細胞評価装置、インキュベータ、細胞評価方法、細胞評価プログラムおよび細胞の培養方法
【課題】細胞を染色せずに、細胞の状態を推定する細胞評価装置を提供する。
【解決手段】第１の種類の細胞と第１の種類の細胞の周囲に存在し、共に培養されている第２の種類の細胞とが撮像された対象画像において、第１の種類の個別の細胞および細胞の集合体が占める領域と第２の種類の細胞が占める領域とを抽出する領域抽出部４４と、領域抽出部４４で抽出された第２の種類の細胞が占める領域に存在する第２の種類の細胞の形態的特徴を示す特徴量を算出する特徴量算出部４５と、第２の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量と、第１の種類の細胞の状態との対応関係に基づいて、第１の種類の細胞の状態を評価する評価処理部４８と、を備える。
【解決手段】第１の種類の細胞と第１の種類の細胞の周囲に存在し、共に培養されている第２の種類の細胞とが撮像された対象画像において、第１の種類の個別の細胞および細胞の集合体が占める領域と第２の種類の細胞が占める領域とを抽出する領域抽出部４４と、領域抽出部４４で抽出された第２の種類の細胞が占める領域に存在する第２の種類の細胞の形態的特徴を示す特徴量を算出する特徴量算出部４５と、第２の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量と、第１の種類の細胞の状態との対応関係に基づいて、第１の種類の細胞の状態を評価する評価処理部４８と、を備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞評価装置、インキュベータ、細胞評価方法、細胞評価プログラムおよび細胞の培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、細胞の培養状態を評価する技術は、再生医療などの先端医療分野や医薬品のスクリーニングを含む幅広い分野での基盤技術となっている。例えば、再生医療分野では、インビトロで細胞を増殖、分化させるプロセスが存在する。そして、上記のプロセスでは、細胞の分化の成否、細胞の癌化や感染の有無を管理するために、細胞の培養状態を的確に評価することが不可欠である。一例として、マーカーとして転写因子を用いたがん細胞の評価方法が開示されている（特許文献１参照）。
【０００３】
一方、ＥＳ（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ、胚性幹）細胞またはｉＰＳ（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ、誘導多能性幹）細胞などの万能細胞は、理論上すべての組織に分化する分化多能性を保ちつつ、ほぼ無限に増殖させる事ができるため、医薬開発および再生医療への応用に注目が集まっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−１９５５３３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ｉＰＳ細胞を再生医療に応用する際には、状態が良いｉＰＳ細胞だけ抽出する必要があるため、培養しているｉＰＳ細胞の状態を評価することが必要となる。しかしながら、従来の技術では、ｉＰＳ細胞を染色マーカーで染色せずに、ｉＰＳ細胞の状態を評価できないという問題があった。
【０００６】
そこで本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、細胞を染色せずに、細胞の状態を推定する細胞評価装置、インキュベータ、細胞評価方法、細胞評価プログラムおよび細胞の培養方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記問題を解決するために、本発明は、第１の種類の細胞と前記第１の種類の細胞の周囲に存在し、共に培養されている第２の種類の細胞とが撮像された対象画像において、前記第１の種類の個別の細胞および細胞の集合体が占める領域と前記第２の種類の細胞が占める領域とを抽出する領域抽出部と、前記領域抽出部で抽出された第２の種類の細胞が占める領域に存在する前記第２の種類の細胞の形態的特徴を示す特徴量を算出する第１の特徴量算出部と、前記第２の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量と、前記第１の種類の細胞の状態との対応関係に基づいて、第１の種類の細胞の状態を評価する評価処理部と、を備えることを特徴とする細胞評価装置である。
【０００８】
また、本発明は、細胞を培養する培養容器を収納するとともに、所定の環境条件に内部を維持可能な恒温室と、前記恒温室内で前記培養容器に含まれる前記細胞の画像を撮像する撮像装置と、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の細胞評価装置と、を備えることを特徴とするインキュベータである。
【０００９】
また、本発明は、第１の種類の細胞と前記第１の種類の細胞の周囲に存在し、共に培養されている第２の種類の細胞とが撮像された対象画像において、前記第１の種類の個別の細胞および細胞の集合体が占める領域と前記第２の種類の細胞が占める領域とを抽出する領域抽出手順と、前記領域抽出手順で抽出された第２の種類の細胞が占める領域に存在する前記第２の種類の細胞の形態的特徴を示す特徴量を算出する第１の特徴量算出手順と、前記第２の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量と、前記第１の種類の細胞の状態との対応関係に基づいて、第１の種類の細胞の状態を評価する評価処理手順と、を有することを特徴とする細胞評価方法である。
【００１０】
また、本発明は、第１の種類の細胞と前記第１の種類の細胞の周囲に存在し、共に培養されている第２の種類の細胞とが撮像された対象画像において、前記第１の種類の個別の細胞および細胞の集合体が占める領域と前記第２の種類の細胞が占める領域とを抽出する第１のステップと、前記第１のステップで抽出された第２の種類の細胞が占める領域に存在する前記第２の種類の細胞の形態的特徴を示す特徴量を算出する第２のステップと、前記第２の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量と、前記第１の種類の細胞の状態との対応関係に基づいて、第１の種類の細胞の状態を評価する第３のステップと、をコンピュータに実行させるための細胞評価プログラムである。
【００１１】
また、本発明は、第１の種類の細胞と前記第１の種類の細胞の周囲に存在し、共に培養されている第２の種類の細胞が撮像された画像から、前記第２の種類の細胞の形態的特徴を示す特徴量を抽出し、前記第２の種類の細胞の形態的特徴を示す特徴量に基づき、第１の種類の細胞の状態を推定し、前記第１の細胞の状態に基づき、前記第１の種類の細胞又は前記第２の種類の細胞の培養条件を変更することを特徴とする細胞の培養方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、細胞を染色せずに、細胞の状態を推定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施形態であるインキュベータの正面図である。
【図２】本発明の実施形態であるインキュベータの平面図である。
【図３】本発明の第１の実施例であるインキュベータのブロック構成図である。
【図４】ｉＰＳ細胞と共培養されているフィーダー細胞とが撮像された画像から、ｉＰＳ細胞のコロニーの領域とフィーダー細胞の領域とを抽出する処理を説明するための図である。
【図５】抽出されたｉＰＳ細胞のコロニーの領域と、フィーダー細胞の領域とを説明するための図である。
【図６】細胞の形態の各特徴量を説明するための図である。
【図７】ある特徴量についての計算モデルのパラメータを格納するテーブルを説明するための図である。
【図８】Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋの概要を説明するための図である。
【図９】Ｆｕｚｚｙ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋの概要を説明するための図である。
【図１０】Ｆｕｚｚｙ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋにおけるシグモイド関数を説明するための図である。
【図１１】インキュベータにおける観察処理の一例を示すフローチャートである。
【図１２】計算モデル用の教師値の算出を説明するためのフローチャートである。
【図１３】計算モデルの構築を説明するためのフローチャートである。
【図１４】計算モデルを用いたｉＰＳ細胞の分化度を推定するためのフローチャートである。
【図１５】本発明の第２の実施例であるインキュベータのブロック構成図である。
【図１６】画像別、コロニー＋フィーダーモデルの決定木を説明するための図である。
【図１７】画像別、コロニー・フィーダー別モデルの決定木を説明するための図である。
【図１８】細胞別、コロニー・フィーダー別モデルの決定木を説明するための図である。
【図１９】決定木算出用の教師値の算出を説明するためのフローチャートである。
【図２０】決定木算出用の特徴量の算出を説明するためのフローチャートである。
【図２１】画像別の決定木の算出を説明するためのフローチャートである。
【図２２】細胞別の決定木算出を説明するためのフローチャートである。
【図２３】図１６に示す画像別、コロニー＋フィーダーモデルを用いたｉＰＳ細胞の状態の推定を説明するためのフローチャートである。
【図２４】図１７に示す画像別、コロニー・フィーダー別モデルを用いたｉＰＳ細胞の状態の推定を説明するためのフローチャートである。
【図２５】図１８に示す細胞別、コロニー・フィーダー別モデルを用いたｉＰＳ細胞の状態の推定を説明するためのフローチャートである。
【図２６】本発明の実施例２の細胞評価プログラムを用いた細胞の培養方法を説明するためのフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための形態について、図面を参照して詳細に説明する。本発明の実施形態では、ｉＰＳ細胞と、ｉＰＳ細胞の周囲に存在しｉＰＳ細胞に栄養素などを供給する１種類のフィーダー細胞とが共に培養されている。
【００１５】
＜実施例１＞
一般的に、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、その分化能力が高いほどその品質が良いと考えられている。従って、本発明の実施例１では、ｉＰＳ細胞の状態を推定するのに、全体の細胞に占める分化した細胞の割合（以下、分化度と称する）を指標とする。
図１は、本発明の実施形態であるインキュベータの正面図である。図２は、本発明の実施形態であるインキュベータの平面図である。
【００１６】
恒温室１５の前面には、大扉１６、中扉１７、小扉１８が配置されている。大扉１６
は、上部ケーシング１２および下部ケーシング１３の前面を覆っている。中扉１７は、上
部ケーシング１２の前面を覆っており、大扉１６の開放時に恒温室１５と外部との環境を
隔離する。小扉１８は、細胞を培養する培養容器１９を搬出入するための扉であって、中
扉１７に取り付けられている。この小扉１８から培養容器１９を搬出入することで、恒温
室１５の環境変化を抑制することが可能となる。なお、大扉１６、中扉１７、小扉１８
は、パッキンＰ１，Ｐ２，Ｐ３によりそれぞれ気密性が維持されている。
【００１７】
また、恒温室１５には、ストッカー２１、観察ユニット２２、容器搬送装置２３、搬送
台２４が配置されている。ここで、搬送台２４は、小扉１８の手前に配置されており、培
養容器１９を小扉１８から搬出入する。
【００１８】
ストッカー２１は、上部ケーシング１２の前面（図２の下側）からみて恒温室１５の左
側に配置される。ストッカー２１は複数の棚を有しており、ストッカー２１の各々の棚に
は培養容器１９を複数収納することができる。なお、各々の培養容器１９には、培養の対
象となる細胞が培地とともに収容されている。
【００１９】
ここで、観察ユニット２２は、上部ケーシング１２のベースプレート１４の開口部に嵌
め込まれて配置される。観察ユニット２２は、試料台３１と、試料台３１の上方に張り出
したスタンドアーム３２と、位相差観察用の顕微光学系および撮像装置（３４）を内蔵し
た本体部分３３と、を有している。そして、試料台３１およびスタンドアーム３２は恒温室１５に配置される一方で、本体部分３３は下部ケーシング１３内に収納される。
【００２０】
観察ユニット２２は、上部ケーシング１２の前面からみて恒温室１５の右側に配置され
る。この観察ユニット２２は、培養容器１９内の細胞のタイムラプス観察を実行すること
ができる。
【００２１】
ここで、観察ユニット２２は、上部ケーシング１２のベースプレート１４の開口部に嵌
め込まれて配置される。観察ユニット２２は、試料台３１と、試料台３１の上方に張り出
したスタンドアーム３２と、位相差観察用の顕微光学系および撮像装置（３４）を内蔵し
た本体部分３３と、を有している。そして、試料台３１およびスタンドアーム３２は恒温室１５に配置される一方で、本体部分３３は下部ケーシング１３内に収納される。
【００２２】
試料台３１は透光性の材質で構成されており、その上に培養容器１９を載置することが
できる。この試料台３１は水平方向に移動可能に構成されており、上面に載置した培養容
器１９の位置を調整できる。また、スタンドアーム３２にはＬＥＤ光源３５が内蔵されて
いる。そして、撮像装置３４は、スタンドアーム３２によって試料台３１の上側から透過
照明された培養容器１９の細胞を、顕微鏡の光学系を介して撮像することで細胞の顕微鏡画像を取得する。
【００２３】
容器搬送装置２３は、上部ケーシング１２の前面からみて恒温室１５の中央に配置され
る。この容器搬送装置２３は、ストッカー２１、観察ユニット２２の試料台３１および搬
送台２４との間で培養容器１９の受け渡しを行う。
【００２４】
図２に示すように、容器搬送装置２３は、多関節アームを有する垂直ロボット３４と、回転ステージ３５と、ミニステージ３６と、アーム部３７とを有している。回転ステージ３５は、垂直ロボット３４の先端部に回転軸３５ａを介して水平方向に１８０°回転可能に取り付けられている。そのため、回転ステージ３５は、ストッカー２１、試料台３１および搬送台２４に対して、アーム部３７をそれぞれ対向させることができる。
【００２５】
また、ミニステージ３６は、回転ステージ３５に対して水平方向に摺動可能に取り付けられている。ミニステージ３６には培養容器１９を把持するアーム部３７が取り付けられている。
【００２６】
図３は、本発明の第１の実施例であるインキュベータのブロック構成図である。
第１の実施例のインキュベータ１１は、上部ケーシング１２と下部ケーシング１３とを有している。インキュベータ１１の組立状態において、上部ケーシング１２は下部ケーシング１３の上に載置される。なお、上部ケーシング１２と下部ケーシング１３との内部空間は、ベースプレート１４によって上下に仕切られている。
【００２７】
上部ケーシング１２は、温度調整装置１５ａと、湿度調整装置１５ｂと、容器搬送装置２３と、ＬＥＤ光源３５とを有している。
まず、上部ケーシング１２の構成の概要を説明する。上部ケーシング１２の内部には、
細胞の培養を行う恒温室１５が形成されている。この恒温室１５は温度調整装置１５ａお
よび湿度調整装置１５ｂを有している。
【００２８】
温度調整装置１５ａおよび湿度調整装置１５ｂは、恒温室１５内を細胞の培養に適した環境（例えば温度３７℃、湿度９０％）に維持する（なお、図１、図２での温度調整装置１５ａ、湿度調整装置１５ｂの図示は省略する）。
ＬＥＤ光源３５は、培養容器１９を照明する。
【００２９】
次に、下部ケーシング１３の構成の概要を説明する。下部ケーシング１３の内部には、観察ユニット２２の撮像装置３４や、インキュベータ１１の制御装置（細胞評価装置）４１が収納されている。
撮像装置３４は、上側から透過照明された培養容器１９の細胞を、顕微鏡の光学系を介して撮像することで細胞の顕微鏡画像を取得する。撮像装置３４は、その細胞の顕微鏡画像をＣＰＵ４２へ供給する。
【００３０】
制御装置（細胞評価装置）４１は、温度調整装置１５ａと、湿度調整装置１５ｂと、観察ユニット２２と、
容器搬送装置２３とそれぞれ接続されている。この制御装置４１は、所定のプログラムに
従ってインキュベータ１１の各部を統括的に制御する。
【００３１】
一例として、制御装置４１は、温度調整装置１５ａおよび湿度調整装置１５ｂをそれぞ
れ制御して恒温室１５内を所定の環境条件に維持する。また、制御装置４１は、所定の観
察スケジュールに基づいて、観察ユニット２２および容器搬送装置２３を制御して、培養
容器１９の観察シーケンスを自動的に実行する。さらに、制御装置４１は、観察シーケン
スで取得した画像に基づいて、細胞の状態の評価を行う培養状態評価処理を実行する。
【００３２】
制御装置４１は、ＣＰＵ４２と、記憶部４３と、を用いて構成されている。ＣＰＵ４２は、制御装置４１の各種の演算処理を実行するプロセッサである。
記憶部４３は、ハードディスクや、フラッシュメモリ等の不揮発性の記憶媒体などで構成される。この記憶部４３は、ストッカー２１に収納されている各培養容器１９に関する管理データと、撮像装置で撮像された顕微鏡画像のデータとを保持する。さらに、記憶部４３は、ＣＰＵ４２によって実行されるプログラムを保持する。
【００３３】
なお、上記の管理データには、（ａ）個々の培養容器１９を示すインデックスデータ、（ｂ）ストッカー２１での培養容器１９の収納位置、（ｃ）培養容器１９の種類および形状（ウェルプレート、ディッシュ、フラスコなど）、（ｄ）培養容器１９で培養されている細胞の種類、（ｅ）培養容器１９の観察スケジュール、（ｆ）タイムラプス観察時の撮像条件（対物レンズの倍率、容器内の観察地点等）、などが含まれている。また、ウェルプレートのように複数の小容器で同時に細胞を培養できる培養容器１９については、各々の小容器ごとにそれぞれ管理データが生成される。
【００３４】
また、記憶部４３は、予め用意されたサンプルの顕微鏡画像のデータを保持する。また、予め用意されたモデル構築用の顕微鏡画像のデータと、画像の教師値（例えば、分化の度合い）を保持する。
【００３５】
ＣＰＵ４２は、記憶部４３に記憶されているプログラムを読み出して実行することにより、領域抽出部４４と、特徴量算出部４５と、度数分布算出部４６と、指標抽出部４７と、評価処理部４８との各部の機能を実現する。
【００３６】
図４は、ｉＰＳ細胞と共培養されているフィーダー細胞とが撮像された画像から、ｉＰＳ細胞のコロニーの領域とフィーダー細胞の領域とを抽出する処理を説明するための図である。
領域抽出部４４は、予め用意されたサンプルの顕微鏡画像のデータを記憶部４３から読み込む。そして、領域抽出部４４は、上記のサンプルの顕微鏡画像のうちから、処理対象となる画像８１を指定する。そして、領域抽出部４４は、画像８１をＯｐｅｎ−Ｃｌｏｓｅフィルタをかけて、Ｏｐｅｎ−Ｃｌｏｓｅフィルタをかけた画像８２を生成する。
【００３７】
そして、領域抽出部４４は、画像８１から生成したＯｐｅｎ−Ｃｌｏｓｅフィルタをかけた画像８２を引き算した背景補正画像８３を生成する。これによって、画像８１のバックグラウンドの輝度を均一にすることができる。
【００３８】
領域抽出部４４は、背景補正画像８３に対して、画像内に含まれる細胞を抽出する。例えば、位相差顕微鏡で細胞を撮像すると、細胞壁のように位相差の変化の大きな部位の周辺にはハロが現れる。そのため、領域抽出部４４は、細胞壁に対応するハロを公知のエッジ抽出手法で抽出するとともに、輪郭追跡処理によってエッジで囲まれた閉空間を細胞と推定する。これにより上記の顕微鏡画像から個々の細胞を抽出することができる。
【００３９】
そして、領域抽出部４４は、背景補正画像８３から、ｉＰＳ細胞のコロニーの領域を抽出した画像８４を生成する。また、領域抽出部４４は、背景補正画像８３から、フィーダー細胞の領域を抽出した画像８５を生成する。
【００４０】
図５は、抽出されたｉＰＳ細胞のコロニーの領域と、フィーダー細胞の領域とを説明するための図である。
領域抽出部４４は、ｉＰＳ細胞のコロニーの領域を抽出した画像８４から、ｉＰＳ細胞のコロニーの領域９１を抜き出す。また、領域抽出部４４は、フィーダー細胞の領域を抽出した画像８５からフィーダー細胞の領域９２を抜き出す。
領域抽出部４４は、各観察時間におけるｉＰＳ細胞のコロニーの領域９１の情報と、そのフィーダー細胞の領域９２の情報とを、特徴量算出部４５へ供給する。
【００４１】
図６は、細胞の形態の各特徴量を説明するための図である。具体的に、細胞形態の特徴量は、例えば、以下の通りである。
「Ｔｏｔａｌ ａｒｅａ」（図６の（ａ）参照）は、注目する細胞の面積を示す値である。例えば、細胞形態の特徴量算出部４５は、注目する細胞の領域の画素数に基づいて「Ｔｏｔａｌ ａｒｅａ」の値を求めることができる。
【００４２】
「Ｈｏｌｅ ａｒｅａ」（図６の（ｂ）参照）は、注目する細胞内のＨｏｌｅの面積を示す値である。ここで、Ｈｏｌｅは、コントラストによって、細胞内における画像の明るさが閾値以上となる部分（位相差観察では白に近い状態となる箇所）を指す。例えば、細胞内小器官の染色されたリソソームなどがＨｏｌｅとして検出される。
また、画像によっては、細胞核や、他の細胞小器官がＨｏｌｅとして検出されうる。なお、細胞形態の特徴量算出部４５は、細胞内における輝度値が閾値以上となる画素のまとまりをＨｏｌｅとして検出し、このＨｏｌｅの画素数に基づいて「Ｈｏｌｅ ａｒｅａ」の値を求めればよい。
【００４３】
「ｒｅｌａｔｉｖｅ ｈｏｌｅ ａｒｅａ」（図６の（ｃ）参照）は、「Ｈｏｌｅ ａｒｅａ」の値を「Ｔｏｔａｌ ａｒｅａ」の値で除した値である（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｈｏｌｅ ａｒｅａ＝Ｈｏｌｅ ａｒｅａ／Ｔｏｔａｌ ａｒｅａ）。この「ｒｅｌａｔｉｖｅ ｈｏｌｅ ａｒｅａ」は、細胞の大きさにおける細胞内小器官の割合を示すパラメータであって、例えば細胞内小器官の肥大化や核の形の悪化などに応じてその値が変動する。
【００４４】
「Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ」（図６の（ｄ）参照）は、注目する細胞の外周の長さを示す値である。例えば、細胞形態の特徴量算出部４５は、細胞を抽出するときの輪郭追跡処理により「Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ」の値を取得することができる。
【００４５】
「Ｗｉｄｔｈ」（図６の（ｅ）参照）は、注目する細胞の画像横方向（Ｘ方向）での長さを示す値である。
「Ｈｅｉｇｈｔ」（図６の（ｆ）参照）は、注目する細胞の画像縦方向（Ｙ方向）での長さを示す値である。
【００４６】
「Ｌｅｎｇｔｈ」（図６の（ｇ）参照）は、注目する細胞を横切る線のうちの最大値（細胞の全長）を示す値である。
「Ｂｒｅａｄｔｈ」（図６の（ｈ）参照）は、「Ｌｅｎｇｔｈ」に直交する線のうちの最大値（細胞の横幅）を示す値である。
【００４７】
「Ｆｉｂｅｒ Ｌｅｎｇｔｈ」（図６の（ｉ）参照）は、注目する細胞を擬似的に線状と仮定した場合の長さを示す値である。細胞形態の特徴量算出部４５は、下式（１）により「Ｆｉｂｅｒ Ｌｅｎｇｔｈ」の値を求める。
【００４８】
【数１】
【００４９】
但し、本明細書の式において「Ｐ」はＰｅｒｉｍｅｔｅｒの値を示す。同様に「Ａ」はＴｏｔａｌ Ａｒｅａの値を示す。
【００５０】
「Ｆｉｂｅｒ Ｂｒｅａｄｔｈ」（図６の（ｊ）参照）は、注目する細胞を擬似的に線状と仮定した場合の幅（Ｆｉｂｅｒ Ｌｅｎｇｔｈと直交する方向の長さ）を示す値である。細胞形態の特徴量算出部４５は、下式（２）により「Ｆｉｂｅｒ Ｂｒｅａｄｔｈ」の値を求める。
【００５１】
【数２】
【００５２】
「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」（図６の（ｋ）参照）は、注目する細胞の円形度（細胞の丸さ）を示す値である。細胞形態の特徴量算出部４５は、下式（３）により「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の値を求める。
【００５３】
【数３】
【００５４】
「Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ ｆｏｒｍ Ｆａｃｔｏｒ」（図６の（ｌ）参照）は、「Ｌｅｎｇｔｈ」の値を「Ｂｒｅａｄｔｈ」の値で除した値（Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ ｆｏｒｍ Ｆａｃｔｏｒ＝Ｌｅｎｇｔｈ／Ｂｒｅａｄｔｈ）であって、注目する細胞の細長さの度合いを示すパラメータとなる。
【００５５】
「Ｉｎｎｅｒ ｒａｄｉｕｓ」（図６の（ｍ）参照）は、注目する細胞の内接円の半径を示す値である。
「Ｏｕｔｅｒ ｒａｄｉｕｓ」（図６の（ｎ）参照）は、注目する細胞の外接円の半径を示す値である。
【００５６】
「Ｍｅａｎ ｒａｄｉｕｓ」（図６の（ｏ）参照）は、注目する細胞の輪郭を構成する全点とその重心点との平均距離を示す値である。
「Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｒａｄｉｕｓ」（図６の（ｐ）参照）は、注目する細胞と同面積の円の半径を示す値である。この「Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｒａｄｉｕｓ」のパラメータは、注目する細胞を仮想的に円に近似した場合の大きさを示している。
【００５７】
ここで、細胞形態の特徴量算出部４５は、細胞に対応する画素数に誤差分を加味して上記の各特徴量を求めてもよい。このとき、細胞形態の特徴量算出部４５は、顕微鏡画像の撮影条件（撮影倍率や顕微光学系の収差など）を考慮して特徴量を求めるようにしてもよい。なお、「Ｉｎｎｅｒ ｒａｄｉｕｓ」、「Ｏｕｔｅｒ ｒａｄｉｕｓ」、「Ｍｅａｎ ｒａｄｉｕｓ」、「Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｒａｄｉｕｓ」を求めるときには、細胞形態の特徴量算出部４５は、公知の重心演算の手法に基づいて各細胞の重心点を求め、この重心点を基準にして各パラメータを求めればよい。
【００５８】
細胞形態の特徴量算出部４５は、領域抽出部４４から供給された各観察時間におけるｉＰＳ細胞のコロニーの領域９１の情報と、フィーダー細胞の領域９２の情報とを受け取る。
【００５９】
