細胞放出物質検出装置、細胞放出物質検出方法および細胞放出物質検出用固定化酵素基板
【課題】細胞から放出されたヌクレオチド関連化学物質について、細胞組織上の濃度分布を検出する細胞放出物質検出装置、細胞放出物質検出方法および細胞放出物質検出用固定化酵素基板を提供すること。
【解決手段】ＧＡＰＤＨを固定化した透明基板１０に、細胞組織Ｓを載置し、ＧＡＰとＮＡＤ＋との存在下で、細胞組織Ｓ表面のＡＴＰが消費されＮＡＤＨが生じる。透明基板１０の側方に設けられた光源ユニット７からの照射光にて透明基板１０の表面にエバネッセント波Ｌ２を発生させ、透明基板１０の極近傍、即ち、細胞組織Ｓ表面のＮＡＤＨを蛍光発光させる。このように反応系を設計することにより、リボヌクレオチドであるＡＴＰを、反応で生成された蛍光物質（ＮＡＤＨ）が放射する蛍光によって検出することができる。
【解決手段】ＧＡＰＤＨを固定化した透明基板１０に、細胞組織Ｓを載置し、ＧＡＰとＮＡＤ＋との存在下で、細胞組織Ｓ表面のＡＴＰが消費されＮＡＤＨが生じる。透明基板１０の側方に設けられた光源ユニット７からの照射光にて透明基板１０の表面にエバネッセント波Ｌ２を発生させ、透明基板１０の極近傍、即ち、細胞組織Ｓ表面のＮＡＤＨを蛍光発光させる。このように反応系を設計することにより、リボヌクレオチドであるＡＴＰを、反応で生成された蛍光物質（ＮＡＤＨ）が放射する蛍光によって検出することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞組織から放出された細胞放出物質を検出する検出装置、検出方法、検出用固定化酵素基板に関し、特に、細胞組織から放出されたヌクレオチド関連化学物質について細胞組織上の濃度分布を検出する細胞放出物質検出装置、細胞放出物質検出方法および細胞放出物質検出用固定化酵素基板に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、アデノシン三リン酸（以下、単に「ＡＴＰ」と略す場合がある。）の定量には、生物発光であるルシフェリン／ルシフェラーゼ発光系が汎用的に用いられている（非特許文献１）。ＡＴＰ及びマグネシウムイオンの存在下で発光基質であるルシフェリンは、ルシフェラーゼによって発光体であるオキシルシフェリンに変換されて発光する。ＡＴＰの検出に際しては、一般に、被検体試料の細胞組織を破砕するなどして細胞抽出液を採取し、その細胞抽出液にルシフェリンとルシフェラーゼとが加えられる。そして、試料抽出液中のＡＴＰが消費されて生じるオキシルシフェリンの発光量を測定することによりＡＴＰ量が定量される。
【０００３】
ルシフェリン／ルシフェラーゼ発光法による試料中ＡＴＰの定量は、感度が良好であり迅速性にも優れているため、当該発光法以外のＡＴＰ定量方法はほとんど実用化されていない。
【０００４】
また、特許文献１には、ＡＴＰ増幅法とＡＴＰサイクリング法とを併用して試料中の微量ＡＴＰを検出する技術が開示されている。当該技術では、まず、アデニレートキナーゼとＡＭＰ(アデニル酸)とを用い、試料中のＡＴＰをＡＭＰと反応させて２分子のＡＤＰ（アデノシン二リン酸）を生成させ、生じた２分子のＡＤＰにポリリン酸キナーゼを作用させることで２分子のＡＴＰを発生させる。発生した２分子のＡＴＰは、再度、ＡＭＰと反応する基質となるため、ｎ回の反応を行うことにより、１個のＡＴＰは２ｎ個のＡＴＰに増幅される（ＡＴＰ増幅法）。その後、増幅に用いた酵素を不活化し、ＡＴＰサイクリング法にて再度ＡＴＰの増幅が実行される。そして、ＡＴＰサイクリング法を経た後、試料中のＡＴＰを酵素比色法または電気的定量法を用いて定量することで、当初試料中のＡＴＰ量が定量される。これにより、当初試料中の僅かなＡＴＰが定量できる。
【０００５】
更に、本願発明者らは、生体組織から放出された化学物質の濃度分布を、組織上の位置に対応つけて観察、測定するための小型化された光学装置を提案している（特許文献２）。この光学装置では、エバネッセント光を用い、ＧＡＢＡ、グルタミン酸などの化学物質の濃度分布を測定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２２３１６３号公報
【特許文献２】特開２００８−１３９２８０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】DeLuca, M., and McElroy, W.D., Kinetics of the firefly luciferase catalyzed reactions. Biochemistry, 26,921-925 (1974).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記特許文献１および非特許文献１に開示された技術は、いずれも試料抽出液中のＡＴＰを定量する手法であり、細胞から放出されるＡＴＰを直接的に検出、測定するものではない。このため、細胞組織上の濃度分布（ＡＴＰの空間分布）を把握することはできないという問題点があった。言い換えれば、従来の技術では、組織片のいずれの細胞からＡＴＰが放出されているかを把握することはできない。また、細胞内外のＡＴＰを区別して検出することができないので、検出されたＡＴＰが、細胞内に存在していたものであるのか、細胞から放出されたものであるかを判別することができない。
【０００９】
そこで、本願発明者らは、特許文献２に開示したエバネッセント光を用いた観察装置と、ルシフェリン／ルシフェラーゼ発光法とを組合せて細胞組織から放出されたＡＴＰの濃度分布を検出することを試みた。しかし、ルシフェリンのモル吸光係数が１８であることから得られる発光が非常に微弱でありＡＴＰの空間分布を検出することはできなかった。
【００１０】
つまり、従来のルシフェリン／ルシフェラーゼ発光法を利用して細胞組織上のＡＴＰ濃度分布を検出しようとすれば、その発光を検出するために光電子増倍管などの高感度光検出器が必要となってしまう。言い換えれば、高コストで大掛かりな光学装置が必要となり、低コストで簡便に細胞組織上のＡＴＰ検出を行うことができないという問題点があった。
【００１１】
ここで、ＡＴＰ増幅をさせることができれば、高価な高感度光検出器を不要にできると考えられるが、例えば、特許文献１に開示された技術を適用してＡＴＰ増幅を行おうとすれば、５０℃以上の温度で酵素を不活化する工程が必要になり、細胞変性を起こしかねない。このため、細胞組織から放出されたＡＴＰを細胞組織上の各位置と対応つけて検出し得る現実的な技術は未だ提案されていない。
【００１２】
例えば、ＡＴＰは、生理活性を有する細胞から放出される一方で、生理活性を失った細胞からは放出されないため、肉や魚などの生鮮食料品の鮮度の指標とし得る。しかし、ＡＴＰは細胞内に多量に存在するため、細胞抽出液からＡＴＰを検出する従来技術においては、細胞内外のＡＴＰを区別できず、精度良く鮮度を判別することが出来ないという問題点があった。
【００１３】
更に、脳が梗塞や酸欠などでダメージを受けた際には、神経細胞を保護する目的でグリア細胞からＡＴＰが放出されるとされている。脳の虚血状態の診断は非常に難しく、熟練した医術者が開頭を行ってその状態を観察したとしても、的確に病状の診断や予測を行うことは困難となっている。ＡＴＰの放出状態（濃度分布）を的確に検知できれば、病状の診断や薬効判定に有用な知見を得ることができると考えられるが、細胞組織上のＡＴＰを検出する有用な技術が提案されていない現状においては、ＡＴＰの放出状態を指標として脳の虚血状態を判定することも、薬の有効性を評価することもままならないという問題点があった。
【００１４】
本発明は、上記問題点を解決するためになされたものであり、細胞から放出されたヌクレオチド関連化学物質について、細胞組織上の濃度分布を検出する細胞放出物質検出装置、細胞放出物質検出方法および細胞放出物質検出用固定化酵素基板を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この目的を達成するために、請求項１記載の細胞放出物質検出装置は、細胞組織が載置される載置面側に、基質をリン酸化するリン酸化反応とリン酸化された後の基質を酸化する酸化反応とを触媒する酵素を有する基板と、その基板上での反応に伴って蛍光元物質から生成される蛍光物質を励起する励起光を、前記基板上の細胞組織に向けて照射する光照射手段と、その光照射手段によって照射された励起光によって蛍光物質から放射される蛍光を検出する検出手段と、その検出手段により検出された蛍光に基づいて画像を形成する画像形成手段とを備えており、その画像形成手段により形成された画像により、前記基板に載置された細胞組織から放出されたヌクレオチド関連化学物質の濃度分布を検出するものである。
【００１６】
尚、ここでヌクレオチド関連化学物質とは、基質に対してのリン酸供給源となる化学物質であって、例えば、各種リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドである。
【００１７】
更に、酵素を有する基板とは、酵素が化学結合によって基板上に結合されたものであってもよく、酵素が基板上に単に塗布や添加されたものなど基板に対する化学結合を伴わないものであってもよい。
【００１８】
蛍光元物質とは、反応系に存在する特定の化学物質と反応して蛍光物質を生成する原料分子を意味するものである。かかる蛍光元物質は、必ずしも１種の物質には限られず、２種類以上の物質の混合物をも含む概念である。
【００１９】
請求項２記載の細胞放出物質検出装置は、請求項１に記載の細胞放出物質検出装置において、前記酵素はグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素である。
【００２０】
請求項３記載の細胞放出物質検出装置は、請求項１または２に記載の細胞放出物質検出装置において、前記基板は、前記酵素が載置面側表面に化学結合によって固定化されたものである。
【００２１】
請求項４記載の細胞放出物質検出装置は、請求項１から３のいずれかに記載の細胞放出物質検出装置において、前記光照射手段は、前記基板の側面へ励起光を入射する光源部を備えており、その光源部から前記基板の側面に照射される励起光により、前記基板の載置面にエバネッセント光を発生させるよう構成されている。
【００２２】
請求項５記載の細胞放出物質検出装置は、請求項１から４のいずれかに記載の細胞放出物質検出装置において、前記検出手段は、前記光照射手段が照射する励起光の光路と重ならない位置に配設されている。
【００２３】
請求項６記載の細胞放出物質検出方法は、細胞組織から放出されたヌクレオチド関連化学物質の濃度分布を検出する方法であって、基質をリン酸化するリン酸化反応とリン酸化された後の基質を酸化する酸化反応とを触媒する酵素を有する基板に載置された細胞組織に向かって、基質と当該酵素反応に伴って蛍光物質に変換される蛍光元物質とが基板上に共存する状態で、蛍光物質の励起光を照射する光照射工程と、その光照射工程により照射された励起光によって励起された蛍光物質から放射される蛍光を検出する蛍光検出工程と、その蛍光検出工程により検出された蛍光に基づいて画像を形成する画像形成工程とを備え、その画像形成工程により形成された画像により、細胞組織から放出されたヌクレオチド関連化学物質の濃度分布を検出するものである。
【００２４】
尚、ここでヌクレオチド関連化学物質とは、基質に対してのリン酸供給源となる化学物質であって、例えば、各種リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドである。
【００２５】
更に、酵素を有する基板とは、酵素が化学結合によって基板上に結合されたものであってもよく、酵素が基板上に単に塗布や添加されたものなど基板に対する化学結合を伴わないものであってもよい。
【００２６】
蛍光元物質とは、反応系に存在する特定の化学物質と反応して蛍光物質を生成する原料分子を意味するものである。かかる蛍光元物質は、必ずしも１種の物質には限られず、２種類以上の物質の混合物をも含む概念である。
【００２７】
請求項７記載の細胞放出物質検出方法は、請求項６に記載の細胞放出物質検出方法において、前記酵素はグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素である。
【００２８】
請求項８記載の細胞放出物質検出方法は、請求項６又は７に記載の細胞放出物質検出方法において、前記酵素は基板表面に化学結合によって固定されており、細胞組織はその基板表面に載置される。
【００２９】
請求項９記載の細胞放出物質検出用固定化酵素基板は、平滑面を有する透光性基板の表面上にグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素が化学的結合によって担持されているものである。
【発明の効果】
【００３０】
請求項１記載の細胞放出物質検出装置によれば、基質をリン酸化するリン酸化反応とリン酸化された後の基質を酸化する酸化反応とを触媒する酵素を有する基板上に載置された細胞組織に向けて、光照射手段にて励起光が照射される。基板上に、酵素の基質と、当該酵素反応が触媒する反応に伴って蛍光物質を生成する蛍光元物質とが存在すると、反応系内のリン酸を消費しながら蛍光物質が生成される。ここで、リン酸供給源は、細胞組織が放出したヌクレオチド関連化学物質となるため、細胞組織からヌクレオチド関連化学物質が放出されていれば蛍光が放射され、否であれば蛍光は放射されない。
【００３１】
従って、検出手段にて蛍光を検出し、検出された蛍光に基づいて画像形成手段にて蛍光画像を形成することで、細胞組織上のヌクレオチド関連化学物質の濃度分布（空間分布）を検出することができるという効果がある。
【００３２】
また、基板が有する酵素によって基質のリン酸化反応と酸化反応とが触媒され、ここに蛍光元物質が存在することにより、酵素反応に伴って蛍光物質が生成する。即ち、簡素な反応系で、リン酸供給源であるヌクレオチド関連化学物質を、生成される蛍光物質にて直ちに検出することができる。故に、複雑な反応系に比べて高い反応効率を維持することができ、信頼性の高い検出結果を得ることができるという効果がある。
【００３３】
請求項２記載の細胞放出物質検出装置によれば、請求項１に記載の細胞放出物質検出装置の奏する効果に加え、酵素はグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素であるので、生体内に存在する天然型の酵素が触媒する酵素反応によって、ヌクレオチド関連化学物質を検出することができる。つまり、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素とその基質との反応は、天然の細胞組織での通常の反応系（解糖系）であるので、安定な酵素反応を実現でき、細胞組織に対する過度の負荷や予想外の副反応を抑制することができるという効果がある。
【００３４】
請求項３記載の細胞放出物質検出装置によれば、請求項１または２に記載の細胞放出物質検出装置の奏する効果に加え、酵素が基板の載置面側表面に化学結合によって固定化されているので、酵素が流出したり偏在したりすることを抑制でき、単純に酵素を基板上に塗布や添加した場合に比べて、基板上で均一な酵素反応を実現できるという効果がある。更に、基板上に載置された細胞組織内部に酵素が移動することを規制でき、基板上に載置された細胞組織表面近傍において局所的に酵素反応を行わせることができる。故に、細胞から放出された（即ち、細胞表面上の）ヌクレオチド関連化学物質を的確に検出することができるという効果がある。これによって、細胞外に放出されたヌクレオチド関連化学物質を、細胞内のアデノシン三リン酸と区別して検出することができるという効果がある。
【００３５】
請求項４記載の細胞放出物質検出装置によれば、請求項１から３のいずれかに記載の細胞放出物質検出装置の奏する効果に加え、光源部から基板の側面に照射される励起光により、基板の載置面にエバネッセント光を発生させるよう構成されているので、載置面に細胞組織が載置されると、載置面近傍に存在する、即ち、細胞組織の表面部分に存在する蛍光物質に限定して蛍光を放射させることができる。このため、細胞から放出された（即ち、細胞表面上の）ヌクレオチド関連化学物質を、細胞内のヌクレオチド関連化学物質と区別して的確に検出することができるという効果がある。
【００３６】
更に、光源部は、基板の端面から励起光を入射させるので、入射角を変更することを簡便に行うことができ、光学系のセッティングを容易化できる上、装置の取扱性を向上できるという効果がある。
【００３７】
