細胞賦活剤
【課題】
本発明は、化粧料（但し、医薬部外品を含む）等に好適な、細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法、当該鑑別方法により選択される細胞賦活剤、及び、当該成分を含有する皮膚外用剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、皮膚細胞の細胞分化増殖能を低下させ、被験物質を添加し、その後に皮膚細胞の細胞分化増殖能を測定し、当該測定値を指標とし、細胞賦活作用を有する成分を判別する鑑別方法、更には、当該鑑別方法により選択される細胞賦活剤、並びに、かかる成分を含有する皮膚外用剤を提供することにより本課題を解決する。
本発明は、化粧料（但し、医薬部外品を含む）等に好適な、細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法、当該鑑別方法により選択される細胞賦活剤、及び、当該成分を含有する皮膚外用剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、皮膚細胞の細胞分化増殖能を低下させ、被験物質を添加し、その後に皮膚細胞の細胞分化増殖能を測定し、当該測定値を指標とし、細胞賦活作用を有する成分を判別する鑑別方法、更には、当該鑑別方法により選択される細胞賦活剤、並びに、かかる成分を含有する皮膚外用剤を提供することにより本課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧料（但し、医薬部外品を含む）等に好適な細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法、並びに、本鑑別方法により選択された細胞賦活剤、及び、当該成分を含有する皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、生体と外部環境との境界に存在し、生体を外界からの刺激より防御するバリア機能に加え、水分蒸散を防ぐ保湿機能等の重要な役割を担っている。皮膚は、表皮、真皮、皮下組織により構成される。表皮層に存在する基底層、取り分け、角化細胞（ケラチノサイト）及び色素細胞（メラノサイト）は、肌荒れ、色素沈着、シミやシワなどの皮膚症状に深く関係することが、これまでに明らかにされている。また、表皮層は、皮膚の表面に存在するために、遺伝的要因に加え、紫外線暴露、湿度変化、温度変化等の種々のストレスを常に受け続けることにより機能低下が生じ易い。ケラチノサイト及びメラノサイトに付いては、前記要因による細胞機能低下により、皮膚のタ−ンオ−バ−速度が遅くなり、皮膚老化現象や肌荒れ症状が皮膚症状の悪化が顕在化し易くなる。また、皮膚細胞機能の低下は、ケラチノサイトが角層表面より剥がれ落ち難くさせるほか、メラノサイトよりケラチノサイトに移輸されたメラニンの排出が遅くなり色素沈着や肌のくすみの原因となる。このため、ケラチノサイトの加齢等の要因による機能低下を回復又は向上させる成分には、色素沈着や肌のくすみ等へ予防又は治療効果が期待出来る。この様な成分としては、細胞賦活剤が広く知られている。
【０００３】
一方、「細胞賦活作用」という用語には、多様な薬理作用が包含され使用されている。部分的な生物活性を評価する狭義の細胞賦活作用には、細胞内の局所的な生物活性を評価するATP産生促進作用（例えば、特許文献１、特許文献２を参照）、血管内皮細胞増殖因子産生亢進作用（例えば、特許文献３を参照）等の生物活性が存在する。これに対し、細胞全体を評価する広義の細胞賦活作用としては、細胞分化増殖作用評価等が存在する。細胞全体の賦活作用を評価することが出来る細胞増殖能を評価する方法は、実際により近い生体反応現象を評価することが出来る利点が存する。また、細胞全体における細胞賦活作用は、ATP産生をはじめとする複雑な生体内反応により制御されているため、狭義の細胞賦活作用を個別に評価することにより、細胞全体の細胞賦活作用を総合的に推察することは難しい。加えて、細胞賦活作用を評価する場合に、正常細胞を使用するか、又は、ストレスが付加された細胞を用いるかにより、その生体反応における評価結果が異なることが存し、その解釈は複雑化する。この様な状況のため、細胞賦活作用には、細胞の活性化作用という共通の意味は存するが、その生物学的な意味及び作用内容は大きく異なることも少なくない。この様な細胞賦活作用を有する成分の内、ケラチノサイトにおける細胞賦活作用を有する成分としては、モモ、センキョウ、サンザシ、カミツレ、マチルスオドラチシマ、トウキ、ワイルドタイム、サンショウ、クスノハガシワ、シャクヤク、オニイチゴ、ケイヒ、ショウブ、タイソウより得られる植物抽出物等にATP産生促進作用（例えば、特許文献１、特許文献２を参照）が存することが知られている。また、角化細胞における分化増殖作用を有する成分としては、アルニカ、ウコン、オトギリソウ、ガンビ−ルノキ、ゲンノショウコ、コウボクシャクヤク、センキュウ、トウキ、トウチュウカソウ、ナツメ、ニンジン、ビロウドアオイ、フキタンポポ、ブクリョウタケ、モモ、ユキノシタより得られる植物抽出物等（例えば、特許文献４を参照）が知られている。しかしながら、かかる細胞賦活作用は、何れも正常細胞を使用したATP産生促進作用、言い換えれば、正常細胞による局所的な細胞賦活作用を評価したものである。
【０００４】
また一般的に、正常細胞又は正常動物等を用いた評価系は、細胞の入手及び評価系の構築が容易であるが、疾患等の症状を反映しているとは言い難いことが多い。このため、生物活性を有する有効成分を評価する際には、症状を反映したモデル細胞又は動物等を用いた評価系が、より症状を反映した評価系であると考えられている。しかしながら、皮膚症状の細胞賦活作用に関するモデル評価系は、ほとんど知られていない。さらに、皮膚細胞において実際に観察されるメラノサイトのメラニン産生亢進、更には、ケラチノサイトへのメラニンの過剰移送及び蓄積により角化細胞が不活性化されしみ又はくすみが生じる状態を反映した細胞を用いた評価系等は全く知られていない。本発明者等は、皮膚細胞の細胞賦活作用評価方法、取り分け、ケラチノサイトにおけるメラニン添加による細胞賦活作用評価系を確立した。当該評価系は、メラノサイトのメラニン産生亢進、並びに、ケラチノサイトへの過剰移送、蓄積によるケラチノサイトの細胞機能低下により生じるしみ又はくすみを反映したモデル評価系であり、具体的には、ケラチノサイトへのメラニン添加により機能低下が生じているケラチノサイトを使用し、その細胞分化増殖能を測定することにより細胞賦活作用を評価することが可能である。かかる評価系において細胞賦活作用を有する成分は、通常の色素沈着の予防又は改善作用に加え、ケラチノサイトにおけるメラニンの過剰移送、蓄積により生じる消え難いしみ、くすみ、更には、重層剥離などの症状を呈する色素沈着の予防又は改善効果が大いに期待出来る。本発明者等は、かかる評価系を利用して細胞賦活剤を探索し、しみ又はくすみ、並びに、色素沈着予防又は改善用として応用可能な、優れた細胞賦活作用を有する成分を見出した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２５６２７２号
【特許文献２】特開２００９−０８４２１６号
【特許文献３】特開平１１−２８６４３２号
【特許文献４】特開２００３−２９２４３２号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、この様な状況下になされたものであり、ケラチノサイトにおけるメラニンの過剰輸送及び蓄積によるしみ、くすみなどの色素沈着症状の予防又は改善用に好適な、細胞賦活剤の鑑別方法、更には、細胞賦活剤及び当該成分を含有する皮膚外用剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この様な状況を鑑みて、本発明者等は、色素沈着予防又は改善用、取り分け、ケラチノサイトへのメラニンの過剰輸送及び蓄積により生じるしみ及び／又はくすみなどの色素沈着予防又は改善作用に優れる細胞賦活剤を求め、鋭意努力を重ねた結果、皮膚細胞に細胞分化増殖能を低下させる物質を添加し培養することにより皮膚細胞の細胞分化増殖能を低下させた後、被験物質を含む培地にて培養し、皮膚細胞の細胞分化増殖能を測定し、当該測定値を指標とし、細胞賦活作用を有する成分を判別することにより、この様な細胞賦活剤が効率的に、且つ、簡便にスクリ−ニング出来ることを見出した。さらに、かかる評価系を利用しスクリ−ニングを実施することにより細胞賦活剤を見出し、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に示す通りである。
＜１＞ 皮膚細胞の細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法であって、皮膚細胞に細胞分化増殖能を低下させる物質を添加し培養することにより皮膚細胞の細胞分化増殖能を低下させた後、被験物質を含む培地にて培養し、皮膚細胞の細胞分化増殖能を測定し、当該測定値を指標とし、細胞賦活作用を有する成分を判別することを特徴とする、細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法。
＜２＞ 前記皮膚細胞が、角化細胞（ケラチノサイト）であることを特徴とする、＜１＞に記載の細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法。
＜３＞ 前記皮膚細胞の細胞分化増殖能を低下させる物質がメラニンであることを特徴とする、＜１＞又は＜２＞に記載の細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法。
＜４＞ 前記細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法により鑑別される、細胞賦活作用剤。
＜５＞ 前記細胞賦活作用を有する成分が、リンドウ科センブリ属、マメ科カンゾウ属、ミカン科サンショウ属、ユキノシタ科アジサイ属、カタバミ科ゴレンシ属、モモ科モモ属、イネ科イネ属に属する植物より得られる植物抽出物より選択される１種又は２種以上よりなることを特徴とする、＜４＞に記載の細胞賦活剤。
＜６＞ 前記リンドウ科センブリ属、マメ科カンゾウ属、ミカン科サンショウ属、ユキノシタ科アジサイ属、カタバミ科ゴレンシ属、イネ科イネ属に属する植物が、リンドウ科センブリ属センブリ、マメ科カンゾウ属カンゾウ、ミカン科サンショウ属サンショウ、ユキノシタ科アジサイ属アマチャ、カタバミ科ゴレンシ属スタ−フル−ツ、モモ科モモ属モモ、イネ科イネ属イネであることを特徴とする、＜４＞又は＜５＞に記載の細胞賦活剤。
＜７＞ 前記細胞賦活作用が、角化細胞の分化増殖促進作用によるものであることを特徴とする、＜４＞〜＜６＞の何れか一項に記載の細胞賦活剤。
＜８＞ 前記角化細胞の分化増殖能の低下が、メラニン添加による角化細胞の分化増殖能の低下であることを特徴とする、＜４＞〜＜７＞の何れか一項に記載の細胞賦活剤。
＜９＞ 前記細胞賦活剤は、しみ及び／又はくすみのある人において、しみ及び／又はくすみを軽減する作用を有することを特徴とする、＜４＞〜＜８＞の何れか一項に記載の細胞賦活剤。
＜１０＞ しみ及び／又はくすみのある人が、採取されたその人の角層細胞において、平均に比較しメラニン量が多く、且つ、有核細胞の出現率が平均よりも高い、乃至は、重層剥離の度合いが平均よりも多い人であることを特徴とする、＜９＞に記載の細胞賦活剤。
＜１１＞ ＜４＞〜＜１０＞の何れか一項に記載の細胞賦活剤を含有することを特徴とする、皮膚外用剤。
＜１２＞ 前記細胞賦活剤を、皮膚外用剤全量に対し、０．００１質量％〜１０質量％含有することを特徴とする、＜１１＞に記載の皮膚外用剤。
＜１３＞ 色素沈着予防又は改善用であることを特徴とする、＜１１＞又は＜１２＞に記載の皮膚外用剤。
＜１４＞ 化粧料（但し、医薬部外品を含む）であることを特徴とする、＜１１＞〜＜１３＞の何れか一項に記載の皮膚外用剤。
＜１５＞ 角化細胞を、細胞分化抑制作用を有する物質を含む培地で培養し、被験物質非添加の場合に比較し、被験物質添加の場合の方が、細胞分化が著しかった被験物質を細胞賦活剤として含むことを特徴とする、＜１１＞〜＜１４＞の何れか一項目に記載の皮膚外用剤。
＜１６＞ 前記細胞分化抑制作用を有する物質が、メラニンであることを特徴とする、＜１１＞〜＜１５＞の何れか一項目に記載の皮膚外用剤。
＜１７＞ 更に、好ましい製剤上の任意成分を含有することを特徴とする、＜１１＞〜＜１６＞の何れか一項に記載の組成物。
＜１８＞ 細胞分化抑制作用を有する物質を含有する、細胞賦活剤のスクリ−ニング用の培地。
＜１９＞ 前記細胞分化抑制作用を有する物質が、メラニンであることを特徴とする、＜１８＞に記載の培地。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
＜本発明の細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法＞
本発明の細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法は、皮膚細胞における細胞賦活作用を有する成分を判別するための鑑別方法であって、細胞分化増殖能を低下させる物質を添加し培養することにより皮膚細胞の細胞分化増殖能を低下させた後、被験物質を含む培地にて培養し、皮膚細胞の細胞分化増殖能を測定し、当該測定値を指標とし、細胞賦活作用を有する成分を判別することを特徴とする。本発明の細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法において、細胞賦活作用を有する成分とは、細胞の分化増殖能を低下させる物質を添加し培養することにより低下した皮膚細胞の細胞分化増殖能を向上させる成分であれば、特段の限定なく適応することが出来る。また、前記細胞分化増殖能評価に用いる皮膚細胞としては、皮膚細胞であれば特段の限定なく適応することが出来るが、より好ましくはケラチノサイトが好適に例示出来る。さらに、皮膚細胞の分化増殖能を低下させる物質としては、当該作用を有する物質であれば特段の限定なく適応することが出来るが、より好ましくは、メラニンが好適に例示出来る。本発明における細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法にて判別される細胞賦活剤に関し、好ましいものを具体的に例示すれば、後記の実施例に記載の「細胞賦活作用評価」において、コントロ−ル群に比較し細胞増殖能が向上する成分が好適に例示出来、より好ましくは、コントロ−ル群に比較し細胞増殖能が１０％以上増加する成分、さらに好ましくは、コントロ−ル群に比較し細胞増殖能が２０％以上増加する成分が好適に例示出来る。皮膚に存在する細胞は、遺伝的な要因に加え、紫外線暴露、湿度変化、温度変化等の種々のストレスを常に受け続けるためその機能低下が生じ易い。また、皮膚細胞であるケラチノサイトは、皮膚の表皮層における基底層に存在し、色素沈着、シミやくすみ、シワなどの老化現象に深く関与することが知られている。特に、くすみ、シミ等の色素沈着異常が関与する皮膚症状とケラチノサイトとの関係としては、メラノサイトにおけるメラニン産生亢進、並びに、それに伴うケラチノサイトへのメラニンの過剰移送、蓄積により生じるケラチノサイトの機能低下が知られている。実際、この様な角化細胞の細胞機能低下は、通常の色素沈着に加え、メラニンの過剰蓄積により消え難いしみやくすみ、重層剥離などの角質細胞が剥離し難くなった状態等の皮膚症状の発生を反映しているものと考えられる。このため、メラニンを添加することにより細胞分化増殖促進作用を低下させたケラチノサイトの細胞分化増殖促進作用を指標とした細胞賦活剤の鑑別方法は、皮膚細胞、取り分け、ケラチノサイトの細胞機能が低下した皮膚状態を反映した有用な鑑別方法であり、該鑑別方法により判別される細胞賦活剤は、前記症状を呈している色素沈着の予防又は改善作用を有する成分として期待出来る。また、かかる評価系は、ケラチノサイトにおけるメラニンの過剰移送、蓄積により生じる細胞機能低下を反映するため、特に、くすみやしみの多い人、重層剥離の程度が高いなどの皮膚症状を呈するにおいては、有用な細胞賦活剤をスクリ−ニングするのに適している。くすみやしみの多い人、又は、重層剥離などの肌症状を呈する人は、皮膚細胞、取り分け、ケラチノサイトのタ−ンオ−バ−そのものが遅くなり、ケラチノサイトにメラニン顆粒が蓄積し、細胞機能が低下している状態である場合が多い。この様な状態のケラチノサイトに本発明の細胞賦活剤を投与することにより、タ−ンオ−バ−を促進し、この様なくすみやしみ、重層剥離などの皮膚症状を解消出来る。くすみやしみの多い人は、例えば、採取されたその人のケラチノサイトにおいて、平均に比較しメラニン量が多く、且つ、有核細胞の出現率が平均よりも高い乃至は、重層剥離の度合いが平均よりも多い人を以て定義づけることができる。この様な示性値を持った人を対象として、本発明の細胞賦活剤を投与することにより、この様なくすみを解消することが出来る。