細胞形態の特徴量算出部４５は、各フィーダー細胞の領域９２において、図６に例示するフィーダー細胞の形態的特徴量を算出する。
ここで、フィーダー細胞の形態的特徴量とは、以下の特徴量を含んでもよい。「フィーダー細胞そのものの凹凸に相当する輝度値」、「フィーダー細胞の中の輝度分布」等である。
【００６０】
なお、細胞形態の特徴量算出部４５は、更に、各ｉＰＳ細胞のコロニーの領域９１において、図６に例示するｉＰＳ細胞のコロニーの形態的特徴量を算出してもよい。
ここで、ｉＰＳ細胞のコロニーの形態的特徴量は、「コロニーそのものの凹凸に相当する輝度値」、「コロニーの中の輝度分布」、「コロニーを１つの物体と考えた、コロニー集団の形の分布」の特徴量を含んでもよい。
【００６１】
なお、細胞形態の特徴量算出部４５は、ｉＰＳ細胞のコロニーの形態的特徴量だけでなく、図６に例示する個々のｉＰＳ細胞の形態的特徴量を算出してもよい。ここで、ｉＰＳ細胞の形態的特徴量は、「ｉＰＳ細胞そのものの凹凸に相当する輝度値」、「ｉＰＳ細胞の中の輝度分布」等の特徴量を含んでもよい。
【００６２】
そして、算出した各観察時間における各フィーダー細胞の形態的特徴量と、各ｉＰＳ細胞のコロニーの形態的特徴量と、個々のｉＰＳ細胞の形態的特徴量と、を記憶部４３に記録する。
【００６３】
度数分布算出部４６は、記憶部４３から各観察時間における各フィーダー細胞の形態的特徴量と、各ｉＰＳ細胞のコロニーの形態的特徴量と、個々のｉＰＳ細胞の形態的特徴量と、を読み出す。また、度数分布算出部４６は、記憶部４３から観察画像の教師値を読み出す。
【００６４】
度数分布算出部４６は、各々の顕微鏡画像毎に算出された特徴量の種類毎に、それぞれ特徴量の度数分布を算出する。従って、度数分布算出部４６は、１つの顕微鏡画像に対して、例えば５７（＝１９［種類の特徴量］×３［種類の細胞］）種類の特徴値の度数分布を求めることとなる。また、度数分布算出部４６は、各々の度数分布において、特徴値の各区分に対応する細胞の数を頻度（％）として算出する。
【００６５】
度数分布算出部４６は、上記の度数分布における度数の区分を、特徴量の種類ごとの標準偏差を用いて正規化する。ここでは一例として、「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布での区分を決定する場合を説明する。
【００６６】
まず、度数分布算出部４６は、各々の顕微鏡画像から算出された全ての「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の値の標準偏差を算出する。次に、度数分布算出部４６は、上記の標準偏差の値をＦｉｓｈｅｒの式に代入して、「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布における度数の区分の基準値を求める。このとき、度数分布算出部４６は、全ての「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の値の標準偏差（Ｓ）を４で除するとともに、小数点以下３桁目を四捨五入して上記の基準値とする。なお、一の実施形態での度数分布算出部４６は、度数分布をヒストグラムとして図示する場合、２０級数分の区間をモニタ等に描画させるものとする。
【００６７】
一例として、「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の標準偏差Ｓが２５９のとき、２５９／４
＝６４．７５０から「６４．７５」が上記の基準値となる。そして、注目する画像の「Ｓ
ｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布を求めるとき、度数分布算出部４６は、「Ｓｈａｐ
ｅ Ｆａｃｔｏｒ」の値に応じて０値から６４．７５刻みで設定された各クラスに細胞を
分類し、各クラスでの細胞の個数をカウントすればよい。
【００６８】
このように、度数分布算出部４６が、特徴量の種類毎に標準偏差で度数分布の区分を正
規化するため、異なる特徴値の間でも度数分布の傾向を大局的に近似させることができる。よって、一の実施例では、異なる特徴値間で細胞の培養状態と度数分布の変化との相関を求めることが比較的容易となる。
【００６９】
度数分布算出部４６は、全ての形態的特徴量をヒストグラムする。度数分布算出部４６は、全てのヒストグラムを記憶部４３に保存する。
【００７０】
指標抽出部４７は、全てのヒストグラムを記憶部４３から読み出す。
指標抽出部４７は、形態的特徴量ごとに、各経時のヒストグラムを、経時の全組み合わせ分比較して、経時間のヒストグラムの面積差の絶対値を算出する。
【００７１】
図７は、ある特徴量についての計算モデルのパラメータを格納するテーブルを説明するための図である。テーブル１００は、時刻１と、時刻２と、各特徴量ｆ（ｊ）（ｊは１からｎまでの整数）の時刻１の特徴量のヒストグラムと、時刻２の特徴量のヒストグラムとの面積差ΔＳｆ（ｊ）と、教師値（例えば、分化の度合い）の差を用いて構成されている。
ここで、一例として、形態的特徴量の種類が同じで、撮影時間（０、２４、４８、７２、９６時間目）が異なる５つの度数分布を想定する。
【００７２】
指標抽出部４７は、上記全１０通りの組み合わせに対して、以下の式（４）により、度数分布の面積差の絶対値（画像間での度数分布の差分の絶対値を積分したもの）を算出する。つまり、１セット分における１種類の特徴量に注目したとき、指標抽出部４７は、その特徴値の度数分布につき、計１０通りの面積差を算出する。
【００７３】
【数４】
【００７４】
但し、式（４）において、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は初期状態の度数分布（８時間目）における１区間分の度数（細胞数）を示す。また、「Ｓａｍｐｌｅ」は、比較対象の度数分布における１区間分の度数を示す。また、ｉは、度数分布の区間を示す変数である。
【００７５】
指標抽出部４７は、特徴量の種類ごとに上記演算を行うことで、すべての特徴量についてそれぞれ１０通りの度数分布の変化量を取得できる。すなわち、１セット分の顕微鏡画像について、１９種類×１０通りで１９０の度数分布の組み合わせをとることができる。以後、上記の度数分布の組み合わせの１つを、指標と称する
指標抽出部４７は、形態的特徴量毎に、上記テーブル１００を、記憶部４３に保存する。
【００７６】
指標抽出部４７は、１９０の指標のうちから、細胞の培養状態をよく反映する指標を多変量解析により１以上指定する。この指標の組合せの選択は、後述するファジーニューラルネットワークと同等の非線形モデル以外にも、細胞とその形態の複雑性に応じて線形モデルの利用も有効である。このような指標の組合せの選択と共に、指標抽出部４７は、上記の指定された１以上の指標を用いて、顕微鏡画像から、ｉＰＳ細胞の状態を推定する計算モデルを算出する。
【００７７】
具体的には、各経時の形の指標１９種類の平均値（入力値１）と、各経時の形の指標１９種類の標準偏差（入力値２）と、各経時の形の指標１９種類の分布の値そのもの（入力値３）と、各経時の形の指標１９種類の分布の経時間の面積差（入力値４）との４つの入力値がある。４つの入力値に対し、各画像細胞の分化度（教師値）が関係付けられる。従って、指標抽出部４７は、教師値を最も精度よく予測できる入力値の組み合わせを見つける。
【００７８】
ここで、指標抽出部４７は、ファジーニューラルネットワーク（Ｆｕｚｚｙ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ：ＦＮＮ）解析によって上記の計算モデルを求める。
【００７９】
ＦＮＮとは、人工ニューラルネットワーク（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ：ＡＮＮ）とファジィ推論とを組み合わせた方法である。このＦＮＮでは、ファジイ推論の欠点であるメンバーシップ関数の決定を人間に頼るという部分を回避すべく、ＡＮＮをファジィ推論に組み込んでその自動決定を行う。学習機械のひとつであるＡＮＮ（図１０参照）は、生体の脳における神経回路網を数学的にモデル化したものであり、以下の特徴を持つ。
【００８０】
図８は、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋの概要を説明するための図である。
ＡＮＮにおける学習は、目的の出力値（教師値）をもつ学習用のデータ（入力値：Ｘ）を用いて、バックプロパゲーション（Ｂａｃｋ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ：ＢＰ）法により教師値と出力値（Ｙ）との誤差が小さくなるように、ノード（図８において丸で示す）間をつなぐ回路における結合荷重を変え、その出力値が教師値に近づくようにモデルを構築する過程である。
【００８１】
このＢＰ法を用いれば、ＡＮＮは学習により自動的に知識を獲得することができる。そして、最終的に学習に用いていないデータを入力することにより、そのモデルの汎用性を評価できる。従来、メンバーシップ関数の決定は、人間の感覚に頼っていたが、上で述べたようなＡＮＮをファジイ推論に組み込むことで自動的なメンバーシップ関数の同定が可能になる。これがＦＮＮである。
【００８２】
図９は、Ｆｕｚｚｙ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋの概要を説明するための図である。
ＦＮＮでは、ＡＮＮと同様に、ＢＰ法を用いることによりネットワークに与えられた入出力関係を、結合荷重を変化させることで自動的に同定しモデル化できる。ＦＮＮは、学習後のモデルを解析することでファジィ推論のように人間に理解しやすい言語的なルール（一例として図９の右下の吹き出しを参照）として知識を獲得できるという特徴をもっている。
【００８３】
つまり、ＦＮＮは、その構造、特徴から、細胞の形態的特徴を表した数値のような変数の組み合わせにおける最適なファジィ推論の組み合わせを自動決定し、予測目標に関する推定と、予測に有効な指標の組み合わせを示すルールの生成を同時に行うことができる。
【００８４】
ＦＮＮの構造は、「入力層」、シグモイド関数に含まれるパラメータＷｃ、Ｗｇを決定する「メンバーシップ関数部分（前件部）」、Ｗｆを決定するとともに入力および出力の関係をルールとして取り出すことが可能な「ファジィルール部分（後件部）」、「出力層」の４層から成り立っている（図９参照）。
【００８５】
図１０は、Ｆｕｚｚｙ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋにおけるシグモイド関数を説明するための図である。
ＦＮＮのモデル構造を決定する結合荷重にはＷｃ、Ｗｇ、Ｗｆがある。結合荷重Ｗｃは、メンバーシップ関数に用いられるシグモイド関数の中心位置、Ｗｇは中心位置での傾きを決定する（図１０参照）。
【００８６】
図９に戻り、モデル内では、入力値がファジィ関数により、人間の感覚的に近い柔軟性を持って表現される（一例として図９の左下の吹き出しを参照）。結合荷重Ｗｆは各ファジイ領域の推定結果に対する寄与を表しており、Ｗｆよりファジィルールを導くことができる。即ち、モデル内の構造はあとから解読でき、ルールとして書き起こすことができる（一例として図９中右下の吹き出しを参照）。
【００８７】
ＦＮＮ解析におけるファジィルールの作成には結合荷重のひとつであるＷｆ値が用いられる。Ｗｆ値が正の値で大きいと、そのユニットは「予測に有効である」と判定されることに対する寄与が大きく、そのルールに当てはまった指標は「有効である」と判断される。Ｗｆ値が負の値で小さいと、そのユニットは「予測に有効でない」と判定されることに対する寄与が大きく、そのルールに当てはまった指標は「有効でない」と判断される。
【００８８】
より具体的な例として、指標抽出部４７は、以下の（Ａ）から（Ｈ）の処理により、上記の計算モデルを求める。
【００８９】
（Ａ）指標抽出部４７は、１９０の指標のうちから１つの指標を選択する。
（Ｂ）指標抽出部４７は、（Ａ）で選択された指標による度数分布の変化量を変数
とした計算式により、各々の顕微鏡画像のセットでの、ｉＰＳ細胞の状態（予測値）を求める。
【００９０】
仮に、１つの指標から、ｉＰＳ細胞の状態を求める計算式を「Ｙ＝αＸ１」（但し、「Ｙ」は、ｉＰＳ細胞の計算値（例えば、ｉＰＳ細胞の増加数を示す値）、「Ｘ１」は上記の選択された指標に対応する度数分布の変化量、「α」はＸ１に対応する係数値、をそれぞれ示す）とする。このとき、指標抽出部４７は、αに任意の値を代入するとともに、Ｘ１に各セットにおける度数分布の変化量をそれぞれ代入する。これにより、各セットでのがん細胞の計算値（Ｙ）が求められる。
【００９１】
（Ｃ）指標抽出部４７は、各々の顕微鏡画像のセットについて、（Ｂ）で求めた計
算値Ｙと、実際のｉＰＳ細胞の数（教師値）との誤差をそれぞれ求める。なお、上記の教師値は、読み込んだｉＰＳ細胞の数の情報に基づいて、指標抽出部４７が求めるものとする。
そして、指標抽出部４７は、各顕微鏡画像のセットでの計算値の誤差がより小さくなるように、教師付き学習により上記の計算式の係数αを修正する。
【００９２】
（Ｄ）指標抽出部４７は、上記の（Ｂ）および（Ｃ）の処理を繰り返し、上記（Ａ）の指標について、計算値の平均誤差が最も小さくなる計算式のモデルを取得する。
（Ｅ）指標抽出部４７は、１９０の各指標について、上記（Ａ）から（Ｄ）の各処理を繰り返す。そして、指標抽出部４７は、１９０の各指標における計算値の平均誤差を比較し、その平均誤差が最も低くなる指標を、評価情報の生成に用いる１番目の指標とする。
【００９３】
（Ｆ）指標抽出部４７は、上記（Ｅ）で求めた１番目の指標と組み合わせる２番目の指標を求める。このとき、指標抽出部４７は、上記の１番目の指標と残りの１８９の指標とを１つずつペアにしてゆく。次に、指標抽出部４７は、各々のペアにおいて、計算式でがん細胞の予測誤差を求める。
【００９４】
仮に、２つの指標からがん細胞の数を求める計算式を「Ｙ＝αＸ１＋βＸ２」（但し、「Ｙ」はがん細胞の計算値、「Ｘ１」は１番目の指標に対応する度数分布の変化量、「α」はＸ１に対応する係数値、「Ｘ２」は、選択された指標に対応する度数分布の変化量、「β」はＸ２に対応する係数値、をそれぞれ示す）とする。
そして、指標抽出部４７は、上記の（Ｂ）および（Ｃ）と同様の処理により、計算値の平均誤差が最も小さくなるように、上記の係数α、βの値を求める。
【００９５】
その後、指標抽出部４７は、各々のペアで求めた計算値の平均誤差を比較し、その平均誤差が最も低くなるペアを求める。そして、指標抽出部４７は、平均誤差が最も低くなるペアの指標を、評価情報の生成に用いる１番目および２番目の指標とする。
【００９６】
（Ｇ）指標抽出部４７は、所定の終了条件を満たした段階で演算処理を終了する。例えば、指標抽出部４７は、指標を増やす前後の各計算式による平均誤差を比較する。そして、指標抽出部４７は、指標を増やした後の計算式による平均誤差が、指標を増やす前の計算式による平均誤差より高い場合（または両者の差が許容範囲に収まる場合）には、演算処理を終了する。
【００９７】
（Ｈ）一方、上記（Ｇ）で終了条件を満たさない場合、指標抽出部４７は、さらに指標の数を１つ増やして、上記（Ｆ）および（Ｇ）と同様の処理を繰り返す。これにより、上記の計算モデルを求めるときに、ステップワイズな変数選択によって指標の絞り込みが行われることとなる。
【００９８】
指標抽出部４７は、上記で求めた計算モデルの情報（計算式に用いる各指標を示す情報、計算式で各々の指標に対応する係数値の情報など）を記憶部４３に記録する。
【００９９】
なお、指標としては上記の指標に限られるものではなく、指標抽出部４７は、０時間目、２４時間目、４８時間目、７２時間目、９６時間目、１２０時間目、１４８時間目、および１６８時間目の各々を基準として、１種類の特徴量に対して３６（＝９×８÷２）通りの指標をそれぞれ求め、１９種類の特徴量に対して合計６８４（１９種類×３６通り）の指標を求めてもよい。
このような基準となる時刻が異なる指標を用いることにより、指標抽出部４７は、より予測精度が高い計算モデルを構築することができる。
【０１００】
評価処理部４８は、記憶部４３から対象画像の入力値１から入力値４と、計算モデルの情報を読み出す。
評価処理部４８は、既に構築された計算モデルの計算式に用いる指標の値のみを入力値１から入力値４から選択する。
【０１０１】
例えば、評価処理部４８は、対象画像において、「８時間目の細胞の長さの標準偏差」と「９６時間目の細胞丸さのヒストグラムと１２時間目の細胞丸さのヒストグラムの面積差」とを選択する。
評価処理部４８は、上記選択した指標を計算モデルに入力し、推定した分化度を算出する。
【０１０２】
ＣＰＵ４２は、評価処理部４８が推定したｉＰＳ細胞の状態に基づき、ｉＰＳ細胞又はフィーダー細胞の培養条件（例えば温度、湿度等）を変更するよう制御する。例えば、ＣＰＵ４２は、温度調整装置１５ａに制御信号を供給し、恒温室１５内の温度を上昇させるように制御する。また、ＣＰＵ４２は、湿度調整装置１５ｂに制御信号を供給し、恒温室１５内の湿度を下降させるように制御する。
【０１０３】
＜ｉＰＳ細胞の観察の例＞
図１１は、インキュベータにおける観察処理の一例を示すフローチャートである。この図１１は、恒温室１５内に搬入された培養容器１９を、登録された観察スケジュールに従ってタイムラプス観察する動作例を示している。
【０１０４】
ステップＳ１０１において、ＣＰＵ４２は、記憶部４３の管理データの観察スケジュールと現在日時とを比較して、培養容器１９の観察開始時間が到来したか否かを判定する。観察開始時間となった場合（ステップＳ１０１ ＹＥＳ）、ＣＰＵ４２はＳ１０２に処理を移行させる。一方、培養容器１９の観察時間ではない場合（ステップＳ１０１ ＮＯ）には、ＣＰＵ４２は次の観察スケジュールの時刻まで待機する。
【０１０５】
次に、ステップＳ１０２において、ＣＰＵ４２は、観察スケジュールに対応する培養容器１９の搬送を容器搬送装置２３に指示する。そして、容器搬送装置２３は、指示された培養容器１９をストッカー２１から搬出して観察ユニット２２の試料台３１に載置する。なお、培養容器１９が試料台３１に載置された段階で、スタンドアーム３２に内蔵されたバードビューカメラ（不図示）によって培養容器１９の全体観察画像が撮像される。
【０１０６】
次に、ステップＳ１０３において、ＣＰＵ４２は、観察ユニット２２に対して細胞の顕微鏡画像の撮像を指示する。観察ユニット２２は、ＬＥＤ光源３５を点灯させて培養容器１９を照明するとともに、撮像装置３４を駆動させて培養容器１９内の細胞の顕微鏡画像を撮像する。
【０１０７】
このとき、撮像装置３４は、記憶部４３に記憶されている管理データに基づいて、ユーザの指定した撮像条件（対物レンズの倍率、容器内の観察地点）に基づいて顕微鏡画像を撮像する。例えば、培養容器１９内の複数のポイントを観察する場合、観察ユニット２２は、試料台３１の駆動によって培養容器１９の位置を逐次調整し、各々のポイントでそれぞれ顕微鏡画像を撮像する。なお、Ｓ１０３で取得された顕微鏡画像のデータは、制御装置４１に読み込まれるとともに、ＣＰＵ４２の制御によって記憶部４３に記録される。
【０１０８】
次に、ステップＳ１０４において、ＣＰＵ４２は、観察スケジュールの終了後に培養容器１９の搬送を容器搬送装置２３に指示する。そして、容器搬送装置２３は、指示された培養容器１９を観察ユニット２２の試料台３１からストッカー２１の所定の収納位置に搬送する。その後、ＣＰＵ４２は、観察シーケンスを終了してＳ１０１に処理を戻す。以上で、本フローチャートの説明を終了する。
【０１０９】
＜計算モデル用の教師値算出の例＞
図１２は、計算モデル用の教師値の算出を説明するためのフローチャートである。この計算モデルの生成処理では、画像の撮影時間および特徴値の種類がそれぞれ異なる複数の度数分布の組み合わせから、ｉＰＳ細胞の状態の推定に用いる度数分布の組み合わせを、制御装置４１が決定する。
【０１１０】
まず、ステップＳ２０１において、撮像装置３４は、ｉＰＳ細胞とｉＰＳ細胞の周囲に存在し、共に培養されているフィーダー細胞とが撮像された参照画像を継続的に取得し、記憶部４３に保存する。
【０１１１】
次に、ステップＳ２０２において、一定期間培養後に、ユーザは、画像撮影した細胞を染色マーカー（例えば、分化度を示す染色マーカーであるＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−１、およびｎａｎｏｇ等）で染色する。
なお、ＣＰＵ４２が、一定期間培養後に、予め容器に入れられた染色マーカーを培養液に加えることに制御してもよい。これによって、画像撮影した細胞を染色マーカーで染色することができる。
【０１１２】
撮像装置３４は、位相差観察用の顕微光学系で結像された染色されたｉＰＳ細胞を撮像する。なお、染色マーカーが蛍光物質で標識されている場合には、撮像装置３４は、図示されていない蛍光観察用の顕微光学系で結像された染色されたｉＰＳ細胞を撮像する。そして、撮像装置３４は、染色後の画像を記憶部４３に保存する。
【０１１３】
次に、ステップＳ２０３において、ＣＰＵ４２は、記憶部４３から染色後の画像を読み出す。ＣＰＵ４２は、ｉＰＳ細胞毎に染色の有無を判定する。
次に、ステップＳ２０４において、ＣＰＵ４２は、画像の教師値（分化度）を算出する。例えば、染色細胞数が７２個、全体のｉＰＳ細胞数が１００個だとすると、画像の教師値（分化度）は染色細胞数／全体の細胞数＝７２（％）となる。
【０１１４】
次に、ステップＳ２０５において、ステップＳ２０１からステップＳ２０４の処理を全てのサンプルに対して所定の回数行っていない場合（ステップＳ２０１ ＮＯ）、上記工程を他のｉＰＳ細胞とフィーダー細胞とが共培養されたサンプルに対して、各々数十から数百枚行う。
【０１１５】
例えば、ユーザが、分化度２０付近（サンプル３０個）、分化度５０付近（サンプル３０個）、分化度８０付近（サンプル３０個）、分化度１００付近（サンプル３０個）のサンプルに対して、２４時間おきに４日間画像を撮影する。
【０１１６】
上記継続培養画像は、４［条件］×３０［サンプル］＝１２０［枚］が、４日分存在するため、各１２０枚の画像に対して、０時間目、２４時間目、４８時間目、７２時間目、９６時間目の５点が存在する。また、それぞれの画像に対して、ＣＰＵ４２は、教師値（分化度）を算出し、記憶部４３に保存する。
【０１１７】
次に、ステップＳ２０５において、ステップＳ２０１からステップＳ２０４の処理を全てのサンプルに対して所定の回数行った場合（ステップＳ２０１ ＹＥＳ）、本フローチャートは、終了する。
【０１１８】
図１３は、計算モデルの構築を説明するためのフローチャートである。
まず、ステップＳ３０１において、ＣＰＵ４２は、予め用意されたサンプルの顕微鏡画像のデータを記憶部４３から読み込む。なお、Ｓ３０１でのＣＰＵ４２は、各画像に対応する細胞の総数およびｉＰＳ細胞の数を示す情報もこの時点で取得するものとする。
【０１１９】
次に、ステップＳ３０２において、ＣＰＵ４２は、上記のサンプルの顕微鏡画像のうちから、処理対象となる画像を指定する。ここで、Ｓ３０２でのＣＰＵ４２は、予め用意されているサンプルの顕微鏡画像のすべてを処理対象として順次指定してゆくものとする。
【０１２０】
次に、ステップＳ３０３において、領域抽出部４４は、処理対象の顕微鏡画像について、画像内に含まれるｉＰＳ細胞のコロニーの領域と、フィーダー細胞の領域とを抽出する。
【０１２１】
次に、ステップＳ３０４において、特徴量算出部４５は、処理対象の顕微鏡画像中に含まれる各ｉＰＳ細胞のコロニーと、各ｉＰＳ細胞と、各フィーダー細胞との形態的特徴を示す特徴量を算出する。例えば、各経時１２０（＝４［条件］×３０［枚］）枚の画像に対して、各経時における特徴量を算出する。
【０１２２】
次に、ステップＳ３０５において、特徴量算出部４５は、算出した全ての特徴量を記憶部４３に保存する。
次に、ステップＳ３０６において、全画像を全画像の特徴量を算出していない場合（ステップＳ３０６ ＮＯ）、ステップＳ３０２に戻る。全画像を全画像の特徴量を算出した場合（ステップＳ３０６ ＹＥＳ）、ステップＳ３０７に遷移する。
【０１２３】
次に、ステップＳ３０７において、度数分布算出部４６は、各経時の特徴量の平均値と、各経時の特徴量の標準偏差と、各経時の特徴量の度数分布を算出する。換言すれば、度数分布算出部４６は、各画像中のすべての細胞１つ１つの形態情報を収集し、これを集団としてヒストグラム化する。
【０１２４】
次に、ステップＳ３０８において、指標抽出部４７は、特徴量毎に、経時間の特徴量の度数分布の面積の差を、経時の全組み合わせに対して算出する。
例えば、各１２０枚の画像に対して、０時間目、２４時間目、４８時間目、７２時間目、９６時間目の５点が存在するとする。そうすると、以下の１０個の経時の組み合わせが存在する。その経時の組み合わせは、［時間目］−［時間目］の書式で表すと、２４−０、４８−０、７２−０、９６−０、４８−２４、７２−２４、９６−２４、７２−４８、９６−４８、９６−７２である。
【０１２５】
次に、ステップＳ３０９において、全ての特徴量で、経時間の特徴量の度数分布の面積の差を、経時の全組み合わせに対して算出していない場合（ステップＳ３０９ ＮＯ）、ステップＳ３０８に戻る。ステップＳ３０９において、全ての特徴量で、経時間の特徴量の度数分布の面積の差を、経時の全組み合わせに対して算出した場合（ステップＳ３０９ ＹＥＳ）、ステップＳ３１０に遷移する。
【０１２６】
次に、ステップＳ３１０において、指標抽出部４７は、１９０の指標のうちから、ｉＰＳ細胞の状態をよく反映する指標を多変量解析により１以上指定する。この指標の組合せの選択は、前述したファジーニューラルネットワークと同等の非線形モデル以外にも、細胞とその形態の複雑性に応じて線形モデルの利用も有効である。このような指標の組合せの選択と共に、指標抽出部４７は、上記の指定された１以上の指標を用いて、顕微鏡画像からｉＰＳ細胞の状態を導出する計算モデルを求める。
【０１２７】
次に、ステップＳ３１１において、指標抽出部４７は、計算モデルの情報（計算式に用いる各指標を示す情報、計算式で各々の指標に対応する係数値の情報など）を記憶部４３に記録する。以上で、本フローチャートは終了する。
【０１２８】
＜ｉＰＳ細胞の状態推定処理の例＞
図１４は、計算モデルを用いたｉＰＳ細胞の分化度を推定するためのフローチャートである。
まず、ステップＳ４０１において、評価処理部４８は、評価対象となる複数の顕微鏡画像（対象画像）のデータを記憶部４３から読み込む。ここで、対象画像は、細胞群を培養した培養容器１９をインキュベータ１１によって同一視野を同一の撮影条件でタイムラプス観察して取得されたものとする。また、この場合のタイムラプス観察は、図１３の例と条件を揃えるために、培養開始を初回として２４時間おきに９６時間目まで行うものとする。
