細胞質照射方法
【課題】二重染色を行うことなく細胞質にＸ線を照射することを可能とする。
【解決手段】細胞核２のみを染色して撮影した細胞１の画像に基づいて細胞核２の重心位置４並びに当該重心位置４を通過する長軸の方向５を算定し、細胞核２の重心位置４から細胞核２の長軸の方向５に所定距離Ｄ1だけ離れた位置６にＸ線を照射するようにした。
【解決手段】細胞核２のみを染色して撮影した細胞１の画像に基づいて細胞核２の重心位置４並びに当該重心位置４を通過する長軸の方向５を算定し、細胞核２の重心位置４から細胞核２の長軸の方向５に所定距離Ｄ1だけ離れた位置６にＸ線を照射するようにした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞質照射方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、直径が例えば数μｍのＸ線を細胞質に照射する際に用いて好適な技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
粒子線を細胞質に照射するための従来の方法として、図６に示すように、細胞１００(全体)及び当該細胞１００の細胞核１０１を各々染色（二重染色と呼ばれる）して細胞核１０１と細胞質１０２とを判別し、細胞核１０１の範囲及び細胞質１０２の範囲を画像解析によって算定し、当該算定の結果に基づいて粒子線の照射位置を決定するものがある（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Tartier L, Gilchrist S, Burdak-Rothkamm S, Folkard M, Prise KM、"Cytoplasmic irradiation induces mitochondrial-dependent 53BP1 protein relocalization in irradiated and bystander cells"、Cancer Res 2007; 67: (12)、pp.5872-5879、米国、2007年6月15日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、生細胞全体を染色する染色試薬は毒性が高いものが多く、細胞の生存に影響を与えることなく二重染色によって細胞質と細胞核とを判別することは困難であるという問題がある。また、仮に上記の問題が解決できたとしても、染色毎に波長が異なる蛍光フィルターを用いて撮影した画像を合成した上で細胞質部分を抽出して照射位置を決定するというプロセスでは処理時間が多大にかかってしまうので、実用的であるとは言い難い。
【０００５】
そこで、本発明は、細胞を二重染色することなく、言い換えると細胞全体を染色することなく細胞質にＸ線を照射することができる細胞質照射方法を提供することを目的とする。また、本発明は、細胞全体の大きさ，細胞核の大きさ，細胞全体における細胞核の位置に影響されることなく細胞質にＸ線を確実に照射することができる細胞質照射方法を提供することを目的とする。なお、本発明においては、直径が数μｍのＸ線のことをマイクロビームＸ線という。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かかる目的を達成するため、請求項１記載の細胞質照射方法は、細胞の細胞核の重心位置並びに当該重心位置を通過する長軸の方向を算定し、細胞核の重心位置から細胞核の長軸の方向に所定距離だけ離れた位置にＸ線を照射するようにしている。
【０００７】
また、請求項２記載の細胞質照射方法は、細胞核のみを染色して撮影した細胞の画像に基づいて細胞核の重心位置並びに当該重心位置を通過する長軸の方向を算定し、細胞核の重心位置から細胞核の長軸の方向に所定距離だけ離れた位置にＸ線を照射するようにしている。
【０００８】
したがって、請求項１，請求項２記載の細胞質照射方法によると、細胞核の長軸方向と細胞全体の長軸方向とは通常は概ね揃うので細胞核の長軸方向に所定距離だけ離れた点は細胞質である可能性が高く、このため、細胞の細胞質にＸ線を高い確率で照射することができる。しかも、細胞を一切染色することなく若しくは細胞核のみを染色することにより、すなわち、細胞核と細胞(全体)との両方の染色即ち二重染色をしないでも細胞の細胞質にＸ線を照射することができる。また、請求項２記載の細胞質照射方法の場合には特に、細胞核のみを対象とした画像処理によって、言い換えると、細胞核と細胞(全体)との両方を対象とした画像処理を行うことなく細胞の細胞質にＸ線を照射することができる。
【０００９】
また、請求項４記載の細胞質照射方法は、細胞の細胞核の重心位置並びに当該重心位置を通過する長軸の端点及び方向を算定し、細胞核の長軸の端点から細胞核の長軸の方向に所定距離だけ離れた位置にＸ線を照射するようにしている。
【００１０】
また、請求項５記載の細胞質照射方法は、細胞核のみを染色して撮影した細胞の画像に基づいて細胞核の重心位置並びに当該重心位置を通過する長軸の端点及び方向を算定し、細胞核の長軸の端点から細胞核の長軸の方向に所定距離だけ離れた位置にＸ線を照射するようにしている。
【００１１】
したがって、請求項４，請求項５記載の細胞質照射方法によると、請求項１，２記載の細胞質照射方法と比べてより一層確実に細胞の細胞質にＸ線を照射することができる。すなわち、細胞全体や細胞核の大きさは細胞毎に異なるので、細胞核の重心位置から所定距離だけ離れた点を照射するようにすると、細胞核が比較的大きい場合には当該細胞核内を照射してしまう虞があり、一方で細胞が比較的小さい場合には細胞外を照射してしまう虞がある。これに対し、この請求項４，請求項５記載の細胞質照射方法によれば、細胞核の長軸の端点（即ち、細胞核の境界面）から当該長軸の方向に所定距離だけ離れた点を照射するようにすることにより、細胞核の大きさに影響を受けることなくより一層確実に細胞質にＸ線を照射することができる。
【００１２】
