細胞用力学負荷装置
【課題】細胞の測定を容易に行うことができると共に、細胞に効率よくせん断速度負荷を加えることができる細胞用力学負荷装置を提供する。
【解決手段】少なくとも一部が透明な第１平板１と、第１平板１に対して隙間を隔てて平行に配置されている第２平板１Ａと、第１平板１と第２平板１Ａとの間の隙間に設けられ、赤血球Ｓを含む試料を入れる血液試料室４と、試料中の赤血球Ｓに周期的なせん断速度負荷を加えるため第１平板１と第２平板１Ａを逆方向に平行振動させる平板振動手段１７とを備える。上下の平板１，１Ａが同じ速度で逆方向に振動するため、上下の平板１，１Ａの中央箇所では赤血球Ｓが移動せず、測定範囲から外れないため、赤血球Ｓの測定を容易に行うことができる。また、従来の片側振動装置に対して、２倍のせん断速度を与えることができる。
【解決手段】少なくとも一部が透明な第１平板１と、第１平板１に対して隙間を隔てて平行に配置されている第２平板１Ａと、第１平板１と第２平板１Ａとの間の隙間に設けられ、赤血球Ｓを含む試料を入れる血液試料室４と、試料中の赤血球Ｓに周期的なせん断速度負荷を加えるため第１平板１と第２平板１Ａを逆方向に平行振動させる平板振動手段１７とを備える。上下の平板１，１Ａが同じ速度で逆方向に振動するため、上下の平板１，１Ａの中央箇所では赤血球Ｓが移動せず、測定範囲から外れないため、赤血球Ｓの測定を容易に行うことができる。また、従来の片側振動装置に対して、２倍のせん断速度を与えることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞用力学負荷装置に関し、特に細胞の変形能を測定する際、細胞を含む試料に周期的なせん断速度負荷を加えるための細胞用力学負荷装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、細胞として血液中で主要な働きを担う赤血球が挙げられ、この赤血球は変形能を有し、その大きさより小さい径の毛細血管を通過することができる。赤血球の変形能は一般的に浸透圧、血液内に溶解している脂質の影響、加齢による影響等が考えられるが、血液が正常な機能を果たす上ではこの変形能が重要になり、循環器系の疾患は赤血球の変形能、血液の流動性が損なわれることにも起因する。そのようなことから、血球細胞、特に赤血球の変形能を測定し、定量的に評価することが循環器系疾患の検査に有効であると考えられ、このような血球細胞の変形能の測定、評価について研究、開発がなされている。また、遺伝による血液疾患における血液循環特性などについても定量的な評価が行われている。
【０００３】
従来、赤血球の変形能評価技術として、細胞を含む試料がニッケルメッシュフィルタを通過するのに要する時間、流れ抵抗を測定することによるもの（例えば特許文献１）、経皮的に血管内の血流に向けて超音波を入射させて散乱エコーを受信し、これから求められた血流速度分布に基づいて血液の粘性率分布を求めることによるもの（例えば特許文献２）、試料流に含まれる赤血球を撮像して得られた画像に基づいて赤血球の形態を示す値を算出することによるもの（例えば特許文献３）などがある。
【０００４】
特許文献１は、赤血球を含む試料がフィルタ、マイクロチャネル等を通過する速度が直接的には求められるが、赤血球の変形能について定量的に評価する上で有効な指標を与えるものにはならない。また、特許文献２では、生体内での血流についての速度分布から粘性率分布が求められるが、赤血球の変形能について定量的に評価するにはやはり適合しないものである。特許文献３においては、撮像により得られた画像に基づいて赤血球の形態を示す値として、赤血球の平均容積、凝集率、奇形の指数等が求められるが、それらの指標は赤血球の形状、形態的なものであって、赤血球の変形能について定量的に示すものではない。
【０００５】
このような問題点を考慮して、本発明者は、１対の平行に間隔をおいて配置した平板の間に試料を収容し、一方の平板を平行に移動させて試料に周期的なせん断速度を加えた状態で血液細胞の状態を光学的に検出し、血液細胞の力学的特性を計測する方法（例えば特許文献４及び特許文献５）を提案している。
【０００６】
上記特許文献４及び特許文献５においての赤血球の変形性測定では、赤血球に均一なせん断速度を定状もしくは過度的に負荷し変形させ、変形した赤血球の形状を顕微鏡と高速度カメラなどを用いて、負荷した力と変形量の関係から推定することができ、従来の問題を解決することができる。
【０００７】
ここで流れ場内にある赤血球の変形は、下記の数１に示すように、せん断速度γ(t)と赤血球周辺の溶媒の粘性μの積によって定義される。
【０００８】
【数１】
【０００９】
ただし、v（t）は流体の速度、ｈは流路の間隔である。赤血球はせん断応力で変形するが、実際の装置はせん断速度を発生し、このせん断速度と赤血球周辺の粘性の積により赤血球のせん断応力が決定するため、赤血球を変形される要素は「せん断速度」として以下に、これまでの赤血球を変形されるせん断速度負荷装置について説明する。
【００１０】
図１０はせん断速度を赤血球に定状的に加え、変形させる従来の装置を示す。この装置は、逆レオメーターと呼ばれる。この逆レオメーターは、例えば円板101と円板102あるいは円錐と円板で構成され、円板101と円板102の間隙に赤血球Ｓを含む試料を入れ、それら円板101と円板102の間隙を一定に保った状態で、円板101と円板102をそれぞれ逆方向に回転させることにより、せん断速度を発生し、焦点の合う赤血球Ｓについて形状変化を観察することができ、また、この装置では、赤血球Ｓが流れ場内で少ない移動で観察できるという大きな利点がある。
【００１１】
図１１は、上記特許文献４の片側振動装置を示し、この片側振動装置は過度なせん断速度を赤血球Ｓに加え、変形されるものであり、固定平板111と可動平板112を平行に配置し、これら２枚の平板111，112間に赤血球Ｓを含む試料を入れ、可動平板112を振動させることで赤血球Ｓに周期的なせん断速度を発生させることができる。
【００１２】
また、上記特許文献５では、片側振動装置の平行平板が作る流れ場が再現性良く出来るように、可動平板を磁力や弾性力で固定平板に押し付け、平行平板の間隙を一定に保つように構成している。
【００１３】
図１２は、逆レオスコープ法を用いた両側逆振動装置を示す。この両側逆振動装置は、円錐121と円板122を回転軸123にそれぞれ回動自在に設け、それら２枚の円錐121と円板122の間に赤血球Ｓを含む試料を入れ、円錐121と円板122とを相互に逆回転方向で正・逆転回転を繰り返すことで、赤血球Ｓにせん断速度を発生させることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００１−２４２１６６号公報
【特許文献２】特開２００６−１６６９７４号公報
【特許文献３】特開平１０−２６０１８１号公報
【特許文献４】特開２００８−１７０３９０号公報
【特許文献５】特開２０１０−２５８５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
これまで赤血球に過度的にせん断速度を負荷する装置は、２枚の平行のガラス板のうち１枚を固定した状態で、もう１枚を動かす方法が主流であり、２枚の平板間でのせん断速度は理想的には、固定側でも可動側と同様のせん断速度が発生する。しかしながら、実際に発生する流れは準クエット流れであり、固定側面の近傍におけるせん断速度は理想よりとても小さくなる。そのため測定対象となる赤血球は、可動側面に近い赤血球が対象となり、周波数を高くするには、可動側の距離もしくは速度を大きくする必要があり、このように赤血球の移動量が大きくなるため、多くの計測条件では赤血球は、視野から消えてしまうことになる。そのため、特定の赤血球について、繰り返し負荷における形状変化特性や耐久性などを測定することはできない。また、高周波数の条件下では、高速度カメラの性能と高輝度な光源装置が必要不可欠となる。
【００１６】
一方、図４に示した逆レオスコープ方式では、円錐121と円板122に接続されたモータを正逆回転することで、周期的なせん断速度負荷を与えることはできるが、振幅が小さいせん断速度を周期的に発生させるには回転側のプーリ径と円錐121および円板122の直径比を大きくする必要があり、装置が大がかりになる。また、コストを下げるために、円板と円板の組み合わせにすると、中心から半径方向に距離が離れた位置では大きな遠心力が加わり赤血球が外周方向に移動する虞がある。
【００１７】
そこで、上記の問題点を考慮して、細胞の測定を容易に行うことができると共に、細胞に効率よくせん断速度負荷を加えることができる細胞用力学負荷装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記目的を達成するために、請求項１に係る発明は、細胞を含む試料に周期的なせん断速度負荷を加えるための細胞用力学負荷装置において、少なくとも一部が透明な第１平板と、前記第１平板に対して隙間を隔てて平行に配置されている第２平板と、前記第１平板と前記第２平板との間の隙間に設けられ、細胞を含む試料を入れる空間と、前記試料中の細胞に周期的なせん断速度負荷を加えるため前記第１平板及び前記第２平板を逆方向の直線往復動により平行振動させる平板振動手段と、を備えることを特徴とする。
