細胞浸透効率を向上させた輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質及びその用途
本発明は、機能を有する蛋白質またはペプチドをより高い効率で細胞内に導入させる融合蛋白質とその用途に関するものであって、より詳しくは６ないし１２個のアミノ酸残基で構成され、アルギニンまたはリシン残基を３／４以上含む輸送ドメインが目標蛋白質のアミノ基とカルボキシル基に共有結合された、細胞浸透性輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質とその用途に関するものである。本発明は、蛋白質の細胞内導入能と効率及び細胞内活性を容易に分析するための緑色蛍光蛋白質(Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ)と生体防御メカニズムにおいて重要な役割を行うものに知られているＣｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムタ−ゼ（ＳＯＤ）を目標蛋白質に使用した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は機能を有する蛋白質又はペプチドをより高い効率で細胞内に導入させる融合蛋白質とその用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近、様々な疾患が細胞蛋白質の非正常的な活性に起因するという事実が知られてきているため、これら蛋白質の活性を調節することにより致命的な人体疾患を治療できる薬剤の開発が全世界的関心の対象となっている。
【０００３】
その一例として、活性酸素種と関連されたス−パ−オキシドジスムタ−ゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）を細胞蛋白質の例として挙げる（但し、本発明の意図する範囲はこの蛋白質だけを目標蛋白質に限定するものではない。）。
【０００４】
活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）は、エネルギ−を得る全ての生命体から、酸素を利用して多くの細胞内代謝過程の副産物として必然的に生成される。このような活性酸素種は、細胞内の蛋白質、核酸及び脂肪のような生体高分子に損傷を与え、人体の多くの疾病の進行過程と深く関連されている。特に発癌過程、脳卒中、関節炎、動脈硬化、放射線損傷及び炎症反応に関与し、正常的な老化過程においても老化を促進させる重要な要因として作用する（非特許文献１〜３）。
【非特許文献１】Ｆｌｏｙｄ,Ｒ.Ａ.（１９９０）ＦＡＳＥＢ Ｊ．４，２５８７−２５９７.
【非特許文献２】Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．（１９８８）Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ３９２，２５−３０.
【非特許文献３】Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ Ｂ．ａｎｄＧｕｔｔｅｒｉｄｇｅ Ｊ．Ｍ．Ｃ.（１９９９）Ｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ．
【０００５】
Ｃｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼと関連された疾病等を簡略に検討すれば表１のとおりである。
【０００６】
【表１】
【０００７】
公知の活性酸素種としては１Ｏ２、ＯＨ、Ｏ２、Ｈ２Ｏ２等があり、これらは生体内で各種の酵素反応によって生成され、各種の生理活性物質の生合成、免疫機能、薬物の代謝等において大変重要な役割をするが、外部からの放射線、紫外線、公害及び各種のストレス等によって過剰生成される場合には、反って生体に損傷を来すことがある。そこで、生体は防御機能として、ＳＯＤ、カタラ−ゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ）、ペルオキシダ−ゼ（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）等の酵素を有するが、老化が始まると皮膚の均衡が壊れるようになり、各種の活性酸素類に対する皮膚保護能力が劣るようになる。
【０００８】
よって、このような活性酸素類等から細胞を保護する必要性が強くなってきており、化粧品原料としての活性酸素除去剤として、ＳＯＤ、ラクトフエリン、酸化防止剤等が使用ないし開発されている。しかしながら、ＳＯＤは、活性酸素除去能を有するにもかかわらず、酵素蛋白質という性質により地質に対し難溶性であり、安定性が悪く、分子量が３０，０００ダルトン（Ｄａｌｔｏｎ）以上で皮膚角質層の透過が不可能であるという問題点があるため、化粧料組成物として有用に利用されなかった。
【０００９】
Ｃｕ，Ｚｕ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼは、自由ラジカルの害毒と酸素の損傷から細胞の損傷を防止する細胞内重要な防御酵素である（非特許文献４）。全ての生体内高分子等は、このような酸素ラジカルの有害な作用に常に晒されているため、多くの疾患においてＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼを治療目的に利用しようとする関心が非常に高くなっている。
【非特許文献４】Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，Ｉ．（１９９５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４，９７−１１２．
【００１０】
最近、Ｃｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼを臨床的に応用するために多くの方法が示されている。現在まで開発されたＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼの生体内運搬方法は大きく３種に区分できる。
【００１１】
第１に、Ｃｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼにポリエチレングリコ−ル（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、フイコ−ル（Ｆｉｃｏｌｌ）、レシチン（ｌｅｃｉｔｈｉｎ）、アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）等を集合させる方法がある。
【非特許文献５】Ｄｅｌ Ｚｏｐｐｏ，ｇ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｄｒｕｇｓ ５４，９−３８
【非特許文献６】Ｍｕｚｙｋａｎｔｏｖ， Ｖ．Ｒ．ｅｔ ａｌ.（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３，５２１３−５２１８．
【００１２】
第２に、リポソ−ム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）を利用してＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼをカプセル化させる方法がある。
【非特許文献７】Ｐｅｒｄｅｒｅａｕ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｕｌｌ．Ｃａｎｃｅｒ ８１，６５９−６６９．
【００１３】
第３に、Ｃｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ遺伝子を形質導入して細胞内で酵素の過多発現を誘導する遺伝子治療等の試みが示されている。
【非特許文献８】Ｏｋｕｍｕｒａ，Ｋ． ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４，１２２３−１２２７
【非特許文献９】Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｔ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６９，１０５１−１０５７．
【非特許文献１０】Ｌｉｕ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８，５８５−５９５．
【００１４】
これらのうち、もっとも注目を受けているものは、遺伝子治療であり、Ｃｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ遺伝子治療を疾病に適用しようとする多くの研究が行われてきた。しかし、遺伝子治療は遺伝子の細胞内への運搬が容易でなく、標的細胞における発現率が低く、発現される細胞で蛋白質が発現される期間が短く、標的細胞から発現される蛋白質の量を人為的に調節するのが非常に難しい等、様々な問題点を有している。
【非特許文献１１】Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ３８９，２３９−２４２．
【００１５】
治療のための薬物や蛋白質を細胞内に移動させることに関しては、他の方法として、目標蛋白質を細胞膜を経て直接伝達する方法が考えられる。しかし、治療用薬物や蛋白質は、そのサイズ又は多くの生化学的性質のため細胞膜を通過することが大変難しい。一般的に分子量６００以上の物質は細胞膜を通過するのが殆ど不可能であることが知られている。
【００１６】
最近になって、ヒト免疫欠乏ビ−ルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ−１）蛋白質の一種であるＴａｔ（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）蛋白質が、効率的に細胞膜を通過して細胞質内に容易に移動するということが明らかになった。このような機能はＴａｔ蛋白質の中間部位である蛋白質形質導入部位（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎ）の特性のため表れ、未だその正確なメカニズムは知られていない状態である（非特許文献１２〜１５）。しかし、Ｔａｔ蛋白質の細胞膜通過には特定受容体や運搬体が関与しないことが見出されており、Ｔａｔ蛋白質の蛋白質形質導入部位が、直接膜の地質二重層と作用することにより起こるものと理解されている（非特許文献１６、１７）。
【非特許文献１２】Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．Ｄ．ａｎｄＰａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９８８）Ｃｅｌｌ ５５，１１８９−１１９３．
【非特許文献１３】Ｇｒｅｅｎ，Ｍ. ａｎｄ Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｐ.Ｍ.（１９８８）Ｃｅｌｌ５５，１１７９−１１８８．
【非特許文献１４】Ｍａ，Ｍ． ａｎｄ Ｎａｔｈ，Ａ.（１９９７），Ｊ.Ｖｉｒｏｌ．７１，２４９５−２４９９.
【非特許文献１５】Ｖｉｖｅｓ，Ｅ．，Ｂｒｏｄｉｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．（１９９７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１６０１０−１６０１７．
【非特許文献１６】Ｖｉｖｅｓ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１６０１０−１６０１７．
【非特許文献１７】Ｄｅｒｏｓｓｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ.（１９９６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１８１８８−１８１９３.
【００１７】
最近の研究において，オバルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）、β−ガラクトシダ−ゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）、セイヨウワサビ ペルオキシダ−ゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）のような異形蛋白質をＨＩＶ−１ Ｔａｔ蛋白質と融合させて投与した際、生体の各組織及び培養された細胞内に直接運搬されるとのことが発表された（非特許文献１８〜２０）。このような実験結果は、Ｔａｔ蛋白質がそれ自身だけではなく、他の種類の巨大な蛋白質も細胞内に一緒に運搬できる能力を有することを意味している。
【非特許文献１８】Ｆａｗｅｌｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１，６６４−６６８．
【非特許文献１９】Ｓｃｗａｒｔｚｅ，Ｓ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８５，１５６９−１５７２．
【非特許文献２０】Ｗａｔｓｏｎ，Ｋ．ａｎｄ Ｅｄｗａｒｄ，Ｒ．Ｊ．（１９９９），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５８，１５２１−１５２８．
【００１８】
しかしながら、実際には、全ての蛋白質がＴａｔ蛋白質によって運搬されるものではない。また、Ｔａｔによって細胞内に運搬された全ての蛋白質が生物学的活性を表すかも未だ明らかになっていないのが現状である。
【００１９】
本発明者は、ＨＩＶ Ｔａｔ ４９−５７輸送ドメインの外にもリシン（ｌｙｃｉｎｅ）が６ないし１２個結合されたオリゴリシン輸送ドメイン、ＨＩＶ Ｔａｔ ４８−５７残基のうち、２、３個の残基が欠如した塩基性輸送ドメインについて、アミノ基に共有結合された融合蛋白質への細胞透過実験を行っており、これらが円滑な細胞透過能を有すること示している
【特許文献１】韓国特許公報第２００２−１００４４６号
【特許文献２】韓国特許公報第２００２−６７１０８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的は、目標蛋白質を細胞内に導入又は発現させる際に、従来技術の問題点を解決し、高効率で細胞内に導入させ、細胞内で活性を有するようにしようとするものである。
【００２１】
また、本発明はス−パ−オキシドジスムタ−ゼを細胞内に導入又は発現させる際に、従来技術の問題点を解決し、高効率で細胞内に導入させ、細胞内で活性を有するようにしようとするものである。
【００２２】
また、本発明は、輸送ドメインと融合されたス−パ−オキシドジスムタ−ゼを利用して皮膚表皮、真皮層、皮下脂肪層まで浸透して卓越した活性酸素種の除去能を有する化粧料を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
上記、課題を解決するために、本発明者らは、輸送ドメインとヒトＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼを融合させ、該融合蛋白質が効果的に細胞内に透過されるかをＨｅＬａ細胞を利用した実験において確認した。また、輸送ドメイン−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ輸送ドメイン融合蛋白質を多量に生産する方法及び精製する方法を開発した。
【００２４】
本発明は、機能を有する蛋白質又はぺプチドをより効率的に細胞内に運搬し、細胞内でもより高い活性を有するようにするために、輸送ドメインと融合させた融合蛋白質と該融合蛋白質を利用した薬剤組成物及び化粧料組成物を提供する。
【００２５】
本発明の輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質は遺伝子組み替え方法の他にも、一般的な化学結合方法で製造することができる。
【００２６】
本発明は、６ないし１２個のアミノ酸残基から構成され、アルギニン又はリシン（ｌｙｃｉｎｅ）残基を３／４以上含む輸送ドメインが目標蛋白質のアミノ基とカルボキシル基に共有結合された、細胞浸透性輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質に関するものである。目標蛋白質の両末端に位置する輸送ドメインは必ず同一な残基からなっていなければならないものではない。
【００２７】
また、本発明は、上記輸送ドメインが９個のアミノ酸残基で構成される細胞浸透性輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質に関するものである。
【００２８】
また、本発明は、上記輸送ドメインがＨＩＶ ｔａｔ ４９−５７残基、オリゴリシン、オリゴアルギニン又はオリゴ（リシン，アルギニン）中の１種以上であることを特徴とする。
【００２９】
更に、本発明は、上記目標蛋白質が治療分子、予防分子、診断分子から構成されたグル−プから選ばれたことを特徴とする。
【００３０】
