細胞集積方法
【課題】誘電泳動による目的細胞の分離とこれに引き続く細胞培養において移植作業を簡略化し、雑菌の混入を防止する細胞集積方法を実現することを課題とする。
【解決手段】細胞集積装置は、第一基板に配置された第一電極部１６と第二基板に配置された第二電極部１７を有する集積兼培養容器を含み、第一電極部１６は、複数の個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥の集合である。（イ）集積兼培養容器内１０１に生体親和性ビーズ２を送り、かつ、第一電極部１６と第二電極部１７に交流電圧を印加し、生体親和性ビーズ２を個別電極に付着するビーズ付着工程と（ロ）ビーズ付着工程の後に、集積兼培養容器内１０１に細胞懸濁液を送り、かつ、電源部から第一電極部と第二電極部に交流電圧を印加し、付着されたビーズに活性細胞４１を捕集する細胞捕集工程からなる。
【解決手段】細胞集積装置は、第一基板に配置された第一電極部１６と第二基板に配置された第二電極部１７を有する集積兼培養容器を含み、第一電極部１６は、複数の個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥の集合である。（イ）集積兼培養容器内１０１に生体親和性ビーズ２を送り、かつ、第一電極部１６と第二電極部１７に交流電圧を印加し、生体親和性ビーズ２を個別電極に付着するビーズ付着工程と（ロ）ビーズ付着工程の後に、集積兼培養容器内１０１に細胞懸濁液を送り、かつ、電源部から第一電極部と第二電極部に交流電圧を印加し、付着されたビーズに活性細胞４１を捕集する細胞捕集工程からなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は誘電泳動を用いる生体親和性ビーズへの細胞集積方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞の種類により誘電泳動特性が異なるので、誘電泳動を用いて複数種の細胞が混在した細胞懸濁液中の目的細胞を分離する技術が知られている。
【０００３】
例えば、分離用容器内に配置した交互くし型形状の一対の電極に特定周波数の交流電圧を印加し、対向する電極間に不均一交流電場を作る。この不均一交流電場に置かれた細胞懸濁液中の目的細胞は、誘電泳動により一方の電極に引き寄せられて目的細胞の分離が実現される（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２６３８４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記細胞の分離技術を再生医療、とりわけＤｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍに利用するには、分離した細胞を継代培養し当該細胞を多数得る必要がある。
【０００６】
従来の技術においては、誘電泳動操作を行った後に分離用容器内の電極面に捕集した細胞を分離用容器から取出し、細胞を試験管やシャーレ等の培養容器に移植し、継代培養を行う。
【０００７】
しかし、この移植作業時に雑菌が混入し、細胞培養の効率を下げるという問題点があった。
【０００８】
そこで本発明は、目的細胞の分離とこれに引き続く細胞培養において移植作業を簡略化し、雑菌の混入を防止する細胞集積方法を実現することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を解決するため、本発明にかかる細胞集積方法は、
細胞集積装置と誘電泳動可能な生体親和性ビーズを用いる、以下のイとロの工程からなる細胞集積方法であって、
前記細胞集積装置は、
第一基板、第一基板に対向して配置された第二基板と側壁に囲まれ、流入口と流出口を持つ集積兼培養容器、
第一基板に配置された第一電極部と第二基板に配置された第二電極部、
第一電極部は複数の個別電極から構成されていて、前記複数の個別電極は集積兼培養容器の内部に露出しているものであり、
第一電極部と第二電極部間に交流電圧を印加する電源部からなり、
イ 前記流入口から前記集積兼培養容器内に生体親和性ビーズを送り、かつ、前記電源部から第一電極部と第二電極部に交流電圧を印加し、前記ビーズを個別電極に付着するビーズ付着工程
ロ ビーズ付着工程の後に、前記流入口から前記集積兼培養容器内に捕集対象細胞を含む細胞懸濁液を送り、かつ、前記電源部から第一電極部と第二電極部に交流電圧を印加し、前記付着されたビーズに前記捕集対象細胞を捕集する細胞捕集工程
である。
【００１０】
本発明において、細胞捕集工程（ロの工程）で用いる細胞懸濁液は捕集対象細胞を含んでいればよい。細胞懸濁液を例示すれば、
(1) 捕集対象細胞、１種以上のその他細胞と緩衝液の混合物、
(2) 捕集対象細胞と緩衝液の混合物
などを挙げることができる。
【００１１】
本発明は捕集対象細胞をビーズに捕集するものであるから、本発明の細胞捕集工程（ロの工程）は、例えば、
(1)２種以上の細胞から捕集対象細胞を分離、
(2)希薄な懸濁液から捕集対象細胞を濃縮
(3)不純物を含む懸濁液中の捕集対象細胞の純化
などを意図して行われる。
【００１２】
本発明の好ましい実施態様にあって、前記生体親和性ビーズは、コラーゲンとアルギン酸塩からなるビーズであってもよい。
【００１３】
本発明の他の好ましい実施態様にあっては、
第一電極部は、第一基板の表面に平坦な表面形状を有する電極部材を形成し、前記電極部材の表面に絶縁性の材料からなる絶縁層を形成し、前記絶縁層を部分的に円形に除去して形成された前記個別電極を有するものであってもよい。
【００１４】
本発明のその他の好ましい実施態様にあって、
第一電極部は、第一基板の表面に前記電極部材である導電膜を形成し、前記導電膜の上に前記絶縁層を形成し、レーザー光線を照射して個別電極部分の前記絶縁層を除去するレーザーエッチング法により形成された前記個別電極を有するものであってもよい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明にかかる細胞集積方法は、その他の特徴とともに、集積兼培養容器内の個別電極上に生体親和性ビーズを付着し当該ビーズ上に細胞を捕集するものであり、ビーズは細胞培養にあたって培養の足場となる。このため、本細胞集積方法によれば、捕集した細胞の移植作業が不必要となり、細胞捕集工程が終了した集積兼培養容器内で細胞の培養ができるので、移植作業時の雑菌の混入が防止される。
【００１６】
また、当該ビーズの付着は誘電泳動により行われ、従来の誘電泳動を用いる細胞分離装置の構成要素である電源部は、大きな変更なく本発明に使用する細胞集積装置の電源部として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は本発明にかかる細胞集積方法の説明図であり、図１（ａ）はビーズ付着工程途中、図１（ｂ）はビーズ付着工程終了後、図１（ｃ）は細胞捕集工程途中、図１（ｄ）は細胞捕集工程終了後を図示している。また、図１（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ集積兼培養容器の断面を示している。
【図２】図２は細胞集積装置１の斜視図であり、第二基板１２の一部を切り欠いて、第一電極部１６を図示している。
【図３】図３は、集積兼培養容器１０から第二基板１２を取り除き、第二基板側から第一基板側を視認した平面図である。
