【課題】細菌病原体の分泌タンパク質及びそれらの使用法に関し、接着／破壊（Ａ／Ｅ）病変を引き起こすＡ／Ｅ病原体の新規な共通の分泌タンパク質を提供する。
【解決手段】組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸を含むＡ／Ｅ病原菌に、該組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡポリペプチドを発現させ、目的のポリペプチド分泌に好ましい条件下でＡ／Ｅ病原菌を成長させて、ＩＩＩ型抗原等、目的のポリペプチドの分泌を促進させる方法。該ポリペプチド及び該ポリペプチドをコードする核酸分子は、Ａ／Ｅ病原体感染に関するワクチン、及び診断または薬剤スクリーニングのツールとして有用である。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のポリペプチドの分泌を促進させる方法であって、
（ａ） 組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子を含むＡ／Ｅ病原菌を提供すること、
（ｂ） 組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子によってコードされた組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡポリペプチドを発現すること、
（ｃ） 目的のポリペプチドの分泌に好ましい条件下でＡ／Ｅ病原菌を成長させて、組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子を含まないＡ／Ｅ病原菌に比べて目的のポリペプチドの分泌を促進させること、
を含む方法。
【請求項２】
前記目的のポリペプチドの分泌に好ましい条件が、ＩＩＩ型抗原の分泌に好ましい条件であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＩＩＩ型抗原の分泌に好ましい条件が、２０−１００ｍＭのＮａＨＣＯ３が添加された最小培地を含む細胞培養倍地中でのＡ／Ｅ病原菌の培養を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記最小培地に、５−１０ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１−１．５％のグルコース及び０．０５から０．５％カサミノ酸がさらに添加されていることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＩＩＩ型抗原の分泌に好ましい条件が、２−１０％のＣＯ２の存在中における、３７℃の温度でのＡ／Ｅ病原菌の培養を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ＩＩＩ型抗原の分泌に好ましい条件が、６００ｎｍで０．７−０．８の吸光度（ＯＤ）までＡ／Ｅ病原菌を培養することを含む請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ＩＩＩ型抗原の分泌に好ましい条件が、２０−１００ｍＭのＮａＨＣＯ３、５−１０ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１−１．５％のグルコース及び０．０５−０．５％のカザミノ酸が添加された最小培地を含む細胞培養培地中でのＡ／Ｅ病原菌の培養を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項８】
組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子を含むＡ／Ｅ病原菌の細胞培養上清を単離することをさらに含む請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子が、異種の又は非相同のもの（heterologous）であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子が、異種の又は非相同のものでないことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子が腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）又はサイトロバクター・ローデンティウム（Citrobacter rodentium）に由来することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子が、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１％ＢＳＡ（フラクションＶ）を含む緩衝液中で温度６５℃で、又は、４８％ホルムアミド、４．８ｘＳＳＣ、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．６、１ｘデンハート液、１０％デキストラン硫酸及び０．１％ＳＤＳを緩衝液中で温度４２℃で、配列番号８５にハイブリダイズすることを特徴とする請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡポリペプチドが、配列番号８６であるか、又は、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１％ＢＳＡ（フラクションＶ）を含む緩衝液中で温度６５℃で、又は、４８％ホルムアミド、４．８ｘＳＳＣ、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．６、１ｘデンハート液、１０％デキストラン硫酸及び０．１％ＳＤＳを緩衝液中で温度４２℃で、配列番号８６にハイブリダイズする核酸分子によってコードされていることを特徴とする請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡポリペプチドが、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１％ＢＳＡ（フラクションＶ）を含む緩衝液中で温度６５℃で、又は、４８％ホルムアミド、４．８ｘＳＳＣ、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．６、１ｘデンハート液、１０％デキストラン硫酸及び０．１％ＳＤＳを緩衝液中で温度４２℃で、配列番号５６をコードする核酸分子にハイブリダイズする核酸分子によってコードされることを特徴とする請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記目的のポリペプチドが分泌ポリペプチドであることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記目的のポリペプチドがＩＩＩ型抗原であることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
目的のポリペプチドが、配列番号２４〜４３、７３〜７５を含むポリペプチド、Ｔｉｒ、ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、ＥｓｐＦ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、及び、Ｍａｐポリペプチドを含む群から１つ以上選択されることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
Ａ／Ｅ病原菌が腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、又はサイトロバクター・ローデンティウム（Citrobacter rodentium）細胞であることを特徴とする請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子を含むＡ／Ｅ病原菌。
【請求項２０】
前記Ａ／Ｅ病原菌が腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）又はサイトロバクター・ローデンティウム（Citrobacter rodentium）であることを特徴とする請求項１９に記載のＡ／Ｅ病原菌。
【請求項２１】
目的のポリペプチドの分泌を促進させる方法であって、
（ａ） 組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子をＡ／Ｅ病原菌に導入すること、
（ｂ） 組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子によってコードされる組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡポリペプチドを発現すること、
（ｃ）目的のポリペプチドの分泌に好ましい条件下でＡ／Ｅ病原菌を成長させて、組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子を含まないＡ／Ｅ病原菌に比べて目的のポリペプチドの分泌を促進させること、
を含む方法。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図１Ｃ】

【図１Ｄ】

【図１Ｅ】

【図１Ｆ】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図２Ｃ】

【図２Ｄ】

【図２Ｅ】

【図２Ｆ】

【図２Ｇ】

【図２Ｈ】

【図２Ｉ】

【図２Ｊ】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図３Ｄ】

【図３Ｅ】

【図３Ｆ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図４Ｃ】

【図４Ｄ】

【図４Ｅ】

【図４Ｆ】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図５Ｄ】

【図５Ｅ】

【図５Ｆ】

【図５Ｇ】

【図５Ｈ】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図６Ｃ】

【図６Ｄ】

【図６Ｅ】

【図６Ｆ】

【図６Ｇ】

【図６Ｈ】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６Ａ】

【図１６Ｂ】

【図１７Ａ】

【図１７Ｂ】

【図１８Ａ】

【図１８Ｂ】

【図１９Ａ】

【図１９Ｂ】

【図２０Ａ】

【図２０Ｂ】

【図２１Ａ】

【図２１Ｂ】

【図２２Ａ】

【図２２Ｂ】

【図２３Ａ】

【図２３Ｂ】

【図２４Ａ】

【図２４Ｂ】

【図２５Ａ】

【図２５Ｂ】

【図２６Ａ】

【図２６Ｂ】

【図２７Ａ】

【図２７Ｂ】

【図２８Ａ】

【図２８Ｂ】

【公開番号】特開２０１１−２５０７９０（Ｐ２０１１−２５０７９０Ａ）
【公開日】平成２３年１２月１５日（２０１１．１２．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１５２０７４（Ｐ２０１１−１５２０７４）
【出願日】平成２３年７月８日（２０１１．７．８）
【分割の表示】特願２００６−５３７０２２（Ｐ２００６−５３７０２２）の分割
【原出願日】平成１６年１０月２９日（２００４．１０．２９）
【出願人】（３０００６６８７４）ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア (24)
【出願人】（５０６１５０２４９）ウニベルシダッド　ナシオナル　アウトノマ　デ　メヒコ (2)
【Ｆターム（参考）】