細胞表面にケイ酸層を備える微生物、およびその作製方法
【課題】本発明は、細胞表面にケイ酸層を備え、且つ野生株に比して耐酸性が向上した微生物、およびその作製方法を提供する。
【解決手段】本発明の微生物の作製方法は、微生物の細胞表面にケイ酸からなるケイ酸層を形成するケイ酸層形成工程を含む。例えば、微生物が胞子を形成し得る微生物である場合において、上記ケイ酸層形成工程は、ケイ酸および亜鉛を含む胞子形成培地を用いて微生物を培養する工程である。
【解決手段】本発明の微生物の作製方法は、微生物の細胞表面にケイ酸からなるケイ酸層を形成するケイ酸層形成工程を含む。例えば、微生物が胞子を形成し得る微生物である場合において、上記ケイ酸層形成工程は、ケイ酸および亜鉛を含む胞子形成培地を用いて微生物を培養する工程である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞表面にケイ酸層を備える微生物、およびその作製方法を提供する。本発明にかかる微生物は野生株に比して耐酸性が向上している。それゆえ、本発明は微生物の耐酸性を向上させる方法をも包含する。さらに本発明は上記微生物の代表的な利用例をも提供する。
【背景技術】
【０００２】
近年、乳酸菌等の善玉菌を食品として摂取し、これによって腸内環境の改善を図ることを目的とするプロバイオティクスが注目されている。プロバイオティクスを行うためには乳酸菌等の善玉菌を生きたまま腸まで送り届けることが重要である。しかし、善玉菌をそのまま摂取した場合、胃酸の影響により摂取した菌体のほとんどが死滅してしまうために、期待する効果が得られない場合がある。このため、耐酸性菌の使用や、乾燥菌体を耐酸性物質でコートする方法が採用されている。例えば、特許文献１には生菌の保存安定性が高く、かつ胃酸耐性を有する乳酸菌錠剤を製造すべく、乳酸菌の生菌乾燥粉末と、デンプン、糖類、セルロース類、無機ケイ酸化合物、タルク、ポリビニルピロリドン、ワックスおよびステアリン酸マグネシウムからなる群から選ばれる１種類以上の添加剤とを混合し、乾式直接打錠法等により製造した錠剤に、胃酸耐性のある腸溶性物質でコーティングすることが開示されている。ここで上記添加剤は錠剤の物性および乳酸菌の保存安定性を高めるために使用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平４−４１４３４号公報（公開日：平成４（１９９２）年２月１２日）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１に記載された技術では、乳酸菌を含む錠剤を、胃酸耐性のある腸溶性物質でコーティングしているに過ぎず、乳酸菌自体の耐酸性が向上しているわけではない。したがって、錠剤が腸へ移行する過程においてコーティングが剥離してしまう場合がある。この場合に、腸へ移行した時点では乳酸菌の生菌率が低下してしまう場合がある。よって、特許文献１に記載された技術では、十分な効果が得られない場合がある。
【０００５】
また微生物の耐酸性を向上させることは、上記プロバイオティクスの分野のみで求められるわけではない。例えば微生物を用いた浄水処理は、低ｐＨの条件下で行われる場合があり、この場合に微生物の耐久性が浄水処理能力に大きく影響する。よって、微生物を用いた浄水処理においても微生物の耐酸性を向上させることが求められる。しかし、特許文献１に記載された技術は、微生物からなる錠剤を耐酸性物質でコーティングする技術であるため、浄水処理への応用を考えた場合、耐酸性物質でコーティングされた錠剤を原水中へ添加した直後からコーティングが剥離し、微生物自体が原水中へ露出することになる。この場合、微生物自体の耐酸性が向上しているわけではないため、低ｐＨの原水中ではすぐに微生物が死滅してしまい、浄水処理の効率がすぐに低下してしまう。それゆえ、特許文献１に記載された技術は浄水処理の分野には適さないといえる。つまり特許文献１に記載された技術は汎用性にかけるという問題点がある。
【０００６】
したがって、微生物の耐酸性を向上させる技術として、十分な実効性と高い汎用性とを持ち合わせた技術が求められている。本発明はこのような課題を解決することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、Bacillus属細菌を、ケイ酸を含む培地で培養したところ、表面のouter coat（以下、適宜「ＯＣ」という）にケイ酸からなる層（「ケイ酸層」という）を備えた胞子が生成され、この胞子は、ケイ酸層を備えていない胞子に比して高い耐酸性を有することを見出した。このことは、ケイ酸で細菌表面を被覆する、すなわち微生物の細胞表面にケイ酸層を形成することにより耐酸性微生物を作製することが可能になることを示している。このようにして得られた微生物は、細胞表面にケイ酸層を備えているため、結果として微生物自体の耐酸性が向上している。それゆえ当該微生物をプロバイオティクスの分野に用いた場合は、安定した胃酸耐性を微生物が発揮し、所望の効果が得られやすくなる。また当該微生物を浄水処理に用いた場合であっても、微生物自体の耐酸性が向上しているために低ｐＨ条件下においても高い耐久性を当該微生物が有するといえ、その結果、効率よく浄水処理を行うことができるといえる。本発明は、上記新規知見により完成されたといえる。すなわち本発明は、上記課題を解決するために以下の発明を包含する。
【０００８】
本発明にかかる微生物は、細胞表面にケイ酸からなるケイ酸層を備える生菌であり、
且つ耐酸性が野生株に比して向上していることを特徴としている。
【０００９】
また本発明にかかる微生物は、細菌であってもよい。
【００１０】
一方、本発明にかかる方法は、上記本発明にかかる微生物を作製するための方法であって、微生物の細胞表面にケイ酸からなるケイ酸層を形成するケイ酸層形成工程を含むことを特徴としている。
【００１１】
また本発明にかかる方法において、上記微生物は細菌であってもよい。
【００１２】
また本発明にかかる方法において、上記微生物が胞子を形成し得る微生物である場合に、上記ケイ酸層形成工程は、ケイ酸および亜鉛を含む胞子形成培地を用いて微生物を培養する工程であってもよい。この時、上記胞子形成培地は、オルトケイ酸換算で１００μｇ/ｍｌ以上のケイ酸を含む胞子形成培地であることが好ましい。
【００１３】
また本発明にかかる方法において、上記ケイ酸層形成工程は、微生物の細胞表面にケイ酸重合体を形成させる工程であってもよい。
【００１４】
一方、本発明は、微生物の耐酸性を野生株に比して向上させる方法をも包含する。かかる方法は、微生物の細胞表面に、ケイ酸からなるケイ酸層を形成するケイ酸層形成工程を含むことを特徴としている。この時、上記微生物は、細菌であってもよい。
【００１５】
また本発明にかかる方法において、上記微生物が胞子を形成し得る微生物である場合に、上記ケイ酸層形成工程は、ケイ酸および亜鉛を含む胞子形成培地を用いて微生物を培養する工程であってもよい。この時、上記胞子形成培地は、オルトケイ酸換算で１００μｇ/ｍｌ以上のケイ酸を含む胞子形成培地であることが好ましい。
【００１６】
また上記ケイ酸層形成工程は、微生物の細胞表面にケイ酸重合体を形成させる工程であってもよい。
【００１７】
一方、本発明は上記本発明にかかる微生物を含む生菌製剤、食品をも包含する。さらに本発明は上記本発明にかかる微生物を用いることを特徴とする浄水方法をも包含する。
【発明の効果】
【００１８】
上記のように本発明によれば、野生株に比して耐酸性が向上した微生物を提供することができる。本発明によって得られた微生物は、細胞表面にケイ酸層を備えているため、結果として微生物自体の耐酸性が向上している。それゆえ当該微生物をプロバイオティクスの分野のみならず、浄水処理やその他の広範な分野において奏効する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ｎｏ．６４株のＳｉ＋胞子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像（図１（ａ））、およびＴＥＭ-ＥＤＸによる元素分析を行った結果（図１（ｂ））を示す図である。
【図２】Ｎｏ．６４株を、１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）が添加されたＲ２Ａ培地、または１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）が添加されたｍＲ２Ａ培地で培養した際の、吸光度（波長６００ｎｍ）の経時変化および培養上清中のケイ酸濃度の経時変化を示すグラフ（図２（ａ））、並びに菌体の顕微鏡像（図２（ｂ））である。
【図３】１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したＲ２Ａ培地、１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したｍＲ２Ａ培地、または１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したｍＲ２Ａ培地から各微量金属（Ｆｅ、Ｃａ、Ｚｎ、Ｍｎ）をそれぞれ除去したｍＲ２Ａ培地（それぞれ「ｍＲ２Ａ（−Ｆｅ）」、「ｍＲ２Ａ（−Ｃａ）」、「ｍＲ２Ａ（−Ｚｎ）」、「ｍＲ２Ａ（−Ｍｎ）」と表記）をそれぞれ用いて、Ｎｏ．６４株を培養した際の、培養上清中のケイ酸濃度の経時変化を示すグラフである。図３（ａ）はｍＲ２Ａを用いた場合の結果、（ｂ）はＲ２Ａを用いた場合の結果、（ｃ）はｍＲ２Ａ（−Ｆｅ）を用いた場合の結果、（ｄ）はｍＲ２Ａ（−Ｃａ）を用いた場合の結果、（ｅ）ｍＲ２Ａ（−Ｚｎ）を用いた場合の結果、（ｆ）はｍＲ２Ａ（−Ｍｎ）を用いた場合の結果をそれぞれ示す。
【図４】１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したｍＲ２Ａ培地、またはケイ酸を添加していないｍＲ２Ａ培地をそれぞれ用いて、Ｎｏ．６４株を培養した際に形成された胞子について、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察およびＳＥＭ-ＥＤＸにより元素分析を行った結果を示す。図４（ａ）はケイ酸を添加していないｍＲ２Ａ培地で培養して得られた胞子の結果、（ｂ）はケイ酸を添加したｍＲ２Ａ培地で培養して得られた胞子の結果をそれぞれ示す。
【図５】図５（ａ）および（ｃ）はＮｏ．６４株のＳｉ−胞子のＴＥＭ像であり、図５（ｂ）および（ｄ）はＮｏ．６４株のＳｉ＋胞子のＴＥＭ像である。
【図６】図６（ａ）は図５（ａ）の四角部分の拡大図であり、図６（ｂ）は図５（ｂ）の四角部分の拡大図である。
【図７】図７（ａ）はＮｏ．６４株のＳｉ−胞子のＴＥＭ像、（ｂ）はＮｏ．６４株のＳｉ−胞子についてＴＥＭ-ＥＤＸにより元素分析を行った結果、（ｃ）はＮｏ．６４株のＳｉ＋胞子のＴＥＭ像、（ｄ）はＮｏ．６４株のＳｉ＋胞子についてＴＥＭ-ＥＤＸにより元素分析を行った結果である。
【図８】塩酸耐性試験の結果を示すグラフであり、図８（ａ）はＮｏ．６４株のＳｉ±胞子の結果、（ｂ）は１５３０５株のＳｉ±胞子の結果、（ｃ）は１０１２３５株のＳｉ±胞子の結果をそれぞれ示す。
【図９】図９（ａ）はＮｏ．６４株のＳｉ±胞子について硫酸耐性試験を行った結果を示すグラフであり、図９（ｂ）はＮｏ．６４株のＳｉ±胞子について硝酸耐性試験の結果を示すグラフである。
【図１０】図１０（ａ）はＮｏ．２２１株のＳｉ±胞子について塩酸耐性試験の結果を示すグラフであり、図１０（ｂ）はＮｏ．２２１株の胞子について、Ｓｉの蓄積量と塩酸耐性との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。また、本明細書中に記載された公知文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【００２１】
＜１.本発明にかかる微生物およびその利用例＞
本発明にかかる微生物は、その細胞表面にケイ酸からなるケイ酸層を備える生菌であり、且つ耐酸性が野生株に比して向上していることを特徴としている。ここで本明細書における「微生物」とは、微生物に分類される生物であれば特に限定されるものではなく、細菌等の原核生物、酵母類、カビ類、担子菌等の真核生物であってもよく、また単細胞生物であっても多細胞生物であってもよい。「微生物」の定義については、例えば「生化学辞典 第２版 東京科学同人」が参照される。ただし本発明は微生物の耐酸性を向上させることを目的としているため、耐酸性を向上させることが求められる微生物が本発明において好ましく適用される。なお、本明細書における「微生物」には、その休眠細胞である「胞子」が含まれる。本発明は胞子表面にケイ酸層を備える場合も含まれる。
【００２２】
ここで、本発明に好ましく適用される微生物としては特に限定されるものではないが、例えば乳酸菌類（ラクトバチルス属（Lactobacillus属）細菌、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium属）細菌、ストレプトコッカス属（Streptococcus属）細菌）、バチルス属（Bacillus属）細菌、クロストリジウム属(Clostridium属)、シュードモナス属（Pseudomonas属）細菌などが挙げられる。乳酸菌類はそれを摂取することで腸内環境を整えることが知られている。バチルス属細菌であるバチルス・ナットウ（Bacillus natto）は例えば整腸剤として利用されている。またバチルス属細菌は、浄水処理法の一つである活性汚泥法において使用されている微生物であり、ｐＨを低下させることでバチルス属菌の優占化が進み、浄水処理効率が高まるとされている（参考文献：防菌防黴誌, Vol.27, No. 7, pp431-440, 1999）。またバチルス・シューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)は、人体や環境に安全な生物農薬、微生物殺虫剤（ＢＴ剤）として、世界各国で使用されているために、本発明が好ましく適用され得る。なお、バチルス属細菌は、栄養飢餓時に胞子を作製することが知られている。
