【課題】ＭＡＳＴ２０５と相互作用する蛋白質を見出し、ＭＡＳＴ２０５の作用調節手段・ＭＡＳＴ２０５の異常に起因する疾患の防止や治療に有用な手段を提供する。
【解決手段】ＭＡＳＴ２０５が、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３／４／６／７、ｐ３８ ＭＡＰＫと結合すること、ＤＣＴＮ１をリン酸化すること、ＭＫＫ３／４／６、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＪＮＫのリン酸化に関与すること、細胞の遊走や浸潤に関与することを見出し、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害方法・阻害剤、癌転移の抑制方法・抑制剤、血管新生の抑制方法・抑制剤、細胞遊走抑制活性を有する化合物・ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３／４／６／７、またはｐ３８ ＭＡＰＫとの結合を阻害する化合物・ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法、試薬キットを提供。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤、該遊走阻害方法または該遊走阻害剤を用いる癌の転移抑制方法、該遊走阻害剤を含む癌の転移抑制剤、並びに血管新生抑制方法および血管新生抑制剤に関する。
【０００２】
より詳しくは、本発明はＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）の発現および／または機能を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤、並びに血管新生抑制方法および血管新生抑制剤に関する。さらに、本発明は、該遊走阻害方法または該遊走阻害剤を用いる癌の転移抑制方法、並びに該遊走阻害剤を含む癌の転移抑制剤に関する。
【０００３】
本発明はまた、前記方法および前記阻害剤に用いる化合物の同定方法、並びに試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００４】
ＭＡＳＴ２０５は、キナーゼドメインおよびＰＤＺドメインを保持するセリンスレオニンキナーゼである。ＭＡＳＴ２０５には、スプライシングバリアントと考えられる数種の変異体が知られている。具体的には、ＮＣＢＩデータベースにアクセッションナンバーＡＡＨ６５４９９（１７９７アミノ酸残基）、ＣＡＨ７３２４４（１７９８アミノ酸残基）、およびＢＡＢ４０７７８（１７３４アミノ酸残基）として開示されている各蛋白質が、ＭＡＳＴ２０５として知られている。ＣＡＨ７３２４４（１７９８アミノ酸残基）は、ＡＡＨ６５４９９（１７９７アミノ酸残基）のアミノ酸配列と比較して、第１２２４番目と第１２２５番目のアミノ酸残基の間にセリン残基が挿入されていることを除いて同一のアミノ酸配列を有する。ＢＡＢ４０７７８（１７３４アミノ酸残基）は、ＣＡＨ７３２４４（１７９８アミノ酸残基）のアミノ酸配列と比較して、第３８８番目、第６５９番目および第１５５０番目のアミノ酸残基がそれぞれグルタミン酸残基、メチオニン残基およびグリシン残基に置換し、かつ第１６８８番目以降の領域がフレームシフトしていることを除いて同一のアミノ酸配列を有する。
【０００５】
ＭＡＳＴ２０５は１９９３年、ワルデン（Ｗａｌｄｅｎ）らによって、微小管結合蛋白質（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）と複合体を形成するリン酸化酵素として最初にクローニングされ、精巣に分布することが報告された（非特許文献１）。また、ＭＡＳＴ２０５の発現がほとんどすべての正常組織で普遍的に認められるという報告がある（非特許文献２）。一方で、ＭＡＳＴ２０５の発現は、精子で、それも発達分化中の精子で最も高いという報告（非特許文献３）や、心臓で高い発現が認められるという報告（非特許文献２）がある。
【０００６】
ＭＡＳＴ２０５と相互作用する蛋白質が現在までにいくつか報告されている。例えば、神経筋接合部ではＭＡＳＴ２０５はＰＤＺドメインを介してβ２−シントロフィンと結合することが知られている（非特許文献２）。このようなＰＤＺドメインを介したＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質との結合は他にも知られており、プロトカドヘリン ＬＫＣやＰＴＥＮ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｔｅｎｓｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｄｅｌｅｔｅｄ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｔｅｎ）がＭＡＳＴ２０５と結合すると報告されている（それぞれ非特許文献４並びに非特許文献５および６）。ＰＴＥＮは腫瘍抑制ホスファターゼとして知られており、細胞増殖やアポトーシスに関連すると考えられている。ＰＴＥＮについては、ＭＡＳＴ２０５によるリン酸化も報告されており、ＭＡＳＴ２０５による機能的制御の可能性も示唆される（非特許文献６）。また、腎臓のＩＩａ型ナトリウム／リン コトランスポーター（ｔｙｐｅ ＩＩａ Ｎａ／Ｐｉ ｃｏｔｒａｎｓｐｏｔｅｒ）とＭＡＳＴ２０５の結合が報告されており（非特許文献７）、このトランスポーターもＰＤＺドメインを保持していることから、該結合はＰＤＺドメインを介した結合であると考えられる。
【０００７】
ＭＡＳＴ２０５の機能については、ＭＡＳＴ２０５の不活性体をトランスフェクションした細胞でリポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：以下、ＬＰＳと略称する）刺激に対するインターロイキン１２（以下、ＩＬ−１２と略称する）産生が抑制されていることが報告（非特許文献８）されている。また、ＭＡＳＴ２０５は、マクロファージをペプチドグリカンによるＴＬＲ−２（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２）刺激やＬＰＳによるＴＬＲ−４刺激により活性化したときのＩＬ−１２産生において必須の蛋白質であること（非特許文献８）、マクロファージにおけるＦｃγ受容体ＩＩＡ（ＦｃγＲ ＩＩＡ）刺激によってユビキチン化を受けプロテアソーム媒介型の分解を受けることが報告されている（非特許文献８）。さらに、ＭＡＳＴ２０５は、ユビキチンリガーゼとして機能するＴＲＡＦ２（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２）やＴＲＡＦ６と結合すること等も報告されている（非特許文献９）。
【０００８】
さらに、ＭＡＳＴ２０５に対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を用いてＭＡＳＴ２０５の発現をノックダウンすることにより癌細胞の増殖が阻害されたことが開示されている（特許文献１）。
【０００９】
【特許文献１】国際公報第２００４／０５８１５３号パンフレット。
【非特許文献１】ワルデン（Ｗａｌｄｅｎ Ｐ．Ｄ．）ら、「モレキュラー アンド セルラー バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９３年、第１３巻、第１２号、ｐ．７６２５−７６３５。
【非特許文献２】ルーメング（Ｌｕｍｅｎｇ Ｃ．）ら、「ネイチャー ニューロサイエンス（Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９９年、第２巻、第７号、ｐ．６１１−６１７。
【非特許文献３】ワルデン（Ｗａｌｄｅｎ Ｐ．Ｄ．）ら、「バイオロジー オブ リプロダクション（Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」、１９９６年、第５５巻、第５巻、ｐ．１０３９−１０４４。
【非特許文献４】オカザキ（Ｏｋａｚａｋｉ Ｎ．）ら、「カルシノジェネシス（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）」、２００２年、第２３巻、第７号、ｐ．１１３９−１１４８。
【非特許文献５】アデイ（Ａｄｅｙ Ｎ．Ｂ．）ら、「キャンサーリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第６０巻、第１号、ｐ．３５−３７。
【非特許文献６】ヴァリエンテ（Ｖａｌｉｅｎｔｅ Ｍ．）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００５年、第２８０巻、第３２号、ｐ．２８９３６−２８９４３。
【非特許文献７】ギスラー（Ｇｉｓｌｅｒ Ｓ．Ｍ．）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００１年、第２７６巻、第１２号、ｐ．９２０６−９２１３。
【非特許文献８】ゾウ（Ｚｈｏｕ Ｈ．）ら、「ザ ジャーナル オブ イムノロジー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、２００４年、第１７２巻、第４号、ｐ．２５５９−２５６８。
【非特許文献９】ション（Ｘｉｏｎｇ Ｈ．）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００４年、第２７９巻、第４２号、ｐ．４３６７５−４３６８３。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＭＡＳＴ２０５はセリンスレオニンキナーゼであり、様々な蛋白質と結合すること、また、刺激を受けたマクロファージにおけるＩＬ−１２産生や癌細胞の増殖に関与することが知られている。ＭＡＳＴ２０５と結合する新たな蛋白質を見出し、ＭＡＳＴ２０５の機能を明らかにすることにより、ＭＡＳＴ２０５の発現や機能の異常に起因する疾患を防止および／または治療できる。
【００１１】
本発明の課題は、ＭＡＳＴ２０５と相互作用してその作用を調節する蛋白質を見出して提供することである。また、本発明の課題には、ＭＡＳＴ２０５の作用を調節する手段を提供することが含まれる。さらに、本発明の課題には、ＭＡＳＴ２０５の異常に起因する疾患の防止および／または治療に有用な手段を提供することが含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、ＭＡＳＴ２０５が、ＤＣＴＮ１（ｄｙｎａｃｔｉｎ １）およびＴＩＡＭ１（Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １）それぞれと結合すること、さらにＤＣＴＮ１をリン酸化することを見出した。また、ＭＡＳＴ２０５に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞で、ｐ３８ ＭＡＰＫ（ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）、ＭＫＫ６（ＭＡＰＫ ｋｉｎａｓｅ ６）／ＭＫＫ３（ＭＡＰＫ ｋｉｎａｓｅ ３）、およびＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ）のリン酸化が阻害されることを見出した。
【００１３】
さらに本発明者らは、ＭＡＳＴ２０５が、ＭＬＫ３（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｉａｇｅ ｋｉｎａｓｅ ３）、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４（ＭＡＰＫ ｋｉｎａｓｅ ４）、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７（ＭＡＰＫ ｋｉｎａｓｅ ７）、およびｐ３８ ＭＡＰＫそれぞれと結合することを見出した。また、ＭＡＳＴ２０５に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞で、ＭＫＫ４のリン酸化が阻害されることを見出した。
【００１４】
ＤＣＴＮ１およびＴＩＡＭ１は、ｐ３８ ＭＡＰＫあるいはその上流のＭＫＫ６／ＭＫＫ３を介した情報伝達経路への関与が示唆されている。
【００１５】
ｐ３８ ＭＡＰＫは、癌の転移、血管新生、および免疫炎症応答に関与していることが知られている。また、ｐ３８ ＭＡＰＫは、ＭＡＰＫキナーゼキナーゼやＭＡＰＫキナーゼを介したキナーゼカスケードにより活性化される。ｐ３８ ＭＡＰＫの活性化には、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４およびＭＫＫ６が関与することが知られている。また、ｐ３８ ＭＡＰＫの活性化を、ＭＬＫ３がＭＫＫ３を介して促進することが知られている。
【００１６】
ＪＮＫは、細胞増殖や細胞死または免疫炎症応答に関与することが知られており、ＭＫＫ７／ＭＫＫ４によりリン酸化されることによりその機能が調節されている。
【００１７】
これらから発明者らは、ＭＡＳＴ２０５は、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、およびＭＫＫ６等の蛋白質とそれぞれ結合し、これら蛋白質が関与する情報伝達を促進することにより、ｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を促進し、その結果、癌の転移、血管新生、および免疫炎症応答に促進的に関与していると考えている。またＭＡＳＴ２０５は、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ４、およびＭＫＫ７等の蛋白質とそれぞれ結合し、これら蛋白質が関与する情報伝達を促進することにより、ＪＮＫのリン酸化にも関与し、その結果、癌の転移、血管新生、細胞増殖や細胞死または免疫炎症応答に関与すると発明者らは考えている。
【００１８】
本発明においてはさらに、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害することにより、細胞の遊走および浸潤が顕著に抑制されることを見出した。細胞の遊走および浸潤は癌の転移能の指標であることから、ＭＡＳＴ２０５は癌の転移に関与すると発明者らは考えている。
【００１９】
上記のようにＭＡＳＴ２０５が、細胞の遊走および浸潤、癌の転移、血管新生、細胞増殖や細胞死、並びに免疫炎症応答に関与すると考えられることから、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することにより癌の転移、血管新生、および免疫炎症応答を抑制できると発明者らは考えている。
【００２０】
本発明は、これら知見により完成した。
【００２１】
すなわち本発明は、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害方法に関する。
【００２２】
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５の機能が、下記の群から選択される１つ以上の機能である前記細胞遊走阻害方法に関する：
（１）ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、
（２）ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、
（３）ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、
（４）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、
（５）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、
（６）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、
（７）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、
（８）ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、
および
（９）ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性。
【００２３】
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性が、ＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性である前記細胞遊走阻害方法に関する。
【００２４】
さらにまた本発明は、細胞が癌細胞である前記細胞遊走阻害方法に関する。
【００２５】
また本発明は、細胞が内皮細胞である前記細胞遊走阻害方法に関する。
【００２６】
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉によりＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する前記細胞遊走阻害方法に関する。
【００２７】
さらにまた本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉がＭＡＳＴ２０５に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを用いて行うＲＮＡ干渉である前記細胞遊走阻害方法に関する。
【００２８】
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである前記細胞遊走阻害方法に関する。
【００２９】
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである前記細胞遊走阻害方法に関する。
【００３０】
さらにまた本発明は、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害剤に関する。
【００３１】
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５の機能が、下記の群から選択される１つ以上の機能である前記細胞遊走阻害剤に関する：
（１）ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、
（２）ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、
（３）ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、
（４）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、
（５）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、
（６）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、
（７）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、
（８）ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、
および
（９）ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性。
【００３２】
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性が、ＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性である前記細胞遊走阻害剤に関する。
【００３３】
さらに本発明は、細胞が癌細胞である前記細胞遊走阻害剤に関する。
【００３４】
さらにまた本発明は、細胞が内皮細胞である前記細胞遊走阻害剤に関する。
【００３５】
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを有効成分として含む前記細胞遊走阻害剤に関する。
【００３６】
さらにまた本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである前記細胞遊走阻害剤に関する。
【００３７】
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである前記細胞遊走阻害剤に関する。
【００３８】
さらに本発明は、前記いずれかの細胞遊走阻害方法を用いることを特徴とする癌の転移抑制方法に関する。
【００３９】
さらにまた本発明は、前記いずれかの細胞遊走阻害剤を用いることを特徴とする癌の転移抑制方法に関する。
【００４０】
また本発明は、前記いずれかの細胞の遊走阻害剤を含んでなる癌の転移抑制剤に関する。
【００４１】
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することを特徴とする血管新生の抑制方法に関する。
【００４２】
さらにまた本発明は、ＭＡＳＴ２０５の機能が、下記の群から選択される１つ以上の機能である前記血管新生の抑制方法に関する：
（１）ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、
（２）ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、
（３）ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、
（４）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、
（５）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、
（６）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、
（７）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、
（８）ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、
および
（９）ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性。
【００４３】
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性が、ＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性である前記血管新生の抑制方法に関する。
【００４４】
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉によりＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する前記血管新生の抑制方法に関する。
【００４５】
さらにまた本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉がＭＡＳＴ２０５に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを用いて行うＲＮＡ干渉である前記血管新生の抑制方法に関する。
【００４６】
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである前記血管新生の抑制方法に関する。
【００４７】
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドである前記血管新生の抑制方法に関する。
【００４８】
さらにまた本発明は、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することを特徴とする血管新生の抑制剤に関する。
【００４９】
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５の機能が、下記の群から選択される１つ以上の機能である前記血管新生の抑制剤に関する：
（１）ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、
（２）ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、
（３）ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、
（４）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、
（５）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、
（６）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、
（７）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、
（８）ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、
および
（９）ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性。
【００５０】
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性が、ＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性である前記血管新生の抑制剤に関する。
【００５１】
さらにまた本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを有効成分として含む前記血管新生の抑制剤に関する。
【００５２】
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである前記血管新生の抑制剤に関する。
【００５３】
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである前記血管新生の抑制剤に関する。
【００５４】
さらにまた本発明は、細胞の遊走を抑制する活性を有する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／または下記の群から選択される１つ以上の蛋白質とある化合物（以下、被検化合物と称する）とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５と該蛋白質との結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５と該蛋白質との結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する：
（ｉ）ＤＣＴＮ１、
（ｉｉ）ＴＩＡＭ１、
（ｉｉｉ）ＭＬＫ３、
（ｉｖ）ＭＫＫ３、
（ｖ）ＭＫＫ４、
（ｖｉ）ＭＫＫ６、
（ｖｉｉ）ＭＫＫ７、
および
（ｖｉｉｉ）ｐ３８ ＭＡＰＫ。
【００５５】
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＤＣＴＮ１と被検化合物とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。
【００５６】
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＴＩＡＭ１と被検化合物とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。
【００５７】
さらにまた本発明は、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＭＬＫ３と被検化合物とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。
【００５８】
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＭＫＫ３と被検化合物とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。
【００５９】
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＭＫＫ４と被検化合物とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。
【００６０】
さらにまた本発明は、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＭＫＫ６と被検化合物とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。
【００６１】
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＭＫＫ７と被検化合物とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。
【００６２】
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはｐ３８ ＭＡＰＫと被検化合物とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。
【００６３】
さらにまた本発明は、細胞の遊走を抑制する活性を有する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５と被検化合物とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５のリン酸化活性を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５のリン酸化活性を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。
【００６４】
また本発明は、ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＤＣＴＮ１と被検化合物とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。
【００６５】
さらに本発明は、ＭＡＳＴ２０５によるＴＩＡＭ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＴＩＡＭ１と被検化合物とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５によるＴＩＡＭ１のリン酸化を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５によるＴＩＡＭ１のリン酸化を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。
【００６６】
さらにまた本発明は、下記Ａ群から選択される１つ以上の成分と、下記Ｂ群から選択される１つ以上の成分とを有してなる試薬キットに関する：
ここで、Ａ群は、
（ａ）ＭＡＳＴ２０５、
（ｂ）ＭＡＳＴ２０５をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）上記（ｂ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｄ）上記（ｃ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなり、
Ｂ群は、
（ｅ）ＤＣＴＮ１およびＴＩＡＭ１から選ばれるいずれか１の蛋白質、
（ｆ）上記（ｅ）の蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｇ）上記（ｆ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｈ）上記（ｇ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなる。
【００６７】
また本発明は、下記Ａ群から選択される１つ以上の成分と、下記Ｂ群から選択される１つ以上の成分とを有してなる試薬キットに関する：
ここで、Ａ群は、
（ａ）ＭＡＳＴ２０５、
（ｂ）ＭＡＳＴ２０５をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）上記（ｂ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｄ）上記（ｃ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなり、
Ｂ群は、
（ｉ）ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６およびｐ３８ ＭＡＰＫから選ばれるいずれか１の蛋白質、
（ｊ）上記（ｉ）の蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｋ）上記（ｊ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｌ）上記（ｋ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなる。
【００６８】
さらに本発明は、下記Ａ群から選択される１つ以上の成分と、下記Ｂ群から選択される１つ以上の成分とを有してなる試薬キットに関する：
ここで、Ａ群は、
（ａ）ＭＡＳＴ２０５、
（ｂ）ＭＡＳＴ２０５をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）上記（ｂ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｄ）上記（ｃ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなり、
Ｂ群は、
（ｍ）ＭＬＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７およびＪＮＫから選ばれるいずれか１の蛋白質、
（ｎ）上記（ｍ）の蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｏ）上記（ｎ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｐ）上記（ｏ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなる。
【発明の効果】
【００６９】
本発明により、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤を提供できる。具体的には本発明により、ＭＡＳＴ２０５の発現、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、およびＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性から選ばれる少なくとも１を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤を提供できる。
【００７０】
ＭＡＳＴ２０５は、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、およびｐ３８ ＭＡＰＫ等の蛋白質とそれぞれ結合し、これら蛋白質が関与する情報伝達を促進することにより、ｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を促進し、その結果、癌の転移、血管新生、および免疫炎症応答に促進的に関与していると発明者らは考えている。またＭＡＳＴ２０５は、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ４、およびＭＫＫ７等の蛋白質とそれぞれ結合し、これら蛋白質が関与する情報伝達を促進することにより、ＪＮＫのリン酸化にも関与し、その結果、細胞増殖や細胞死または免疫炎症応答に関与すると発明者らは考えている。
【００７１】
実際に、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害することにより、細胞の遊走および浸潤が顕著に抑制されることを本発明において見出した。したがって、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することにより、癌の転移や免疫炎症応答を抑制できると発明者らは考えている。
【００７２】
このように本発明により、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する癌の転移抑制方法および転移抑制剤を提供できる。
【００７３】
ＭＡＳＴ２０５がｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化の促進に関与することを本発明において見出し、また、ｐ３８ ＭＡＰＫが血管新生に関与することが知られていることから、本発明によりＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する血管新生抑制用法および血管新生抑制剤を提供できる。
【００７４】