【００１９】
また、請求項２に係る発明は、前記第１平板を設けた第１振動体と、前記第２平板を設けた第２振動体と、を備え、前記平板振動手段は、前記第１振動体と前記第２振動体の一方を往復駆動する直線往復駆動源と、前記第１振動体と前記第２振動体の間に配置され、前記第１振動体と前記第２振動体の一方の往復動を他方に伝達して該他方を逆方向に往復動する回転伝達体と、を備えることを特徴とする。
【００２０】
また、請求項３に係る発明は、前記回転伝達体が前記第１振動体と前記第２振動体の間に挟んで配置したローラであることを特徴とする。
【００２１】
また、請求項４に係る発明は、前記第１振動体と前記第２振動体に相互に平行に配置された第１対向部と第２対向部を設け、前記第１対向部と前記第２対向部の間に複数の前記回転伝達体を配置したことを特徴とする。
【００２２】
また、請求項５に係る発明は、前記第１平板と前記第２平板の間に介挿されて前記第１平板と前記第２平板の間隔を維持するとともに前記第１平板と前記第２平板の間において前記試料を入れる空間を形成する間隙板と、前記間隙板を位置固定する位置固定手段と、を備えることを特徴とする。
【００２３】
また、請求項６に係る発明は、前記間隙板は少なくとも一部が磁性材料からなり、前記第１平板と前記第２平板の外側から作用する磁力により前記間隙板を位置固定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の請求項１に記載の細胞用力学負荷装置によれば、上下の平板が同じ速度で逆方向に振動するため、上下の平板の間隙板中央箇所では細胞が移動せず、測定範囲から外れないため、細胞の測定を容易に行うことができる。また、両方の平板が振動することにより従来の片側振動装置に対して、２倍のせん断速度を与えることができる。
【００２５】
また、本発明の請求項２に記載の細胞用力学負荷装置によれば、直線往復駆動源により第１振動体と前記第２振動体の一方を往復駆動すると、回転伝達体により他方が逆方向に往復動し、これにより第１平板と第２平板が逆向きで往復振動することで片側振動装置に比べ２倍のせん断速度を与えることができる。
【００２６】
また、本発明の請求項３に記載の細胞用力学負荷装置によれば、第１振動体と第２振動体の間に挟まれたローラが、一方の往復動を他方に逆方向に伝達し、これにより第１平板と第２平板が逆向きで往復振動する。
【００２７】
また、本発明の請求項４に記載の細胞用力学負荷装置によれば、複数の回転伝達体を第１対向部と前記第２対向部により挟むことにより、それら第１対向部と前記第２対向部を平行に配置することができ、これにより第１平板と第２平板を平行に配置することができる。
【００２８】
また、本発明の請求項５に記載の細胞用力学負荷装置によれば、間隙板により第１平板と第２平板との間に試料を入れる空間を形成することができ、平板が往復動しても位置固定手段により間隙板が位置固定され、平板間の空間が動くことがない。
【００２９】
また、本発明の請求項６に記載の細胞用力学負荷装置によれば、平板が往復動しても磁力により間隙板を位置固定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の実施例１を示す赤血球にせん断速度を負荷した状態の説明図である。
【図２】同上、平板の往復動を説明する説明図である。
【図３】同上、細胞用力学負荷装置の下側部材を示し、図３（Ａ）は平面図、図３（Ｂ）は縦断面図である。
【図４】同上、細胞用力学負荷装置の要部の縦断面図である。
【図５】同上、振動体に上側部材と下側部材を組み込んだ状態の縦断面図である。
【図６】同上、全体縦断面図である。
【図７】同上、平板の移動距離と時間との関係を示すグラフ図である。
【図８】同上、振幅位置における赤血球の状態を説明する説明図である。
【図９】本発明の実施例２を示す要部の平面図であり、図９（Ａ）は下側部材の平面図、図９（Ｂ）は間隙板の平面図である。
【図１０】従来例において赤血球にせん断速度を負荷した状態の説明図である。
【図１１】従来例の片側振動装置において赤血球にせん断速度を負荷した状態の説明図である。
【図１２】従来例の両側逆振動装置を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、図面を参照して、本発明の細胞用力学負荷装置の実施例について説明する。
【実施例１】
【００３２】
図１〜図８は本発明の実施例１を示し、まず、図１を用いて本発明の両側逆振動について説明する。
【００３３】
図１に示すように、上下の第１及び第２平板１，１Ａを同時に逆方向に移動すると、従来の片側振動に対して赤血球Ｓには２倍のせん断速度を発生することになる。尚、図１において、ｈは上下の平板１，１Ａの間隔である。
【００３４】
図１で赤血球Ｓが受けるせん断速度γ・（t）は、下記の数２で表される。構成
【００３５】
【数２】
【００３６】
ただし、Ｖu(t)は上側平板の平板速さ，Ｖb(t)は下側平板の平板速さ，
ここで、Ｖu(t)＝Ｖb(t)＝Ｖ(t)する。
【００３７】
実際には、観察方向から速度がゼロ点（ｈ/２）より、上下の位置にいる赤血球でも十分に、視野内に赤血球が留まることが可能な速度が加わっていると考えられる。この時のせん断速度は、
【００３８】
【数３】
【００３９】
上記数３となり、間隙ｈの中心にいる赤血球Ｓと同様のせん断速度が加わる。ただし、間隙ｈの中心の上下で、赤血球Ｓが移動する方向は逆となる。
【００４０】
本実施例では、図２に示すように、水平方向で平行に配置した２枚の平板１，１Ａ間に２個の回転伝達体たるローラ２，２を挟み、一方の平板１に直線往復駆動源たるリニアアクチュエータ３を接続することで両側逆振動を実現した。
【００４１】
図３〜図５に示すように、赤血球Ｓにせん断速度を加える血液試料室４は、前記第１及び第２平板１，１Ａの間に設けられ、これら平板１，１Ａはガラス板からなる。図３（Ａ）（Ｂ）に対物レンズ側（装置下側）の構造を示す。複数の磁石５，５Ａが埋め込まれた平板状の取付部６，６Ａに、前記平板１，１Ａが着脱可能に固定され、それら取付部６，６Ａは横方向に配置されている。尚、この例では磁石５，５Ａに永久磁石を用いているが、電磁石を用いてもよい。
【００４２】
そして、第２平板１Ａの上には、間隙板７が置かれ、この間隙板７は金属製のシムテープからなり、図３（Ａ）に示すように、血液試料室４を挟んだ左右に間隙板７，７が配置され、これら間隙板７，７は前後方向をなす。また、複数の前記磁石５，５Ａが、間隙板７を上下に挟んで相互に対応した位置に配置されており、磁石５，５Ａは磁極を異とすることにより、対向する上下の磁石５，５Ａ同士が磁力により吸引し、磁石５，５Ａに挟まれた間隙板７，７が位置固定される。この場合、平板１，１Ａと一体に磁石５，５Ａは逆方向にほぼ同速度で往復動するから、磁石５，５Ａが動いても、磁性材料を含む間隙板７が左右一方に動くことがなく、位置固定した状態が得られる。
【００４３】
このように第１及び第２平板１，１Ａの間に間隙板７を配置した状態で、磁石５，５Ａの磁石面を向い合せることで、図４に示すように両側の間隙板７，７の間に血液試料室４が形成され、血液と接触する上の第１平板１と下の第２平板１Ａが図中において左右逆方向に直線往復動でスライドすることで、図１のようなせん断速度を負荷することができる。尚、前記スライドによる平板１，１Ａの移動量（振幅）は、赤血球Ｓの大きさに比べて十分に大きく、前記スライドは一定周期で行われる。また、磁石５，５Ａを用いることで、２枚の平板１，１Ａが吸着して、安定した流れ場をもたらすことになる。さらに、前記取付部６，６Ａには、上下に間隔を置いて平板状の連結部８，８Ａを配置し、取付部６，６Ａと連結部８，８Ａとを、上下方向の複数の連結杆９により連結する。そして、前記平板１，１Ａ，取付部６，６Ａ，連結部８，８Ａ及び連結杆９により、上側部材１４と下側部材１４Ａを構成している。また、取付部及６，６Ａ及び連結部８，８Ａには、血液試料室４を視認するための窓部１５が開口している。尚、窓部１５を透光性部材から形成してもよい。
【００４４】