【０００９】
また、本発明の細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法に関し、細胞賦活作用を評価する方法としては、皮膚細胞の分化増殖能を低下させる物質を添加し培養することにより細胞増殖能を低下させた後、被験物質を添加した培地により培養することにより細胞分化増殖能を測定する方法であれば、特段の限定なく適応することが出来る。細胞増殖能力を測定する方法に関しては、具体例を挙げれば、同仁化学研究所より市販されているCell Counting Kit等を使用し測定することも出来し、後述する実施例１に記載の方法の通り、生細胞数測定試薬を添加し培養した後、吸光度をマイクロプレ−トリ−ダ−で測定することも出来る。また、かかる測定方法に使用するケラチノサイトの培地としては、通常のケラチノサイトの培養に用いられる培地であれば特段の限定なく適応出来るが、より好ましくは、Humedia−KG２（倉敷紡績株式会社）が好ましい。また、細胞分化増殖能測定における測定感度を向上させるため、Humedia−KG２培地に含まれるハイドロコルチゾン（HC）等の成長因子を除くことも場合によっては好ましい。かかる細胞賦活作用評価系の内、本発明における細胞賦活作用を有する成分としては、後述する実施例１に記載の測定方法が好適に例示出来る。本発明の実施例１において細胞賦活作用を有する成分とは、コントロ−ル群に比較し細胞分化増殖能が高まる成分、より好ましくは、コントロ−ル群に比較し細胞増殖能が１０％以上増加する成分、さらに好ましくは、コントロ−ル群に比較し細胞増殖能が２０％以上増加する成分が好適に例示出来る。
【００１０】
＜本発明の皮膚外用剤の必須成分である細胞賦活作用を有する成分＞
本発明の細胞賦活剤は、細胞分化増殖能を低下させる物質を添加し培養することにより皮膚細胞の細胞分化増殖能を低下させた後、被験物質を含む培地にて培養し、皮膚細胞の細胞分化増殖能を測定し、当該測定値を指標とし、細胞賦活作用を有する成分と判別された細胞賦活剤であることを特徴とする。本発明の細胞賦活剤は、前記の細胞分化増殖能を指標とする細胞賦活作用を有する成分の判別方法により細胞賦活作用を有する成分であると判別される成分であれば特段の限定なく適応することが出来る。前記細胞賦活作用を有する成分の内、より好ましいものを挙げれば、後記実施例１に記載の「細胞賦活作用評価」において細胞賦活作用を有する成分が好適に例示出来る。尚、後述する「細胞賦活作用評価」において細胞賦活作用を有する成分とは、コントロ−ル群に比較し細胞分化増殖能が高まる成分、より好ましくは、コントロ−ル群に比較し細胞増殖能が１０％以上増加する成分、さらに好ましくは、コントロ−ル群に比較し細胞増殖能が２０％以上増加する成分が好適に例示出来る。前記の本発明の細胞賦活剤の内、より好ましくは、リンドウ科センブリ属、マメ科カンゾウ属、ミカン科サンショウ属、ユキノシタ科アジサイ属、カタバミ科ゴレンシ属、モモ科モモ属、イネ科イネ属に属する植物より得られる植物抽出物より選択される１種又は２種以上よりなる植物抽出物が好適に例示出来、より好ましくは、リンドウ科センブリ属センブリ、マメ科カンゾウ属カンゾウ、ミカン科サンショウ属サンショウ、ユキノシタ科アジサイ属アマチャ、カタバミ科ゴレンシ属スタ−フル−ツ、モモ科モモ属モモ、イネ科イネ属イネより得られる植物抽出物が好適に例示出来る。尚、本発明における植物抽出物とは、植物抽出物自体、植物抽出物を分画、精製した分画、植物抽出物乃至は分画、精製物の溶媒除去物の総称を意味する。
【００１１】
本発明の細胞賦活剤は、前記植物より得られる植物抽出物を唯１種のみ含有することも出来るし、２種以上を組み合わせて含有させることも出来る。ここで、植物由来の植物抽出物とは、植物抽出物自体、植物抽出物を分画、精製した分画、植物抽出物乃至は分画、精製物の溶媒除去物の総称を意味する。リンドウ科センブリ属センブリは、日本、朝鮮半島、中国原産の山や野の乾いた草地や木の下に生える草であり、日本全土に分布し、苦い胃の薬として有名である。マメ科カンゾウ属カンゾウは、ヨ−ロッパ南部を原産地とする多年草であり、日本においては３００年以上前から山梨県をはじめとする日本各地で栽培されている。カンゾウには、グリチルリチン等の抗炎症成分が含有されることが広く知られている。また、根又は根茎を乾燥させたものを生薬として使用するほか、抽出物や粉末を甘味料として利用している。ミカン科サンショウ属サンショウは、東アジア、日本を原産地とする落葉低木である。日本においては、関東以西の本州、四国、九州などに生育し、古くから葉や果実が香辛料として利用されている。ユキノシタ科アジサイ属アマチャは、日本、中国などを原産の落葉小低木であり、本州、四国、九州等の日本全国で生育し、甘味飲料や加工食品の甘味原料として使用されている。カタバミ科ゴレンシ属スタ−フル−ツ（和名：五歛子）は、熱帯アジアを原産地とする常緑の木本であり、日本においては、沖縄県、宮崎県などで栽培されている。実は、食用として使用される。バラ科モモ属モモは、中国を原産地とする落葉小高木であり、その果実をモモと呼ぶ。日本国内においては、福島県、山梨県、長野県、岡山県など全国で栽培されている。また、その果実は、食用として利用され、血行改善、利尿作用などがあるとされている。本発明の細胞賦活作用を有する植物抽出物を得るために好ましい部位としては、葉が好適に例示出来る。イネ科イネ属イネは、熱帯アジアを原産地とする穀物であり、日本全国で栽培されている。実部分は、食料、飼料、醸造用等に使用されるほか、わらは、農具、飾り等に利用されている。また、食用とされる米には、消化不良、腹痛等に効果があるとされている。本発明の細胞賦活作用を有する植物抽出物を得るために好ましい部位としては、実部分が好適に例示出来、より好ましくは、実である米を精米する際に得られるコメヌカより得られる植物抽出物が好適に例示出来る。
【００１２】
本発明の細胞賦活作用を有する植物抽出物は、日本において、自生又は生育された植物、漢方生薬原料等として販売される日本産のものを用い植物抽出物を作製することも出来るし、丸善製薬株式会社等より植物抽出物として販売されている市販の植物抽出物を購入し使用することも出来る。前記植物より得られる植物抽出物の作製に用いる植物部には、特段の限定はなく、全草を用いることが出来るが、勿論、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾、果実等の部位のみを使用することも出来る。前記植物の抽出に際しては、植物体などの抽出に用いる部位は、予め、粉砕或いは細切して抽出効率を向上させるように加工することが好ましい。抽出物製造においては、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬する。浸漬後は、室温まで冷却し、所望により不溶物を除去した後、溶媒を減圧濃縮するなどにより除去することが出来る。しかる後、シリカゲルやイオン交換樹脂を充填したカラムクロマトグラフィ−などで分画精製し、所望の抽出物を得ることが出来る。ここで、本発明の植物より得られる抽出物とは、抽出物自体、抽出物の分画、精製した分画、抽出物乃至は分画、精製物の溶媒除去物の総称を意味する
【００１３】
前記抽出溶媒としては、極性溶媒が好適に例示出来、より好ましくは、メタノ−ル、エタノ−ル、イソプロピルアルコ−ル、ブタノ−ルなどのアルコ−ル類、１，３−ブチレングリコ−ル、ポリプロピレングリコ−ルなどの多価アルコ−ル類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエ−テル、テトラヒドロフランなどのエ−テル類、ヘキサン、ペンタン等の炭化水素類等のから選択される１種乃至は２種以上が好適に例示出来、さらに好ましくは、エタノ−ル、含水エタノ−ル、ブチレングリコ−ル、含水ブチレングリコ−ルが好適に例示出来、抽出効率の点からは、５０〜９５％（溶量）含水エタノ−ル、より好ましくは、７０〜９５％（溶量）含水エタノ−ル１，３−ブチレングリコ−ルが好ましく例示出来る。
【００１４】
＜製造例１： 本発明の植物抽出物の製造方法１＞
本発明の細胞賦活作用を有する植物抽出物を以下の手順に従い製造した。各植物の抽出原料としては、リンドウ科センブリ属センブリ、マメ科カンゾウ属カンゾウ、ミカン科サンショウ属サンショウ、ユキノシタ科アジサイ属アマチャ、カタバミ科ゴレンシ属スタ−フル−ツ、モモ科モモ属モモ、イネ科イネ属イネの粗砕物１００（ｇ）をエタノ−ル溶媒１０００（Ｌ）に投入し、穏やかに攪拌しながら３時間、７０℃に保った後、ろ過した。ろ液を４０℃で減圧下にて濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥し、固形分の植物抽出物を得た。また、前記植物抽出物の作製にあたっては、前記植物の粗砕物のほか、カタバミ科ゴレンシ属スタ−フル−ツの果実部、バラ科モモ属モモの葉、イネ科イネ属イネの花穂（米）部の粗砕物が好ましい。
【００１５】
＜バラ科モモ属モモより得られる植物抽出物の製造方法＞
モモの葉１（kg）の粗砕物に１０（Ｌ）の１，３−ブチレングリコ−ルを加え２時間リフラックスさせ、濾過し濾液を取り、これを水３（Ｌ）に一気に加え析出した沈殿を濾取し、４０℃で減圧下にて濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥し、植物抽出物を得た。
【００１６】
＜カタバミ科ゴレンシ属スタ−フル−ツより得られる植物抽出物の製造方法＞
スタ−フル−ツの果実の粗粉砕物５０（ｇ）を８０％含水エタノ−ル溶媒５００（mL）に投入し、８０℃で３時間、穏やかに攪拌しながら抽出を行った。その後濾過し、濾液を４０℃で減圧下にて濃縮し、さらに減圧乾燥機で乾燥した後、１，３−ブチレングリコ−ルを加えてスタ−フル−ツの果実抽出物を得た。
【００１７】
本発明の細胞賦活作用を有する植物抽出物は、前記方法に従い製造することも出来るし、市販の植物抽出物として丸善製薬株式会社等より購入し使用することも出来る。本発明の実施例に記載の試験には、前記方法に従い製造された植物抽出物を用いた。
【００１８】
本発明の細胞賦活剤の皮膚外用剤における好ましい含有量は、０．０００１〜１０質量％、より好ましくは、０．００５質量％〜５質量％であり、さらに好ましくは、０．０１質量％〜３質量％である。これは、あまり濃すぎると効果が頭打ちになる場合があり、少なすぎると有効濃度とならない場合があるからである。また、かかる成分は、細胞分化増殖能を低下させる物質を添加し培養することにより皮膚細胞の細胞分化増殖能を低下させた後、被験物質を含む培地にて培養した皮膚細胞の細胞分化増殖能に優れ、さらに、高い安全性及び安定性を有するため、化粧料、医薬部外品、医薬品等への使用が好ましい。
【００１９】
また、本発明の細胞賦活剤は、しみ及び／又はくすみのある人を対象とし、しみ及び／又はくすみを軽減することを目的に使用することが好ましい。しみ及び／又はくすみのある人は、皮膚細胞の機能低下、取り分け、紫外線暴露等の外部刺激によるメラノサイトのメラニン産生亢進、それに続くケラチノサイトへのメラニンの過剰輸送、蓄積を原因とする細胞機能（細胞分化増殖機能）の低下により、ケラチノサイトにおけるメラニン量の増加又は有核細胞数の増加が認められ、皮膚症状としては、重層剥離が多く観察される。このため、本発明の細胞賦活作用を有する成分が使用されるべき対象としては、採取されたケラチノサイトにおいて、メラニン染色をした場合、平均に比してメラニンの量が多く、ケラチノサイトの観察において、平均に比して有核細胞数及び／又は重層剥離が多い人が特に好ましく例示できる。この様な人においては、しみ及び／又はくすみが著しく目立つ場合が存し、そのしみ及び／又はくすみがこの様な構成の組成物を投与することにより著しく改善する。
【００２０】
＜本発明の皮膚外用剤＞
本発明の皮膚外用剤は、前記の皮膚細胞における細胞賦活作用を有する物質の鑑別方法において、細胞分化増殖能を低下させる物質を添加し培養することにより皮膚細胞の細胞分化増殖能を低下させた後、被験物質を含む培地にて培養し、皮膚細胞の細胞分化増殖能を測定し、当該測定値を指標とし、細胞賦活作用を有する成分と判別された成分を含有することを特徴とする。本発明の皮膚外用剤には、前記の皮膚細胞における細胞賦活作用を有する成分を、唯１種含有させることも出来るし、２種以上を組み合わせて含有させることも出来る。この様な成分の内、好ましいものとしては、後記の実施例１に記載の「細胞賦活作用評価」において、メラニン添加により細胞増殖能が低下したケラチノサイトにおいて、被験物質を含有する培地により培養することにより、コントロ−ル群に比較し細胞増殖能が高まる成分、より好ましくは、コントロ−ル群に比較し細胞増殖能が１０％以上増加する成分、より好ましくは、コントロ−ル群に比較し細胞増殖能が１０％以上増加する成分、さらに好ましくは、コントロ−ル群に比較し細胞増殖能が２０％以上増加する成分が好適に例示出来る。かかる成分としては、具体的には、リンドウ科センブリ属、マメ科カンゾウ属、ミカン科サンショウ属、ユキノシタ科アジサイ属、カタバミ科ゴレンシ属、モモ科モモ属、イネ科イネ属に属する植物より得られる植物抽出物より選択される１種又は２種以上よりなる植物抽出物が好適に例示出来、より好ましくは、リンドウ科センブリ属センブリ、マメ科カンゾウ属カンゾウ、ミカン科サンショウ属サンショウ、ユキノシタ科アジサイ属アマチャ、カタバミ科ゴレンシ属スタ−フル−ツ、モモ科モモ属モモ、イネ科イネ属イネより得られる植物抽出物が好適に例示出来る。本発明の皮膚外用剤は、前記の細胞賦活剤が有する作用、即ち、メラニン添加により細胞増殖能が低下したケラチノサイトにおける細胞賦活作用により、色素沈着異常、取り分け、ケラチノサイトへのメラニンの過剰輸送、蓄積により生じるしみ及び／又はくすみなどの色素沈着異常に対する予防又は治療効果を発揮する。