請求項５記載の細胞放出物質検出装置によれば、請求項１から４のいずれかに記載の細胞放出物質検出装置の奏する効果に加え、検出手段は、光照射手段が照射する励起光の光路と重ならない位置に配設されているので、目的とする信号（蛍光）を励起光と分離して捕捉することができ、検出される蛍光に対する励起光の影響（ノイズ）を低減できるという効果がある。
【００３８】
請求項６記載の細胞放出物質検出方法によれば、基質をリン酸化するリン酸化反応とリン酸化された後の基質を酸化する酸化反応とを触媒する酵素を有する基板に載置された細胞組織に向かって、基質と酵素反応に伴って蛍光物質に変換される蛍光元物質とが基板上に共存する状態で、蛍光物質の励起光が光照射工程で照射される。
【００３９】
酵素の基質と、当該酵素反応が触媒する反応に伴って蛍光物質を生成する蛍光元物質とが存在すると、基板上の酵素の働きにより、反応系内のリン酸を消費しながら蛍光物質が生成される。ここで、リン酸供給源は、細胞組織が放出したヌクレオチド関連化学物質となるため、細胞組織からヌクレオチド関連化学物質が放出されていれば蛍光が放射され、否であれば蛍光は放射されない。
【００４０】
そして、その光照射工程により照射された励起光によって励起された蛍光物質から放射される蛍光が蛍光検出工程により検出され、その蛍光に基づいて画像形成工程により蛍光画像が形成される。これにより、細胞組織から放出された（細胞組織上の）ヌクレオチド関連化学物質の濃度分布（空間分布）を検出することができるという効果がある。
【００４１】
また、酵素によって基質のリン酸化反応と酸化反応とが触媒され、ここに蛍光元物質が存在することにより、酸化反応に伴って蛍光物質が生成する。即ち、簡素な反応系で、リン酸供給源であるヌクレオチド関連化学物質を、生成される蛍光物質にて直ちに検出することができる。故に、複雑な反応系に比べて高い反応効率を維持することができ、信頼性の高い検出結果を得ることができるという効果がある。
【００４２】
請求項７記載の細胞放出物質検出方法によれば、請求項６に記載の細胞放出物質検出方法の奏する効果に加え、酵素はグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素であるので、生体内に存在する天然型の酵素が触媒する酵素反応によって、ヌクレオチド関連化学物質を検出することができる。つまり、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素とその基質との反応は、天然の細胞組織での通常の反応系（解糖系）であるので、安定な酵素反応を実現でき、細胞組織に対する過度の負荷や予想外の副反応を抑制することができるという効果がある。
【００４３】
請求項８記載の細胞放出物質検出方法によれば、請求項６又は７に記載の細胞放出物質検出方法の奏する効果に加え、酵素は基板表面に化学結合によって固定されており、細胞組織はその基板表面に載置されるので、酵素が流出したり偏在したりすることを抑制でき、単純に酵素を基板上に塗布や添加した場合に比べて、基板上で均一な酵素反応を実現できるという効果がある。更に、基板上に載置された細胞組織内部に酵素が移動することを規制でき、基板上に載置された細胞組織表面近傍において局所的に酵素反応を行わせることができる。故に、細胞から放出された（即ち、細胞表面上の）ヌクレオチド関連化学物質を的確に検出することができるという効果がある。
【００４４】
請求項９記載の細胞放出物質検出用固定化酵素基板によれば、平滑面を有する透光性基板の表面上にグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素が化学的結合によって担持されているものであるので、本基板に細胞組織を載置し、更に、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素の基質（グリセルアルデヒド３−リン酸）と、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素が触媒する酸化反応に伴って蛍光物質に変換される蛍光元物質とを基板上に共存させることにより、細胞組織から放出されるヌクレオチド関連化学物質に対応して蛍光を放射させることができるという効果がある。このため、本基板を用いて蛍光分析を行えば、細胞組織から放出されたヌクレオチド関連化学物質を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の細胞放出物質検出装置の１実施形態であるＡＴＰ検出システムの概略構成を示す図である。
【図２】本発明の細胞放出物質検出用固定化酵素基板の１実施形態であって、図１の測定装置に用いられる透明基板を詳細に説明する図である。
【図３】ＡＴＰ検出システムの電気的構成を示すブロック図である。
【図４】ＡＴＰ検出システムのパーソナルコンピュータにて実行されるＡＴＰ測定処理のフローチャートを示した図である。
【図５】実施例１におけるラット大脳のスライス片の観察結果を示した図であり、図５（ａ）は通常光での光学的観察結果であり、図５（b）は同じ細胞組織の蛍光画像である。
【図６】図６は、図５（ａ）に示した各位置ａ〜ｈのそれぞれの蛍光強度の経時変化を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
以下、本発明の好ましい実施形態について、添付図面を参照して説明する。本発明は、細胞表面のヌクレオチド関連化学物質の濃度分布を検出するものである。濃度分布を検出するとは、ある面積を有する二次元平面でヌクレオチド関連化学物質がどのように分布しているかの空間分布を測定することを意味している。まずは、本発明のヌクレオチド関連化学物質検出原理について、ヌクレオチド関連化学物質をＡＴＰとして説明する。
【００４７】
グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（以下、単に「ＧＡＰＤＨ」と称す場合がある。）は、生体内において解糖系に関与する酵素であり、基質であるグリセルアルデヒド三リン酸（以下、単に「ＧＡＰ」と略す場合がある。）のリン酸化と酸化とを触媒する。ＧＡＰは、ＧＡＰＤＨの作用によって１,３−ビスホスホグリセリン酸となる。このＧＡＰＤＨが触媒するリン酸化反応は、生体内では、通常、無機リン酸がリン酸供給源となっている。
【００４８】
１,３−ビスホスホグリセリン酸は、ＧＡＰのリン酸化に続いて、生じたアルデヒドが酸化されることで生成する。この酸化反応には、補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型のもの、以下、単に「ＮＡＤ＋」と略す。）が関与し、電子受容体であるＮＡＤ＋は還元され還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、単に「ＮＡＤＨ」と略す。）となる。ここで、ＮＡＤＨは蛍光物質である。本発明では、ＧＡＰＤＨが触媒する下記反応式に示す反応によって、検出対象のＡＴＰをＧＡＰリン酸化のリン酸供給源とすることで、その存在をＮＡＤＨの蛍光で検出できるようになっているのである。
ＧＡＰ＋ＡＴＰ→１,３−ビスホスホグリセリン酸＋ＡＤＰ
ＮＡＤ＋→ＮＡＤＨ
【００４９】
即ち、ＮＡＤ＋は、ＧＡＰＤＨが介在する反応において蛍光物質に変換される蛍光元物質である。この蛍光元物質としては、酵素反応に際し特定の化学物質と反応して蛍光物質に変換される物質であり、例えば、上述のＮＡＤ＋や、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型のもの、以下、単に「ＮＡＤＰ＋」と略す。）が例示される。このように反応系を設計することにより、リボヌクレオチドであるＡＴＰを、反応で生成された蛍光物質（ＮＡＤＨ）が放射する蛍光によって検出することができるのである。
【００５０】
上記の反応系では、ＡＴＰの反応モル量とＮＡＤＨ（ＮＡＤＰＨ）の生成モル量とは同じであるので、ＮＡＤＨ（ＮＡＤＰＨ）の蛍光強度を測定すれば、ＡＴＰ濃度を測定できるのである。尚、蛍光元物質としては、ＮＡＤ＋とＮＡＤＰ＋とのいずれか一方を用いても良く、両者を混合して用いても良い。
【００５１】
また、上記したＧＡＰＤＨの酵素反応は、リン酸要求性である。従って、測定時に用いられる緩衝液は、リン酸を含有しないものが用いられる。このような緩衝液としては、例えば、Britton-Robinson 緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液などが例示される。
【００５２】
更に、上記した反応は常温常圧で進行する酵素反応であるため、細胞組織に対する負荷が軽微である。このため、反応場にセットされた細胞組織が直ちに生理活性を失うといったことがなく、細胞組織からのヌクレオチド関連化学物質放出状態の経時変化を、蛍光検出によって測定することができる。
【００５３】
本発明において、測定対象のヌクレオチド関連化学物質は、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドであり、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンのいずれかのリボヌクレオシド、又はデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジンのいずれかのデオキシリボヌクレオシドにリン酸基が結合したものである。尚、本発明ではリン酸基のないものは検出されない。従って、類似した構造体であるヌクレオシドの影響をうけることなく、ヌクレオチドを選択的に検出することができる。例えば、アデノシンは生理活性のない細胞にも蓄積（放出）される。一方で、その類似構造体であるＡＴＰ（ＡＤＰ，ＡＭＰ）は生理活性を有する細胞からのみ放出される。本発明では、ＡＴＰ（ＡＤＰ，ＡＭＰ）を検出し、アデノシンを検出しないので、細胞組織の生理活性の有無や状態を高精度に検出することができる。
【００５４】
本発明において用いられる酵素としては、基質をリン酸化するリン酸化反応とリン酸化された後の基質を酸化する酸化反応とを触媒するものであって、例えば、アスパラギンシンテターゼとグルタミン酸デヒドロゲナーゼとを組合せたもの、アセトキナーゼ及びグルコキナーゼ（又はヘキソキナーゼ）の二つの酵素とグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼとを組合せたもの、上記したＧＡＰＤＨが例示される。好適には、ＧＡＰＤＨが用いられる。反応系が簡素であり、且つ、反応速度が他の酵素に比して速いためである。ＧＡＰＤＨを用いた場合、反応速度はｍ秒オーダー（１００ｍｓ以下）で迅速に反応するため、細胞組織へのダメージを抑制でき、得られる検出結果の信頼性を向上させることができる。
【００５５】
図１は、本発明の細胞放出物質検出装置の１実施形態であるＡＴＰ検出システム１００の概略構成を示す図である。ＡＴＰ検出システム１００は、細胞組織の表面に存在するＡＴＰを、ＧＡＰＤＨの酵素反応を利用した蛍光発光によって検出するように構成されている。図１(ａ)にはシステム全体の概略図を示し、図１(ｂ)には、固定化酵素基板である透明基板１０の表面部分拡大図を示している。
【００５６】
このＡＴＰ検出システム１００は、図１（ａ）に示すように、細胞組織からのＡＴＰを検出するための反応場と光学系とが備えられた測定装置１と、その測定装置１を制御するとともにＡＴＰの濃度分布を画像で表示するパーソナルコンピュータ（以下、単に「ＰＣ」と略す。）２０とを備えており、細胞組織上においてＡＴＰがどのように分布しているか、即ち、ある面積を有する二次元平面での濃度分布（空間分布）を測定するようになっている。測定装置１とＰＣ２０とはケーブル１８を介して相互に接続されている。
【００５７】
測定装置１は、測定対象の細胞組織Ｓに対し酵素反応によって蛍光を生じさせる反応場を備えており、反応によって生じる蛍光物質に励起光を照射すると共に、生じた蛍光を検出（撮像）するように構成されている。この測定装置１は、光源ユニット７、透明基板１０、集光レンズ１１、光検出器１２、ＣＣＤカメラユニット１３、基板保持部１６を備えている。
【００５８】
光源ユニット７は、透明基板１０の側方に配設されており、透明基板１０の端面に向けて光を照射するものである。この光源ユニット７は、非図示のハウジングを備えており、このハウジング内に光源８と入射光側レンズ９とは収納されている。図１(ａ)において、光源８からの光の方向（光路）は、一点鎖線の矢印Ｌ１にて示している。
【００５９】
光源ユニット７の該ハウジング内において、光源８からの照射光の光路Ｌ１上に入射光側レンズ９が配設されており、光源８からの照射光は入射光側レンズ９にて集光された後、透明基板１０の端面へ入射される。また、光源ユニット７は、その後方側（ハウジングにおいて入射光側レンズ９と反対側）において上下方向に可動可能に軸支されており、非図示の調整ダイヤルを操作することにより、その操作量に応じて光源ユニット７の設置角度を変更できるようになっている。これにより光源８からの照射光の透明基板１０の端面への入射角度を調整できる。
【００６０】
光源８は、蛍光物質を励起する光を照射するためのものであり、３６０ｎｍの励起紫外光（ＵＶ）を照射する発光ダイオード（ＬＥＤ）が用いられている。本実施形態において光源８から照射される照射光（励起紫外光）は、単色光であり、バンドパスフィルタを不要としている。光源８からの励起光の波長は、蛍光物質を励起できる波長であれば特に限定されない。一般に、蛍光物質は、吸光度が高い波長であるほど、より励起状態への遷移が生じやすく、吸光極大の波長が照射された場合に励起状態への遷移が最も活発になる。ＮＡＤＨは、３４０ｎｍに吸光極大を有しており、従ってその近傍の波長においても比較的吸光度が高く良好な励起光となる。本実施形態においては、ＮＡＤＨの吸光極大近傍で、十分な蛍光を生じさせることのできる３６０ｎｍの紫外光を励起光に用いている。
【００６１】
尚、光源８は、生成される蛍光物質を励起する励起光を照射するものであれば特に限定されるものではなく、ＬＥＤ、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプからなる群から選択されるものの一つであれば良い。また、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプを用いる場合には、測定対象とする蛍光物質に応じて適切な励起光が照射されるように適当なフィルターを用いられる。
【００６２】
透明基板１０は、測定対象の組織細胞Ｓが載置される基板であって、矩形形の板状に形成されている。基板保持部１６によって保持され、ＣＣＤカメラユニット１３の上方に配置されている。透明基板１０は、透明性の基板であり、光源８からの照射光の光導波路となっている。この透明基板１０は高屈折材料にて形成されており、石英、ガラス（重フリントガラス）、サファイアなどの結晶やＰＭＭＡ（ポリメタクリル酸メチル）などのアクリル樹脂を用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、基板表面が導波路全長にわたってＬＢ膜でディップコートされたものであっても良い。尚、励起光の照射により透明基板１０が大きく発熱する場合には、透明基板１０には耐熱性の高い石英やガラスなどが用いられる。また、透明基板１０の材質としては、励起光の波長に対して吸収がないものが好ましい。本実施形態の透明基板１０には石英が用いられている。
【００６３】
この透明基板１０の表面および裏面は、高度な平滑性を備えており、例えば、その表面粗さが、入射光の波長と同程度以下となるように形成されている。測定装置１においては、透明基板１０の端面から入射された光は、透明基板１０の界面で全反射しつつ、入射側とは反対側の端面から出射するように設計されている。このため、透明基板１０の表面にはエバネッセント波Ｌ２が発生することとなる。
【００６４】
基板保持部１６は、透明基板１０を略水平に保持するものであり、光路方向Ｌ１に沿って所定間隔を隔てて立設された２の支柱１６ａと、当該２の支柱１６ａに架設された天板１６ｂとを、測定装置１の前面側と奥方側とに一対で備えている。天板１６ｂは、透明基板１０の表面に対し、その表面の端部近傍の狭い範囲に当接する幅で形成された板状部材である。透明基板１０は、一対で設けられた天板１６ｂに載置することで、対向する二辺側の端部が支持され、４本の支柱に架設された状態で保持される。
【００６５】
図１（ｂ）には、透明基板１０の表面部分Iを拡大して示している。図１（ｂ）に示すように、透明基板１０の表面においては、全反射に伴ってエバネッセント波Ｌ２が発生する。エバネッセント波Ｌ２は、全反射の際に発生し、全反射した界面の反対側に染みだした光である。エバネッセント波は、その全反射角に応じてその染み込み深さを数十ナノメータから数百ナノメータまで変えることのできる光である。つまり、エバネッセント波Ｌ２は、透明基板１０表面近傍にしか存在しないため、細胞組織Ｓを透明基板１０に載置すると、エバネッセント波Ｌ２が照射される細胞組織Ｓ表面の極浅い部分の光学的情報を取得することができる。