【０１２９】
次に、ステップＳ４０２において、評価処理部４８は、記憶部４３の計算モデルの情報（図１３のＳ３１１で記録されたもの）を読み込む。
次に、ステップＳ４０３において、特徴量算出部４５、度数分布演算部４６および評価処理部４８は、上記の計算モデルの変数に対応する各指標について、それぞれ度数分布の変化量を求める。
【０１３０】
次に、ステップＳ３０４において、評価処理部４８は、ステップＳ４０３で求めた各指標の度数分布の変化量を、Ｓ３０２で読み出した計算モデルに代入して演算を行う。そして、評価処理部４８は、上記の演算結果に基づいて、評価対象の顕微鏡画像におけるｉＰＳ細胞の分化度を示す推定情報を生成する。その後、評価処理部４８は、この推定情報を不図示のモニタ等に表示させる。以上で、本フローチャートは終了する。
【０１３１】
第１の実施例によれば、ｉＰＳ細胞のコロニーの形態的特徴量と、ｉＰＳ細胞の形態的特徴量と、フィーダー細胞の形態的特徴量とから、ｉＰＳ細胞の状態を推定することができる。
【０１３２】
なお、第１の実施例では、ｉＰＳ細胞のコロニーの形態的特徴量と、ｉＰＳ細胞の形態的特徴量と、フィーダー細胞の形態的特徴量とから、ｉＰＳ細胞の分化度を推定したがこれに限らない。
フィーダー細胞の形態的特徴量の度数分布の時間変化のみから、ｉＰＳ細胞の分化度を推定してもよい。
また、フィーダー細胞の形態的特徴量の度数分布の時間変化と、個別のｉＰＳ細胞の形態的特徴量の度数分布の時間変化またはｉＰＳ細胞のコロニーの形態的特徴量の度数分布の時間変化とから、ｉＰＳ細胞の分化度を推定してもよい。
【０１３３】
なお、第１の実施例では、ｉＰＳ細胞の分化度を推定したがこれに限らず、ｉＰＳ細胞の劣化度合い、ｉＰＳ細胞の増殖度、ｉＰＳ細胞の分化の方向性、ｉＰＳ細胞の腫瘍化しやすさ等でもよい。
【０１３４】
＜実施例２＞
上記の実施例１は、連続値でｉＰＳ細胞の状態を評価したが、本実施例２ではレベルとして大まかにｉＰＳ細胞の状態を区分する。本実施例２の方法は、染色評価の信頼性や実施例１の推定精度によっては連続値評価が適していない場合に、特に有用である。以下、本発明の第２の実施例について、図面を参照して詳細に説明する。
【０１３５】
図１５は、本発明の第２の実施例であるインキュベータのブロック構成図である。インキュベータ１１ａは、上部ケーシング１２と、下部ケーシング１３ａとを用いて構成されている。下部ケーシング１３ａは、撮像装置３４と制御装置４１ａとを用いて構成されている。制御装置（細胞評価装置）４１ａは、ＣＰＵ４２ａと記憶部４３ａとを用いて構成されている。
ＣＰＵ４２ａと記憶部４３ａ以外は、図３のブロック構成図と同じであるので、ＣＰＵ４２ａと記憶部４３ａ以外は説明を省略する。
【０１３６】
記憶部４３ａは、ハードディスクや、フラッシュメモリ等の不揮発性の記憶媒体などで構成される。この記憶部４３ａは、不図示のストッカーに収納されている各培養容器（不図示）に関する管理データと、撮像装置で撮像された顕微鏡画像のデータとを保持する。
さらに、記憶部４３ａは、ＣＰＵ４２ａによって実行されるプログラムと、指標抽出部４７ａで算出された判別モデルの情報とを保持する。
【０１３７】
ＣＰＵ４２ａは、記憶部４３ａに記憶されているプログラムを読み出して実行することにより、領域抽出部４４と、特徴量算出部４５ａと、度数分布算出部４６と、指標抽出部４７ａと、評価処理部４８ａとの各部の機能を実現する。
【０１３８】
領域抽出部４４と、度数分布算出部４６との処理は、第１の実施例と同じなので、説明を省略する。
【０１３９】
特徴量算出部４５ａは、実施例１と同様に、領域抽出部４４により画像から抽出した各画像のオブジェクトに対して、細胞の形態的特徴を示す特徴量をそれぞれ求める。一例として、特徴量算出部４５ａは、各細胞について１９種類の特徴量をそれぞれ求める。
【０１４０】
特徴量算出部４５ａは、演算対象の教師画像について、１９種類の特徴量の画像内平均値および画像内標準偏差をそれぞれ求める。そして、特徴量算出部４５ａは、上記の各特徴量の画像内平均値および画像内標準偏差をそれぞれ記憶部４３ａに記録する。
【０１４１】
これにより、細胞の継代数が同一であって観察時期（０、２４、４８、７２、９６時間目）がいずれも異なる５枚分の教師画像について、各観察時期においてそれぞれ３８の特徴量（１９種類×２通り（平均値、標準偏差））が求まることとなる。
【０１４２】
特徴量算出部４５ａは、以下の（Ａ１）−（Ａ３）の処理によって、継代数が共通する教師画像をグループ化し、グループ化した教師画像群のうちの２つの教師画像間で各特徴量の変化量を求める。
【０１４３】
（Ａ１）特徴量算出部４５ａは、細胞の継代数が同一であって観察時期（０、２４、４８、７２、９６時間目）がいずれも異なる６枚分の教師画像をそれぞれグループ化する。特に限定するものではないが、グループ化する教師画像は、培養容器および撮像した位置（視野）が共通する５枚の顕微鏡画像であることが好ましい。
【０１４４】
（Ａ２）特徴量算出部４５ａは、上記（Ａ１）でグループ化した教師画像群において、撮像時点の異なる２つの教師画像を組み合わせる。ここで、１グループの教師画像は５枚であるので、２つの教師画像の組み合わせは１０通りとなる。また、２つの教師画像の組み合わせは１０通りであるため、１グループの教師画像群から求まる変化量は３８０種類（１９の特徴量×２通り（平均値、標準偏差）×１０通りの組み合わせ）となる。
【０１４５】
（Ａ３）特徴量算出部４５ａは、上記（Ａ２）の１つの組み合わせごとに、２つの教師画像間における各特徴量の画像内平均値の変化を示す１９種類の変化量と、２つの教師画像間における各特徴量の画像内標準偏差の変化を示す１９種類の変化量とをそれぞれ求める。
【０１４６】
続いて、指標抽出部４７ａの処理について、説明する。
指標抽出部４７ａは、度数分布算出部４６で算出された形態的特徴量の度数分布の各経時の面積差を算出する。
【０１４７】
指標抽出部４７ａは、特徴量算出部４５ａで算出された形態的特徴量と、形態的特徴量の度数分布の面積差とに基づいて、異なる分化を示す細胞を、分化毎にクラス分けする判別モデルを構築する。本第２の実施例での指標抽出部４７ａは、判別モデルの１つの形態として、決定木解析（Ｄｅｃｉｓｉｏｎ ｔｒｅｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）を採用し、細胞の継代回数に応じて顕微鏡画像をクラス分けする決定木を構築する。
【０１４８】
＜決定木の構築方法＞
以下、指標抽出部４７ａが決定木を構築する方法について説明する。
指標抽出部４７ａは、決定木の根ノードにおいて、継代数の異なる細胞を分類するときに適用するパラメータの種類（指標の種類）とそのパラメータの値（指標の閾値）とを求める。なお、上記のパラメータの種類は、各観察時期（０、２４、４８、７２、９６時間目）の各特徴量（１５０種類）および特徴量の変化量（３８０種類）のうちから選択される。
【０１４９】
以下、上記の指標の種類および指標の閾値の求め方の一例を説明する。まず、指標抽出部４７ａは、上記の５３０（＝１５０＋３８０）種類のパラメータのうちから演算対象のパラメータを選択する。このとき、指標抽出部４７ａは、演算対象のパラメータに対応する教師画像群を予め抽出する。なお、抽出された教師画像群には、細胞の継代数の異なる教師画像が含まれる。
【０１５０】
次に、指標抽出部４７ａは、演算対象のパラメータに探索範囲（上限および下限）を設定するとともに、演算対象のパラメータの探索範囲を任意の刻みで複数に区切る。指標抽出部４７ａは、演算対象のパラメータの各刻み（パラメータの値）を閾値として、演算対象のパラメータに対応する教師画像群の細胞を２つの集合に分類する。これにより、演算対象のパラメータの各刻みにおいて、教師画像群の細胞の分類結果がそれぞれ得られる。
このとき、指標抽出部４７ａは、分類結果の各集合において、細胞の継代数に応じた細胞の数の分布をそれぞれ求めておく。
【０１５１】
指標抽出部４７ａは、上記の４５０種類の全パラメータでそれぞれ同様の処理を行い、各パラメータの個々の刻みにおける教師画像群の分類結果を取得する。そして、指標抽出部４７ａは、全ての分類結果のうちから、継代数の異なる細胞の分類に最も適したパラメータの種類（指標の種類）およびそのパラメータでの閾値（指標の閾値または指標の閾値）を決定する。
【０１５２】
一例として、指標抽出部４７ａは、パラメータの種類および閾値の組み合わせのうち、任意の継代数の細胞を一方の集合に完全に分離できるものを、指標の種類および指標の閾値に決定する。上記条件に該当する組み合わせが複数ある場合、指標抽出部４７ａは、１種類分の任意の継代数の細胞のみを一方の集合に分離できるものを優先して上記の指標の種類および指標の閾値を決定すればよい。
【０１５３】
また、上記条件に該当する組み合わせがない場合、指標抽出部４７ａは、以下の要領で指標の種類および指標の閾値を決定してもよい。例えば、指標抽出部４７ａは、２つの集合に同じ継代数の教師画像が含まれるが、一方の集合は１種類分の継代数の教師画像のみを抽出でき、かつ、一方の集合で抽出できる教師画像の数が最も多くなるものを優先して上記の指標の種類および指標の閾値を決定すればよい。
【０１５４】
指標抽出部４７ａは、次に指標の種類および指標の閾値を求める演算対象のノードを指定する。例えば、指標抽出部４７ａは、親ノードから左右に分岐する子ノードのうち左側のノードを指定する。なお、左側の子ノードよりも下層の全ノードで既に指標の種類および指標の閾値が求められている場合、指標抽出部４７ａは、親ノードから右側に分岐するノードを指定する。
【０１５５】
指標抽出部４７ａは、現在の演算対象のノードがそれ以上に分岐できないターミナルノードであるか否かを判定する。例えば、指標抽出部４７ａは、現在の演算対象のノードで１種類分の継代数の細胞が分離できている場合、ターミナルノードであると判定する。
【０１５６】
指標抽出部４７ａは、演算が完了したか否かを判定する。なお、指標抽出部４７ａは、ターミナルノードを除くすべてのノードで指標の種類および指標の閾値を求め終えた場合に演算が完了したものと判定する。
【０１５７】
指標抽出部４７ａは、現在の演算対象のノードにおいて、指標の種類および指標の閾値を求める。その後、指標抽出部４７ａは、演算対象のノードを変更する。その後、ループにより、各ノードでの指標の種類および指標の閾値が再帰的に求められる。
指標抽出部４７ａは、以上の処理で構築された判別モデルのデータを記憶装置４３ａに記録する。
【０１５８】
＜指標の算出方法＞
指標抽出部４７ａは、下記の２つの方法を用いて、ｉＰＳ細胞の状態を区分するための指標を算出する。
１つ目の方法として、指標抽出部４７ａは、細胞の状態を染色等で評価し、「レベル」として大まかにいくつかに区分する。例えば、指標抽出部４７ａは、分化度小、分化度中、および分化度大に区分する。すなわち、指標抽出部４７ａは、順番や優劣が存在するものを、いくつかの「レベル」に区分する。
【０１５９】
２つ目の方法として、指標抽出部４７ａは、細胞の品質を染色等で評価し、「グループ」として大まかにいくつかに区分する。例えば、指標抽出部４７ａは、骨分化グループ、軟骨分化グループおよび脂肪分化グループに区分する。すなわち、指標抽出部４７ａは、各グループに順番や優劣はなく、並列的なグループであり、数字等で各グループをうまく言い表すことができないものを、いくつかの「グループ」に区分する。
【０１６０】
指標抽出部４７ａは、決定木法を用いて、下記の２種類のモデルを作る。
指標抽出部４７ａは、画像別モデルとして、画像毎の入力値と画像毎の教師値を用いて、データをグループ化する。指標抽出部４７ａは、各「レベル」または各「グループ」を区分し、細胞の分化の度合いのレベルを分類し、各分化の種類が分類する。
【０１６１】
指標抽出部４７ａは、細胞別モデルとして、細胞毎の入力値と細胞毎の教師値を用いて、データをグループ化する。指標抽出部４７ａは、画像中の細胞１つ１つに対して、各細胞のレベルやグループを区分する。これによって、１つ１つの細胞において、どんな形の指標の組み合わせならば、どんなレベルかグループに相当するかがわかる。
【０１６２】
指標抽出部４７ａは、上記各分類において、用意された「レベル」または「グループ」という多群をもっともよく別々に分離できる精度が高くなるように、各「レベル」または各「グループ」に対して指標の組み合わせと、その指標の閾値を選ぶ。
指標抽出部４７ａは、決定木の指標とその指標の閾値を記憶部４３ａに保存する。
【０１６３】
評価処理部４８ａは、記憶部４３ａからその決定木の指標とその指標の閾値を読み出す。評価処理部４８ａは、対象画像の特徴量からその指標の値を抽出する。評価処理部４８ａは、決定木のノードの指標ごとに、対象画像から抽出した指標の値と閾値とを比較する。これによって、評価処理部４８ａは、対象画像または対象ｉＰＳ細胞を、「レベル」または「グループ」に分類する。評価処理部４８ａは、分類結果に基づいて、ｉＰＳ細胞の状態の推定結果を算出する。
以下、指標抽出部４７ａと評価処理部４８ａとの具体的な処理例について説明する。
【０１６４】
＜画像別、コロニー＋フィーダーモデル＞
図１６は、画像別、コロニー＋フィーダーモデルの決定木を説明するための図である。
図１６の決定木は、分化のグループを分けた一例である。対象画像において、９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞のヒストグラム間の面積差が２０以上であれば、グループ１（骨の分化グループ）に属する。
【０１６５】
対象画像において、９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞のヒストグラム間の面積差が２０未満で、２４時間のコロニーの丸さの平均値が３０以上であれば、グループ２（軟骨の分化グループ）に属する。
対象画像において、９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞のヒストグラム間の面積差が２０未満で、２４時間のコロニーの丸さの平均値が３０未満であれば、グループ３（脂肪の分化グループ）に属する。
【０１６６】
指標抽出部４７ａは、画像別モデルとして、ｉＰＳ細胞のコロニーの特徴量とフィーダー細胞の特徴量を用いた決定木の指標の種類を算出する。
例えば、指標抽出部４７ａは、「９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞のヒストグラム間の面積差」と「２４時間目のコロニーの丸さの平均値」という指標の種類を選択する。
【０１６７】
また、指標抽出部４７ａは、各指標の種類に対して、どの値以上または未満で判断するかという閾値（指標の閾値）を決定する。
例えば、指標抽出部４７ａは、指標「９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞のヒストグラム間の面積差」の種類に対して、指標の閾値２０を決定し、指標の種類「２４時間目のコロニーの丸さの平均値」に対して、指標の閾値３０を決定する。
【０１６８】
＜画像別、コロニー・フィーダーモデル＞
図１７は、画像別、コロニー・フィーダー別モデルの決定木を説明するための図である。
図１７（ａ）は、画像別の、ｉＰＳ細胞のコロニーの特徴量に基づく決定木（以下、コロニーモデル）を説明するための図である。図１７（ａ）の決定木は、分化のグループを分けた一例である。対象画像において、２４時間のコロニーの丸さの平均値が２０以上であれば、グループ１（骨の分化グループ）に属する。
【０１６９】
対象画像において、２４時間のコロニーの丸さの平均値が２０未満で、９６時間目と２４時間目のコロニーの長さの変化量が１００以上であれば、グループ２（軟骨の分化グループ）に属する。
一方、対象画像において、２４時間のコロニーの丸さの平均値が２０未満で、９６時間目と２４時間目のコロニーの長さの変化量が１００未満であれば、グループ３（脂肪の分化グループ）に属する。
【０１７０】
図１７（ｂ）は、画像別の、フィーダー細胞の特徴量に基づく決定木（以下、フィーダーモデルと称する）を説明するための図である。図１７（ｂ）の決定木は、ｉＰＳ細胞の劣化度合いのレベルを分けた一例である。対象画像において、４８時間のフィーダー細胞の丸さの平均値が４０以上であれば、グループ１（劣化度合い：大）に属する。
【０１７１】
対象画像において、４８時間のフィーダー細胞の丸さの平均値が４０未満で、９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞の丸さのヒストグラムの面積差が５０以上であれば、グループ２（劣化度合い：中）に属する。
一方、対象画像において、４８時間のフィーダー細胞の丸さの平均値が４０未満で、９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞の丸さのヒストグラムの面積差が５０未満であれば、グループ３（劣化度合い：小）に属する。
【０１７２】
指標抽出部４７ａは、画像別モデルとして、ｉＰＳ細胞のコロニーの特徴量とフィーダー細胞の特徴量を用いた別々の決定木の指標を算出する。
例えば、指標抽出部４７ａは、コロニーモデルに対して、「２４時間目のコロニーの丸さの平均値」と「９６時間目と２４時間目のコロニーの長さの変化量」という指標の種類を選択する。
また、指標抽出部４７ａは、フィーダーモデルに対して、「４８時間目のフィーダー細胞の丸さの平均値」と「９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞の丸さのヒストグラムの面積差」という指標の種類を選択する。
【０１７３】
また、指標抽出部４７ａは、各指標の種類に対して、指標の閾値を決定する。
例えば、指標抽出部４７ａは、指標の種類「２４時間目のコロニーの丸さの平均値」に対して、指標の閾値２０を決定し、指標の種類「９６時間目と２４時間目のコロニーの長さの変化量」に対して、指標の閾値１００を決定する。
【０１７４】
また、指標抽出部４７ａは、指標の種類「４８時間目のフィーダー細胞の丸さの平均値」に対して、指標の閾値４０を決定し、指標の種類「９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞の丸さのヒストグラムの面積差」に対して、指標の閾値５０を決定する。
【０１７５】
評価処理部４８ａは、コロニーモデルでグループ１（分化グループ：骨）、フィーダーモデルでグループ３（劣化度合い：小）というような複合的な推定をする。
なお、評価処理部４８ａは、コロニーモデルでグループ１（分化グループ骨）、フィーダーモデルでグループ１（分化グループ骨）の両方でグループ名が一致した場合のみ、確かな予測とすることにしてもよい。
【０１７６】
＜細胞別、コロニー・フィーダー別モデル＞
図１８は、細胞別、コロニー・フィーダー別モデルの決定木を説明するための図である。図１８（ａ）は、細胞毎のコロニーモデルを説明するための図である。図１８（ａ）の決定木は、分化のグループを分けた一例である。対象画像のあるｉＰＳ細胞のコロニーにおいて、２４時間のコロニーの丸さの平均値が８０以上で、９６時間目と２４時間目の９６時間目と２４時間目のコロニーの丸さのヒストグラムの面積差が２０未満であれば、そのｉＰＳ細胞はグループ１（骨の分化グループ）に属する。
【０１７７】
対象画像のあるｉＰＳ細胞のコロニーにおいて、２４時間のコロニーの丸さが８０以上で、９６時間目と２４時間目のコロニーの丸さのヒストグラムの面積差が２０以上であれば、そのｉＰＳ細胞はグループ２（軟骨の分化グループ）に属する。
一方、対象画像のあるｉＰＳ細胞のコロニーにおいて、２４時間のコロニーの丸さが８０未満であれば、そのｉＰＳ細胞はグループ３（脂肪の分化グループ）に属する。
【０１７８】
図１８（ｂ）は、細胞毎のフィーダーモデルを説明するための図である。図１８（ｂ）の決定木は、分化のグループを分けた一例である。対象画像において、状態を推定したいｉＰＳ細胞の周囲に存在するフィーダー細胞において、４８時間のフィーダーの長さが２０以上で、２４時間目のフィーダーの輝度が３０以上であれば、そのｉＰＳ細胞はレベル１（増殖能：高）に属する。
【０１７９】
対象画像において、状態を推定したいｉＰＳ細胞の周囲に存在するフィーダー細胞において、４８時間のフィーダーの長さが２０以上で、２４時間目のフィーダーの輝度が３０以上であれば、そのｉＰＳ細胞はレベル２（増殖能：中）に属する。
一方、対象画像において、状態を推定したいｉＰＳ細胞の周囲に存在するフィーダー細胞において、４８時間のフィーダーの長さが２０以上で、２４時間目のフィーダーの輝度が３０以上であれば、そのｉＰＳ細胞はレベル３（増殖能：小）に属する。
【０１８０】
指標抽出部４７ａは、個々の細胞レベルでｉＰＳ細胞の状態を推定するために、ｉＰＳ細胞のコロニーの特徴量を用いた決定木と、フィーダー細胞の特徴量を用いた決定木とを作成する。
指標抽出部４７ａは、ｉＰＳ細胞のコロニー１つ１つに対して、コロニーモデルの指標の組み合わせを検証して、コロニーに対する指標を算出する。
【０１８１】
また、指標抽出部４７ａは、フィーダー細胞１つ１つに対して、フィーダーモデルの指標の組み合わせを検証して、フィーダー細胞に対する指標を算出する。
また、指標抽出部４７ａは、各指標の種類に対して、指標の閾値を決定する。
【０１８２】
例えば、指標抽出部４７ａは、指標の種類「２４時間目のコロニーの丸さ」に対して、指標の閾値８０を決定し、指標の種類「９６時間目と２４時間目のコロニーの丸さのヒストグラムの面積差」に対して、指標の閾値２０を決定する。
また、指標抽出部４７ａは、指標の種類「４８時間目のフィーダー細胞の長さ」に対して、指標の閾値２０を決定し、指標の種類「２４時間目のフィーダー細胞の輝度」に対して、指標の閾値３０を決定する。
【０１８３】
対象画像において、あるｉＰＳ細胞の状態を推定する際には、評価処理部４８ａは、２つのモデルの結果を総合して、ｉＰＳ細胞の状態を推定する。
例えば、コロニーモデルにおいて、ｉＰＳ細胞のコロニーの２４時間目のコロニーの丸さ８０以上、９６時間目と２４時間目のコロニーの丸さのヒストグラムの面積差が２０未満であれば、評価処理部４８ａは、ｉＰＳ細胞をグループ１に分類する。これによって、評価処理部４８ａは、そのｉＰＳ細胞が骨に分化する能力をもつと推定する。
【０１８４】
また、例えば、そのｉＰＳ細胞の周囲に存在するフィーダー細胞の形態的特徴量のうち、４８時間目のフィーダー細胞の長さが２０以上で、２４時間目のフィーダー細胞の輝度が３０以上であれば、評価処理部４８ａは、ｉＰＳ細胞をレベル１に分類する。これによって、評価処理部４８ａは、ｉＰＳ細胞の増殖能が高いと推定する。
そして、評価処理部４８ａは、ｉＰＳ細胞を骨に分化する能力があり、増殖能が高いと複合的に推定する。
【０１８５】
ＣＰＵ４２ａは、評価処理部４８ａが推定したｉＰＳ細胞の状態に基づき、ｉＰＳ細胞又はフィーダー細胞の培養条件（例えば温度、湿度等）を変更するよう制御する。例えば、ＣＰＵ４２ａは、温度調整装置１５ａに制御信号を供給し、恒温室１５内の温度を上昇させるように制御する。また、ＣＰＵ４２ａは、湿度調整装置１５ｂに制御信号を供給し、恒温室１５内の湿度を下降させるように制御する。
【０１８６】
図１９は、決定木算出用の教師値の算出を説明するためのフローチャートである。
まず、ステップＳ５０１において、撮像装置３４は、ｉＰＳ細胞とｉＰＳ細胞の周囲に存在し、共に培養されているフィーダー細胞とが撮像された参照画像を継続的に取得し、記憶部４３ａに保存する。
【０１８７】
次に、ステップＳ５０２において、一定期間培養後に、ユーザは、画像撮影した細胞を染色マーカー（例えば、分化度を示す染色マーカーであるＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−１、およびｎａｎｏｇ等）で染色する。
なお、ＣＰＵ４２ａが、一定期間培養後に、予め容器に入れられた染色マーカーを培養液に加えることに制御してもよい。これによって、画像撮影した細胞を染色マーカーで染色することができる。
【０１８８】
次に、ステップＳ５０３において、ＣＰＵ４２ａは、染色画像から細胞毎に染色の有無を判定する。
次のステップＳ５０４とステップＳ５０５において、ＣＰＵ４２ａは、評価の結果を「レベル」か「グループ」として評価し、下記の画像別教師値と細胞別教師値をつくる。なお、教師値は、染色結果だけでなく、熟練者による評価に基づいてもよい。
【０１８９】
＜画像別教師値＞
まず、ステップＳ５０４において、ＣＰＵ４２ａは、画像ごとに、画像中に含まれる細胞と認識される画像中のオブジェクト１個１個に対して、染色の有無を判定する。染色の判定の際、ＣＰＵ４２ａは、オブジェクトの輝度値が所定の閾値よりも大きい場合には、「染色有り」と判定する。一方、指標抽出部４７ａは、オブジェクトの輝度値が所定の閾値以下の場合には、「染色無し」と判定する。
【０１９０】
そして、ＣＰＵ４２ａは、全体の細胞数に対する「染色有り」と判定された細胞数の割合を算出する。ＣＰＵ４２ａは、その割合に基づいて、その画像毎に、「レベル」または「グループ」の分類名を決定する。例えば、ＣＰＵ４２ａは、ある画像に対して、「分化グループ：骨」と分類名を決定する。
【０１９１】
＜細胞別教師値＞
次に、ステップＳ５０５において、ＣＰＵ４２ａは、各サンプル（＝複数の画像から構成されるある１つの実験条件下のデータ）中の細胞と認識される画像中のオブジェクト１個１個に対して、染色の有無や、熟練者の経験に基づき、その細胞毎に、「レベル」または「グループ」の呼び名をつける。ここで、「判断不能」「ゴミ」などというグループを作ってもよい。
【０１９２】
次に、ステップＳ５０６において、全ての条件で、ステップＳ５０１からステップＳ５０５の処理を所定の回数行っていない場合（ステップＳ５０６ ＮＯ）、ステップＳ５０１に戻る。一方、ステップＳ５０６において、全ての条件で、ステップＳ５０１からステップＳ５０５の処理を所定の回数行った場合（ステップＳ５０６ ＹＥＳ）、本フローチャートは終了する。
【０１９３】
図２０は、決定木算出用の特徴量の算出を説明するためのフローチャートである。図２０のフローチャートの処理は、ユーザからの指示に応じてＣＰＵ４２ａが実行する。
まず、ステップＳ６０１において、ＣＰＵ４２ａは、予め用意されたサンプルの顕微鏡画像のデータを記憶部４３ａから読み込む。なお、Ｓ６０１でのＣＰＵ４２ａは、各画像に対応する細胞の総数およびｉＰＳ細胞の数を示す情報もこの時点で取得するものとする。
【０１９４】
次に、ステップＳ６０２において、ＣＰＵ４２ａは、上記のサンプルの顕微鏡画像のうちから、処理対象となる画像を指定する。ここで、Ｓ６０２でのＣＰＵ４２ａは、予め用意されているサンプルの顕微鏡画像のすべてを処理対象として順次指定してゆくものとする。
