細菌検出器具、細菌検出方法および細菌検出キット
本発明は被検試料中に混入している細菌を簡便な操作で迅速かつ正確に判定することができる細菌検出器具、細菌検出方法および細菌検出キットを提供する。 本発明に係る細菌検出器具は、対象となる細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されたマイクロアレイ型の器具である。被検試料から調製したプローブと上記基板表面に固定化されたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの成立の有無により、被検試料中の細菌を簡便、迅速かつ正確に検出・同定することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌検出器具、細菌検出方法および細菌検出キットに関するものであり、具体的には、細菌に特異的なオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化された細菌検出器具と、これを用いた極めて正確かつ操作性の高い細菌検出方法および細菌検出キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
例えば、麦芽アルコール飲料中に有害な微生物が混入した場合、濁りや風味劣化などが生じ、品質劣化の原因となる。より具体的には、例えばビールにおいては、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ペクチネータス属（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）等が代表的な有害細菌である。中でもラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）はビール汚染菌として有名である。これらの有害細菌を検出する方法として、現在最も一般的なものは、対象となるビールをメンブランフィルターでろ過後、適当な培地中で培養し、生育するコロニーを検出する方法である。
【０００３】
さらに、このコロニーが上記有害細菌であるかどうかを判定する方法としては、コロニーから抽出したＤＮＡを鋳型として、上記有害細菌に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物が得られるかどうかを電気泳動で判定する方法（例えば、特開平７−２８９２９５号公報（公開日：平成７年１１月７日）参照）が用いられている。しかしながら、この方法では、菌種ごとに多数のプライマーを用いてＰＣＲを複数回行う必要があるため、操作が極めて煩雑であり、迅速性に問題がある。また、要する時間を短縮するために多数のプライマーを混合して１つのチューブで増幅反応を行うことは可能であるが、使用できるプライマーの数には限界があり、微量な検体に基づいて正確な判定を行う事は困難である。
【０００４】
上記問題点を解決するために、それぞれの菌種に普遍的に存在している遺伝子の種特異的な配列を含む部分が増幅されるようにプライマーを設計し、増幅後に種特異的な配列を認識する制限酵素で増幅産物を切断し、電気泳動で得られるバンドサイズからどの菌種の遺伝子であるかを特定する方法が用いられている。しかしながら、必ずしも対象となる全ての菌種について判別可能な制限酵素が存在するとは限らず、また、得られた増幅産物を数種類の制限酵素で各々切断し、電気泳動に供するという極めて煩雑な操作が必要であり、迅速性、簡便性という面では問題がある。
【０００５】
さらに、上記のような問題点を解決するために、種特異的な配列をプローブとして用い、被検体中のＤＮＡまたはＲＮＡにその配列と相補的な配列が存在するかどうかをハイブリダイゼーションによって判定する方法も行われている。
【０００６】
しかしながら、上記ハイブリダイゼーションによって判定する方法でも、非常に近縁でＤＮＡの相同性が高い菌種では、別の種と誤ってハイブリダイズしてしまうクロスハイブリダイゼーションが頻繁に生じるという問題があり、正確に菌種を同定することが困難となる場合も生じる。
【０００７】
特に、上述の代表的なビール汚染菌であるラクトバチルス属に属する種には非常に近縁なものが多いため、クロスハイブリダイゼーションが頻繁に生じる方法を用いたのでは、有害細菌を検出・同定するという目的を達成することができない。
【０００８】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、特定の細菌の存在の有無を正確に判定するために用いることができるオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化された細菌検出器具と、当該細菌検出器具を用いて簡便な操作で迅速かつ正確に判定することができる細菌検出方法および細菌検出キットを提供することにある。
【発明の開示】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、麦芽アルコール飲料の代表的な汚染細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列において、特定の属または特定の種に特異的な配列を見出し、この塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドを基板表面に固定化した器具を用いて、被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより、迅速かつ正確に目的の細菌を検出・同定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち本発明に係る細菌検出器具は、被検試料中の細菌を検出・同定するための器具であって、対象となる細菌は（１）ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する細菌、（２）ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）に属する細菌、（３）ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌、（４）メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）に属する細菌、（５）ペクチネータス属（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）に属する細菌から選ばれる少なくとも２種類以上の細菌であり、対象となる細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されており、当該オリゴヌクレオチドと被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより被検試料中の細菌を検出・同定することを特徴としている。
【００１１】
本発明の（１）〜（５）の細菌は、例えば、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）は配列番号７〜９、および７１に示される塩基配列の全てを１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子中に含む細菌である。ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）は配列番号２２〜２４に示される塩基配列の全てを１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子中に含む細菌である。ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌は配列番号３６〜４５に示される塩基配列のうち少なくとも２つの塩基配列を１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子中に含む細菌である。メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）に属する細菌は配列番号５０〜５５に示される塩基配列のうち少なくとも２つの塩基配列を１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子中に含む細菌である。ペクチネータス属（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）に属する細菌は配列番号５６〜５８に示される塩基配列のうち少なくとも２つの塩基配列を１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子中に含む細菌である。
【００１２】
さらに、本発明に係る細菌検出器具の検出対象細菌としては、（６）ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌、（７）ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌、（８）ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）に属する細菌、（９）ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）に属する細菌、（１０）ラクトバチルス・コリニフォルミス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）に属する細菌、（１１）ラクトバチルス・カルバトス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）に属する細菌、（１２）ラクトバチルス・デルブリュッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）に属する細菌、（１３）ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に属する細菌、（１４）ラクトバチルス・マレファーメンタンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）に属する細菌、（１５）ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）グループ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｅａｅ）に属する細菌、（１６）ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）に属する細菌、（１７）ラクトバチルス・ブヒネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）に属する細菌、（１８）エンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）に属する細菌および（１９）ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）に属する細菌が含まれることが好ましい。