【図４】図４は、図３中に矢印Ａと矢印Ｂで示した平面で切断した、集積兼培養容器１０の断面図である。
【図５】図５はコラーゲンビーズ作成に用いる器具の説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、図面を参照して本発明の実施例にかかる細胞集積方法をさらに説明する。本明細書において参照する各図は、本発明の理解を容易にするため、一部の構成要素を誇張して表すなど模式的に表しているものがある。このため、構成要素間の寸法や比率などは実物と異なっている場合がある。また、本発明の実施例に記載した部材や部分の寸法、材質、形状、その相対位置などは、とくに特定的な記載のない限りは、この発明の範囲をそれらのみに限定する趣旨のものではなく、単なる説明例にすぎない。
【００１９】
本発明にかかる細胞集積方法は細胞集積装置１を使用する。図２を参照して、細胞集積装置１は、集積兼培養容器１０と電源部３０からなる。集積兼培養容器１０は、平板状の第一基板１１と平板状の第二基板１２を平板面が対向するように配置し、第一基板１１と第二基板１２の間に側壁部材１３を配置している。
【００２０】
集積兼培養容器１０から第二基板１２を取り除き、第二基板側から第一基板側を視認した平面図である図３と、図３中に矢印Ａと矢印Ｂで示した平面で切断した集積兼培養容器１０の断面図である図４を合せて参照して、側壁部材１３は窓部を設けた額縁状の板状部材である。当該窓部が集積兼培養容器１０の容器内部１０１となっている。換言すれば、容器内部１０は第一基板１１、第二基板１２と側壁部材１３の窓部側壁に囲まれた空間である。
【００２１】
第二基板１２は容器内部１０１に通じる２つの貫通穴を有する。一方の穴が流入口１４であり、他方の穴が流出口１５である。流入口１４から容器内部１０１に入った液体は流出口１５から排出される。図３中には容器内部１０１にあって、流入口１４に対面する流入口対面部１４１と流出口１５に対面する流出口対面部１５１を図示している。
【００２２】
流入口１４には必要に応じて第一開閉弁、チューブとポンプ等の送液手段（これらは図示していない）が接続される。流出口１５には必要に応じて第二開閉弁、チューブ等（これらは図示していない）が接続される。後述するように、集積兼培養容器１０は細胞培養の容器として使用するものだから、第一開閉弁よりも上流側に接続するチューブとポンプ及び第二開閉弁よりも下流側に接続するチューブは着脱可能とすることが好ましい。
【００２３】
流入口１４と流出口１５は第一基板に取付けてもよい。また、流入口１４と流出口１５のいずれかを第一基板に取付け、他方を第二基板に取付けてもよい。
【００２４】
第一基板１１の上面（容器内部１０１に接する面）に第一電極部１６が配置されている。第一電極部１６は複数の個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥からなる。複数の個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥は互いに等間隔に配置されている。本実施例においては、複数の個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥は円形であり、格子の間隔５５０μｍの正方格子の各格子点に各々の個別電極の中心を一致して配置されている。図２では第二基板１２を一部切り欠いて第一電極部１６を図示している。
【００２５】
個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥の平面形状は、特に制限は無いが、円形であることが好ましい。個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥が円形であると、交流電圧付加時に個別電極上に現れるそれぞれの電気力線の密度が一定となるので、個別電極上に付着した生体親和性ビーズ上の電気力線の密度も一定となる。従って、細胞懸濁液を流入させたとき、細胞懸濁液に含まれる捕集対象細胞はビーズの特定箇所に偏ることなく、その表面上に均一に捕集される。その結果、捕集されたいずれの捕集対象細胞も生体親和性ビーズを足場として成長することができる。
【００２６】
個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥は、必ずしも互いに等間隔に配置されていなくてもよい。個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥が不等間隔に配置されていても、誘電泳動によって個別電極に生体親和性ビーズを付着可能であり、また、誘電泳動によって当該付着したビーズに捕集対象細胞を捕集可能である。もっとも個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥を互いに等間隔に配置すれば、例えば、細胞培養時に個別ビーズ上に在る細胞が、個別ビーズ毎に相違することなく、周囲に存在する栄養成分を均等に代謝可能である等の理由から好ましい。
【００２７】
第一電極部１６は第一基板１１の表面に導電膜を形成し、当該導電膜の非個別電極領域を絶縁層１８で被膜して形成されている。当該導電膜は第一基板の容器内部領域から食み出す領域まで延長して形成されている。食み出した領域は第一電極部１６と導通する端子部１６１である。
【００２８】
第一電極部１６は、フォトリソグラフィーやレーザーエッチング法を用いて形成することが好ましい。
【００２９】
フォトリソグラフィーを用いて第一電極部１６を形成するには、ガラスなどの第一基板材料である板材の一方表面に導電膜であるＦＴＯ（フッ素ドープ酸化スズ）膜を形成する。次にＦＴＯ膜の上に絶縁層である光レジスト膜を塗布する。そして光レジスト膜を個別電極のパターンに露光し、個別電極部分の光レジスト膜を除去する。フォトリソグラフィーを用いると解像度高く第一電極部１６を形成できる。従って、第一電極部１６上に後述の生体親和性ビーズを高い位置精度で捕捉できる。
【００３０】
レーザーエッチング法を用いて第一電極部１６を形成するには、上記方法と同様に、第一基板材料である板材の一方表面にＦＴＯ（フッ素ドープ酸化スズ）膜を形成し、その上に絶縁層を塗布する。次に絶縁層を個別電極のパターンにレーザー光で照射し、個別電極部分の絶縁層を除去する。レーザーエッチングに使用するレーザーは、ニ酸化炭素、ＹＡＧ、ルビー、あるいはＹＶＯ４などを用いるとよい。
【００３１】
レーザーエッチング法を用いると絶縁層に用いる材料を任意に選択できる。例えば、必要に応じて防水機能を有する材料を用いて絶縁層を形成することができる。絶縁層に防水性の材料を用いると、ＦＴＯ膜などの導電膜から絶縁層が剥離することを抑制することができる。その結果、第一電極部の寿命を延長することができる。また、レーザーエッチング法を用いると、上記フォトリソグラフィーなどと比較して、少ない工程数で第一電極部を形成できることから経済的にも有利である。
【００３２】
第二基板１２の下面（容器内部１０１に接する面）に第二電極部１７が配置されている。第二電極部は第二基板１２が容器内部を画する面の全面に形成されている。第二電極部１７は第二基板１２の表面に形成された導電膜である。当該導電膜は第二基板の容器内部領域から食み出す領域まで延長して形成されている。食み出した領域は第二電極部１７と導通する端子部１７１である。
【００３３】
第一基板１１と第二基板１２はガラス、アクリル樹脂等任意の材料で作ればよい。