さらに本発明により、前記阻害方法、前記阻害剤、前記抑制方法および前記抑制剤に用いる化合物の同定方法を提供できる。具体的には例えば、細胞の遊走を抑制する活性を有する化合物の同定方法を提供できる。また、ＭＡＳＴ２０５の発現、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化、およびＭＡＳＴ２０５によるＴＩＡＭ１のリン酸化から選ばれる少なくとも１を阻害する化合物の同定方法を提供できる。
【００７５】
また本発明により、（Ａ）ＭＡＳＴ２０５、ＭＡＳＴ２０５をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組み換えベクターおよび該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれるいずれか１つの成分と、（Ｂ）ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫから選ばれるいずれか１つの蛋白質、該蛋白質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組み換えベクターおよび該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれるいずれか１つの成分とを有してなる試薬キットを提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７６】
以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。
本明細書においては単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「蛋白質」という用語を使用することがある。ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドはペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個以上のアミノ酸を含むものである。以降、アミノ酸を表記する場合、１文字または３文字にて表記することがある。
【００７７】
（細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤、癌の転移抑制方法および転移抑制剤、並びに血管新生の抑制方法および抑制剤）
本発明の一態様は、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤に関する。
【００７８】
本発明の一態様はまた、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することを特徴とする癌の転移抑制方法および転移抑制剤に関する。
【００７９】
本発明の一態様はまた、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することを特徴とする血管新生の抑制方法および抑制剤に関する。
【００８０】
「ＭＡＳＴ２０５」は、セリンスレオニンキナーゼであり、ほとんどすべての正常組織において普遍的に発現が認められている（非特許文献２）。一方、精子に、それも発達分化中の精子において最も発現が高いという報告（非特許文献３）や、心臓において高い発現が認められるという報告（非特許文献２）がある。
【００８１】
ＭＡＳＴ２０５として、配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来の蛋白質を好ましく例示できる。配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来の蛋白質は、本発明において汎用の遺伝子工学的手法により取得した遺伝子によりコードされる１７９７アミノ酸残基からなる蛋白質であり、キナーゼドメインおよびＰＤＺドメインを保持する。本蛋白質は、ＮＣＢＩデータベースにアクセッションナンバーＡＡＨ６５４９９（１７９７アミノ酸残基）として開示されているＭＡＳＴ２０５のアミノ酸配列と比較して、第３８８番目のアミノ酸残基がグルタミン酸残基に置換していることを除いて同一のアミノ酸配列を有する。本蛋白質が、公知ＭＡＳＴ２０５と著しく高い相同性を有し、公知ＭＡＳＴ２０５が有するキナーゼドメインおよびＰＤＺドメインと同一のアミノ酸配列からなるキナーゼドメインおよびＰＤＺドメインを保持することから、本蛋白質は、ＭＡＳＴ２０５であると考えることができる。後述するように、配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来の蛋白質が、ＤＣＴＮ１をリン酸化したこと（実施例２参照）から、機能の観点からも、本蛋白質はセリンスレオニンキナーゼであるＭＡＳＴ２０５であると考えることができる。
【００８２】
ＭＡＳＴ２０５は、配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来の蛋白質に制限されず、該蛋白質と配列相同性を有し、かつ該蛋白質と同様の構造的特徴および生物学的機能を有する蛋白質である限りにおいていずれの蛋白質も包含される。また、ＭＡＳＴ２０５をコードする遺伝子は、配列番号１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質をコードするポリヌクレオチドに制限されず、該ポリヌクレオチドと配列相同性を有し、かつ該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と同様の構造的特徴や生物学的機能を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドである限りにおいていずれのポリヌクレオチドも包含される。
【００８３】
配列相同性は、通常、アミノ酸配列または塩基配列の全体で５０％以上、好ましくは少なくとも７０％であることが適当である。より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、またさらにより好ましくは９５％以上であることが適当である。
【００８４】
配列番号１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と配列相同性を有する蛋白質には、該アミノ酸配列において、１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入といった変異が存するアミノ酸配列で表される蛋白質が含まれる。また、配列番号１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質をコードするポリヌクレオチドと配列相同性を有するポリヌクレオチドには、該ポリヌクレオチドの塩基配列において、１個以上、例えば１〜３００個、好ましくは１〜９０個、より好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜３０個、特に好ましくは１〜数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異が存する塩基配列で表されるポリヌクレオチドが含まれる。変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有する蛋白質あるいは該変異を有するポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と同様の構造的特徴および生物学的機能を有するものである限り特に制限されない。変異を有する蛋白質およびポリヌクレオチドは天然に存在するものであってよく、また人工的に変異を導入したものであってもよい。
【００８５】
配列番号１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質の構造的特徴は、酵素活性に関与するキナーゼドメイン、および同種または別種の蛋白質との結合に関与するＰＤＺドメインを例示できる。配列番号１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質は、そのアミノ酸配列の第５１２番目から７８５番目のアミノ酸領域にキナーゼドメインを、第１１０５番目から１１８６番目のアミノ酸領域にＰＤＺドメインを保持する。配列番号１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と同様の構造的特徴とは、該蛋白質に存在する上記ドメインと配列相同性を有しかつ同様の機能を有するドメインを意味する。ドメインの配列相同性は、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、またさらにより好ましくは９５％以上であることが適当である。
【００８６】
配列番号１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質の生物学的機能として、セリンスレオニンキナーゼ活性を例示できる。「セリンスレオニンキナーゼ活性」とは、本蛋白質が、基質となる他の蛋白質（以下、基質蛋白質と称することがある）と結合し、該基質蛋白質のあるセリン残基および／またはスレオニン残基のヒドロキシル基にアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のγ−リン酸基を転移させる反応を触媒することにより、該基質蛋白質をリン酸化する機能を意味する。「基質」とは、酵素によって触媒作用を受ける化合物または分子を意味する。本蛋白質のセリンスレオニンキナーゼ活性によりリン酸化される基質蛋白質として、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、およびＰＴＥＮを好ましく例示できる。本蛋白質の基質蛋白質は、これら例示した蛋白質に限定されず、本蛋白質のセリンスレオニンキナーゼ活性によりリン酸化される蛋白質である限りにおいていずれの蛋白質でもあり得る。
【００８７】
本蛋白質のセリンスレオニンキナーゼ活性の測定は、基質蛋白質のリン酸化を指標にして実施できる。本蛋白質による基質蛋白質のリン酸化は、自体公知の蛋白質リン酸化測定方法を用いて、本蛋白質と基質蛋白質とを共存させてリン酸化反応を行った後にリン酸化基質蛋白質を測定することにより実施できる。このような方法として、本蛋白質と基質蛋白質とをインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で共存させる方法、および本蛋白質と基質蛋白質とを細胞で発現させて両蛋白質をインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で共存させる方法のいずれも利用できる。リン酸化された基質蛋白質の検出は、例えば、リン酸化基質蛋白質に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングにより実施できる。また、リン酸化された基質蛋白質の検出は、リン酸化反応に放射性同位体標識したＡＴＰ、例えば［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰを用いて、リン酸化反応により基質蛋白質に転移された［γ−^３２Ｐ］の放射活性を測定することにより実施できる。具体的には、本実施例２を参照して本蛋白質のセリンスレオニンキナーゼ活性の測定を実施できる。
【００８８】
配列番号１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質の生物学的機能としてまた、他の蛋白質との結合を例示できる。本蛋白質と結合する蛋白質として、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＰＴＥＮ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、β２−シントロフィン、プロトカドヘリン ＬＫＣ、および腎臓のＩＩａ型ナトリウム／リン コトランスポーターを例示できる。本蛋白質と結合する蛋白質は、これら例示した蛋白質に限定されず、本蛋白質と結合する蛋白質である限りにおいていずれの蛋白質でもあり得る。「本蛋白質と他の蛋白質の結合」とは、本蛋白質と他の蛋白質とが、複合体を形成するように、水素結合、疎水結合または静電的相互作用等の非共有結合により相互作用することを意味する。ここでの結合とは、本蛋白質と他の蛋白質がその一部分において結合すれば足りる。例えば、本蛋白質または他の蛋白質を構成するアミノ酸の中に、両蛋白質の結合に関与しないアミノ酸が含まれていてもよい。また、本蛋白質と他の蛋白質により形成される複合体には、これら蛋白質とは別種の蛋白質が含まれていてもよい。本蛋白質と他の蛋白質との結合の測定は、ウェスタンブロッティング、免疫沈降法、プルダウン法、ツーハイブリッド法および蛍光共鳴エネルギー転移法等の自体公知の方法またはこれらの方法を組合わせることにより実施できる。
【００８９】
配列番号１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と配列相同性を有する蛋白質として、ＮＣＢＩデータベースにアクセッションナンバーＡＡＨ６５４９９、ＣＡＨ７３２４４、ＢＡＢ４０７７８、およびＢＡＡ３４５２７として開示されている各蛋白質を例示できる。これら蛋白質は配列番号１に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と比較して、ＰＤＺドメインのアミノ酸配列が同一であること、さらに、キナーゼドメインのアミノ酸配列が同一または１塩基置換の他は同一であることから、いずれも本蛋白質と同様の構造的特徴および生物学的機能を有すると考えることができる。
【００９０】
「ＭＡＳＴ２０５の発現」とは、ＭＡＳＴ２０５をコードするＤＮＡの遺伝子情報がｍＲＮＡに転写されること、または、ｍＲＮＡに転写され、かつ蛋白質（ＭＡＳＴ２０５）のアミノ酸配列として翻訳されることをいう。
【００９１】
「ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害する」とは、ＭＡＳＴ２０５をコードするＤＮＡの遺伝子情報がｍＲＮＡに転写される過程、または、ｍＲＮＡに転写され、かつ蛋白質（ＭＡＳＴ２０５）のアミノ酸配列として翻訳される過程で生じる様々な反応の少なくとも１つを妨げることにより、ＭＡＳＴ２０５遺伝子の転写・翻訳によるＭＡＳＴ２０５の生成を妨げることを意味する。
【００９２】
ＭＡＳＴ２０５の発現の阻害は、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害する化合物を用いて実施できる。このような化合物として、好ましくはＭＡＳＴ２０５の発現を特異的に阻害する化合物、より好ましくはＭＡＳＴ２０５の発現を特異的に阻害する低分子量化合物を挙げることができる。ＭＡＳＴ２０５の発現を特異的に阻害するとは、当該発現を強く阻害するが、他の蛋白質の発現は阻害しないか、弱く阻害することを意味する。低分子量化合物とは、ペプチド、ペプチド様物質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、有機化合物、および無機化合物が含まれ、その分子量が好ましくは１００００以下、より好ましくは５０００以下、さらに好ましくは１０００以下、さらにより好ましくは５００以下の化合物を意味する。ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害する化合物は、後述する化合物の同定方法を用いて取得できる。
【００９３】
ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害する化合物として、ＭＡＳＴ２０５の発現をＲＮＡ干渉の手法により低下または消失させ得るｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を例示できる（エルバシ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ Ｓ．Ｍ．）ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２００１年、第４１１巻、ｐ．４９４−４９８；およびパディソン（Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ．Ｊ．）ら、「ジーンズ アンド ディベロプメント（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、２００２年、第１６巻、ｐ．９４８−９５８）。
【００９４】
ＭＡＳＴ２０５に対するｓｉＲＮＡは、ＭＡＳＴ２０５ ｍＲＮＡの部分配列からなるＲＮＡ（センスＲＮＡ）と該ＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）とを、ＭＡＳＴ２０５ ｍＲＮＡの配列に基づいて設計し、自体公知の化学合成法により合成し、得られた両ＲＮＡをハイブリダイゼーションさせることにより製造できる。ｓｉＲＮＡを構成するセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡは、それぞれ数個ないし１０数個程度のヌクレオチドからなることが好ましい。また、それぞれ、その３´末端に、オーバーハング配列と呼ばれる１個ないし数個の塩基配列からなるヌクレオチドを結合させることが好ましい。オーバーハング配列は、ＲＮＡをヌクレアーゼから保護する作用を有する。オーバーハング配列は、該ＲＮＡのＲＮＡ干渉効果を阻害しない限りにおいて特に制限されず、好ましくは１個ないし１０個、より好ましくは１個ないし４個、さらに好ましくは２個のヌクレオチドからなるものをいずれも用いることができる。具体的には、デオキシチミジル酸からなる配列（例えばＴＴ）、ウリジル酸からなる配列（例えばＵＵ）、デオキシチミジル酸に続いて任意のヌクレオチドが結合した配列（例えばＴＮ）といった配列を例示できる。合成を安価に行えることおよびヌクレアーゼ耐性がより強いことから、より好ましくは、２つのデオキシチミジル酸からなる配列をオーバーハング配列として用いる。オーバーハング配列は、センスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡのそれぞれの３´末端のリボース３´水酸基部位にジエステル結合により結合させる。
【００９５】
ＭＡＳＴ２０５に対するｓｉＲＮＡとして、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを例示できる。配列表の配列番号２に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドとして、具体的には、配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが例示できる。配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。ＭＡＳＴ２０５に対するｓｉＲＮＡは上記例示したものに制限されず、ＭＡＳＴ２０５の発現をＲＮＡ干渉の手法により低下または消失させ得るものであればいずれを用いることもできる。
【００９６】
蛋白質の発現をＲＮＡ干渉の手法により低下または消失させ得るｓｉＲＮＡとしてまた、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）を例示できる。ｓｈＲＮＡは、ヘアピン構造を有する短鎖二重鎖ＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡと同様、ＲＮＡ干渉により遺伝子の発現を抑制する（パディソン（Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ．Ｊ．）ら、「ジーンズ アンド ディベロプメント（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、２００２年、第１６巻、ｐ．９４８−９５８）。ｓｈＲＮＡは、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとが例えばオリゴヌクレオチド等により連結され、センスＲＮＡ由来部分とアンチセンスＲＮＡ由来部分が二重鎖を形成するため、ヘアピン様構造を呈する。ｓｈＲＮＡは、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡに加え、これら２つのＲＮＡを連結しかつループ構造を形成するようなオリゴヌクレオチドを含むＲＮＡを、ＭＡＳＴ２０５ ｍＲＮＡの塩基配列に基づいて設計して、自体公知の方法により製造することができる。好ましくは、センスＲＮＡの３´末端とループ構造を形成するオリゴヌクレオチドの５´末端とが結合し、さらにループ構造を形成するオリゴヌクレオチドの３´末端とアンチセンスＲＮＡの５´末端とが結合したオリゴヌクレオチドであることが望ましい。ループ構造を形成するオリゴヌクレオチドとは、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの間に存在して両ＲＮＡを連結でき、それ自体がループ構造を形成するものを意味する。このようなオリゴヌクレオチドの設計は、文献（パディソン（Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ．Ｊ．）ら、「ジーンズ アンド ディベロプメント（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、２００２年、第１６巻、ｐ．９４８−９５８）の記載を参考にして実施できる。好ましくは４個ないし２３個、より好ましくは４個ないし８個のヌクレオチドからなるものが望ましい。例えば、ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ（Ａｍｂｉｏｎ社製またはＯｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ社製）、ＡＡＣＧＴＴ、ＴＴＡＡ、ＣＡＡＧＣＴＴＣ等の配列を挙げることができる。ヘアピン構造を有する二重鎖の形成は、センスＲＮＡ由来部分とアンチセンスＲＮＡ由来部分とを慣用の方法でアニーリングすることにより実施できる。
【００９７】
また、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害する化合物として、ＭＡＳＴ２０５遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドを例示できる。
【００９８】
ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害する機能を有するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびアンチセンスポリヌクレオチドの選択は、適当な細胞にＭＡＳＴ２０５遺伝子とｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびアンチセンスポリヌクレオチドのいずれか１つとをコトランスフェクション（共遺伝子導入）し、ＭＡＳＴ２０５の発現をウエスタンブロッティング等の自体公知の方法により検出し、ＭＡＳＴ２０５の発現が阻害されるか否かを確認することにより実施できる。
【００９９】
内在性のＭＡＳＴ２０５の発現の阻害は、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害する機能を有するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびアンチセンスポリヌクレオチドを、適当な遺伝子工学的手法、例えばリポフェクションにより細胞内に導入することにより達成できる。
【０１００】
ここでは、阻害効果を有する化合物（例えば競合阻害効果を有する低分子化合物等）を阻害剤と称する。
【０１０１】
「ＭＡＳＴ２０５の機能」とは、ＭＡＳＴ２０５が備えている働きを意味する。ＭＡＳＴ２０５の機能として、上述したように、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性、およびＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質との結合を例示できる。ＭＡＳＴ２０５が結合する蛋白質として、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＰＴＥＮ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、β２−シントロフィン、プロトカドヘリン ＬＫＣ、および腎臓のＩＩａ型ナトリウム／リン コトランスポーターを好ましく例示できる。
【０１０２】
ＭＡＳＴ２０５の機能としてより具体的には、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、ＭＡＳＴ２０５のＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性を例示できる。ＭＡＳＴ２０５のＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性とは、ＭＡＳＴ２０５がＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１のセリン残基および／またはスレオニン残基をリン酸化する活性を意味する。
【０１０３】
「ＭＡＳＴ２０５の機能を阻害する」とは、ＭＡＳＴ２０５が備えている働きを低減させるまたは消失させることを意味する。ＭＡＳＴ２０５の機能を阻害することとして、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性、およびＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質との結合のうちの少なくとも１を阻害することを例示できる。より具体的には、ＭＡＳＴ２０５の機能を阻害することとして、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、ＭＡＳＴ２０５のＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性のうちの少なくとも１を阻害することを例示できる。
【０１０４】
ＭＡＳＴ２０５の機能の阻害は、ＭＡＳＴ２０５の機能を阻害する化合物を用いて実施できる。このような化合物として、好ましくはＭＡＳＴ２０５の機能を特異的に阻害する化合物、より好ましくはＭＡＳＴ２０５の機能を特異的に阻害する低分子量化合物を挙げることができる。ＭＡＳＴ２０５の機能を特異的に阻害するとは、当該機能を強く阻害するが、他の蛋白質の機能は阻害しないか、弱く阻害することを意味する。ＭＡＳＴ２０５の機能を阻害する化合物は、後述する化合物の同定方法を用いて取得できる。
【０１０５】
ＭＡＳＴ２０５の機能の阻害は、具体的には、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性、およびＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質との結合のうちの少なくとも１を阻害する化合物により実施できる。より具体的には、ＭＡＳＴ２０５の機能の阻害は、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、ＭＡＳＴ２０５のＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性のうちの少なくとも１を阻害する化合物を用いて実施できる。
【０１０６】
ＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質との結合を阻害する化合物のうち、ＭＡＳＴ２０５と基質蛋白質の結合を阻害する化合物は、該結合を阻害する結果、ＭＡＳＴ２０５の該基質蛋白質への作用を阻害するため、例えば、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性による該基質蛋白質のリン酸化を阻害する。具体的には、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害する化合物は、ＭＡＳＴ２０５のＤＣＴＮ１への作用を阻害するため、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性によるＤＣＴＮ１のリン酸化を阻害する。また、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合を阻害する化合物は、ＭＡＳＴ２０５のＴＩＡＭ１への作用を阻害するため、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性によるＴＩＡＭ１のリン酸化を阻害する。
【０１０７】
ＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質との結合を阻害する化合物として、ＭＡＳＴ２０５の不活性変異体（以下、不活性型ＭＡＳＴ２０５と称することがある）を例示できる。「ＭＡＳＴ２０５の不活性変異体」とは、ＭＡＳＴ２０５の変異体であって、セリンスレオニンキナーゼ活性がＭＡＳＴ２０５と比較して減弱したまたは消失したＭＡＳＴ２０５変異体を意味する。好ましい不活性型ＭＡＳＴ２０５として、ＭＡＳＴ２０５にアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異が導入されたＭＡＳＴ２０５変異体であって、ＭＡＳＴ２０５が結合する他の蛋白質との結合能を有するが、セリンスレオニンキナーゼ活性を有さないＭＡＳＴ２０５変異体を例示できる。このような不活性型ＭＡＳＴ２０５は、野生型のＭＡＳＴ２０５と拮抗して他の蛋白質と結合することにより、該蛋白質に対するＭＡＳＴ２０５の作用を阻害できる。不活性型ＭＡＳＴ２０５は、天然に存在するものであってもよく、人工的に変異を導入したものであってもよい。不活性型ＭＡＳＴ２０５における変異部位として、ＭＡＳＴ２０５のアミノ酸配列においてＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性に必要な部位を例示できる。不活性型ＭＡＳＴ２０５は、ＭＡＳＴ２０５のアミノ酸配列に基づいて所望の蛋白質を設計して公知の方法で製造し、取得した蛋白質の中からＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質との結合を阻害するものを、後述する化合物の同定方法に記載の方法を用いて選別することにより取得できる。
【０１０８】
ＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質の結合を阻害する化合物としてまた、ＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質とが結合する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを例示できる。このようなポリペプチドは、蛋白質間の結合を競合的に阻害することができる。このようなポリペプチドは、ＭＡＳＴ２０５またはＭＡＳＴ２０５と結合する蛋白質のアミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成法により合成したものから、ＭＡＳＴ２０５と該他の蛋白質の結合を阻害するものを選択することにより取得できる。このように特定されたポリペプチドに、１〜数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入したものも本発明の範囲に包含される。このような変異を導入したポリペプチドは、ＭＡＳＴ２０５と該他の蛋白質の結合を阻害するものが好ましい。変異を有するポリペプチドは天然に存在するものであってよく、また人工的に変異を導入したものであってもよい。これらポリペプチドは、後述する一般的な製造方法により取得できる。
【０１０９】
ＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質の結合を阻害する化合物としてまた、ＭＡＳＴ２０５またはＭＡＳＴ２０５と結合する蛋白質を認識する抗体であって、ＭＡＳＴ２０５と該他の蛋白質の結合を阻害する抗体およびそのフラグメントを例示できる。かかる抗体は、ＭＡＳＴ２０５またはＭＡＳＴ２０５と結合する蛋白質自体、またはこれらの断片、好ましくはＭＡＳＴ２０５と該他の蛋白質が結合する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として自体公知の抗体作製法により取得できる。
【０１１０】
ＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質の結合を阻害する化合物としてさらにまた、ＭＡＳＴ２０５またはＭＡＳＴ２０５と結合する蛋白質を特異的に認識するアプタマーであって、ＭＡＳＴ２０５と該他の蛋白質の結合を阻害するアプタマーを例示できる。アプタマーは、核酸アプタマーまたはペプチドアプタマーのいずれであってもよい。かかるアプタマーは、公知の方法（例えば、ハーマン（Ｈｅｒｍａｎｎ Ｔ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、２０００年、第２８７巻、第５４５４号、ｐ．８２０−８２５；バーグスタラー（Ｂｕｒｇｓｔａｌｌｅｒ Ｐ．）ら、「カレント オピニオン イン ドラッグ ディスカバリー アンド ディベロプメント（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、２００２年、第５巻、第５号、ｐ．６９０−７００；およびホップ−セイラー（Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ Ｆ．）ら、２００２年、「カレント モレキュラー メディシン（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、２００４年、第４巻、第５号、ｐ．５２９−５３８）に記載された方法）を用いて取得することができる。
【０１１１】
ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する化合物は、ＭＡＳＴ２０５が、基質蛋白質と結合し、該基質蛋白質のあるセリン残基および／またはスレオニン残基のヒドロキシル基にアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のγ−リン酸基を転移させる反応を触媒することにより、該基質蛋白質をリン酸化する一連の反応において生じる様々な反応のうち少なくともいずれか１を阻害する化合物であり得る。例えば、ＭＡＳＴ２０５のＤＣＴＮ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する化合物は、ＭＡＳＴ２０５が、ＤＣＴＮ１と結合し、ＤＣＴＮ１をリン酸化する一連の反応において生じる様々な反応のうち少なくともいずれか１を阻害する化合物であり得る。また、ＭＡＳＴ２０５のＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する化合物は、ＭＡＳＴ２０５が、ＴＩＡＭ１と結合し、ＴＩＡＭ１をリン酸化する一連の反応において生じる様々な反応のうち少なくともいずれか１を阻害する化合物であり得る。
【０１１２】
ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する化合物として、ＭＡＳＴ２０５に特異的に結合しそのセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する抗体またはそのフラグメントを例示できる。また、ＭＡＳＴ２０５に特異的に結合しそのセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する活性を有するアプタマーを例示できる。抗体あるいはアプタマーは上述の方法で取得でき、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性に対するこれらの阻害活性を後述する化合物の同定方法に記載の方法で測定することにより、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する活性を有する抗体あるいはアプタマーを取得できる。
【０１１３】
本発明においては、ＭＡＳＴ２０５として配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来の蛋白質を用い、該蛋白質が、ＤＣＴＮ１およびＴＩＡＭ１それぞれと結合すること、さらにＤＣＴＮ１をリン酸化することを見出した（実施例１および２参照）。また、該蛋白質に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞で、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＫＫ６／ＭＫＫ３、およびＪＮＫのリン酸化が阻害されることを見出した（実施例３参照）。
【０１１４】
さらに本発明において、ＭＡＳＴ２０５が、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、およびｐ３８ ＭＡＰＫそれぞれと結合することを見出した（実施例６参照）。また、ＭＡＳＴ２０５に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞で、ＭＫＫ４のリン酸化が阻害されることを見出した（実施例７参照）。
【０１１５】
