幅及び大きさ（深さ）を実質的に拡大した。
【００９０】
２７匹の非近交系アカゲザルを、以下の抗原を発現する組換えアデノウイルス血清型２６（ｒＡｄ２６）ベクターの単回注射で免疫した：（ｉ）二価モザイク（Ｎ＝７）、（ｉｉ）Ｍコンセンサス（Ｎ＝７）、（ｉｉｉ）クレードＢとクレードＣ（Ｎ＝７）とを組み合わせた二価、又は（ｉｖ）最適天然クレードＣ（Ｎ＝６）ＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原。これらの抗原を発現するｒＡｄ２６ベクターの３×１０１０個のウイルス粒子の全用量を各動物に１回筋肉内投与した。最適クレードＣ抗原は、ロスアラモスＨＩＶ−１配列データベースにおけるクレードＣ配列の最大ＰＴＥ有効範囲を提供するように選択した天然株配列であった（以下の「材料及び方法」で考察する）。ワクチンにより誘発されたＨＩＶ−１特異的Ｔリンパ球応答の幅及び大きさ（深さ）を、ＨＩＶ−１ Ｍ群配列の少なくとも１５％に存在する全てのＰＴＥを含むペプチドのプール及びサブプールを利用して、免疫後４週目にＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより評価した。全ての個々のペプチド応答を解析し、細胞枯渇ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施して、反応性ペプチドがＣＤ８＋又はＣＤ４＋ Ｔリンパ球エピトープに相当するかどうかを判断した。
【００９１】
モザイク抗原により誘発されたＰＴＥペプチドに対するＧａｇ特異的、Ｐｏｌ特異的、及びＥｎｖ特異的細胞性免疫応答の総数は、コンセンサス又は天然配列抗原により誘起された応答数と比べて３．８倍高かった（図１９Ａ；Ｐ＝１×１０−１１、モザイクを次に高い群のコンセンサス抗原との比較、ポアソン回帰モデルに基づく）。ＣＤ４＋ Ｔリンパ球応答と比べてＣＤ８＋は４．４倍多く（Ｐ＜１０−１１）、Ｇａｇ又はＰｏｌに対する応答と比べてＥｎｖに対する応答は少なかった（Ｐ＜０．０００７）。ＣＤ８＋ Ｔリンパ球応答の中位数はモザイクワクチンについて最も高く、それにコンセンサス、組み合わせのＢ＋Ｃ、及び天然クレードＣワクチンが続いた（それぞれ、各群における動物当たりの応答の中央値は１６、５、３、及び２）。全体ではＣＤ４＋ Ｔリンパ球応答はより少なかったが、ＣＤ４＋ Ｔリンパ球応答に関しても、最高数がモザイクワクチンに対するもので、それにコンセンサス、組み合わせのＢ＋Ｃ、及び天然クレードＣワクチンが続く、同じ相対的パターンが現れた（それぞれ、各群における動物当たりの応答の中央値は４、１、１、及び０．５）。コンセンサス、組み合わせのＢ＋Ｃ、及び天然クレードＣワクチンにより誘発されたＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔリンパ球応答の数は、統計的には区別できなかった。
【００９２】
ＰＴＥペプチドは、天然に存在するＨＩＶ−１配列多型を反映する複数の重複配列を含み、従ってＰＴＥペプチド応答は、特定のエピトープの認識（幅）と当該エピトープの変異体の交差認識（深さ）との双方を包含する。サル当たりの反応性エピトープ領域の数を評価することにより幅の保存分析を実施し、ここでは８個以上のアミノ酸が重複する全ての反応性ＰＴＥペプチドを１イベントとして数えた。この保存分析においてもなお、モザイク抗原が、コンセンサス抗原又は天然配列抗原と比較したとき３．１倍多いＧａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ反応性エピトープ領域数を誘発したことが観察された（図１９Ｂ；Ｐ＝１．６×１０−７、ポアソン回帰）。エピトープ領域は、高いエピトープ密度の領域によって明らかなとおり、動物にわたっていくらかのクラスタ化を示した（図２０Ａ〜図２０Ｃ及び図２１Ａ〜図２１Ｃ）。応答領域ごとに整理した全ての陽性ペプチドの完全アラインメントを図２２に示す。
【００９３】
これらのデータは、モザイク抗原が、Ｍコンセンサス及び天然クレードＣ抗原と比較したとき、細胞性免疫応答の幅を実質的に増加させたことを示す。二価モザイク抗原はまた、クレードＢ及びクレードＣ抗原の二価の組み合わせより優れていることも分かり（図１９Ａ及び図１９Ｂ）、幅の亢進がモザイク配列設計に起因したもので、単純にタンパク質当たりに２つの異なる抗原配列を使用したことを反映したものではないことが示された。モザイク抗原により誘起された幅の増加により応答の潜在能力が損なわれたかどうかを判断するため、全ての個々のＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔリンパ球応答の大きさを評価した。これらの応答の大きさはあらゆる群間で同程度であることが分かった（図２３；それぞれＰ＝０．５８及びＰ＝０．９９、コルモゴロフ−スミルノフの両側検定）。このように、モザイク抗原は、個々のエピトープ特異的応答の大きさを損なうことなく細胞性免疫幅を拡大し、抗原競合及び免疫優性の制約が、この試験のモザイク抗原の免疫原性を制限しなかったことが示された。
【００９４】
次に、様々なワクチンレジメンにより誘発された細胞性免疫応答の深さを特徴付けた。特定のエピトープ領域について同時に誘発された変異ＰＴＥペプチドの数として深さを定義した。複数の共通のエピトープ変異体に対する応答が誘起されると、感染ウイルス配列の免疫有効範囲は大きくなり、生体内で共通のエスケープ経路が遮断され、又は大きいフィットネスコストを被る三次エスケープ経路にウイルスが押し込まれ得る。コンセンサス及び天然配列抗原は、天然クレードＣ抗原の投与を受けたサル３６６における応答により例示されるとおりの、ワクチン配列と反応性ＰＴＥペプチドとの間の高度の配列同一性により特徴付けられる応答を誘発した（図２４Ａ；また図２２も参照）。対照的に、モザイク抗原は、特定のエピトープ領域における複数の反応性ＰＴＥペプチドにより特徴付けられる応答を誘発した。これらのペプチドは共通の変異体を表し、多くの場合に、サル３６１における応答により例示されるとおり、モザイクワクチン配列に含まれる多型を反映した（図２４Ｂ；また図２２も参照）。これらの動物における全てのエピトープ特異的応答についての要約から、コンセンサス又は天然配列抗原と比較したとき、モザイク抗原は、２個以上の標的化された変異体を有するペプチドに対する細胞性免疫応答の頻度を増加させたことが実証される（図２４Ｃ；Ｐ＝０．００１、モザイクを次に高い群のコンセンサス抗原と比較するウィルコクソン順位和検定）。
【００９５】
ＰＴＥペプチドを利用する分析を補足するため、５個の異なるＧａｇ配列：クレードＣ ＤＵ４２２、クレードＣ ＺＭ６５１、コンセンサスＣ、コンセンサスＡ、及びコンセンサスＢを包含する従来の重複ペプチドによるワクチン接種を受けたサルにおける細胞性免疫応答の幅も評価した。細胞性免疫幅は、各Ｇａｇ配列にわたる１０個の重複ペプチドのサブプールに対する反応性を評価することにより決定した。モザイク抗原は、コンセンサス又は天然配列抗原と比較したとき、試験した全てのＧａｇ配列に対してＴリンパ球応答の増幅を誘発した（図２５；Ｐ＝１×１０−７、二項回帰）。このように、モザイク抗原は、ＰＴＥペプチドに対するだけでなく、クレードＡ、Ｂ、及びＣ由来の実際のＧａｇペプチドに対する細胞性免疫幅も増大させた。モザイク抗原は、クレードＣ Ｇａｇペプチドに対する応答の誘起について最適天然クレードＣ抗原より優れていることまでもが分かった。さらに、モザイク抗原は複数のクレード由来のＧａｇペプチドに対する同程度の応答を誘発したが、一方、天然クレードＣ抗原は、クレードＡ及びクレードＢ Ｇａｇペプチドに対する応答の低下を示した（図２５）。
【００９６】