【００６６】
ここで、透明基板１０の表面は酵素反応の反応場となるものであって、透明基板１０の表面には、ＧＡＰＤＨが固定化されている。測定に際しては、透明基板１０の表面にＧＡＰとＮＡＤ＋とが供給される。このため、透明基板１０上にセットされた細胞組織ＳからＡＴＰが放出されていれば、ＧＡＰＤＨの作用によってＡＴＰのリン酸を消費する酵素反応が生じ、ＧＡＰから１,３ビスホスホグリセリン酸が生成されると共に、ＮＡＤ＋が還元されてＮＡＤＨが生じることとなる。
【００６７】
生じたＮＡＤＨは蛍光物質であるので、エバネッセント波Ｌ２にて励起され蛍光が放出される。つまり、エバネッセント波Ｌ２で励起された蛍光を検出することで、細胞表面に存在する、即ち細胞から放出されたＡＴＰを検出することができるのである。
【００６８】
測定される細胞組織Ｓは、生体試料であり、例えば生物から切開や穿刺によって取得した組織片、細胞、微小生物などが例示されるが、これらには限定されるものではない。
【００６９】
尚、本実施形態では、発生した蛍光のうち、透明基板１０の下方側に向かう（二点鎖線の矢印Ｌ３で示す方向）蛍光を検出するように測定装置１は構成されている。
【００７０】
図１（ａ）に戻って説明する。
【００７１】
集光レンズ１１は、透明基板１０を挟んで、光源ユニット７と反対側に配設されている。光源ユニット７から透明基板１０の端面へ入射され、透明基板１０内を面方向に沿って伝搬して入射側と反対側の端面から出射した励起紫外光を集光させて、光検出器１２に入力するためのレンズである。この集光レンズ１１は、可動可能に保持されており、操作者の操作によって透明基板１０の端面に対する角度を変更できるようになっている。
【００７２】
光検出器１２は、励起紫外光Ｌ１の光路上において、集光レンズ１１の後方に設置されている。光検出器１２は、集光レンズ１１を介して入射された入射光をフォトダイオードで検出するものである。検出器１１での検出信号は、ＰＣ２０へ出力されるようになっており、操作者は、ＰＣ２０にて表示される検出結果に基づいて、光源ユニット７の入射角を調整することができる。
【００７３】
ＣＣＤカメラユニット１３は、透明基板１０の下方に配設されており、細胞組織Ｓから下方へ向かって放出される蛍光を受光し、細胞組織Ｓの撮像（光学的情報の取得）を行うものである。このＣＣＤカメラユニット１３は、ピンホール機能を備えたＣＣＤカメラとして構成されている。ここでいうピンホール機能とは０．０５〜０．５ｍｍ径の孔（光の導入孔）から光を導入し、焦点距離が２０ｍｍ以下の小型化されうるカメラ機能を意味している。このＣＣＤカメラユニット１３は、結像レンズ１４とＣＣＤ１５とを備えている。結像レンズ１４は、本体上面に設けられた光の導入孔の下方に配設され、更に結像レンズの下方にＣＣＤ１５が配設されている。細胞組織Ｓから放射された蛍光は、光の導入孔から取り込まれ、結像レンズ１４を介してＣＣＤ１５の表面に像が結ばれる。
【００７４】
ＣＣＤ１４は光電変換素子であり、主に、光を感知する受光部(センサ)と、光電変換された電荷を垂直転送する垂直転送部(垂直レジスタ)と、水平転送する水平転送部(水平レジスタ)とから構成される一般的なものである。取り出された電荷は出力回路で電圧に変換される。
【００７５】
本実施形態の測定装置１では、上記したように透明基板１０の下方に配設され、組織細胞Ｓから放出される光路Ｌ３方向の蛍光をＣＣＤカメラユニット１３にて受光する。つまり、ＣＣＤカメラユニット１３は、励起光L１の光路とは重ならない位置（励起光の光路と直交する方向）に配置されており、組織細胞Ｓから下方に放射される光路Ｌ３の蛍光を
受光する。このため、透明基板１０内を全反射しつつ光路Ｌ１を伝播する励起光とは分離して、組織細胞Ｓからの光学情報である蛍光をＣＣＤ１５に入力することができ、ダイクロイックミラー、カットフィルタ等を不要とすることができる。ＣＣＤカメラユニット１３にて取得された画像信号は、測定装置１からケーブル１８を介してＰＣ２０へと出力される。
【００７６】
尚、本実施形態では蛍光検出にＣＣＤカメラを用いたが、無限焦点で近接撮影可能であればこれに限られるものではなく、例えば蛍光顕微鏡もしくはピンホール機能を備えたＣＭＯＳカメラを用いることができる。ピンホールを備えたカメラ構造とすることにより、結合レンズの手前（光路方向手前）の対物レンズを不要とでき、その分、カメラ本体を小型化することができる。尚、装置サイズを小型化する必要がない場合には、ピンホールに代えて対物レンズを備えたカメラ構造としても良い。
【００７７】
ＰＣ２０は、測定装置１を制御するコンピュータであって、表示装置である液晶ディスプレイ（以下、単に「ＬＣＤ」と略す。）２７と、入力装置であるキーボード２８とを備えている。操作者はキーボードからコマンドを入力することで測定装置１に測定を実行させることができる。撮像された細胞組織Ｓの画像データ（蛍光画像）は、ＬＣＤ２７に表示される。ここで、本実施形態においては、細胞組織Ｓの表面（透明基板１０との接触面）に放出されたＡＴＰを蛍光検出するように反応場が形成されており、ＬＣＤ２７にはＡＴＰの濃度分布が二次元の蛍光画像で示される。
【００７８】
また、ＰＣ２０は、測定装置１にＡＴＰの測定を実行させるのみならず、操作者のキーボード２８からのコマンド入力に基づいて、測定装置１の光検出器１２で取得した信号をＬＣＤ２７に表示させることができるようになっている。このため、操作者は、ＬＣＤ２７に表示される表示結果を見ながら測定装置１の光路調整を行うことができる。
【００７９】
図２は、本実施形態のアデノシン三リン酸検出用固定化酵素基板であって、測定装置１に用いられる透明基板１０を詳細に説明する図である。
【００８０】
図２（ａ）は、透明基板１０の構成を模式的に示した部分断面図である。図２（ａ）においては、紙面上側が透明基板１０の表面側となるように図示されている。また、酵素（ＧＡＰＤＨ）を楕円形状で模式的に示している。図２（ａ）に示すように、この透明基板１０の表面側、即ち細胞組織Ｓの載置面には、酵素（ＧＡＰＤＨ）が全体に一様に配列されており、化学的結合によって、透明基板１０表面に固定されている。
【００８１】
図２（ｂ）は、図２(ａ)の微小領域IIの部分拡大図である。図２（ｂ）においては、紙面の左右方向が上下方向（透明基板１０の平面に直交する方向（厚み方向））となっている。図２（ｂ）に示すように、ＧＡＰＤＨは、その末端側においてシッフ塩基を形成してシラン化合物と結合しており、このシラン化合物を介して石英（ＳｉＯ２）である透明基板１０表面に固定化されている。シラン化合物は、いわゆるシランカップリング剤であり、脱水縮合反応によって無機化合物（石英）の表面と共有結合を形成するものである。
【００８２】
シッフ塩基を形成するシラン化合物としては、例えば、アミノシラン化合物が選択され、具体的には、N-2-（アミノエチル）-3-アミノプロピルメチルジメトキシシラン、N-2-（アミノエチル）-3-アミノプロピルトリメトキシシラン、N-2-（アミノエチル）-3-アミノプロピルトリエトキシシラン、3-アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）、3-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、3-トリエトキシシリル-Ｎ-（1,3-ジメチル-ブチリデン）プロピルアミン、N-フェニル-3-アミノプロピルトリメトキシシラン、N-（ビニルベンジル）-2-アミノエチル-3-アミノプロピルトリメトキシシランの塩酸塩、エチルジメチルアミノ
プロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）などが例示される。尚、本実施形態においては、3-アミノプロピルトリメトキシシランが用いられている。
【００８３】
タンパク質である酵素の末端は、アミノ基を有しており、これにより透明基板１０に結合されたアミノシラン化合物と反応してシッフ塩基を形成し、結合を形成することができる。
【００８４】
このように透明基板１０の表面に酵素を固定することにより、透明基板１０上に細胞組織Ｓを載置すると、透明基板１０と細胞組織Ｓとの間に、酵素が存在することとなる。
【００８５】
図３は、上記のＡＴＰ検出システム１００の電気的構成を示すブロック図である。ＡＴＰ検出システム１００は、測定装置１とＰＣ２０とを備え、両者はケーブル１８によって相互に接続されている。
【００８６】
測定装置１は、上記したように、細胞組織Ｓから放出されたＡＴＰを検出するための装置であり、演算装置であるＣＰＵ２と、そのＣＰＵ２により実行される各種の制御プログラムや固定値データを記憶した不揮発性のメモリであるＲＯＭ３と、各種のデータ等を一時的に記憶するためのメモリであるＲＡＭ４と、入出力ポート６と、光源ユニット７と、光検出器１２と、ＣＣＤカメラユニット１３と、インターフェース１７とを備えている。
【００８７】
ＣＰＵ２、ＲＯＭ３、ＲＡＭ４は、バスライン５を介して互いに接続されており、バスライン５は、また、入出力ポート６にも接続されている。この入出力ポート６は光源ユニット７と、光検出器１２と、ＣＣＤカメラユニット１３と、インターフェース１７とそれぞれ接続されている。
【００８８】
ＣＰＵ２は、ＰＣ２０から送信されたコマンドを解読し、コマンドに応じて測定装置１の各部を制御する。ＰＣ２０から送信されたコマンドが、光源点灯コマンドである場合には、ＣＰＵ２は光源ユニット７において光源８の点灯を実行させる。また、ＰＣ２０から送信されたコマンドがＡＴＰ測定の実行を指示する測定実行コマンドであると、ＣＣＤカメラユニット１３に撮像信号を取得する動作を実行させる。
【００８９】
ＣＣＤカメラユニット１３は、ＣＣＤ１５とＡ／Ｄコンバータ１６とを備え、細胞組織Ｓの蛍光画像の撮像を行うものであって、非図示のコントローラによってその動作が制御される。ＣＣＤ１５にて取得された各画素の信号（撮像信号）は、それぞれアンプにて増幅された後、電圧値に変換され、更にＡ／Ｄコンバータ１６によってデジタルデータに変換される。ＣＣＤ１５の全画素の一群の画素データにて、１フレームの画像データが構成される。コントローラは、指定されたタイムラプスで、指定されたフレーム数の撮像を実行し、得られた画像データを、インターフェース１７を介してＰＣ２０へ出力する。
【００９０】
尚、本実施形態では、ＣＣＤカメラユニット１３にはカラーフィルターが設けられており、画像データは、カラー画像データ（ＲＧＢデータ）で形成される。
【００９１】
ＰＣ２０は、上記したように、測定装置１での各処理を制御するものであり、演算装置であるＣＰＵ２１と、ＲＯＭ２２と、ＲＡＭ２３と、ハードディスクドライブ（以下「ＨＤＤ」と称す）２４と、入出力ポート２６と、表示装置であるＬＣＤ２７と、入力装置であるキーボード２８と、インターフェース２９とを備えている。
【００９２】
ＣＰＵ２１、ＲＯＭ２２、ＲＡＭ２３、ＨＤＤ２４は、バスライン２５を介して互いに接続されており、バスライン２５は、また、入出力ポート２６にも接続されている。この入出力ポート２６は、ＬＣＤ２７と、キーボード２８と、インターフェース２９とにそれぞれ接続されている。
【００９３】
ＣＰＵ２１は演算装置であり、ＲＯＭ２２やＨＤＤ２４に記憶されるプログラムを実行するものである。図示を省略しているが、このＣＰＵ１１は、タイマを備えている。タイマは、所定時間の計時を行うためのものであり、後述するＡＴＰ測定処理において光源８の安定時間が計測されるようになっている。
【００９４】
ＲＯＭ２２は、ＣＰＵ２１により実行される各種の制御プログラムや固定値データを記憶した不揮発性のメモリである。
【００９５】
ＲＡＭ２３は、各種のデータ等を一時的に記憶するための書換可能なメモリであり、ＣＰＵ２１が各種プログラムを実行する際、変数などを一時記憶するワークエリアを有している。また、ＲＡＭ２３は、設定値メモリ２３ａと、測定値メモリ２３bと、画像メモリ２３cとを備えている。
【００９６】
設定値メモリ２３ａは、測定条件を記憶するためのメモリである。ＡＴＰ検出システム１００は、操作者の入力に基づいて測定装置１に実行させる測定条件を任意に設定することができるようになっている。操作者によって入力される測定条件は、測定時間（露光時間）、タイムラプス、撮影フレーム数、光源８の照射光量（印加電圧）、アンプゲインである。後述するＡＴＰ測定処理にて操作者から測定条件が入力されると、入力された項目の値がこの設定値メモリ２３ａに書き込まれ、先に記憶される値が更新される。ＣＰＵ２１は後述するＡＴＰ測定処理が実行される際に、この設定値メモリ２３ａを参照し、記憶されている測定条件にて測定装置１に測定の実行を指示する。
【００９７】
測定値メモリ２３ｂは、測定装置１から送信される画像データを記憶するためのメモリであり、受信バッファとして機能する緩衝用のメモリである。ＰＣ２０から測定装置１に対し測定実行コマンドが送信された後に測定装置１から画像データを受信すると、受信した画像データはこの測定値メモリ２３ｂに書き込まれる。１フレームの画像データが記憶されると、記憶された１フレーム分の画像データが画像メモリ２３ｃに書き込まれる。画像メモリ２３ｃに書き込まれた画像データは、測定値メモリ２３ｂから消去される。尚、測定時間中、測定装置１では、繰り返して撮像信号の取り込みが実行されるため、ＰＣ２０では継続して画像データが受信される。
【００９８】
尚、ＰＣ２０にて受信された画像データは、測定値メモリ２３ｂに記憶された後、ＨＤＤ２４に書き込まれ、設定されたフレーム数分の画像データがＰＣ２０にて保持される。
【００９９】
画像メモリ２３ｃは、ＬＣＤ２７に表示する画像データを記憶するためのメモリである。この画像メモリ２３ｃには、画像データを構成する各画素データが座標（ｘ，ｙ）に対応つけて記憶されている。座標は、ＬＣＤ２７におけるＸ軸上の位置を示すＸ座標（ｘ）と、そのＸ軸に直交するＹ軸上の位置を示すＹ座標（ｙ）とにより位置を示す情報である。ＣＰＵ２１は、測定値メモリ２３ｂに１フレーム分の画像データが記憶されると、予め定めた座標に対応つけて各画素データを画像メモリ２３ｃに書き込む。ＬＣＤ２７への表示に際しては、この画像メモリ２３ｃから画像データを読み出して、各画素データを対応する座標に基づいてＬＣＤ２７へ出力する。これにより、撮影された組織細胞Ｓの画像データが、ＬＣＤ２７の表示画面において所定の位置に表示される。
【０１００】
測定値メモリ２３ｂに新たな１フレーム分の画像データが記憶されると、当該１フレーム分の画像データが画像メモリ２３ｃに書き込まれ、先に記憶される画像データが更新される。
【０１０１】
ＨＤＤ２４は、書換可能な大容量のメモリであり、電源断後も記憶されるデータを保持する不揮発性のメモリである。このＨＤＤ２４には、図示しないオペレーティングシステムの他、測定装置１を制御するための測定装置制御プログラム２４ａと、初期値メモリ２４ｂとを備えている。図４のフローチャートに示すＡＴＰ測定処理のプログラムは測定装置制御プログラム２４ａの一部として、ＨＤＤ２４内に記憶されている。ＨＤＤ２４に記憶される各種のプログラムは、必要に応じてＲＡＭ２３にロードされ、ＣＰＵ２１により実行される。
【０１０２】
初期値メモリ２４ｂは、測定装置１にＡＴＰ測定を実行させる際の測定条件（測定時間（露光時間）、タイムラプス、撮影フレーム数、光源８の照射光量（印加電圧）、アンプゲイン）や、その他必要な値（例えば、光源８の安定時間）をデフォルトで記憶するメモリである。ＰＣ２０にてＡＴＰ測定処理が開始されると、この初期値メモリ２４ｂに記憶される測定条件が設定値メモリ２３ａに書き込まれて記憶される。従って、操作者にて任意の測定条件が入力されなかった場合には、初期値メモリ２４ｂにデフォルトで記憶されている測定条件に従って、測定装置１で測定が実行されることとなる。また、操作者によって測定条件が入力されると、入力された項目については、その入力された値に基づいて測定が実行されることとなる。
【０１０３】
次に、図４のフローチャートを参照して、上記のように構成されたＡＴＰ検出システム１００の動作について説明する。図４は、ＰＣ２０で実行されるＡＴＰ測定処理を示したフローチャートである。ＡＴＰ測定処理は、操作者の入力操作に基づいて、測定装置１に細胞組織ＳにおけるＡＴＰの濃度分布の測定を実行させる処理である。このＡＴＰ測定処理は、操作者が所定の入力操作により、ＰＣ２０にＡＴＰ測定の実行を要求することで開始される。
【０１０４】