また、請求項３記載の発明は、請求項１または２記載の細胞質照射方法において、前記所定距離が８〜１０μｍであるようにしている。また、請求項６記載の発明は、請求項４または５記載の細胞質照射方法において、前記所定距離が３〜５μｍであるようにしている。この場合には、一般的な細胞全体及び細胞核の大きさ（具体的には例えば、典型的な哺乳類細胞の核の大きさは長軸方向長さ１０μｍ程度と仮定され得る）に鑑みてより一層確実に細胞質にＸ線が照射される。
【００１３】
また、請求項７記載の発明は、請求項１，２，４，５のいずれか一つに記載の細胞質照射方法において、Ｘ線が直径1.8〜2.0μｍのマイクロビームであるようにしている。この場合には、一般的な細胞全体及び細胞核の大きさに鑑みて、Ｘ線が細胞核と細胞質とに跨って照射されてしまうことが回避され易くなる。
【発明の効果】
【００１４】
請求項１，請求項２記載の細胞質照射方法によれば、細胞の細胞質にＸ線を高い確率で照射することができるので、Ｘ線を細胞質に照射する作業における無駄を省いて作業効率の向上を図ることが可能になると共に、細胞質へのＸ線照射の信頼性の向上を図ることが可能になる。しかも、細胞核と細胞(全体)との両方の染色即ち二重染色をしないでも細胞の細胞質にＸ線を照射することができるので、毒性が高い染色試薬を用いないで済み、生細胞に与える影響を抑制してＸ線照射を行うことができる。また、請求項２記載の細胞質照射方法の場合には特に、細胞核と細胞(全体)との両方を対象とした画像処理を行うことなく細胞の細胞質にＸ線を照射することができるので、画像の合成や細胞質部分の抽出などの処理プロセスを行わないで済み、Ｘ線を細胞質に照射する作業の手間を軽減することができると共に処理時間を短縮することができ、実用性・汎用性の向上を図ることが可能になる。
【００１５】
請求項４，請求項５記載の細胞質照射方法によれば、請求項１，請求項２記載の細胞質照射方法の効果に加え、細胞核の大きさに影響を受けることなくより一層確実に細胞質にＸ線を照射することができるので、Ｘ線を細胞質に照射する作業における無駄を省いて作業効率のより一層の向上を図ることが可能になると共に、細胞質へのＸ線照射の信頼性のより一層の向上を図ることが可能になる。
【００１６】
また、請求項３，請求項６記載の細胞質照射方法によれば、一般的な細胞全体及び細胞核の大きさに鑑みてより一層確実に細胞質にＸ線を照射することができるので、Ｘ線を細胞質に照射する作業における無駄を省いて作業効率のより一層の向上を図ることが可能になると共に、細胞質へのＸ線照射の信頼性のより一層の向上を図ることが可能になる。
【００１７】
また、請求項７記載の細胞質照射方法によれば、一般的な細胞全体及び細胞核の大きさに鑑みて、Ｘ線が細胞核と細胞質とに跨って照射されてしまうことを回避することができるので、Ｘ線を細胞質に照射する作業における無駄を省いて作業効率のより一層の向上を図ることが可能になると共に、細胞質へのＸ線照射の信頼性のより一層の向上を図ることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の細胞質照射方法の第一の実施形態を説明するフローチャートである。
【図２】本発明の細胞質照射方法の第一の実施形態を説明する図で、細胞の細胞核と細胞質との模式図である。
【図３】本発明の細胞質照射方法に適用し得るＸ線照射システムの一例を説明する図である。
【図４】本発明の細胞質照射方法の第二の実施形態を説明するフローチャートである。
【図５】本発明の細胞質照射方法の第二の実施形態を説明する図で、細胞の細胞核と細胞質との模式図である。
【図６】従来の細胞質照射方法を説明する図で、細胞の細胞核と細胞質との模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の構成を図面に示す実施の形態の一例に基づいて詳細に説明する。
【００２０】
図１から図３に、本発明の細胞質照射方法の第一の実施形態を示す。第一の実施形態の細胞質照射方法は、細胞核２のみを染色して撮影した細胞１の画像に基づいて細胞核２の重心位置４並びに当該重心位置４を通過する長軸の方向５を算定し、細胞核２の重心位置４から細胞核２の長軸の方向５に所定距離Ｄ1だけ離れた位置６にＸ線を照射することにより細胞１の細胞質３にＸ線を照射するものである。
【００２１】
本発明の細胞質照射方法の実施にあたっては、まず、細胞核のみを染色する（Ｓ１）。
【００２２】
照射試料である細胞１の細胞核２の染色は、細胞１を試料皿（ディッシュ）に播種，接着させた上で、細胞核の染色処理として従来から用いられているものと同様の手順・染色試薬によって行う。染色試薬としては具体的には例えばHoechst 33258やHoechst 33342などの蛍光染色試薬が用いられる。なお、本発明では、細胞１の細胞核２のみを染色する。そして、本発明によれば、細胞毒性が低い例えばHoechstのみを染色試薬として用いて細胞質３にＸ線を照射することができるので、細胞の生存に影響を与えることがない。
【００２３】
次に、細胞核の画像を取得する（Ｓ２）。
【００２４】
具体的には、Ｓ１の処理によって細胞核２のみが染色された細胞１を接着させたディッシュを、Ｘ線を照射する機器・システムの所定の場所（例えば精密ステージ）に載置する。そして、細胞１を撮影して画像を取得する。
【００２５】
ここで、遺伝子組み換えによって細胞核自身が発光若しくは蛍光を発する場合、或いは細胞の位相差像若しくは微分干渉像が取得可能な場合など、染色しないでも適当な画像処理，解析によって細胞核を識別可能であれば、細胞核を染色（Ｓ１）する必要はない。
【００２６】
次に、細胞核の重心位置を算定する（Ｓ３）。
【００２７】
具体的には、Ｓ２の処理によって取得された細胞１の画像を用いて画像処理技術によって細胞核２の範囲を判別し、当該範囲（平面図形）の重心位置４を算定する。なお、当該Ｓ３の処理は特殊な処理ではなく、画像データを用いて所与の条件に合う座標算出（ここでは、例えば任意に設定されたＸ−Ｙ平面における座標の算出、或いは画像のピクセルの算定）の処理を行う従来の画像処理技術を用いて行うことが可能であり、このような画像処理技術は周知の技術であるのでここでは詳細については省略する。