【００２１】
これらの必須成分、任意成分を常法に従って処理し、ロ−ション、乳液、エッセンス、クリ−ム、パック化粧料、洗浄料などに加工することにより、本発明の皮膚外用剤は製造できる。皮膚に適応させることの出来る剤型であれば、いずれの剤型でも可能であるが、有効成分が皮膚に浸透して効果を発揮することから、皮膚への馴染みの良い、ロ−ション、乳液、クリ−ム、エッセンスなどの剤型がより好ましい。
【００２２】
また、本発明の細胞賦活剤を含有する皮膚外用剤の製剤化にあたっては、通常の食品、医薬品、化粧料などの製剤化で使用される任意成分を含有することが出来る。この様な任意成分としては、経口投与組成物であれば、例えば、乳糖や白糖などの賦形剤、デンプン、セルロ−ス、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロ−スなどの結合剤、カルボキシメチルセルロ−スナトリウム、カルボキシメチルセルロ−スカルシウムなどの崩壊剤、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステルなどの界面活性剤、マルチト−ルやソルビト−ルなどの甘味剤、クエン酸などの酸味剤、リン酸塩などの緩衝剤、シェラックやツェインなどの皮膜形成剤、タルク、ロウ類などの滑沢剤、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲルなどの流動促進剤、生理食塩水、ブドウ糖水溶液などの希釈剤、矯味矯臭剤、着色剤、殺菌剤、防腐剤、香料など好適に例示出来る。
【００２３】
また、かかる成分が連続投与される場合、さらには安全性を考慮した場合、経皮的に投与されることが好ましく、経皮的に投与されるものであれば特段の限定なく応用出来、例えば、医薬部外品を含む化粧料、皮膚外用医薬、皮膚外用雑貨等が好ましく例示できる。これは本発明の皮膚外用剤が、比類無き使用感の良さを有しているため、使用感が重要な化粧料に特に好適であるためである。又、その剤形としては、ロ−ション剤形、乳液剤形、クリ−ム剤形、エッセンス剤形等が好適に例示できる。乳化系については、水中油乳化系でも、油中水乳化系でも、水中油中水乳化系や油中水中油乳化系などの多相乳化系でも良い。特に好ましいものは、本発明の効果が著しい、ロ−ション剤形乃至は油中水乳化剤形である。
【００２４】
本発明の皮膚外用剤においては、前記必須成分に加えて、油中水乳化剤形を形成するための乳化剤を含有することが好ましく、該乳化剤としては、有機変性粘土鉱物やジグリセリンモノオレ−トやトリグリセリンジイソステアレ−ト等が好適に例示できる。ジグリセリンモノオレ−トを乳化剤として用いる場合に於いては、必須成分としての量に、乳化のための量を積算し、安定化作用のための役割と、乳化のための役割を兼ねさせることもできる。
【００２５】
前記有機変性粘土鉱物に於いて、有機変性とは、粘土鉱物の一部に有機化合物の一部を共有結合乃至はイオン結合を介して強固乃至は緩やかな結合を生ぜしめ、有機化合物の性質の一部乃至は全部を粘土鉱物に付与させることを意味し、この様な変性としては４級アミン基と粘土鉱物のアニオン部分を結合させる方法、カルボキシル基と粘土鉱物のカチオン部分を結合させる方法等が例示でき、４級アミン基と粘土鉱物のアニオン部分を結合させる方法が特に好ましく例示できる。
【００２６】
粘土鉱物を変性させる４級アミノ基を有する化合物としては、特に限定されるわけではないが、クオタニウムと称される化合物が例示される。クオタニウムとは、低分子の置換第４級アンモニウム塩であって、国際基準化粧品原材料（ＩＮＣＩ）に登録された化粧料原料が好ましい。さらに、粘土鉱物を変性させる４級アミノ基を有する化合物は、クオタニウム化合物のなかでも、従来の皮膚外用剤に含有されるクオタニウム化合物であることが好ましい。従来の皮膚外用剤で使用されているクオタニウム化合物としては、ステアリルトリメチルアンモニウムクロリド、ジメチルジステアリルアンモニウムクロリド等が好ましく例示される。ステアリルトリメチルアンモニウムクロリド、ジメチルジステアリルアンモニウムクロリド等は、粘土鉱物とともに安定な油中水乳化構造を形成することができるので好ましい。
【００２７】
一方、４級アミノ基を有する化合物で変性される粘土鉱物（未変性粘土鉱物）としては、従来の皮膚外用剤に含有される粘土鉱物であれば特段の限定無く使用することができる。従来の皮膚外用剤に含有される粘土鉱物としては、スメクタイト系のヘクトライト、ベントナイトやモンモリロナイト；カオリナイト；イライト；マリ−ン粘土鉱物（海泥）；デザ−トロ−ズ粘土鉱物；パスカライトなどが好ましく挙げられる。これらのうち、油中水乳化構造を安定化させることができるベントナイト、ヘクトライト、モンモリロナイト又はカオリナイトが好ましく例示される。
【００２８】
本発明の皮膚外用剤に含有される４級アミノ基を有する化合物で変性された粘土鉱物の製造方法の一例を以下に説明する。前記未変性粘土鉱物を分散媒に分散させる。該分散剤は水系の溶媒であることが好ましく、水であってもよい。分散未変性粘土鉱物を含む分散液に、さらに４級アミノ基を有する化合物を加え、よく撹拌する。４級アミノ基を有する化合物は、水に溶解されて加えられてもよい。加えられる４級アミノ基を有する化合物の量は、分散未変性粘土鉱物の量に対して０．１〜２０質量％であることが好ましく、０．５〜１５質量％であることがより好ましい。この様な構成を取ることにより、乳化系において、好ましい使用感を呈するためである。撹拌後、分散質を濾取し、脱水、乾固することにより本発明における変性粘土鉱物を得ることができる。あるいは、分散質を濾取することなく、減圧濃縮することにより分散剤を除去して乾固させることにより、本発明における変性粘土鉱物を得ることもできる。得られた変性粘土鉱物は、好ましくは所望のサイズ（粒径が１〜１０００μｍであることが好ましい）に粉砕され、本発明の皮膚外用剤に含有される。
【００２９】
本発明における変性粘土鉱物は、前述したように調製して使用されることもできるが、市販されているものを使用することもできる。市販されている変性粘土鉱物には、化粧料などの皮膚外用剤などとして用いられているものもある。市販されている変性粘土鉱物としては、例えば、エレメンティス社より「ベントン３８Ｖ」の名称で販売されている、ジメチルジステアリルアンモニウム変性ヘクトライトなどが好ましく例示される。
【００３０】
本発明の皮膚外用剤においては、かかる成分は０．５〜１０質量％好ましく含有され、より好ましくは１〜５質量％含有される。かかる成分は、前記の含有量の範囲において、乳化剤として、高内相の油中水乳化剤形を形成すべく働く。
【００３１】
ジグリセリンモノオレ−ト及び／又はトリグリセリンジイソステアレ−トを乳化剤として含有する場合には、かかる乳化剤の質量の０．５〜２倍のマルチト−ルやソルビト−ルの様な多価アルコ−ルをともに含有させることが好ましい。前記ジグリセリンモノオレ−トの化粧料用の原料としては、「ニッコ−ルＤＧＭＯ−Ｃ」（日本サ−ファクタント株式会社製）が好ましく例示できるし、トリグリセリンジイソステアレ−トの化粧料用の原料としては、「エメレスト２４５２」（エメリ−社製）などが好ましく例示できる。かかる成分の好ましい含有量は、皮膚外用剤全量に対して、１〜１０質量％であり、より好ましくは２〜７質量％である。これはこの量範囲を逸脱すると乳化できない場合や安定性が損なわれる場合が存するためである。
【００３２】
本発明の皮膚外用剤は、油中水乳化剤形に形態を取るため、油中水乳化剤形の使用感、仕上がり感の欠点を補うために、シリコ−ン、特に好ましくは、シクロメチコン及び／又は粘度１ｍＰａ・ｓ以下のジメチコンを含有することが好ましく、該シリコ−ンの含有量としては、化粧料全量に対しては、１０〜５０質量％含有することが好ましく、より好ましくは、２０〜４０質量％であり、シクロメチコン及び粘度１ｍＰａ・ｓ以下のジメチコンの含有量の和が油相全量に対して、５０質量％以上、より好ましくは５５質量％以上であることが好ましい。
【００３３】
又、本発明の皮膚外用剤では、乳化剤として前記有機変性粘土鉱物を用いる場合、前記有機変性粘土鉱物の乳化作用を補助する意味で、ＰＯＥ変性メチルポリシロキサン、ＰＯＰ変性メチルポリシロキサン、ＰＯＰ・ＰＯＥ変性メチルポリシロキサン等のポリエ−テル変性メチルポリシロキサンを含有することが好適に例示できる。かかるポリエ−テル変性メチルポリシロキサンの好ましい含有量は、０．５〜５質量％、１〜３質量％がより好ましい。
【００３４】
乳化剤として前記有機変性粘土鉱物を用いる場合、更に、上記の成分以外の好ましい任意成分としては、乳化状態を安定化できる、多価アルコ−ルが例示できる。特に、グリセリン、ジグリセリン、ジプロピレングリコ−ルが好適に例示できる。かかる成分は唯一種を含有することもできるし、二種以上を組み合わせて含有させることもできる。好ましい含有量は、総量で、皮膚外用剤全量に対して、５〜３０質量％であり、より好ましくは１０〜２５質量％である。更に加えて、１，２−ペンタンジオ−ル、１，２−ヘキサンジオ−ル及び１，２−オクタンジオ−ルから選択される１種乃至は２種以上を１〜７質量％含有させることも、防腐力を向上させる見地から好ましい。
【００３５】
これらに加え、特に好ましい成分としては、前記有機変性粘土鉱物の乳化性を補助する意味で、ポリエ−テル変性シリコ−ンが例示できる。ポリエ−テル変性シリコ−ンとしては、ポリエチレングリコ−ル変性メチルシロキサンやポリプロピレングリコ−ル変性メチルシロキサン、ポリエチレングリコ−ル・ポリプロピレングリコ−ル変性メチルシロキサンなどが好ましく例示できる。特に好ましいものは、ポリエチレングリコ−ル（１０）変性メチルシロキサンであり、これには、例えば、信越化学株式会社製の「シリコ−ンKF６０１７」等が市販品として存する。この様なポリエ−テル変性シリコ−ンの好ましい含有量は、総量で、皮膚外用剤全量に対して、０．５〜３０質量％であり、より好ましくは１〜２５質量％である。
【００３６】
上記以外にも、本発明の皮膚外用剤に於いては、本発明の効果を損ねない限度に於いて、通常使用される任意成分を含有することもできる。この様な任意成分としては、例えば、マカデミアナッツ油、アボガド油、トウモロコシ油、オリ−ブ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワ−油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パ−ム油、液状ラノリン、硬化ヤシ油、硬化油、モクロウ、硬化ヒマシ油、ミツロウ、キャンデリラロウ、カルナウバロウ、イボタロウ、ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、ホホバロウ等のオイル、ワックス類；流動パラフィン、スクワラン、プリスタン、オゾケライト、パラフィン、セレシン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類；オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸等の高級脂肪酸類；セチルアルコ−ル、ステアリルアルコ−ル、イソステアリルアルコ−ル、ベヘニルアルコ−ル、オクチルドデカノ−ル、ミリスチルアルコ−ル、セトステアリルアルコ−ル等の高級アルコ−ル等；イソオクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、イソステアリン酸ヘキシルデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバチン酸ジ−２−エチルヘキシル、乳酸セチル、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ−２−エチルヘキサン酸エチレングリコ−ル、ジカプリン酸ネオペンチルグリコ−ル、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸トリメチロ−ルプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロ−ルプロパン、テトラ−２−エチルヘキサン酸ペンタンエリトリット等の合成エステル油類等の油剤類；脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノ−ルアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類；塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類；イミダゾリン系両性界面活性剤（２−ココイル−２−イミダゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類；ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレ−ト、セスキオレイン酸ソルビタン等）、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコ−ル脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコ−ル等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエ−テル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエ−ト、モノステアリン酸ポリオキエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−ソルビットモノラウレ−ト等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−グリセリンモノイソステアレ−ト等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコ−ルモノオレ−ト、ＰＯＥジステアレ−ト等）、ＰＯＥアルキルエ−テル類（ＰＯＥ２−オクチルドデシルエ−テル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエ−テル類（ＰＯＥノニルフェニルエ−テル等）、プルロニック型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエ−テル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２−デシルテトラデシルエ−テル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類；ポリエチレングリコ−ル、グリセリン、エリスリト−ル、ソルビト−ル、キシリト−ル、マルチト−ル、プロピレングリコ−ル、２，４−ヘキサンジオ−ル等の多価アルコ−ル類；ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等の保湿成分類；表面を処理されていても良い、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類、；表面を処理されていても良い、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛の無機顔料類；表面を処理されていても良い、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパ−ル剤類；レ−キ化されていても良い赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類；ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマ−等の有機粉体類；パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤；アントラニル酸系紫外線吸収剤；サリチル酸系紫外線吸収剤；桂皮酸系紫外線吸収剤；ベンゾフェノン系紫外線吸収剤；糖系紫外線吸収剤；２−（２’−ヒドロキシ−５’−ｔ−オクチルフェニル)ベンゾトリアゾ−ル、４−メトキシ−４’−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン等の紫外線吸収剤類；エタノ−ル、イソプロパノ−ル等の低級アルコ−ル類；ビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＢ６塩酸塩、ビタミンＢ６トリパルミテ−ト、ビタミンＢ６ジオクタノエ−ト、ビタミンＢ２又はその誘導体、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１５又はその誘導体等のビタミンＢ類；α−トコフェロ−ル、β−トコフェロ−ル、γ−トコフェロ−ル、ビタミンＥアセテ−ト等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノン等のビタミン類等；フェノキシエタノ−ル等の抗菌剤などが好ましく例示できる。
【００３７】
以下に、本発明に付いて、実施例を挙げて更に詳しく説明を加えるが、本発明がかかる実施例のみに限定されないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００３８】
＜試験例１： 本発明の細胞賦活作用評価＞
以下の手順に従い、本発明の皮膚細胞における細胞賦活作用（細胞増殖抑制作用）を評価した。尚、本発明の植物抽出物は、丸善製薬株式会社より市販の植物抽出物として購入した植物抽出物を用いた。
１） 正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）（倉敷紡績株式会社）を４８well plateに３×１０４（cells/well）播種し、播種と同時にジメチルスルホキシド（DMSO、和光純薬工業株式会社）に懸濁した合成メラニン（SIGMA社）を終濃度１．５×１０-3 （％）となるよう添加した。
２） 被験物質（植物抽出液の固形分）をDMSO（和光純薬工業株式会社）により溶解し、１０（w/v％）エキス液を作製した。それらを１/１０００量ずつ添加した培地（Humedia-KG２、倉敷紡績株式会社）を作製し、播種６時間後にその培地と交換し、さらに培養を継続した（各被験物質の最終固形分濃度は１×１０−２（w/v％））。
３） 播種翌日、培地を除去しPBSで１回プレ−トを洗浄した後、生細胞数測定試薬SF（ナカライテスク社）溶液を添加した培地に交換し、３７℃、1時間呈色反応を行った。
４） 反応後、４５０（nm）の吸光度をマイクロプレ−トリ−ダ−Benchmark Plus（Bio-Rad Laboratories）を用いて測定した。コントロ−ルとして被験物質を含まないサンプルを前記同様に調製し、コントロ−ルに対する被験物質を含むサンプルの吸光度の百分率を求め細胞賦活作用を評価した。結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】
前記植物抽出物は、何れも顕著な細胞賦活作用（細胞増殖抑制作用）を示した。尚、前記植物抽出物の内、特に、カラバミ科ゴレンシ属スタ−フル−ツより得られる植物抽出物、モモ科モモ属モモより得られる植物抽出物の細胞賦活作用は優れていた。かかる植物抽出物は、細胞賦活作用による皮膚の色素沈着異常、しみ、くすみなどの皮膚老化現象に対し、優れた予防又は改善効果を示すことが期待出来る。また、また、本評価系は、皮膚のメラノサイトにおけるメラニン産生亢進、それに続くケラチノサイトへのメラニンの過剰移輸、蓄積により生じるしみ及び／又はくすみなどの色素沈着異常により細胞機能（細胞分化増殖機能）が低下したケラチノサイトのモデル評価系であるため、本評価系において細胞賦活作用を示した前記植物抽出物は、特に、採取されたケラチノサイトにおいて、メラニン染色をした場合、平均に比してメラニンの量が多く、ケラチノサイトの観察において、平均に比して有核細胞数及び／又は重層剥離が多い人を対象とした場合に優れた効果が期待出来る。
【実施例２】
【００４１】
＜製造例２： 本発明の皮膚外用剤の製造方法１＞
表２及び表３に記載の処方に従って、本発明の皮膚外用剤である化粧料（ロ−ション）を作製した。即ち、処方成分を８０℃に加熱し、攪拌可溶化し、攪拌冷却して本発明の皮膚外用剤（化粧料１〜７）を作製した。また、表２中、「本発明の細胞賦活剤」を「アルブチン」に置換した比較例１、「本発明の細胞賦活剤」を「水」に置換した比較例２を作製した。
【００４２】
【表２】
【００４３】
【表３】
【実施例３】
【００４４】
＜試験例２： 本発明の細胞賦活剤を含有する皮膚外用剤の色素沈着抑制効果評価１＞
実施例２に記載の方法に従い製造された化粧料１〜７、比較例１及び２の化粧料を用いて、色素沈着抑制効果を調べた。メラニン量が平均より多いパネラ−の選択にあたっては、皮膚から粘着テ−プストリッピングにより採取したケラチノサイトの標本を、硝酸銀水溶液を用いたメラニン染色を行うことにより可視化し、これを顕微鏡下観察することにより判定した。また、判定にあたっては、平均的な存在状況を中心にスコア化して判別した。さらに、前記パネラ−の内、角層標本を用い有核細胞の出現率が平均よりも高い、乃至は、重層剥離の度合いが平均よりも多い人を観察により選択しパネラ−とした。前記の特性を有する自由意思で参加したパネラ−の両上腕内側部に１．５ｃｍ×１．５ｃｍの部位を上下２段に分け、合計９ヶ所設け、最少紅斑量（１ＭＥＤ）の紫外線照射を１日１回、３日連続して３回照射した。照射終了後１日より、１日１回２８日連続してサンプル５０μLを塗布した。１部位は無処置部位とした。塗布終了２４時間後に色彩色差計（ＣＲ-３００、コニカミノルタ株式会社）にて各試験部位の皮膚明度（Ｌ＊値）を測定し、無処置部位のＬ値に対するΔＬ＊値を算出した。Ｌ＊値は、色素沈着の程度が強いほど低い値となる。従って、ΔＬ＊値が大きい程、色素沈着が抑制されたと判断することができる。結果を表４に示す。これにより、本発明の皮膚外用剤である化粧料１〜７は、優れた色素沈着抑制効果を示すことが分かる。本評価系において細胞賦活作用を示した前記植物抽出物は、特に、採取されたケラチノサイトにおいて、メラニン染色をした場合、平均に比してメラニンの量が多く、ケラチノサイトの観察において、平均に比して有核細胞数及び／又は重層剥離が多い人を対象とした場合に優れた効果を有する。本発明の化粧料１〜７の前記効果は、化粧料に配合された細胞賦活作用を有する成分の作用によるものである。
【００４５】
【表４】
【実施例４】
【００４６】
＜製造例２： 本発明の皮膚外用剤の製造方法２＞
実施例２に記載の化粧料５及び化粧料６の処方成分中、「本発明の細胞賦活剤」の濃度を表５に記載の濃度に変更した化粧料８〜１１を作製した。また、処方成分中の「本発明の細胞賦活剤」の濃度増減による質量％変化は、処方成分中の「水」の質量％により調整した。
【００４７】
【表５】
【実施例５】
【００４８】
＜試験例３： 本発明の細胞賦活剤を含有する皮膚外用剤の色素沈着抑制効果評価２＞
前記の実施例３に記載の方法に従い化粧料８〜１１に関し色素沈着抑制効果を評価した。結果を表６に示す。化粧料８〜１１は、何れも色素沈着抑制効果を示した。本評価系において細胞賦活作用を示した前記植物抽出物は、特に、採取されたケラチノサイトにおいて、メラニン染色をした場合、平均に比してメラニンの量が多く、ケラチノサイトの観察において、平均に比して有核細胞数及び／又は重層剥離が多い人を対象とした場合に優れた効果を有する。本発明の化粧料８〜１１の前記効果は、化粧料に配合された細胞賦活剤が有する作用によるものである。
【００４９】
【表６】
【実施例６】
【００５０】
＜製造例３： 本発明の皮膚外用剤の製造方法３＞
表７及び表８に記載の処方に従い、本発明の油中水乳化製剤（クリ−ム）を作製した。即ち、イ、ロ、ハの成分をそれぞれ８０℃に加温し、イの中にニを加えて溶解させ、混練してゲルを形成させ、これにロを加え希釈し、これに攪拌下徐々にハを加えて乳化し、攪拌冷却し、本発明の皮膚外用剤である、油中水乳化剤形の化粧料１２〜１８を作製した。また、表７に記載の成分中、「本発明の細胞賦活剤」を「４−ブチルレゾルシノ−ル」に置換した比較例３、「本発明の細胞賦活剤」を「水」に置換した比較例４を作製した。
【００５１】
【表７】
【００５２】
【表８】
【実施例７】
【００５３】
＜試験例４： 本発明の細胞賦活剤を含有する皮膚外用剤の色素沈着抑制効果評価３＞
前記実施例３に記載の方法に従い製造した化粧１２〜１８、比較例３及び４に関し、前記実施例３に記載の方法に従い色素沈着抑制作用評価した。結果を表９に示す。
【００５４】
【表９】
【実施例８】
【００５５】
表７及び表８に記載した化粧料１７の処方成分中、「ベントン３８Ｖ」を「シリコ−ンKF６０１７」に置換した化粧料１９、「１，２−ペンタンジオ−ル」を「ポリエチレングリコ−ル４００」に置換した化粧料２０を作製し、実施例３に記載の方法に従い、紫外線照射による色素沈着予防効果を検討したところ、化粧料１９は、△Ｌ＊値は、０．５６を示し、化粧料２０は、△Ｌ＊値は、０．４９を示し、何れも化粧料においても紫外線照射後の色素沈着に対する予防効果がほとんど認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明は、色素沈着の予防又は改善に有用な皮膚外用剤に応用出来る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧料（但し、医薬部外品を含む）等に好適な細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法、並びに、本鑑別方法により選択された細胞賦活剤、及び、当該成分を含有する皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、生体と外部環境との境界に存在し、生体を外界からの刺激より防御するバリア機能に加え、水分蒸散を防ぐ保湿機能等の重要な役割を担っている。皮膚は、表皮、真皮、皮下組織により構成される。表皮層に存在する基底層、取り分け、角化細胞（ケラチノサイト）及び色素細胞（メラノサイト）は、肌荒れ、色素沈着、シミやシワなどの皮膚症状に深く関係することが、これまでに明らかにされている。また、表皮層は、皮膚の表面に存在するために、遺伝的要因に加え、紫外線暴露、湿度変化、温度変化等の種々のストレスを常に受け続けることにより機能低下が生じ易い。ケラチノサイト及びメラノサイトに付いては、前記要因による細胞機能低下により、皮膚のタ−ンオ−バ−速度が遅くなり、皮膚老化現象や肌荒れ症状が皮膚症状の悪化が顕在化し易くなる。また、皮膚細胞機能の低下は、ケラチノサイトが角層表面より剥がれ落ち難くさせるほか、メラノサイトよりケラチノサイトに移輸されたメラニンの排出が遅くなり色素沈着や肌のくすみの原因となる。このため、ケラチノサイトの加齢等の要因による機能低下を回復又は向上させる成分には、色素沈着や肌のくすみ等へ予防又は治療効果が期待出来る。この様な成分としては、細胞賦活剤が広く知られている。
【０００３】
一方、「細胞賦活作用」という用語には、多様な薬理作用が包含され使用されている。部分的な生物活性を評価する狭義の細胞賦活作用には、細胞内の局所的な生物活性を評価するATP産生促進作用（例えば、特許文献１、特許文献２を参照）、血管内皮細胞増殖因子産生亢進作用（例えば、特許文献３を参照）等の生物活性が存在する。これに対し、細胞全体を評価する広義の細胞賦活作用としては、細胞分化増殖作用評価等が存在する。細胞全体の賦活作用を評価することが出来る細胞増殖能を評価する方法は、実際により近い生体反応現象を評価することが出来る利点が存する。また、細胞全体における細胞賦活作用は、ATP産生をはじめとする複雑な生体内反応により制御されているため、狭義の細胞賦活作用を個別に評価することにより、細胞全体の細胞賦活作用を総合的に推察することは難しい。加えて、細胞賦活作用を評価する場合に、正常細胞を使用するか、又は、ストレスが付加された細胞を用いるかにより、その生体反応における評価結果が異なることが存し、その解釈は複雑化する。この様な状況のため、細胞賦活作用には、細胞の活性化作用という共通の意味は存するが、その生物学的な意味及び作用内容は大きく異なることも少なくない。この様な細胞賦活作用を有する成分の内、ケラチノサイトにおける細胞賦活作用を有する成分としては、モモ、センキョウ、サンザシ、カミツレ、マチルスオドラチシマ、トウキ、ワイルドタイム、サンショウ、クスノハガシワ、シャクヤク、オニイチゴ、ケイヒ、ショウブ、タイソウより得られる植物抽出物等にATP産生促進作用（例えば、特許文献１、特許文献２を参照）が存することが知られている。また、角化細胞における分化増殖作用を有する成分としては、アルニカ、ウコン、オトギリソウ、ガンビ−ルノキ、ゲンノショウコ、コウボクシャクヤク、センキュウ、トウキ、トウチュウカソウ、ナツメ、ニンジン、ビロウドアオイ、フキタンポポ、ブクリョウタケ、モモ、ユキノシタより得られる植物抽出物等（例えば、特許文献４を参照）が知られている。しかしながら、かかる細胞賦活作用は、何れも正常細胞を使用したATP産生促進作用、言い換えれば、正常細胞による局所的な細胞賦活作用を評価したものである。
【０００４】