【００３４】
第一電極部１６と第二電極部１７は透明導電膜（ＦＴＯ、ＩＴＯ（スズドープ酸化インジウム）、酸化スズ等）や蒸着金属膜等任意の材料で作ればよい。集積兼培養容器１０は細胞培養容器として使用されることを考慮すれば、容器内の視覚観察の容易性、容器の洗浄、除菌容易性等から、第二基板１２はガラス製、第二電極部１７は透明導電膜製とすることが好ましい。
【００３５】
側壁部材１３は例えばシリコンを材料とすればよい。
【００３６】
細胞集積装置１の電源部３０は、第一電極部１６と第二電極部１７に交流電圧を印加するものである。電源部３０は交流周波数が可変であり、電圧も可変である。電源部３０の出力リード線は端子部１６１と端子部１７１に接続される。集積兼培養容器１０は細胞培養の容器として使用するものだから、電源部３０の出力リード線と端子部１６１、端子部１７１の接続は、例えばクリップやプラグ等を用いて接続することにより、着脱可能とすることが好ましい。
【００３７】
次に、生体親和性ビーズであるコラーゲンビーズの作成方法を説明する。ＴｙｐｅＩコラーゲン粉末を１０ｍｇ／ｍｌとアルギン酸ナトリウム２％を含むコラーゲン／アルギン酸塩混合水溶液を作成する。またゲル化溶液として１０２ｍＭ ＣａＣｌ２水溶液を作成する。
【００３８】
図５はコラーゲンビーズ作成に用いる器具の説明図である。ビーズ作成容器２０中に上記のゲル化溶液２３を貯留する。図示しないシリンジポンプを用いて上記の混合水溶液を材料押出しノズル２１から押し出す。この時、気体ノズル２２から気体を材料押出しノズル２１に向かって吹き付け、混合水溶液滴の等量化を図っている。気体ノズルから吹き付ける気体は不活性ガスが好ましく、本実施例では窒素ガスを使用した。こうして、粒子径が略一定のコラーゲンビーズを作成した。
【００３９】
コラーゲンのみからなるビーズは誘電泳動現象を生じないが、アルギン酸塩を添加したコラーゲンビーズは誘電泳動現象を示す。そして、コラーゲンビーズは、生体親和性ビーズであり、細胞培養の足場となる。コラーゲンビーズは動物由来細胞の培養に好適である。
【００４０】
他の生体親和性ビーズとしては、アガロースビーズ、アルギン酸ビーズなどが考えられる。アルギン酸ビーズは植物由来細胞の培養に好適である。
【００４１】
図１を参照しつつ本発明にかかる細胞集積方法を説明する。細胞集積方法はビーズ付着工程とその後に行われる細胞捕集工程からなる。図１（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ集積兼培養容器の断面を示しており、（ａ）はビーズ付着工程途中、（ｂ）はビーズ付着工程終了後、（ｃ）は細胞捕集工程途中、（ｄ）は細胞捕集工程終了後の説明図である。
【００４２】
ビーズ付着工程は流入口１４からコラーゲンビーズ２懸濁液を集積兼培養容器１０の容器内部１０１内へ流入させつつ、電源部３０から第一電極部１６と第二電極部１７に交流電圧を印加して行う。図１（ａ）を参照して矢印５１はコラーゲンビーズ懸濁液の流れの方向を示している。
【００４３】
第一電極部１６は微細な面状である個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥からなっていて、第二電極部１７は容器内部の天面の全面に広がった面状であるから、容器内部１０１に、不均一交流電場が生じる。そして、コラーゲンビーズ２中にはアルギン酸塩が添加されているのでコラーゲンビーズ２は誘電泳動し、第一電極部に引き寄せられる。
【００４４】
図１（ｂ）を参照して、ビーズ付着工程後は個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥の各々にコラーゲンビーズ２が１個ずつ付着している。後の細胞培養において、コラーゲンビーズは細胞培養の足場となるものである。ビーズ付着工程におけるビーズ懸濁液の流量、印加交流の周波数と電圧、ビーズの粒子径、個別電極の相互間隔等を調整して個別電極とコラーゲンビーズが１対１に付着することが好ましい。細胞培養時に単一の集積兼培養容器１０内での培養状況が均一化するからである。例えば、個別電極の直径よりも大きい直径を有するビーズを用いると個別電極１ヶ所にビーズ１個が付着するに適していると考えられる。
【００４５】
細胞捕集工程は、コラーゲンビーズ付着工程終了後の集積兼培養容器の容器内部１０１内へ流入口１４から細胞懸濁液を流入させつつ、電源部３０から第一電極部１６と第二電極部１７に交流電圧を印加して行う。ここでは、例示の題材として、細胞懸濁液中に活性細胞４１と死活細胞模擬体４２が混在していて、活性細胞４１が捕集対象細胞であるという分離モデルを例にとって説明する。
【００４６】
図１（ｃ）を参照して矢印５２は細胞懸濁液の流れの方向を示している。活性細胞４１と死活細胞模擬体４２は誘電泳動の挙動が異なり、適切な周波数と電圧を選択すれば活性細胞４１はコラーゲンビーズ２上に捕集され、死活細胞模擬体４２は細胞懸濁液の流れに乗って流出口１５から排出される。図中の波線４３は排出液を表している。
【００４７】
図１（ｄ）を参照して細胞捕集工程の終了後に、集積兼培養容器１０の容器内部１０１では、個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥上にコラーゲンビーズ２が付着し、当該コラーゲンビーズ２上に活性細胞４１が捕集されている。図１（ｄ）の図示では単一のコラーゲンビーズ２上に単一又は２個の活性細胞４１が捕集されているが、これは、発明の説明の容易化の目的で簡略化して図示したものである。実際に実験を行うと単一のコラーゲンビーズ２上に複数の活性細胞４１が捕集された。
【００４８】
以上は分離モデルにおける細胞捕集工程を説明した。本発明にかかる細胞捕集工程は捕集対象細胞を濃縮するものであってもかまわない。続いて、例示の題材として、細胞懸濁液中に活性細胞４１のみが存在している濃縮モデルを例にとってその細胞捕集工程を説明する。
【００４９】
細胞捕集工程は、コラーゲンビーズ付着工程終了後の集積兼培養容器の容器内部１０１内へ流入口１４から細胞懸濁液を流入させつつ、電源部３０から第一電極部１６と第二電極部１７に交流電圧を印加して行う。適切な周波数と電圧を選択すれば、活性細胞４１はコラーゲンビーズ２上に捕集される。
【００５０】
以上説明した細胞捕集工程の終了後、集積兼培養容器１０の容器内部１０１を培養液で置換して集積兼培養容器内で培養を行う。
【００５１】
細胞が増殖するとコラーゲンビーズの表面全体を増殖細胞が覆う状態になる。さらに培養を継続すれば、コラーゲンビーズが細胞に吸収されて、増殖細胞が球形の塊になることが期待される。
【００５２】
本発明にかかる細胞集積方法を実施し、その後に培養を行えば、従来の分離と培養に必要であった、試験管やシャーレなど培養容器の滅菌作業が不要となる。
【実施例１】
【００５３】
−−分離モデル−−
集積兼培養容器は、シリコンガスケットを側壁部材として用い、ＩＴＯ薄膜付ガラスを上下に配置し、当該ガラスを圧接して作成した。第一電極部は、厚膜レジスト剤ＳＵ−８を使用しフォトリソグラフィーで作成した。
【００５４】
シリコンガスケットの厚さは５００μｍ、容器内部の寸法は縦１５ｍｍ、横１５ｍｍであって、内部容量は１１２．５ｍｍ３であった。個別電極は格子間距離５５０μｍの正方格子の各格子点に配置し、円形で、電極の直径は５０μｍと１００μｍの２種を作成した。
【００５５】