【００２３】
本発明にかかる微生物は、その細胞表面にケイ酸からなるケイ酸層を備えている。ケイ酸層を細胞表面に備えるとは、微生物が外界と接触している細胞表面にケイ酸が層状に存在するようになっていることを意味する。換言すれば微生物の表面がケイ酸によって被覆（コート）されている状態を意味する。かかるケイ酸層が微生物の外界に存在する酸に対するバリアとなり、耐酸性が当該微生物において発揮されることとなる。それゆえ、耐酸性をより強化する観点から、微生物の細胞表面のできるだけ大部分がケイ酸層で被覆されていることが好ましく、微生物の細胞表面の１００％がケイ酸層で被覆されていることが最も好ましいといえる。
【００２４】
図１にバチルス・セレウス（Bacillus cereus）およびバチルス・シューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）の近縁種と同定されたバチルス属（Bacillus属）細菌 Ｎｏ．６４株（以下「Ｎｏ．６４株」という）を、ケイ酸をオルトケイ酸換算で１００μｇ/ｍｌ含む胞子形成培地（改変Ｒ２Ａ培地：0.05% 酵母エキス、0.05% ペプトン、0.05% カザミノ酸、0.05% グルコース、0.05% 可溶性デンプン、0.03% K2HPO4、0.005% MgSO4・7H2O、0.03% ピルビン酸ナトリウム、0.2 mM CaCl2、0.01 mM MnCl2・4H2O、0.05 mM ZnCl2、0.05 mM FeSO4・7H2O 、pH 7.2）で培養した際に得られた胞子の切片の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像（図１（ａ））およびＴＥＭ-ＥＤＸによって元素分析を行った結果（図１（ｂ））を示す。図１（ｂ）におけるドットがケイ素（ケイ酸）を示している。図１（ａ）および（ｂ）によれば、Ｎｏ．６４株の胞子表面のouter coat（ＯＣ）にケイ素（ケイ酸）が層状に局在していることがわかる。つまりＮｏ．６４株の胞子は、その細胞表面であるＯＣにケイ酸層を備えていることが確認された。
【００２５】
図１においては胞子を用いて本発明にかかる微生物の一実施形態を説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、胞子でない形態の微生物の場合、細胞膜や細胞壁の内側またはこれらの外界側にケイ酸層が形成されている態様であってもよい。
【００２６】
本発明にかかる微生物は、死滅した微生物を除く、生きた微生物（生菌）であり、休眠状態の細胞（胞子）も含まれる。生菌であるか否かは、微生物を培養した際に増殖するかどうかで判断することができる。
【００２７】
また本発明にかかる微生物は耐酸性が野生株に比して向上していることを特徴としている。耐酸性が野生株に比して向上しているか否かの判断は、後述する実施例における耐酸性試験によって実施され得る。すなわち、ケイ酸層を備えていない微生物（野生株）と、ケイ酸層を備えている微生物（本発明にかかる微生物）とをそれぞれ酸溶液中で一定時間保持した後の生存率を比較し、ケイ酸層を備えている微生物（本発明にかかる微生物）の生存率がケイ酸層を備えていない微生物（野生株）の生存率に比して高くなっていれば、野生株に比して耐酸性が向上していると判断できる。
【００２８】
本発明にかかる微生物の利用例については特に限定されるものではないが、例えばプロバイオティクス分野への利用、浄水処理への利用、微生物製剤への利用が挙げられる。プロバイオティクスへの応用を考えた場合、微生物そのものを食品や生菌製剤として利用することが可能である。本発明にかかる微生物からなる食品を製造する場合は、微生物の菌体そのものを食品として利用してもよいし、当該微生物を食品に添加してもよい。食品への添加量は特に限定されるものではなく、微生物による効果や、食品の物性、食味などを考慮して適宜決定すればよい。また本発明にかかる微生物が乳酸菌類である場合、当該微生物を用いて原料を乳酸発行させることにより、ヨーグルトなどの乳製品を製造すればよい。上記乳製品は従来公知の乳製品の製造方法に準じて製造され得る。この際に使用する微生物の性質に応じて乳製品の製造条件は、適宜変更され得る。
【００２９】
また生菌製剤として利用する場合、微生物の培養菌体そのものを生菌製剤としてもよいし、微生物の乾燥菌体を生菌製剤としてもよい。本発明にかかる生菌製剤は、その効果を阻害しない、他の成分（例えば、薬学的に受容可能なキャリア等）をさらに含有してもよい。ここで、上記「薬学的に受容可能なキャリア」について以下に説明する。本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」（以下、単に「キャリア」ともいう）とは、医薬、または動物薬のような農薬を製造するときに、処方を補助することを目的として用いられる物質であって、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。さらに、本発明にかかる生菌製剤を受容した個体において毒性が無く、且つキャリア自体は有害な抗体の産生を誘導しないものが意図される。
【００３０】
上記キャリアとしては、製剤素材として使用可能な各種有機または無機のキャリア物質が用いられる。例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤等；防腐剤；抗酸化剤；安定剤；矯味矯臭剤等として配合されるが、本発明はこれらに限定されない。
【００３１】
上記「賦形剤」としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ-マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、デンプン、結晶セルロース等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００３２】
上記「滑沢剤」としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ワックス、タルク、コロイドシリカ等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００３３】
上記「結合剤」としては、例えば、α化デンプン、メチルセルロース、結晶セルロース、白糖、Ｄ-マンニトール、トレハロース、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００３４】
上記「崩壊剤」としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００３５】
上記「溶剤」としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、トリカプリリン等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００３６】
上記「溶解補助剤」としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ-マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００３７】
上記「懸濁剤」としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、あるいは、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００３８】
上記「等張化剤」としては、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ-マンニトール等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００３９】
上記「緩衝剤」としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００４０】
上記「防腐剤」としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００４１】
上記「抗酸化剤」としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００４２】
また、上記安定剤、矯味矯臭剤としては、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００４３】
本発明にかかる生菌製剤の剤型としては、例えば、粉剤、顆粒剤、錠剤、リポソーム、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、散剤等の固形製剤や、シロップ剤等の液状製剤とすることができる。
【００４４】
上記「液状製剤」は、上記キャリアとして、例えば、水；グリセロール、グリコール、ポリエチレングリコール等の有機溶媒；これらの有機溶媒と水との混合物等を用いて、製薬分野において通常用いられる方法で製造することができる。また、上記液状製剤は、さらに、溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、安定剤等を含んでいてもよい。
【００４５】
上記「固形製剤」は、上記キャリアとして、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤等を用いて、製薬分野において通常用いられる方法で製造することができる。
【００４６】
かかる経口剤を調製する際には、目的に応じて、潤滑剤、流動性促進剤、着色剤、香料等をさらに配合してもよい。
【００４７】
本発明にかかる生菌製剤は、単独で投与されてもよいし、他の薬剤と併用して投与されてもよい。併用して投与される方法としては、例えば、他の薬剤との混合物として同時に投与されてもよいし、他の薬剤とは別の薬剤として同時にもしくは並行して投与されてもよいし、あるいは経時的に投与されてもよいが、本発明はこれに限定されない。また、本発明にかかる生菌製剤が１日あたりに投与される回数は特に限定されるものではない。
【００４８】
また本発明にかかる微生物を浄水処理に利用する場合は、従来公知の方法において本発明にかかる微生物を利用すればよい。こうすることで、本発明にかかる浄水方法が構成される。なおその運転条件は、本発明の微生物の浄水処理能力に応じて適宜変更され得る。例えば本発明にかかる微生物がバチルス属細菌である場合は、前述の活性汚泥法において使用することができる。
【００４９】
＜２.本発明にかかる微生物の作製方法および微生物の耐酸性向上させるための方法＞
次に上述の本発明にかかる微生物の作製方法の一実施形態を説明する。ただし、本発明にかかる微生物は以下に説明する方法によって得られるものに限定されるものではない。なお、本発明にかかる微生物の作製方法により得られる微生物は、野生株に比して耐酸性が向上した微生物である。よって本発明は微生物の耐酸性を野生株に比して向上させる方法をも包含するといえる。本発明にかかる微生物の作製方法と、本発明にかかる微生物の耐酸性を野生株に比して向上させる方法とはその工程が共通しているため、本項では本発明にかかる微生物の作製方法（以下「本発明の作製方法」という）のみを説明する。本発明にかかる微生物の耐酸性を野生株に比して向上させる方法の説明は、本発明の作製方法の説明を援用することとする。また本発明の作製方法における説明と、上述の本発明にかかる微生物の説明とにおいて共通する項目については、本発明にかかる微生物の説明を援用する。
【００５０】
本発明の作製方法は、本発明にかかる微生物を作製するための方法であって、微生物の細胞表面にケイ酸からなるケイ酸層を形成するケイ酸層形成工程を含むことを特徴としている。このケイ酸層形成工程は、微生物の細胞表面にケイ酸層を形成し得る方法であれば特に限定されるものではない。以下にケイ酸層形成工程の一例として、微生物が胞子を形成し得る微生物（例えば芽胞細菌）である場合について説明する。
【００５１】
後述する実施例に示すように、胞子を形成し得る微生物の一例としてバチルス属細菌を用い、ケイ酸をオルトケイ酸換算で１００μｇ/ｍｌ含む胞子形成培地（改変Ｒ２Ａ培地：0.05% 酵母エキス、0.05% ペプトン、0.05% カザミノ酸、0.05% グルコース、0.05% 可溶性デンプン、0.03% K2HPO4、0.005% MgSO4・7H2O、0.03% ピルビン酸ナトリウム、0.2 mM CaCl2、0.01 mM MnCl2・4H2O、0.05 mM ZnCl2、0.05 mM FeSO4・7H2O 、pH 7.2）で培養したところ、図１に示したような、胞子のＯＣにケイ酸層を備える胞子を作製することに成功した。そして、このようにして得られた胞子は、野生株の胞子に比して耐酸性が向上していた。本発明者らの検討によれば、上記のようにして培養した場合、胞子を形成する際に培地中に含まれるケイ酸を取り込んで胞子のＯＣに蓄積することがわかった。さらに培地中に亜鉛（Ｚｎ）が含まれることで、ＯＣに蓄積されたケイ酸が安定化するということを見出だした。
【００５２】