図４に示すように、このＡＴＰ測定処理では、まず、光源点灯コマンドを測定装置１に送信する（Ｓ１）。これにより、測定装置１においては、光源８が点灯し、照射光（励起紫外光）が透明基板１０の端面へ入射される。尚、ＣＰＵ２１は、光源点灯コマンドを測定装置１に送信したタイミングで、光源８を安定させるに必要な時間（安定時間）をタイマにセットする。
【０１０５】
次に、初期値メモリ２４ｂの値（デフォルトで記憶されている測定条件）を設定値メモリ２３ａに書き込み（Ｓ２）、操作者から入力に基づいて処理を実行するための各種コマンドが表示されたメイン画面をＬＣＤ２７に表示する（Ｓ３）。これにより、メイン画面に表示されたコマンドが所定の入力操作によって入力されると、ＰＣ２０は、入力されたコマンドに従って処理を実行する。このため、コマンドが操作者によって入力されたかを確認し（Ｓ４）、コマンド入力がなければ（Ｓ４：Ｎｏ）、コマンドの入力を待機する。一方、コマンドが入力されれば（Ｓ４：Ｙｅｓ）、入力されたコマンドは何かを確認し（Ｓ５）、入力されたコマンドが終了コマンドであれば（Ｓ５：終了コマンド）、測定の終了要求であるので、光源消灯コマンドを測定装置１に送信する。これにより、測定装置１では光源８が消灯する。その後、ＰＣ２０での処理を終了するべく、ＲＡＭクリアやデータ保存、出力画面の消去などを行う終了処理を実行して（Ｓ７）、このＡＴＰ測定処理を終了する。
【０１０６】
また、Ｓ５の処理で確認した結果、入力されたコマンドが測定実行コマンドであれば（Ｓ５：測定実行コマンド）、ＡＴＰ測定の実行要求であるので、光源８が安定したか、即ち、タイマが所定時間（安定時間）の経過を示しているかを確認し（Ｓ８）、ここで、安定時間が経過していなければ、光源８が安定していないと判断して（Ｓ８：Ｎｏ）、安定時間が経過するまで以降の処理を待機する。一方、安定時間が経過していれば、光源８が安定したと判断し（Ｓ８：Ｙｅｓ）、測定実行コマンドと設定値メモリ２３ａに記憶される測定条件（測定時間（露光時間）、タイムラプス、撮影フレーム数、光源８の照射光量（印加電圧）、アンプゲイン）とを測定装置１に出力する（Ｓ９）。これにより、測定装置１では、指定された光量が光源８から照射されるとともに、指定された時間、ＣＣＤ１５による撮像信号の取り込みが実行される。尚、測定実行コマンドの測定装置への出力に際しては、ＣＰＵ２１は、設定値メモリ２３ａに記憶される測定時間をタイマにセットする。
【０１０７】
続いて、ＰＣ２０においては、測定データ、即ち画像データを測定装置１から受信したかを確認し（Ｓ１０）、未受信であれば（Ｓ１０：Ｎｏ）、受信を待機し、受信した場合には（Ｓ１０：Ｙｅｓ）、受信した画像データを測定値メモリ２３ｂに記憶する（Ｓ１１）。そして、１フレームの画像データの受信が完了したかを確認し（Ｓ１２）、未完了であれば（Ｓ１２：Ｎｏ）、Ｓ１１の処理に移行して１フレームの画像データの受信を完了するまで、Ｓ１１，Ｓ１２の処理を繰り返す。また、Ｓ１２の処理で確認した結果、１フレームの画像データの受信を完了していれば（Ｓ１２：Ｙｅｓ）、測定値メモリ２３ｂに記憶される画像データを所定の座標に対応つけて画像メモリ２３ｃに書き込み（Ｓ１３）、続いて、画像メモリ２３ｃに記憶される画像データをＬＣＤ２７に出力し、表示画面を更新する（Ｓ１４）。これにより、メイン画面の予め定められた所定位置に、測定装置１にて撮像された細胞組織Ｓの蛍光画像が表示される。
【０１０８】
尚、ＬＣＤ２７へ画像データを表示するタイミングで、画像メモリ２３ｃに記憶される画像データは非図示のステップによりＨＤＤ２４の所定のエリアに書き込まれて記憶される。
【０１０９】
その後、測定時間終了したかをタイマの値によって確認し（Ｓ１５）、測定時間が終了していない場合は（Ｓ１５：Ｎｏ）、その処理をＳ１０の処理に移行して、測定時間が終了するまで、Ｓ１０〜Ｓ１５の処理を繰り返す。一方、Ｓ１５の処理で確認した結果、測定時間が終了していれば（Ｓ１５：Ｙｅｓ）、その処理をＳ４の処理に移行する。尚、Ｓ１５の処理を経てＳ４の処理に移行した場合には、画像メモリ２３ｃに記憶される画像データが継続して表示される。
【０１１０】
更に、Ｓ５の処理で確認した結果、入力されたコマンドが条件設定コマンドであれば（Ｓ５：条件設定コマンド）、操作者からの測定条件の変更要求であるので、測定条件の入力画面を表示する（Ｓ１６）。この入力画面においては、操作者によるキーボードからの入力に基づいて、任意の測定条件を入力できる入力欄が設けられると共に、操作者が測定条件の入力完了を示すコマンドを入力できるように構成されている。ＣＰＵ２１は、この入力画面において測定条件の入力完了を示すコマンドが入力されたかを監視し（Ｓ１７）、測定条件の入力完了を示すコマンドが入力されていなければ（Ｓ１７：Ｎｏ）、その入力を待機し、一方、測定条件の入力完了を示すコマンドが入力されていれば（Ｓ１７：Ｙｅｓ）、入力欄に入力された測定条件を設定値メモリ２３ａに書き込み（Ｓ１８）、先に記憶される対応する値を更新する。そして、各処理を実行した後（Ｓ１９）、その処理をＳ４の処理に移行する。
【０１１１】
Ｓ１８の処理の後に実行される各処理（Ｓ１９）においては、ＬＣＤ２７の表示画面をメイン画面に切り替える処理を実行される。また、例えば、入力欄に入力された値が測定装置１にて実行できる範囲を超えていた場合には、エラーメッセージを表示するといった処理が実行される。
【０１１２】
加えて、Ｓ５の処理で確認した結果、入力されたコマンドが終了コマンド、測定実行コマンド、条件設定コマンド以外のその他のコマンドであれば（Ｓ５：その他）、入力されたコマンドに応じた処理を各処理（Ｓ１９）において実行し、その処理をＳ４の処理に移行する。尚、その他のコマンドとしては、測定装置１のキャリブレーションを実行するコマンドなどである。キャリブレーションが要求された場合には、測定装置１の光検出器１２で検出されたデータがＬＣＤ２７に表示される。これにより、操作者は、ＬＣＤ２７に表示される検出データを視認しつつ、光源８の入射角調整などを実行できる。
【０１１３】
以上、説明したように、本実施形態のＡＴＰ検出システム１００によれば、細胞組織から放出されたＡＴＰの濃度分布を、組織構造と対応つけて検出することができる。このため、細胞組織がどのようにＡＴＰを放出しているか、いずれの部位からＡＴＰを放出しているかを、明らかとすることができる。
【０１１４】
例えば、脳における炎症反応は進行性であることが多いが、本ＡＴＰ検出システム１００によれば、脳の炎症反応に対し、ＡＴＰが放出されている位置や、その経時変化を検出し得るので、得られた検出結果に基づき、医師が行う診断や治療等を円滑に進め易くすることができる。
【０１１５】
更には、ＡＴＰ検出システム１００を用いて、ＡＴＰの放出状況や時間変化、空間パターンを観察することで、神経保護効果のある薬の開発、スクリーニング、治療法の検討を行うことができる。また、ＡＴＰ検出システム１００にて生鮮食料品の検査を行うことにより、鮮度の評価を行うことも可能となる。
【０１１６】
尚、本実施形態においては、ヌクレオチド関連化学物質として「ＡＴＰ」を用いて説明したが、当然のことながらリン酸供給源となるヌクレオチド関連化学物質であれば、本システムを利用して細胞組織上のヌクレオチドを検出することができる。これによれば、例えば、食品中に含まれるリン酸成分、ヌクレオチド成分の測定を行うことができる。
【０１１７】
尚、上記実施形態においては、ＡＴＰ検出システム１００は、穿刺や切り出しによって得られる細胞組織Ｓを外部に（生体外に）設置された透明基板１０に載置して測定を行うように構成されたが、透明基板１０をプローブ状の光ファイバの一部分に形成すると共に、ＧＡＰやＮＡＤ＋を供給するラインや、光ファイバを介して透明基板１０に対向する位置にＣＣＤを設けたカテーテルとし、生体内に挿入された状態で測定を行う構成としても良い。
【０１１８】
また、上記実施形態において基板保持部１６は、固定されたものとして説明したが、搬送用モータを設け、ＰＣ２０から入力される位置制御命令に従って、透明基板１０を上下左右の任意の位置に移動できるようにしても良い。これによれば、光源８からの入射光と透明基板１０、測定対象の細胞組織Ｓとの位置関係を微調整することが容易となり、高精度な測定を実現することができる。
【０１１９】
更に、上記実施形態においては、透明基板１０の端面に励起光を入射し、透明基板１０の下方に検出器であるＣＣＤカメラユニット１３を配置する構成としたが、これに限られるものではなく、励起光を入射する方法はプリズム法、グレーティング法などを用いても良い。更に、細胞組織Sから放射される蛍光を、透明基板１０の上方において検出する構成としても良く、導波路である透明基板１０を伝播したものを検出する構成としてもよい。
【０１２０】
加えて、透明基板１０の端面真横に光源ユニット７を対向させ、真横から励起光を入射するように光源８を設置してもよい。かかる構成でも、エバネッセント光を透明基板１０に発生させることができ、細胞組織Ｓ表面のＡＴＰを検出することができる。また、光路調整のためのレンズ等の設備が不要となり、装置全体を小型化できる。
【０１２１】
尚、請求項に記載の細胞放出物質検出方法としては、上記実施形態において説明したＡＴＰ検出システム１００を利用して実行させたＡＴＰを検出する一連の工程、即ち、上記実施形態において、ＧＡＰＤＨを固定化した透明基板１０に載置した細胞組織Ｓに向かって、ＧＡＰとＮＡＤ＋とが透明基板１０の表面に供給された状態で、光源ユニット７から励起光を照射し、細胞組織Sから放射される蛍光をＣＣＤカメラユニット１３で検出し、検出された蛍光に基づいてＰＣ２０にて画像を形成表示する一連の工程が該当する。
【実施例】
【０１２２】
次に、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例として、上記したＡＴＰ測定システム１００にて、ラット大脳を測定対象の細胞組織とし、組織細胞上におけるＡＴＰの濃度分布を測定した。
（実施例１）
【０１２３】
出生直後の新生仔ラット（Ｎｏｒｍａｌ Ｐ２３）を用意し、７０％エタノールにて全身の消毒を行い、滅菌下にて断頭した。小脳を傷付けないように、延髄側より頭皮及び頭蓋骨を切り、切開した。その後、全脳を先曲ピンセットにて持ち上げ摘出し、生理食塩水内で血液等を洗浄した。この後に全脳をシャーレ上に移し、スカルペルナイフによって延髄及び間脳を切り離し、大脳を摘出した。大脳に付着したクモ膜及び血管を、先細ピンセットを用いて剥がし取り、再度生理食塩水にて洗浄した後、単離した大脳をロータリースライサーもしくはクリオスタット等にて４００μｍにスライスした。
【０１２４】
このスライス片（細胞組織Ｓ）を広口スポイトですくい取り、余分な水分を吸い取とってから、測定直前にＨＥＰＥＳ緩衝液に浸した後、測定装置１の透明基板１０上に載置した。次いで、ＧＡＰとＮＡＤ＋とを添加し、測定開始から１０ｓ後に、グルタミン酸１ｍＭを透明基板１０上のスライス片に滴下して、蛍光画像の撮像を行った。グルタミン酸は、脳細胞へ損傷を与えることが知られており、グルタミン酸投与により模擬的に虚血状態が誘発されることとなる。
【０１２５】
蛍光画像の撮影に先立ってＰＣ２０においてＡＴＰ測定処理を起動し、光源８を点灯させた。また、測定条件は、露光時間３００ｓ、ゲイン最大、タイムプラス１．０ｓ、フレーム数１３０で設定された。
【０１２６】
本実施例では、光源８には、３６５ｎｍの紫外波長のＬＥＤ（日亜化学ＮＳＨＵ５５０Ｂ（紫外発光ＬＥＤ）を用い、透明基板１０の下方にＣＣＤカメラを装備した倒立型蛍光顕微鏡にて観察を行った。また、透明基板１０としては、ＧＡＰＤを表面に固定した石英ガラス板（２５ｍｍｘ２５ｍｍｘ１ｍｍ）を用いた。
【０１２７】
結果を図５および図６に示した。図５（ａ）は、上記手順で準備した大脳のスライス片を可視光で観察した状態を示した図である。図５（ｂ）は、図５（ａ）に示したスライス片を蛍光観察した結果を示した図であり、グルタミン酸投与後のサンプル片の蛍光画像である。図６は、図５（ａ）に示した各位置ａ〜hのそれぞれの蛍光強度の経時変化を示した図である。
【０１２８】
図５（ａ）に示した光学画像と図５（ｂ）に示した蛍光画像とは対応しており、いずれの図においても、紙面左側が大脳皮質外方である。大脳皮質は６層の層状構造物であり、図５においては、紙面左下方から右上方に向かって、１層〜６層の順に積層された状態になっている。図５（ｂ）において白い部分が蛍光発光の箇所である。
【０１２９】
図５（ａ）、図５（ｂ）において、大脳皮質の１層と２層とに強く蛍光が生じていることが示されている。また、図６に示した各位置ａ〜hそれぞれに対応する８つのグラフは、
横軸に時間（秒）、縦軸に蛍光強度を示している。尚、蛍光強度は、最大値を４０９６とする相対値である。図５、図６からも分かるように、サンプル片の位置ａ,ｂ,ｃ部分の蛍光強度が明確に上昇していることが示されている。
【０１３０】
大脳皮質では、１層と２層とにグリア細胞が多く分布しており、グルタミン酸投与によって脳虚血状態が誘発されたサンプル片において、この１層と２層とに強く蛍光が生じていることは、生理学上の知見とがよく一致していた。即ち、上記結果は、損傷を受けた細胞組織からＡＴＰが放出されたことを示すものであり、本発明の細胞放出物質検出装置を用いれば、細胞から放出されたヌクレオチド関連物質の細胞組織上の濃度分布を画像化して検出できることが示された。
【符号の説明】
【０１３１】
７ 光源ユニット（光照射手段）
１０ 透明基板（基板、細胞放出物質検出用固定化酵素基板）
１５ ＣＣＤ（検出手段）
１００ ＡＴＰ検出システム（細胞放出物質検出装置）
Ｓ１３,Ｓ１４ （画像形成手段の一部）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞組織から放出された細胞放出物質を検出する検出装置、検出方法、検出用固定化酵素基板に関し、特に、細胞組織から放出されたヌクレオチド関連化学物質について細胞組織上の濃度分布を検出する細胞放出物質検出装置、細胞放出物質検出方法および細胞放出物質検出用固定化酵素基板に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、アデノシン三リン酸（以下、単に「ＡＴＰ」と略す場合がある。）の定量には、生物発光であるルシフェリン／ルシフェラーゼ発光系が汎用的に用いられている（非特許文献１）。ＡＴＰ及びマグネシウムイオンの存在下で発光基質であるルシフェリンは、ルシフェラーゼによって発光体であるオキシルシフェリンに変換されて発光する。ＡＴＰの検出に際しては、一般に、被検体試料の細胞組織を破砕するなどして細胞抽出液を採取し、その細胞抽出液にルシフェリンとルシフェラーゼとが加えられる。そして、試料抽出液中のＡＴＰが消費されて生じるオキシルシフェリンの発光量を測定することによりＡＴＰ量が定量される。
【０００３】
ルシフェリン／ルシフェラーゼ発光法による試料中ＡＴＰの定量は、感度が良好であり迅速性にも優れているため、当該発光法以外のＡＴＰ定量方法はほとんど実用化されていない。
【０００４】
また、特許文献１には、ＡＴＰ増幅法とＡＴＰサイクリング法とを併用して試料中の微量ＡＴＰを検出する技術が開示されている。当該技術では、まず、アデニレートキナーゼとＡＭＰ(アデニル酸)とを用い、試料中のＡＴＰをＡＭＰと反応させて２分子のＡＤＰ（アデノシン二リン酸）を生成させ、生じた２分子のＡＤＰにポリリン酸キナーゼを作用させることで２分子のＡＴＰを発生させる。発生した２分子のＡＴＰは、再度、ＡＭＰと反応する基質となるため、ｎ回の反応を行うことにより、１個のＡＴＰは２ｎ個のＡＴＰに増幅される（ＡＴＰ増幅法）。その後、増幅に用いた酵素を不活化し、ＡＴＰサイクリング法にて再度ＡＴＰの増幅が実行される。そして、ＡＴＰサイクリング法を経た後、試料中のＡＴＰを酵素比色法または電気的定量法を用いて定量することで、当初試料中のＡＴＰ量が定量される。これにより、当初試料中の僅かなＡＴＰが定量できる。
【０００５】
更に、本願発明者らは、生体組織から放出された化学物質の濃度分布を、組織上の位置に対応つけて観察、測定するための小型化された光学装置を提案している（特許文献２）。この光学装置では、エバネッセント光を用い、ＧＡＢＡ、グルタミン酸などの化学物質の濃度分布を測定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２２３１６３号公報