また一般的に、正常細胞又は正常動物等を用いた評価系は、細胞の入手及び評価系の構築が容易であるが、疾患等の症状を反映しているとは言い難いことが多い。このため、生物活性を有する有効成分を評価する際には、症状を反映したモデル細胞又は動物等を用いた評価系が、より症状を反映した評価系であると考えられている。しかしながら、皮膚症状の細胞賦活作用に関するモデル評価系は、ほとんど知られていない。さらに、皮膚細胞において実際に観察されるメラノサイトのメラニン産生亢進、更には、ケラチノサイトへのメラニンの過剰移送及び蓄積により角化細胞が不活性化されしみ又はくすみが生じる状態を反映した細胞を用いた評価系等は全く知られていない。本発明者等は、皮膚細胞の細胞賦活作用評価方法、取り分け、ケラチノサイトにおけるメラニン添加による細胞賦活作用評価系を確立した。当該評価系は、メラノサイトのメラニン産生亢進、並びに、ケラチノサイトへの過剰移送、蓄積によるケラチノサイトの細胞機能低下により生じるしみ又はくすみを反映したモデル評価系であり、具体的には、ケラチノサイトへのメラニン添加により機能低下が生じているケラチノサイトを使用し、その細胞分化増殖能を測定することにより細胞賦活作用を評価することが可能である。かかる評価系において細胞賦活作用を有する成分は、通常の色素沈着の予防又は改善作用に加え、ケラチノサイトにおけるメラニンの過剰移送、蓄積により生じる消え難いしみ、くすみ、更には、重層剥離などの症状を呈する色素沈着の予防又は改善効果が大いに期待出来る。本発明者等は、かかる評価系を利用して細胞賦活剤を探索し、しみ又はくすみ、並びに、色素沈着予防又は改善用として応用可能な、優れた細胞賦活作用を有する成分を見出した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２５６２７２号
【特許文献２】特開２００９−０８４２１６号
【特許文献３】特開平１１−２８６４３２号
【特許文献４】特開２００３−２９２４３２号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、この様な状況下になされたものであり、ケラチノサイトにおけるメラニンの過剰輸送及び蓄積によるしみ、くすみなどの色素沈着症状の予防又は改善用に好適な、細胞賦活剤の鑑別方法、更には、細胞賦活剤及び当該成分を含有する皮膚外用剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この様な状況を鑑みて、本発明者等は、色素沈着予防又は改善用、取り分け、ケラチノサイトへのメラニンの過剰輸送及び蓄積により生じるしみ及び／又はくすみなどの色素沈着予防又は改善作用に優れる細胞賦活剤を求め、鋭意努力を重ねた結果、皮膚細胞に細胞分化増殖能を低下させる物質を添加し培養することにより皮膚細胞の細胞分化増殖能を低下させた後、被験物質を含む培地にて培養し、皮膚細胞の細胞分化増殖能を測定し、当該測定値を指標とし、細胞賦活作用を有する成分を判別することにより、この様な細胞賦活剤が効率的に、且つ、簡便にスクリ−ニング出来ることを見出した。さらに、かかる評価系を利用しスクリ−ニングを実施することにより細胞賦活剤を見出し、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に示す通りである。
＜１＞ 皮膚細胞の細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法であって、皮膚細胞に細胞分化増殖能を低下させる物質を添加し培養することにより皮膚細胞の細胞分化増殖能を低下させた後、被験物質を含む培地にて培養し、皮膚細胞の細胞分化増殖能を測定し、当該測定値を指標とし、細胞賦活作用を有する成分を判別することを特徴とする、細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法。
＜２＞ 前記皮膚細胞が、角化細胞（ケラチノサイト）であることを特徴とする、＜１＞に記載の細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法。
＜３＞ 前記皮膚細胞の細胞分化増殖能を低下させる物質がメラニンであることを特徴とする、＜１＞又は＜２＞に記載の細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法。
＜４＞ 前記細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法により鑑別される、細胞賦活作用剤。
＜５＞ 前記細胞賦活作用を有する成分が、リンドウ科センブリ属、マメ科カンゾウ属、ミカン科サンショウ属、ユキノシタ科アジサイ属、カタバミ科ゴレンシ属、モモ科モモ属、イネ科イネ属に属する植物より得られる植物抽出物より選択される１種又は２種以上よりなることを特徴とする、＜４＞に記載の細胞賦活剤。
＜６＞ 前記リンドウ科センブリ属、マメ科カンゾウ属、ミカン科サンショウ属、ユキノシタ科アジサイ属、カタバミ科ゴレンシ属、イネ科イネ属に属する植物が、リンドウ科センブリ属センブリ、マメ科カンゾウ属カンゾウ、ミカン科サンショウ属サンショウ、ユキノシタ科アジサイ属アマチャ、カタバミ科ゴレンシ属スタ−フル−ツ、モモ科モモ属モモ、イネ科イネ属イネであることを特徴とする、＜４＞又は＜５＞に記載の細胞賦活剤。
＜７＞ 前記細胞賦活作用が、角化細胞の分化増殖促進作用によるものであることを特徴とする、＜４＞〜＜６＞の何れか一項に記載の細胞賦活剤。
＜８＞ 前記角化細胞の分化増殖能の低下が、メラニン添加による角化細胞の分化増殖能の低下であることを特徴とする、＜４＞〜＜７＞の何れか一項に記載の細胞賦活剤。
＜９＞ 前記細胞賦活剤は、しみ及び／又はくすみのある人において、しみ及び／又はくすみを軽減する作用を有することを特徴とする、＜４＞〜＜８＞の何れか一項に記載の細胞賦活剤。
＜１０＞ しみ及び／又はくすみのある人が、採取されたその人の角層細胞において、平均に比較しメラニン量が多く、且つ、有核細胞の出現率が平均よりも高い、乃至は、重層剥離の度合いが平均よりも多い人であることを特徴とする、＜９＞に記載の細胞賦活剤。
＜１１＞ ＜４＞〜＜１０＞の何れか一項に記載の細胞賦活剤を含有することを特徴とする、皮膚外用剤。
＜１２＞ 前記細胞賦活剤を、皮膚外用剤全量に対し、０．００１質量％〜１０質量％含有することを特徴とする、＜１１＞に記載の皮膚外用剤。
＜１３＞ 色素沈着予防又は改善用であることを特徴とする、＜１１＞又は＜１２＞に記載の皮膚外用剤。
＜１４＞ 化粧料（但し、医薬部外品を含む）であることを特徴とする、＜１１＞〜＜１３＞の何れか一項に記載の皮膚外用剤。
＜１５＞ 角化細胞を、細胞分化抑制作用を有する物質を含む培地で培養し、被験物質非添加の場合に比較し、被験物質添加の場合の方が、細胞分化が著しかった被験物質を細胞賦活剤として含むことを特徴とする、＜１１＞〜＜１４＞の何れか一項目に記載の皮膚外用剤。
＜１６＞ 前記細胞分化抑制作用を有する物質が、メラニンであることを特徴とする、＜１１＞〜＜１５＞の何れか一項目に記載の皮膚外用剤。
＜１７＞ 更に、好ましい製剤上の任意成分を含有することを特徴とする、＜１１＞〜＜１６＞の何れか一項に記載の組成物。
＜１８＞ 細胞分化抑制作用を有する物質を含有する、細胞賦活剤のスクリ−ニング用の培地。
＜１９＞ 前記細胞分化抑制作用を有する物質が、メラニンであることを特徴とする、＜１８＞に記載の培地。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
＜本発明の細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法＞
本発明の細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法は、皮膚細胞における細胞賦活作用を有する成分を判別するための鑑別方法であって、細胞分化増殖能を低下させる物質を添加し培養することにより皮膚細胞の細胞分化増殖能を低下させた後、被験物質を含む培地にて培養し、皮膚細胞の細胞分化増殖能を測定し、当該測定値を指標とし、細胞賦活作用を有する成分を判別することを特徴とする。本発明の細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法において、細胞賦活作用を有する成分とは、細胞の分化増殖能を低下させる物質を添加し培養することにより低下した皮膚細胞の細胞分化増殖能を向上させる成分であれば、特段の限定なく適応することが出来る。また、前記細胞分化増殖能評価に用いる皮膚細胞としては、皮膚細胞であれば特段の限定なく適応することが出来るが、より好ましくはケラチノサイトが好適に例示出来る。さらに、皮膚細胞の分化増殖能を低下させる物質としては、当該作用を有する物質であれば特段の限定なく適応することが出来るが、より好ましくは、メラニンが好適に例示出来る。本発明における細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法にて判別される細胞賦活剤に関し、好ましいものを具体的に例示すれば、後記の実施例に記載の「細胞賦活作用評価」において、コントロ−ル群に比較し細胞増殖能が向上する成分が好適に例示出来、より好ましくは、コントロ−ル群に比較し細胞増殖能が１０％以上増加する成分、さらに好ましくは、コントロ−ル群に比較し細胞増殖能が２０％以上増加する成分が好適に例示出来る。皮膚に存在する細胞は、遺伝的な要因に加え、紫外線暴露、湿度変化、温度変化等の種々のストレスを常に受け続けるためその機能低下が生じ易い。また、皮膚細胞であるケラチノサイトは、皮膚の表皮層における基底層に存在し、色素沈着、シミやくすみ、シワなどの老化現象に深く関与することが知られている。特に、くすみ、シミ等の色素沈着異常が関与する皮膚症状とケラチノサイトとの関係としては、メラノサイトにおけるメラニン産生亢進、並びに、それに伴うケラチノサイトへのメラニンの過剰移送、蓄積により生じるケラチノサイトの機能低下が知られている。実際、この様な角化細胞の細胞機能低下は、通常の色素沈着に加え、メラニンの過剰蓄積により消え難いしみやくすみ、重層剥離などの角質細胞が剥離し難くなった状態等の皮膚症状の発生を反映しているものと考えられる。このため、メラニンを添加することにより細胞分化増殖促進作用を低下させたケラチノサイトの細胞分化増殖促進作用を指標とした細胞賦活剤の鑑別方法は、皮膚細胞、取り分け、ケラチノサイトの細胞機能が低下した皮膚状態を反映した有用な鑑別方法であり、該鑑別方法により判別される細胞賦活剤は、前記症状を呈している色素沈着の予防又は改善作用を有する成分として期待出来る。また、かかる評価系は、ケラチノサイトにおけるメラニンの過剰移送、蓄積により生じる細胞機能低下を反映するため、特に、くすみやしみの多い人、重層剥離の程度が高いなどの皮膚症状を呈するにおいては、有用な細胞賦活剤をスクリ−ニングするのに適している。くすみやしみの多い人、又は、重層剥離などの肌症状を呈する人は、皮膚細胞、取り分け、ケラチノサイトのタ−ンオ−バ−そのものが遅くなり、ケラチノサイトにメラニン顆粒が蓄積し、細胞機能が低下している状態である場合が多い。この様な状態のケラチノサイトに本発明の細胞賦活剤を投与することにより、タ−ンオ−バ−を促進し、この様なくすみやしみ、重層剥離などの皮膚症状を解消出来る。くすみやしみの多い人は、例えば、採取されたその人のケラチノサイトにおいて、平均に比較しメラニン量が多く、且つ、有核細胞の出現率が平均よりも高い乃至は、重層剥離の度合いが平均よりも多い人を以て定義づけることができる。この様な示性値を持った人を対象として、本発明の細胞賦活剤を投与することにより、この様なくすみを解消することが出来る。
【０００９】
また、本発明の細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法に関し、細胞賦活作用を評価する方法としては、皮膚細胞の分化増殖能を低下させる物質を添加し培養することにより細胞増殖能を低下させた後、被験物質を添加した培地により培養することにより細胞分化増殖能を測定する方法であれば、特段の限定なく適応することが出来る。細胞増殖能力を測定する方法に関しては、具体例を挙げれば、同仁化学研究所より市販されているCell Counting Kit等を使用し測定することも出来し、後述する実施例１に記載の方法の通り、生細胞数測定試薬を添加し培養した後、吸光度をマイクロプレ−トリ−ダ−で測定することも出来る。また、かかる測定方法に使用するケラチノサイトの培地としては、通常のケラチノサイトの培養に用いられる培地であれば特段の限定なく適応出来るが、より好ましくは、Humedia−KG２（倉敷紡績株式会社）が好ましい。また、細胞分化増殖能測定における測定感度を向上させるため、Humedia−KG２培地に含まれるハイドロコルチゾン（HC）等の成長因子を除くことも場合によっては好ましい。かかる細胞賦活作用評価系の内、本発明における細胞賦活作用を有する成分としては、後述する実施例１に記載の測定方法が好適に例示出来る。本発明の実施例１において細胞賦活作用を有する成分とは、コントロ−ル群に比較し細胞分化増殖能が高まる成分、より好ましくは、コントロ−ル群に比較し細胞増殖能が１０％以上増加する成分、さらに好ましくは、コントロ−ル群に比較し細胞増殖能が２０％以上増加する成分が好適に例示出来る。
【００１０】
＜本発明の皮膚外用剤の必須成分である細胞賦活作用を有する成分＞
本発明の細胞賦活剤は、細胞分化増殖能を低下させる物質を添加し培養することにより皮膚細胞の細胞分化増殖能を低下させた後、被験物質を含む培地にて培養し、皮膚細胞の細胞分化増殖能を測定し、当該測定値を指標とし、細胞賦活作用を有する成分と判別された細胞賦活剤であることを特徴とする。本発明の細胞賦活剤は、前記の細胞分化増殖能を指標とする細胞賦活作用を有する成分の判別方法により細胞賦活作用を有する成分であると判別される成分であれば特段の限定なく適応することが出来る。前記細胞賦活作用を有する成分の内、より好ましいものを挙げれば、後記実施例１に記載の「細胞賦活作用評価」において細胞賦活作用を有する成分が好適に例示出来る。尚、後述する「細胞賦活作用評価」において細胞賦活作用を有する成分とは、コントロ−ル群に比較し細胞分化増殖能が高まる成分、より好ましくは、コントロ−ル群に比較し細胞増殖能が１０％以上増加する成分、さらに好ましくは、コントロ−ル群に比較し細胞増殖能が２０％以上増加する成分が好適に例示出来る。前記の本発明の細胞賦活剤の内、より好ましくは、リンドウ科センブリ属、マメ科カンゾウ属、ミカン科サンショウ属、ユキノシタ科アジサイ属、カタバミ科ゴレンシ属、モモ科モモ属、イネ科イネ属に属する植物より得られる植物抽出物より選択される１種又は２種以上よりなる植物抽出物が好適に例示出来、より好ましくは、リンドウ科センブリ属センブリ、マメ科カンゾウ属カンゾウ、ミカン科サンショウ属サンショウ、ユキノシタ科アジサイ属アマチャ、カタバミ科ゴレンシ属スタ−フル−ツ、モモ科モモ属モモ、イネ科イネ属イネより得られる植物抽出物が好適に例示出来る。尚、本発明における植物抽出物とは、植物抽出物自体、植物抽出物を分画、精製した分画、植物抽出物乃至は分画、精製物の溶媒除去物の総称を意味する。