ここで、本発明の方法で使用する胞子形成培地とは、胞子を形成し得る微生物が胞子を形成することができる要件を満たす培地であれば特に限定されるものではない。一般に胞子は微生物が飢餓状態に陥った場合に形成されるために、飢餓培養し得るような培地であることが好ましい。飢餓培養し得る培地としては、例えば最小培地が挙げられる。なお胞子形成培地の組成については、微生物毎に異なっている。したがって、微生物の種類に応じて適宜最適な培地組成を選択すればよい。例えば、Bacillus subtilisにおいては2×SG培地（Beef extract 6g, ペプトン10g, KCl 2g, MgSO4・7H2O 0.5g, CaCl2 22mg, MnCl2・4H2O 2mg, ZnCl27mg, FeSO4・7H2O 14mg per litter water）、Bacillus cereusグループのバクテリアにおいては、一般的な複合培地にカルシウム、マンガン、亜鉛、鉄などの微量金属（例えば、CaCl222mg, MnCl2・4H2O 2mg, ZnCl2 7mg, FeSO4・7H2O 14mg per litter程度）を添加した培地を用いることで胞子形成が促進される。
【００５３】
上記胞子形成培地に含まれているケイ酸の濃度は、微生物が取り込んでケイ酸を形成しえる濃度であれば特に限定されるものでない。ただし、できるだけ高濃度であることで、微生物の取り込み効率や、取り込み量が高くなるという観点から、できるだけ高濃度でケイ酸が胞子形成培地に含まれていることが好ましい。特に限定されるものではないが、胞子形成培地中に含まれているケイ酸濃度（オルトケイ酸換算）は、１５μｇ/ｍｌ以上が好ましく、３０μｇ/ｍｌがさらに好ましく、１００μｇ/ｍｌが最も好ましい。なお、ケイ酸濃度の上限としては、胞子形成培地中に溶解し得る濃度である。
【００５４】
また微生物に取り込まれたケイ酸の微生物内での安定化に寄与する亜鉛の胞子形成培地中の濃度は、特に限定されるものではないが例えば亜鉛イオンとして、０．０１ｍＭ〜０．０５ｍＭ程度含まれていればよい。なお、亜鉛によるケイ酸の微生物内での安定化は、ケイ酸構造体の保持に関わるタンパク質の補因子としての機能によるものであると発明者らは推察している。
【００５５】
本発明の作製方法におけるケイ酸層形成工程は、上記で説示した態様の他に以下の示す態様が挙げられる。すなわちこの態様は、微生物の細胞表面にケイ酸重合体を形成させる工程である。この態様は、微生物の細胞表面に人工的にケイ酸重合体を形成してケイ酸層を形成させる方法である。それゆえ、胞子の生成能力の有無を問わず全ての微生物に対して有効である。かかる態様は、自体公知の方法で実施することができ、これを実施するための薬品が既に市販されている（信越化学工業株式会社製、製品名：トリメチルシランなど）。この薬品で微生物表面を修飾することによって、微生物の表面にケイ酸層を形成することができると考えられる。また、海綿のケイ酸構造体形成を促進するシリカテインなどの生物由来タンパク質をバクテリア表面に発現させることで、微生物にケイ酸層を形成させることも可能である（参考文献：Mular, E. G. et al., Bioencapsulation of living bacteria (Escherichia coli) with poly(silicate) after transformation with silicatein-alpha gene. Biomaterials, 29, 771-779 (2008)）。
【００５６】
本発明の作製方法を実施することによって所望の微生物が取得されたかどうかの判断は、透過型電子顕微鏡観察およびＴＥＭ-ＥＤＸによる元素分析を行うことによって、ケイ酸層が形成されたかどうかを確認するとともに、取得された微生物の耐酸性を野生株の耐酸性と比較して耐酸性の向上を確認することによって実施することができる。
【００５７】
以下実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。
【実施例】
【００５８】
〔方法〕
＜ケイ素濃度測定法＞
ケイ酸の形態で存在しているケイ素の濃度を測定するため、Silicate （Silicic Acid） Test（メルク社）のキットを用いた。超純水７８０μｌに測定試料２０μｌを加え、キット中のsolution Iを１５μl添加して攪拌後、３分間室温で静置した。そしてsolution IIを１５μl添加して攪拌後、solution IIIを８０μl加えた。攪拌後１０分間室温で静置し、波長８１０ｎｍの吸光度を吸光度計（DU800, ベックマン・コールター社製）にて測定した。１０００μｇ/ｍｌ ケイ素標準液（メルク社製）を０〜１００μｇ/ｍｌの範囲になるように超純水で希釈し、それぞれの溶液の吸光度とケイ素濃度との傾きから、ケイ素濃度の検量線は作成された。この検量線を用いて算出した試料のケイ素濃度をオルトケイ酸濃度に換算したものをケイ酸濃度とした。
【００５９】
＜ケイ酸蓄積試験および菌体顕微鏡観察＞
発明者らがケイ酸高蓄積菌として単離した、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）およびバチルス・シューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）の近縁種と同定されたバチルス属（Bacillus属）細菌 Ｎｏ．６４株（「Ｎｏ．６４株」という）を用いた。Ｎｏ．６４株を、２ｍｌのＲ２Ａ液体培地（0.05% 酵母エキス、0.05% ペプトン、0.05% カザミノ酸、0.05% グルコース、0.05% 可溶性デンプン、0.03% K2HPO4、0.005% MgSO4・7H2O、0.03% ピルビン酸ナトリウム、ｐＨ7.2）に植菌し、２８℃で２４時間前培養を行った。１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したＲ２Ａ培地（本実施例では「Ｒ２Ａ」と表記）、または改変Ｒ２Ａ培地（Ｒ２Ａ培地に微量金属（0.2 mM CaCl2、0.01 mM MnCl2・4H2O、0.05 mM ZnCl2、0.05 mM FeSO4・7H2O）が添加された培地：本実施例では「ｍＲ２Ａ」と表記）の液体培地４ｍｌに、上記前培養液を１％（ｖ/ｖ）となるように植菌し、２８℃で培養した。経時的に培養液を５０μｌずつサンプリングし、サンプルの吸光度測定（波長６００ｎｍ）の測定を行した後、当該サンプルを1,3000 rpmで３分間遠心分離に供した。遠心分離によって得られた上清についてケイ素濃度測定、および菌体の顕微鏡観察 (BX60、オリンパス社製)を行った。
【００６０】
＜ケイ酸蓄積における微量金属の影響＞
Ｎｏ．６４株をＲ２Ａの液体培地２ｍｌに植菌し、２８℃で２４時間前培養を行った。１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したＲ２Ａ、１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したｍＲ２Ａ、または１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したｍＲ２Ａから各微量金属（Ｆｅ、Ｃａ、Ｚｎ、Ｍｎ）をそれぞれ除去したｍＲ２Ａ（それぞれ「ｍＲ２Ａ（−Ｆｅ）」、「ｍＲ２Ａ（−Ｃａ）」、「ｍＲ２Ａ（−Ｚｎ）」、「ｍＲ２Ａ（−Ｍｎ）」という）の液体培地３ｍｌに、上記前培養液を１％（ｖ/ｖ）となるように植菌し、２８℃で培養した。経時的に培養液を５０μｌずつサンプリングし、サンプルを13,000 rpmで３分間遠心分離に供した。遠心分離により得られた上清のケイ素濃度測定を行った。
【００６１】
＜胞子作製＞
Ｎｏ．６４株をＲ２Ａの液体培地２ｍｌに植菌し、２８℃で２４時間前培養を行った。１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したｍＲ２Ａ、またはケイ酸を添加していないｍＲ２Ａの液体培地５０ｍｌに、上記前培養液を１％（ｖ/ｖ）となるように植菌した。２８℃で４８時間培養後、ほぼ全ての細胞が胞子になっていること（９９％以上）を顕微鏡で確認し、４℃で１２時間静置した。その後6,000 rpm、１０分間遠心分離に供した。上清を除去した後、菌体ペレットを、滅菌水２０ｍｌを用いて２回洗浄した。洗浄後のペレットを滅菌水２０ｍｌで再懸濁し、使用するまで４℃で保存した。１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したｍＲ２Ａで作製した胞子を「Ｓｉ＋胞子」、ケイ酸を添加していないｍＲ２Ａで作製した胞子を「Ｓｉ−胞子」とした。なお両者をあわせて表記する場合は「Ｓｉ±胞子」と表記する。
【００６２】
＜走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察用サンプル調製＞
上記で作製したＳｉ±胞子菌液５ｍｌを6,000 rpm、１０分間遠心分離後、上清を除去した。その胞子ペレットを２．５％（ｗ/ｖ）グルタルアルデヒド１ｍｌで懸濁し、４℃で２時間静置した。その後15,000 rpm、３分間遠心分離後、上清を除去し、ペレットを滅菌水１ｍｌで３回洗浄した。その後３０％（ｖ/ｖ）エタノール１ｍｌでペレットを懸濁し、１分間 室温で静置後、15,000 rpm、３分間遠心分離後、上清を除去した（脱水操作）。この脱水作業を５０％（ｖ/ｖ）エタノール（１分間 室温で静置１回）、７０％（ｖ/ｖ）エタノール（５分間 室温で静置１回、１０分間 室温で静置１回）、８０％（ｖ/ｖ）エタノール（５分間 室温で静置１回、１０分間 室温で静置１回）、９０％（ｖ/ｖ）エタノール（１０分間 室温で静置２回）、９５％（ｖ/ｖ）エタノール（１０分間 室温で静置２回）、９９.５％（ｖ/ｖ）エタノール（１５分間 室温で静置２回）、そして９９％（ｖ/ｖ） t-ブチルアルコール（２０分間 室温で静置３回）でも同様に行った。最後に胞子ペレットを凍結乾燥（FRD-50M, イワキ社製）して、ＳＥＭ用のサンプルとした。
【００６３】
＜走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察および元素分析＞
上記で作製したＳＥＭ用サンプルをオートファインコータ（JFC-1600, 日本電子社製）を用いて白金コーティングし、走査型電子顕微鏡（JSM-5900, 日本電子社製）により観察した（倍率 10,000倍, 加速電圧 25 kV, 作動距離 10 mm, スポットサイズ 約30, 信号 SEI）。胞子の元素分析（ＳＥＭ-ＥＤＸ）は、エネルギー分散形Ｘ線分析装置（JED-2200, 日本電子社製）を用いて行われた（倍率 50,000倍, 加速電圧 25 kV, 作動距離 10 mm, 信号 SEI）。
【００６４】
＜透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察用サンプル調製＞
上記で作製したＳｉ±の胞子菌液５００μｌを、15,000 rpm、３分間遠心分離後、上清を除去した。その胞子ペレットを２．５％（ｗ/ｖ）グルタルアルデヒドを含む０．１％（ｗ/ｖ） MgSO4、０．１Ｍ カコジル酸ナトリウム、pH 7.2の緩衝液１ｍｌに懸濁し、４℃で２時間静置した。その後、上記緩衝液１ｍｌで１回遠心洗浄を行い、１％（ｖ/ｖ）四酸化オスミウムを含む０．２Ｍ カコジル酸ナトリウム、pH 7.4の緩衝液１ｍｌに懸濁し、４℃で３６時間静置した。15,000 rpm、３分間遠心分離を行って上清を除き、４５℃で融解させておいたＬＭＰ agar ３０μｌで懸濁し（約109 spores/ml）、スライドガラス（松浪社製）上に懸濁液を滴下後、氷上に１５分間静置して固化させた。カミソリを用いて１〜２ｍｍ3程度になるようカットした後、５０％（ｖ/ｖ）エタノール１ｍｌで懸濁し、５分間室温で静置後、15,000 rpm、３分間遠心分離し、上清を除く操作を合計３回行った（脱水操作）。この脱水操作を、この脱水作業を７０％（ｖ/ｖ）エタノール（５分間 室温で静置３回）、８０％（ｖ/ｖ）エタノール（５分間 室温で静置３回）、９０％（ｖ/ｖ）エタノール（１０分間 室温で静置３回）、９５％（ｖ/ｖ）エタノール（１０分間 室温で静置３回）、９９．５％（ｖ/ｖ）エタノール（１０分間 室温で静置３回）、そして９９％（ｖ/ｖ） プロピレンオキサイド（１５分間 室温で静置３回）でも同様に行った。
【００６５】
その後、４５％（ｗ/ｖ） Epok 812、３１％（ｗ/ｖ） DDSA、２４％（ｗ/ｖ） MNAの混合液１ｍｌに懸濁し、室温で１２時間静置した。その後、サンプルをビームカプセルに入れ、包埋液（４５％（ｗ/ｖ） Epok 812、３０％（ｗ/ｖ） DDSA、２３％（ｗ/ｖ） MNA、２％（ｗ/ｖ） DMP-30）でカプセルを満たし、６０℃で４８時間静置して固化させ、それをウルトラミクロトーム（ライカマイクロシステムズ社製）で超薄切片（８０〜９０ｎｍ厚）にした。その後、Ｓｉ±の超薄切片を９．２％（ｗ/ｖ） 酢酸ウラニルに浸し、室温で２０分間静置した。そして滅菌水で超薄切片を洗浄し、水分を除去した後、クエン酸鉛溶液（２．６６％（ｗ/ｖ） 硝酸鉛、３．５２％（ｗ/ｖ）クエン酸三ナトリウム二水和物、０．１６Ｎ ＮａＯＨ）に浸し、１０分間室温で静置後、滅菌水で洗浄し、乾燥させたものをＴＥＭ用サンプルとした。
【００６６】
＜透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察および元素分析＞
上記で作製したＴＥＭ用サンプルをカーボン真空蒸着によりコーティングし、透過型電子顕微鏡（JEM1200EX, 日本電子社製）により観察した（倍率 30,000倍, 加速電圧 80 kV）。サンプルの元素分析（ＴＥＭ-ＥＤＸ）は、エネルギー分散形Ｘ線分析装置（HD-2000, 日立）を用いて行われた（倍率 300,000倍, 加速電圧 200 kV）。
【００６７】
＜Ｓｉ±胞子の塩酸耐性試験＞