また、本発明は、上記目標蛋白質がＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ又はその機能的等価物であることを特徴とする。
【００３１】
また、本発明は、上記細胞浸透性輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質を有効成分とすることを特徴とする化粧料組成物に関するものである。
【００３２】
また、本発明は、上記目標蛋白質がＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ又はその機能的等価物であることを特徴とする化粧料組成物に関するものである。
【００３３】
また、本発明は、上記化粧料組成物が化粧水、ジエル、水溶性リキッド、水中油（Ｏ／Ｗ）型又は油中水（Ｗ／Ｏ）型であることを特徴とする。
【００３４】
のみならず、本発明は上記輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質を有効成分とし、薬学的に許与される担体を含むことを特徴とする薬剤学的組成物に関するものである。
【００３５】
また、本発明は、上記目標蛋白質がＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−ジスムタ−ゼ、又は、その機能的等価物であることを特徴とする。
【００３６】
輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質を有効成分として含有する薬剤学的組成物は薬剤学的分野で通常的に許容される担体と共に配合して通常的な方法によって経口又は注射形態に成型することができる。経口用組成物としては、例えば、錠製及びゼラチンカプセルがあり、これらは活性成分以外にも必要によって、希釈剤（例：ラクト−ス、デキストロ−ス、蔗糖、マンニト−ル、ソルビト−ル、セルロ−ス及び／又はグリシン）、滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸及びそのマグネシウム又はカルシウム塩及び／又はポリエチレングリコ−ル）を含有し、錠剤はまた結合剤（例：マグネシウムアルミニウムシリケ−ト、澱粉ペ−スト、ゼラチン、メチルセルロ−ス、ナトリウムカルボキシメチルセルロ−ス及び／又はポリビニルピロリドン）を含有し、場合によって、崩解剤（例：澱粉、寒天、アルギン酸、又はそのナトリウム塩）又は沸騰混合物及び／又は吸水剤、着色剤、抗味剤及び甘味剤を含有することが好ましい。注射用組成物は、等張性水溶液又は懸濁液が好ましく、これらの組成物は滅菌され、必要によって補助剤（例：防腐剤、安定化剤、湿潤剤、又は乳化剤溶液促進剤、浸透圧調節のための塩及び/又は緩衝剤）を含有する。又、これらはその他治療的に有用な物質を含有することができる。
【００３７】
このように製造された薬剤学的製剤は、その目的により、経口投与するか、非経口方式、即ち、静脈内、皮下、腹腔内投与又は局所適用することができ、容量は１日の投与量が０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇの量を1ないし数回に分けて投与することができる。特定患者に対する投与容量水準は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、投与時間、投与方法、排泄率、疾患の重症度等によって変化し得る。
【００３８】
また、本発明の化粧料組成物は、クリ−ム、軟膏、ジエル、ロ−ション、化粧水等で製品化されて使用できる、どんな製品として使用するかは、本発明の属する技術分野の当業者によって極めて容易に決定され得る。
【００３９】
また、本発明の輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質を有効成分とするロ−ション、ジェル、エセンス、クリ−ム、化粧水等はそれぞれ、通常的な製造方法によって、どんな形態でも容易に製造することができ、基礎化粧品等に適宜に添加して使用することができる。
【００４０】
その一例として、クリ−ムを製造するにおいては、一般的な水中油型（Ｏ／Ｗ）又は油中水型（Ｗ／Ｏ）のクリ−ムベ−スに本発明の融合蛋白質を含有させ、ここに香料、キレ−ト剤、色素、酸化防止剤、防腐剤等を使用する一方、物性改善を目的に蛋白質、ミネラル、ビタミン等合成又は天然素材を併用することができる。
【００４１】
本明細書及び請求範囲の”目標蛋白質（ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）”は、上記ＨＩＶ−１ Ｔａｔ輸送ドメインと共有結合をなして細胞内に導入され活性を示す治療分子、予防分子及び診断分子等を意味し、実際には、純粋な蛋白質にだけ限定されるものでなく、ペプチド、ポリペプチド、糖類と結合された糖蛋白質、ペプチドグリカン等を通称する表現に使用される。
【００４２】
また、本発明において”輸送ドメイン“はペプチド、蛋白質、オリゴペプチド、糖類と結合された糖蛋白質、ペプチドグリカン又はポリペプチド等と共有結合をなして別途の受容体や運搬体、エネルギ−を必要としないで上記有機化合物等を細胞内へ導入させることができるドメインであって、６〜１２個のアミノ酸残基からなっており、その中、３／４以上がアルギニン又はリシン残基からなっていることをいい、代表的な例を挙げるとすれば、ＨＩＶ−１ Ｔａｔ（４８−５７）、オリゴリシン、オリゴアルギニン、オリゴ（リシン、アルギニン）等をいう。さらに好ましくは、９個のアミノ酸残基からなっており、そのうち、３／４以上がアルギニン又はリシン残基からなっているものを本発明の輸送ドメインの例に挙げることができる。
【００４３】
また、本明細書及び請求範囲では蛋白質、ペプチド、糖蛋白質、オリゴペプチド、ポリペプチド等を細胞内に”導入“させることに対して、”運搬”、”浸透”、”輸送“、”伝達”、”透過“、”通過”するという表現と混合して使用している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
以下では、本発明の構成を実施例を通じて詳しく説明する。
【００４５】
実施例１：輸送ドメイン融合蛋白質発現ベクタ−の製造
機能を有する蛋白質又はぺプチドを細胞内に浸透させる技術を開発するために細胞内に目標蛋白質を伝達できる融合蛋白質発現べクタ−を製造した。
【００４６】
本実施例では、輸送ドメイン蛋白質を細胞内に伝達する能力を簡易に分析するために、緑色蛍光蛋白質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ；本明細書において“ＧＦＰ”と略称する）を目標蛋白質に選んだ。ＧＦＰの塩基配列に該当するＤＮＡ切片をプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ２（ク−ロンテック）を利用してＰｆｕ ＤＮＡ重合酵素で重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）させ、ＧＦＰの完全な配列を増幅した。正方向開始体（ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）は５‘−ＣＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧ−３’（配列番号1）であり、逆方向開始体（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）の配列は５‘−ＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣ ＡＴＧＣＣＧＡＧ−３’（配列番号２）である。ＰＣＲ産物はＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩで切られ、ｐＥＴ１５ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ座にサブク−ロンされ、ＨＩＶ−１ Ｔａｔの塩基性ドメインがないＧＦＰ融合蛋白質を発現させるｐＧＦＰを製造した。約０．７ｋｂの挿入体を有するク−ロンはＸｈｏｌ−ＢａｍＨＩ制限酵素分析で選ばれ、配列決定を通じて分析された。
【００４７】
ＧＦＰと融合されたＨＩＶ−１ Ｔａｔの塩基性ドメイン（アミノ酸４８−５７）を発現させるｐＴａｔ−ＧＦＰは、次の方法で製造された。
【００４８】
第１の方法：二つのオリゴヌクレオチドが製造され、ＨＩＶ−１ Ｔａｔの塩基性ドメインの９個のアミノ酸をコ−デイングする二重鎖オリゴヌクレオチドでアニ−ルされた。ＨＩＶ−１ Ｔａｔの塩基性ドメインの９個のアミノ酸をコ−デイングする配列は上方の鎖（ｔｏｐ ｓｔｒａｎｄ）二重鎖オリゴヌクレオチドでアニ−ルされた。ＨＩＶ−１ Ｔａｔの塩基性ドメイン５‘−ＴＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号３）と下方鎖（ｂｏｔｔｏｍ ｓｔｒａｎｄ）５‘−ＴＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号4）である。二重鎖オリゴヌクレオチドは直接ｐＧＦＰのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩで消化された部位に連結される。そして、インフレ−ム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）で６個のヒスチジンオ−プンリディングフレ−ムと連結されたＴａｔ−ＧＦＰ発現プラスミドであるｐＴａｔ−ＧＦＰが製造された（図１）。
【００４９】
また、Ｔａｔ塩基性ドメインＧＦＰ両側末端に融合されたｐＴａｔ−ＧＦＰ−ＴａｔはｐＴａｔ−ＧＦＰにＴａｔ塩基性ドメイン９個のアミノ酸をコ−デイングする二重鎖オリゴヌクレオチドがアニ−ルされ、カルボキシル末端に挿入され、Ｔａｔ塩基性末端がカルボキシル末端に融合されたｐＧＦＰ−ＴａｔはｐＧＦＰにＴａｔ塩基性ドメイン９個のアミノ酸をコ−デイングする二重鎖オリゴマヌクレオチドがアニ−ルされてカルボキシル末端に挿入された（図１）。
【００５０】
プラスミドにク−ロンされたオリゴヌクレオチドの配列は蛍光自動配列分析器（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ，モデル３７３Ａ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）で確認した。
【００５１】
実施例２：Ｔａｔ−ＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｔａｔ及びＴａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質の発現及び精製（Ｎａｔｉｖｅ、ｄｅｎａｔｕｒｅｄ）
ｐＧＦＰ及びｐＴａｔ−ＧＦＰ、ｐＧＦＰ−ＴａｔとｐＴａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ等で形質転換されたＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ ２１（パ−マシア）を選んだ後、コロニ−を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが含有されたＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩培養した。培養した培養液は新鮮なＬＢ培地で１０倍希釈して２５０ｒｐｍで撹伴して培養した。培養液内のバクテリア濃度が０．Ｄ６００１.０を示したとき、ＩＰＴＧを培地内に添加して最終濃度が０．５ｍＭになるようにした後、４時間さらに培養した。
【００５２】
変性された輸送ドメイン−ＧＦＰ融合蛋白質を得るために、培養された細胞に６Ｍウレアとプロテア−ゼ抑制剤（２０ｍｇ／ｍｌソイビントリップシン抑制剤、２ｍｇ／ｍｌアプロチ二ン、５ｍｇ／ｍｌリュペップチン、１００ｍｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ）が含まれた結合緩衝溶液（ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ;５ｍＭイミダゾ−ル、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）を入れて超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）して収獲し、溶菌した。緩衝液Ａ（ｂｕｆｆｅｒ Ａ;６Ｍウレア、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ）に入れ超音波処理して細胞を破砕させた後、遠心分離を２回（１６、５００ｒｐｍ×３０ｍｉｎ、４０，０００ｒｐｍ×３０ｍｉｎ、４℃）連続して行って、不溶性の細胞破片（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）を除去した。その後、溶菌液（ｌｙｓａｔｅ）をＮｉ＋＋＋−ＩＤＡコラムを通じて精製した。コラムは先ず６Ｍウレアがない結合緩衝液で洗浄した後、洗浄緩衝溶液（８０ｍＭイミダゾ−ル、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）で洗浄した。蛋白質は溶出緩衝液（１ｍＭ イミダゾ−ル、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．９）で溶出した後、ＰＤ−１０コラムクロマトグラフィ−（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を利用して蛋白質に含まれた塩分を除去した（図２）。精製されたＧＦＰ融合蛋白質は約３０ｋＤａのサイズに発現、精製され、Ｔａｔ−ＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質はＴａｔ輸送ドメインのサイズ（約１ｋＤａ）ほどより大きいサイズに発現、精製され、Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質は両側にＴａｔ輸送ドメインが融合されているので、Ｔａｔ−ＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質より一つのＴａｔ輸送ドメインのサイズほどもっと大きい分子量で発現され精製された。
【００５３】
変性されない自然状態の輸送ドメイン−ＧＦＰ融合蛋白質は上記言及された変性剤なしで同一の過程で得られた。各分画の蛋白質濃度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに分離した後、密度測定分析方法で牛胎血清アルブミン（ＢＳＡ）をスタンダ−ドとして定量した。蛋白質濃度はブレドフオ−ド蛋白質アッセイ（Ｂｉｏｒａｄ）で測定した。精製された融合蛋白質等は、２０％グリセロ−ルが含まれたＰＢＳに溶解され−８０℃で貯蔵された。
【００５４】
実施例３：細胞培養と融合蛋白質の細胞内伝達実験
ＨｅＬａ細胞は３７℃で２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１０％牛胎血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）及び抗生剤（１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン）が含まれたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’Ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）において培養した。
【００５５】
９個のアミノ酸（４９−５７）からなるＨＩＶ−１ Ｔａｔ蛋白質輸送部分をアミノ酸末端とカルボキシル末端に結合させた変異体輸送ドメインに対する化物分子細胞透過能を観察するために次のように実験した。即ち、輸送ドメイン−ＧＦＰ、ＧＦＰ−輸送ドメイン、輸送ドメイン−ＧＦＰ−輸送ドメイン融合蛋白質等の細胞内透過を観察するために、ＨｅＬａ細胞を６−ウエルプレ−トで４〜６時間養った後、１０％ＦＢＳが含まれた新鮮なＤＭＥＭ培養液で交替し、多くの濃度のＧＦＰ融合蛋白質を培養液内に処理した。３７℃で１時間培養した後、細胞をりん酸緩衝液生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ;ＰＢＳ）で十分に洗浄し、１０分間トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で処理した。細胞を粉砕した後、細胞内に透過された輸送ドメイン−ＧＦＰ融合蛋白質の量を次の実施例のようにウエスタン−ブロット分析で測定した。
【００５６】
実施例４：ウエスタン−ブロット分析
Ｔａｔ輸送ドメインがアミノ酸末端に一つが融合されている蛋白質と両側に融合されている蛋白質間の細胞内移動効率を分析するために、ウエスタン−ブロット実験方法を行った。先ず、蛋白質等を変性された状態で精製した。準備されたＨｅＬａ動物細胞に１Ｍの変性された融合蛋白質を処理した後、１時間後に、細胞等だけを集めてウエスタン−ブロットを行った。細胞を溶菌して得られた細胞溶菌液を溶菌緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、２％ ＳＤＳ、１０％ ｖ／ｖグリセロ−ル）がある６−ウエル プレ−トに入れた。全体細胞溶菌液各１５μｇずつをＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドジェル上で電気移動させた。