【００１３】
基板表面に固定化されるオリゴヌクレオチドとしては、以下に示すオリゴヌクレオチドであることが好ましく、本発明に係る細菌検出器具は、これらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が基板表面に固定化されていることを特徴としている。
【００１４】
（Ａ）ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００１５】
（Ｂ）ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）の１６Ｓリボソー厶ＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号７１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００１６】
（Ｃ）ラクトバチルス・コリニフォルミス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号１０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号１１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号１２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００１７】
（Ｄ）ラクトバチルス・カルバトス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号１３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号１４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００１８】
（Ｅ）ラクトバチルス・デルブリュッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号１６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号１７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号１８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００１９】
（Ｆ）ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号１９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号２０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号２１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２０】
（Ｇ）ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号２２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号２３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号２４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２１】
（Ｈ）ラクトバチルス・マレファーメンタンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号２５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号２６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号２７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２２】
（Ｉ）ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）グループ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｅａｅ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号２８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号２９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、並びにラクトバチルス・ゼアエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｅａｅ、ただし、ラクトバチルス・カゼイの基準株を含む）に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号３０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号３１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２３】
（Ｊ）ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号３２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号３３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２４】
（Ｋ）ラクトバチルス・ブヒネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号３４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号３５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２５】
（Ｌ）ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号３６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号３７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号３８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号３９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号４５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２６】
（Ｍ）ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号４６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号４７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２７】
（Ｎ）ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号４８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号４９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２８】
（Ｏ）メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号５０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号５５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２９】
（Ｐ）ペクチネータス属（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号５６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号５８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００３０】
（Ｑ）ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号５９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号６０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００３１】
（Ｒ）エンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号６１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号６２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００３２】
（Ｓ）ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号６３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号６４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００３３】
（Ｔ）ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）の一部に属する細菌およびラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の一部に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列に共通する塩基配列のうち、配列番号７２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００３４】
上記（Ａ）〜（Ｔ）に記載のオリゴヌクレオチドを基板表面に固定化した細菌検出器具を用いることにより、食品中の汚染菌、特に麦芽アルコール飲料中の汚染菌を網羅的に検出・同定することが可能となる。
【００３５】
また、本発明に係る細菌検出器具は、上記基板表面にカルボジイミド基またはイソシアネート基を有し、当該カルボジイミド基またはイソシアネート基と上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド末端に付加されたリンカーとの反応により共有結合が形成されることが好ましい。
【００３６】
本発明に係る細菌検出方法は、被検試料中の細菌を検出・同定するための方法であって、被検試料中の細菌の核酸を調製する核酸調製工程と、当該核酸を鋳型として標識プローブを調製するプローブ調製工程と、上記プローブを、上記本発明に係る細菌検出器具の基板表面に固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるハイブリダイゼーション工程と、ハイブリダイゼーションシグナルを検出するシグナル検出工程とを含むことを特徴としている。
