細胞損傷及び炎症疾患の治療または予防用薬学組成物
【課題】細胞損傷と炎症疾患の治療または予防に有用な薬学組成物、及びこれを用いる細胞損傷と炎症疾患の治療または予防方法の提供。
【解決手段】２‐ヒドロキシ‐５‐フェネチルアミノ‐安息香酸、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（３‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸、５‐［２‐（３，５‐ビス‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（２‐ニトロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸、５‐［２‐（４‐クロロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸などの２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩。
【解決手段】２‐ヒドロキシ‐５‐フェネチルアミノ‐安息香酸、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（３‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸、５‐［２‐（３，５‐ビス‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（２‐ニトロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸、５‐［２‐（４‐クロロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸などの２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、胃炎、胃潰瘍、膵臓炎、大腸炎、関節炎、糖尿病、動脈硬化、腎臓炎、肝炎、アルツハイマー性痴呆、パーキンソン病、ルーゲーリック病などの炎症性疾患で現われる炎症と細胞損傷の治療または予防に有用な薬学組成物、及びこのような薬学組成物を用いる治療または予防方法に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
炎症は、損傷を受けた細胞から由来する損傷因子と外来物質に対する血管反応及び細胞反応である。炎症反応を媒介する物質としては、１）アラキドン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）の代謝物質であるプロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）、ロイコトリエン（ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ）及びリポキシン（ｌｉｐｏｘｉｎｓ）、２）血小板活性化因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）、３）腫瘍壊死因子α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ）、インターロイキン‐１（ＩＬ‐１）などのサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）とｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＣＰ‐１）、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ‐１ａｌｐｈａ（ＭＣＰ‐１ａｌｐｈａ）などのケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ）、４）一酸化窒素（ＮＯ）、５）活性酸素、６）ヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）、セロトニンなどのような血管拡張因子などが知られている。炎症反応の主な目的は、外来物質及び損傷を受けた細胞と組織を除去することであるが、炎症反応はリューマチ性関節炎及び動脈硬化のような慢性疾患を誘発する原因になる。
【０００３】
炎症損傷の程度が小さく制限的且つ一時的な場合、炎症反応の完了と共に損傷因子が除去され、組織は正常に戻ってくる。損傷の程度が大きく再生力が不十分な組織における炎症反応は、かなりの組織損傷が伴われると、機能の障害を引き起し得る。炎症反応が長期間に亘って慢性的に続くと、リューマチ性関節炎、動脈硬化、結核、慢性肺疾患で致命的な組織損傷の原因になる（Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ、ｐｐ．４７−８６、７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）。
【０００４】
また、炎症が退行性脳疾患の病態生理に重要な役割を占めるという結果が続々と報告されている。脳に存在するミクログリア（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）は、アルツハイマー性痴呆、パーキンソン病、ルーゲーリック病において神経損傷が起きる部位で活性化される（Ｌｉｕ Ｂ及びＨｏｎｇ ＪＳ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２００３；３０４（１）：１−７；Ｏｒｒ ＣＦ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２００２；６８（５）：３２５−４０；及びＨｅｎｋｅｌ ＪＳ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．２００４；５５（２）：２２１−３５）。活性化されたミクログリアはプロスタグランジン、サイトカイン、ケモカイン、活性酸素、ＮＯなどを生成し、脳における炎症反応を開始する（Ｍｉｎｇｈｅｔｔｉ Ｌ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ．２００５；１８（３）：３１５−２１；Ｇａｏ ＨＭ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ．２００３；２４（８）：３９５−４０１；Ｗｅｙｄｔ Ｐ ａｎｄ Ｍｏｌｌｅｒ Ｔ．Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．２００５；１６（６）：５２７−３１；及びＪ．Ｊ．Ｍ．Ｈｏｏｚｅｍａｎｓ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２００６；２４：１５７−１６５）。したがって、炎症を抑制する薬物の投与は、アルツハイマー性痴呆の動物モデルでベータアミロイドとプラークの生成を抑制し（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ＫＰ ａｎｄ Ｐｒａｔｉｃｏ Ｄ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．２００５；１８：３１５−２１）、パーキンソン病動物モデルでドーパミン神経細胞を保護し（Ｆｅｒｇｅｒ Ｂ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｕｎｙｎ Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ Ａｒｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９９；３６０（３）：２５６−６１；及びＴｅｉｓｍａｎｎ Ｐ、Ｆｅｒｇｅｒ Ｂ．Ｓｙｎａｐｓｅ．２００１；３９（２）：１６７−７４）、ルーゲーリック病モデルで脊髄運動神経細胞の死滅を防止し且つグリア（ｇｌｉａ）活性を減らすと報告された（Ｋｉａｅｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００５；９３（２）：４０３‐１１）。実際、打撲傷など脳に炎症反応を伴う病歴を持つ患者からＡＤの発病率が高く（Ｂｒｅｉｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９４）、非ステロイド性消炎剤（ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇ、ＮＳＡＩＤ）を長期服用するリューマチ性関節炎患者のＡＤ発病率が低いと報告された（ＭｃＧｅｅｒ ａｎｄ Ｒｏｇｅｒｓ、１９９０）。ＮＳＡＩＤの服用が、ＡＤの予防はもちろん認知機能損傷の進行を遅らせるという研究結果も発表された（Ｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．、１９９５ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ；Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９９５ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ；及びＢｒｅｉｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９４ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）。このような結果は、炎症反応を抑制する薬物が退行性脳疾患の予防と治療に用いられ得ることを提示する。
【０００５】
プロスタグランジンの生成に関与するシクロオキシゲナーゼの作用を抑制する薬物であるＮＳＡＩＤが開発されて痛症を含む炎症疾患の症状を緩和するために広く使われているが、その副作用により使用に大きい障害となっている。特に、消化不良、胃炎、潰瘍、出血、穿孔などの胃腸管障害は、ＮＳＡＩＤの服用後、頻繁に現われる副作用である。実際、ＮＳＡＩＤの副作用で、米国だけで年間１０７，０００人が入院し、１６，５００人が死亡すると報告されている。胃腸管損傷の副作用が小さい選択的ＣＯＸ‐２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ‐２）酵素抑制薬物であるＣｏｘｉｂとしてｃｅｌｅｃｏｘｉｂとｒｏｆｅｃｏｘｉｂが開発され、関節炎と痛症の治療に使われてきた。２００５年米国ＦＤＡは、ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ、ｒｏｆｅｃｏｘｉｂまたはｖａｌｄｅｃｏｘｉｂの長期服用は心臓疾患を誘発すると報告し、関節炎治療剤としてのＣｏｘｉｂ薬物の使用が制限された。さらに、ｃｅｌｅｃｏｘｉｂとｒｏｆｅｃｏｘｉｂの痴呆臨床研究が安全性の理由から中断された。
【０００６】
また、炎症疾患において、好中球、マクロファージ、モノサイトなどによって生成される活性酸素は、炎症反応を媒介して組織損傷を誘発する主な原因として知られている。実際、活性酸素を除去する薬物の投与が、炎症疾患で現われる胃損傷（Ｍａｔｔｈｅｗｓ ＧＭ ｅｔ ａｌ．及びＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ．２００５；１０（４）：２９８−３０６）、膵臓損傷（Ｓｈｉ Ｃ ｅｔ ａｌ．、Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌｏｇｙ．２００５；５（４−５）：４９２−５００）、動脈硬化（Ｔａｒｄｉｆ ＪＣ．Ｃｕｒｒ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ Ｒｅｐ．２００５；７（１）：７１−７）、大腸損傷（Ｏｚ ＨＳ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｎｕｔｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００５；１６（５）：２９７−３０４）、関節損傷（Ｈｅｎｒｏｔｉｎ Ｙ Ｅ ｅｔ ａｌ．、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ．２００３；１１（１０）：７４７−５５）、腎臓損傷（Ｔｉａｎ Ｎ ｅｔ ａｌ．、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．２００５；４５（５）：９３４−９）、肝損傷（Ｌｏｇｕｅｒｃｉｏ Ｃ ｅｔ ａｌ．、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．２００３；３４（１）：１−１０）、心血管損傷（Ｈａｉｄａｒａ ＭＡ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ Ｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００６；４（３）：２１５−２７）などに効果があるという結果が提示されている。さらに、非ステロイド性抗炎症薬物の投与は、活性酸素の生成を誘発して胃粘膜損傷との副作用を起こし、このような胃損傷は抗酸化物質の投与によって減少することが報告されている（Ｇｒａｚｉａｎｉ Ｇ ｅｔ ａｌ．、Ｇｕｔ．２００５；５４（２）：１９３−２００）。
【０００７】
炎症は消火器、呼吸器、神経系疾患の病態生理に重要な役割を占めるが、現在使われている薬物は副作用のために使用が制限されている。抗炎症薬物であるアスピリン（ａｃｅｔｙｌｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ）がＮＦ‐ｋＢとｃ‐Ｊｕｎ Ｎ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅの作用を抑制し（Ｋｏ ＨＷ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９９８；７１（４）：１３９０−５）、スルファサラジンが抗酸化作用で細胞を保護することが知られている（Ｒｙｕ ＢＲ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２００３；３０５（１）：４８−５６）。しかし、アスピリンとスルファサラジンの細胞保護作用は、高濃度で現われるとの限界が問題として提起された。
【０００８】
〔発明の開示〕
したがって、本発明の技術的課題は、胃損傷、心血管障害などの副作用がなく安全であって炎症疾患の治療または予防に優れる薬学組成物、このような薬学組成物の炎症疾患治療または予防用途、及びこのような薬学組成物を投与することを含む炎症疾患治療または予防方法を提供することである。
【０００９】
上記の技術的課題を達成するために、本発明は有効成分として下記化学式１で表れる２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩を含むことを特徴とする炎症疾患の治療または予防用薬学組成物を提供する。
【００１０】
［化学式１］
【００１１】
【化１】
【００１２】
前記化学式１において、
ｎは２ないし５の整数であり、
Ｒ１は水素またはアルキルであり、
Ｒ２は水素、アルキルまたはアルカノイルであり、
Ｒ３は水素またはアセトキシであり、
Ｘは相互独立的に、水素、ニトロ、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたはハロアルコキシである。
【００１３】
より望ましくは、本発明は前記炎症疾患が胃炎、大腸炎、関節炎、糖尿病炎症、動脈硬化、腎臓炎、肝炎、アルツハイマー性痴呆、パーキンソン病、及びルーゲーリック病からなる群より選択されたいずれか１つであることを特徴とする炎症疾患の治療または予防用薬学組成物を提供する。
【００１４】
また、本発明は炎症疾患で苦む患者または動物に前記化学式１で表れる２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩の治療的に有効な量を投与することを含む炎症疾患の治療または予防方法を提供する。
【００１５】
本発明者等は、様々な化合物を製造して評価したところ、前記化学式１で表れる２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩が安全であるだけでなく炎症疾患の治療または予防に非常に有用であることを見つけ、本発明の完成に至った。
【００１６】
以下、本発明の炎症疾患治療または予防用薬学組成物、及び炎症疾患の治療または予防方法についてより具体的に説明する。
【００１７】
本発明は、下記化学式１で表れる２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩の新たな用途、すなわち炎症疾患の治療または予防用途を提供し、また下記化学式１で表れる２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩を用いて炎症疾患を治療または予防する方法を提供する。
【００１８】
［化学式１］
【００１９】
【化２】
【００２０】
前記化学式１において、
ｎは２ないし５の整数であり、
Ｒ１は水素またはアルキルであり、
Ｒ２は水素、アルキルまたはアルカノイルであり、
Ｒ３は水素またはアセトキシであり、
Ｘは相互独立的に、水素、ニトロ、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたはハロアルコキシである。
【００２１】
前記化学式１において、アルキル（ハロアルキルのアルキルを含む）は炭素数１ないし５のアルキルであることが望ましく、炭素数１または３のアルキルであることがさらに望ましい。具体的に、前記アルキルとしてはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ‐ブチル及びｔｅｒｔ‐ブチル基が望ましいが、これに限定されることはない。アルコキシ（ハロアルコキシのアルコキシを含む）は、炭素数１ないし５のアルコキシであることが望ましく、炭素数１または３のアルコキシであることがさらに望ましい。具体的に、前記アルコキシとしてはメトキシ、エトキシ及びプロトキシ基が望ましいが、これに限定されることはない。ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素及びヨードであることが望ましいが、これに限定されることはない。アルカノイルは炭素数２ないし１０のアルカノイルであることが望ましく、炭素数３または５であることがさらに望ましい。具体的に、前記アルカノイルとしてはエタノイル、プロパノイル、及びシクロヘキサンカルボニルが望ましいが、これに限定されることはない。
【００２２】
前記化学式１で表れる２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体の望ましい例には、２‐ヒドロキシ‐５‐フェネチルアミノ‐安息香酸（化合物１）、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（化合物２）、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（３‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（化合物３）、５‐［２‐（３，５‐ビス‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸（化合物４）、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（２‐ニトロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（化合物５）、５‐［２‐（４‐クロロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸（化合物６）、５‐［２‐（３，４‐ジフルオロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸（化合物７）、５‐［２‐（３，４‐ジクロロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸（化合物８）、５‐［２‐（４‐フルオロ‐２‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸（化合物９）、５‐［２‐（２‐フルオロ‐４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸（化合物１０）、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐メトキシ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（化合物１１）、２‐ヒドロキシ‐５‐（２‐ｏ‐トリル‐エチルアミノ）‐安息香酸（化合物１２）、２‐ヒドロキシ‐５‐（３‐フェニル‐プロピルアミノ）‐安息香酸（化合物１３）、２‐ヒドロキシ‐５‐［３‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐プロピルアミノ］‐安息香酸（化合物１４）、５‐［３‐（４‐フルオロ‐フェニル）‐プロピルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸（化合物１５）、５‐［３‐（３，４‐ジクロロ‐フェニル）‐プロピルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸（化合物１６）、２‐ヒドロキシ‐５‐（３‐ｐ‐トリル‐プロピルアミノ）‐安息香酸（化合物１７）、２‐アセトキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（化合物１８）、及び５‐［２‐（２‐クロロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸（化合物１９）が含まれるが、これに限定されることはない。
【００２３】
前述した望ましい化合物のうち、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（化合物２）及び２‐アセトキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（化合物１８）は、炎症疾患治療用活性物質として他の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体に比べてさらに望ましい。
【００２４】
前述した望ましい化合物のうち、化合物２は、特に退行性脳疾患の細胞損傷及び炎症の治療において他の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体に比べてさらに望ましい。化合物２は、抗炎症効果の観点から、類似の構造を持つ幾つかの化合物に比べて非常に優れた効果を示し、またベータアミロイド生成抑制効果に対する観点からも、類似の構造を持つ幾つかの化合物に比べて優れた効果を示した。勿論、ＮＯ生成抑制効果など１つの実験結果のみに基づく場合には、化合物２よりさらに優れた効果を示す化合物が存在するが、退行性脳疾患治療剤としての他の評価実験で相対的に良くない結果を示し退行性脳疾患治療剤として好適ではなかった（例えば、幾つかの化合物はＮＯ生成抑制効果が化合物２より優れたが、退行性脳疾患の治療において非常に重要なベータアミロイド生成抑制効果が非常に微弱であった）。また、幾つかの化合物は薬効評価実験で優れた結果を示したが、後述する毒性評価実験で化合物２に比べて望ましくなかった。
【００２５】
同様に、前述した望ましい化合物のうちの化合物１８は、炎症疾患の治療において、他の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体に比べてさらに望ましい。化合物１８は、抗炎症効果の観点から類似の構造を持つ幾つかの化合物に比べて非常に優れた効果を示したが、また後述する毒性評価実験で化合物２に比べては効果が落ちた。
【００２６】
本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体は、以下のような反応式によって製造することができるが、これに限定されることはない。本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体は、本発明が属した分野で公知の合成法を用いて製造することができる。
【００２７】
＜反応式１＞
【００２８】
【化３】
【００２９】
反応条件：トリエチルアミン、ヨウ化テトラブチルアンモニウム、Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド、常温、３時間。
【００３０】
＜反応式２＞
【００３１】
【化４】
【００３２】
反応条件：（ａ）エタノール、Ｈ２ＳＯ４、還流、６時間；（ｂ）無水酢酸、メタノール、０℃、３０分；（ｃ）無水酢酸、Ｈ２ＳＯ４、０℃、３０分
また、本発明の望ましい一実施例である２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（化合物２）は、以下のような反応式３によって製造することができるが、これに限定されることはない。
【００３３】
＜反応式３＞
【００３４】
【化５】
【００３５】
反応条件：（ａ）４‐（トリフルオロメチル）ヒドロ桂皮酸、ＰＣｌ５、キシレン、還流、１２時間；（ｂ）塩化アセチル、ＤＭＦ／Ｋ２ＣＯ３、室温、２時間；（ｃ）ＮａＢＨ４、酢酸／１，４‐ジオキサン、約９５℃、５０分；（ｄ）ＨＣｌ／Ｈ２Ｏ、酢酸。
【００３６】
本発明において「薬学的に許容可能な塩」とは、毒性がないか又は少ない酸または塩基から製造された塩を言う。本発明の化合物が相対的に酸性である場合、塩基（ｂａｓｅ）付加塩は十分な量の所望の塩基と本発明の化合物とを適当な不活性溶媒で接触させ、中性形態を得ることができる。薬学的に許容可能な塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、マグネシウムまたは有機アミノからなる塩を含むが、これに限定されることはない。本発明の化合物が相対的に塩基性である場合、酸（ａｃｉｄ）付加塩は十分な量の所望の酸と本発明の化合物とを適当な不活性溶媒で接触させ、中性形態を得ることができる。薬学的に許容可能な酸付加塩は、プロピオン酸、イソブチル酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ‐トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸、塩酸、臭素酸、窒酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素、亜リン酸などから形成された塩を含むが、これに限定されることはない。また、アルジネートのようなアミノ酸の塩、及びグルクロン酸またはガラクツロン酸（ｇａｌａｃｔｕｎｏｒｉｃ ａｃｉｄ）のような有機酸の類似体を含むが、これに限定されることはない。
【００３７】
例えば、本発明の望ましい一実施例である２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（化合物２）の薬学的に許容可能な塩は、以下のような反応式４によって製造することができるが、これに限定されることはない。