発明者らがケイ酸高蓄積菌として単離した、バチルス・シャンドンゲンシス（Bacillus shandongensis）の近縁種と同定されたバチルス属（Bacillus属）細菌 Ｎｏ．２２１株（「Ｎｏ．２２１株」という）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus NBRC 15305、以下「１５３０５株」と表記）およびバチルス・シューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis NBRC 101235、「１０１２３５株」と表記）のＳｉ±胞子を、Ｎｏ．６４株と同様にして作製した。
【００６８】
Ｎｏ．６４株、Ｎｏ．２２１株、１５３０５株、および１０１２３５株のＳｉ±胞子それぞれを滅菌水でＯＤ600＝１になるよう希釈し、１ｍｌずつ13,000 rpm、３分間遠心分離を行った。上清を除去し、胞子ペレットを０．２Ｎ ＨＣｌ １ｍｌで懸濁し、２８℃で一定時間インキュベート後、１００μｌサンプリングし、それを適宜滅菌水で希釈してＲ２Ａプレートに塗布した。Ｒ２Ａプレートを２８℃、４８時間培養後、コロニー数を数えて菌濃度を算出した。コントロールとしてＨＣｌの代わりに滅菌水１ｍｌで胞子ペレットを懸濁した場合についても同様にして菌濃度を算出した。コントロールの菌濃度を１００％として、ＨＣｌ処理後の生存率を計算した。
【００６９】
＜Ｓｉ±胞子の硫酸耐性試験および硝酸耐性試験＞
Ｎｏ．６４株の胞子について０．２Ｎ ＨＣｌの代わりに０．８Ｎの Ｈ2ＳＯ4 または０．１Ｎ ＨＮＯ３を用いる以外は、塩酸耐性試験と同様にして硫酸耐性試験または硝酸耐性試験を行った。この試験はＮｏ．６４株の胞子についてのみ行われた。
【００７０】
＜Ｓｉ＋胞子のＳｉ蓄積量の検討＞
Ｎｏ．２２１株のＳｉ±胞子についてＳｉ蓄積量を検討した。方法は、２２１株が取り込んだＳｉ量を培養液中に存在する２２１株の細胞数（colony forming unit:CFU）で除し、その値を胞子あたりのＳｉ蓄積量とした。
【００７１】
〔結果〕
＜ケイ酸蓄積試験および菌体顕微鏡観察＞
Ｎｏ．６４株を、１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）が添加されたＲ２Ａ、または１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）が添加されたｍＲ２Ａで培養した際の、吸光度（波長６００ｎｍ）の経時変化、培養上清中のケイ酸濃度の経時変化、および菌体の顕微鏡像を図２に示す。
【００７２】
図２（ａ）は吸光度（波長６００ｎｍ）の経時変化（黒丸のシンボルで表記）と培養上清中のケイ酸濃度（白四角のシンボルで表記）とを示すグラフである。図２（ａ）中「ｍＲ２Ａ」と記載されたグラフは１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）が添加されたｍＲ２Ａを用いてＮｏ．６４株を培養した結果であり、「Ｒ２Ａ」と記載されたグラフは１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）が添加されたＲ２Ａを用いてＮｏ．６４株を培養した結果である。グラフの横軸は培養時間（ｈ）であり、縦軸は吸光度（波長６００ｎｍ）および培養上清中のケイ酸濃度である。
【００７３】
一方、図２（ｂ）は培養１２時間後（図上部に「１２ｈ」と表記）、２４時間後（図上部に「２４ｈ」と表記）、および４８時間後（図上部に「４８ｈ」と表記）の菌体の顕微鏡像である。図２（ｂ）の左部に「ｍＲ２Ａ」と記載された行は、１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）が添加されたｍＲ２Ａを用いてＮｏ．６４株を培養した結果であり、図２（ｂ）の左部「Ｒ２Ａ」と記載された行は１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）が添加されたＲ２Ａを用いてＮｏ．６４株を培養した結果である。
【００７４】
Ｒ２Ａ（ケイ酸含有）を用いた場合ではケイ酸の減少（すなわち取り込み）が見られず、ｍＲ２Ａ（ケイ酸含有）を用いた場合ではそれが確認された。ｍＲ２Ａ（ケイ酸含有）で培養したときの顕微鏡像を見ると、ケイ酸の取り込みが始まった２４時間培養時に、細胞内の内生胞子が観察され、４８時間培養後には全ての細胞が胞子になっていた。一方、Ｒ２Ａ（ケイ酸含有）で培養した場合では、胞子形成はされていなかった。このことから、ケイ酸は胞子形成時に蓄積されることが判明した。
【００７５】
＜ケイ酸蓄積における微量金属の影響＞
１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したＲ２Ａ（「Ｒ２Ａ」と表記）、１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したｍＲ２Ａ（「ｍＲ２Ａ」と表記）、または１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したｍＲ２Ａから各微量金属（Ｆｅ、Ｃａ、Ｚｎ、Ｍｎ）をそれぞれ除去したｍＲ２Ａ培地（それぞれ「ｍＲ２Ａ（−Ｆｅ）」、「ｍＲ２Ａ（−Ｃａ）」、「ｍＲ２Ａ（−Ｚｎ）」、「ｍＲ２Ａ（−Ｍｎ）」と表記）をそれぞれ用いて、Ｎｏ．６４株を培養した際の、培養上清中のケイ酸濃度の経時変化を図３に示す。
【００７６】
図３（ａ）はｍＲ２Ａを用いた場合の結果、（ｂ）はＲ２Ａを用いた場合の結果、（ｃ）はｍＲ２Ａ（−Ｆｅ）を用いた場合の結果、（ｄ）はｍＲ２Ａ（−Ｃａ）を用いた場合の結果、（ｅ）ｍＲ２Ａ（−Ｚｎ）を用いた場合の結果、（ｆ）はｍＲ２Ａ（−Ｍｎ）を用いた場合の結果を示す。
【００７７】
ｍＲ２Ａ（−Ｍｎ）では、Ｒ２Ａと同様にケイ酸の取り込みが見られなかった。これは、Ｍｎがないと胞子形成が著しく阻害されるためであると考えられる（参考文献：Weinberg ED., Manganese requirement for sporulation and other secondary biosynthetic processes of Bacillus. Appl Microbiol, 12, 436-441 (1964)）。また、ｍＲ２Ａ（−Ｃａ）では、ケイ酸蓄積量の低下が確認された。ｍＲ２Ａ（−Ｚｎ）では、ケイ酸蓄積量は変化しなかったが、蓄積後の放出量の増加が見られた。そして、ｍＲ２Ａ（−Ｆｅ）では、ｍＲ２Ａの結果と同様の結果を示した。上記の結果から、Ｚｎは胞子内にケイ酸を安定的に保持するために重要であることが分かった。
【００７８】
＜Ｓｉ±胞子の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察および元素分析＞
Ｎｏ．６４株の培養上清中のケイ素濃度の低下が、菌体のケイ酸の蓄積によるものであることを確認すべく、１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したｍＲ２Ａ、またはケイ酸を添加していないｍＲ２Ａをそれぞれ用いて、Ｎｏ．６４株を培養した際に形成された胞子について、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察およびＳＥＭ-ＥＤＸにより元素分析を行った。その結果を図４に示す。図４（ａ）はケイ酸を添加していないｍＲ２Ａで培養して得られた胞子（「Ｓｉ−」と表記）の結果、（ｂ）はケイ酸を添加したｍＲ２Ａで培養して得られた胞子（「Ｓｉ＋」と表記）の結果を示す。図４（ｂ）の矢印はケイ素のピークを示す。
【００７９】
図４の結果からＮｏ．６４株のＳｉ±胞子を観察したところ、表面の構造的な違いは見られなかった。さらにＳｉ±胞子の元素分析（ＳＥＭ-ＥＤＸ）を行った結果、Ｓｉ＋胞子に高いケイ素のピークが見られた。よって、Ｎｏ．６４株はケイ酸を確かに蓄積していることが明らかになった。
【００８０】
＜Ｓｉ±胞子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察および元素分析＞
胞子内のケイ素の形態および局在を調べるため、Ｓｉ±胞子の切片のＴＥＭ観察を行った。その結果を図５および６に示した。図５（ａ）、（ｃ）はＳｉ−胞子のＴＥＭ像であり、図５（ｂ）、（ｄ）はＳｉ＋胞子のＴＥＭ像である。また図６（ａ）は図５（ａ）の四角部分の拡大図であり、図６（ｂ）は図５（ｂ）の四角部分の拡大図である。なお図５および６中の「ＥＸ」はexosporiumを示し、「ＯＣ」はouter coatを示し、「ＩＣ」はinner coatを示し、「ＣＸ」はcortexを示し、ＣＲはcoreを示す（以後、他の図においても同じ）。
【００８１】
図５および６から、Ｓｉ−胞子とＳｉ＋胞子間とでＯＣの構造に変化が見られた。すなわち、Ｓｉ−胞子のＯＣに比して、Ｓｉ＋胞子のＯＣに肥大化が見られた。特に顕著な構造変化が見られた箇所を図５（ｂ）中、矢印で示す。
【００８２】
この構造変化を解析すべく、Ｓｉ±胞子の元素分析（ＴＥＭ-ＥＤＸ）を行った。その結果を図１および図７に示す。図７（ａ）Ｓｉ−胞子のＴＥＭ像、（ｂ）はＳｉ−胞子のＴＥＭ-ＥＤＸの結果、（ｃ）はＳｉ＋胞子のＴＥＭ像、（ｄ）はＳｉ＋胞子のＴＥＭ-ＥＤＸの結果を示す。また図１（ａ）はＳｉ＋胞子（一部）のＴＥＭ像であり、（ｂ）はＳｉ＋胞子（一部）のＴＥＭ-ＥＤＸの結果を示す。ＴＥＭ-ＥＤＸの結果中に示されるドットはケイ素を表している。図７（ｄ）および図１（ｂ）においてＳｉ＋胞子のＯＣにケイ素のドットの集中が見られたことから、Ｓｉ＋胞子のＯＣにはケイ素（つまりケイ酸）が高密度で存在していることが確認された。
＜Ｓｉ±胞子の耐酸性試験＞
塩酸耐性試験の結果を図８および図１０に示す。図８（ａ）はＮｏ．６４株のＳｉ±胞子の結果、（ｂ）は１５３０５株のＳｉ±胞子の結果、（ｃ）は１０１２３５株のＳｉ±胞子の結果、図１０（ａ）はＮｏ．２２１株のＳｉ±胞子の結果を示す。また硫酸耐性試験の結果を図９（ａ）に示し、硝酸耐性試験の結果を図９（ｂ）に示す。図８〜１０中、黒四角のシンボルはＳｉ＋胞子の結果を示し、黒丸のシンボルはＳｉ−胞子の結果を示す。また図１０（ｂ）にＮｏ．２２１株の胞子について、Ｓｉの蓄積量と塩酸耐性との関係を示した。図１０（ｂ）中、白丸のシンボルは１時間塩酸処理を行った場合の結果を示し、白四角のシンボルは２時間塩酸処理を行った場合の結果を示す。
【００８３】
図８、図９および図１０（ａ）の結果から、Ｓｉ＋胞子は明らかに耐酸性が向上していることが確かめられた。またＮｏ．６４株、１５３０５株、１０１２３５株、Ｎｏ．２２１株共に同様の結果が得られたことから、ＯＣにおけるケイ酸の蓄積による耐酸性向上の効果は、微生物の種類に限定されるものではないことが確認された。
【００８４】
さらに図１０（ｂ）の結果からケイ素（ケイ酸）の蓄積量に応じて塩酸耐性が向上していることが確認され、塩酸耐性の向上はケイ素（ケイ酸）の蓄積によるものであるということがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
上記説示したように、本発明によれば、微生物の耐酸性を野生株に比して向上させることができる。よってプロバイオティクスや浄水処理等、微生物の耐酸性が求められる分野において本発明は特に奏効する。
【００８６】
したがって本発明は、微生物を取り扱う分野、例えば、医薬品、食品、環境産業などに利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞表面にケイ酸層を備える微生物、およびその作製方法を提供する。本発明にかかる微生物は野生株に比して耐酸性が向上している。それゆえ、本発明は微生物の耐酸性を向上させる方法をも包含する。さらに本発明は上記微生物の代表的な利用例をも提供する。
【背景技術】
【０００２】
近年、乳酸菌等の善玉菌を食品として摂取し、これによって腸内環境の改善を図ることを目的とするプロバイオティクスが注目されている。プロバイオティクスを行うためには乳酸菌等の善玉菌を生きたまま腸まで送り届けることが重要である。しかし、善玉菌をそのまま摂取した場合、胃酸の影響により摂取した菌体のほとんどが死滅してしまうために、期待する効果が得られない場合がある。このため、耐酸性菌の使用や、乾燥菌体を耐酸性物質でコートする方法が採用されている。例えば、特許文献１には生菌の保存安定性が高く、かつ胃酸耐性を有する乳酸菌錠剤を製造すべく、乳酸菌の生菌乾燥粉末と、デンプン、糖類、セルロース類、無機ケイ酸化合物、タルク、ポリビニルピロリドン、ワックスおよびステアリン酸マグネシウムからなる群から選ばれる１種類以上の添加剤とを混合し、乾式直接打錠法等により製造した錠剤に、胃酸耐性のある腸溶性物質でコーティングすることが開示されている。ここで上記添加剤は錠剤の物性および乳酸菌の保存安定性を高めるために使用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平４−４１４３４号公報（公開日：平成４（１９９２）年２月１２日）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１に記載された技術では、乳酸菌を含む錠剤を、胃酸耐性のある腸溶性物質でコーティングしているに過ぎず、乳酸菌自体の耐酸性が向上しているわけではない。したがって、錠剤が腸へ移行する過程においてコーティングが剥離してしまう場合がある。この場合に、腸へ移行した時点では乳酸菌の生菌率が低下してしまう場合がある。よって、特許文献１に記載された技術では、十分な効果が得られない場合がある。
【０００５】