これらの観察の耐久性を評価するため、モザイク、コンセンサス、及び最適天然クレードＣ抗原の投与を受けたサルを、初回の免疫で利用された配列と一致するＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原を発現する異種ベクターｒＡｄ５ＨＶＲ４８の３×１０１０個のウイルス粒子の合計用量で４０週目に追加免疫した。１０個のＰＴＥペプチドのサブプールに対する反応性を４週目（プライミング後）及び４４週目（追加免疫後）に評価することにより、細胞性免疫幅を決定した。プライミング免疫後に観察されたＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔリンパ球応答の大部分が、追加免疫後に拡大し（図２６Ａ、赤色及び青色の線）、及び数多くの新規の応答も検出された（図２６Ａ、赤色及び青色の点）。４４週目、個々の細胞性免疫応答の大きさは群間で同程度であることが分かった（図２６Ａ）。しかしながら、モザイク抗原により誘発されたサブプール応答の数は（動物当たりの応答の中央値２７）、追加免疫後、コンセンサス抗原（動物当たりの応答の中央値１１）又は最適天然クレードＣ抗原（動物当たりの応答の中央値１０）により誘起されたサブプール応答の数と比べて実質的に高いままであった（図２６Ｂ）。追加免疫の前も、及び後も、モザイクワクチンにより誘発された動物当たりの応答は、コンセンサス又は天然クレードＣワクチンによるものより多かった（Ｐ＜０．００１、全てのペアワイズ比較についてのウィルコクソン順位和検定）。
【００９７】
また、追加免疫後、ＥＬＩＳＡ（図２６Ｃ）及びルシフェラーゼベースのシュードウイルス中和アッセイ（図２６Ｄ）によりＥｎｖ特異的体液性免疫応答も測定した。全ての群がクレードＣ ｇｐ１４０に対する同程度のＥＬＩＳＡ力価を示し、第１層クレードＣウイルスＭＷ９６５．２６に対する同程度の中和抗体（ＮＡｂ）応答を示した。モザイク抗原は、コンセンサス又は天然クレードＣ抗原と比較したとき、第１層クレードＢウイルスＳＦ１６２．ＬＳに対する僅かに高いＮａｂ応答を誘発したが（Ｐ＝０．０２、ウィルコクソン順位和検定）、しかしながらどの群においても、第２層ウイルスに対するＮＡｂ応答は検出されなかった。
【００９８】
本発明者らのデータは、モザイクＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原が、理論的予想と良好に一致して、アカゲザルにおいてコンセンサス又は天然配列抗原と比較したときにエピトープ特異的細胞性免疫応答の幅及び深さの双方を増大させたことを実証する（図２７）。この試験におけるモザイク抗原に関する顕著な結果は、ｒＡｄ２６ベクターが、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球応答の誘発に特に効率的であるという事実、並びにモザイク抗原がＣＤ８＋ Ｔリンパ球幅の増大に特に有効であるように思われるという事実を反映したものであり得る（図１９Ａ及び図１９Ｂ）。また、モザイク抗原に関してＣＤ４＋ Ｔリンパ球幅の亢進も認められたが、しかしながらそれらの応答数は実質的により少なかった。
【００９９】
Ｇａｇ特異的細胞性免疫応答の幅は、アカゲザルにおけるＳＩＶ制御及びヒトにおけるＨＩＶ−１制御にとって重要であることが示されている。さらに、第２ｂ相ＳＴＥＰ試験において、天然クレードＢ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＮｅｆ抗原を発現するｒＡｄ５ベースのＨＩＶ−１ワクチン候補は、限られた幅のＨＩＶ−１特異的細胞性免疫応答しか誘発せず、ワクチン有益性は認められなかった。ＳＴＥＰ試験のワクチン被接種体は、Ｇａｇに対するわずか１のエピトープ特異的応答の中央値を含め、わずか２〜３のエピトープ特異的Ｔリンパ球応答の中央値を生じ、この極めて狭い幅の細胞性免疫応答が、感染ウイルスの多様性の不十分な免疫有効範囲をもたらしたように思われる。ＣＤ８＋ Ｔリンパ球からのウイルスエスケープもまた、急性ＨＩＶ−１感染において急速に起こることが報告されており、従って共通のエピトープ変異体に対するワクチンにより誘発された細胞性免疫応答もまた重要であることが分かり得る。まとめると、以上の試験は、細胞性免疫の幅及び深さを増大させるＨＩＶ−１ワクチン戦略を開発する必要性を強調するものである。
【０１００】
本発明者らはこの試験においてモザイクＨＩＶ−１抗原を評価したため、ＳＩＶ攻撃誘発に対するこうしたワクチンレジメンの防御効力を評価することはできなかった。しかしながら、本発明者らは、ｒＡｄベクターにより誘発されたＳＩＶ特異的細胞性免疫応答の幅が、アカゲザルにおいてＳＩＶ攻撃誘発に対する防御効力と相関していることを以前報告している（Ｌｉｕら、Ｎａｔｕｒｅ ４５７：８７頁、２００９年）。本発明者らはまた、変異エピトープに対する細胞性免疫応答が、アカゲザルにおいてインビボでＳＩＶ突然変異進化を阻止することができることも示しており（Ｂａｒｏｕｃｈら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２４７頁、２００５年）、細胞性免疫の深さの拡大の生物学的関連性が示唆される。非ヒト霊長類におけるＳＩＶ攻撃誘発に対するモザイクワクチンの防御効力のモデリングには固有の限界があり、これは、ＳＩＶとＨＩＶ−１ Ｍ群配列とでは観察される多様性が実質的に異なり、影響を受ける基礎となる生物学が異なるためである。例えば、スーティーマンガベイなどの天然宿主におけるＣＤ８＋ Ｔリンパ球選択圧は、ヒトにおけるものと比べて実質的に低いものと思われる。従って、候補ＨＩＶ−１ワクチンとしてのモザイク抗原のさらなる評価には、臨床治験が役立ち得る。
【０１０１】
要約すれば、本発明者らは、アカゲザルにおいて二価モザイクＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原が細胞性免疫幅及び深さを実質的に拡大したことを実証する。全体的なウイルス多様性及び細胞性免疫応答からのウイルスのエスケープは、Ｔ細胞ベースのＨＩＶ−１ワクチンの開発における決定的な難関に相当するため、こうした知見は、ＨＩＶ−１ワクチン開発に対する重要な含意を有する。モザイク抗原の二価カクテルはまた、臨床開発が実際的及び潜在的に実現可能でもある。モザイク抗原の結合価が増加すると、有効範囲がさらに向上し得る。最後に、このモザイク抗原戦略は一般化可能であり、ＨＩＶ−１に加えて他の遺伝的に多様な病原体に利用される可能性がある。
【０１０２】
材料及び方法
抗原設計及びベクター産生。本質的に、ロスアラモスＨＩＶ−１配列データベースにおけるＨＩＶ−１ Ｍ群配列の最適な有効範囲を提供するように二価モザイクＧａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原を作成した。ロスアラモスＨＩＶ−１配列データベースにおける最適ＰＴＥ有効範囲のクレードＣ配列を提供する配列となるように最適天然クレードＣ抗原を選択した（Ｃ．ＩＮ．−．７０１７７ Ｇａｇ、Ｃ．ＺＡ．０４．０４ＺＡＳＫ２０８Ｂ１ Ｐｏｌ、Ｃ．ＳＮ．９０．９０ＳＥ＿３６４ Ｅｎｖ）。準コンセンサス又はコンセンサス配列となるようにクレードＢ抗原を選択し（Ｂ．ＣＡＭ−１ Ｇａｇ、Ｂ．ＩＩＩＢ Ｐｏｌ、Ｂ．Ｃｏｎ Ｅｎｖ）、それを用いて二価クレードＢ＋Ｃワクチン手法に対する最適クレードＣ抗原を補足した。Ｐｏｌ抗原はＲＴ及びＩＮを含んでＰＲを含まず、及び記載されるとおり触媒活性を除去する点突然変異を含んだ（Ｐｒｉｄｄｙら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ ４６：１７６９頁、２００８年）。Ｅｎｖ ｇｐ１４０抗原は、切断及び融合活性を除去する点突然変異を含んだ。ワクチン配列を図２７に示す。組換え複製無能アデノウイルス血清型２６（ｒＡｄ２６）及びそれらの抗原を発現するヘキソン−キメラｒＡｄ５ＨＶＲ４８ベクターをＰＥＲ．５５Ｋ細胞で成長させて、本質的に記載されるとおり二重ＣｓＣｌ勾配沈降により精製した（Ａｂｂｉｎｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：４６５４頁、２００７年、及びＲｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ４４１：２３９頁、２００６年）。
【０１０３】