【００３７】
本発明に係る細菌検出方法の被検試料としては、食品が好適であり、なかでも麦芽アルコール飲料が最も適している。
【００３８】
本発明に係る細菌検出キットは、上記本発明に係る細菌検出方法を実施するためのキットであり、上記本発明に係る細菌検出器具が含まれる。さらに、ハイブリダイゼーション工程、シグナル検出工程、プローブ調製工程、核酸調製工程で用いる試薬を含むことが好ましい。
【００３９】
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１（ａ）】実施例において使用した、本発明に係る細菌検出器具の基板上に固定化されているオリゴヌクレオチドの配置を示した図である。
【図１（ｂ）】図１（ａ）に示された配置にオリゴヌクレオチドが固定化された細菌検出器具を用いてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓを検出した結果を示す画像である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【００４２】
（１）本発明に係る細菌検出器具
本発明に係る細菌検出器具は、被検試料中の細菌を検出・同定するための器具であって、対象となる細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されており、当該オリゴヌクレオチドと被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより被検試料中の細菌を検出・同定するものである。
【００４３】
〔基板〕
本発明に係る細菌検出器具に用いる基板の材質としては、オリゴヌクレオチドを安定して固定化することができるものであればよい。例えば、ポリカーボネートやプラスティックなどの合成樹脂、ガラス等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。基板の形態も特に限定されるものではないが、例えば、板状、フィルム状等の基板を好適に用いることができる。
【００４４】
〔基板表面に固定化されるオリゴヌクレオチド〕
本発明に係る細菌検出器具の基板表面に固定化されるオリゴヌクレオチドは、検出対象細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドであればよい。当該オリゴヌクレオチドと被検試料由来の核酸との間にハイブリダイゼーションが成立することにより、被検試料中に含まれている目的の種または属に属する細菌を検出することが可能となる。なお、上記検出対象細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドを、以下適宜「キャプチャーオリゴ」と称する。
【００４５】
上記特異的な塩基配列は、検出対象細菌のゲノムの塩基配列から属または種特異的な塩基配列を見出せばよいが、検出対象細菌のリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列から見出すことが好ましい。なかでも細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子は属または種特異的な塩基配列を多く有していることが知られており、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応するＤＮＡ配列中から属または種特異的な塩基配列を見出すことが特に好ましい。リボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ等のデータベース等から入手することができる。
【００４６】
キャプチャーオリゴは上記属または種特異的な塩基配列に基づいて設計すればよい。したがって、上記属または種特異的な塩基配列そのものであってもよいし、検出対象細菌から調製した核酸と特異的なハイブリダイゼーションが成立する限りにおいて、変異が含まれていてもよい。変異の位置は特に限定されるものではない。
【００４７】
キャプチャーオリゴの長さ（塩基数）は特に限定されるものではないが、短すぎるとハイブリダイゼーションの検出が困難になり、長すぎると非特異的ハイブリダイゼーションを許容してしまう。発明者らは、キャプチャーオリゴの長さの最適化について検討を重ね、標準的な長さを１２〜２４塩基とした。より好ましくは１３〜２２塩基である。ただし、これに限定されるものではない。塩基長は主として配列特性（特定の塩基の含有率，同一塩基のリピート）に依存するものであり、結合性の良いものは短鎖でも特異的ハイブリダイゼーションが可能であることが、発明者らにより確認されている。
【００４８】
キャプチャーオリゴが、被検試料由来の核酸とのハイブリダイゼーションを妨害するヘアピン構造、ループ構造、またはそれ以外の立体構造を持つ場合、キャプチャーオリゴを構成する１またはそれ以上のヌクレオチドをイノシンまたはいずれのヌクレオチドとも対合しない核酸に置換することにより、その立体構造を解除することができる。
【００４９】
キャプチャーオリゴの合成法は特に限定されるものではなく、公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の方法等）により合成すればよい。一般的には、市販のＤＮＡ合成機を用いて化学合成することができる。
【００５０】
本発明に係る細菌検出器具において、上記検出対象細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドのみではなく、それらに加えて、いわゆるコントロール・キャプチャーオリゴを基板表面に固定化することが好ましい。コントロール・キャプチャーオリゴには、陽性コントロール・キャプチャーオリゴおよび陰性コントロール・キャプチャーオリゴが含まれる。陽性コントロール・キャプチャーオリゴは、後述するプローブ調製工程において増幅反応がうまくいっているかどうかを判定するために用いるものである。陰性コントロール・キャプチャーオリゴは、非特異的ハイブリダイゼーションが生じていないこと、すなわち擬陽性のハイブリダイゼーションシグナルが生じていないことを確認するために用いるものである。これらの陽性コントロール・キャプチャーオリゴおよび陰性コントロール・キャプチャーオリゴが基板表面に固定化された細菌検出器具も本発明に含まれる。
【００５１】
陽性コントロール・キャプチャーオリゴは検出対象細菌から調製するプローブに含まれる塩基配列に基づいて設計されるものであればよい。また、複数の検出対象細菌を同時に同一の細菌検出器具を用いて検出する場合には、各検出対象細菌について陽性コントロール・キャプチャーオリゴを設計してもよいが、複数の検出対象細菌から調製するプローブに共通する塩基配列に基づいて設計してもよい。すべての検出対象細菌から調製するプローブに共通する塩基配列がない場合は、いくつかのグループごとに陽性コントロール・キャプチャーオリゴを設計してもよい。あるいは、プライマー配列部分が同じで、対象となる細菌の配列とは異なる人工的な配列を設計し、この配列の一部を陽性コントロール・キャプチャーオリゴとすることもできる。上記人工的な配列を鋳型としてプローブを調製し（本明細書では、このようなプローブをコントロールプローブと称する。）、被検試料から調製したプローブに添加することにより、ハイブリダイゼーションの特異性を検証することが可能となる。なお、上記プローブについては後述する。
【００５２】
陰性コントロール・キャプチャーオリゴは、陽性コントロール・キャプチャーオリゴの塩基配列において、１塩基以上であり、かつ、当該配列の有する塩基数の２０％未満の範囲内で人為的な塩基の置換を含む塩基配列を有するように設計することが好ましい。塩基置換を行う塩基数は、ハイブリダイゼーションの条件との関係で決定され、検出対象細菌由来のプローブがハイブリダイゼーションを生じないような塩基数を選択すればよい。
【００５３】
検出対象細菌は特に限定されるものではなく、目的とする被検試料中から検出しようとする細菌を適宜選択すればよい。例えば、食品中に混入し当該食品を汚染する可能性のある細菌を挙げることができる。なかでも麦芽アルコール飲料に混入・汚染する可能性のある細菌を検出対象細菌とすることが好ましい。食品中に有害な細菌が混入することは、公衆衛生上非常に大きな問題となる。また、ビールや発泡酒に代表される麦芽アルコール飲料においては、有害な細菌が混入した場合、濁りや風味劣化などの品質劣化の原因となるため、これらの有害細菌を迅速かつ正確に検出・同定する方法の開発が特に強く望まれている。
【００５４】
麦芽アルコール飲料を汚染する細菌としては、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）およびペクチネータス属（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）に属する細菌を挙げることができる。また、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌種としては、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・コリニフォルミス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ラクトバチルス・カルバトス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・マレファーメンタンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ブヒネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・ゼアエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉの基準株を含む）を挙げることができる。また、食品を汚染する細菌として、上記の他にロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）およびザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）に属する細菌、並びにエンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）およびラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）を挙げることができる。ただし、検出対象細菌はこれらに限定されるものではない。
【００５５】