【００５７】
電気移動で分離された蛋白質をニトロセルロ−スメンブレイン（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ;Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）へ移動させた。蛋白質が移動されたニトロセルロ−スメンブレインを１０％粉乳を含むＰＢＳでブロッキングした。次いで、メンブレインはラビット抗−ＧＦＰポリク−ロン抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ;Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ、１：１，０００）で処理した。その後、セイヨウワサビペルオキシダ−ゼ−（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）結合されたゴ−ト抗−ラビット（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ）IｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ、１：１０，０００希釈）と反応させた。結合された抗体等は、化学発光にて確認することができた（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）。その結果、図３で現したように、Ｔａｔ輸送ドメインがアミノ酸末端にのみある融合蛋白質と、Ｔａｔ輸送ドメインがカルボキシル末端にある融合蛋白質は、同様に細胞内に移動した。しかし、Ｔａｔ輸送ドメインが両側の末端に融合されている蛋白質は、一つのＴａｔ輸送ドメインが連結されている融合蛋白質より効果的に細胞内に移動した。この結果は、Ｔａｔ輸送ドメインが融合蛋白質のアミノ酸末端とカルボキシル末端のいずれ側に融合されてあってもその効果は類似するが、Ｔａｔ輸送ドメインが両側に融合されておれば、細胞内への移動効果が向上することを示す。
【００５８】
実施例５：共焦点蛍光分析（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）による細胞導入分析
目標細胞に融合蛋白質を伝達しようとするとき、伝達される細胞の割合がいくらになるかは重要である。また、細胞内に透過された融合蛋白質がその固有な活性を維持しなければ、このような蛋白質伝達技術が応用できない。そこで、本実験において、ＧＦＰ融合蛋白質が伝達される細胞の割合や伝達された融合蛋白質の活性の有無を分析した。変性されたＧＦＰ融合蛋白質を処理したＨｅＬａ細胞からＧＦＰが現れる蛍光度を蛍光顕微鏡で観察した。
【００５９】
カバ−スリップ上で５０〜７０％のコンフルエンシ（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）になるように細胞を培養した次の両側末端に輸送ドメインが結合されているＧＦＰ−融合蛋白質を１Ｍ処理し、１５分間培養した。ＨｅＬａ細胞等はＰＢＳで２回洗浄した後、トリプシン処理し、室温で５分間ホルムアルデヒドが含有されたＰＢＳで固定された。細胞等はさらにＰＢＳで洗浄した後、核だけを染色するために２ｇ／ｍｌのプロピジウムアイオダイド（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｅｄ；ＰＩ）を１５分間処理した。細胞等はさらにＰＢＳで洗浄した後、マウンテイング溶液（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ;９０％グリセロ−ル、０．１％フエニレンジアミンが含まれたりん酸緩衝液食塩水（ＰＢＳ））を処理し、カバ−ガラスを被せて共焦点蛍光顕微鏡を利用して４８８ｎｍと５４５ｎｍ蛍光フイルタ−で細胞内の蛍光の有無を観察、蛋白質の細胞内分布を分析した（Ｅｒｉｃ ｅｔ ａl.，１９９７）。その結果、Ｔａｔ輸送ドメインがアミノ酸末端に融合されている蛋白質とカルボキシル末端に融合されている蛋白質は殆ど細胞質のみならず核まで到達した（図４）。これは、ウエスタン−ブロットの結果と同じく、Ｔａｔ輸送ドメインが蛋白質のどの部分に融合されていても、その効果が類似することを示す。その反面、Ｔａｔ輸送ドメインが両側に付いた融合蛋白質は、一方にのみ存在する融合蛋白質より明るい蛍光を現した。加えて、Ｔａｔ輸送ドメインが両側に付いた融合蛋白質は、より多くの核内に移動していることが確認された。
【００６０】
実施例６：ＦＡＣＳ（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）分析による細胞導入分析
９個のアミノ酸（４９−５７）からなるＨＩＶ−１ Ｔａｔ蛋白質輸送部分をアミノ酸末端とカルボキシル末端両側に結合させた変異体輸送ドメインに対する化物分子細胞透過能を観察するために次のように実験した（図５）。即ち、輸送ドメイン−ＧＦＰ−輸送ドメイン融合蛋白質の細胞内透過を観察するために、ＨｅＬａ細胞を６−ウエル プレ−トにおいて４〜６時間培養した後、１０％ＦＢＳが分布された新鮮なＤＭＥＭ培養液で交替し、多数濃度のＧＦＰ融合蛋白質を培養液内に処理した。３７℃で３０分間培養した後、細胞をりん酸緩衝液生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ;ＰＢＳ）で十分に洗浄し、１０分間トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で処理した。細胞を集めて、さらにＰＢＳで２回洗浄した後、４%パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｅｄ）で１時間固定させた。固定させた細胞に対してＦＡＣＳを利用して細胞内蛍光を分析した。ＦＡＣＳ分析結果、図５のような曲線を得ることができた。上記の結果と同様、Ｔａｔ輸送ドメインが一方にだけ融合されている蛋白質は似た量で細胞内に導入される反面、両側にＴａｔ輸送ドメインがある融合蛋白質は多くの量で細胞内に導入されることを分かることができた。平均蛍光度（Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）は、輸送ドメイン−ＧＦＰが２３．８６、ＧＦＰ−輸送ドメインが１７．２１、輸送ドメイン−Ｔａｔ−輸送ドメインは２０４．５２であって、Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質が特に高い数値を示した。その後、Ｔａｔ輸送ドメインを両側に融合された蛋白質の量によって細胞内に導入されるメカニズムを分析するために多様な濃度で処理して３０分間培養した後、ＦＡＣＳ分析を行った（図６）．この結果、Ｔａｔ輸送ドメインを両側に有する融合蛋白質は、その濃度と共に平均蛍光度が増加することが確認できた。
【００６１】
実施例７：ＦＡＣＳ（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）分析とウエスタン−ブロットによる自然状態の融合蛋白質と変性された融合蛋白質の細胞導入比較分析
自然状態で輸送ドメイン−ＧＦＰを精製して細胞内に導入したとき、変性させ精製した輸送ドメイン−ＧＦＰより導入されるときと比較して、その効果が制限される。輸送ドメインが両側の末端に存在するＧＦＰ融合蛋白質は変性して精製されたとき、一方にだけ存在するＧＦＰより大きな効果を示すことから、輸送ドメイン−ＧＦＰ−輸送ドメイン融合蛋白質が自然状態で精製されたとき、細胞内に導入される効果について検討すべく実験を行った。まず、変性された蛋白質と自然状態に精製した蛋白質をウエスタン−ブロットで分析した結果、事前に精製された蛋白質も輸送ドメインが一つ存在するＧＦＰ融合蛋白質と同じ数値で細胞内に導入されたときの結果を示した（図７）。また、自然状態に分離した輸送ドメイン−ＧＦＰ−輸送ドメイン融合蛋白質の細胞内導入効果を知るためにＦＡＣＳ分析法を行った。それぞれ自然状態と変性された状態で精製された蛋白質をそれぞれの濃度に処理して１時間培養した。その結果図８のように変性された状態の輸送ドメイン−ＧＦＰ−輸送ドメイン融合蛋白質は、１Ｍ処理したとき平均蛍光度が１１７である反面、自然状態に精製した輸送ドメイン−ＧＦＰ−輸送ドメインは５４である数値を示した。これは、変性された状態の融合蛋白質の細胞内導入効果より劣っているが、図７と比較すると、変性して精製した輸送ドメイン−ＧＦＰ融合蛋白質程度の細胞内導入能力を有しているのが分かった。結果的に、Ｔａｔ輸送ドメインを一方の末端に有する融合蛋白質よりＴａｔ輸送ドメインを両側に有しており、変性して（ｄｅｎａｔｕｒｅｄ）精製した融合蛋白質が効果的に細胞内浸透をすることができ、自然状態（ｎａｔｉｖｅ）に精製した輸送ドメイン−ＧＦＰ−融合蛋白質もまた細胞内浸透が可能であることを結論づけることができた。
【００６２】
実施例８：組み替えＳＯＤ融合蛋白質等の発現ベクタ−製造
機能を有する蛋白質又はペプチドを細胞内に浸透させる技術を開発するために細胞内に目標蛋白質を伝達し得る融合蛋白質発現ベクタ−を製造し、輸送ドメインが蛋白質を細胞内に伝達する能力を容易に分析するために、ヒトＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ（Ｃｕ，Ｚｎ−ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ；以下、本明細書ではＳＯＤと略称する）蛋白質を選んだ。
【００６３】
組み替え融合蛋白質を過大に発現させるために、ＳＯＤ、ＨＩＶ−１Ｔａｔの形質導入部（Ｔａｔ ４９−５７）及び６個のヒスチジンに対するｃＤＮＡが連続的に含まれているＴａｔ−ＳＯＤ、ＳＯＤ−Ｔａｔ、Ｔａｔ−ＳＯＤ−Ｔａｔ発現ベクタ−を製造した（図９）。融合蛋白質に対する対照蛋白質であるＳＯＤを過大に発現させるために、Ｔａｔの形質導入部位だけ含まれておらず、残りの部位は同一なｐＥＴ−ＳＯＤ発現ベクタ−を製造した。
【００６４】
Ｔａｔ基本ドメインに該当する２種類のオリゴヌクレオチド[上位鎖（ｔｏｐ ｓｔｒａｎｄ）、５‘−ＴＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号３）と下位鎖５‘−ＴＣＧＡＧＴＣＴＴＣＧＴＣＧＣＴＧＣＴＣＣＧＣＴＴＣＴＴＣＣ−３’（配列番号４）]をＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ制限酵素で切ったｐＥＴ−１５ｂベクタ−に結さつ（ｌｉｇａｔｉｏｎ）して挿入した後、ヒトＳＯＤのｃＤＮＡの配列を基本として２種類のオリゴヌクレオチドを合成した。正方向プライマ−（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ）はＸｈｏ Ｉ 制限部位を有しており、逆方向プライマ−（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）はＢａｍＨ Ｉ制限部位を有している。重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行なった後、反応物を分離し、これをＴＡクロニングベクタ−に結さつして形質変換させプラスミドを分離した。ヒトＳＯＤ ｃＤＮＡがＴＡベクタ−をＸｈｏ Ｉ とＢａｍＨ Ｉで切断した後、ｐＥＴ−１５ｂ及びｐＥＴ−１５ｂ−Ｔａｔ発現ベクターに挿入した。
【００６５】
また、Ｔａｔ塩基性ドメインがＳＯＤ両側末端に融合されたｐＴａｔ−ＳＯＤ−ＴａｔはｐＴａｔ−ＳＯＤにＴａｔ塩基性ドメイン９個アミノ酸をコ−デイングする２重鎖オリゴヌクレオチドがアニ−ルされ、カルボキシル末端に挿入され、Ｔａｔ塩基性末端がカルボキシル末端に融合されたｐＳＯＤ−ＴａｔはｐＳＯＤにＴａｔ塩基性ドメイン９個のアミノ酸をコ−デイングする２重鎖オリゴヌクレオチドがアニ−ルされ、カルボキシル末端に挿入された（図９）。
【００６６】
実施例９：組み替えＳＯＤ融合蛋白質等の発現及び精製
本研究室で製造したヒトＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼｃＤＮＡが含まれているＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（ｐＳＯＤ及びｐＴａｔ−ＳＯＤ、ｐＳＯＤ−Ｔａｔ、ｐＴａｔ−ＳＯＤ−Ｔａｔ）をアンピシリンが含まれているＬＢ培地に入れ３７℃で２００ｒｐｍに撹拌して培養した。培養液内のバクテリア濃度が０.Ｄ６００＝０.５〜１.０を表す時、ＩＰＴＧを培地内に添加して最終濃度が０．５ｍＭになるようにした後、３〜４時間さらに培養した。培養した細胞を遠心分離して集めた後、６Ｍ Ｕｒｅａが添加された結合緩衝溶液（ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ;５ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）５ｍｌ入れ超音波粉砕器で粉砕（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）した。遠心分離して上層液を直ちにＮｉ−ニトリロトリアセチックアクシド セパロズス−パ−フロウ（Ｎｉ−ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｓｕｐｅｒ ｆｌｏｗ）コラムに負荷し、１０倍容積の結合緩衝溶液（ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）と６倍容積の洗浄緩衝溶液（ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ;６０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）で洗浄した後、溶出緩衝溶液（ｅｌｉｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ;１Ｍ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）で融合蛋白質を溶出した。次いで、融合蛋白質が含まれた分画等を集めてＰＤ−１０コラムクロマトグラフイ−（ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行なって分画中に含まれた塩分を除去した。融合蛋白質は６個のヒスチジンを含んでいるため、金属イオン−キレ−ト親和クロマトグラフイ−単一段階に融合蛋白質を純粋に（純度＞９０％）精製された（図１０）。
【００６７】
分画の蛋白質濃度は牛血清アルブミンを標準物質に使用してブレッドフオ−ド（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）方法で測定した。
【００６８】
実施例１０：ＨｅＬａ細胞培養及び組み替え融合蛋白質等の細胞内透過
ＨｅＬａ細胞は３７℃で９５％空気と５％ＣＯ２とを供給し、２０ｍＭＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１０％牛胎血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ;ＦＢＳ）及び抗生剤（１００μｇ／ｍｌ ストレフトマイシン、 １００Ｕ／ｍｌ ペニシリン）が含まれたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）で培養した。
【００６９】
９個のアミノ酸（４９−５７）からなるＨＩＶ−１ Ｔａｔ蛋白質輸送部分をアミノ酸末端とカルボキシル末端に結合させた変異体輸送ドメインに対する化物分子細胞透過能を観察するために次のように実験した。即ち、Ｔａｔ−ＳＯＤ、ＳＯＤ−Ｔａｔ、Ｔａｔ−ＳＯＤ−Ｔａｔ融合蛋白質等の細胞内透過を観察するために、ＨｅＬａ細胞を６−ウエルプレ−トで４〜６時間培養した後、１０％ＦＢＳが含まれた新鮮なＤＭＥＭ培養液に交換し、２Ｍ ＳＯＤ融合蛋白質を培養液内に処理した。１時間後、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で処理し、リン酸緩衝液生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ;ＰＢＳ）で十分に洗浄した。細胞を粉砕した後、細胞内に透過されたＳＯＤの量と活性度をＳＯＤ活性度分析とウエスタン−ブロッド分析で測定した。
【００７０】
実施例１１：ウエスタン−ブロッド分析
Ｔａｔ蛋白質がアミノ酸末端に1個が融合されている蛋白質と、両側に融合された蛋白質の細胞内移動効率を分析するためにウエスタン−ブロット方法を行なった。先ず、蛋白質等は変性された状態で精製した。準備されたＨｅＬａ細胞に２Ｍの変性された融合蛋白質を処理した後、１時間後に細胞等だけを集めてウエスタン−ブロットを行なった。細胞を溶菌して得られた細胞溶菌液を溶菌緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、２％ ＳＤＳ、１０％ ｖ／ｖ グリセロ−ル）を有する６−ウエルプレ−トに入れた。全体細胞溶菌液各１５μｇずつをＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドジェル上で電気移動させた。