動物及び免疫化。ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子Ｍａｍｕ−Ａ＊０１を発現しなかった２７匹の非近交系アカゲザルをＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＥＰＲＣ）、Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡで飼育した。免疫化は、モザイク、Ｍコンセンサス、クレードＢ＋クレードＣ、又は最適天然クレードＣ ＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ抗原を発現する３×１０１０個のウイルス粒子ｒＡｄ２６又はｒＡｄ５ＨＶＲ４８ベクターを、１ｍｌの筋肉内注射として０週目及び４０週目に双方の大腿四頭筋に送達することを含んだ。全ての動物試験は、本発明者らの研究機関内の動物の管理及び使用に関する委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ：ＩＡＣＵＣ）により承認された。
【０１０４】
ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。ワクチン接種を受けたサルにおけるＨＩＶ−１特異的細胞性免疫応答を、本質的に記載されるとおりインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより評価した（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ４４１：２３９頁、２００６年、及びＬｉｕら、Ｎａｔｕｒｅ ４５７：８７頁、２００９年）。ＨＩＶ−１ Ｍ群配列の少なくとも１５％に存在するＨＩＶ−１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖの潜在的Ｔ細胞エピトープ（ＰＴＥ）ペプチド、並びにクレードＣ ＤＵ４２２、クレードＣ ＺＭ６５１、コンセンサスＣ、コンセンサスＡ、及びコンセンサスＢ株由来のＨＩＶ−１ Ｇａｇペプチドを、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍから入手した。９６ウェルマルチスクリーンプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、エンドトキシンフリーのダルベッコＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）中の１０μｇ／ｍｌ抗ヒトＩＦＮ−γ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の１００μｌ／ウェルで一晩コートした。次にプレートを０．２５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有Ｄ−ＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄し、３７℃で５％ＦＢＳ含有Ｄ−ＰＢＳにより２時間ブロックし、Ｄ−ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０でリンスしてＴｗｅｅｎ−２０を取り除き、１００μｌの反応量で３通りに各２μｇ／ｍｌのペプチド及び２×１０５ＰＢＭＣと共にインキュベートした。３７℃で１８時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで９回及び蒸留水で１回洗浄した。次にプレートを、２μｇ／ｍｌのビオチン化抗ヒトＩＦＮ−γ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで６回洗浄し、１：５００希釈のストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）と共に２時間インキュベートした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで５回及びＰＢＳで１回洗浄した後、プレートをニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸色原体（Ｐｉｅｒｃｅ）で展開し、水道水で洗浄することにより停止させ、風乾し、ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ）を使用して読み取った。１０６個のＰＢＭＣ当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）を計算した。媒質バックグラウンドは、典型的には１０６ＰＢＭＣ当たり１５ＳＦＣ未満であった。陽性応答は、１０６個のＰＢＭＣ当たり５５個より多いＳＦＣ、且つバックグラウンドの４倍超として定義した。
【０１０５】
エピトープマッピング。ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍから入手したＧａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ ＰＴＥペプチドを利用して、包括的なＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔリンパ球エピトープマッピングを実施した。最初に完全ペプチドプールで、並びに１０個のＰＴＥペプチドを含むサブプールで免疫した後４週目に、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。陽性応答を有する全てのペプチドサブプールをデコンボリューション処理し、個々の１５アミノ酸ＰＴＥペプチドでエピトープが確認された。次に細胞枯渇ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施して、反応性ペプチドがＣＤ８＋又はＣＤ４＋ Ｔリンパ球エピトープに相当するかどうかを判断した。追加免疫の４週間後４４週目にＰＴＥサブプールを利用した部分的エピトープマッピングもまた実施した。ボーダーラインの応答は全て再試験し、確認された場合にのみ陽性と見なした。１０個の重複Ｇａｇペプチドを含むサブプールを利用した部分的エピトープマッピングもまた実施し、様々なクレード由来のＨＩＶ−１ Ｇａｇの幅を評価した。
【０１０６】
体液性免疫アッセイ。本質的に記載されるとおり、ＨＩＶ−１クレードＣ Ｅｎｖ ｇｐ１４０及びルシフェラーゼベースのシュードウイルス中和アッセイを利用する直接ＥＬＩＳＡにより、Ｅｎｖ特異的体液性免疫応答について調べた（Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ、「Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＨＩＶ， ＳＩＶ ａｎｄ ＳＨＩＶ ｉｎ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ａｓｓａｙｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｓｔｒｏｂｅｒ、及びＣｏｉｃｏ編（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、２００４年、１〜１５頁）。
【０１０７】
統計分析。全ての統計分析はパッケージＲ（Ｔｅａｍ、Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、Ｖｉｅｎｎａ、オーストリア、２００９年）を使用して行った。細胞性免疫応答の幅を分析してＰＴＥペプチドをマッピングするため（図１９Ａ）、ワクチン群、抗原（Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ）、及びリンパ球部分母集団（ＣＤ４、ＣＤ８）の関数として反応性ペプチドの数を予想するポアソン回帰モデルをフィットさせた。本発明者らのモデルでは、動物間のばらつきに対応するため変量効果を含め、パッケージＲのｌｍｅ４ライブラリ（Ｐｉｎｈｅｉｒｏ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００年））によりフィットさせた。データはモデルを良好にフィットし（分散パラメータ１．０）、３個の説明因子間に有意な交互作用はなかった。例えば、モザイク抗原の投与を受けたサルによって認識されたＰＴＥペプチド数が、コンセンサス又は天然配列抗原の投与を受けた場合と比較したとき３．８倍亢進したことは（図１９Ａ）、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びＥｎｖ由来のＰＴＥに等しく当てはまり、ＣＤ８＋並びにＣＤ４＋ Ｔリンパ球による応答について維持された。