ＤＣＴＮ１は、１０〜１１個のサブユニット（それぞれ２２〜１５０ｋＤのサイズ）からなる巨大分子であるダイナクチンの最大サブユニットであり、１２７８アミノ酸残基からなる。本蛋白質は、ストレス刺激、例えばソルビトール刺激によるｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化にＭＫＫ３あるいはＭＫＫ６の活性化を介して関与している（チェウン（Ｃｈｅｕｎｇ Ｐ．）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００４年、第２７９巻、第４４号、ｐ．４５３０８−４５３１１）。
【０１１６】
ＴＩＡＭ１は、１５９１アミノ酸残基からなる蛋白質であり、ＰＤＺドメインを有し、グアニン二リン酸−グアニン三リン酸（ＧＤＰ−ＧＴＰ）交換因子活性を示す。本蛋白質は、Ｔ細胞腫の浸潤、転移に関与することが知られている。その他、本蛋白質は神経細胞分化にも関与することが知られている。本蛋白質は急性骨髄性白血病を発症したダウン症の子供の骨髄で過剰発現している。本蛋白質はＭＫＫ３を介してｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化に関与している（バックスバウム（Ｂｕｃｈｓｂａｕｍ Ｒ．Ｊ．）ら、「モレキュラー アンド セルラー バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、２００２年、第２２巻、第１２号、ｐ．４０７３−４０８５）。
【０１１７】
ＤＣＴＮ１およびＴＩＡＭ１は、ｐ３８ ＭＡＰＫあるいはその上流のＭＫＫ６／ＭＫＫ３を介した情報伝達経路への関与が示唆されている。
【０１１８】
ｐ３８ ＭＡＰＫおよびＪＮＫは、ＭＡＰキナーゼ（以下、ＭＡＰＫと略称することがある）ファミリーに属するセリンスレオニンキナーゼである。
【０１１９】
ＭＡＰキナーゼは細胞内情報伝達系において重要な役割を果たすプロテインキナーゼの一つであり、関連する一連のプロテインキナーゼとともに連鎖的に活性化することによって、細胞膜表面のシグナルを核内に伝達する働きをしている。ＭＡＰＫが関与する細胞内情報伝達経路（以下、ＭＡＰキナーゼ経路と称することがある）には、キナーゼカスケードが存在し、該キナーゼカスケードにおいて、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（以下、ＭＡＰＫＫＫまたはＭＡＰ３Ｋと略称することがある）によりＭＡＰキナーゼキナーゼ（以下、ＭＡＰＫＫまたはＭＡＰ２Ｋと略称することがある）がリン酸化されて活性化され、次いでＭＡＰＫＫによりＭＡＰＫがリン酸化されて活性化する。ＭＡＰキナーゼカスケードにおいて活性化されたＭＡＰＫは数々の転写因子をリン酸化し、その結果、該転写因子により様々な遺伝子の転写が開始される。このＭＡＰキナーゼカスケードは、細胞増殖刺激やストレス刺激等の様々な刺激によって発生する様々な細胞内シグナル伝達系で働いている。
【０１２０】
ＭＡＰ３Ｋ、ＭＡＰ２Ｋ、およびＭＡＰＫには多くのファミリー蛋白質が知られている。例えば、ＭＡＰ３Ｋファミリー蛋白質として、ＭＬＫ、ＭＥＫＫ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ）、およびＡＳＫ１（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ １）等の蛋白質が知られている。また、ＭＡＰＫＫファミリー蛋白質として、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、およびＭＫＫ７等の蛋白質が知られている。ＭＡＰＫファミリー蛋白質として、ｐ３８ ＭＡＰＫ（α／β／γ／δ）、ＪＮＫ（ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、およびＪＮＫ３等）、およびＥＲＫ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ：ＥＲＫ２、ＥＲＫ３等）等が知られている。
【０１２１】
ＭＬＫ３は、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ １１とも呼称され、ＭＡＰ３Ｋファミリーに属するセリンスレオニンキナーゼである。ＭＬＫ３は、８４７アミノ酸残基からなる蛋白質であり、分子内にＳＨ３ドメインやロイシンジッパーモチーフを有する。活性ループ内のセリン・スレオニン残基、特にアミノ酸配列中第２７７番目のスレオニン残基（Ｔｈｒ２７７）は自己リン酸化する。また、アミノ酸配列中第５５５番目および第５５６番目のセリン残基（Ｓｅｒ５５５およびＳｅｒ５５６）のリン酸化はＣＤＣ４２により誘導される。ＭＬＫ３はＭＡＰＫ８／ＪＮＫ１を活性化し、ＪＮＫシグナル伝達経路の促進的調節因子として機能することや、ＭＫＫ３を介してｐ３８の活性化を促進することなどが知られている。またＭＬＫ３は、ＩκＢキナーゼαとβを直接リン酸化することができ、ＲｈｏファミリーＧＴＰアーゼやＣＤＣ４２を介したＮＦ−κＢの活性への関与も示唆されている。
【０１２２】
ＭＫＫ３は、ＭＡＰ２Ｋファミリーに属するセリンスレオニンキナーゼであり、３４７アミノ酸残基からなる。ＭＫＫ３はサイトカインや環境ストレスにより活性化され、ｐ３８ ＭＡＰＫのスレオニンやチロシン残基をリン酸化することが知られている。
【０１２３】
ＭＫＫ４は、ＳＥＫ１とも称され、ＭＡＰ２Ｋファミリーに属するセリンスレオニンキナーゼであり、３９９アミノ酸残基からなる。ＭＫＫ４はサイトカインや環境ストレスにより活性化される。また、ＭＡＰキナーゼ経路においてＪＮＫ１／ＭＡＰＫ８、ＪＮＫ２／ＭＡＰＫ９およびｐ３８ ＭＡＰＫを活性化するが、ＥＲＫ２／ＭＡＰＫ１やＥＲＫ３／ＭＡＰＫ３は活性化しないことが知られている。
【０１２４】
ＭＫＫ６は、ＭＡＰ２Ｋファミリーに属するセリンスレオニンキナーゼであり、３３４アミノ酸残基からなる。ＭＫＫ６は、サイトカインや環境ストレスにより活性化され、ｐ３８ ＭＡＰＫのスレオニンやチロシン残基をリン酸化することが知られている。また、ＭＫＫ６は、ストレスにより誘発される細胞周期停止、転写の活性化およびアポトーシスに関与している。
【０１２５】
ＭＫＫ７は、ＭＡＰ２Ｋファミリーに属するセリンスレオニンキナーゼであり、４１９アミノ酸残基からなる。ＭＫＫ７はサイトカインや環境ストレスにより活性化され、ＪＮＫ１やＪＮＫ２を活性化することが知られている。また、ＭＫＫ７は、ＭＡＰ３Ｋ１／ＭＥＫＫ１、ＭＡＰ３Ｋ２／ＭＥＫＫ２、ＭＡＰ３Ｋ３／ＭＥＫＫ５等のＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼやＭＡＰ４Ｋ２／ＧＣＫによりリン酸化され活性化する。
【０１２６】
ｐ３８ ＭＡＰＫは、ＭＡＰＫファミリーに属するセリンスレオニンキナーゼであり、３６０アミノ酸残基からなる。ｐ３８ ＭＡＰＫは、細胞内でのシグナル伝達経路で重要な働きをしており、環境ストレス、炎症性サイトカインおよびＬＰＳにより活性化され、インターロイキン６（ＩＬ−６）等のサイトカイン産生や細胞増殖、分化、転写調節等に関与し、ストレス応答やアポトーシスといった様々な細胞の応答を制御している。ｐ３８ ＭＡＰＫは、ＭＡＰＫＫＫファミリーやＭＡＰＫＫファミリーに属するキナーゼを介したキナーゼカスケードによって活性化される。ｐ３８ ＭＡＰＫは、基質としてＥＬＫ１やＡＴＦ２のような多くの転写因子をリン酸化して転写を促進する。また、ＭＡＰキナーゼ経路において下流に位置するＭＡＰＫＡＰＫ２やＭＡＰＫＡＰＫ５のようなキナーゼのリン酸化を介してシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）やサイトカインのｍＲＮＡを安定化させてプロスタグランジン産生やサイトカインを介した炎症反応を誘導したり、サイクリンＤ１をリン酸化して分解を促進し、細胞周期を停止させる等、転写因子以外の経路を制御する例も報告されている。
【０１２７】
ｐ３８ ＭＡＰＫは、癌の転移、血管新生、および免疫炎症応答に関与していることが知られている（ラフェリエール（Ｌａｆｅｒｒｉｅｒｅ Ｊ．）ら、「アナルズ オブ ザ ニューヨーク アカデミー オブ サイエンシズ（Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、２００２年、第９７３巻、ｐ．５６２−５７２；ドン（Ｄｏｎｇ Ｃ．）ら、「アニュアル レビュー オブ イムノロジー（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、２００２年、第２０巻、ｐ．５５−７２）。また、ｐ３８ ＭＡＰＫが、血管内皮増殖因子（以下、ＶＥＧＦと略称する）により誘導される内皮細胞の遊走や増殖並びに血管新生において重要な役割を果たしていることが報告されている（ルソー（Ｒｏｕｓｓｅａｕ Ｓ．）ら、「トレンズ イン カルディオバスキュラー メディシン（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、２０００年、第１０巻、第８号、ｐ．３２１−３２７）。
【０１２８】
ＪＮＫは、細胞増殖や細胞死または免疫炎症応答に関与することが知られており、ＭＫＫ７／ＭＫＫ４によりリン酸化されることによりその機能が調節されている（ドン（Ｄｏｎｇ Ｃ．）ら、「アニュアル レビュー オブ イムノロジー（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、２００２年、第２０巻、ｐ．５５−７２）。
【０１２９】
ＭＡＳＴ２０５が結合する蛋白質のうちＤＣＴＮ１およびＴＩＡＭ１は、ＭＡＳＴ２０５の基質蛋白質であり、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性によりリン酸化される。ＰＴＥＮについても、ＭＡＳＴ２０５によりリン酸化されると報告されている。ＤＣＴＮ１およびＴＩＡＭ１は、ｐ３８ ＭＡＰＫあるいはその上流のＭＫＫ６／ＭＫＫ３を介した情報伝達経路への関与が示唆されている。
【０１３０】
これらから、ＭＡＳＴ２０５は、直接的および／または間接的にＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１と結合してリン酸化し、その結果、ｐ３８ ＭＡＰＫあるいはその上流のＭＫＫ６／ＭＫＫ３を介した情報伝達経路に促進的に作用すると考えることができる。
【０１３１】
ｐ３８ ＭＡＰＫが癌の転移、血管新生、および免疫炎症応答に関与していることから、ＭＡＳＴ２０５はＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１と結合することによりＭＫＫ６／ＭＫＫ３を介してｐ３８ ＭＡＰＫをリン酸化し、その結果、癌の転移および免疫炎症応答に促進的に関与していると発明者らは考えている。また、ｐ３８ ＭＡＰＫがＶＥＧＦにより誘導される内皮細胞の遊走や増殖並びに血管新生に重要な役割を果たすことから、ＭＡＳＴ２０５はＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１と結合することによりＭＫＫ６／ＭＫＫ３を介したｐ３８ ＭＡＰＫをリン酸化し、その結果、内皮細胞の遊走や増殖並びに血管新生を促進すると考えることができる。
【０１３２】
またＭＡＳＴ２０５は、ＪＮＫのリン酸化にも関与し、その結果、細胞増殖や細胞死または免疫炎症応答に関与すると発明者らは考えている。ＭＡＳＴ２０５がＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１と結合したこと、ＭＡＳＴ２０５の発現阻害によりＪＮＫのリン酸化が阻害されたこと、並びにＪＮＫの機能はＭＫＫ７／ＭＫＫ４によるリン酸化により調節されていること（ドン（Ｄｏｎｇ Ｃ．）ら、「アニュアル レビュー オブ イムノロジー（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、２００２年、第２０巻、ｐ．５５−７２）から、ＭＡＳＴ２０５は、ＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１との結合によりＭＫＫ７／ＭＫＫ４を介してＪＮＫのリン酸化に関与していると発明者らは考えている。
【０１３３】
ＭＡＳＴ２０５が結合する蛋白質のうちＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７およびｐ３８ ＭＡＰＫはＭＡＰキナーゼカスケードを構成する蛋白質である。また、ＭＡＳＴ２０５の発現阻害により、ストレス刺激によるＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ｐ３８ＭＡＰＫ、およびＪＮＫのリン酸化が阻害された（実施例３および７参照）。したがって、ＭＡＳＴ２０５はこれら蛋白質と結合することにより、該蛋白質のリン酸化に関与し、ひいては該蛋白質が関与する情報伝達を促進すると考えることができる。
【０１３４】
ＭＡＰキナーゼ経路の機構として、足場蛋白質（ｓｃａｆｆｏｌｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）によるＭＡＰＫ、ＭＡＰ２Ｋ、ＭＡＰ３Ｋの集積が示唆されている（モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｄ．Ｋ．）ら、「アニュアル レビュー オブ セル アンド ディベロプメンタル バイオロジー（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、２００３年、第１９巻、ｐ．９１−１１８；ホイットマーシュ（Ｗｈｉｔｍａｒｓｈ Ａ．Ｊ．）ら、「トレンズ イン バイオケミカル サイエンシズ（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、１９９８年、第２３巻、ｐ．４８１−４８５）。
【０１３５】
「足場蛋白質」とは、特定の同一の情報伝達経路に寄与する複数の特定分子を結合して会合させる機能を有する蛋白質を意味する。より詳しくは、足場蛋白質は情報伝達経路に寄与する複数の特定分子と結合することにより複合体を形成し、該分子間の選択的な反応を促進する機能を有する蛋白質を意味する。足場蛋白質との複合体形成により、情報伝達経路に寄与する特定の分子間の反応が促進されるため、該情報伝達経路が関与する特定の情報伝達が促進される。
【０１３６】
ＭＡＰキナーゼ経路において、足場蛋白質にＭＡＰＫ、ＭＡＰ２ＫおよびＭＡＰ３Ｋが集積することにより、ＭＡＰ３ＫによるＭＡＰ２Ｋのリン酸化および活性化、リン酸化ＭＡＰ２ＫによるＭＡＰＫのリン酸化および活性化が促進され、その結果、ＭＡＰキナーゼが関与する情報伝達が促進される。ＭＡＰキナーゼ経路に関与する足場蛋白質として、いくつかの蛋白質が報告されている（モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｄ．Ｋ．）ら、「アニュアル レビュー オブ セル アンド ディベロプメンタル バイオロジー（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、２００３年、第１９巻、ｐ．９１−１１８）。足場蛋白質の種類により結合する蛋白質が異なることから、足場蛋白質の種類とＭＡＰＫ、ＭＡＰ２ＫおよびＭＡＰ３Ｋそれぞれのファミリーに属する蛋白質の種類との間に、組み合わせが存在すると考えられる。ＭＡＰキナーゼ経路は、ＭＡＰＫ、ＭＡＰ２ＫおよびＭＡＰ３Ｋそれぞれのファミリーに属する蛋白質や足場蛋白質の多様性、およびそれらの組み合わせにより、細胞増殖刺激やストレス刺激等の様々な刺激によって発生する様々な細胞内シグナル伝達を担っていると考えられる。
【０１３７】
一方、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４およびＭＫＫ６により、ｐ３８ ＭＡＰＫが活性化されること、およびＭＫＫ４およびＭＫＫ７によりＪＮＫが活性化することが報告されている（モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｄ．Ｋ．）ら、「アニュアル レビュー オブ セル アンド ディベロプメンタル バイオロジー（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、２００３年、第１９巻、ｐ．９１−１１８）。
【０１３８】
また、ＭＬＫ３がＭＫＫ４をリン酸化すること（デイビス（Ｄａｖｉｓ Ｒ．Ｊ．）、「セル（Ｃｅｌｌ）」、２０００年、第１０３巻、ｐ．２３９−２５２；ティブルス（Ｔｉｂｂｌｅｓ Ｌ．Ａ．）ら、「ザ エンボ ジャーナル（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ）」、１９９６年、第１５巻、第２４巻ｐ．７０２６−７０３５）、およびＭＬＫ３がＭＫＫ７をリン酸化すること（メリット（Ｍｅｒｒｉｔｔ Ｓ．Ｅ．）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９９年、第２７４巻、第１５号、ｐ．１０１９５−１０２０２）が報告されている。
【０１３９】
さらに、ＭＬＫ３とＭＫＫ３の共発現がＭＫＫ３のリン酸化を誘導すること、およびＭＬＫ３とＭＫＫ６が共沈降することが実証され、それにより、哺乳動物や酵母におけるＭＡＰキナーゼ経路の機構の一部として、ＭＬＫ３によるＭＫＫ３／ＭＫＫ６の活性化とそれに続くｐ３８ ＭＡＰＫの活性化（ＭＬＫ３→ＭＫＫ３／ＭＫＫ６→ｐ３８ ＭＡＰＫ）という機構が提唱されている（ティブルス（Ｔｉｂｂｌｅｓ Ｌ．Ａ．）ら、「ザ エンボ ジャーナル（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ）」、１９９６年、第１５巻、第２４巻ｐ．７０２６−７０３５）。
【０１４０】
本発明における実証データおよび上記知見から本発明者らは、ｐ３８ ＭＡＰＫが関与する情報伝達経路にはＭＬＫ３によるＭＫＫ３／ＭＫＫ４／ＭＫＫ６の活性化とそれに続くｐ３８ ＭＡＰＫの活性化（ＭＬＫ３→ＭＫＫ３／ＭＫＫ４／ＭＫＫ６→ｐ３８ ＭＡＰＫ）という機構が存在し、ＭＡＳＴ２０５は本機構に足場蛋白質として作用していると考えている。すなわち、ＭＡＳＴ２０５は、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、およびｐ３８ ＭＡＰＫと結合することにより複合体を形成して蛋白質間相互作用を促進し、その結果、ｐ３８ ＭＡＰＫが関与する情報伝達経路を促進すると考えることができる。
【０１４１】
さらに本発明者らは、ＪＮＫが関与する情報伝達経路にはＭＬＫ３によるＭＫＫ４／ＭＫＫ７の活性化とそれに続くＪＮＫの活性化（ＭＬＫ３→ＭＫＫ４／ＭＫＫ７→ＪＮＫ）という機構が存在し、ＭＡＳＴ２０５は本機構に足場蛋白質として作用していると考えている。すなわち、ＭＡＳＴ２０５は、ＭＬＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７、およびＪＮＫと結合することにより複合体を形成して蛋白質間相互作用を促進し、その結果、ＪＮＫが関与する情報伝達経路を促進すると考えることができる。
【０１４２】
ＭＡＳＴ２０５はＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、およびｐ３８ ＭＡＰＫと結合して足場を提供することによりｐ３８ ＭＡＰＫが関与する情報伝達経路を促進し、その結果、ｐ３８ ＭＡＰＫが関与する細胞や生体の機能や応答、例えば癌の転移および免疫炎症応答、並びにＶＥＧＦにより誘導される内皮細胞の遊走や増殖並びに血管新生（フワン（Ｈｕａｎｇ Ｃ．）ら、「ジャーナル オブ セル サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、２００４年、第１１７巻、ｐ．４６１９−４６２８）に促進的に関与すると発明者らは考えている。
【０１４３】
ＪＮＫはＭＫＫ７／ＭＫＫ４によりリン酸化されることによりその機能が調節されていることが知られており、さらに、ＪＮＫ活性化は、細胞や生体の機能や応答、例えば癌の転移、血管新生との関連が示唆されている。具体的には、ＪＮＫの作用を阻害し得る化合物が、血管新生抑制を誘導することが報告されている。
【０１４４】
このことから、ＭＡＳＴ２０５はＭＬＫ３、ＭＫＫ４、およびＭＫＫ７と結合して足場を提供することにより、ＭＬＫ３によるＭＫＫ４／ＭＫＫ７のリン酸化および活性化を促進し、さらにはＪＮＫが関与する情報伝達経路を促進し、その結果、ＪＮＫが関与する細胞や生体の機能や応答、例えば癌の転移および免疫応答、内皮細胞の遊走や増殖、並びに血管新生に促進的に関与すると発明者らは考えている。
【０１４５】
ＭＡＳＴ２０５が、このように、細胞の遊走および浸潤、血管新生、癌の転移、細胞増殖や細胞死、並びに免疫炎症応答に関与すると考えられることから、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することにより、細胞の遊走および／または浸潤を阻害でき、その結果、癌の転移、細胞増殖や細胞死、血管新生および免疫炎症応答を抑制できると発明者らは考えている。例えば、ＭＡＳＴ２０５の発現、ＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質、例えば基質蛋白質との結合、およびＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性のうちの少なくとも１を阻害することにより、細胞の遊走および／または浸潤を阻害でき、その結果、癌の転移、細胞増殖や細胞死、血管新生および免疫炎症応答を抑制できると考えることができる。より具体的には、ＭＡＳＴ２０５の発現、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、並びにＭＡＳＴ２０５のＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性のうちの少なくとも１を阻害することにより、細胞の遊走および／または浸潤を阻害でき、その結果、癌の転移、細胞増殖や細胞死、血管新生および免疫炎症応答を抑制できると考えることができる。
【０１４６】
実際、本発明において、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害することにより、細胞の遊走および浸潤が顕著に抑制されることを見出した（実施例４および５参照）。
【０１４７】
「細胞の遊走」とは、細胞がその運動能により元の位置から別の位置へと動くことを意味する。一般的に細胞の遊走は、遊走因子に対し濃度依存的な方向性を示す。細胞の方向性を持った遊走は、炎症性細胞の炎症部位への移動、癌細胞の浸潤および転移、血管新生のみならず、個体発生や器官の形成にも必須で重要な生理現象である。
【０１４８】
「細胞の遊走阻害」とは、細胞の元の位置から別の位置への移動を低減すること、または移動させないことを意味する。具体的には、移動する細胞の数および／または細胞の移動距離を低減させることを意味する。
【０１４９】
「細胞の浸潤」とは、細胞が細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を破壊し、ＥＣＭが形成するバリアーを通過して、ＥＣＭ自体や周囲の組織に侵入することを意味する。例えば、癌細胞の浸潤とは、癌細胞が基底膜を破壊し、上皮下組織や周囲の他臓器に侵入することを意味する。「細胞外マトリックス（ＥＣＭ）」とは、動物組織中の細胞の外側に存在する安定な生体構造物である。ＥＣＭは細胞により合成され、細胞外に分泌・蓄積された生体高分子の複雑な会合体であり、細胞膜成分は含まない。その主要な構成成分は、繊維状蛋白質（コラーゲン、エラスチン、フィブリリン等）、ムコ多糖類（プロテオグリカン、グリコサミノグリカン等）、および糖蛋白質（フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン等）である。ＥＣＭは、細胞接着、細胞移動、細胞の分化・増殖、細胞骨格の配向、細胞形態形成、および細胞代謝等に重要な役割を果たしている。
【０１５０】
「癌の転移」とは、癌が原発巣から分離して、別の組織や臓器に移行し、そこで増殖することを意味する。
【０１５１】
「癌の転移抑制」とは、癌の原発巣からの分離、別の組織や臓器への移行、移行先における増殖を低減させることを意味する。
【０１５２】
「細胞増殖」とは、分裂により細胞の数が増すことを意味し、炎症性刺激に対する反応としての細胞増殖並びに腫瘍性増殖等を含む。
【０１５３】
「細胞死」とは、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞の死を意味する。
【０１５４】
「血管新生」とは、新たな血管の形成を意味する。癌、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチのような疾患には過剰に血管が形成されるという特徴がある。癌においては、癌細胞が産生する血管新生誘導物質により活性化された血管内皮細胞が誘導物質に向かって遊走し、かつ組織内に浸潤して増殖し、新たな血管を形成する。新生血管は癌細胞の増殖を促進し、さらに新しい転移巣の形成に関与する。
【０１５５】
「血管新生の抑制」とは、新たな血管の形成を低減させることを意味する。
【０１５６】
「免疫炎症応答」とは、生体組織の傷害において、生体組織に対して何らかの有害な刺激を起こす物質（起炎物質）が作用したときに生体が示す局所の反応を意味する。組織傷害の原因として、細菌感染、外傷、熱・放射線・電気等の物理的刺激、および化学物質を例示できる。炎症部位では血管内皮細胞表面の接着分子の発現、血管内皮へのリンパ球・好中球・単球の接着と血管外への遊走、血管透過性の亢進が認められる。炎症のメディエーターとして、ヒスタミン、セロトニン、プロスタグランジン、ロイコトリエンや、各種サイトカイン等の生理活性物質が関与している。免疫炎症応答に関与するサイトカインとして、単球やマクロファージ等から産生されるインターロイキン１（以下、ＩＬ−１と略称する）、細胞性免疫に関与するヘルパーＴ１細胞の分化や活性化に関与するＩＬ−１２・インターフェロンγ・腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、また、液性免疫に関与するヘルパーＴ２細胞の分化や活性化に関与するＩＬ−４・ＩＬ−５・ＩＬ−１０を例示できる。
【０１５７】
細胞の遊走および浸潤の検出は、例えば、市販の細胞遊走測定システムまたは細胞浸潤測定システムを用いて実施できる。
【０１５８】
細胞遊走測定システムとして、具体的には、セルカルチャーインサートとコンパニオンプレートから構成される細胞遊走測定チャンバー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）を例示できる。セルカルチャーインサートは、細孔を有するＰＥＴメンブレン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｐｈｔｈａｌａｔｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）をその底に保持する。セルカルチャーインサートはコンパニオンプレートの上部にセットして用いる。セルカルチャーインサートに添加された遊走性細胞は、ＰＥＴメンブレンに存在する細孔を通過してメンブレンの裏面（コンパニオンプレート側）に移動する。しかし、非遊走性細胞は、ＰＥＴメンブレンの表面（セルカルチャーインサート側）に残る。したがって、メンブレンの裏面に存在する細胞を測定することにより、細胞遊走を検出できる。移動した細胞および移動しない細胞の定量は、簡便には、それぞれの細胞を計数することにより実施できる。細胞の計数は、細胞を回収して、その数を実際に計数することにより実施できる。または、上記のようなシステムを用いたときには、移動しない細胞を除去した後に、メンブレンの裏面の細胞を適当な細胞染色剤で染色し、数箇所の領域の顕微鏡写真を撮影して細胞数を算定することができる。また、予め細胞を蛍光標識して用い、移動した細胞のみを回収してその蛍光を測定することにより細胞の定量を実施できる。細胞染色剤として蛍光色素を用いる場合、また、予め細胞を蛍光標識して用いる場合は、セルカルチャーインサートとして、フルオロブロック セルカルチャーインサート（Ｆｌｕｏｒｏｂｌｏｃｋ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔ，ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）を用いることにより、より簡便にメンブレンの裏面に移動した細胞の定量を実施できる。
【０１５９】
細胞浸潤測定システムとして、具体的には、上記セルカルチャーインサートにＥＣＭを塗布したものとコンパニオンプレートから構成される細胞浸潤測定チャンバーを例示できる。ＥＣＭとして、マトリゲル（ＧＲＯＷＴＨ ＦＡＣＴＯＲ ＲＥＤＵＣＥＤ ＢＤ ＭＡＴＲＩＧＥＬ ＭＡＴＲＩＸ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を例示できる。また、細胞浸潤測定システムとして、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製のバイオコート^ＴＭマトリゲル^ＴＭ（ＢｉｏＣｏａｔ^ＴＭｍａｔｒｉｇｅｌ^ＴＭ） インベージョンチャンバーを例示できる。バイオコート^ＴＭマトリゲル^ＴＭ インベージョンチャンバーは細胞の浸潤特性試験用インビトロシステムであり、再構成したＥＣＭが予め塗布された細孔を有するＰＥＴメンブレンを保持するセルカルチャーインサートとコンパニオンプレートから構成されている。ＥＣＭが塗布されたセルカルチャーインサートはコンパニオンプレートの上部にセットして用いる。該セルカルチャーインサートに添加された浸潤性細胞は、ＥＣＭが塗布されたＰＥＴメンブレンに存在する細孔を通過してメンブレンの裏面（コンパニオンプレート側）に移動する。しかし、非浸潤性細胞はＥＣＭが形成するバリアーを通過できないため、メンブレンの表面（セルカルチャーインサート側）に残る。したがって、メンブレンの裏面に存在する細胞を測定することにより、細胞浸潤を検出できる。移動した細胞および移動しない細胞の定量は、上記した方法と同じ方法により実施できる。
【０１６０】
本発明に係る細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤により遊走が阻害される細胞として、ＭＡＳＴ２０５の発現が亢進しており、ＭＡＳＴ２０５による遊走や浸潤が認められる細胞を挙げることができる。具体的には、癌細胞や内皮細胞を例示できる。
【０１６１】
ＭＡＳＴ２０５の発現は、ほとんどすべての正常組織において普遍的に認められるという報告がある（非特許文献２）。一方、精子に、それも発達分化中の精子において最も発現が高いという報告（非特許文献３）や、心臓において高い発現が認められるという報告（非特許文献２）がある。
【０１６２】
ＭＡＳＴ２０５の発現は、癌組織において正常組織と比較して亢進が認められる。例えば、肺平滑筋肉腫（ｌｕｎｇ ｌｅｉｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ）や小細胞肺癌（ｌｕｎｇ ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、脳髄芽腫（ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ）、および骨肉腫（ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）等の癌組織において、ＭＡＳＴ２０５の発現亢進が認められる。これらの腫瘍はいずれも転移能が高いことが知られている。これらの腫瘍ではＭＡＳＴ２０５の発現が亢進しているため、腫瘍細胞の遊走や浸潤が促進され、その結果、転移能が高くなると考えられる。
【０１６３】
本発明に係る細胞の遊走阻害剤および血管新生抑制剤は、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する化合物を有効成分として含む。例えば、ＭＡＳＴ２０５の発現、ＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質、例えば基質蛋白質との結合、およびＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性のうちの少なくとも１を阻害する化合物を有効成分として含む。より具体的には、ＭＡＳＴ２０５の発現、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、並びにＭＡＳＴ２０５のＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性のうちの少なくとも１を阻害する化合物を有効成分として含む。
【０１６４】
ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する化合物を有効成分として、具体的には、ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを例示できる。ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害することにより、ＭＡＳＴ２０５の発現量を減少させるまたは消失させることができるため、ＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質、例えば基質蛋白質との結合を低減または消失させることができ、その結果、ＭＡＳＴ２０５の該蛋白質への作用、例えばセリンスレオニンキナーゼ活性を低減または消失させることができる。
【０１６５】
ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドとして、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを好ましく例示できる。配列表の配列番号２に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドとして、具体的には、配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが例示できる。配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドは上記例示したものに制限されず、ＭＡＳＴ２０５の発現をＲＮＡ干渉の手法により低下または消失させ得るものであればいずれを用いることもできる。
【０１６６】
本発明に係る細胞の遊走阻害剤は、細胞の遊走阻害方法の実施に用いることができる。
【０１６７】
細胞の遊走および浸潤は癌の転移能の指標であることから、細胞の遊走および浸潤を阻害することにより、癌の転移を抑制することができると考えることができる。したがって、本発明に係る細胞の遊走阻害剤および遊走阻害方法を用いることにより、癌の転移抑制方法を実施できる。また、本発明に係る細胞の遊走阻害剤を含む癌の転移抑制剤を提供することができる。
【０１６８】
本発明に係る血管新生阻害剤は、血管新生の阻害方法の実施に用いることができる。
【０１６９】
本発明に係る細胞の遊走阻害剤、癌の転移抑制剤、および血管新生の抑制剤は、医薬組成物として調製することができる。この場合、通常、有効成分に加えて１種または２種以上の医薬用担体を含む医薬組成物として製造することが好ましい。
【０１７０】
本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常、約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。
【０１７１】
医薬用担体は、製剤の使用形態に応じて一般的に使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤および賦形剤を例示できる。これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択して使用される。
【０１７２】
より具体的には、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースを例示できる。これらは、本医薬組成物の剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組合わせて使用される。
【０１７３】
所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、界面活性剤、およびｐＨ調整剤等を適宜使用することもできる。
【０１７４】
安定化剤は、ヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体を例示できる。これらは単独でまたは界面活性剤等と組合わせて使用できる。特にこの組合わせによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。
【０１７５】
界面活性剤も特に限定はなく、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。界面活性剤には、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。
【０１７６】
緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）を例示できる。
【０１７７】