【特許文献２】特開２００８−１３９２８０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】DeLuca, M., and McElroy, W.D., Kinetics of the firefly luciferase catalyzed reactions. Biochemistry, 26,921-925 (1974).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記特許文献１および非特許文献１に開示された技術は、いずれも試料抽出液中のＡＴＰを定量する手法であり、細胞から放出されるＡＴＰを直接的に検出、測定するものではない。このため、細胞組織上の濃度分布（ＡＴＰの空間分布）を把握することはできないという問題点があった。言い換えれば、従来の技術では、組織片のいずれの細胞からＡＴＰが放出されているかを把握することはできない。また、細胞内外のＡＴＰを区別して検出することができないので、検出されたＡＴＰが、細胞内に存在していたものであるのか、細胞から放出されたものであるかを判別することができない。
【０００９】
そこで、本願発明者らは、特許文献２に開示したエバネッセント光を用いた観察装置と、ルシフェリン／ルシフェラーゼ発光法とを組合せて細胞組織から放出されたＡＴＰの濃度分布を検出することを試みた。しかし、ルシフェリンのモル吸光係数が１８であることから得られる発光が非常に微弱でありＡＴＰの空間分布を検出することはできなかった。
【００１０】
つまり、従来のルシフェリン／ルシフェラーゼ発光法を利用して細胞組織上のＡＴＰ濃度分布を検出しようとすれば、その発光を検出するために光電子増倍管などの高感度光検出器が必要となってしまう。言い換えれば、高コストで大掛かりな光学装置が必要となり、低コストで簡便に細胞組織上のＡＴＰ検出を行うことができないという問題点があった。
【００１１】
ここで、ＡＴＰ増幅をさせることができれば、高価な高感度光検出器を不要にできると考えられるが、例えば、特許文献１に開示された技術を適用してＡＴＰ増幅を行おうとすれば、５０℃以上の温度で酵素を不活化する工程が必要になり、細胞変性を起こしかねない。このため、細胞組織から放出されたＡＴＰを細胞組織上の各位置と対応つけて検出し得る現実的な技術は未だ提案されていない。
【００１２】
例えば、ＡＴＰは、生理活性を有する細胞から放出される一方で、生理活性を失った細胞からは放出されないため、肉や魚などの生鮮食料品の鮮度の指標とし得る。しかし、ＡＴＰは細胞内に多量に存在するため、細胞抽出液からＡＴＰを検出する従来技術においては、細胞内外のＡＴＰを区別できず、精度良く鮮度を判別することが出来ないという問題点があった。
【００１３】
更に、脳が梗塞や酸欠などでダメージを受けた際には、神経細胞を保護する目的でグリア細胞からＡＴＰが放出されるとされている。脳の虚血状態の診断は非常に難しく、熟練した医術者が開頭を行ってその状態を観察したとしても、的確に病状の診断や予測を行うことは困難となっている。ＡＴＰの放出状態（濃度分布）を的確に検知できれば、病状の診断や薬効判定に有用な知見を得ることができると考えられるが、細胞組織上のＡＴＰを検出する有用な技術が提案されていない現状においては、ＡＴＰの放出状態を指標として脳の虚血状態を判定することも、薬の有効性を評価することもままならないという問題点があった。
【００１４】
本発明は、上記問題点を解決するためになされたものであり、細胞から放出されたヌクレオチド関連化学物質について、細胞組織上の濃度分布を検出する細胞放出物質検出装置、細胞放出物質検出方法および細胞放出物質検出用固定化酵素基板を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この目的を達成するために、請求項１記載の細胞放出物質検出装置は、細胞組織が載置される載置面側に、基質をリン酸化するリン酸化反応とリン酸化された後の基質を酸化する酸化反応とを触媒する酵素を有する基板と、その基板上での反応に伴って蛍光元物質から生成される蛍光物質を励起する励起光を、前記基板上の細胞組織に向けて照射する光照射手段と、その光照射手段によって照射された励起光によって蛍光物質から放射される蛍光を検出する検出手段と、その検出手段により検出された蛍光に基づいて画像を形成する画像形成手段とを備えており、その画像形成手段により形成された画像により、前記基板に載置された細胞組織から放出されたヌクレオチド関連化学物質の濃度分布を検出するものである。
【００１６】
尚、ここでヌクレオチド関連化学物質とは、基質に対してのリン酸供給源となる化学物質であって、例えば、各種リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドである。
【００１７】
更に、酵素を有する基板とは、酵素が化学結合によって基板上に結合されたものであってもよく、酵素が基板上に単に塗布や添加されたものなど基板に対する化学結合を伴わないものであってもよい。
【００１８】
蛍光元物質とは、反応系に存在する特定の化学物質と反応して蛍光物質を生成する原料分子を意味するものである。かかる蛍光元物質は、必ずしも１種の物質には限られず、２種類以上の物質の混合物をも含む概念である。
【００１９】
請求項２記載の細胞放出物質検出装置は、請求項１に記載の細胞放出物質検出装置において、前記酵素はグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素である。
【００２０】
請求項３記載の細胞放出物質検出装置は、請求項１または２に記載の細胞放出物質検出装置において、前記基板は、前記酵素が載置面側表面に化学結合によって固定化されたものである。
【００２１】
請求項４記載の細胞放出物質検出装置は、請求項１から３のいずれかに記載の細胞放出物質検出装置において、前記光照射手段は、前記基板の側面へ励起光を入射する光源部を備えており、その光源部から前記基板の側面に照射される励起光により、前記基板の載置面にエバネッセント光を発生させるよう構成されている。
【００２２】
請求項５記載の細胞放出物質検出装置は、請求項１から４のいずれかに記載の細胞放出物質検出装置において、前記検出手段は、前記光照射手段が照射する励起光の光路と重ならない位置に配設されている。
【００２３】
請求項６記載の細胞放出物質検出方法は、細胞組織から放出されたヌクレオチド関連化学物質の濃度分布を検出する方法であって、基質をリン酸化するリン酸化反応とリン酸化された後の基質を酸化する酸化反応とを触媒する酵素を有する基板に載置された細胞組織に向かって、基質と当該酵素反応に伴って蛍光物質に変換される蛍光元物質とが基板上に共存する状態で、蛍光物質の励起光を照射する光照射工程と、その光照射工程により照射された励起光によって励起された蛍光物質から放射される蛍光を検出する蛍光検出工程と、その蛍光検出工程により検出された蛍光に基づいて画像を形成する画像形成工程とを備え、その画像形成工程により形成された画像により、細胞組織から放出されたヌクレオチド関連化学物質の濃度分布を検出するものである。
【００２４】
尚、ここでヌクレオチド関連化学物質とは、基質に対してのリン酸供給源となる化学物質であって、例えば、各種リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドである。
【００２５】
更に、酵素を有する基板とは、酵素が化学結合によって基板上に結合されたものであってもよく、酵素が基板上に単に塗布や添加されたものなど基板に対する化学結合を伴わないものであってもよい。
【００２６】
蛍光元物質とは、反応系に存在する特定の化学物質と反応して蛍光物質を生成する原料分子を意味するものである。かかる蛍光元物質は、必ずしも１種の物質には限られず、２種類以上の物質の混合物をも含む概念である。
【００２７】
請求項７記載の細胞放出物質検出方法は、請求項６に記載の細胞放出物質検出方法において、前記酵素はグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素である。
【００２８】
請求項８記載の細胞放出物質検出方法は、請求項６又は７に記載の細胞放出物質検出方法において、前記酵素は基板表面に化学結合によって固定されており、細胞組織はその基板表面に載置される。
【００２９】
請求項９記載の細胞放出物質検出用固定化酵素基板は、平滑面を有する透光性基板の表面上にグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素が化学的結合によって担持されているものである。
【発明の効果】
【００３０】
請求項１記載の細胞放出物質検出装置によれば、基質をリン酸化するリン酸化反応とリン酸化された後の基質を酸化する酸化反応とを触媒する酵素を有する基板上に載置された細胞組織に向けて、光照射手段にて励起光が照射される。基板上に、酵素の基質と、当該酵素反応が触媒する反応に伴って蛍光物質を生成する蛍光元物質とが存在すると、反応系内のリン酸を消費しながら蛍光物質が生成される。ここで、リン酸供給源は、細胞組織が放出したヌクレオチド関連化学物質となるため、細胞組織からヌクレオチド関連化学物質が放出されていれば蛍光が放射され、否であれば蛍光は放射されない。
【００３１】
従って、検出手段にて蛍光を検出し、検出された蛍光に基づいて画像形成手段にて蛍光画像を形成することで、細胞組織上のヌクレオチド関連化学物質の濃度分布（空間分布）を検出することができるという効果がある。
【００３２】
また、基板が有する酵素によって基質のリン酸化反応と酸化反応とが触媒され、ここに蛍光元物質が存在することにより、酵素反応に伴って蛍光物質が生成する。即ち、簡素な反応系で、リン酸供給源であるヌクレオチド関連化学物質を、生成される蛍光物質にて直ちに検出することができる。故に、複雑な反応系に比べて高い反応効率を維持することができ、信頼性の高い検出結果を得ることができるという効果がある。
【００３３】
請求項２記載の細胞放出物質検出装置によれば、請求項１に記載の細胞放出物質検出装置の奏する効果に加え、酵素はグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素であるので、生体内に存在する天然型の酵素が触媒する酵素反応によって、ヌクレオチド関連化学物質を検出することができる。つまり、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素とその基質との反応は、天然の細胞組織での通常の反応系（解糖系）であるので、安定な酵素反応を実現でき、細胞組織に対する過度の負荷や予想外の副反応を抑制することができるという効果がある。
【００３４】
請求項３記載の細胞放出物質検出装置によれば、請求項１または２に記載の細胞放出物質検出装置の奏する効果に加え、酵素が基板の載置面側表面に化学結合によって固定化されているので、酵素が流出したり偏在したりすることを抑制でき、単純に酵素を基板上に塗布や添加した場合に比べて、基板上で均一な酵素反応を実現できるという効果がある。更に、基板上に載置された細胞組織内部に酵素が移動することを規制でき、基板上に載置された細胞組織表面近傍において局所的に酵素反応を行わせることができる。故に、細胞から放出された（即ち、細胞表面上の）ヌクレオチド関連化学物質を的確に検出することができるという効果がある。これによって、細胞外に放出されたヌクレオチド関連化学物質を、細胞内のアデノシン三リン酸と区別して検出することができるという効果がある。
【００３５】
請求項４記載の細胞放出物質検出装置によれば、請求項１から３のいずれかに記載の細胞放出物質検出装置の奏する効果に加え、光源部から基板の側面に照射される励起光により、基板の載置面にエバネッセント光を発生させるよう構成されているので、載置面に細胞組織が載置されると、載置面近傍に存在する、即ち、細胞組織の表面部分に存在する蛍光物質に限定して蛍光を放射させることができる。このため、細胞から放出された（即ち、細胞表面上の）ヌクレオチド関連化学物質を、細胞内のヌクレオチド関連化学物質と区別して的確に検出することができるという効果がある。
【００３６】
更に、光源部は、基板の端面から励起光を入射させるので、入射角を変更することを簡便に行うことができ、光学系のセッティングを容易化できる上、装置の取扱性を向上できるという効果がある。
【００３７】
請求項５記載の細胞放出物質検出装置によれば、請求項１から４のいずれかに記載の細胞放出物質検出装置の奏する効果に加え、検出手段は、光照射手段が照射する励起光の光路と重ならない位置に配設されているので、目的とする信号（蛍光）を励起光と分離して捕捉することができ、検出される蛍光に対する励起光の影響（ノイズ）を低減できるという効果がある。
【００３８】
請求項６記載の細胞放出物質検出方法によれば、基質をリン酸化するリン酸化反応とリン酸化された後の基質を酸化する酸化反応とを触媒する酵素を有する基板に載置された細胞組織に向かって、基質と酵素反応に伴って蛍光物質に変換される蛍光元物質とが基板上に共存する状態で、蛍光物質の励起光が光照射工程で照射される。
【００３９】
酵素の基質と、当該酵素反応が触媒する反応に伴って蛍光物質を生成する蛍光元物質とが存在すると、基板上の酵素の働きにより、反応系内のリン酸を消費しながら蛍光物質が生成される。ここで、リン酸供給源は、細胞組織が放出したヌクレオチド関連化学物質となるため、細胞組織からヌクレオチド関連化学物質が放出されていれば蛍光が放射され、否であれば蛍光は放射されない。
【００４０】
そして、その光照射工程により照射された励起光によって励起された蛍光物質から放射される蛍光が蛍光検出工程により検出され、その蛍光に基づいて画像形成工程により蛍光画像が形成される。これにより、細胞組織から放出された（細胞組織上の）ヌクレオチド関連化学物質の濃度分布（空間分布）を検出することができるという効果がある。
【００４１】
また、酵素によって基質のリン酸化反応と酸化反応とが触媒され、ここに蛍光元物質が存在することにより、酸化反応に伴って蛍光物質が生成する。即ち、簡素な反応系で、リン酸供給源であるヌクレオチド関連化学物質を、生成される蛍光物質にて直ちに検出することができる。故に、複雑な反応系に比べて高い反応効率を維持することができ、信頼性の高い検出結果を得ることができるという効果がある。
【００４２】
請求項７記載の細胞放出物質検出方法によれば、請求項６に記載の細胞放出物質検出方法の奏する効果に加え、酵素はグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素であるので、生体内に存在する天然型の酵素が触媒する酵素反応によって、ヌクレオチド関連化学物質を検出することができる。つまり、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素とその基質との反応は、天然の細胞組織での通常の反応系（解糖系）であるので、安定な酵素反応を実現でき、細胞組織に対する過度の負荷や予想外の副反応を抑制することができるという効果がある。
【００４３】
請求項８記載の細胞放出物質検出方法によれば、請求項６又は７に記載の細胞放出物質検出方法の奏する効果に加え、酵素は基板表面に化学結合によって固定されており、細胞組織はその基板表面に載置されるので、酵素が流出したり偏在したりすることを抑制でき、単純に酵素を基板上に塗布や添加した場合に比べて、基板上で均一な酵素反応を実現できるという効果がある。更に、基板上に載置された細胞組織内部に酵素が移動することを規制でき、基板上に載置された細胞組織表面近傍において局所的に酵素反応を行わせることができる。故に、細胞から放出された（即ち、細胞表面上の）ヌクレオチド関連化学物質を的確に検出することができるという効果がある。
【００４４】
請求項９記載の細胞放出物質検出用固定化酵素基板によれば、平滑面を有する透光性基板の表面上にグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素が化学的結合によって担持されているものであるので、本基板に細胞組織を載置し、更に、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素の基質（グリセルアルデヒド３−リン酸）と、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素が触媒する酸化反応に伴って蛍光物質に変換される蛍光元物質とを基板上に共存させることにより、細胞組織から放出されるヌクレオチド関連化学物質に対応して蛍光を放射させることができるという効果がある。このため、本基板を用いて蛍光分析を行えば、細胞組織から放出されたヌクレオチド関連化学物質を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の細胞放出物質検出装置の１実施形態であるＡＴＰ検出システムの概略構成を示す図である。
【図２】本発明の細胞放出物質検出用固定化酵素基板の１実施形態であって、図１の測定装置に用いられる透明基板を詳細に説明する図である。