【００３８】
＜反応式４＞
【００３９】
【化６】
【００４０】
反応式４において、Ｍはジエチルアミン、リチウム、ナトリウム、カリウムなどの薬学的に許容される金属または塩基性有機化合物を指す。
【００４１】
より具体的に、ジエチルアミン塩はアルコールに化合物を溶解してから、ジエチルアミンを滴加し撹拌した後、減圧蒸留し残渣にエーテルを添加して結晶化させて得る。アルカリ金属塩を製造する方法としては、アルコール、アセトン、アセトニトリルなどのような溶媒下でアルカリ金属を提供し得る水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの無機試薬を用いて目的とする塩形態化合物を製造し、凍結乾燥させて得ることができる。また、類似の方法を用いて、リチウム塩はリチウムアセテートを使用し、ナトリウム塩はナトリウム２‐ヘキサン酸エチルまたはナトリウムアセテートを使用し、カリウム塩はカリウムアセテートを使用して目的とする塩を製造することができる。
【００４２】
本発明の一部化合物は、水和物形態を含み、溶媒和された形態だけでなく非溶媒和された形態で存在することもできる。本発明の一部化合物は、結晶形または無晶形で存在することができ、このようなすべての物理的形態は本発明の範囲に含まれる。また、本発明の一部化合物は、光学中心である非対称炭素原子または二重結合を有することがあり、ラセミ化合物、鏡像異性体、ジアステレオマー、幾何異性体（きかいせいたい）などが存在することができ、これらも本発明の範囲に含まれる。
【００４３】
さらに、本発明は前記化学式１で表れる２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩と、薬剤学的に許容される賦形剤または添加剤とを含む薬学組成物を提供する。本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩は、単独であるいは如何なる便利な担体、賦形剤などと共に混合して投与でき、そのような投与剤形は単回投与または反復投与剤形であり得る。
【００４４】
本発明の薬学組成物は固形製剤または液状製剤であり得る。固形製剤としては、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、坐剤などがあるが、これに限定されることはない。固形製剤には、賦形剤、着香剤、結合剤、防腐剤、崩解剤、滑沢剤、充填剤などがさらに含まれるが、これに限定されることはない。液状製剤としては、水、プロピレングリコール溶液のような溶液剤、懸濁液剤、乳剤などがあるが、これに限定されることはなく、適当な着色剤、着香剤、安定化剤、粘性化剤などを添加して製造することができる。
【００４５】
例えば、散剤は、本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体化合物と乳糖、澱粉、微結晶セルロースなど薬剤学的に許容される適当な賦形剤を単純混合することで製造することができる。顆粒剤は、本発明の化合物またはこれの薬学的に許容できる塩；薬剤学的に許容される適当な賦形剤；及びポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの薬剤学的に許容される適当な結合剤を混合した後、水、エタノール、イソプロパノールなどの溶媒を用いた湿式顆粒法または圧縮力を用いた乾式顆粒法を用いて製造することができる。また、錠剤は前記顆粒剤をステアリン酸マグネシウムなどの薬剤学的に許容される適当な滑沢剤と混合した後、打錠機を用いて打錠することで製造することができる。
【００４６】
本発明の薬学組成物は、治療する疾患及び個体の状態に応じて経口剤、注射剤（例えば、筋肉注射、腹腔走査、静脈注射、注入、皮下注射、イムプラント）、吸入剤、鼻腔投与剤、膣剤、直腸投与剤、舌下剤、経皮剤、局所剤などに投与することができるが、これに限定されることはない。投与経路により、通常用いられて非毒性であり、且つ薬剤学的に許容される担体、添加剤、ビヒクルを含む適当な投与ユニット剤形に製剤化することができる。一定時間薬物を持続的に放出できるデポー（ｄｅｐｏｔ）剤形も本発明の範囲に含まれる。
【００４７】
さらに、本発明は前記化学式１で表れる２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩の炎症疾患治療または予防用途、すなわち前記化学式１で表れる２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩を含むことを特徴とする炎症疾患の治療または予防用組成物を提供する。より具体的に、本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩は胃炎、胃潰瘍、膵臓炎、大腸炎、関節炎、糖尿病、動脈硬化、腎臓炎、肝炎などの炎症疾患、及びアルツハイマー性痴呆、パーキンソン病、ルーゲーリック病などの退行性脳疾患で現われる炎症と細胞損傷の治療または予防のために用いることができるが、本発明による２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体及びこれの塩の用途は前述した具体的な疾患名に限定されることはない。
【００４８】
炎症疾患の治療のための使用にあたって、本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体は毎日約０．０１ｍｇ／ｋｇないし約１００ｇ／ｋｇ投与することができ、約０．１ｍｇ／ｋｇないし約１０ｇ／ｋｇの１日投与量が望ましい。しかし、前述した投与量は、患者の状態（年齢、性別、体重など）、治療している状態の深刻性、使われた化合物などによって多様である。必要に応じて、１日の総投与量を分け、一日数回に渡って投与することができる。
【００４９】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、化合物２が胃の粘膜損傷を誘発せず安全であることを示す実験結果である。胃粘膜の損傷程度を確認するために、直接薬物を容量別に経口投与した。比較群としてアスピリンを使用した。
【００５０】
図２は、胃粘膜の損傷程度を確認するために試料を表示された容量どおり経口投与した結果である。化合物１８は高容量を投与したにもかかわらず胃粘膜の損傷を誘発しなかった。比較群としてインドメタシン、イブプロフェン及びセレコキシブを使用した。
【００５１】
図３は、ヘリコバクターによって誘導される胃粘膜の損傷を用いた化合物２の細胞保護効果の評価結果である。培養されたＡＧＳ（ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）細胞にヘリコバクター（４３５０４、５×１０８ｃｆｕ／ｍｌ）を単独でまたは標識された濃度のサンプルと共に添加した。添加して２４時間後に、ＭＴＴ分析方法を用いて胃粘膜細胞の生存率を測定した。
【００５２】
図４は、ＮＳＡＩＤであるスリンダク（ｓｕｌｉｎｄａｃ）によって誘導される胃粘膜損傷を用いた化合物２の細胞保護効果の評価結果である。培養されたＡＧＳ細胞に１００ｕＭスリンダクを単独でまたは標識された濃度のサンプルと共に添加した。添加して１６時間後に、ＭＴＴ分析方法を用いて胃粘膜細胞の生存率を測定した。
【００５３】
図５は、酸化ストレスであるＨ２Ｏ２によって誘導される胃粘膜損傷を用いた化合物２の細胞保護効果の評価結果である。培養されたＡＧＳ細胞に１００ｕＭのＨ２Ｏ２を単独でまたは標識された濃度のサンプルと共に８時間処理した後、培養液でさらに洗滌した。２４時間後にＭＴＴ分析方法を用いて胃粘膜細胞の生存率を測定した。
【００５４】
図６は、アルコール（エタノール）によって誘導される胃粘膜損傷を用いた化合物２の細胞保護効果の評価結果である。培養されたＡＧＳ細胞に２５ｍＭのエタノールを単独でまたは標識された濃度のサンプルと共に２４時間処理した。その後、ＭＴＴ分析方法を用いて胃粘膜細胞の生存率を測定した。
【００５５】
図７は、ＴＮＦ‐α ｍＲＮＡの発現程度を示した写真である。培養されたＡＧＳ細胞に２５ｍＭのエタノールを単独でまたは標識された濃度の化合物２と共に２４時間処理した。その後、ｍＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲ法によって評価した。
【００５６】
図８は、アルコール／塩酸（ＥｔＯＨ／ＨＣｌ）によって誘導される胃腸管出血を用いた化合物２の保護効果を評価した結果である。Ａは正常マウスの胃の写真である。Ｂは２００〜２５０ｇのマウスを２４時間絶食させた後、６０％ ＥｔＯＨ／１５０ｍＭ ＨＣｌを経口投与して胃腸管出血を誘導した写真である。Ｃはアルコール／塩酸を投与する３０分前に化合物２で前処理し、胃腸管出血を起こして９０分後に胃を摘出して観察した写真である。Ｄは胃損傷の程度を観察するために損傷された面積を定量したグラフである。
【００５７】
図９は、アルコール性胃炎に対する化合物２の保護作用を評価した結果である。Ａは正常マウスの胃の写真である。Ｂは２５０ｇのマウスを２４時間絶食させた後、エタノール（４ｍｌ／ｋｇ）を経口投与して胃腸管出血を誘導した写真である。Ｃは化合物２を胃腸管出血誘導の１時間前に前処理した後、胃腸管出血を起こして９０分後に胃を摘出して観察した写真である。Ｄは胃損傷の程度を観察して定量したグラフである。
【００５８】
図１０は、ＮＳＡＩＤ誘導胃炎に対する化合物２の保護作用を示す写真である。２５０ｇのマウスを２４時間絶食させた後、インドメタシンを経口投与（Ａ及びＣ）すれば胃腸管出血が起きる。化合物２を１時間前に処理（Ｂ及びＤ）し、胃腸管出血を起こして６時間（Ａ及びＢ）または１２時間（Ｃ及びＤ）後に胃を摘出した写真である。
【００５９】
図１１は、関節炎動物モデルの１つであるカラゲナン（Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）によって誘導される温熱性痛覚過敏症（ｔｈｅｒｍａｌ ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ）を用いた化合物２の効果評価の結果である。２％カラゲナンをマウスの足部に皮内注射して温熱性痛覚過敏症を誘導した。化合物２は経口投与し、イブプロフェンを比較群として使用した。
【００６０】
図１２は、関節炎動物モデルの１つであるザイモサン（ｚｙｍｏｓａｎ）によって誘導されるＴＮＦ‐αの量を用いた化合物２の効果評価の結果である。１％ザイモサンをエアパウチで注入し、投与１時間の前に化合物２を容量別に単回経口投与した。４時間後に、エアパウチ滲出物からＴＮＦ‐αの量をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００６１】
図１３は、関節炎動物モデルのうちの１つであるザイモサンによって誘導されるＩＬ‐１αの量を化合物２が減少させる程度を示すグラフである。１％ザイモサンをエアパウチで注入し、投与１時間の前に化合物２を容量別に単回経口投与した。４時間後に、エアパウチ滲出物からＩＬ‐１αの量をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００６２】
図１４は、コラーゲンによって誘導される関節炎動物モデルを用いた効果評価の結果であり、コラーゲンによる足の浮腫を示す。
Ｓｈａｍ：正常マウス
Ｃｏｌｌａｇｅｎ：コラーゲンを注射したマウス
化合物１８：２５ｍｇ／ｋｇの化合物１８を腹腔注射したマウス
図１５は、コラーゲンによって誘導される関節炎動物モデルを用いた効果評価の結果である。コラーゲン投与後、２５ｍｇ／ｋｇの化合物２、３または１８及び対照群であるメトトレキサート（ＭＴＸ、１ｍｇ／ｋｇ／ｗｅｅｋ）を腹腔注射した。その後、４週間目視で観察した結果を関節炎指数として評価した。
【００６３】
図１６は、コラーゲンによって誘導される関節炎動物モデルを用いた化合物６及び１１の効果評価の結果である。コラーゲンを２週間隔で２回皮内注射し、１週間後に化合物６、化合物１１、及び対照群であるメトトレキサートを腹腔注射した。その後、２〜３週間毎日観察した結果を関節炎指数として評価した。
【００６４】
図１７は、炎症性腸疾患動物モデルである５％デキストラン硫酸ナトリウム（Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ、ＤＳＳ）モデルを用いた効果評価の結果である。ＤＳＳを処理した後、１０％ビヒクルに懸濁して１０、２５、５０ｍｇ／ｋｇの化合物１８を経口投与した。Ｓｈａｍは正常マウスの大腸であり、ＤＳＳは５％ＤＳＳを処理したマウスの大腸である。その他は各容量の化合物１８を投与したマウスの大腸写真である。
【００６５】
図１８及び１９は、図１７の結果を定量化したグラフである。図１８は大腸の長さであり、図１９は大腸の広さである。
【００６６】
図２０は、ＤＳＳを用いた化合物１８の効果評価の結果である。ＤＳＳを処理した後、１０％ビヒクルに懸濁して化合物１８（２５ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。その後、大腸の損傷による血便、下痢、及び汚ない程度を点数に換算して示した。
【００６７】
図２１は、セルレイン（ｃｅｒｕｌｅｉｎ）によって誘導される急性膵臓炎モデルを用いた効果評価の結果である。５０μｇ／ｋｇのセルレインを投与して２時間が経過した後、ＬＰＳを投与して浮腫を誘発した。Ａ−Ｃは写真結果であり、Ｄは膵臓の重さを測定して示したグラフである。
Ａ：正常マウス
Ｂ：セルレインを投与したマウス
Ｃ：化合物１８（２５ｍｇ／ｋｇ）を投与したマウス
図２２は、セルレインによって誘導される急性膵臓炎モデルを用いた効果評価の結果である。５０μｇ／ｋｇのセルレインを投与して２時間が経過した後、ＬＰＳを投与して浮腫を誘発した。２５ｍｇ／ｋｇの化合物１８を投与し、膵臓消化酵素であるアミラーゼとリパーゼの変化を定量化して示した。
【００６８】
図２３及び図２４は、セルレインによって誘導される膵臓炎モデルを用いた評価結果である。本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体が炎症マーカーであるＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１β及びＰＧＥ２に及ぼす影響を評価した。
【００６９】
図２５は、１０．５ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウス（Ｔｇ＋）の脳でＥＬＩＳＡ法を用いてＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１βまたはＩＬ−６の量を測定したグラフである。３ヶ月から７ヶ月の間、化合物２（２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）あるいはイブプロフェン（６２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を飼料に混合して長期投与した。
【００７０】
図２６は、脳血管障壁に対する化合物２の保護効果を示す写真（低倍率と高配率）である。
Ａ：正常マウス
Ｂ／Ｆ：ＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウス
Ｃ／Ｇ：化合物２（２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）投与
Ｄ／Ｈ：イブプロフェン（６２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）投与
図２７は、１０．５ヶ月齢の正常マウス（Ａ）、１０．５ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウス（Ｂ、Ｔｇ＋）、３．５ヶ月から７ヶ月間化合物２（２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ、Ｃ）あるいはイブプロフェン（６２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄ、Ｄ）を飼料に混合して長期投与したＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスの脳で生成されたアミロイドプラークを測定した写真である。チオフラビン（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ‐Ｓ）で免疫染色した。ＥはＡ−Ｄの結果を定量化したグラフである。
【００７１】
図２８は、１０．５ヶ月齢の正常マウス、１０．５ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウス、３．５ヶ月から７ヶ月間化合物２（２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ）を飼料に混合して長期投与した１０．５ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスを用いて高架式十字迷路テストを行った結果である。それぞれの実験動物がｏｐｅｎ ａｒｍに留まる時間で効果を評価した。
【００７２】
図２９は、Ｇ９３Ａマウスで炎症のマーカーであるミクログリア活性を示す写真である。ＴＯＭＡＴＯレクチンで免疫染色した。
Ａ：正常マウス
Ｂ：Ｇ９３Ａマウス
Ｃ：５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ化合物２投与群
図３０は、Ｇ９３Ａマウスで炎症の一マーカーである炎症性サイトカイン（ＴＮＦ‐αとＩＬ‐１β）のｍＲＮＡレベルを示す結果である。ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）が使用された。
【００７３】
図３１は、パーキンソン病の動物モデルで炎症に対する化合物２の抑制効果を示した写真である。ＣＤ１１ｂで免疫染色した。
Ａ：ＭＰＴＰを投与したマウス
Ｂ：５０ｍｇ／ｋｇ／ｄの化合物２投与群
図３２は、本発明による幾つかの２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体化合物の単回投与毒性実験の結果である。
【００７４】
〔発明を実施するための最良の形態〕
以下、本発明をより具体的に説明するために実施例などを挙げて説明する。しかし、本発明による実施例は多くの他の形態に変形することができ、本発明の範囲が後述する実施例に限定されると解釈されてはならない。本発明の実施例は、本発明の具体的理解を助けるために例示的に提供されるものである。
【００７５】
＜合成例１＞２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（化合物２）の製造
５‐アミノサリチル酸（０．５１ｇ、３．９０ｍｍｏｌ）を常温窒素気流下でＮ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド（２０．０ｍｌ）に入れて撹拌させた。トリエチルアミン（０．５０ｍｌ）とヨウ化テトラブチルアンモニウム（１０．１ｍｇ）を入れた後、３０分間撹拌した。その後、１‐（２‐（ブロモエチル）‐４‐トリフルオロメチル）ベンゼンを添加し、常温で３時間撹拌した。反応を終結するために反応容器に氷を添加した。生成された結晶を濾過してアセトンとヘクサンを用いて撹拌させた後、再び濾過した。濾過された固体をエチルアセテートに溶かした後、０．５Ｎ塩酸と塩水で洗滌した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧蒸留して２‐ヒドロキシ‐５‐（４‐（トリフルオロメチル）ペニルエチルアミノ）安息香酸０．５４ｇ（２１％収率）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ‐ｄ６）：７．６２（ｄ，２Ｈ）、７．４８（ｄ，２Ｈ）、６．９８（ｄ，１Ｈ）、６．８８（ｑ，１Ｈ）、６．７６（ｄ，１Ｈ）、３．２４（ｔ，２Ｈ）、２．９１（ｔ，２Ｈ）
＜合成例２＞２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸カリウム塩の製造
前記合成例１で製造した２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（１０ｇ、３０．７ｍｍｏｌ）を無水エタノール（１００ｍｌ）に加えて５０℃まで加温して完全に溶解させた。その後、溶液を０℃に冷却した。８５％水酸化カリウム（２．０３ｇ、３０．７ｍｍｏｌ）と無水エタノール（２０ｍｌ）溶液を使ってｐＨを６．８〜７．０に調節した後、室温で２時間撹拌した。沈殿した結晶を濾過及び乾燥して目的とする化合物である２‐ヒドロキシ‐５‐（４‐（トリフルオロメチル）ペニルエチルアミノ）安息香酸カリウム塩（１０．４ｇ）を９３％の収率で得た。
【００７６】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ‐ｄ６）：７．６２（ｄ，２Ｈ）、７．４８（ｄ，２Ｈ）、６．９８（ｄ，１Ｈ）、６．９０（ｑ，１Ｈ）、６．８４（ｄ，１Ｈ）、３．２４（ｔ，２Ｈ）、２．９１（ｔ，２Ｈ）
＜合成例３＞２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐ニトロペニル）エチルアミノ］‐安息香酸の製造
５‐アミノサリチル酸（５００ｍｇ、３．２６ｍｍｏｌ）及び４‐ニトロペニルエチルブロマイド（９００ｍｇ、３．９２ｍｍｏｌ）を使って合成例１と同様の方法によって、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐ニトロペニル）エチルアミノ］‐安息香酸８９０ｍｇ（５０％収率）を淡い黄色固体相で得た。融点２３４〜２３６℃。
【００７７】
Ｃ１５Ｈ１４Ｎ２Ｏ５の元素分析
【００７８】
【表１】
【００７９】
＜合成例４＞２‐ヒドロキシ‐５‐［３‐（４‐ニトロペニル）‐ｎ‐プロピルアミノ］‐安息香酸の製造
５‐アミノサリチル酸（５００ｍｇ、３．２６ｍｍｏｌ）及び３‐（４‐ニトロペニル）プロピルブロマイド（９５０ｍｇ、３．９２ｍｍｏｌ）を使って合成例１と同様の方法により、２‐ヒドロキシ‐５‐［３‐（４‐ニトロペニル）‐ｎ‐プロピルアミノ］‐安息香酸５２０ｍｇ（５０％収率）を淡い黄色固体相で得た。融点２２９〜２３１℃。
Ｃ１６Ｈ１６Ｎ２Ｏ５の元素分析
【００８０】
【表２】
【００８１】
＜合成例５＞
他の化合物も前記合成例１と同様の方法で製造し、分析結果を下記表３にまとめて示した。
【００８２】
【表３】
【００８３】
＜合成例６＞２‐アセトキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（化合物１８）の製造
化合物１８を下記反応式によって製造した。
【００８４】
＜反応式５＞
【００８５】
【化７】
【００８６】
化合物ａ：化合物２（５０．０ｇ、１５４ｍｍｏｌ）の２００ｍＬ Ｈ２Ｏ：１，４‐ジオキサン（１：１）混合溶液にＮａ２ＣＯ３（３２．６ｇ、３０７ｍｍｏｌ）とジ‐ｔｅｒｔ‐ブチルジカボネイト（４０．３ｇ、１８５ｍｍｏｌ）を室温で添加した。８時間撹拌した後、ジ‐ｔｅｒｔ‐ブチルジカボネイト（１６．８ｇ、７６．９ｍｍｏｌ）をさらに添加した。室温で８時間再び撹拌した後、反応混合物は２Ｎ ＨＣｌで中和（ｐＨ 〜６）した。生成混合物はエチルアセテート（２００ｍＬ、２回）で抽出した。有機相を混合し、塩水（１００ｍＬ）で洗滌してＭｇＳＯ４で乾燥した後、濾過した。結果として、黄色い泡沫状の濃縮物である化合物２１を得、追加精製なく粗化合物ａが後続する反応に使われた。
【００８７】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１０．５２（１Ｈ，ｂｒ Ｓ）、７．５３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ）、７．５３（ｂｒ，１Ｈ）、７．２８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ）、７．２６（ｂｒ，１Ｈ）、６．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、２．９４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、１．４３（ｂｒ ｓ，９Ｈ）
化合物ｂ：化合物ａのジクロロメタン（２００ｍＬ）溶液にＮ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミン（８０．３ｍＬ、４６１ｍｍｏｌ）と塩化アセチル（２１．９ｍＬ、３０７ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合物は室温まで加温し、５時間撹拌した。１Ｎ ＨＣｌ（１００ｍＬ）水溶液を反応混合物に添加した。反応物は層に分離され、水層はジクロロメタン（１００ｍＬ）で抽出した。有機相を混合して塩水（１００ｍＬ）で洗滌し、ＭｇＳＯ４で乾燥して濾過した後、濃縮した。粗生成物をジエチルエーテルで再結晶して白い固体相の化合物２２（５１．５ｇ、７１．７％）を生成した。
【００８８】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．８２（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、７．５４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ）、７．３８−７．２４（ｍ，１Ｈ）、７．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ）、７．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）、３．９１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、２．９８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、２．３４（ｓ，３Ｈ）、１．４２（ｂｒ ｓ，９Ｈ）
化合物１８：化合物ｂ（５１．５ｇ、１１０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２００ｍＬ）溶液を０℃で４Ｎ ＨＣｌの１，４‐ジオキサン溶液（２００ｍＬ）で処理した。反応混合物は室温まで加温された。５時間撹拌した後、懸濁液は濃縮した。残渣はジエチルエーテル（５００ｍＬ）で粉砕（ｔｒｉｔｕｒａｔｅ）した。ジクロロメタン（５００ｍＬ）とジエチルエーテル（５００ｍＬ）を用いて濾過及び洗滌し、白い固体相の化合物１８（４６．０ｇ、８２．５ｍｍｏｌ、９２．３％）を得た。
【００８９】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ‐ｄ６）７．６６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）、７．５２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）、７．１５（ｓ，１Ｈ）、６．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）、６．８５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）、３．３２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）、２．９５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）、２．１８（ｓ，３Ｈ））；ＬＣＭＳ ｃａｌｃ．ｆｏｒ Ｃ１８Ｈ１６Ｆ３ＮＯ４（Ｍ＋Ｈ＋）：３６８、ｆｏｕｎｄ ３６８．