【００２８】
次に、細胞核の長軸方向を特定する（Ｓ４）。
【００２９】
具体的には、Ｓ２の処理によって取得された細胞１の画像を用いて画像処理技術によって細胞核２の範囲を判別し、当該範囲（平面図形）の長軸方向５（即ち、細胞核２の重心位置４を通る長径軸の方向）を特定する。なお、当該Ｓ４の処理は特殊な処理ではなく、画像データを用いて所与の条件に合う角度算出（ここでは、例えば任意に設定されたＸ−Ｙ平面における図形の長径軸の角度の算出）の処理を行う従来の画像処理技術を用いて行うことが可能であり、このような画像処理技術は周知の技術であるのでここでは詳細については省略する。
【００３０】
次に、Ｘ線の照射位置を決定する（Ｓ５）。
【００３１】
第一の実施形態では、具体的には、Ｓ３の処理によって算定された細胞核２の重心位置４から、Ｓ４の処理によって特定された細胞核２の長軸方向５に所定距離Ｄ1だけ離れた点をＸ線の照射位置６とする。
【００３２】
なお、所定距離Ｄ1は特定の値に絶対的に定まるものではなく、細胞１の細胞質３にＸ線を照射することができるように、例えば細胞１および細胞核２の大きさや照射するＸ線の直径などを考慮して適宜設定される。なお、必要な場合には、Ｘ線を照射する細胞自体若しくは同種の細胞を用いて細胞全体および細胞核の大きさ（例えば少なくとも長軸方向の長さ）を予め計測しておく。
【００３３】
なお、具体例を挙げると、例えば典型的な哺乳類細胞の核の大きさは長軸方向長さ１０μｍ程度と仮定され得ることなどに鑑み、所定距離Ｄ1を８〜１０〔μｍ〕程度にすることが考えられる。
【００３４】
そして、Ｘ線を細胞に照射する（Ｓ６）。
【００３５】
Ｓ３〜Ｓ５の処理によれば、高い確率で、細胞１の細胞質３にＸ線を照射することができる。
【００３６】
ここで、本実施形態では、マイクロビームＸ線を細胞質３に照射する。そして、本発明では、Ｘ線を照射する機器・システムは特定のものには限定されず、被照射体（即ち、細胞１）へのＸ線照射位置の制御機能を有していると共に直径が例えば数μｍのＸ線を照射することができる機器・システムであれば何れでも良い。
【００３７】
本実施形態では、Ｘ線を照射する機器として本発明者らによって開発されたマイクロビームＸ線照射システムを用いる。このマイクロビームＸ線照射システム１０は、細胞核や細胞質の検出，照射位置の決定，Ｘ線の照射を自動的に行う機能を有し、図３に示すように、電子銃１１（株式会社オメガトロン製OME-0055LBW）から射出された電子線１２をアルミニウムターゲット１３に照射して発生させた1.49〔keV〕の特性Ｘ線１４を斜入射ミラー１５及び真空窓１６を介してフレネルゾーンプレート１７に到達させ、前記特性Ｘ線１４を当該フレネルゾーンプレート１７によって回折させ集光すると共にピンホール１９（Ｏrder Ｓelecting Ａpertuer：ＯＳＡ）を通過させて直径1.8〜2.0〔μｍ〕程度のマイクロビームＸ線にして精密ステージ２０（PRIOR Scientific社製H101BX）に設置されたディッシュ上の被照射体に照射することが可能である。なお、図３中の符号１８はＸ線の照射時間を調整・制御するためのシャッターを表す。
【００３８】
また、本実施形態のマイクロビームＸ線照射システム１０は共焦点レーザー顕微鏡（図示省略；オリンパス株式会社製ＦＶ300をベースに改造）を装備している。ただし、本発明においては共焦点レーザー顕微鏡を用いることは必須要件ではなく、細胞１の細胞質３にＸ線を照射して得られたデータを用いて行う分析・解析の目的に合わせて適当な顕微鏡を用いれば良い。
【００３９】
そして、例えば共焦点レーザー顕微鏡等も用いて必要なデータを収集した上で、当該細胞１に対するＸ線の照射の処理を終了する（ＥＮＤ）。なお、一個の細胞に対するＸ線の照射は、一回（一箇所）のみ行うようにしても良いし、必要な場合には複数回（複数箇所で）行うようにしても良い。そして、一個の細胞に対して複数回の照射を行う場合には、同一座標で複数回の照射を行うか、細胞核２の長軸方向５に沿って複数回の照射を行うようにする。なお、後者の場合、細胞核２の片側で長軸方向５に沿ってＸ線の照射を複数回行うようにしても良いし、細胞核２の両側に跨って長軸方向５に沿ってＸ線の照射を複数回行うようにしても良い。
【００４０】
以上のように構成された本発明の第一の実施形態の細胞質照射方法によれば、細胞核２の長軸方向５と細胞１全体の長軸方向とは通常は概ね揃うので細胞核２の長軸方向５に所定距離Ｄ1だけ離れた点は細胞質３である可能性が高く、このため、細胞１の細胞質３にＸ線を高い確率で照射することができる。しかも、細胞核２のみを染色することにより、すなわち、細胞核２と細胞(全体)１との両方の染色即ち二重染色をしないでも細胞１の細胞質３にＸ線を照射することができるので、毒性が高い染色試薬を用いないで済み、生細胞に与える影響を抑制してＸ線照射を行うことができる。また、細胞核２のみを対象とした画像処理によって、言い換えると、細胞核２と細胞(全体)１との両方を対象とした画像処理を行うことなく細胞１の細胞質３にＸ線を照射することができるので、画像の合成や細胞質部分３の抽出などの処理プロセスを行わないで済み、Ｘ線を細胞質に照射する作業の手間を軽減することができると共に処理時間を短縮することができる。
【００４１】
なお、上述の形態は本発明の第一の実施形態の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。
【００４２】
次に、図４及び図５を用いて、本発明の細胞質照射方法の第二の実施形態について説明する。なお、以下に説明する第二の実施形態において上述の第一の実施形態と同様の構成要素についてはその詳細な説明を省略する。
【００４３】