【図３】ＡＴＰ検出システムの電気的構成を示すブロック図である。
【図４】ＡＴＰ検出システムのパーソナルコンピュータにて実行されるＡＴＰ測定処理のフローチャートを示した図である。
【図５】実施例１におけるラット大脳のスライス片の観察結果を示した図であり、図５（ａ）は通常光での光学的観察結果であり、図５（b）は同じ細胞組織の蛍光画像である。
【図６】図６は、図５（ａ）に示した各位置ａ〜ｈのそれぞれの蛍光強度の経時変化を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
以下、本発明の好ましい実施形態について、添付図面を参照して説明する。本発明は、細胞表面のヌクレオチド関連化学物質の濃度分布を検出するものである。濃度分布を検出するとは、ある面積を有する二次元平面でヌクレオチド関連化学物質がどのように分布しているかの空間分布を測定することを意味している。まずは、本発明のヌクレオチド関連化学物質検出原理について、ヌクレオチド関連化学物質をＡＴＰとして説明する。
【００４７】
グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（以下、単に「ＧＡＰＤＨ」と称す場合がある。）は、生体内において解糖系に関与する酵素であり、基質であるグリセルアルデヒド三リン酸（以下、単に「ＧＡＰ」と略す場合がある。）のリン酸化と酸化とを触媒する。ＧＡＰは、ＧＡＰＤＨの作用によって１,３−ビスホスホグリセリン酸となる。このＧＡＰＤＨが触媒するリン酸化反応は、生体内では、通常、無機リン酸がリン酸供給源となっている。
【００４８】
１,３−ビスホスホグリセリン酸は、ＧＡＰのリン酸化に続いて、生じたアルデヒドが酸化されることで生成する。この酸化反応には、補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型のもの、以下、単に「ＮＡＤ＋」と略す。）が関与し、電子受容体であるＮＡＤ＋は還元され還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、単に「ＮＡＤＨ」と略す。）となる。ここで、ＮＡＤＨは蛍光物質である。本発明では、ＧＡＰＤＨが触媒する下記反応式に示す反応によって、検出対象のＡＴＰをＧＡＰリン酸化のリン酸供給源とすることで、その存在をＮＡＤＨの蛍光で検出できるようになっているのである。
ＧＡＰ＋ＡＴＰ→１,３−ビスホスホグリセリン酸＋ＡＤＰ
ＮＡＤ＋→ＮＡＤＨ
【００４９】
即ち、ＮＡＤ＋は、ＧＡＰＤＨが介在する反応において蛍光物質に変換される蛍光元物質である。この蛍光元物質としては、酵素反応に際し特定の化学物質と反応して蛍光物質に変換される物質であり、例えば、上述のＮＡＤ＋や、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型のもの、以下、単に「ＮＡＤＰ＋」と略す。）が例示される。このように反応系を設計することにより、リボヌクレオチドであるＡＴＰを、反応で生成された蛍光物質（ＮＡＤＨ）が放射する蛍光によって検出することができるのである。
【００５０】
上記の反応系では、ＡＴＰの反応モル量とＮＡＤＨ（ＮＡＤＰＨ）の生成モル量とは同じであるので、ＮＡＤＨ（ＮＡＤＰＨ）の蛍光強度を測定すれば、ＡＴＰ濃度を測定できるのである。尚、蛍光元物質としては、ＮＡＤ＋とＮＡＤＰ＋とのいずれか一方を用いても良く、両者を混合して用いても良い。
【００５１】
また、上記したＧＡＰＤＨの酵素反応は、リン酸要求性である。従って、測定時に用いられる緩衝液は、リン酸を含有しないものが用いられる。このような緩衝液としては、例えば、Britton-Robinson 緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液などが例示される。
【００５２】
更に、上記した反応は常温常圧で進行する酵素反応であるため、細胞組織に対する負荷が軽微である。このため、反応場にセットされた細胞組織が直ちに生理活性を失うといったことがなく、細胞組織からのヌクレオチド関連化学物質放出状態の経時変化を、蛍光検出によって測定することができる。
【００５３】
本発明において、測定対象のヌクレオチド関連化学物質は、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドであり、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンのいずれかのリボヌクレオシド、又はデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジンのいずれかのデオキシリボヌクレオシドにリン酸基が結合したものである。尚、本発明ではリン酸基のないものは検出されない。従って、類似した構造体であるヌクレオシドの影響をうけることなく、ヌクレオチドを選択的に検出することができる。例えば、アデノシンは生理活性のない細胞にも蓄積（放出）される。一方で、その類似構造体であるＡＴＰ（ＡＤＰ，ＡＭＰ）は生理活性を有する細胞からのみ放出される。本発明では、ＡＴＰ（ＡＤＰ，ＡＭＰ）を検出し、アデノシンを検出しないので、細胞組織の生理活性の有無や状態を高精度に検出することができる。
【００５４】
本発明において用いられる酵素としては、基質をリン酸化するリン酸化反応とリン酸化された後の基質を酸化する酸化反応とを触媒するものであって、例えば、アスパラギンシンテターゼとグルタミン酸デヒドロゲナーゼとを組合せたもの、アセトキナーゼ及びグルコキナーゼ（又はヘキソキナーゼ）の二つの酵素とグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼとを組合せたもの、上記したＧＡＰＤＨが例示される。好適には、ＧＡＰＤＨが用いられる。反応系が簡素であり、且つ、反応速度が他の酵素に比して速いためである。ＧＡＰＤＨを用いた場合、反応速度はｍ秒オーダー（１００ｍｓ以下）で迅速に反応するため、細胞組織へのダメージを抑制でき、得られる検出結果の信頼性を向上させることができる。
【００５５】
図１は、本発明の細胞放出物質検出装置の１実施形態であるＡＴＰ検出システム１００の概略構成を示す図である。ＡＴＰ検出システム１００は、細胞組織の表面に存在するＡＴＰを、ＧＡＰＤＨの酵素反応を利用した蛍光発光によって検出するように構成されている。図１(ａ)にはシステム全体の概略図を示し、図１(ｂ)には、固定化酵素基板である透明基板１０の表面部分拡大図を示している。
【００５６】
このＡＴＰ検出システム１００は、図１（ａ）に示すように、細胞組織からのＡＴＰを検出するための反応場と光学系とが備えられた測定装置１と、その測定装置１を制御するとともにＡＴＰの濃度分布を画像で表示するパーソナルコンピュータ（以下、単に「ＰＣ」と略す。）２０とを備えており、細胞組織上においてＡＴＰがどのように分布しているか、即ち、ある面積を有する二次元平面での濃度分布（空間分布）を測定するようになっている。測定装置１とＰＣ２０とはケーブル１８を介して相互に接続されている。
【００５７】
測定装置１は、測定対象の細胞組織Ｓに対し酵素反応によって蛍光を生じさせる反応場を備えており、反応によって生じる蛍光物質に励起光を照射すると共に、生じた蛍光を検出（撮像）するように構成されている。この測定装置１は、光源ユニット７、透明基板１０、集光レンズ１１、光検出器１２、ＣＣＤカメラユニット１３、基板保持部１６を備えている。
【００５８】
光源ユニット７は、透明基板１０の側方に配設されており、透明基板１０の端面に向けて光を照射するものである。この光源ユニット７は、非図示のハウジングを備えており、このハウジング内に光源８と入射光側レンズ９とは収納されている。図１(ａ)において、光源８からの光の方向（光路）は、一点鎖線の矢印Ｌ１にて示している。
【００５９】
光源ユニット７の該ハウジング内において、光源８からの照射光の光路Ｌ１上に入射光側レンズ９が配設されており、光源８からの照射光は入射光側レンズ９にて集光された後、透明基板１０の端面へ入射される。また、光源ユニット７は、その後方側（ハウジングにおいて入射光側レンズ９と反対側）において上下方向に可動可能に軸支されており、非図示の調整ダイヤルを操作することにより、その操作量に応じて光源ユニット７の設置角度を変更できるようになっている。これにより光源８からの照射光の透明基板１０の端面への入射角度を調整できる。
【００６０】
光源８は、蛍光物質を励起する光を照射するためのものであり、３６０ｎｍの励起紫外光（ＵＶ）を照射する発光ダイオード（ＬＥＤ）が用いられている。本実施形態において光源８から照射される照射光（励起紫外光）は、単色光であり、バンドパスフィルタを不要としている。光源８からの励起光の波長は、蛍光物質を励起できる波長であれば特に限定されない。一般に、蛍光物質は、吸光度が高い波長であるほど、より励起状態への遷移が生じやすく、吸光極大の波長が照射された場合に励起状態への遷移が最も活発になる。ＮＡＤＨは、３４０ｎｍに吸光極大を有しており、従ってその近傍の波長においても比較的吸光度が高く良好な励起光となる。本実施形態においては、ＮＡＤＨの吸光極大近傍で、十分な蛍光を生じさせることのできる３６０ｎｍの紫外光を励起光に用いている。
【００６１】
尚、光源８は、生成される蛍光物質を励起する励起光を照射するものであれば特に限定されるものではなく、ＬＥＤ、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプからなる群から選択されるものの一つであれば良い。また、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプを用いる場合には、測定対象とする蛍光物質に応じて適切な励起光が照射されるように適当なフィルターを用いられる。
【００６２】
透明基板１０は、測定対象の組織細胞Ｓが載置される基板であって、矩形形の板状に形成されている。基板保持部１６によって保持され、ＣＣＤカメラユニット１３の上方に配置されている。透明基板１０は、透明性の基板であり、光源８からの照射光の光導波路となっている。この透明基板１０は高屈折材料にて形成されており、石英、ガラス（重フリントガラス）、サファイアなどの結晶やＰＭＭＡ（ポリメタクリル酸メチル）などのアクリル樹脂を用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、基板表面が導波路全長にわたってＬＢ膜でディップコートされたものであっても良い。尚、励起光の照射により透明基板１０が大きく発熱する場合には、透明基板１０には耐熱性の高い石英やガラスなどが用いられる。また、透明基板１０の材質としては、励起光の波長に対して吸収がないものが好ましい。本実施形態の透明基板１０には石英が用いられている。
【００６３】
この透明基板１０の表面および裏面は、高度な平滑性を備えており、例えば、その表面粗さが、入射光の波長と同程度以下となるように形成されている。測定装置１においては、透明基板１０の端面から入射された光は、透明基板１０の界面で全反射しつつ、入射側とは反対側の端面から出射するように設計されている。このため、透明基板１０の表面にはエバネッセント波Ｌ２が発生することとなる。
【００６４】
基板保持部１６は、透明基板１０を略水平に保持するものであり、光路方向Ｌ１に沿って所定間隔を隔てて立設された２の支柱１６ａと、当該２の支柱１６ａに架設された天板１６ｂとを、測定装置１の前面側と奥方側とに一対で備えている。天板１６ｂは、透明基板１０の表面に対し、その表面の端部近傍の狭い範囲に当接する幅で形成された板状部材である。透明基板１０は、一対で設けられた天板１６ｂに載置することで、対向する二辺側の端部が支持され、４本の支柱に架設された状態で保持される。
【００６５】
図１（ｂ）には、透明基板１０の表面部分Iを拡大して示している。図１（ｂ）に示すように、透明基板１０の表面においては、全反射に伴ってエバネッセント波Ｌ２が発生する。エバネッセント波Ｌ２は、全反射の際に発生し、全反射した界面の反対側に染みだした光である。エバネッセント波は、その全反射角に応じてその染み込み深さを数十ナノメータから数百ナノメータまで変えることのできる光である。つまり、エバネッセント波Ｌ２は、透明基板１０表面近傍にしか存在しないため、細胞組織Ｓを透明基板１０に載置すると、エバネッセント波Ｌ２が照射される細胞組織Ｓ表面の極浅い部分の光学的情報を取得することができる。
【００６６】
ここで、透明基板１０の表面は酵素反応の反応場となるものであって、透明基板１０の表面には、ＧＡＰＤＨが固定化されている。測定に際しては、透明基板１０の表面にＧＡＰとＮＡＤ＋とが供給される。このため、透明基板１０上にセットされた細胞組織ＳからＡＴＰが放出されていれば、ＧＡＰＤＨの作用によってＡＴＰのリン酸を消費する酵素反応が生じ、ＧＡＰから１,３ビスホスホグリセリン酸が生成されると共に、ＮＡＤ＋が還元されてＮＡＤＨが生じることとなる。
【００６７】
生じたＮＡＤＨは蛍光物質であるので、エバネッセント波Ｌ２にて励起され蛍光が放出される。つまり、エバネッセント波Ｌ２で励起された蛍光を検出することで、細胞表面に存在する、即ち細胞から放出されたＡＴＰを検出することができるのである。
【００６８】
測定される細胞組織Ｓは、生体試料であり、例えば生物から切開や穿刺によって取得した組織片、細胞、微小生物などが例示されるが、これらには限定されるものではない。
【００６９】
尚、本実施形態では、発生した蛍光のうち、透明基板１０の下方側に向かう（二点鎖線の矢印Ｌ３で示す方向）蛍光を検出するように測定装置１は構成されている。
【００７０】
図１（ａ）に戻って説明する。
【００７１】
集光レンズ１１は、透明基板１０を挟んで、光源ユニット７と反対側に配設されている。光源ユニット７から透明基板１０の端面へ入射され、透明基板１０内を面方向に沿って伝搬して入射側と反対側の端面から出射した励起紫外光を集光させて、光検出器１２に入力するためのレンズである。この集光レンズ１１は、可動可能に保持されており、操作者の操作によって透明基板１０の端面に対する角度を変更できるようになっている。
【００７２】
光検出器１２は、励起紫外光Ｌ１の光路上において、集光レンズ１１の後方に設置されている。光検出器１２は、集光レンズ１１を介して入射された入射光をフォトダイオードで検出するものである。検出器１１での検出信号は、ＰＣ２０へ出力されるようになっており、操作者は、ＰＣ２０にて表示される検出結果に基づいて、光源ユニット７の入射角を調整することができる。
【００７３】
ＣＣＤカメラユニット１３は、透明基板１０の下方に配設されており、細胞組織Ｓから下方へ向かって放出される蛍光を受光し、細胞組織Ｓの撮像（光学的情報の取得）を行うものである。このＣＣＤカメラユニット１３は、ピンホール機能を備えたＣＣＤカメラとして構成されている。ここでいうピンホール機能とは０．０５〜０．５ｍｍ径の孔（光の導入孔）から光を導入し、焦点距離が２０ｍｍ以下の小型化されうるカメラ機能を意味している。このＣＣＤカメラユニット１３は、結像レンズ１４とＣＣＤ１５とを備えている。結像レンズ１４は、本体上面に設けられた光の導入孔の下方に配設され、更に結像レンズの下方にＣＣＤ１５が配設されている。細胞組織Ｓから放射された蛍光は、光の導入孔から取り込まれ、結像レンズ１４を介してＣＣＤ１５の表面に像が結ばれる。
【００７４】
ＣＣＤ１４は光電変換素子であり、主に、光を感知する受光部(センサ)と、光電変換された電荷を垂直転送する垂直転送部(垂直レジスタ)と、水平転送する水平転送部(水平レジスタ)とから構成される一般的なものである。取り出された電荷は出力回路で電圧に変換される。
【００７５】
本実施形態の測定装置１では、上記したように透明基板１０の下方に配設され、組織細胞Ｓから放出される光路Ｌ３方向の蛍光をＣＣＤカメラユニット１３にて受光する。つまり、ＣＣＤカメラユニット１３は、励起光L１の光路とは重ならない位置（励起光の光路と直交する方向）に配置されており、組織細胞Ｓから下方に放射される光路Ｌ３の蛍光を
受光する。このため、透明基板１０内を全反射しつつ光路Ｌ１を伝播する励起光とは分離して、組織細胞Ｓからの光学情報である蛍光をＣＣＤ１５に入力することができ、ダイクロイックミラー、カットフィルタ等を不要とすることができる。ＣＣＤカメラユニット１３にて取得された画像信号は、測定装置１からケーブル１８を介してＰＣ２０へと出力される。
【００７６】
