細胞組織増加促進方法及び肌問題改善方法並びにこれらに用いるキット
【課題】自己由来の多血小板血漿（ＰＲＰ）を美容形成の治療剤として用いる場面において、必ずしも高濃度の多血小板血漿（ＰＲＰ）の調製が困難な場合であってもより安定した多血小板血漿（ＰＲＰ）を用いた肌改善方法を提供すること。
【解決手段】患者の肌を改善する方法であって、患者から採血した血液を分離したものから多血小板血漿を精製する工程と、この精製した多血小板血漿と、予め精製された成長因子とを少なくとも含む注入液を混合して作成する工程と、前記注入液を前記患者の肌の問題が生じている箇所に注入する注入工程とを有することを特徴とする肌問題改善方法。なお肌問題の改善のみならず、広く細胞組織増加促進の目的に適用可能である。
【解決手段】患者の肌を改善する方法であって、患者から採血した血液を分離したものから多血小板血漿を精製する工程と、この精製した多血小板血漿と、予め精製された成長因子とを少なくとも含む注入液を混合して作成する工程と、前記注入液を前記患者の肌の問題が生じている箇所に注入する注入工程とを有することを特徴とする肌問題改善方法。なお肌問題の改善のみならず、広く細胞組織増加促進の目的に適用可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、美容形成、形成外科、皮膚科その他肌の問題を取り扱う分野において、組織再生を促進することにより患者の肌に関する問題を改善する方法、及びこれに用いる混合用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
組織再生には、成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：以下「ＧＦ」と表記することがある。）と呼ばれる、細胞の分化を実現することが可能なポリペプチド分子、または他の関連化学物質が大きく関与していることが知られている。成長因子は「増殖因子」とも呼ばれ、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、ヒト内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、骨形成蛋白質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来血管形成増殖因子（ＰＤＡＦ）、血小板由来上皮増殖因子（ＰＤＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）などが挙げられる。
【０００３】
損傷した組織が再生するにあたっては、ヒトの血液中の血小板に内在する成長因子（ＧＦ）が作用することが知られている。血小板は、骨髄中の巨核球（巨大核細胞）の細胞質が破砕したものであり、核を持っておらず、不定形略円盤状の形状を有する。血管が損傷すると、血小板は露出した内皮下組織に粘着し、血管外への血液の流出を防止する役割を果たす。
【０００４】
上述の成長因子の多くは、血液成分中の血小板から放出されることが知られている。こうした背景から、創傷の治癒を促進するために多血小板血漿（Platelet Rich Plasma：以下「ＰＲＰ」ということがある。）を使用する療法がある。多血小板血漿（ＰＲＰ）とは、血小板が濃縮され豊富に含まれる血漿のことをいう。従来の多血小板血漿（ＰＲＰ）の調製方法として例えば、採取した血液にクエン酸ナトリウム等の凝固防止剤を添加し、室温で所定時間放置した後、複数回の遠心分離に処理を行う。一回目の遠心分離（例えば約5,400rpm）によって２層に分離される。上層はＰＰＰ（Platelet Poor Plasma）と呼ばれる画分であり、下層には赤血球及びバフィーコートが含まれる。上層を除去したあと、更に赤血球が分離される条件（例えば約2,400ｒｐｍ）で遠心分離処理を行う。その結果得られる、赤血球を実質的に含まない画分が多血小板血漿（ＰＲＰ）として採取される。
【０００５】
多血小板血漿（ＰＲＰ）には、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来血管形成増殖因子（ＰＤＡＦ）、血小板由来上皮増殖因子（ＰＤＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）などの様々な成長因子（ＧＦ）が含有されていることが知られており、この治癒力を組織再生に活用すべく、種々研究が行われている。
【０００６】
ここで、一般の創傷治癒の過程において、血液の各成分、及びこれらから放出されるサイトカインの働きにつき説明する。一般的には出血・凝固期、炎症期、増殖期、再構築期といった時系列に沿って治癒は進展していく。
【０００７】
出血・凝固期：血管が破綻し出血しているため、血小板が集まり止血する。血管は収縮し止血を助ける。これとともに、血小板からＰＤＧＦ、ＥＧＦなどのサイトカインが放出される。
炎症期：白血球が創内に遊走し、身体の組織に侵入した細菌や異物を取り込むことにより感染予防に寄与する。白血球がマクロファージを遊走させ、マクロファージが創内に浸入し、壊死した組織などを除去する。
増殖期：マクロファージが各種増殖因子を放出する。また血管の新生や線維芽細胞の遊走・増殖、コラーゲンの産生が始まる。
再構築期：上皮細胞が表面を覆う。また線維芽細胞がコラーゲン、マトリックスなどを生成する。また毛細血管が増殖する。
【０００８】
このように、血小板は、創傷箇所の物理的な止血作用において一定の役割を果たしている傍ら、これより放出される各種サイトカインの働きによってダメージを負った組織の再生を促進する働きを有していることが知られている。多血小板血漿（ＰＲＰ）は、文字通り多量の血小板を含んだ分離血液の画分であることから、その中に含まれている血小板が活性化することにより放出される顆粒状の要素の中に、損傷した皮膚組織において足場を構築する物質と、ここで組織の再建をおこなう成長因子（ＧＦ）とが含まれており、これらの働きによって組織は復元する。
【０００９】
このような、多血小板血漿（ＰＲＰ）が有する組織復元能に着目した技術が、例えば下記に示す各特許文献において開示されている。特許文献１には、骨の再生に多血小板血漿（ＰＲＰ）を含んでなる促進剤が開示されている。特許文献２には、筋肉及び／又は骨組織を再生するのに有用な、多血小板血漿を含む半合成の血小板ゲル及びその調製方法が開示されている。また特許文献３には、自己由来の多血小板血漿組成物を用い、哺乳動物での組織の血管新生を促進するための方法及びキットが提示されている。
【特許文献１】特開２００３−５５２３７
【特許文献２】特開２００６−１８１３６５
【特許文献３】特開２００６−２３２８３４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、特許文献１及び特許文献２のように、骨や筋肉の治療に多血小板血漿（ＰＲＰ）を活用する例は記載されているものはあったが、美容形成の分野、特に皮膚、皮下、軟部組織の問題を改善する方法においてこれを活用することを具体的に開示するものは存在しなかった。特に、血小板ゲルやシーラントなど、患部に被覆させて使用する治療剤についての言及はあるものの、これらは特段外相を有さない肌問題の改善について適用することは難しく、問題を有する部位に直接多血小板血漿（ＰＲＰ）を含む治療剤を注入する方法やそのための治療剤はなく、その出現が望まれていた。
【００１１】
殊に、高齢化社会の進展とともに生活の質（ＱＯＬ）が重視され、加齢に伴う肌の問題の改善方法が注目されている。また、美容治療においては安全性が高く、ノーダウンタイムあるいはミニマムダウンタイムであることが治療法として普及するための基礎的要件となっている。そのため、シワやタルミに関する治療に関しては、メスを入れてダウンタイムの発生するような治療よりは、ヒアルロン酸などフィラーによる治療が一般的となってきている。しかしながら、従来のフィラーを用いた治療は、治療終了時には改善するものの、永続性に乏しく、３ヶ月から半年でその効果が無くなってしまうのが欠点であった。
【００１２】
その欠点を補うべく、ＢＳＥなどの感染の心配もない自己ＰＲＰを用いた肌改善の施術がシワ、タルミに対する治療に有効であることが認められてきており、近年美容領域の学会で発表されている。しかしながら、その原理や有効性に関しての基礎的研究がなされていないのが現状であった。さらに、従来のＰＲＰ治療は、ダウンタイムがほとんどなくシワやタルミを改善できるのが利点だが、個人の血液を用いる治療のため、肌改善効果の個人差が生じやすく、安定的な効果が期待できる肌改善方法が希求されている。
【００１３】