【００７１】
電気移動で分離された蛋白質をニトロセルロ−スメンブレイン（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ;Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）で移動させた。蛋白質が移動されたニトロセルロ−スメンブレインを５％脱粉乳（ｎｏｎ−ｄｒｙ ｍｉｌｋ）が入っているＰＢＳでブロキングした。次いで、メンブレインはゴト抗−ＳＯＤポリク−ロン抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ;Ｓａｎｔａｃｒｕｚｅ、ＵＳＡ、１：１，０００）で処理した。その後セイヨウワサビペルオキシダ−ゼ（ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）−結合されたマウス抗−ゴ−ト（ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ）ＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ、１：１０，０００希釈）と反応させた。結合された抗体等は化学発光で確認することができた（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）。その結果、図１１ａのようにＴａｔ蛋白質がアミノ酸末端にだけある融合蛋白質とＴａｔ蛋白質がカルボキシル末端にある融合蛋白質は共に細胞内に透過された。しかし、Ｔａｔ蛋白質が両側の末端に融合されている融合蛋白質は１個のＴａｔ蛋白質が連結されている融合蛋白質より効果的に細胞内に移動した。この結果は、Ｔａｔ蛋白質が融合蛋白質のアミノ酸末端とカルボキシル末端のいずれかの側に融合されているものの効果は類似する、Ｔａｔ蛋白質が両側に融合されているものが細胞内移動効果が大きく向上されていることを示す（図１１ａ）。
【００７２】
実施例１２：ＳＯＤ酵素活性度測定
本研究において、ＳＯＤの活性度は、ＭｃＣｏｒｄとＦｒｉｄｏｖｉｃｈの方法（１９６９）によってキサンチン/キサンチンオキシダ−ゼ（ｘａｎｔｈｉｎｅ／ｘａｎｔｈｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ）反応によるペリシトクロム（ｆｅｒｒｉｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）ｃ還元の抑制程度を分光光度計で観察することにより測定した（ＭｃＣｏｒｄ、ＪＭ ａｎｄ Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ、Ｉ．（１９６９）Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２４４、６０４９−６０５５）。
【００７３】
標準分析方法は２５℃で２ｍｌの０．１ｍＭ ＥＤＴＡが含まれた５０ｍＭリン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）において行なった。反応混合液には１０ｕＭ ｆｅｒｒｉｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ、５０ｕＭキサンチン（ｘａｎｔｈｉｎｅ）及び十分な量のキサンチンオキシダ−ゼ（ｘａｎｔｈｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ）を含有しており、５５０ｎｍにおいてフエリシトクロム（ｆｅｒｒｉｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）cの還元程度を測定した。上記の条件下においてシトクロム（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）cを５０％減少させるス−パ−オキシドジスムタ−ゼの量を１単位に定義した。
【００７４】
細胞内に透過された溶融蛋白質は、その固有な活性を維持しなければ蛋白質治療に有用することができない。よって、細胞内に透過された融合蛋白質が生物学的な活性を有することは大変重要な問題である。図１１ｂは２Ｍの融合蛋白質等を1時間ＨｅＬａ細胞培地に透過したとき、細胞内のＳＯＤ酵素活性の変化を表した結果である。溶融蛋白質を投与しなかった細胞からＳＯＤ活性度は２．４６±０．３９Ｕ／ｍg蛋白質であり、Ｔａｔ−ＳＯＤとＳＯＤ−Ｔａｔ融合蛋白質を投与した時にＳＯＤ活性度は１２．６８±１．４４Ｕ／ｍｇ蛋白質として有意に上昇し、Ｔａｔ−ＳＯＤ−Ｔａｔ融合蛋白質を投与した時にＳＯＤ活性度は２３．７５±２．３５Ｕ／ｍｇ蛋白質でＴａｔ−ＳＯＤとＳＯＤ−Ｔａｔ融合蛋白質より２倍以上高いＳＯＤ活性度を表した（図１１ｂ）。よって、Ｔａｔ−ＳＯＤ−Tat融合蛋白質の細胞内透過及び活性がＴａｔ−ＳＯＤとＳＯＤ−Ｔａｔ融合蛋白質より２倍以上大きく増加されることを示した（図１１）。
【００７５】
実施例１３：アルギニン９−ＧＦＰ−アルギニン９融合蛋白質の細胞浸透活性測定
上記実施例１ないし３の方法と類似な方法で、９個のアルギニン残基で構成された輸送ドメインが緑色蛍光蛋白質のアミノ基及びカロボキシ基に共有結合されたオリゴリシン−ＧＦＰオリゴリシン融合蛋白質を製造した。
【００７６】
Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質とアルギニン９−ＧＦＰ−アルギニン９（Ｒ９−ＧＦＰ−Ｒ９）融合蛋白質の細胞浸透効率を比較するために、各融合蛋白質５０、１００、２００ｎＭずつをＨｅＬａ細胞が入っている２４ウエルプレ−トに加え、１時間が経過した後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで数回洗浄した後、蛍光をフルオロメ−タ−で測定した。結果は図１２のとおりである。
【００７７】
実施例１４：リシン９−ＧＦＰ−リシン９融合蛋白質の細胞浸透活性測定
実施例１ないし３の方法と類似の方法で９個のリシン残基で構成された輸送ドメインが緑色蛍光蛋白質のアミノ基及びカロボキシ基に共有結合されたオリゴリシン−ＧＦＰオリゴリシン融合蛋白質を製造した。
【００７８】
Ｔａｔ−ＧＦＰ融合蛋白質、ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質、アルギニン９−ＧＦＰ融合蛋白質とリシン９−ＧＦＰ−リシン９（Ｋ９−ＧＦＰ−Ｋ９）融合蛋白質の細胞浸透効率を比較するために、各融合蛋白質２００ｎＭずつをＨｅＬａ細胞が入っている２４ウエルプレ−トに加えた後、１時間が経過した後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで数回洗浄した後、蛍光を蛍光顕微鏡で測定した。結果は図1３のとおりである。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明は機能を有する蛋白質を蛋白質水準で細胞内に透過させるにおいて、既存の塩基性輸送ドメインを１側に結合させたものよりもっと高い透過効率と、細胞内活性を有する溶融蛋白質を提供することができる。
【００８０】
また、本発明の融合蛋白質を有効成分とする薬剤学的組成物及び化粧品等を提供することができる。
【００８１】
更に、本発明はヒトＧｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシド ジスムタ−ゼ（Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ）を蛋白質水準で細胞内に直接透過させるもので、特に細胞内に投与された−輸送ドメイン−ＳＯＤ−輸送ドメイン融合蛋白質はＳＯＤ活性度を回復して蛋白質治療に効率的に活用され得ることを提示する。
【００８２】
活性酸素種は、細胞内の生体高分子に損傷を加え、報告によれば、１００余種の疾病の進行過程と深く関連されている。よって、本発明はこのような活性酸素種を除去する際に主な役割を担当するＳＯＤを細胞内に投与することにより、疾患を治療する蛋白質治療に本発明の輸送ドメイン−ＳＯＤ−輸送ドメイン融合蛋白質が効果的に活用され得る。
【００８３】
本技術を基にして抗酸化酵素の一種であるＳＯＤを細胞内に直接伝達して我らの人体に有害な活性酸素を除去することができ、多くの疾病以外にも化粧品及び健康食品産業等に本技術を広範囲に活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】Ｔａｔ−ＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｔａｔ、Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ、ＧＦＰ発現ベクタ−の概略図である。合成されたＴａｔ輸送ドメインはＧＦＰのアミノ末端やカルボキシル末端、又は、両側末端に融合してベクタ−を製造した。ＧＦＰ発現ベクタ−ｐＧＦＰはＧＦＰのコ−デイング配列をｐＥＴ１５ｂに挿入して構成された。
【図２】精製された輸送ドメイン−ＧＦＰ融合蛋白質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに分離した後、クマシ−ブル−（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）で染色したものである。レイン Ｍ：ＳＤＳ Ｍａｒｋｅｒレイン ＧＦＰ：ＧＦＰレイン ＴＧ：Ｔａｔ−ＧＦＰレイン ＧＴ：ＧＦＰ−Ｔａｔレイン ＴＧＴ：Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ
【図３】Ａ：変性されたＴａｔ−ＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｔａｔ、Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質の細胞内導入分析結果であって、１Ｍ Ｔａｔ融合蛋白質等を１時間ＨｅＬａ細胞内に導入させた時、細胞内に導入された蛋白質をウエスタン−ブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）法で分析したものである。Ｂ：細胞内に導入された蛋白質をウエスタン−ブロットした結果を基に、結果に表れた蛋白質等線の強さを図式化したものである。
【図４】細胞内に導入されたＴａｔ−ＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｔａｔ、Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質を公焦点蛍光顕微鏡で可視化したものである。各セクションは、それぞれ次のとおりである。Ｃｏｎｔｒｏｌ:何も処理しない細胞ＧＦＰ:対照群 ＧＦＰ １ＭＴＧ： Ｔａｔ−ＧＦＰ １ＭＧＴ：ＧＦＰ−Ｔａｔ １ＭＴＧＴ:Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ １Ｍ
【図５】ＦＡＣＳ分析法によってＧＦＰ融合蛋白質の細胞内導入効率を比較分析したものである。各融合蛋白質等は２Ｍ濃度で３０分間処理した。ＴＧ：Ｔａｔ−ＧＦＰＧＴ:ＧＦＰ−ＴａｔＴＧＴ:Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ
【図６】Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質を濃度別に処理して３０分間培養した結果をＦＡＣＳ分析法によって分析した結果。対照群ＧＦＰは最高濃度である２Ｍで処理した。
【図７】Ａ：Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質を自然状態と変性された状態で精製して細胞内導入効率を分析するためにウエスタン−ブロットである。各融合蛋白質等は１Ｍで処理して1時間培養した。レインｃｏｎ:処理しない細胞レインＧＦＰ：対照群 ＧＦＰレインｎａｔｉｖｅ:自然状態に精製したＴａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔレインｄｅｎａｔｕｒｅｄ:変性された状態に精製したＴａｔ−ＧＦＰ−ＴａｔＢ： 図７Ａの結果に表れた線の強さを図表で模式化したものである。
【図８】ＦＡＣＳ分析法によって自然状態に精製されたＴａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔと変性された状態に精製されたＴａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔの細胞内導入効果を濃度別に１時間処理して分析したものである。Ａ：変性された状態に精製されたＴａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔを０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ処理して分析した結果である。Ｂ：自然状態に精製されたＴａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔを０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ処理して分析した結果である。
【図９】Ｔａｔ−ＳＯＤ、ＳＯＤ−Ｔａｔ、Ｔａｔ−ＳＯＤ−Ｔａｔ、ＳＯＤ発現ベクタ−の概略図である. 合成されたＴａｔ蛋白質をＳＯＤのアミノ末端やカルボキル末端、又は両側末端に融合してベクタ−を製造した。ＳＯＤ発現ベクタ−であるｐＳＯＤはＳＯＤのコ−デイング配列をｐＥＴ−１５ｂベクタ−に挿入して製造した。
【図１０】精製された輸送ドメイン−ＳＯＤ融合蛋白質等を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに分離した後、クマシ−ブル−で染色したものである。レイン Ｍ：ＳＤＳ Ｍａｒｋｅｒレイン ＳＯＤ：ＳＯＤレイン ＴＳ：Ｔａｔ−ＳＯＤレイン ＳＴ：ＳＯＤ−Ｔａｔレイン ＴＳＴ：Ｔａｔ−ＳＯＤ−Ｔａｔ
【図１１】Ａ：変性された状態に精製したＴａｔ−ＳＯＤ、ＳＯＤ−Ｔａｔ、Ｔａｔ−ＳＯＤ−Ｔａｔ融合蛋白質の細胞内導入分析結果であって、２Ｍ Ｔａｔ融合蛋白質を１時間ＨｅＬａ細胞内に導入させたとき、細胞内の導入された蛋白質をウエスタン−ブロット法で分析したものである。Ｂ：２Ｍ融合蛋白質等を１時間ＨｅＬａ細胞に投与したとき、細胞内に導入されたＳＯＤ酵素の活性度変化を示したグラフである。
【図１２】Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質とアルギニン９−ＧＦＰ−アルギニン９（Ｒ９−ＧＦＰ−Ｒ9）融合蛋白質の細胞浸透効率を蛍光を測定して図式化したグラフである。
【図１３】ＧＦＰ、Ｔａｔ−ＧＦＰ融合蛋白質、ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質、アルギニン９−ＧＦＰ融合蛋白質とリシン９−ＧＦＰ−リシン９（Ｋ９−ＧＦＰ−Ｋ９）融合蛋白質の細胞浸透効率を比較するために、各融合蛋白質２００ｎＭずつをＨｅＬａ細胞に加えて１時間が経過した後、蛍光顕微鏡で観察した写真である。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
本発明は機能を有する蛋白質又はペプチドをより高い効率で細胞内に導入させる融合蛋白質とその用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近、様々な疾患が細胞蛋白質の非正常的な活性に起因するという事実が知られてきているため、これら蛋白質の活性を調節することにより致命的な人体疾患を治療できる薬剤の開発が全世界的関心の対象となっている。
【０００３】
その一例として、活性酸素種と関連されたス−パ−オキシドジスムタ−ゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）を細胞蛋白質の例として挙げる（但し、本発明の意図する範囲はこの蛋白質だけを目標蛋白質に限定するものではない。）。
【０００４】
活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）は、エネルギ−を得る全ての生命体から、酸素を利用して多くの細胞内代謝過程の副産物として必然的に生成される。このような活性酸素種は、細胞内の蛋白質、核酸及び脂肪のような生体高分子に損傷を与え、人体の多くの疾病の進行過程と深く関連されている。特に発癌過程、脳卒中、関節炎、動脈硬化、放射線損傷及び炎症反応に関与し、正常的な老化過程においても老化を促進させる重要な要因として作用する（非特許文献１〜３）。
【非特許文献１】Ｆｌｏｙｄ,Ｒ.Ａ.（１９９０）ＦＡＳＥＢ Ｊ．４，２５８７−２５９７.
【非特許文献２】Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．（１９８８）Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ３９２，２５−３０.