上記例示した細菌を検出・同定するためのキャプチャーオリゴとしては、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）、ペクチネータス属（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）およびザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、各属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチド、およびラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・コリニフォルミス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ラクトバチルス・カルバトス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・マレファーメンタンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ブヒネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・ゼアエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉの基準株を含む）、エンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）およびラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、各細菌種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドを挙げることができる。具体的には、配列番号１〜６４、７１および７２に示されたいずれかの塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に特異的な塩基配列に基づくキャプチャーオリゴ（配列番号１〜６）、およびラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の一部とロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）の一部とに対応する塩基配列に基づくキャプチャーオリゴ（配列番号７２）により検出可能なラクトバチルス属細菌を表１に例示した。ただし、配列番号１〜６および７２に示されたいずれかの塩基配列を有するキャプチャーオリゴにより検出可能な細菌は、これらに限定されるものではない。
【００５７】
【表１】
【００５８】
ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）に特異的な塩基配列に基づくキャプチャーオリゴ（配列番号３６〜４５）により検出可能な細菌を表２に例示した。ただし、配列番号３６〜４５に示されたいずれかの塩基配列を有するキャプチャーオリゴにより検出可能な細菌は、これらに限定されるものではない。
【００５９】
【表２】
【００６０】
ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に特異的な塩基配列に基づくキャプチャーオリゴ（配列番号４６、４７）により検出可能な細菌を表３に例示した。ただし、配列番号４６または４７に示された塩基配列を有するキャプチャーオリゴにより検出可能な細菌は、これらに限定されるものではない。
【００６１】
【表３】
【００６２】
ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）に特異的な塩基配列に基づくキャプチャーオリゴ（配列番号４８、４９）、およびラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の一部とロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）の一部とに対応する塩基配列に基づくキャプチャーオリゴ（配列番号７２）により検出可能なロイコノストック属細菌を表４に例示した。ただし、配列番号４８、４９および７２に示されたいずれかの塩基配列を有するキャプチャーオリゴにより検出可能な細菌は、これらに限定されるものではない。
【００６３】
【表４】
【００６４】
メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）に特異的な塩基配列に基づくキャプチャーオリゴ（配列番号５０〜５５）により検出可能な細菌としては、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｍｉｃｒｏｎｕｃｉｆｏｒｍｉｓを挙げることができる。ただし、配列番号５０〜５５に示されたいずれかの塩基配列を有するキャプチャーオリゴにより検出可能な細菌は、これらに限定されるものではない。
【００６５】
ペクチネータス属（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）に特異的な塩基配列に基づくキャプチャーオリゴ（配列番号５６〜５８）により検出可能な細菌としては、Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉｉｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓを挙げることができる。ただし、配列番号５６〜５８に示されたいずれかの塩基配列を有するキャプチャーオリゴにより検出可能な細菌は、これらに限定されるものではない。
【００６６】
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）に特異的な塩基配列に基づくキャプチャーオリゴ（配列番号５９、６０）により検出可能な細菌としては、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｐｏｍａｃｅａｅを挙げることができる。ただし、配列番号５９または６０に示された塩基配列を有するキャプチャーオリゴにより検出可能な細菌は、これらに限定されるものではない。
【００６７】
本発明に係る細菌検出器具の基板表面に固定化されるキャプチャーオリゴは、対象とする細菌から調製されたプローブとハイブリダイゼーションが成立するものであれば特に限定されるものではない。したがって、上記配列番号１〜６４、７１および７２に示されたいずれかの塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１〜６４、７１および７２に示されたいずれかの塩基配列のみからなるものであってもよく、配列番号１〜６４、７１および７２に示されたいずれかの塩基配列以外の配列を含むものであってもよい。配列番号１〜６４、７１および７２に示されたいずれかの塩基配列以外の配列を含むキャプチャーオリゴとしては、配列番号１〜６４、７１および７２に示された各塩基配列の５’側もしくは３’側またはその両方に対して、各々の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいて伸長させた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができ、このようなオリゴヌクレオチドを基板表面に固定化された細菌検出器具も本発明に含まれる。
【００６８】
１つの基板上に固定化するキャプチャーオリゴは、少なくとも１種類以上であればよく、特に上限はない。一般に、試料中に混入した細菌を検出する場合は、被検試料中から検出可能な細菌を１つの基板で網羅的に検出できることが、操作の簡便性および検査の迅速性の観点から好ましいといえる。したがって、本発明に係る細菌検出器具も、１つの基板上に目的の細菌種または属に対応するキャプチャーオリゴを複数固定化した、いわゆるマイクロアレイ型の器具とすることが最も好ましい。例えば、麦芽アルコール飲料を被検試料とする場合には、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）、ペクチネータス属（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）等に属する細菌に対応したキャプチャーオリゴを基板表面に固定化することが好ましい。
【００６９】
〔オリゴヌクレオチド（キャプチャーオリゴ）の固定化〕
オリゴヌクレオチドの基板表面への固定化法は特に限定されるものではなく、公知の方法を適宜選択して用いればよい。例えば、物理的吸着、電気的結合または分子共有結合などの一般的なハイブリダイゼーション法に用いられる手法が利用可能である。本発明に係る細菌検出器具においては、表面にカルボジイミド基またはイソシアネート基を有する基材を使用し（米国特許：ＵＳ５，９０８，７４６、特開平８−２３９７５号）、固定化することが好ましい。
【００７０】
オリゴヌクレオチドをスポッティングする際に、オリゴヌクレオチドのスポット量が少なすぎると、オリゴヌクレオチドとプローブとの間の反応性を十分に確保することができず、判定が困難になることがある。また、高集積度のスポッティングは技術的な問題と同時にコストがかかり、さらにプローブの蛍光標識や化学発色などを用いたハイブリダイゼーションシグナルの検出にもより精密で高額な検出装置（例えば、スキャナー）が必要となる。したがって、オリゴヌクレオチドは、基板の表面に径１０〜１，０００μｍのサイズに固定することが好ましい。オリゴヌクレオチドの基板上へのスポッティング方法は特に限定されるものではない。例えば、スポッティングマシンを使用して基板上にオリゴヌクレオチド溶液をスポッティングすることにより行うことができる。これによりオリゴヌクレオチド溶液は、通常ほぼ円形にスポッティングされる。
【００７１】
（２）本発明に係る細菌検出方法
本発明に係る細菌検出方法は、被検試料中の細菌の核酸を調製する核酸調製工程と、当該核酸を鋳型として標識プローブを調製するプローブ調製工程と、対象となる細菌が属する種または属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドと上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程と、ハイブリダイゼーションシグナルを検出するシグナル検出工程とを含む、被検試料中の細菌を検出・同定するための方法である。本検出方法のハイブリダイゼーション工程においては、上記本発明に係る細菌検出器具を用いることが好ましい。当該細菌検出器具を用いることにより、簡便、迅速かつ正確に網羅的な検出・同定を行うことが可能となる。また、本検出方法の被検試料としては、食品であることが好ましく、麦芽アルコール飲料であることが特に好ましい。以下各工程に分けて詳細に説明する。
【００７２】
〔核酸調製工程〕
被検試料中の細菌の核酸を調製する工程である。被検試料からの核酸の調製法は、公知の核酸の調製法を適宜選択して用いることができる。例えば、ＤＮＡの調製は、Ｒ−Ｆ．Ｗａｎｇが紹介する方法に従って抽出することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（２０００）１４，１−５）。この方法は標準的な調製法であるが、多くの代替法があり、いずれを採用してもよいことはいうまでもない。また、市販のキットを使用してもよい。