【００１１】
本発明の細胞賦活剤は、前記植物より得られる植物抽出物を唯１種のみ含有することも出来るし、２種以上を組み合わせて含有させることも出来る。ここで、植物由来の植物抽出物とは、植物抽出物自体、植物抽出物を分画、精製した分画、植物抽出物乃至は分画、精製物の溶媒除去物の総称を意味する。リンドウ科センブリ属センブリは、日本、朝鮮半島、中国原産の山や野の乾いた草地や木の下に生える草であり、日本全土に分布し、苦い胃の薬として有名である。マメ科カンゾウ属カンゾウは、ヨ−ロッパ南部を原産地とする多年草であり、日本においては３００年以上前から山梨県をはじめとする日本各地で栽培されている。カンゾウには、グリチルリチン等の抗炎症成分が含有されることが広く知られている。また、根又は根茎を乾燥させたものを生薬として使用するほか、抽出物や粉末を甘味料として利用している。ミカン科サンショウ属サンショウは、東アジア、日本を原産地とする落葉低木である。日本においては、関東以西の本州、四国、九州などに生育し、古くから葉や果実が香辛料として利用されている。ユキノシタ科アジサイ属アマチャは、日本、中国などを原産の落葉小低木であり、本州、四国、九州等の日本全国で生育し、甘味飲料や加工食品の甘味原料として使用されている。カタバミ科ゴレンシ属スタ−フル−ツ（和名：五歛子）は、熱帯アジアを原産地とする常緑の木本であり、日本においては、沖縄県、宮崎県などで栽培されている。実は、食用として使用される。バラ科モモ属モモは、中国を原産地とする落葉小高木であり、その果実をモモと呼ぶ。日本国内においては、福島県、山梨県、長野県、岡山県など全国で栽培されている。また、その果実は、食用として利用され、血行改善、利尿作用などがあるとされている。本発明の細胞賦活作用を有する植物抽出物を得るために好ましい部位としては、葉が好適に例示出来る。イネ科イネ属イネは、熱帯アジアを原産地とする穀物であり、日本全国で栽培されている。実部分は、食料、飼料、醸造用等に使用されるほか、わらは、農具、飾り等に利用されている。また、食用とされる米には、消化不良、腹痛等に効果があるとされている。本発明の細胞賦活作用を有する植物抽出物を得るために好ましい部位としては、実部分が好適に例示出来、より好ましくは、実である米を精米する際に得られるコメヌカより得られる植物抽出物が好適に例示出来る。
【００１２】
本発明の細胞賦活作用を有する植物抽出物は、日本において、自生又は生育された植物、漢方生薬原料等として販売される日本産のものを用い植物抽出物を作製することも出来るし、丸善製薬株式会社等より植物抽出物として販売されている市販の植物抽出物を購入し使用することも出来る。前記植物より得られる植物抽出物の作製に用いる植物部には、特段の限定はなく、全草を用いることが出来るが、勿論、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾、果実等の部位のみを使用することも出来る。前記植物の抽出に際しては、植物体などの抽出に用いる部位は、予め、粉砕或いは細切して抽出効率を向上させるように加工することが好ましい。抽出物製造においては、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬する。浸漬後は、室温まで冷却し、所望により不溶物を除去した後、溶媒を減圧濃縮するなどにより除去することが出来る。しかる後、シリカゲルやイオン交換樹脂を充填したカラムクロマトグラフィ−などで分画精製し、所望の抽出物を得ることが出来る。ここで、本発明の植物より得られる抽出物とは、抽出物自体、抽出物の分画、精製した分画、抽出物乃至は分画、精製物の溶媒除去物の総称を意味する
【００１３】
前記抽出溶媒としては、極性溶媒が好適に例示出来、より好ましくは、メタノ−ル、エタノ−ル、イソプロピルアルコ−ル、ブタノ−ルなどのアルコ−ル類、１，３−ブチレングリコ−ル、ポリプロピレングリコ−ルなどの多価アルコ−ル類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエ−テル、テトラヒドロフランなどのエ−テル類、ヘキサン、ペンタン等の炭化水素類等のから選択される１種乃至は２種以上が好適に例示出来、さらに好ましくは、エタノ−ル、含水エタノ−ル、ブチレングリコ−ル、含水ブチレングリコ−ルが好適に例示出来、抽出効率の点からは、５０〜９５％（溶量）含水エタノ−ル、より好ましくは、７０〜９５％（溶量）含水エタノ−ル１，３−ブチレングリコ−ルが好ましく例示出来る。
【００１４】
＜製造例１： 本発明の植物抽出物の製造方法１＞
本発明の細胞賦活作用を有する植物抽出物を以下の手順に従い製造した。各植物の抽出原料としては、リンドウ科センブリ属センブリ、マメ科カンゾウ属カンゾウ、ミカン科サンショウ属サンショウ、ユキノシタ科アジサイ属アマチャ、カタバミ科ゴレンシ属スタ−フル−ツ、モモ科モモ属モモ、イネ科イネ属イネの粗砕物１００（ｇ）をエタノ−ル溶媒１０００（Ｌ）に投入し、穏やかに攪拌しながら３時間、７０℃に保った後、ろ過した。ろ液を４０℃で減圧下にて濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥し、固形分の植物抽出物を得た。また、前記植物抽出物の作製にあたっては、前記植物の粗砕物のほか、カタバミ科ゴレンシ属スタ−フル−ツの果実部、バラ科モモ属モモの葉、イネ科イネ属イネの花穂（米）部の粗砕物が好ましい。
【００１５】
＜バラ科モモ属モモより得られる植物抽出物の製造方法＞
モモの葉１（kg）の粗砕物に１０（Ｌ）の１，３−ブチレングリコ−ルを加え２時間リフラックスさせ、濾過し濾液を取り、これを水３（Ｌ）に一気に加え析出した沈殿を濾取し、４０℃で減圧下にて濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥し、植物抽出物を得た。
【００１６】
＜カタバミ科ゴレンシ属スタ−フル−ツより得られる植物抽出物の製造方法＞
スタ−フル−ツの果実の粗粉砕物５０（ｇ）を８０％含水エタノ−ル溶媒５００（mL）に投入し、８０℃で３時間、穏やかに攪拌しながら抽出を行った。その後濾過し、濾液を４０℃で減圧下にて濃縮し、さらに減圧乾燥機で乾燥した後、１，３−ブチレングリコ−ルを加えてスタ−フル−ツの果実抽出物を得た。
【００１７】
本発明の細胞賦活作用を有する植物抽出物は、前記方法に従い製造することも出来るし、市販の植物抽出物として丸善製薬株式会社等より購入し使用することも出来る。本発明の実施例に記載の試験には、前記方法に従い製造された植物抽出物を用いた。
【００１８】
本発明の細胞賦活剤の皮膚外用剤における好ましい含有量は、０．０００１〜１０質量％、より好ましくは、０．００５質量％〜５質量％であり、さらに好ましくは、０．０１質量％〜３質量％である。これは、あまり濃すぎると効果が頭打ちになる場合があり、少なすぎると有効濃度とならない場合があるからである。また、かかる成分は、細胞分化増殖能を低下させる物質を添加し培養することにより皮膚細胞の細胞分化増殖能を低下させた後、被験物質を含む培地にて培養した皮膚細胞の細胞分化増殖能に優れ、さらに、高い安全性及び安定性を有するため、化粧料、医薬部外品、医薬品等への使用が好ましい。
【００１９】
また、本発明の細胞賦活剤は、しみ及び／又はくすみのある人を対象とし、しみ及び／又はくすみを軽減することを目的に使用することが好ましい。しみ及び／又はくすみのある人は、皮膚細胞の機能低下、取り分け、紫外線暴露等の外部刺激によるメラノサイトのメラニン産生亢進、それに続くケラチノサイトへのメラニンの過剰輸送、蓄積を原因とする細胞機能（細胞分化増殖機能）の低下により、ケラチノサイトにおけるメラニン量の増加又は有核細胞数の増加が認められ、皮膚症状としては、重層剥離が多く観察される。このため、本発明の細胞賦活作用を有する成分が使用されるべき対象としては、採取されたケラチノサイトにおいて、メラニン染色をした場合、平均に比してメラニンの量が多く、ケラチノサイトの観察において、平均に比して有核細胞数及び／又は重層剥離が多い人が特に好ましく例示できる。この様な人においては、しみ及び／又はくすみが著しく目立つ場合が存し、そのしみ及び／又はくすみがこの様な構成の組成物を投与することにより著しく改善する。
【００２０】
＜本発明の皮膚外用剤＞
本発明の皮膚外用剤は、前記の皮膚細胞における細胞賦活作用を有する物質の鑑別方法において、細胞分化増殖能を低下させる物質を添加し培養することにより皮膚細胞の細胞分化増殖能を低下させた後、被験物質を含む培地にて培養し、皮膚細胞の細胞分化増殖能を測定し、当該測定値を指標とし、細胞賦活作用を有する成分と判別された成分を含有することを特徴とする。本発明の皮膚外用剤には、前記の皮膚細胞における細胞賦活作用を有する成分を、唯１種含有させることも出来るし、２種以上を組み合わせて含有させることも出来る。この様な成分の内、好ましいものとしては、後記の実施例１に記載の「細胞賦活作用評価」において、メラニン添加により細胞増殖能が低下したケラチノサイトにおいて、被験物質を含有する培地により培養することにより、コントロ−ル群に比較し細胞増殖能が高まる成分、より好ましくは、コントロ−ル群に比較し細胞増殖能が１０％以上増加する成分、より好ましくは、コントロ−ル群に比較し細胞増殖能が１０％以上増加する成分、さらに好ましくは、コントロ−ル群に比較し細胞増殖能が２０％以上増加する成分が好適に例示出来る。かかる成分としては、具体的には、リンドウ科センブリ属、マメ科カンゾウ属、ミカン科サンショウ属、ユキノシタ科アジサイ属、カタバミ科ゴレンシ属、モモ科モモ属、イネ科イネ属に属する植物より得られる植物抽出物より選択される１種又は２種以上よりなる植物抽出物が好適に例示出来、より好ましくは、リンドウ科センブリ属センブリ、マメ科カンゾウ属カンゾウ、ミカン科サンショウ属サンショウ、ユキノシタ科アジサイ属アマチャ、カタバミ科ゴレンシ属スタ−フル−ツ、モモ科モモ属モモ、イネ科イネ属イネより得られる植物抽出物が好適に例示出来る。本発明の皮膚外用剤は、前記の細胞賦活剤が有する作用、即ち、メラニン添加により細胞増殖能が低下したケラチノサイトにおける細胞賦活作用により、色素沈着異常、取り分け、ケラチノサイトへのメラニンの過剰輸送、蓄積により生じるしみ及び／又はくすみなどの色素沈着異常に対する予防又は治療効果を発揮する。
【００２１】
これらの必須成分、任意成分を常法に従って処理し、ロ−ション、乳液、エッセンス、クリ−ム、パック化粧料、洗浄料などに加工することにより、本発明の皮膚外用剤は製造できる。皮膚に適応させることの出来る剤型であれば、いずれの剤型でも可能であるが、有効成分が皮膚に浸透して効果を発揮することから、皮膚への馴染みの良い、ロ−ション、乳液、クリ−ム、エッセンスなどの剤型がより好ましい。
【００２２】
また、本発明の細胞賦活剤を含有する皮膚外用剤の製剤化にあたっては、通常の食品、医薬品、化粧料などの製剤化で使用される任意成分を含有することが出来る。この様な任意成分としては、経口投与組成物であれば、例えば、乳糖や白糖などの賦形剤、デンプン、セルロ−ス、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロ−スなどの結合剤、カルボキシメチルセルロ−スナトリウム、カルボキシメチルセルロ−スカルシウムなどの崩壊剤、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステルなどの界面活性剤、マルチト−ルやソルビト−ルなどの甘味剤、クエン酸などの酸味剤、リン酸塩などの緩衝剤、シェラックやツェインなどの皮膜形成剤、タルク、ロウ類などの滑沢剤、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲルなどの流動促進剤、生理食塩水、ブドウ糖水溶液などの希釈剤、矯味矯臭剤、着色剤、殺菌剤、防腐剤、香料など好適に例示出来る。
【００２３】
また、かかる成分が連続投与される場合、さらには安全性を考慮した場合、経皮的に投与されることが好ましく、経皮的に投与されるものであれば特段の限定なく応用出来、例えば、医薬部外品を含む化粧料、皮膚外用医薬、皮膚外用雑貨等が好ましく例示できる。これは本発明の皮膚外用剤が、比類無き使用感の良さを有しているため、使用感が重要な化粧料に特に好適であるためである。又、その剤形としては、ロ−ション剤形、乳液剤形、クリ−ム剤形、エッセンス剤形等が好適に例示できる。乳化系については、水中油乳化系でも、油中水乳化系でも、水中油中水乳化系や油中水中油乳化系などの多相乳化系でも良い。特に好ましいものは、本発明の効果が著しい、ロ−ション剤形乃至は油中水乳化剤形である。
【００２４】
本発明の皮膚外用剤においては、前記必須成分に加えて、油中水乳化剤形を形成するための乳化剤を含有することが好ましく、該乳化剤としては、有機変性粘土鉱物やジグリセリンモノオレ−トやトリグリセリンジイソステアレ−ト等が好適に例示できる。ジグリセリンモノオレ−トを乳化剤として用いる場合に於いては、必須成分としての量に、乳化のための量を積算し、安定化作用のための役割と、乳化のための役割を兼ねさせることもできる。
【００２５】
前記有機変性粘土鉱物に於いて、有機変性とは、粘土鉱物の一部に有機化合物の一部を共有結合乃至はイオン結合を介して強固乃至は緩やかな結合を生ぜしめ、有機化合物の性質の一部乃至は全部を粘土鉱物に付与させることを意味し、この様な変性としては４級アミン基と粘土鉱物のアニオン部分を結合させる方法、カルボキシル基と粘土鉱物のカチオン部分を結合させる方法等が例示でき、４級アミン基と粘土鉱物のアニオン部分を結合させる方法が特に好ましく例示できる。
【００２６】
粘土鉱物を変性させる４級アミノ基を有する化合物としては、特に限定されるわけではないが、クオタニウムと称される化合物が例示される。クオタニウムとは、低分子の置換第４級アンモニウム塩であって、国際基準化粧品原材料（ＩＮＣＩ）に登録された化粧料原料が好ましい。さらに、粘土鉱物を変性させる４級アミノ基を有する化合物は、クオタニウム化合物のなかでも、従来の皮膚外用剤に含有されるクオタニウム化合物であることが好ましい。従来の皮膚外用剤で使用されているクオタニウム化合物としては、ステアリルトリメチルアンモニウムクロリド、ジメチルジステアリルアンモニウムクロリド等が好ましく例示される。ステアリルトリメチルアンモニウムクロリド、ジメチルジステアリルアンモニウムクロリド等は、粘土鉱物とともに安定な油中水乳化構造を形成することができるので好ましい。
【００２７】
一方、４級アミノ基を有する化合物で変性される粘土鉱物（未変性粘土鉱物）としては、従来の皮膚外用剤に含有される粘土鉱物であれば特段の限定無く使用することができる。従来の皮膚外用剤に含有される粘土鉱物としては、スメクタイト系のヘクトライト、ベントナイトやモンモリロナイト；カオリナイト；イライト；マリ−ン粘土鉱物（海泥）；デザ−トロ−ズ粘土鉱物；パスカライトなどが好ましく挙げられる。これらのうち、油中水乳化構造を安定化させることができるベントナイト、ヘクトライト、モンモリロナイト又はカオリナイトが好ましく例示される。