加えて、確かに多血小板血漿（ＰＲＰ）それ自体が成長因子（ＧＦ）を含んでおり、これに基づいて組織の再生が促進されるが、その効果を向上させるための技術の開示はなされていなかった。多血小板血漿（ＰＲＰ）は、調製後の時間の経過とともにその効能が低下し、また凝固によってそもそも治療剤としての活用が困難になるという問題があるところ、特許文献３には、自己由来の多血小板血漿（ＰＲＰ）を抗凝固剤やｐＨ調整剤が一体となったキットが提案されている。これは自己由来の多血小板血漿（ＰＲＰ）を処理するに際して求められる迅速性に寄与する技術ではあるが、多血小板血漿（ＰＲＰ）の効能を向上させつつ迅速性を担保するという点については何らの言及もなされていない。
【００１４】
更には、通常の多血小板血漿（ＰＲＰ）を得るための遠心分離過程によって得られる多血小板血漿では必ずしも十分な肌改善、組織生成の効果が得られないケースもあることから、より効果の高い手法が求められていた。
【００１５】
加えて、多血小板血漿（ＰＲＰ）調製の方法にも優劣があり、高濃度の多血小板血漿（ＰＲＰ）の画分を採取するためには、成分毎の精密な分離を行うことが可能な遠心分離機の存在が不可欠だが、かかる要求に応える性能を持ち合わせた遠心分離機は高価であり、美容形成を含め一般の治療現場において広く普及しているとはいえない。そのため、必ずしも濃度が高くない多血小板血漿（ＰＲＰ）、具体的には既述の例におけるＰＰＰもが混在した状態の多血小板血漿（ＰＲＰ）を治療に用いなければならない場面もあり、この際高濃度の多血小板血漿（ＰＲＰ）で期待しうる効能を得られるとは限らない。
【００１６】
そこで本発明は、自己由来の多血小板血漿（ＰＲＰ）を美容形成の治療剤として用いる場面において、必ずしも高濃度の多血小板血漿（ＰＲＰ）の調製が困難な場合であってもより安定した多血小板血漿（ＰＲＰ）を用いた細胞組織増加促進方法、及びこれを応用した肌改善方法を提供することを課題としている。
【００１７】
出願人は、上記課題につき鋭意研究を行った結果、多血小板血漿（ＰＲＰ）に成長因子（ＧＦ）を付加的に添加することにより、個人差のある多血小板血漿（ＰＲＰ）の組織復元効果を補い、安定した効果を得られることを知見するに至った。加えて、多血小板血漿（ＰＲＰ）の採取において、特定の遠心分離条件により遠心分離を行うことにより、従来に比して著しく効果の高い多血小板血漿（ＰＲＰ）画分を得られることを知見するに至った。
【００１８】
更には、得られた多血小板血漿（ＰＲＰ）と成長因子（ＧＦ）とを混合して注入する現実の施術場面において、こうした処理を迅速に行うことができるようにするために、該治療に好適な混合用キットを案出するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記課題を解決すべく、本発明は下記のような構成を有する。
（１）細胞組織の増加を促進する方法であって、患者から採血した血液を分離したものから多血小板血漿を精製する工程と、前記精製された多血小板血漿と、予め精製された成長因子とを少なくとも含む注入液を作成する工程と、前記注入液を前期患者の要処方域に注入する工程とを含むことを特徴とする細胞組織増加促進方法（請求項１）。
（２）前記多血小板血漿は、白血球を多量に含むことを特徴とする（１）に記載の細胞組織増加促進方法（請求項２）。
（３）前記白血球を多量に含む多血小板血漿は、３，９００個／μｌ以上の白血球を含むことを特徴とする（２）に記載の細胞組織増加促進方法（請求項３）。
（４）前記成長因子は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）であることを特徴とする（１）から（３）のいずれかに記載の細胞組織増加促進方法（請求項４）。
（５）上記記載の細胞組織増加促進方法を用いた肌問題改善方法であって、前記要処方域は前記患者の肌問題が生じている箇所であることを特徴とする肌問題改善方法（請求項５）。
（６）前記肌問題は、表皮、真皮、皮下組織及び軟部組織における乾燥、弾力の低下、欠損、減耗を含むことを特徴とする、（５）に記載の肌問題改善方法（請求項６）。
（７）上記記載の細胞組織増加促進方法又は肌問題改善方法に用いられる多血小板血漿と成長因子とを混合して注入するための混合注入キットであって、採血用試験管と、塩化カルシウムが予め封入された第一の真空試験管と、所定量の成長因子が予め封入された第二の真空試験管とを含むことを特徴とする混合注入キット（請求項７）。
（８）上記記載の細胞組織増加促進方法又は肌問題改善方法に用いられる多血小板血漿と成長因子とを混合して注入するための混合注入キットであって、採血用試験管と、塩化カルシウム及び所定量音成長因子が予め封入された真空試験管とを含むことを特徴とする混合注入キット（請求項８）。
【００２０】
本発明の細胞組織増加促進方法によれば、多血小板血漿（ＰＲＰ）の成分が一定でなくとも、補助的に成長因子（ＧＦ）を添加混合して注入することにより、より安定的な細胞組織増加の促進効果が期待できる。特に、自己由来の多血小板血漿（ＰＲＰ）を用いる場合においては、例えば老齢者から採取する場合に必ずしも期待される治療効果が得られないことが予想される。これは加齢とともに細胞活性の低下が進み、老齢者の血小板から放出されるサイトカインの量が若年者のそれと必ずしも同様ではないためである。こうした場合であっても、成長因子（ＧＦ）を補助的に添加混合することにより、より優れた効果が期待できる。かかる細胞増加促進方法は、肌問題の改善においても、問題の生じている部位に直接注入することにより、効果が期待できる。
【００２１】
特に、補助的に添加する成長因子（ＧＦ）としてｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）を加えた際の改善効果が特に高いことが認められた。また、多血小板血漿（ＰＲＰ）の抽出方法については、従来の遠心分離手法において得られる多血小板血漿の画分には白血球が殆ど含まれていなかった。ところが、肌問題の改善においては、上述の一般的創傷治癒過程における炎症期以降のステップを人為的に誘発させることが狙いであるところ、白血球（マクロファージ）の働きが重要である。そこで、所定の条件により得られる白血球含有多血小板血漿（White blood cell-containing platelet-rich plasma：以下「Ｗ−ＰＲＰ」と表示することがある。）を投与することにより、肌問題の改善に著しく寄与することが認められた。
【００２２】
ここで白血球含有多血小板血漿（Ｗ−ＰＲＰ）の含有量としては、１μｌあたり３，９００個以上、好ましくは７，０００個以上の白血球が含有されていることにより、顕著な肌問題改善効果が見られる。
【００２３】
そして、これらの肌問題改善の為の措置は迅速に行われる要請があるところ、本発明の混合用キットによれば、採取した多血小板血漿（ＰＲＰ）を所望の成長因子（ＧＦ）と即座に混合を行うことが可能であるため、治療が滞ることによる多血小板血漿（ＰＲＰ）の不具合（凝固或いは失活）といった問題が生じることを防止することができる。予め成長因子（ＧＦ）が適切な量封入されていることにより、注入直前に添加量の計量等によって手間取ることがない。
【００２４】
なお、本発明における「細胞組織増加促進」とは、本来存在した組織の欠損や減耗のみに限らず、生来的に矮小であった部位の増強など、例えば豊胸術や陰茎増大にも適用の余地がある。また本発明における「肌問題」とは、美容において施術の対象となりうる肌のトラブル、例えば肌のしわやたるみなど、主として老化によって生じる肌の乾燥や弾力の低下、皮脂細胞の萎縮や表情筋の過度の収縮や弛緩などによって起きる美観上の問題をいう。また美観上の問題に限らず、何等かの事故等による欠損、減耗或いは生来からの矮小などの問題も含まれる。
【００２５】
なお、「ｂＦＧＦ」とは塩基性線維芽細胞増殖因子の意味であり、創傷治癒過程の増殖期において線維芽細胞を増殖させるとともに、再構築期に至る過程ではアポトーシスを促進することにより線維芽細胞の数を減らし、瘢痕を軽微化させることが知られている。創傷治療においては散布ないし噴霧投与されるのが一般的であるが、本発明ではこれを多血小板血漿（ＰＲＰ）とともに注入投与する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下では、本発明の具体的な実施形態につき、図面を参照しつつ説明する。
【００２７】