【００７３】
〔プローブ調製工程〕
上記核酸調製工程で調製した核酸を鋳型として標識プローブを調製する工程である。プローブは、例えば、キャプチャーオリゴおよび陽性コントロール・キャプチャーオリゴの塩基配列を含むよう設計されたプライマーを使用して核酸増幅により作製することができる。核酸増幅の方法としては、例えば、ＰＣＲによりＤＮＡとして増幅する方法、あるいはインビトロ・トランスクリプション（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）法によりＲＮＡとして増幅する方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
例えば、ＰＣＲにより標識プローブを調製する場合には、ＰＣＲに用いるプライマーは、プローブがキャプチャーオリゴおよび陽性コントロール・キャプチャーオリゴと相補的な塩基配列を含むように設計される。なお、ハイブリダイゼーションが可能である限りにおいて、プローブはキャプチャーオリゴまたは陽性コントロール・キャプチャーオリゴよりも長くても短くてもよい。標識プローブを得るために、ＰＣＲに用いるプライマーを予め標識しておくことが可能である。また、ＰＣＲの基質（デオキシヌクレオシド三リン酸）を標識しておくことにより標識プローブを得ることもできる。あるいはＰＣＲ終了後にプローブを標識してもよい。標識物質は特に限定されるものではなく、例えば、蛍光物質、ハプテン、放射性物質等、通常のハイブリダイゼーションに用いるプローブと同様の標識物質を使用することができる。具体的には、蛍光物質としてはフルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ローダミン（Ｒｏｄａｍｉｎｅ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、シアニン系蛍光色素等が、ハプテンとしてはビオチン（ＢＩＯＴＩＮ）、ジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、フルオレセイン等を挙げることができる。
【００７５】
〔ハイブリダイゼーション工程〕
ハイブリダイゼーション工程は、対象となる細菌が属する種または属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドと上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行う工程である。ハイブリダイゼーションは上記オリゴヌクレオチドを固定化したメンブレン上等で行うことができるが、本発明に係る細菌検出器具を用いることが好ましい。当該細菌検出器具を用いることにより、簡便、迅速かつ正確に網羅的な検出・同定を行うことが可能となる。ハイブリダイゼーション工程に用いる方法は特に限定されるものではなく、公知の核酸ハイブリダイゼーション方法を適宜選択して用いることができる。以下に、具体的なハイブリダイゼーション方法の一例を示す。
【００７６】
ＳＳＣ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｃｉｔｒａｔｅ）などの塩溶液、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのブロッキング溶液、および融合反応促進のための添加剤からなる融合液に、標識プローブを加える。プローブが２本鎖の場合は熱等による変性を行う。基板上に標識プローブ液を数μＬ添加した後、数時間加熱操作（通常３７〜５０℃）を行い、基板上に固定化されているオリゴヌクレオチドと標識プローブ間でハイブリッドを形成させる。その後、基板上に５×ＳＳＣまたは３Ｍテトラメチルアンモニウムクロライドを加えて加熱し（通常３７〜５０℃）、特異的なハイブリッドを形成していない標識プローブを基板から剥離させ、特異的なハイブリッドのみを選択的に基板上に残す。
【００７７】
〔シグナル検出工程〕
シグナル検出工程は、上記ハイブリダイゼーション工程においてハイブリダイゼーションの成立の有無を判定する工程であり、通常上記ハイブリダイゼーション工程と連続的に行われる。
【００７８】
ハイブリッド検出工程で用いる方法は、上記プローブ調製工程で調製したプローブに導入された標識物質に依存する。すなわち、ハイブリッドの検出には、プローブに導入されている蛍光物質、ハプテン等の標識物質を使用する。したがって、用いたプローブに導入した標識物質を検出するための公知の方法を適宜選択して使用すればよい。
【００７９】
例えば、ハプテンを使用する場合は、ハプテンを認識するタンパクまたはそれに結合するタンパクと、アルカリフォスファターゼまたはホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ等の結合体（酵素コンジュゲート）を含む溶液を基板上に加え、室温で数１０分間反応させる。なお、このハプテンと酵素コンジュゲートの結合反応を行う前に、オリゴヌクレオチドを固定した領域以外の基板の領域をカゼインなどのタンパクを用いて完全に被覆することによって、酵素コンジュゲートと基板の非特異的吸着反応を阻止することができる。これは、オリゴヌクレオチドを固定した後に基板上にカゼインなどのタンパクの溶液を加え、室温で数１０分間放置することによって行うことができる。酵素コンジュゲートとプローブ中のハプテンとの結合反応終了後、ハプテンと結合しなかった酵素コンジュゲートを、界面活性剤を含む適当な緩衝液で洗浄し排除する。これによって、基板上にはプローブ中のハプテンと結合した酵素コンジュゲートのみが残ることになる。
【００８０】
ハイブリッドの視覚化には、ハプテンと酵素コンジュゲート結合体のみが存在する場合にのみ不溶化合物が形成されるような化合物を添加する。その不溶性化合物の生成は、酵素反応によって増幅され可視化される。添加される化合物として、酵素コンジュゲート中の酵素がアルカリフォスファターゼの場合には、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）とＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸−ｐトルイジン塩）が用いられ、酵素がホースラディッシ・ペルオキシダーゼの場合には、ＴＭＢ（３，３’，５，５’テトラメチルベンチジン）などが用いられる。
【００８１】
キャプチャーオリゴを固定化した位置におけるハイブリッドの色素沈着または蛍光発色等のハイブリダイゼーションシグナルを見ることによって、被検試料中に含まれる細菌種の判定を行う。すなわち、ハイブリダイゼーションシグナルが検出された場合には、当該シグナルがある位置にスポットされたオリゴヌクレオチドに対応する細菌が、被検試料中に含まれていることを意味する。なお、陽性コントロール・キャプチャーオリゴの位置にシグナルが認められれば、本試験が正常に機能していることが確認でき、陰性コントロール・キャプチャーオリゴの位置にシグナルが認められなければ、ハイブリダイゼーションが適当な条件で行われたことが確認できる。
【００８２】
（３）本発明に係る細菌検出キット
本発明に係る細菌検出キットは、上述の本発明に係る細菌検出方法を実施するためのキットである。したがって、本発明に係る細菌検出方法を実施できるものであれば、キットに含まれる構成は特に限定されるものではない。
【００８３】
本細菌検出キットは、本発明に係る細菌検出器具を含むものであることが好ましい。当該細菌検出器具を含むキットとすることにより、簡便、迅速かつ正確に網羅的な検出・同定を行うことが可能となる。また、本細菌検出キットには、上記ハイブリダイゼーション工程およびシグナル検出工程で使用する試薬を含むことが好ましい。ハイブリダイゼーション工程で用いる試薬としては、例えば、ＳＳＣ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｃｉｔｒａｔｅ）などの塩溶液、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのブロッキング溶液、融合反応促進のための添加剤等を挙げることができ、シグナル検出工程で使用する試薬としては、例えば、ハプテンを認識するタンパクと酵素との結合体（酵素コンジュゲート）や、ＮＢＴ、ＢＣＩＰ、ＴＭＢ等の発色基質等を挙げることができるが、これに限定されるものではなく、目的に適合するように適宜適切な試薬を選択してキットの構成とすればよい。
【００８４】
本細菌検出キットには、上記プローブ調製工程で使用する試薬を含むことが好ましく、さらに、上記核酸調製工程で使用する試薬を含むことが好ましい。プローブ調製工程で使用する試薬としては、例えば、ＰＣＲ用緩衝液、耐熱性ＤＮＡ合成酵素、デオキシヌクレオシド三リン酸混合液等を挙げることができ、核酸調製工程で使用する試薬としては、溶菌用緩衝液、ＤＮＡ回収用カラム、ＤＮＡ抽出用緩衝液等を挙げることができる。ただしこれに限定されるものではなく、目的に適合するように適宜適切な試薬を選択してキットの構成とすればよい。
【００８５】
本発明に係るキット（本発明に係る細菌検出器具および各工程に使用する試薬を含むもの）を用いることにより、被検試料受領後約６時間で被検試料中に含まれる細菌の検出・同定を実施することができる。
【００８６】
（４）本発明の用途
本発明に係る細菌検出器具、細菌検出方法および細菌検出キットの用途は特に限定されるものではなく、細菌の判定が必要な用途全てに用いることができる。具体的には、例えば、細菌による汚染が品質に大きな影響を及ぼす各種工業製品の製造工程で、同工業製品やその製造環境等から分離された細菌を迅速かつ正確に検出・同定する必要がある場合に好適に用いられる。
【００８７】
判定の対象となる被判定細菌の由来となる上記工業製品としては、代表的なものとして、食品、飲料、医薬品・試薬・医薬部外品、使い捨ての医療用器具等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。本発明は上記例示した工業製品のなかでの食品に応用することが好ましい。食品としては、より具体的には、パン、和洋菓子（冷菓等も含む）、惣菜食品、乳製品、シリアル食品、豆腐・油揚げ類、麺類、弁当類、調味料、小麦粉や食肉等の農産加工品、栄養補助食品（サプリメント等）、長期保存食品（缶詰、冷凍食品、レトルト食品等）等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００８８】
本発明は、上記例示した食品のなかでも、特に麦芽アルコール飲料に好適に応用することができる。麦芽アルコール飲料としては、ビール、発泡酒等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【実施例】
【００８９】
〔オリゴヌクレオチドの合成〕