コラーゲンビーズは上述したコラーゲンとアルギン酸塩との混合物であり、上述した方法で作成した。コラーゲンビーズの直径は７０〜１２０μｍの間に分布し、中央値は概略１００μｍであった。
【００５６】
細胞は、活性細胞として生後１〜２ヶ月の仔ウシの膝関節の軟骨細胞を、死活細胞模擬体としてプラスチック製の微粒子（製品名：Polybead Polystyrene Microspheres(2.5% Solids-Latex),10μm 会社名：Polysciences, Inc.）を用いた。プラスチック製の微粒子の直径は概略１０μｍであった
コラーゲンビーズ懸濁液と細胞懸濁液の溶媒は細胞等張液である低導電性の生理緩衝液を使用した。コラーゲンビーズ懸濁液の濃度は密度０．５〜１．０×１０５個／ｍｌに調製した。細胞懸濁液は活性細胞の細胞密度を２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、死活細胞模擬体の細胞密度を２．５〜５．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう調製した。
【００５７】
コラーゲンビーズの付着状態は、Ｃｏｌｌａｒｇｅｎ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（コスモ・バイオ（株）製）を用いてコラーゲンビーズを赤色に染色し、顕微鏡で観察した。
【００５８】
細胞捕集工程終了後、シリコンラバーヒータを用いて集積兼培養容器を２７℃に保持し、コラーゲンビーズに軟骨細胞を定着させた。その後容器内部に培養液（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２０％ＦＢＳ、Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ）を満たし、１週間培養した。培養環境は３７℃、５％ＣＯ２、湿度１００％とした。
【００５９】
細胞捕集工程終了後の細胞捕集状況と培養終了後の細胞は顕微鏡を用いて観察した。
【００６０】
＜ビーズ付着工程＞
印加電圧は、正弦波である交流電圧のピーク間の電圧、すなわち、すなわち振幅×２を２５Ｖとした。（以下印加電圧を「○○Ｖｐ−ｐ」と表示する、○○にはピーク間の電圧を表す数値が入る）
【００６１】
印加周波数５００ｋＨｚでコラーゲンビーズ懸濁液０．２５ｍｌ／ｍｉｎ、０．５ｍｌ／ｍｉｎ、１．０ｍｌ／ｍｉｎで実験を行った。流量が０．５ｍｌ／ｍｉｎ、１．０ｍｌ／ｍｉｎのとき個別電極にのみビーズが付着した。流量が０．２５ｍｌ／ｍｉｎのとき個別電極のみならず絶縁層領域にもビーズが沈殿して付着した。
【００６２】
個別電極の直径を５０μｍとした集積兼培養容器を用いビーズ懸濁液流量１．０ｍｌ／ｍｉｎの時に個別電極に１個ずつのビーズが付着した。一方個別電極の直径を１００μｍとすると個別電極１ヶ所当たり複数のビーズが付着した。これにより、個別電極の直径よりも大きい直径を有するビーズを用いると個別電極１ヶ所にビーズ１個が付着するに適していると考えられる。
【００６３】
さらに、印加周波数を１ＭＨzにして実験を行った。印加周波数については５００ｋＨｚと１ＭＨzでビーズ付着状況に大きな変化は認められなかった。
【００６４】
＜細胞捕集工程＞
印加電圧２０Ｖｐ−ｐ、印加周波数を５００ｋＨｚと１ＭＨｚ、細胞懸濁液の流量０．１０ｍｌ／ｍｉｎ、０．２５ｍｌ／ｍｉｎ、０．５０ｍｌ／ｍｉｎ、１．０ｍｌ／ｍｉｎで実験を行った。
【００６５】
流量が０．２５ｍｌ／ｍｉｎのときビーズに集積する細胞の数が最大であった。一方流量が１．０ｍｌ／ｍｉｎでは細胞がビーズに集積せず流出した。印加周波数については５００ｋＨｚと１ＭＨｚで細胞捕集状況に大きな変化は認められなかった。
【００６６】
＜細胞培養＞
細胞捕集工程終了後にコラーゲンビーズの表面に分散して付着していた軟骨細胞が、培養後はコラーゲンビーズに定着し、集積していた。
【実施例２】
【００６７】
−−濃縮モデル−−
実施例２で使用した集積兼培養容器は実施例１と同一である。細胞は生後１〜２ヶ月の仔ウシの膝関節の軟骨細胞を用いた。細胞懸濁液の溶媒は細胞等張液である低導電性の生理緩衝液を使用した。細胞懸濁液は細胞密度２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。実施例１と異なり、細胞懸濁液に死活細胞模擬体を含んでいない。
【００６８】
＜ビーズ付着工程＞
ビーズ付着工程は実施例１と同一であり、説明を省略する。
【００６９】
＜細胞捕集工程＞
印加電圧２０Ｖｐ−ｐ、印加周波数を５００ｋＨｚと１ＭＨｚ、細胞懸濁液の流量０．１０ｍｌ／ｍｉｎ、０．２５ｍｌ／ｍｉｎ、０．５０ｍｌ／ｍｉｎ、１．０ｍｌ／ｍｉｎで実験を行った。
【００７０】
流量が０．２５ｍｌ／ｍｉｎのときビーズに集積する細胞の数が最大であった。一方流量が１．０ｍｌ／ｍｉｎでは細胞がビーズに集積せず流出した。印加周波数については５００ｋＨｚと１ＭＨｚで細胞捕集状況に大きな変化は認められなかった。
【００７１】
＜細胞培養＞
細胞捕集工程終了後にコラーゲンビーズの表面に分散して付着していた軟骨細胞が、培養後はコラーゲンビーズに定着し、集積していた。培養条件は実施例１と同一とした。
【符号の説明】
【００７２】
１ 細胞集積装置
２ 生体親和性ビーズであるコラーゲンビーズ
１０ 集積兼培養容器
１１ 第一基板
１２ 第二基板
１３ 側壁部材
１４ 流入口
１５ 流出口
１６ 第一電極部
１６ａ、１６ｂ、１６ｃ 個別電極
１７ 第二電極部
１８ 絶縁体である光レジスト膜
２０ ビーズ作成容器
２１ 材料押出しノズル
２２ 気体ノズル
２３ ゲル化溶液
３０ 電源部
４０ 細胞懸濁液
４１ 活性細胞
４２ 死活細胞模擬体
４３ 流出液
１０１ 容器内部
１６１ 端子部
１７１ 端子部
【技術分野】
【０００１】
本発明は誘電泳動を用いる生体親和性ビーズへの細胞集積方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞の種類により誘電泳動特性が異なるので、誘電泳動を用いて複数種の細胞が混在した細胞懸濁液中の目的細胞を分離する技術が知られている。
【０００３】
例えば、分離用容器内に配置した交互くし型形状の一対の電極に特定周波数の交流電圧を印加し、対向する電極間に不均一交流電場を作る。この不均一交流電場に置かれた細胞懸濁液中の目的細胞は、誘電泳動により一方の電極に引き寄せられて目的細胞の分離が実現される（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２６３８４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記細胞の分離技術を再生医療、とりわけＤｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍに利用するには、分離した細胞を継代培養し当該細胞を多数得る必要がある。
【０００６】
従来の技術においては、誘電泳動操作を行った後に分離用容器内の電極面に捕集した細胞を分離用容器から取出し、細胞を試験管やシャーレ等の培養容器に移植し、継代培養を行う。
【０００７】
しかし、この移植作業時に雑菌が混入し、細胞培養の効率を下げるという問題点があった。
【０００８】
そこで本発明は、目的細胞の分離とこれに引き続く細胞培養において移植作業を簡略化し、雑菌の混入を防止する細胞集積方法を実現することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を解決するため、本発明にかかる細胞集積方法は、