まず、ＰＲＰ及びＷ−ＰＲＰの精製について説明する。ＰＲＰの調整には、１回遠心分離でＰＲＰを精製可能な方法としてカスケードメディカル社製のＰＲＰ分離システムを用いた。これは、採血用試験管の中にポリエステル製のセパレータジェルが封入されているものであり、採血後遠心分離を行うことにより、比重差により所定の試験管内高さに定位する。採血量は９ｍｌで、抗凝固剤にはTri-sodium citrate solutionが用いられている。遠心分離条件は一般的なＰＲＰ抽出手法である２６００回転６分を含め、表１記載の通り、いくつかの方法を行った。遠心分離機はkubota 2410（ロータ半径14.5cm）を用いた。遠心分離後、フィルタ近くの層を１ｍｌ残して上清（platelet poor plasma：ＰＰＰ）を除去した。残った液を混ぜてＰＲＰを得た。なお下記遠心条件は、上述のＰＲＰ分離システムを用いた際の条件であり、２回遠心分離を行う場合、あるいはセパレータジェルの質に応じて適切な遠心条件は変化するものと思われる。
【００２８】
【表１】
【００２９】
＜ＰＲＰ、Ｗ-ＰＲＰの質の解析＞
分離したＰＲＰに対して、血小板（Ｐｔ）、白血球（ＷＢＣ）、赤血球（ＲＢＣ）、フィブリンモノマー複合体、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ-１を測定した。ｂＦＧＦの測定にはＲ＆Ｄ System Inc. (MN. USA)社製、Human FGF basic Immunoassay キットを用いた。ＶＥＧＦの測定には、Ｒ＆Ｄ System Inc. (MN. USA)社製、Human VEGF Immunoassay Kitを用いた。ＩＧＦ−１の測定には株式会社テイエフビ−(TFB,INC. Tokyo. Japan)社製試薬を用いてＩＲＩＡで測定した。また、ゲル化させて内容物をＨＥ染色した。図１は、上記ＨＥ染色を施した（ａ）ＰＲＰ（２６００ｒｐｍ／６ｍｉｎ）、（ｂ）Ｗ−ＰＲＰ（１８００ｒｐｍ／１０ｍｉｎ）、（ｃ）ＰＰＰの成分含有状況を示す写真である。（ａ）ＰＲＰではフィブリンネットワークに濃縮された血小板、多少の有核球（メインは白血球）を認めた。（ｂ）Ｗ-ＰＲＰではフィブリンネットワークに濃縮された血小板、多くの有核球、若干の赤血球を認めた。（ｃ）ＰＰＰではフィブリンネットワークのみ認めた。
【００３０】
＜ＰＲＰ遠心条件に関して＞
表２は、図１において示された各分画のうち、２６００ｒｐｍ／６ｍｉｎの分離条件で得られたＰＲＰ、１８００ｒｐｍ／１０ｍｉｎの分離条件で得られたＷ−ＰＲＰ、及びＰＰＰの成分に関する分析結果である。まず、遠心分離の条件によってＰＲＰに含まれる血小板や白血球が異なることが、前述のように分かった。従来言われている血小板が主体の効果をみるためには、２６００回転６分の遠心分離条件がよく、それに白血球が混在するものの効果を見るためには、１８００回転１０分の遠心条件が望ましいと考え、両方の条件で検討を行った。２６００回転６分の遠心分離条件では、血小板は約３倍に濃縮されており、白血球は０．７倍となっていた。１８００回転１０分では、血小板は5倍に濃縮されており、白血球は１．４倍に濃縮されていた。
【００３１】
【表２】
【００３２】
また、ＰＲＰ, Ｗ-ＰＲＰ, ＰＰＰの内容を分析したところ、ＰＲＰでは血小板の濃縮をメインに認めたが、Ｗ−ＰＲＰでは血小板とともに多数の白血球を認めた。また、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦの放出量もＷ−ＰＲＰの方が多いことがわかった。またＰＰＰには血小板、白血球ともにほとんど含まれていないことが示された。２６００回転６分の遠心分離では従来のＰＲＰが採取可能であり、１８００回転１０分の遠心分離では今回われわれが目的としている白血球含有率の高いＷ-ＰＲＰが採取できた。
【００３３】
＜ＰＲＰ、Ｗ-ＰＲＰのヌードマウス耳介への注入実験＞
つぎに、ＰＲＰ、Ｗ-ＰＲＰの臨床効果を想定して、ヌードマウスの耳介にＰＲＰ、Ｗ-ＰＲＰを注入して組織学的検討をした。また、ｂＦＧＦを添加することによってその効果を増大させることが出来るかを検討した。ＰＲＰの調整には、上述と同様の方法を用いた。活性化には１０％塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）溶液を１０分の１量添加した。得られたＰＲＰをヌードマウスの耳介に０．２ｍｌずつ、３０Ｇ針で局所注入した。また、コントロールとして生食、ＰＰＰ、さらにｂＦＧＦを添加したものに関しても検討した。ｂＦＧＦ添加量は、１、１０、１００μｇ／ｍｌで行った。
【００３４】
注入後２週目で組織学的に検討した。ｂＦＧＦ単独、ｂＦＧＦ＋ＰＰＰ、ｂＦＧＦ＋ＰＲＰは、Ｗ−ＰＲＰ＋ｂＦＧＦ群と比較して優位な組織の増量を認めなかった。
【００３５】
図２は、２週間後のヌードマウスの耳介の様子を示す写真を各条件毎に並べたものである。（ａ）はＰＲＰを注入したもの、（ｂ）はＷ−ＰＲＰを注入したもの、（ｃ）はＷ−ＰＲＰにｂＦＧＦ１００μｇ／ｍｌを添加して注入したもの、（ｄ）はＰＰＰを注入したもの、（ｅ）は生理食塩水を注入したものである。外見上はＰＲＰ群、Ｗ−ＰＲＰ群とＷ−ＰＲＰ＋ｂＦＧＦ群で耳介の肥厚を認めた。
【００３６】
＜組織学的検討＞
図３は、局所注入２週後の耳介先端部位での耳介の横断切片をＨＥ染色処理したものである。各写真の符号は図２におけるものと同一である。この所見では、ＰＲＰ，Ｗ−ＰＲＰ、Ｗ−ＰＲＰ＋１００μｇ/ｍｌ ｂＦＧＦ群では、耳介の肥厚を認めた。とりわけ（ｃ）のＷ−ＰＲＰにｂＦＧＦを添加したものでは他を凌駕する肥厚が認められた。耳介の肥厚の組織部位としては皮膚、皮下組織で著明であった。また、毛根の活性化も認められた。一方、ＰＰＰとコントロールとして生食を注入した群では、耳介の肥厚はほとんど認められなかった。
【００３７】
図４は、耳介先端部から５ｍｍの部位の厚さを比較した対比分析グラフである。各例を比較したところ、コントロール群やＰＰＰ群と比較し、ＰＲＰ群、Ｗ−ＰＲＰ群で肥厚傾向が認められた。またＷ−ＰＲＰ＋ｂＦＧＦ（１０、１００μｇ/ｍｌ）群では、有意に組織の肥厚が認められた。耳介の一番肥厚した部位の厚さの検討（図５）では、Ｗ−ＰＲＰ群とｂＦＧＦ添加Ｗ−ＰＲＰ群で優位差のある耳介の肥厚が認められた。また、ｂＦＧＦ添加群では濃度依存性に耳介の肥厚が認められた。
【００３８】
図６は、局所注入２週後の耳介先端部位での耳介の横断切片をαＳＭＡ染色処理したものである（各写真ごとの符号は図２及び図３と同一である）。また図７は各群におけるα陽性細胞の増加数をグラフ化したものである。αＳＭＡ染色の結果では、ＰＰＰ群とコントロール群に比較し、ＰＲＰ群、Ｗ−ＰＲＰ群にαＳＭＡ陽性細胞数の増加傾向が認められた。また、Ｗ−ＰＲＰ＋ｂＦＧＦ（１０、１００μｇ／ｍｌ）群で優位なαＳＭＡ陽性細胞数の増加を認めた。図７は各群におけるαＳＭＡ陽性細胞数をグラフ化したものである。Ｗ−ＰＲＰ＋ｂＦＧＦ１０群及びＷ−ＰＲＰ＋ｂＦＧＦ１００群において顕著な効果が見られた。αＳＭＡ陽性細胞の増大により、組織を収縮させ、シワやたるみといった肌問題が改善されるという効果が期待される。
【００３９】
以上のヌードマウス耳介への注入実験から、以下の結論が得られる。
（１）組織の増量には、ＰＲＰよりもＷ−ＰＲＰのほうが効果があることが認められた。
（２）組織の増量には、血小板のみならず、白血球の関与が重要であることが認められた。
（３）フィブリネット採血管を用いたＷ−ＰＲＰの作成には、１８００回転、１０分の遠心条件が最適であった。
（４）αＳＭＡ陽性細胞数は、ＰＲＰ、Ｗ−ＰＲＰ、ｂＦＧＦを添加したＷ−ＰＲＰにおいて優位に増加していた。
【００４０】
＜肌問題の改善への適用＞
以上の知見を、人間の肌のしわやたるみに対して適用する場面につき言及する。
人間の肌のしわやたるみの原因は、既述の通り老齢化に伴う肌の乾燥や皮下脂肪の減少、表情筋の過度の収縮や弛緩にあるといわれている。こうした問題を解決するために、老化した細胞の除去、新たな組織の産生が寄与する。一般的な創傷治癒過程における炎症期以降のステップを人為的に誘発することにより、肌組織が適切に増量するためのいわば材料が備わり、長期的な肌問題の改善に寄与するのである。
【００４１】
しわやたるみに対してＰＲＰを用いる場合、単なるＰＲＰでは組織の増量は期待できず、Ｗ−ＰＲＰを用いる方がより優位な組織の増量が期待できる。これは、Ｗ−ＰＲＰに含まれている白血球がマクロファージを誘導し、さらにマクロファージが線維芽細胞を遊走、増殖させることが一因であると推測される。
【００４２】
また組織の肥厚には筋線維芽細胞が関与していると考えられる。組織が肥厚することにより減少していた皮下組織が回復し、しわの改善に繋がるものである。また、潰瘍にＰＲＰを用いるのと異なり、組織を構築しオーギュメンテーションを図るには、足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）が必要であると考えられる。生体由来のスキャホールドとして、フィブリンや血小板糊によるネットワークの形成が重要であると考えられる。