【０１９５】
次に、ステップＳ６０３において、領域抽出部４４は、処理対象の顕微鏡画像について、画像内に含まれるｉＰＳ細胞のコロニーの領域と、フィーダー細胞の領域とを抽出する。
【０１９６】
次に、ステップＳ６０４において、特徴量算出部４５ａは、実施例１と同様に、領域抽出部４４により画像から抽出した各画像のオブジェクトに対して、細胞の形態的特徴を示す特徴量をそれぞれ求める。一例として、特徴量算出部４５ａは、各細胞について図６に示された１９種類の特徴量をそれぞれ求める。
【０１９７】
次に、ステップＳ６０５において、特徴量算出部４５ａは、演算対象の教師画像について、１９種類の特徴量の画像内平均値および画像内標準偏差をそれぞれ求める。そして、特徴量算出部４５ａは、上記の各特徴量の画像内平均値および画像内標準偏差をそれぞれ記憶部４３ａに記録する。
【０１９８】
次に、ステップＳ６０６において、特徴量算出部４５ａが、全画像の特徴量を算出していない場合（Ｓ６０６ ＮＯ）、ステップＳ６０２に戻る。一方、特徴量算出部４５ａが、全画像の特徴量を算出した場合（Ｓ６０６ ＹＥＳ）、本フローチャートは終了する。
【０１９９】
図２１は、画像別の決定木の算出を説明するためのフローチャートである。予め、図２０のフローチャートで、特徴量算出部４５ａが各経時の各形態的特徴量の平均値（入力値１）および各経時の各形態的特徴量の標準偏差（入力値２）を算出しているものとする。
まず、ステップＳ７０１において、度数分布算出部４６は、各経時の各形態的特徴量の度数分布（入力値３）を算出する。
【０２００】
次に、ステップＳ７０２において、指標抽出部４７ａは、形態的特徴量ごとに、特徴量の度数分布の面積の差（入力値４）を経時の全組み合わせで算出する。
次に、ステップＳ７０３において、指標抽出部４７ａが、全ての特徴量で、各経時間の特徴量の度数分布の面積の差を算出していない場合（Ｓ７０３ ＮＯ）、指標抽出部４７ａは、ステップＳ７０２に戻る。一方、指標抽出部４７ａが、全ての特徴量で、各経時間の特徴量の度数分布の面積の差を算出した場合（Ｓ７０３ ＮＯ）、ステップＳ７０４に遷移する。
【０２０１】
次に、ステップＳ７０４において、指標抽出部４７ａは、画像毎の上記４つの入力値と画像毎の教師値を用いてデータをグループ化して、決定木を構築する。ここで、教師値は、例えば、細胞の分化の度合いを示すレベルであえば、高、中または小であり、分化の種類を示すグループであれば、骨、軟骨または脂肪である。
これによって、各「レベル」または各「グループ」が区分される。例えば、細胞の分化の度合いを示すレベルが分類されたり、各分化の種類を示すグループが分類されたりする。
【０２０２】
次に、ステップＳ７０５において、指標抽出部４７ａは、決定木の構造と、グループ化したときの指標の種類と、指標の種類毎の指標の閾値とを記憶部４３ａに保存する。以上で、本フローチャートは終了する。
【０２０３】
図２２は、細胞別の決定木算出を説明するためのフローチャートである。
まず、ステップＳ８０１において、指標抽出部４７ａは、特徴量算出部４５ａにより算出された各画像中の細胞と認識されるオブジェクト１個１個に対して形の指標を、実験条件毎に記憶部４３ａから読み出す。
【０２０４】
次に、ステップＳ８０２において、指標抽出部４７ａは、細胞毎の上記４つの入力値と細胞毎の教師値を用いてデータをグループ化して、決定木を構築する。これによって、対象画像中の細胞１つ１つに対して、各細胞のレベル」または「グループ」が区分される。従って、１つ１つの細胞において、形の指標の組み合わせから、その細胞の「レベル」または「グループ」を特定することができる。
【０２０５】
次に、ステップＳ８０３において、指標抽出部４７ａは、決定木の構造と、グループ化したときの指標の種類と、指標の種類毎の指標の閾値とを記憶部４３ａに保存する。以上で、本フローチャートは終了する。
【０２０６】
続いて、判別モデルである決定木を用いて、対象画像からｉＰＳ細胞の状態を推定する３つの方法について説明する。まず、フィーダー細胞の形態的特徴量とｉＰＳ細胞のコロニーの特徴量とから、対象画像中に含まれるｉＰＳ細胞集団の状態を推定する方法について説明する。
【０２０７】
図２３は、図１６に示す画像別、コロニー＋フィーダーモデルを用いたｉＰＳ細胞の状態の推定を説明するためのフローチャートである。
まず、ステップＳ９０１において、撮像装置３４は、ｉＰＳ細胞とｉＰＳ細胞の周囲に存在し、共に培養されているフィーダー細胞とが撮像された参照画像を継続的に取得し、記憶部４３ａに保存する。
【０２０８】
次に、ステップＳ９０２において、特徴量算出部４５ａは、上記４つの入力値を算出する。
次に、ステップＳ９０３において、評価処理部４８ａは、記憶部４３ａから画像別、コロニー＋フィーダーモデルで用いられる指標の種類およびその指標の閾値を読み出す。
【０２０９】
次に、ステップＳ９０４において、評価処理部４８ａは、特徴量算出部４５ａが算出した４つの入力値から、読み出した指標の種類に該当する値を読み出す。
そして、評価処理部４８ａは、その読み出した指標の種類に該当する値を、その指標の閾値と比較することによって、ｉＰＳ細胞を所定のグループに分類する。これによって、評価処理部４８ａは、ｉＰＳ細胞の状態を推定することができる。
【０２１０】
例えば、評価処理部４８ａは、上記入力値から「９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞のヒストグラム間の面積差」と「２４時間目のコロニーの丸さ平均値」という指標の種類に該当する値をそれぞれ読み出す（図１６参照）。
そして、評価処理部４８ａは、「９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞のヒストグラム間の面積差」に該当する値が、その指標の閾値（２０）以上であれば、ｉＰＳ細胞を「骨に分化する能力を持つ」というグループに分類する。
【０２１１】
これによって、ｉＰＳ細胞の周囲に存在するフィーダー細胞集団の形態的特徴量の度数分布の時間変化から、ｉＰＳ細胞の分化の種類を推定することができる。
【０２１２】
一方、評価処理部４８ａは、入力値のうち「９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞のヒストグラム間の面積差」に該当する値が、その指標の閾値（２０）未満であり、入力値のうち「２４時間目のコロニーの丸さの平均値」に該当する値が、その指標の閾値（３０）以上であれば、ｉＰＳ細胞を「軟骨に分化する能力を持つ」というグループに分類する。
【０２１３】
これによって、ｉＰＳ細胞の周囲に存在するフィーダー細胞集団の形態的特徴量の度数分布の時間変化と、ｉＰＳ細胞のコロニー集団の形態的特徴量とから、ｉＰＳ細胞の分化の種類を推定することができる。以上で、本フローチャートは終了する。
【０２１４】
２番目に、フィーダー細胞の形態的特徴量とｉＰＳ細胞のコロニーの特徴量とから、対象画像中に含まれるｉＰＳ細胞集団の状態を推定する方法について説明する。
図２４は、図１７に示す画像別、コロニー・フィーダー別モデルを用いたｉＰＳ細胞の状態の推定を説明するためのフローチャートである。
【０２１５】
まず、ステップＳ１００１からステップＳ１００２までは、ステップＳ９０１からステップＳ９０２までと同じなので、説明を省略する。
次に、ステップＳ１００３において、評価処理部４８ａは、記憶部４３ａから画像別、コロニー・フィーダー別モデルで用いられる指標の種類およびその指標の閾値を読み出す。
【０２１６】
次に、ステップＳ１００４において、評価処理部４８ａは、特徴量算出部４５ａが算出した４つの入力値から、コロニーモデルの指標の種類に該当する値を読み出す。
そして、評価処理部４８ａは、その読み出した指標の種類に該当する値を、その指標の閾値と比較することによって、ｉＰＳ細胞を所定のグループに分類する。
【０２１７】
例えば、評価処理部４８ａは、上記入力値から「２４時間目のコロニーの丸さの平均値」と「９６時間目と２４時間目のコロニーの長さの変化量」という指標の種類に該当する値をそれぞれ読み出す（図１７（ａ）参照）。
そして、評価処理部４８ａは、入力値のうち「２４時間目のコロニーの丸さの平均値」に該当する値が、その指標の閾値（２０）以上であれば、ｉＰＳ細胞を「骨に分化する能力を持つ」というグループに分類する。
【０２１８】
これによって、ｉＰＳ細胞のコロニー集団の形態的特徴量から、ｉＰＳ細胞の分化の種類を推定することができる。
【０２１９】
次に、ステップＳ１００５において、評価処理部４８ａは、特徴量算出部４５ａが算出した４つの入力値から、フィーダーモデルの指標の種類に該当する値を読み出す。
そして、評価処理部４８ａは、その読み出した指標の種類に該当する値を、その指標の閾値と比較することによって、ｉＰＳ細胞を所定のレベルに分類する。
【０２２０】
例えば、評価処理部４８ａは、上記入力値から「４８時間目のフィーダー細胞の丸さ平均値」と「９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞の丸さのヒストグラムの面積差」という指標の種類に該当する値をそれぞれ読み出す（図１７（ｂ）参照）。
そして、評価処理部４８ａは、入力値のうち「４８時間目のフィーダー細胞の丸さ平均値」に該当する値が、その指標の閾値（４０）以上であれば、ｉＰＳ細胞を「大きな劣化度合い」というレベルに分類する。
【０２２１】
これによって、フィーダー細胞集団の形態的特徴量から、ｉＰＳ細胞の劣化度合いを推定することができる。
【０２２２】
次に、ステップＳ１００６において、評価処理部４８ａは、分類したグループとレベルに基づいて、ｉＰＳ細胞の状態を複合的に推定する。
例えば、評価処理部４８ａは、コロニーモデルでグループ１（分化グループ：骨）、フィーダーモデルでレベル１（劣化度合い：大）に分類されたことから、ｉＰＳ細胞は骨に分化したが、劣化が激しいという複合的な推定をする。以上で、本フローチャートは、終了する。
【０２２３】
最後に、フィーダー細胞の形態的特徴量とｉＰＳ細胞のコロニーの特徴量とから、対象画像中に含まれるｉＰＳ細胞集団の状態を推定する方法について説明する。
図２５は、図１８に示す細胞別、コロニー・フィーダー別モデルを用いたｉＰＳ細胞の状態の推定を説明するためのフローチャートである。
【０２２４】
まず、ステップＳ１１０１からステップＳ１１０２までは、ステップＳ９０１からステップＳ９０２までと同じなので、説明を省略する。
次に、ステップＳ１１０３において、評価処理部４８ａは、記憶部４３ａから細胞別、コロニー・フィーダー別モデルで用いられる指標の種類およびその指標の閾値を読み出す。
【０２２５】
次に、ステップＳ１１０４において、評価処理部４８ａは、特徴量算出部４５ａが算出した４つの入力値から、コロニーモデルの指標の種類に該当する値を読み出す。
そして、評価処理部４８ａは、その読み出した指標の種類に該当する値を、その指標の閾値と比較することによって、ｉＰＳ細胞を所定のグループに分類する。
【０２２６】
例えば、評価処理部４８ａは、上記入力値から「２４時間目のコロニーの丸さ」と「９６時間目と２４時間目のコロニーの丸さのヒストグラムの面積差」という指標の種類に該当する値をそれぞれ読み出す（図１８（ａ）参照）。
そして、評価処理部４８ａは、入力値のうち「２４時間目のコロニーの丸さ」に該当する値が、その指標の閾値（８０）未満であれば、ｉＰＳ細胞を「脂肪に分化する能力をもつ」というグループに分類する。
【０２２７】
これによって、ｉＰＳ細胞の１つのコロニーの形態的特徴量から、そのｉＰＳ細胞のコロニーに含まれるｉＰＳ細胞の分化の種類を推定することができる。
【０２２８】
次に、ステップＳ１１０５において、評価処理部４８ａは、特徴量算出部４５ａが算出した４つの入力値から、フィーダーモデルの指標の種類に該当する値を読み出す。
そして、評価処理部４８ａは、その読み出した指標の種類に該当する値を、その指標の閾値と比較することによって、ｉＰＳ細胞を所定のレベルに分類する。
【０２２９】
例えば、評価処理部４８ａは、上記入力値から「４８時間目のフィーダー細胞の長さ」と「２４時間目のフィーダー細胞の輝度」という指標の種類に該当する値をそれぞれ読み出す（図１８（ｂ）参照）。
そして、評価処理部４８ａは、入力値のうち「４８時間目のフィーダー細胞の長さ」に該当する値が、その指標の閾値（２０）未満であれば、ｉＰＳ細胞を「低い増殖能」というレベルに分類する。
【０２３０】
これによって、１つのフィーダー細胞の形態的特徴量から、その周囲に存在するｉＰＳ細胞の分化の種類を推定することができる。
【０２３１】
次に、ステップＳ１１０６において、評価処理部４８ａは、分類したグループとレベルに基づいて、ｉＰＳ細胞の状態を複合的に推定する。
例えば、評価処理部４８ａは、コロニーモデルでグループ３（分化グループ：脂肪）、フィーダーモデルでレベル３（増殖能：低）に分類されたことから、そのｉＰＳ細胞は脂肪に分化する分化能を有するが、増殖能が低いという複合的な推定をする。以上で、本フローチャートは、終了する。
【０２３２】
以上、本発明の第２の実施例によれば、対象画像中に含まれるフィーダー細胞集団の形態的特徴量から、対象画像中に含まれるｉＰＳ細胞集団を、所定の「レベル」または所定の「グループ」に区分することができる。
さらに、対象画像中に含まれるフィーダー細胞集団の形態的特徴量と、対象画像中に含まれるｉＰＳ細胞集団の形態的特徴量とから、対象画像中に含まれるｉＰＳ細胞集団を、所定の「レベル」または所定の「グループ」に区分することができる。
【０２３３】
また、対象画像中に含まれる１つのフィーダー細胞の形態的特徴量から、対象画像中の１つのｉＰＳ細胞を、所定の「レベル」または所定の「グループ」に区分することができる。
さらに、対象画像中に含まれる１つのフィーダー細胞の形態的特徴量と、対象画像中に含まれる１つのｉＰＳ細胞の形態的特徴量とから、対象画像中の１つのｉＰＳ細胞を、所定の「レベル」または所定の「グループ」に区分することができる。
【０２３４】
なお、第２の実施例では、ｉＰＳ細胞のコロニーの特徴量とフィーダー細胞の特徴量に対して、それぞれ別々の決定木を構築したが、これに限らず、両方の特徴量を用いた決定木を構築してもよい。
なお、第２の実施例では、ｉＰＳ細胞の分化の方向性、ｉＰＳ細胞の劣化度合い、またはｉＰＳ細胞の増殖度を推定したがこれに限らず、ｉＰＳ細胞の分化度、ｉＰＳ細胞の腫瘍化しやすさ等でもよい。
【０２３５】
＜細胞の培養法の例＞
図２６は、本発明の実施例２の細胞評価プログラムを用いた細胞の培養方法を説明するためのフローチャートである。本フローチャートでは、インキュベータ１１に増殖させたいｉＰＳ細胞を含んだシャーレが置かれた状況を想定することとする。
【０２３６】
まず、ステップＳ１２０１において、ＣＰＵ４２ａは、予め決められた培養条件（例えば所定の温度、湿度等）で細胞を培養するよう温度調整装置１５ａと湿度調整装置１５ｂとを制御する。所定期間経過後、ステップＳ１２０２において、ＣＰＵ４２ａは、記憶部４３ａから読み出した本発明の実施形態の細胞評価プログラムを実行し、細胞の状態を評価する。次に、ステップＳ１２０３において、ＣＰＵ４２ａは、細胞の状態の評価結果に基づき、培養を中止するか、培養条件を変更するか、または現在の培養条件で培養を続行するか判定する。
【０２３７】
次に、ステップＳ１２０４において、ＣＰＵ４２ａが培養を中止すると判定した場合（ステップＳ１２０４ ＹＥＳ）、ＣＰＵ４２ａは培養の中止を示す情報を不図示のモニタ等に表示させ、処理を終了する。
一方、ＣＰＵ４２ａは培養を中止すると判定しなかった場合（ステップＳ１２０４ ＮＯ）、ＣＰＵ４２ａはステップＳ１２０５の処理に進む。
【０２３８】
次に、ステップＳ１２０５において、ＣＰＵ４２ａが培養条件を変更すると判定した場合（ステップＳ１２０５ ＹＥＳ）、ＣＰＵ４２ａは、細胞の状態の評価結果と関係付けられた培養条件（例えば所定の温度、湿度等）に変更するよう温度調整装置１５ａと湿度調整装置１５ｂとを制御する（ステップＳ１２０６）。ＣＰＵ４２ａは、ステップＳ１２０２の処理に戻る。
一方、ＣＰＵ４２ａが現在の培養条件で培養を続行すると判定した場合（ステップＳ１２０５ ＮＯ）、ＣＰＵ４２ａはステップＳ１２０７の処理に進む。
【０２３９】
次に、ステップＳ１２０７において、ＣＰＵ４２ａは、予め決められた時間の経過毎に、撮像装置３４で撮像された画像から、ｉＰＳ細胞に相当するオブジェクトを抽出し、オブジェクトの数すなわち細胞数を計数する。
【０２４０】
次に、ステップＳ１２０８において、計数された細胞数が所定の細胞数に到達していない場合（ステップＳ１２０８ ＮＯ）、計数された細胞数に応じた時間が経過した後、ＣＰＵ４２ａはステップＳ１２０２の処理に戻る。
一方、計数された細胞数が所定の細胞数に到達した場合（ステップＳ１２０８ ＹＥＳ）、ＣＰＵ４２ａはその細胞の培養が完了した旨を示す情報を、不図示のモニタ等に表 示させる。以上で、本フローチャートは、終了する。
【０２４１】
以上により、本発明の細胞の培養方法を用いれば、細胞の評価に基づいて動的に培養条件を変更することができるので、ｉＰＳ細胞を容易に増殖させることができる。
なお、本発明の実施例２の細胞評価プログラムを用いて、細胞の培養条件を変更したが、これに限らず、本発明の実施例１の細胞評価プログラムを用いて、細胞の培養条件を変更してもよい。
【０２４２】
なお、本発明の実施形態では、ｉＰＳ細胞について説明したがこれに限らず、ＥＳ細胞でも、他の細胞でもよい。
また、本発明の実施形態では、ｉＰＳ細胞の状態を推定するために、他のｉＰＳ細胞の形態的特徴量を指標にしたが、これに限らず、ＥＳ細胞など近種の細胞の形態的特徴量を指標にしてもよい。
【０２４３】
なお、本発明の実施形態では、フィーダー細胞は１種類の細胞であるとして説明したが、これに限らず、フィーダー細胞は複数種類の細胞を用いて構成されてもよい。その際には、その複数種類のフィーダー細胞のうち、少なくとも１種類のフィーダー細胞の形態的特徴量を指標にすればよい。
また、本発明の実施形態では、ｉＰＳ細胞とフィーダー細胞との２種類の細胞が共に培養されているとしたが、これに限らず、その他の種類の細胞が、ｉＰＳ細胞とフィーダー細胞と共に培養されていてもよい。
【０２４４】
＜実施形態の補足事項＞
（１）上記の一の実施形態では、インキュベータ１１またはインキュベータ１１ａがそれぞれ備える制御装置４１または制御装置４１ａに情報処理装置を組み込んだ例を説明したが、本発明の情報処理装置は、インキュベータ１１またはインキュベータ１１ａから顕微鏡画像を取得して解析を行う外部の独立したコンピュータで構成されていてもよい（この場合の図示は省略する）。
【０２４５】
（２）上記の実施形態では、領域抽出部４４、特徴量算出部４５または特徴量算出部４５ａ、度数分布算出部４６、指標抽出部４７または指標抽出部４７ａ、評価処理部４８または評価処理部４８ａの各機能をプログラムでソフトウェア的に実現する例を説明したが、これらの処理をＡＳＩＣによってハードウエア的に実現しても勿論かまわない。
【０２４６】
（３）上記の一の実施形態では、評価情報の計算モデルとその指標を制御装置４１または制御装置４１ａがＦＮＮによって求める例を説明した。しかし、本発明の培養状態評価装置は、例えば、重回帰分析などの他の多変量解析によって、評価情報の計算モデルとその指標を求めるものでもよい。
【０２４７】
さらに、本発明の培養状態評価装置は、複数の計算モデルを組み合わせて、これらの計算モデルによる演算結果の多数決（あるいは重み付け平均）によって、最終的な評価情報を生成するようにしてもよい。この場合には、例えば、混在率の低いデータではＭＲＡが強く、混在率の高いデータにはＦＮＮが強いというように、一方の計算モデルでは精度の低い状況を他のモデルによってカバーすることができ、評価情報の精度をより高めることができる。
【０２４８】
（４）また、培養状態評価装置は、評価情報の計算モデルを求めるときに、最初に複数の指標を組み合わせでの計算結果を演算し、変数増減法により指標を増減させるようにしてもよい。また、データの精度が高ければ指標を全て用いても良い。
【０２４９】
（５）上記の一の実施形態では、２つの度数分布の差分の絶対値和を用いて、度数分布の変化量を求める例を説明したが、２つの度数分布の差分の二乗和から度数分布の変化量を求めてもよい。また、上記の一の実施形態で示した計算式はあくまで一例に過ぎず、例えば２次以上のｎ次方程式などであってもよい。
【０２５０】
（６）上記の実施形態や実施例に示した特徴値はあくまで一例にすぎず、評価対象の細胞の種類などに応じて他の特徴値のパラメータを採用することも勿論可能である。
【０２５１】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。
【符号の説明】
【０２５２】
１１ インキュベータ
１１ａ インキュベータ
１５ 恒温室
１９ 培養容器
２２ 観察ユニット
３４ 撮像装置
４１ 制御装置
４１ａ 制御装置
４２ ＣＰＵ
４２ａ ＣＰＵ
４３ 記憶部
４３ａ 記憶部
４４ 領域抽出部
４５ 特徴量算出部
４５ａ 特徴量算出部
４６ 度数分布算出部
４７ 指標抽出部
４７ａ 指標抽出部
４８ 評価処理部
４８ａ 評価処理部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞評価装置、インキュベータ、細胞評価方法、細胞評価プログラムおよび細胞の培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、細胞の培養状態を評価する技術は、再生医療などの先端医療分野や医薬品のスクリーニングを含む幅広い分野での基盤技術となっている。例えば、再生医療分野では、インビトロで細胞を増殖、分化させるプロセスが存在する。そして、上記のプロセスでは、細胞の分化の成否、細胞の癌化や感染の有無を管理するために、細胞の培養状態を的確に評価することが不可欠である。一例として、マーカーとして転写因子を用いたがん細胞の評価方法が開示されている（特許文献１参照）。
【０００３】
一方、ＥＳ（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ、胚性幹）細胞またはｉＰＳ（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ、誘導多能性幹）細胞などの万能細胞は、理論上すべての組織に分化する分化多能性を保ちつつ、ほぼ無限に増殖させる事ができるため、医薬開発および再生医療への応用に注目が集まっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−１９５５３３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ｉＰＳ細胞を再生医療に応用する際には、状態が良いｉＰＳ細胞だけ抽出する必要があるため、培養しているｉＰＳ細胞の状態を評価することが必要となる。しかしながら、従来の技術では、ｉＰＳ細胞を染色マーカーで染色せずに、ｉＰＳ細胞の状態を評価できないという問題があった。
【０００６】
そこで本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、細胞を染色せずに、細胞の状態を推定する細胞評価装置、インキュベータ、細胞評価方法、細胞評価プログラムおよび細胞の培養方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記問題を解決するために、本発明は、第１の種類の細胞と前記第１の種類の細胞の周囲に存在し、共に培養されている第２の種類の細胞とが撮像された対象画像において、前記第１の種類の個別の細胞および細胞の集合体が占める領域と前記第２の種類の細胞が占める領域とを抽出する領域抽出部と、前記領域抽出部で抽出された第２の種類の細胞が占める領域に存在する前記第２の種類の細胞の形態的特徴を示す特徴量を算出する第１の特徴量算出部と、前記第２の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量と、前記第１の種類の細胞の状態との対応関係に基づいて、第１の種類の細胞の状態を評価する評価処理部と、を備えることを特徴とする細胞評価装置である。
【０００８】
また、本発明は、細胞を培養する培養容器を収納するとともに、所定の環境条件に内部を維持可能な恒温室と、前記恒温室内で前記培養容器に含まれる前記細胞の画像を撮像する撮像装置と、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の細胞評価装置と、を備えることを特徴とするインキュベータである。
【０００９】
また、本発明は、第１の種類の細胞と前記第１の種類の細胞の周囲に存在し、共に培養されている第２の種類の細胞とが撮像された対象画像において、前記第１の種類の個別の細胞および細胞の集合体が占める領域と前記第２の種類の細胞が占める領域とを抽出する領域抽出手順と、前記領域抽出手順で抽出された第２の種類の細胞が占める領域に存在する前記第２の種類の細胞の形態的特徴を示す特徴量を算出する第１の特徴量算出手順と、前記第２の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量と、前記第１の種類の細胞の状態との対応関係に基づいて、第１の種類の細胞の状態を評価する評価処理手順と、を有することを特徴とする細胞評価方法である。
【００１０】
また、本発明は、第１の種類の細胞と前記第１の種類の細胞の周囲に存在し、共に培養されている第２の種類の細胞とが撮像された対象画像において、前記第１の種類の個別の細胞および細胞の集合体が占める領域と前記第２の種類の細胞が占める領域とを抽出する第１のステップと、前記第１のステップで抽出された第２の種類の細胞が占める領域に存在する前記第２の種類の細胞の形態的特徴を示す特徴量を算出する第２のステップと、前記第２の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量と、前記第１の種類の細胞の状態との対応関係に基づいて、第１の種類の細胞の状態を評価する第３のステップと、をコンピュータに実行させるための細胞評価プログラムである。
【００１１】
また、本発明は、第１の種類の細胞と前記第１の種類の細胞の周囲に存在し、共に培養されている第２の種類の細胞が撮像された画像から、前記第２の種類の細胞の形態的特徴を示す特徴量を抽出し、前記第２の種類の細胞の形態的特徴を示す特徴量に基づき、第１の種類の細胞の状態を推定し、前記第１の細胞の状態に基づき、前記第１の種類の細胞又は前記第２の種類の細胞の培養条件を変更することを特徴とする細胞の培養方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、細胞を染色せずに、細胞の状態を推定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施形態であるインキュベータの正面図である。