反応性エピトープ領域数の分析（図１９Ｂ）にもまた変量効果を伴うポアソン回帰モデルを含め、これもまた有意な交互作用なしに良好にフィットした（分散パラメータ０．８７）。コルモゴロフ−スミルノフの両側検定を利用してＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔリンパ球応答の大きさの比較（図２３）を実施した。サル当たりの応答の幅及び深さを種々のワクチン間で比較するノンパラメトリック検定もまた実施した（図１９Ａ及び図２４Ｃ）。本発明者らは、４つのワクチン群間に違いがあるかどうかを判断するため最初にクラスカル・ワリス検定を用いた。いずれの場合も、これは高度に有意であったとともに、次に本発明者らはウィルコクソン順位和検定を使用して４つのワクチン群間の全てのペアワイズ比較を評価した。これらの比較の各々において、モザイクワクチンが誘発したサル当たりの応答は、他の３つのワクチンと比べて有意に多かった。様々なクレード由来のＨＩＶ−１ Ｇａｇに対する応答の幅を分析するため（図２５）、データを二項回帰モデルにフィットさせた。これらのモデルでは説明変数としてワクチン群を使用し、動物間及び株間のばらつきを考慮するため変量効果を含めた。データは僅かに過小分散であったが、モザイクワクチンの投与を受けた動物はなお有意により多い応答数を誘発した。ロスアラモスＨＩＶ−１配列データベースで利用可能なツールを使用してＰＴＥ有効範囲の評価を実施した。
【０１０８】
配列別添資料
Ｉ．二価ＭモザイクＥＮＶ ＧＰ１６０、ＧＡＧ、ＰＯＬ、ＮＥＦ配列
モザイクＥＮＶ１ ＧＰ１６０（アミノ酸配列）
配列番号１
【０１０９】
モザイクＥＮＶ２ ＧＰ１６０（アミノ酸配列）
配列番号２
【０１１０】
モザイクＧＡＧ１（アミノ酸配列）
配列番号３
【０１１１】
モザイクＧＡＧ２（アミノ酸配列）
配列番号４
【０１１２】
モザイクＰＯＬ１（アミノ酸配列）
配列番号５
【０１１３】
モザイクＰＯＬ２（アミノ酸配列）
配列番号６
【０１１４】
モザイクＮＥＦ１（アミノ酸配列）
配列番号７
【０１１５】
モザイクＮＥＦ２（アミノ酸配列）
配列番号８
【０１１６】
ＩＩ．二価ＭモザイクＥＮＶ ＧＰ１４０配列（切断／融合欠損）
モザイクＥＮＶ１ ＧＰ１４０（アミノ酸配列）
配列番号９
【０１１７】
【０１１８】
モザイクＥＮＶ２ ＧＰ１４０（アミノ酸配列）
配列番号１０
【０１１９】
ＭＯＳ３ ＥＮＶ ＧＰ１４０（アミノ酸配列）
６７８アミノ酸
配列番号１１
【０１２０】
ＩＩＩ．二価ＭモザイクＰＯＬ配列（広範囲に不活化、ＰＲ欠失、９個のＡの不活化突然変異による触媒活性の除去）
モザイクＰＯＬ１（アミノ酸配列）
配列番号１２
【０１２１】
モザイクＰＯＬ２（アミノ酸配列）
配列番号１３
【０１２２】
ＭＯＳ３ ＰＯＬ Ｖ３（アミノ酸配列）
８５１アミノ酸
配列番号１４
【０１２３】
ＩＶ．二価ＭモザイクＧＡＧ配列
ＭＯＳ３ ＧＡＧ（アミノ酸配列）
５０８アミノ酸
配列番号１５
【０１２４】
Ｖ．二価ＭモザイクＮＥＦ配列（２位のＧをＡにすることによるミリスチル化部位の欠失）
ＭＯＳ１ ＮＥＦ
（２０６アミノ酸）
配列番号１６
【０１２５】
ＭＯＳ２ ＮＥＦ
（２０６アミノ酸）−２位のＧをＡにすることによるミリスチル化部位の欠失
配列番号１７
【０１２６】
ＭＯＳ３ ＮＥＦ
（２０８アミノ酸）
配列番号１８
【０１２７】
ＶＩ．二価ＭモザイクＧＡＧＮＥＦ融合配列
モザイクＧＡＧＮＥＦ１（アミノ酸配列）
配列番号１９
【０１２８】
モザイクＧＡＧＮＥＦ２（アミノ酸配列）
配列番号２０
【０１２９】
【０１３０】
ＶＩＩ．二価ＭモザイクＧＡＧＰＯＬ融合配列（バージョン３；ＰＯＬは広範囲に不活化、ＰＲ欠失、９個のＡの不活化突然変異による触媒活性の除去）
モザイクＧＡＧＰＯＬ１ Ｖ３（アミノ酸配列）
配列番号２１
【０１３１】
モザイクＧＡＧＰＯＬ２ Ｖ３（アミノ酸配列）
配列番号２２
【０１３２】
【０１３３】
ＭＯＳ３ ＧＡＧ−ＰＯＬ Ｖ３（アミノ酸配列）
１３５９アミノ酸−完全ＧＡＧと修飾ＰＯＬとのＧＡＧ−ＰＯＬ融合
配列番号２３
【０１３４】
【０１３５】
ＶＩＩＩ．二価ＭモザイクＧＡＧＰＯＬ融合配列（バージョン４；ＰＯＬは最小限の不活化、完全なＰＲ−ＲＴ−ＩＮ）
モザイクＧＡＧＰＯＬ１ Ｖ４（アミノ酸配列）
配列番号２４
【０１３６】
モザイクＧＡＧＰＯＬ２ Ｖ４（アミノ酸配列）
配列番号２５
【０１３７】
【０１３８】
ＩＸ．二価ＭモザイクＧＡＧＰＯＬ融合配列（バージョン５；ＰＯＬは最小限の不活化、ＰＲ欠失）
モザイクＧＡＧＰＯＬ１ Ｖ５（アミノ酸配列）
配列番号２６
【０１３９】
【０１４０】
モザイクＧＡＧＰＯＬ２ Ｖ５（アミノ酸配列）
配列番号２７
【０１４１】
Ｘ．二価ＭモザイクＧＡＧＰＯＬＮＥＦ融合配列（ＰＯＬは広範囲に不活化、ＰＲ欠失）
モザイクＧａｇＰｏｌＮｅｆ１（アミノ酸配列）
配列番号２８
【０１４２】
【０１４３】
モザイクＧＡＧＰＯＬＮＥＦ２（アミノ酸配列）
配列番号２９
【０１４４】
【０１４５】
ＸＩ．最適クレードＣ ＥＮＶ ＧＰ１６０、ＧＡＧ、ＰＯＬ、ＮＥＦ配列
最適クレードＣ ＥＮＶ ＧＰ１６０（ＳＮ９０．９０．ＳＥ３６４）（アミノ酸配列）
配列番号３０
【０１４６】
最適クレードＣ ＧＡＧ（ＩＮ．７０１７７）（アミノ酸配列）
配列番号３１
【０１４７】
最適クレードＣ ＰＯＬ（ＺＡ．０４．０４ＺＡＳＫ２０８Ｂ１）（アミノ酸配列）
配列番号３２
【０１４８】
【０１４９】
最適クレードＣ ＮＥＦ（ＺＡ００．１１７０ＭＢ）（アミノ酸配列）
配列番号３３
【０１５０】
ＸＩＩ．最適クレードＣ ＥＮＶ ＧＰ１４０配列（切断／融合欠損）
最適クレードＣ ＥＮＶ ＧＰ１４０（ＳＮ９０．９０．ＳＥ３６４）（アミノ酸配列）
配列番号３４
【０１５１】
ＸＩＩＩ．最適クレードＣ ＰＯＬ 配列（広範囲に不活化、ＰＲ欠失）
最適クレードＣ ＰＯＬ（ＺＡ．０４．０４ＺＡＳＫ２０８Ｂ１）（アミノ酸配列）
配列番号３５
【０１５２】
ＸＩＶ．最適クレードＣ ＧＡＧＮＥＦ融合配列
最適クレードＣ ＧＡＧＮＥＦ（ＩＮ．７０１７７−ＺＡ００．１１７０ＭＢ）（アミノ酸配列）
配列番号３６
【０１５３】
ＸＶ．コンセンサス配列
ＭコンセンサスＥＮＶ
配列番号３７
【０１５４】
ＭコンセンサスＧＡＧ
配列番号３８
【０１５５】
ＭコンセンサスＰＯＬ
配列番号３９
【０１５６】
【０１５７】
他の実施形態
本発明はその特定の実施形態に関連して記載されているが、さらなる変更が可能であり、及び本願が、概して本発明の原理に従い、且つ本発明が関係する技術分野のなかの公知の又は通常の実施の範囲内に含まれるとともに本明細書で以上に示された本質的な特徴に該当し得る本開示からのかかる逸脱を含む本発明の任意の変形例、使用、又は適応を包含することを意図していることは理解されるであろう。
【０１５８】
本明細書において言及される全ての刊行物及び特許出願は、あたかも各々の独立した刊行物又は特許出願が、全体として参照により援用されるように具体的且つ個別的に示されたのと同じ程度まで、参照により本明細書に援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２個の別個の最適化ウイルスポリペプチドを含む、哺乳動物におけるウイルス感染症を治療し、又はそのリスクを低減するワクチンであって、前記最適化ウイルスポリペプチドが同じウイルス遺伝子産物に対応する、前記ワクチン。
【請求項２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記ワクチンが、前記ウイルス遺伝子産物に対する細胞性免疫応答を誘発する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
前記ウイルス感染症が、レトロウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、カリシウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、アストロウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、又はポリオーマウイルスにより引き起こされる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