【００４３】
また、Ｗ-ＰＲＰに内在している白血球が周囲や流血中のマクロファージを注入部位に遊走させることも大切であると考えられる。マクロファージは、一般の創傷治癒において修復組織中に多数認められ、そのマクロファージは繊維芽細胞を遊走させて、その遊走してきた繊維芽細胞がコラーゲンを再生させると考えられるからである。つまり、Ｗ-ＰＲＰに含まれている白血球がマクロファージを誘導し、さらにマクロファージが線維芽細胞を遊走、増殖させることが一因であると推測されることから、従来の細胞移植の概念と異なり、サイトカインを放出する細胞を移植することによって、組織の修復に必要な細胞を生体自身から誘導するという新たな手法であるとも考えられる。これらの起序により、シワが改善するのではないかと考えられた。また、繊維芽細胞の中に出現する筋線維芽細胞組織を収縮させることによって、たるみを改善する効果があると考えられる。
【００４４】
Ｗ-ＰＲＰにｂＦＧＦを添加することによって組織のさらなる増量が認められたことから、肌問題の改善にあっては、Ｗ-ＰＲＰはｂＦＧＦの徐放ドナーとしても有用であると思われる。ゼラチンなどを用いてｂＦＧＦを徐放させることでその働きを効果的にしようとの報告があるが、ＢＳＥ問題もあり、ゼラチンをすぐに臨床で用いるのは難しい。外用剤としてのｂＦＧＦ製剤を局所注入用に用いることに関しては、近年縫合創にｂＦＧＦを局所注射することによって創がきれいに治るとの報告や、ゼラチンを徐放ドナーとして局所注射することによってＡＳＯの患肢の血管新生の治療が可能であるとの報告からも、使用量を守れば問題ないと考えられる 。
【００４５】
図８は、人体額部及び眼下部にＷ−ＰＲＰを注入したことの効果を示す図である。（ａ）は注入前、（ｂ）は注入後７月経過時点の写真である。注入は、両下眼瞼及び右前額部（写真左側）について行った。写真からも明らかなように、注入を行った額部の隆起が生じており、陥没が改善されている。下眼瞼においても同様である。
【００４６】
図９は、上記実験を行った人体をＭＲＩにて撮影したものである。（ａ）の左はコントロールであり、右が注入を施したものである。（ｂ）は当該部分の拡大図である。コントロール側では、骨の形態にそった陥凹が皮膚にまで認められるが、注入側では注入部位の皮膚、皮下組織（脂肪組織）、前頭筋の肥厚が認められ、皮膚の陥凹が消失していることが判る。
【００４７】
＜好適な混合注入キット＞
次に、上記の肌問題改善方法に用いるＷ−ＰＲＰを迅速に抽出し、成長因子とともに注入するための混合注入キットについて説明する。図１０（ａ）は、本発明を実施するにあたって好適な混合注入キット１を図示したものである。図１０（ｂ）に示すように、混合注入キット１は採血用試験管２、予め活性剤としての塩化カルシウム３１が封入された第一の真空試験管３、及び予めｂＦＧＦ４１が封入された第二の真空試験管４を含んでいる。
【００４８】
図１１は、図１０に示した混合注入キットを用いた肌問題改善方法の具体的ステップの一例を示したものである。まず、好適なシリンジを用い、肌問題を有する患者から採血用試験管２に採血する（図中ステップ（１）及び（２））。採血はすぐに遠心分離器にかけられる（ステップ（３））。この遠心分離にあたっては、上述のカスケードメディカル社製のＰＲＰ分離システムを用いることができる。所定の分離条件、例えば１８００ｒｐｍ／１０ｍｉｎで遠沈させることにより上澄み部分をＷ−ＰＲＰとして抽出することができる（ステップ（４））。
【００４９】
抽出したＷ−ＰＲＰは、直ちに第一の真空試験管３に移し替えられる。第一の真空試験管３には予め活性剤としての塩化カルシウムが封入されている。これをＷ−ＰＲＰ混合後攪拌することにより、Ｗ−ＰＲＰ内のサイトカインが活性化される（ステップ（５））。さらにこれを第二の真空試験管４へと移し変える（ステップ（６））。第二の真空試験管４には予めｂＦＧＦが封入されており、これと混合攪拌させた後、肌問題を有する患部に注入する。
【００５０】
なお、塩化カルシウムとｂＦＧＦとを第一の真空試験管３と第二の真空試験管４とに分けて封入したのは、ｂＦＧＦは粉体でないとその効能を維持することができないからである。このように、採血試験管２、第一の真空試験管３及び第二の真空試験管４がユニットとして備えられていることにより、迅速な処理が求められる肌問題改善の処置を速やかに行うことができ、肌問題の適切な改善に資する。
【００５１】
なお、本実施例では混合注入キットに包含される構成要素として上記３種の試験管のみとしたが、これに限られず、例えば採血用のシリンジ、注入用のシリンジ及び注射針をキットに含めても良い。或いは、図示しないが、塩化カルシウムと所定量のｂＦＧＦとを一の真空試験管に封入してもよい。この場合ｂＦＧＦ効能を損なわないよう、塩化カルシウムも粉体のものを適用することが望ましい。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】各遠心分離条件毎の成分含有状況を示す写真である。
【図２】局所注入２週間後のヌードマウスの耳介の様子を示す写真を各条件毎に並べたものである。
【図３】局所注入２週後の耳介先端部位での耳介の横断切片をＨＥ染色処理したものである。
【図４】耳介先端部から５ｍｍの部位の厚さを比較した対比分析グラフである。
【図５】耳介の一番肥厚した部位の厚さを比較した対比分析グラフである。
【図６】局所注入２週後の耳介先端部位での耳介の横断切片をαＳＭＡ染色処理したものである。
【図７】各群におけるαＳＭＡ陽性細胞数をグラフ化したものである。
【図８】人体顔部への局所注入の前後を示す写真であり、（ａ）注入前の額部写真である。（ｂ）注入後７月の額部写真である。
【図９】（ａ）局所注入を行った人体頭部の側面ＭＲＩ画像（左は注入後７月、右はコントロール）である。（ｂ）上記の注入部位の拡大図である。
【図１０】本発明の一実施例である混合注入キットの構成を示した図である。
【図１１】本発明の一実施例である混合注入キットを用いた肌問題改善の手順を図示したものである。
【符号の説明】
【００５３】
１ 混合注入キット
２ 採血用試験管
３ 第一の真空試験管
４ 第二の真空試験管
３１ 塩化カルシウム
４１ ｂＦＧＦ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、美容形成、形成外科、皮膚科その他肌の問題を取り扱う分野において、組織再生を促進することにより患者の肌に関する問題を改善する方法、及びこれに用いる混合用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
組織再生には、成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：以下「ＧＦ」と表記することがある。）と呼ばれる、細胞の分化を実現することが可能なポリペプチド分子、または他の関連化学物質が大きく関与していることが知られている。成長因子は「増殖因子」とも呼ばれ、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、ヒト内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、骨形成蛋白質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来血管形成増殖因子（ＰＤＡＦ）、血小板由来上皮増殖因子（ＰＤＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）などが挙げられる。
【０００３】
損傷した組織が再生するにあたっては、ヒトの血液中の血小板に内在する成長因子（ＧＦ）が作用することが知られている。血小板は、骨髄中の巨核球（巨大核細胞）の細胞質が破砕したものであり、核を持っておらず、不定形略円盤状の形状を有する。血管が損傷すると、血小板は露出した内皮下組織に粘着し、血管外への血液の流出を防止する役割を果たす。
【０００４】
上述の成長因子の多くは、血液成分中の血小板から放出されることが知られている。こうした背景から、創傷の治癒を促進するために多血小板血漿（Platelet Rich Plasma：以下「ＰＲＰ」ということがある。）を使用する療法がある。多血小板血漿（ＰＲＰ）とは、血小板が濃縮され豊富に含まれる血漿のことをいう。従来の多血小板血漿（ＰＲＰ）の調製方法として例えば、採取した血液にクエン酸ナトリウム等の凝固防止剤を添加し、室温で所定時間放置した後、複数回の遠心分離に処理を行う。一回目の遠心分離（例えば約5,400rpm）によって２層に分離される。上層はＰＰＰ（Platelet Poor Plasma）と呼ばれる画分であり、下層には赤血球及びバフィーコートが含まれる。上層を除去したあと、更に赤血球が分離される条件（例えば約2,400ｒｐｍ）で遠心分離処理を行う。その結果得られる、赤血球を実質的に含まない画分が多血小板血漿（ＰＲＰ）として採取される。