第二の実施形態の細胞質照射方法は、細胞核２のみを染色して撮影した細胞１の画像に基づいて細胞核２の重心位置４並びに当該重心位置４を通過する長軸５ａの端点７及び方向５を算定し、細胞核２の長軸５ａの端点７から細胞核２の長軸の方向５に所定距離Ｄ2だけ離れた位置６にＸ線を照射することにより細胞１の細胞質３にＸ線を照射するものである。
【００４４】
第二の実施形態は、Ｓ１からＳ３までの処理は上述の第一の実施形態と同じである。
【００４５】
そして、Ｓ４の処理として、第二の実施形態では、細胞核の長軸を特定する。
【００４６】
具体的には、Ｓ２の処理によって取得された細胞１の画像を用いて画像処理技術によって細胞核２の範囲を判別し、当該範囲（平面図形）の長軸５ａ（即ち、細胞核２の重心位置４を通る長径軸）を特定する。ここで、本発明における細胞核２の長軸５ａの特定とは、具体的には、細胞核２の範囲の重心を通る当該範囲の長径軸の両端を特定すると共に当該両端を結ぶ線分として特定することをいう。なお、図５においては、細胞核２の長軸方向は破線（符号５）で表し、長軸は実線（符号５ａ）で表している。
【００４７】
なお、当該Ｓ４の処理は特殊な処理ではなく、画像データを用いて所与の条件に合う線分の算出（ここでは、例えば任意に設定されたＸ−Ｙ平面における図形の長径軸の両端の座標の算出と当該両端の座標を結ぶ線分の座標群の算出、或いは長径軸の両端の画像ピクセルの算定と当該両端の画像ピクセルを結ぶ線分の画像ピクセル群の算定）の処理を行う従来の画像処理技術を用いて行うことが可能であり、このような画像処理技術は周知の技術であるのでここでは詳細については省略する。
【００４８】
次に、Ｘ線の照射位置を決定する（Ｓ５）。
【００４９】
第二の実施形態では、具体的には、Ｓ４の処理によって特定された細胞核２の長軸５ａの端点７（即ち、細胞核２の境界面）から細胞核２の外側に向かって長軸方向５に所定距離Ｄ2だけ離れた点をＸ線の照射位置６とする。
【００５０】
なお、所定距離Ｄ2は特定の値に絶対的に定まるものではなく、細胞１の細胞質３にＸ線を照射することができるように、例えば細胞１の大きさや細胞核２の長軸５ａの長さや照射するＸ線の直径などを考慮して適宜設定される。なお、必要な場合には、Ｘ線を照射する細胞自体若しくは同種の細胞を用いて細胞全体および細胞核の大きさ（例えば少なくとも長軸方向の長さ）を予め計測しておく。
【００５１】
具体的には例えば、細胞１の長軸の長さＬと細胞核２の長軸５ａの長さｌ（Ｓ４の処理において細胞核２の範囲の長径軸の両端の間の距離として算出され得る）との差分の四分の一程度の値を距離Ｄ2にしたり（数式１）、照射するＸ線の直径ｄの二倍を距離Ｄ2にしたりする（数式２）ことが考えられる。
（数式１） Ｄ2＝(Ｌ−ｌ)／４
（数式２） Ｄ2＝ｄ×２
【００５２】
なお、具体例を挙げると、例えば典型的な哺乳類細胞の核の大きさは長軸方向長さ１０μｍ程度と仮定され得ることなどに鑑み、所定距離Ｄ2を３〜５〔μｍ〕程度にすることが考えられる。
【００５３】
そして、Ｘ線を細胞に照射する（Ｓ６）。このＳ６の処理は第一の実施形態と同様である。
【００５４】
Ｓ３〜Ｓ５の処理によれば、高い確率で、細胞１の細胞質３にＸ線を照射することができる。
【００５５】
以上のように構成された本発明の第二の実施形態の細胞質照射方法によれば、細胞１の細胞質３にＸ線をより一層高い確率で照射することができる。すなわち、第二の実施形態によれば、細胞核２の長軸５ａの端点７（即ち、細胞核２の境界面）から長軸方向５に所定距離Ｄ2だけ離れた点を照射するようにすることにより、細胞核２の大きさに影響を受けることなくより一層確実に細胞質３にＸ線を照射することができる。
【００５６】
なお、第二の実施形態においても、生細胞に与える影響を抑制してＸ線照射を行うことができるという作用効果、及び、Ｘ線を細胞質に照射する作業の手間を軽減することができると共に処理時間を短縮することができるという作用効果は第一の実施形態と同様に発揮される。
【００５７】
なお、上述の形態は本発明の第二の実施形態の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。
【符号の説明】
【００５８】
１ 細胞
２ 細胞核
３ 細胞質
４ 細胞核の重心
５ 細胞核の長軸方向
６ 照射位置
Ｄ1 細胞核の重心位置からの所定距離
Ｄ2 細胞核の長軸の端点からの所定距離
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞質照射方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、直径が例えば数μｍのＸ線を細胞質に照射する際に用いて好適な技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
粒子線を細胞質に照射するための従来の方法として、図６に示すように、細胞１００(全体)及び当該細胞１００の細胞核１０１を各々染色（二重染色と呼ばれる）して細胞核１０１と細胞質１０２とを判別し、細胞核１０１の範囲及び細胞質１０２の範囲を画像解析によって算定し、当該算定の結果に基づいて粒子線の照射位置を決定するものがある（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Tartier L, Gilchrist S, Burdak-Rothkamm S, Folkard M, Prise KM、"Cytoplasmic irradiation induces mitochondrial-dependent 53BP1 protein relocalization in irradiated and bystander cells"、Cancer Res 2007; 67: (12)、pp.5872-5879、米国、2007年6月15日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、生細胞全体を染色する染色試薬は毒性が高いものが多く、細胞の生存に影響を与えることなく二重染色によって細胞質と細胞核とを判別することは困難であるという問題がある。また、仮に上記の問題が解決できたとしても、染色毎に波長が異なる蛍光フィルターを用いて撮影した画像を合成した上で細胞質部分を抽出して照射位置を決定するというプロセスでは処理時間が多大にかかってしまうので、実用的であるとは言い難い。