図５は、前記上側，下側部材１４，１４Ａを、平板状の第１及び第２振動体１１，１１Ａに組み込んだ状態を示す。前記第１及び第２振動体１１，１１Ａは、平板状をなし、前記連結杆９を挿通する挿通孔１２を有し、挿通孔１２に連結杆９を挿通することにより前記第１及び第２振動体１１，１１Ａに前記第１及び第２平板１，１Ａが昇降可能に組み込まれ、第１及び第２振動体１１，１１Ａの横移動を平板１，１Ａに伝達することができ、また、連結杆９は挿通孔１２の長さ方向に沿って移動可能となる。また、血液試料室４を挟んだ左右に前記ローラ２，２を配置し、これらローラ２，２は前記振動体１１，１１Ａの対向部たる第１及び第２対向面１６，１６Ａに接触状態で挟まれている。尚、それら対向面１６，１６Ａは相互に平行に配置され、また、前記ローラ２の少なくとも外周はゴムなどの弾性体からなる。そして、血液試料室４の上下の取付部６，６Ａの磁石５，５Ａの吸磁力が弱い場合は、取付部６，６Ａと振動体１１，１１Ａとの間に付勢手段たるコイルスプリング１３を配置し、このコイルスプリング１３は前記連結杆９に外装されており、コイルスプリング１３により第１平板１を第２平板１Ａとを近接する方向に付勢する。このようにコイルスプリング１３を上側部材１４に組み込み、下側部材１４Ａと面が平行になるようにしてもよい。
【００４５】
そして、前記第１及び第２振動体１１，１１Ａ，上側部材１４，下側部材１４Ａ及びリニアアクチュエータ３などにより、試料中の赤血球Ｓに周期的なせん断速度負荷を加えるため第１平板１と第２平板１Ａを逆方向に平行振動させる平板振動手段１７を構成している。
【００４６】
実際の実験では、血液試料室４の下側の下側部材１４Ａを対物レンズの焦点距離を考慮して上下位置を固定し、上側部材１４はある程度は上下に動くようにした。
【００４７】
図６に細胞用力学負荷装置の全体を示す。前記上側，下側部材１４，１４Ａは、機本体２０の上側駆動支持部２１及び下側駆動支持部２１Ａの間に組み込まれ、ベースとなる下側駆動支持部２１Ａの周囲には４本の支柱２２が立設され、これら支柱２２の上端は固定部２３に固定されている。また、それら支柱２２が上側駆動支持部２１の透孔２４に挿通され、前記下側駆動支持部２１Ａと固定部２３の間で、上側駆動支持部２１が支柱２２に昇降可能に設けられ、上側駆動支持部２１と前記振動体１１との間には、複数のリニアガイド２５が配置され、このリニアガイド２５により上側駆動支持部２１に対して振動体１１が左右方向に案内されと共に、上側駆動支持部２１に前記振動体１１が取り付けられている。また、下側駆動支持部２１Ａと前記振動体１１Ａとの間には、複数のリニアガイド２５が配置され、このリニアガイド２５により下側駆動支持部２１Ａに対して振動体１１Ａが左右方向に案内されと共に、下側駆動支持部２１Ａに前記振動体１１Ａが取り付けられている。また、前記振動体１１，１１Ａと上側駆動支持部２１と下側駆動支持部２１Ａには、前記窓部１５が開口して設けられている。
【００４８】
前記ローラ２は、磁石やゴム系の素材が適応可能となる。尚、ローラ２が磁石の場合は、前記振動体１１，１１Ａには磁石が吸着する磁性材料を用いる。本実施例では、ゴム系素材を考慮して設計・試作したローラ２を用いている。このようにゴムローラ２を用いることにより、ローラ２と対向面１６，１６Ａとの滑りの発生を防止することができる。前記ゴムローラ２は、その中心に回転軸２６を挿通し、この回転軸２６の両端側が連結部品２７に固定される。両端側の連結部品２７，２７には透孔２８が加工されており、この透孔２８に前記支柱２２が挿通され、連結部材２７が支柱２２に沿って上下動することができる。また、上側駆動支持部２１と連結部材２７との間に、第１の付勢手段たる圧縮コイルスプリング２９を配置し、連結部材２７と下側駆動支持部２１Ａとの間に、第２の付勢手段たる圧縮コイルスプリング２９Ａを配置し、それらコイルスプリング２９，２９Ａは前記支柱２２に外装されている。そして、連結部材２７の上側と下側のコイルスプリング２９，２９Ａでばね定数の強さを変えており、回転伝達体１６が上もしくは下の振動体１１，１１Ａの側のどちらかに強く押されるようにして、滑りが低減する工夫をした。また、固定部２３と上側駆動支持部２１との間に付勢手段たる圧縮コイルスプリング２９Ｂを配置し、このコイルスプリング２９Ｂにより上側駆動支持部２１はさらに連結部品２７側に付勢されている。
【００４９】
使用においては、前記下側駆動支持部２１Ａを平坦面上に固定し、上側の振動体１１に前記リニアアクチュエータ３を接続し、また、血液資料室４に血液細胞を含む試料を入れ、リニアアクチュエータ３により上側の振動体１１を横方向に往復動すると、ローラ２，２により下側の振動体１１Ａが横方向で逆に往復動し、血液試料室４内の試料中の赤血球Ｓにせん断速度負荷が付与される。尚、同径のローラ２，２を用いることにより、振動体１１，１１Ａは平行に保たれ、これにより平板１，１Ａも平行に保たれる。
【００５０】
前記細胞用力学負荷装置において、上側の振動体１１と下側振動体１１Ａの振幅と周波数の測定を行った。上側の振動体１１は、リニアアクチュエータ３を接続してあり、設定された周期と振幅で動き、レーザー変位計で変位を測定した。下側の振動体１１Ａは、上側の振動体１１と同様にレーザー変位計でその変位を測定した。但し、上側及び下振の振動体１１，１１Ａの変位は、同時測定ではなく、それぞれ測定を行った。
【００５１】
図７に上側の振動体１１を周波数２Ｈｚ、振幅０．５ｍｍ設定し、豚の赤血球Ｓをデキストラン３１Ｗｔ％で浮遊させて時の下側の振動体１１Ａの移動量の測定結果を示す。この結果、上側の振動体１１に比べ、下側の振動体１１Ａは７０μｍほど少ない移動量になった。これはローラ２にゴムローラを用いたため、ロストモーションが生じ、下側の振動体１１Ａに伝わる振動が上側の振動体１１の振幅より小さくなるためである。また、最大で、上側の振動体１１は下側の振動体１１Ａより１０ｍＳほど速く動くことが確認された。そして、理想的な最大せん断応力は１１．６３Ｐａが生じると予想される。
【００５２】
次に、上記の条件下で測定された赤血球Ｓを示す。尚、高速度カメラの撮影条件は、２００フレーム／秒である。対物レンズ４０倍、拡大レンズ約１．５倍、高速度カメラの画素が６４０×４００ピクセルとしたとき、全体の視野領域１９２×１４４μｍとなった。ピクセルからｍｍへの換算は、長さのわかる基準から、単位ピクセル数当たりの長さを求めて行った。間隙は３０μｍとなるように間隙板７，７を血液試料室４の両側に設置した。駆動周波数が２Ｈｚで振幅が０．５ｍｍにおいて、最大せん断速度は１３３．３Ｓ-1、最大速度は２ｍｍ／ｓとなる。そのため、従来の片側駆動方式であれば、視野領域から一度消えて、また、現れることになる。
【００５３】
図８に視野領域内で観察された赤血球の移動履歴の一例を示す。図８において、Ａ−Ｂ間は１７μｍ、Ｂ−Ｃ間は−１４．１μｍであった。平板１，１Ａは実測値でＡ−Ｂ、Ｂ−Ｃ間では振動体は４９０μｍで動いており，視野の横幅１９２μｍに対して，赤血球の移動した量は，約１／１１である。
【００５４】
同条件に基づいて、従来の片側振動でせん断速度を負荷すれば、赤血球Ｓは振幅とほぼ同じ移動距離を動くため、画面中心付近の赤血球Ｓを測定対象とすれば、視野の横幅は１９２μｍであるから、一度は視野から消えることになる。また、本実施例の両側駆動は、片側駆動に比べ、速度が半分で済むため、高速度カメラのコマ数も少なくて済むことになる。
【００５５】
次に、前記細胞用力学負荷装置を用いた血液細胞の力学的特性測定装置の一例について説明する。前記力学的特性測定装置は、図６に示すように、照射光源部３０，受光部４０及びデータ解析処理部５０を備える。照射光源部３０は細胞用力学負荷装置における血液細胞を含む試料の位置に光を照射するものであり、試料を透過した光を受光部４０で受光もしくは形態撮像を行い、試料についての計測を行う。細胞用力学負荷装置において、上側及び下側部材１４，１４Ａなどが往復動した際にも照射光源部３０からの試料を透過する光を遮らないように形成、配置され、光は窓部１５を通過する。照射光源部３０からの光は試料を透過した後に、装置の下側に配置された受光部４０で受光もしくは形態撮像を行う。
【００５６】
前記受光部４０は試料を透過した光の検出もしくは形態撮像を行い、血液細胞の状態について測定するものであり、本例としては、上述した高速度カメラを用いている。データ解析処理部５０は受光部４０としての撮像装置により撮像された血液細胞を含む試料についての画像を解析し、血液細胞の形状変化から、粘弾性特性等を求める。受光部４０として試料における血液細胞の状態を撮像装置により撮像して画像解析により力学的特性を測定するもののほか、照射光で照射された血液細胞を含む試料の透過光または散乱光の強度を受光部で測定し、得られた強度の時間変化についてのデータから血液細胞を粘弾性モデル化したパラメータを求め、血液細胞の力学的特性を測定するものとすることもできる。
【００５７】