【非特許文献３】Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ Ｂ．ａｎｄＧｕｔｔｅｒｉｄｇｅ Ｊ．Ｍ．Ｃ.（１９９９）Ｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ．
【０００５】
Ｃｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼと関連された疾病等を簡略に検討すれば表１のとおりである。
【０００６】
【表１】
【０００７】
公知の活性酸素種としては１Ｏ２、ＯＨ、Ｏ２、Ｈ２Ｏ２等があり、これらは生体内で各種の酵素反応によって生成され、各種の生理活性物質の生合成、免疫機能、薬物の代謝等において大変重要な役割をするが、外部からの放射線、紫外線、公害及び各種のストレス等によって過剰生成される場合には、反って生体に損傷を来すことがある。そこで、生体は防御機能として、ＳＯＤ、カタラ−ゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ）、ペルオキシダ−ゼ（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）等の酵素を有するが、老化が始まると皮膚の均衡が壊れるようになり、各種の活性酸素類に対する皮膚保護能力が劣るようになる。
【０００８】
よって、このような活性酸素類等から細胞を保護する必要性が強くなってきており、化粧品原料としての活性酸素除去剤として、ＳＯＤ、ラクトフエリン、酸化防止剤等が使用ないし開発されている。しかしながら、ＳＯＤは、活性酸素除去能を有するにもかかわらず、酵素蛋白質という性質により地質に対し難溶性であり、安定性が悪く、分子量が３０，０００ダルトン（Ｄａｌｔｏｎ）以上で皮膚角質層の透過が不可能であるという問題点があるため、化粧料組成物として有用に利用されなかった。
【０００９】
Ｃｕ，Ｚｕ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼは、自由ラジカルの害毒と酸素の損傷から細胞の損傷を防止する細胞内重要な防御酵素である（非特許文献４）。全ての生体内高分子等は、このような酸素ラジカルの有害な作用に常に晒されているため、多くの疾患においてＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼを治療目的に利用しようとする関心が非常に高くなっている。
【非特許文献４】Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，Ｉ．（１９９５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４，９７−１１２．
【００１０】
最近、Ｃｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼを臨床的に応用するために多くの方法が示されている。現在まで開発されたＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼの生体内運搬方法は大きく３種に区分できる。
【００１１】
第１に、Ｃｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼにポリエチレングリコ−ル（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、フイコ−ル（Ｆｉｃｏｌｌ）、レシチン（ｌｅｃｉｔｈｉｎ）、アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）等を集合させる方法がある。
【非特許文献５】Ｄｅｌ Ｚｏｐｐｏ，ｇ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｄｒｕｇｓ ５４，９−３８
【非特許文献６】Ｍｕｚｙｋａｎｔｏｖ， Ｖ．Ｒ．ｅｔ ａｌ.（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３，５２１３−５２１８．
【００１２】
第２に、リポソ−ム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）を利用してＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼをカプセル化させる方法がある。
【非特許文献７】Ｐｅｒｄｅｒｅａｕ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｕｌｌ．Ｃａｎｃｅｒ ８１，６５９−６６９．
【００１３】
第３に、Ｃｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ遺伝子を形質導入して細胞内で酵素の過多発現を誘導する遺伝子治療等の試みが示されている。
【非特許文献８】Ｏｋｕｍｕｒａ，Ｋ． ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４，１２２３−１２２７
【非特許文献９】Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｔ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６９，１０５１−１０５７．
【非特許文献１０】Ｌｉｕ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８，５８５−５９５．
【００１４】
これらのうち、もっとも注目を受けているものは、遺伝子治療であり、Ｃｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ遺伝子治療を疾病に適用しようとする多くの研究が行われてきた。しかし、遺伝子治療は遺伝子の細胞内への運搬が容易でなく、標的細胞における発現率が低く、発現される細胞で蛋白質が発現される期間が短く、標的細胞から発現される蛋白質の量を人為的に調節するのが非常に難しい等、様々な問題点を有している。
【非特許文献１１】Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ３８９，２３９−２４２．
【００１５】
治療のための薬物や蛋白質を細胞内に移動させることに関しては、他の方法として、目標蛋白質を細胞膜を経て直接伝達する方法が考えられる。しかし、治療用薬物や蛋白質は、そのサイズ又は多くの生化学的性質のため細胞膜を通過することが大変難しい。一般的に分子量６００以上の物質は細胞膜を通過するのが殆ど不可能であることが知られている。
【００１６】
最近になって、ヒト免疫欠乏ビ−ルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ−１）蛋白質の一種であるＴａｔ（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）蛋白質が、効率的に細胞膜を通過して細胞質内に容易に移動するということが明らかになった。このような機能はＴａｔ蛋白質の中間部位である蛋白質形質導入部位（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎ）の特性のため表れ、未だその正確なメカニズムは知られていない状態である（非特許文献１２〜１５）。しかし、Ｔａｔ蛋白質の細胞膜通過には特定受容体や運搬体が関与しないことが見出されており、Ｔａｔ蛋白質の蛋白質形質導入部位が、直接膜の地質二重層と作用することにより起こるものと理解されている（非特許文献１６、１７）。
【非特許文献１２】Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．Ｄ．ａｎｄＰａｂｏ，Ｃ．Ｏ．（１９８８）Ｃｅｌｌ ５５，１１８９−１１９３．
【非特許文献１３】Ｇｒｅｅｎ，Ｍ. ａｎｄ Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｐ.Ｍ.（１９８８）Ｃｅｌｌ５５，１１７９−１１８８．
【非特許文献１４】Ｍａ，Ｍ． ａｎｄ Ｎａｔｈ，Ａ.（１９９７），Ｊ.Ｖｉｒｏｌ．７１，２４９５−２４９９.
【非特許文献１５】Ｖｉｖｅｓ，Ｅ．，Ｂｒｏｄｉｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．（１９９７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１６０１０−１６０１７．
【非特許文献１６】Ｖｉｖｅｓ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１６０１０−１６０１７．
【非特許文献１７】Ｄｅｒｏｓｓｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ.（１９９６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１８１８８−１８１９３.
【００１７】
最近の研究において，オバルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）、β−ガラクトシダ−ゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）、セイヨウワサビ ペルオキシダ−ゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）のような異形蛋白質をＨＩＶ−１ Ｔａｔ蛋白質と融合させて投与した際、生体の各組織及び培養された細胞内に直接運搬されるとのことが発表された（非特許文献１８〜２０）。このような実験結果は、Ｔａｔ蛋白質がそれ自身だけではなく、他の種類の巨大な蛋白質も細胞内に一緒に運搬できる能力を有することを意味している。
【非特許文献１８】Ｆａｗｅｌｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１，６６４−６６８．
【非特許文献１９】Ｓｃｗａｒｔｚｅ，Ｓ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８５，１５６９−１５７２．
【非特許文献２０】Ｗａｔｓｏｎ，Ｋ．ａｎｄ Ｅｄｗａｒｄ，Ｒ．Ｊ．（１９９９），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５８，１５２１−１５２８．
【００１８】
しかしながら、実際には、全ての蛋白質がＴａｔ蛋白質によって運搬されるものではない。また、Ｔａｔによって細胞内に運搬された全ての蛋白質が生物学的活性を表すかも未だ明らかになっていないのが現状である。
【００１９】
本発明者は、ＨＩＶ Ｔａｔ ４９−５７輸送ドメインの外にもリシン（ｌｙｃｉｎｅ）が６ないし１２個結合されたオリゴリシン輸送ドメイン、ＨＩＶ Ｔａｔ ４８−５７残基のうち、２、３個の残基が欠如した塩基性輸送ドメインについて、アミノ基に共有結合された融合蛋白質への細胞透過実験を行っており、これらが円滑な細胞透過能を有すること示している
【特許文献１】韓国特許公報第２００２−１００４４６号
【特許文献２】韓国特許公報第２００２−６７１０８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的は、目標蛋白質を細胞内に導入又は発現させる際に、従来技術の問題点を解決し、高効率で細胞内に導入させ、細胞内で活性を有するようにしようとするものである。
【００２１】
また、本発明はス−パ−オキシドジスムタ−ゼを細胞内に導入又は発現させる際に、従来技術の問題点を解決し、高効率で細胞内に導入させ、細胞内で活性を有するようにしようとするものである。
【００２２】
また、本発明は、輸送ドメインと融合されたス−パ−オキシドジスムタ−ゼを利用して皮膚表皮、真皮層、皮下脂肪層まで浸透して卓越した活性酸素種の除去能を有する化粧料を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
上記、課題を解決するために、本発明者らは、輸送ドメインとヒトＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼを融合させ、該融合蛋白質が効果的に細胞内に透過されるかをＨｅＬａ細胞を利用した実験において確認した。また、輸送ドメイン−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ輸送ドメイン融合蛋白質を多量に生産する方法及び精製する方法を開発した。
【００２４】
本発明は、機能を有する蛋白質又はぺプチドをより効率的に細胞内に運搬し、細胞内でもより高い活性を有するようにするために、輸送ドメインと融合させた融合蛋白質と該融合蛋白質を利用した薬剤組成物及び化粧料組成物を提供する。
【００２５】
本発明の輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質は遺伝子組み替え方法の他にも、一般的な化学結合方法で製造することができる。
【００２６】
本発明は、６ないし１２個のアミノ酸残基から構成され、アルギニン又はリシン（ｌｙｃｉｎｅ）残基を３／４以上含む輸送ドメインが目標蛋白質のアミノ基とカルボキシル基に共有結合された、細胞浸透性輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質に関するものである。目標蛋白質の両末端に位置する輸送ドメインは必ず同一な残基からなっていなければならないものではない。
【００２７】
また、本発明は、上記輸送ドメインが９個のアミノ酸残基で構成される細胞浸透性輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質に関するものである。
【００２８】
また、本発明は、上記輸送ドメインがＨＩＶ ｔａｔ ４９−５７残基、オリゴリシン、オリゴアルギニン又はオリゴ（リシン，アルギニン）中の１種以上であることを特徴とする。
【００２９】
更に、本発明は、上記目標蛋白質が治療分子、予防分子、診断分子から構成されたグル−プから選ばれたことを特徴とする。
【００３０】
また、本発明は、上記目標蛋白質がＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ又はその機能的等価物であることを特徴とする。
【００３１】
また、本発明は、上記細胞浸透性輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質を有効成分とすることを特徴とする化粧料組成物に関するものである。
【００３２】
また、本発明は、上記目標蛋白質がＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ又はその機能的等価物であることを特徴とする化粧料組成物に関するものである。
【００３３】
また、本発明は、上記化粧料組成物が化粧水、ジエル、水溶性リキッド、水中油（Ｏ／Ｗ）型又は油中水（Ｗ／Ｏ）型であることを特徴とする。
【００３４】
のみならず、本発明は上記輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質を有効成分とし、薬学的に許与される担体を含むことを特徴とする薬剤学的組成物に関するものである。
【００３５】
また、本発明は、上記目標蛋白質がＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−ジスムタ−ゼ、又は、その機能的等価物であることを特徴とする。
【００３６】
輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質を有効成分として含有する薬剤学的組成物は薬剤学的分野で通常的に許容される担体と共に配合して通常的な方法によって経口又は注射形態に成型することができる。経口用組成物としては、例えば、錠製及びゼラチンカプセルがあり、これらは活性成分以外にも必要によって、希釈剤（例：ラクト−ス、デキストロ−ス、蔗糖、マンニト−ル、ソルビト−ル、セルロ−ス及び／又はグリシン）、滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸及びそのマグネシウム又はカルシウム塩及び／又はポリエチレングリコ−ル）を含有し、錠剤はまた結合剤（例：マグネシウムアルミニウムシリケ−ト、澱粉ペ−スト、ゼラチン、メチルセルロ−ス、ナトリウムカルボキシメチルセルロ−ス及び／又はポリビニルピロリドン）を含有し、場合によって、崩解剤（例：澱粉、寒天、アルギン酸、又はそのナトリウム塩）又は沸騰混合物及び／又は吸水剤、着色剤、抗味剤及び甘味剤を含有することが好ましい。注射用組成物は、等張性水溶液又は懸濁液が好ましく、これらの組成物は滅菌され、必要によって補助剤（例：防腐剤、安定化剤、湿潤剤、又は乳化剤溶液促進剤、浸透圧調節のための塩及び/又は緩衝剤）を含有する。又、これらはその他治療的に有用な物質を含有することができる。
【００３７】
このように製造された薬剤学的製剤は、その目的により、経口投与するか、非経口方式、即ち、静脈内、皮下、腹腔内投与又は局所適用することができ、容量は１日の投与量が０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇの量を1ないし数回に分けて投与することができる。特定患者に対する投与容量水準は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、投与時間、投与方法、排泄率、疾患の重症度等によって変化し得る。
【００３８】
また、本発明の化粧料組成物は、クリ−ム、軟膏、ジエル、ロ−ション、化粧水等で製品化されて使用できる、どんな製品として使用するかは、本発明の属する技術分野の当業者によって極めて容易に決定され得る。
【００３９】
また、本発明の輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質を有効成分とするロ−ション、ジェル、エセンス、クリ−ム、化粧水等はそれぞれ、通常的な製造方法によって、どんな形態でも容易に製造することができ、基礎化粧品等に適宜に添加して使用することができる。
【００４０】