【００２８】
本発明の皮膚外用剤に含有される４級アミノ基を有する化合物で変性された粘土鉱物の製造方法の一例を以下に説明する。前記未変性粘土鉱物を分散媒に分散させる。該分散剤は水系の溶媒であることが好ましく、水であってもよい。分散未変性粘土鉱物を含む分散液に、さらに４級アミノ基を有する化合物を加え、よく撹拌する。４級アミノ基を有する化合物は、水に溶解されて加えられてもよい。加えられる４級アミノ基を有する化合物の量は、分散未変性粘土鉱物の量に対して０．１〜２０質量％であることが好ましく、０．５〜１５質量％であることがより好ましい。この様な構成を取ることにより、乳化系において、好ましい使用感を呈するためである。撹拌後、分散質を濾取し、脱水、乾固することにより本発明における変性粘土鉱物を得ることができる。あるいは、分散質を濾取することなく、減圧濃縮することにより分散剤を除去して乾固させることにより、本発明における変性粘土鉱物を得ることもできる。得られた変性粘土鉱物は、好ましくは所望のサイズ（粒径が１〜１０００μｍであることが好ましい）に粉砕され、本発明の皮膚外用剤に含有される。
【００２９】
本発明における変性粘土鉱物は、前述したように調製して使用されることもできるが、市販されているものを使用することもできる。市販されている変性粘土鉱物には、化粧料などの皮膚外用剤などとして用いられているものもある。市販されている変性粘土鉱物としては、例えば、エレメンティス社より「ベントン３８Ｖ」の名称で販売されている、ジメチルジステアリルアンモニウム変性ヘクトライトなどが好ましく例示される。
【００３０】
本発明の皮膚外用剤においては、かかる成分は０．５〜１０質量％好ましく含有され、より好ましくは１〜５質量％含有される。かかる成分は、前記の含有量の範囲において、乳化剤として、高内相の油中水乳化剤形を形成すべく働く。
【００３１】
ジグリセリンモノオレ−ト及び／又はトリグリセリンジイソステアレ−トを乳化剤として含有する場合には、かかる乳化剤の質量の０．５〜２倍のマルチト−ルやソルビト−ルの様な多価アルコ−ルをともに含有させることが好ましい。前記ジグリセリンモノオレ−トの化粧料用の原料としては、「ニッコ−ルＤＧＭＯ−Ｃ」（日本サ−ファクタント株式会社製）が好ましく例示できるし、トリグリセリンジイソステアレ−トの化粧料用の原料としては、「エメレスト２４５２」（エメリ−社製）などが好ましく例示できる。かかる成分の好ましい含有量は、皮膚外用剤全量に対して、１〜１０質量％であり、より好ましくは２〜７質量％である。これはこの量範囲を逸脱すると乳化できない場合や安定性が損なわれる場合が存するためである。
【００３２】
本発明の皮膚外用剤は、油中水乳化剤形に形態を取るため、油中水乳化剤形の使用感、仕上がり感の欠点を補うために、シリコ−ン、特に好ましくは、シクロメチコン及び／又は粘度１ｍＰａ・ｓ以下のジメチコンを含有することが好ましく、該シリコ−ンの含有量としては、化粧料全量に対しては、１０〜５０質量％含有することが好ましく、より好ましくは、２０〜４０質量％であり、シクロメチコン及び粘度１ｍＰａ・ｓ以下のジメチコンの含有量の和が油相全量に対して、５０質量％以上、より好ましくは５５質量％以上であることが好ましい。
【００３３】
又、本発明の皮膚外用剤では、乳化剤として前記有機変性粘土鉱物を用いる場合、前記有機変性粘土鉱物の乳化作用を補助する意味で、ＰＯＥ変性メチルポリシロキサン、ＰＯＰ変性メチルポリシロキサン、ＰＯＰ・ＰＯＥ変性メチルポリシロキサン等のポリエ−テル変性メチルポリシロキサンを含有することが好適に例示できる。かかるポリエ−テル変性メチルポリシロキサンの好ましい含有量は、０．５〜５質量％、１〜３質量％がより好ましい。
【００３４】
乳化剤として前記有機変性粘土鉱物を用いる場合、更に、上記の成分以外の好ましい任意成分としては、乳化状態を安定化できる、多価アルコ−ルが例示できる。特に、グリセリン、ジグリセリン、ジプロピレングリコ−ルが好適に例示できる。かかる成分は唯一種を含有することもできるし、二種以上を組み合わせて含有させることもできる。好ましい含有量は、総量で、皮膚外用剤全量に対して、５〜３０質量％であり、より好ましくは１０〜２５質量％である。更に加えて、１，２−ペンタンジオ−ル、１，２−ヘキサンジオ−ル及び１，２−オクタンジオ−ルから選択される１種乃至は２種以上を１〜７質量％含有させることも、防腐力を向上させる見地から好ましい。
【００３５】
これらに加え、特に好ましい成分としては、前記有機変性粘土鉱物の乳化性を補助する意味で、ポリエ−テル変性シリコ−ンが例示できる。ポリエ−テル変性シリコ−ンとしては、ポリエチレングリコ−ル変性メチルシロキサンやポリプロピレングリコ−ル変性メチルシロキサン、ポリエチレングリコ−ル・ポリプロピレングリコ−ル変性メチルシロキサンなどが好ましく例示できる。特に好ましいものは、ポリエチレングリコ−ル（１０）変性メチルシロキサンであり、これには、例えば、信越化学株式会社製の「シリコ−ンKF６０１７」等が市販品として存する。この様なポリエ−テル変性シリコ−ンの好ましい含有量は、総量で、皮膚外用剤全量に対して、０．５〜３０質量％であり、より好ましくは１〜２５質量％である。
【００３６】
上記以外にも、本発明の皮膚外用剤に於いては、本発明の効果を損ねない限度に於いて、通常使用される任意成分を含有することもできる。この様な任意成分としては、例えば、マカデミアナッツ油、アボガド油、トウモロコシ油、オリ−ブ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワ−油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パ−ム油、液状ラノリン、硬化ヤシ油、硬化油、モクロウ、硬化ヒマシ油、ミツロウ、キャンデリラロウ、カルナウバロウ、イボタロウ、ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、ホホバロウ等のオイル、ワックス類；流動パラフィン、スクワラン、プリスタン、オゾケライト、パラフィン、セレシン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類；オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸等の高級脂肪酸類；セチルアルコ−ル、ステアリルアルコ−ル、イソステアリルアルコ−ル、ベヘニルアルコ−ル、オクチルドデカノ−ル、ミリスチルアルコ−ル、セトステアリルアルコ−ル等の高級アルコ−ル等；イソオクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、イソステアリン酸ヘキシルデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバチン酸ジ−２−エチルヘキシル、乳酸セチル、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ−２−エチルヘキサン酸エチレングリコ−ル、ジカプリン酸ネオペンチルグリコ−ル、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸トリメチロ−ルプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロ−ルプロパン、テトラ−２−エチルヘキサン酸ペンタンエリトリット等の合成エステル油類等の油剤類；脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノ−ルアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類；塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類；イミダゾリン系両性界面活性剤（２−ココイル−２−イミダゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類；ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレ−ト、セスキオレイン酸ソルビタン等）、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコ−ル脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコ−ル等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエ−テル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエ−ト、モノステアリン酸ポリオキエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−ソルビットモノラウレ−ト等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−グリセリンモノイソステアレ−ト等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコ−ルモノオレ−ト、ＰＯＥジステアレ−ト等）、ＰＯＥアルキルエ−テル類（ＰＯＥ２−オクチルドデシルエ−テル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエ−テル類（ＰＯＥノニルフェニルエ−テル等）、プルロニック型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエ−テル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２−デシルテトラデシルエ−テル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類；ポリエチレングリコ−ル、グリセリン、エリスリト−ル、ソルビト−ル、キシリト−ル、マルチト−ル、プロピレングリコ−ル、２，４−ヘキサンジオ−ル等の多価アルコ−ル類；ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等の保湿成分類；表面を処理されていても良い、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類、；表面を処理されていても良い、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛の無機顔料類；表面を処理されていても良い、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパ−ル剤類；レ−キ化されていても良い赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類；ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマ−等の有機粉体類；パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤；アントラニル酸系紫外線吸収剤；サリチル酸系紫外線吸収剤；桂皮酸系紫外線吸収剤；ベンゾフェノン系紫外線吸収剤；糖系紫外線吸収剤；２−（２’−ヒドロキシ−５’−ｔ−オクチルフェニル)ベンゾトリアゾ−ル、４−メトキシ−４’−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン等の紫外線吸収剤類；エタノ−ル、イソプロパノ−ル等の低級アルコ−ル類；ビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＢ６塩酸塩、ビタミンＢ６トリパルミテ−ト、ビタミンＢ６ジオクタノエ−ト、ビタミンＢ２又はその誘導体、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１５又はその誘導体等のビタミンＢ類；α−トコフェロ−ル、β−トコフェロ−ル、γ−トコフェロ−ル、ビタミンＥアセテ−ト等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノン等のビタミン類等；フェノキシエタノ−ル等の抗菌剤などが好ましく例示できる。
【００３７】
以下に、本発明に付いて、実施例を挙げて更に詳しく説明を加えるが、本発明がかかる実施例のみに限定されないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００３８】
＜試験例１： 本発明の細胞賦活作用評価＞
以下の手順に従い、本発明の皮膚細胞における細胞賦活作用（細胞増殖抑制作用）を評価した。尚、本発明の植物抽出物は、丸善製薬株式会社より市販の植物抽出物として購入した植物抽出物を用いた。
１） 正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）（倉敷紡績株式会社）を４８well plateに３×１０４（cells/well）播種し、播種と同時にジメチルスルホキシド（DMSO、和光純薬工業株式会社）に懸濁した合成メラニン（SIGMA社）を終濃度１．５×１０-3 （％）となるよう添加した。
２） 被験物質（植物抽出液の固形分）をDMSO（和光純薬工業株式会社）により溶解し、１０（w/v％）エキス液を作製した。それらを１/１０００量ずつ添加した培地（Humedia-KG２、倉敷紡績株式会社）を作製し、播種６時間後にその培地と交換し、さらに培養を継続した（各被験物質の最終固形分濃度は１×１０−２（w/v％））。
３） 播種翌日、培地を除去しPBSで１回プレ−トを洗浄した後、生細胞数測定試薬SF（ナカライテスク社）溶液を添加した培地に交換し、３７℃、1時間呈色反応を行った。
４） 反応後、４５０（nm）の吸光度をマイクロプレ−トリ−ダ−Benchmark Plus（Bio-Rad Laboratories）を用いて測定した。コントロ−ルとして被験物質を含まないサンプルを前記同様に調製し、コントロ−ルに対する被験物質を含むサンプルの吸光度の百分率を求め細胞賦活作用を評価した。結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】
前記植物抽出物は、何れも顕著な細胞賦活作用（細胞増殖抑制作用）を示した。尚、前記植物抽出物の内、特に、カラバミ科ゴレンシ属スタ−フル−ツより得られる植物抽出物、モモ科モモ属モモより得られる植物抽出物の細胞賦活作用は優れていた。かかる植物抽出物は、細胞賦活作用による皮膚の色素沈着異常、しみ、くすみなどの皮膚老化現象に対し、優れた予防又は改善効果を示すことが期待出来る。また、また、本評価系は、皮膚のメラノサイトにおけるメラニン産生亢進、それに続くケラチノサイトへのメラニンの過剰移輸、蓄積により生じるしみ及び／又はくすみなどの色素沈着異常により細胞機能（細胞分化増殖機能）が低下したケラチノサイトのモデル評価系であるため、本評価系において細胞賦活作用を示した前記植物抽出物は、特に、採取されたケラチノサイトにおいて、メラニン染色をした場合、平均に比してメラニンの量が多く、ケラチノサイトの観察において、平均に比して有核細胞数及び／又は重層剥離が多い人を対象とした場合に優れた効果が期待出来る。