前記レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）である、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
前記ウイルス遺伝子産物が、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、及びＶｐｕからなる群から選択される、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
前記ワクチンが、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、及びＶｐｕからなる群から選択される前記ウイルス遺伝子産物のうちの１つに対応する最適化ウイルスポリペプチドを２個以下含む、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
前記ワクチンが、Ｇａｇ及びＮｅｆに対応する最適化ウイルスポリペプチドを含まない、請求項５又は６に記載のワクチン。
【請求項９】
配列番号１〜２９に示される配列のいずれか１つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸を含む最適化ウイルスポリペプチドを含む、哺乳動物におけるヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）感染症を治療し、又はそのリスクを低減するワクチン。
【請求項１０】
前記最適化ウイルスポリペプチドが、配列番号１〜２９に示される配列のいずれか１つとのアミノ酸配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸を含む、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記最適化ウイルスポリペプチドが、配列番号１〜２９に示される配列のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記ワクチンが、ＨＩＶ−１に対する細胞性免疫応答を誘発する、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記ワクチンが、少なくとも２つの前記最適化ウイルスポリペプチドを含む、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記少なくとも２つの前記最適化ウイルスポリペプチドが、
ａ） 配列番号１及び２；
ｂ） 配列番号３及び４；
ｃ） 配列番号５及び６；
ｄ） 配列番号７及び８；
ｅ） 配列番号９及び１０；
ｆ） 配列番号１０及び１１；
ｇ） 配列番号９及び１１；
ｈ） 配列番号１２及び１３；
ｉ） 配列番号１３及び１４；
ｊ） 配列番号１２及び１４；
ｋ） 配列番号３及び１５；
ｌ） 配列番号４及び１５；
ｍ） 配列番号１６及び１７；
ｎ） 配列番号１７及び１８；
ｏ） 配列番号１６及び１８；
ｐ） 配列番号１９及び２０；
ｑ） 配列番号２１及び２２；
ｒ） 配列番号２２及び２３；
ｓ） 配列番号２１及び２３；
ｔ） 配列番号２４及び２５；
ｕ） 配列番号２６及び２７；又は
ｖ） 配列番号２８及び２９、
を含む、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
前記ワクチンが、少なくとも３つの前記最適化ウイルスポリペプチドを含む、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１７】
前記ワクチンが、少なくとも４つの前記最適化ウイルスポリペプチドを含む、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１８】
別個の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも２つの対を含む、哺乳動物におけるウイルス感染症を治療し、又はそのリスクを低減するワクチンであって、前記最適化ウイルスポリペプチドの各対が同じウイルス遺伝子産物に対応し、及び前記ワクチンに組み込まれる２個以下の最適化ウイルスポリペプチドが同じウイルス遺伝子産物に対応する、前記ワクチン。
【請求項１９】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２０】
前記ワクチンが、前記ウイルス遺伝子産物に対する細胞性免疫応答を誘発する、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２１】
別個の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも３つの対を含む、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２２】
別個の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも４つの対を含む、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２３】
前記ウイルス感染症が、レトロウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、カリシウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、アストロウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、又はポリオーマウイルスにより引き起こされる、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２４】
前記レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）である、請求項２３に記載のワクチン。
【請求項２５】
前記別個の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも２つの対が、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、及びＶｐｕからなる群から選択される前記ウイルス遺伝子産物のうちの任意の２つに対応する、請求項２４に記載のワクチン。
【請求項２６】
前記少なくとも２つのウイルス遺伝子産物が、Ｇａｇ及びＮｅｆではない、請求項２５に記載のワクチン。
【請求項２７】
Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、及びＶｐｕからなる群から選択される前記ウイルス遺伝子産物のうちの任意の３つに対応する別個の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも３つの対を含む、請求項２５に記載のワクチン。
【請求項２８】
Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、及びＶｐｕからなる群から選択される前記ウイルス遺伝子産物のうちの任意の４つに対応する別個の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも４つの対を含む、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２９】
前記ワクチンが、ＨＩＶ−１に対する細胞性免疫応答を誘発する、請求項２４に記載のワクチン。
【請求項３０】
少なくとも１つの別個の最適化ウイルスポリペプチドのヌクレオチド配列が核酸又はベクターによりコードされる、請求項１、９又は１８に記載のワクチン。
【請求項３１】
前記ベクターが組換えアデノウイルスである、請求項３０に記載のワクチン。
【請求項３２】
前記組換えアデノウイルスが、アデノウイルス血清型２６（Ａｄ２６）、アデノウイルス血清型３４（Ａｄ３４）、アデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）、アデノウイルス血清型４８（Ａｄ４８）、又はアデノウイルス血清型５ ＨＶＲ４８（Ａｄ５ＨＶＲ４８）である、請求項３１に記載のワクチン。
【請求項３３】
薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤とさらに組み合わされた、請求項１、９又は１８に記載のワクチン。
【請求項３４】
配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸を含む最適化ウイルスポリペプチドのヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項３５】
前記最適化ウイルスポリペプチドが、配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸を含む、請求項３４に記載の核酸。
【請求項３６】
前記最適化ウイルスポリペプチドが、配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを含む、請求項３４に記載の核酸。
【請求項３７】
ベクターをさらに含む、請求項３４に記載の核酸。
【請求項３８】
前記ベクターが組換えアデノウイルスである、請求項３７に記載の核酸。
【請求項３９】
前記組換えアデノウイルスが、アデノウイルス血清型２６（Ａｄ２６）、アデノウイルス血清型３４（Ａｄ３４）、アデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）、アデノウイルス血清型４８（Ａｄ４８）、又はアデノウイルス血清型５ ＨＶＲ４８（Ａｄ５ＨＶＲ４８）である、請求項３８に記載の核酸。
【請求項４０】
配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸を含む最適化ウイルスポリペプチド。
【請求項４１】
前記最適化ウイルスポリペプチドが、配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸を含む、請求項４０に記載の最適化ウイルスポリペプチド。
【請求項４２】
前記最適化ウイルスポリペプチドが、配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを含む、請求項４０に記載の最適化ウイルスポリペプチド。
【請求項４３】
哺乳動物に対し、請求項１、９若しくは１８に記載のワクチン又は請求項３７に記載の核酸を投与することを含む、前記哺乳動物におけるウイルス感染症を治療し、又はそのリスクを低減する方法。
【請求項４４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ワクチン又は核酸が、前記ウイルス遺伝子産物に対する細胞性免疫応答を誘発する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記ウイルス感染症が、レトロウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、カリシウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、アストロウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、又はポリオーマウイルスにより引き起こされる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ウイルス遺伝子産物が、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、及びＶｐｕからなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
哺乳動物におけるウイルス感染症を治療し、又はそのリスクを低減するワクチンの製造方法であって、請求項１、９又は１８に記載のワクチンを合成することを含む、前記方法。
【請求項５０】
哺乳動物におけるウイルス感染症を治療し、又はそのリスクを低減するワクチンの製造方法であって、
ａ）請求項３７に記載の核酸を細胞と接触させるステップと、
ｂ）前記最適化ウイルスポリペプチドを単離するステップと、
を含む、前記方法。
【請求項５１】
前記最適化ウイルスポリペプチドが、哺乳動物に投与されると細胞性免疫応答を誘発する、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記ワクチンが、前記ウイルス遺伝子産物に対する細胞性免疫応答を誘発する、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記ウイルス感染症が、レトロウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、カリシウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、アストロウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、又はポリオーマウイルスにより引き起こされる、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ウイルス遺伝子産物が、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、及びＶｐｕからなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ａ）請求項１、９又は１８に記載のワクチンと、
ｂ）薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤と、
ｃ）キットの使用説明書と、
を含むキット。
【請求項５８】
アジュバントをさらに含む、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
ａ）請求項３７に記載の核酸と、
ｂ）薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤と、
ｃ）キットの使用説明書と、
を含むキット。
【請求項６０】
アジュバントをさらに含む、請求項５９に記載のキット。
【請求項１】
少なくとも２個の別個の最適化ウイルスポリペプチドを含む、哺乳動物におけるウイルス感染症を治療し、又はそのリスクを低減するワクチンであって、前記最適化ウイルスポリペプチドが同じウイルス遺伝子産物に対応する、前記ワクチン。
【請求項２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記ワクチンが、前記ウイルス遺伝子産物に対する細胞性免疫応答を誘発する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
前記ウイルス感染症が、レトロウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、カリシウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、アストロウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、又はポリオーマウイルスにより引き起こされる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
前記レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）である、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
前記ウイルス遺伝子産物が、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、及びＶｐｕからなる群から選択される、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
前記ワクチンが、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、及びＶｐｕからなる群から選択される前記ウイルス遺伝子産物のうちの１つに対応する最適化ウイルスポリペプチドを２個以下含む、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
前記ワクチンが、Ｇａｇ及びＮｅｆに対応する最適化ウイルスポリペプチドを含まない、請求項５又は６に記載のワクチン。