等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンを例示できる。
【０１７８】
キレート剤は、エデト酸ナトリウム、クエン酸を例示できる。
【０１７９】
本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生理的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。
【０１８０】
医薬および医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ〜１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は１日１回〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。
【０１８１】
本発明の医薬組成物を投与するときは、該医薬組成物を単独で使用してもよく、あるいは目的の疾患の防止および／または治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。例えば、他の抗腫瘍用医薬や抗炎症用医薬の有効成分等を配合してもよい。
【０１８２】
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与を挙げることができる。あるいは経口経路で投与することもできる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も可能である。癌疾患に用いる場合は、腫瘍に注射等により直接投与することができる。
【０１８３】
投与形態は、各種の形態が目的に応じて選択できる。その代表的なものは、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらはさらに投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。
【０１８４】
（化合物の同定方法）
本発明の一態様は、細胞の遊走を抑制する活性を有する化合物の同定方法、およびＭＡＳＴ２０５の機能を阻害する化合物の同定方法に関する。
【０１８５】
本発明においては、細胞の遊走および／または浸潤の阻害を、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することにより達成できることを見出した（実施例４および５参照）。例えば、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する化合物を用いることにより、細胞の遊走および／または浸潤の阻害を達成できる。すなわち、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する化合物は、細胞の遊走および／または浸潤を抑制する活性を有する化合物であるということができる。したがって、細胞の遊走および／または浸潤を抑制する活性を有する化合物を、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する活性を指標にして同定することができる。
【０１８６】
ＭＡＳＴ２０５の機能として、上述したように、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性、およびＭＡＳＴ２０５と他の蛋白質、例えば基質蛋白質との結合を例示できる。より具体的には、ＭＡＳＴ２０５の機能として、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、ＭＡＳＴ２０５のＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性を例示できる。ＭＡＳＴ２０５のＤＣＴＮ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性によりＤＣＴＮ１がリン酸化され、ＭＡＳＴ２０５のＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性により、ＴＩＡＭ１がリン酸化される。ただし、ＭＡＳＴ２０５の機能であるセリンスレオニンキナーゼ活性が、ＤＣＴＮ１およびＴＩＡＭ１に対するリン酸化活性に留まらないことはいうまでもない。例えば、当該同定方法を実施する場合、セリンスレオニンキナーゼの一般的な基質として当業者に知られている適当な基質を用いたり、市販のキットを使用したりして実施することができる。
【０１８７】
この知見に基づき、本発明において、細胞の遊走および／または浸潤を阻害する活性を有する化合物の同定方法、並びにＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する化合物の同定方法を提供できる。より具体的には、細胞の遊走を阻害する活性を有する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法を阻害する化合物の同定方法、またはＭＡＳＴ２０５によるＴＩＡＭ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法を提供できる。
【０１８８】
細胞の遊走および／または浸潤を抑制する活性を有する化合物は、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する活性を指標にして同定することができることから、該化合物の同定方法は、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する化合物の同定方法により実施することができる。
【０１８９】
細胞の遊走を抑制する活性を有する化合物の同定方法は、例えば、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合を阻害する化合物の同定方法、ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法を阻害する化合物の同定方法、またはＭＡＳＴ２０５によるＴＩＡＭ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法により実施することができる。
【０１９０】
細胞の遊走を抑制する活性を有する化合物の同定方法は、具体的には次に示す実験系を用いて実施できる：ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７およびｐ３８ ＭＡＰＫからなる群より選択された１つ以上の蛋白質とＭＡＳＴ２０５とを共存させて、ＭＡＳＴ２０５と該蛋白質を結合させる実験系を用いて実施できる。このような実験系において、ある化合物（以下、被検化合物と称する）と該蛋白質および／またはＭＡＳＴ２０５を接触させ、ＭＡＳＴ２０５と該蛋白質との結合を検出することができるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出し、被検化合物がＭＡＳＴ２０５と該蛋白質との結合を阻害するか否かを決定することにより、細胞の遊走を抑制する活性を有する化合物を同定できる。
【０１９１】
被検化合物はＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７およびｐ３８ ＭＡＰＫからなる群より選択された１つ以上の蛋白質とＭＡＳＴ２０５との結合反応に共存させることもできるし、被検化合物を予め該蛋白質および／またはＭＡＳＴ２０５と接触させ、その後にＭＡＳＴ２０５と該蛋白質の結合反応を行うこともできる。ＭＡＳＴ２０５と該蛋白質の結合により生じるシグナルまたは結合のマーカーが、被検化合物をＭＡＳＴ２０５と接触させたときに、被検化合物を接触させなかったときと比較して低下あるいは消失する等の変化を示す場合、当該被検化合物はＭＡＳＴ２０５と該蛋白質との結合を阻害し、その結果、細胞の遊走を抑制すると判定できる。
【０１９２】
細胞の遊走を抑制する活性を有する化合物の同定方法はまた、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１とを共存させて、ＭＡＳＴ２０５によりＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１をリン酸化させる実験系を用いて実施できる。このような実験系において、被検化合物とＭＡＳＴ２０５を接触させ、ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１のリン酸化を検出することができるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出し、被検化合物がＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１のリン酸化を阻害するか否かを決定することにより、ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１のリン酸化を阻害し、その結果、細胞の遊走を抑制する化合物を同定できる。
【０１９３】
被検化合物はＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１のリン酸化反応に共存させることもできるし、被検化合物を予めＭＡＳＴ２０５と接触させ、その後にＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１のリン酸化反応を行うこともできる。ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１のリン酸化により生じるシグナルまたはリン酸化のマーカーが、被検化合物をＭＡＳＴ２０５と接触させたときに、被検化合物を接触させなかったときと比較して低下あるいは消失する等の変化を示す場合、当該被検化合物はＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１のリン酸化を阻害し、その結果、細胞の遊走を抑制すると判定できる。
【０１９４】
ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害する化合物の同定方法は、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１とを共存させて、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１を結合させる実験系を用いて実施できる。このような実験系において、被検化合物とＭＡＳＴ２０５および／またはＤＣＴＮ１とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を検出することができるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出し、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害するか否かを決定することにより、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害する化合物を同定できる。
【０１９５】
被検化合物はＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合反応に共存させることもできるし、被検化合物を予めＭＡＳＴ２０５および／またはＤＣＴＮ１と接触させ、その後にＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合反応を行うこともできる。ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合により生じるシグナルまたは結合のマーカーが、被検化合物をＭＡＳＴ２０５および／またはＤＣＴＮ１と接触させたときに、被検化合物を接触させなかったときと比較して低下あるいは消失する等の変化を示す場合、当該被検化合物はＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害すると判定できる。
【０１９６】
このような実験系は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれの条件においても実施できる。
【０１９７】
ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験系は、蛋白質の結合阻害剤のスクリーニングにおいて一般的に用いられている同定方法を参考にして実施できる。ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験系として、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１とをｉｎ ｖｉｔｒｏで反応させて、ウエスタンブロッティングやプルダウン法により両蛋白質の結合を検出する実験系を例示できる。
【０１９８】
ｉｎ ｖｉｖｏの実験系として、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１とを共に発現している真核細胞または培養細胞株を用いた実験系が好ましく例示できる。また、ＭＡＳＴ２０５やＤＣＴＮ１を発現させた真核細胞または培養細胞株を用いることができる。細胞におけるこれら蛋白質の発現は、ＭＡＳＴ２０５をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターおよび／またはＤＣＴＮ１をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターを用いて慣用の遺伝子工学的手法でこれらベクターを細胞にトランスフェクションすることにより達成できる。
【０１９９】
ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合の検出は、自体公知の蛋白質の検出方法、例えば免疫沈降法、プルダウン法、ツーハイブリッド法、ウェスタンブロッティングおよび蛍光共鳴エネルギー転移法等の方法またはこれらの方法を組合わせて、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１により形成される複合体を検出することにより実施できる。ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１により形成される複合体の検出を容易にするために、ＭＡＳＴ２０５および／またはＤＣＴＮ１は、適当な標識物質により標識されたものを用いることが好ましい。標識物質として、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇおよびＨＡ−ｔａｇ等のタグペプチド類が好ましく例示できる。標識物質の検出は、自体公知の検出方法を用いて実施できる。例えば、タグペプチド類は、抗タグペプチド抗体により検出できる。このとき、抗タグペプチド抗体として、ＨＲＰやＡＬＰ等の酵素、放射性同位元素、蛍光物質またはビオチン等で標識した抗体を用いることにより検出がより容易に実施できる。あるいは、上記酵素、放射性同位元素、蛍光物質、ビオチン等で標識した二次抗体を用いてもよい。
【０２００】
具体的には、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害する化合物の同定方法は、例えば、Ｍｙｃ−ｔａｇが付加されたＭＡＳＴ２０５をコードする遺伝子を含む適当なベクターおよびＦＬＡＧ−ｔａｇが付加されたＤＣＴＮ１をコードする遺伝子を含む適当なベクターをトランスフェクションした細胞（実施例１参照）を用いて実施できる。該細胞を、被検化合物で処理した後、細胞を回収し、適当な方法で細胞を溶解して細胞溶解物を調製し、該細胞溶解物中に含まれるＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１により形成された複合体を検出する。細胞溶解物中に含まれる該複合体の測定は、一方の蛋白質に付加されたタグペプチドに対する抗体を用いた免疫沈降の後に、もう一方の蛋白質に付加されたタグペプチドに対する抗体を用いてウェスタンブロッティングを行うことにより実施できる。被検化合物で処理したときに検出されるＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１により形成された複合体の量が、細胞を被検化合物で処理しないときに検出される複合体の量と比較して低減または消失する場合には、被検化合物はＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害すると判定できる。
【０２０１】
ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害する化合物の同定方法はまた、公知のツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法を用いて実施できる。例えば、ＭＡＳＴ２０５とＤＮＡ結合蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、ＤＣＴＮ１と転写活性化蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、および適切なプロモーター遺伝子に接続したｌａｃＺ等レポーター遺伝子を含有するプラスミドを酵母や真核細胞等の細胞に導入し、該細胞を被検化合物で処理したときのレポーター遺伝子の発現量を、被検化合物で該細胞を処理しないときのレポーター遺伝子の発現量とを比較する。被検化合物で処理した該細胞のレポーター遺伝子の発現量が、被検化合物で処理しない該細胞のレポーター遺伝子の発現量と比較して低減または消失する場合、該被検化合物はＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害すると判定できる。
【０２０２】
上記同定方法により同定される化合物は、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害する化合物である。
【０２０３】
上記同定方法において、ＤＣＴＮ１の代わりにＴＩＡＭ１を用いることにより、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合を阻害する化合物の同定方法を実施することができる。該同定方法により同定される化合物は、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合を阻害する化合物である。ＤＣＴＮ１の代わりにＭＬＫ３を用いることにより、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合を阻害する化合物の同定方法を実施することができる。該同定方法により同定される化合物は、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合を阻害する化合物である。ＤＣＴＮ１の代わりにＭＫＫ３を用いることにより、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合を阻害する化合物の同定方法を実施することができる。該同定方法により同定される化合物は、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合を阻害する化合物である。ＤＣＴＮ１の代わりにＭＫＫ４を用いることにより、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合を阻害する化合物の同定方法を実施することができる。該同定方法により同定される化合物は、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合を阻害する化合物である。ＤＣＴＮ１の代わりにＭＫＫ６を用いることにより、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合を阻害する化合物の同定方法を実施することができる。該同定方法により同定される化合物は、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合を阻害する化合物である。ＤＣＴＮ１の代わりにＭＫＫ７を用いることにより、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合を阻害する化合物の同定方法を実施することができる。該同定方法により同定される化合物は、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合を阻害する化合物である。ＤＣＴＮ１の代わりにｐ３８ ＭＡＰＫを用いることにより、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合を阻害する化合物の同定方法を実施することができる。該同定方法により同定される化合物は、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合を阻害する化合物である。
【０２０４】
ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法は、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１とを共存させて、ＭＡＳＴ２０５によりＤＣＴＮ１をリン酸化させる実験系を用いて実施できる。このような実験系において、被検化合物とＭＡＳＴ２０５および／またはＤＣＴＮ１とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を検出することができるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出し、被検化合物がＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を阻害するか否かを決定することにより、ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を阻害する化合物を同定できる。
【０２０５】
被検化合物はＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化反応に共存させることもできるし、被検化合物を予めＭＡＳＴ２０５および／またはＤＣＴＮ１と接触させ、その後にＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化反応を行うこともできる。ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化により生じるシグナルまたはリン酸化のマーカーが、被検化合物をＭＡＳＴ２０５および／またはＤＣＴＮ１と接触させたときに、被検化合物を接触させなかったときと比較して低下あるいは消失する等の変化を示す場合、当該被検化合物はＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を阻害すると判定できる。
【０２０６】
このような実験系は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれの条件においても実施できる。好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏの実験系を用いることが適当である。
【０２０７】
リン酸化された蛋白質の検出は、例えば、リン酸化された蛋白質に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングにより実施できる。また、リン酸化された蛋白質の検出は、リン酸化反応に放射性同位体標識したＡＴＰ、例えば［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰを用いて、リン酸化された蛋白質に転移された［γ−^３２Ｐ］の放射活性を測定することにより実施できる（実施例２を参照）。あるいは、ペプチドアレイを用いた表面プラズモン共鳴イメージング法により蛋白質のリン酸化を検出できる。
【０２０８】
上記同定方法により同定される化合物は、ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を阻害する化合物である。このような化合物には、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害する化合物や、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する化合物が含まれる。
【０２０９】
上記同定方法において、ＤＣＴＮ１の代わりにＴＩＡＭ１を用いることにより、ＭＡＳＴ２０５によるＴＩＡＭ１のリン酸化を阻害する化合物の同定方法を実施することができる。該同定方法により同定される化合物は、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合を阻害する化合物である。このような化合物には、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合を阻害する化合物や、ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性を阻害する化合物が含まれる。
【０２１０】
本発明においてはまた、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害する化合物の同定方法を実施することができる。ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害する化合物の同定方法は、ＭＡＳＴ２０５の発現を測定できる実験系を用いて実施できる。このような実験系において、ＭＡＳＴ２０５をコードする遺伝子と被検化合物とを共存させてその発現を測定し、ついで、被検化合物の非存在下での測定結果との比較における発現の変化（低減または消失）を検出することにより、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害する化合物を同定できる。
【０２１１】
ＭＡＳＴ２０５の発現を測定できる実験系として、具体的には、ＭＡＳＴ２０５をコードする遺伝子を含む発現ベクターをトランスフェクションした細胞を用いてＭＡＳＴ２０５を発現させる実験系を例示できる。このような実験系において、該細胞を、被検化合物で処理した後、細胞を回収し、適当な方法で細胞を溶解して細胞溶解物を調製し、該細胞溶解物中に含まれるＭＡＳＴ２０５を検出する。細胞を被検化合物で処理したときに検出されるＭＡＳＴ２０５の量が、細胞を被検化合物で処理しないときに検出されるＭＡＳＴ２０５の量と比較して低減または消失する場合には、被検化合物はＭＡＳＴ２０５の発現を阻害すると判定できる。
【０２１２】
ＭＡＳＴ２０５の発現の測定は、自体公知の蛋白質の検出方法、例えばウェスタンブロッティング等の方法により、ＭＡＳＴ２０５を直接的に検出することにより実施できる。また、発現の指標となるシグナルを実験系に導入して該シグナルを検出することにより、ＭＡＳＴ２０５の測定を容易に実施できる。発現の指標となるシグナルとして、例えば、標識物質を例示できる。標識物質でＭＡＳＴ２０５を標識し、該標識物質を測定することにより、ＭＡＳＴ２０５の測定を容易に実施できる。標識物質として、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇおよびＨＡ−ｔａｇ等のタグペプチド類が好ましく例示できる。標識物質の検出は、自体公知の検出方法を用いて実施できる。例えば、タグペプチド類は、抗タグペプチド抗体により検出できる。このとき、抗タグペプチド抗体として、ＨＲＰやＡＬＰ等の酵素、放射性同位元素、蛍光物質またはビオチン等で標識した抗体を用いることにより検出がより容易に実施できる。あるいは、上記酵素、放射性同位元素、蛍光物質、ビオチン等で標識した二次抗体を用いてもよい。
【０２１３】
ＭＡＳＴ２０５の発現を測定できる実験系としてまた、ＭＡＳＴ２０５をコードする遺伝子のプロモーター領域の下流に、該遺伝子の代わりにレポーター遺伝子を連結したベクターを作成し、該ベクターを導入した細胞、例えば真核細胞等を用いた実験系を例示できる。このような実験系において、該細胞を被検化合物で処理したときのレポーター遺伝子の発現量を、被検化合物で該細胞を処理しないときのレポーター遺伝子の発現量とを比較する。被検化合物で処理した該細胞のレポーター遺伝子の発現量が、被検化合物で処理しない該細胞のレポーター遺伝子の発現量と比較して低減または消失する場合、該被検化合物はＭＡＳＴ２０５の発現を阻害すると判定できる。レポーター遺伝子として、レポーターアッセイで一般的に用いられている遺伝子を使用でき、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等の酵素をコードする遺伝子を例示できる。レポーター遺伝子の発現の検出は、その遺伝子産物の活性、例えば、上記例示したレポーター遺伝子の場合は酵素活性を検出することにより実施できる。
【０２１４】
被検化合物は、例えば化学ライブラリーや天然物由来の化合物、またはＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１およびＴＩＡＭ１の一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等を挙げることができる。あるいは、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合部位またはＭＡＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドの構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等も被検化合物として好適である。
【０２１５】
本発明に係る細胞遊走を抑制する活性を有する化合物の同定方法は、上記同定方法によりＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することが明らかになった被検化合物が、細胞遊走を抑制し得るか否かを測定する工程をさらに含む同定方法であり得る。
【０２１６】
細胞遊走の抑制を測定できる実験系として、例えば上記細胞遊走測定システムまたは上記細胞浸潤測定システムを使用できる。このようなシステムを用いて、細胞の遊走または浸潤を被検化合物で処理した細胞と被検化合物で処理していない細胞の間で比較検討し、前者の遊走または浸潤が、後者のものと比較して抑制された場合には、被検化合物は細胞遊走を抑制する活性を有すると判定できる。
【０２１７】
（試薬キット）
本発明の一態様は、試薬キットに関する。本試薬キットは、次の成分を有してなる試薬キットであり得る：（Ａ）ＭＡＳＴ２０５、ＭＡＳＴ２０５をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組み換えベクターおよび該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれる１つ以上の成分；および（Ｂ）ＤＣＴＮ１、ＤＣＴＮ１をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれる１つ以上の成分、または、ＴＩＡＭ１、ＴＩＡＭ１をコードするポリヌクレオチド、ＴＩＡＭ１をコードするポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、およびＴＩＡＭ１をコードするポリヌクレオチドを含有する組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれる１つ以上の成分。
【０２１８】
また、本試薬キットは、次の成分を有してなる試薬キットであり得る：（Ａ）ＭＡＳＴ２０５、ＭＡＳＴ２０５をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組み換えベクターおよび該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれる１つ以上の成分；および（Ｂ）ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６およびｐ３８ ＭＡＰＫから選ばれるいずれか１の蛋白質、該蛋白質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドをコードする組み換えベクター、該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれる１つ以上の成分。
【０２１９】
また、本試薬キットは、次の成分を有してなる試薬キットであり得る：（Ａ）ＭＡＳＴ２０５、ＭＡＳＴ２０５をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組み換えベクターおよび該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれる１つ以上の成分；および（Ｂ）ＭＬＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７およびＪＮＫから選ばれるいずれか１の蛋白質、該蛋白質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドをコードする組み換えベクター、該組み換えベクターを含有する形質転換体からなる群から選ばれる１つ以上の成分。
【０２２０】
本発明に係る試薬キットは、上記同定方法において用いるシグナルおよび／またはマーカー、緩衝液、並びに塩等、必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
【０２２１】
本発明に係る試薬キットは、例えば本発明に係る化合物の同定方法に使用できる。
【０２２２】
（ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫの取得）
ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫはヒト由来の蛋白質であることが好ましいが、該ヒト由来の蛋白質と同質の機能を有し、かつ構造的相同性を有する哺乳動物由来の蛋白質、例えばマウス、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、ラットまたはウサギ等に由来する蛋白質であることができる。また、ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫをそれぞれコードする遺伝子は、ヒト由来の遺伝子であることが好ましいが、該ヒト由来の蛋白質と同質の機能を有しかつ構造的相同性を有する哺乳動物由来の蛋白質をコードする遺伝子であれば、例えばマウス、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、ラットまたはウサギ等に由来する遺伝子であることができる。ＭＡＳＴ２０５の性質や機能として、例えば、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、およびｐ３８ ＭＡＰＫそれぞれとの結合や、ＤＣＴＮ１およびＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性を挙げることができる。ＤＣＴＮ１の性質や機能として、例えば、ストレス刺激、例えばソルビトール刺激によるｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化へのＭＫＫ３あるいはＭＫＫ６の活性化を介した関与を挙げることができる。ＴＩＡＭ１の性質や機能として、例えば、ＧＤＰ−ＧＴＰ交換因子活性や、ＭＫＫ３を介したｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を挙げることができる。ＭＬＫ３の性質や機能として、例えば、ＩκＢキナーゼαとβの直接的なリン酸化とそれによる活性化を挙げることができる。ＭＫＫ３の性質や機能として、例えば、ｐ３８ ＭＡＰＫのスレオニンやチロシン残基のリン酸化を挙げることができる。ＭＫＫ４の性質や機能として、例えば、ＪＮＫ１／ＭＡＰＫ８やＪＮＫ２／ＭＡＰＫ９およびｐ３８ ＭＡＰＫの活性化が挙げられる。ＭＫＫ６の性質や機能として、例えば、ｐ３８ ＭＡＰＫのスレオニンやチロシン残基のリン酸化を挙げることができる。ＭＫＫ７の性質や機能として、例えば、ＪＮＫ１やＪＮＫ２の活性化を挙げることができる。ｐ３８ ＭＡＰＫの性質や機能として、例えば、ＥＬＫ１やＡＴＦ２のような転写因子のリン酸化を挙げることができる。ＪＮＫの性質や機能として、例えば、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化を挙げることができる。
【０２２３】
ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫは、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよく、あるいはこれらからさらに精製されたものであってもよい。また、ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫのうち少なくとも１を遺伝子工学的手法で発現させた細胞を使用することもできる。ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫは、その性質や機能に影響がない限りにおいて、Ｎ末端側やＣ末端側に別種の蛋白質やポリペプチドを、直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加してもよい。別種の蛋白質やポリペプチドとして、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、β−ガラクトシダーゼ、ＨＲＰまたはＡＬＰ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、あるいはＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類を例示できる。