このように本実施例では、請求項に対応して、細胞たる赤血球Ｓを含む液体試料に周期的なせん断速度負荷を加えるための細胞用力学負荷装置において、少なくとも一部が透明な第１平板１と、第１平板１に対して隙間を隔てて平行に配置されている第２平板１Ａと、第１平板１と第２平板１Ａとの間の隙間に設けられ、赤血球Ｓを含む試料を入れる空間たる血液試料室４と、試料中の赤血球Ｓに周期的なせん断速度負荷を加えるため第１平板１と第２平板１Ａを逆方向の直線往復動により平行振動させる平板振動手段１７とを備えるから、上下の平板１，１Ａが同じ速度で逆方向に振動するため、上下の平板１，１Ａの中央箇所では赤血球Ｓが移動せず、測定範囲から外れないため、赤血球Ｓの測定を容易に行うことができる。また、従来の片側振動装置に対して、２倍のせん断速度を与えることができる。
【００５８】
また、このように本実施例では、請求項に対応して、第１平板１を設けた第１振動体１６と、第２平板１Ａを設けた第２振動体１６Ａとを備え、平板振動手段１７は、第１振動体１６と第２振動体１６Ａの一方である第１振動体１６を往復駆動する直線往復駆動源たるリニアアクチュエータ３と、第１振動体１６と第２振動体１６Ａの間に配置され、第１振動体１６と第２振動体１６Ａの一方である第１振動体１６の往復動を他方である第２振動体１６Ａに伝達して該他方を逆方向に往復動する回転伝達体たるローラ２とを備えるから、リニアアクチュエータ３により第１振動体１６と第２振動体１６Ａの一方を往復駆動すると、回転伝達体により他方が逆方向に往復動し、これにより第１平板１と第２平板１Ａが逆向きで往復振動して細胞に２倍のせん断速度を与えることができる。
【００５９】
また、このように本実施例では、請求項に対応して、回転伝達体が第１振動体１６と第２振動体１６Ａの間に挟んで配置したローラ２であるから、ローラ２が一方の往復動を他方に逆方向に伝達し、これにより第１平板１と第２平板１Ａが逆向きで往復振動する。
【００６０】
また、このように本実施例では、請求項に対応して、第１振動体１６と第２振動体１６Ａに相互に平行に配置された第１対向部たる第１対向面１６と第２対向部たる第２対向面１６Ａを設け、第１対向面１６と第２対向面１６Ａの間に複数のローラ２，２を配置したから、第１対向面１６と第２対向面１６Ａを平行に配置することができ、これにより第１平板１と第２平板１Ａを平行に配置することができる。
【００６１】
また、このように本実施例では、請求項に対応して、第１平板１と第２平板１Ａの間に介挿されて第１平板１と第２平板１Ａの間隔を維持するとともに第１平板１と第２平板１Ａの間において試料を入れる空間たる血液試料室４を形成する間隙板７と、間隙板７を位置固定する位置固定手段たる磁石５，５Ａとを備えるから、間隙板７により第１平板１と第２平板１Ａとの間に試料を入れる血液試料室４を形成することができ、平板１，１Ａが往復動しても磁石５，５Ａにより間隙板７が位置固定され、間の血液試料室４が動くことがない。また、間隙板７により往復動の際にも平板１，１Ａとの間隙が精度よく保持され、試料における流れの平行度が高められる。
【００６２】
また、このように本実施例では、請求項に対応して、間隙板７は少なくとも一部が磁性材料からなり、第１平板１と第２平板１Ａの外側から作用する磁力により間隙板７を位置固定するように構成したから、平板１，１Ａが往復動しても磁力により間隙板７を位置固定することができる。尚、この場合、平板１，１Ａには磁力を通す材料を用いる。
【００６３】
また、実施例上の効果として、上側駆動支持部２１を昇降可能に設けることにより、上側駆動支持部２１に対してスライド可能で且つ上下間隔を一定に保った第１振動体１１を昇降することができ、これにより第１振動体１１と第２振動体１１Ａの間隔を調整して、ローラ２による伝達を円滑に行うことができる。さらに、ローラ２と振動体１１，１１Ａとの接触圧を調整する調整手段として、連結部材２７と下側駆動支持部２１Ａとの間に、第１の付勢手段たる圧縮コイルスプリング２９Ａを配置したから、連結部材２７の上側と下側のコイルスプリング２９，２９Ａでばね定数の強さを変えて、回転伝達体１６が上もしくは下の振動体１１，１１Ａの側のどちらかに強く押されるようにして、ローラ２の滑りを低減することができる。また、取付部６と振動体１１，１１Ａとの間に付勢手段たるコイルスプリング１３を配置し、コイルスプリング１３は血液試料室４を挟む位置に配置されているから、平板１，１Ａ同士が平行になるように付勢することができる。さらに、間隙板７の厚みを自由に変更することにより血液試料室４の高さを調整できるから、せん断速度の大きさは、リニアアクチュエータ３による振動体１１の移動速度と間隙板７の厚さの２つで調整することができる。
【００６４】
さらに、実施例上の効果として、本発明による血液細胞の力学的特性測定装置は、血液細胞を含む試料に周期的なせん断速度負荷を加えるための細胞用力学負荷装置と、細胞用力学負荷装置において周期的なせん断速度負荷を加えた状態の血液細胞を含む試料に光を照射するための照射光源部３０と、照射光源部３０により光を照射された血液細胞を含む試料からの透過光または反射光を受光する受光部４０と、受光部４０により受光された光信号データについて解析処理を行って血液細胞の力学的特性を求めるデータ解析処理部５０とを備えるから、血液細胞の変形能の測定の再現性が高められる。また、取付部６，６Ａに平板１，１Ａが着脱可能に固定されるから、血液細胞を含む試料の載置部の構成をディスポーザブル化することができ、血液による感染症のリスクが軽減される。血液細胞の力学的特性測定装置の構成を簡易で精度のよいものとし、日常的な利用に供するものとすることができる。
【実施例２】
【００６５】
図９は本発明の実施例２を示し、上記実施例１と同一部分に同一符号を付して説明する。この例では、左右の間隙板７，７の前後を前後の間隙板７Ａ，７Ａにより連結し、これら前後の間隙板７Ａ，７Ａは、前記血液試料室４の前後に位置する。即ち同一厚さの間隙板７，７，７Ａ，７Ａを枠状に形成して前記血液試料室４の周囲を囲むように構成している。
【００６６】
このように前記血液試料室４の周囲を間隙板７，７，７Ａ，７Ａにより囲むことによって、血液試料室４の試料の漏れを確実に防止することができる。
【００６７】
尚、本発明は、本実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で種々の変形実施が可能である。例えば、実施例では、上側部材及び下側部材を組み込んだ振動体を例示したが、取付部を左右方向に広げて振動体としたり、連結部を左右に広げて振動体にしたり、図２に示したように平板に振動体を一体的に設けてもよい。また、直線往復駆動源を振動体に直接接続しなくても、直線往復駆動源は間接的に振動体を往復駆動するものでもよい。さらに、回転伝達体としてゴムローラを用いたが、一方の往復動を他方に逆方向の往復動に伝達するものであれば、各種のものを用いることができ、例えば対向面にラックを設け、ラックに歯合するギアにより回転伝達体を構成してもよい。また、試料を交換する際、平板と取付部を交換したり、上側部材と下側部材を交換したり、平板のみあるいは平板を含む上側部材と下側部材の少なくとも一部を交換するようにしてもよい。
【符号の説明】
【００６８】
１ 第１平板
１Ａ 第２平板
２ ローラ（回転伝達体）
３ リニアアクチュエータ（直線往復駆動源）
４ 血液試料室（空間）
５，５Ａ 磁石
７ 間隙板
７Ａ 間隙板
８ 連結部
９ 連結杆
１１ 第１振動体
１１Ａ 第２振動体
１６ 第１対向面（第１対向部）
１６Ａ 第２対向面（第２対向部）
１７ 平板振動手段
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞用力学負荷装置に関し、特に細胞の変形能を測定する際、細胞を含む試料に周期的なせん断速度負荷を加えるための細胞用力学負荷装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、細胞として血液中で主要な働きを担う赤血球が挙げられ、この赤血球は変形能を有し、その大きさより小さい径の毛細血管を通過することができる。赤血球の変形能は一般的に浸透圧、血液内に溶解している脂質の影響、加齢による影響等が考えられるが、血液が正常な機能を果たす上ではこの変形能が重要になり、循環器系の疾患は赤血球の変形能、血液の流動性が損なわれることにも起因する。そのようなことから、血球細胞、特に赤血球の変形能を測定し、定量的に評価することが循環器系疾患の検査に有効であると考えられ、このような血球細胞の変形能の測定、評価について研究、開発がなされている。また、遺伝による血液疾患における血液循環特性などについても定量的な評価が行われている。
【０００３】
従来、赤血球の変形能評価技術として、細胞を含む試料がニッケルメッシュフィルタを通過するのに要する時間、流れ抵抗を測定することによるもの（例えば特許文献１）、経皮的に血管内の血流に向けて超音波を入射させて散乱エコーを受信し、これから求められた血流速度分布に基づいて血液の粘性率分布を求めることによるもの（例えば特許文献２）、試料流に含まれる赤血球を撮像して得られた画像に基づいて赤血球の形態を示す値を算出することによるもの（例えば特許文献３）などがある。
【０００４】