その一例として、クリ−ムを製造するにおいては、一般的な水中油型（Ｏ／Ｗ）又は油中水型（Ｗ／Ｏ）のクリ−ムベ−スに本発明の融合蛋白質を含有させ、ここに香料、キレ−ト剤、色素、酸化防止剤、防腐剤等を使用する一方、物性改善を目的に蛋白質、ミネラル、ビタミン等合成又は天然素材を併用することができる。
【００４１】
本明細書及び請求範囲の”目標蛋白質（ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）”は、上記ＨＩＶ−１ Ｔａｔ輸送ドメインと共有結合をなして細胞内に導入され活性を示す治療分子、予防分子及び診断分子等を意味し、実際には、純粋な蛋白質にだけ限定されるものでなく、ペプチド、ポリペプチド、糖類と結合された糖蛋白質、ペプチドグリカン等を通称する表現に使用される。
【００４２】
また、本発明において”輸送ドメイン“はペプチド、蛋白質、オリゴペプチド、糖類と結合された糖蛋白質、ペプチドグリカン又はポリペプチド等と共有結合をなして別途の受容体や運搬体、エネルギ−を必要としないで上記有機化合物等を細胞内へ導入させることができるドメインであって、６〜１２個のアミノ酸残基からなっており、その中、３／４以上がアルギニン又はリシン残基からなっていることをいい、代表的な例を挙げるとすれば、ＨＩＶ−１ Ｔａｔ（４８−５７）、オリゴリシン、オリゴアルギニン、オリゴ（リシン、アルギニン）等をいう。さらに好ましくは、９個のアミノ酸残基からなっており、そのうち、３／４以上がアルギニン又はリシン残基からなっているものを本発明の輸送ドメインの例に挙げることができる。
【００４３】
また、本明細書及び請求範囲では蛋白質、ペプチド、糖蛋白質、オリゴペプチド、ポリペプチド等を細胞内に”導入“させることに対して、”運搬”、”浸透”、”輸送“、”伝達”、”透過“、”通過”するという表現と混合して使用している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
以下では、本発明の構成を実施例を通じて詳しく説明する。
【００４５】
実施例１：輸送ドメイン融合蛋白質発現ベクタ−の製造
機能を有する蛋白質又はぺプチドを細胞内に浸透させる技術を開発するために細胞内に目標蛋白質を伝達できる融合蛋白質発現べクタ−を製造した。
【００４６】
本実施例では、輸送ドメイン蛋白質を細胞内に伝達する能力を簡易に分析するために、緑色蛍光蛋白質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ；本明細書において“ＧＦＰ”と略称する）を目標蛋白質に選んだ。ＧＦＰの塩基配列に該当するＤＮＡ切片をプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ２（ク−ロンテック）を利用してＰｆｕ ＤＮＡ重合酵素で重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）させ、ＧＦＰの完全な配列を増幅した。正方向開始体（ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）は５‘−ＣＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧ−３’（配列番号1）であり、逆方向開始体（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）の配列は５‘−ＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣ ＡＴＧＣＣＧＡＧ−３’（配列番号２）である。ＰＣＲ産物はＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩで切られ、ｐＥＴ１５ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ座にサブク−ロンされ、ＨＩＶ−１ Ｔａｔの塩基性ドメインがないＧＦＰ融合蛋白質を発現させるｐＧＦＰを製造した。約０．７ｋｂの挿入体を有するク−ロンはＸｈｏｌ−ＢａｍＨＩ制限酵素分析で選ばれ、配列決定を通じて分析された。
【００４７】
ＧＦＰと融合されたＨＩＶ−１ Ｔａｔの塩基性ドメイン（アミノ酸４８−５７）を発現させるｐＴａｔ−ＧＦＰは、次の方法で製造された。
【００４８】
第１の方法：二つのオリゴヌクレオチドが製造され、ＨＩＶ−１ Ｔａｔの塩基性ドメインの９個のアミノ酸をコ−デイングする二重鎖オリゴヌクレオチドでアニ−ルされた。ＨＩＶ−１ Ｔａｔの塩基性ドメインの９個のアミノ酸をコ−デイングする配列は上方の鎖（ｔｏｐ ｓｔｒａｎｄ）二重鎖オリゴヌクレオチドでアニ−ルされた。ＨＩＶ−１ Ｔａｔの塩基性ドメイン５‘−ＴＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号３）と下方鎖（ｂｏｔｔｏｍ ｓｔｒａｎｄ）５‘−ＴＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号4）である。二重鎖オリゴヌクレオチドは直接ｐＧＦＰのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩで消化された部位に連結される。そして、インフレ−ム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）で６個のヒスチジンオ−プンリディングフレ−ムと連結されたＴａｔ−ＧＦＰ発現プラスミドであるｐＴａｔ−ＧＦＰが製造された（図１）。
【００４９】
また、Ｔａｔ塩基性ドメインＧＦＰ両側末端に融合されたｐＴａｔ−ＧＦＰ−ＴａｔはｐＴａｔ−ＧＦＰにＴａｔ塩基性ドメイン９個のアミノ酸をコ−デイングする二重鎖オリゴヌクレオチドがアニ−ルされ、カルボキシル末端に挿入され、Ｔａｔ塩基性末端がカルボキシル末端に融合されたｐＧＦＰ−ＴａｔはｐＧＦＰにＴａｔ塩基性ドメイン９個のアミノ酸をコ−デイングする二重鎖オリゴマヌクレオチドがアニ−ルされてカルボキシル末端に挿入された（図１）。
【００５０】
プラスミドにク−ロンされたオリゴヌクレオチドの配列は蛍光自動配列分析器（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ，モデル３７３Ａ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）で確認した。
【００５１】
実施例２：Ｔａｔ−ＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｔａｔ及びＴａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質の発現及び精製（Ｎａｔｉｖｅ、ｄｅｎａｔｕｒｅｄ）
ｐＧＦＰ及びｐＴａｔ−ＧＦＰ、ｐＧＦＰ−ＴａｔとｐＴａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ等で形質転換されたＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ ２１（パ−マシア）を選んだ後、コロニ−を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが含有されたＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩培養した。培養した培養液は新鮮なＬＢ培地で１０倍希釈して２５０ｒｐｍで撹伴して培養した。培養液内のバクテリア濃度が０．Ｄ６００１.０を示したとき、ＩＰＴＧを培地内に添加して最終濃度が０．５ｍＭになるようにした後、４時間さらに培養した。
【００５２】
変性された輸送ドメイン−ＧＦＰ融合蛋白質を得るために、培養された細胞に６Ｍウレアとプロテア−ゼ抑制剤（２０ｍｇ／ｍｌソイビントリップシン抑制剤、２ｍｇ／ｍｌアプロチ二ン、５ｍｇ／ｍｌリュペップチン、１００ｍｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ）が含まれた結合緩衝溶液（ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ;５ｍＭイミダゾ−ル、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）を入れて超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）して収獲し、溶菌した。緩衝液Ａ（ｂｕｆｆｅｒ Ａ;６Ｍウレア、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ）に入れ超音波処理して細胞を破砕させた後、遠心分離を２回（１６、５００ｒｐｍ×３０ｍｉｎ、４０，０００ｒｐｍ×３０ｍｉｎ、４℃）連続して行って、不溶性の細胞破片（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）を除去した。その後、溶菌液（ｌｙｓａｔｅ）をＮｉ＋＋＋−ＩＤＡコラムを通じて精製した。コラムは先ず６Ｍウレアがない結合緩衝液で洗浄した後、洗浄緩衝溶液（８０ｍＭイミダゾ−ル、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）で洗浄した。蛋白質は溶出緩衝液（１ｍＭ イミダゾ−ル、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．９）で溶出した後、ＰＤ−１０コラムクロマトグラフィ−（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を利用して蛋白質に含まれた塩分を除去した（図２）。精製されたＧＦＰ融合蛋白質は約３０ｋＤａのサイズに発現、精製され、Ｔａｔ−ＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質はＴａｔ輸送ドメインのサイズ（約１ｋＤａ）ほどより大きいサイズに発現、精製され、Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質は両側にＴａｔ輸送ドメインが融合されているので、Ｔａｔ−ＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質より一つのＴａｔ輸送ドメインのサイズほどもっと大きい分子量で発現され精製された。
【００５３】
変性されない自然状態の輸送ドメイン−ＧＦＰ融合蛋白質は上記言及された変性剤なしで同一の過程で得られた。各分画の蛋白質濃度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに分離した後、密度測定分析方法で牛胎血清アルブミン（ＢＳＡ）をスタンダ−ドとして定量した。蛋白質濃度はブレドフオ−ド蛋白質アッセイ（Ｂｉｏｒａｄ）で測定した。精製された融合蛋白質等は、２０％グリセロ−ルが含まれたＰＢＳに溶解され−８０℃で貯蔵された。
【００５４】
実施例３：細胞培養と融合蛋白質の細胞内伝達実験
ＨｅＬａ細胞は３７℃で２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１０％牛胎血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）及び抗生剤（１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン）が含まれたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’Ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）において培養した。
【００５５】
９個のアミノ酸（４９−５７）からなるＨＩＶ−１ Ｔａｔ蛋白質輸送部分をアミノ酸末端とカルボキシル末端に結合させた変異体輸送ドメインに対する化物分子細胞透過能を観察するために次のように実験した。即ち、輸送ドメイン−ＧＦＰ、ＧＦＰ−輸送ドメイン、輸送ドメイン−ＧＦＰ−輸送ドメイン融合蛋白質等の細胞内透過を観察するために、ＨｅＬａ細胞を６−ウエルプレ−トで４〜６時間養った後、１０％ＦＢＳが含まれた新鮮なＤＭＥＭ培養液で交替し、多くの濃度のＧＦＰ融合蛋白質を培養液内に処理した。３７℃で１時間培養した後、細胞をりん酸緩衝液生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ;ＰＢＳ）で十分に洗浄し、１０分間トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で処理した。細胞を粉砕した後、細胞内に透過された輸送ドメイン−ＧＦＰ融合蛋白質の量を次の実施例のようにウエスタン−ブロット分析で測定した。
【００５６】
実施例４：ウエスタン−ブロット分析
Ｔａｔ輸送ドメインがアミノ酸末端に一つが融合されている蛋白質と両側に融合されている蛋白質間の細胞内移動効率を分析するために、ウエスタン−ブロット実験方法を行った。先ず、蛋白質等を変性された状態で精製した。準備されたＨｅＬａ動物細胞に１Ｍの変性された融合蛋白質を処理した後、１時間後に、細胞等だけを集めてウエスタン−ブロットを行った。細胞を溶菌して得られた細胞溶菌液を溶菌緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、２％ ＳＤＳ、１０％ ｖ／ｖグリセロ−ル）がある６−ウエル プレ−トに入れた。全体細胞溶菌液各１５μｇずつをＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドジェル上で電気移動させた。
【００５７】
電気移動で分離された蛋白質をニトロセルロ−スメンブレイン（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ;Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）へ移動させた。蛋白質が移動されたニトロセルロ−スメンブレインを１０％粉乳を含むＰＢＳでブロッキングした。次いで、メンブレインはラビット抗−ＧＦＰポリク−ロン抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ;Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ、１：１，０００）で処理した。その後、セイヨウワサビペルオキシダ−ゼ−（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）結合されたゴ−ト抗−ラビット（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ）IｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ、１：１０，０００希釈）と反応させた。結合された抗体等は、化学発光にて確認することができた（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）。その結果、図３で現したように、Ｔａｔ輸送ドメインがアミノ酸末端にのみある融合蛋白質と、Ｔａｔ輸送ドメインがカルボキシル末端にある融合蛋白質は、同様に細胞内に移動した。しかし、Ｔａｔ輸送ドメインが両側の末端に融合されている蛋白質は、一つのＴａｔ輸送ドメインが連結されている融合蛋白質より効果的に細胞内に移動した。この結果は、Ｔａｔ輸送ドメインが融合蛋白質のアミノ酸末端とカルボキシル末端のいずれ側に融合されてあってもその効果は類似するが、Ｔａｔ輸送ドメインが両側に融合されておれば、細胞内への移動効果が向上することを示す。
【００５８】
実施例５：共焦点蛍光分析（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）による細胞導入分析
目標細胞に融合蛋白質を伝達しようとするとき、伝達される細胞の割合がいくらになるかは重要である。また、細胞内に透過された融合蛋白質がその固有な活性を維持しなければ、このような蛋白質伝達技術が応用できない。そこで、本実験において、ＧＦＰ融合蛋白質が伝達される細胞の割合や伝達された融合蛋白質の活性の有無を分析した。変性されたＧＦＰ融合蛋白質を処理したＨｅＬａ細胞からＧＦＰが現れる蛍光度を蛍光顕微鏡で観察した。
【００５９】
カバ−スリップ上で５０〜７０％のコンフルエンシ（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）になるように細胞を培養した次の両側末端に輸送ドメインが結合されているＧＦＰ−融合蛋白質を１Ｍ処理し、１５分間培養した。ＨｅＬａ細胞等はＰＢＳで２回洗浄した後、トリプシン処理し、室温で５分間ホルムアルデヒドが含有されたＰＢＳで固定された。細胞等はさらにＰＢＳで洗浄した後、核だけを染色するために２ｇ／ｍｌのプロピジウムアイオダイド（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｅｄ；ＰＩ）を１５分間処理した。細胞等はさらにＰＢＳで洗浄した後、マウンテイング溶液（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ;９０％グリセロ−ル、０．１％フエニレンジアミンが含まれたりん酸緩衝液食塩水（ＰＢＳ））を処理し、カバ−ガラスを被せて共焦点蛍光顕微鏡を利用して４８８ｎｍと５４５ｎｍ蛍光フイルタ−で細胞内の蛍光の有無を観察、蛋白質の細胞内分布を分析した（Ｅｒｉｃ ｅｔ ａl.，１９９７）。その結果、Ｔａｔ輸送ドメインがアミノ酸末端に融合されている蛋白質とカルボキシル末端に融合されている蛋白質は殆ど細胞質のみならず核まで到達した（図４）。これは、ウエスタン−ブロットの結果と同じく、Ｔａｔ輸送ドメインが蛋白質のどの部分に融合されていても、その効果が類似することを示す。その反面、Ｔａｔ輸送ドメインが両側に付いた融合蛋白質は、一方にのみ存在する融合蛋白質より明るい蛍光を現した。加えて、Ｔａｔ輸送ドメインが両側に付いた融合蛋白質は、より多くの核内に移動していることが確認された。
【００６０】
実施例６：ＦＡＣＳ（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）分析による細胞導入分析