【０００５】
そこで、本発明は、細胞を二重染色することなく、言い換えると細胞全体を染色することなく細胞質にＸ線を照射することができる細胞質照射方法を提供することを目的とする。また、本発明は、細胞全体の大きさ，細胞核の大きさ，細胞全体における細胞核の位置に影響されることなく細胞質にＸ線を確実に照射することができる細胞質照射方法を提供することを目的とする。なお、本発明においては、直径が数μｍのＸ線のことをマイクロビームＸ線という。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かかる目的を達成するため、請求項１記載の細胞質照射方法は、細胞の細胞核の重心位置並びに当該重心位置を通過する長軸の方向を算定し、細胞核の重心位置から細胞核の長軸の方向に所定距離だけ離れた位置にＸ線を照射するようにしている。
【０００７】
また、請求項２記載の細胞質照射方法は、細胞核のみを染色して撮影した細胞の画像に基づいて細胞核の重心位置並びに当該重心位置を通過する長軸の方向を算定し、細胞核の重心位置から細胞核の長軸の方向に所定距離だけ離れた位置にＸ線を照射するようにしている。
【０００８】
したがって、請求項１，請求項２記載の細胞質照射方法によると、細胞核の長軸方向と細胞全体の長軸方向とは通常は概ね揃うので細胞核の長軸方向に所定距離だけ離れた点は細胞質である可能性が高く、このため、細胞の細胞質にＸ線を高い確率で照射することができる。しかも、細胞を一切染色することなく若しくは細胞核のみを染色することにより、すなわち、細胞核と細胞(全体)との両方の染色即ち二重染色をしないでも細胞の細胞質にＸ線を照射することができる。また、請求項２記載の細胞質照射方法の場合には特に、細胞核のみを対象とした画像処理によって、言い換えると、細胞核と細胞(全体)との両方を対象とした画像処理を行うことなく細胞の細胞質にＸ線を照射することができる。
【０００９】
また、請求項４記載の細胞質照射方法は、細胞の細胞核の重心位置並びに当該重心位置を通過する長軸の端点及び方向を算定し、細胞核の長軸の端点から細胞核の長軸の方向に所定距離だけ離れた位置にＸ線を照射するようにしている。
【００１０】
また、請求項５記載の細胞質照射方法は、細胞核のみを染色して撮影した細胞の画像に基づいて細胞核の重心位置並びに当該重心位置を通過する長軸の端点及び方向を算定し、細胞核の長軸の端点から細胞核の長軸の方向に所定距離だけ離れた位置にＸ線を照射するようにしている。
【００１１】
したがって、請求項４，請求項５記載の細胞質照射方法によると、請求項１，２記載の細胞質照射方法と比べてより一層確実に細胞の細胞質にＸ線を照射することができる。すなわち、細胞全体や細胞核の大きさは細胞毎に異なるので、細胞核の重心位置から所定距離だけ離れた点を照射するようにすると、細胞核が比較的大きい場合には当該細胞核内を照射してしまう虞があり、一方で細胞が比較的小さい場合には細胞外を照射してしまう虞がある。これに対し、この請求項４，請求項５記載の細胞質照射方法によれば、細胞核の長軸の端点（即ち、細胞核の境界面）から当該長軸の方向に所定距離だけ離れた点を照射するようにすることにより、細胞核の大きさに影響を受けることなくより一層確実に細胞質にＸ線を照射することができる。
【００１２】
また、請求項３記載の発明は、請求項１または２記載の細胞質照射方法において、前記所定距離が８〜１０μｍであるようにしている。また、請求項６記載の発明は、請求項４または５記載の細胞質照射方法において、前記所定距離が３〜５μｍであるようにしている。この場合には、一般的な細胞全体及び細胞核の大きさ（具体的には例えば、典型的な哺乳類細胞の核の大きさは長軸方向長さ１０μｍ程度と仮定され得る）に鑑みてより一層確実に細胞質にＸ線が照射される。
【００１３】
また、請求項７記載の発明は、請求項１，２，４，５のいずれか一つに記載の細胞質照射方法において、Ｘ線が直径1.8〜2.0μｍのマイクロビームであるようにしている。この場合には、一般的な細胞全体及び細胞核の大きさに鑑みて、Ｘ線が細胞核と細胞質とに跨って照射されてしまうことが回避され易くなる。
【発明の効果】
【００１４】
請求項１，請求項２記載の細胞質照射方法によれば、細胞の細胞質にＸ線を高い確率で照射することができるので、Ｘ線を細胞質に照射する作業における無駄を省いて作業効率の向上を図ることが可能になると共に、細胞質へのＸ線照射の信頼性の向上を図ることが可能になる。しかも、細胞核と細胞(全体)との両方の染色即ち二重染色をしないでも細胞の細胞質にＸ線を照射することができるので、毒性が高い染色試薬を用いないで済み、生細胞に与える影響を抑制してＸ線照射を行うことができる。また、請求項２記載の細胞質照射方法の場合には特に、細胞核と細胞(全体)との両方を対象とした画像処理を行うことなく細胞の細胞質にＸ線を照射することができるので、画像の合成や細胞質部分の抽出などの処理プロセスを行わないで済み、Ｘ線を細胞質に照射する作業の手間を軽減することができると共に処理時間を短縮することができ、実用性・汎用性の向上を図ることが可能になる。
【００１５】
請求項４，請求項５記載の細胞質照射方法によれば、請求項１，請求項２記載の細胞質照射方法の効果に加え、細胞核の大きさに影響を受けることなくより一層確実に細胞質にＸ線を照射することができるので、Ｘ線を細胞質に照射する作業における無駄を省いて作業効率のより一層の向上を図ることが可能になると共に、細胞質へのＸ線照射の信頼性のより一層の向上を図ることが可能になる。
【００１６】