また微生物の耐酸性を向上させることは、上記プロバイオティクスの分野のみで求められるわけではない。例えば微生物を用いた浄水処理は、低ｐＨの条件下で行われる場合があり、この場合に微生物の耐久性が浄水処理能力に大きく影響する。よって、微生物を用いた浄水処理においても微生物の耐酸性を向上させることが求められる。しかし、特許文献１に記載された技術は、微生物からなる錠剤を耐酸性物質でコーティングする技術であるため、浄水処理への応用を考えた場合、耐酸性物質でコーティングされた錠剤を原水中へ添加した直後からコーティングが剥離し、微生物自体が原水中へ露出することになる。この場合、微生物自体の耐酸性が向上しているわけではないため、低ｐＨの原水中ではすぐに微生物が死滅してしまい、浄水処理の効率がすぐに低下してしまう。それゆえ、特許文献１に記載された技術は浄水処理の分野には適さないといえる。つまり特許文献１に記載された技術は汎用性にかけるという問題点がある。
【０００６】
したがって、微生物の耐酸性を向上させる技術として、十分な実効性と高い汎用性とを持ち合わせた技術が求められている。本発明はこのような課題を解決することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、Bacillus属細菌を、ケイ酸を含む培地で培養したところ、表面のouter coat（以下、適宜「ＯＣ」という）にケイ酸からなる層（「ケイ酸層」という）を備えた胞子が生成され、この胞子は、ケイ酸層を備えていない胞子に比して高い耐酸性を有することを見出した。このことは、ケイ酸で細菌表面を被覆する、すなわち微生物の細胞表面にケイ酸層を形成することにより耐酸性微生物を作製することが可能になることを示している。このようにして得られた微生物は、細胞表面にケイ酸層を備えているため、結果として微生物自体の耐酸性が向上している。それゆえ当該微生物をプロバイオティクスの分野に用いた場合は、安定した胃酸耐性を微生物が発揮し、所望の効果が得られやすくなる。また当該微生物を浄水処理に用いた場合であっても、微生物自体の耐酸性が向上しているために低ｐＨ条件下においても高い耐久性を当該微生物が有するといえ、その結果、効率よく浄水処理を行うことができるといえる。本発明は、上記新規知見により完成されたといえる。すなわち本発明は、上記課題を解決するために以下の発明を包含する。
【０００８】
本発明にかかる微生物は、細胞表面にケイ酸からなるケイ酸層を備える生菌であり、
且つ耐酸性が野生株に比して向上していることを特徴としている。
【０００９】
また本発明にかかる微生物は、細菌であってもよい。
【００１０】
一方、本発明にかかる方法は、上記本発明にかかる微生物を作製するための方法であって、微生物の細胞表面にケイ酸からなるケイ酸層を形成するケイ酸層形成工程を含むことを特徴としている。
【００１１】
また本発明にかかる方法において、上記微生物は細菌であってもよい。
【００１２】
また本発明にかかる方法において、上記微生物が胞子を形成し得る微生物である場合に、上記ケイ酸層形成工程は、ケイ酸および亜鉛を含む胞子形成培地を用いて微生物を培養する工程であってもよい。この時、上記胞子形成培地は、オルトケイ酸換算で１００μｇ/ｍｌ以上のケイ酸を含む胞子形成培地であることが好ましい。
【００１３】
また本発明にかかる方法において、上記ケイ酸層形成工程は、微生物の細胞表面にケイ酸重合体を形成させる工程であってもよい。
【００１４】
一方、本発明は、微生物の耐酸性を野生株に比して向上させる方法をも包含する。かかる方法は、微生物の細胞表面に、ケイ酸からなるケイ酸層を形成するケイ酸層形成工程を含むことを特徴としている。この時、上記微生物は、細菌であってもよい。
【００１５】
また本発明にかかる方法において、上記微生物が胞子を形成し得る微生物である場合に、上記ケイ酸層形成工程は、ケイ酸および亜鉛を含む胞子形成培地を用いて微生物を培養する工程であってもよい。この時、上記胞子形成培地は、オルトケイ酸換算で１００μｇ/ｍｌ以上のケイ酸を含む胞子形成培地であることが好ましい。
【００１６】
また上記ケイ酸層形成工程は、微生物の細胞表面にケイ酸重合体を形成させる工程であってもよい。
【００１７】
一方、本発明は上記本発明にかかる微生物を含む生菌製剤、食品をも包含する。さらに本発明は上記本発明にかかる微生物を用いることを特徴とする浄水方法をも包含する。
【発明の効果】
【００１８】
上記のように本発明によれば、野生株に比して耐酸性が向上した微生物を提供することができる。本発明によって得られた微生物は、細胞表面にケイ酸層を備えているため、結果として微生物自体の耐酸性が向上している。それゆえ当該微生物をプロバイオティクスの分野のみならず、浄水処理やその他の広範な分野において奏効する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ｎｏ．６４株のＳｉ＋胞子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像（図１（ａ））、およびＴＥＭ-ＥＤＸによる元素分析を行った結果（図１（ｂ））を示す図である。
【図２】Ｎｏ．６４株を、１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）が添加されたＲ２Ａ培地、または１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）が添加されたｍＲ２Ａ培地で培養した際の、吸光度（波長６００ｎｍ）の経時変化および培養上清中のケイ酸濃度の経時変化を示すグラフ（図２（ａ））、並びに菌体の顕微鏡像（図２（ｂ））である。
【図３】１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したＲ２Ａ培地、１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したｍＲ２Ａ培地、または１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したｍＲ２Ａ培地から各微量金属（Ｆｅ、Ｃａ、Ｚｎ、Ｍｎ）をそれぞれ除去したｍＲ２Ａ培地（それぞれ「ｍＲ２Ａ（−Ｆｅ）」、「ｍＲ２Ａ（−Ｃａ）」、「ｍＲ２Ａ（−Ｚｎ）」、「ｍＲ２Ａ（−Ｍｎ）」と表記）をそれぞれ用いて、Ｎｏ．６４株を培養した際の、培養上清中のケイ酸濃度の経時変化を示すグラフである。図３（ａ）はｍＲ２Ａを用いた場合の結果、（ｂ）はＲ２Ａを用いた場合の結果、（ｃ）はｍＲ２Ａ（−Ｆｅ）を用いた場合の結果、（ｄ）はｍＲ２Ａ（−Ｃａ）を用いた場合の結果、（ｅ）ｍＲ２Ａ（−Ｚｎ）を用いた場合の結果、（ｆ）はｍＲ２Ａ（−Ｍｎ）を用いた場合の結果をそれぞれ示す。
【図４】１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したｍＲ２Ａ培地、またはケイ酸を添加していないｍＲ２Ａ培地をそれぞれ用いて、Ｎｏ．６４株を培養した際に形成された胞子について、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察およびＳＥＭ-ＥＤＸにより元素分析を行った結果を示す。図４（ａ）はケイ酸を添加していないｍＲ２Ａ培地で培養して得られた胞子の結果、（ｂ）はケイ酸を添加したｍＲ２Ａ培地で培養して得られた胞子の結果をそれぞれ示す。
【図５】図５（ａ）および（ｃ）はＮｏ．６４株のＳｉ−胞子のＴＥＭ像であり、図５（ｂ）および（ｄ）はＮｏ．６４株のＳｉ＋胞子のＴＥＭ像である。
【図６】図６（ａ）は図５（ａ）の四角部分の拡大図であり、図６（ｂ）は図５（ｂ）の四角部分の拡大図である。
【図７】図７（ａ）はＮｏ．６４株のＳｉ−胞子のＴＥＭ像、（ｂ）はＮｏ．６４株のＳｉ−胞子についてＴＥＭ-ＥＤＸにより元素分析を行った結果、（ｃ）はＮｏ．６４株のＳｉ＋胞子のＴＥＭ像、（ｄ）はＮｏ．６４株のＳｉ＋胞子についてＴＥＭ-ＥＤＸにより元素分析を行った結果である。
【図８】塩酸耐性試験の結果を示すグラフであり、図８（ａ）はＮｏ．６４株のＳｉ±胞子の結果、（ｂ）は１５３０５株のＳｉ±胞子の結果、（ｃ）は１０１２３５株のＳｉ±胞子の結果をそれぞれ示す。
【図９】図９（ａ）はＮｏ．６４株のＳｉ±胞子について硫酸耐性試験を行った結果を示すグラフであり、図９（ｂ）はＮｏ．６４株のＳｉ±胞子について硝酸耐性試験の結果を示すグラフである。
【図１０】図１０（ａ）はＮｏ．２２１株のＳｉ±胞子について塩酸耐性試験の結果を示すグラフであり、図１０（ｂ）はＮｏ．２２１株の胞子について、Ｓｉの蓄積量と塩酸耐性との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。また、本明細書中に記載された公知文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【００２１】
＜１.本発明にかかる微生物およびその利用例＞
本発明にかかる微生物は、その細胞表面にケイ酸からなるケイ酸層を備える生菌であり、且つ耐酸性が野生株に比して向上していることを特徴としている。ここで本明細書における「微生物」とは、微生物に分類される生物であれば特に限定されるものではなく、細菌等の原核生物、酵母類、カビ類、担子菌等の真核生物であってもよく、また単細胞生物であっても多細胞生物であってもよい。「微生物」の定義については、例えば「生化学辞典 第２版 東京科学同人」が参照される。ただし本発明は微生物の耐酸性を向上させることを目的としているため、耐酸性を向上させることが求められる微生物が本発明において好ましく適用される。なお、本明細書における「微生物」には、その休眠細胞である「胞子」が含まれる。本発明は胞子表面にケイ酸層を備える場合も含まれる。
【００２２】
ここで、本発明に好ましく適用される微生物としては特に限定されるものではないが、例えば乳酸菌類（ラクトバチルス属（Lactobacillus属）細菌、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium属）細菌、ストレプトコッカス属（Streptococcus属）細菌）、バチルス属（Bacillus属）細菌、クロストリジウム属(Clostridium属)、シュードモナス属（Pseudomonas属）細菌などが挙げられる。乳酸菌類はそれを摂取することで腸内環境を整えることが知られている。バチルス属細菌であるバチルス・ナットウ（Bacillus natto）は例えば整腸剤として利用されている。またバチルス属細菌は、浄水処理法の一つである活性汚泥法において使用されている微生物であり、ｐＨを低下させることでバチルス属菌の優占化が進み、浄水処理効率が高まるとされている（参考文献：防菌防黴誌, Vol.27, No. 7, pp431-440, 1999）。またバチルス・シューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)は、人体や環境に安全な生物農薬、微生物殺虫剤（ＢＴ剤）として、世界各国で使用されているために、本発明が好ましく適用され得る。なお、バチルス属細菌は、栄養飢餓時に胞子を作製することが知られている。
【００２３】
本発明にかかる微生物は、その細胞表面にケイ酸からなるケイ酸層を備えている。ケイ酸層を細胞表面に備えるとは、微生物が外界と接触している細胞表面にケイ酸が層状に存在するようになっていることを意味する。換言すれば微生物の表面がケイ酸によって被覆（コート）されている状態を意味する。かかるケイ酸層が微生物の外界に存在する酸に対するバリアとなり、耐酸性が当該微生物において発揮されることとなる。それゆえ、耐酸性をより強化する観点から、微生物の細胞表面のできるだけ大部分がケイ酸層で被覆されていることが好ましく、微生物の細胞表面の１００％がケイ酸層で被覆されていることが最も好ましいといえる。
【００２４】
図１にバチルス・セレウス（Bacillus cereus）およびバチルス・シューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）の近縁種と同定されたバチルス属（Bacillus属）細菌 Ｎｏ．６４株（以下「Ｎｏ．６４株」という）を、ケイ酸をオルトケイ酸換算で１００μｇ/ｍｌ含む胞子形成培地（改変Ｒ２Ａ培地：0.05% 酵母エキス、0.05% ペプトン、0.05% カザミノ酸、0.05% グルコース、0.05% 可溶性デンプン、0.03% K2HPO4、0.005% MgSO4・7H2O、0.03% ピルビン酸ナトリウム、0.2 mM CaCl2、0.01 mM MnCl2・4H2O、0.05 mM ZnCl2、0.05 mM FeSO4・7H2O 、pH 7.2）で培養した際に得られた胞子の切片の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像（図１（ａ））およびＴＥＭ-ＥＤＸによって元素分析を行った結果（図１（ｂ））を示す。図１（ｂ）におけるドットがケイ素（ケイ酸）を示している。図１（ａ）および（ｂ）によれば、Ｎｏ．６４株の胞子表面のouter coat（ＯＣ）にケイ素（ケイ酸）が層状に局在していることがわかる。つまりＮｏ．６４株の胞子は、その細胞表面であるＯＣにケイ酸層を備えていることが確認された。
【００２５】
図１においては胞子を用いて本発明にかかる微生物の一実施形態を説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、胞子でない形態の微生物の場合、細胞膜や細胞壁の内側またはこれらの外界側にケイ酸層が形成されている態様であってもよい。
【００２６】
本発明にかかる微生物は、死滅した微生物を除く、生きた微生物（生菌）であり、休眠状態の細胞（胞子）も含まれる。生菌であるか否かは、微生物を培養した際に増殖するかどうかで判断することができる。
【００２７】
また本発明にかかる微生物は耐酸性が野生株に比して向上していることを特徴としている。耐酸性が野生株に比して向上しているか否かの判断は、後述する実施例における耐酸性試験によって実施され得る。すなわち、ケイ酸層を備えていない微生物（野生株）と、ケイ酸層を備えている微生物（本発明にかかる微生物）とをそれぞれ酸溶液中で一定時間保持した後の生存率を比較し、ケイ酸層を備えている微生物（本発明にかかる微生物）の生存率がケイ酸層を備えていない微生物（野生株）の生存率に比して高くなっていれば、野生株に比して耐酸性が向上していると判断できる。