【請求項９】
配列番号１〜２９に示される配列のいずれか１つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸を含む最適化ウイルスポリペプチドを含む、哺乳動物におけるヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）感染症を治療し、又はそのリスクを低減するワクチン。
【請求項１０】
前記最適化ウイルスポリペプチドが、配列番号１〜２９に示される配列のいずれか１つとのアミノ酸配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸を含む、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記最適化ウイルスポリペプチドが、配列番号１〜２９に示される配列のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記ワクチンが、ＨＩＶ−１に対する細胞性免疫応答を誘発する、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記ワクチンが、少なくとも２つの前記最適化ウイルスポリペプチドを含む、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記少なくとも２つの前記最適化ウイルスポリペプチドが、
ａ） 配列番号１及び２；
ｂ） 配列番号３及び４；
ｃ） 配列番号５及び６；
ｄ） 配列番号７及び８；
ｅ） 配列番号９及び１０；
ｆ） 配列番号１０及び１１；
ｇ） 配列番号９及び１１；
ｈ） 配列番号１２及び１３；
ｉ） 配列番号１３及び１４；
ｊ） 配列番号１２及び１４；
ｋ） 配列番号３及び１５；
ｌ） 配列番号４及び１５；
ｍ） 配列番号１６及び１７；
ｎ） 配列番号１７及び１８；
ｏ） 配列番号１６及び１８；
ｐ） 配列番号１９及び２０；
ｑ） 配列番号２１及び２２；
ｒ） 配列番号２２及び２３；
ｓ） 配列番号２１及び２３；
ｔ） 配列番号２４及び２５；
ｕ） 配列番号２６及び２７；又は
ｖ） 配列番号２８及び２９、
を含む、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
前記ワクチンが、少なくとも３つの前記最適化ウイルスポリペプチドを含む、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１７】
前記ワクチンが、少なくとも４つの前記最適化ウイルスポリペプチドを含む、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１８】
別個の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも２つの対を含む、哺乳動物におけるウイルス感染症を治療し、又はそのリスクを低減するワクチンであって、前記最適化ウイルスポリペプチドの各対が同じウイルス遺伝子産物に対応し、及び前記ワクチンに組み込まれる２個以下の最適化ウイルスポリペプチドが同じウイルス遺伝子産物に対応する、前記ワクチン。
【請求項１９】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２０】
前記ワクチンが、前記ウイルス遺伝子産物に対する細胞性免疫応答を誘発する、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２１】
別個の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも３つの対を含む、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２２】
別個の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも４つの対を含む、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２３】
前記ウイルス感染症が、レトロウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、カリシウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、アストロウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、又はポリオーマウイルスにより引き起こされる、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２４】
前記レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）である、請求項２３に記載のワクチン。
【請求項２５】
前記別個の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも２つの対が、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、及びＶｐｕからなる群から選択される前記ウイルス遺伝子産物のうちの任意の２つに対応する、請求項２４に記載のワクチン。
【請求項２６】
前記少なくとも２つのウイルス遺伝子産物が、Ｇａｇ及びＮｅｆではない、請求項２５に記載のワクチン。
【請求項２７】
Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、及びＶｐｕからなる群から選択される前記ウイルス遺伝子産物のうちの任意の３つに対応する別個の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも３つの対を含む、請求項２５に記載のワクチン。
【請求項２８】
Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、及びＶｐｕからなる群から選択される前記ウイルス遺伝子産物のうちの任意の４つに対応する別個の最適化ウイルスポリペプチドの少なくとも４つの対を含む、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２９】
前記ワクチンが、ＨＩＶ−１に対する細胞性免疫応答を誘発する、請求項２４に記載のワクチン。
【請求項３０】
少なくとも１つの別個の最適化ウイルスポリペプチドのヌクレオチド配列が核酸又はベクターによりコードされる、請求項１、９又は１８に記載のワクチン。
【請求項３１】
前記ベクターが組換えアデノウイルスである、請求項３０に記載のワクチン。
【請求項３２】
前記組換えアデノウイルスが、アデノウイルス血清型２６（Ａｄ２６）、アデノウイルス血清型３４（Ａｄ３４）、アデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）、アデノウイルス血清型４８（Ａｄ４８）、又はアデノウイルス血清型５ ＨＶＲ４８（Ａｄ５ＨＶＲ４８）である、請求項３１に記載のワクチン。
【請求項３３】
薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤とさらに組み合わされた、請求項１、９又は１８に記載のワクチン。
【請求項３４】
配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸を含む最適化ウイルスポリペプチドのヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項３５】
前記最適化ウイルスポリペプチドが、配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸を含む、請求項３４に記載の核酸。
【請求項３６】
前記最適化ウイルスポリペプチドが、配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを含む、請求項３４に記載の核酸。
【請求項３７】
ベクターをさらに含む、請求項３４に記載の核酸。
【請求項３８】
前記ベクターが組換えアデノウイルスである、請求項３７に記載の核酸。
【請求項３９】