細胞集積装置と誘電泳動可能な生体親和性ビーズを用いる、以下のイとロの工程からなる細胞集積方法であって、
前記細胞集積装置は、
第一基板、第一基板に対向して配置された第二基板と側壁に囲まれ、流入口と流出口を持つ集積兼培養容器、
第一基板に配置された第一電極部と第二基板に配置された第二電極部、
第一電極部は複数の個別電極から構成されていて、前記複数の個別電極は集積兼培養容器の内部に露出しているものであり、
第一電極部と第二電極部間に交流電圧を印加する電源部からなり、
イ 前記流入口から前記集積兼培養容器内に生体親和性ビーズを送り、かつ、前記電源部から第一電極部と第二電極部に交流電圧を印加し、前記ビーズを個別電極に付着するビーズ付着工程
ロ ビーズ付着工程の後に、前記流入口から前記集積兼培養容器内に捕集対象細胞を含む細胞懸濁液を送り、かつ、前記電源部から第一電極部と第二電極部に交流電圧を印加し、前記付着されたビーズに前記捕集対象細胞を捕集する細胞捕集工程
である。
【００１０】
本発明において、細胞捕集工程（ロの工程）で用いる細胞懸濁液は捕集対象細胞を含んでいればよい。細胞懸濁液を例示すれば、
(1) 捕集対象細胞、１種以上のその他細胞と緩衝液の混合物、
(2) 捕集対象細胞と緩衝液の混合物
などを挙げることができる。
【００１１】
本発明は捕集対象細胞をビーズに捕集するものであるから、本発明の細胞捕集工程（ロの工程）は、例えば、
(1)２種以上の細胞から捕集対象細胞を分離、
(2)希薄な懸濁液から捕集対象細胞を濃縮
(3)不純物を含む懸濁液中の捕集対象細胞の純化
などを意図して行われる。
【００１２】
本発明の好ましい実施態様にあって、前記生体親和性ビーズは、コラーゲンとアルギン酸塩からなるビーズであってもよい。
【００１３】
本発明の他の好ましい実施態様にあっては、
第一電極部は、第一基板の表面に平坦な表面形状を有する電極部材を形成し、前記電極部材の表面に絶縁性の材料からなる絶縁層を形成し、前記絶縁層を部分的に円形に除去して形成された前記個別電極を有するものであってもよい。
【００１４】
本発明のその他の好ましい実施態様にあって、
第一電極部は、第一基板の表面に前記電極部材である導電膜を形成し、前記導電膜の上に前記絶縁層を形成し、レーザー光線を照射して個別電極部分の前記絶縁層を除去するレーザーエッチング法により形成された前記個別電極を有するものであってもよい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明にかかる細胞集積方法は、その他の特徴とともに、集積兼培養容器内の個別電極上に生体親和性ビーズを付着し当該ビーズ上に細胞を捕集するものであり、ビーズは細胞培養にあたって培養の足場となる。このため、本細胞集積方法によれば、捕集した細胞の移植作業が不必要となり、細胞捕集工程が終了した集積兼培養容器内で細胞の培養ができるので、移植作業時の雑菌の混入が防止される。
【００１６】
また、当該ビーズの付着は誘電泳動により行われ、従来の誘電泳動を用いる細胞分離装置の構成要素である電源部は、大きな変更なく本発明に使用する細胞集積装置の電源部として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は本発明にかかる細胞集積方法の説明図であり、図１（ａ）はビーズ付着工程途中、図１（ｂ）はビーズ付着工程終了後、図１（ｃ）は細胞捕集工程途中、図１（ｄ）は細胞捕集工程終了後を図示している。また、図１（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ集積兼培養容器の断面を示している。
【図２】図２は細胞集積装置１の斜視図であり、第二基板１２の一部を切り欠いて、第一電極部１６を図示している。
【図３】図３は、集積兼培養容器１０から第二基板１２を取り除き、第二基板側から第一基板側を視認した平面図である。
【図４】図４は、図３中に矢印Ａと矢印Ｂで示した平面で切断した、集積兼培養容器１０の断面図である。
【図５】図５はコラーゲンビーズ作成に用いる器具の説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、図面を参照して本発明の実施例にかかる細胞集積方法をさらに説明する。本明細書において参照する各図は、本発明の理解を容易にするため、一部の構成要素を誇張して表すなど模式的に表しているものがある。このため、構成要素間の寸法や比率などは実物と異なっている場合がある。また、本発明の実施例に記載した部材や部分の寸法、材質、形状、その相対位置などは、とくに特定的な記載のない限りは、この発明の範囲をそれらのみに限定する趣旨のものではなく、単なる説明例にすぎない。
【００１９】
本発明にかかる細胞集積方法は細胞集積装置１を使用する。図２を参照して、細胞集積装置１は、集積兼培養容器１０と電源部３０からなる。集積兼培養容器１０は、平板状の第一基板１１と平板状の第二基板１２を平板面が対向するように配置し、第一基板１１と第二基板１２の間に側壁部材１３を配置している。
【００２０】
集積兼培養容器１０から第二基板１２を取り除き、第二基板側から第一基板側を視認した平面図である図３と、図３中に矢印Ａと矢印Ｂで示した平面で切断した集積兼培養容器１０の断面図である図４を合せて参照して、側壁部材１３は窓部を設けた額縁状の板状部材である。当該窓部が集積兼培養容器１０の容器内部１０１となっている。換言すれば、容器内部１０は第一基板１１、第二基板１２と側壁部材１３の窓部側壁に囲まれた空間である。
【００２１】
第二基板１２は容器内部１０１に通じる２つの貫通穴を有する。一方の穴が流入口１４であり、他方の穴が流出口１５である。流入口１４から容器内部１０１に入った液体は流出口１５から排出される。図３中には容器内部１０１にあって、流入口１４に対面する流入口対面部１４１と流出口１５に対面する流出口対面部１５１を図示している。
【００２２】
流入口１４には必要に応じて第一開閉弁、チューブとポンプ等の送液手段（これらは図示していない）が接続される。流出口１５には必要に応じて第二開閉弁、チューブ等（これらは図示していない）が接続される。後述するように、集積兼培養容器１０は細胞培養の容器として使用するものだから、第一開閉弁よりも上流側に接続するチューブとポンプ及び第二開閉弁よりも下流側に接続するチューブは着脱可能とすることが好ましい。
【００２３】
流入口１４と流出口１５は第一基板に取付けてもよい。また、流入口１４と流出口１５のいずれかを第一基板に取付け、他方を第二基板に取付けてもよい。
【００２４】
第一基板１１の上面（容器内部１０１に接する面）に第一電極部１６が配置されている。第一電極部１６は複数の個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥からなる。複数の個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥は互いに等間隔に配置されている。本実施例においては、複数の個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥は円形であり、格子の間隔５５０μｍの正方格子の各格子点に各々の個別電極の中心を一致して配置されている。図２では第二基板１２を一部切り欠いて第一電極部１６を図示している。