【００２８】
本発明にかかる微生物の利用例については特に限定されるものではないが、例えばプロバイオティクス分野への利用、浄水処理への利用、微生物製剤への利用が挙げられる。プロバイオティクスへの応用を考えた場合、微生物そのものを食品や生菌製剤として利用することが可能である。本発明にかかる微生物からなる食品を製造する場合は、微生物の菌体そのものを食品として利用してもよいし、当該微生物を食品に添加してもよい。食品への添加量は特に限定されるものではなく、微生物による効果や、食品の物性、食味などを考慮して適宜決定すればよい。また本発明にかかる微生物が乳酸菌類である場合、当該微生物を用いて原料を乳酸発行させることにより、ヨーグルトなどの乳製品を製造すればよい。上記乳製品は従来公知の乳製品の製造方法に準じて製造され得る。この際に使用する微生物の性質に応じて乳製品の製造条件は、適宜変更され得る。
【００２９】
また生菌製剤として利用する場合、微生物の培養菌体そのものを生菌製剤としてもよいし、微生物の乾燥菌体を生菌製剤としてもよい。本発明にかかる生菌製剤は、その効果を阻害しない、他の成分（例えば、薬学的に受容可能なキャリア等）をさらに含有してもよい。ここで、上記「薬学的に受容可能なキャリア」について以下に説明する。本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」（以下、単に「キャリア」ともいう）とは、医薬、または動物薬のような農薬を製造するときに、処方を補助することを目的として用いられる物質であって、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。さらに、本発明にかかる生菌製剤を受容した個体において毒性が無く、且つキャリア自体は有害な抗体の産生を誘導しないものが意図される。
【００３０】
上記キャリアとしては、製剤素材として使用可能な各種有機または無機のキャリア物質が用いられる。例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤等；防腐剤；抗酸化剤；安定剤；矯味矯臭剤等として配合されるが、本発明はこれらに限定されない。
【００３１】
上記「賦形剤」としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ-マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、デンプン、結晶セルロース等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００３２】
上記「滑沢剤」としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ワックス、タルク、コロイドシリカ等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００３３】
上記「結合剤」としては、例えば、α化デンプン、メチルセルロース、結晶セルロース、白糖、Ｄ-マンニトール、トレハロース、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００３４】
上記「崩壊剤」としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００３５】
上記「溶剤」としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、トリカプリリン等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００３６】
上記「溶解補助剤」としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ-マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００３７】
上記「懸濁剤」としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、あるいは、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００３８】
上記「等張化剤」としては、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ-マンニトール等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００３９】
上記「緩衝剤」としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００４０】
上記「防腐剤」としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００４１】
上記「抗酸化剤」としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００４２】
また、上記安定剤、矯味矯臭剤としては、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
【００４３】
本発明にかかる生菌製剤の剤型としては、例えば、粉剤、顆粒剤、錠剤、リポソーム、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、散剤等の固形製剤や、シロップ剤等の液状製剤とすることができる。
【００４４】
上記「液状製剤」は、上記キャリアとして、例えば、水；グリセロール、グリコール、ポリエチレングリコール等の有機溶媒；これらの有機溶媒と水との混合物等を用いて、製薬分野において通常用いられる方法で製造することができる。また、上記液状製剤は、さらに、溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、安定剤等を含んでいてもよい。
【００４５】
上記「固形製剤」は、上記キャリアとして、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤等を用いて、製薬分野において通常用いられる方法で製造することができる。
【００４６】
かかる経口剤を調製する際には、目的に応じて、潤滑剤、流動性促進剤、着色剤、香料等をさらに配合してもよい。
【００４７】
本発明にかかる生菌製剤は、単独で投与されてもよいし、他の薬剤と併用して投与されてもよい。併用して投与される方法としては、例えば、他の薬剤との混合物として同時に投与されてもよいし、他の薬剤とは別の薬剤として同時にもしくは並行して投与されてもよいし、あるいは経時的に投与されてもよいが、本発明はこれに限定されない。また、本発明にかかる生菌製剤が１日あたりに投与される回数は特に限定されるものではない。
【００４８】
また本発明にかかる微生物を浄水処理に利用する場合は、従来公知の方法において本発明にかかる微生物を利用すればよい。こうすることで、本発明にかかる浄水方法が構成される。なおその運転条件は、本発明の微生物の浄水処理能力に応じて適宜変更され得る。例えば本発明にかかる微生物がバチルス属細菌である場合は、前述の活性汚泥法において使用することができる。
【００４９】
＜２.本発明にかかる微生物の作製方法および微生物の耐酸性向上させるための方法＞
次に上述の本発明にかかる微生物の作製方法の一実施形態を説明する。ただし、本発明にかかる微生物は以下に説明する方法によって得られるものに限定されるものではない。なお、本発明にかかる微生物の作製方法により得られる微生物は、野生株に比して耐酸性が向上した微生物である。よって本発明は微生物の耐酸性を野生株に比して向上させる方法をも包含するといえる。本発明にかかる微生物の作製方法と、本発明にかかる微生物の耐酸性を野生株に比して向上させる方法とはその工程が共通しているため、本項では本発明にかかる微生物の作製方法（以下「本発明の作製方法」という）のみを説明する。本発明にかかる微生物の耐酸性を野生株に比して向上させる方法の説明は、本発明の作製方法の説明を援用することとする。また本発明の作製方法における説明と、上述の本発明にかかる微生物の説明とにおいて共通する項目については、本発明にかかる微生物の説明を援用する。
【００５０】
本発明の作製方法は、本発明にかかる微生物を作製するための方法であって、微生物の細胞表面にケイ酸からなるケイ酸層を形成するケイ酸層形成工程を含むことを特徴としている。このケイ酸層形成工程は、微生物の細胞表面にケイ酸層を形成し得る方法であれば特に限定されるものではない。以下にケイ酸層形成工程の一例として、微生物が胞子を形成し得る微生物（例えば芽胞細菌）である場合について説明する。
【００５１】
後述する実施例に示すように、胞子を形成し得る微生物の一例としてバチルス属細菌を用い、ケイ酸をオルトケイ酸換算で１００μｇ/ｍｌ含む胞子形成培地（改変Ｒ２Ａ培地：0.05% 酵母エキス、0.05% ペプトン、0.05% カザミノ酸、0.05% グルコース、0.05% 可溶性デンプン、0.03% K2HPO4、0.005% MgSO4・7H2O、0.03% ピルビン酸ナトリウム、0.2 mM CaCl2、0.01 mM MnCl2・4H2O、0.05 mM ZnCl2、0.05 mM FeSO4・7H2O 、pH 7.2）で培養したところ、図１に示したような、胞子のＯＣにケイ酸層を備える胞子を作製することに成功した。そして、このようにして得られた胞子は、野生株の胞子に比して耐酸性が向上していた。本発明者らの検討によれば、上記のようにして培養した場合、胞子を形成する際に培地中に含まれるケイ酸を取り込んで胞子のＯＣに蓄積することがわかった。さらに培地中に亜鉛（Ｚｎ）が含まれることで、ＯＣに蓄積されたケイ酸が安定化するということを見出だした。
【００５２】
ここで、本発明の方法で使用する胞子形成培地とは、胞子を形成し得る微生物が胞子を形成することができる要件を満たす培地であれば特に限定されるものではない。一般に胞子は微生物が飢餓状態に陥った場合に形成されるために、飢餓培養し得るような培地であることが好ましい。飢餓培養し得る培地としては、例えば最小培地が挙げられる。なお胞子形成培地の組成については、微生物毎に異なっている。したがって、微生物の種類に応じて適宜最適な培地組成を選択すればよい。例えば、Bacillus subtilisにおいては2×SG培地（Beef extract 6g, ペプトン10g, KCl 2g, MgSO4・7H2O 0.5g, CaCl2 22mg, MnCl2・4H2O 2mg, ZnCl27mg, FeSO4・7H2O 14mg per litter water）、Bacillus cereusグループのバクテリアにおいては、一般的な複合培地にカルシウム、マンガン、亜鉛、鉄などの微量金属（例えば、CaCl222mg, MnCl2・4H2O 2mg, ZnCl2 7mg, FeSO4・7H2O 14mg per litter程度）を添加した培地を用いることで胞子形成が促進される。
【００５３】
上記胞子形成培地に含まれているケイ酸の濃度は、微生物が取り込んでケイ酸を形成しえる濃度であれば特に限定されるものでない。ただし、できるだけ高濃度であることで、微生物の取り込み効率や、取り込み量が高くなるという観点から、できるだけ高濃度でケイ酸が胞子形成培地に含まれていることが好ましい。特に限定されるものではないが、胞子形成培地中に含まれているケイ酸濃度（オルトケイ酸換算）は、１５μｇ/ｍｌ以上が好ましく、３０μｇ/ｍｌがさらに好ましく、１００μｇ/ｍｌが最も好ましい。なお、ケイ酸濃度の上限としては、胞子形成培地中に溶解し得る濃度である。
【００５４】
また微生物に取り込まれたケイ酸の微生物内での安定化に寄与する亜鉛の胞子形成培地中の濃度は、特に限定されるものではないが例えば亜鉛イオンとして、０．０１ｍＭ〜０．０５ｍＭ程度含まれていればよい。なお、亜鉛によるケイ酸の微生物内での安定化は、ケイ酸構造体の保持に関わるタンパク質の補因子としての機能によるものであると発明者らは推察している。
【００５５】
本発明の作製方法におけるケイ酸層形成工程は、上記で説示した態様の他に以下の示す態様が挙げられる。すなわちこの態様は、微生物の細胞表面にケイ酸重合体を形成させる工程である。この態様は、微生物の細胞表面に人工的にケイ酸重合体を形成してケイ酸層を形成させる方法である。それゆえ、胞子の生成能力の有無を問わず全ての微生物に対して有効である。かかる態様は、自体公知の方法で実施することができ、これを実施するための薬品が既に市販されている（信越化学工業株式会社製、製品名：トリメチルシランなど）。この薬品で微生物表面を修飾することによって、微生物の表面にケイ酸層を形成することができると考えられる。また、海綿のケイ酸構造体形成を促進するシリカテインなどの生物由来タンパク質をバクテリア表面に発現させることで、微生物にケイ酸層を形成させることも可能である（参考文献：Mular, E. G. et al., Bioencapsulation of living bacteria (Escherichia coli) with poly(silicate) after transformation with silicatein-alpha gene. Biomaterials, 29, 771-779 (2008)）。
【００５６】
本発明の作製方法を実施することによって所望の微生物が取得されたかどうかの判断は、透過型電子顕微鏡観察およびＴＥＭ-ＥＤＸによる元素分析を行うことによって、ケイ酸層が形成されたかどうかを確認するとともに、取得された微生物の耐酸性を野生株の耐酸性と比較して耐酸性の向上を確認することによって実施することができる。