＜実施例１＞細胞における抗炎症効果の評価
１−１．ＮＯ生成阻害効果
炎症反応に関与する炎症性因子であるＮＯに対する本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体の阻害効果を評価した。ＢＶ２ ミクログリア細胞株にバクテリアトキシン炎症誘発物質であるリポ多糖体（ＬＰＳ）と本発明の化合物をそれぞれ１０ｕＭ、３０ｕＭ、または１００ｕＭずつ同時に処理して２４時間培養した。その後、培養液５０ｕｌを９６ウェルプレートに採り、グリーズ試薬（Ｇｒｉｅｓｓ ｒｅａｇｅｎｔ）を５０ｕｌずつ加えて１０分間室温で反応させた。その後、ＥＬＩＳＡリーダーで５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。各化合物のＢＶ２細胞株から出たＩＣ５０の結果は、下記表４に「ＮＯ ｉｎ ＢＶ」の欄に示した。
【００９０】
下記表４の結果から分かるように、「ＮＯ ｉｎ ＢＶ」のうち化合物９のＩＣ５０は１．７９ｕＭであり、化合物１４のＩＣ５０は６．７ｕＭであって最も高い水準のＩＣ５０値を示した。ＮＯ生成に対する減少効果をＩＣ５０値で示したとき、大半の化合物が１００ｕＭより小さい値を持つことを確認することができた。このように本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体は、炎症反応に関与するＮＯ活性を効果的に阻害するため、抗炎症剤として非常に有効である。
【００９１】
１−２．遺伝子発現抑制効果
ＢＶ２細胞株で２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体の濃度別ｉＮＯＳ遺伝子の発現を観察した。ＢＶ２細胞株を１×１０６個になるように１００ｍｍディッシュに接種し、炎症誘導物質であるＬＰＳと２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体をそれぞれ１〜１００ｕＭ濃度範囲で一定濃度間隔で同時に処理した。２４時間培養した後、ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡは逆転写酵素反応（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）及び重合酵素反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った後、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１β、及びｉＮＯＳ遺伝子の発現様相を比べた。その結果を下記表４にまとめて示した。
【００９２】
下記表４に示されたように、炎症性サイトカインの遺伝子発現様相を対照群（ＬＰＳ処理群）と比べた結果、ＴＮＦ‐α遺伝子の発現は化合物２が６３．２４％減少させ、化合物８が７７．０５％減少させ、化合物９が６１．６７％減少させた。また、ＩＬ‐１β遺伝子の発現は化合物２が７５．１％、化合物５が６７．７％、化合物８、９、１０、及び１４がそれぞれ５０％以上減少させる様相を確認した。さらに、化合物２、５、８、１０、１５、及び１７はｉＮＯＳ遺伝子の発現を５０％以上抑制した。
【００９３】
【表４】
【００９４】
前記表４において、「ＮＤ」は測定されなかった（ｎｏｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）ことを意味する。
【００９５】
１‐３．サイトカインの生成抑制効果
ＢＶ２細胞株で２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体のサイトカイン生成の抑制効果を観察した。ＢＶ２細胞株を１×１０６個になるように２４ウェルプレートに接種し、炎症誘導物質であるＬＰＳとそれぞれ１００ｕＭの２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体または比較薬物とを同時に処理した。２４時間培養した後、培養液を採った。培養液はＥＬＩＳＡ法により、サイトカインであるＴＮＦ‐αとＩＬ‐６の量を測定した。その結果を下記表５にまとめて示した。
【００９６】
下記表５に示されたように、ＬＰＳによって生成されたＴＮＦ‐αの量を対照群（ＬＰＳ処理群）と比べた結果、化合物２が６２．２６％減少させ、化合物３が３１．９０％減少させ、化合物１４が６２．６％減少させる様相を確認した。また、比較薬物として使ったイブプロフェンとアスピリンは同じ濃度で減少効果を示さなかった。同様に、ＩＬ‐６の量も化合物２は明らかな減少効果を見せたが、比較群であるイブプロフェンとアスピリンはほとんど減少効果を見せなかった。
【００９７】
【表５】
【００９８】
前記表５において、「ＮＤ」は測定されなかった（ｎｏｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）ことを意味する。
【００９９】
＜実施例２＞基礎毒性評価
２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体化合物の単回毒性を評価し、その結果を図３２に示した。
【０１００】
図３２に示されたように、本発明の望ましい化合物２及び１８のＬＤ５０は３ｇ／ｋｇ以上と安全性が良好であると示された。しかし、化合物１９のＬＤ５０は０．５〜１ｇ／ｋｇと相対的に安全性が落ちている。また、化合物４は、抗炎症などの効果評価においては卓越な効果を見せたが、毒性実験の結果、３ｇ／ｋｇで急に動物群が死亡して濃度依存的な結果が得られなかった。さらに、化合物３及び１４は、化合物２と類似の構造を持ち抗炎症効果が類似したものの、毒性実験の結果、濃度依存的ではないか又は毒性が強く治療剤としては相対的に望ましくなかった。
【０１０１】
＜実施例３＞胃粘膜損傷の誘発可否に対する安全性評価
従来のＮＳＡＩＤ系消炎剤は胃粘膜損傷を起こす副作用があったため、抗炎症効果のある化合物２も胃粘膜損傷を誘発するか否かを実験した。比較群として３０、１００、及び３００ｍｇ／ｋｇのアスピリンを経口投与したときに発生する胃粘膜損傷を用いた。本発明による一実施例である化合物２は、かなり多い容量である１０００ｍｇ／ｋｇの経口投与群でも胃粘膜損傷を誘発せず、本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体は非常に安全であることが分かった（図１）。
【０１０２】
また、他のＮＳＡＩＤ系消炎剤であるインドメタシンとイブプロフェン、及び選択的ＣＯＸ‐２抑制剤であるセレコキシブを対照群として経口投与し、化合物１８の安全性を比較実験した。化合物１８を高容量で経口投与したが、胃粘膜損傷を誘発しなかった（図２）。
【０１０３】
＜実施例４＞細胞保護効果の評価
本発明による一実施例である２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体の細胞保護効果を評価した。ＡＧＳ細胞株（ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ）を９６ウェルプレートに１×１０５個接種した。その後、それぞれにヘリコバクターを２４時間処理（図３）、スリンダク（ｓｕｌｉｎｄｏｃ）を１６時間処理（図４）、Ｈ２Ｏ２を８時間処理（図５）、またはエタノールを２４時間処理（図６）して胃粘膜細胞の死滅を誘導した。また、一部ＡＧＳ細胞株には、本発明の一実施例である化合物２をそれぞれ１０ｕＭ、３０ｕＭ、または１００ｕＭずつ同時に処理して２４時間培養した。ＭＴＴ溶液をそれぞれのウェルに添加した後、４時間３７℃で反応させた。その後、ＥＬＩＳＡリーダーで５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、胃粘膜細胞の生存率を計算した。その結果、１ｕＭ及び１０ｕＭの化合物２では５０％以上の細胞保護効果を見せ、１００ｕＭの化合物２は大半の細胞死滅モデルで７０％以上の細胞保護効果を見せた。
【０１０４】
また、炎症の一マーカーとして、サイトカインの１つであるＴＮＦ‐αのｍＲＮＡの発現程度をＲＴ−ＰＣＲ法を用いて評価した。エタノールを２４時間処理したサンプルを用いて評価した。１〜１００ｕＭの化合物２は、ＴＮＦ‐αのｍＲＮＡ発現をほとんど完全に抑制した（図７）。
【０１０５】
このような結果から、本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体が炎症疾患、特にさまざまな原因による胃炎で細胞保護及び炎症抑制に有効であることを確認することができる。特に、本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体は、炎症疾患治療剤として知られたムコスタ（ｍｕｃｏｓｔａ）及びＰＰＩより優れた効果を示した。
【０１０６】
＜実施例５＞胃腸管出血の防御効果
５−１．アルコール及び塩酸誘導胃炎
本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体がアルコール及び塩酸誘導胃炎に及ぶ効果を評価した。２００〜２５０ｇの雄ＳＤマウスを２４時間絶食させた後、６０％ ＥｔＯＨ／１５０ｍＭ ＨＣｌを経口投与して胃腸管出血を誘導した。胃腸管出血の３０分前に容量別に化合物２を経口投与し、胃腸管出血の９０分後に胃を摘出して胃損傷の程度を観察した。その結果、本発明による一実施例である化合物２は胃腸管出血を防御し、毒性もなかった。その結果を図８にまとめて示した。
【０１０７】
５‐２．アルコール性胃炎
本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体がアルコール性胃炎に及ぼす効果を評価した。２５０ｇのマウスを２４時間絶食させた後、アルコールを経口投与すれば胃腸管出血が起きるが（Ｂ）、化合物２を１時間前に前処理する場合（Ｃ）胃の出血が著しく減少した。その結果を図９のＤに数値化して示した。このような結果から、本発明の化合物２はアルコール性胃炎に強力な保護作用を示すと言える。
【０１０８】
アルコール性胃炎は胃酸分泌抑制剤や胃防御因子増強剤でも予防及び治療効果が容易には現れないため、アルコール性胃炎は他の原因による胃炎より治療効果を期待し難い。これは、アルコールが直接的毒性及び炎症媒介、出血誘導などの形態で病気を誘発するためである。本発明による一実施例である化合物２が、このようなアルコールの直接的毒性を著しく減少させると考えられる。
【０１０９】
５‐３．ＮＳＡＩＤ誘導胃炎
本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体が、ＮＳＡＩＤ誘導胃炎に及ぼす効果を評価した。ＮＳＡＩＤであるインドメタシンを６時間投与し胃損傷を弱く誘発させたモデル（図１０のＡ）、及びインドメタシンを１２時間投与してかなりの胃損傷を誘発させたモデル（図１０のＣ）で、化合物２は卓越な胃保護効能を見せた（図１０のＢ及びＤ）。
【０１１０】
＜実施例６＞関節炎動物モデルにおける薬効評価
６−１．カラゲナン誘導炎症モデル：鎮痛効果の評価
本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体の一例である化合物２が持つ関節炎モデルにおける鎮痛効能を評価した。２％カラゲナンを白いマウスの左側足部に注射した後、３〜３００ｍｇ／ｋｇの化合物２を経口投与してカラゲナンによって誘導される関節炎モデルにおける温熱性痛覚過敏症に及ぼす化合物２の影響を観察した。その結果を図１０に示した。
【０１１１】
化合物２は濃度依存的に温熱性痛覚過敏症を減少させた。３００ｍｇ／ｋｇの化合物２は温熱性痛覚過敏症を９０％以上減少させた。また、抗炎症剤として知られているイブプロフェン５０ｍｇ／ｋｇと同じ程度の抑制効果を化合物２を１００ｍｇ投与した群で観察することができた。
【０１１２】
６−２．ザイモサン誘導炎症モデル：サイトカイン評価
ザイモサンを用いて本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体の一例である化合物２が持つ関節炎モデルにおける抗炎症効能を評価した。１％ザイモサン０．５ｍｌをエアパウチ内に注入し、ザイモサン投与の１時間前に３〜３００ｍｇ／ｋｇの化合物２を単回投与した。４時間後に関節炎の主な症状である浮腫と病因であるサイトカインの濃度を観察した。その結果、化合物２は３０ｍｇ／ｋｇから対照群に比べてＴＮＦ‐αの量を減少させる効果を示し、３００ｍｇ／ｋｇまで濃度依存的に減少させた。比較群として炎症疾患治療剤で知られているイブプロフェン（５０ｍｇ／ｋｇ）を使った（図１２）。ＩＬ‐１αも同様に濃度依存的に減少した（図１３）。このような結果から本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体は、炎症疾患、特に関節炎に効果があることを把握することができる。
【０１１３】
６−３．コラーゲン誘導関節炎動物モデルの評価
本発明による一実施例である２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体の有効性を評価するために、リュウマチ性関節炎動物モデルであるコラーゲン誘導関節炎モデルを使った。Ｂｏｖｉｎｅ ｔｙｐｅ ＩＩコラーゲンをｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔと混ぜて乳剤を製造した。８〜１０週のＤＢＡ／１ＬａｃＪマウスのしっぽの基始部に前記乳剤を皮内注射した。２週後に同様の方法で皮内注射した。２次コラーゲン皮内注射の１週間後、腹腔に化合物２、３、及び１８を２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、比較群としてメトトレキサート１ｍｇ／ｋｇ／ｗｅｅｋを注射し、対照群として１０％ビヒクルを注射した（図１５）。図１４に、正常マウス（ｓｈａｍ）、コラーゲンを投与したマウス（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、及び化合物１８を投与したマウス（化合物１８、化合物１８を２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ注射）の足浮腫を撮影した写真を示した。
【０１１４】
また、腹腔に２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体のうち化合物６と化合物１１を５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、比較群としてメトトレキサート５ｍｇ／ｋｇ／２ｄａｙを注射した。対照群としてリン酸緩衝生理食塩水を注射した（図１６）。２〜３週間関節炎の発生程度を毎日観察し、その結果を浮腫による下記関節炎指数（ａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｉｎｄｅｘ）で評価した。関節炎指数で評価した結果、化合物２、３、１８、及び化合物６、１１は明らかな減少効果を見せた（図１５及び１６）。
【０１１５】
−関節炎指数−
４本の足を０〜４点で評価、総１６点
０点−正常
１点−足根骨に限られた軽い浮腫と発赤
２点−足首関節から足根骨にわたる軽い浮腫と発赤
３点−足首関節から中足骨にわたる中程度の浮腫と発赤
４点−足首関節から足指全体にわたる浮腫と発赤
＜実施例７＞炎症性腸疾患動物モデルにおける薬効の評価
炎症性腸疾患モデルとして５％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）モデルを使用した。５％ＤＳＳを飲み水に混ぜて経口投与した。５％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）モデルは上皮細胞に損傷を誘発し、主に左側大腸の潰瘍と大腸長さの縮小などが観察される。このようなモデルは投与容量に応じて一定程度の炎症が誘発される比較的簡単且つ再現性の高いモデルである。したがって、新しい薬剤の効能評価に多く使用される。
【０１１６】
ＤＳＳを飲み水ボトルに刺しておき、攝取させ続けた。本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体化合物は１０％ビヒクルで懸濁して経口投与した。
【０１１７】
ＤＳＳを処理した結果、大腸の長さと幅が変化した。化合物１８を処理した群では有意義に大腸の長さと幅が変化した（図１７、１８及び１９）。この結果は、大腸炎モデルにおける本発明の化合物が防御効果を奏することを示す。
【０１１８】
また、排泄物状態として血便、肛門の汚ない程度、及び下痢を毎日測定した。スルファサラジンと化合物１８の両方ともＤＳＳ処理群に比べ、排泄物スコアが有意義に減少した（図２０）。
【０１１９】
＜実施例８＞急性膵臓炎動物モデルにおける薬効の評価
急性膵臓炎モデルとして、セルレイン誘導膵臓炎モデルを使用した。セルレインはコレシストキニンの類似体であって、膵臓で膵臓消化酵素の分泌を誘発するホルモンである。腹腔注射でセルレイン（５０μｇ／ｋｇ）を投与することで膵臓に消化酵素を過度に分泌させた。２時間が経過した後、ＬＰＳを投与することで浮腫を誘発させた。セルレイン投与時、脾臓を基準にして全体的に浮腫が過度に起きたことが観察された。また、２５ｍｇ／ｋｇの化合物１８を投与したとき、その浮腫を減少させることを確認することができた（図２１）。図２１のＤは、このような浮腫によって増加する膵臓の重さを測定した結果である。化合物１８の投与群は、膵臓の重さを有意義に減少させることを確認することができる。
【０１２０】
図２２は、膵臓消化酵素であるアミラーゼとリパーゼの血漿内の濃度を測定したものである。上記のモデルでは、消化酵素が過度に増加して血液に放出される。結局、血液内の消化酵素の増加を抑制させるということは膵臓炎を低減させたことの間接的な証拠になる。図２２は、アミラーゼとリパーゼが前記膵臓炎動物モデルにおける血漿で増加し、また２５ｍｇ／ｋｇの化合物１８を投与したとき、このような増加を有意義に減少させたことを示す。
【０１２１】
炎症の防御効果を確認するために、炎症性サイトカインであるＴＮＦ‐αとＩＬ‐１βの量を測定した。炎症酵素であるＣＯＸ‐２の生成物であるＰＧＥ２をＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。膵臓炎モデルで炎症マーカーとして使用したＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１β、及びＰＧＥ２が全て過度に増加したことを確認することができ、化合物１８がこのような炎症マーカーを有意義に減少させることを確認することができた（図２３及び２４）。
【０１２２】
＜実施例９＞ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ｄｅｌｔａＥ９二重遺伝子組み換え痴呆マウスにおける化合物２の薬効評価
９−１．ＥＬＩＳＡ分析によるサイトカインの減少効果
３．５ヶ月から１０．５ヶ月までのＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスに、化合物２を２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙあるいはイブプロフェン６２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを飼料に混合して長期投与した。総７ヶ月間薬物を投与した後、ＥＬＩＳＡを通じてＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１β、及びＩＬ‐６の量を定量的に分析した（ｍｅａｎ±ＳＥＭ、ｎ＝３−５）。図２５において「＊」は、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ ｔｅｓｔによる一元変量分析（Ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）時、一般飼料のみを供給したＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスに比べてｐ＜０．０５の有意差を見せることを示す。
【０１２３】
実験結果、化合物２の投与群はＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスに比べてＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１β、及びＩＬ‐６の量全てが有意義に減少した（図２５）。
【０１２４】
９−２．脳血管障壁に対する化合物２の保護効果
アルツハイマー病で脳血管損傷が発生することは広く知られている。脳血管障壁の損傷に対する化合物２と比較群であるイブプロフェンの効果を評価した。５ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスに２％ Ｅｖａｎｓ ｂｌｕｅ ｄｙｅ ３ｍｌ／ｇを血管に注入した。薬物は、生後２ヶ月から５ヶ月まで化合物２（２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）または比較薬物であるイブプロフェン（６２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を飼料に混合して投与した。その結果、図２６のＢと図２６のＦのように、正常マウスに比べてｃｏｒｔｅｘ、ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ、及びｔｈａｌａｍｕｓでＥｖａｎｓ ｂｌｕｅ ｄｙｅの透過度が増加することを確認することができた。また、図２６に示されたように、化合物２の投与群（図２６のＣ及びＧ）及びイブプロフェンの投与群（図２６のＤ及びＨ）で脳血管障壁の保護効果を確認することができた。
【０１２５】
９−３．チオフラビン色素染色法（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ‐Ｓ ｓｔａｉｎ）を用いた化合物２のアミロイドプラーク減少効果
チオフラビン色素染色法を用いて本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体が痴呆に及ぼす影響を評価した。総７ヶ月間（３．５〜１０．５ヶ月齢ＡＰＰ／ＰＳ１）化合物２を２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙずつ投与した。化合物２の投与群は一般飼料のみを供給したＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスに比べてアミロイドプラークの量が約５３％減少した（図２７）。また、総４ヶ月間（８．５〜１２．５ヶ月齢ＡＰＰ／ＰＳ１）化合物１を２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与した群は、一般飼料のみを供給したＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスに比べてアミロイドプラークの量が約４９．３％減少した。
【０１２６】
９−４．高架式十字迷路の遂行能力評価による化合物２の行動改善効果
３．５ヶ月から１０．５ヶ月までのＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスに化合物２を２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ飼料に混合して長期投与した。総７ヶ月間薬物を投与した後、行動改善効果を検証するために高架式十字迷路テストを行った。高架式十字迷路は２つのｏｐｅｎ ａｒｍｓ（３０ｃｍ×６ｃｍ×０．５ｃｍ）と２つのｃｌｏｓｅｄ ａｒｍｓ（３０ｃｍ×６ｃｍ×１５ｃｍ）で構成され、６ｃｍ×６ｃｍのｃｅｎｔｅｒ ｐｌａｔｆｏｒｍがある。高架式十字迷路テストにおいて、中央地点にｏｐｅｎ ａｒｍｓに向かって慎重にマウスをおいた後、５分間実験動物がｏｐｅｎ ａｒｍに留まる時間を測定して分析した（ｍｅａｎ±ＳＥＭ、ｎ＝３−５）。図２８において「＊」は、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ ｔｅｓｔによる一元変量分析時、ＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスに比べてｐ＜０．０５の有意差を見せることを示す。
【０１２７】
その結果、７ヶ月間薬物を投与した後、１０．５ヶ月齢の一般飼料のみを提供したＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスと比べたところ、化合物２の投与群はｏｐｅｎ ａｒｍに留まる時間がさらに短いことが確認できた（図２８）。
【０１２８】
＜実施例１０＞Ｇ９３Ａ ＡＬＳ動物モデルにおける化合物２の薬効評価
１０−１．ミクログリア活性化の減少効果
退行性脳疾患の１つであるＡＬＳ（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）における薬物効果を測定するために、実際患者と類似の病理的特徴を持つ形質組み替え動物モデルＧ９３Ａ（Ｇｌｙｃｉｎｅ⇒Ａｌａｎｉｎｅ）マウスを用いた。
【０１２９】
ＴＯＭＡＴＯ Ｌｅｃｔｉｎ ｄｙｅ染色を通じてＧ９３Ａマウスの脊髄前角内に発現されるミクログリア（脳疾患モデルにおける炎症の１つのマーカー）の活性化程度を確認した。Ｇ９３Ａマウスは正常マウスに比べて観察されるミクログリアの活性化程度が著しく増加した。また、５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの化合物２を投与したとき、活性化されたミクログリアを減少させることが確認できた（図２９）。
【０１３０】
１０−２．サイトカインの発現減少効果
一般飼料のみを提供した１６週齢のＧ９３Ａマウス及び５ｍｇ／ｋｇ／ｄの化合物２投与群の脊髄部位を摘出した。ＲＮＡを分離した後、ＲＴ−ＰＣＲを通じて炎症性サイトカインであるＴＮＦ‐α及びＩＬ‐１β ｍＲＮＡの発現程度を確認した。その結果、化合物２の投与群は炎症性サイトカインを有効に減らすことが観察できた（図３０）。
【０１３１】
＜実施例１２＞パーキンソン病動物モデルにおける化合物２の薬効評価
Ｃ５７／ＢＬ６マウス（雄／８週齢）にＭＰＴＰ（４０ｍｇ／ｋｇ）のみを皮下注射するか、またはＭＰＴＰを注射する３０分前から化合物２を５０ｍｇ／ｋｇずつ毎日腹腔注射した。２日後に脳組織を摘出した。脳組織をＣＤ１１ｂ免疫染色し、反応させた後、ＤＡＢ（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）で発色させた。光学顕微鏡でミクログリア（脳疾患モデルにおける炎症の１つのマーカー）の活性化程度を観察した（図３１）。
【０１３２】
その結果、ＭＰＴＰによって誘導されるミクログリアの活性が化合物２の投与によって減少することが分かった。