【０２２４】
遺伝子工学的手法として、公知の方法がいずれも使用できる。公知の方法として、成書に記載の方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社；ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス等を参照）を例示できる。
【０２２５】
ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫをそれぞれコードする遺伝子は、例えば、各遺伝子の発現が認められる適当な起源から、自体公知のクローニング方法等を用いて容易に取得できる。これら遺伝子の起源として、該遺伝子の発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞を例示できる。ＭＡＳＴ２０５遺伝子は様々な組織で普遍的に発現しているが、高発現が認められる組織として、例えば、ヒトの癌組織、具体的には肺平滑筋肉腫や小細胞肺癌、脳髄芽腫、および骨肉腫を挙げることができる。ＤＣＴＮ１遺伝子の起源として、脳組織を例示できる。ＴＩＡＭ１遺伝子の起源として、小脳組織、ヒト白血病細胞を例示できる。ＭＬＫ３遺伝子、ＭＫＫ３遺伝子、ＭＫＫ４遺伝子、ＭＫＫ６遺伝子、ＭＫＫ７遺伝子、ｐ３８ ＭＡＰＫ遺伝子、およびＪＮＫ遺伝子は、様々な組織や細胞で普遍的に発現している。ＭＬＫ３遺伝子が発現している組織として脾臓、リンパ節が例示できる。ＭＫＫ３遺伝子が発現している組織として、脾臓、前立腺、卵巣、小腸、白血球、骨格筋等が例示できる。ＭＫＫ４遺伝子が発現している組織として脳組織が例示できる。ＭＫＫ６遺伝子が発現している組織として骨格筋、心臓、肝臓、膵臓が例示できる。ＭＫＫ７遺伝子が発現している組織として骨格筋、心臓、脳、精巣が例示できる。ｐ３８ ＭＡＰＫ遺伝子が発現している組織として骨格筋、骨髄、リンパ節が例示できる。ＪＮＫ遺伝子が発現している組織として心臓、骨格筋、脳が例示できる。
【０２２６】
起源からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従って実施できる。また、市販されているｃＤＮＡライブラリーを用いることもできる。所望のクローンをｃＤＮＡライブラリーから選択する方法も特に制限されず、慣用の方法を使用できる。例えば、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法等やこれらを組合せた方法を挙げることができる。ここで用いるプローブとして、ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫをそれぞれコードする遺伝子の塩基配列に関する情報に基づいて化学合成されたＤＮＡ等が一般的に使用できる。また、該遺伝子の塩基配列情報に基づき設計したセンスプライマー、アンチセンスプライマーをこのようなプローブとして使用できる。ｃＤＮＡライブラリーからの目的クローンの選択は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して各クローンについて発現蛋白質の確認を行い、その生物学的機能を指標にして実施できる。
【０２２７】
遺伝子の取得にはその他、ＰＣＲ（ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス；サイキ（Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８５年、第２３０巻、ｐ．１３５０−１３５４））によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。ｃＤＮＡライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法（「実験医学」、１９９４年、第１２巻、第６号、ｐ．３５−）、特に５´−ＲＡＣＥ法（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ Ｍ．Ａ．）ら、「プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ザ ユナイテッド ステーツ オブ アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９８８年、第８５巻、第２３号、ｐ．８９９８−９００２）等の採用が好適である。ＰＣＲに使用するプライマーは、ＤＮＡの塩基配列情報に基づいて適宜設計でき、常法に従って合成により取得できる。増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は、常法により実施できる。例えばゲル電気泳動法等によりＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製を実施できる。
【０２２８】
遺伝子は、その機能、例えばコードする蛋白質の発現や、発現された蛋白質の機能が阻害されない限りにおいて、５´末端側や３´末端側に、例えばＧＳＴ、β−ガラクトシダーゼ、ＨＲＰまたはＡＬＰ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、あるいはＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類等の遺伝子が、１つまたは２つ以上付加されたＤＮＡであることができる。これら遺伝子の付加は、慣用の遺伝子工学的手法により実施できる。
【０２２９】
ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫをそれぞれコードする遺伝子を含む組み換えベクターを構築し、該組み換えベクターを用いて適当な宿主細胞で該遺伝子を発現させることにより、これら遺伝子のうち少なくとも１を発現する細胞を取得できる。また、該細胞から、公知の方法でＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫを調製することができる。
【０２３０】
ベクターＤＮＡは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するものを抽出したもののほか、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているものでもよい。代表的なものとして、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターＤＮＡを例示できる。プラスミドＤＮＡとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドを例示できる。バクテリオファージＤＮＡとして、λファージを例示できる。ウイルス由来のベクターＤＮＡとして、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルス等の動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルス等の昆虫ウイルス由来のベクターを例示できる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターＤＮＡを例示できる。あるいは、これらを組合せて作成したベクターＤＮＡ、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組合せて作成したベクターＤＮＡ（コスミドやファージミド等）を例示できる。また、目的により発現ベクターやクローニングベクター等、いずれを用いることもできる。
【０２３１】
ベクターＤＮＡには、目的遺伝子の機能が発揮されるように遺伝子を組込むことが必要であり、少なくとも目的遺伝子配列とプロモーターとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えば、リボソーム結合配列、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー等から選択した１つまたは複数の遺伝子配列を自体公知の方法により組合せてベクターＤＮＡに組込むことができる。選択マーカーとして、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子を例示できる。
【０２３２】
ベクターＤＮＡに目的遺伝子配列を組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、目的遺伝子配列を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的遺伝子配列に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組み換えベクターが得られる。
【０２３３】
ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫをそれぞれコードする遺伝子を含む組み換えベクターを宿主に導入することにより、形質転換体が得られる。ベクターＤＮＡとして発現ベクターを使用すれば、これら遺伝子のうち少なくとも１を発現する細胞を取得でき、さらに該細胞用いて公知の方法によりＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫを製造できる。該形質転換体には、ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫをそれぞれコードする遺伝子以外の所望の遺伝子を組込んだベクターＤＮＡの１つまたは２つ以上をさらに導入することもできる。
【０２３４】
宿主として、原核生物および真核生物のいずれも使用できる。原核生物として、例えば大腸菌（エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））等のエシェリヒア属、枯草菌等のバシラス属、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウムメリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌を例示できる。真核生物として、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等の酵母、Ｓｆ９やＳｆ２１等の昆虫細胞、あるいはサル腎由来細胞（ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞等の動物細胞を例示できる。好ましくは動物細胞を用いる。
【０２３５】
ベクターＤＮＡの宿主細胞への導入は、自体公知の手段が応用でき、例えば成書に記載されている標準的な方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）により実施できる。より好ましい方法として、遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法を挙げることができるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。具体的な方法として、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染を例示できる。
【０２３６】
ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫは、これら蛋白質をそれぞれコードする遺伝子を遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよく、あるいはこれらからさらに精製されたものであってもよい。また、本蛋白質は、本蛋白質をコードする遺伝子を含む細胞において発現しているものであり得る。該細胞は、本蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターをトランスフェクションして得られた形質転換体であり得る。
【０２３７】
ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫはさらに、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない限りにおいて改変できる。また、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質等を、直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に遺伝子工学的手法等を用いて付加することにより標識化したものであってもよい。好ましくは、本蛋白質の基本的な性質が阻害されないような標識化が望ましい。付加する蛋白質等として、ＧＳＴ、β−ガラクトシダーゼ、ＨＲＰまたはＡＬＰ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）またはフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）等の蛍光色素類、マルトース結合蛋白質、免疫グロブリンのＦｃ断片あるいはビオチンを例示できるが、これらに限定されない。また、放射性同位元素により標識することもできる。標識化に用いる物質は、１つまたは２つ以上を組合せて付加できる。これら標識化に用いた物質自体、またはその機能を測定することにより、本蛋白質を容易に検出または精製でき、また、例えば本蛋白質と他の蛋白質との相互作用を検出できる。
【０２３８】
ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫは、具体的には例えば、これら蛋白質をそれぞれコードする遺伝子を含むベクターＤＮＡをトランスフェクションした形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的とする蛋白質を回収することにより製造できる。形質転換体の培養は、各々の宿主に最適な自体公知の培養条件および培養方法で実施できる。培養は、形質転換体により発現される本蛋白質自体またはその機能を指標にして実施できる。あるいは、宿主中または宿主外に産生された本蛋白質自体またはその蛋白質量を指標にして培養してもよく、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養を行ってもよい。
【０２３９】
目的とする蛋白質が形質転換体の細胞内あるいは細胞膜上に発現する場合には、形質転換体を破砕して目的とする蛋白質を抽出する。また、目的とする蛋白質が形質転換体外に分泌される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離処理等により形質転換体を除去した培養液を用いる。
【０２４０】
ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびＪＮＫはまた、一般的な化学合成法により製造できる。例えば、成書（「ペプチド合成」、丸善株式会社、１９７５年および「ペプチド シンテシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、インターサイエンス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９６年）に記載の方法により、これら蛋白質を製造できるが、これらに限らず公知の方法が広く利用できる。蛋白質の化学合成方法として、固相合成方法や液相合成方法等が知られているがいずれを用いることもできる。このような蛋白質合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていくいわゆるステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメントコンデンセーション法とを包含し、本蛋白質の合成は、そのいずれによっても実施できる。上記蛋白質合成において用いられる縮合法も、常法に従うことができ、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）法、ウッドワード法を例示できる。また、市販のアミノ酸合成装置を用いてペプチドを製造することができる。
【０２４１】
ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、またはＪＮＫに、変異が導入されたものも本発明において使用できる。蛋白質、ポリペプチドおよびポリペプチドに変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術（ウルマー（Ｋ．Ｍ．Ｕｌｍｅｒ）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１）を利用して実施できる。このような変異の導入において、当該の基本的な性質（物性、機能または免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるポリペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変することができる。
【０２４２】
ＭＡＳＴ２０５、ＤＣＴＮ１、ＴＩＡＭ１、ＭＬＫ３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、ｐ３８ ＭＡＰＫ、またはＪＮＫは、所望により、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種分離操作方法により精製および／または分離できる。分離および／または精製は、本蛋白質の機能を指標にして実施できる。分離操作方法として、例えば硫酸アンモニウム沈殿、限外ろ過、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析法等を単独でまたは適宜組合せて使用できる。好ましくは、本蛋白質のアミノ酸配列情報に基づき、これらに対する特異的抗体を作成し、該抗体を用いて特異的に吸着する方法、例えば該抗体を結合させたカラムを利用するアフィニティクロマトグラフィーを用いることが推奨される。
【０２４３】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
【実施例１】
【０２４４】
（ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１およびＴＩＡＭ１との結合解析）
ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１およびＴＩＡＭ１との結合を、ヒト培養細胞における一過性共発現系を用いて免疫沈降法により検討した。
【０２４５】
細胞数５．０×１０^５／５ｍｌ ｍｅｄｉｕｍのＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ｃｍ ディッシュに播種し、３７℃にて５％ ＣＯ_２／９５％ エアの条件下で２４時間培養後、ＭＡＳＴ２０５遺伝子を組み込んだｐＣＩ／Ｍｙｃ発現ベクター ４μｇと、ＤＣＴＮ１遺伝子またはＴＩＡＭ１遺伝子を組み込んだｐＣＩ／ＦＬＡＧ発現ベクター ４μｇとを、１５μＬのリポフェクトアミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて細胞にトランスフェクションした。これらベクターにより、それぞれＭｙｃ−ｔａｇで標識されたＭＡＳＴ２０５（以下、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５と称する）、ＦＬＡＧ−ｔａｇで標識されたＤＣＴＮ１（以下、ＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１と称する）、ＦＬＡＧ−ｔａｇで標識されたＴＩＡＭ１（以下、ＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１と称する）が細胞内で発現される。コントロールとして、ＭＡＳＴ２０５遺伝子を組み込んだｐＣＩ／Ｍｙｃ発現ベクターの代わりにＭＡＳＴ２０５遺伝子を組み込んでいないｐＣＩ／Ｍｙｃ発現ベクター、あるいはＤＣＴＮ１遺伝子またはＴＩＡＭ１遺伝子を組み込んだｐＣＩ／ＦＬＡＧ発現ベクターの代わりにＤＣＴＮ１遺伝子またはＴＩＡＭ１遺伝子を組み込んでいないｐＣＩ／ＦＬＡＧ発現ベクターを、同様の方法でトランスフェクションした細胞を調製した。トランスフェクションして４８時間培養した後、培養上清を除き、細胞を冷たいリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと略称する）で２回洗浄し、０．０１容となるようにプロテアーゼ阻害カクテル（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｓｉｇｍａ社製）を加えた１×細胞溶解バッファー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を５００μＬ添加した。氷上で１５分間放置した後、１５，０００ｒｐｍにて４℃で３０分間遠心処理し、その上清を細胞溶解液として用いた。細胞溶解液の蛋白質濃度は、クマシー プラス−２００ プロテインアッセイ試薬（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ−２００ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて定量した。一部の細胞溶解液は、２×ＳＤＳ サンプルバッファーを加え、熱変性させた（以下、細胞溶解液サンプルと称する）。細胞から抽出した細胞溶解液は、各サンプル間で蛋白質量を同一にし、０．１％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした２０μＬ（５０％ ｖ／ｖ）のプロテインＧ セファロース ４ ファストフロー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加え、４℃で１時間回転させて攪拌した。その後、１０，０００ｒｐｍにて４℃で１分間遠心処理し、その上清を回収した。回収した上清に１μｇの抗体を加え、４℃で一晩回転させて攪拌した。その後、０．１％ ＢＳＡでブロッキングした６０μＬ（５０％ ｖ／ｖ）のＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを加え、４℃で２時間回転させて攪拌した。次いで、１０，０００ｒｐｍにて４℃で１分間遠心処理し、その上清を除去した。５００μＬの１×細胞溶解バッファーを加え、１０，０００ｒｐｍにて４℃で１分間遠心処理し、その上清を除去した。この洗浄操作を３回繰り返した後に、２×ＳＤＳ サンプルバッファーをレジンと等量（３０μＬ）加え、吸着した蛋白質を抽出し熱変性させた（以下、免疫沈降サンプルと称する）。細胞溶解液サンプルおよび免疫沈降サンプルを５−２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、１次抗体および２次抗体で染色後、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）またはＥＣＬ Ｐｌｕｓ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて蛋白質の検出を行った。免疫沈降サンプルの調製に用いた抗体および１次抗体として、マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ社製）およびマウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）を、２次抗体としてＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。
【０２４６】
図１に、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合解析の結果を示す。図１の中パネルおよび右パネルに示すように、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を共発現させた細胞（レーン１）から、マウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：Ｍｙｃと示す）およびマウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：ＦＬＡＧと示す）においてのみ、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１の共沈（図中、矢印で示す）が検出された。一方、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５非発現細胞（レーン２）から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１の共沈が検出されなかった。このことから、この共沈降はＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１のレジンへの非特異的吸着によるものではなく、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１の結合を示すものと判定した。また、ＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１非発現細胞（レーン３）、並びにＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５およびＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１非発現細胞（レーン４）から同様に調製した免疫沈降サンプルでもＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１の共沈は検出されなかった。Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５発現細胞から調製したサンプルにおけるＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５の発現、およびＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１発現細胞から調製したサンプルにおけるＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１の発現は、いずれも同程度であった（図１の左パネル）。
【０２４７】
具体的には、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を共発現させた細胞の細胞溶解液をマウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図１の中パネル、レーン１）において、ＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を示すバンド（図中、矢印で示す）およびＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を示すバンドが検出された。これに対して、ＭｙｃとＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図１の中パネル、レーン２）では、ＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１およびＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を示すバンドはいずれも検出されなかった。また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図１の中パネル、レーン３）ではＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を示すバンドのみが検出され、ＭｙｃとＦＬＡＧを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図１の中パネル、レーン４）ではいずれのバンドも検出されなかった。
【０２４８】
また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を共発現させた細胞の細胞溶解液をマウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図１の右パネル、レーン１）において、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を示すバンド（図中、矢印で示す）およびＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を示すバンドが検出された。これに対して、ＭｙｃとＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図１の右パネル、レーン２）では、ＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を示すバンドのみが検出された。また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図１の右パネル、レーン３）およびＭｙｃとＦＬＡＧを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図１の右パネル、レーン４）ではいずれのバンドも検出されなかった。
【０２４９】
上記結果から、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１が細胞内で結合することが明らかになった。
【０２５０】
図２に、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合解析の結果を示す。図２の中パネルおよび右パネルに示すように、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１を共発現させた細胞（レーン１）から、マウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：Ｍｙｃと示す）およびマウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：ＦＬＡＧと示す）においてのみ、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１の共沈（図中、矢印で示す）が検出された。一方、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５非発現細胞（レーン２）から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１の共沈が検出されなかった。このことから、この共沈降はＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１のレジンへの非特異的吸着によるものではなく、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１の結合を示すものと判定した。また、ＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１非発現細胞（レーン３）、並びにＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５およびＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１非発現細胞（レーン４）から同様に調製した免疫沈降サンプルでもＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１の共沈は検出されなかった。Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５発現細胞から調製したサンプルにおけるＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５の発現、およびＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１発現細胞から調製したサンプルにおけるＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１の発現は、いずれも同程度であった（図２の左パネル）。
【０２５１】
具体的には、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１を共発現させた細胞の細胞溶解液をマウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図２の中パネル、レーン１）において、ＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１を示すバンド（図中、矢印で示す）およびＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を示すバンドが検出された。これに対して、ＭｙｃとＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１を共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図２の中パネル、レーン２）では、ＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１およびＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を示すバンドはいずれも検出されなかった。また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図２の中パネル、レーン３）ではＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を示すバンドのみが検出され、ＭｙｃとＦＬＡＧを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図２の中パネル、レーン４）ではいずれのバンドも検出されなかった。
【０２５２】
また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１を共発現させた細胞の細胞溶解液をマウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図２の右パネル、レーン１）において、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を示すバンド（図中、矢印で示す）およびＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１を示すバンドが検出された。これに対して、ＭｙｃとＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１を共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図２の右パネル、レーン２）では、ＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１を示すバンドのみが検出された。また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図２の右パネル、レーン３）およびＭｙｃとＦＬＡＧを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図２の右パネル、レーン４）ではいずれのバンドも検出されなかった。
【０２５３】
上記結果から、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１が細胞内で結合することが明らかになった。
【実施例２】
【０２５４】
（ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化解析）
ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化をｉｎ ｖｉｔｒｏで解析した。
【０２５５】