特許文献１は、赤血球を含む試料がフィルタ、マイクロチャネル等を通過する速度が直接的には求められるが、赤血球の変形能について定量的に評価する上で有効な指標を与えるものにはならない。また、特許文献２では、生体内での血流についての速度分布から粘性率分布が求められるが、赤血球の変形能について定量的に評価するにはやはり適合しないものである。特許文献３においては、撮像により得られた画像に基づいて赤血球の形態を示す値として、赤血球の平均容積、凝集率、奇形の指数等が求められるが、それらの指標は赤血球の形状、形態的なものであって、赤血球の変形能について定量的に示すものではない。
【０００５】
このような問題点を考慮して、本発明者は、１対の平行に間隔をおいて配置した平板の間に試料を収容し、一方の平板を平行に移動させて試料に周期的なせん断速度を加えた状態で血液細胞の状態を光学的に検出し、血液細胞の力学的特性を計測する方法（例えば特許文献４及び特許文献５）を提案している。
【０００６】
上記特許文献４及び特許文献５においての赤血球の変形性測定では、赤血球に均一なせん断速度を定状もしくは過度的に負荷し変形させ、変形した赤血球の形状を顕微鏡と高速度カメラなどを用いて、負荷した力と変形量の関係から推定することができ、従来の問題を解決することができる。
【０００７】
ここで流れ場内にある赤血球の変形は、下記の数１に示すように、せん断速度γ(t)と赤血球周辺の溶媒の粘性μの積によって定義される。
【０００８】
【数１】
【０００９】
ただし、v（t）は流体の速度、ｈは流路の間隔である。赤血球はせん断応力で変形するが、実際の装置はせん断速度を発生し、このせん断速度と赤血球周辺の粘性の積により赤血球のせん断応力が決定するため、赤血球を変形される要素は「せん断速度」として以下に、これまでの赤血球を変形されるせん断速度負荷装置について説明する。
【００１０】
図１０はせん断速度を赤血球に定状的に加え、変形させる従来の装置を示す。この装置は、逆レオメーターと呼ばれる。この逆レオメーターは、例えば円板101と円板102あるいは円錐と円板で構成され、円板101と円板102の間隙に赤血球Ｓを含む試料を入れ、それら円板101と円板102の間隙を一定に保った状態で、円板101と円板102をそれぞれ逆方向に回転させることにより、せん断速度を発生し、焦点の合う赤血球Ｓについて形状変化を観察することができ、また、この装置では、赤血球Ｓが流れ場内で少ない移動で観察できるという大きな利点がある。
【００１１】
図１１は、上記特許文献４の片側振動装置を示し、この片側振動装置は過度なせん断速度を赤血球Ｓに加え、変形されるものであり、固定平板111と可動平板112を平行に配置し、これら２枚の平板111，112間に赤血球Ｓを含む試料を入れ、可動平板112を振動させることで赤血球Ｓに周期的なせん断速度を発生させることができる。
【００１２】
また、上記特許文献５では、片側振動装置の平行平板が作る流れ場が再現性良く出来るように、可動平板を磁力や弾性力で固定平板に押し付け、平行平板の間隙を一定に保つように構成している。
【００１３】
図１２は、逆レオスコープ法を用いた両側逆振動装置を示す。この両側逆振動装置は、円錐121と円板122を回転軸123にそれぞれ回動自在に設け、それら２枚の円錐121と円板122の間に赤血球Ｓを含む試料を入れ、円錐121と円板122とを相互に逆回転方向で正・逆転回転を繰り返すことで、赤血球Ｓにせん断速度を発生させることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００１−２４２１６６号公報
【特許文献２】特開２００６−１６６９７４号公報
【特許文献３】特開平１０−２６０１８１号公報
【特許文献４】特開２００８−１７０３９０号公報
【特許文献５】特開２０１０−２５８５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
これまで赤血球に過度的にせん断速度を負荷する装置は、２枚の平行のガラス板のうち１枚を固定した状態で、もう１枚を動かす方法が主流であり、２枚の平板間でのせん断速度は理想的には、固定側でも可動側と同様のせん断速度が発生する。しかしながら、実際に発生する流れは準クエット流れであり、固定側面の近傍におけるせん断速度は理想よりとても小さくなる。そのため測定対象となる赤血球は、可動側面に近い赤血球が対象となり、周波数を高くするには、可動側の距離もしくは速度を大きくする必要があり、このように赤血球の移動量が大きくなるため、多くの計測条件では赤血球は、視野から消えてしまうことになる。そのため、特定の赤血球について、繰り返し負荷における形状変化特性や耐久性などを測定することはできない。また、高周波数の条件下では、高速度カメラの性能と高輝度な光源装置が必要不可欠となる。
【００１６】
一方、図４に示した逆レオスコープ方式では、円錐121と円板122に接続されたモータを正逆回転することで、周期的なせん断速度負荷を与えることはできるが、振幅が小さいせん断速度を周期的に発生させるには回転側のプーリ径と円錐121および円板122の直径比を大きくする必要があり、装置が大がかりになる。また、コストを下げるために、円板と円板の組み合わせにすると、中心から半径方向に距離が離れた位置では大きな遠心力が加わり赤血球が外周方向に移動する虞がある。
【００１７】
そこで、上記の問題点を考慮して、細胞の測定を容易に行うことができると共に、細胞に効率よくせん断速度負荷を加えることができる細胞用力学負荷装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記目的を達成するために、請求項１に係る発明は、細胞を含む試料に周期的なせん断速度負荷を加えるための細胞用力学負荷装置において、少なくとも一部が透明な第１平板と、前記第１平板に対して隙間を隔てて平行に配置されている第２平板と、前記第１平板と前記第２平板との間の隙間に設けられ、細胞を含む試料を入れる空間と、前記試料中の細胞に周期的なせん断速度負荷を加えるため前記第１平板及び前記第２平板を逆方向の直線往復動により平行振動させる平板振動手段と、を備えることを特徴とする。
【００１９】
また、請求項２に係る発明は、前記第１平板を設けた第１振動体と、前記第２平板を設けた第２振動体と、を備え、前記平板振動手段は、前記第１振動体と前記第２振動体の一方を往復駆動する直線往復駆動源と、前記第１振動体と前記第２振動体の間に配置され、前記第１振動体と前記第２振動体の一方の往復動を他方に伝達して該他方を逆方向に往復動する回転伝達体と、を備えることを特徴とする。
【００２０】
また、請求項３に係る発明は、前記回転伝達体が前記第１振動体と前記第２振動体の間に挟んで配置したローラであることを特徴とする。
【００２１】
また、請求項４に係る発明は、前記第１振動体と前記第２振動体に相互に平行に配置された第１対向部と第２対向部を設け、前記第１対向部と前記第２対向部の間に複数の前記回転伝達体を配置したことを特徴とする。
【００２２】
また、請求項５に係る発明は、前記第１平板と前記第２平板の間に介挿されて前記第１平板と前記第２平板の間隔を維持するとともに前記第１平板と前記第２平板の間において前記試料を入れる空間を形成する間隙板と、前記間隙板を位置固定する位置固定手段と、を備えることを特徴とする。
【００２３】
また、請求項６に係る発明は、前記間隙板は少なくとも一部が磁性材料からなり、前記第１平板と前記第２平板の外側から作用する磁力により前記間隙板を位置固定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の請求項１に記載の細胞用力学負荷装置によれば、上下の平板が同じ速度で逆方向に振動するため、上下の平板の間隙板中央箇所では細胞が移動せず、測定範囲から外れないため、細胞の測定を容易に行うことができる。また、両方の平板が振動することにより従来の片側振動装置に対して、２倍のせん断速度を与えることができる。
【００２５】
また、本発明の請求項２に記載の細胞用力学負荷装置によれば、直線往復駆動源により第１振動体と前記第２振動体の一方を往復駆動すると、回転伝達体により他方が逆方向に往復動し、これにより第１平板と第２平板が逆向きで往復振動することで片側振動装置に比べ２倍のせん断速度を与えることができる。
【００２６】
また、本発明の請求項３に記載の細胞用力学負荷装置によれば、第１振動体と第２振動体の間に挟まれたローラが、一方の往復動を他方に逆方向に伝達し、これにより第１平板と第２平板が逆向きで往復振動する。
【００２７】
また、本発明の請求項４に記載の細胞用力学負荷装置によれば、複数の回転伝達体を第１対向部と前記第２対向部により挟むことにより、それら第１対向部と前記第２対向部を平行に配置することができ、これにより第１平板と第２平板を平行に配置することができる。
【００２８】