【００５７】
以下実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。
【実施例】
【００５８】
〔方法〕
＜ケイ素濃度測定法＞
ケイ酸の形態で存在しているケイ素の濃度を測定するため、Silicate （Silicic Acid） Test（メルク社）のキットを用いた。超純水７８０μｌに測定試料２０μｌを加え、キット中のsolution Iを１５μl添加して攪拌後、３分間室温で静置した。そしてsolution IIを１５μl添加して攪拌後、solution IIIを８０μl加えた。攪拌後１０分間室温で静置し、波長８１０ｎｍの吸光度を吸光度計（DU800, ベックマン・コールター社製）にて測定した。１０００μｇ/ｍｌ ケイ素標準液（メルク社製）を０〜１００μｇ/ｍｌの範囲になるように超純水で希釈し、それぞれの溶液の吸光度とケイ素濃度との傾きから、ケイ素濃度の検量線は作成された。この検量線を用いて算出した試料のケイ素濃度をオルトケイ酸濃度に換算したものをケイ酸濃度とした。
【００５９】
＜ケイ酸蓄積試験および菌体顕微鏡観察＞
発明者らがケイ酸高蓄積菌として単離した、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）およびバチルス・シューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）の近縁種と同定されたバチルス属（Bacillus属）細菌 Ｎｏ．６４株（「Ｎｏ．６４株」という）を用いた。Ｎｏ．６４株を、２ｍｌのＲ２Ａ液体培地（0.05% 酵母エキス、0.05% ペプトン、0.05% カザミノ酸、0.05% グルコース、0.05% 可溶性デンプン、0.03% K2HPO4、0.005% MgSO4・7H2O、0.03% ピルビン酸ナトリウム、ｐＨ7.2）に植菌し、２８℃で２４時間前培養を行った。１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したＲ２Ａ培地（本実施例では「Ｒ２Ａ」と表記）、または改変Ｒ２Ａ培地（Ｒ２Ａ培地に微量金属（0.2 mM CaCl2、0.01 mM MnCl2・4H2O、0.05 mM ZnCl2、0.05 mM FeSO4・7H2O）が添加された培地：本実施例では「ｍＲ２Ａ」と表記）の液体培地４ｍｌに、上記前培養液を１％（ｖ/ｖ）となるように植菌し、２８℃で培養した。経時的に培養液を５０μｌずつサンプリングし、サンプルの吸光度測定（波長６００ｎｍ）の測定を行した後、当該サンプルを1,3000 rpmで３分間遠心分離に供した。遠心分離によって得られた上清についてケイ素濃度測定、および菌体の顕微鏡観察 (BX60、オリンパス社製)を行った。
【００６０】
＜ケイ酸蓄積における微量金属の影響＞
Ｎｏ．６４株をＲ２Ａの液体培地２ｍｌに植菌し、２８℃で２４時間前培養を行った。１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したＲ２Ａ、１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したｍＲ２Ａ、または１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したｍＲ２Ａから各微量金属（Ｆｅ、Ｃａ、Ｚｎ、Ｍｎ）をそれぞれ除去したｍＲ２Ａ（それぞれ「ｍＲ２Ａ（−Ｆｅ）」、「ｍＲ２Ａ（−Ｃａ）」、「ｍＲ２Ａ（−Ｚｎ）」、「ｍＲ２Ａ（−Ｍｎ）」という）の液体培地３ｍｌに、上記前培養液を１％（ｖ/ｖ）となるように植菌し、２８℃で培養した。経時的に培養液を５０μｌずつサンプリングし、サンプルを13,000 rpmで３分間遠心分離に供した。遠心分離により得られた上清のケイ素濃度測定を行った。
【００６１】
＜胞子作製＞
Ｎｏ．６４株をＲ２Ａの液体培地２ｍｌに植菌し、２８℃で２４時間前培養を行った。１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したｍＲ２Ａ、またはケイ酸を添加していないｍＲ２Ａの液体培地５０ｍｌに、上記前培養液を１％（ｖ/ｖ）となるように植菌した。２８℃で４８時間培養後、ほぼ全ての細胞が胞子になっていること（９９％以上）を顕微鏡で確認し、４℃で１２時間静置した。その後6,000 rpm、１０分間遠心分離に供した。上清を除去した後、菌体ペレットを、滅菌水２０ｍｌを用いて２回洗浄した。洗浄後のペレットを滅菌水２０ｍｌで再懸濁し、使用するまで４℃で保存した。１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したｍＲ２Ａで作製した胞子を「Ｓｉ＋胞子」、ケイ酸を添加していないｍＲ２Ａで作製した胞子を「Ｓｉ−胞子」とした。なお両者をあわせて表記する場合は「Ｓｉ±胞子」と表記する。
【００６２】
＜走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察用サンプル調製＞
上記で作製したＳｉ±胞子菌液５ｍｌを6,000 rpm、１０分間遠心分離後、上清を除去した。その胞子ペレットを２．５％（ｗ/ｖ）グルタルアルデヒド１ｍｌで懸濁し、４℃で２時間静置した。その後15,000 rpm、３分間遠心分離後、上清を除去し、ペレットを滅菌水１ｍｌで３回洗浄した。その後３０％（ｖ/ｖ）エタノール１ｍｌでペレットを懸濁し、１分間 室温で静置後、15,000 rpm、３分間遠心分離後、上清を除去した（脱水操作）。この脱水作業を５０％（ｖ/ｖ）エタノール（１分間 室温で静置１回）、７０％（ｖ/ｖ）エタノール（５分間 室温で静置１回、１０分間 室温で静置１回）、８０％（ｖ/ｖ）エタノール（５分間 室温で静置１回、１０分間 室温で静置１回）、９０％（ｖ/ｖ）エタノール（１０分間 室温で静置２回）、９５％（ｖ/ｖ）エタノール（１０分間 室温で静置２回）、９９.５％（ｖ/ｖ）エタノール（１５分間 室温で静置２回）、そして９９％（ｖ/ｖ） t-ブチルアルコール（２０分間 室温で静置３回）でも同様に行った。最後に胞子ペレットを凍結乾燥（FRD-50M, イワキ社製）して、ＳＥＭ用のサンプルとした。
【００６３】
＜走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察および元素分析＞
上記で作製したＳＥＭ用サンプルをオートファインコータ（JFC-1600, 日本電子社製）を用いて白金コーティングし、走査型電子顕微鏡（JSM-5900, 日本電子社製）により観察した（倍率 10,000倍, 加速電圧 25 kV, 作動距離 10 mm, スポットサイズ 約30, 信号 SEI）。胞子の元素分析（ＳＥＭ-ＥＤＸ）は、エネルギー分散形Ｘ線分析装置（JED-2200, 日本電子社製）を用いて行われた（倍率 50,000倍, 加速電圧 25 kV, 作動距離 10 mm, 信号 SEI）。
【００６４】
＜透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察用サンプル調製＞
上記で作製したＳｉ±の胞子菌液５００μｌを、15,000 rpm、３分間遠心分離後、上清を除去した。その胞子ペレットを２．５％（ｗ/ｖ）グルタルアルデヒドを含む０．１％（ｗ/ｖ） MgSO4、０．１Ｍ カコジル酸ナトリウム、pH 7.2の緩衝液１ｍｌに懸濁し、４℃で２時間静置した。その後、上記緩衝液１ｍｌで１回遠心洗浄を行い、１％（ｖ/ｖ）四酸化オスミウムを含む０．２Ｍ カコジル酸ナトリウム、pH 7.4の緩衝液１ｍｌに懸濁し、４℃で３６時間静置した。15,000 rpm、３分間遠心分離を行って上清を除き、４５℃で融解させておいたＬＭＰ agar ３０μｌで懸濁し（約109 spores/ml）、スライドガラス（松浪社製）上に懸濁液を滴下後、氷上に１５分間静置して固化させた。カミソリを用いて１〜２ｍｍ3程度になるようカットした後、５０％（ｖ/ｖ）エタノール１ｍｌで懸濁し、５分間室温で静置後、15,000 rpm、３分間遠心分離し、上清を除く操作を合計３回行った（脱水操作）。この脱水操作を、この脱水作業を７０％（ｖ/ｖ）エタノール（５分間 室温で静置３回）、８０％（ｖ/ｖ）エタノール（５分間 室温で静置３回）、９０％（ｖ/ｖ）エタノール（１０分間 室温で静置３回）、９５％（ｖ/ｖ）エタノール（１０分間 室温で静置３回）、９９．５％（ｖ/ｖ）エタノール（１０分間 室温で静置３回）、そして９９％（ｖ/ｖ） プロピレンオキサイド（１５分間 室温で静置３回）でも同様に行った。
【００６５】
その後、４５％（ｗ/ｖ） Epok 812、３１％（ｗ/ｖ） DDSA、２４％（ｗ/ｖ） MNAの混合液１ｍｌに懸濁し、室温で１２時間静置した。その後、サンプルをビームカプセルに入れ、包埋液（４５％（ｗ/ｖ） Epok 812、３０％（ｗ/ｖ） DDSA、２３％（ｗ/ｖ） MNA、２％（ｗ/ｖ） DMP-30）でカプセルを満たし、６０℃で４８時間静置して固化させ、それをウルトラミクロトーム（ライカマイクロシステムズ社製）で超薄切片（８０〜９０ｎｍ厚）にした。その後、Ｓｉ±の超薄切片を９．２％（ｗ/ｖ） 酢酸ウラニルに浸し、室温で２０分間静置した。そして滅菌水で超薄切片を洗浄し、水分を除去した後、クエン酸鉛溶液（２．６６％（ｗ/ｖ） 硝酸鉛、３．５２％（ｗ/ｖ）クエン酸三ナトリウム二水和物、０．１６Ｎ ＮａＯＨ）に浸し、１０分間室温で静置後、滅菌水で洗浄し、乾燥させたものをＴＥＭ用サンプルとした。
【００６６】
＜透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察および元素分析＞
上記で作製したＴＥＭ用サンプルをカーボン真空蒸着によりコーティングし、透過型電子顕微鏡（JEM1200EX, 日本電子社製）により観察した（倍率 30,000倍, 加速電圧 80 kV）。サンプルの元素分析（ＴＥＭ-ＥＤＸ）は、エネルギー分散形Ｘ線分析装置（HD-2000, 日立）を用いて行われた（倍率 300,000倍, 加速電圧 200 kV）。
【００６７】
＜Ｓｉ±胞子の塩酸耐性試験＞
発明者らがケイ酸高蓄積菌として単離した、バチルス・シャンドンゲンシス（Bacillus shandongensis）の近縁種と同定されたバチルス属（Bacillus属）細菌 Ｎｏ．２２１株（「Ｎｏ．２２１株」という）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus NBRC 15305、以下「１５３０５株」と表記）およびバチルス・シューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis NBRC 101235、「１０１２３５株」と表記）のＳｉ±胞子を、Ｎｏ．６４株と同様にして作製した。
【００６８】
Ｎｏ．６４株、Ｎｏ．２２１株、１５３０５株、および１０１２３５株のＳｉ±胞子それぞれを滅菌水でＯＤ600＝１になるよう希釈し、１ｍｌずつ13,000 rpm、３分間遠心分離を行った。上清を除去し、胞子ペレットを０．２Ｎ ＨＣｌ １ｍｌで懸濁し、２８℃で一定時間インキュベート後、１００μｌサンプリングし、それを適宜滅菌水で希釈してＲ２Ａプレートに塗布した。Ｒ２Ａプレートを２８℃、４８時間培養後、コロニー数を数えて菌濃度を算出した。コントロールとしてＨＣｌの代わりに滅菌水１ｍｌで胞子ペレットを懸濁した場合についても同様にして菌濃度を算出した。コントロールの菌濃度を１００％として、ＨＣｌ処理後の生存率を計算した。
【００６９】
＜Ｓｉ±胞子の硫酸耐性試験および硝酸耐性試験＞
Ｎｏ．６４株の胞子について０．２Ｎ ＨＣｌの代わりに０．８Ｎの Ｈ2ＳＯ4 または０．１Ｎ ＨＮＯ３を用いる以外は、塩酸耐性試験と同様にして硫酸耐性試験または硝酸耐性試験を行った。この試験はＮｏ．６４株の胞子についてのみ行われた。
【００７０】
＜Ｓｉ＋胞子のＳｉ蓄積量の検討＞
Ｎｏ．２２１株のＳｉ±胞子についてＳｉ蓄積量を検討した。方法は、２２１株が取り込んだＳｉ量を培養液中に存在する２２１株の細胞数（colony forming unit:CFU）で除し、その値を胞子あたりのＳｉ蓄積量とした。
【００７１】
〔結果〕
＜ケイ酸蓄積試験および菌体顕微鏡観察＞
Ｎｏ．６４株を、１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）が添加されたＲ２Ａ、または１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）が添加されたｍＲ２Ａで培養した際の、吸光度（波長６００ｎｍ）の経時変化、培養上清中のケイ酸濃度の経時変化、および菌体の顕微鏡像を図２に示す。
【００７２】
図２（ａ）は吸光度（波長６００ｎｍ）の経時変化（黒丸のシンボルで表記）と培養上清中のケイ酸濃度（白四角のシンボルで表記）とを示すグラフである。図２（ａ）中「ｍＲ２Ａ」と記載されたグラフは１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）が添加されたｍＲ２Ａを用いてＮｏ．６４株を培養した結果であり、「Ｒ２Ａ」と記載されたグラフは１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）が添加されたＲ２Ａを用いてＮｏ．６４株を培養した結果である。グラフの横軸は培養時間（ｈ）であり、縦軸は吸光度（波長６００ｎｍ）および培養上清中のケイ酸濃度である。
【００７３】