【図２】本発明の実施形態であるインキュベータの平面図である。
【図３】本発明の第１の実施例であるインキュベータのブロック構成図である。
【図４】ｉＰＳ細胞と共培養されているフィーダー細胞とが撮像された画像から、ｉＰＳ細胞のコロニーの領域とフィーダー細胞の領域とを抽出する処理を説明するための図である。
【図５】抽出されたｉＰＳ細胞のコロニーの領域と、フィーダー細胞の領域とを説明するための図である。
【図６】細胞の形態の各特徴量を説明するための図である。
【図７】ある特徴量についての計算モデルのパラメータを格納するテーブルを説明するための図である。
【図８】Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋの概要を説明するための図である。
【図９】Ｆｕｚｚｙ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋの概要を説明するための図である。
【図１０】Ｆｕｚｚｙ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋにおけるシグモイド関数を説明するための図である。
【図１１】インキュベータにおける観察処理の一例を示すフローチャートである。
【図１２】計算モデル用の教師値の算出を説明するためのフローチャートである。
【図１３】計算モデルの構築を説明するためのフローチャートである。
【図１４】計算モデルを用いたｉＰＳ細胞の分化度を推定するためのフローチャートである。
【図１５】本発明の第２の実施例であるインキュベータのブロック構成図である。
【図１６】画像別、コロニー＋フィーダーモデルの決定木を説明するための図である。
【図１７】画像別、コロニー・フィーダー別モデルの決定木を説明するための図である。
【図１８】細胞別、コロニー・フィーダー別モデルの決定木を説明するための図である。
【図１９】決定木算出用の教師値の算出を説明するためのフローチャートである。
【図２０】決定木算出用の特徴量の算出を説明するためのフローチャートである。
【図２１】画像別の決定木の算出を説明するためのフローチャートである。
【図２２】細胞別の決定木算出を説明するためのフローチャートである。
【図２３】図１６に示す画像別、コロニー＋フィーダーモデルを用いたｉＰＳ細胞の状態の推定を説明するためのフローチャートである。
【図２４】図１７に示す画像別、コロニー・フィーダー別モデルを用いたｉＰＳ細胞の状態の推定を説明するためのフローチャートである。
【図２５】図１８に示す細胞別、コロニー・フィーダー別モデルを用いたｉＰＳ細胞の状態の推定を説明するためのフローチャートである。
【図２６】本発明の実施例２の細胞評価プログラムを用いた細胞の培養方法を説明するためのフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための形態について、図面を参照して詳細に説明する。本発明の実施形態では、ｉＰＳ細胞と、ｉＰＳ細胞の周囲に存在しｉＰＳ細胞に栄養素などを供給する１種類のフィーダー細胞とが共に培養されている。
【００１５】
＜実施例１＞
一般的に、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞は、その分化能力が高いほどその品質が良いと考えられている。従って、本発明の実施例１では、ｉＰＳ細胞の状態を推定するのに、全体の細胞に占める分化した細胞の割合（以下、分化度と称する）を指標とする。
図１は、本発明の実施形態であるインキュベータの正面図である。図２は、本発明の実施形態であるインキュベータの平面図である。
【００１６】
恒温室１５の前面には、大扉１６、中扉１７、小扉１８が配置されている。大扉１６
は、上部ケーシング１２および下部ケーシング１３の前面を覆っている。中扉１７は、上
部ケーシング１２の前面を覆っており、大扉１６の開放時に恒温室１５と外部との環境を
隔離する。小扉１８は、細胞を培養する培養容器１９を搬出入するための扉であって、中
扉１７に取り付けられている。この小扉１８から培養容器１９を搬出入することで、恒温
室１５の環境変化を抑制することが可能となる。なお、大扉１６、中扉１７、小扉１８
は、パッキンＰ１，Ｐ２，Ｐ３によりそれぞれ気密性が維持されている。
【００１７】
また、恒温室１５には、ストッカー２１、観察ユニット２２、容器搬送装置２３、搬送
台２４が配置されている。ここで、搬送台２４は、小扉１８の手前に配置されており、培
養容器１９を小扉１８から搬出入する。
【００１８】
ストッカー２１は、上部ケーシング１２の前面（図２の下側）からみて恒温室１５の左
側に配置される。ストッカー２１は複数の棚を有しており、ストッカー２１の各々の棚に
は培養容器１９を複数収納することができる。なお、各々の培養容器１９には、培養の対
象となる細胞が培地とともに収容されている。
【００１９】
ここで、観察ユニット２２は、上部ケーシング１２のベースプレート１４の開口部に嵌
め込まれて配置される。観察ユニット２２は、試料台３１と、試料台３１の上方に張り出
したスタンドアーム３２と、位相差観察用の顕微光学系および撮像装置（３４）を内蔵し
た本体部分３３と、を有している。そして、試料台３１およびスタンドアーム３２は恒温室１５に配置される一方で、本体部分３３は下部ケーシング１３内に収納される。
【００２０】
観察ユニット２２は、上部ケーシング１２の前面からみて恒温室１５の右側に配置され
る。この観察ユニット２２は、培養容器１９内の細胞のタイムラプス観察を実行すること
ができる。
【００２１】
ここで、観察ユニット２２は、上部ケーシング１２のベースプレート１４の開口部に嵌
め込まれて配置される。観察ユニット２２は、試料台３１と、試料台３１の上方に張り出
したスタンドアーム３２と、位相差観察用の顕微光学系および撮像装置（３４）を内蔵し
た本体部分３３と、を有している。そして、試料台３１およびスタンドアーム３２は恒温室１５に配置される一方で、本体部分３３は下部ケーシング１３内に収納される。
【００２２】
試料台３１は透光性の材質で構成されており、その上に培養容器１９を載置することが
できる。この試料台３１は水平方向に移動可能に構成されており、上面に載置した培養容
器１９の位置を調整できる。また、スタンドアーム３２にはＬＥＤ光源３５が内蔵されて
いる。そして、撮像装置３４は、スタンドアーム３２によって試料台３１の上側から透過
照明された培養容器１９の細胞を、顕微鏡の光学系を介して撮像することで細胞の顕微鏡画像を取得する。
【００２３】
容器搬送装置２３は、上部ケーシング１２の前面からみて恒温室１５の中央に配置され
る。この容器搬送装置２３は、ストッカー２１、観察ユニット２２の試料台３１および搬
送台２４との間で培養容器１９の受け渡しを行う。
【００２４】
図２に示すように、容器搬送装置２３は、多関節アームを有する垂直ロボット３４と、回転ステージ３５と、ミニステージ３６と、アーム部３７とを有している。回転ステージ３５は、垂直ロボット３４の先端部に回転軸３５ａを介して水平方向に１８０°回転可能に取り付けられている。そのため、回転ステージ３５は、ストッカー２１、試料台３１および搬送台２４に対して、アーム部３７をそれぞれ対向させることができる。
【００２５】
また、ミニステージ３６は、回転ステージ３５に対して水平方向に摺動可能に取り付けられている。ミニステージ３６には培養容器１９を把持するアーム部３７が取り付けられている。
【００２６】
図３は、本発明の第１の実施例であるインキュベータのブロック構成図である。
第１の実施例のインキュベータ１１は、上部ケーシング１２と下部ケーシング１３とを有している。インキュベータ１１の組立状態において、上部ケーシング１２は下部ケーシング１３の上に載置される。なお、上部ケーシング１２と下部ケーシング１３との内部空間は、ベースプレート１４によって上下に仕切られている。
【００２７】
上部ケーシング１２は、温度調整装置１５ａと、湿度調整装置１５ｂと、容器搬送装置２３と、ＬＥＤ光源３５とを有している。
まず、上部ケーシング１２の構成の概要を説明する。上部ケーシング１２の内部には、
細胞の培養を行う恒温室１５が形成されている。この恒温室１５は温度調整装置１５ａお
よび湿度調整装置１５ｂを有している。
【００２８】
温度調整装置１５ａおよび湿度調整装置１５ｂは、恒温室１５内を細胞の培養に適した環境（例えば温度３７℃、湿度９０％）に維持する（なお、図１、図２での温度調整装置１５ａ、湿度調整装置１５ｂの図示は省略する）。
ＬＥＤ光源３５は、培養容器１９を照明する。
【００２９】
次に、下部ケーシング１３の構成の概要を説明する。下部ケーシング１３の内部には、観察ユニット２２の撮像装置３４や、インキュベータ１１の制御装置（細胞評価装置）４１が収納されている。
撮像装置３４は、上側から透過照明された培養容器１９の細胞を、顕微鏡の光学系を介して撮像することで細胞の顕微鏡画像を取得する。撮像装置３４は、その細胞の顕微鏡画像をＣＰＵ４２へ供給する。
【００３０】
制御装置（細胞評価装置）４１は、温度調整装置１５ａと、湿度調整装置１５ｂと、観察ユニット２２と、
容器搬送装置２３とそれぞれ接続されている。この制御装置４１は、所定のプログラムに
従ってインキュベータ１１の各部を統括的に制御する。
【００３１】
一例として、制御装置４１は、温度調整装置１５ａおよび湿度調整装置１５ｂをそれぞ
れ制御して恒温室１５内を所定の環境条件に維持する。また、制御装置４１は、所定の観
察スケジュールに基づいて、観察ユニット２２および容器搬送装置２３を制御して、培養
容器１９の観察シーケンスを自動的に実行する。さらに、制御装置４１は、観察シーケン
スで取得した画像に基づいて、細胞の状態の評価を行う培養状態評価処理を実行する。
【００３２】
制御装置４１は、ＣＰＵ４２と、記憶部４３と、を用いて構成されている。ＣＰＵ４２は、制御装置４１の各種の演算処理を実行するプロセッサである。
記憶部４３は、ハードディスクや、フラッシュメモリ等の不揮発性の記憶媒体などで構成される。この記憶部４３は、ストッカー２１に収納されている各培養容器１９に関する管理データと、撮像装置で撮像された顕微鏡画像のデータとを保持する。さらに、記憶部４３は、ＣＰＵ４２によって実行されるプログラムを保持する。
【００３３】
なお、上記の管理データには、（ａ）個々の培養容器１９を示すインデックスデータ、（ｂ）ストッカー２１での培養容器１９の収納位置、（ｃ）培養容器１９の種類および形状（ウェルプレート、ディッシュ、フラスコなど）、（ｄ）培養容器１９で培養されている細胞の種類、（ｅ）培養容器１９の観察スケジュール、（ｆ）タイムラプス観察時の撮像条件（対物レンズの倍率、容器内の観察地点等）、などが含まれている。また、ウェルプレートのように複数の小容器で同時に細胞を培養できる培養容器１９については、各々の小容器ごとにそれぞれ管理データが生成される。
【００３４】
また、記憶部４３は、予め用意されたサンプルの顕微鏡画像のデータを保持する。また、予め用意されたモデル構築用の顕微鏡画像のデータと、画像の教師値（例えば、分化の度合い）を保持する。
【００３５】
ＣＰＵ４２は、記憶部４３に記憶されているプログラムを読み出して実行することにより、領域抽出部４４と、特徴量算出部４５と、度数分布算出部４６と、指標抽出部４７と、評価処理部４８との各部の機能を実現する。
【００３６】
図４は、ｉＰＳ細胞と共培養されているフィーダー細胞とが撮像された画像から、ｉＰＳ細胞のコロニーの領域とフィーダー細胞の領域とを抽出する処理を説明するための図である。
領域抽出部４４は、予め用意されたサンプルの顕微鏡画像のデータを記憶部４３から読み込む。そして、領域抽出部４４は、上記のサンプルの顕微鏡画像のうちから、処理対象となる画像８１を指定する。そして、領域抽出部４４は、画像８１をＯｐｅｎ−Ｃｌｏｓｅフィルタをかけて、Ｏｐｅｎ−Ｃｌｏｓｅフィルタをかけた画像８２を生成する。
【００３７】
そして、領域抽出部４４は、画像８１から生成したＯｐｅｎ−Ｃｌｏｓｅフィルタをかけた画像８２を引き算した背景補正画像８３を生成する。これによって、画像８１のバックグラウンドの輝度を均一にすることができる。
【００３８】
領域抽出部４４は、背景補正画像８３に対して、画像内に含まれる細胞を抽出する。例えば、位相差顕微鏡で細胞を撮像すると、細胞壁のように位相差の変化の大きな部位の周辺にはハロが現れる。そのため、領域抽出部４４は、細胞壁に対応するハロを公知のエッジ抽出手法で抽出するとともに、輪郭追跡処理によってエッジで囲まれた閉空間を細胞と推定する。これにより上記の顕微鏡画像から個々の細胞を抽出することができる。
【００３９】
そして、領域抽出部４４は、背景補正画像８３から、ｉＰＳ細胞のコロニーの領域を抽出した画像８４を生成する。また、領域抽出部４４は、背景補正画像８３から、フィーダー細胞の領域を抽出した画像８５を生成する。
【００４０】
図５は、抽出されたｉＰＳ細胞のコロニーの領域と、フィーダー細胞の領域とを説明するための図である。
領域抽出部４４は、ｉＰＳ細胞のコロニーの領域を抽出した画像８４から、ｉＰＳ細胞のコロニーの領域９１を抜き出す。また、領域抽出部４４は、フィーダー細胞の領域を抽出した画像８５からフィーダー細胞の領域９２を抜き出す。
領域抽出部４４は、各観察時間におけるｉＰＳ細胞のコロニーの領域９１の情報と、そのフィーダー細胞の領域９２の情報とを、特徴量算出部４５へ供給する。
【００４１】
図６は、細胞の形態の各特徴量を説明するための図である。具体的に、細胞形態の特徴量は、例えば、以下の通りである。
「Ｔｏｔａｌ ａｒｅａ」（図６の（ａ）参照）は、注目する細胞の面積を示す値である。例えば、細胞形態の特徴量算出部４５は、注目する細胞の領域の画素数に基づいて「Ｔｏｔａｌ ａｒｅａ」の値を求めることができる。
【００４２】
「Ｈｏｌｅ ａｒｅａ」（図６の（ｂ）参照）は、注目する細胞内のＨｏｌｅの面積を示す値である。ここで、Ｈｏｌｅは、コントラストによって、細胞内における画像の明るさが閾値以上となる部分（位相差観察では白に近い状態となる箇所）を指す。例えば、細胞内小器官の染色されたリソソームなどがＨｏｌｅとして検出される。
また、画像によっては、細胞核や、他の細胞小器官がＨｏｌｅとして検出されうる。なお、細胞形態の特徴量算出部４５は、細胞内における輝度値が閾値以上となる画素のまとまりをＨｏｌｅとして検出し、このＨｏｌｅの画素数に基づいて「Ｈｏｌｅ ａｒｅａ」の値を求めればよい。
【００４３】
「ｒｅｌａｔｉｖｅ ｈｏｌｅ ａｒｅａ」（図６の（ｃ）参照）は、「Ｈｏｌｅ ａｒｅａ」の値を「Ｔｏｔａｌ ａｒｅａ」の値で除した値である（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｈｏｌｅ ａｒｅａ＝Ｈｏｌｅ ａｒｅａ／Ｔｏｔａｌ ａｒｅａ）。この「ｒｅｌａｔｉｖｅ ｈｏｌｅ ａｒｅａ」は、細胞の大きさにおける細胞内小器官の割合を示すパラメータであって、例えば細胞内小器官の肥大化や核の形の悪化などに応じてその値が変動する。
【００４４】
「Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ」（図６の（ｄ）参照）は、注目する細胞の外周の長さを示す値である。例えば、細胞形態の特徴量算出部４５は、細胞を抽出するときの輪郭追跡処理により「Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ」の値を取得することができる。
【００４５】
「Ｗｉｄｔｈ」（図６の（ｅ）参照）は、注目する細胞の画像横方向（Ｘ方向）での長さを示す値である。
「Ｈｅｉｇｈｔ」（図６の（ｆ）参照）は、注目する細胞の画像縦方向（Ｙ方向）での長さを示す値である。
【００４６】
「Ｌｅｎｇｔｈ」（図６の（ｇ）参照）は、注目する細胞を横切る線のうちの最大値（細胞の全長）を示す値である。
「Ｂｒｅａｄｔｈ」（図６の（ｈ）参照）は、「Ｌｅｎｇｔｈ」に直交する線のうちの最大値（細胞の横幅）を示す値である。
【００４７】
「Ｆｉｂｅｒ Ｌｅｎｇｔｈ」（図６の（ｉ）参照）は、注目する細胞を擬似的に線状と仮定した場合の長さを示す値である。細胞形態の特徴量算出部４５は、下式（１）により「Ｆｉｂｅｒ Ｌｅｎｇｔｈ」の値を求める。
【００４８】
【数１】
【００４９】
但し、本明細書の式において「Ｐ」はＰｅｒｉｍｅｔｅｒの値を示す。同様に「Ａ」はＴｏｔａｌ Ａｒｅａの値を示す。
【００５０】
「Ｆｉｂｅｒ Ｂｒｅａｄｔｈ」（図６の（ｊ）参照）は、注目する細胞を擬似的に線状と仮定した場合の幅（Ｆｉｂｅｒ Ｌｅｎｇｔｈと直交する方向の長さ）を示す値である。細胞形態の特徴量算出部４５は、下式（２）により「Ｆｉｂｅｒ Ｂｒｅａｄｔｈ」の値を求める。
【００５１】
【数２】
【００５２】
「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」（図６の（ｋ）参照）は、注目する細胞の円形度（細胞の丸さ）を示す値である。細胞形態の特徴量算出部４５は、下式（３）により「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の値を求める。
【００５３】
【数３】
【００５４】
「Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ ｆｏｒｍ Ｆａｃｔｏｒ」（図６の（ｌ）参照）は、「Ｌｅｎｇｔｈ」の値を「Ｂｒｅａｄｔｈ」の値で除した値（Ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ ｆｏｒｍ Ｆａｃｔｏｒ＝Ｌｅｎｇｔｈ／Ｂｒｅａｄｔｈ）であって、注目する細胞の細長さの度合いを示すパラメータとなる。
【００５５】
「Ｉｎｎｅｒ ｒａｄｉｕｓ」（図６の（ｍ）参照）は、注目する細胞の内接円の半径を示す値である。
「Ｏｕｔｅｒ ｒａｄｉｕｓ」（図６の（ｎ）参照）は、注目する細胞の外接円の半径を示す値である。
【００５６】
「Ｍｅａｎ ｒａｄｉｕｓ」（図６の（ｏ）参照）は、注目する細胞の輪郭を構成する全点とその重心点との平均距離を示す値である。
「Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｒａｄｉｕｓ」（図６の（ｐ）参照）は、注目する細胞と同面積の円の半径を示す値である。この「Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｒａｄｉｕｓ」のパラメータは、注目する細胞を仮想的に円に近似した場合の大きさを示している。
【００５７】
ここで、細胞形態の特徴量算出部４５は、細胞に対応する画素数に誤差分を加味して上記の各特徴量を求めてもよい。このとき、細胞形態の特徴量算出部４５は、顕微鏡画像の撮影条件（撮影倍率や顕微光学系の収差など）を考慮して特徴量を求めるようにしてもよい。なお、「Ｉｎｎｅｒ ｒａｄｉｕｓ」、「Ｏｕｔｅｒ ｒａｄｉｕｓ」、「Ｍｅａｎ ｒａｄｉｕｓ」、「Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｒａｄｉｕｓ」を求めるときには、細胞形態の特徴量算出部４５は、公知の重心演算の手法に基づいて各細胞の重心点を求め、この重心点を基準にして各パラメータを求めればよい。
【００５８】
細胞形態の特徴量算出部４５は、領域抽出部４４から供給された各観察時間におけるｉＰＳ細胞のコロニーの領域９１の情報と、フィーダー細胞の領域９２の情報とを受け取る。
【００５９】
細胞形態の特徴量算出部４５は、各フィーダー細胞の領域９２において、図６に例示するフィーダー細胞の形態的特徴量を算出する。
ここで、フィーダー細胞の形態的特徴量とは、以下の特徴量を含んでもよい。「フィーダー細胞そのものの凹凸に相当する輝度値」、「フィーダー細胞の中の輝度分布」等である。
【００６０】
なお、細胞形態の特徴量算出部４５は、更に、各ｉＰＳ細胞のコロニーの領域９１において、図６に例示するｉＰＳ細胞のコロニーの形態的特徴量を算出してもよい。
ここで、ｉＰＳ細胞のコロニーの形態的特徴量は、「コロニーそのものの凹凸に相当する輝度値」、「コロニーの中の輝度分布」、「コロニーを１つの物体と考えた、コロニー集団の形の分布」の特徴量を含んでもよい。
【００６１】
なお、細胞形態の特徴量算出部４５は、ｉＰＳ細胞のコロニーの形態的特徴量だけでなく、図６に例示する個々のｉＰＳ細胞の形態的特徴量を算出してもよい。ここで、ｉＰＳ細胞の形態的特徴量は、「ｉＰＳ細胞そのものの凹凸に相当する輝度値」、「ｉＰＳ細胞の中の輝度分布」等の特徴量を含んでもよい。
【００６２】
そして、算出した各観察時間における各フィーダー細胞の形態的特徴量と、各ｉＰＳ細胞のコロニーの形態的特徴量と、個々のｉＰＳ細胞の形態的特徴量と、を記憶部４３に記録する。
【００６３】
度数分布算出部４６は、記憶部４３から各観察時間における各フィーダー細胞の形態的特徴量と、各ｉＰＳ細胞のコロニーの形態的特徴量と、個々のｉＰＳ細胞の形態的特徴量と、を読み出す。また、度数分布算出部４６は、記憶部４３から観察画像の教師値を読み出す。
【００６４】
度数分布算出部４６は、各々の顕微鏡画像毎に算出された特徴量の種類毎に、それぞれ特徴量の度数分布を算出する。従って、度数分布算出部４６は、１つの顕微鏡画像に対して、例えば５７（＝１９［種類の特徴量］×３［種類の細胞］）種類の特徴値の度数分布を求めることとなる。また、度数分布算出部４６は、各々の度数分布において、特徴値の各区分に対応する細胞の数を頻度（％）として算出する。
【００６５】
度数分布算出部４６は、上記の度数分布における度数の区分を、特徴量の種類ごとの標準偏差を用いて正規化する。ここでは一例として、「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布での区分を決定する場合を説明する。
【００６６】
まず、度数分布算出部４６は、各々の顕微鏡画像から算出された全ての「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の値の標準偏差を算出する。次に、度数分布算出部４６は、上記の標準偏差の値をＦｉｓｈｅｒの式に代入して、「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布における度数の区分の基準値を求める。このとき、度数分布算出部４６は、全ての「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の値の標準偏差（Ｓ）を４で除するとともに、小数点以下３桁目を四捨五入して上記の基準値とする。なお、一の実施形態での度数分布算出部４６は、度数分布をヒストグラムとして図示する場合、２０級数分の区間をモニタ等に描画させるものとする。
【００６７】
一例として、「Ｓｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の標準偏差Ｓが２５９のとき、２５９／４
＝６４．７５０から「６４．７５」が上記の基準値となる。そして、注目する画像の「Ｓ
ｈａｐｅ Ｆａｃｔｏｒ」の度数分布を求めるとき、度数分布算出部４６は、「Ｓｈａｐ
ｅ Ｆａｃｔｏｒ」の値に応じて０値から６４．７５刻みで設定された各クラスに細胞を
分類し、各クラスでの細胞の個数をカウントすればよい。
【００６８】
このように、度数分布算出部４６が、特徴量の種類毎に標準偏差で度数分布の区分を正
規化するため、異なる特徴値の間でも度数分布の傾向を大局的に近似させることができる。よって、一の実施例では、異なる特徴値間で細胞の培養状態と度数分布の変化との相関を求めることが比較的容易となる。
【００６９】
度数分布算出部４６は、全ての形態的特徴量をヒストグラムする。度数分布算出部４６は、全てのヒストグラムを記憶部４３に保存する。
【００７０】
指標抽出部４７は、全てのヒストグラムを記憶部４３から読み出す。
指標抽出部４７は、形態的特徴量ごとに、各経時のヒストグラムを、経時の全組み合わせ分比較して、経時間のヒストグラムの面積差の絶対値を算出する。
【００７１】
図７は、ある特徴量についての計算モデルのパラメータを格納するテーブルを説明するための図である。テーブル１００は、時刻１と、時刻２と、各特徴量ｆ（ｊ）（ｊは１からｎまでの整数）の時刻１の特徴量のヒストグラムと、時刻２の特徴量のヒストグラムとの面積差ΔＳｆ（ｊ）と、教師値（例えば、分化の度合い）の差を用いて構成されている。
ここで、一例として、形態的特徴量の種類が同じで、撮影時間（０、２４、４８、７２、９６時間目）が異なる５つの度数分布を想定する。
【００７２】
指標抽出部４７は、上記全１０通りの組み合わせに対して、以下の式（４）により、度数分布の面積差の絶対値（画像間での度数分布の差分の絶対値を積分したもの）を算出する。つまり、１セット分における１種類の特徴量に注目したとき、指標抽出部４７は、その特徴値の度数分布につき、計１０通りの面積差を算出する。
【００７３】
【数４】
【００７４】
但し、式（４）において、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は初期状態の度数分布（８時間目）における１区間分の度数（細胞数）を示す。また、「Ｓａｍｐｌｅ」は、比較対象の度数分布における１区間分の度数を示す。また、ｉは、度数分布の区間を示す変数である。
【００７５】
指標抽出部４７は、特徴量の種類ごとに上記演算を行うことで、すべての特徴量についてそれぞれ１０通りの度数分布の変化量を取得できる。すなわち、１セット分の顕微鏡画像について、１９種類×１０通りで１９０の度数分布の組み合わせをとることができる。以後、上記の度数分布の組み合わせの１つを、指標と称する
指標抽出部４７は、形態的特徴量毎に、上記テーブル１００を、記憶部４３に保存する。
【００７６】
指標抽出部４７は、１９０の指標のうちから、細胞の培養状態をよく反映する指標を多変量解析により１以上指定する。この指標の組合せの選択は、後述するファジーニューラルネットワークと同等の非線形モデル以外にも、細胞とその形態の複雑性に応じて線形モデルの利用も有効である。このような指標の組合せの選択と共に、指標抽出部４７は、上記の指定された１以上の指標を用いて、顕微鏡画像から、ｉＰＳ細胞の状態を推定する計算モデルを算出する。
【００７７】
具体的には、各経時の形の指標１９種類の平均値（入力値１）と、各経時の形の指標１９種類の標準偏差（入力値２）と、各経時の形の指標１９種類の分布の値そのもの（入力値３）と、各経時の形の指標１９種類の分布の経時間の面積差（入力値４）との４つの入力値がある。４つの入力値に対し、各画像細胞の分化度（教師値）が関係付けられる。従って、指標抽出部４７は、教師値を最も精度よく予測できる入力値の組み合わせを見つける。