尚、本実施形態では蛍光検出にＣＣＤカメラを用いたが、無限焦点で近接撮影可能であればこれに限られるものではなく、例えば蛍光顕微鏡もしくはピンホール機能を備えたＣＭＯＳカメラを用いることができる。ピンホールを備えたカメラ構造とすることにより、結合レンズの手前（光路方向手前）の対物レンズを不要とでき、その分、カメラ本体を小型化することができる。尚、装置サイズを小型化する必要がない場合には、ピンホールに代えて対物レンズを備えたカメラ構造としても良い。
【００７７】
ＰＣ２０は、測定装置１を制御するコンピュータであって、表示装置である液晶ディスプレイ（以下、単に「ＬＣＤ」と略す。）２７と、入力装置であるキーボード２８とを備えている。操作者はキーボードからコマンドを入力することで測定装置１に測定を実行させることができる。撮像された細胞組織Ｓの画像データ（蛍光画像）は、ＬＣＤ２７に表示される。ここで、本実施形態においては、細胞組織Ｓの表面（透明基板１０との接触面）に放出されたＡＴＰを蛍光検出するように反応場が形成されており、ＬＣＤ２７にはＡＴＰの濃度分布が二次元の蛍光画像で示される。
【００７８】
また、ＰＣ２０は、測定装置１にＡＴＰの測定を実行させるのみならず、操作者のキーボード２８からのコマンド入力に基づいて、測定装置１の光検出器１２で取得した信号をＬＣＤ２７に表示させることができるようになっている。このため、操作者は、ＬＣＤ２７に表示される表示結果を見ながら測定装置１の光路調整を行うことができる。
【００７９】
図２は、本実施形態のアデノシン三リン酸検出用固定化酵素基板であって、測定装置１に用いられる透明基板１０を詳細に説明する図である。
【００８０】
図２（ａ）は、透明基板１０の構成を模式的に示した部分断面図である。図２（ａ）においては、紙面上側が透明基板１０の表面側となるように図示されている。また、酵素（ＧＡＰＤＨ）を楕円形状で模式的に示している。図２（ａ）に示すように、この透明基板１０の表面側、即ち細胞組織Ｓの載置面には、酵素（ＧＡＰＤＨ）が全体に一様に配列されており、化学的結合によって、透明基板１０表面に固定されている。
【００８１】
図２（ｂ）は、図２(ａ)の微小領域IIの部分拡大図である。図２（ｂ）においては、紙面の左右方向が上下方向（透明基板１０の平面に直交する方向（厚み方向））となっている。図２（ｂ）に示すように、ＧＡＰＤＨは、その末端側においてシッフ塩基を形成してシラン化合物と結合しており、このシラン化合物を介して石英（ＳｉＯ２）である透明基板１０表面に固定化されている。シラン化合物は、いわゆるシランカップリング剤であり、脱水縮合反応によって無機化合物（石英）の表面と共有結合を形成するものである。
【００８２】
シッフ塩基を形成するシラン化合物としては、例えば、アミノシラン化合物が選択され、具体的には、N-2-（アミノエチル）-3-アミノプロピルメチルジメトキシシラン、N-2-（アミノエチル）-3-アミノプロピルトリメトキシシラン、N-2-（アミノエチル）-3-アミノプロピルトリエトキシシラン、3-アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）、3-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、3-トリエトキシシリル-Ｎ-（1,3-ジメチル-ブチリデン）プロピルアミン、N-フェニル-3-アミノプロピルトリメトキシシラン、N-（ビニルベンジル）-2-アミノエチル-3-アミノプロピルトリメトキシシランの塩酸塩、エチルジメチルアミノ
プロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）などが例示される。尚、本実施形態においては、3-アミノプロピルトリメトキシシランが用いられている。
【００８３】
タンパク質である酵素の末端は、アミノ基を有しており、これにより透明基板１０に結合されたアミノシラン化合物と反応してシッフ塩基を形成し、結合を形成することができる。
【００８４】
このように透明基板１０の表面に酵素を固定することにより、透明基板１０上に細胞組織Ｓを載置すると、透明基板１０と細胞組織Ｓとの間に、酵素が存在することとなる。
【００８５】
図３は、上記のＡＴＰ検出システム１００の電気的構成を示すブロック図である。ＡＴＰ検出システム１００は、測定装置１とＰＣ２０とを備え、両者はケーブル１８によって相互に接続されている。
【００８６】
測定装置１は、上記したように、細胞組織Ｓから放出されたＡＴＰを検出するための装置であり、演算装置であるＣＰＵ２と、そのＣＰＵ２により実行される各種の制御プログラムや固定値データを記憶した不揮発性のメモリであるＲＯＭ３と、各種のデータ等を一時的に記憶するためのメモリであるＲＡＭ４と、入出力ポート６と、光源ユニット７と、光検出器１２と、ＣＣＤカメラユニット１３と、インターフェース１７とを備えている。
【００８７】
ＣＰＵ２、ＲＯＭ３、ＲＡＭ４は、バスライン５を介して互いに接続されており、バスライン５は、また、入出力ポート６にも接続されている。この入出力ポート６は光源ユニット７と、光検出器１２と、ＣＣＤカメラユニット１３と、インターフェース１７とそれぞれ接続されている。
【００８８】
ＣＰＵ２は、ＰＣ２０から送信されたコマンドを解読し、コマンドに応じて測定装置１の各部を制御する。ＰＣ２０から送信されたコマンドが、光源点灯コマンドである場合には、ＣＰＵ２は光源ユニット７において光源８の点灯を実行させる。また、ＰＣ２０から送信されたコマンドがＡＴＰ測定の実行を指示する測定実行コマンドであると、ＣＣＤカメラユニット１３に撮像信号を取得する動作を実行させる。
【００８９】
ＣＣＤカメラユニット１３は、ＣＣＤ１５とＡ／Ｄコンバータ１６とを備え、細胞組織Ｓの蛍光画像の撮像を行うものであって、非図示のコントローラによってその動作が制御される。ＣＣＤ１５にて取得された各画素の信号（撮像信号）は、それぞれアンプにて増幅された後、電圧値に変換され、更にＡ／Ｄコンバータ１６によってデジタルデータに変換される。ＣＣＤ１５の全画素の一群の画素データにて、１フレームの画像データが構成される。コントローラは、指定されたタイムラプスで、指定されたフレーム数の撮像を実行し、得られた画像データを、インターフェース１７を介してＰＣ２０へ出力する。
【００９０】
尚、本実施形態では、ＣＣＤカメラユニット１３にはカラーフィルターが設けられており、画像データは、カラー画像データ（ＲＧＢデータ）で形成される。
【００９１】
ＰＣ２０は、上記したように、測定装置１での各処理を制御するものであり、演算装置であるＣＰＵ２１と、ＲＯＭ２２と、ＲＡＭ２３と、ハードディスクドライブ（以下「ＨＤＤ」と称す）２４と、入出力ポート２６と、表示装置であるＬＣＤ２７と、入力装置であるキーボード２８と、インターフェース２９とを備えている。
【００９２】
ＣＰＵ２１、ＲＯＭ２２、ＲＡＭ２３、ＨＤＤ２４は、バスライン２５を介して互いに接続されており、バスライン２５は、また、入出力ポート２６にも接続されている。この入出力ポート２６は、ＬＣＤ２７と、キーボード２８と、インターフェース２９とにそれぞれ接続されている。
【００９３】
ＣＰＵ２１は演算装置であり、ＲＯＭ２２やＨＤＤ２４に記憶されるプログラムを実行するものである。図示を省略しているが、このＣＰＵ１１は、タイマを備えている。タイマは、所定時間の計時を行うためのものであり、後述するＡＴＰ測定処理において光源８の安定時間が計測されるようになっている。
【００９４】
ＲＯＭ２２は、ＣＰＵ２１により実行される各種の制御プログラムや固定値データを記憶した不揮発性のメモリである。
【００９５】
ＲＡＭ２３は、各種のデータ等を一時的に記憶するための書換可能なメモリであり、ＣＰＵ２１が各種プログラムを実行する際、変数などを一時記憶するワークエリアを有している。また、ＲＡＭ２３は、設定値メモリ２３ａと、測定値メモリ２３bと、画像メモリ２３cとを備えている。
【００９６】
設定値メモリ２３ａは、測定条件を記憶するためのメモリである。ＡＴＰ検出システム１００は、操作者の入力に基づいて測定装置１に実行させる測定条件を任意に設定することができるようになっている。操作者によって入力される測定条件は、測定時間（露光時間）、タイムラプス、撮影フレーム数、光源８の照射光量（印加電圧）、アンプゲインである。後述するＡＴＰ測定処理にて操作者から測定条件が入力されると、入力された項目の値がこの設定値メモリ２３ａに書き込まれ、先に記憶される値が更新される。ＣＰＵ２１は後述するＡＴＰ測定処理が実行される際に、この設定値メモリ２３ａを参照し、記憶されている測定条件にて測定装置１に測定の実行を指示する。
【００９７】
測定値メモリ２３ｂは、測定装置１から送信される画像データを記憶するためのメモリであり、受信バッファとして機能する緩衝用のメモリである。ＰＣ２０から測定装置１に対し測定実行コマンドが送信された後に測定装置１から画像データを受信すると、受信した画像データはこの測定値メモリ２３ｂに書き込まれる。１フレームの画像データが記憶されると、記憶された１フレーム分の画像データが画像メモリ２３ｃに書き込まれる。画像メモリ２３ｃに書き込まれた画像データは、測定値メモリ２３ｂから消去される。尚、測定時間中、測定装置１では、繰り返して撮像信号の取り込みが実行されるため、ＰＣ２０では継続して画像データが受信される。
【００９８】
尚、ＰＣ２０にて受信された画像データは、測定値メモリ２３ｂに記憶された後、ＨＤＤ２４に書き込まれ、設定されたフレーム数分の画像データがＰＣ２０にて保持される。
【００９９】
画像メモリ２３ｃは、ＬＣＤ２７に表示する画像データを記憶するためのメモリである。この画像メモリ２３ｃには、画像データを構成する各画素データが座標（ｘ，ｙ）に対応つけて記憶されている。座標は、ＬＣＤ２７におけるＸ軸上の位置を示すＸ座標（ｘ）と、そのＸ軸に直交するＹ軸上の位置を示すＹ座標（ｙ）とにより位置を示す情報である。ＣＰＵ２１は、測定値メモリ２３ｂに１フレーム分の画像データが記憶されると、予め定めた座標に対応つけて各画素データを画像メモリ２３ｃに書き込む。ＬＣＤ２７への表示に際しては、この画像メモリ２３ｃから画像データを読み出して、各画素データを対応する座標に基づいてＬＣＤ２７へ出力する。これにより、撮影された組織細胞Ｓの画像データが、ＬＣＤ２７の表示画面において所定の位置に表示される。
【０１００】
測定値メモリ２３ｂに新たな１フレーム分の画像データが記憶されると、当該１フレーム分の画像データが画像メモリ２３ｃに書き込まれ、先に記憶される画像データが更新される。
【０１０１】
ＨＤＤ２４は、書換可能な大容量のメモリであり、電源断後も記憶されるデータを保持する不揮発性のメモリである。このＨＤＤ２４には、図示しないオペレーティングシステムの他、測定装置１を制御するための測定装置制御プログラム２４ａと、初期値メモリ２４ｂとを備えている。図４のフローチャートに示すＡＴＰ測定処理のプログラムは測定装置制御プログラム２４ａの一部として、ＨＤＤ２４内に記憶されている。ＨＤＤ２４に記憶される各種のプログラムは、必要に応じてＲＡＭ２３にロードされ、ＣＰＵ２１により実行される。
【０１０２】
初期値メモリ２４ｂは、測定装置１にＡＴＰ測定を実行させる際の測定条件（測定時間（露光時間）、タイムラプス、撮影フレーム数、光源８の照射光量（印加電圧）、アンプゲイン）や、その他必要な値（例えば、光源８の安定時間）をデフォルトで記憶するメモリである。ＰＣ２０にてＡＴＰ測定処理が開始されると、この初期値メモリ２４ｂに記憶される測定条件が設定値メモリ２３ａに書き込まれて記憶される。従って、操作者にて任意の測定条件が入力されなかった場合には、初期値メモリ２４ｂにデフォルトで記憶されている測定条件に従って、測定装置１で測定が実行されることとなる。また、操作者によって測定条件が入力されると、入力された項目については、その入力された値に基づいて測定が実行されることとなる。
【０１０３】
次に、図４のフローチャートを参照して、上記のように構成されたＡＴＰ検出システム１００の動作について説明する。図４は、ＰＣ２０で実行されるＡＴＰ測定処理を示したフローチャートである。ＡＴＰ測定処理は、操作者の入力操作に基づいて、測定装置１に細胞組織ＳにおけるＡＴＰの濃度分布の測定を実行させる処理である。このＡＴＰ測定処理は、操作者が所定の入力操作により、ＰＣ２０にＡＴＰ測定の実行を要求することで開始される。
【０１０４】
図４に示すように、このＡＴＰ測定処理では、まず、光源点灯コマンドを測定装置１に送信する（Ｓ１）。これにより、測定装置１においては、光源８が点灯し、照射光（励起紫外光）が透明基板１０の端面へ入射される。尚、ＣＰＵ２１は、光源点灯コマンドを測定装置１に送信したタイミングで、光源８を安定させるに必要な時間（安定時間）をタイマにセットする。
【０１０５】
次に、初期値メモリ２４ｂの値（デフォルトで記憶されている測定条件）を設定値メモリ２３ａに書き込み（Ｓ２）、操作者から入力に基づいて処理を実行するための各種コマンドが表示されたメイン画面をＬＣＤ２７に表示する（Ｓ３）。これにより、メイン画面に表示されたコマンドが所定の入力操作によって入力されると、ＰＣ２０は、入力されたコマンドに従って処理を実行する。このため、コマンドが操作者によって入力されたかを確認し（Ｓ４）、コマンド入力がなければ（Ｓ４：Ｎｏ）、コマンドの入力を待機する。一方、コマンドが入力されれば（Ｓ４：Ｙｅｓ）、入力されたコマンドは何かを確認し（Ｓ５）、入力されたコマンドが終了コマンドであれば（Ｓ５：終了コマンド）、測定の終了要求であるので、光源消灯コマンドを測定装置１に送信する。これにより、測定装置１では光源８が消灯する。その後、ＰＣ２０での処理を終了するべく、ＲＡＭクリアやデータ保存、出力画面の消去などを行う終了処理を実行して（Ｓ７）、このＡＴＰ測定処理を終了する。
【０１０６】
また、Ｓ５の処理で確認した結果、入力されたコマンドが測定実行コマンドであれば（Ｓ５：測定実行コマンド）、ＡＴＰ測定の実行要求であるので、光源８が安定したか、即ち、タイマが所定時間（安定時間）の経過を示しているかを確認し（Ｓ８）、ここで、安定時間が経過していなければ、光源８が安定していないと判断して（Ｓ８：Ｎｏ）、安定時間が経過するまで以降の処理を待機する。一方、安定時間が経過していれば、光源８が安定したと判断し（Ｓ８：Ｙｅｓ）、測定実行コマンドと設定値メモリ２３ａに記憶される測定条件（測定時間（露光時間）、タイムラプス、撮影フレーム数、光源８の照射光量（印加電圧）、アンプゲイン）とを測定装置１に出力する（Ｓ９）。これにより、測定装置１では、指定された光量が光源８から照射されるとともに、指定された時間、ＣＣＤ１５による撮像信号の取り込みが実行される。尚、測定実行コマンドの測定装置への出力に際しては、ＣＰＵ２１は、設定値メモリ２３ａに記憶される測定時間をタイマにセットする。
【０１０７】
続いて、ＰＣ２０においては、測定データ、即ち画像データを測定装置１から受信したかを確認し（Ｓ１０）、未受信であれば（Ｓ１０：Ｎｏ）、受信を待機し、受信した場合には（Ｓ１０：Ｙｅｓ）、受信した画像データを測定値メモリ２３ｂに記憶する（Ｓ１１）。そして、１フレームの画像データの受信が完了したかを確認し（Ｓ１２）、未完了であれば（Ｓ１２：Ｎｏ）、Ｓ１１の処理に移行して１フレームの画像データの受信を完了するまで、Ｓ１１，Ｓ１２の処理を繰り返す。また、Ｓ１２の処理で確認した結果、１フレームの画像データの受信を完了していれば（Ｓ１２：Ｙｅｓ）、測定値メモリ２３ｂに記憶される画像データを所定の座標に対応つけて画像メモリ２３ｃに書き込み（Ｓ１３）、続いて、画像メモリ２３ｃに記憶される画像データをＬＣＤ２７に出力し、表示画面を更新する（Ｓ１４）。これにより、メイン画面の予め定められた所定位置に、測定装置１にて撮像された細胞組織Ｓの蛍光画像が表示される。
【０１０８】
尚、ＬＣＤ２７へ画像データを表示するタイミングで、画像メモリ２３ｃに記憶される画像データは非図示のステップによりＨＤＤ２４の所定のエリアに書き込まれて記憶される。
【０１０９】
その後、測定時間終了したかをタイマの値によって確認し（Ｓ１５）、測定時間が終了していない場合は（Ｓ１５：Ｎｏ）、その処理をＳ１０の処理に移行して、測定時間が終了するまで、Ｓ１０〜Ｓ１５の処理を繰り返す。一方、Ｓ１５の処理で確認した結果、測定時間が終了していれば（Ｓ１５：Ｙｅｓ）、その処理をＳ４の処理に移行する。尚、Ｓ１５の処理を経てＳ４の処理に移行した場合には、画像メモリ２３ｃに記憶される画像データが継続して表示される。
【０１１０】