【００２５】
個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥の平面形状は、特に制限は無いが、円形であることが好ましい。個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥が円形であると、交流電圧付加時に個別電極上に現れるそれぞれの電気力線の密度が一定となるので、個別電極上に付着した生体親和性ビーズ上の電気力線の密度も一定となる。従って、細胞懸濁液を流入させたとき、細胞懸濁液に含まれる捕集対象細胞はビーズの特定箇所に偏ることなく、その表面上に均一に捕集される。その結果、捕集されたいずれの捕集対象細胞も生体親和性ビーズを足場として成長することができる。
【００２６】
個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥は、必ずしも互いに等間隔に配置されていなくてもよい。個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥が不等間隔に配置されていても、誘電泳動によって個別電極に生体親和性ビーズを付着可能であり、また、誘電泳動によって当該付着したビーズに捕集対象細胞を捕集可能である。もっとも個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥を互いに等間隔に配置すれば、例えば、細胞培養時に個別ビーズ上に在る細胞が、個別ビーズ毎に相違することなく、周囲に存在する栄養成分を均等に代謝可能である等の理由から好ましい。
【００２７】
第一電極部１６は第一基板１１の表面に導電膜を形成し、当該導電膜の非個別電極領域を絶縁層１８で被膜して形成されている。当該導電膜は第一基板の容器内部領域から食み出す領域まで延長して形成されている。食み出した領域は第一電極部１６と導通する端子部１６１である。
【００２８】
第一電極部１６は、フォトリソグラフィーやレーザーエッチング法を用いて形成することが好ましい。
【００２９】
フォトリソグラフィーを用いて第一電極部１６を形成するには、ガラスなどの第一基板材料である板材の一方表面に導電膜であるＦＴＯ（フッ素ドープ酸化スズ）膜を形成する。次にＦＴＯ膜の上に絶縁層である光レジスト膜を塗布する。そして光レジスト膜を個別電極のパターンに露光し、個別電極部分の光レジスト膜を除去する。フォトリソグラフィーを用いると解像度高く第一電極部１６を形成できる。従って、第一電極部１６上に後述の生体親和性ビーズを高い位置精度で捕捉できる。
【００３０】
レーザーエッチング法を用いて第一電極部１６を形成するには、上記方法と同様に、第一基板材料である板材の一方表面にＦＴＯ（フッ素ドープ酸化スズ）膜を形成し、その上に絶縁層を塗布する。次に絶縁層を個別電極のパターンにレーザー光で照射し、個別電極部分の絶縁層を除去する。レーザーエッチングに使用するレーザーは、ニ酸化炭素、ＹＡＧ、ルビー、あるいはＹＶＯ４などを用いるとよい。
【００３１】
レーザーエッチング法を用いると絶縁層に用いる材料を任意に選択できる。例えば、必要に応じて防水機能を有する材料を用いて絶縁層を形成することができる。絶縁層に防水性の材料を用いると、ＦＴＯ膜などの導電膜から絶縁層が剥離することを抑制することができる。その結果、第一電極部の寿命を延長することができる。また、レーザーエッチング法を用いると、上記フォトリソグラフィーなどと比較して、少ない工程数で第一電極部を形成できることから経済的にも有利である。
【００３２】
第二基板１２の下面（容器内部１０１に接する面）に第二電極部１７が配置されている。第二電極部は第二基板１２が容器内部を画する面の全面に形成されている。第二電極部１７は第二基板１２の表面に形成された導電膜である。当該導電膜は第二基板の容器内部領域から食み出す領域まで延長して形成されている。食み出した領域は第二電極部１７と導通する端子部１７１である。
【００３３】
第一基板１１と第二基板１２はガラス、アクリル樹脂等任意の材料で作ればよい。
【００３４】
第一電極部１６と第二電極部１７は透明導電膜（ＦＴＯ、ＩＴＯ（スズドープ酸化インジウム）、酸化スズ等）や蒸着金属膜等任意の材料で作ればよい。集積兼培養容器１０は細胞培養容器として使用されることを考慮すれば、容器内の視覚観察の容易性、容器の洗浄、除菌容易性等から、第二基板１２はガラス製、第二電極部１７は透明導電膜製とすることが好ましい。
【００３５】
側壁部材１３は例えばシリコンを材料とすればよい。
【００３６】
細胞集積装置１の電源部３０は、第一電極部１６と第二電極部１７に交流電圧を印加するものである。電源部３０は交流周波数が可変であり、電圧も可変である。電源部３０の出力リード線は端子部１６１と端子部１７１に接続される。集積兼培養容器１０は細胞培養の容器として使用するものだから、電源部３０の出力リード線と端子部１６１、端子部１７１の接続は、例えばクリップやプラグ等を用いて接続することにより、着脱可能とすることが好ましい。
【００３７】
次に、生体親和性ビーズであるコラーゲンビーズの作成方法を説明する。ＴｙｐｅＩコラーゲン粉末を１０ｍｇ／ｍｌとアルギン酸ナトリウム２％を含むコラーゲン／アルギン酸塩混合水溶液を作成する。またゲル化溶液として１０２ｍＭ ＣａＣｌ２水溶液を作成する。
【００３８】
図５はコラーゲンビーズ作成に用いる器具の説明図である。ビーズ作成容器２０中に上記のゲル化溶液２３を貯留する。図示しないシリンジポンプを用いて上記の混合水溶液を材料押出しノズル２１から押し出す。この時、気体ノズル２２から気体を材料押出しノズル２１に向かって吹き付け、混合水溶液滴の等量化を図っている。気体ノズルから吹き付ける気体は不活性ガスが好ましく、本実施例では窒素ガスを使用した。こうして、粒子径が略一定のコラーゲンビーズを作成した。
【００３９】
コラーゲンのみからなるビーズは誘電泳動現象を生じないが、アルギン酸塩を添加したコラーゲンビーズは誘電泳動現象を示す。そして、コラーゲンビーズは、生体親和性ビーズであり、細胞培養の足場となる。コラーゲンビーズは動物由来細胞の培養に好適である。
【００４０】
他の生体親和性ビーズとしては、アガロースビーズ、アルギン酸ビーズなどが考えられる。アルギン酸ビーズは植物由来細胞の培養に好適である。
【００４１】
図１を参照しつつ本発明にかかる細胞集積方法を説明する。細胞集積方法はビーズ付着工程とその後に行われる細胞捕集工程からなる。図１（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ集積兼培養容器の断面を示しており、（ａ）はビーズ付着工程途中、（ｂ）はビーズ付着工程終了後、（ｃ）は細胞捕集工程途中、（ｄ）は細胞捕集工程終了後の説明図である。
【００４２】
ビーズ付着工程は流入口１４からコラーゲンビーズ２懸濁液を集積兼培養容器１０の容器内部１０１内へ流入させつつ、電源部３０から第一電極部１６と第二電極部１７に交流電圧を印加して行う。図１（ａ）を参照して矢印５１はコラーゲンビーズ懸濁液の流れの方向を示している。
【００４３】
第一電極部１６は微細な面状である個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥からなっていて、第二電極部１７は容器内部の天面の全面に広がった面状であるから、容器内部１０１に、不均一交流電場が生じる。そして、コラーゲンビーズ２中にはアルギン酸塩が添加されているのでコラーゲンビーズ２は誘電泳動し、第一電極部に引き寄せられる。