リン酸化試験に用いたＭＡＳＴ２０５およびＤＣＴＮ１は以下のようにして調製した。細胞数１０×１０^５／１０ｍｌ ｍｅｄｉｕｍのＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍ ディッシュに播種し、３７℃にて５％ ＣＯ_２／９５％ エアの条件下で２４時間培養後、ＭＡＳＴ２０５遺伝子を組み込んだｐＣＩ／Ｍｙｃ発現ベクター ４μｇ、またはＤＣＴＮ１遺伝子を組み込んだｐＣＩ／ＦＬＡＧ発現ベクター ４μｇを、３０μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて細胞にトランスフェクションした。これらベクターにより、それぞれＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５およびＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１が細胞内で発現される。コントロールとして、ＭＡＳＴ２０５遺伝子を組み込んでいないｐＣＩ／Ｍｙｃ発現ベクター、あるいはＤＣＴＮ１遺伝子を組み込んでいないｐＣＩ／ＦＬＡＧ発現ベクターを同様の方法でトランスフェクションした細胞を調製した。各蛋白質はトランスフェクションの４８時間後に抽出した。具体的には、上記細胞をＰＢＳで洗浄後、０．０１容となるようにプロテアーゼ阻害カクテル（Ｓｉｇｍａ社製）を加えた１×細胞溶解バッファー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を添加し、氷上で３５分間放置した後、１５，０００ｒｐｍにて４℃で３０分間遠心処理し、その上清を細胞溶解液とした。細胞溶解液の蛋白質濃度は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ−２００ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて定量した。細胞溶解液（０．２ｍＬ〜０．５ｍＬ）に０．１％ ＢＳＡでブロッキングした２０μＬ（５０％ ｖ／ｖ）のＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加え、４℃で１時間回転させて攪拌した。次いで、１０，０００ｒｐｍにて４℃で１分間遠心処理し、その上清を回収した。回収した上清に抗体を２μｇ添加し、４℃で一晩回転させて攪拌した。抗体は、マウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ社製）およびマウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）を用いた。その後、０．１％ ＢＳＡでブロッキングした６６μＬ（５０％ ｖ／ｖ）のＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを加え、４℃で２時間回転させて攪拌した。次いで、１０，０００ｒｐｍにて４℃で１分間遠心処理し、その上清を除去した。５００μＬの１×細胞溶解バッファーを加え、１０，０００ｒｐｍにて４℃で１分間遠心処理し、その上清を除去した。この操作を３回繰り返した。次に５００μＬのキナーゼバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５，２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２，２ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ））を加え、１０，０００ｒｐｍにて４℃で１分間遠心処理後、上清を除去した。この操作を３回繰り返した。最後に、３３μＬの割合でキナーゼバッファーを加え、使用時まで−８０℃で保存した。
【０２５６】
リン酸化試験には上記調製したＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を６μＬ（５０％ ｖ／ｖ）およびＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を１３μＬ（５０％ ｖ／ｖ）使用した。これらを混合し、ＡＴＰミクスチャーを６μＬ加えて（ＡＴＰ終濃度２００μＭ、［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰ ２．５μＣｉ／ｓａｍｐｌｅ）、３０℃で１５分間反応させた。５×ＳＤＳサンプルバッファーを６．２５μＬ／ｓａｍｐｌｅ加え、熱変性させ、これを５％あるいは５−２０％アクリルアミドゲルで電気泳動（１０μＬ／ｌａｎｅ）し、ゲルドライヤーでゲルを乾燥後、イメージングプレートに露出、ＦＬＡ３０００（富士フィルム社製）にて解析した。
【０２５７】
図３に示すように、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を反応させたときに、ＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１のリン酸化を示すバンドが検出された（レーン１）。これに対して、ＭｙｃとＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を反応させたときにはこのようなバンドはほとんど検出されなかった（レーン２）。また、ＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１の代わりにＦＬＡＧを用いて同様の反応を行ったときには、ＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１のリン酸化を示すバンドは検出されなかった（レーン３および４）。
【０２５８】
この結果から、ＭＡＳＴ２０５がＤＣＴＮ１をリン酸化することが明らかになった。
【実施例３】
【０２５９】
（ＭＡＳＴ２０５発現阻害によるｐ３８ ＭＡＰＫ、ＪＮＫ、ＭＫＫ６のリン酸化阻害）
ＭＡＳＴ２０５はＤＣＴＮ１と結合してこれをリン酸化する（実施例２参照）。ＤＣＴＮ１は、ｐ３８ ＭＡＰＫあるいはその上流のＭＫＫ６／ＭＫＫ３を介した情報伝達経路に関与することが知られている（チェウン（Ｃｈｅｕｎｇ Ｐ．）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００４年、第２７９巻、第４４号、ｐ．４５３０８−４５３１１）。
【０２６０】
そこで、ＭＡＰＫＫ（ＭＡＰＫ ｋｉｎａｓｅ）あるいはＭＡＰＫが関与する情報伝達経路へのＭＡＳＴ２０５の影響を解析するため、ストレス刺激により活性化されるＭＡＰＫＫおよびその下流に位置する蛋白質のリン酸化を、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害した細胞と該発現を阻害しない細胞とを用いて比較検討した。
【０２６１】
細胞は、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頚部癌細胞株）を用いた。細胞におけるＭＡＳＴ２０５の発現阻害は、ＭＡＳＴ２０５に対するｓｉＲＮＡ（以下、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡと称する）を用いて行った。ここで用いたＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡは、配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社へ製造委託）である。配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。コントロールとして、非特異的コントロール デュープレックスＶＩＩＩ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）を用いた。非特異的コントロール デュープレックスＶＩＩＩは、配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである（以下、コントロールｓｉＲＮＡと称することがある）。
【０２６２】
蛋白質リン酸化の検討は、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＫＫ６、ＭＫＫ３、ＪＮＫ、およびＥＲＫ１／２について行った。
【０２６３】
具体的には、２×１０^５／１ｍＬ ｍｅｄｉｕｍのＨｅＬａ細胞を１２ウエルプレートの各ウエルに播種し、３７℃にて５％ ＣＯ_２／９５％ エアの条件下で２４時間培養した。次いで、３μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、１００ｐｍｏｌのＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡ（２０μＭ ｓｉＲＮＡを５μＬ）を細胞にトランスフェクションし、さらに２４時間、３７℃にて５％ ＣＯ_２／９５％ エアの条件下で培養した。その後、細胞を回収し、２等分にして１２ウエルプレートにまきなおし、さらに２４時間、３７℃にて５％ ＣＯ_２／９５％ エアの条件下で培養した。次いで、細胞を０．４Ｍ ソルビトールで２０分間刺激した。刺激後、培養上清を除去し、冷トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）にて２回洗浄後、０．０１容となるようにプロテアーゼ阻害カクテル（Ｓｉｇｍａ社製）、およびそれぞれ終濃度で１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０μＭ フッ化ナトリウム、１μＭ パラニトロフェニルホスフェート、２μＭ ＤＴＴ、０．５μＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を加えた１×細胞溶解バッファー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、氷上で２０分間放置した後、１５，０００ｒｐｍにて４℃で３０分間遠心処理し、その上清を細胞溶解液とした。細胞溶解液はＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ−２００ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて定量した。一部の細胞溶解液は、５×ＳＤＳ サンプルバッファーを加え、熱変性させた（以下、細胞溶解サンプルと称する）。これらのサンプルを５−２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離、１次抗体および２次抗体で染色後、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）またはＥＣＬ Ｐｌｕｓ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて検出した。各蛋白質を検出するための１次抗体として、ウサギ抗ｐ３８ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、ウサギ抗ＭＫＫ３ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、ウサギ抗ＭＫＫ６ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ウサギ抗ＳＡＰＫ／ＪＮＫポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、ウサギ抗ｐ４４／４２ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、およびウサギ抗ＭＡＳＴ２０５ポリクローナル抗体を用いた。リン酸化蛋白質を検出するための１次抗体として、ウサギ抗リン酸化ｐ３８ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、ウサギ抗リン酸化ＭＫＫ３／ＭＫＫ６（Ｓｅｒ１８９／２０７）ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、ウサギ抗リン酸化ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、およびウサギ抗リン酸化ｐ４４／４２ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。２次抗体として、ＨＲＰ結合ロバ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた。
【０２６４】
図４の左パネルに各蛋白質の検出結果を示す。ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞では、ソルビトール刺激の有無に関わらず、ＭＡＳＴ２０５が検出されなかった。コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞ではＭＡＳＴ２０５が検出され、該細胞におけるＭＡＳＴ２０５の発現量はソルビトール刺激の有無に関わらず同程度であった。ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＫＫ６、ＭＫＫ３、ＪＮＫ、およびＥＲＫ１／２の発現量は、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞およびＭＡＳＴ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞で、ソルビトール刺激の有無に関わらず、ほぼ同程度であった。
【０２６５】
この結果から、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションすることにより、ＭＡＳＴ２０５の発現が阻害されることが確認できた。
【０２６６】
図４の右パネルにリン酸化蛋白質の検出結果を示す。コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞では、ソルビトール刺激をしないときには、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ６、およびＪＮＫのリン酸化は検出されず、ソルビトール刺激により、これら蛋白質のリン酸化が検出された。一方、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞では、ソルビトール刺激によっても、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ６およびＪＮＫのリン酸化は検出されないか、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞と比較してその程度が低かった。ＥＲＫ１／２のリン酸化は、ソルビトール刺激の有無に関わらず、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞およびＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞のいずれにおいても検出された。
【０２６７】
ＭＡＳＴ２０５の発現阻害により、ソルビトール刺激によるｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ６、およびＪＮＫのリン酸化が著しく低減したことから、ＭＡＳＴ２０５がｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ６およびＪＮＫのリン酸化に関与することが明らかになった。一方、ＭＡＳＴ２０５は、ＭＡＰＫＫが関与する情報伝達経路のうちＭＥＫ１およびＭＥＫ２の下流に位置するＥＲＫ１／２のリン酸化に関与しなかった。このように、ＭＡＳＴ２０５はＤＣＴＮ１と結合することにより、ＭＫＫ３およびＭＫＫ６のリン酸化に関与し、さらにこれらの下流に位置するｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化に関与すると発明者らは考えている。ＭＡＳＴ２０５が関与するＪＮＫのリン酸化過程は明らかではないが、ＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１との結合によりＭＫＫ７／ＭＫＫ４を介してＪＮＫのリン酸化に関与しているかもしれない。
【実施例４】
【０２６８】
（細胞遊走試験）
細胞の遊走へのＭＡＳＴ２０５の影響を、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害した細胞と該発現を阻害しない細胞とを用いて比較検討した。
【０２６９】
細胞は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ヒト乳癌細胞株）を用いた。細胞におけるＭＡＳＴ２０５の発現阻害はＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡを用いて行った。ここで用いたＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡは、配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社へ製造委託）である。配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドコントロールとして、非特異的コントロール デュープレックスＶＩＩＩ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）を用いた。非特異的コントロール デュープレックスＶＩＩＩは、配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである（以下、コントロールｓｉＲＮＡと称することがある）。
【０２７０】
細胞遊走試験は、セルカルチャーインサート（上層）をコンパニオンプレート（下層）に載せることにより構成されたチャンバー（以下、細胞遊走試験用チャンバーと称することがある）を用いて実施した。セルカルチャーインサート（上層）には０．１％ ＢＳＡを含む培養培地（ｍｅｄｉｕｍ）に懸濁した細胞溶液を添加し、コンパニオンプレート（下層）には１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む培養培地を添加した。セルカルチャーインサート（上層）に添加された細胞は、コンパニオンプレート（下層）に添加された培養培地に含まれる１０％ ＦＢＳにより遊走が誘導されると、該セルカルチャーインサートのメンブレンの細孔を通過してその裏面に移動する。細胞遊走のバックグラウンドとして、１０％ ＦＢＳ含む培養培地の代わりに０．１％ ＢＳＡを含む培養培地を用い、同様の方法で細胞遊走試験を実施した。
【０２７１】
細胞遊走の判定は、セルカルチャーインサートとして、フルオロブロック セルカルチャーインサート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）を用い、セルカルチャーインサートのメンブレンの裏面に上層から移動した細胞を蛍光色素染色し、次いで蛍光強度を測定することにより実施した。蛍光強度は、フルオロブロック セルカルチャーインサートのメンブレンの裏面に上層から移動した細胞の数を反映する。
【０２７２】
細胞遊走へのＭＡＳＴ２０５の影響の検討は、具体的には、次のように実施した。まず、細胞数１×１０^６／５ｍＬ ｍｅｄｉｕｍのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を６ｃｍ ディッシュに播種し、３７℃にて５％ ＣＯ_２／９５％ エアの条件下で２４時間培養した。培養培地は、１０％ ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。次いで、１５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、５００ｐｍｏｌのＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡ（２０μＭ ｓｉＲＮＡを２５μＬ）を細胞にトランスフェクションし、さらに４８時間、３７℃にて５％ ＣＯ_２／９５％ エアの条件下で培養した。その後、細胞を回収し、０．１％ ＢＳＡ／ＤＭＥＭに再懸濁して細胞数２×１０^５／ｍＬに調整した。細胞遊走試験用チャンバーの上層であるフルオロブロック セルカルチャーインサートに細胞懸濁液を２５０μＬずつ添加し、該チャンバーの下層である２４ウエルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）に１０％ ＦＢＳ／ＤＭＥＭあるいは０．１％ ＢＳＡ／ＤＭＥＭを７５０μＬ添加した。３７℃にて５％ ＣＯ_２／９５％ エアの条件下でさらに６時間培養した後、フルオロブロック セルカルチャーインサートを２ｍＭ カルセイン−ＡＭ（Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を含むハンクス緩衝平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で３７℃にて１時間染色し、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いてＥｘ４８５／Ｅｍ５３０の波長で蛍光を測定した。ｓｉＲＮＡをトランスフェクションして培養した細胞の一部は、６ｃｍ ディッシュに播種し、ＭＡＳＴ２０５の発現の測定に用いた。ＭＡＳＴ２０５の発現の測定は、細胞から蛋白質を抽出し、ウエスタンブロッティングにより実施した。細胞からの蛋白質の抽出およびウエスタンブロッティングは実施例１に記載の方法と同様の方法で実施した。
【０２７３】
図５に示すように、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞を用いたときの蛍光強度は、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞を用いたときのものと比較して有意に低下した。コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞ではＭＡＳＴ２０５の高い発現が認められたが、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞ではＭＡＳＴ２０５の発現はほとんど認められなかった。
【０２７４】
蛍光強度は、フルオロブロック セルカルチャーインサートのメンブレンの裏面に遊走した細胞の数を反映する。すなわち、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞の遊走は、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞と比較して有意に低減していることが判明した。また、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞では、ＭＡＳＴ２０５の発現が著しく阻害されていることが分かった。
【０２７５】
このように、ＭＡＳＴ２０５を阻害することにより、細胞の遊走が抑制されることが明らかになった。
【実施例５】
【０２７６】
（細胞浸潤試験）
細胞の浸潤へのＭＡＳＴ２０５の影響を、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害した細胞と該発現を阻害しない細胞とを用いて比較検討した。
【０２７７】
細胞は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ヒト乳癌細胞株）を用いた。細胞におけるＭＡＳＴ２０５の発現阻害はＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡを用いて行った。ここで用いたＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡは、配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社へ製造委託）である。配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。コントロールとして、非特異的コントロール デュープレックスＶＩＩＩ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）を用いた。非特異的コントロール デュープレックスＶＩＩＩは、配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである（以下、コントロールｓｉＲＮＡと称することがある）。
【０２７８】
細胞浸潤試験は、マトリゲルが被覆されたセルカルチャーインサート（上層）をコンパニオンプレート（下層）に載せることにより構成されたチャンバー（以下、細胞浸潤試験用チャンバーと称することがある）を用いて実施した。マトリゲルが被覆されたセルカルチャーインサート（上層）には０．１％ ＢＳＡを含む培養培地（ｍｅｄｉｕｍ）に懸濁した細胞溶液を添加し、コンパニオンプレート（下層）には１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む培養培地を添加した。マトリゲルが被覆されたセルカルチャーインサート（上層）に添加された細胞は、コンパニオンプレート（下層）に添加された培養培地に含まれる１０％ ＦＢＳにより浸潤が誘導されると、セルカルチャーインサートに被覆されたマトリゲルに浸潤し、セルカルチャーインサートのメンブレンの細孔を通過してその裏面に移動する。細胞浸潤のバックグラウンドとして、１０％ ＦＢＳ含む培養培地の代わりに０．１％ ＢＳＡを含む培養培地を用い、同様の方法で細胞浸潤試験を実施した。
【０２７９】
細胞浸潤の判定は、セルカルチャーインサートとして、１００μｇ／ｃｍ^２でマトリゲル（ＧＲＯＷＴＨ ＦＡＣＴＯＲ ＲＥＤＵＣＥＤ ＢＤ ＭＡＴＲＩＧＥＬ ＭＡＴＲＩＸ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を被覆したフルオロブロック セルカルチャーインサート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）を用い、該セルカルチャーインサートのメンブレンの裏面に上層から移動した細胞を蛍光色素染色し、次いで蛍光強度を測定することにより実施した。蛍光強度は、マトリゲルが被覆されたフルオロブロック セルカルチャーインサートのメンブレンの裏面に上層から移動した細胞の数を反映する。
【０２８０】
細胞浸潤へのＭＡＳＴ２０５の影響の検討は、具体的には、次のように実施した。まず、細胞数１×１０^６／５ｍＬ ｍｅｄｉｕｍのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を６ｃｍ ディッシュに播種し、３７℃にて５％ ＣＯ_２／９５％ エアの条件下で２４時間培養した。培養培地は、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭを用いた。次いで、１５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、５００ｐｍｏｌのＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡ（２０μＭ ｓｉＲＮＡを２５μＬ）を細胞にトランスフェクションし、さらに４８時間、３７℃にて５％ ＣＯ_２／９５％ エアの条件下で培養した。その後、細胞を回収し、０．１％ ＢＳＡ／ＤＭＥＭに再懸濁して細胞数８×１０^５／ｍＬに調整した。細胞浸潤試験用チャンバーの上層であるマトリゲルが被覆されたフルオロブロック セルカルチャーインサートに細胞懸濁液を２５０μＬずつ添加し、該チャンバーの下層である２４ウエルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製）に１０％ ＦＢＳ／ＤＭＥＭあるいは０．１％ ＢＳＡ／ＤＭＥＭを７５０μＬ添加した。３７℃にて５％ ＣＯ_２／９５％ エアの条件下でさらに２４時間培養した後、フルオロブロック セルカルチャーインサートを２ｍＭ カルセイン−ＡＭ（Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を含むハンクス緩衝平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で３７℃にて１時間染色し、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いてＥｘ４８５／Ｅｍ５３０の波長で蛍光を測定した。ｓｉＲＮＡをトランスフェクションして培養した細胞の一部は、６ｃｍ ディッシュに播種し、ＭＡＳＴ２０５の発現の測定に用いた。ＭＡＳＴ２０５の発現の測定は、細胞から蛋白質を抽出し、ウエスタンブロッティングにより実施した。細胞からの蛋白質の抽出およびウエスタンブロッティングは実施例１に記載の方法と同様の方法で実施した。
【０２８１】
図６−Ａに示すように、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞を用いたときの蛍光強度は、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞を用いたときのものと比較して有意に低下した。コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞ではＭＡＳＴ２０５の高い発現が認められたが、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞ではＭＡＳＴ２０５の発現はほとんど認められなかった（図６−Ｂ）。一方、β−チューブリンの発現量は、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞とコントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞でほぼ同程度であった。
【０２８２】
蛍光強度は、マトリゲルを被覆したメンブレンの裏面に移動した細胞の数を反映する。すなわち、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞のマトリゲルへの浸潤は、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞と比較して有意に低減していることが判明した。また、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞では、ＭＡＳＴ２０５の発現が著しく阻害されていることが分かった。
【０２８３】
このように、ＭＡＳＴ２０５を阻害することにより、細胞の浸潤が抑制されることが明らかになった。
【実施例６】
【０２８４】
（ＭＡＳＴ２０５とキナーゼとの結合解析）
ＭＡＳＴ２０５と６種類のキナーゼ（ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７およびＭＬＫ３）それぞれとの結合を、ヒト培養細胞における一過性共発現系を用いて免疫沈降法により検討した。以下、各キナーゼを候補蛋白質と称することがある。
【０２８５】
細胞数５．０×１０^５／５ｍｌ ｍｅｄｉｕｍのＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ｃｍ ディッシュに播種し、３７℃にて５％ ＣＯ_２／９５％ エアの条件下で２４時間培養した。その後、ＭＡＳＴ２０５遺伝子を組み込んだｐＣＩ／Ｍｙｃ発現ベクター ４μｇと、候補蛋白質遺伝子を組み込んだｐＣＩ−ｎｅｏ／ＨＡ（ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ７およびＭＬＫ３）またはｐＣＭＶ／ＨＡ発現ベクター（ＭＫＫ６） ０．５−４μｇとを、１５μＬのＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて細胞にトランスフェクションした。これらベクターにより、それぞれＭｙｃ−ｔａｇで標識されたＭＡＳＴ２０５（以下、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５と称する）、ＨＡ−ｔａｇで標識されたｐ３８ ＭＡＰＫ（以下、ＨＡ−ｐ３８と称する）、ＨＡ−ｔａｇで標識されたＭＫＫ３（以下、ＨＡ−ＭＫＫ３と称する）、ＨＡ−ｔａｇで標識されたＭＫＫ４（以下、ＨＡ−ＭＫＫ４と称する）、ＨＡ−ｔａｇで標識されたＭＫＫ７（以下、ＨＡ−ＭＫＫ７と称する）、ＨＡ−ｔａｇで標識されたＭＬＫ３（以下、ＨＡ−ＭＬＫ３と称する）およびＨＡ−ｔａｇで標識されたＭＫＫ６（以下、ＨＡ−ＭＫＫ６と称する）が細胞内で発現される。コントロールとして、ＭＡＳＴ２０５遺伝子を組み込んだｐＣＩ／Ｍｙｃ発現ベクターの代わりにＭＡＳＴ２０５遺伝子を組み込んでいないｐＣＩ／Ｍｙｃ発現ベクター、あるいは候補蛋白質遺伝子を組み込んだｐＣＩ／ＨＡ発現ベクターまたはｐＣＭＶ／ＨＡ発現ベクターの代わりに、候補蛋白質遺伝子を組み込んでいないｐＣＩ／ＨＡ発現ベクターまたはｐＣＭＶ／ＨＡ発現ベクターを、同様の方法でトランスフェクションした細胞を調製した。トランスフェクションして４８時間培養した後、培養上清を除き、細胞を冷たいＰＢＳで２回洗浄し、０．０１容となるようにプロテアーゼ阻害カクテル（Ｓｉｇｍａ社製）を加えた１×細胞溶解バッファー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を５００μＬ添加した。氷上で１５分間放置した後、１５，０００ｒｐｍにて４℃で３０分間遠心処理し、その上清を細胞溶解液として用いた。細胞溶解液の蛋白質濃度は、クマシー プラス−２００ プロテインアッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて定量した。細胞から抽出した細胞溶解液は、各サンプル間で蛋白質量を同一にし、０．１％ ＢＳＡでブロッキングした８０μＬ（５０％ ｖ／ｖ）のプロテインＧ セファロース ４ ファストフロー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加え、４℃で１時間回転させて攪拌した。その後、１０，０００ｒｐｍにて４℃で１分間遠心処理し、その上清を回収した。回収した細胞溶解液の一部は、２×ＳＤＳ サンプルバッファーを加え、熱変性させた（以下、細胞溶解液サンプルと称する）。回収した上清に１μｇの抗体を加え、４℃で一晩回転させて攪拌した。その後、０．１％ ＢＳＡでブロッキングした８０μＬ（５０％ ｖ／ｖ）のプロテインＧ セファロース ４ ファストフローを加え、４℃で２時間回転させて攪拌した。次いで、１０，０００ｒｐｍにて４℃で１分間遠心処理し、その上清を除去した。５００μＬの１×細胞溶解バッファーを加え、１０，０００ｒｐｍにて４℃で１分間遠心処理し、その上清を除去した。この洗浄操作を３回繰り返した後に、２×ＳＤＳ サンプルバッファーを５０μＬ加え、吸着した蛋白質を抽出し熱変性させた（以下、免疫沈降サンプルと称する）。細胞溶解液サンプルおよび免疫沈降サンプルを５−２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、１次抗体および２次抗体で染色後、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）またはＥＣＬ Ｐｌｕｓ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて蛋白質の検出を行った。免疫沈降サンプルの調製および各種蛋白質の検出には、ウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体（Ａ１４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、マウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（９Ｅ１０、ウェスタンブロッティングに１：１０００倍希釈して使用、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）マウス抗ＨＡモノクローナル抗体（１２ＣＡ５、ウェスタンブロッティングに１：１０００倍希釈して使用、Ｒｏｃｈｅ社製）、およびＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ウェスタンブロッティングに１：２０００倍希釈して使用、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。
【０２８６】