【０１３３】
以下、本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩が適用され得る炎症疾患の具体的な例についてより詳細に説明する。下記の適用例は、本発明を例示するものにすぎず、本発明の範囲が下記の適用例に限定されることはない。本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、多様な炎症疾患の治療または予防に有効に使用することができる。
【０１３４】
＜適用例１＞胃炎
本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体は、細胞培養実験によってアルコール誘導、ヘリコバクター・ピロリ誘導、ＮＳＡＩＤ誘導、及びＨ２Ｏ２誘導された細胞の死滅を効果的に防止した。本発明の化合物の効果は従来の胃炎などの細胞防御効果を持つ薬物であるムコスタまたはＰＰＩに比べて卓越であった。また、本発明の化合物は動物モデルにおける実験結果から、アルコール誘導による胃炎などの治療に優れた効果を示し、消炎鎮痛剤として使われているＮＳＡＩＤによる胃炎を緩和した。アスピリンと比較実験した結果、アスピリンよりさらに高容量を投与したマウスの胃で出血を誘導せず、安全性が確保された。したがって、本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体は胃炎の治療及び予防に非常に有効である。
【０１３５】
＜適用例２＞大腸炎（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｌ Ｄｉｓｅａｓｅ、ＩＢＤ）
シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）の産物であるプロスタグランジンとリポオキシゲナーゼの産物であるロイコトリエン（ＬＴＢ４）は、潰瘍性大腸炎のような炎症性疾患の炎症反応で重要な役割を占めると知られている。５‐リポオキシゲナーゼ（５‐ＬＯＸ）の抑制剤であるジレウトン（ｚｉｌｅｕｔｏｎ）とＮＳＡＩＤであるスルファサラジンは、腸損傷動物モデルにおける炎症の程度を現わす指標として使われるＭＰＯ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）の活性を減少させた（Ｓｉｎｇｈ ＶＰ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ．２００４；４２（７）：６６７−７３）。また、ＣＯＸ‐２選択的抑制剤であるニメスリド（ｎｉｍｅｓｕｌｉｄｅ）は、２つの異なる（酢酸誘導及びＬＴＢ４誘導ＩＢＤ）腸損傷動物モデルにおいて保護効果を見せた。ニメスリドは炎症反応においてＭＰＯ活性を著しく抑制した（Ｓｉｎｇｈ ＶＰ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ Ｏｔｈｅｒ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｄｉａｔ．２００３；７１（３−４）：１６３−７５）。したがって、抗炎症効果のある本発明の化合物は大腸炎の治療に非常に有効に利用することができる。
【０１３６】
＜適用例３＞リュウマチ性関節炎
本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体は、コラーゲン誘導関節炎モデルにおいて従来関節炎治療剤として処方されているが副作用のあるメトトレキサートに比べ、ほぼ同じかまたは多少優れた効果を見せた。また、本発明の化合物はカラゲナン誘導痛覚過敏症に対する鎮痛緩和効果及びザイモサン誘導炎症性サイトカインの生成を抑制した。したがって、本発明の化合物は従来の炎症治療剤として使われる薬物と同等の効能を持ちながらも、安全性が確保されたリュウマチ性関節炎治療剤として使用することができる。
【０１３７】
＜適用例４＞膵臓炎
急性膵臓炎は、膵液の消化酵素または胆石症による胆汁が膵臓内に逆流して膵臓組織を自己消化して生じる炎症である。少しの浮腫からひどい出血まで多様な症状を現わし、これにより膵臓のさまざまな損傷をもたらす。膵臓炎は炎症と関連があるという報告が数多くあり、ＣＯＸ抑制剤による膵臓炎モデルの保護効果、及び炎症マーカーであるＴＮＦ‐α及びプロスタグランジン生成の抑制効果が報告された（Ｓｏｎｇ ＡＭ ｅｔ ａｌ．、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００２；２８３（５）：Ｇ１１６６−７４）。本発明の化合物は膵臓炎の治療に非常に有効に利用することができる。
【０１３８】
＜適用例５＞糖尿病性炎症及び痛症
第２型糖尿病で抗炎症及び鎮痛の役割が重要視されている。さらに、抗炎症効果を持っている多くの治療剤が、第２型糖尿病の兆候を減少させるか又は発病時点を遅らせるという証拠が報告されている（Ｄｅａｎｓ ＫＡ ｅｔ ａｌ．、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｔｈｅｒ．２００６；８（１）：１８−２７）。抗炎症化合物であるリソフィリン（ｌｉｓｏｆｙｌｌｉｎｅ）は、ストレプトゾトシン投与マウスにおいてＩＦＮ‐γとＴＮＦ‐αを抑制することで糖尿の症状を５０％以上減少させた（Ｙａｎｇ Ｚ ｅｔ ａｌ．、Ｐａｎｃｒｅａｓ．２００３；２６（４）：ｅ９９−１０４）。したがって、抗炎症効果のある本発明の化合物は糖尿病性炎症及び痛症の治療及び／または予防に非常に有効に利用することができる。
【０１３９】
＜適用例６＞動脈硬化
アポリポタンパク質Ｅ‐欠乏（ａｐｏＥ（−／−））マウスの初期アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｌｅｓｉｏｎ）において、選択的なＣＯＸ‐２抑制剤（例えば、ロフェコキシブ及びＮＳ‐３９８）と非選択的なＣＯＸ抑制剤（例えば、インドメタシン）はアテローム性動脈硬化症をそれぞれ約３５〜３８％及び約３８〜５１％減少させた（Ｂｕｒｌｅｉｇｈ ＭＥ Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２００５ Ｓｅｐ；３９（３）：４４３−５２）。したがって、抗炎症効果のある本発明の化合物は、動脈硬化の治療に有効に利用することができる。
【０１４０】
＜適用例７＞アルツハイマー性痴呆
アルツハイマー性痴呆は痴呆の原因のうち最も一般的な形態である。病理組織学的には、神経繊維のもつれ、アミロイドプラーク、深刻な神経細胞の死滅などがアルツハイマー性痴呆の特徴である。
近年、アルツハイマー性痴呆が炎症と関連があるという論文が数多く報告されている。痴呆動物モデルでミクログリア及び炎症性サイトカインの生成が増加するという報告が多い（Ｍｉｎｇｈｅｔｔｉ Ｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００５、１８：３１５−３２１）。また、炎症を抑制する薬物の投与はアルツハイマー性痴呆動物モデルで保護効果を奏し得ると知られている（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ＫＰ ａｎｄ Ｐｒａｔｉｃｏ Ｄ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．２００５；１９（１２）：１５９２−６０１）。
【０１４１】
したがって、細胞保護効果及び抗炎症効果を示す本発明の化合物はアルツハイマー性痴呆の治療剤として有効に利用することができる。
【０１４２】
＜適用例８＞ＡＬＳ
ルーゲーリック病は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ：ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、運動（うんどう）ニューロン疾患（ＭＮＤ：ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）などと呼ばれる病気であり、運動神経細胞が退行性変化によって漸次損傷することがこの疾患の特徴である。
また、ＡＬＳが炎症と関連があるという論文が数多く報告されているが、ＡＬＳ動物モデルであるＧ９３Ａマウスでミクログリア及び炎症性サイトカインの生成が増加するという報告が多く（Ｗｅｙｄｔ Ｐ ａｎｄ Ｍｏｌｌｅｒ Ｔ．Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．２００５、２５；１６（６）：５２７−３１）、炎症を抑制する薬物の投与はＡＬＳ動物モデルにおける保護効果を奏し得ることも知られている（Ｗｅｓｔ Ｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００４；９１（１）：１３３−４３）。
したがって、本発明の化合物はルーゲーリック病の治療に有効に利用することができる。
【０１４３】
＜適用例９＞パーキンソン病
パーキンソン病は、黒質に存在するドーパミン神経細胞の死滅が伴われ、振戦、筋肉硬直、非正常的姿勢、運動不能などの多様な症状を現わす退行性神経系疾患である。
パーキンソン病が炎症と関連があるという論文が数多く報告されている。パーキンソン病でミクログリア及び炎症性サイトカインの生成が増加するという報告が多く（Ｇａｏ ＨＭ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ．２００３；２４（８）：３９５−４０１；Ｍｉｎｇｈｅｔｔｉ Ｌ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ．２００５；１８（３）：３１５−２１）、炎症を抑制する薬物の投与はパーキンソン病動物モデルにおける保護効果を奏すると知られている（Ｇａｏ ＨＭ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ．２００３；２４（８）：３９５−４０１）。
【０１４４】
したがって、細胞保護効果及び抗炎症効果を持つ本発明の化合物はパーキンソン病の治療に非常に有効に利用することができる。
【０１４５】
〔産業上の利用可能性〕
本発明は、炎症疾患の治療または予防に有用な前記化学式１で表れる２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩を含むことを特徴とする薬学組成物、及びこのような薬学組成物を用いる炎症疾患の治療または予防方法を提供する。本発明による薬学組成物は、胃炎、大腸炎、関節炎、糖尿病炎症、膵臓炎、動脈硬化、腎臓炎、肝炎、アルツハイマー性痴呆、ルーゲーリック病、パーキンソン病などのような炎症疾患の治療または予防に非常に有効であるだけでなく、安全性に優れる。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】図１は、化合物２が胃の粘膜損傷を誘発せず安全であることを示す実験結果である。胃粘膜の損傷程度を確認するために、直接薬物を容量別に経口投与した。比較群としてアスピリンを使用した。
【図２】図２は、胃粘膜の損傷程度を確認するために試料を表示された容量どおり経口投与した結果である。化合物１８は高容量を投与したにもかかわらず胃粘膜の損傷を誘発しなかった。比較群としてインドメタシン、イブプロフェン及びセレコキシブを使用した。
【図３】図３は、ヘリコバクターによって誘導される胃粘膜の損傷を用いた化合物２の細胞保護効果の評価結果である。培養されたＡＧＳ（ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）細胞にヘリコバクター（４３５０４、５×１０８ｃｆｕ／ｍｌ）を単独でまたは標識された濃度のサンプルと共に添加した。添加して２４時間後に、ＭＴＴ分析方法を用いて胃粘膜細胞の生存率を測定した。
【図４】図４は、ＮＳＡＩＤであるスリンダク（ｓｕｌｉｎｄａｃ）によって誘導される胃粘膜損傷を用いた化合物２の細胞保護効果の評価結果である。培養されたＡＧＳ細胞に１００ｕＭスリンダクを単独でまたは標識された濃度のサンプルと共に添加した。添加して１６時間後に、ＭＴＴ分析方法を用いて胃粘膜細胞の生存率を測定した。
【図５】図５は、酸化ストレスであるＨ２Ｏ２によって誘導される胃粘膜損傷を用いた化合物２の細胞保護効果の評価結果である。培養されたＡＧＳ細胞に１００ｕＭのＨ２Ｏ２を単独でまたは標識された濃度のサンプルと共に８時間処理した後、培養液でさらに洗滌した。２４時間後にＭＴＴ分析方法を用いて胃粘膜細胞の生存率を測定した。
【図６】図６は、アルコール（エタノール）によって誘導される胃粘膜損傷を用いた化合物２の細胞保護効果の評価結果である。培養されたＡＧＳ細胞に２５ｍＭのエタノールを単独でまたは標識された濃度のサンプルと共に２４時間処理した。その後、ＭＴＴ分析方法を用いて胃粘膜細胞の生存率を測定した。
【図７】図７は、ＴＮＦ‐α ｍＲＮＡの発現程度を示した写真である。培養されたＡＧＳ細胞に２５ｍＭのエタノールを単独でまたは標識された濃度の化合物２と共に２４時間処理した。その後、ｍＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲ法によって評価した。
【図８】図８は、アルコール／塩酸（ＥｔＯＨ／ＨＣｌ）によって誘導される胃腸管出血を用いた化合物２の保護効果を評価した結果である。Ａは正常マウスの胃の写真である。Ｂは２００〜２５０ｇのマウスを２４時間絶食させた後、６０％ ＥｔＯＨ／１５０ｍＭ ＨＣｌを経口投与して胃腸管出血を誘導した写真である。Ｃはアルコール／塩酸を投与する３０分前に化合物２で前処理し、胃腸管出血を起こして９０分後に胃を摘出して観察した写真である。Ｄは胃損傷の程度を観察するために損傷された面積を定量したグラフである。
【図９】図９は、アルコール性胃炎に対する化合物２の保護作用を評価した結果である。Ａは正常マウスの胃の写真である。Ｂは２５０ｇのマウスを２４時間絶食させた後、エタノール（４ｍｌ／ｋｇ）を経口投与して胃腸管出血を誘導した写真である。Ｃは化合物２を胃腸管出血誘導の１時間前に前処理した後、胃腸管出血を起こして９０分後に胃を摘出して観察した写真である。Ｄは胃損傷の程度を観察して定量したグラフである。
【図１０】図１０は、ＮＳＡＩＤ誘導胃炎に対する化合物２の保護作用を示す写真である。２５０ｇのマウスを２４時間絶食させた後、インドメタシンを経口投与（Ａ及びＣ）すれば胃腸管出血が起きる。化合物２を１時間前に処理（Ｂ及びＤ）し、胃腸管出血を起こして６時間（Ａ及びＢ）または１２時間（Ｃ及びＤ）後に胃を摘出した写真である。
【図１１】図１１は、関節炎動物モデルの１つであるカラゲナン（Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）によって誘導される温熱性痛覚過敏症（ｔｈｅｒｍａｌ ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ）を用いた化合物２の効果評価の結果である。２％カラゲナンをマウスの足部に皮内注射して温熱性痛覚過敏症を誘導した。化合物２は経口投与し、イブプロフェンを比較群として使用した。
【図１２】図１２は、関節炎動物モデルの１つであるザイモサン（ｚｙｍｏｓａｎ）によって誘導されるＴＮＦ‐αの量を用いた化合物２の効果評価の結果である。１％ザイモサンをエアパウチで注入し、投与１時間の前に化合物２を容量別に単回経口投与した。４時間後に、エアパウチ滲出物からＴＮＦ‐αの量をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【図１３】図１３は、関節炎動物モデルのうちの１つであるザイモサンによって誘導されるＩＬ‐１αの量を化合物２が減少させる程度を示すグラフである。１％ザイモサンをエアパウチで注入し、投与１時間の前に化合物２を容量別に単回経口投与した。４時間後に、エアパウチ滲出物からＩＬ‐１αの量をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【図１４】図１４は、コラーゲンによって誘導される関節炎動物モデルを用いた効果評価の結果であり、コラーゲンによる足の浮腫を示す。Ｓｈａｍ：正常マウスＣｏｌｌａｇｅｎ：コラーゲンを注射したマウス化合物１８：２５ｍｇ／ｋｇの化合物１８を腹腔注射したマウス
【図１５】図１５は、コラーゲンによって誘導される関節炎動物モデルを用いた効果評価の結果である。コラーゲン投与後、２５ｍｇ／ｋｇの化合物２、３または１８及び対照群であるメトトレキサート（ＭＴＸ、１ｍｇ／ｋｇ／ｗｅｅｋ）を腹腔注射した。その後、４週間目視で観察した結果を関節炎指数として評価した。
【図１６】図１６は、コラーゲンによって誘導される関節炎動物モデルを用いた化合物６及び１１の効果評価の結果である。コラーゲンを２週間隔で２回皮内注射し、１週間後に化合物６、化合物１１、及び対照群であるメトトレキサートを腹腔注射した。その後、２〜３週間毎日観察した結果を関節炎指数として評価した。
【図１７】図１７は、炎症性腸疾患動物モデルである５％デキストラン硫酸ナトリウム（Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ、ＤＳＳ）モデルを用いた効果評価の結果である。ＤＳＳを処理した後、１０％ビヒクルに懸濁して１０、２５、５０ｍｇ／ｋｇの化合物１８を経口投与した。Ｓｈａｍは正常マウスの大腸であり、ＤＳＳは５％ＤＳＳを処理したマウスの大腸である。その他は各容量の化合物１８を投与したマウスの大腸写真である。
【図１８】図１８及び１９は、図１７の結果を定量化したグラフである。図１８は大腸の長さであり、図１９は大腸の広さである。
【図１９】図１８及び１９は、図１７の結果を定量化したグラフである。図１８は大腸の長さであり、図１９は大腸の広さである。
【図２０】図２０は、ＤＳＳを用いた化合物１８の効果評価の結果である。ＤＳＳを処理した後、１０％ビヒクルに懸濁して化合物１８（２５ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。その後、大腸の損傷による血便、下痢、及び汚ない程度を点数に換算して示した。
【図２１】図２１は、セルレイン（ｃｅｒｕｌｅｉｎ）によって誘導される急性膵臓炎モデルを用いた効果評価の結果である。５０μｇ／ｋｇのセルレインを投与して２時間が経過した後、ＬＰＳを投与して浮腫を誘発した。Ａ−Ｃは写真結果であり、Ｄは膵臓の重さを測定して示したグラフである。Ａ：正常マウスＢ：セルレインを投与したマウスＣ：化合物１８（２５ｍｇ／ｋｇ）を投与したマウス
【図２２】図２２は、セルレインによって誘導される急性膵臓炎モデルを用いた効果評価の結果である。５０μｇ／ｋｇのセルレインを投与して２時間が経過した後、ＬＰＳを投与して浮腫を誘発した。２５ｍｇ／ｋｇの化合物１８を投与し、膵臓消化酵素であるアミラーゼとリパーゼの変化を定量化して示した。
【図２３】図２３及び図２４は、セルレインによって誘導される膵臓炎モデルを用いた評価結果である。本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体が炎症マーカーであるＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１β及びＰＧＥ２に及ぼす影響を評価した。
【図２４】図２３及び図２４は、セルレインによって誘導される膵臓炎モデルを用いた評価結果である。本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体が炎症マーカーであるＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１β及びＰＧＥ２に及ぼす影響を評価した。
【図２５】図２５は、１０．５ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウス（Ｔｇ＋）の脳でＥＬＩＳＡ法を用いてＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１βまたはＩＬ−６の量を測定したグラフである。３ヶ月から７ヶ月の間、化合物２（２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）あるいはイブプロフェン（６２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を飼料に混合して長期投与した。
【図２６】図２６は、脳血管障壁に対する化合物２の保護効果を示す写真（低倍率と高配率）である。Ａ：正常マウスＢ／Ｆ：ＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスＣ／Ｇ：化合物２（２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）投与Ｄ／Ｈ：イブプロフェン（６２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）投与
【図２７】図２７は、１０．５ヶ月齢の正常マウス（Ａ）、１０．５ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウス（Ｂ、Ｔｇ＋）、３．５ヶ月から７ヶ月間化合物２（２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ、Ｃ）あるいはイブプロフェン（６２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄ、Ｄ）を飼料に混合して長期投与したＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスの脳で生成されたアミロイドプラークを測定した写真である。チオフラビン（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ‐Ｓ）で免疫染色した。ＥはＡ−Ｄの結果を定量化したグラフである。
【図２８】図２８は、１０．５ヶ月齢の正常マウス、１０．５ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウス、３．５ヶ月から７ヶ月間化合物２（２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ）を飼料に混合して長期投与した１０．５ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスを用いて高架式十字迷路テストを行った結果である。それぞれの実験動物がｏｐｅｎ ａｒｍに留まる時間で効果を評価した。
【図２９】図２９は、Ｇ９３Ａマウスで炎症のマーカーであるミクログリア活性を示す写真である。ＴＯＭＡＴＯレクチンで免疫染色した。Ａ：正常マウスＢ：Ｇ９３ＡマウスＣ：５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ化合物２投与群
【図３０】図３０は、Ｇ９３Ａマウスで炎症の一マーカーである炎症性サイトカイン（ＴＮＦ‐αとＩＬ‐１β）のｍＲＮＡレベルを示す結果である。ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）が使用された。
【図３１】図３１は、パーキンソン病の動物モデルで炎症に対する化合物２の抑制効果を示した写真である。ＣＤ１１ｂで免疫染色した。Ａ：ＭＰＴＰを投与したマウスＢ：５０ｍｇ／ｋｇ／ｄの化合物２投与群
【図３２】図３２は、本発明による幾つかの２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体化合物の単回投与毒性実験の結果である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、胃炎、胃潰瘍、膵臓炎、大腸炎、関節炎、糖尿病、動脈硬化、腎臓炎、肝炎、アルツハイマー性痴呆、パーキンソン病、ルーゲーリック病などの炎症性疾患で現われる炎症と細胞損傷の治療または予防に有用な薬学組成物、及びこのような薬学組成物を用いる治療または予防方法に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
炎症は、損傷を受けた細胞から由来する損傷因子と外来物質に対する血管反応及び細胞反応である。炎症反応を媒介する物質としては、１）アラキドン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）の代謝物質であるプロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）、ロイコトリエン（ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ）及びリポキシン（ｌｉｐｏｘｉｎｓ）、２）血小板活性化因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）、３）腫瘍壊死因子α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ）、インターロイキン‐１（ＩＬ‐１）などのサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）とｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＣＰ‐１）、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ‐１ａｌｐｈａ（ＭＣＰ‐１ａｌｐｈａ）などのケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ）、４）一酸化窒素（ＮＯ）、５）活性酸素、６）ヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）、セロトニンなどのような血管拡張因子などが知られている。炎症反応の主な目的は、外来物質及び損傷を受けた細胞と組織を除去することであるが、炎症反応はリューマチ性関節炎及び動脈硬化のような慢性疾患を誘発する原因になる。
【０００３】
炎症損傷の程度が小さく制限的且つ一時的な場合、炎症反応の完了と共に損傷因子が除去され、組織は正常に戻ってくる。損傷の程度が大きく再生力が不十分な組織における炎症反応は、かなりの組織損傷が伴われると、機能の障害を引き起し得る。炎症反応が長期間に亘って慢性的に続くと、リューマチ性関節炎、動脈硬化、結核、慢性肺疾患で致命的な組織損傷の原因になる（Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ、ｐｐ．４７−８６、７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）。
【０００４】