一方、図２（ｂ）は培養１２時間後（図上部に「１２ｈ」と表記）、２４時間後（図上部に「２４ｈ」と表記）、および４８時間後（図上部に「４８ｈ」と表記）の菌体の顕微鏡像である。図２（ｂ）の左部に「ｍＲ２Ａ」と記載された行は、１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）が添加されたｍＲ２Ａを用いてＮｏ．６４株を培養した結果であり、図２（ｂ）の左部「Ｒ２Ａ」と記載された行は１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）が添加されたＲ２Ａを用いてＮｏ．６４株を培養した結果である。
【００７４】
Ｒ２Ａ（ケイ酸含有）を用いた場合ではケイ酸の減少（すなわち取り込み）が見られず、ｍＲ２Ａ（ケイ酸含有）を用いた場合ではそれが確認された。ｍＲ２Ａ（ケイ酸含有）で培養したときの顕微鏡像を見ると、ケイ酸の取り込みが始まった２４時間培養時に、細胞内の内生胞子が観察され、４８時間培養後には全ての細胞が胞子になっていた。一方、Ｒ２Ａ（ケイ酸含有）で培養した場合では、胞子形成はされていなかった。このことから、ケイ酸は胞子形成時に蓄積されることが判明した。
【００７５】
＜ケイ酸蓄積における微量金属の影響＞
１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したＲ２Ａ（「Ｒ２Ａ」と表記）、１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したｍＲ２Ａ（「ｍＲ２Ａ」と表記）、または１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したｍＲ２Ａから各微量金属（Ｆｅ、Ｃａ、Ｚｎ、Ｍｎ）をそれぞれ除去したｍＲ２Ａ培地（それぞれ「ｍＲ２Ａ（−Ｆｅ）」、「ｍＲ２Ａ（−Ｃａ）」、「ｍＲ２Ａ（−Ｚｎ）」、「ｍＲ２Ａ（−Ｍｎ）」と表記）をそれぞれ用いて、Ｎｏ．６４株を培養した際の、培養上清中のケイ酸濃度の経時変化を図３に示す。
【００７６】
図３（ａ）はｍＲ２Ａを用いた場合の結果、（ｂ）はＲ２Ａを用いた場合の結果、（ｃ）はｍＲ２Ａ（−Ｆｅ）を用いた場合の結果、（ｄ）はｍＲ２Ａ（−Ｃａ）を用いた場合の結果、（ｅ）ｍＲ２Ａ（−Ｚｎ）を用いた場合の結果、（ｆ）はｍＲ２Ａ（−Ｍｎ）を用いた場合の結果を示す。
【００７７】
ｍＲ２Ａ（−Ｍｎ）では、Ｒ２Ａと同様にケイ酸の取り込みが見られなかった。これは、Ｍｎがないと胞子形成が著しく阻害されるためであると考えられる（参考文献：Weinberg ED., Manganese requirement for sporulation and other secondary biosynthetic processes of Bacillus. Appl Microbiol, 12, 436-441 (1964)）。また、ｍＲ２Ａ（−Ｃａ）では、ケイ酸蓄積量の低下が確認された。ｍＲ２Ａ（−Ｚｎ）では、ケイ酸蓄積量は変化しなかったが、蓄積後の放出量の増加が見られた。そして、ｍＲ２Ａ（−Ｆｅ）では、ｍＲ２Ａの結果と同様の結果を示した。上記の結果から、Ｚｎは胞子内にケイ酸を安定的に保持するために重要であることが分かった。
【００７８】
＜Ｓｉ±胞子の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察および元素分析＞
Ｎｏ．６４株の培養上清中のケイ素濃度の低下が、菌体のケイ酸の蓄積によるものであることを確認すべく、１００μｇ/ｍｌケイ酸（オルトケイ酸換算）を添加したｍＲ２Ａ、またはケイ酸を添加していないｍＲ２Ａをそれぞれ用いて、Ｎｏ．６４株を培養した際に形成された胞子について、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察およびＳＥＭ-ＥＤＸにより元素分析を行った。その結果を図４に示す。図４（ａ）はケイ酸を添加していないｍＲ２Ａで培養して得られた胞子（「Ｓｉ−」と表記）の結果、（ｂ）はケイ酸を添加したｍＲ２Ａで培養して得られた胞子（「Ｓｉ＋」と表記）の結果を示す。図４（ｂ）の矢印はケイ素のピークを示す。
【００７９】
図４の結果からＮｏ．６４株のＳｉ±胞子を観察したところ、表面の構造的な違いは見られなかった。さらにＳｉ±胞子の元素分析（ＳＥＭ-ＥＤＸ）を行った結果、Ｓｉ＋胞子に高いケイ素のピークが見られた。よって、Ｎｏ．６４株はケイ酸を確かに蓄積していることが明らかになった。
【００８０】
＜Ｓｉ±胞子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察および元素分析＞
胞子内のケイ素の形態および局在を調べるため、Ｓｉ±胞子の切片のＴＥＭ観察を行った。その結果を図５および６に示した。図５（ａ）、（ｃ）はＳｉ−胞子のＴＥＭ像であり、図５（ｂ）、（ｄ）はＳｉ＋胞子のＴＥＭ像である。また図６（ａ）は図５（ａ）の四角部分の拡大図であり、図６（ｂ）は図５（ｂ）の四角部分の拡大図である。なお図５および６中の「ＥＸ」はexosporiumを示し、「ＯＣ」はouter coatを示し、「ＩＣ」はinner coatを示し、「ＣＸ」はcortexを示し、ＣＲはcoreを示す（以後、他の図においても同じ）。
【００８１】
図５および６から、Ｓｉ−胞子とＳｉ＋胞子間とでＯＣの構造に変化が見られた。すなわち、Ｓｉ−胞子のＯＣに比して、Ｓｉ＋胞子のＯＣに肥大化が見られた。特に顕著な構造変化が見られた箇所を図５（ｂ）中、矢印で示す。
【００８２】
この構造変化を解析すべく、Ｓｉ±胞子の元素分析（ＴＥＭ-ＥＤＸ）を行った。その結果を図１および図７に示す。図７（ａ）Ｓｉ−胞子のＴＥＭ像、（ｂ）はＳｉ−胞子のＴＥＭ-ＥＤＸの結果、（ｃ）はＳｉ＋胞子のＴＥＭ像、（ｄ）はＳｉ＋胞子のＴＥＭ-ＥＤＸの結果を示す。また図１（ａ）はＳｉ＋胞子（一部）のＴＥＭ像であり、（ｂ）はＳｉ＋胞子（一部）のＴＥＭ-ＥＤＸの結果を示す。ＴＥＭ-ＥＤＸの結果中に示されるドットはケイ素を表している。図７（ｄ）および図１（ｂ）においてＳｉ＋胞子のＯＣにケイ素のドットの集中が見られたことから、Ｓｉ＋胞子のＯＣにはケイ素（つまりケイ酸）が高密度で存在していることが確認された。
＜Ｓｉ±胞子の耐酸性試験＞
塩酸耐性試験の結果を図８および図１０に示す。図８（ａ）はＮｏ．６４株のＳｉ±胞子の結果、（ｂ）は１５３０５株のＳｉ±胞子の結果、（ｃ）は１０１２３５株のＳｉ±胞子の結果、図１０（ａ）はＮｏ．２２１株のＳｉ±胞子の結果を示す。また硫酸耐性試験の結果を図９（ａ）に示し、硝酸耐性試験の結果を図９（ｂ）に示す。図８〜１０中、黒四角のシンボルはＳｉ＋胞子の結果を示し、黒丸のシンボルはＳｉ−胞子の結果を示す。また図１０（ｂ）にＮｏ．２２１株の胞子について、Ｓｉの蓄積量と塩酸耐性との関係を示した。図１０（ｂ）中、白丸のシンボルは１時間塩酸処理を行った場合の結果を示し、白四角のシンボルは２時間塩酸処理を行った場合の結果を示す。
【００８３】
図８、図９および図１０（ａ）の結果から、Ｓｉ＋胞子は明らかに耐酸性が向上していることが確かめられた。またＮｏ．６４株、１５３０５株、１０１２３５株、Ｎｏ．２２１株共に同様の結果が得られたことから、ＯＣにおけるケイ酸の蓄積による耐酸性向上の効果は、微生物の種類に限定されるものではないことが確認された。
【００８４】
さらに図１０（ｂ）の結果からケイ素（ケイ酸）の蓄積量に応じて塩酸耐性が向上していることが確認され、塩酸耐性の向上はケイ素（ケイ酸）の蓄積によるものであるということがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
上記説示したように、本発明によれば、微生物の耐酸性を野生株に比して向上させることができる。よってプロバイオティクスや浄水処理等、微生物の耐酸性が求められる分野において本発明は特に奏効する。
【００８６】
したがって本発明は、微生物を取り扱う分野、例えば、医薬品、食品、環境産業などに利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面にケイ酸からなるケイ酸層を備える生菌であり、
且つ耐酸性が野生株に比して向上していることを特徴とする微生物。
【請求項２】
細菌である、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の微生物を作製するための方法であって、
微生物の細胞表面にケイ酸からなるケイ酸層を形成するケイ酸層形成工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
上記微生物は、細菌であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記微生物が胞子を形成し得る微生物である場合において、
上記ケイ酸層形成工程は、ケイ酸および亜鉛を含む胞子形成培地を用いて微生物を培養する工程である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
上記胞子形成培地は、オルトケイ酸換算で１００μｇ/ｍｌ以上のケイ酸を含む胞子形成培地である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記ケイ酸層形成工程は、微生物の細胞表面にケイ酸重合体を形成させる工程である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項８】
微生物の耐酸性を野生株に比して向上させる方法であって、
微生物の細胞表面に、ケイ酸からなるケイ酸層を形成するケイ酸層形成工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
上記微生物は、細菌であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記微生物が胞子を形成し得る微生物である場合において、
上記ケイ酸層形成工程は、ケイ酸および亜鉛を含む胞子形成培地を用いて微生物を培養する工程である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
上記胞子形成培地は、オルトケイ酸換算で１００μｇ/ｍｌ以上のケイ酸を含む胞子形成培地である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
上記ケイ酸層形成工程は、微生物の細胞表面にケイ酸重合体を形成させる工程である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１または２に記載の微生物を含む生菌製剤。
【請求項１４】
請求項１または２に記載の微生物を含む食品。
【請求項１５】
請求項１または２に記載の微生物を用いることを特徴とする浄水方法。
【請求項１】
細胞表面にケイ酸からなるケイ酸層を備える生菌であり、
且つ耐酸性が野生株に比して向上していることを特徴とする微生物。
【請求項２】
細菌である、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の微生物を作製するための方法であって、
微生物の細胞表面にケイ酸からなるケイ酸層を形成するケイ酸層形成工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
上記微生物は、細菌であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記微生物が胞子を形成し得る微生物である場合において、
上記ケイ酸層形成工程は、ケイ酸および亜鉛を含む胞子形成培地を用いて微生物を培養する工程である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
上記胞子形成培地は、オルトケイ酸換算で１００μｇ/ｍｌ以上のケイ酸を含む胞子形成培地である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記ケイ酸層形成工程は、微生物の細胞表面にケイ酸重合体を形成させる工程である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項８】
微生物の耐酸性を野生株に比して向上させる方法であって、
微生物の細胞表面に、ケイ酸からなるケイ酸層を形成するケイ酸層形成工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
上記微生物は、細菌であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記微生物が胞子を形成し得る微生物である場合において、
上記ケイ酸層形成工程は、ケイ酸および亜鉛を含む胞子形成培地を用いて微生物を培養する工程である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
上記胞子形成培地は、オルトケイ酸換算で１００μｇ/ｍｌ以上のケイ酸を含む胞子形成培地である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
上記ケイ酸層形成工程は、微生物の細胞表面にケイ酸重合体を形成させる工程である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１または２に記載の微生物を含む生菌製剤。
【請求項１４】
請求項１または２に記載の微生物を含む食品。
【請求項１５】
請求項１または２に記載の微生物を用いることを特徴とする浄水方法。
【図３】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１０−２５９３４１（Ｐ２０１０−２５９３４１Ａ）
【公開日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１１０９７７（Ｐ２００９−１１０９７７）
【出願日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]