【実施例２】
【００４１】
＜製造例２： 本発明の皮膚外用剤の製造方法１＞
表２及び表３に記載の処方に従って、本発明の皮膚外用剤である化粧料（ロ−ション）を作製した。即ち、処方成分を８０℃に加熱し、攪拌可溶化し、攪拌冷却して本発明の皮膚外用剤（化粧料１〜７）を作製した。また、表２中、「本発明の細胞賦活剤」を「アルブチン」に置換した比較例１、「本発明の細胞賦活剤」を「水」に置換した比較例２を作製した。
【００４２】
【表２】
【００４３】
【表３】
【実施例３】
【００４４】
＜試験例２： 本発明の細胞賦活剤を含有する皮膚外用剤の色素沈着抑制効果評価１＞
実施例２に記載の方法に従い製造された化粧料１〜７、比較例１及び２の化粧料を用いて、色素沈着抑制効果を調べた。メラニン量が平均より多いパネラ−の選択にあたっては、皮膚から粘着テ−プストリッピングにより採取したケラチノサイトの標本を、硝酸銀水溶液を用いたメラニン染色を行うことにより可視化し、これを顕微鏡下観察することにより判定した。また、判定にあたっては、平均的な存在状況を中心にスコア化して判別した。さらに、前記パネラ−の内、角層標本を用い有核細胞の出現率が平均よりも高い、乃至は、重層剥離の度合いが平均よりも多い人を観察により選択しパネラ−とした。前記の特性を有する自由意思で参加したパネラ−の両上腕内側部に１．５ｃｍ×１．５ｃｍの部位を上下２段に分け、合計９ヶ所設け、最少紅斑量（１ＭＥＤ）の紫外線照射を１日１回、３日連続して３回照射した。照射終了後１日より、１日１回２８日連続してサンプル５０μLを塗布した。１部位は無処置部位とした。塗布終了２４時間後に色彩色差計（ＣＲ-３００、コニカミノルタ株式会社）にて各試験部位の皮膚明度（Ｌ＊値）を測定し、無処置部位のＬ値に対するΔＬ＊値を算出した。Ｌ＊値は、色素沈着の程度が強いほど低い値となる。従って、ΔＬ＊値が大きい程、色素沈着が抑制されたと判断することができる。結果を表４に示す。これにより、本発明の皮膚外用剤である化粧料１〜７は、優れた色素沈着抑制効果を示すことが分かる。本評価系において細胞賦活作用を示した前記植物抽出物は、特に、採取されたケラチノサイトにおいて、メラニン染色をした場合、平均に比してメラニンの量が多く、ケラチノサイトの観察において、平均に比して有核細胞数及び／又は重層剥離が多い人を対象とした場合に優れた効果を有する。本発明の化粧料１〜７の前記効果は、化粧料に配合された細胞賦活作用を有する成分の作用によるものである。
【００４５】
【表４】
【実施例４】
【００４６】
＜製造例２： 本発明の皮膚外用剤の製造方法２＞
実施例２に記載の化粧料５及び化粧料６の処方成分中、「本発明の細胞賦活剤」の濃度を表５に記載の濃度に変更した化粧料８〜１１を作製した。また、処方成分中の「本発明の細胞賦活剤」の濃度増減による質量％変化は、処方成分中の「水」の質量％により調整した。
【００４７】
【表５】
【実施例５】
【００４８】
＜試験例３： 本発明の細胞賦活剤を含有する皮膚外用剤の色素沈着抑制効果評価２＞
前記の実施例３に記載の方法に従い化粧料８〜１１に関し色素沈着抑制効果を評価した。結果を表６に示す。化粧料８〜１１は、何れも色素沈着抑制効果を示した。本評価系において細胞賦活作用を示した前記植物抽出物は、特に、採取されたケラチノサイトにおいて、メラニン染色をした場合、平均に比してメラニンの量が多く、ケラチノサイトの観察において、平均に比して有核細胞数及び／又は重層剥離が多い人を対象とした場合に優れた効果を有する。本発明の化粧料８〜１１の前記効果は、化粧料に配合された細胞賦活剤が有する作用によるものである。
【００４９】
【表６】
【実施例６】
【００５０】
＜製造例３： 本発明の皮膚外用剤の製造方法３＞
表７及び表８に記載の処方に従い、本発明の油中水乳化製剤（クリ−ム）を作製した。即ち、イ、ロ、ハの成分をそれぞれ８０℃に加温し、イの中にニを加えて溶解させ、混練してゲルを形成させ、これにロを加え希釈し、これに攪拌下徐々にハを加えて乳化し、攪拌冷却し、本発明の皮膚外用剤である、油中水乳化剤形の化粧料１２〜１８を作製した。また、表７に記載の成分中、「本発明の細胞賦活剤」を「４−ブチルレゾルシノ−ル」に置換した比較例３、「本発明の細胞賦活剤」を「水」に置換した比較例４を作製した。
【００５１】
【表７】
【００５２】
【表８】
【実施例７】
【００５３】
＜試験例４： 本発明の細胞賦活剤を含有する皮膚外用剤の色素沈着抑制効果評価３＞
前記実施例３に記載の方法に従い製造した化粧１２〜１８、比較例３及び４に関し、前記実施例３に記載の方法に従い色素沈着抑制作用評価した。結果を表９に示す。
【００５４】
【表９】
【実施例８】
【００５５】
表７及び表８に記載した化粧料１７の処方成分中、「ベントン３８Ｖ」を「シリコ−ンKF６０１７」に置換した化粧料１９、「１，２−ペンタンジオ−ル」を「ポリエチレングリコ−ル４００」に置換した化粧料２０を作製し、実施例３に記載の方法に従い、紫外線照射による色素沈着予防効果を検討したところ、化粧料１９は、△Ｌ＊値は、０．５６を示し、化粧料２０は、△Ｌ＊値は、０．４９を示し、何れも化粧料においても紫外線照射後の色素沈着に対する予防効果がほとんど認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明は、色素沈着の予防又は改善に有用な皮膚外用剤に応用出来る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚細胞の細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法であって、皮膚細胞に細胞分化増殖能を低下させる物質を添加し培養することにより皮膚細胞の細胞分化増殖能を低下させた後、被験物質を含む培地にて培養し、皮膚細胞の細胞分化増殖能を測定し、当該測定値を指標とし、細胞賦活作用を有する成分を判別することを特徴とする、細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法。
【請求項２】
前記皮膚細胞が、角化細胞（ケラチノサイト）であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法。
【請求項３】
前記皮膚細胞の細胞分化増殖能を低下させる物質がメラニンであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法。
【請求項４】
前記細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法により鑑別される、細胞賦活作用剤。
【請求項５】
前記細胞賦活作用を有する成分が、リンドウ科センブリ属、マメ科カンゾウ属、ミカン科サンショウ属、ユキノシタ科アジサイ属、カタバミ科ゴレンシ属、モモ科モモ属、イネ科イネ属に属する植物より得られる植物抽出物より選択される１種又は２種以上よりなることを特徴とする、請求項４に記載の細胞賦活剤。
【請求項６】
前記リンドウ科センブリ属、マメ科カンゾウ属、ミカン科サンショウ属、ユキノシタ科アジサイ属、カタバミ科ゴレンシ属、イネ科イネ属に属する植物が、リンドウ科センブリ属センブリ、マメ科カンゾウ属カンゾウ、ミカン科サンショウ属サンショウ、ユキノシタ科アジサイ属アマチャ、カタバミ科ゴレンシ属スタ−フル−ツ、モモ科モモ属モモ、イネ科イネ属イネであることを特徴とする、請求項４又は５に記載の細胞賦活剤。
【請求項７】
前記細胞賦活作用が、角化細胞の分化増殖促進作用によるものであることを特徴とする、請求項４〜６の何れか一項に記載の細胞賦活剤。
【請求項８】
前記角化細胞の分化増殖能の低下が、メラニン添加による角化細胞の分化増殖能の低下であることを特徴とする、請求項４〜７の何れか一項に記載の細胞賦活剤。
【請求項９】
前記細胞賦活剤は、しみ及び／又はくすみのある人において、しみ及び／又はくすみを軽減する作用を有することを特徴とする、請求項４〜８の何れか一項に記載の細胞賦活剤。
【請求項１０】
しみ及び／又はくすみのある人が、採取されたその人の角層細胞において、平均に比較しメラニン量が多く、且つ、有核細胞の出現率が平均よりも高い、乃至は、重層剥離の度合いが平均よりも多い人であることを特徴とする、請求項９に記載の細胞賦活剤。
【請求項１１】
請求項４〜１０の何れか一項に記載の細胞賦活剤を含有することを特徴とする、皮膚外用剤。
【請求項１２】
前記細胞賦活剤を、皮膚外用剤全量に対し、０．０００１質量％〜１０質量％含有することを特徴とする、請求項１１に記載の皮膚外用剤。
【請求項１３】
色素沈着予防又は改善用であることを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の皮膚外用剤。
【請求項１４】
化粧料（但し、医薬部外品を含む）であることを特徴とする、請求項１１〜１３の何れか一項に記載の皮膚外用剤。
【請求項１５】
角化細胞を、細胞分化抑制作用を有する物質を含む培地で培養し、被験物質非添加の場合に比較し、被験物質添加の場合の方が、細胞分化が著しかった被験物質を細胞賦活剤として含むことを特徴とする、請求項１１〜１４の何れか一項目に記載の皮膚外用剤。
【請求項１６】
前記細胞分化抑制作用を有する物質が、メラニンであることを特徴とする、請求項１１〜１５の何れか一項目に記載の皮膚外用剤。
【請求項１７】
更に、好ましい製剤上の任意成分を含有することを特徴とする、請求項１１〜１６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
細胞分化抑制作用を有する物質を含有する、細胞賦活剤のスクリ−ニング用の培地。
【請求項１９】
前記細胞分化抑制作用を有する物質が、メラニンであることを特徴とする、請求項１８に記載の培地。
【請求項１】
皮膚細胞の細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法であって、皮膚細胞に細胞分化増殖能を低下させる物質を添加し培養することにより皮膚細胞の細胞分化増殖能を低下させた後、被験物質を含む培地にて培養し、皮膚細胞の細胞分化増殖能を測定し、当該測定値を指標とし、細胞賦活作用を有する成分を判別することを特徴とする、細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法。
【請求項２】
前記皮膚細胞が、角化細胞（ケラチノサイト）であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法。
【請求項３】
前記皮膚細胞の細胞分化増殖能を低下させる物質がメラニンであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法。
【請求項４】
前記細胞賦活作用を有する成分の鑑別方法により鑑別される、細胞賦活作用剤。
【請求項５】
前記細胞賦活作用を有する成分が、リンドウ科センブリ属、マメ科カンゾウ属、ミカン科サンショウ属、ユキノシタ科アジサイ属、カタバミ科ゴレンシ属、モモ科モモ属、イネ科イネ属に属する植物より得られる植物抽出物より選択される１種又は２種以上よりなることを特徴とする、請求項４に記載の細胞賦活剤。
【請求項６】
前記リンドウ科センブリ属、マメ科カンゾウ属、ミカン科サンショウ属、ユキノシタ科アジサイ属、カタバミ科ゴレンシ属、イネ科イネ属に属する植物が、リンドウ科センブリ属センブリ、マメ科カンゾウ属カンゾウ、ミカン科サンショウ属サンショウ、ユキノシタ科アジサイ属アマチャ、カタバミ科ゴレンシ属スタ−フル−ツ、モモ科モモ属モモ、イネ科イネ属イネであることを特徴とする、請求項４又は５に記載の細胞賦活剤。
【請求項７】
前記細胞賦活作用が、角化細胞の分化増殖促進作用によるものであることを特徴とする、請求項４〜６の何れか一項に記載の細胞賦活剤。
【請求項８】
前記角化細胞の分化増殖能の低下が、メラニン添加による角化細胞の分化増殖能の低下であることを特徴とする、請求項４〜７の何れか一項に記載の細胞賦活剤。
【請求項９】
前記細胞賦活剤は、しみ及び／又はくすみのある人において、しみ及び／又はくすみを軽減する作用を有することを特徴とする、請求項４〜８の何れか一項に記載の細胞賦活剤。
【請求項１０】
しみ及び／又はくすみのある人が、採取されたその人の角層細胞において、平均に比較しメラニン量が多く、且つ、有核細胞の出現率が平均よりも高い、乃至は、重層剥離の度合いが平均よりも多い人であることを特徴とする、請求項９に記載の細胞賦活剤。
【請求項１１】
請求項４〜１０の何れか一項に記載の細胞賦活剤を含有することを特徴とする、皮膚外用剤。
【請求項１２】
前記細胞賦活剤を、皮膚外用剤全量に対し、０．０００１質量％〜１０質量％含有することを特徴とする、請求項１１に記載の皮膚外用剤。
【請求項１３】
色素沈着予防又は改善用であることを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の皮膚外用剤。
【請求項１４】
化粧料（但し、医薬部外品を含む）であることを特徴とする、請求項１１〜１３の何れか一項に記載の皮膚外用剤。
【請求項１５】
角化細胞を、細胞分化抑制作用を有する物質を含む培地で培養し、被験物質非添加の場合に比較し、被験物質添加の場合の方が、細胞分化が著しかった被験物質を細胞賦活剤として含むことを特徴とする、請求項１１〜１４の何れか一項目に記載の皮膚外用剤。
【請求項１６】
前記細胞分化抑制作用を有する物質が、メラニンであることを特徴とする、請求項１１〜１５の何れか一項目に記載の皮膚外用剤。
【請求項１７】
更に、好ましい製剤上の任意成分を含有することを特徴とする、請求項１１〜１６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
細胞分化抑制作用を有する物質を含有する、細胞賦活剤のスクリ−ニング用の培地。
【請求項１９】
前記細胞分化抑制作用を有する物質が、メラニンであることを特徴とする、請求項１８に記載の培地。
【公開番号】特開２０１１−２１９４０３（Ｐ２０１１−２１９４０３Ａ）
【公開日】平成２３年１１月４日（２０１１．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−８９１０９（Ｐ２０１０−８９１０９）
【出願日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【出願人】（０００１１３４７０）ポーラ化成工業株式会社 (717)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月４日（２０１１．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【出願人】（０００１１３４７０）ポーラ化成工業株式会社 (717)
【Ｆターム（参考）】
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