【０００５】
多血小板血漿（ＰＲＰ）には、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来血管形成増殖因子（ＰＤＡＦ）、血小板由来上皮増殖因子（ＰＤＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）などの様々な成長因子（ＧＦ）が含有されていることが知られており、この治癒力を組織再生に活用すべく、種々研究が行われている。
【０００６】
ここで、一般の創傷治癒の過程において、血液の各成分、及びこれらから放出されるサイトカインの働きにつき説明する。一般的には出血・凝固期、炎症期、増殖期、再構築期といった時系列に沿って治癒は進展していく。
【０００７】
出血・凝固期：血管が破綻し出血しているため、血小板が集まり止血する。血管は収縮し止血を助ける。これとともに、血小板からＰＤＧＦ、ＥＧＦなどのサイトカインが放出される。
炎症期：白血球が創内に遊走し、身体の組織に侵入した細菌や異物を取り込むことにより感染予防に寄与する。白血球がマクロファージを遊走させ、マクロファージが創内に浸入し、壊死した組織などを除去する。
増殖期：マクロファージが各種増殖因子を放出する。また血管の新生や線維芽細胞の遊走・増殖、コラーゲンの産生が始まる。
再構築期：上皮細胞が表面を覆う。また線維芽細胞がコラーゲン、マトリックスなどを生成する。また毛細血管が増殖する。
【０００８】
このように、血小板は、創傷箇所の物理的な止血作用において一定の役割を果たしている傍ら、これより放出される各種サイトカインの働きによってダメージを負った組織の再生を促進する働きを有していることが知られている。多血小板血漿（ＰＲＰ）は、文字通り多量の血小板を含んだ分離血液の画分であることから、その中に含まれている血小板が活性化することにより放出される顆粒状の要素の中に、損傷した皮膚組織において足場を構築する物質と、ここで組織の再建をおこなう成長因子（ＧＦ）とが含まれており、これらの働きによって組織は復元する。
【０００９】
このような、多血小板血漿（ＰＲＰ）が有する組織復元能に着目した技術が、例えば下記に示す各特許文献において開示されている。特許文献１には、骨の再生に多血小板血漿（ＰＲＰ）を含んでなる促進剤が開示されている。特許文献２には、筋肉及び／又は骨組織を再生するのに有用な、多血小板血漿を含む半合成の血小板ゲル及びその調製方法が開示されている。また特許文献３には、自己由来の多血小板血漿組成物を用い、哺乳動物での組織の血管新生を促進するための方法及びキットが提示されている。
【特許文献１】特開２００３−５５２３７
【特許文献２】特開２００６−１８１３６５
【特許文献３】特開２００６−２３２８３４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、特許文献１及び特許文献２のように、骨や筋肉の治療に多血小板血漿（ＰＲＰ）を活用する例は記載されているものはあったが、美容形成の分野、特に皮膚、皮下、軟部組織の問題を改善する方法においてこれを活用することを具体的に開示するものは存在しなかった。特に、血小板ゲルやシーラントなど、患部に被覆させて使用する治療剤についての言及はあるものの、これらは特段外相を有さない肌問題の改善について適用することは難しく、問題を有する部位に直接多血小板血漿（ＰＲＰ）を含む治療剤を注入する方法やそのための治療剤はなく、その出現が望まれていた。
【００１１】
殊に、高齢化社会の進展とともに生活の質（ＱＯＬ）が重視され、加齢に伴う肌の問題の改善方法が注目されている。また、美容治療においては安全性が高く、ノーダウンタイムあるいはミニマムダウンタイムであることが治療法として普及するための基礎的要件となっている。そのため、シワやタルミに関する治療に関しては、メスを入れてダウンタイムの発生するような治療よりは、ヒアルロン酸などフィラーによる治療が一般的となってきている。しかしながら、従来のフィラーを用いた治療は、治療終了時には改善するものの、永続性に乏しく、３ヶ月から半年でその効果が無くなってしまうのが欠点であった。
【００１２】
その欠点を補うべく、ＢＳＥなどの感染の心配もない自己ＰＲＰを用いた肌改善の施術がシワ、タルミに対する治療に有効であることが認められてきており、近年美容領域の学会で発表されている。しかしながら、その原理や有効性に関しての基礎的研究がなされていないのが現状であった。さらに、従来のＰＲＰ治療は、ダウンタイムがほとんどなくシワやタルミを改善できるのが利点だが、個人の血液を用いる治療のため、肌改善効果の個人差が生じやすく、安定的な効果が期待できる肌改善方法が希求されている。
【００１３】
加えて、確かに多血小板血漿（ＰＲＰ）それ自体が成長因子（ＧＦ）を含んでおり、これに基づいて組織の再生が促進されるが、その効果を向上させるための技術の開示はなされていなかった。多血小板血漿（ＰＲＰ）は、調製後の時間の経過とともにその効能が低下し、また凝固によってそもそも治療剤としての活用が困難になるという問題があるところ、特許文献３には、自己由来の多血小板血漿（ＰＲＰ）を抗凝固剤やｐＨ調整剤が一体となったキットが提案されている。これは自己由来の多血小板血漿（ＰＲＰ）を処理するに際して求められる迅速性に寄与する技術ではあるが、多血小板血漿（ＰＲＰ）の効能を向上させつつ迅速性を担保するという点については何らの言及もなされていない。
【００１４】
更には、通常の多血小板血漿（ＰＲＰ）を得るための遠心分離過程によって得られる多血小板血漿では必ずしも十分な肌改善、組織生成の効果が得られないケースもあることから、より効果の高い手法が求められていた。
【００１５】
加えて、多血小板血漿（ＰＲＰ）調製の方法にも優劣があり、高濃度の多血小板血漿（ＰＲＰ）の画分を採取するためには、成分毎の精密な分離を行うことが可能な遠心分離機の存在が不可欠だが、かかる要求に応える性能を持ち合わせた遠心分離機は高価であり、美容形成を含め一般の治療現場において広く普及しているとはいえない。そのため、必ずしも濃度が高くない多血小板血漿（ＰＲＰ）、具体的には既述の例におけるＰＰＰもが混在した状態の多血小板血漿（ＰＲＰ）を治療に用いなければならない場面もあり、この際高濃度の多血小板血漿（ＰＲＰ）で期待しうる効能を得られるとは限らない。
【００１６】
そこで本発明は、自己由来の多血小板血漿（ＰＲＰ）を美容形成の治療剤として用いる場面において、必ずしも高濃度の多血小板血漿（ＰＲＰ）の調製が困難な場合であってもより安定した多血小板血漿（ＰＲＰ）を用いた細胞組織増加促進方法、及びこれを応用した肌改善方法を提供することを課題としている。
【００１７】
出願人は、上記課題につき鋭意研究を行った結果、多血小板血漿（ＰＲＰ）に成長因子（ＧＦ）を付加的に添加することにより、個人差のある多血小板血漿（ＰＲＰ）の組織復元効果を補い、安定した効果を得られることを知見するに至った。加えて、多血小板血漿（ＰＲＰ）の採取において、特定の遠心分離条件により遠心分離を行うことにより、従来に比して著しく効果の高い多血小板血漿（ＰＲＰ）画分を得られることを知見するに至った。
【００１８】
更には、得られた多血小板血漿（ＰＲＰ）と成長因子（ＧＦ）とを混合して注入する現実の施術場面において、こうした処理を迅速に行うことができるようにするために、該治療に好適な混合用キットを案出するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記課題を解決すべく、本発明は下記のような構成を有する。
（１）細胞組織の増加を促進する方法であって、患者から採血した血液を分離したものから多血小板血漿を精製する工程と、前記精製された多血小板血漿と、予め精製された成長因子とを少なくとも含む注入液を作成する工程と、前記注入液を前期患者の要処方域に注入する工程とを含むことを特徴とする細胞組織増加促進方法（請求項１）。
（２）前記多血小板血漿は、白血球を多量に含むことを特徴とする（１）に記載の細胞組織増加促進方法（請求項２）。
（３）前記白血球を多量に含む多血小板血漿は、３，９００個／μｌ以上の白血球を含むことを特徴とする（２）に記載の細胞組織増加促進方法（請求項３）。