また、請求項３，請求項６記載の細胞質照射方法によれば、一般的な細胞全体及び細胞核の大きさに鑑みてより一層確実に細胞質にＸ線を照射することができるので、Ｘ線を細胞質に照射する作業における無駄を省いて作業効率のより一層の向上を図ることが可能になると共に、細胞質へのＸ線照射の信頼性のより一層の向上を図ることが可能になる。
【００１７】
また、請求項７記載の細胞質照射方法によれば、一般的な細胞全体及び細胞核の大きさに鑑みて、Ｘ線が細胞核と細胞質とに跨って照射されてしまうことを回避することができるので、Ｘ線を細胞質に照射する作業における無駄を省いて作業効率のより一層の向上を図ることが可能になると共に、細胞質へのＸ線照射の信頼性のより一層の向上を図ることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の細胞質照射方法の第一の実施形態を説明するフローチャートである。
【図２】本発明の細胞質照射方法の第一の実施形態を説明する図で、細胞の細胞核と細胞質との模式図である。
【図３】本発明の細胞質照射方法に適用し得るＸ線照射システムの一例を説明する図である。
【図４】本発明の細胞質照射方法の第二の実施形態を説明するフローチャートである。
【図５】本発明の細胞質照射方法の第二の実施形態を説明する図で、細胞の細胞核と細胞質との模式図である。
【図６】従来の細胞質照射方法を説明する図で、細胞の細胞核と細胞質との模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の構成を図面に示す実施の形態の一例に基づいて詳細に説明する。
【００２０】
図１から図３に、本発明の細胞質照射方法の第一の実施形態を示す。第一の実施形態の細胞質照射方法は、細胞核２のみを染色して撮影した細胞１の画像に基づいて細胞核２の重心位置４並びに当該重心位置４を通過する長軸の方向５を算定し、細胞核２の重心位置４から細胞核２の長軸の方向５に所定距離Ｄ1だけ離れた位置６にＸ線を照射することにより細胞１の細胞質３にＸ線を照射するものである。
【００２１】
本発明の細胞質照射方法の実施にあたっては、まず、細胞核のみを染色する（Ｓ１）。
【００２２】
照射試料である細胞１の細胞核２の染色は、細胞１を試料皿（ディッシュ）に播種，接着させた上で、細胞核の染色処理として従来から用いられているものと同様の手順・染色試薬によって行う。染色試薬としては具体的には例えばHoechst 33258やHoechst 33342などの蛍光染色試薬が用いられる。なお、本発明では、細胞１の細胞核２のみを染色する。そして、本発明によれば、細胞毒性が低い例えばHoechstのみを染色試薬として用いて細胞質３にＸ線を照射することができるので、細胞の生存に影響を与えることがない。
【００２３】
次に、細胞核の画像を取得する（Ｓ２）。
【００２４】
具体的には、Ｓ１の処理によって細胞核２のみが染色された細胞１を接着させたディッシュを、Ｘ線を照射する機器・システムの所定の場所（例えば精密ステージ）に載置する。そして、細胞１を撮影して画像を取得する。
【００２５】
ここで、遺伝子組み換えによって細胞核自身が発光若しくは蛍光を発する場合、或いは細胞の位相差像若しくは微分干渉像が取得可能な場合など、染色しないでも適当な画像処理，解析によって細胞核を識別可能であれば、細胞核を染色（Ｓ１）する必要はない。
【００２６】
次に、細胞核の重心位置を算定する（Ｓ３）。
【００２７】
具体的には、Ｓ２の処理によって取得された細胞１の画像を用いて画像処理技術によって細胞核２の範囲を判別し、当該範囲（平面図形）の重心位置４を算定する。なお、当該Ｓ３の処理は特殊な処理ではなく、画像データを用いて所与の条件に合う座標算出（ここでは、例えば任意に設定されたＸ−Ｙ平面における座標の算出、或いは画像のピクセルの算定）の処理を行う従来の画像処理技術を用いて行うことが可能であり、このような画像処理技術は周知の技術であるのでここでは詳細については省略する。
【００２８】
次に、細胞核の長軸方向を特定する（Ｓ４）。
【００２９】
具体的には、Ｓ２の処理によって取得された細胞１の画像を用いて画像処理技術によって細胞核２の範囲を判別し、当該範囲（平面図形）の長軸方向５（即ち、細胞核２の重心位置４を通る長径軸の方向）を特定する。なお、当該Ｓ４の処理は特殊な処理ではなく、画像データを用いて所与の条件に合う角度算出（ここでは、例えば任意に設定されたＸ−Ｙ平面における図形の長径軸の角度の算出）の処理を行う従来の画像処理技術を用いて行うことが可能であり、このような画像処理技術は周知の技術であるのでここでは詳細については省略する。
【００３０】
次に、Ｘ線の照射位置を決定する（Ｓ５）。
【００３１】
第一の実施形態では、具体的には、Ｓ３の処理によって算定された細胞核２の重心位置４から、Ｓ４の処理によって特定された細胞核２の長軸方向５に所定距離Ｄ1だけ離れた点をＸ線の照射位置６とする。
【００３２】
なお、所定距離Ｄ1は特定の値に絶対的に定まるものではなく、細胞１の細胞質３にＸ線を照射することができるように、例えば細胞１および細胞核２の大きさや照射するＸ線の直径などを考慮して適宜設定される。なお、必要な場合には、Ｘ線を照射する細胞自体若しくは同種の細胞を用いて細胞全体および細胞核の大きさ（例えば少なくとも長軸方向の長さ）を予め計測しておく。
【００３３】
なお、具体例を挙げると、例えば典型的な哺乳類細胞の核の大きさは長軸方向長さ１０μｍ程度と仮定され得ることなどに鑑み、所定距離Ｄ1を８〜１０〔μｍ〕程度にすることが考えられる。
【００３４】
そして、Ｘ線を細胞に照射する（Ｓ６）。
【００３５】
Ｓ３〜Ｓ５の処理によれば、高い確率で、細胞１の細胞質３にＸ線を照射することができる。
【００３６】
ここで、本実施形態では、マイクロビームＸ線を細胞質３に照射する。そして、本発明では、Ｘ線を照射する機器・システムは特定のものには限定されず、被照射体（即ち、細胞１）へのＸ線照射位置の制御機能を有していると共に直径が例えば数μｍのＸ線を照射することができる機器・システムであれば何れでも良い。