また、炎症が退行性脳疾患の病態生理に重要な役割を占めるという結果が続々と報告されている。脳に存在するミクログリア（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）は、アルツハイマー性痴呆、パーキンソン病、ルーゲーリック病において神経損傷が起きる部位で活性化される（Ｌｉｕ Ｂ及びＨｏｎｇ ＪＳ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２００３；３０４（１）：１−７；Ｏｒｒ ＣＦ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２００２；６８（５）：３２５−４０；及びＨｅｎｋｅｌ ＪＳ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．２００４；５５（２）：２２１−３５）。活性化されたミクログリアはプロスタグランジン、サイトカイン、ケモカイン、活性酸素、ＮＯなどを生成し、脳における炎症反応を開始する（Ｍｉｎｇｈｅｔｔｉ Ｌ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ．２００５；１８（３）：３１５−２１；Ｇａｏ ＨＭ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ．２００３；２４（８）：３９５−４０１；Ｗｅｙｄｔ Ｐ ａｎｄ Ｍｏｌｌｅｒ Ｔ．Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．２００５；１６（６）：５２７−３１；及びＪ．Ｊ．Ｍ．Ｈｏｏｚｅｍａｎｓ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２００６；２４：１５７−１６５）。したがって、炎症を抑制する薬物の投与は、アルツハイマー性痴呆の動物モデルでベータアミロイドとプラークの生成を抑制し（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ＫＰ ａｎｄ Ｐｒａｔｉｃｏ Ｄ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．２００５；１８：３１５−２１）、パーキンソン病動物モデルでドーパミン神経細胞を保護し（Ｆｅｒｇｅｒ Ｂ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｕｎｙｎ Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ Ａｒｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９９；３６０（３）：２５６−６１；及びＴｅｉｓｍａｎｎ Ｐ、Ｆｅｒｇｅｒ Ｂ．Ｓｙｎａｐｓｅ．２００１；３９（２）：１６７−７４）、ルーゲーリック病モデルで脊髄運動神経細胞の死滅を防止し且つグリア（ｇｌｉａ）活性を減らすと報告された（Ｋｉａｅｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００５；９３（２）：４０３‐１１）。実際、打撲傷など脳に炎症反応を伴う病歴を持つ患者からＡＤの発病率が高く（Ｂｒｅｉｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９４）、非ステロイド性消炎剤（ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇ、ＮＳＡＩＤ）を長期服用するリューマチ性関節炎患者のＡＤ発病率が低いと報告された（ＭｃＧｅｅｒ ａｎｄ Ｒｏｇｅｒｓ、１９９０）。ＮＳＡＩＤの服用が、ＡＤの予防はもちろん認知機能損傷の進行を遅らせるという研究結果も発表された（Ｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．、１９９５ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ；Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９９５ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ；及びＢｒｅｉｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９４ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）。このような結果は、炎症反応を抑制する薬物が退行性脳疾患の予防と治療に用いられ得ることを提示する。
【０００５】
プロスタグランジンの生成に関与するシクロオキシゲナーゼの作用を抑制する薬物であるＮＳＡＩＤが開発されて痛症を含む炎症疾患の症状を緩和するために広く使われているが、その副作用により使用に大きい障害となっている。特に、消化不良、胃炎、潰瘍、出血、穿孔などの胃腸管障害は、ＮＳＡＩＤの服用後、頻繁に現われる副作用である。実際、ＮＳＡＩＤの副作用で、米国だけで年間１０７，０００人が入院し、１６，５００人が死亡すると報告されている。胃腸管損傷の副作用が小さい選択的ＣＯＸ‐２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ‐２）酵素抑制薬物であるＣｏｘｉｂとしてｃｅｌｅｃｏｘｉｂとｒｏｆｅｃｏｘｉｂが開発され、関節炎と痛症の治療に使われてきた。２００５年米国ＦＤＡは、ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ、ｒｏｆｅｃｏｘｉｂまたはｖａｌｄｅｃｏｘｉｂの長期服用は心臓疾患を誘発すると報告し、関節炎治療剤としてのＣｏｘｉｂ薬物の使用が制限された。さらに、ｃｅｌｅｃｏｘｉｂとｒｏｆｅｃｏｘｉｂの痴呆臨床研究が安全性の理由から中断された。
【０００６】
また、炎症疾患において、好中球、マクロファージ、モノサイトなどによって生成される活性酸素は、炎症反応を媒介して組織損傷を誘発する主な原因として知られている。実際、活性酸素を除去する薬物の投与が、炎症疾患で現われる胃損傷（Ｍａｔｔｈｅｗｓ ＧＭ ｅｔ ａｌ．及びＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ．２００５；１０（４）：２９８−３０６）、膵臓損傷（Ｓｈｉ Ｃ ｅｔ ａｌ．、Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌｏｇｙ．２００５；５（４−５）：４９２−５００）、動脈硬化（Ｔａｒｄｉｆ ＪＣ．Ｃｕｒｒ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ Ｒｅｐ．２００５；７（１）：７１−７）、大腸損傷（Ｏｚ ＨＳ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｎｕｔｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００５；１６（５）：２９７−３０４）、関節損傷（Ｈｅｎｒｏｔｉｎ Ｙ Ｅ ｅｔ ａｌ．、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ．２００３；１１（１０）：７４７−５５）、腎臓損傷（Ｔｉａｎ Ｎ ｅｔ ａｌ．、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．２００５；４５（５）：９３４−９）、肝損傷（Ｌｏｇｕｅｒｃｉｏ Ｃ ｅｔ ａｌ．、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．２００３；３４（１）：１−１０）、心血管損傷（Ｈａｉｄａｒａ ＭＡ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ Ｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００６；４（３）：２１５−２７）などに効果があるという結果が提示されている。さらに、非ステロイド性抗炎症薬物の投与は、活性酸素の生成を誘発して胃粘膜損傷との副作用を起こし、このような胃損傷は抗酸化物質の投与によって減少することが報告されている（Ｇｒａｚｉａｎｉ Ｇ ｅｔ ａｌ．、Ｇｕｔ．２００５；５４（２）：１９３−２００）。
【０００７】
炎症は消火器、呼吸器、神経系疾患の病態生理に重要な役割を占めるが、現在使われている薬物は副作用のために使用が制限されている。抗炎症薬物であるアスピリン（ａｃｅｔｙｌｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ）がＮＦ‐ｋＢとｃ‐Ｊｕｎ Ｎ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅの作用を抑制し（Ｋｏ ＨＷ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９９８；７１（４）：１３９０−５）、スルファサラジンが抗酸化作用で細胞を保護することが知られている（Ｒｙｕ ＢＲ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２００３；３０５（１）：４８−５６）。しかし、アスピリンとスルファサラジンの細胞保護作用は、高濃度で現われるとの限界が問題として提起された。
【０００８】
〔発明の開示〕
したがって、本発明の技術的課題は、胃損傷、心血管障害などの副作用がなく安全であって炎症疾患の治療または予防に優れる薬学組成物、このような薬学組成物の炎症疾患治療または予防用途、及びこのような薬学組成物を投与することを含む炎症疾患治療または予防方法を提供することである。
【０００９】
上記の技術的課題を達成するために、本発明は有効成分として下記化学式１で表れる２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩を含むことを特徴とする炎症疾患の治療または予防用薬学組成物を提供する。
【００１０】
［化学式１］
【００１１】
【化１】
【００１２】
前記化学式１において、
ｎは２ないし５の整数であり、
Ｒ１は水素またはアルキルであり、
Ｒ２は水素、アルキルまたはアルカノイルであり、
Ｒ３は水素またはアセトキシであり、
Ｘは相互独立的に、水素、ニトロ、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたはハロアルコキシである。
【００１３】
より望ましくは、本発明は前記炎症疾患が胃炎、大腸炎、関節炎、糖尿病炎症、動脈硬化、腎臓炎、肝炎、アルツハイマー性痴呆、パーキンソン病、及びルーゲーリック病からなる群より選択されたいずれか１つであることを特徴とする炎症疾患の治療または予防用薬学組成物を提供する。
【００１４】
また、本発明は炎症疾患で苦む患者または動物に前記化学式１で表れる２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩の治療的に有効な量を投与することを含む炎症疾患の治療または予防方法を提供する。
【００１５】
本発明者等は、様々な化合物を製造して評価したところ、前記化学式１で表れる２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩が安全であるだけでなく炎症疾患の治療または予防に非常に有用であることを見つけ、本発明の完成に至った。
【００１６】
以下、本発明の炎症疾患治療または予防用薬学組成物、及び炎症疾患の治療または予防方法についてより具体的に説明する。
【００１７】
本発明は、下記化学式１で表れる２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩の新たな用途、すなわち炎症疾患の治療または予防用途を提供し、また下記化学式１で表れる２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩を用いて炎症疾患を治療または予防する方法を提供する。
【００１８】
［化学式１］
【００１９】
【化２】
【００２０】
前記化学式１において、
ｎは２ないし５の整数であり、
Ｒ１は水素またはアルキルであり、
Ｒ２は水素、アルキルまたはアルカノイルであり、
Ｒ３は水素またはアセトキシであり、
Ｘは相互独立的に、水素、ニトロ、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシまたはハロアルコキシである。
【００２１】
前記化学式１において、アルキル（ハロアルキルのアルキルを含む）は炭素数１ないし５のアルキルであることが望ましく、炭素数１または３のアルキルであることがさらに望ましい。具体的に、前記アルキルとしてはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ‐ブチル及びｔｅｒｔ‐ブチル基が望ましいが、これに限定されることはない。アルコキシ（ハロアルコキシのアルコキシを含む）は、炭素数１ないし５のアルコキシであることが望ましく、炭素数１または３のアルコキシであることがさらに望ましい。具体的に、前記アルコキシとしてはメトキシ、エトキシ及びプロトキシ基が望ましいが、これに限定されることはない。ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素及びヨードであることが望ましいが、これに限定されることはない。アルカノイルは炭素数２ないし１０のアルカノイルであることが望ましく、炭素数３または５であることがさらに望ましい。具体的に、前記アルカノイルとしてはエタノイル、プロパノイル、及びシクロヘキサンカルボニルが望ましいが、これに限定されることはない。
【００２２】
前記化学式１で表れる２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体の望ましい例には、２‐ヒドロキシ‐５‐フェネチルアミノ‐安息香酸（化合物１）、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（化合物２）、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（３‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（化合物３）、５‐［２‐（３，５‐ビス‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸（化合物４）、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（２‐ニトロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（化合物５）、５‐［２‐（４‐クロロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸（化合物６）、５‐［２‐（３，４‐ジフルオロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸（化合物７）、５‐［２‐（３，４‐ジクロロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸（化合物８）、５‐［２‐（４‐フルオロ‐２‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸（化合物９）、５‐［２‐（２‐フルオロ‐４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸（化合物１０）、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐メトキシ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（化合物１１）、２‐ヒドロキシ‐５‐（２‐ｏ‐トリル‐エチルアミノ）‐安息香酸（化合物１２）、２‐ヒドロキシ‐５‐（３‐フェニル‐プロピルアミノ）‐安息香酸（化合物１３）、２‐ヒドロキシ‐５‐［３‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐プロピルアミノ］‐安息香酸（化合物１４）、５‐［３‐（４‐フルオロ‐フェニル）‐プロピルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸（化合物１５）、５‐［３‐（３，４‐ジクロロ‐フェニル）‐プロピルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸（化合物１６）、２‐ヒドロキシ‐５‐（３‐ｐ‐トリル‐プロピルアミノ）‐安息香酸（化合物１７）、２‐アセトキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（化合物１８）、及び５‐［２‐（２‐クロロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸（化合物１９）が含まれるが、これに限定されることはない。
【００２３】
前述した望ましい化合物のうち、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（化合物２）及び２‐アセトキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（化合物１８）は、炎症疾患治療用活性物質として他の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体に比べてさらに望ましい。
【００２４】
前述した望ましい化合物のうち、化合物２は、特に退行性脳疾患の細胞損傷及び炎症の治療において他の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体に比べてさらに望ましい。化合物２は、抗炎症効果の観点から、類似の構造を持つ幾つかの化合物に比べて非常に優れた効果を示し、またベータアミロイド生成抑制効果に対する観点からも、類似の構造を持つ幾つかの化合物に比べて優れた効果を示した。勿論、ＮＯ生成抑制効果など１つの実験結果のみに基づく場合には、化合物２よりさらに優れた効果を示す化合物が存在するが、退行性脳疾患治療剤としての他の評価実験で相対的に良くない結果を示し退行性脳疾患治療剤として好適ではなかった（例えば、幾つかの化合物はＮＯ生成抑制効果が化合物２より優れたが、退行性脳疾患の治療において非常に重要なベータアミロイド生成抑制効果が非常に微弱であった）。また、幾つかの化合物は薬効評価実験で優れた結果を示したが、後述する毒性評価実験で化合物２に比べて望ましくなかった。
【００２５】
同様に、前述した望ましい化合物のうちの化合物１８は、炎症疾患の治療において、他の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体に比べてさらに望ましい。化合物１８は、抗炎症効果の観点から類似の構造を持つ幾つかの化合物に比べて非常に優れた効果を示したが、また後述する毒性評価実験で化合物２に比べては効果が落ちた。
【００２６】
本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体は、以下のような反応式によって製造することができるが、これに限定されることはない。本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体は、本発明が属した分野で公知の合成法を用いて製造することができる。
【００２７】
＜反応式１＞
【００２８】
【化３】
【００２９】
反応条件：トリエチルアミン、ヨウ化テトラブチルアンモニウム、Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド、常温、３時間。
【００３０】
＜反応式２＞
【００３１】
【化４】
【００３２】
反応条件：（ａ）エタノール、Ｈ２ＳＯ４、還流、６時間；（ｂ）無水酢酸、メタノール、０℃、３０分；（ｃ）無水酢酸、Ｈ２ＳＯ４、０℃、３０分
また、本発明の望ましい一実施例である２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（化合物２）は、以下のような反応式３によって製造することができるが、これに限定されることはない。
【００３３】
＜反応式３＞
【００３４】
【化５】
【００３５】
反応条件：（ａ）４‐（トリフルオロメチル）ヒドロ桂皮酸、ＰＣｌ５、キシレン、還流、１２時間；（ｂ）塩化アセチル、ＤＭＦ／Ｋ２ＣＯ３、室温、２時間；（ｃ）ＮａＢＨ４、酢酸／１，４‐ジオキサン、約９５℃、５０分；（ｄ）ＨＣｌ／Ｈ２Ｏ、酢酸。
【００３６】
本発明において「薬学的に許容可能な塩」とは、毒性がないか又は少ない酸または塩基から製造された塩を言う。本発明の化合物が相対的に酸性である場合、塩基（ｂａｓｅ）付加塩は十分な量の所望の塩基と本発明の化合物とを適当な不活性溶媒で接触させ、中性形態を得ることができる。薬学的に許容可能な塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、マグネシウムまたは有機アミノからなる塩を含むが、これに限定されることはない。本発明の化合物が相対的に塩基性である場合、酸（ａｃｉｄ）付加塩は十分な量の所望の酸と本発明の化合物とを適当な不活性溶媒で接触させ、中性形態を得ることができる。薬学的に許容可能な酸付加塩は、プロピオン酸、イソブチル酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ‐トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸、塩酸、臭素酸、窒酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素、亜リン酸などから形成された塩を含むが、これに限定されることはない。また、アルジネートのようなアミノ酸の塩、及びグルクロン酸またはガラクツロン酸（ｇａｌａｃｔｕｎｏｒｉｃ ａｃｉｄ）のような有機酸の類似体を含むが、これに限定されることはない。
【００３７】
例えば、本発明の望ましい一実施例である２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（化合物２）の薬学的に許容可能な塩は、以下のような反応式４によって製造することができるが、これに限定されることはない。
【００３８】
＜反応式４＞
【００３９】
【化６】
【００４０】
反応式４において、Ｍはジエチルアミン、リチウム、ナトリウム、カリウムなどの薬学的に許容される金属または塩基性有機化合物を指す。
【００４１】
より具体的に、ジエチルアミン塩はアルコールに化合物を溶解してから、ジエチルアミンを滴加し撹拌した後、減圧蒸留し残渣にエーテルを添加して結晶化させて得る。アルカリ金属塩を製造する方法としては、アルコール、アセトン、アセトニトリルなどのような溶媒下でアルカリ金属を提供し得る水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの無機試薬を用いて目的とする塩形態化合物を製造し、凍結乾燥させて得ることができる。また、類似の方法を用いて、リチウム塩はリチウムアセテートを使用し、ナトリウム塩はナトリウム２‐ヘキサン酸エチルまたはナトリウムアセテートを使用し、カリウム塩はカリウムアセテートを使用して目的とする塩を製造することができる。
【００４２】
本発明の一部化合物は、水和物形態を含み、溶媒和された形態だけでなく非溶媒和された形態で存在することもできる。本発明の一部化合物は、結晶形または無晶形で存在することができ、このようなすべての物理的形態は本発明の範囲に含まれる。また、本発明の一部化合物は、光学中心である非対称炭素原子または二重結合を有することがあり、ラセミ化合物、鏡像異性体、ジアステレオマー、幾何異性体（きかいせいたい）などが存在することができ、これらも本発明の範囲に含まれる。
【００４３】
さらに、本発明は前記化学式１で表れる２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩と、薬剤学的に許容される賦形剤または添加剤とを含む薬学組成物を提供する。本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩は、単独であるいは如何なる便利な担体、賦形剤などと共に混合して投与でき、そのような投与剤形は単回投与または反復投与剤形であり得る。
【００４４】
本発明の薬学組成物は固形製剤または液状製剤であり得る。固形製剤としては、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、坐剤などがあるが、これに限定されることはない。固形製剤には、賦形剤、着香剤、結合剤、防腐剤、崩解剤、滑沢剤、充填剤などがさらに含まれるが、これに限定されることはない。液状製剤としては、水、プロピレングリコール溶液のような溶液剤、懸濁液剤、乳剤などがあるが、これに限定されることはなく、適当な着色剤、着香剤、安定化剤、粘性化剤などを添加して製造することができる。
【００４５】
例えば、散剤は、本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体化合物と乳糖、澱粉、微結晶セルロースなど薬剤学的に許容される適当な賦形剤を単純混合することで製造することができる。顆粒剤は、本発明の化合物またはこれの薬学的に許容できる塩；薬剤学的に許容される適当な賦形剤；及びポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの薬剤学的に許容される適当な結合剤を混合した後、水、エタノール、イソプロパノールなどの溶媒を用いた湿式顆粒法または圧縮力を用いた乾式顆粒法を用いて製造することができる。また、錠剤は前記顆粒剤をステアリン酸マグネシウムなどの薬剤学的に許容される適当な滑沢剤と混合した後、打錠機を用いて打錠することで製造することができる。
【００４６】
本発明の薬学組成物は、治療する疾患及び個体の状態に応じて経口剤、注射剤（例えば、筋肉注射、腹腔走査、静脈注射、注入、皮下注射、イムプラント）、吸入剤、鼻腔投与剤、膣剤、直腸投与剤、舌下剤、経皮剤、局所剤などに投与することができるが、これに限定されることはない。投与経路により、通常用いられて非毒性であり、且つ薬剤学的に許容される担体、添加剤、ビヒクルを含む適当な投与ユニット剤形に製剤化することができる。一定時間薬物を持続的に放出できるデポー（ｄｅｐｏｔ）剤形も本発明の範囲に含まれる。
【００４７】
さらに、本発明は前記化学式１で表れる２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩の炎症疾患治療または予防用途、すなわち前記化学式１で表れる２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩を含むことを特徴とする炎症疾患の治療または予防用組成物を提供する。より具体的に、本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩は胃炎、胃潰瘍、膵臓炎、大腸炎、関節炎、糖尿病、動脈硬化、腎臓炎、肝炎などの炎症疾患、及びアルツハイマー性痴呆、パーキンソン病、ルーゲーリック病などの退行性脳疾患で現われる炎症と細胞損傷の治療または予防のために用いることができるが、本発明による２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体及びこれの塩の用途は前述した具体的な疾患名に限定されることはない。
【００４８】
炎症疾患の治療のための使用にあたって、本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体は毎日約０．０１ｍｇ／ｋｇないし約１００ｇ／ｋｇ投与することができ、約０．１ｍｇ／ｋｇないし約１０ｇ／ｋｇの１日投与量が望ましい。しかし、前述した投与量は、患者の状態（年齢、性別、体重など）、治療している状態の深刻性、使われた化合物などによって多様である。必要に応じて、１日の総投与量を分け、一日数回に渡って投与することができる。