（４）前記成長因子は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）であることを特徴とする（１）から（３）のいずれかに記載の細胞組織増加促進方法（請求項４）。
（５）上記記載の細胞組織増加促進方法を用いた肌問題改善方法であって、前記要処方域は前記患者の肌問題が生じている箇所であることを特徴とする肌問題改善方法（請求項５）。
（６）前記肌問題は、表皮、真皮、皮下組織及び軟部組織における乾燥、弾力の低下、欠損、減耗を含むことを特徴とする、（５）に記載の肌問題改善方法（請求項６）。
（７）上記記載の細胞組織増加促進方法又は肌問題改善方法に用いられる多血小板血漿と成長因子とを混合して注入するための混合注入キットであって、採血用試験管と、塩化カルシウムが予め封入された第一の真空試験管と、所定量の成長因子が予め封入された第二の真空試験管とを含むことを特徴とする混合注入キット（請求項７）。
（８）上記記載の細胞組織増加促進方法又は肌問題改善方法に用いられる多血小板血漿と成長因子とを混合して注入するための混合注入キットであって、採血用試験管と、塩化カルシウム及び所定量音成長因子が予め封入された真空試験管とを含むことを特徴とする混合注入キット（請求項８）。
【００２０】
本発明の細胞組織増加促進方法によれば、多血小板血漿（ＰＲＰ）の成分が一定でなくとも、補助的に成長因子（ＧＦ）を添加混合して注入することにより、より安定的な細胞組織増加の促進効果が期待できる。特に、自己由来の多血小板血漿（ＰＲＰ）を用いる場合においては、例えば老齢者から採取する場合に必ずしも期待される治療効果が得られないことが予想される。これは加齢とともに細胞活性の低下が進み、老齢者の血小板から放出されるサイトカインの量が若年者のそれと必ずしも同様ではないためである。こうした場合であっても、成長因子（ＧＦ）を補助的に添加混合することにより、より優れた効果が期待できる。かかる細胞増加促進方法は、肌問題の改善においても、問題の生じている部位に直接注入することにより、効果が期待できる。
【００２１】
特に、補助的に添加する成長因子（ＧＦ）としてｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）を加えた際の改善効果が特に高いことが認められた。また、多血小板血漿（ＰＲＰ）の抽出方法については、従来の遠心分離手法において得られる多血小板血漿の画分には白血球が殆ど含まれていなかった。ところが、肌問題の改善においては、上述の一般的創傷治癒過程における炎症期以降のステップを人為的に誘発させることが狙いであるところ、白血球（マクロファージ）の働きが重要である。そこで、所定の条件により得られる白血球含有多血小板血漿（White blood cell-containing platelet-rich plasma：以下「Ｗ−ＰＲＰ」と表示することがある。）を投与することにより、肌問題の改善に著しく寄与することが認められた。
【００２２】
ここで白血球含有多血小板血漿（Ｗ−ＰＲＰ）の含有量としては、１μｌあたり３，９００個以上、好ましくは７，０００個以上の白血球が含有されていることにより、顕著な肌問題改善効果が見られる。
【００２３】
そして、これらの肌問題改善の為の措置は迅速に行われる要請があるところ、本発明の混合用キットによれば、採取した多血小板血漿（ＰＲＰ）を所望の成長因子（ＧＦ）と即座に混合を行うことが可能であるため、治療が滞ることによる多血小板血漿（ＰＲＰ）の不具合（凝固或いは失活）といった問題が生じることを防止することができる。予め成長因子（ＧＦ）が適切な量封入されていることにより、注入直前に添加量の計量等によって手間取ることがない。
【００２４】
なお、本発明における「細胞組織増加促進」とは、本来存在した組織の欠損や減耗のみに限らず、生来的に矮小であった部位の増強など、例えば豊胸術や陰茎増大にも適用の余地がある。また本発明における「肌問題」とは、美容において施術の対象となりうる肌のトラブル、例えば肌のしわやたるみなど、主として老化によって生じる肌の乾燥や弾力の低下、皮脂細胞の萎縮や表情筋の過度の収縮や弛緩などによって起きる美観上の問題をいう。また美観上の問題に限らず、何等かの事故等による欠損、減耗或いは生来からの矮小などの問題も含まれる。
【００２５】
なお、「ｂＦＧＦ」とは塩基性線維芽細胞増殖因子の意味であり、創傷治癒過程の増殖期において線維芽細胞を増殖させるとともに、再構築期に至る過程ではアポトーシスを促進することにより線維芽細胞の数を減らし、瘢痕を軽微化させることが知られている。創傷治療においては散布ないし噴霧投与されるのが一般的であるが、本発明ではこれを多血小板血漿（ＰＲＰ）とともに注入投与する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下では、本発明の具体的な実施形態につき、図面を参照しつつ説明する。
【００２７】
まず、ＰＲＰ及びＷ−ＰＲＰの精製について説明する。ＰＲＰの調整には、１回遠心分離でＰＲＰを精製可能な方法としてカスケードメディカル社製のＰＲＰ分離システムを用いた。これは、採血用試験管の中にポリエステル製のセパレータジェルが封入されているものであり、採血後遠心分離を行うことにより、比重差により所定の試験管内高さに定位する。採血量は９ｍｌで、抗凝固剤にはTri-sodium citrate solutionが用いられている。遠心分離条件は一般的なＰＲＰ抽出手法である２６００回転６分を含め、表１記載の通り、いくつかの方法を行った。遠心分離機はkubota 2410（ロータ半径14.5cm）を用いた。遠心分離後、フィルタ近くの層を１ｍｌ残して上清（platelet poor plasma：ＰＰＰ）を除去した。残った液を混ぜてＰＲＰを得た。なお下記遠心条件は、上述のＰＲＰ分離システムを用いた際の条件であり、２回遠心分離を行う場合、あるいはセパレータジェルの質に応じて適切な遠心条件は変化するものと思われる。
【００２８】
【表１】
【００２９】
＜ＰＲＰ、Ｗ-ＰＲＰの質の解析＞
分離したＰＲＰに対して、血小板（Ｐｔ）、白血球（ＷＢＣ）、赤血球（ＲＢＣ）、フィブリンモノマー複合体、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ-１を測定した。ｂＦＧＦの測定にはＲ＆Ｄ System Inc. (MN. USA)社製、Human FGF basic Immunoassay キットを用いた。ＶＥＧＦの測定には、Ｒ＆Ｄ System Inc. (MN. USA)社製、Human VEGF Immunoassay Kitを用いた。ＩＧＦ−１の測定には株式会社テイエフビ−(TFB,INC. Tokyo. Japan)社製試薬を用いてＩＲＩＡで測定した。また、ゲル化させて内容物をＨＥ染色した。図１は、上記ＨＥ染色を施した（ａ）ＰＲＰ（２６００ｒｐｍ／６ｍｉｎ）、（ｂ）Ｗ−ＰＲＰ（１８００ｒｐｍ／１０ｍｉｎ）、（ｃ）ＰＰＰの成分含有状況を示す写真である。（ａ）ＰＲＰではフィブリンネットワークに濃縮された血小板、多少の有核球（メインは白血球）を認めた。（ｂ）Ｗ-ＰＲＰではフィブリンネットワークに濃縮された血小板、多くの有核球、若干の赤血球を認めた。（ｃ）ＰＰＰではフィブリンネットワークのみ認めた。
【００３０】
＜ＰＲＰ遠心条件に関して＞
表２は、図１において示された各分画のうち、２６００ｒｐｍ／６ｍｉｎの分離条件で得られたＰＲＰ、１８００ｒｐｍ／１０ｍｉｎの分離条件で得られたＷ−ＰＲＰ、及びＰＰＰの成分に関する分析結果である。まず、遠心分離の条件によってＰＲＰに含まれる血小板や白血球が異なることが、前述のように分かった。従来言われている血小板が主体の効果をみるためには、２６００回転６分の遠心分離条件がよく、それに白血球が混在するものの効果を見るためには、１８００回転１０分の遠心条件が望ましいと考え、両方の条件で検討を行った。２６００回転６分の遠心分離条件では、血小板は約３倍に濃縮されており、白血球は０．７倍となっていた。１８００回転１０分では、血小板は5倍に濃縮されており、白血球は１．４倍に濃縮されていた。
【００３１】
【表２】
【００３２】
また、ＰＲＰ, Ｗ-ＰＲＰ, ＰＰＰの内容を分析したところ、ＰＲＰでは血小板の濃縮をメインに認めたが、Ｗ−ＰＲＰでは血小板とともに多数の白血球を認めた。また、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦの放出量もＷ−ＰＲＰの方が多いことがわかった。またＰＰＰには血小板、白血球ともにほとんど含まれていないことが示された。２６００回転６分の遠心分離では従来のＰＲＰが採取可能であり、１８００回転１０分の遠心分離では今回われわれが目的としている白血球含有率の高いＷ-ＰＲＰが採取できた。