定法に従い、オリゴヌクレオチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、脱保護を施した後乾燥させた。このオリゴヌクレオチド乾燥体を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）・１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液を用いて溶解し、１００ｐｍｏｌ／μＬのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。本実施例に使用したすべてのオリゴヌクレオチドはこの方法で合成した。合成したオリゴヌクレオチドの塩基配列を配列番号１〜７２に示した。これらのうち、配列番号１〜６４、７１および７２がキャプチャーオリゴであり、配列番号６５が検出対象細菌に対する陽性コントロール・キャプチャーオリゴであり、配列番号６６が陰性コントロール・キャプチャーオリゴであり、配列番号６７〜６８がプライマーであり、配列番号６９がコントロールプローブであり、配列番号７０がコントロールプローブに対する陽性コントロール・キャプチャーオリゴある。キャプチャーオリゴヌクレオチドについては上記合成機を用いて５’末端にアミノ基を結合させ、プライマーは５’末端にビオチンを結合させた。
【００９０】
〔基板へのキャプチャーオリゴヌクレオチドのスポッティング〕
５’末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチド溶液１０μＬに対してマイクロスポッティング溶液（ＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．製）を１０μＬ混合し、マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｃ．製）上に分注した。スポッティングマシンの所定の位置にカルボジイミド樹脂処理スライドグラスＣａｒｂｏｓｔａｔｉｏｎ（日清紡績株式会社製）を配置し、スポッティングマシンを作動させた。スポッティング終了後、スライドグラスに熱水からの蒸気を数秒間あて、その後紫外線を６００ｍＪ照射した。再度蒸気に数秒間曝露した後、ホットプレート上にスライドグラスを置いて水分を除去した。スライドグラスを３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）・１００ｍＭ ＮａＣｌ・０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に室温で３０分間浸し、ブロッキングした。その後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）・１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液で洗浄した。スライドグラスを室温で乾燥させ、使用まで乾燥状態で冷暗所にて保存した。図１（ａ）に、本実施例で実際に使用した細菌検出器具の基板上に固定化されているオリゴヌクレオチドの配置を示した。
【００９１】
〔核酸調製工程〕
検体として用いた細菌はラクトバチルス属１４種、ペディオコッカス属５種、ストレプトコッカス属１種、ロイコノストック属１種、メガスフェラ属３種、ペクチネータス属２種、ザイモモナス属２種、エンテロコッカス属１種、ラクトコッカス属１種の合計３０種類の細菌である。検体として用いた細菌を表５に示した。
【００９２】
【表５】
【００９３】
これらの各細菌に最適な培養条件で培養した菌液から、Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆ． Ｋｉｔ（ＥｄｇｅＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ製、Ｃａｔ．Ｎｏ．＃８５１７１）を用いて各細菌のゲノムＤＮＡをそれぞれ調製した。
【００９４】
〔プローブ調製工程〕
得られた各細菌のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによりプローブ核酸を調製した。ＰＣＲ反応液の組成は、Ｔａｑポリメラーゼ：１ｕｎｉｔ、ビオチン化プライマー（配列番号６８および６９）：各１０ｐｍｏｌ、反応用緩衝液（１０×）：５μＬ、ｄＮＴＰ：各１０ｎｍｏｌ、鋳型ＤＮＡ：１００ｎｇに滅菌蒸留水を加えて総量５０μＬとした。サーマルサイクラーを用いて、９５℃で３分間保持した後、９５℃：３０秒間、５５℃：１５秒間、７２℃：１分間の反応を３０サイクル行い、７２℃で５分間保持して反応を終了した。
【００９５】
また、プライマー配列部分が同じで対象となる細菌の配列とは異なる人工的な配列を設計し、これをコントロールプローブとした。これを鋳型としてＰＣＲを行い、ビオチン化コントロールプローブを調製した。ＰＣＲ反応液の組成は、鋳型ＤＮＡを１ｎｇとした点を除いて上記と同様である。また、反応温度およびサイクル数は上記と同一である。プローブの精製は行わず、ＰＣＲ反応液をそのままプローブ溶液として、以下のハイブリダイゼーション工程で使用した。
【００９６】
〔ハイブリダイゼーション工程およびシグナル検出工程〕
上記プローブ核酸溶液３μＬと、ビオチン化コントロールプローブ溶液１μＬと、Ａｒｒａｙｌｔ Ｕｎｉｈｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．製）１６μＬとを加えて混合し、１００℃で１分間加熱処理を行った後、氷中に５分間浸した。このプローブ核酸溶液を全量とり、キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定化した基板に載せ、その上にカバーグラスを載せた。これを保湿箱に入れ、３７℃に設定した恒温器中に１２０分間静置した。基板を取り出し、すばやく室温下で２×ＳＳＣ溶液（２×ＳＳＣ：０．０３３ＭＮａＣｌ、０．０３３Ｍクエン酸ナトリウム）に浸してカバーグラスを除去し、３７℃に保温した２×ＳＳＣ中に５分間浸した。
【００９７】
基板を２×ＳＳＣから取り出し、遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）にセットして、２，０００ｒｐｍで１分間遠心した。次にＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ ｋｉｔ（ＶＥＣＴＯＲ社製）を用いてアビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体を作製し基板上に１．４ｍＬ滴下し、室温で３０分間静置した。その後、ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、０．９％塩化ナトリウム）中で洗浄した。ＴＭＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｋｉｔ ｆｏｒ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＶＥＣＴＯＲ社）を用いて発色溶液を作製し、基板上に１．４ｍＬ滴下して室温で３０分間静置した。基盤を蒸留水で洗浄して発色反応を止めた。
【００９８】
〔判定〕
ＥＰＳＯＮ社製スキャナーＧＴ−８７００Ｆおよびその透過型ユニットを用いてハイブリダイゼーションを行った領域を６００ｄｐｉにてスキャンし、スキャン画像を目視により発色の有無を確認した。図１（ｂ）にスキャン画像の一例として、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓのスキャン画像を示した。なお、図１（ａ）は基板上のオリゴヌクレオチドの配置を示している。
【００９９】
〔結果〕
検体として用いた３０種類の各細菌についての結果を表６〜３５に示した。各表とも○印が発色の確認されたスポットを表し、−印が発色の確認されなかったスポットを表す。表６〜３５から明らかなように全ての場合、コントロールプローブではそれに対する陽性コントロール・キャプチャーオリゴ（配列番号７０）に発色が見られ、また、陰性コントロール・キャプチャーオリゴでは発色が認められず、増幅およびハイブリダイゼーションの工程が共に正常に機能していることが確認された。また、全ての細菌に対して陽性コントロール・キャプチャーオリゴ（配列番号６５）で発色が確認された。このことより細菌より調整した核酸が増幅されていることも確認された。なお、以下の結果の説明においては陽性コントロール・キャプチャーオリゴ（配列番号６５および７０）の発色は含めないものとする。
【０１００】
表６にはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓの結果を示した。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓは１個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号１）と、４個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号７、８、９、７１）との合計５箇所のみで発色が確認された（図１参照）。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ（表８）は、１個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号５）と、２個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号１３、１４）との合計３箇所のみで発色が確認された。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ（表７）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ（表９）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ（表１１）およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ（表１２）は、６個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号１〜６）のうちいずれか１個所と、各細菌に対応する３個所の種特異的キャプチャーオリゴとの合計４個所のみに発色が認められた。