９個のアミノ酸（４９−５７）からなるＨＩＶ−１ Ｔａｔ蛋白質輸送部分をアミノ酸末端とカルボキシル末端両側に結合させた変異体輸送ドメインに対する化物分子細胞透過能を観察するために次のように実験した（図５）。即ち、輸送ドメイン−ＧＦＰ−輸送ドメイン融合蛋白質の細胞内透過を観察するために、ＨｅＬａ細胞を６−ウエル プレ−トにおいて４〜６時間培養した後、１０％ＦＢＳが分布された新鮮なＤＭＥＭ培養液で交替し、多数濃度のＧＦＰ融合蛋白質を培養液内に処理した。３７℃で３０分間培養した後、細胞をりん酸緩衝液生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ;ＰＢＳ）で十分に洗浄し、１０分間トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で処理した。細胞を集めて、さらにＰＢＳで２回洗浄した後、４%パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｅｄ）で１時間固定させた。固定させた細胞に対してＦＡＣＳを利用して細胞内蛍光を分析した。ＦＡＣＳ分析結果、図５のような曲線を得ることができた。上記の結果と同様、Ｔａｔ輸送ドメインが一方にだけ融合されている蛋白質は似た量で細胞内に導入される反面、両側にＴａｔ輸送ドメインがある融合蛋白質は多くの量で細胞内に導入されることを分かることができた。平均蛍光度（Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）は、輸送ドメイン−ＧＦＰが２３．８６、ＧＦＰ−輸送ドメインが１７．２１、輸送ドメイン−Ｔａｔ−輸送ドメインは２０４．５２であって、Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質が特に高い数値を示した。その後、Ｔａｔ輸送ドメインを両側に融合された蛋白質の量によって細胞内に導入されるメカニズムを分析するために多様な濃度で処理して３０分間培養した後、ＦＡＣＳ分析を行った（図６）．この結果、Ｔａｔ輸送ドメインを両側に有する融合蛋白質は、その濃度と共に平均蛍光度が増加することが確認できた。
【００６１】
実施例７：ＦＡＣＳ（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）分析とウエスタン−ブロットによる自然状態の融合蛋白質と変性された融合蛋白質の細胞導入比較分析
自然状態で輸送ドメイン−ＧＦＰを精製して細胞内に導入したとき、変性させ精製した輸送ドメイン−ＧＦＰより導入されるときと比較して、その効果が制限される。輸送ドメインが両側の末端に存在するＧＦＰ融合蛋白質は変性して精製されたとき、一方にだけ存在するＧＦＰより大きな効果を示すことから、輸送ドメイン−ＧＦＰ−輸送ドメイン融合蛋白質が自然状態で精製されたとき、細胞内に導入される効果について検討すべく実験を行った。まず、変性された蛋白質と自然状態に精製した蛋白質をウエスタン−ブロットで分析した結果、事前に精製された蛋白質も輸送ドメインが一つ存在するＧＦＰ融合蛋白質と同じ数値で細胞内に導入されたときの結果を示した（図７）。また、自然状態に分離した輸送ドメイン−ＧＦＰ−輸送ドメイン融合蛋白質の細胞内導入効果を知るためにＦＡＣＳ分析法を行った。それぞれ自然状態と変性された状態で精製された蛋白質をそれぞれの濃度に処理して１時間培養した。その結果図８のように変性された状態の輸送ドメイン−ＧＦＰ−輸送ドメイン融合蛋白質は、１Ｍ処理したとき平均蛍光度が１１７である反面、自然状態に精製した輸送ドメイン−ＧＦＰ−輸送ドメインは５４である数値を示した。これは、変性された状態の融合蛋白質の細胞内導入効果より劣っているが、図７と比較すると、変性して精製した輸送ドメイン−ＧＦＰ融合蛋白質程度の細胞内導入能力を有しているのが分かった。結果的に、Ｔａｔ輸送ドメインを一方の末端に有する融合蛋白質よりＴａｔ輸送ドメインを両側に有しており、変性して（ｄｅｎａｔｕｒｅｄ）精製した融合蛋白質が効果的に細胞内浸透をすることができ、自然状態（ｎａｔｉｖｅ）に精製した輸送ドメイン−ＧＦＰ−融合蛋白質もまた細胞内浸透が可能であることを結論づけることができた。
【００６２】
実施例８：組み替えＳＯＤ融合蛋白質等の発現ベクタ−製造
機能を有する蛋白質又はペプチドを細胞内に浸透させる技術を開発するために細胞内に目標蛋白質を伝達し得る融合蛋白質発現ベクタ−を製造し、輸送ドメインが蛋白質を細胞内に伝達する能力を容易に分析するために、ヒトＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ（Ｃｕ，Ｚｎ−ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ；以下、本明細書ではＳＯＤと略称する）蛋白質を選んだ。
【００６３】
組み替え融合蛋白質を過大に発現させるために、ＳＯＤ、ＨＩＶ−１Ｔａｔの形質導入部（Ｔａｔ ４９−５７）及び６個のヒスチジンに対するｃＤＮＡが連続的に含まれているＴａｔ−ＳＯＤ、ＳＯＤ−Ｔａｔ、Ｔａｔ−ＳＯＤ−Ｔａｔ発現ベクタ−を製造した（図９）。融合蛋白質に対する対照蛋白質であるＳＯＤを過大に発現させるために、Ｔａｔの形質導入部位だけ含まれておらず、残りの部位は同一なｐＥＴ−ＳＯＤ発現ベクタ−を製造した。
【００６４】
Ｔａｔ基本ドメインに該当する２種類のオリゴヌクレオチド[上位鎖（ｔｏｐ ｓｔｒａｎｄ）、５‘−ＴＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号３）と下位鎖５‘−ＴＣＧＡＧＴＣＴＴＣＧＴＣＧＣＴＧＣＴＣＣＧＣＴＴＣＴＴＣＣ−３’（配列番号４）]をＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ制限酵素で切ったｐＥＴ−１５ｂベクタ−に結さつ（ｌｉｇａｔｉｏｎ）して挿入した後、ヒトＳＯＤのｃＤＮＡの配列を基本として２種類のオリゴヌクレオチドを合成した。正方向プライマ−（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ）はＸｈｏ Ｉ 制限部位を有しており、逆方向プライマ−（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）はＢａｍＨ Ｉ制限部位を有している。重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行なった後、反応物を分離し、これをＴＡクロニングベクタ−に結さつして形質変換させプラスミドを分離した。ヒトＳＯＤ ｃＤＮＡがＴＡベクタ−をＸｈｏ Ｉ とＢａｍＨ Ｉで切断した後、ｐＥＴ−１５ｂ及びｐＥＴ−１５ｂ−Ｔａｔ発現ベクターに挿入した。
【００６５】
また、Ｔａｔ塩基性ドメインがＳＯＤ両側末端に融合されたｐＴａｔ−ＳＯＤ−ＴａｔはｐＴａｔ−ＳＯＤにＴａｔ塩基性ドメイン９個アミノ酸をコ−デイングする２重鎖オリゴヌクレオチドがアニ−ルされ、カルボキシル末端に挿入され、Ｔａｔ塩基性末端がカルボキシル末端に融合されたｐＳＯＤ−ＴａｔはｐＳＯＤにＴａｔ塩基性ドメイン９個のアミノ酸をコ−デイングする２重鎖オリゴヌクレオチドがアニ−ルされ、カルボキシル末端に挿入された（図９）。
【００６６】
実施例９：組み替えＳＯＤ融合蛋白質等の発現及び精製
本研究室で製造したヒトＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼｃＤＮＡが含まれているＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（ｐＳＯＤ及びｐＴａｔ−ＳＯＤ、ｐＳＯＤ−Ｔａｔ、ｐＴａｔ−ＳＯＤ−Ｔａｔ）をアンピシリンが含まれているＬＢ培地に入れ３７℃で２００ｒｐｍに撹拌して培養した。培養液内のバクテリア濃度が０.Ｄ６００＝０.５〜１.０を表す時、ＩＰＴＧを培地内に添加して最終濃度が０．５ｍＭになるようにした後、３〜４時間さらに培養した。培養した細胞を遠心分離して集めた後、６Ｍ Ｕｒｅａが添加された結合緩衝溶液（ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ;５ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）５ｍｌ入れ超音波粉砕器で粉砕（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）した。遠心分離して上層液を直ちにＮｉ−ニトリロトリアセチックアクシド セパロズス−パ−フロウ（Ｎｉ−ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｓｕｐｅｒ ｆｌｏｗ）コラムに負荷し、１０倍容積の結合緩衝溶液（ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）と６倍容積の洗浄緩衝溶液（ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ;６０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）で洗浄した後、溶出緩衝溶液（ｅｌｉｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ;１Ｍ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）で融合蛋白質を溶出した。次いで、融合蛋白質が含まれた分画等を集めてＰＤ−１０コラムクロマトグラフイ−（ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行なって分画中に含まれた塩分を除去した。融合蛋白質は６個のヒスチジンを含んでいるため、金属イオン−キレ−ト親和クロマトグラフイ−単一段階に融合蛋白質を純粋に（純度＞９０％）精製された（図１０）。
【００６７】
分画の蛋白質濃度は牛血清アルブミンを標準物質に使用してブレッドフオ−ド（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）方法で測定した。
【００６８】
実施例１０：ＨｅＬａ細胞培養及び組み替え融合蛋白質等の細胞内透過
ＨｅＬａ細胞は３７℃で９５％空気と５％ＣＯ２とを供給し、２０ｍＭＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１０％牛胎血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ;ＦＢＳ）及び抗生剤（１００μｇ／ｍｌ ストレフトマイシン、 １００Ｕ／ｍｌ ペニシリン）が含まれたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）で培養した。
【００６９】
９個のアミノ酸（４９−５７）からなるＨＩＶ−１ Ｔａｔ蛋白質輸送部分をアミノ酸末端とカルボキシル末端に結合させた変異体輸送ドメインに対する化物分子細胞透過能を観察するために次のように実験した。即ち、Ｔａｔ−ＳＯＤ、ＳＯＤ−Ｔａｔ、Ｔａｔ−ＳＯＤ−Ｔａｔ融合蛋白質等の細胞内透過を観察するために、ＨｅＬａ細胞を６−ウエルプレ−トで４〜６時間培養した後、１０％ＦＢＳが含まれた新鮮なＤＭＥＭ培養液に交換し、２Ｍ ＳＯＤ融合蛋白質を培養液内に処理した。１時間後、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で処理し、リン酸緩衝液生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ;ＰＢＳ）で十分に洗浄した。細胞を粉砕した後、細胞内に透過されたＳＯＤの量と活性度をＳＯＤ活性度分析とウエスタン−ブロッド分析で測定した。
【００７０】
実施例１１：ウエスタン−ブロッド分析
Ｔａｔ蛋白質がアミノ酸末端に1個が融合されている蛋白質と、両側に融合された蛋白質の細胞内移動効率を分析するためにウエスタン−ブロット方法を行なった。先ず、蛋白質等は変性された状態で精製した。準備されたＨｅＬａ細胞に２Ｍの変性された融合蛋白質を処理した後、１時間後に細胞等だけを集めてウエスタン−ブロットを行なった。細胞を溶菌して得られた細胞溶菌液を溶菌緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、２％ ＳＤＳ、１０％ ｖ／ｖ グリセロ−ル）を有する６−ウエルプレ−トに入れた。全体細胞溶菌液各１５μｇずつをＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドジェル上で電気移動させた。
【００７１】
電気移動で分離された蛋白質をニトロセルロ−スメンブレイン（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ;Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）で移動させた。蛋白質が移動されたニトロセルロ−スメンブレインを５％脱粉乳（ｎｏｎ−ｄｒｙ ｍｉｌｋ）が入っているＰＢＳでブロキングした。次いで、メンブレインはゴト抗−ＳＯＤポリク−ロン抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ;Ｓａｎｔａｃｒｕｚｅ、ＵＳＡ、１：１，０００）で処理した。その後セイヨウワサビペルオキシダ−ゼ（ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）−結合されたマウス抗−ゴ−ト（ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ）ＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ、１：１０，０００希釈）と反応させた。結合された抗体等は化学発光で確認することができた（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）。その結果、図１１ａのようにＴａｔ蛋白質がアミノ酸末端にだけある融合蛋白質とＴａｔ蛋白質がカルボキシル末端にある融合蛋白質は共に細胞内に透過された。しかし、Ｔａｔ蛋白質が両側の末端に融合されている融合蛋白質は１個のＴａｔ蛋白質が連結されている融合蛋白質より効果的に細胞内に移動した。この結果は、Ｔａｔ蛋白質が融合蛋白質のアミノ酸末端とカルボキシル末端のいずれかの側に融合されているものの効果は類似する、Ｔａｔ蛋白質が両側に融合されているものが細胞内移動効果が大きく向上されていることを示す（図１１ａ）。
【００７２】
実施例１２：ＳＯＤ酵素活性度測定
本研究において、ＳＯＤの活性度は、ＭｃＣｏｒｄとＦｒｉｄｏｖｉｃｈの方法（１９６９）によってキサンチン/キサンチンオキシダ−ゼ（ｘａｎｔｈｉｎｅ／ｘａｎｔｈｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ）反応によるペリシトクロム（ｆｅｒｒｉｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）ｃ還元の抑制程度を分光光度計で観察することにより測定した（ＭｃＣｏｒｄ、ＪＭ ａｎｄ Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ、Ｉ．（１９６９）Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２４４、６０４９−６０５５）。
【００７３】
標準分析方法は２５℃で２ｍｌの０．１ｍＭ ＥＤＴＡが含まれた５０ｍＭリン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）において行なった。反応混合液には１０ｕＭ ｆｅｒｒｉｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ、５０ｕＭキサンチン（ｘａｎｔｈｉｎｅ）及び十分な量のキサンチンオキシダ−ゼ（ｘａｎｔｈｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ）を含有しており、５５０ｎｍにおいてフエリシトクロム（ｆｅｒｒｉｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）cの還元程度を測定した。上記の条件下においてシトクロム（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）cを５０％減少させるス−パ−オキシドジスムタ−ゼの量を１単位に定義した。
【００７４】
細胞内に透過された溶融蛋白質は、その固有な活性を維持しなければ蛋白質治療に有用することができない。よって、細胞内に透過された融合蛋白質が生物学的な活性を有することは大変重要な問題である。図１１ｂは２Ｍの融合蛋白質等を1時間ＨｅＬａ細胞培地に透過したとき、細胞内のＳＯＤ酵素活性の変化を表した結果である。溶融蛋白質を投与しなかった細胞からＳＯＤ活性度は２．４６±０．３９Ｕ／ｍg蛋白質であり、Ｔａｔ−ＳＯＤとＳＯＤ−Ｔａｔ融合蛋白質を投与した時にＳＯＤ活性度は１２．６８±１．４４Ｕ／ｍｇ蛋白質として有意に上昇し、Ｔａｔ−ＳＯＤ−Ｔａｔ融合蛋白質を投与した時にＳＯＤ活性度は２３．７５±２．３５Ｕ／ｍｇ蛋白質でＴａｔ−ＳＯＤとＳＯＤ−Ｔａｔ融合蛋白質より２倍以上高いＳＯＤ活性度を表した（図１１ｂ）。よって、Ｔａｔ−ＳＯＤ−Tat融合蛋白質の細胞内透過及び活性がＴａｔ−ＳＯＤとＳＯＤ−Ｔａｔ融合蛋白質より２倍以上大きく増加されることを示した（図１１）。
【００７５】
実施例１３：アルギニン９−ＧＦＰ−アルギニン９融合蛋白質の細胞浸透活性測定
上記実施例１ないし３の方法と類似な方法で、９個のアルギニン残基で構成された輸送ドメインが緑色蛍光蛋白質のアミノ基及びカロボキシ基に共有結合されたオリゴリシン−ＧＦＰオリゴリシン融合蛋白質を製造した。
【００７６】
Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質とアルギニン９−ＧＦＰ−アルギニン９（Ｒ９−ＧＦＰ−Ｒ９）融合蛋白質の細胞浸透効率を比較するために、各融合蛋白質５０、１００、２００ｎＭずつをＨｅＬａ細胞が入っている２４ウエルプレ−トに加え、１時間が経過した後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで数回洗浄した後、蛍光をフルオロメ−タ−で測定した。結果は図１２のとおりである。
【００７７】