また、本発明の請求項５に記載の細胞用力学負荷装置によれば、間隙板により第１平板と第２平板との間に試料を入れる空間を形成することができ、平板が往復動しても位置固定手段により間隙板が位置固定され、平板間の空間が動くことがない。
【００２９】
また、本発明の請求項６に記載の細胞用力学負荷装置によれば、平板が往復動しても磁力により間隙板を位置固定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の実施例１を示す赤血球にせん断速度を負荷した状態の説明図である。
【図２】同上、平板の往復動を説明する説明図である。
【図３】同上、細胞用力学負荷装置の下側部材を示し、図３（Ａ）は平面図、図３（Ｂ）は縦断面図である。
【図４】同上、細胞用力学負荷装置の要部の縦断面図である。
【図５】同上、振動体に上側部材と下側部材を組み込んだ状態の縦断面図である。
【図６】同上、全体縦断面図である。
【図７】同上、平板の移動距離と時間との関係を示すグラフ図である。
【図８】同上、振幅位置における赤血球の状態を説明する説明図である。
【図９】本発明の実施例２を示す要部の平面図であり、図９（Ａ）は下側部材の平面図、図９（Ｂ）は間隙板の平面図である。
【図１０】従来例において赤血球にせん断速度を負荷した状態の説明図である。
【図１１】従来例の片側振動装置において赤血球にせん断速度を負荷した状態の説明図である。
【図１２】従来例の両側逆振動装置を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、図面を参照して、本発明の細胞用力学負荷装置の実施例について説明する。
【実施例１】
【００３２】
図１〜図８は本発明の実施例１を示し、まず、図１を用いて本発明の両側逆振動について説明する。
【００３３】
図１に示すように、上下の第１及び第２平板１，１Ａを同時に逆方向に移動すると、従来の片側振動に対して赤血球Ｓには２倍のせん断速度を発生することになる。尚、図１において、ｈは上下の平板１，１Ａの間隔である。
【００３４】
図１で赤血球Ｓが受けるせん断速度γ・（t）は、下記の数２で表される。構成
【００３５】
【数２】
【００３６】
ただし、Ｖu(t)は上側平板の平板速さ，Ｖb(t)は下側平板の平板速さ，
ここで、Ｖu(t)＝Ｖb(t)＝Ｖ(t)する。
【００３７】
実際には、観察方向から速度がゼロ点（ｈ/２）より、上下の位置にいる赤血球でも十分に、視野内に赤血球が留まることが可能な速度が加わっていると考えられる。この時のせん断速度は、
【００３８】
【数３】
【００３９】
上記数３となり、間隙ｈの中心にいる赤血球Ｓと同様のせん断速度が加わる。ただし、間隙ｈの中心の上下で、赤血球Ｓが移動する方向は逆となる。
【００４０】
本実施例では、図２に示すように、水平方向で平行に配置した２枚の平板１，１Ａ間に２個の回転伝達体たるローラ２，２を挟み、一方の平板１に直線往復駆動源たるリニアアクチュエータ３を接続することで両側逆振動を実現した。
【００４１】
図３〜図５に示すように、赤血球Ｓにせん断速度を加える血液試料室４は、前記第１及び第２平板１，１Ａの間に設けられ、これら平板１，１Ａはガラス板からなる。図３（Ａ）（Ｂ）に対物レンズ側（装置下側）の構造を示す。複数の磁石５，５Ａが埋め込まれた平板状の取付部６，６Ａに、前記平板１，１Ａが着脱可能に固定され、それら取付部６，６Ａは横方向に配置されている。尚、この例では磁石５，５Ａに永久磁石を用いているが、電磁石を用いてもよい。
【００４２】
そして、第２平板１Ａの上には、間隙板７が置かれ、この間隙板７は金属製のシムテープからなり、図３（Ａ）に示すように、血液試料室４を挟んだ左右に間隙板７，７が配置され、これら間隙板７，７は前後方向をなす。また、複数の前記磁石５，５Ａが、間隙板７を上下に挟んで相互に対応した位置に配置されており、磁石５，５Ａは磁極を異とすることにより、対向する上下の磁石５，５Ａ同士が磁力により吸引し、磁石５，５Ａに挟まれた間隙板７，７が位置固定される。この場合、平板１，１Ａと一体に磁石５，５Ａは逆方向にほぼ同速度で往復動するから、磁石５，５Ａが動いても、磁性材料を含む間隙板７が左右一方に動くことがなく、位置固定した状態が得られる。
【００４３】
このように第１及び第２平板１，１Ａの間に間隙板７を配置した状態で、磁石５，５Ａの磁石面を向い合せることで、図４に示すように両側の間隙板７，７の間に血液試料室４が形成され、血液と接触する上の第１平板１と下の第２平板１Ａが図中において左右逆方向に直線往復動でスライドすることで、図１のようなせん断速度を負荷することができる。尚、前記スライドによる平板１，１Ａの移動量（振幅）は、赤血球Ｓの大きさに比べて十分に大きく、前記スライドは一定周期で行われる。また、磁石５，５Ａを用いることで、２枚の平板１，１Ａが吸着して、安定した流れ場をもたらすことになる。さらに、前記取付部６，６Ａには、上下に間隔を置いて平板状の連結部８，８Ａを配置し、取付部６，６Ａと連結部８，８Ａとを、上下方向の複数の連結杆９により連結する。そして、前記平板１，１Ａ，取付部６，６Ａ，連結部８，８Ａ及び連結杆９により、上側部材１４と下側部材１４Ａを構成している。また、取付部及６，６Ａ及び連結部８，８Ａには、血液試料室４を視認するための窓部１５が開口している。尚、窓部１５を透光性部材から形成してもよい。
【００４４】
図５は、前記上側，下側部材１４，１４Ａを、平板状の第１及び第２振動体１１，１１Ａに組み込んだ状態を示す。前記第１及び第２振動体１１，１１Ａは、平板状をなし、前記連結杆９を挿通する挿通孔１２を有し、挿通孔１２に連結杆９を挿通することにより前記第１及び第２振動体１１，１１Ａに前記第１及び第２平板１，１Ａが昇降可能に組み込まれ、第１及び第２振動体１１，１１Ａの横移動を平板１，１Ａに伝達することができ、また、連結杆９は挿通孔１２の長さ方向に沿って移動可能となる。また、血液試料室４を挟んだ左右に前記ローラ２，２を配置し、これらローラ２，２は前記振動体１１，１１Ａの対向部たる第１及び第２対向面１６，１６Ａに接触状態で挟まれている。尚、それら対向面１６，１６Ａは相互に平行に配置され、また、前記ローラ２の少なくとも外周はゴムなどの弾性体からなる。そして、血液試料室４の上下の取付部６，６Ａの磁石５，５Ａの吸磁力が弱い場合は、取付部６，６Ａと振動体１１，１１Ａとの間に付勢手段たるコイルスプリング１３を配置し、このコイルスプリング１３は前記連結杆９に外装されており、コイルスプリング１３により第１平板１を第２平板１Ａとを近接する方向に付勢する。このようにコイルスプリング１３を上側部材１４に組み込み、下側部材１４Ａと面が平行になるようにしてもよい。
【００４５】
そして、前記第１及び第２振動体１１，１１Ａ，上側部材１４，下側部材１４Ａ及びリニアアクチュエータ３などにより、試料中の赤血球Ｓに周期的なせん断速度負荷を加えるため第１平板１と第２平板１Ａを逆方向に平行振動させる平板振動手段１７を構成している。
【００４６】
実際の実験では、血液試料室４の下側の下側部材１４Ａを対物レンズの焦点距離を考慮して上下位置を固定し、上側部材１４はある程度は上下に動くようにした。
【００４７】
図６に細胞用力学負荷装置の全体を示す。前記上側，下側部材１４，１４Ａは、機本体２０の上側駆動支持部２１及び下側駆動支持部２１Ａの間に組み込まれ、ベースとなる下側駆動支持部２１Ａの周囲には４本の支柱２２が立設され、これら支柱２２の上端は固定部２３に固定されている。また、それら支柱２２が上側駆動支持部２１の透孔２４に挿通され、前記下側駆動支持部２１Ａと固定部２３の間で、上側駆動支持部２１が支柱２２に昇降可能に設けられ、上側駆動支持部２１と前記振動体１１との間には、複数のリニアガイド２５が配置され、このリニアガイド２５により上側駆動支持部２１に対して振動体１１が左右方向に案内されと共に、上側駆動支持部２１に前記振動体１１が取り付けられている。また、下側駆動支持部２１Ａと前記振動体１１Ａとの間には、複数のリニアガイド２５が配置され、このリニアガイド２５により下側駆動支持部２１Ａに対して振動体１１Ａが左右方向に案内されと共に、下側駆動支持部２１Ａに前記振動体１１Ａが取り付けられている。また、前記振動体１１，１１Ａと上側駆動支持部２１と下側駆動支持部２１Ａには、前記窓部１５が開口して設けられている。
【００４８】