【００３３】
＜ＰＲＰ、Ｗ-ＰＲＰのヌードマウス耳介への注入実験＞
つぎに、ＰＲＰ、Ｗ-ＰＲＰの臨床効果を想定して、ヌードマウスの耳介にＰＲＰ、Ｗ-ＰＲＰを注入して組織学的検討をした。また、ｂＦＧＦを添加することによってその効果を増大させることが出来るかを検討した。ＰＲＰの調整には、上述と同様の方法を用いた。活性化には１０％塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）溶液を１０分の１量添加した。得られたＰＲＰをヌードマウスの耳介に０．２ｍｌずつ、３０Ｇ針で局所注入した。また、コントロールとして生食、ＰＰＰ、さらにｂＦＧＦを添加したものに関しても検討した。ｂＦＧＦ添加量は、１、１０、１００μｇ／ｍｌで行った。
【００３４】
注入後２週目で組織学的に検討した。ｂＦＧＦ単独、ｂＦＧＦ＋ＰＰＰ、ｂＦＧＦ＋ＰＲＰは、Ｗ−ＰＲＰ＋ｂＦＧＦ群と比較して優位な組織の増量を認めなかった。
【００３５】
図２は、２週間後のヌードマウスの耳介の様子を示す写真を各条件毎に並べたものである。（ａ）はＰＲＰを注入したもの、（ｂ）はＷ−ＰＲＰを注入したもの、（ｃ）はＷ−ＰＲＰにｂＦＧＦ１００μｇ／ｍｌを添加して注入したもの、（ｄ）はＰＰＰを注入したもの、（ｅ）は生理食塩水を注入したものである。外見上はＰＲＰ群、Ｗ−ＰＲＰ群とＷ−ＰＲＰ＋ｂＦＧＦ群で耳介の肥厚を認めた。
【００３６】
＜組織学的検討＞
図３は、局所注入２週後の耳介先端部位での耳介の横断切片をＨＥ染色処理したものである。各写真の符号は図２におけるものと同一である。この所見では、ＰＲＰ，Ｗ−ＰＲＰ、Ｗ−ＰＲＰ＋１００μｇ/ｍｌ ｂＦＧＦ群では、耳介の肥厚を認めた。とりわけ（ｃ）のＷ−ＰＲＰにｂＦＧＦを添加したものでは他を凌駕する肥厚が認められた。耳介の肥厚の組織部位としては皮膚、皮下組織で著明であった。また、毛根の活性化も認められた。一方、ＰＰＰとコントロールとして生食を注入した群では、耳介の肥厚はほとんど認められなかった。
【００３７】
図４は、耳介先端部から５ｍｍの部位の厚さを比較した対比分析グラフである。各例を比較したところ、コントロール群やＰＰＰ群と比較し、ＰＲＰ群、Ｗ−ＰＲＰ群で肥厚傾向が認められた。またＷ−ＰＲＰ＋ｂＦＧＦ（１０、１００μｇ/ｍｌ）群では、有意に組織の肥厚が認められた。耳介の一番肥厚した部位の厚さの検討（図５）では、Ｗ−ＰＲＰ群とｂＦＧＦ添加Ｗ−ＰＲＰ群で優位差のある耳介の肥厚が認められた。また、ｂＦＧＦ添加群では濃度依存性に耳介の肥厚が認められた。
【００３８】
図６は、局所注入２週後の耳介先端部位での耳介の横断切片をαＳＭＡ染色処理したものである（各写真ごとの符号は図２及び図３と同一である）。また図７は各群におけるα陽性細胞の増加数をグラフ化したものである。αＳＭＡ染色の結果では、ＰＰＰ群とコントロール群に比較し、ＰＲＰ群、Ｗ−ＰＲＰ群にαＳＭＡ陽性細胞数の増加傾向が認められた。また、Ｗ−ＰＲＰ＋ｂＦＧＦ（１０、１００μｇ／ｍｌ）群で優位なαＳＭＡ陽性細胞数の増加を認めた。図７は各群におけるαＳＭＡ陽性細胞数をグラフ化したものである。Ｗ−ＰＲＰ＋ｂＦＧＦ１０群及びＷ−ＰＲＰ＋ｂＦＧＦ１００群において顕著な効果が見られた。αＳＭＡ陽性細胞の増大により、組織を収縮させ、シワやたるみといった肌問題が改善されるという効果が期待される。
【００３９】
以上のヌードマウス耳介への注入実験から、以下の結論が得られる。
（１）組織の増量には、ＰＲＰよりもＷ−ＰＲＰのほうが効果があることが認められた。
（２）組織の増量には、血小板のみならず、白血球の関与が重要であることが認められた。
（３）フィブリネット採血管を用いたＷ−ＰＲＰの作成には、１８００回転、１０分の遠心条件が最適であった。
（４）αＳＭＡ陽性細胞数は、ＰＲＰ、Ｗ−ＰＲＰ、ｂＦＧＦを添加したＷ−ＰＲＰにおいて優位に増加していた。
【００４０】
＜肌問題の改善への適用＞
以上の知見を、人間の肌のしわやたるみに対して適用する場面につき言及する。
人間の肌のしわやたるみの原因は、既述の通り老齢化に伴う肌の乾燥や皮下脂肪の減少、表情筋の過度の収縮や弛緩にあるといわれている。こうした問題を解決するために、老化した細胞の除去、新たな組織の産生が寄与する。一般的な創傷治癒過程における炎症期以降のステップを人為的に誘発することにより、肌組織が適切に増量するためのいわば材料が備わり、長期的な肌問題の改善に寄与するのである。
【００４１】
しわやたるみに対してＰＲＰを用いる場合、単なるＰＲＰでは組織の増量は期待できず、Ｗ−ＰＲＰを用いる方がより優位な組織の増量が期待できる。これは、Ｗ−ＰＲＰに含まれている白血球がマクロファージを誘導し、さらにマクロファージが線維芽細胞を遊走、増殖させることが一因であると推測される。
【００４２】
また組織の肥厚には筋線維芽細胞が関与していると考えられる。組織が肥厚することにより減少していた皮下組織が回復し、しわの改善に繋がるものである。また、潰瘍にＰＲＰを用いるのと異なり、組織を構築しオーギュメンテーションを図るには、足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）が必要であると考えられる。生体由来のスキャホールドとして、フィブリンや血小板糊によるネットワークの形成が重要であると考えられる。
【００４３】
また、Ｗ-ＰＲＰに内在している白血球が周囲や流血中のマクロファージを注入部位に遊走させることも大切であると考えられる。マクロファージは、一般の創傷治癒において修復組織中に多数認められ、そのマクロファージは繊維芽細胞を遊走させて、その遊走してきた繊維芽細胞がコラーゲンを再生させると考えられるからである。つまり、Ｗ-ＰＲＰに含まれている白血球がマクロファージを誘導し、さらにマクロファージが線維芽細胞を遊走、増殖させることが一因であると推測されることから、従来の細胞移植の概念と異なり、サイトカインを放出する細胞を移植することによって、組織の修復に必要な細胞を生体自身から誘導するという新たな手法であるとも考えられる。これらの起序により、シワが改善するのではないかと考えられた。また、繊維芽細胞の中に出現する筋線維芽細胞組織を収縮させることによって、たるみを改善する効果があると考えられる。
【００４４】
Ｗ-ＰＲＰにｂＦＧＦを添加することによって組織のさらなる増量が認められたことから、肌問題の改善にあっては、Ｗ-ＰＲＰはｂＦＧＦの徐放ドナーとしても有用であると思われる。ゼラチンなどを用いてｂＦＧＦを徐放させることでその働きを効果的にしようとの報告があるが、ＢＳＥ問題もあり、ゼラチンをすぐに臨床で用いるのは難しい。外用剤としてのｂＦＧＦ製剤を局所注入用に用いることに関しては、近年縫合創にｂＦＧＦを局所注射することによって創がきれいに治るとの報告や、ゼラチンを徐放ドナーとして局所注射することによってＡＳＯの患肢の血管新生の治療が可能であるとの報告からも、使用量を守れば問題ないと考えられる 。
【００４５】
図８は、人体額部及び眼下部にＷ−ＰＲＰを注入したことの効果を示す図である。（ａ）は注入前、（ｂ）は注入後７月経過時点の写真である。注入は、両下眼瞼及び右前額部（写真左側）について行った。写真からも明らかなように、注入を行った額部の隆起が生じており、陥没が改善されている。下眼瞼においても同様である。
【００４６】
図９は、上記実験を行った人体をＭＲＩにて撮影したものである。（ａ）の左はコントロールであり、右が注入を施したものである。（ｂ）は当該部分の拡大図である。コントロール側では、骨の形態にそった陥凹が皮膚にまで認められるが、注入側では注入部位の皮膚、皮下組織（脂肪組織）、前頭筋の肥厚が認められ、皮膚の陥凹が消失していることが判る。
【００４７】
＜好適な混合注入キット＞
次に、上記の肌問題改善方法に用いるＷ−ＰＲＰを迅速に抽出し、成長因子とともに注入するための混合注入キットについて説明する。図１０（ａ）は、本発明を実施するにあたって好適な混合注入キット１を図示したものである。図１０（ｂ）に示すように、混合注入キット１は採血用試験管２、予め活性剤としての塩化カルシウム３１が封入された第一の真空試験管３、及び予めｂＦＧＦ４１が封入された第二の真空試験管４を含んでいる。
【００４８】
図１１は、図１０に示した混合注入キットを用いた肌問題改善方法の具体的ステップの一例を示したものである。まず、好適なシリンジを用い、肌問題を有する患者から採血用試験管２に採血する（図中ステップ（１）及び（２））。採血はすぐに遠心分離器にかけられる（ステップ（３））。この遠心分離にあたっては、上述のカスケードメディカル社製のＰＲＰ分離システムを用いることができる。所定の分離条件、例えば１８００ｒｐｍ／１０ｍｉｎで遠沈させることにより上澄み部分をＷ−ＰＲＰとして抽出することができる（ステップ（４））。