【００４９】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、化合物２が胃の粘膜損傷を誘発せず安全であることを示す実験結果である。胃粘膜の損傷程度を確認するために、直接薬物を容量別に経口投与した。比較群としてアスピリンを使用した。
【００５０】
図２は、胃粘膜の損傷程度を確認するために試料を表示された容量どおり経口投与した結果である。化合物１８は高容量を投与したにもかかわらず胃粘膜の損傷を誘発しなかった。比較群としてインドメタシン、イブプロフェン及びセレコキシブを使用した。
【００５１】
図３は、ヘリコバクターによって誘導される胃粘膜の損傷を用いた化合物２の細胞保護効果の評価結果である。培養されたＡＧＳ（ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）細胞にヘリコバクター（４３５０４、５×１０８ｃｆｕ／ｍｌ）を単独でまたは標識された濃度のサンプルと共に添加した。添加して２４時間後に、ＭＴＴ分析方法を用いて胃粘膜細胞の生存率を測定した。
【００５２】
図４は、ＮＳＡＩＤであるスリンダク（ｓｕｌｉｎｄａｃ）によって誘導される胃粘膜損傷を用いた化合物２の細胞保護効果の評価結果である。培養されたＡＧＳ細胞に１００ｕＭスリンダクを単独でまたは標識された濃度のサンプルと共に添加した。添加して１６時間後に、ＭＴＴ分析方法を用いて胃粘膜細胞の生存率を測定した。
【００５３】
図５は、酸化ストレスであるＨ２Ｏ２によって誘導される胃粘膜損傷を用いた化合物２の細胞保護効果の評価結果である。培養されたＡＧＳ細胞に１００ｕＭのＨ２Ｏ２を単独でまたは標識された濃度のサンプルと共に８時間処理した後、培養液でさらに洗滌した。２４時間後にＭＴＴ分析方法を用いて胃粘膜細胞の生存率を測定した。
【００５４】
図６は、アルコール（エタノール）によって誘導される胃粘膜損傷を用いた化合物２の細胞保護効果の評価結果である。培養されたＡＧＳ細胞に２５ｍＭのエタノールを単独でまたは標識された濃度のサンプルと共に２４時間処理した。その後、ＭＴＴ分析方法を用いて胃粘膜細胞の生存率を測定した。
【００５５】
図７は、ＴＮＦ‐α ｍＲＮＡの発現程度を示した写真である。培養されたＡＧＳ細胞に２５ｍＭのエタノールを単独でまたは標識された濃度の化合物２と共に２４時間処理した。その後、ｍＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲ法によって評価した。
【００５６】
図８は、アルコール／塩酸（ＥｔＯＨ／ＨＣｌ）によって誘導される胃腸管出血を用いた化合物２の保護効果を評価した結果である。Ａは正常マウスの胃の写真である。Ｂは２００〜２５０ｇのマウスを２４時間絶食させた後、６０％ ＥｔＯＨ／１５０ｍＭ ＨＣｌを経口投与して胃腸管出血を誘導した写真である。Ｃはアルコール／塩酸を投与する３０分前に化合物２で前処理し、胃腸管出血を起こして９０分後に胃を摘出して観察した写真である。Ｄは胃損傷の程度を観察するために損傷された面積を定量したグラフである。
【００５７】
図９は、アルコール性胃炎に対する化合物２の保護作用を評価した結果である。Ａは正常マウスの胃の写真である。Ｂは２５０ｇのマウスを２４時間絶食させた後、エタノール（４ｍｌ／ｋｇ）を経口投与して胃腸管出血を誘導した写真である。Ｃは化合物２を胃腸管出血誘導の１時間前に前処理した後、胃腸管出血を起こして９０分後に胃を摘出して観察した写真である。Ｄは胃損傷の程度を観察して定量したグラフである。
【００５８】
図１０は、ＮＳＡＩＤ誘導胃炎に対する化合物２の保護作用を示す写真である。２５０ｇのマウスを２４時間絶食させた後、インドメタシンを経口投与（Ａ及びＣ）すれば胃腸管出血が起きる。化合物２を１時間前に処理（Ｂ及びＤ）し、胃腸管出血を起こして６時間（Ａ及びＢ）または１２時間（Ｃ及びＤ）後に胃を摘出した写真である。
【００５９】
図１１は、関節炎動物モデルの１つであるカラゲナン（Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）によって誘導される温熱性痛覚過敏症（ｔｈｅｒｍａｌ ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ）を用いた化合物２の効果評価の結果である。２％カラゲナンをマウスの足部に皮内注射して温熱性痛覚過敏症を誘導した。化合物２は経口投与し、イブプロフェンを比較群として使用した。
【００６０】
図１２は、関節炎動物モデルの１つであるザイモサン（ｚｙｍｏｓａｎ）によって誘導されるＴＮＦ‐αの量を用いた化合物２の効果評価の結果である。１％ザイモサンをエアパウチで注入し、投与１時間の前に化合物２を容量別に単回経口投与した。４時間後に、エアパウチ滲出物からＴＮＦ‐αの量をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００６１】
図１３は、関節炎動物モデルのうちの１つであるザイモサンによって誘導されるＩＬ‐１αの量を化合物２が減少させる程度を示すグラフである。１％ザイモサンをエアパウチで注入し、投与１時間の前に化合物２を容量別に単回経口投与した。４時間後に、エアパウチ滲出物からＩＬ‐１αの量をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００６２】
図１４は、コラーゲンによって誘導される関節炎動物モデルを用いた効果評価の結果であり、コラーゲンによる足の浮腫を示す。
Ｓｈａｍ：正常マウス
Ｃｏｌｌａｇｅｎ：コラーゲンを注射したマウス
化合物１８：２５ｍｇ／ｋｇの化合物１８を腹腔注射したマウス
図１５は、コラーゲンによって誘導される関節炎動物モデルを用いた効果評価の結果である。コラーゲン投与後、２５ｍｇ／ｋｇの化合物２、３または１８及び対照群であるメトトレキサート（ＭＴＸ、１ｍｇ／ｋｇ／ｗｅｅｋ）を腹腔注射した。その後、４週間目視で観察した結果を関節炎指数として評価した。
【００６３】
図１６は、コラーゲンによって誘導される関節炎動物モデルを用いた化合物６及び１１の効果評価の結果である。コラーゲンを２週間隔で２回皮内注射し、１週間後に化合物６、化合物１１、及び対照群であるメトトレキサートを腹腔注射した。その後、２〜３週間毎日観察した結果を関節炎指数として評価した。
【００６４】
図１７は、炎症性腸疾患動物モデルである５％デキストラン硫酸ナトリウム（Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ、ＤＳＳ）モデルを用いた効果評価の結果である。ＤＳＳを処理した後、１０％ビヒクルに懸濁して１０、２５、５０ｍｇ／ｋｇの化合物１８を経口投与した。Ｓｈａｍは正常マウスの大腸であり、ＤＳＳは５％ＤＳＳを処理したマウスの大腸である。その他は各容量の化合物１８を投与したマウスの大腸写真である。
【００６５】
図１８及び１９は、図１７の結果を定量化したグラフである。図１８は大腸の長さであり、図１９は大腸の広さである。
【００６６】
図２０は、ＤＳＳを用いた化合物１８の効果評価の結果である。ＤＳＳを処理した後、１０％ビヒクルに懸濁して化合物１８（２５ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。その後、大腸の損傷による血便、下痢、及び汚ない程度を点数に換算して示した。
【００６７】
図２１は、セルレイン（ｃｅｒｕｌｅｉｎ）によって誘導される急性膵臓炎モデルを用いた効果評価の結果である。５０μｇ／ｋｇのセルレインを投与して２時間が経過した後、ＬＰＳを投与して浮腫を誘発した。Ａ−Ｃは写真結果であり、Ｄは膵臓の重さを測定して示したグラフである。
Ａ：正常マウス
Ｂ：セルレインを投与したマウス
Ｃ：化合物１８（２５ｍｇ／ｋｇ）を投与したマウス
図２２は、セルレインによって誘導される急性膵臓炎モデルを用いた効果評価の結果である。５０μｇ／ｋｇのセルレインを投与して２時間が経過した後、ＬＰＳを投与して浮腫を誘発した。２５ｍｇ／ｋｇの化合物１８を投与し、膵臓消化酵素であるアミラーゼとリパーゼの変化を定量化して示した。
【００６８】
図２３及び図２４は、セルレインによって誘導される膵臓炎モデルを用いた評価結果である。本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体が炎症マーカーであるＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１β及びＰＧＥ２に及ぼす影響を評価した。
【００６９】
図２５は、１０．５ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウス（Ｔｇ＋）の脳でＥＬＩＳＡ法を用いてＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１βまたはＩＬ−６の量を測定したグラフである。３ヶ月から７ヶ月の間、化合物２（２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）あるいはイブプロフェン（６２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を飼料に混合して長期投与した。
【００７０】
図２６は、脳血管障壁に対する化合物２の保護効果を示す写真（低倍率と高配率）である。
Ａ：正常マウス
Ｂ／Ｆ：ＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウス
Ｃ／Ｇ：化合物２（２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）投与
Ｄ／Ｈ：イブプロフェン（６２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）投与
図２７は、１０．５ヶ月齢の正常マウス（Ａ）、１０．５ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウス（Ｂ、Ｔｇ＋）、３．５ヶ月から７ヶ月間化合物２（２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ、Ｃ）あるいはイブプロフェン（６２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄ、Ｄ）を飼料に混合して長期投与したＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスの脳で生成されたアミロイドプラークを測定した写真である。チオフラビン（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ‐Ｓ）で免疫染色した。ＥはＡ−Ｄの結果を定量化したグラフである。
【００７１】
図２８は、１０．５ヶ月齢の正常マウス、１０．５ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウス、３．５ヶ月から７ヶ月間化合物２（２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ）を飼料に混合して長期投与した１０．５ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスを用いて高架式十字迷路テストを行った結果である。それぞれの実験動物がｏｐｅｎ ａｒｍに留まる時間で効果を評価した。
【００７２】
図２９は、Ｇ９３Ａマウスで炎症のマーカーであるミクログリア活性を示す写真である。ＴＯＭＡＴＯレクチンで免疫染色した。
Ａ：正常マウス
Ｂ：Ｇ９３Ａマウス
Ｃ：５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ化合物２投与群
図３０は、Ｇ９３Ａマウスで炎症の一マーカーである炎症性サイトカイン（ＴＮＦ‐αとＩＬ‐１β）のｍＲＮＡレベルを示す結果である。ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）が使用された。
【００７３】
図３１は、パーキンソン病の動物モデルで炎症に対する化合物２の抑制効果を示した写真である。ＣＤ１１ｂで免疫染色した。
Ａ：ＭＰＴＰを投与したマウス
Ｂ：５０ｍｇ／ｋｇ／ｄの化合物２投与群
図３２は、本発明による幾つかの２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体化合物の単回投与毒性実験の結果である。
【００７４】
〔発明を実施するための最良の形態〕
以下、本発明をより具体的に説明するために実施例などを挙げて説明する。しかし、本発明による実施例は多くの他の形態に変形することができ、本発明の範囲が後述する実施例に限定されると解釈されてはならない。本発明の実施例は、本発明の具体的理解を助けるために例示的に提供されるものである。
【００７５】
＜合成例１＞２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（化合物２）の製造
５‐アミノサリチル酸（０．５１ｇ、３．９０ｍｍｏｌ）を常温窒素気流下でＮ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド（２０．０ｍｌ）に入れて撹拌させた。トリエチルアミン（０．５０ｍｌ）とヨウ化テトラブチルアンモニウム（１０．１ｍｇ）を入れた後、３０分間撹拌した。その後、１‐（２‐（ブロモエチル）‐４‐トリフルオロメチル）ベンゼンを添加し、常温で３時間撹拌した。反応を終結するために反応容器に氷を添加した。生成された結晶を濾過してアセトンとヘクサンを用いて撹拌させた後、再び濾過した。濾過された固体をエチルアセテートに溶かした後、０．５Ｎ塩酸と塩水で洗滌した。無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧蒸留して２‐ヒドロキシ‐５‐（４‐（トリフルオロメチル）ペニルエチルアミノ）安息香酸０．５４ｇ（２１％収率）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ‐ｄ６）：７．６２（ｄ，２Ｈ）、７．４８（ｄ，２Ｈ）、６．９８（ｄ，１Ｈ）、６．８８（ｑ，１Ｈ）、６．７６（ｄ，１Ｈ）、３．２４（ｔ，２Ｈ）、２．９１（ｔ，２Ｈ）
＜合成例２＞２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸カリウム塩の製造
前記合成例１で製造した２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（１０ｇ、３０．７ｍｍｏｌ）を無水エタノール（１００ｍｌ）に加えて５０℃まで加温して完全に溶解させた。その後、溶液を０℃に冷却した。８５％水酸化カリウム（２．０３ｇ、３０．７ｍｍｏｌ）と無水エタノール（２０ｍｌ）溶液を使ってｐＨを６．８〜７．０に調節した後、室温で２時間撹拌した。沈殿した結晶を濾過及び乾燥して目的とする化合物である２‐ヒドロキシ‐５‐（４‐（トリフルオロメチル）ペニルエチルアミノ）安息香酸カリウム塩（１０．４ｇ）を９３％の収率で得た。
【００７６】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ‐ｄ６）：７．６２（ｄ，２Ｈ）、７．４８（ｄ，２Ｈ）、６．９８（ｄ，１Ｈ）、６．９０（ｑ，１Ｈ）、６．８４（ｄ，１Ｈ）、３．２４（ｔ，２Ｈ）、２．９１（ｔ，２Ｈ）
＜合成例３＞２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐ニトロペニル）エチルアミノ］‐安息香酸の製造
５‐アミノサリチル酸（５００ｍｇ、３．２６ｍｍｏｌ）及び４‐ニトロペニルエチルブロマイド（９００ｍｇ、３．９２ｍｍｏｌ）を使って合成例１と同様の方法によって、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐ニトロペニル）エチルアミノ］‐安息香酸８９０ｍｇ（５０％収率）を淡い黄色固体相で得た。融点２３４〜２３６℃。
【００７７】
Ｃ１５Ｈ１４Ｎ２Ｏ５の元素分析
【００７８】
【表１】
【００７９】
＜合成例４＞２‐ヒドロキシ‐５‐［３‐（４‐ニトロペニル）‐ｎ‐プロピルアミノ］‐安息香酸の製造
５‐アミノサリチル酸（５００ｍｇ、３．２６ｍｍｏｌ）及び３‐（４‐ニトロペニル）プロピルブロマイド（９５０ｍｇ、３．９２ｍｍｏｌ）を使って合成例１と同様の方法により、２‐ヒドロキシ‐５‐［３‐（４‐ニトロペニル）‐ｎ‐プロピルアミノ］‐安息香酸５２０ｍｇ（５０％収率）を淡い黄色固体相で得た。融点２２９〜２３１℃。
Ｃ１６Ｈ１６Ｎ２Ｏ５の元素分析
【００８０】
【表２】
【００８１】
＜合成例５＞
他の化合物も前記合成例１と同様の方法で製造し、分析結果を下記表３にまとめて示した。
【００８２】
【表３】
【００８３】
＜合成例６＞２‐アセトキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸（化合物１８）の製造
化合物１８を下記反応式によって製造した。
【００８４】
＜反応式５＞
【００８５】
【化７】
【００８６】
化合物ａ：化合物２（５０．０ｇ、１５４ｍｍｏｌ）の２００ｍＬ Ｈ２Ｏ：１，４‐ジオキサン（１：１）混合溶液にＮａ２ＣＯ３（３２．６ｇ、３０７ｍｍｏｌ）とジ‐ｔｅｒｔ‐ブチルジカボネイト（４０．３ｇ、１８５ｍｍｏｌ）を室温で添加した。８時間撹拌した後、ジ‐ｔｅｒｔ‐ブチルジカボネイト（１６．８ｇ、７６．９ｍｍｏｌ）をさらに添加した。室温で８時間再び撹拌した後、反応混合物は２Ｎ ＨＣｌで中和（ｐＨ 〜６）した。生成混合物はエチルアセテート（２００ｍＬ、２回）で抽出した。有機相を混合し、塩水（１００ｍＬ）で洗滌してＭｇＳＯ４で乾燥した後、濾過した。結果として、黄色い泡沫状の濃縮物である化合物２１を得、追加精製なく粗化合物ａが後続する反応に使われた。
【００８７】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１０．５２（１Ｈ，ｂｒ Ｓ）、７．５３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ）、７．５３（ｂｒ，１Ｈ）、７．２８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ）、７．２６（ｂｒ，１Ｈ）、６．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、３．８５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、２．９４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、１．４３（ｂｒ ｓ，９Ｈ）
化合物ｂ：化合物ａのジクロロメタン（２００ｍＬ）溶液にＮ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミン（８０．３ｍＬ、４６１ｍｍｏｌ）と塩化アセチル（２１．９ｍＬ、３０７ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合物は室温まで加温し、５時間撹拌した。１Ｎ ＨＣｌ（１００ｍＬ）水溶液を反応混合物に添加した。反応物は層に分離され、水層はジクロロメタン（１００ｍＬ）で抽出した。有機相を混合して塩水（１００ｍＬ）で洗滌し、ＭｇＳＯ４で乾燥して濾過した後、濃縮した。粗生成物をジエチルエーテルで再結晶して白い固体相の化合物２２（５１．５ｇ、７１．７％）を生成した。
【００８８】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）７．８２（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、７．５４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ）、７．３８−７．２４（ｍ，１Ｈ）、７．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ）、７．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）、３．９１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、２．９８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、２．３４（ｓ，３Ｈ）、１．４２（ｂｒ ｓ，９Ｈ）
化合物１８：化合物ｂ（５１．５ｇ、１１０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２００ｍＬ）溶液を０℃で４Ｎ ＨＣｌの１，４‐ジオキサン溶液（２００ｍＬ）で処理した。反応混合物は室温まで加温された。５時間撹拌した後、懸濁液は濃縮した。残渣はジエチルエーテル（５００ｍＬ）で粉砕（ｔｒｉｔｕｒａｔｅ）した。ジクロロメタン（５００ｍＬ）とジエチルエーテル（５００ｍＬ）を用いて濾過及び洗滌し、白い固体相の化合物１８（４６．０ｇ、８２．５ｍｍｏｌ、９２．３％）を得た。
【００８９】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ‐ｄ６）７．６６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）、７．５２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）、７．１５（ｓ，１Ｈ）、６．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）、６．８５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）、３．３２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）、２．９５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ）、２．１８（ｓ，３Ｈ））；ＬＣＭＳ ｃａｌｃ．ｆｏｒ Ｃ１８Ｈ１６Ｆ３ＮＯ４（Ｍ＋Ｈ＋）：３６８、ｆｏｕｎｄ ３６８．
＜実施例１＞細胞における抗炎症効果の評価
１−１．ＮＯ生成阻害効果
炎症反応に関与する炎症性因子であるＮＯに対する本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体の阻害効果を評価した。ＢＶ２ ミクログリア細胞株にバクテリアトキシン炎症誘発物質であるリポ多糖体（ＬＰＳ）と本発明の化合物をそれぞれ１０ｕＭ、３０ｕＭ、または１００ｕＭずつ同時に処理して２４時間培養した。その後、培養液５０ｕｌを９６ウェルプレートに採り、グリーズ試薬（Ｇｒｉｅｓｓ ｒｅａｇｅｎｔ）を５０ｕｌずつ加えて１０分間室温で反応させた。その後、ＥＬＩＳＡリーダーで５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。各化合物のＢＶ２細胞株から出たＩＣ５０の結果は、下記表４に「ＮＯ ｉｎ ＢＶ」の欄に示した。
【００９０】
下記表４の結果から分かるように、「ＮＯ ｉｎ ＢＶ」のうち化合物９のＩＣ５０は１．７９ｕＭであり、化合物１４のＩＣ５０は６．７ｕＭであって最も高い水準のＩＣ５０値を示した。ＮＯ生成に対する減少効果をＩＣ５０値で示したとき、大半の化合物が１００ｕＭより小さい値を持つことを確認することができた。このように本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体は、炎症反応に関与するＮＯ活性を効果的に阻害するため、抗炎症剤として非常に有効である。
【００９１】
１−２．遺伝子発現抑制効果
ＢＶ２細胞株で２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体の濃度別ｉＮＯＳ遺伝子の発現を観察した。ＢＶ２細胞株を１×１０６個になるように１００ｍｍディッシュに接種し、炎症誘導物質であるＬＰＳと２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体をそれぞれ１〜１００ｕＭ濃度範囲で一定濃度間隔で同時に処理した。２４時間培養した後、ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡは逆転写酵素反応（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）及び重合酵素反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った後、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１β、及びｉＮＯＳ遺伝子の発現様相を比べた。その結果を下記表４にまとめて示した。
【００９２】
下記表４に示されたように、炎症性サイトカインの遺伝子発現様相を対照群（ＬＰＳ処理群）と比べた結果、ＴＮＦ‐α遺伝子の発現は化合物２が６３．２４％減少させ、化合物８が７７．０５％減少させ、化合物９が６１．６７％減少させた。また、ＩＬ‐１β遺伝子の発現は化合物２が７５．１％、化合物５が６７．７％、化合物８、９、１０、及び１４がそれぞれ５０％以上減少させる様相を確認した。さらに、化合物２、５、８、１０、１５、及び１７はｉＮＯＳ遺伝子の発現を５０％以上抑制した。
【００９３】
【表４】
【００９４】
前記表４において、「ＮＤ」は測定されなかった（ｎｏｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）ことを意味する。
【００９５】
１‐３．サイトカインの生成抑制効果
ＢＶ２細胞株で２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体のサイトカイン生成の抑制効果を観察した。ＢＶ２細胞株を１×１０６個になるように２４ウェルプレートに接種し、炎症誘導物質であるＬＰＳとそれぞれ１００ｕＭの２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体または比較薬物とを同時に処理した。２４時間培養した後、培養液を採った。培養液はＥＬＩＳＡ法により、サイトカインであるＴＮＦ‐αとＩＬ‐６の量を測定した。その結果を下記表５にまとめて示した。
【００９６】
下記表５に示されたように、ＬＰＳによって生成されたＴＮＦ‐αの量を対照群（ＬＰＳ処理群）と比べた結果、化合物２が６２．２６％減少させ、化合物３が３１．９０％減少させ、化合物１４が６２．６％減少させる様相を確認した。また、比較薬物として使ったイブプロフェンとアスピリンは同じ濃度で減少効果を示さなかった。同様に、ＩＬ‐６の量も化合物２は明らかな減少効果を見せたが、比較群であるイブプロフェンとアスピリンはほとんど減少効果を見せなかった。
【００９７】
【表５】
【００９８】
前記表５において、「ＮＤ」は測定されなかった（ｎｏｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）ことを意味する。
【００９９】
＜実施例２＞基礎毒性評価
２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体化合物の単回毒性を評価し、その結果を図３２に示した。