【０１０１】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ（表１０）は、１個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号６）と、１個所のＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属の一部およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の一部検出用キャプチャーオリゴ（配列番号７２）と、３個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号１９〜２１）との合計５個所のみに発色が認められた。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ（表１３）は、２個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号３、４）と、２個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号２８、２９）との合計４個所のみに発色が認められた。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（表１４）は、２個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号３、４）と、２個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号３２、３３）との合計４個所のみに発色が認められた。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ（表１５）は、１個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号１）と、２個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号３４、３５）との合計３個所のみに発色が認められた。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｅａｅ（表１９）は、２個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号３、４）と、２個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｅａｅ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号３０、３１）との合計４個所のみに発色が認められた。
【０１０２】
また、種特異的キャプチャーオリゴが設計されていないＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ（表１６）およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ（表１８）は、６個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号１〜６）のうちいずれか１個所のみに発色が認められた。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｉｔｔａｃｉ（表１７）は、１個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号６）とＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属の一部およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の一部検出用キャプチャーオリゴ（配列番号７２）の合計２個所のみに発色が認められた。
【０１０３】
Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｄａｍｎｏｓｕｓ（表２０）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ（表２１）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ（表２２）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｄｅｘｔｒｉｎｉｃｕｓ（表２３）およびＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｕｒｉｎａｅｅｑｕｉ（表２４）は１０個所のＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号３６〜４５）のうちいずれか２個所のみに発色が認められた。
【０１０４】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ（表２５）は２個所のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号４６、４７）のみに発色が認められた。
【０１０５】
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ（表２６）は２個所のＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号４８、４９）と、１個所のＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属の一部およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の一部検出用キャプチャーオリゴ（配列番号７２）の合計３箇所のみに発色が認められた。
【０１０６】
Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｃｉｓｉａｅ（表２７）、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ（表２８）およびＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｍｉｃｒｏｎｕｃｉｆｏｒｍｉｓ（表２９）は６個所のＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号５０〜５５）のうちいずれか２個所のみに発色が認められた。
【０１０７】
Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉｉｐｈｉｌｓ（表３０）およびＰｅｃｔｉｎａｔｕｓ ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓ（表３１）は３個所のＰｅｃｔｉｎａｔｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号５６〜５８）のうちいずれか２個所のみに発色が認められた。
【０１０８】
Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ（表３２）およびＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｐｏｍａｃｅａｅ（表３３）は２個所のＺｙｍｏｍｏｎａｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号５９、６０）にのみ発色が認められた。
【０１０９】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ（表３４）は２個所のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号６１、６２）のみに発色が認められた。
【０１１０】
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ（表３５）は２個所のＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号６３、６４）のみに発色が認められた。
【０１１１】
以上の結果は、検体として用いた各細菌において、各細菌に特異的なキャプチャーオリゴを固定化したスポットのみで発色が認められ、非特異的な発色は全く認められなかったことを示すものである。したがって、本実施例において作製した細菌検出器具は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ属、Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属を特異的に検出でき、かつ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉを含む）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｅａｅ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉの基準株を含む）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓおよびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓを種特異的に検出できる細菌検出器具であることが確認された。
【０１１２】
【表６】
【０１１３】
【表７】
【０１１４】
【表８】
【０１１５】
【表９】
【０１１６】
【表１０】
【０１１７】
【表１１】
【０１１８】
【表１２】
【０１１９】
【表１３】
【０１２０】
【表１４】
【０１２１】
【表１５】
【０１２２】
【表１６】
【０１２３】
【表１７】
【０１２４】
【表１８】
【０１２５】
【表１９】
【０１２６】
【表２０】
【０１２７】
【表２１】
【０１２８】
【表２２】
【０１２９】
【表２３】
【０１３０】
【表２４】
【０１３１】
【表２５】
【０１３２】
【表２６】
【０１３３】
【表２７】
【０１３４】
【表２８】
【０１３５】
【表２９】
【０１３６】
【表３０】
【０１３７】
【表３１】
【０１３８】
【表３２】
【０１３９】
【表３３】
【０１４０】
【表３４】
【０１４１】
【表３５】
【０１４２】
なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０１４３】
本発明に係る細菌検出器具は、対象となる細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されており、当該オリゴヌクレオチドと被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより、被検試料中の細菌を検出・同定することが可能となる。それゆえ、本発明によれば、正確かつ簡便に細菌の検出・同定を行うことができるという効果を奏する。
【０１４４】
また、基板表面に複数の細菌種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドを固定化しておけば、網羅的な検査を行うことができるという効果を奏する。
【０１４５】
さらに、本発明に係る細菌検出キットは、上記細菌検査器具および必要な試薬を含むものであるため、操作性が向上し、一層簡便に細菌の検出・同定を行うことができるという効果を奏する。
【０１４６】
本発明は、食品製造業、飲食産業、薬品産業等における衛生管理、工程管理、品質管理に利用することが可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌検出器具、細菌検出方法および細菌検出キットに関するものであり、具体的には、細菌に特異的なオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化された細菌検出器具と、これを用いた極めて正確かつ操作性の高い細菌検出方法および細菌検出キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