【００４４】
図１（ｂ）を参照して、ビーズ付着工程後は個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥の各々にコラーゲンビーズ２が１個ずつ付着している。後の細胞培養において、コラーゲンビーズは細胞培養の足場となるものである。ビーズ付着工程におけるビーズ懸濁液の流量、印加交流の周波数と電圧、ビーズの粒子径、個別電極の相互間隔等を調整して個別電極とコラーゲンビーズが１対１に付着することが好ましい。細胞培養時に単一の集積兼培養容器１０内での培養状況が均一化するからである。例えば、個別電極の直径よりも大きい直径を有するビーズを用いると個別電極１ヶ所にビーズ１個が付着するに適していると考えられる。
【００４５】
細胞捕集工程は、コラーゲンビーズ付着工程終了後の集積兼培養容器の容器内部１０１内へ流入口１４から細胞懸濁液を流入させつつ、電源部３０から第一電極部１６と第二電極部１７に交流電圧を印加して行う。ここでは、例示の題材として、細胞懸濁液中に活性細胞４１と死活細胞模擬体４２が混在していて、活性細胞４１が捕集対象細胞であるという分離モデルを例にとって説明する。
【００４６】
図１（ｃ）を参照して矢印５２は細胞懸濁液の流れの方向を示している。活性細胞４１と死活細胞模擬体４２は誘電泳動の挙動が異なり、適切な周波数と電圧を選択すれば活性細胞４１はコラーゲンビーズ２上に捕集され、死活細胞模擬体４２は細胞懸濁液の流れに乗って流出口１５から排出される。図中の波線４３は排出液を表している。
【００４７】
図１（ｄ）を参照して細胞捕集工程の終了後に、集積兼培養容器１０の容器内部１０１では、個別電極１６ａ、１６ｂ、１６ｃ‥‥上にコラーゲンビーズ２が付着し、当該コラーゲンビーズ２上に活性細胞４１が捕集されている。図１（ｄ）の図示では単一のコラーゲンビーズ２上に単一又は２個の活性細胞４１が捕集されているが、これは、発明の説明の容易化の目的で簡略化して図示したものである。実際に実験を行うと単一のコラーゲンビーズ２上に複数の活性細胞４１が捕集された。
【００４８】
以上は分離モデルにおける細胞捕集工程を説明した。本発明にかかる細胞捕集工程は捕集対象細胞を濃縮するものであってもかまわない。続いて、例示の題材として、細胞懸濁液中に活性細胞４１のみが存在している濃縮モデルを例にとってその細胞捕集工程を説明する。
【００４９】
細胞捕集工程は、コラーゲンビーズ付着工程終了後の集積兼培養容器の容器内部１０１内へ流入口１４から細胞懸濁液を流入させつつ、電源部３０から第一電極部１６と第二電極部１７に交流電圧を印加して行う。適切な周波数と電圧を選択すれば、活性細胞４１はコラーゲンビーズ２上に捕集される。
【００５０】
以上説明した細胞捕集工程の終了後、集積兼培養容器１０の容器内部１０１を培養液で置換して集積兼培養容器内で培養を行う。
【００５１】
細胞が増殖するとコラーゲンビーズの表面全体を増殖細胞が覆う状態になる。さらに培養を継続すれば、コラーゲンビーズが細胞に吸収されて、増殖細胞が球形の塊になることが期待される。
【００５２】
本発明にかかる細胞集積方法を実施し、その後に培養を行えば、従来の分離と培養に必要であった、試験管やシャーレなど培養容器の滅菌作業が不要となる。
【実施例１】
【００５３】
−−分離モデル−−
集積兼培養容器は、シリコンガスケットを側壁部材として用い、ＩＴＯ薄膜付ガラスを上下に配置し、当該ガラスを圧接して作成した。第一電極部は、厚膜レジスト剤ＳＵ−８を使用しフォトリソグラフィーで作成した。
【００５４】
シリコンガスケットの厚さは５００μｍ、容器内部の寸法は縦１５ｍｍ、横１５ｍｍであって、内部容量は１１２．５ｍｍ３であった。個別電極は格子間距離５５０μｍの正方格子の各格子点に配置し、円形で、電極の直径は５０μｍと１００μｍの２種を作成した。
【００５５】
コラーゲンビーズは上述したコラーゲンとアルギン酸塩との混合物であり、上述した方法で作成した。コラーゲンビーズの直径は７０〜１２０μｍの間に分布し、中央値は概略１００μｍであった。
【００５６】
細胞は、活性細胞として生後１〜２ヶ月の仔ウシの膝関節の軟骨細胞を、死活細胞模擬体としてプラスチック製の微粒子（製品名：Polybead Polystyrene Microspheres(2.5% Solids-Latex),10μm 会社名：Polysciences, Inc.）を用いた。プラスチック製の微粒子の直径は概略１０μｍであった
コラーゲンビーズ懸濁液と細胞懸濁液の溶媒は細胞等張液である低導電性の生理緩衝液を使用した。コラーゲンビーズ懸濁液の濃度は密度０．５〜１．０×１０５個／ｍｌに調製した。細胞懸濁液は活性細胞の細胞密度を２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、死活細胞模擬体の細胞密度を２．５〜５．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう調製した。
【００５７】
コラーゲンビーズの付着状態は、Ｃｏｌｌａｒｇｅｎ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（コスモ・バイオ（株）製）を用いてコラーゲンビーズを赤色に染色し、顕微鏡で観察した。
【００５８】
細胞捕集工程終了後、シリコンラバーヒータを用いて集積兼培養容器を２７℃に保持し、コラーゲンビーズに軟骨細胞を定着させた。その後容器内部に培養液（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２０％ＦＢＳ、Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ）を満たし、１週間培養した。培養環境は３７℃、５％ＣＯ２、湿度１００％とした。
【００５９】
細胞捕集工程終了後の細胞捕集状況と培養終了後の細胞は顕微鏡を用いて観察した。
【００６０】
＜ビーズ付着工程＞
印加電圧は、正弦波である交流電圧のピーク間の電圧、すなわち、すなわち振幅×２を２５Ｖとした。（以下印加電圧を「○○Ｖｐ−ｐ」と表示する、○○にはピーク間の電圧を表す数値が入る）
【００６１】
印加周波数５００ｋＨｚでコラーゲンビーズ懸濁液０．２５ｍｌ／ｍｉｎ、０．５ｍｌ／ｍｉｎ、１．０ｍｌ／ｍｉｎで実験を行った。流量が０．５ｍｌ／ｍｉｎ、１．０ｍｌ／ｍｉｎのとき個別電極にのみビーズが付着した。流量が０．２５ｍｌ／ｍｉｎのとき個別電極のみならず絶縁層領域にもビーズが沈殿して付着した。
【００６２】
個別電極の直径を５０μｍとした集積兼培養容器を用いビーズ懸濁液流量１．０ｍｌ／ｍｉｎの時に個別電極に１個ずつのビーズが付着した。一方個別電極の直径を１００μｍとすると個別電極１ヶ所当たり複数のビーズが付着した。これにより、個別電極の直径よりも大きい直径を有するビーズを用いると個別電極１ヶ所にビーズ１個が付着するに適していると考えられる。
【００６３】
さらに、印加周波数を１ＭＨzにして実験を行った。印加周波数については５００ｋＨｚと１ＭＨzでビーズ付着状況に大きな変化は認められなかった。
【００６４】
＜細胞捕集工程＞
印加電圧２０Ｖｐ−ｐ、印加周波数を５００ｋＨｚと１ＭＨｚ、細胞懸濁液の流量０．１０ｍｌ／ｍｉｎ、０．２５ｍｌ／ｍｉｎ、０．５０ｍｌ／ｍｉｎ、１．０ｍｌ／ｍｉｎで実験を行った。
【００６５】