【０１００】
図３２に示されたように、本発明の望ましい化合物２及び１８のＬＤ５０は３ｇ／ｋｇ以上と安全性が良好であると示された。しかし、化合物１９のＬＤ５０は０．５〜１ｇ／ｋｇと相対的に安全性が落ちている。また、化合物４は、抗炎症などの効果評価においては卓越な効果を見せたが、毒性実験の結果、３ｇ／ｋｇで急に動物群が死亡して濃度依存的な結果が得られなかった。さらに、化合物３及び１４は、化合物２と類似の構造を持ち抗炎症効果が類似したものの、毒性実験の結果、濃度依存的ではないか又は毒性が強く治療剤としては相対的に望ましくなかった。
【０１０１】
＜実施例３＞胃粘膜損傷の誘発可否に対する安全性評価
従来のＮＳＡＩＤ系消炎剤は胃粘膜損傷を起こす副作用があったため、抗炎症効果のある化合物２も胃粘膜損傷を誘発するか否かを実験した。比較群として３０、１００、及び３００ｍｇ／ｋｇのアスピリンを経口投与したときに発生する胃粘膜損傷を用いた。本発明による一実施例である化合物２は、かなり多い容量である１０００ｍｇ／ｋｇの経口投与群でも胃粘膜損傷を誘発せず、本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体は非常に安全であることが分かった（図１）。
【０１０２】
また、他のＮＳＡＩＤ系消炎剤であるインドメタシンとイブプロフェン、及び選択的ＣＯＸ‐２抑制剤であるセレコキシブを対照群として経口投与し、化合物１８の安全性を比較実験した。化合物１８を高容量で経口投与したが、胃粘膜損傷を誘発しなかった（図２）。
【０１０３】
＜実施例４＞細胞保護効果の評価
本発明による一実施例である２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体の細胞保護効果を評価した。ＡＧＳ細胞株（ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ）を９６ウェルプレートに１×１０５個接種した。その後、それぞれにヘリコバクターを２４時間処理（図３）、スリンダク（ｓｕｌｉｎｄｏｃ）を１６時間処理（図４）、Ｈ２Ｏ２を８時間処理（図５）、またはエタノールを２４時間処理（図６）して胃粘膜細胞の死滅を誘導した。また、一部ＡＧＳ細胞株には、本発明の一実施例である化合物２をそれぞれ１０ｕＭ、３０ｕＭ、または１００ｕＭずつ同時に処理して２４時間培養した。ＭＴＴ溶液をそれぞれのウェルに添加した後、４時間３７℃で反応させた。その後、ＥＬＩＳＡリーダーで５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、胃粘膜細胞の生存率を計算した。その結果、１ｕＭ及び１０ｕＭの化合物２では５０％以上の細胞保護効果を見せ、１００ｕＭの化合物２は大半の細胞死滅モデルで７０％以上の細胞保護効果を見せた。
【０１０４】
また、炎症の一マーカーとして、サイトカインの１つであるＴＮＦ‐αのｍＲＮＡの発現程度をＲＴ−ＰＣＲ法を用いて評価した。エタノールを２４時間処理したサンプルを用いて評価した。１〜１００ｕＭの化合物２は、ＴＮＦ‐αのｍＲＮＡ発現をほとんど完全に抑制した（図７）。
【０１０５】
このような結果から、本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体が炎症疾患、特にさまざまな原因による胃炎で細胞保護及び炎症抑制に有効であることを確認することができる。特に、本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体は、炎症疾患治療剤として知られたムコスタ（ｍｕｃｏｓｔａ）及びＰＰＩより優れた効果を示した。
【０１０６】
＜実施例５＞胃腸管出血の防御効果
５−１．アルコール及び塩酸誘導胃炎
本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体がアルコール及び塩酸誘導胃炎に及ぶ効果を評価した。２００〜２５０ｇの雄ＳＤマウスを２４時間絶食させた後、６０％ ＥｔＯＨ／１５０ｍＭ ＨＣｌを経口投与して胃腸管出血を誘導した。胃腸管出血の３０分前に容量別に化合物２を経口投与し、胃腸管出血の９０分後に胃を摘出して胃損傷の程度を観察した。その結果、本発明による一実施例である化合物２は胃腸管出血を防御し、毒性もなかった。その結果を図８にまとめて示した。
【０１０７】
５‐２．アルコール性胃炎
本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体がアルコール性胃炎に及ぼす効果を評価した。２５０ｇのマウスを２４時間絶食させた後、アルコールを経口投与すれば胃腸管出血が起きるが（Ｂ）、化合物２を１時間前に前処理する場合（Ｃ）胃の出血が著しく減少した。その結果を図９のＤに数値化して示した。このような結果から、本発明の化合物２はアルコール性胃炎に強力な保護作用を示すと言える。
【０１０８】
アルコール性胃炎は胃酸分泌抑制剤や胃防御因子増強剤でも予防及び治療効果が容易には現れないため、アルコール性胃炎は他の原因による胃炎より治療効果を期待し難い。これは、アルコールが直接的毒性及び炎症媒介、出血誘導などの形態で病気を誘発するためである。本発明による一実施例である化合物２が、このようなアルコールの直接的毒性を著しく減少させると考えられる。
【０１０９】
５‐３．ＮＳＡＩＤ誘導胃炎
本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体が、ＮＳＡＩＤ誘導胃炎に及ぼす効果を評価した。ＮＳＡＩＤであるインドメタシンを６時間投与し胃損傷を弱く誘発させたモデル（図１０のＡ）、及びインドメタシンを１２時間投与してかなりの胃損傷を誘発させたモデル（図１０のＣ）で、化合物２は卓越な胃保護効能を見せた（図１０のＢ及びＤ）。
【０１１０】
＜実施例６＞関節炎動物モデルにおける薬効評価
６−１．カラゲナン誘導炎症モデル：鎮痛効果の評価
本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体の一例である化合物２が持つ関節炎モデルにおける鎮痛効能を評価した。２％カラゲナンを白いマウスの左側足部に注射した後、３〜３００ｍｇ／ｋｇの化合物２を経口投与してカラゲナンによって誘導される関節炎モデルにおける温熱性痛覚過敏症に及ぼす化合物２の影響を観察した。その結果を図１０に示した。
【０１１１】
化合物２は濃度依存的に温熱性痛覚過敏症を減少させた。３００ｍｇ／ｋｇの化合物２は温熱性痛覚過敏症を９０％以上減少させた。また、抗炎症剤として知られているイブプロフェン５０ｍｇ／ｋｇと同じ程度の抑制効果を化合物２を１００ｍｇ投与した群で観察することができた。
【０１１２】
６−２．ザイモサン誘導炎症モデル：サイトカイン評価
ザイモサンを用いて本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体の一例である化合物２が持つ関節炎モデルにおける抗炎症効能を評価した。１％ザイモサン０．５ｍｌをエアパウチ内に注入し、ザイモサン投与の１時間前に３〜３００ｍｇ／ｋｇの化合物２を単回投与した。４時間後に関節炎の主な症状である浮腫と病因であるサイトカインの濃度を観察した。その結果、化合物２は３０ｍｇ／ｋｇから対照群に比べてＴＮＦ‐αの量を減少させる効果を示し、３００ｍｇ／ｋｇまで濃度依存的に減少させた。比較群として炎症疾患治療剤で知られているイブプロフェン（５０ｍｇ／ｋｇ）を使った（図１２）。ＩＬ‐１αも同様に濃度依存的に減少した（図１３）。このような結果から本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体は、炎症疾患、特に関節炎に効果があることを把握することができる。
【０１１３】
６−３．コラーゲン誘導関節炎動物モデルの評価
本発明による一実施例である２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体の有効性を評価するために、リュウマチ性関節炎動物モデルであるコラーゲン誘導関節炎モデルを使った。Ｂｏｖｉｎｅ ｔｙｐｅ ＩＩコラーゲンをｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔと混ぜて乳剤を製造した。８〜１０週のＤＢＡ／１ＬａｃＪマウスのしっぽの基始部に前記乳剤を皮内注射した。２週後に同様の方法で皮内注射した。２次コラーゲン皮内注射の１週間後、腹腔に化合物２、３、及び１８を２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、比較群としてメトトレキサート１ｍｇ／ｋｇ／ｗｅｅｋを注射し、対照群として１０％ビヒクルを注射した（図１５）。図１４に、正常マウス（ｓｈａｍ）、コラーゲンを投与したマウス（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、及び化合物１８を投与したマウス（化合物１８、化合物１８を２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ注射）の足浮腫を撮影した写真を示した。
【０１１４】
また、腹腔に２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体のうち化合物６と化合物１１を５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、比較群としてメトトレキサート５ｍｇ／ｋｇ／２ｄａｙを注射した。対照群としてリン酸緩衝生理食塩水を注射した（図１６）。２〜３週間関節炎の発生程度を毎日観察し、その結果を浮腫による下記関節炎指数（ａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｉｎｄｅｘ）で評価した。関節炎指数で評価した結果、化合物２、３、１８、及び化合物６、１１は明らかな減少効果を見せた（図１５及び１６）。
【０１１５】
−関節炎指数−
４本の足を０〜４点で評価、総１６点
０点−正常
１点−足根骨に限られた軽い浮腫と発赤
２点−足首関節から足根骨にわたる軽い浮腫と発赤
３点−足首関節から中足骨にわたる中程度の浮腫と発赤
４点−足首関節から足指全体にわたる浮腫と発赤
＜実施例７＞炎症性腸疾患動物モデルにおける薬効の評価
炎症性腸疾患モデルとして５％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）モデルを使用した。５％ＤＳＳを飲み水に混ぜて経口投与した。５％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）モデルは上皮細胞に損傷を誘発し、主に左側大腸の潰瘍と大腸長さの縮小などが観察される。このようなモデルは投与容量に応じて一定程度の炎症が誘発される比較的簡単且つ再現性の高いモデルである。したがって、新しい薬剤の効能評価に多く使用される。
【０１１６】
ＤＳＳを飲み水ボトルに刺しておき、攝取させ続けた。本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体化合物は１０％ビヒクルで懸濁して経口投与した。
【０１１７】
ＤＳＳを処理した結果、大腸の長さと幅が変化した。化合物１８を処理した群では有意義に大腸の長さと幅が変化した（図１７、１８及び１９）。この結果は、大腸炎モデルにおける本発明の化合物が防御効果を奏することを示す。
【０１１８】
また、排泄物状態として血便、肛門の汚ない程度、及び下痢を毎日測定した。スルファサラジンと化合物１８の両方ともＤＳＳ処理群に比べ、排泄物スコアが有意義に減少した（図２０）。
【０１１９】
＜実施例８＞急性膵臓炎動物モデルにおける薬効の評価
急性膵臓炎モデルとして、セルレイン誘導膵臓炎モデルを使用した。セルレインはコレシストキニンの類似体であって、膵臓で膵臓消化酵素の分泌を誘発するホルモンである。腹腔注射でセルレイン（５０μｇ／ｋｇ）を投与することで膵臓に消化酵素を過度に分泌させた。２時間が経過した後、ＬＰＳを投与することで浮腫を誘発させた。セルレイン投与時、脾臓を基準にして全体的に浮腫が過度に起きたことが観察された。また、２５ｍｇ／ｋｇの化合物１８を投与したとき、その浮腫を減少させることを確認することができた（図２１）。図２１のＤは、このような浮腫によって増加する膵臓の重さを測定した結果である。化合物１８の投与群は、膵臓の重さを有意義に減少させることを確認することができる。
【０１２０】
図２２は、膵臓消化酵素であるアミラーゼとリパーゼの血漿内の濃度を測定したものである。上記のモデルでは、消化酵素が過度に増加して血液に放出される。結局、血液内の消化酵素の増加を抑制させるということは膵臓炎を低減させたことの間接的な証拠になる。図２２は、アミラーゼとリパーゼが前記膵臓炎動物モデルにおける血漿で増加し、また２５ｍｇ／ｋｇの化合物１８を投与したとき、このような増加を有意義に減少させたことを示す。
【０１２１】
炎症の防御効果を確認するために、炎症性サイトカインであるＴＮＦ‐αとＩＬ‐１βの量を測定した。炎症酵素であるＣＯＸ‐２の生成物であるＰＧＥ２をＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。膵臓炎モデルで炎症マーカーとして使用したＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１β、及びＰＧＥ２が全て過度に増加したことを確認することができ、化合物１８がこのような炎症マーカーを有意義に減少させることを確認することができた（図２３及び２４）。
【０１２２】
＜実施例９＞ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ｄｅｌｔａＥ９二重遺伝子組み換え痴呆マウスにおける化合物２の薬効評価
９−１．ＥＬＩＳＡ分析によるサイトカインの減少効果
３．５ヶ月から１０．５ヶ月までのＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスに、化合物２を２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙあるいはイブプロフェン６２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを飼料に混合して長期投与した。総７ヶ月間薬物を投与した後、ＥＬＩＳＡを通じてＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１β、及びＩＬ‐６の量を定量的に分析した（ｍｅａｎ±ＳＥＭ、ｎ＝３−５）。図２５において「＊」は、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ ｔｅｓｔによる一元変量分析（Ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）時、一般飼料のみを供給したＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスに比べてｐ＜０．０５の有意差を見せることを示す。
【０１２３】
実験結果、化合物２の投与群はＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスに比べてＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１β、及びＩＬ‐６の量全てが有意義に減少した（図２５）。
【０１２４】
９−２．脳血管障壁に対する化合物２の保護効果
アルツハイマー病で脳血管損傷が発生することは広く知られている。脳血管障壁の損傷に対する化合物２と比較群であるイブプロフェンの効果を評価した。５ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスに２％ Ｅｖａｎｓ ｂｌｕｅ ｄｙｅ ３ｍｌ／ｇを血管に注入した。薬物は、生後２ヶ月から５ヶ月まで化合物２（２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）または比較薬物であるイブプロフェン（６２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を飼料に混合して投与した。その結果、図２６のＢと図２６のＦのように、正常マウスに比べてｃｏｒｔｅｘ、ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ、及びｔｈａｌａｍｕｓでＥｖａｎｓ ｂｌｕｅ ｄｙｅの透過度が増加することを確認することができた。また、図２６に示されたように、化合物２の投与群（図２６のＣ及びＧ）及びイブプロフェンの投与群（図２６のＤ及びＨ）で脳血管障壁の保護効果を確認することができた。
【０１２５】
９−３．チオフラビン色素染色法（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ‐Ｓ ｓｔａｉｎ）を用いた化合物２のアミロイドプラーク減少効果
チオフラビン色素染色法を用いて本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体が痴呆に及ぼす影響を評価した。総７ヶ月間（３．５〜１０．５ヶ月齢ＡＰＰ／ＰＳ１）化合物２を２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙずつ投与した。化合物２の投与群は一般飼料のみを供給したＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスに比べてアミロイドプラークの量が約５３％減少した（図２７）。また、総４ヶ月間（８．５〜１２．５ヶ月齢ＡＰＰ／ＰＳ１）化合物１を２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与した群は、一般飼料のみを供給したＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスに比べてアミロイドプラークの量が約４９．３％減少した。
【０１２６】
９−４．高架式十字迷路の遂行能力評価による化合物２の行動改善効果
３．５ヶ月から１０．５ヶ月までのＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスに化合物２を２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ飼料に混合して長期投与した。総７ヶ月間薬物を投与した後、行動改善効果を検証するために高架式十字迷路テストを行った。高架式十字迷路は２つのｏｐｅｎ ａｒｍｓ（３０ｃｍ×６ｃｍ×０．５ｃｍ）と２つのｃｌｏｓｅｄ ａｒｍｓ（３０ｃｍ×６ｃｍ×１５ｃｍ）で構成され、６ｃｍ×６ｃｍのｃｅｎｔｅｒ ｐｌａｔｆｏｒｍがある。高架式十字迷路テストにおいて、中央地点にｏｐｅｎ ａｒｍｓに向かって慎重にマウスをおいた後、５分間実験動物がｏｐｅｎ ａｒｍに留まる時間を測定して分析した（ｍｅａｎ±ＳＥＭ、ｎ＝３−５）。図２８において「＊」は、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ ｔｅｓｔによる一元変量分析時、ＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスに比べてｐ＜０．０５の有意差を見せることを示す。
【０１２７】
その結果、７ヶ月間薬物を投与した後、１０．５ヶ月齢の一般飼料のみを提供したＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスと比べたところ、化合物２の投与群はｏｐｅｎ ａｒｍに留まる時間がさらに短いことが確認できた（図２８）。
【０１２８】
＜実施例１０＞Ｇ９３Ａ ＡＬＳ動物モデルにおける化合物２の薬効評価
１０−１．ミクログリア活性化の減少効果
退行性脳疾患の１つであるＡＬＳ（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）における薬物効果を測定するために、実際患者と類似の病理的特徴を持つ形質組み替え動物モデルＧ９３Ａ（Ｇｌｙｃｉｎｅ⇒Ａｌａｎｉｎｅ）マウスを用いた。
【０１２９】
ＴＯＭＡＴＯ Ｌｅｃｔｉｎ ｄｙｅ染色を通じてＧ９３Ａマウスの脊髄前角内に発現されるミクログリア（脳疾患モデルにおける炎症の１つのマーカー）の活性化程度を確認した。Ｇ９３Ａマウスは正常マウスに比べて観察されるミクログリアの活性化程度が著しく増加した。また、５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの化合物２を投与したとき、活性化されたミクログリアを減少させることが確認できた（図２９）。
【０１３０】
１０−２．サイトカインの発現減少効果
一般飼料のみを提供した１６週齢のＧ９３Ａマウス及び５ｍｇ／ｋｇ／ｄの化合物２投与群の脊髄部位を摘出した。ＲＮＡを分離した後、ＲＴ−ＰＣＲを通じて炎症性サイトカインであるＴＮＦ‐α及びＩＬ‐１β ｍＲＮＡの発現程度を確認した。その結果、化合物２の投与群は炎症性サイトカインを有効に減らすことが観察できた（図３０）。
【０１３１】
＜実施例１２＞パーキンソン病動物モデルにおける化合物２の薬効評価
Ｃ５７／ＢＬ６マウス（雄／８週齢）にＭＰＴＰ（４０ｍｇ／ｋｇ）のみを皮下注射するか、またはＭＰＴＰを注射する３０分前から化合物２を５０ｍｇ／ｋｇずつ毎日腹腔注射した。２日後に脳組織を摘出した。脳組織をＣＤ１１ｂ免疫染色し、反応させた後、ＤＡＢ（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）で発色させた。光学顕微鏡でミクログリア（脳疾患モデルにおける炎症の１つのマーカー）の活性化程度を観察した（図３１）。
【０１３２】
その結果、ＭＰＴＰによって誘導されるミクログリアの活性が化合物２の投与によって減少することが分かった。
【０１３３】
以下、本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩が適用され得る炎症疾患の具体的な例についてより詳細に説明する。下記の適用例は、本発明を例示するものにすぎず、本発明の範囲が下記の適用例に限定されることはない。本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、多様な炎症疾患の治療または予防に有効に使用することができる。
【０１３４】
＜適用例１＞胃炎
本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体は、細胞培養実験によってアルコール誘導、ヘリコバクター・ピロリ誘導、ＮＳＡＩＤ誘導、及びＨ２Ｏ２誘導された細胞の死滅を効果的に防止した。本発明の化合物の効果は従来の胃炎などの細胞防御効果を持つ薬物であるムコスタまたはＰＰＩに比べて卓越であった。また、本発明の化合物は動物モデルにおける実験結果から、アルコール誘導による胃炎などの治療に優れた効果を示し、消炎鎮痛剤として使われているＮＳＡＩＤによる胃炎を緩和した。アスピリンと比較実験した結果、アスピリンよりさらに高容量を投与したマウスの胃で出血を誘導せず、安全性が確保された。したがって、本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体は胃炎の治療及び予防に非常に有効である。
【０１３５】
＜適用例２＞大腸炎（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｌ Ｄｉｓｅａｓｅ、ＩＢＤ）
シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）の産物であるプロスタグランジンとリポオキシゲナーゼの産物であるロイコトリエン（ＬＴＢ４）は、潰瘍性大腸炎のような炎症性疾患の炎症反応で重要な役割を占めると知られている。５‐リポオキシゲナーゼ（５‐ＬＯＸ）の抑制剤であるジレウトン（ｚｉｌｅｕｔｏｎ）とＮＳＡＩＤであるスルファサラジンは、腸損傷動物モデルにおける炎症の程度を現わす指標として使われるＭＰＯ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）の活性を減少させた（Ｓｉｎｇｈ ＶＰ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ．２００４；４２（７）：６６７−７３）。また、ＣＯＸ‐２選択的抑制剤であるニメスリド（ｎｉｍｅｓｕｌｉｄｅ）は、２つの異なる（酢酸誘導及びＬＴＢ４誘導ＩＢＤ）腸損傷動物モデルにおいて保護効果を見せた。ニメスリドは炎症反応においてＭＰＯ活性を著しく抑制した（Ｓｉｎｇｈ ＶＰ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ Ｏｔｈｅｒ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｄｉａｔ．２００３；７１（３−４）：１６３−７５）。したがって、抗炎症効果のある本発明の化合物は大腸炎の治療に非常に有効に利用することができる。
【０１３６】
＜適用例３＞リュウマチ性関節炎
本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体は、コラーゲン誘導関節炎モデルにおいて従来関節炎治療剤として処方されているが副作用のあるメトトレキサートに比べ、ほぼ同じかまたは多少優れた効果を見せた。また、本発明の化合物はカラゲナン誘導痛覚過敏症に対する鎮痛緩和効果及びザイモサン誘導炎症性サイトカインの生成を抑制した。したがって、本発明の化合物は従来の炎症治療剤として使われる薬物と同等の効能を持ちながらも、安全性が確保されたリュウマチ性関節炎治療剤として使用することができる。
【０１３７】
＜適用例４＞膵臓炎
急性膵臓炎は、膵液の消化酵素または胆石症による胆汁が膵臓内に逆流して膵臓組織を自己消化して生じる炎症である。少しの浮腫からひどい出血まで多様な症状を現わし、これにより膵臓のさまざまな損傷をもたらす。膵臓炎は炎症と関連があるという報告が数多くあり、ＣＯＸ抑制剤による膵臓炎モデルの保護効果、及び炎症マーカーであるＴＮＦ‐α及びプロスタグランジン生成の抑制効果が報告された（Ｓｏｎｇ ＡＭ ｅｔ ａｌ．、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００２；２８３（５）：Ｇ１１６６−７４）。本発明の化合物は膵臓炎の治療に非常に有効に利用することができる。
【０１３８】
＜適用例５＞糖尿病性炎症及び痛症
第２型糖尿病で抗炎症及び鎮痛の役割が重要視されている。さらに、抗炎症効果を持っている多くの治療剤が、第２型糖尿病の兆候を減少させるか又は発病時点を遅らせるという証拠が報告されている（Ｄｅａｎｓ ＫＡ ｅｔ ａｌ．、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｔｈｅｒ．２００６；８（１）：１８−２７）。抗炎症化合物であるリソフィリン（ｌｉｓｏｆｙｌｌｉｎｅ）は、ストレプトゾトシン投与マウスにおいてＩＦＮ‐γとＴＮＦ‐αを抑制することで糖尿の症状を５０％以上減少させた（Ｙａｎｇ Ｚ ｅｔ ａｌ．、Ｐａｎｃｒｅａｓ．２００３；２６（４）：ｅ９９−１０４）。したがって、抗炎症効果のある本発明の化合物は糖尿病性炎症及び痛症の治療及び／または予防に非常に有効に利用することができる。
【０１３９】
＜適用例６＞動脈硬化