【００７８】
ここで、指標抽出部４７は、ファジーニューラルネットワーク（Ｆｕｚｚｙ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ：ＦＮＮ）解析によって上記の計算モデルを求める。
【００７９】
ＦＮＮとは、人工ニューラルネットワーク（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ：ＡＮＮ）とファジィ推論とを組み合わせた方法である。このＦＮＮでは、ファジイ推論の欠点であるメンバーシップ関数の決定を人間に頼るという部分を回避すべく、ＡＮＮをファジィ推論に組み込んでその自動決定を行う。学習機械のひとつであるＡＮＮ（図１０参照）は、生体の脳における神経回路網を数学的にモデル化したものであり、以下の特徴を持つ。
【００８０】
図８は、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋの概要を説明するための図である。
ＡＮＮにおける学習は、目的の出力値（教師値）をもつ学習用のデータ（入力値：Ｘ）を用いて、バックプロパゲーション（Ｂａｃｋ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ：ＢＰ）法により教師値と出力値（Ｙ）との誤差が小さくなるように、ノード（図８において丸で示す）間をつなぐ回路における結合荷重を変え、その出力値が教師値に近づくようにモデルを構築する過程である。
【００８１】
このＢＰ法を用いれば、ＡＮＮは学習により自動的に知識を獲得することができる。そして、最終的に学習に用いていないデータを入力することにより、そのモデルの汎用性を評価できる。従来、メンバーシップ関数の決定は、人間の感覚に頼っていたが、上で述べたようなＡＮＮをファジイ推論に組み込むことで自動的なメンバーシップ関数の同定が可能になる。これがＦＮＮである。
【００８２】
図９は、Ｆｕｚｚｙ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋの概要を説明するための図である。
ＦＮＮでは、ＡＮＮと同様に、ＢＰ法を用いることによりネットワークに与えられた入出力関係を、結合荷重を変化させることで自動的に同定しモデル化できる。ＦＮＮは、学習後のモデルを解析することでファジィ推論のように人間に理解しやすい言語的なルール（一例として図９の右下の吹き出しを参照）として知識を獲得できるという特徴をもっている。
【００８３】
つまり、ＦＮＮは、その構造、特徴から、細胞の形態的特徴を表した数値のような変数の組み合わせにおける最適なファジィ推論の組み合わせを自動決定し、予測目標に関する推定と、予測に有効な指標の組み合わせを示すルールの生成を同時に行うことができる。
【００８４】
ＦＮＮの構造は、「入力層」、シグモイド関数に含まれるパラメータＷｃ、Ｗｇを決定する「メンバーシップ関数部分（前件部）」、Ｗｆを決定するとともに入力および出力の関係をルールとして取り出すことが可能な「ファジィルール部分（後件部）」、「出力層」の４層から成り立っている（図９参照）。
【００８５】
図１０は、Ｆｕｚｚｙ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋにおけるシグモイド関数を説明するための図である。
ＦＮＮのモデル構造を決定する結合荷重にはＷｃ、Ｗｇ、Ｗｆがある。結合荷重Ｗｃは、メンバーシップ関数に用いられるシグモイド関数の中心位置、Ｗｇは中心位置での傾きを決定する（図１０参照）。
【００８６】
図９に戻り、モデル内では、入力値がファジィ関数により、人間の感覚的に近い柔軟性を持って表現される（一例として図９の左下の吹き出しを参照）。結合荷重Ｗｆは各ファジイ領域の推定結果に対する寄与を表しており、Ｗｆよりファジィルールを導くことができる。即ち、モデル内の構造はあとから解読でき、ルールとして書き起こすことができる（一例として図９中右下の吹き出しを参照）。
【００８７】
ＦＮＮ解析におけるファジィルールの作成には結合荷重のひとつであるＷｆ値が用いられる。Ｗｆ値が正の値で大きいと、そのユニットは「予測に有効である」と判定されることに対する寄与が大きく、そのルールに当てはまった指標は「有効である」と判断される。Ｗｆ値が負の値で小さいと、そのユニットは「予測に有効でない」と判定されることに対する寄与が大きく、そのルールに当てはまった指標は「有効でない」と判断される。
【００８８】
より具体的な例として、指標抽出部４７は、以下の（Ａ）から（Ｈ）の処理により、上記の計算モデルを求める。
【００８９】
（Ａ）指標抽出部４７は、１９０の指標のうちから１つの指標を選択する。
（Ｂ）指標抽出部４７は、（Ａ）で選択された指標による度数分布の変化量を変数
とした計算式により、各々の顕微鏡画像のセットでの、ｉＰＳ細胞の状態（予測値）を求める。
【００９０】
仮に、１つの指標から、ｉＰＳ細胞の状態を求める計算式を「Ｙ＝αＸ１」（但し、「Ｙ」は、ｉＰＳ細胞の計算値（例えば、ｉＰＳ細胞の増加数を示す値）、「Ｘ１」は上記の選択された指標に対応する度数分布の変化量、「α」はＸ１に対応する係数値、をそれぞれ示す）とする。このとき、指標抽出部４７は、αに任意の値を代入するとともに、Ｘ１に各セットにおける度数分布の変化量をそれぞれ代入する。これにより、各セットでのがん細胞の計算値（Ｙ）が求められる。
【００９１】
（Ｃ）指標抽出部４７は、各々の顕微鏡画像のセットについて、（Ｂ）で求めた計
算値Ｙと、実際のｉＰＳ細胞の数（教師値）との誤差をそれぞれ求める。なお、上記の教師値は、読み込んだｉＰＳ細胞の数の情報に基づいて、指標抽出部４７が求めるものとする。
そして、指標抽出部４７は、各顕微鏡画像のセットでの計算値の誤差がより小さくなるように、教師付き学習により上記の計算式の係数αを修正する。
【００９２】
（Ｄ）指標抽出部４７は、上記の（Ｂ）および（Ｃ）の処理を繰り返し、上記（Ａ）の指標について、計算値の平均誤差が最も小さくなる計算式のモデルを取得する。
（Ｅ）指標抽出部４７は、１９０の各指標について、上記（Ａ）から（Ｄ）の各処理を繰り返す。そして、指標抽出部４７は、１９０の各指標における計算値の平均誤差を比較し、その平均誤差が最も低くなる指標を、評価情報の生成に用いる１番目の指標とする。
【００９３】
（Ｆ）指標抽出部４７は、上記（Ｅ）で求めた１番目の指標と組み合わせる２番目の指標を求める。このとき、指標抽出部４７は、上記の１番目の指標と残りの１８９の指標とを１つずつペアにしてゆく。次に、指標抽出部４７は、各々のペアにおいて、計算式でがん細胞の予測誤差を求める。
【００９４】
仮に、２つの指標からがん細胞の数を求める計算式を「Ｙ＝αＸ１＋βＸ２」（但し、「Ｙ」はがん細胞の計算値、「Ｘ１」は１番目の指標に対応する度数分布の変化量、「α」はＸ１に対応する係数値、「Ｘ２」は、選択された指標に対応する度数分布の変化量、「β」はＸ２に対応する係数値、をそれぞれ示す）とする。
そして、指標抽出部４７は、上記の（Ｂ）および（Ｃ）と同様の処理により、計算値の平均誤差が最も小さくなるように、上記の係数α、βの値を求める。
【００９５】
その後、指標抽出部４７は、各々のペアで求めた計算値の平均誤差を比較し、その平均誤差が最も低くなるペアを求める。そして、指標抽出部４７は、平均誤差が最も低くなるペアの指標を、評価情報の生成に用いる１番目および２番目の指標とする。
【００９６】
（Ｇ）指標抽出部４７は、所定の終了条件を満たした段階で演算処理を終了する。例えば、指標抽出部４７は、指標を増やす前後の各計算式による平均誤差を比較する。そして、指標抽出部４７は、指標を増やした後の計算式による平均誤差が、指標を増やす前の計算式による平均誤差より高い場合（または両者の差が許容範囲に収まる場合）には、演算処理を終了する。
【００９７】
（Ｈ）一方、上記（Ｇ）で終了条件を満たさない場合、指標抽出部４７は、さらに指標の数を１つ増やして、上記（Ｆ）および（Ｇ）と同様の処理を繰り返す。これにより、上記の計算モデルを求めるときに、ステップワイズな変数選択によって指標の絞り込みが行われることとなる。
【００９８】
指標抽出部４７は、上記で求めた計算モデルの情報（計算式に用いる各指標を示す情報、計算式で各々の指標に対応する係数値の情報など）を記憶部４３に記録する。
【００９９】
なお、指標としては上記の指標に限られるものではなく、指標抽出部４７は、０時間目、２４時間目、４８時間目、７２時間目、９６時間目、１２０時間目、１４８時間目、および１６８時間目の各々を基準として、１種類の特徴量に対して３６（＝９×８÷２）通りの指標をそれぞれ求め、１９種類の特徴量に対して合計６８４（１９種類×３６通り）の指標を求めてもよい。
このような基準となる時刻が異なる指標を用いることにより、指標抽出部４７は、より予測精度が高い計算モデルを構築することができる。
【０１００】
評価処理部４８は、記憶部４３から対象画像の入力値１から入力値４と、計算モデルの情報を読み出す。
評価処理部４８は、既に構築された計算モデルの計算式に用いる指標の値のみを入力値１から入力値４から選択する。
【０１０１】
例えば、評価処理部４８は、対象画像において、「８時間目の細胞の長さの標準偏差」と「９６時間目の細胞丸さのヒストグラムと１２時間目の細胞丸さのヒストグラムの面積差」とを選択する。
評価処理部４８は、上記選択した指標を計算モデルに入力し、推定した分化度を算出する。
【０１０２】
ＣＰＵ４２は、評価処理部４８が推定したｉＰＳ細胞の状態に基づき、ｉＰＳ細胞又はフィーダー細胞の培養条件（例えば温度、湿度等）を変更するよう制御する。例えば、ＣＰＵ４２は、温度調整装置１５ａに制御信号を供給し、恒温室１５内の温度を上昇させるように制御する。また、ＣＰＵ４２は、湿度調整装置１５ｂに制御信号を供給し、恒温室１５内の湿度を下降させるように制御する。
【０１０３】
＜ｉＰＳ細胞の観察の例＞
図１１は、インキュベータにおける観察処理の一例を示すフローチャートである。この図１１は、恒温室１５内に搬入された培養容器１９を、登録された観察スケジュールに従ってタイムラプス観察する動作例を示している。
【０１０４】
ステップＳ１０１において、ＣＰＵ４２は、記憶部４３の管理データの観察スケジュールと現在日時とを比較して、培養容器１９の観察開始時間が到来したか否かを判定する。観察開始時間となった場合（ステップＳ１０１ ＹＥＳ）、ＣＰＵ４２はＳ１０２に処理を移行させる。一方、培養容器１９の観察時間ではない場合（ステップＳ１０１ ＮＯ）には、ＣＰＵ４２は次の観察スケジュールの時刻まで待機する。
【０１０５】
次に、ステップＳ１０２において、ＣＰＵ４２は、観察スケジュールに対応する培養容器１９の搬送を容器搬送装置２３に指示する。そして、容器搬送装置２３は、指示された培養容器１９をストッカー２１から搬出して観察ユニット２２の試料台３１に載置する。なお、培養容器１９が試料台３１に載置された段階で、スタンドアーム３２に内蔵されたバードビューカメラ（不図示）によって培養容器１９の全体観察画像が撮像される。
【０１０６】
次に、ステップＳ１０３において、ＣＰＵ４２は、観察ユニット２２に対して細胞の顕微鏡画像の撮像を指示する。観察ユニット２２は、ＬＥＤ光源３５を点灯させて培養容器１９を照明するとともに、撮像装置３４を駆動させて培養容器１９内の細胞の顕微鏡画像を撮像する。
【０１０７】
このとき、撮像装置３４は、記憶部４３に記憶されている管理データに基づいて、ユーザの指定した撮像条件（対物レンズの倍率、容器内の観察地点）に基づいて顕微鏡画像を撮像する。例えば、培養容器１９内の複数のポイントを観察する場合、観察ユニット２２は、試料台３１の駆動によって培養容器１９の位置を逐次調整し、各々のポイントでそれぞれ顕微鏡画像を撮像する。なお、Ｓ１０３で取得された顕微鏡画像のデータは、制御装置４１に読み込まれるとともに、ＣＰＵ４２の制御によって記憶部４３に記録される。
【０１０８】
次に、ステップＳ１０４において、ＣＰＵ４２は、観察スケジュールの終了後に培養容器１９の搬送を容器搬送装置２３に指示する。そして、容器搬送装置２３は、指示された培養容器１９を観察ユニット２２の試料台３１からストッカー２１の所定の収納位置に搬送する。その後、ＣＰＵ４２は、観察シーケンスを終了してＳ１０１に処理を戻す。以上で、本フローチャートの説明を終了する。
【０１０９】
＜計算モデル用の教師値算出の例＞
図１２は、計算モデル用の教師値の算出を説明するためのフローチャートである。この計算モデルの生成処理では、画像の撮影時間および特徴値の種類がそれぞれ異なる複数の度数分布の組み合わせから、ｉＰＳ細胞の状態の推定に用いる度数分布の組み合わせを、制御装置４１が決定する。
【０１１０】
まず、ステップＳ２０１において、撮像装置３４は、ｉＰＳ細胞とｉＰＳ細胞の周囲に存在し、共に培養されているフィーダー細胞とが撮像された参照画像を継続的に取得し、記憶部４３に保存する。
【０１１１】
次に、ステップＳ２０２において、一定期間培養後に、ユーザは、画像撮影した細胞を染色マーカー（例えば、分化度を示す染色マーカーであるＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−１、およびｎａｎｏｇ等）で染色する。
なお、ＣＰＵ４２が、一定期間培養後に、予め容器に入れられた染色マーカーを培養液に加えることに制御してもよい。これによって、画像撮影した細胞を染色マーカーで染色することができる。
【０１１２】
撮像装置３４は、位相差観察用の顕微光学系で結像された染色されたｉＰＳ細胞を撮像する。なお、染色マーカーが蛍光物質で標識されている場合には、撮像装置３４は、図示されていない蛍光観察用の顕微光学系で結像された染色されたｉＰＳ細胞を撮像する。そして、撮像装置３４は、染色後の画像を記憶部４３に保存する。
【０１１３】
次に、ステップＳ２０３において、ＣＰＵ４２は、記憶部４３から染色後の画像を読み出す。ＣＰＵ４２は、ｉＰＳ細胞毎に染色の有無を判定する。
次に、ステップＳ２０４において、ＣＰＵ４２は、画像の教師値（分化度）を算出する。例えば、染色細胞数が７２個、全体のｉＰＳ細胞数が１００個だとすると、画像の教師値（分化度）は染色細胞数／全体の細胞数＝７２（％）となる。
【０１１４】
次に、ステップＳ２０５において、ステップＳ２０１からステップＳ２０４の処理を全てのサンプルに対して所定の回数行っていない場合（ステップＳ２０１ ＮＯ）、上記工程を他のｉＰＳ細胞とフィーダー細胞とが共培養されたサンプルに対して、各々数十から数百枚行う。
【０１１５】
例えば、ユーザが、分化度２０付近（サンプル３０個）、分化度５０付近（サンプル３０個）、分化度８０付近（サンプル３０個）、分化度１００付近（サンプル３０個）のサンプルに対して、２４時間おきに４日間画像を撮影する。
【０１１６】
上記継続培養画像は、４［条件］×３０［サンプル］＝１２０［枚］が、４日分存在するため、各１２０枚の画像に対して、０時間目、２４時間目、４８時間目、７２時間目、９６時間目の５点が存在する。また、それぞれの画像に対して、ＣＰＵ４２は、教師値（分化度）を算出し、記憶部４３に保存する。
【０１１７】
次に、ステップＳ２０５において、ステップＳ２０１からステップＳ２０４の処理を全てのサンプルに対して所定の回数行った場合（ステップＳ２０１ ＹＥＳ）、本フローチャートは、終了する。
【０１１８】
図１３は、計算モデルの構築を説明するためのフローチャートである。
まず、ステップＳ３０１において、ＣＰＵ４２は、予め用意されたサンプルの顕微鏡画像のデータを記憶部４３から読み込む。なお、Ｓ３０１でのＣＰＵ４２は、各画像に対応する細胞の総数およびｉＰＳ細胞の数を示す情報もこの時点で取得するものとする。
【０１１９】
次に、ステップＳ３０２において、ＣＰＵ４２は、上記のサンプルの顕微鏡画像のうちから、処理対象となる画像を指定する。ここで、Ｓ３０２でのＣＰＵ４２は、予め用意されているサンプルの顕微鏡画像のすべてを処理対象として順次指定してゆくものとする。
【０１２０】
次に、ステップＳ３０３において、領域抽出部４４は、処理対象の顕微鏡画像について、画像内に含まれるｉＰＳ細胞のコロニーの領域と、フィーダー細胞の領域とを抽出する。
【０１２１】
次に、ステップＳ３０４において、特徴量算出部４５は、処理対象の顕微鏡画像中に含まれる各ｉＰＳ細胞のコロニーと、各ｉＰＳ細胞と、各フィーダー細胞との形態的特徴を示す特徴量を算出する。例えば、各経時１２０（＝４［条件］×３０［枚］）枚の画像に対して、各経時における特徴量を算出する。
【０１２２】
次に、ステップＳ３０５において、特徴量算出部４５は、算出した全ての特徴量を記憶部４３に保存する。
次に、ステップＳ３０６において、全画像を全画像の特徴量を算出していない場合（ステップＳ３０６ ＮＯ）、ステップＳ３０２に戻る。全画像を全画像の特徴量を算出した場合（ステップＳ３０６ ＹＥＳ）、ステップＳ３０７に遷移する。
【０１２３】
次に、ステップＳ３０７において、度数分布算出部４６は、各経時の特徴量の平均値と、各経時の特徴量の標準偏差と、各経時の特徴量の度数分布を算出する。換言すれば、度数分布算出部４６は、各画像中のすべての細胞１つ１つの形態情報を収集し、これを集団としてヒストグラム化する。
【０１２４】
次に、ステップＳ３０８において、指標抽出部４７は、特徴量毎に、経時間の特徴量の度数分布の面積の差を、経時の全組み合わせに対して算出する。
例えば、各１２０枚の画像に対して、０時間目、２４時間目、４８時間目、７２時間目、９６時間目の５点が存在するとする。そうすると、以下の１０個の経時の組み合わせが存在する。その経時の組み合わせは、［時間目］−［時間目］の書式で表すと、２４−０、４８−０、７２−０、９６−０、４８−２４、７２−２４、９６−２４、７２−４８、９６−４８、９６−７２である。
【０１２５】
次に、ステップＳ３０９において、全ての特徴量で、経時間の特徴量の度数分布の面積の差を、経時の全組み合わせに対して算出していない場合（ステップＳ３０９ ＮＯ）、ステップＳ３０８に戻る。ステップＳ３０９において、全ての特徴量で、経時間の特徴量の度数分布の面積の差を、経時の全組み合わせに対して算出した場合（ステップＳ３０９ ＹＥＳ）、ステップＳ３１０に遷移する。
【０１２６】
次に、ステップＳ３１０において、指標抽出部４７は、１９０の指標のうちから、ｉＰＳ細胞の状態をよく反映する指標を多変量解析により１以上指定する。この指標の組合せの選択は、前述したファジーニューラルネットワークと同等の非線形モデル以外にも、細胞とその形態の複雑性に応じて線形モデルの利用も有効である。このような指標の組合せの選択と共に、指標抽出部４７は、上記の指定された１以上の指標を用いて、顕微鏡画像からｉＰＳ細胞の状態を導出する計算モデルを求める。
【０１２７】
次に、ステップＳ３１１において、指標抽出部４７は、計算モデルの情報（計算式に用いる各指標を示す情報、計算式で各々の指標に対応する係数値の情報など）を記憶部４３に記録する。以上で、本フローチャートは終了する。
【０１２８】
＜ｉＰＳ細胞の状態推定処理の例＞
図１４は、計算モデルを用いたｉＰＳ細胞の分化度を推定するためのフローチャートである。
まず、ステップＳ４０１において、評価処理部４８は、評価対象となる複数の顕微鏡画像（対象画像）のデータを記憶部４３から読み込む。ここで、対象画像は、細胞群を培養した培養容器１９をインキュベータ１１によって同一視野を同一の撮影条件でタイムラプス観察して取得されたものとする。また、この場合のタイムラプス観察は、図１３の例と条件を揃えるために、培養開始を初回として２４時間おきに９６時間目まで行うものとする。
【０１２９】
次に、ステップＳ４０２において、評価処理部４８は、記憶部４３の計算モデルの情報（図１３のＳ３１１で記録されたもの）を読み込む。
次に、ステップＳ４０３において、特徴量算出部４５、度数分布演算部４６および評価処理部４８は、上記の計算モデルの変数に対応する各指標について、それぞれ度数分布の変化量を求める。
【０１３０】
次に、ステップＳ３０４において、評価処理部４８は、ステップＳ４０３で求めた各指標の度数分布の変化量を、Ｓ３０２で読み出した計算モデルに代入して演算を行う。そして、評価処理部４８は、上記の演算結果に基づいて、評価対象の顕微鏡画像におけるｉＰＳ細胞の分化度を示す推定情報を生成する。その後、評価処理部４８は、この推定情報を不図示のモニタ等に表示させる。以上で、本フローチャートは終了する。
【０１３１】
第１の実施例によれば、ｉＰＳ細胞のコロニーの形態的特徴量と、ｉＰＳ細胞の形態的特徴量と、フィーダー細胞の形態的特徴量とから、ｉＰＳ細胞の状態を推定することができる。
【０１３２】
なお、第１の実施例では、ｉＰＳ細胞のコロニーの形態的特徴量と、ｉＰＳ細胞の形態的特徴量と、フィーダー細胞の形態的特徴量とから、ｉＰＳ細胞の分化度を推定したがこれに限らない。
フィーダー細胞の形態的特徴量の度数分布の時間変化のみから、ｉＰＳ細胞の分化度を推定してもよい。
また、フィーダー細胞の形態的特徴量の度数分布の時間変化と、個別のｉＰＳ細胞の形態的特徴量の度数分布の時間変化またはｉＰＳ細胞のコロニーの形態的特徴量の度数分布の時間変化とから、ｉＰＳ細胞の分化度を推定してもよい。
【０１３３】
なお、第１の実施例では、ｉＰＳ細胞の分化度を推定したがこれに限らず、ｉＰＳ細胞の劣化度合い、ｉＰＳ細胞の増殖度、ｉＰＳ細胞の分化の方向性、ｉＰＳ細胞の腫瘍化しやすさ等でもよい。
【０１３４】
＜実施例２＞
上記の実施例１は、連続値でｉＰＳ細胞の状態を評価したが、本実施例２ではレベルとして大まかにｉＰＳ細胞の状態を区分する。本実施例２の方法は、染色評価の信頼性や実施例１の推定精度によっては連続値評価が適していない場合に、特に有用である。以下、本発明の第２の実施例について、図面を参照して詳細に説明する。
【０１３５】
図１５は、本発明の第２の実施例であるインキュベータのブロック構成図である。インキュベータ１１ａは、上部ケーシング１２と、下部ケーシング１３ａとを用いて構成されている。下部ケーシング１３ａは、撮像装置３４と制御装置４１ａとを用いて構成されている。制御装置（細胞評価装置）４１ａは、ＣＰＵ４２ａと記憶部４３ａとを用いて構成されている。
ＣＰＵ４２ａと記憶部４３ａ以外は、図３のブロック構成図と同じであるので、ＣＰＵ４２ａと記憶部４３ａ以外は説明を省略する。
【０１３６】
記憶部４３ａは、ハードディスクや、フラッシュメモリ等の不揮発性の記憶媒体などで構成される。この記憶部４３ａは、不図示のストッカーに収納されている各培養容器（不図示）に関する管理データと、撮像装置で撮像された顕微鏡画像のデータとを保持する。
さらに、記憶部４３ａは、ＣＰＵ４２ａによって実行されるプログラムと、指標抽出部４７ａで算出された判別モデルの情報とを保持する。
【０１３７】
ＣＰＵ４２ａは、記憶部４３ａに記憶されているプログラムを読み出して実行することにより、領域抽出部４４と、特徴量算出部４５ａと、度数分布算出部４６と、指標抽出部４７ａと、評価処理部４８ａとの各部の機能を実現する。
【０１３８】
領域抽出部４４と、度数分布算出部４６との処理は、第１の実施例と同じなので、説明を省略する。
【０１３９】
特徴量算出部４５ａは、実施例１と同様に、領域抽出部４４により画像から抽出した各画像のオブジェクトに対して、細胞の形態的特徴を示す特徴量をそれぞれ求める。一例として、特徴量算出部４５ａは、各細胞について１９種類の特徴量をそれぞれ求める。
【０１４０】
特徴量算出部４５ａは、演算対象の教師画像について、１９種類の特徴量の画像内平均値および画像内標準偏差をそれぞれ求める。そして、特徴量算出部４５ａは、上記の各特徴量の画像内平均値および画像内標準偏差をそれぞれ記憶部４３ａに記録する。
【０１４１】
これにより、細胞の継代数が同一であって観察時期（０、２４、４８、７２、９６時間目）がいずれも異なる５枚分の教師画像について、各観察時期においてそれぞれ３８の特徴量（１９種類×２通り（平均値、標準偏差））が求まることとなる。
【０１４２】
特徴量算出部４５ａは、以下の（Ａ１）−（Ａ３）の処理によって、継代数が共通する教師画像をグループ化し、グループ化した教師画像群のうちの２つの教師画像間で各特徴量の変化量を求める。
【０１４３】
（Ａ１）特徴量算出部４５ａは、細胞の継代数が同一であって観察時期（０、２４、４８、７２、９６時間目）がいずれも異なる６枚分の教師画像をそれぞれグループ化する。特に限定するものではないが、グループ化する教師画像は、培養容器および撮像した位置（視野）が共通する５枚の顕微鏡画像であることが好ましい。
【０１４４】
（Ａ２）特徴量算出部４５ａは、上記（Ａ１）でグループ化した教師画像群において、撮像時点の異なる２つの教師画像を組み合わせる。ここで、１グループの教師画像は５枚であるので、２つの教師画像の組み合わせは１０通りとなる。また、２つの教師画像の組み合わせは１０通りであるため、１グループの教師画像群から求まる変化量は３８０種類（１９の特徴量×２通り（平均値、標準偏差）×１０通りの組み合わせ）となる。
【０１４５】
（Ａ３）特徴量算出部４５ａは、上記（Ａ２）の１つの組み合わせごとに、２つの教師画像間における各特徴量の画像内平均値の変化を示す１９種類の変化量と、２つの教師画像間における各特徴量の画像内標準偏差の変化を示す１９種類の変化量とをそれぞれ求める。
【０１４６】
続いて、指標抽出部４７ａの処理について、説明する。
指標抽出部４７ａは、度数分布算出部４６で算出された形態的特徴量の度数分布の各経時の面積差を算出する。
【０１４７】
指標抽出部４７ａは、特徴量算出部４５ａで算出された形態的特徴量と、形態的特徴量の度数分布の面積差とに基づいて、異なる分化を示す細胞を、分化毎にクラス分けする判別モデルを構築する。本第２の実施例での指標抽出部４７ａは、判別モデルの１つの形態として、決定木解析（Ｄｅｃｉｓｉｏｎ ｔｒｅｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）を採用し、細胞の継代回数に応じて顕微鏡画像をクラス分けする決定木を構築する。
【０１４８】
＜決定木の構築方法＞
以下、指標抽出部４７ａが決定木を構築する方法について説明する。
指標抽出部４７ａは、決定木の根ノードにおいて、継代数の異なる細胞を分類するときに適用するパラメータの種類（指標の種類）とそのパラメータの値（指標の閾値）とを求める。なお、上記のパラメータの種類は、各観察時期（０、２４、４８、７２、９６時間目）の各特徴量（１５０種類）および特徴量の変化量（３８０種類）のうちから選択される。
【０１４９】