前記ローラ２は、磁石やゴム系の素材が適応可能となる。尚、ローラ２が磁石の場合は、前記振動体１１，１１Ａには磁石が吸着する磁性材料を用いる。本実施例では、ゴム系素材を考慮して設計・試作したローラ２を用いている。このようにゴムローラ２を用いることにより、ローラ２と対向面１６，１６Ａとの滑りの発生を防止することができる。前記ゴムローラ２は、その中心に回転軸２６を挿通し、この回転軸２６の両端側が連結部品２７に固定される。両端側の連結部品２７，２７には透孔２８が加工されており、この透孔２８に前記支柱２２が挿通され、連結部材２７が支柱２２に沿って上下動することができる。また、上側駆動支持部２１と連結部材２７との間に、第１の付勢手段たる圧縮コイルスプリング２９を配置し、連結部材２７と下側駆動支持部２１Ａとの間に、第２の付勢手段たる圧縮コイルスプリング２９Ａを配置し、それらコイルスプリング２９，２９Ａは前記支柱２２に外装されている。そして、連結部材２７の上側と下側のコイルスプリング２９，２９Ａでばね定数の強さを変えており、回転伝達体１６が上もしくは下の振動体１１，１１Ａの側のどちらかに強く押されるようにして、滑りが低減する工夫をした。また、固定部２３と上側駆動支持部２１との間に付勢手段たる圧縮コイルスプリング２９Ｂを配置し、このコイルスプリング２９Ｂにより上側駆動支持部２１はさらに連結部品２７側に付勢されている。
【００４９】
使用においては、前記下側駆動支持部２１Ａを平坦面上に固定し、上側の振動体１１に前記リニアアクチュエータ３を接続し、また、血液資料室４に血液細胞を含む試料を入れ、リニアアクチュエータ３により上側の振動体１１を横方向に往復動すると、ローラ２，２により下側の振動体１１Ａが横方向で逆に往復動し、血液試料室４内の試料中の赤血球Ｓにせん断速度負荷が付与される。尚、同径のローラ２，２を用いることにより、振動体１１，１１Ａは平行に保たれ、これにより平板１，１Ａも平行に保たれる。
【００５０】
前記細胞用力学負荷装置において、上側の振動体１１と下側振動体１１Ａの振幅と周波数の測定を行った。上側の振動体１１は、リニアアクチュエータ３を接続してあり、設定された周期と振幅で動き、レーザー変位計で変位を測定した。下側の振動体１１Ａは、上側の振動体１１と同様にレーザー変位計でその変位を測定した。但し、上側及び下振の振動体１１，１１Ａの変位は、同時測定ではなく、それぞれ測定を行った。
【００５１】
図７に上側の振動体１１を周波数２Ｈｚ、振幅０．５ｍｍ設定し、豚の赤血球Ｓをデキストラン３１Ｗｔ％で浮遊させて時の下側の振動体１１Ａの移動量の測定結果を示す。この結果、上側の振動体１１に比べ、下側の振動体１１Ａは７０μｍほど少ない移動量になった。これはローラ２にゴムローラを用いたため、ロストモーションが生じ、下側の振動体１１Ａに伝わる振動が上側の振動体１１の振幅より小さくなるためである。また、最大で、上側の振動体１１は下側の振動体１１Ａより１０ｍＳほど速く動くことが確認された。そして、理想的な最大せん断応力は１１．６３Ｐａが生じると予想される。
【００５２】
次に、上記の条件下で測定された赤血球Ｓを示す。尚、高速度カメラの撮影条件は、２００フレーム／秒である。対物レンズ４０倍、拡大レンズ約１．５倍、高速度カメラの画素が６４０×４００ピクセルとしたとき、全体の視野領域１９２×１４４μｍとなった。ピクセルからｍｍへの換算は、長さのわかる基準から、単位ピクセル数当たりの長さを求めて行った。間隙は３０μｍとなるように間隙板７，７を血液試料室４の両側に設置した。駆動周波数が２Ｈｚで振幅が０．５ｍｍにおいて、最大せん断速度は１３３．３Ｓ-1、最大速度は２ｍｍ／ｓとなる。そのため、従来の片側駆動方式であれば、視野領域から一度消えて、また、現れることになる。
【００５３】
図８に視野領域内で観察された赤血球の移動履歴の一例を示す。図８において、Ａ−Ｂ間は１７μｍ、Ｂ−Ｃ間は−１４．１μｍであった。平板１，１Ａは実測値でＡ−Ｂ、Ｂ−Ｃ間では振動体は４９０μｍで動いており，視野の横幅１９２μｍに対して，赤血球の移動した量は，約１／１１である。
【００５４】
同条件に基づいて、従来の片側振動でせん断速度を負荷すれば、赤血球Ｓは振幅とほぼ同じ移動距離を動くため、画面中心付近の赤血球Ｓを測定対象とすれば、視野の横幅は１９２μｍであるから、一度は視野から消えることになる。また、本実施例の両側駆動は、片側駆動に比べ、速度が半分で済むため、高速度カメラのコマ数も少なくて済むことになる。
【００５５】
次に、前記細胞用力学負荷装置を用いた血液細胞の力学的特性測定装置の一例について説明する。前記力学的特性測定装置は、図６に示すように、照射光源部３０，受光部４０及びデータ解析処理部５０を備える。照射光源部３０は細胞用力学負荷装置における血液細胞を含む試料の位置に光を照射するものであり、試料を透過した光を受光部４０で受光もしくは形態撮像を行い、試料についての計測を行う。細胞用力学負荷装置において、上側及び下側部材１４，１４Ａなどが往復動した際にも照射光源部３０からの試料を透過する光を遮らないように形成、配置され、光は窓部１５を通過する。照射光源部３０からの光は試料を透過した後に、装置の下側に配置された受光部４０で受光もしくは形態撮像を行う。
【００５６】
前記受光部４０は試料を透過した光の検出もしくは形態撮像を行い、血液細胞の状態について測定するものであり、本例としては、上述した高速度カメラを用いている。データ解析処理部５０は受光部４０としての撮像装置により撮像された血液細胞を含む試料についての画像を解析し、血液細胞の形状変化から、粘弾性特性等を求める。受光部４０として試料における血液細胞の状態を撮像装置により撮像して画像解析により力学的特性を測定するもののほか、照射光で照射された血液細胞を含む試料の透過光または散乱光の強度を受光部で測定し、得られた強度の時間変化についてのデータから血液細胞を粘弾性モデル化したパラメータを求め、血液細胞の力学的特性を測定するものとすることもできる。
【００５７】
このように本実施例では、請求項に対応して、細胞たる赤血球Ｓを含む液体試料に周期的なせん断速度負荷を加えるための細胞用力学負荷装置において、少なくとも一部が透明な第１平板１と、第１平板１に対して隙間を隔てて平行に配置されている第２平板１Ａと、第１平板１と第２平板１Ａとの間の隙間に設けられ、赤血球Ｓを含む試料を入れる空間たる血液試料室４と、試料中の赤血球Ｓに周期的なせん断速度負荷を加えるため第１平板１と第２平板１Ａを逆方向の直線往復動により平行振動させる平板振動手段１７とを備えるから、上下の平板１，１Ａが同じ速度で逆方向に振動するため、上下の平板１，１Ａの中央箇所では赤血球Ｓが移動せず、測定範囲から外れないため、赤血球Ｓの測定を容易に行うことができる。また、従来の片側振動装置に対して、２倍のせん断速度を与えることができる。
【００５８】
また、このように本実施例では、請求項に対応して、第１平板１を設けた第１振動体１６と、第２平板１Ａを設けた第２振動体１６Ａとを備え、平板振動手段１７は、第１振動体１６と第２振動体１６Ａの一方である第１振動体１６を往復駆動する直線往復駆動源たるリニアアクチュエータ３と、第１振動体１６と第２振動体１６Ａの間に配置され、第１振動体１６と第２振動体１６Ａの一方である第１振動体１６の往復動を他方である第２振動体１６Ａに伝達して該他方を逆方向に往復動する回転伝達体たるローラ２とを備えるから、リニアアクチュエータ３により第１振動体１６と第２振動体１６Ａの一方を往復駆動すると、回転伝達体により他方が逆方向に往復動し、これにより第１平板１と第２平板１Ａが逆向きで往復振動して細胞に２倍のせん断速度を与えることができる。
【００５９】
また、このように本実施例では、請求項に対応して、回転伝達体が第１振動体１６と第２振動体１６Ａの間に挟んで配置したローラ２であるから、ローラ２が一方の往復動を他方に逆方向に伝達し、これにより第１平板１と第２平板１Ａが逆向きで往復振動する。
【００６０】
また、このように本実施例では、請求項に対応して、第１振動体１６と第２振動体１６Ａに相互に平行に配置された第１対向部たる第１対向面１６と第２対向部たる第２対向面１６Ａを設け、第１対向面１６と第２対向面１６Ａの間に複数のローラ２，２を配置したから、第１対向面１６と第２対向面１６Ａを平行に配置することができ、これにより第１平板１と第２平板１Ａを平行に配置することができる。
【００６１】
また、このように本実施例では、請求項に対応して、第１平板１と第２平板１Ａの間に介挿されて第１平板１と第２平板１Ａの間隔を維持するとともに第１平板１と第２平板１Ａの間において試料を入れる空間たる血液試料室４を形成する間隙板７と、間隙板７を位置固定する位置固定手段たる磁石５，５Ａとを備えるから、間隙板７により第１平板１と第２平板１Ａとの間に試料を入れる血液試料室４を形成することができ、平板１，１Ａが往復動しても磁石５，５Ａにより間隙板７が位置固定され、間の血液試料室４が動くことがない。また、間隙板７により往復動の際にも平板１，１Ａとの間隙が精度よく保持され、試料における流れの平行度が高められる。
【００６２】
また、このように本実施例では、請求項に対応して、間隙板７は少なくとも一部が磁性材料からなり、第１平板１と第２平板１Ａの外側から作用する磁力により間隙板７を位置固定するように構成したから、平板１，１Ａが往復動しても磁力により間隙板７を位置固定することができる。尚、この場合、平板１，１Ａには磁力を通す材料を用いる。
【００６３】