前記組換えアデノウイルスが、アデノウイルス血清型２６（Ａｄ２６）、アデノウイルス血清型３４（Ａｄ３４）、アデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）、アデノウイルス血清型４８（Ａｄ４８）、又はアデノウイルス血清型５ ＨＶＲ４８（Ａｄ５ＨＶＲ４８）である、請求項３８に記載の核酸。
【請求項４０】
配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸を含む最適化ウイルスポリペプチド。
【請求項４１】
前記最適化ウイルスポリペプチドが、配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと配列同一性を有する少なくとも７個の連続するアミノ酸を含む、請求項４０に記載の最適化ウイルスポリペプチド。
【請求項４２】
前記最適化ウイルスポリペプチドが、配列番号１〜２９に示されるアミノ酸配列のいずれか１つを含む、請求項４０に記載の最適化ウイルスポリペプチド。
【請求項４３】
哺乳動物に対し、請求項１、９若しくは１８に記載のワクチン又は請求項３７に記載の核酸を投与することを含む、前記哺乳動物におけるウイルス感染症を治療し、又はそのリスクを低減する方法。
【請求項４４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ワクチン又は核酸が、前記ウイルス遺伝子産物に対する細胞性免疫応答を誘発する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記ウイルス感染症が、レトロウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、カリシウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、アストロウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、又はポリオーマウイルスにより引き起こされる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ウイルス遺伝子産物が、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、及びＶｐｕからなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
哺乳動物におけるウイルス感染症を治療し、又はそのリスクを低減するワクチンの製造方法であって、請求項１、９又は１８に記載のワクチンを合成することを含む、前記方法。
【請求項５０】
哺乳動物におけるウイルス感染症を治療し、又はそのリスクを低減するワクチンの製造方法であって、
ａ）請求項３７に記載の核酸を細胞と接触させるステップと、
ｂ）前記最適化ウイルスポリペプチドを単離するステップと、
を含む、前記方法。
【請求項５１】
前記最適化ウイルスポリペプチドが、哺乳動物に投与されると細胞性免疫応答を誘発する、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記ワクチンが、前記ウイルス遺伝子産物に対する細胞性免疫応答を誘発する、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記ウイルス感染症が、レトロウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、カリシウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、アストロウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、ポックスウイルス、又はポリオーマウイルスにより引き起こされる、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ウイルス遺伝子産物が、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｎｅｆ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、及びＶｐｕからなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ａ）請求項１、９又は１８に記載のワクチンと、
ｂ）薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤と、
ｃ）キットの使用説明書と、
を含むキット。
【請求項５８】
アジュバントをさらに含む、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
ａ）請求項３７に記載の核酸と、
ｂ）薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤と、
ｃ）キットの使用説明書と、
を含むキット。
【請求項６０】
アジュバントをさらに含む、請求項５９に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ−１】
【図２０Ｂ−２】
【図２０Ｃ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２２−１】
【図２２−２】
【図２２−３】
【図２２−４】
【図２２−５】
【図２２−６】
【図２２−７】
【図２２−８】
【図２２−９】
【図２２−１０】
【図２２−１１】
【図２２−１２】
【図２２−１３】
【図２２−１４】
【図２２−１５】
【図２２−１６】
【図２２−１７】
【図２２−１８】
【図２３】
【図２４Ａ−Ｂ】
【図２４Ｃ】
【図２５】
【図２６Ａ−Ｂ】
【図２６Ｃ−Ｄ】
【図２７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ−１】
【図２０Ｂ−２】
【図２０Ｃ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２２−１】
【図２２−２】
【図２２−３】
【図２２−４】
【図２２−５】
【図２２−６】
【図２２−７】
【図２２−８】
【図２２−９】
【図２２−１０】
【図２２−１１】
【図２２−１２】
【図２２−１３】
【図２２−１４】
【図２２−１５】
【図２２−１６】
【図２２−１７】
【図２２−１８】
【図２３】
【図２４Ａ−Ｂ】
【図２４Ｃ】
【図２５】
【図２６Ａ−Ｂ】
【図２６Ｃ−Ｄ】
【図２７】
【公表番号】特表２０１２−５０９３４０（Ｐ２０１２−５０９３４０Ａ）
【公表日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３７５８６（Ｐ２０１１−５３７５８６）
【出願日】平成２１年１１月１８日（２００９．１１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６４９９９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５９７３２
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（３０３０３６１９７）ベス イスラエル デアコネス メディカル センター インコーポレイテッド (4)
【出願人】（５１１１２１４４７）ロス アラモス ナショナル セキュリティー，エルエルシー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１８日（２００９．１１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６４９９９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５９７３２
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（３０３０３６１９７）ベス イスラエル デアコネス メディカル センター インコーポレイテッド (4)
【出願人】（５１１１２１４４７）ロス アラモス ナショナル セキュリティー，エルエルシー (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]