【００３７】
本実施形態では、Ｘ線を照射する機器として本発明者らによって開発されたマイクロビームＸ線照射システムを用いる。このマイクロビームＸ線照射システム１０は、細胞核や細胞質の検出，照射位置の決定，Ｘ線の照射を自動的に行う機能を有し、図３に示すように、電子銃１１（株式会社オメガトロン製OME-0055LBW）から射出された電子線１２をアルミニウムターゲット１３に照射して発生させた1.49〔keV〕の特性Ｘ線１４を斜入射ミラー１５及び真空窓１６を介してフレネルゾーンプレート１７に到達させ、前記特性Ｘ線１４を当該フレネルゾーンプレート１７によって回折させ集光すると共にピンホール１９（Ｏrder Ｓelecting Ａpertuer：ＯＳＡ）を通過させて直径1.8〜2.0〔μｍ〕程度のマイクロビームＸ線にして精密ステージ２０（PRIOR Scientific社製H101BX）に設置されたディッシュ上の被照射体に照射することが可能である。なお、図３中の符号１８はＸ線の照射時間を調整・制御するためのシャッターを表す。
【００３８】
また、本実施形態のマイクロビームＸ線照射システム１０は共焦点レーザー顕微鏡（図示省略；オリンパス株式会社製ＦＶ300をベースに改造）を装備している。ただし、本発明においては共焦点レーザー顕微鏡を用いることは必須要件ではなく、細胞１の細胞質３にＸ線を照射して得られたデータを用いて行う分析・解析の目的に合わせて適当な顕微鏡を用いれば良い。
【００３９】
そして、例えば共焦点レーザー顕微鏡等も用いて必要なデータを収集した上で、当該細胞１に対するＸ線の照射の処理を終了する（ＥＮＤ）。なお、一個の細胞に対するＸ線の照射は、一回（一箇所）のみ行うようにしても良いし、必要な場合には複数回（複数箇所で）行うようにしても良い。そして、一個の細胞に対して複数回の照射を行う場合には、同一座標で複数回の照射を行うか、細胞核２の長軸方向５に沿って複数回の照射を行うようにする。なお、後者の場合、細胞核２の片側で長軸方向５に沿ってＸ線の照射を複数回行うようにしても良いし、細胞核２の両側に跨って長軸方向５に沿ってＸ線の照射を複数回行うようにしても良い。
【００４０】
以上のように構成された本発明の第一の実施形態の細胞質照射方法によれば、細胞核２の長軸方向５と細胞１全体の長軸方向とは通常は概ね揃うので細胞核２の長軸方向５に所定距離Ｄ1だけ離れた点は細胞質３である可能性が高く、このため、細胞１の細胞質３にＸ線を高い確率で照射することができる。しかも、細胞核２のみを染色することにより、すなわち、細胞核２と細胞(全体)１との両方の染色即ち二重染色をしないでも細胞１の細胞質３にＸ線を照射することができるので、毒性が高い染色試薬を用いないで済み、生細胞に与える影響を抑制してＸ線照射を行うことができる。また、細胞核２のみを対象とした画像処理によって、言い換えると、細胞核２と細胞(全体)１との両方を対象とした画像処理を行うことなく細胞１の細胞質３にＸ線を照射することができるので、画像の合成や細胞質部分３の抽出などの処理プロセスを行わないで済み、Ｘ線を細胞質に照射する作業の手間を軽減することができると共に処理時間を短縮することができる。
【００４１】
なお、上述の形態は本発明の第一の実施形態の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。
【００４２】
次に、図４及び図５を用いて、本発明の細胞質照射方法の第二の実施形態について説明する。なお、以下に説明する第二の実施形態において上述の第一の実施形態と同様の構成要素についてはその詳細な説明を省略する。
【００４３】
第二の実施形態の細胞質照射方法は、細胞核２のみを染色して撮影した細胞１の画像に基づいて細胞核２の重心位置４並びに当該重心位置４を通過する長軸５ａの端点７及び方向５を算定し、細胞核２の長軸５ａの端点７から細胞核２の長軸の方向５に所定距離Ｄ2だけ離れた位置６にＸ線を照射することにより細胞１の細胞質３にＸ線を照射するものである。
【００４４】
第二の実施形態は、Ｓ１からＳ３までの処理は上述の第一の実施形態と同じである。
【００４５】
そして、Ｓ４の処理として、第二の実施形態では、細胞核の長軸を特定する。
【００４６】
具体的には、Ｓ２の処理によって取得された細胞１の画像を用いて画像処理技術によって細胞核２の範囲を判別し、当該範囲（平面図形）の長軸５ａ（即ち、細胞核２の重心位置４を通る長径軸）を特定する。ここで、本発明における細胞核２の長軸５ａの特定とは、具体的には、細胞核２の範囲の重心を通る当該範囲の長径軸の両端を特定すると共に当該両端を結ぶ線分として特定することをいう。なお、図５においては、細胞核２の長軸方向は破線（符号５）で表し、長軸は実線（符号５ａ）で表している。
【００４７】
なお、当該Ｓ４の処理は特殊な処理ではなく、画像データを用いて所与の条件に合う線分の算出（ここでは、例えば任意に設定されたＸ−Ｙ平面における図形の長径軸の両端の座標の算出と当該両端の座標を結ぶ線分の座標群の算出、或いは長径軸の両端の画像ピクセルの算定と当該両端の画像ピクセルを結ぶ線分の画像ピクセル群の算定）の処理を行う従来の画像処理技術を用いて行うことが可能であり、このような画像処理技術は周知の技術であるのでここでは詳細については省略する。
【００４８】
次に、Ｘ線の照射位置を決定する（Ｓ５）。
【００４９】
第二の実施形態では、具体的には、Ｓ４の処理によって特定された細胞核２の長軸５ａの端点７（即ち、細胞核２の境界面）から細胞核２の外側に向かって長軸方向５に所定距離Ｄ2だけ離れた点をＸ線の照射位置６とする。
【００５０】
なお、所定距離Ｄ2は特定の値に絶対的に定まるものではなく、細胞１の細胞質３にＸ線を照射することができるように、例えば細胞１の大きさや細胞核２の長軸５ａの長さや照射するＸ線の直径などを考慮して適宜設定される。なお、必要な場合には、Ｘ線を照射する細胞自体若しくは同種の細胞を用いて細胞全体および細胞核の大きさ（例えば少なくとも長軸方向の長さ）を予め計測しておく。