また、実施例上の効果として、上側駆動支持部２１を昇降可能に設けることにより、上側駆動支持部２１に対してスライド可能で且つ上下間隔を一定に保った第１振動体１１を昇降することができ、これにより第１振動体１１と第２振動体１１Ａの間隔を調整して、ローラ２による伝達を円滑に行うことができる。さらに、ローラ２と振動体１１，１１Ａとの接触圧を調整する調整手段として、連結部材２７と下側駆動支持部２１Ａとの間に、第１の付勢手段たる圧縮コイルスプリング２９Ａを配置したから、連結部材２７の上側と下側のコイルスプリング２９，２９Ａでばね定数の強さを変えて、回転伝達体１６が上もしくは下の振動体１１，１１Ａの側のどちらかに強く押されるようにして、ローラ２の滑りを低減することができる。また、取付部６と振動体１１，１１Ａとの間に付勢手段たるコイルスプリング１３を配置し、コイルスプリング１３は血液試料室４を挟む位置に配置されているから、平板１，１Ａ同士が平行になるように付勢することができる。さらに、間隙板７の厚みを自由に変更することにより血液試料室４の高さを調整できるから、せん断速度の大きさは、リニアアクチュエータ３による振動体１１の移動速度と間隙板７の厚さの２つで調整することができる。
【００６４】
さらに、実施例上の効果として、本発明による血液細胞の力学的特性測定装置は、血液細胞を含む試料に周期的なせん断速度負荷を加えるための細胞用力学負荷装置と、細胞用力学負荷装置において周期的なせん断速度負荷を加えた状態の血液細胞を含む試料に光を照射するための照射光源部３０と、照射光源部３０により光を照射された血液細胞を含む試料からの透過光または反射光を受光する受光部４０と、受光部４０により受光された光信号データについて解析処理を行って血液細胞の力学的特性を求めるデータ解析処理部５０とを備えるから、血液細胞の変形能の測定の再現性が高められる。また、取付部６，６Ａに平板１，１Ａが着脱可能に固定されるから、血液細胞を含む試料の載置部の構成をディスポーザブル化することができ、血液による感染症のリスクが軽減される。血液細胞の力学的特性測定装置の構成を簡易で精度のよいものとし、日常的な利用に供するものとすることができる。
【実施例２】
【００６５】
図９は本発明の実施例２を示し、上記実施例１と同一部分に同一符号を付して説明する。この例では、左右の間隙板７，７の前後を前後の間隙板７Ａ，７Ａにより連結し、これら前後の間隙板７Ａ，７Ａは、前記血液試料室４の前後に位置する。即ち同一厚さの間隙板７，７，７Ａ，７Ａを枠状に形成して前記血液試料室４の周囲を囲むように構成している。
【００６６】
このように前記血液試料室４の周囲を間隙板７，７，７Ａ，７Ａにより囲むことによって、血液試料室４の試料の漏れを確実に防止することができる。
【００６７】
尚、本発明は、本実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で種々の変形実施が可能である。例えば、実施例では、上側部材及び下側部材を組み込んだ振動体を例示したが、取付部を左右方向に広げて振動体としたり、連結部を左右に広げて振動体にしたり、図２に示したように平板に振動体を一体的に設けてもよい。また、直線往復駆動源を振動体に直接接続しなくても、直線往復駆動源は間接的に振動体を往復駆動するものでもよい。さらに、回転伝達体としてゴムローラを用いたが、一方の往復動を他方に逆方向の往復動に伝達するものであれば、各種のものを用いることができ、例えば対向面にラックを設け、ラックに歯合するギアにより回転伝達体を構成してもよい。また、試料を交換する際、平板と取付部を交換したり、上側部材と下側部材を交換したり、平板のみあるいは平板を含む上側部材と下側部材の少なくとも一部を交換するようにしてもよい。
【符号の説明】
【００６８】
１ 第１平板
１Ａ 第２平板
２ ローラ（回転伝達体）
３ リニアアクチュエータ（直線往復駆動源）
４ 血液試料室（空間）
５，５Ａ 磁石
７ 間隙板
７Ａ 間隙板
８ 連結部
９ 連結杆
１１ 第１振動体
１１Ａ 第２振動体
１６ 第１対向面（第１対向部）
１６Ａ 第２対向面（第２対向部）
１７ 平板振動手段
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含む試料に周期的なせん断速度負荷を加えるための細胞用力学負荷装置において、少なくとも一部が透明な第１平板と、
前記第１平板に対して隙間を隔てて平行に配置されている第２平板と、
前記第１平板と前記第２平板との間の隙間に設けられ、細胞を含む試料を入れる空間と、
前記試料中の細胞に周期的なせん断速度負荷を加えるため前記第１平板及び前記第２平板を逆方向の直線往復動により平行振動させる平板振動手段と、
を備えることを特徴とする細胞用力学負荷装置。
【請求項２】
前記第１平板を設けた第１振動体と、
前記第２平板を設けた第２振動体と、
を備え、
前記平板振動手段は、
前記第１振動体と前記第２振動体の一方を往復駆動する直線往復駆動源と、
前記第１振動体と前記第２振動体の間に配置され、前記第１振動体と前記第２振動体の一方の往復動を他方に伝達して該他方を逆方向に往復動する回転伝達体と、
を備えることを特徴とする請求項１記載の細胞用力学負荷装置。
【請求項３】
前記回転伝達体が前記第１振動体と前記第２振動体の間に挟んで配置したローラであることを特徴とする請求項２記載の細胞用力学負荷装置。
【請求項４】
前記第１振動体と前記第２振動体に相互に平行に配置された第１対向部と第２対向部を設け、
前記第１対向部と前記第２対向部の間に複数の前記回転伝達体を配置したことを特徴とする請求項２記載の細胞用力学負荷装置。
【請求項５】
前記第１平板と前記第２平板の間に介挿されて前記第１平板と前記第２平板の間隔を維持するとともに前記第１平板と前記第２平板の間において前記試料を入れる空間を形成する間隙板と、
前記間隙板を位置固定する位置固定手段と、
を備えることを特徴とする請求項１記載の細胞用力学負荷装置。
【請求項６】
前記間隙板は少なくとも一部が磁性材料からなり、前記第１平板と前記第２平板の外側から作用する磁力により前記間隙板を位置固定することを特徴とする請求項５記載の細胞用力学負荷装置。
【請求項１】
細胞を含む試料に周期的なせん断速度負荷を加えるための細胞用力学負荷装置において、少なくとも一部が透明な第１平板と、
前記第１平板に対して隙間を隔てて平行に配置されている第２平板と、
前記第１平板と前記第２平板との間の隙間に設けられ、細胞を含む試料を入れる空間と、
前記試料中の細胞に周期的なせん断速度負荷を加えるため前記第１平板及び前記第２平板を逆方向の直線往復動により平行振動させる平板振動手段と、
を備えることを特徴とする細胞用力学負荷装置。
【請求項２】
前記第１平板を設けた第１振動体と、
前記第２平板を設けた第２振動体と、
を備え、
前記平板振動手段は、
前記第１振動体と前記第２振動体の一方を往復駆動する直線往復駆動源と、
前記第１振動体と前記第２振動体の間に配置され、前記第１振動体と前記第２振動体の一方の往復動を他方に伝達して該他方を逆方向に往復動する回転伝達体と、
を備えることを特徴とする請求項１記載の細胞用力学負荷装置。
【請求項３】
前記回転伝達体が前記第１振動体と前記第２振動体の間に挟んで配置したローラであることを特徴とする請求項２記載の細胞用力学負荷装置。
【請求項４】
前記第１振動体と前記第２振動体に相互に平行に配置された第１対向部と第２対向部を設け、
前記第１対向部と前記第２対向部の間に複数の前記回転伝達体を配置したことを特徴とする請求項２記載の細胞用力学負荷装置。
【請求項５】
前記第１平板と前記第２平板の間に介挿されて前記第１平板と前記第２平板の間隔を維持するとともに前記第１平板と前記第２平板の間において前記試料を入れる空間を形成する間隙板と、
前記間隙板を位置固定する位置固定手段と、
を備えることを特徴とする請求項１記載の細胞用力学負荷装置。
【請求項６】
前記間隙板は少なくとも一部が磁性材料からなり、前記第１平板と前記第２平板の外側から作用する磁力により前記間隙板を位置固定することを特徴とする請求項５記載の細胞用力学負荷装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−１５４８９２（Ｐ２０１２−１５４８９２Ａ）
【公開日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１６５３２（Ｐ２０１１−１６５３２）
【出願日】平成２３年１月２８日（２０１１．１．２８）
【出願人】（５０４２３７０５０）独立行政法人国立高等専門学校機構 (656)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月２８日（２０１１．１．２８）
【出願人】（５０４２３７０５０）独立行政法人国立高等専門学校機構 (656)
【Ｆターム（参考）】
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