以下、上記の指標の種類および指標の閾値の求め方の一例を説明する。まず、指標抽出部４７ａは、上記の５３０（＝１５０＋３８０）種類のパラメータのうちから演算対象のパラメータを選択する。このとき、指標抽出部４７ａは、演算対象のパラメータに対応する教師画像群を予め抽出する。なお、抽出された教師画像群には、細胞の継代数の異なる教師画像が含まれる。
【０１５０】
次に、指標抽出部４７ａは、演算対象のパラメータに探索範囲（上限および下限）を設定するとともに、演算対象のパラメータの探索範囲を任意の刻みで複数に区切る。指標抽出部４７ａは、演算対象のパラメータの各刻み（パラメータの値）を閾値として、演算対象のパラメータに対応する教師画像群の細胞を２つの集合に分類する。これにより、演算対象のパラメータの各刻みにおいて、教師画像群の細胞の分類結果がそれぞれ得られる。
このとき、指標抽出部４７ａは、分類結果の各集合において、細胞の継代数に応じた細胞の数の分布をそれぞれ求めておく。
【０１５１】
指標抽出部４７ａは、上記の４５０種類の全パラメータでそれぞれ同様の処理を行い、各パラメータの個々の刻みにおける教師画像群の分類結果を取得する。そして、指標抽出部４７ａは、全ての分類結果のうちから、継代数の異なる細胞の分類に最も適したパラメータの種類（指標の種類）およびそのパラメータでの閾値（指標の閾値または指標の閾値）を決定する。
【０１５２】
一例として、指標抽出部４７ａは、パラメータの種類および閾値の組み合わせのうち、任意の継代数の細胞を一方の集合に完全に分離できるものを、指標の種類および指標の閾値に決定する。上記条件に該当する組み合わせが複数ある場合、指標抽出部４７ａは、１種類分の任意の継代数の細胞のみを一方の集合に分離できるものを優先して上記の指標の種類および指標の閾値を決定すればよい。
【０１５３】
また、上記条件に該当する組み合わせがない場合、指標抽出部４７ａは、以下の要領で指標の種類および指標の閾値を決定してもよい。例えば、指標抽出部４７ａは、２つの集合に同じ継代数の教師画像が含まれるが、一方の集合は１種類分の継代数の教師画像のみを抽出でき、かつ、一方の集合で抽出できる教師画像の数が最も多くなるものを優先して上記の指標の種類および指標の閾値を決定すればよい。
【０１５４】
指標抽出部４７ａは、次に指標の種類および指標の閾値を求める演算対象のノードを指定する。例えば、指標抽出部４７ａは、親ノードから左右に分岐する子ノードのうち左側のノードを指定する。なお、左側の子ノードよりも下層の全ノードで既に指標の種類および指標の閾値が求められている場合、指標抽出部４７ａは、親ノードから右側に分岐するノードを指定する。
【０１５５】
指標抽出部４７ａは、現在の演算対象のノードがそれ以上に分岐できないターミナルノードであるか否かを判定する。例えば、指標抽出部４７ａは、現在の演算対象のノードで１種類分の継代数の細胞が分離できている場合、ターミナルノードであると判定する。
【０１５６】
指標抽出部４７ａは、演算が完了したか否かを判定する。なお、指標抽出部４７ａは、ターミナルノードを除くすべてのノードで指標の種類および指標の閾値を求め終えた場合に演算が完了したものと判定する。
【０１５７】
指標抽出部４７ａは、現在の演算対象のノードにおいて、指標の種類および指標の閾値を求める。その後、指標抽出部４７ａは、演算対象のノードを変更する。その後、ループにより、各ノードでの指標の種類および指標の閾値が再帰的に求められる。
指標抽出部４７ａは、以上の処理で構築された判別モデルのデータを記憶装置４３ａに記録する。
【０１５８】
＜指標の算出方法＞
指標抽出部４７ａは、下記の２つの方法を用いて、ｉＰＳ細胞の状態を区分するための指標を算出する。
１つ目の方法として、指標抽出部４７ａは、細胞の状態を染色等で評価し、「レベル」として大まかにいくつかに区分する。例えば、指標抽出部４７ａは、分化度小、分化度中、および分化度大に区分する。すなわち、指標抽出部４７ａは、順番や優劣が存在するものを、いくつかの「レベル」に区分する。
【０１５９】
２つ目の方法として、指標抽出部４７ａは、細胞の品質を染色等で評価し、「グループ」として大まかにいくつかに区分する。例えば、指標抽出部４７ａは、骨分化グループ、軟骨分化グループおよび脂肪分化グループに区分する。すなわち、指標抽出部４７ａは、各グループに順番や優劣はなく、並列的なグループであり、数字等で各グループをうまく言い表すことができないものを、いくつかの「グループ」に区分する。
【０１６０】
指標抽出部４７ａは、決定木法を用いて、下記の２種類のモデルを作る。
指標抽出部４７ａは、画像別モデルとして、画像毎の入力値と画像毎の教師値を用いて、データをグループ化する。指標抽出部４７ａは、各「レベル」または各「グループ」を区分し、細胞の分化の度合いのレベルを分類し、各分化の種類が分類する。
【０１６１】
指標抽出部４７ａは、細胞別モデルとして、細胞毎の入力値と細胞毎の教師値を用いて、データをグループ化する。指標抽出部４７ａは、画像中の細胞１つ１つに対して、各細胞のレベルやグループを区分する。これによって、１つ１つの細胞において、どんな形の指標の組み合わせならば、どんなレベルかグループに相当するかがわかる。
【０１６２】
指標抽出部４７ａは、上記各分類において、用意された「レベル」または「グループ」という多群をもっともよく別々に分離できる精度が高くなるように、各「レベル」または各「グループ」に対して指標の組み合わせと、その指標の閾値を選ぶ。
指標抽出部４７ａは、決定木の指標とその指標の閾値を記憶部４３ａに保存する。
【０１６３】
評価処理部４８ａは、記憶部４３ａからその決定木の指標とその指標の閾値を読み出す。評価処理部４８ａは、対象画像の特徴量からその指標の値を抽出する。評価処理部４８ａは、決定木のノードの指標ごとに、対象画像から抽出した指標の値と閾値とを比較する。これによって、評価処理部４８ａは、対象画像または対象ｉＰＳ細胞を、「レベル」または「グループ」に分類する。評価処理部４８ａは、分類結果に基づいて、ｉＰＳ細胞の状態の推定結果を算出する。
以下、指標抽出部４７ａと評価処理部４８ａとの具体的な処理例について説明する。
【０１６４】
＜画像別、コロニー＋フィーダーモデル＞
図１６は、画像別、コロニー＋フィーダーモデルの決定木を説明するための図である。
図１６の決定木は、分化のグループを分けた一例である。対象画像において、９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞のヒストグラム間の面積差が２０以上であれば、グループ１（骨の分化グループ）に属する。
【０１６５】
対象画像において、９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞のヒストグラム間の面積差が２０未満で、２４時間のコロニーの丸さの平均値が３０以上であれば、グループ２（軟骨の分化グループ）に属する。
対象画像において、９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞のヒストグラム間の面積差が２０未満で、２４時間のコロニーの丸さの平均値が３０未満であれば、グループ３（脂肪の分化グループ）に属する。
【０１６６】
指標抽出部４７ａは、画像別モデルとして、ｉＰＳ細胞のコロニーの特徴量とフィーダー細胞の特徴量を用いた決定木の指標の種類を算出する。
例えば、指標抽出部４７ａは、「９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞のヒストグラム間の面積差」と「２４時間目のコロニーの丸さの平均値」という指標の種類を選択する。
【０１６７】
また、指標抽出部４７ａは、各指標の種類に対して、どの値以上または未満で判断するかという閾値（指標の閾値）を決定する。
例えば、指標抽出部４７ａは、指標「９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞のヒストグラム間の面積差」の種類に対して、指標の閾値２０を決定し、指標の種類「２４時間目のコロニーの丸さの平均値」に対して、指標の閾値３０を決定する。
【０１６８】
＜画像別、コロニー・フィーダーモデル＞
図１７は、画像別、コロニー・フィーダー別モデルの決定木を説明するための図である。
図１７（ａ）は、画像別の、ｉＰＳ細胞のコロニーの特徴量に基づく決定木（以下、コロニーモデル）を説明するための図である。図１７（ａ）の決定木は、分化のグループを分けた一例である。対象画像において、２４時間のコロニーの丸さの平均値が２０以上であれば、グループ１（骨の分化グループ）に属する。
【０１６９】
対象画像において、２４時間のコロニーの丸さの平均値が２０未満で、９６時間目と２４時間目のコロニーの長さの変化量が１００以上であれば、グループ２（軟骨の分化グループ）に属する。
一方、対象画像において、２４時間のコロニーの丸さの平均値が２０未満で、９６時間目と２４時間目のコロニーの長さの変化量が１００未満であれば、グループ３（脂肪の分化グループ）に属する。
【０１７０】
図１７（ｂ）は、画像別の、フィーダー細胞の特徴量に基づく決定木（以下、フィーダーモデルと称する）を説明するための図である。図１７（ｂ）の決定木は、ｉＰＳ細胞の劣化度合いのレベルを分けた一例である。対象画像において、４８時間のフィーダー細胞の丸さの平均値が４０以上であれば、グループ１（劣化度合い：大）に属する。
【０１７１】
対象画像において、４８時間のフィーダー細胞の丸さの平均値が４０未満で、９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞の丸さのヒストグラムの面積差が５０以上であれば、グループ２（劣化度合い：中）に属する。
一方、対象画像において、４８時間のフィーダー細胞の丸さの平均値が４０未満で、９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞の丸さのヒストグラムの面積差が５０未満であれば、グループ３（劣化度合い：小）に属する。
【０１７２】
指標抽出部４７ａは、画像別モデルとして、ｉＰＳ細胞のコロニーの特徴量とフィーダー細胞の特徴量を用いた別々の決定木の指標を算出する。
例えば、指標抽出部４７ａは、コロニーモデルに対して、「２４時間目のコロニーの丸さの平均値」と「９６時間目と２４時間目のコロニーの長さの変化量」という指標の種類を選択する。
また、指標抽出部４７ａは、フィーダーモデルに対して、「４８時間目のフィーダー細胞の丸さの平均値」と「９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞の丸さのヒストグラムの面積差」という指標の種類を選択する。
【０１７３】
また、指標抽出部４７ａは、各指標の種類に対して、指標の閾値を決定する。
例えば、指標抽出部４７ａは、指標の種類「２４時間目のコロニーの丸さの平均値」に対して、指標の閾値２０を決定し、指標の種類「９６時間目と２４時間目のコロニーの長さの変化量」に対して、指標の閾値１００を決定する。
【０１７４】
また、指標抽出部４７ａは、指標の種類「４８時間目のフィーダー細胞の丸さの平均値」に対して、指標の閾値４０を決定し、指標の種類「９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞の丸さのヒストグラムの面積差」に対して、指標の閾値５０を決定する。
【０１７５】
評価処理部４８ａは、コロニーモデルでグループ１（分化グループ：骨）、フィーダーモデルでグループ３（劣化度合い：小）というような複合的な推定をする。
なお、評価処理部４８ａは、コロニーモデルでグループ１（分化グループ骨）、フィーダーモデルでグループ１（分化グループ骨）の両方でグループ名が一致した場合のみ、確かな予測とすることにしてもよい。
【０１７６】
＜細胞別、コロニー・フィーダー別モデル＞
図１８は、細胞別、コロニー・フィーダー別モデルの決定木を説明するための図である。図１８（ａ）は、細胞毎のコロニーモデルを説明するための図である。図１８（ａ）の決定木は、分化のグループを分けた一例である。対象画像のあるｉＰＳ細胞のコロニーにおいて、２４時間のコロニーの丸さの平均値が８０以上で、９６時間目と２４時間目の９６時間目と２４時間目のコロニーの丸さのヒストグラムの面積差が２０未満であれば、そのｉＰＳ細胞はグループ１（骨の分化グループ）に属する。
【０１７７】
対象画像のあるｉＰＳ細胞のコロニーにおいて、２４時間のコロニーの丸さが８０以上で、９６時間目と２４時間目のコロニーの丸さのヒストグラムの面積差が２０以上であれば、そのｉＰＳ細胞はグループ２（軟骨の分化グループ）に属する。
一方、対象画像のあるｉＰＳ細胞のコロニーにおいて、２４時間のコロニーの丸さが８０未満であれば、そのｉＰＳ細胞はグループ３（脂肪の分化グループ）に属する。
【０１７８】
図１８（ｂ）は、細胞毎のフィーダーモデルを説明するための図である。図１８（ｂ）の決定木は、分化のグループを分けた一例である。対象画像において、状態を推定したいｉＰＳ細胞の周囲に存在するフィーダー細胞において、４８時間のフィーダーの長さが２０以上で、２４時間目のフィーダーの輝度が３０以上であれば、そのｉＰＳ細胞はレベル１（増殖能：高）に属する。
【０１７９】
対象画像において、状態を推定したいｉＰＳ細胞の周囲に存在するフィーダー細胞において、４８時間のフィーダーの長さが２０以上で、２４時間目のフィーダーの輝度が３０以上であれば、そのｉＰＳ細胞はレベル２（増殖能：中）に属する。
一方、対象画像において、状態を推定したいｉＰＳ細胞の周囲に存在するフィーダー細胞において、４８時間のフィーダーの長さが２０以上で、２４時間目のフィーダーの輝度が３０以上であれば、そのｉＰＳ細胞はレベル３（増殖能：小）に属する。
【０１８０】
指標抽出部４７ａは、個々の細胞レベルでｉＰＳ細胞の状態を推定するために、ｉＰＳ細胞のコロニーの特徴量を用いた決定木と、フィーダー細胞の特徴量を用いた決定木とを作成する。
指標抽出部４７ａは、ｉＰＳ細胞のコロニー１つ１つに対して、コロニーモデルの指標の組み合わせを検証して、コロニーに対する指標を算出する。
【０１８１】
また、指標抽出部４７ａは、フィーダー細胞１つ１つに対して、フィーダーモデルの指標の組み合わせを検証して、フィーダー細胞に対する指標を算出する。
また、指標抽出部４７ａは、各指標の種類に対して、指標の閾値を決定する。
【０１８２】
例えば、指標抽出部４７ａは、指標の種類「２４時間目のコロニーの丸さ」に対して、指標の閾値８０を決定し、指標の種類「９６時間目と２４時間目のコロニーの丸さのヒストグラムの面積差」に対して、指標の閾値２０を決定する。
また、指標抽出部４７ａは、指標の種類「４８時間目のフィーダー細胞の長さ」に対して、指標の閾値２０を決定し、指標の種類「２４時間目のフィーダー細胞の輝度」に対して、指標の閾値３０を決定する。
【０１８３】
対象画像において、あるｉＰＳ細胞の状態を推定する際には、評価処理部４８ａは、２つのモデルの結果を総合して、ｉＰＳ細胞の状態を推定する。
例えば、コロニーモデルにおいて、ｉＰＳ細胞のコロニーの２４時間目のコロニーの丸さ８０以上、９６時間目と２４時間目のコロニーの丸さのヒストグラムの面積差が２０未満であれば、評価処理部４８ａは、ｉＰＳ細胞をグループ１に分類する。これによって、評価処理部４８ａは、そのｉＰＳ細胞が骨に分化する能力をもつと推定する。
【０１８４】
また、例えば、そのｉＰＳ細胞の周囲に存在するフィーダー細胞の形態的特徴量のうち、４８時間目のフィーダー細胞の長さが２０以上で、２４時間目のフィーダー細胞の輝度が３０以上であれば、評価処理部４８ａは、ｉＰＳ細胞をレベル１に分類する。これによって、評価処理部４８ａは、ｉＰＳ細胞の増殖能が高いと推定する。
そして、評価処理部４８ａは、ｉＰＳ細胞を骨に分化する能力があり、増殖能が高いと複合的に推定する。
【０１８５】
ＣＰＵ４２ａは、評価処理部４８ａが推定したｉＰＳ細胞の状態に基づき、ｉＰＳ細胞又はフィーダー細胞の培養条件（例えば温度、湿度等）を変更するよう制御する。例えば、ＣＰＵ４２ａは、温度調整装置１５ａに制御信号を供給し、恒温室１５内の温度を上昇させるように制御する。また、ＣＰＵ４２ａは、湿度調整装置１５ｂに制御信号を供給し、恒温室１５内の湿度を下降させるように制御する。
【０１８６】
図１９は、決定木算出用の教師値の算出を説明するためのフローチャートである。
まず、ステップＳ５０１において、撮像装置３４は、ｉＰＳ細胞とｉＰＳ細胞の周囲に存在し、共に培養されているフィーダー細胞とが撮像された参照画像を継続的に取得し、記憶部４３ａに保存する。
【０１８７】
次に、ステップＳ５０２において、一定期間培養後に、ユーザは、画像撮影した細胞を染色マーカー（例えば、分化度を示す染色マーカーであるＳＳＥＡ−４、ＳＳＥＡ−１、およびｎａｎｏｇ等）で染色する。
なお、ＣＰＵ４２ａが、一定期間培養後に、予め容器に入れられた染色マーカーを培養液に加えることに制御してもよい。これによって、画像撮影した細胞を染色マーカーで染色することができる。
【０１８８】
次に、ステップＳ５０３において、ＣＰＵ４２ａは、染色画像から細胞毎に染色の有無を判定する。
次のステップＳ５０４とステップＳ５０５において、ＣＰＵ４２ａは、評価の結果を「レベル」か「グループ」として評価し、下記の画像別教師値と細胞別教師値をつくる。なお、教師値は、染色結果だけでなく、熟練者による評価に基づいてもよい。
【０１８９】
＜画像別教師値＞
まず、ステップＳ５０４において、ＣＰＵ４２ａは、画像ごとに、画像中に含まれる細胞と認識される画像中のオブジェクト１個１個に対して、染色の有無を判定する。染色の判定の際、ＣＰＵ４２ａは、オブジェクトの輝度値が所定の閾値よりも大きい場合には、「染色有り」と判定する。一方、指標抽出部４７ａは、オブジェクトの輝度値が所定の閾値以下の場合には、「染色無し」と判定する。
【０１９０】
そして、ＣＰＵ４２ａは、全体の細胞数に対する「染色有り」と判定された細胞数の割合を算出する。ＣＰＵ４２ａは、その割合に基づいて、その画像毎に、「レベル」または「グループ」の分類名を決定する。例えば、ＣＰＵ４２ａは、ある画像に対して、「分化グループ：骨」と分類名を決定する。
【０１９１】
＜細胞別教師値＞
次に、ステップＳ５０５において、ＣＰＵ４２ａは、各サンプル（＝複数の画像から構成されるある１つの実験条件下のデータ）中の細胞と認識される画像中のオブジェクト１個１個に対して、染色の有無や、熟練者の経験に基づき、その細胞毎に、「レベル」または「グループ」の呼び名をつける。ここで、「判断不能」「ゴミ」などというグループを作ってもよい。
【０１９２】
次に、ステップＳ５０６において、全ての条件で、ステップＳ５０１からステップＳ５０５の処理を所定の回数行っていない場合（ステップＳ５０６ ＮＯ）、ステップＳ５０１に戻る。一方、ステップＳ５０６において、全ての条件で、ステップＳ５０１からステップＳ５０５の処理を所定の回数行った場合（ステップＳ５０６ ＹＥＳ）、本フローチャートは終了する。
【０１９３】
図２０は、決定木算出用の特徴量の算出を説明するためのフローチャートである。図２０のフローチャートの処理は、ユーザからの指示に応じてＣＰＵ４２ａが実行する。
まず、ステップＳ６０１において、ＣＰＵ４２ａは、予め用意されたサンプルの顕微鏡画像のデータを記憶部４３ａから読み込む。なお、Ｓ６０１でのＣＰＵ４２ａは、各画像に対応する細胞の総数およびｉＰＳ細胞の数を示す情報もこの時点で取得するものとする。
【０１９４】
次に、ステップＳ６０２において、ＣＰＵ４２ａは、上記のサンプルの顕微鏡画像のうちから、処理対象となる画像を指定する。ここで、Ｓ６０２でのＣＰＵ４２ａは、予め用意されているサンプルの顕微鏡画像のすべてを処理対象として順次指定してゆくものとする。
【０１９５】
次に、ステップＳ６０３において、領域抽出部４４は、処理対象の顕微鏡画像について、画像内に含まれるｉＰＳ細胞のコロニーの領域と、フィーダー細胞の領域とを抽出する。
【０１９６】
次に、ステップＳ６０４において、特徴量算出部４５ａは、実施例１と同様に、領域抽出部４４により画像から抽出した各画像のオブジェクトに対して、細胞の形態的特徴を示す特徴量をそれぞれ求める。一例として、特徴量算出部４５ａは、各細胞について図６に示された１９種類の特徴量をそれぞれ求める。
【０１９７】
次に、ステップＳ６０５において、特徴量算出部４５ａは、演算対象の教師画像について、１９種類の特徴量の画像内平均値および画像内標準偏差をそれぞれ求める。そして、特徴量算出部４５ａは、上記の各特徴量の画像内平均値および画像内標準偏差をそれぞれ記憶部４３ａに記録する。
【０１９８】
次に、ステップＳ６０６において、特徴量算出部４５ａが、全画像の特徴量を算出していない場合（Ｓ６０６ ＮＯ）、ステップＳ６０２に戻る。一方、特徴量算出部４５ａが、全画像の特徴量を算出した場合（Ｓ６０６ ＹＥＳ）、本フローチャートは終了する。
【０１９９】
図２１は、画像別の決定木の算出を説明するためのフローチャートである。予め、図２０のフローチャートで、特徴量算出部４５ａが各経時の各形態的特徴量の平均値（入力値１）および各経時の各形態的特徴量の標準偏差（入力値２）を算出しているものとする。
まず、ステップＳ７０１において、度数分布算出部４６は、各経時の各形態的特徴量の度数分布（入力値３）を算出する。
【０２００】
次に、ステップＳ７０２において、指標抽出部４７ａは、形態的特徴量ごとに、特徴量の度数分布の面積の差（入力値４）を経時の全組み合わせで算出する。
次に、ステップＳ７０３において、指標抽出部４７ａが、全ての特徴量で、各経時間の特徴量の度数分布の面積の差を算出していない場合（Ｓ７０３ ＮＯ）、指標抽出部４７ａは、ステップＳ７０２に戻る。一方、指標抽出部４７ａが、全ての特徴量で、各経時間の特徴量の度数分布の面積の差を算出した場合（Ｓ７０３ ＮＯ）、ステップＳ７０４に遷移する。
【０２０１】
次に、ステップＳ７０４において、指標抽出部４７ａは、画像毎の上記４つの入力値と画像毎の教師値を用いてデータをグループ化して、決定木を構築する。ここで、教師値は、例えば、細胞の分化の度合いを示すレベルであえば、高、中または小であり、分化の種類を示すグループであれば、骨、軟骨または脂肪である。
これによって、各「レベル」または各「グループ」が区分される。例えば、細胞の分化の度合いを示すレベルが分類されたり、各分化の種類を示すグループが分類されたりする。
【０２０２】
次に、ステップＳ７０５において、指標抽出部４７ａは、決定木の構造と、グループ化したときの指標の種類と、指標の種類毎の指標の閾値とを記憶部４３ａに保存する。以上で、本フローチャートは終了する。
【０２０３】
図２２は、細胞別の決定木算出を説明するためのフローチャートである。
まず、ステップＳ８０１において、指標抽出部４７ａは、特徴量算出部４５ａにより算出された各画像中の細胞と認識されるオブジェクト１個１個に対して形の指標を、実験条件毎に記憶部４３ａから読み出す。
【０２０４】
次に、ステップＳ８０２において、指標抽出部４７ａは、細胞毎の上記４つの入力値と細胞毎の教師値を用いてデータをグループ化して、決定木を構築する。これによって、対象画像中の細胞１つ１つに対して、各細胞のレベル」または「グループ」が区分される。従って、１つ１つの細胞において、形の指標の組み合わせから、その細胞の「レベル」または「グループ」を特定することができる。
【０２０５】
次に、ステップＳ８０３において、指標抽出部４７ａは、決定木の構造と、グループ化したときの指標の種類と、指標の種類毎の指標の閾値とを記憶部４３ａに保存する。以上で、本フローチャートは終了する。
【０２０６】
続いて、判別モデルである決定木を用いて、対象画像からｉＰＳ細胞の状態を推定する３つの方法について説明する。まず、フィーダー細胞の形態的特徴量とｉＰＳ細胞のコロニーの特徴量とから、対象画像中に含まれるｉＰＳ細胞集団の状態を推定する方法について説明する。
【０２０７】
図２３は、図１６に示す画像別、コロニー＋フィーダーモデルを用いたｉＰＳ細胞の状態の推定を説明するためのフローチャートである。
まず、ステップＳ９０１において、撮像装置３４は、ｉＰＳ細胞とｉＰＳ細胞の周囲に存在し、共に培養されているフィーダー細胞とが撮像された参照画像を継続的に取得し、記憶部４３ａに保存する。
【０２０８】
次に、ステップＳ９０２において、特徴量算出部４５ａは、上記４つの入力値を算出する。
次に、ステップＳ９０３において、評価処理部４８ａは、記憶部４３ａから画像別、コロニー＋フィーダーモデルで用いられる指標の種類およびその指標の閾値を読み出す。
【０２０９】
次に、ステップＳ９０４において、評価処理部４８ａは、特徴量算出部４５ａが算出した４つの入力値から、読み出した指標の種類に該当する値を読み出す。
そして、評価処理部４８ａは、その読み出した指標の種類に該当する値を、その指標の閾値と比較することによって、ｉＰＳ細胞を所定のグループに分類する。これによって、評価処理部４８ａは、ｉＰＳ細胞の状態を推定することができる。
【０２１０】
例えば、評価処理部４８ａは、上記入力値から「９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞のヒストグラム間の面積差」と「２４時間目のコロニーの丸さ平均値」という指標の種類に該当する値をそれぞれ読み出す（図１６参照）。
そして、評価処理部４８ａは、「９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞のヒストグラム間の面積差」に該当する値が、その指標の閾値（２０）以上であれば、ｉＰＳ細胞を「骨に分化する能力を持つ」というグループに分類する。
【０２１１】
これによって、ｉＰＳ細胞の周囲に存在するフィーダー細胞集団の形態的特徴量の度数分布の時間変化から、ｉＰＳ細胞の分化の種類を推定することができる。
【０２１２】
一方、評価処理部４８ａは、入力値のうち「９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞のヒストグラム間の面積差」に該当する値が、その指標の閾値（２０）未満であり、入力値のうち「２４時間目のコロニーの丸さの平均値」に該当する値が、その指標の閾値（３０）以上であれば、ｉＰＳ細胞を「軟骨に分化する能力を持つ」というグループに分類する。
【０２１３】
これによって、ｉＰＳ細胞の周囲に存在するフィーダー細胞集団の形態的特徴量の度数分布の時間変化と、ｉＰＳ細胞のコロニー集団の形態的特徴量とから、ｉＰＳ細胞の分化の種類を推定することができる。以上で、本フローチャートは終了する。
【０２１４】
２番目に、フィーダー細胞の形態的特徴量とｉＰＳ細胞のコロニーの特徴量とから、対象画像中に含まれるｉＰＳ細胞集団の状態を推定する方法について説明する。
図２４は、図１７に示す画像別、コロニー・フィーダー別モデルを用いたｉＰＳ細胞の状態の推定を説明するためのフローチャートである。
【０２１５】