アポリポタンパク質Ｅ‐欠乏（ａｐｏＥ（−／−））マウスの初期アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｌｅｓｉｏｎ）において、選択的なＣＯＸ‐２抑制剤（例えば、ロフェコキシブ及びＮＳ‐３９８）と非選択的なＣＯＸ抑制剤（例えば、インドメタシン）はアテローム性動脈硬化症をそれぞれ約３５〜３８％及び約３８〜５１％減少させた（Ｂｕｒｌｅｉｇｈ ＭＥ Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２００５ Ｓｅｐ；３９（３）：４４３−５２）。したがって、抗炎症効果のある本発明の化合物は、動脈硬化の治療に有効に利用することができる。
【０１４０】
＜適用例７＞アルツハイマー性痴呆
アルツハイマー性痴呆は痴呆の原因のうち最も一般的な形態である。病理組織学的には、神経繊維のもつれ、アミロイドプラーク、深刻な神経細胞の死滅などがアルツハイマー性痴呆の特徴である。
近年、アルツハイマー性痴呆が炎症と関連があるという論文が数多く報告されている。痴呆動物モデルでミクログリア及び炎症性サイトカインの生成が増加するという報告が多い（Ｍｉｎｇｈｅｔｔｉ Ｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００５、１８：３１５−３２１）。また、炎症を抑制する薬物の投与はアルツハイマー性痴呆動物モデルで保護効果を奏し得ると知られている（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ＫＰ ａｎｄ Ｐｒａｔｉｃｏ Ｄ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．２００５；１９（１２）：１５９２−６０１）。
【０１４１】
したがって、細胞保護効果及び抗炎症効果を示す本発明の化合物はアルツハイマー性痴呆の治療剤として有効に利用することができる。
【０１４２】
＜適用例８＞ＡＬＳ
ルーゲーリック病は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ：ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、運動（うんどう）ニューロン疾患（ＭＮＤ：ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）などと呼ばれる病気であり、運動神経細胞が退行性変化によって漸次損傷することがこの疾患の特徴である。
また、ＡＬＳが炎症と関連があるという論文が数多く報告されているが、ＡＬＳ動物モデルであるＧ９３Ａマウスでミクログリア及び炎症性サイトカインの生成が増加するという報告が多く（Ｗｅｙｄｔ Ｐ ａｎｄ Ｍｏｌｌｅｒ Ｔ．Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．２００５、２５；１６（６）：５２７−３１）、炎症を抑制する薬物の投与はＡＬＳ動物モデルにおける保護効果を奏し得ることも知られている（Ｗｅｓｔ Ｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００４；９１（１）：１３３−４３）。
したがって、本発明の化合物はルーゲーリック病の治療に有効に利用することができる。
【０１４３】
＜適用例９＞パーキンソン病
パーキンソン病は、黒質に存在するドーパミン神経細胞の死滅が伴われ、振戦、筋肉硬直、非正常的姿勢、運動不能などの多様な症状を現わす退行性神経系疾患である。
パーキンソン病が炎症と関連があるという論文が数多く報告されている。パーキンソン病でミクログリア及び炎症性サイトカインの生成が増加するという報告が多く（Ｇａｏ ＨＭ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ．２００３；２４（８）：３９５−４０１；Ｍｉｎｇｈｅｔｔｉ Ｌ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ．２００５；１８（３）：３１５−２１）、炎症を抑制する薬物の投与はパーキンソン病動物モデルにおける保護効果を奏すると知られている（Ｇａｏ ＨＭ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ．２００３；２４（８）：３９５−４０１）。
【０１４４】
したがって、細胞保護効果及び抗炎症効果を持つ本発明の化合物はパーキンソン病の治療に非常に有効に利用することができる。
【０１４５】
〔産業上の利用可能性〕
本発明は、炎症疾患の治療または予防に有用な前記化学式１で表れる２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩を含むことを特徴とする薬学組成物、及びこのような薬学組成物を用いる炎症疾患の治療または予防方法を提供する。本発明による薬学組成物は、胃炎、大腸炎、関節炎、糖尿病炎症、膵臓炎、動脈硬化、腎臓炎、肝炎、アルツハイマー性痴呆、ルーゲーリック病、パーキンソン病などのような炎症疾患の治療または予防に非常に有効であるだけでなく、安全性に優れる。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】図１は、化合物２が胃の粘膜損傷を誘発せず安全であることを示す実験結果である。胃粘膜の損傷程度を確認するために、直接薬物を容量別に経口投与した。比較群としてアスピリンを使用した。
【図２】図２は、胃粘膜の損傷程度を確認するために試料を表示された容量どおり経口投与した結果である。化合物１８は高容量を投与したにもかかわらず胃粘膜の損傷を誘発しなかった。比較群としてインドメタシン、イブプロフェン及びセレコキシブを使用した。
【図３】図３は、ヘリコバクターによって誘導される胃粘膜の損傷を用いた化合物２の細胞保護効果の評価結果である。培養されたＡＧＳ（ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）細胞にヘリコバクター（４３５０４、５×１０８ｃｆｕ／ｍｌ）を単独でまたは標識された濃度のサンプルと共に添加した。添加して２４時間後に、ＭＴＴ分析方法を用いて胃粘膜細胞の生存率を測定した。
【図４】図４は、ＮＳＡＩＤであるスリンダク（ｓｕｌｉｎｄａｃ）によって誘導される胃粘膜損傷を用いた化合物２の細胞保護効果の評価結果である。培養されたＡＧＳ細胞に１００ｕＭスリンダクを単独でまたは標識された濃度のサンプルと共に添加した。添加して１６時間後に、ＭＴＴ分析方法を用いて胃粘膜細胞の生存率を測定した。
【図５】図５は、酸化ストレスであるＨ２Ｏ２によって誘導される胃粘膜損傷を用いた化合物２の細胞保護効果の評価結果である。培養されたＡＧＳ細胞に１００ｕＭのＨ２Ｏ２を単独でまたは標識された濃度のサンプルと共に８時間処理した後、培養液でさらに洗滌した。２４時間後にＭＴＴ分析方法を用いて胃粘膜細胞の生存率を測定した。
【図６】図６は、アルコール（エタノール）によって誘導される胃粘膜損傷を用いた化合物２の細胞保護効果の評価結果である。培養されたＡＧＳ細胞に２５ｍＭのエタノールを単独でまたは標識された濃度のサンプルと共に２４時間処理した。その後、ＭＴＴ分析方法を用いて胃粘膜細胞の生存率を測定した。
【図７】図７は、ＴＮＦ‐α ｍＲＮＡの発現程度を示した写真である。培養されたＡＧＳ細胞に２５ｍＭのエタノールを単独でまたは標識された濃度の化合物２と共に２４時間処理した。その後、ｍＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲ法によって評価した。
【図８】図８は、アルコール／塩酸（ＥｔＯＨ／ＨＣｌ）によって誘導される胃腸管出血を用いた化合物２の保護効果を評価した結果である。Ａは正常マウスの胃の写真である。Ｂは２００〜２５０ｇのマウスを２４時間絶食させた後、６０％ ＥｔＯＨ／１５０ｍＭ ＨＣｌを経口投与して胃腸管出血を誘導した写真である。Ｃはアルコール／塩酸を投与する３０分前に化合物２で前処理し、胃腸管出血を起こして９０分後に胃を摘出して観察した写真である。Ｄは胃損傷の程度を観察するために損傷された面積を定量したグラフである。
【図９】図９は、アルコール性胃炎に対する化合物２の保護作用を評価した結果である。Ａは正常マウスの胃の写真である。Ｂは２５０ｇのマウスを２４時間絶食させた後、エタノール（４ｍｌ／ｋｇ）を経口投与して胃腸管出血を誘導した写真である。Ｃは化合物２を胃腸管出血誘導の１時間前に前処理した後、胃腸管出血を起こして９０分後に胃を摘出して観察した写真である。Ｄは胃損傷の程度を観察して定量したグラフである。
【図１０】図１０は、ＮＳＡＩＤ誘導胃炎に対する化合物２の保護作用を示す写真である。２５０ｇのマウスを２４時間絶食させた後、インドメタシンを経口投与（Ａ及びＣ）すれば胃腸管出血が起きる。化合物２を１時間前に処理（Ｂ及びＤ）し、胃腸管出血を起こして６時間（Ａ及びＢ）または１２時間（Ｃ及びＤ）後に胃を摘出した写真である。
【図１１】図１１は、関節炎動物モデルの１つであるカラゲナン（Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）によって誘導される温熱性痛覚過敏症（ｔｈｅｒｍａｌ ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ）を用いた化合物２の効果評価の結果である。２％カラゲナンをマウスの足部に皮内注射して温熱性痛覚過敏症を誘導した。化合物２は経口投与し、イブプロフェンを比較群として使用した。
【図１２】図１２は、関節炎動物モデルの１つであるザイモサン（ｚｙｍｏｓａｎ）によって誘導されるＴＮＦ‐αの量を用いた化合物２の効果評価の結果である。１％ザイモサンをエアパウチで注入し、投与１時間の前に化合物２を容量別に単回経口投与した。４時間後に、エアパウチ滲出物からＴＮＦ‐αの量をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【図１３】図１３は、関節炎動物モデルのうちの１つであるザイモサンによって誘導されるＩＬ‐１αの量を化合物２が減少させる程度を示すグラフである。１％ザイモサンをエアパウチで注入し、投与１時間の前に化合物２を容量別に単回経口投与した。４時間後に、エアパウチ滲出物からＩＬ‐１αの量をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【図１４】図１４は、コラーゲンによって誘導される関節炎動物モデルを用いた効果評価の結果であり、コラーゲンによる足の浮腫を示す。Ｓｈａｍ：正常マウスＣｏｌｌａｇｅｎ：コラーゲンを注射したマウス化合物１８：２５ｍｇ／ｋｇの化合物１８を腹腔注射したマウス
【図１５】図１５は、コラーゲンによって誘導される関節炎動物モデルを用いた効果評価の結果である。コラーゲン投与後、２５ｍｇ／ｋｇの化合物２、３または１８及び対照群であるメトトレキサート（ＭＴＸ、１ｍｇ／ｋｇ／ｗｅｅｋ）を腹腔注射した。その後、４週間目視で観察した結果を関節炎指数として評価した。
【図１６】図１６は、コラーゲンによって誘導される関節炎動物モデルを用いた化合物６及び１１の効果評価の結果である。コラーゲンを２週間隔で２回皮内注射し、１週間後に化合物６、化合物１１、及び対照群であるメトトレキサートを腹腔注射した。その後、２〜３週間毎日観察した結果を関節炎指数として評価した。
【図１７】図１７は、炎症性腸疾患動物モデルである５％デキストラン硫酸ナトリウム（Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ、ＤＳＳ）モデルを用いた効果評価の結果である。ＤＳＳを処理した後、１０％ビヒクルに懸濁して１０、２５、５０ｍｇ／ｋｇの化合物１８を経口投与した。Ｓｈａｍは正常マウスの大腸であり、ＤＳＳは５％ＤＳＳを処理したマウスの大腸である。その他は各容量の化合物１８を投与したマウスの大腸写真である。
【図１８】図１８及び１９は、図１７の結果を定量化したグラフである。図１８は大腸の長さであり、図１９は大腸の広さである。
【図１９】図１８及び１９は、図１７の結果を定量化したグラフである。図１８は大腸の長さであり、図１９は大腸の広さである。
【図２０】図２０は、ＤＳＳを用いた化合物１８の効果評価の結果である。ＤＳＳを処理した後、１０％ビヒクルに懸濁して化合物１８（２５ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。その後、大腸の損傷による血便、下痢、及び汚ない程度を点数に換算して示した。
【図２１】図２１は、セルレイン（ｃｅｒｕｌｅｉｎ）によって誘導される急性膵臓炎モデルを用いた効果評価の結果である。５０μｇ／ｋｇのセルレインを投与して２時間が経過した後、ＬＰＳを投与して浮腫を誘発した。Ａ−Ｃは写真結果であり、Ｄは膵臓の重さを測定して示したグラフである。Ａ：正常マウスＢ：セルレインを投与したマウスＣ：化合物１８（２５ｍｇ／ｋｇ）を投与したマウス
【図２２】図２２は、セルレインによって誘導される急性膵臓炎モデルを用いた効果評価の結果である。５０μｇ／ｋｇのセルレインを投与して２時間が経過した後、ＬＰＳを投与して浮腫を誘発した。２５ｍｇ／ｋｇの化合物１８を投与し、膵臓消化酵素であるアミラーゼとリパーゼの変化を定量化して示した。
【図２３】図２３及び図２４は、セルレインによって誘導される膵臓炎モデルを用いた評価結果である。本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体が炎症マーカーであるＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１β及びＰＧＥ２に及ぼす影響を評価した。
【図２４】図２３及び図２４は、セルレインによって誘導される膵臓炎モデルを用いた評価結果である。本発明の２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体が炎症マーカーであるＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１β及びＰＧＥ２に及ぼす影響を評価した。
【図２５】図２５は、１０．５ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウス（Ｔｇ＋）の脳でＥＬＩＳＡ法を用いてＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１βまたはＩＬ−６の量を測定したグラフである。３ヶ月から７ヶ月の間、化合物２（２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）あるいはイブプロフェン（６２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を飼料に混合して長期投与した。
【図２６】図２６は、脳血管障壁に対する化合物２の保護効果を示す写真（低倍率と高配率）である。Ａ：正常マウスＢ／Ｆ：ＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスＣ／Ｇ：化合物２（２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）投与Ｄ／Ｈ：イブプロフェン（６２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）投与
【図２７】図２７は、１０．５ヶ月齢の正常マウス（Ａ）、１０．５ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウス（Ｂ、Ｔｇ＋）、３．５ヶ月から７ヶ月間化合物２（２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ、Ｃ）あるいはイブプロフェン（６２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄ、Ｄ）を飼料に混合して長期投与したＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウスの脳で生成されたアミロイドプラークを測定した写真である。チオフラビン（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ‐Ｓ）で免疫染色した。ＥはＡ−Ｄの結果を定量化したグラフである。
【図２８】図２８は、１０．５ヶ月齢の正常マウス、１０．５ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１痴呆マウス、３．５ヶ月から７ヶ月間化合物２（２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ）を飼料に混合して長期投与した１０．５ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスを用いて高架式十字迷路テストを行った結果である。それぞれの実験動物がｏｐｅｎ ａｒｍに留まる時間で効果を評価した。
【図２９】図２９は、Ｇ９３Ａマウスで炎症のマーカーであるミクログリア活性を示す写真である。ＴＯＭＡＴＯレクチンで免疫染色した。Ａ：正常マウスＢ：Ｇ９３ＡマウスＣ：５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ化合物２投与群
【図３０】図３０は、Ｇ９３Ａマウスで炎症の一マーカーである炎症性サイトカイン（ＴＮＦ‐αとＩＬ‐１β）のｍＲＮＡレベルを示す結果である。ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）が使用された。
【図３１】図３１は、パーキンソン病の動物モデルで炎症に対する化合物２の抑制効果を示した写真である。ＣＤ１１ｂで免疫染色した。Ａ：ＭＰＴＰを投与したマウスＢ：５０ｍｇ／ｋｇ／ｄの化合物２投与群
【図３２】図３２は、本発明による幾つかの２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体化合物の単回投与毒性実験の結果である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で表れる２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含むことを特徴とする痛症の治療または予防用薬学組成物：
＜化学式１＞
【化１】
前記化学式１において、
ｎは２ないし５の整数であり、
Ｒ１は水素またはアルキルであり、
Ｒ２は水素、アルキルまたはアルカノイルであり、
Ｒ３は水素またはアセトキシであり、
Ｘは相互独立的に、水素、ニトロ、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシ、またはハロアルコキシである。
【請求項２】
前記２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体は、２‐ヒドロキシ‐５‐フェネチルアミノ‐安息香酸、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（３‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸、５‐［２‐（３，５‐ビス‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（２‐ニトロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸、５‐［２‐（４‐クロロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸、５‐［２‐（３，４‐ジフルオロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸、５‐［２‐（３，４‐ジクロロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸、５‐［２‐（４‐フルオロ‐２‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸、５‐［２‐（２‐フルオロ‐４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐メトキシ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸、２‐ヒドロキシ‐５‐（２‐ｏ‐トリル‐エチルアミノ）‐安息香酸、２‐ヒドロキシ‐５‐（３‐フェニル‐プロピルアミノ）‐安息香酸、２‐ヒドロキシ‐５‐［３‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐プロピルアミノ］‐安息香酸、５‐［３‐（４‐フルオロ‐フェニル）‐プロピルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸、５‐［３‐（３，４‐ジクロロ‐フェニル）‐プロピルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸、２‐ヒドロキシ‐５‐（３‐ｐ‐トリル‐プロピルアミノ）‐安息香酸、２‐アセトキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸、及び５‐［２‐（２‐クロロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸からなる群より選択されたいずれか１つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の炎症疾患の治療または予防用薬学組成物。
【請求項１】
下記化学式１で表れる２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体又はこれの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含むことを特徴とする痛症の治療または予防用薬学組成物：
＜化学式１＞
【化１】
前記化学式１において、
ｎは２ないし５の整数であり、
Ｒ１は水素またはアルキルであり、
Ｒ２は水素、アルキルまたはアルカノイルであり、
Ｒ３は水素またはアセトキシであり、
Ｘは相互独立的に、水素、ニトロ、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルコキシ、またはハロアルコキシである。
【請求項２】
前記２‐ヒドロキシ安息香酸誘導体は、２‐ヒドロキシ‐５‐フェネチルアミノ‐安息香酸、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（３‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸、５‐［２‐（３，５‐ビス‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（２‐ニトロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸、５‐［２‐（４‐クロロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸、５‐［２‐（３，４‐ジフルオロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸、５‐［２‐（３，４‐ジクロロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸、５‐［２‐（４‐フルオロ‐２‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸、５‐［２‐（２‐フルオロ‐４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸、２‐ヒドロキシ‐５‐［２‐（４‐メトキシ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸、２‐ヒドロキシ‐５‐（２‐ｏ‐トリル‐エチルアミノ）‐安息香酸、２‐ヒドロキシ‐５‐（３‐フェニル‐プロピルアミノ）‐安息香酸、２‐ヒドロキシ‐５‐［３‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐プロピルアミノ］‐安息香酸、５‐［３‐（４‐フルオロ‐フェニル）‐プロピルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸、５‐［３‐（３，４‐ジクロロ‐フェニル）‐プロピルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸、２‐ヒドロキシ‐５‐（３‐ｐ‐トリル‐プロピルアミノ）‐安息香酸、２‐アセトキシ‐５‐［２‐（４‐トリフルオロメチル‐フェニル）‐エチルアミノ］‐安息香酸、及び５‐［２‐（２‐クロロ‐フェニル）‐エチルアミノ］‐２‐ヒドロキシ‐安息香酸からなる群より選択されたいずれか１つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の炎症疾患の治療または予防用薬学組成物。
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１５】
【図１６】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２８】
【図３２】
【図１】
【図２】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１４】
【図１７】
【図２１】
【図２６】
【図２７】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１５】
【図１６】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２８】
【図３２】
【図１】
【図２】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１４】
【図１７】
【図２１】
【図２６】
【図２７】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【公開番号】特開２０１２−１５３７０４（Ｐ２０１２−１５３７０４Ａ）
【公開日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−７７９７４（Ｐ２０１２−７７９７４）
【出願日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【分割の表示】特願２００９−５０５３０３（Ｐ２００９−５０５３０３）の分割
【原出願日】平成１９年４月１３日（２００７．４．１３）
【出願人】（５０５２７４３７９）ニューロテック ファーマシューティカルズ カンパニー リミテッド (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【分割の表示】特願２００９−５０５３０３（Ｐ２００９−５０５３０３）の分割
【原出願日】平成１９年４月１３日（２００７．４．１３）
【出願人】（５０５２７４３７９）ニューロテック ファーマシューティカルズ カンパニー リミテッド (7)
【Ｆターム（参考）】
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