図７に、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＬＫ３またはＭＫＫ６との結合解析の結果を示す。図７の右上パネルに示すように、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３またはＨＡ−ＭＫＫ６とを共発現させた細胞（レーン４、６および８）から、ウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：Ｍｙｃと示す）において、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３またはＨＡ−ＭＫＫ６との共沈（図中、矢印で示す）が検出された。一方、ＭｙｃとＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３またはＨＡ−ＭＫＫ６とを共発現させた細胞（レーン３、５または７）から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、Ｍｙｃ−ＭＡＳ２０５とＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３またはＨＡ−ＭＫＫ６の共沈が検出されなかった。このことから、この共沈降はＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３およびＨＡ−ＭＫＫ６のレジンへの非特異的吸着によるものではなく、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３およびＨＡ−ＭＫＫ６それぞれとの結合を示すものと判定した。また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を発現させたがＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３およびＨＡ−ＭＫＫ６のいずれをも発現させていない細胞（レーン２）、並びにＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５、ＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３およびＨＡ−ＭＫＫ６のいずれをも発現させていない細胞（レーン１）から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、上記のような共沈は検出されなかった。Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５発現細胞から調製したサンプルにおけるＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５の発現は、ウェスタンブロッティングにより確認できた（図７の右下パネルおよび左下パネル：レーン２、４、６および８）。また、ＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３またはＨＡ−ＭＫＫ６を発現させた細胞における各蛋白質の発現も、ウェスタンブロッティングにより確認できた（図７の左上パネル：レーン３−８）。
【０２８７】
具体的には、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３またはＨＡ−ＭＫＫ６とを共発現させた細胞の細胞溶解液をウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図７の右上パネル：レーン４、６および８）について、マウス抗ＨＡモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果、ＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３またはＨＡ−ＭＫＫ６を示すバンド（図中、矢印で示す）が検出された。これに対して、ＭｙｃとＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３またはＨＡ−ＭＫＫ６とを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図７の右上パネル：レーン３、５および７）では、ＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３またはＨＡ−ＭＫＫ６を示すバンドは検出されなかった。また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図７の右上パネル：レーン２）、およびＭｙｃとＨＡを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図７の右上パネル：レーン１）ではＨＡを示すバンドしか検出されなかった。
【０２８８】
上記結果から、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＬＫ３およびＭＫＫ６それぞれとが細胞内で結合することが明らかになった。
【０２８９】
図８に、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３との結合解析の結果を示す。図８の右上パネルに示すように、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ３を共発現させた細胞（レーン４）から、ウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：Ｍｙｃと示す）において、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ３との共沈（図中、矢印で示す）が検出された。一方、ＭｙｃとＨＡ−ＭＫＫ３を共発現させた細胞（レーン３）から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ３の共沈が検出されなかった。このことから、この共沈降はＨＡ−ＭＫＫ３のレジンへの非特異的吸着によるものではなく、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ３の結合を示すものと判定した。また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を発現させたがＨＡ−ＭＫＫ３を発現させていない細胞（レーン２）、並びにＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５およびＨＡ−ＭＫＫ３をいずれも発現させていない細胞（レーン１）から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、上記のような共沈は検出されなかった。Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５発現細胞から調製したサンプルにおけるＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５の発現は、ウェスタンブロッティングにより確認できた（図８の右下パネルおよび左下パネル：レーン２および４）。また、ＨＡ−ＭＫＫ３を発現させた細胞におけるＨＡ−ＭＫＫ３の発現も、ウェスタンブロッティングにより確認できた（図８の左上パネル：レーン３および４）。
【０２９０】
具体的には、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ３を共発現させた細胞の細胞溶解液をウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図８の右上パネル：レーン４）について、マウス抗ＨＡモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果、ＨＡ−ＭＫＫ３を示すバンド（図中、矢印で示す）が検出された。これに対して、ＭｙｃとＨＡ−ＭＫＫ３を共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図８の右上パネル：レーン３）では、ＨＡ−ＭＫＫ３を示すバンドは検出されなかった。また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図８の右上パネル：レーン２）、およびＭｙｃとＨＡを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図８の右上パネル：レーン１）ではＨＡを示すバンドしか検出されなかった。
【０２９１】
上記結果から、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３が細胞内で結合することが明らかになった。
【０２９２】
図９に、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４との結合解析の結果を示す。図９の右上パネルに示すように、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ４を共発現させた細胞（レーン３）から、ウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：Ｍｙｃと示す）において、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ３との共沈（図中、矢印で示す）が検出された。一方、ＭｙｃとＨＡ−ＭＫＫ４を共発現させた細胞（レーン２）から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ３の共沈が検出されなかった。このことから、この共沈降はＨＡ−ＭＫＫ４のレジンへの非特異的吸着によるものではなく、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ４の結合を示すものと判定した。また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５およびＨＡ−ＭＫＫ３をいずれも発現させていない細胞（レーン１）から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、上記のような共沈は検出されなかった。Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５発現細胞から調製したサンプルにおけるＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５の発現は、ウェスタンブロッティングにより確認できた（図９の右下パネルおよび左下パネル：レーン１および３）。また、ＨＡ−ＭＫＫ４を発現させた細胞におけるＨＡ−ＭＫＫ４の発現も、ウェスタンブロッティングにより確認できた（図９の左上パネル：レーン２および３）。
【０２９３】
具体的には、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ４を共発現させた細胞の細胞溶解液をウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図９の右上パネル：レーン３）について、マウス抗ＨＡモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果、ＨＡ−ＭＫＫ４を示すバンド（図中、矢印で示す）が検出された。これに対して、ＭｙｃとＨＡ−ＭＫＫ４を共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図９の右上パネル：レーン２）では、ＨＡ−ＭＫＫ４を示すバンドは検出されなかった。また、ＭｙｃとＨＡを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図９の右上パネル：レーン１）ではＨＡを示すバンドしか検出されなかった。
【０２９４】
上記結果から、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４が細胞内で結合することが明らかになった。
【０２９５】
図１０に、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７との結合解析の結果を示す。図１０の右上パネルに示すように、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ７を共発現させた細胞（レーン４）から、ウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：Ｍｙｃと示す）において、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ７との共沈（図中、矢印で示す）が検出された。一方、ＭｙｃとＨＡ−ＭＫＫ７を共発現させた細胞（レーン３）から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ７の共沈が検出されなかった。このことから、この共沈降はＨＡ−ＭＫＫ７のレジンへの非特異的吸着によるものではなく、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ７の結合を示すものと判定した。また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５を発現させたがＨＡ−ＭＫＫ７を発現させていない細胞（レーン２）、並びにＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５およびＨＡ−ＭＫＫ７をいずれも発現させていない細胞（レーン１）から同様に調製した免疫沈降サンプルでは、上記のような共沈は検出されなかった。Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５発現細胞から調製したサンプルにおけるＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５の発現は、ウェスタンブロッティングにより確認できた（図１０の右下パネルおよび左下パネル：レーン２および４）。また、ＨＡ−ＭＫＫ７を発現させた細胞におけるＨＡ−ＭＫＫ７の発現も、ウェスタンブロッティングにより確認できた（図１０の左上パネル：レーン３および４）。
【０２９６】
具体的には、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ７を共発現させた細胞の細胞溶解液をウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプル（図１０の右上パネル：レーン４）について、マウス抗ＨＡモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った結果、ＨＡ−ＭＫＫ７を示すバンド（図中、矢印で示す）が検出された。これに対して、ＭｙｃとＨＡ−ＭＫＫ７を共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図１０の右上パネル：レーン３）では、ＨＡ−ＭＫＫ７を示すバンドは検出されなかった。また、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図１０の右上パネル：レーン２）、およびＭｙｃとＨＡを共発現させた細胞から同様に調製した免疫沈降サンプル（図１０の右上パネル：レーン１）ではＨＡを示すバンドしか検出されなかった。
【０２９７】
上記結果から、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７が細胞内で結合することが明らかになった。
【実施例７】
【０２９８】
（ＭＡＳＴ２０５発現阻害によるＭＫＫ４のリン酸化阻害）
ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害することにより、ＪＮＫのリン酸化が阻害された（実施例３参照）。ＪＮＫは、細胞増殖や細胞死または免疫炎症応答に関与することが知られており、ＭＫＫ７／ＭＫＫ４によってリン酸化されることによりその機能が調節されている。
【０２９９】
そこで、ＭＡＳＴ２０５の発現阻害によるＪＮＫのリン酸化阻害が、ＭＡＳＴ２０５によるＭＫＫ４の機能阻害に起因するか否かを解析した。ＭＫＫ４は、ストレス刺激によりリン酸化されて活性化する。ストレス刺激によるＭＫＫ４のリン酸化を、ＭＫＫ４の機能の指標として測定した。具体的には、ストレス刺激によるＭＫＫ４のリン酸化を、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害した細胞と該発現を阻害しない細胞とを用いて比較検討した。
【０３００】
細胞は、ＨｅＬａ細胞を用いた。ＨｅＬａ細胞は、４０μｍ メッシュによりろ過してから用いた。
【０３０１】
細胞におけるＭＡＳＴ２０５の発現阻害は、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡを用いて行った。ここで用いたＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡは、配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチド（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社へ製造委託）である。配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドの３´末端に、２個のデオキシチミジル酸（ＴＴ）からなるオーバーハング配列を結合させたオリゴヌクレオチドである。コントロールとして、非特異的コントロール デュープレックスＶＩＩＩ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）を用いた。非特異的コントロール デュープレックスＶＩＩＩは、配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである（以下、コントロールｓｉＲＮＡと称することがある）。
【０３０２】
具体的には、５×１０^５／１ｍＬ ｍｅｄｉｕｍのＨｅＬａ細胞を６ウエルプレートの各ウエルに播種し、３７℃にて５％ ＣＯ_２／９５％ エアの条件下で２４時間培養した。次いで、７．５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、２５０ｐｍｏｌのＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡを細胞にトランスフェクションした（最終液量は３ｍＬ）。３７℃にて５％ ＣＯ_２／９５％ エアの条件下で２４時間培養後、細胞を回収し、４等分にして１２ウエルプレートにまきなおし、さらに２４時間、３７℃にて５％ ＣＯ_２／９５％ エアの条件下で培養した。次いで、０．４Ｍ ソルビトールで２０分間、または、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１で１５分間、細胞を刺激した。刺激後、培養上清を除去し、冷ＴＢＳにて２回洗浄後、０．０１容となるようにプロテアーゼ阻害カクテル（Ｓｉｇｍａ社製）、およびそれぞれ終濃度で１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０μＭ フッ化ナトリウム、１μＭ パラニトロフェニルホスフェート、２μＭ ＤＴＴ、０．５μＭ ＰＭＳＦを加えた１×細胞溶解バッファー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、氷上で２０分間放置した後、１５，０００ｒｐｍにて４℃で３０分間遠心処理し、その上清を細胞溶解液とて用いた。細胞溶解液はＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ−２００ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて定量した。一部の細胞溶解液は、５×ＳＤＳ サンプルバッファーを加え、熱変性させた（以下、細胞溶解サンプルと称する）。これらのサンプルを５−２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、１次抗体および２次抗体で染色後、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）またはＥＣＬ Ｐｌｕｓ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて検出した。蛋白質を検出するための１次抗体として、ウサギ抗ＳＥＫ１／ＭＫＫ４ポリクローナル抗体（ウエスタンブロッティングに１：５００希釈して用いた、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、ウサギ抗ＭＡＳＴ２０５ポリクローナル抗体（ウエスタンブロッティングに１：１０００希釈して用いた、スクラム社へ製造委託）、およびウサギ抗β−チューブリンポリクローナル抗体（ウエスタンブロッティングに１：３００希釈して用いた、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）を用いた。リン酸化蛋白質を検出するための１次抗体として、ウサギ抗リン酸化ＳＥＫ１／ＭＫＫ４（Ｔｈｒ２６１）ポリクローナル抗体（ウエスタンブロッティングに１：５００希釈して用いた、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。２次抗体として、ＨＲＰ結合ロバ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（ウエスタンブロッティングに１：２０００希釈して用いた、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた。
【０３０３】
図１１の各パネルにそれぞれ、ＭＡＳＴ２０５、リン酸化ＭＫＫ４（図中、Ｐ−ＭＫＫ４と示す）ＭＫＫ４、およびβ−チューブリン（図中、β−ｔｕｂｕｌｉｎと示す）をウエスタンブロッティングにより検出した結果を示す。
【０３０４】
リン酸化ＭＫＫ４（図１１、左から２番目のパネル中で矢印により示す）は、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションし且つソルビトール刺激またはＩＬ−１刺激した細胞で検出された（レーン２および３）。それに対し、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞では、ソルビトール刺激やＩＬ−１刺激を行っても、リン酸化ＭＫＫ４が検出されなかった（レーン５および６）。ソルビトール刺激やＩＬ−１刺激を行わない場合は、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションの有無に関らず、リン酸化ＭＫＫ４は検出されなかった（レーン１および４）。
【０３０５】
ＭＡＳＴ２０５の発現（図１１、左パネル中で矢印により示す）は、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞において検出され、その発現量はソルビトール刺激やＩＬ−１刺激の有無に関わらずほぼ同程度であった（レーン１−３）。一方、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞では、ＭＡＳＴ２０５の発現はほとんど検出されなかった（レーン４−６）。ＭＫＫ４の発現（図１１、左から３番目のパネル中で矢印により示す）は、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞およびＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞のいずれにおいても検出され、その発現量はソルビトール刺激やＩＬ−１刺激の有無に関わらずほぼ同程度であった。また、内因性蛋白質であるβ−チューブリンの発現量が、用いたいずれの細胞溶解液においてもほぼ同程度であることから、ウェスタンブロッティングに用いた細胞溶解液中の蛋白質量は、いずれのレーンにおいてもほぼ同程度であることが明らかである。
【０３０６】
ＭＡＳＴ２０５の発現阻害により、ソルビトール刺激またはＩＬ−１刺激によるＭＫＫ４のリン酸化が著しく低減したことから、ＭＡＳＴ２０５がＭＫＫ４のリン酸化に関与することが明らかになった。一方、ＭＡＳＴ２０５の発現を阻害することにより、ＪＮＫのリン酸化が阻害された（実施例３参照）。また、ＭＡＳＴ２０５はＭＫＫ４と結合した（実施例６）。したがって、ＭＡＳＴ２０５はＭＫＫ４と結合することにより、ＭＫＫ４のリン酸化に関与し、さらにこれらの下流に位置するＪＮＫ３のリン酸化に関与すると発明者らは考えている。
【産業上の利用可能性】
【０３０７】
本発明によれば、ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤を提供できる。具体的には本発明により、ＭＡＳＴ２０５の発現、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合、およびＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性から選ばれる少なくとも１を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害方法および遊走阻害剤を提供できる。ＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害することにより、癌転移、血管新生、および免疫炎症応答の抑制を実施できると発明者らは考えている。
【０３０８】
本発明は、細胞の遊走および浸潤、癌転移、血管新生、並びに免疫炎症応答に関する基礎的研究直に有用である。さらに、癌転移、血管新生を伴う疾患、炎症性疾患の防止および／または治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０３０９】
【図１】ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１とのｉｎ ｖｉｖｏでの結合を、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５およびＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を一過性共発現させたヒト培養細胞を用いて免疫沈降法により検出した結果を示す図である。左パネルは、細胞溶解液（図中、ｌｙｓａｔｅと示す）を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す。中パネルは抗ｃ−Ｍｙｃ抗体による免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：Ｍｙｃと示す）について、抗ＦＬＡＧ抗体および抗ｃ−Ｍｙｃ抗体を用いてイムノブロットを行った結果を示す。右パネルは、抗ＦＬＡＧ抗体による免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：ＦＬＡＧと示す）について、抗ＦＬＡＧ抗体および抗ｃ−Ｍｙｃ抗体を用いてイムノブロットを行った結果を示す。各パネルともレーン１はＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５およびＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を共発現させた細胞、レーン２はＭｙｃとＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を共発現させた細胞、レーン３はＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧを共発現させた細胞、レーン４はＭｙｃとＦＬＡＧを共発現させた細胞を用いた結果を示す。Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を共発現させた細胞（レーン１）から、マウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプルおよびマウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプルにおいてのみ、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１の共沈（図中、矢印で示す）が検出された。図中の矢頭および数字は分子量を表す。（実施例１）
【図２】ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１とのｉｎ ｖｉｖｏでの結合を、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５およびＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１を一過性共発現させたヒト培養細胞を用いて免疫沈降法により検出した結果を示す図である。左パネルは、細胞溶解液（図中、Ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅと示す）を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す。中パネルは抗ｃ−Ｍｙｃ抗体による免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：Ｍｙｃと示す）について、抗ＦＬＡＧ抗体および抗ｃ−Ｍｙｃ抗体を用いてイムノブロットを行った結果を示す。右パネルは、抗ＦＬＡＧ抗体による免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：ＦＬＡＧと示す）について、抗ＦＬＡＧ抗体および抗ｃ−Ｍｙｃ抗体を用いてイムノブロットを行った結果を示す。各パネルともレーン１はＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５およびＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１を共発現させた細胞、レーン２はＭｙｃとＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１を共発現させた細胞、レーン３はＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧを共発現させた細胞、レーン４はＭｙｃとＦＬＡＧを共発現させた細胞を用いた結果を示す。Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１を共発現させた細胞（レーン１）から、マウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプルおよびマウス抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体で処理した免疫沈降サンプルにおいてのみ、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＴＩＡＭ１の共沈（図中、矢印で示す）が検出された。図中の矢頭および数字は分子量を表す。（実施例１）
【図３】ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化をｉｎ ｖｉｔｒｏで解析した結果を示す図である。レーン１はＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１、レーン２はＭｙｃとＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１、レーン３はＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＦＬＡＧ、レーン４はＭｙｃとＦＬＡＧを反応させた結果を示す。Ｍｙｃ−ＭＡＳＴとＦＬＡＧ−ＤＣＴＮ１を反応させたときのみ、ＤＣＴＮ１のリン酸化を示すバンドが検出された（レーン１）。図中の矢頭および数字は分子量を表す。（実施例２）
【図４】ソルビトール（Ｓｏｒｂｉｔｏｌ）刺激により活性化されるＭＡＰＫＫおよびその下流に位置する蛋白質のリン酸化を、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞と、コントロールｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクションした細胞を用いて比較検討した結果を示す図である。右パネルは、各リン酸化蛋白質を検出した結果を示す。左パネルは、各蛋白質をウエスタンブロッティングにより検出した結果を示す。コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞では、ソルビトール刺激をしないときには、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ６、およびＪＮＫのリン酸化は検出されず、ソルビトール刺激により、これら蛋白質のリン酸化が検出された。一方、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞では、ソルビトール刺激によっても、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ６およびＪＮＫのリン酸化は検出されないか、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞と比較してその程度が低かった。ＥＲＫ１／２のリン酸化は、ソルビトール刺激の有無に関わらず、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞およびＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞のいずれにおいても検出された。（実施例３）
【図５】細胞の遊走へのＭＡＳＴ２０５の影響を、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞と、コントロールｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクションした細胞を用いて比較検討した結果を示す図である。細胞の遊走は、フルオロブロック セルカルチャーインサートを用いて実施した。遊走した細胞は蛍光染色し、蛍光強度（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５３０））により細胞の遊走を判定した。蛍光強度の低下は、細胞の遊走の低減を反映する。ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞を用いたときの蛍光強度は、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞を用いたときのものと比較して有意に低下した。（実施例４）
【図６−Ａ】細胞の浸潤へのＭＡＳＴ２０５の影響を、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞と、コントロールｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクションした細胞を用いて比較検討した結果を示す図である。細胞の浸潤は、マトリゲルを被覆したフルオロブロック セルカルチャーインサートを用いて実施した。マトリゲルに浸潤した細胞は蛍光染色し、蛍光強度（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ｅｘ４８５／Ｅｍ５３０））により細胞の浸潤を判定した。蛍光強度の低下は、細胞の浸潤の低減を反映する。ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞を用いたときの蛍光強度は、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞を用いたときのものと比較して有意に低下した。（実施例５）
【図６−Ｂ】細胞の浸潤の検討に用いた、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞とコントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞におけるＭＡＳＴ２０５の発現量をウエスタンブロッティングにより測定した結果を示す図である。ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞（レーン２）では、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞（レーン１）と比較して、ＭＡＳＴ２０５の発現が著しく低減していた。一方、β−チューブリン（β−ｔｕｂｕｌｉｎ）の発現量はいずれの細胞でも同程度であった。図中の矢印は各蛋白質を示す。図中の矢頭および数字は分子量を表す。（実施例５）
【図７】ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫ、ＭＬＫ３またはＭＫＫ６とのｉｎ ｖｉｖｏでの結合を、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３またはＨＡ−ＭＫＫ６とを一過性共発現させたヒト培養細胞を用いて免疫沈降法により検出した結果を示す図である。左上パネルおよび左下パネルは、細胞溶解液（図中、ｌｙｓａｔｅと示す）について、それぞれマウス抗ＨＡモノクローナル抗体およびマウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った結果を示す。右上パネルおよび左下パネルは、ウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体による免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：Ｍｙｃと示す）について、それぞれマウス抗ＨＡモノクローナル抗体およびマウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った結果を示す。各パネルともレーン１はＭｙｃとＨＡを共発現させた細胞、レーン２はＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡを共発現させた細胞、レーン３はＭｙｃとＨＡ−ｐ３８を共発現させた細胞、レーン４はＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ｐ３８を共発現させた細胞、レーン５はＭｙｃとＨＡ−ＭＬＫ３を共発現させた細胞、レーン６はＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＬＫ３を共発現させた細胞、レーン７はＭｙｃとＨＡ−ＭＫＫ６を共発現させた細胞、およびレーン８はＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ６を共発現させた細胞を用いた結果を示す。Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３またはＨＡ−ＭＫＫ６とを共発現させた細胞（レーン４、６および８）から、ウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプルにおいてのみ、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ｐ３８、ＨＡ−ＭＬＫ３またはＨＡ−ＭＫＫ６との共沈（図中、矢印で示す）が検出された。図中の矢頭および数字は分子量を表す。（実施例６）