【００４９】
抽出したＷ−ＰＲＰは、直ちに第一の真空試験管３に移し替えられる。第一の真空試験管３には予め活性剤としての塩化カルシウムが封入されている。これをＷ−ＰＲＰ混合後攪拌することにより、Ｗ−ＰＲＰ内のサイトカインが活性化される（ステップ（５））。さらにこれを第二の真空試験管４へと移し変える（ステップ（６））。第二の真空試験管４には予めｂＦＧＦが封入されており、これと混合攪拌させた後、肌問題を有する患部に注入する。
【００５０】
なお、塩化カルシウムとｂＦＧＦとを第一の真空試験管３と第二の真空試験管４とに分けて封入したのは、ｂＦＧＦは粉体でないとその効能を維持することができないからである。このように、採血試験管２、第一の真空試験管３及び第二の真空試験管４がユニットとして備えられていることにより、迅速な処理が求められる肌問題改善の処置を速やかに行うことができ、肌問題の適切な改善に資する。
【００５１】
なお、本実施例では混合注入キットに包含される構成要素として上記３種の試験管のみとしたが、これに限られず、例えば採血用のシリンジ、注入用のシリンジ及び注射針をキットに含めても良い。或いは、図示しないが、塩化カルシウムと所定量のｂＦＧＦとを一の真空試験管に封入してもよい。この場合ｂＦＧＦ効能を損なわないよう、塩化カルシウムも粉体のものを適用することが望ましい。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】各遠心分離条件毎の成分含有状況を示す写真である。
【図２】局所注入２週間後のヌードマウスの耳介の様子を示す写真を各条件毎に並べたものである。
【図３】局所注入２週後の耳介先端部位での耳介の横断切片をＨＥ染色処理したものである。
【図４】耳介先端部から５ｍｍの部位の厚さを比較した対比分析グラフである。
【図５】耳介の一番肥厚した部位の厚さを比較した対比分析グラフである。
【図６】局所注入２週後の耳介先端部位での耳介の横断切片をαＳＭＡ染色処理したものである。
【図７】各群におけるαＳＭＡ陽性細胞数をグラフ化したものである。
【図８】人体顔部への局所注入の前後を示す写真であり、（ａ）注入前の額部写真である。（ｂ）注入後７月の額部写真である。
【図９】（ａ）局所注入を行った人体頭部の側面ＭＲＩ画像（左は注入後７月、右はコントロール）である。（ｂ）上記の注入部位の拡大図である。
【図１０】本発明の一実施例である混合注入キットの構成を示した図である。
【図１１】本発明の一実施例である混合注入キットを用いた肌問題改善の手順を図示したものである。
【符号の説明】
【００５３】
１ 混合注入キット
２ 採血用試験管
３ 第一の真空試験管
４ 第二の真空試験管
３１ 塩化カルシウム
４１ ｂＦＧＦ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞組織の増加を促進する方法であって、
患者から採血した血液を分離したものから白血球を含有する多血小板血漿を精製する工程と、
前記精製された多血小板血漿と、予め精製された成長因子とを少なくとも含む注入液を作成する工程と、
前記注入液を前期患者の要処方域に注入する工程と
を含むことを特徴とする細胞組織増加促進方法。
【請求項２】
前記多血小板血漿は、白血球を多量に含むことを特徴とする、請求項１に記載の細胞組織増加促進方法。
【請求項３】
前記白血球を多量に含む多血小板血漿は、３，９００個／μｌ以上の白血球を含むことを特徴とする、請求項２に記載の細胞組織増加促進方法。
【請求項４】
前記成長因子は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）であることを特徴とする、請求項２から請求項４のいずれかに記載の細胞組織増加促進方法。
【請求項５】
請求項１から請求項４に記載の細胞組織増加促進方法を用いた肌問題改善方法であって、
前記要処方域は前記患者の肌問題が生じている箇所であることを特徴とする肌問題改善方法。
【請求項６】
前記肌問題は、表皮、真皮、皮下組織及び軟部組織における乾燥、弾力の低下、欠損、減耗を含むことを特徴とする、請求項５に記載の肌問題改善方法。
【請求項７】
請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の細胞組織増加促進方法又は肌問題改善方法に用いられる多血小板血漿と成長因子とを混合して注入するための混合注入キットであって、
採血用試験管と、
塩化カルシウムが予め封入された第一の真空試験管と、
所定量の成長因子が予め封入された第二の真空試験管と
を含むことを特徴とする混合注入キット。
【請求項８】
請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の細胞組織増加促進方法又は肌問題改善方法に用いられる多血小板血漿と成長因子とを混合して注入するための混合注入キットであって、
採血用試験管と、
塩化カルシウム及び所定量音成長因子が予め封入された真空試験管と
を含むことを特徴とする混合注入キット。
【請求項１】
細胞組織の増加を促進する方法であって、
患者から採血した血液を分離したものから白血球を含有する多血小板血漿を精製する工程と、
前記精製された多血小板血漿と、予め精製された成長因子とを少なくとも含む注入液を作成する工程と、
前記注入液を前期患者の要処方域に注入する工程と
を含むことを特徴とする細胞組織増加促進方法。
【請求項２】
前記多血小板血漿は、白血球を多量に含むことを特徴とする、請求項１に記載の細胞組織増加促進方法。
【請求項３】
前記白血球を多量に含む多血小板血漿は、３，９００個／μｌ以上の白血球を含むことを特徴とする、請求項２に記載の細胞組織増加促進方法。
【請求項４】
前記成長因子は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）であることを特徴とする、請求項２から請求項４のいずれかに記載の細胞組織増加促進方法。
【請求項５】
請求項１から請求項４に記載の細胞組織増加促進方法を用いた肌問題改善方法であって、
前記要処方域は前記患者の肌問題が生じている箇所であることを特徴とする肌問題改善方法。
【請求項６】
前記肌問題は、表皮、真皮、皮下組織及び軟部組織における乾燥、弾力の低下、欠損、減耗を含むことを特徴とする、請求項５に記載の肌問題改善方法。
【請求項７】
請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の細胞組織増加促進方法又は肌問題改善方法に用いられる多血小板血漿と成長因子とを混合して注入するための混合注入キットであって、
採血用試験管と、
塩化カルシウムが予め封入された第一の真空試験管と、
所定量の成長因子が予め封入された第二の真空試験管と
を含むことを特徴とする混合注入キット。
【請求項８】
請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の細胞組織増加促進方法又は肌問題改善方法に用いられる多血小板血漿と成長因子とを混合して注入するための混合注入キットであって、
採血用試験管と、
塩化カルシウム及び所定量音成長因子が予め封入された真空試験管と
を含むことを特徴とする混合注入キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００９−２３５００４（Ｐ２００９−２３５００４Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８４５９５（Ｐ２００８−８４５９５）
【出願日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者名 ：第１６回日本形成外科学会基礎学術集会事務局 刊行物名 ：第１６回日本形成外科学会基礎学術集会プログラム・抄録集 発行年月日：平成１９年１０月１１日
【出願人】（５０１３４５６６６）ジェイ・ヒューイット株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者名 ：第１６回日本形成外科学会基礎学術集会事務局 刊行物名 ：第１６回日本形成外科学会基礎学術集会プログラム・抄録集 発行年月日：平成１９年１０月１１日
【出願人】（５０１３４５６６６）ジェイ・ヒューイット株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
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