【００５１】
具体的には例えば、細胞１の長軸の長さＬと細胞核２の長軸５ａの長さｌ（Ｓ４の処理において細胞核２の範囲の長径軸の両端の間の距離として算出され得る）との差分の四分の一程度の値を距離Ｄ2にしたり（数式１）、照射するＸ線の直径ｄの二倍を距離Ｄ2にしたりする（数式２）ことが考えられる。
（数式１） Ｄ2＝(Ｌ−ｌ)／４
（数式２） Ｄ2＝ｄ×２
【００５２】
なお、具体例を挙げると、例えば典型的な哺乳類細胞の核の大きさは長軸方向長さ１０μｍ程度と仮定され得ることなどに鑑み、所定距離Ｄ2を３〜５〔μｍ〕程度にすることが考えられる。
【００５３】
そして、Ｘ線を細胞に照射する（Ｓ６）。このＳ６の処理は第一の実施形態と同様である。
【００５４】
Ｓ３〜Ｓ５の処理によれば、高い確率で、細胞１の細胞質３にＸ線を照射することができる。
【００５５】
以上のように構成された本発明の第二の実施形態の細胞質照射方法によれば、細胞１の細胞質３にＸ線をより一層高い確率で照射することができる。すなわち、第二の実施形態によれば、細胞核２の長軸５ａの端点７（即ち、細胞核２の境界面）から長軸方向５に所定距離Ｄ2だけ離れた点を照射するようにすることにより、細胞核２の大きさに影響を受けることなくより一層確実に細胞質３にＸ線を照射することができる。
【００５６】
なお、第二の実施形態においても、生細胞に与える影響を抑制してＸ線照射を行うことができるという作用効果、及び、Ｘ線を細胞質に照射する作業の手間を軽減することができると共に処理時間を短縮することができるという作用効果は第一の実施形態と同様に発揮される。
【００５７】
なお、上述の形態は本発明の第二の実施形態の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。
【符号の説明】
【００５８】
１ 細胞
２ 細胞核
３ 細胞質
４ 細胞核の重心
５ 細胞核の長軸方向
６ 照射位置
Ｄ1 細胞核の重心位置からの所定距離
Ｄ2 細胞核の長軸の端点からの所定距離
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の細胞核の重心位置並びに当該重心位置を通過する長軸の方向を算定し、前記細胞核の重心位置から前記細胞核の長軸の方向に所定距離だけ離れた位置にＸ線を照射することを特徴とする細胞質照射方法。
【請求項２】
細胞核のみを染色して撮影した細胞の画像に基づいて前記細胞核の重心位置並びに当該重心位置を通過する長軸の方向を算定し、前記細胞核の重心位置から前記細胞核の長軸の方向に所定距離だけ離れた位置にＸ線を照射することを特徴とする細胞質照射方法。
【請求項３】
前記所定距離が８〜１０μｍであることを特徴とする請求項１または２記載の細胞質照射方法。
【請求項４】
細胞の細胞核の重心位置並びに当該重心位置を通過する長軸の端点及び方向を算定し、前記細胞核の長軸の端点から前記細胞核の長軸の方向に所定距離だけ離れた位置にＸ線を照射することを特徴とする細胞質照射方法。
【請求項５】
細胞核のみを染色して撮影した細胞の画像に基づいて前記細胞核の重心位置並びに当該重心位置を通過する長軸の端点及び方向を算定し、前記細胞核の長軸の端点から前記細胞核の長軸の方向に所定距離だけ離れた位置にＸ線を照射することを特徴とする細胞質照射方法。
【請求項６】
前記所定距離が３〜５μｍであることを特徴とする請求項４または５記載の細胞質照射方法。
【請求項７】
前記Ｘ線が直径1.8〜2.0μｍのマイクロビームであることを特徴とする請求項１，２，４，５のいずれか一つに記載の細胞質照射方法。
【請求項１】
細胞の細胞核の重心位置並びに当該重心位置を通過する長軸の方向を算定し、前記細胞核の重心位置から前記細胞核の長軸の方向に所定距離だけ離れた位置にＸ線を照射することを特徴とする細胞質照射方法。
【請求項２】
細胞核のみを染色して撮影した細胞の画像に基づいて前記細胞核の重心位置並びに当該重心位置を通過する長軸の方向を算定し、前記細胞核の重心位置から前記細胞核の長軸の方向に所定距離だけ離れた位置にＸ線を照射することを特徴とする細胞質照射方法。
【請求項３】
前記所定距離が８〜１０μｍであることを特徴とする請求項１または２記載の細胞質照射方法。
【請求項４】
細胞の細胞核の重心位置並びに当該重心位置を通過する長軸の端点及び方向を算定し、前記細胞核の長軸の端点から前記細胞核の長軸の方向に所定距離だけ離れた位置にＸ線を照射することを特徴とする細胞質照射方法。
【請求項５】
細胞核のみを染色して撮影した細胞の画像に基づいて前記細胞核の重心位置並びに当該重心位置を通過する長軸の端点及び方向を算定し、前記細胞核の長軸の端点から前記細胞核の長軸の方向に所定距離だけ離れた位置にＸ線を照射することを特徴とする細胞質照射方法。
【請求項６】
前記所定距離が３〜５μｍであることを特徴とする請求項４または５記載の細胞質照射方法。
【請求項７】
前記Ｘ線が直径1.8〜2.0μｍのマイクロビームであることを特徴とする請求項１，２，４，５のいずれか一つに記載の細胞質照射方法。
【図１】
【図３】
【図４】
【図２】
【図５】
【図６】
【図３】
【図４】
【図２】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−１９７０４（Ｐ２０１２−１９７０４Ａ）
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１５８０２６（Ｐ２０１０−１５８０２６）
【出願日】平成２２年７月１２日（２０１０．７．１２）
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月１２日（２０１０．７．１２）
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【Ｆターム（参考）】
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