まず、ステップＳ１００１からステップＳ１００２までは、ステップＳ９０１からステップＳ９０２までと同じなので、説明を省略する。
次に、ステップＳ１００３において、評価処理部４８ａは、記憶部４３ａから画像別、コロニー・フィーダー別モデルで用いられる指標の種類およびその指標の閾値を読み出す。
【０２１６】
次に、ステップＳ１００４において、評価処理部４８ａは、特徴量算出部４５ａが算出した４つの入力値から、コロニーモデルの指標の種類に該当する値を読み出す。
そして、評価処理部４８ａは、その読み出した指標の種類に該当する値を、その指標の閾値と比較することによって、ｉＰＳ細胞を所定のグループに分類する。
【０２１７】
例えば、評価処理部４８ａは、上記入力値から「２４時間目のコロニーの丸さの平均値」と「９６時間目と２４時間目のコロニーの長さの変化量」という指標の種類に該当する値をそれぞれ読み出す（図１７（ａ）参照）。
そして、評価処理部４８ａは、入力値のうち「２４時間目のコロニーの丸さの平均値」に該当する値が、その指標の閾値（２０）以上であれば、ｉＰＳ細胞を「骨に分化する能力を持つ」というグループに分類する。
【０２１８】
これによって、ｉＰＳ細胞のコロニー集団の形態的特徴量から、ｉＰＳ細胞の分化の種類を推定することができる。
【０２１９】
次に、ステップＳ１００５において、評価処理部４８ａは、特徴量算出部４５ａが算出した４つの入力値から、フィーダーモデルの指標の種類に該当する値を読み出す。
そして、評価処理部４８ａは、その読み出した指標の種類に該当する値を、その指標の閾値と比較することによって、ｉＰＳ細胞を所定のレベルに分類する。
【０２２０】
例えば、評価処理部４８ａは、上記入力値から「４８時間目のフィーダー細胞の丸さ平均値」と「９６時間目と２４時間目のフィーダー細胞の丸さのヒストグラムの面積差」という指標の種類に該当する値をそれぞれ読み出す（図１７（ｂ）参照）。
そして、評価処理部４８ａは、入力値のうち「４８時間目のフィーダー細胞の丸さ平均値」に該当する値が、その指標の閾値（４０）以上であれば、ｉＰＳ細胞を「大きな劣化度合い」というレベルに分類する。
【０２２１】
これによって、フィーダー細胞集団の形態的特徴量から、ｉＰＳ細胞の劣化度合いを推定することができる。
【０２２２】
次に、ステップＳ１００６において、評価処理部４８ａは、分類したグループとレベルに基づいて、ｉＰＳ細胞の状態を複合的に推定する。
例えば、評価処理部４８ａは、コロニーモデルでグループ１（分化グループ：骨）、フィーダーモデルでレベル１（劣化度合い：大）に分類されたことから、ｉＰＳ細胞は骨に分化したが、劣化が激しいという複合的な推定をする。以上で、本フローチャートは、終了する。
【０２２３】
最後に、フィーダー細胞の形態的特徴量とｉＰＳ細胞のコロニーの特徴量とから、対象画像中に含まれるｉＰＳ細胞集団の状態を推定する方法について説明する。
図２５は、図１８に示す細胞別、コロニー・フィーダー別モデルを用いたｉＰＳ細胞の状態の推定を説明するためのフローチャートである。
【０２２４】
まず、ステップＳ１１０１からステップＳ１１０２までは、ステップＳ９０１からステップＳ９０２までと同じなので、説明を省略する。
次に、ステップＳ１１０３において、評価処理部４８ａは、記憶部４３ａから細胞別、コロニー・フィーダー別モデルで用いられる指標の種類およびその指標の閾値を読み出す。
【０２２５】
次に、ステップＳ１１０４において、評価処理部４８ａは、特徴量算出部４５ａが算出した４つの入力値から、コロニーモデルの指標の種類に該当する値を読み出す。
そして、評価処理部４８ａは、その読み出した指標の種類に該当する値を、その指標の閾値と比較することによって、ｉＰＳ細胞を所定のグループに分類する。
【０２２６】
例えば、評価処理部４８ａは、上記入力値から「２４時間目のコロニーの丸さ」と「９６時間目と２４時間目のコロニーの丸さのヒストグラムの面積差」という指標の種類に該当する値をそれぞれ読み出す（図１８（ａ）参照）。
そして、評価処理部４８ａは、入力値のうち「２４時間目のコロニーの丸さ」に該当する値が、その指標の閾値（８０）未満であれば、ｉＰＳ細胞を「脂肪に分化する能力をもつ」というグループに分類する。
【０２２７】
これによって、ｉＰＳ細胞の１つのコロニーの形態的特徴量から、そのｉＰＳ細胞のコロニーに含まれるｉＰＳ細胞の分化の種類を推定することができる。
【０２２８】
次に、ステップＳ１１０５において、評価処理部４８ａは、特徴量算出部４５ａが算出した４つの入力値から、フィーダーモデルの指標の種類に該当する値を読み出す。
そして、評価処理部４８ａは、その読み出した指標の種類に該当する値を、その指標の閾値と比較することによって、ｉＰＳ細胞を所定のレベルに分類する。
【０２２９】
例えば、評価処理部４８ａは、上記入力値から「４８時間目のフィーダー細胞の長さ」と「２４時間目のフィーダー細胞の輝度」という指標の種類に該当する値をそれぞれ読み出す（図１８（ｂ）参照）。
そして、評価処理部４８ａは、入力値のうち「４８時間目のフィーダー細胞の長さ」に該当する値が、その指標の閾値（２０）未満であれば、ｉＰＳ細胞を「低い増殖能」というレベルに分類する。
【０２３０】
これによって、１つのフィーダー細胞の形態的特徴量から、その周囲に存在するｉＰＳ細胞の分化の種類を推定することができる。
【０２３１】
次に、ステップＳ１１０６において、評価処理部４８ａは、分類したグループとレベルに基づいて、ｉＰＳ細胞の状態を複合的に推定する。
例えば、評価処理部４８ａは、コロニーモデルでグループ３（分化グループ：脂肪）、フィーダーモデルでレベル３（増殖能：低）に分類されたことから、そのｉＰＳ細胞は脂肪に分化する分化能を有するが、増殖能が低いという複合的な推定をする。以上で、本フローチャートは、終了する。
【０２３２】
以上、本発明の第２の実施例によれば、対象画像中に含まれるフィーダー細胞集団の形態的特徴量から、対象画像中に含まれるｉＰＳ細胞集団を、所定の「レベル」または所定の「グループ」に区分することができる。
さらに、対象画像中に含まれるフィーダー細胞集団の形態的特徴量と、対象画像中に含まれるｉＰＳ細胞集団の形態的特徴量とから、対象画像中に含まれるｉＰＳ細胞集団を、所定の「レベル」または所定の「グループ」に区分することができる。
【０２３３】
また、対象画像中に含まれる１つのフィーダー細胞の形態的特徴量から、対象画像中の１つのｉＰＳ細胞を、所定の「レベル」または所定の「グループ」に区分することができる。
さらに、対象画像中に含まれる１つのフィーダー細胞の形態的特徴量と、対象画像中に含まれる１つのｉＰＳ細胞の形態的特徴量とから、対象画像中の１つのｉＰＳ細胞を、所定の「レベル」または所定の「グループ」に区分することができる。
【０２３４】
なお、第２の実施例では、ｉＰＳ細胞のコロニーの特徴量とフィーダー細胞の特徴量に対して、それぞれ別々の決定木を構築したが、これに限らず、両方の特徴量を用いた決定木を構築してもよい。
なお、第２の実施例では、ｉＰＳ細胞の分化の方向性、ｉＰＳ細胞の劣化度合い、またはｉＰＳ細胞の増殖度を推定したがこれに限らず、ｉＰＳ細胞の分化度、ｉＰＳ細胞の腫瘍化しやすさ等でもよい。
【０２３５】
＜細胞の培養法の例＞
図２６は、本発明の実施例２の細胞評価プログラムを用いた細胞の培養方法を説明するためのフローチャートである。本フローチャートでは、インキュベータ１１に増殖させたいｉＰＳ細胞を含んだシャーレが置かれた状況を想定することとする。
【０２３６】
まず、ステップＳ１２０１において、ＣＰＵ４２ａは、予め決められた培養条件（例えば所定の温度、湿度等）で細胞を培養するよう温度調整装置１５ａと湿度調整装置１５ｂとを制御する。所定期間経過後、ステップＳ１２０２において、ＣＰＵ４２ａは、記憶部４３ａから読み出した本発明の実施形態の細胞評価プログラムを実行し、細胞の状態を評価する。次に、ステップＳ１２０３において、ＣＰＵ４２ａは、細胞の状態の評価結果に基づき、培養を中止するか、培養条件を変更するか、または現在の培養条件で培養を続行するか判定する。
【０２３７】
次に、ステップＳ１２０４において、ＣＰＵ４２ａが培養を中止すると判定した場合（ステップＳ１２０４ ＹＥＳ）、ＣＰＵ４２ａは培養の中止を示す情報を不図示のモニタ等に表示させ、処理を終了する。
一方、ＣＰＵ４２ａは培養を中止すると判定しなかった場合（ステップＳ１２０４ ＮＯ）、ＣＰＵ４２ａはステップＳ１２０５の処理に進む。
【０２３８】
次に、ステップＳ１２０５において、ＣＰＵ４２ａが培養条件を変更すると判定した場合（ステップＳ１２０５ ＹＥＳ）、ＣＰＵ４２ａは、細胞の状態の評価結果と関係付けられた培養条件（例えば所定の温度、湿度等）に変更するよう温度調整装置１５ａと湿度調整装置１５ｂとを制御する（ステップＳ１２０６）。ＣＰＵ４２ａは、ステップＳ１２０２の処理に戻る。
一方、ＣＰＵ４２ａが現在の培養条件で培養を続行すると判定した場合（ステップＳ１２０５ ＮＯ）、ＣＰＵ４２ａはステップＳ１２０７の処理に進む。
【０２３９】
次に、ステップＳ１２０７において、ＣＰＵ４２ａは、予め決められた時間の経過毎に、撮像装置３４で撮像された画像から、ｉＰＳ細胞に相当するオブジェクトを抽出し、オブジェクトの数すなわち細胞数を計数する。
【０２４０】
次に、ステップＳ１２０８において、計数された細胞数が所定の細胞数に到達していない場合（ステップＳ１２０８ ＮＯ）、計数された細胞数に応じた時間が経過した後、ＣＰＵ４２ａはステップＳ１２０２の処理に戻る。
一方、計数された細胞数が所定の細胞数に到達した場合（ステップＳ１２０８ ＹＥＳ）、ＣＰＵ４２ａはその細胞の培養が完了した旨を示す情報を、不図示のモニタ等に表 示させる。以上で、本フローチャートは、終了する。
【０２４１】
以上により、本発明の細胞の培養方法を用いれば、細胞の評価に基づいて動的に培養条件を変更することができるので、ｉＰＳ細胞を容易に増殖させることができる。
なお、本発明の実施例２の細胞評価プログラムを用いて、細胞の培養条件を変更したが、これに限らず、本発明の実施例１の細胞評価プログラムを用いて、細胞の培養条件を変更してもよい。
【０２４２】
なお、本発明の実施形態では、ｉＰＳ細胞について説明したがこれに限らず、ＥＳ細胞でも、他の細胞でもよい。
また、本発明の実施形態では、ｉＰＳ細胞の状態を推定するために、他のｉＰＳ細胞の形態的特徴量を指標にしたが、これに限らず、ＥＳ細胞など近種の細胞の形態的特徴量を指標にしてもよい。
【０２４３】
なお、本発明の実施形態では、フィーダー細胞は１種類の細胞であるとして説明したが、これに限らず、フィーダー細胞は複数種類の細胞を用いて構成されてもよい。その際には、その複数種類のフィーダー細胞のうち、少なくとも１種類のフィーダー細胞の形態的特徴量を指標にすればよい。
また、本発明の実施形態では、ｉＰＳ細胞とフィーダー細胞との２種類の細胞が共に培養されているとしたが、これに限らず、その他の種類の細胞が、ｉＰＳ細胞とフィーダー細胞と共に培養されていてもよい。
【０２４４】
＜実施形態の補足事項＞
（１）上記の一の実施形態では、インキュベータ１１またはインキュベータ１１ａがそれぞれ備える制御装置４１または制御装置４１ａに情報処理装置を組み込んだ例を説明したが、本発明の情報処理装置は、インキュベータ１１またはインキュベータ１１ａから顕微鏡画像を取得して解析を行う外部の独立したコンピュータで構成されていてもよい（この場合の図示は省略する）。
【０２４５】
（２）上記の実施形態では、領域抽出部４４、特徴量算出部４５または特徴量算出部４５ａ、度数分布算出部４６、指標抽出部４７または指標抽出部４７ａ、評価処理部４８または評価処理部４８ａの各機能をプログラムでソフトウェア的に実現する例を説明したが、これらの処理をＡＳＩＣによってハードウエア的に実現しても勿論かまわない。
【０２４６】
（３）上記の一の実施形態では、評価情報の計算モデルとその指標を制御装置４１または制御装置４１ａがＦＮＮによって求める例を説明した。しかし、本発明の培養状態評価装置は、例えば、重回帰分析などの他の多変量解析によって、評価情報の計算モデルとその指標を求めるものでもよい。
【０２４７】
さらに、本発明の培養状態評価装置は、複数の計算モデルを組み合わせて、これらの計算モデルによる演算結果の多数決（あるいは重み付け平均）によって、最終的な評価情報を生成するようにしてもよい。この場合には、例えば、混在率の低いデータではＭＲＡが強く、混在率の高いデータにはＦＮＮが強いというように、一方の計算モデルでは精度の低い状況を他のモデルによってカバーすることができ、評価情報の精度をより高めることができる。
【０２４８】
（４）また、培養状態評価装置は、評価情報の計算モデルを求めるときに、最初に複数の指標を組み合わせでの計算結果を演算し、変数増減法により指標を増減させるようにしてもよい。また、データの精度が高ければ指標を全て用いても良い。
【０２４９】
（５）上記の一の実施形態では、２つの度数分布の差分の絶対値和を用いて、度数分布の変化量を求める例を説明したが、２つの度数分布の差分の二乗和から度数分布の変化量を求めてもよい。また、上記の一の実施形態で示した計算式はあくまで一例に過ぎず、例えば２次以上のｎ次方程式などであってもよい。
【０２５０】
（６）上記の実施形態や実施例に示した特徴値はあくまで一例にすぎず、評価対象の細胞の種類などに応じて他の特徴値のパラメータを採用することも勿論可能である。
【０２５１】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。
【符号の説明】
【０２５２】
１１ インキュベータ
１１ａ インキュベータ
１５ 恒温室
１９ 培養容器
２２ 観察ユニット
３４ 撮像装置
４１ 制御装置
４１ａ 制御装置
４２ ＣＰＵ
４２ａ ＣＰＵ
４３ 記憶部
４３ａ 記憶部
４４ 領域抽出部
４５ 特徴量算出部
４５ａ 特徴量算出部
４６ 度数分布算出部
４７ 指標抽出部
４７ａ 指標抽出部
４８ 評価処理部
４８ａ 評価処理部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の種類の細胞と前記第１の種類の細胞の周囲に存在し、共に培養されている第２の種類の細胞とが撮像された対象画像において、前記第１の種類の個別の細胞および細胞の集合体が占める領域と前記第２の種類の細胞が占める領域とを抽出する領域抽出部と、
前記領域抽出部で抽出された第２の種類の細胞が占める領域に存在する前記第２の種類の細胞の形態的特徴を示す特徴量を算出する第１の特徴量算出部と、
前記第２の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量と、前記第１の種類の細胞の状態との対応関係に基づいて、第１の種類の細胞の状態を評価する評価処理部と、
を備えることを特徴とする細胞評価装置。
【請求項２】
前記対象画像毎に前記第２の種類の細胞の特徴量の度数分布を算出する第１の度数分布算出部を更に備え、
前記評価処理部は、異なる時刻で取得された対象画像間における前記第１の度数分布算出部により算出された度数分布の変化を抽出し、前記抽出された変化に応じて、前記第１の種類の細胞の状態を評価することを特徴とする請求項１に記載の細胞評価装置。
【請求項３】
前記対象画像毎に前記第１の種類の細胞の特徴量の度数分布をそれぞれ算出する第２の度数分布算出部を更に備え、
前記評価処理部は、異なる時刻で取得された対象画像間における前記第１の度数分布算出部により算出された度数分布の変化と、前記対象画像間での前記第２の度数分布算出部により算出された度数分布の変化を抽出し、前記抽出された変化に基づいて、前記第１の種類の細胞の状態を評価することを特徴とする請求項２に記載の細胞評価装置。
【請求項４】
前記第１の種類の細胞と前記第２の種類の細胞と同種の細胞が共に培養されている状態が撮像された参照画像を記憶する記憶部と、
前記参照画像が撮像された時間の情報と、前記参照画像における第２の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量とに基づいて、前記第１の種類の細胞の品質を分類する指標を算出する第１の指標算出部と、
を更に備え、
前記評価処理部は、前記第１の指標算出部により算出された指標と、前記対象画像から抽出された前記第２の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量とを照合し、前記第１の種類の細胞の状態を評価することを特徴とする請求項１に記載の細胞評価装置。
【請求項５】
前記参照画像が撮像された時間の情報と、前記参照画像における第１の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量と、前記参照画像における第２の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量とに基づいて、前記第１の種類の細胞の品質を分類する指標を算出する第２の指標算出部と、
を更に備え、
前記評価処理部は、前記第１の指標算出部により算出された指標と前記第２の指標算出部により算出された指標と、前記対象画像から抽出された前記第１の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量とを照合し、前記第１の種類の細胞の状態を評価することを特徴とする請求項４に記載の細胞評価装置。
【請求項６】
前記第１の種類の細胞は、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれかに記載の細胞評価装置。
【請求項７】
前記第２の種類の細胞は、フィーダー細胞であることを特徴とする請求項１から請求項６のいずれかに記載の細胞評価装置。
【請求項８】
細胞を培養する培養容器を収納するとともに、所定の環境条件に内部を維持可能な恒温室と、
前記恒温室内で前記培養容器に含まれる前記細胞の画像を撮像する撮像装置と、
請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の細胞評価装置と、
を備えることを特徴とするインキュベータ。
【請求項９】
第１の種類の細胞と前記第１の種類の細胞の周囲に存在し、共に培養されている第２の種類の細胞とが撮像された対象画像において、前記第１の種類の個別の細胞および細胞の集合体が占める領域と前記第２の種類の細胞が占める領域とを抽出する領域抽出手順と、
前記領域抽出手順で抽出された第２の種類の細胞が占める領域に存在する前記第２の種類の細胞の形態的特徴を示す特徴量を算出する第１の特徴量算出手順と、
前記第２の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量と、前記第１の種類の細胞の状態との対応関係に基づいて、第１の種類の細胞の状態を評価する評価処理手順と、
を有することを特徴とする細胞評価方法。
【請求項１０】
第１の種類の細胞と前記第１の種類の細胞の周囲に存在し、共に培養されている第２の種類の細胞とが撮像された対象画像において、前記第１の種類の個別の細胞および細胞の集合体が占める領域と前記第２の種類の細胞が占める領域とを抽出する第１のステップと、
前記第１のステップで抽出された第２の種類の細胞が占める領域に存在する前記第２の種類の細胞の形態的特徴を示す特徴量を算出する第２のステップと、
前記第２の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量と、前記第１の種類の細胞の状態との対応関係に基づいて、第１の種類の細胞の状態を評価する第３のステップと、
をコンピュータに実行させるための細胞評価プログラム。
【請求項１１】
第１の種類の細胞と前記第１の種類の細胞の周囲に存在し、共に培養されている第２の種類の細胞が撮像された画像から、前記第２の種類の細胞の形態的特徴を示す特徴量を抽出し、
前記第２の種類の細胞の形態的特徴を示す特徴量に基づき、第１の種類の細胞の状態を推定し、
前記第１の細胞の状態に基づき、前記第１の種類の細胞又は前記第２の種類の細胞の培養条件を変更することを特徴とする細胞の培養方法。
【請求項１】
第１の種類の細胞と前記第１の種類の細胞の周囲に存在し、共に培養されている第２の種類の細胞とが撮像された対象画像において、前記第１の種類の個別の細胞および細胞の集合体が占める領域と前記第２の種類の細胞が占める領域とを抽出する領域抽出部と、
前記領域抽出部で抽出された第２の種類の細胞が占める領域に存在する前記第２の種類の細胞の形態的特徴を示す特徴量を算出する第１の特徴量算出部と、
前記第２の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量と、前記第１の種類の細胞の状態との対応関係に基づいて、第１の種類の細胞の状態を評価する評価処理部と、
を備えることを特徴とする細胞評価装置。
【請求項２】
前記対象画像毎に前記第２の種類の細胞の特徴量の度数分布を算出する第１の度数分布算出部を更に備え、
前記評価処理部は、異なる時刻で取得された対象画像間における前記第１の度数分布算出部により算出された度数分布の変化を抽出し、前記抽出された変化に応じて、前記第１の種類の細胞の状態を評価することを特徴とする請求項１に記載の細胞評価装置。
【請求項３】
前記対象画像毎に前記第１の種類の細胞の特徴量の度数分布をそれぞれ算出する第２の度数分布算出部を更に備え、
前記評価処理部は、異なる時刻で取得された対象画像間における前記第１の度数分布算出部により算出された度数分布の変化と、前記対象画像間での前記第２の度数分布算出部により算出された度数分布の変化を抽出し、前記抽出された変化に基づいて、前記第１の種類の細胞の状態を評価することを特徴とする請求項２に記載の細胞評価装置。
【請求項４】
前記第１の種類の細胞と前記第２の種類の細胞と同種の細胞が共に培養されている状態が撮像された参照画像を記憶する記憶部と、
前記参照画像が撮像された時間の情報と、前記参照画像における第２の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量とに基づいて、前記第１の種類の細胞の品質を分類する指標を算出する第１の指標算出部と、
を更に備え、
前記評価処理部は、前記第１の指標算出部により算出された指標と、前記対象画像から抽出された前記第２の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量とを照合し、前記第１の種類の細胞の状態を評価することを特徴とする請求項１に記載の細胞評価装置。
【請求項５】
前記参照画像が撮像された時間の情報と、前記参照画像における第１の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量と、前記参照画像における第２の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量とに基づいて、前記第１の種類の細胞の品質を分類する指標を算出する第２の指標算出部と、
を更に備え、
前記評価処理部は、前記第１の指標算出部により算出された指標と前記第２の指標算出部により算出された指標と、前記対象画像から抽出された前記第１の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量とを照合し、前記第１の種類の細胞の状態を評価することを特徴とする請求項４に記載の細胞評価装置。
【請求項６】
前記第１の種類の細胞は、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれかに記載の細胞評価装置。
【請求項７】
前記第２の種類の細胞は、フィーダー細胞であることを特徴とする請求項１から請求項６のいずれかに記載の細胞評価装置。
【請求項８】
細胞を培養する培養容器を収納するとともに、所定の環境条件に内部を維持可能な恒温室と、
前記恒温室内で前記培養容器に含まれる前記細胞の画像を撮像する撮像装置と、
請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の細胞評価装置と、
を備えることを特徴とするインキュベータ。
【請求項９】
第１の種類の細胞と前記第１の種類の細胞の周囲に存在し、共に培養されている第２の種類の細胞とが撮像された対象画像において、前記第１の種類の個別の細胞および細胞の集合体が占める領域と前記第２の種類の細胞が占める領域とを抽出する領域抽出手順と、
前記領域抽出手順で抽出された第２の種類の細胞が占める領域に存在する前記第２の種類の細胞の形態的特徴を示す特徴量を算出する第１の特徴量算出手順と、
前記第２の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量と、前記第１の種類の細胞の状態との対応関係に基づいて、第１の種類の細胞の状態を評価する評価処理手順と、
を有することを特徴とする細胞評価方法。
【請求項１０】
第１の種類の細胞と前記第１の種類の細胞の周囲に存在し、共に培養されている第２の種類の細胞とが撮像された対象画像において、前記第１の種類の個別の細胞および細胞の集合体が占める領域と前記第２の種類の細胞が占める領域とを抽出する第１のステップと、
前記第１のステップで抽出された第２の種類の細胞が占める領域に存在する前記第２の種類の細胞の形態的特徴を示す特徴量を算出する第２のステップと、
前記第２の種類の細胞が有する形態的特徴を示す特徴量と、前記第１の種類の細胞の状態との対応関係に基づいて、第１の種類の細胞の状態を評価する第３のステップと、
をコンピュータに実行させるための細胞評価プログラム。
【請求項１１】
第１の種類の細胞と前記第１の種類の細胞の周囲に存在し、共に培養されている第２の種類の細胞が撮像された画像から、前記第２の種類の細胞の形態的特徴を示す特徴量を抽出し、
前記第２の種類の細胞の形態的特徴を示す特徴量に基づき、第１の種類の細胞の状態を推定し、
前記第１の細胞の状態に基づき、前記第１の種類の細胞又は前記第２の種類の細胞の培養条件を変更することを特徴とする細胞の培養方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−２２９４０９（Ｐ２０１１−２２９４０９Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１００１６２（Ｐ２０１０−１００１６２）
【出願日】平成２２年４月２３日（２０１０．４．２３）
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２３日（２０１０．４．２３）
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
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