更に、Ｓ５の処理で確認した結果、入力されたコマンドが条件設定コマンドであれば（Ｓ５：条件設定コマンド）、操作者からの測定条件の変更要求であるので、測定条件の入力画面を表示する（Ｓ１６）。この入力画面においては、操作者によるキーボードからの入力に基づいて、任意の測定条件を入力できる入力欄が設けられると共に、操作者が測定条件の入力完了を示すコマンドを入力できるように構成されている。ＣＰＵ２１は、この入力画面において測定条件の入力完了を示すコマンドが入力されたかを監視し（Ｓ１７）、測定条件の入力完了を示すコマンドが入力されていなければ（Ｓ１７：Ｎｏ）、その入力を待機し、一方、測定条件の入力完了を示すコマンドが入力されていれば（Ｓ１７：Ｙｅｓ）、入力欄に入力された測定条件を設定値メモリ２３ａに書き込み（Ｓ１８）、先に記憶される対応する値を更新する。そして、各処理を実行した後（Ｓ１９）、その処理をＳ４の処理に移行する。
【０１１１】
Ｓ１８の処理の後に実行される各処理（Ｓ１９）においては、ＬＣＤ２７の表示画面をメイン画面に切り替える処理を実行される。また、例えば、入力欄に入力された値が測定装置１にて実行できる範囲を超えていた場合には、エラーメッセージを表示するといった処理が実行される。
【０１１２】
加えて、Ｓ５の処理で確認した結果、入力されたコマンドが終了コマンド、測定実行コマンド、条件設定コマンド以外のその他のコマンドであれば（Ｓ５：その他）、入力されたコマンドに応じた処理を各処理（Ｓ１９）において実行し、その処理をＳ４の処理に移行する。尚、その他のコマンドとしては、測定装置１のキャリブレーションを実行するコマンドなどである。キャリブレーションが要求された場合には、測定装置１の光検出器１２で検出されたデータがＬＣＤ２７に表示される。これにより、操作者は、ＬＣＤ２７に表示される検出データを視認しつつ、光源８の入射角調整などを実行できる。
【０１１３】
以上、説明したように、本実施形態のＡＴＰ検出システム１００によれば、細胞組織から放出されたＡＴＰの濃度分布を、組織構造と対応つけて検出することができる。このため、細胞組織がどのようにＡＴＰを放出しているか、いずれの部位からＡＴＰを放出しているかを、明らかとすることができる。
【０１１４】
例えば、脳における炎症反応は進行性であることが多いが、本ＡＴＰ検出システム１００によれば、脳の炎症反応に対し、ＡＴＰが放出されている位置や、その経時変化を検出し得るので、得られた検出結果に基づき、医師が行う診断や治療等を円滑に進め易くすることができる。
【０１１５】
更には、ＡＴＰ検出システム１００を用いて、ＡＴＰの放出状況や時間変化、空間パターンを観察することで、神経保護効果のある薬の開発、スクリーニング、治療法の検討を行うことができる。また、ＡＴＰ検出システム１００にて生鮮食料品の検査を行うことにより、鮮度の評価を行うことも可能となる。
【０１１６】
尚、本実施形態においては、ヌクレオチド関連化学物質として「ＡＴＰ」を用いて説明したが、当然のことながらリン酸供給源となるヌクレオチド関連化学物質であれば、本システムを利用して細胞組織上のヌクレオチドを検出することができる。これによれば、例えば、食品中に含まれるリン酸成分、ヌクレオチド成分の測定を行うことができる。
【０１１７】
尚、上記実施形態においては、ＡＴＰ検出システム１００は、穿刺や切り出しによって得られる細胞組織Ｓを外部に（生体外に）設置された透明基板１０に載置して測定を行うように構成されたが、透明基板１０をプローブ状の光ファイバの一部分に形成すると共に、ＧＡＰやＮＡＤ＋を供給するラインや、光ファイバを介して透明基板１０に対向する位置にＣＣＤを設けたカテーテルとし、生体内に挿入された状態で測定を行う構成としても良い。
【０１１８】
また、上記実施形態において基板保持部１６は、固定されたものとして説明したが、搬送用モータを設け、ＰＣ２０から入力される位置制御命令に従って、透明基板１０を上下左右の任意の位置に移動できるようにしても良い。これによれば、光源８からの入射光と透明基板１０、測定対象の細胞組織Ｓとの位置関係を微調整することが容易となり、高精度な測定を実現することができる。
【０１１９】
更に、上記実施形態においては、透明基板１０の端面に励起光を入射し、透明基板１０の下方に検出器であるＣＣＤカメラユニット１３を配置する構成としたが、これに限られるものではなく、励起光を入射する方法はプリズム法、グレーティング法などを用いても良い。更に、細胞組織Sから放射される蛍光を、透明基板１０の上方において検出する構成としても良く、導波路である透明基板１０を伝播したものを検出する構成としてもよい。
【０１２０】
加えて、透明基板１０の端面真横に光源ユニット７を対向させ、真横から励起光を入射するように光源８を設置してもよい。かかる構成でも、エバネッセント光を透明基板１０に発生させることができ、細胞組織Ｓ表面のＡＴＰを検出することができる。また、光路調整のためのレンズ等の設備が不要となり、装置全体を小型化できる。
【０１２１】
尚、請求項に記載の細胞放出物質検出方法としては、上記実施形態において説明したＡＴＰ検出システム１００を利用して実行させたＡＴＰを検出する一連の工程、即ち、上記実施形態において、ＧＡＰＤＨを固定化した透明基板１０に載置した細胞組織Ｓに向かって、ＧＡＰとＮＡＤ＋とが透明基板１０の表面に供給された状態で、光源ユニット７から励起光を照射し、細胞組織Sから放射される蛍光をＣＣＤカメラユニット１３で検出し、検出された蛍光に基づいてＰＣ２０にて画像を形成表示する一連の工程が該当する。
【実施例】
【０１２２】
次に、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例として、上記したＡＴＰ測定システム１００にて、ラット大脳を測定対象の細胞組織とし、組織細胞上におけるＡＴＰの濃度分布を測定した。
（実施例１）
【０１２３】
出生直後の新生仔ラット（Ｎｏｒｍａｌ Ｐ２３）を用意し、７０％エタノールにて全身の消毒を行い、滅菌下にて断頭した。小脳を傷付けないように、延髄側より頭皮及び頭蓋骨を切り、切開した。その後、全脳を先曲ピンセットにて持ち上げ摘出し、生理食塩水内で血液等を洗浄した。この後に全脳をシャーレ上に移し、スカルペルナイフによって延髄及び間脳を切り離し、大脳を摘出した。大脳に付着したクモ膜及び血管を、先細ピンセットを用いて剥がし取り、再度生理食塩水にて洗浄した後、単離した大脳をロータリースライサーもしくはクリオスタット等にて４００μｍにスライスした。
【０１２４】
このスライス片（細胞組織Ｓ）を広口スポイトですくい取り、余分な水分を吸い取とってから、測定直前にＨＥＰＥＳ緩衝液に浸した後、測定装置１の透明基板１０上に載置した。次いで、ＧＡＰとＮＡＤ＋とを添加し、測定開始から１０ｓ後に、グルタミン酸１ｍＭを透明基板１０上のスライス片に滴下して、蛍光画像の撮像を行った。グルタミン酸は、脳細胞へ損傷を与えることが知られており、グルタミン酸投与により模擬的に虚血状態が誘発されることとなる。
【０１２５】
蛍光画像の撮影に先立ってＰＣ２０においてＡＴＰ測定処理を起動し、光源８を点灯させた。また、測定条件は、露光時間３００ｓ、ゲイン最大、タイムプラス１．０ｓ、フレーム数１３０で設定された。
【０１２６】
本実施例では、光源８には、３６５ｎｍの紫外波長のＬＥＤ（日亜化学ＮＳＨＵ５５０Ｂ（紫外発光ＬＥＤ）を用い、透明基板１０の下方にＣＣＤカメラを装備した倒立型蛍光顕微鏡にて観察を行った。また、透明基板１０としては、ＧＡＰＤを表面に固定した石英ガラス板（２５ｍｍｘ２５ｍｍｘ１ｍｍ）を用いた。
【０１２７】
結果を図５および図６に示した。図５（ａ）は、上記手順で準備した大脳のスライス片を可視光で観察した状態を示した図である。図５（ｂ）は、図５（ａ）に示したスライス片を蛍光観察した結果を示した図であり、グルタミン酸投与後のサンプル片の蛍光画像である。図６は、図５（ａ）に示した各位置ａ〜hのそれぞれの蛍光強度の経時変化を示した図である。
【０１２８】
図５（ａ）に示した光学画像と図５（ｂ）に示した蛍光画像とは対応しており、いずれの図においても、紙面左側が大脳皮質外方である。大脳皮質は６層の層状構造物であり、図５においては、紙面左下方から右上方に向かって、１層〜６層の順に積層された状態になっている。図５（ｂ）において白い部分が蛍光発光の箇所である。
【０１２９】
図５（ａ）、図５（ｂ）において、大脳皮質の１層と２層とに強く蛍光が生じていることが示されている。また、図６に示した各位置ａ〜hそれぞれに対応する８つのグラフは、
横軸に時間（秒）、縦軸に蛍光強度を示している。尚、蛍光強度は、最大値を４０９６とする相対値である。図５、図６からも分かるように、サンプル片の位置ａ,ｂ,ｃ部分の蛍光強度が明確に上昇していることが示されている。
【０１３０】
大脳皮質では、１層と２層とにグリア細胞が多く分布しており、グルタミン酸投与によって脳虚血状態が誘発されたサンプル片において、この１層と２層とに強く蛍光が生じていることは、生理学上の知見とがよく一致していた。即ち、上記結果は、損傷を受けた細胞組織からＡＴＰが放出されたことを示すものであり、本発明の細胞放出物質検出装置を用いれば、細胞から放出されたヌクレオチド関連物質の細胞組織上の濃度分布を画像化して検出できることが示された。
【符号の説明】
【０１３１】
７ 光源ユニット（光照射手段）
１０ 透明基板（基板、細胞放出物質検出用固定化酵素基板）
１５ ＣＣＤ（検出手段）
１００ ＡＴＰ検出システム（細胞放出物質検出装置）
Ｓ１３,Ｓ１４ （画像形成手段の一部）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞組織が載置される載置面側に、基質をリン酸化するリン酸化反応とリン酸化された後の基質を酸化する酸化反応とを触媒する酵素を有する基板と、
その基板上での反応に伴って蛍光元物質から生成される蛍光物質を励起する励起光を、前記基板上の細胞組織に向けて照射する光照射手段と、
その光照射手段によって照射された励起光によって蛍光物質から放射される蛍光を検出する検出手段と、
その検出手段により検出された蛍光に基づいて画像を形成する画像形成手段とを備えており、
その画像形成手段により形成された画像により、前記基板に載置された細胞組織から放出されたヌクレオチド関連化学物質の濃度分布を検出することを特徴とする細胞放出物質検出装置。
【請求項２】
前記酵素はグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素であることを特徴とする請求項１に記載の細胞放出物質検出装置。
【請求項３】
前記基板は、前記酵素が載置面側表面に化学結合によって固定化されたものであることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞放出物質検出装置。
【請求項４】
前記光照射手段は、前記基板の側面へ励起光を入射する光源部を備えており、
その光源部から前記基板の側面に照射される励起光により、前記基板の載置面にエバネッセント光を発生させるよう構成されていることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の細胞放出物質検出装置。
【請求項５】
前記検出手段は、前記光照射手段が照射する励起光の光路と重ならない位置に配設されていることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の細胞放出物質検出装置。
【請求項６】
細胞組織から放出されたヌクレオチド関連化学物質の濃度分布を検出する方法であって、
基質をリン酸化するリン酸化反応とリン酸化された後の基質を酸化する酸化反応とを触媒する酵素を有する基板に載置された細胞組織に向かって、基質と当該酵素反応に伴って蛍光物質に変換される蛍光元物質とが基板上に共存する状態で、蛍光物質の励起光を照射する光照射工程と、
その光照射工程により照射された励起光によって励起された蛍光物質から放射される蛍光を検出する蛍光検出工程と、
その蛍光検出工程により検出された蛍光に基づいて画像を形成する画像形成工程とを備え、
その画像形成工程により形成された画像により、細胞組織から放出されたヌクレオチド関連化学物質の濃度分布を検出することを特徴とする細胞放出物質検出方法。
【請求項７】
前記酵素はグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素であることを特徴とする請求項６に記載の細胞放出物質検出方法。
【請求項８】
前記酵素は基板表面に化学結合によって固定されており、細胞組織はその基板表面に載置されることを特徴とする請求項６又は７に記載の細胞放出物質検出方法。
【請求項９】
平滑面を有する透光性基板の表面上にグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素が化学的結合によって担持されていることを特徴とする細胞放出物質検出用固定化酵素基板。
【請求項１】
細胞組織が載置される載置面側に、基質をリン酸化するリン酸化反応とリン酸化された後の基質を酸化する酸化反応とを触媒する酵素を有する基板と、
その基板上での反応に伴って蛍光元物質から生成される蛍光物質を励起する励起光を、前記基板上の細胞組織に向けて照射する光照射手段と、
その光照射手段によって照射された励起光によって蛍光物質から放射される蛍光を検出する検出手段と、
その検出手段により検出された蛍光に基づいて画像を形成する画像形成手段とを備えており、
その画像形成手段により形成された画像により、前記基板に載置された細胞組織から放出されたヌクレオチド関連化学物質の濃度分布を検出することを特徴とする細胞放出物質検出装置。
【請求項２】
前記酵素はグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素であることを特徴とする請求項１に記載の細胞放出物質検出装置。
【請求項３】
前記基板は、前記酵素が載置面側表面に化学結合によって固定化されたものであることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞放出物質検出装置。
【請求項４】
前記光照射手段は、前記基板の側面へ励起光を入射する光源部を備えており、
その光源部から前記基板の側面に照射される励起光により、前記基板の載置面にエバネッセント光を発生させるよう構成されていることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の細胞放出物質検出装置。
【請求項５】
前記検出手段は、前記光照射手段が照射する励起光の光路と重ならない位置に配設されていることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の細胞放出物質検出装置。
【請求項６】
細胞組織から放出されたヌクレオチド関連化学物質の濃度分布を検出する方法であって、
基質をリン酸化するリン酸化反応とリン酸化された後の基質を酸化する酸化反応とを触媒する酵素を有する基板に載置された細胞組織に向かって、基質と当該酵素反応に伴って蛍光物質に変換される蛍光元物質とが基板上に共存する状態で、蛍光物質の励起光を照射する光照射工程と、
その光照射工程により照射された励起光によって励起された蛍光物質から放射される蛍光を検出する蛍光検出工程と、
その蛍光検出工程により検出された蛍光に基づいて画像を形成する画像形成工程とを備え、
その画像形成工程により形成された画像により、細胞組織から放出されたヌクレオチド関連化学物質の濃度分布を検出することを特徴とする細胞放出物質検出方法。
【請求項７】
前記酵素はグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素であることを特徴とする請求項６に記載の細胞放出物質検出方法。
【請求項８】
前記酵素は基板表面に化学結合によって固定されており、細胞組織はその基板表面に載置されることを特徴とする請求項６又は７に記載の細胞放出物質検出方法。
【請求項９】
平滑面を有する透光性基板の表面上にグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素が化学的結合によって担持されていることを特徴とする細胞放出物質検出用固定化酵素基板。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１３−４０８００（Ｐ２０１３−４０８００Ａ）
【公開日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１７６３４２（Ｐ２０１１−１７６３４２）
【出願日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【出願人】（３０４０２７３４９）国立大学法人豊橋技術科学大学 (391)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【出願人】（３０４０２７３４９）国立大学法人豊橋技術科学大学 (391)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]