流量が０．２５ｍｌ／ｍｉｎのときビーズに集積する細胞の数が最大であった。一方流量が１．０ｍｌ／ｍｉｎでは細胞がビーズに集積せず流出した。印加周波数については５００ｋＨｚと１ＭＨｚで細胞捕集状況に大きな変化は認められなかった。
【００６６】
＜細胞培養＞
細胞捕集工程終了後にコラーゲンビーズの表面に分散して付着していた軟骨細胞が、培養後はコラーゲンビーズに定着し、集積していた。
【実施例２】
【００６７】
−−濃縮モデル−−
実施例２で使用した集積兼培養容器は実施例１と同一である。細胞は生後１〜２ヶ月の仔ウシの膝関節の軟骨細胞を用いた。細胞懸濁液の溶媒は細胞等張液である低導電性の生理緩衝液を使用した。細胞懸濁液は細胞密度２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。実施例１と異なり、細胞懸濁液に死活細胞模擬体を含んでいない。
【００６８】
＜ビーズ付着工程＞
ビーズ付着工程は実施例１と同一であり、説明を省略する。
【００６９】
＜細胞捕集工程＞
印加電圧２０Ｖｐ−ｐ、印加周波数を５００ｋＨｚと１ＭＨｚ、細胞懸濁液の流量０．１０ｍｌ／ｍｉｎ、０．２５ｍｌ／ｍｉｎ、０．５０ｍｌ／ｍｉｎ、１．０ｍｌ／ｍｉｎで実験を行った。
【００７０】
流量が０．２５ｍｌ／ｍｉｎのときビーズに集積する細胞の数が最大であった。一方流量が１．０ｍｌ／ｍｉｎでは細胞がビーズに集積せず流出した。印加周波数については５００ｋＨｚと１ＭＨｚで細胞捕集状況に大きな変化は認められなかった。
【００７１】
＜細胞培養＞
細胞捕集工程終了後にコラーゲンビーズの表面に分散して付着していた軟骨細胞が、培養後はコラーゲンビーズに定着し、集積していた。培養条件は実施例１と同一とした。
【符号の説明】
【００７２】
１ 細胞集積装置
２ 生体親和性ビーズであるコラーゲンビーズ
１０ 集積兼培養容器
１１ 第一基板
１２ 第二基板
１３ 側壁部材
１４ 流入口
１５ 流出口
１６ 第一電極部
１６ａ、１６ｂ、１６ｃ 個別電極
１７ 第二電極部
１８ 絶縁体である光レジスト膜
２０ ビーズ作成容器
２１ 材料押出しノズル
２２ 気体ノズル
２３ ゲル化溶液
３０ 電源部
４０ 細胞懸濁液
４１ 活性細胞
４２ 死活細胞模擬体
４３ 流出液
１０１ 容器内部
１６１ 端子部
１７１ 端子部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞集積装置と誘電泳動可能な生体親和性ビーズを用いる、以下のイとロの工程からなる細胞集積方法であって、
前記細胞集積装置は、
第一基板、第一基板に対向して配置された第二基板と側壁に囲まれ、流入口と流出口を持つ集積兼培養容器、
第一基板に配置された第一電極部と第二基板に配置された第二電極部、
第一電極部は複数の個別電極から構成されていて、前記複数の個別電極は集積兼培養容器の内部に露出しているものであり、
第一電極部と第二電極部間に交流電圧を印加する電源部からなり、
イ 前記流入口から前記集積兼培養容器内に生体親和性ビーズを送り、かつ、前記電源部から第一電極部と第二電極部に交流電圧を印加し、前記ビーズを個別電極に付着するビーズ付着工程
ロ ビーズ付着工程の後に、前記流入口から前記集積兼培養容器内に捕集対象細胞を含む細胞懸濁液を送り、かつ、前記電源部から第一電極部と第二電極部に交流電圧を印加し、前記付着されたビーズに前記捕集対象細胞を捕集する細胞捕集工程。
【請求項２】
前記生体親和性ビーズは、コラーゲンとアルギン酸塩からなるビーズである請求項１に記載した細胞集積方法。
【請求項３】
第一電極部は、第一基板の表面に平坦な表面形状を有する電極部材を形成し、前記電極部材の表面に絶縁性の材料からなる絶縁層を形成し、前記絶縁層を部分的に円形に除去して形成された前記個別電極を有する請求項１に記載した細胞集積方法。
【請求項４】
第一電極部は、第一基板の表面に前記電極部材である導電膜を形成し、前記導電膜の上に前記絶縁層を形成し、レーザー光線を照射して個別電極部分の前記絶縁層を除去するレーザーエッチング法により形成された前記個別電極を有する請求項３に記載した細胞集積方法。
【請求項１】
細胞集積装置と誘電泳動可能な生体親和性ビーズを用いる、以下のイとロの工程からなる細胞集積方法であって、
前記細胞集積装置は、
第一基板、第一基板に対向して配置された第二基板と側壁に囲まれ、流入口と流出口を持つ集積兼培養容器、
第一基板に配置された第一電極部と第二基板に配置された第二電極部、
第一電極部は複数の個別電極から構成されていて、前記複数の個別電極は集積兼培養容器の内部に露出しているものであり、
第一電極部と第二電極部間に交流電圧を印加する電源部からなり、
イ 前記流入口から前記集積兼培養容器内に生体親和性ビーズを送り、かつ、前記電源部から第一電極部と第二電極部に交流電圧を印加し、前記ビーズを個別電極に付着するビーズ付着工程
ロ ビーズ付着工程の後に、前記流入口から前記集積兼培養容器内に捕集対象細胞を含む細胞懸濁液を送り、かつ、前記電源部から第一電極部と第二電極部に交流電圧を印加し、前記付着されたビーズに前記捕集対象細胞を捕集する細胞捕集工程。
【請求項２】
前記生体親和性ビーズは、コラーゲンとアルギン酸塩からなるビーズである請求項１に記載した細胞集積方法。
【請求項３】
第一電極部は、第一基板の表面に平坦な表面形状を有する電極部材を形成し、前記電極部材の表面に絶縁性の材料からなる絶縁層を形成し、前記絶縁層を部分的に円形に除去して形成された前記個別電極を有する請求項１に記載した細胞集積方法。
【請求項４】
第一電極部は、第一基板の表面に前記電極部材である導電膜を形成し、前記導電膜の上に前記絶縁層を形成し、レーザー光線を照射して個別電極部分の前記絶縁層を除去するレーザーエッチング法により形成された前記個別電極を有する請求項３に記載した細胞集積方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−６０８８５（Ｐ２０１２−６０８８５Ａ）
【公開日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２０４９８９（Ｐ２０１０−２０４９８９）
【出願日】平成２２年９月１４日（２０１０．９．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者名 日本生体医工学会 第４９回日本生体医工学会大会事務局 刊行物名 第４９回日本生体医工学会大会 プログラム・抄録集 発行年月日 平成２２年６月２５日
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【出願人】（０００２３１３６１）日本写真印刷株式会社 (477)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１４日（２０１０．９．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 発行者名 日本生体医工学会 第４９回日本生体医工学会大会事務局 刊行物名 第４９回日本生体医工学会大会 プログラム・抄録集 発行年月日 平成２２年６月２５日
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【出願人】（０００２３１３６１）日本写真印刷株式会社 (477)
【Ｆターム（参考）】
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