実施例１４：リシン９−ＧＦＰ−リシン９融合蛋白質の細胞浸透活性測定
実施例１ないし３の方法と類似の方法で９個のリシン残基で構成された輸送ドメインが緑色蛍光蛋白質のアミノ基及びカロボキシ基に共有結合されたオリゴリシン−ＧＦＰオリゴリシン融合蛋白質を製造した。
【００７８】
Ｔａｔ−ＧＦＰ融合蛋白質、ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質、アルギニン９−ＧＦＰ融合蛋白質とリシン９−ＧＦＰ−リシン９（Ｋ９−ＧＦＰ−Ｋ９）融合蛋白質の細胞浸透効率を比較するために、各融合蛋白質２００ｎＭずつをＨｅＬａ細胞が入っている２４ウエルプレ−トに加えた後、１時間が経過した後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで数回洗浄した後、蛍光を蛍光顕微鏡で測定した。結果は図1３のとおりである。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明は機能を有する蛋白質を蛋白質水準で細胞内に透過させるにおいて、既存の塩基性輸送ドメインを１側に結合させたものよりもっと高い透過効率と、細胞内活性を有する溶融蛋白質を提供することができる。
【００８０】
また、本発明の融合蛋白質を有効成分とする薬剤学的組成物及び化粧品等を提供することができる。
【００８１】
更に、本発明はヒトＧｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシド ジスムタ−ゼ（Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ）を蛋白質水準で細胞内に直接透過させるもので、特に細胞内に投与された−輸送ドメイン−ＳＯＤ−輸送ドメイン融合蛋白質はＳＯＤ活性度を回復して蛋白質治療に効率的に活用され得ることを提示する。
【００８２】
活性酸素種は、細胞内の生体高分子に損傷を加え、報告によれば、１００余種の疾病の進行過程と深く関連されている。よって、本発明はこのような活性酸素種を除去する際に主な役割を担当するＳＯＤを細胞内に投与することにより、疾患を治療する蛋白質治療に本発明の輸送ドメイン−ＳＯＤ−輸送ドメイン融合蛋白質が効果的に活用され得る。
【００８３】
本技術を基にして抗酸化酵素の一種であるＳＯＤを細胞内に直接伝達して我らの人体に有害な活性酸素を除去することができ、多くの疾病以外にも化粧品及び健康食品産業等に本技術を広範囲に活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】Ｔａｔ−ＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｔａｔ、Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ、ＧＦＰ発現ベクタ−の概略図である。合成されたＴａｔ輸送ドメインはＧＦＰのアミノ末端やカルボキシル末端、又は、両側末端に融合してベクタ−を製造した。ＧＦＰ発現ベクタ−ｐＧＦＰはＧＦＰのコ−デイング配列をｐＥＴ１５ｂに挿入して構成された。
【図２】精製された輸送ドメイン−ＧＦＰ融合蛋白質を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに分離した後、クマシ−ブル−（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）で染色したものである。レイン Ｍ：ＳＤＳ Ｍａｒｋｅｒレイン ＧＦＰ：ＧＦＰレイン ＴＧ：Ｔａｔ−ＧＦＰレイン ＧＴ：ＧＦＰ−Ｔａｔレイン ＴＧＴ：Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ
【図３】Ａ：変性されたＴａｔ−ＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｔａｔ、Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質の細胞内導入分析結果であって、１Ｍ Ｔａｔ融合蛋白質等を１時間ＨｅＬａ細胞内に導入させた時、細胞内に導入された蛋白質をウエスタン−ブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）法で分析したものである。Ｂ：細胞内に導入された蛋白質をウエスタン−ブロットした結果を基に、結果に表れた蛋白質等線の強さを図式化したものである。
【図４】細胞内に導入されたＴａｔ−ＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｔａｔ、Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質を公焦点蛍光顕微鏡で可視化したものである。各セクションは、それぞれ次のとおりである。Ｃｏｎｔｒｏｌ:何も処理しない細胞ＧＦＰ:対照群 ＧＦＰ １ＭＴＧ： Ｔａｔ−ＧＦＰ １ＭＧＴ：ＧＦＰ−Ｔａｔ １ＭＴＧＴ:Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ １Ｍ
【図５】ＦＡＣＳ分析法によってＧＦＰ融合蛋白質の細胞内導入効率を比較分析したものである。各融合蛋白質等は２Ｍ濃度で３０分間処理した。ＴＧ：Ｔａｔ−ＧＦＰＧＴ:ＧＦＰ−ＴａｔＴＧＴ:Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ
【図６】Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質を濃度別に処理して３０分間培養した結果をＦＡＣＳ分析法によって分析した結果。対照群ＧＦＰは最高濃度である２Ｍで処理した。
【図７】Ａ：Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質を自然状態と変性された状態で精製して細胞内導入効率を分析するためにウエスタン−ブロットである。各融合蛋白質等は１Ｍで処理して1時間培養した。レインｃｏｎ:処理しない細胞レインＧＦＰ：対照群 ＧＦＰレインｎａｔｉｖｅ:自然状態に精製したＴａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔレインｄｅｎａｔｕｒｅｄ:変性された状態に精製したＴａｔ−ＧＦＰ−ＴａｔＢ： 図７Ａの結果に表れた線の強さを図表で模式化したものである。
【図８】ＦＡＣＳ分析法によって自然状態に精製されたＴａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔと変性された状態に精製されたＴａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔの細胞内導入効果を濃度別に１時間処理して分析したものである。Ａ：変性された状態に精製されたＴａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔを０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ処理して分析した結果である。Ｂ：自然状態に精製されたＴａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔを０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ処理して分析した結果である。
【図９】Ｔａｔ−ＳＯＤ、ＳＯＤ−Ｔａｔ、Ｔａｔ−ＳＯＤ−Ｔａｔ、ＳＯＤ発現ベクタ−の概略図である. 合成されたＴａｔ蛋白質をＳＯＤのアミノ末端やカルボキル末端、又は両側末端に融合してベクタ−を製造した。ＳＯＤ発現ベクタ−であるｐＳＯＤはＳＯＤのコ−デイング配列をｐＥＴ−１５ｂベクタ−に挿入して製造した。
【図１０】精製された輸送ドメイン−ＳＯＤ融合蛋白質等を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに分離した後、クマシ−ブル−で染色したものである。レイン Ｍ：ＳＤＳ Ｍａｒｋｅｒレイン ＳＯＤ：ＳＯＤレイン ＴＳ：Ｔａｔ−ＳＯＤレイン ＳＴ：ＳＯＤ−Ｔａｔレイン ＴＳＴ：Ｔａｔ−ＳＯＤ−Ｔａｔ
【図１１】Ａ：変性された状態に精製したＴａｔ−ＳＯＤ、ＳＯＤ−Ｔａｔ、Ｔａｔ−ＳＯＤ−Ｔａｔ融合蛋白質の細胞内導入分析結果であって、２Ｍ Ｔａｔ融合蛋白質を１時間ＨｅＬａ細胞内に導入させたとき、細胞内の導入された蛋白質をウエスタン−ブロット法で分析したものである。Ｂ：２Ｍ融合蛋白質等を１時間ＨｅＬａ細胞に投与したとき、細胞内に導入されたＳＯＤ酵素の活性度変化を示したグラフである。
【図１２】Ｔａｔ−ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質とアルギニン９−ＧＦＰ−アルギニン９（Ｒ９−ＧＦＰ−Ｒ9）融合蛋白質の細胞浸透効率を蛍光を測定して図式化したグラフである。
【図１３】ＧＦＰ、Ｔａｔ−ＧＦＰ融合蛋白質、ＧＦＰ−Ｔａｔ融合蛋白質、アルギニン９−ＧＦＰ融合蛋白質とリシン９−ＧＦＰ−リシン９（Ｋ９−ＧＦＰ−Ｋ９）融合蛋白質の細胞浸透効率を比較するために、各融合蛋白質２００ｎＭずつをＨｅＬａ細胞に加えて１時間が経過した後、蛍光顕微鏡で観察した写真である。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
６ないし１２個のアミノ酸残基から構成され、アルギニン又はリシン残基を３/４以上含む輸送ドメインが目標蛋白質のアミノ基とカルボキシル基に共有結合された細胞浸透性輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質。
【請求項２】
輸送ドメインは、９個のアミノ酸残基で構成される請求項１記載の細胞浸透性輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質。
【請求項３】
輸送ドメインはＨＩＶ ｔａｔ４９−５７残基、オリゴリシン、オリゴアルギニン又はオリゴ（リシン，アルギニン）の少なくともいずれか１種である請求項１記載の細胞浸透性輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質。
【請求項４】
目標蛋白質は治療分子、予防分子、診断分子で構成されたグル−プから選ばれる請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の細胞浸透性輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質。
【請求項５】
目標蛋白質がＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ又はその機能的等価物である請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の細胞浸透性輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質。
【請求項６】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の細胞浸透性輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質を有効成分とする化粧料組成物。
【請求項７】
目標蛋白質がＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ又はその機能的等価物である請求項６記載の細胞浸透性輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質を有効成分とする化粧料組成物。
【請求項８】
化粧料組成物は化粧水、ジエル、水溶性リキッド、水中油（Ｏ／Ｗ）型又は油中水（Ｗ／Ｏ）型である請求項６記載の細胞浸透性輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質を有効成分とする化粧料組成物。
【請求項９】
請求項１〜請求項３のいずれか１項記載の輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質を有効成分とし、薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物。
【請求項１０】
目標蛋白質がＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ又はその機能的等価物である請求項９記載の輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質を有効成分とする薬剤学的組成物。
【請求項１】
６ないし１２個のアミノ酸残基から構成され、アルギニン又はリシン残基を３/４以上含む輸送ドメインが目標蛋白質のアミノ基とカルボキシル基に共有結合された細胞浸透性輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質。
【請求項２】
輸送ドメインは、９個のアミノ酸残基で構成される請求項１記載の細胞浸透性輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質。
【請求項３】
輸送ドメインはＨＩＶ ｔａｔ４９−５７残基、オリゴリシン、オリゴアルギニン又はオリゴ（リシン，アルギニン）の少なくともいずれか１種である請求項１記載の細胞浸透性輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質。
【請求項４】
目標蛋白質は治療分子、予防分子、診断分子で構成されたグル−プから選ばれる請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の細胞浸透性輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質。
【請求項５】
目標蛋白質がＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ又はその機能的等価物である請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の細胞浸透性輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質。
【請求項６】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の細胞浸透性輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質を有効成分とする化粧料組成物。
【請求項７】
目標蛋白質がＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ又はその機能的等価物である請求項６記載の細胞浸透性輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質を有効成分とする化粧料組成物。
【請求項８】
化粧料組成物は化粧水、ジエル、水溶性リキッド、水中油（Ｏ／Ｗ）型又は油中水（Ｗ／Ｏ）型である請求項６記載の細胞浸透性輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質を有効成分とする化粧料組成物。
【請求項９】
請求項１〜請求項３のいずれか１項記載の輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質を有効成分とし、薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物。
【請求項１０】
目標蛋白質がＣｕ，Ｚｎ−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ又はその機能的等価物である請求項９記載の輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質を有効成分とする薬剤学的組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２００６−５０４７７０（Ｐ２００６−５０４７７０Ａ）
【公表日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４８１１９（Ｐ２００４−５４８１１９）
【出願日】平成１５年３月１３日（２００３．３．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００３／０００４９０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３９８４６
【国際公開日】平成１６年５月１３日（２００４．５．１３）
【出願人】（５０４１１７９３６）ハリム ユニバーシティ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＨＡＬＬＹＭ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】１，Ｏｋｃｈｏｎ−ｄｏｎｇ，Ｃｈｕｎｃｈｅｏｎ−ｓｉ，Ｋａｎｇｗｏｎ−ｄｏ ２００−７０２ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年３月１３日（２００３．３．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００３／０００４９０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３９８４６
【国際公開日】平成１６年５月１３日（２００４．５．１３）
【出願人】（５０４１１７９３６）ハリム ユニバーシティ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＨＡＬＬＹＭ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】１，Ｏｋｃｈｏｎ−ｄｏｎｇ，Ｃｈｕｎｃｈｅｏｎ−ｓｉ，Ｋａｎｇｗｏｎ−ｄｏ ２００−７０２ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
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