【図８】ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３のｉｎ ｖｉｖｏでの結合を、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ３を一過性共発現させたヒト培養細胞を用いて免疫沈降法により検出した結果を示す図である。左上パネルおよび左下パネルは、細胞溶解液（図中、ｌｙｓａｔｅと示す）について、それぞれマウス抗ＨＡモノクローナル抗体およびマウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った結果を示す。右上パネルおよび右下パネルは、ウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体による免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：Ｍｙｃと示す）について、それぞれマウス抗ＨＡモノクローナル抗体およびマウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った結果を示す。各パネルともレーン１はＭｙｃとＨＡを共発現させた細胞、レーン２はＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡを共発現させた細胞、レーン３はＭｙｃとＨＡ−ＭＫＫ３を共発現させた細胞、およびレーン４はＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ３を共発現させた細胞を用いた結果を示す。Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ３を共発現させた細胞（レーン４）から、ウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプルにおいてのみ、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ３の共沈（図中、矢印で示す）が検出された。図中の矢頭および数字は分子量を表す。（実施例６）
【図９】ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４のｉｎ ｖｉｖｏでの結合を、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ４を一過性共発現させたヒト培養細胞を用いて免疫沈降法により検出した結果を示す図である。左上パネルおよび左下パネルは、細胞溶解液（図中、ｌｙｓａｔｅと示す）について、それぞれマウス抗ＨＡモノクローナル抗体およびマウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った結果を示す。右上パネルおよび右下パネルは、ウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体による免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：Ｍｙｃと示す）について、それぞれマウス抗ＨＡモノクローナル抗体およびマウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った結果を示す。各パネルともレーン１はＭｙｃとＨＡを共発現させた細胞、レーン２はＭｙｃとＨＡ−ＭＫＫ４を共発現させた細胞、およびレーン３はＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ４を共発現させた細胞を用いた結果を示す。Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ４を共発現させた細胞（レーン３）から、ウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプルにおいてのみ、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ４の共沈（図中、矢印で示す）が検出された。図中の矢頭および数字は分子量を表す。（実施例６）
【図１０】ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７のｉｎ ｖｉｖｏでの結合を、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ７を一過性共発現させたヒト培養細胞を用いて免疫沈降法により検出した結果を示す図である。左上パネルおよび左下パネルは、細胞溶解液（図中、ｌｙｓａｔｅと示す）について、それぞれマウス抗ＨＡモノクローナル抗体およびマウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った結果を示す。右上パネルおよび右下パネルは、ウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体による免疫沈降サンプル（図中、ＩＰ：Ｍｙｃと示す）について、それぞれマウス抗ＨＡモノクローナル抗体およびマウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った結果を示す。各パネルともレーン１はＭｙｃとＨＡを共発現させた細胞、レーン２はＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡを共発現させた細胞、レーン３はＭｙｃとＨＡ−ＭＫＫ７を共発現させた細胞、およびレーン４はＭｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ７を共発現させた細胞を用いた結果を示す。Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ７を共発現させた細胞（レーン４）から、ウサギ抗ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体を用いて調製した免疫沈降サンプルにおいてのみ、Ｍｙｃ−ＭＡＳＴ２０５とＨＡ−ＭＫＫ７の共沈（図中、矢印で示す）が検出された。図中の矢頭および数字は分子量を表す。（実施例６）
【図１１】ソルビトール（図中、Ｓｏｒｂと示す）刺激またはＩＬ−１（図中、ＩＬ１と示す）刺激により活性化されるＭＫＫ４のリン酸化を、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞と、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞を用いて比較検討した結果を示す図である。左パネルは、ＭＡＳＴ２０５を検出した結果を示す。左から２番目のパネルは、リン酸化ＭＫＫ４（図中、Ｐ−ＭＫＫ４と示す）を検出した結果を示す。左から３番目のパネルは、ＭＫＫ４を検出した結果を示す。右パネルはβ−チューブリン（β−ｔｕｂｌｉｎ）を検出した結果を示す。各蛋白質の検出は、各蛋白質に対する抗体を用いたウエスタンブロッティングにより行った。図中の矢印は、各蛋白質を示す。図中の矢頭と数値は分子量を示す。コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞では、ソルビトール刺激またはＩＬ−１刺激をしないときには、ＭＫＫ４のリン酸化は検出されず、ソルビトール刺激またはＩＬ−１刺激により、ＭＫＫ４のリン酸化が検出された。一方、ＭＡＳＴ２０５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞では、ソルビトール刺激またはＩＬ−１刺激によっても、ＭＫＫ４のリン酸化は検出されなかった。（実施例７）
【配列表フリーテキスト】
【０３１０】
配列番号１：ＭＡＳＴ２０５。
配列番号１：（５１２）：（７８５）キナーゼドメイン。
配列番号１：（１１０５）：（１１８６）ＰＤＺドメイン。
配列番号２：ＭＡＳＴ２０５遺伝子の発現を阻害するために該遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたＲＮＡ。
配列番号３：配列番号２に記載の塩基配列を有し、その３´末端にｄＴｄＴを有する設計されたＲＮＡ／ＤＮＡ。
配列番号４：非特異的コントロール デュープレックスＶＩＩＩを構成するセンスＲＮＡ。
配列番号５：配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有し、その３´末端にｄＴｄＴを有する設計されたＲＮＡ／ＤＮＡ。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）の発現および／または機能を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害方法。
【請求項２】
ＭＡＳＴ２０５の機能が、下記の群から選択される１つ以上の機能である請求項１に記載の細胞の遊走阻害方法：
（１）ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１（ｄｙｎａｃｔｉｎ １）の結合、
（２）ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１（Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １）の結合、
（３）ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｉａｇｅ ｋｉｎａｓｅ ３）の結合、
（４）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）の結合、
（５）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ４）の結合、
（６）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ６）の結合、
（７）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ７）の結合、
（８）ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫ（ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）の結合、
および
（９）ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性。
【請求項３】
ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性が、ＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性である請求項２に記載の細胞の遊走阻害方法。
【請求項４】
細胞が癌細胞である請求項１に記載の細胞の遊走阻害方法。
【請求項５】
細胞が内皮細胞である請求項１に記載の細胞の遊走阻害方法。
【請求項６】
ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉によりＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する請求項１に記載の細胞の遊走阻害方法。
【請求項７】
ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉がＭＡＳＴ２０５に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを用いて行うＲＮＡ干渉である請求項６に記載の細胞の遊走阻害方法。
【請求項８】
ＭＡＳＴ２０５に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである請求項７に記載の細胞の遊走阻害方法。
【請求項９】
ＭＡＳＴ２０５に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである請求項７に記載の細胞の遊走阻害方法。
【請求項１０】
ＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）の発現および／または機能を阻害することを特徴とする細胞の遊走阻害剤。
【請求項１１】
ＭＡＳＴ２０５の機能が、下記の群から選択される１つ以上の機能である請求項１０に記載の細胞の遊走阻害剤：
（１）ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１（ｄｙｎａｃｔｉｎ １）の結合、
（２）ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１（Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １）の結合、
（３）ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｉａｇｅ ｋｉｎａｓｅ ３）の結合、
（４）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）の結合、
（５）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ４）の結合、
（６）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ６）の結合、
（７）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ７）の結合、
（８）ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫ（ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）の結合、
および
（９）ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性。
【請求項１２】
ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性が、ＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性である請求項１１に記載の細胞の遊走阻害剤。
【請求項１３】
細胞が癌細胞である請求項１０に記載の細胞の遊走阻害剤。
【請求項１４】
細胞が内皮細胞である請求項１０に記載の細胞の遊走阻害剤。
【請求項１５】
ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを有効成分として含む請求項１０に記載の細胞の遊走阻害剤。
【請求項１６】
ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである請求項１５に記載の細胞の遊走阻害剤。
【請求項１７】
ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである請求項１５に記載の細胞の遊走阻害剤。
【請求項１８】
請求項１から９のいずれか１項に記載の細胞の遊走阻害方法を用いることを特徴とする癌の転移抑制方法。
【請求項１９】
請求項１０から１７のいずれか１項に記載の細胞の遊走阻害剤を用いることを特徴とする癌の転移抑制方法。
【請求項２０】
請求項１０から１７のいずれか１項に記載の細胞の遊走阻害剤を含んでなる癌の転移抑制剤。
【請求項２１】
ＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）の発現および／または機能を阻害することを特徴とする血管新生の抑制方法。
【請求項２２】
ＭＡＳＴ２０５の機能が、下記の群から選択される１つ以上の機能である請求項２１に記載の血管新生の抑制方法：
（１）ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１（ｄｙｎａｃｔｉｎ １）の結合、
（２）ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１（Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １）の結合、
（３）ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｉａｇｅ ｋｉｎａｓｅ ３）の結合、
（４）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）の結合、
（５）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ４）の結合、
（６）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ６）の結合、
（７）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ７）の結合、
（８）ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫ（ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）の結合、
および
（９）ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性。
【請求項２３】
ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性が、ＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性である請求項２２に記載の血管新生の抑制方法。
【請求項２４】
ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉によりＭＡＳＴ２０５の発現および／または機能を阻害する請求項２１に記載の血管新生の抑制方法。
【請求項２５】
ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉がＭＡＳＴ２０５に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを用いて行うＲＮＡ干渉である請求項２４に記載の血管新生の抑制方法。
【請求項２６】
ＭＡＳＴ２０５に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである請求項２５に記載の血管新生の抑制方法。
【請求項２７】
ＭＡＳＴ２０５に対する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである請求項２５に記載の血管新生の抑制方法。
【請求項２８】
ＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）の発現および／または機能を阻害することを特徴とする血管新生の抑制剤。
【請求項２９】
ＭＡＳＴ２０５の機能が、下記の群から選択される１つ以上の機能である請求項２８に記載の血管新生の抑制剤：
（１）ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１（ｄｙｎａｃｔｉｎ １）の結合、
（２）ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１（Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １）の結合、
（３）ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｉａｇｅ ｋｉｎａｓｅ ３）の結合、
（４）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）の結合、
（５）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ４）の結合、
（６）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ６）の結合、
（７）ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ７）の結合、
（８）ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫ（ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）の結合、
および
（９）ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性。
【請求項３０】
ＭＡＳＴ２０５のセリンスレオニンキナーゼ活性が、ＤＣＴＮ１および／またはＴＩＡＭ１に対するセリンスレオニンキナーゼ活性である請求項２９に記載の血管新生の抑制剤。
【請求項３１】
ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドを有効成分として含む請求項２８に記載の血管新生の抑制剤。
【請求項３２】
ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと該塩基配列の相補的塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである請求項３１に記載の血管新生の抑制剤。
【請求項３３】
ＭＡＳＴ２０５に対するＲＮＡ干渉作用を有する短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとからなる短鎖二重鎖オリゴヌクレオチドである請求項３１に記載の血管新生の抑制剤。
【請求項３４】
細胞の遊走を抑制する活性を有する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）および／または下記の群から選択される１つ以上の蛋白質とある化合物（被検化合物）とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５と該蛋白質との結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５と該蛋白質との結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法：
（ｉ）ＤＣＴＮ１（ｄｙｎａｃｔｉｎ １）、
（ｉｉ）ＴＩＡＭ１（Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １）、
（ｉｉｉ）ＭＬＫ３（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｉａｇｅ ｋｉｎａｓｅ ３）、
（ｉｖ）ＭＫＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）、
（ｖ）ＭＫＫ４（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ４）、
（ｖｉ）ＭＫＫ６（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ６）、
（ｖｉｉ）ＭＫＫ７（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ７）、
および
（ｖｉｉｉ）ｐ３８ ＭＡＰＫ（ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）。
【請求項３５】
ＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）とＤＣＴＮ１（ｄｙｎａｃｔｉｎ １）の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＤＣＴＮ１とある化合物（被検化合物）とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とＤＣＴＮ１の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法。
【請求項３６】
ＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）とＴＩＡＭ１（Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １）の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＴＩＡＭ１とある化合物（被検化合物）とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とＴＩＡＭ１の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法。
【請求項３７】
ＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）とＭＬＫ３（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｉａｇｅ ｋｉｎａｓｅ ３）の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＭＬＫ３とある化合物（被検化合物）とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とＭＬＫ３の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法。
【請求項３８】
ＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）とＭＫＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＭＫＫ３とある化合物（被検化合物）とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ３の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法。
【請求項３９】
ＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）とＭＫＫ４（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ４）の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＭＫＫ４とある化合物（被検化合物）とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ４の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法。
【請求項４０】
ＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）とＭＫＫ６（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ６）の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＭＫＫ６とある化合物（被検化合物）とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ６の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法。
【請求項４１】
ＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）とＭＫＫ７（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ７）の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＭＫＫ７とある化合物（被検化合物）とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とＭＫＫ７の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法。
【請求項４２】
ＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）とｐ３８ ＭＡＰＫ（ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）の結合を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはｐ３８ ＭＡＰＫとある化合物（被検化合物）とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５とｐ３８ ＭＡＰＫの結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法。
【請求項４３】
細胞の遊走を抑制する活性を有する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）とある化合物（被検化合物）とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５のリン酸化活性を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５のリン酸化活性を阻害するか否かを決定することを含む同定方法。
【請求項４４】
ＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）によるＤＣＴＮ１（ｄｙｎａｃｔｉｎ １）のリン酸化を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＤＣＴＮ１とある化合物（被検化合物）とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５によるＤＣＴＮ１のリン酸化を阻害するか否かを決定することを含む同定方法。
【請求項４５】
ＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）によるＴＩＡＭ１（Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １）のリン酸化を阻害する化合物の同定方法であって、ＭＡＳＴ２０５および／またはＴＩＡＭ１とある化合物（被検化合物）とを接触させ、ＭＡＳＴ２０５によるＴＩＡＭ１のリン酸化を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在または不存在または変化を検出することにより、被検化合物がＭＡＳＴ２０５によるＴＩＡＭ１のリン酸化を阻害するか否かを決定することを含む同定方法。
【請求項４６】
下記Ａ群から選択される１つ以上の成分と、下記Ｂ群から選択される１つ以上の成分とを有してなる試薬キット：
ここで、Ａ群は、
（ａ）ＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）、
（ｂ）ＭＡＳＴ２０５をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）上記（ｂ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｄ）上記（ｃ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなり、
Ｂ群は、
（ｅ）ＤＣＴＮ１（ｄｙｎａｃｔｉｎ １）およびＴＩＡＭ１（Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １）から選ばれるいずれか１の蛋白質、
（ｆ）上記（ｅ）の蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｇ）上記（ｆ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｈ）上記（ｇ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなる。
【請求項４７】
下記Ａ群から選択される１つ以上の成分と、下記Ｂ群から選択される１つ以上の成分とを有してなる試薬キット：
ここで、Ａ群は、
（ａ）ＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）、
（ｂ）ＭＡＳＴ２０５をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）上記（ｂ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｄ）上記（ｃ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなり、
Ｂ群は、
（ｉ）ＭＬＫ３（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｉａｇｅ ｋｉｎａｓｅ ３）、ＭＫＫ３（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）、ＭＫＫ４（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ４）、ＭＫＫ６（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ６）およびｐ３８ ＭＡＰＫ（ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）から選ばれるいずれか１の蛋白質、
（ｊ）上記（ｉ）の蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｋ）上記（ｊ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｌ）上記（ｋ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなる。
【請求項４８】
下記Ａ群から選択される１つ以上の成分と、下記Ｂ群から選択される１つ以上の成分とを有してなる試薬キット：
ここで、Ａ群は、
（ａ）ＭＡＳＴ２０５（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｓｔｉｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２０５ｋＤａ）、
（ｂ）ＭＡＳＴ２０５をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）上記（ｂ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｄ）上記（ｃ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなり、
Ｂ群は、
（ｍ）ＭＬＫ３（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｉａｇｅ ｋｉｎａｓｅ ３）、ＭＫＫ４（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ４）、ＭＫＫ７（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ７）およびＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ）から選ばれるいずれか１の蛋白質、
（ｎ）上記（ｍ）の蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｏ）上記（ｎ）のポリヌクレオチドを含有する組み換えベクター、および
（ｐ）上記（ｏ）の組み換えベクターを含有する形質転換体、
からなる。

【図５】

【図６−Ａ】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図６−Ｂ】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【公開番号】特開２００８−３０８４０７（Ｐ２００８−３０８４０７Ａ）
【公開日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１７０２８４（Ｐ２００６−１７０２８４）
【出願日】平成１８年６月２０日（２００６．６．２０）
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【Ｆターム（参考）】