例えば、麦芽アルコール飲料中に有害な微生物が混入した場合、濁りや風味劣化などが生じ、品質劣化の原因となる。より具体的には、例えばビールにおいては、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ペクチネータス属（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）等が代表的な有害細菌である。中でもラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）はビール汚染菌として有名である。これらの有害細菌を検出する方法として、現在最も一般的なものは、対象となるビールをメンブランフィルターでろ過後、適当な培地中で培養し、生育するコロニーを検出する方法である。
【０００３】
さらに、このコロニーが上記有害細菌であるかどうかを判定する方法としては、コロニーから抽出したＤＮＡを鋳型として、上記有害細菌に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物が得られるかどうかを電気泳動で判定する方法（例えば、特開平７−２８９２９５号公報（公開日：平成７年１１月７日）参照）が用いられている。しかしながら、この方法では、菌種ごとに多数のプライマーを用いてＰＣＲを複数回行う必要があるため、操作が極めて煩雑であり、迅速性に問題がある。また、要する時間を短縮するために多数のプライマーを混合して１つのチューブで増幅反応を行うことは可能であるが、使用できるプライマーの数には限界があり、微量な検体に基づいて正確な判定を行う事は困難である。
【０００４】
上記問題点を解決するために、それぞれの菌種に普遍的に存在している遺伝子の種特異的な配列を含む部分が増幅されるようにプライマーを設計し、増幅後に種特異的な配列を認識する制限酵素で増幅産物を切断し、電気泳動で得られるバンドサイズからどの菌種の遺伝子であるかを特定する方法が用いられている。しかしながら、必ずしも対象となる全ての菌種について判別可能な制限酵素が存在するとは限らず、また、得られた増幅産物を数種類の制限酵素で各々切断し、電気泳動に供するという極めて煩雑な操作が必要であり、迅速性、簡便性という面では問題がある。
【０００５】
さらに、上記のような問題点を解決するために、種特異的な配列をプローブとして用い、被検体中のＤＮＡまたはＲＮＡにその配列と相補的な配列が存在するかどうかをハイブリダイゼーションによって判定する方法も行われている。
【０００６】
しかしながら、上記ハイブリダイゼーションによって判定する方法でも、非常に近縁でＤＮＡの相同性が高い菌種では、別の種と誤ってハイブリダイズしてしまうクロスハイブリダイゼーションが頻繁に生じるという問題があり、正確に菌種を同定することが困難となる場合も生じる。
【０００７】
特に、上述の代表的なビール汚染菌であるラクトバチルス属に属する種には非常に近縁なものが多いため、クロスハイブリダイゼーションが頻繁に生じる方法を用いたのでは、有害細菌を検出・同定するという目的を達成することができない。
【０００８】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、特定の細菌の存在の有無を正確に判定するために用いることができるオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化された細菌検出器具と、当該細菌検出器具を用いて簡便な操作で迅速かつ正確に判定することができる細菌検出方法および細菌検出キットを提供することにある。
【発明の開示】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、麦芽アルコール飲料の代表的な汚染細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列において、特定の属または特定の種に特異的な配列を見出し、この塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドを基板表面に固定化した器具を用いて、被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより、迅速かつ正確に目的の細菌を検出・同定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち本発明に係る細菌検出器具は、被検試料中の細菌を検出・同定するための器具であって、対象となる細菌は（１）ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する細菌、（２）ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）に属する細菌、（３）ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌、（４）メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）に属する細菌、（５）ペクチネータス属（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）に属する細菌から選ばれる少なくとも２種類以上の細菌であり、対象となる細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されており、当該オリゴヌクレオチドと被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより被検試料中の細菌を検出・同定することを特徴としている。
【００１１】
本発明の（１）〜（５）の細菌は、例えば、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）は配列番号７〜９、および７１に示される塩基配列の全てを１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子中に含む細菌である。ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）は配列番号２２〜２４に示される塩基配列の全てを１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子中に含む細菌である。ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌は配列番号３６〜４５に示される塩基配列のうち少なくとも２つの塩基配列を１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子中に含む細菌である。メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）に属する細菌は配列番号５０〜５５に示される塩基配列のうち少なくとも２つの塩基配列を１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子中に含む細菌である。ペクチネータス属（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）に属する細菌は配列番号５６〜５８に示される塩基配列のうち少なくとも２つの塩基配列を１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子中に含む細菌である。
【００１２】
さらに、本発明に係る細菌検出器具の検出対象細菌としては、（６）ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌、（７）ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌、（８）ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）に属する細菌、（９）ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）に属する細菌、（１０）ラクトバチルス・コリニフォルミス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）に属する細菌、（１１）ラクトバチルス・カルバトス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）に属する細菌、（１２）ラクトバチルス・デルブリュッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）に属する細菌、（１３）ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に属する細菌、（１４）ラクトバチルス・マレファーメンタンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）に属する細菌、（１５）ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）グループ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｅａｅ）に属する細菌、（１６）ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）に属する細菌、（１７）ラクトバチルス・ブヒネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）に属する細菌、（１８）エンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）に属する細菌および（１９）ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）に属する細菌が含まれることが好ましい。
【００１３】
基板表面に固定化されるオリゴヌクレオチドとしては、以下に示すオリゴヌクレオチドであることが好ましく、本発明に係る細菌検出器具は、これらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ以上が基板表面に固定化されていることを特徴としている。
【００１４】
（Ａ）ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００１５】
（Ｂ）ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）の１６Ｓリボソー厶ＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号７１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００１６】
（Ｃ）ラクトバチルス・コリニフォルミス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号１０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号１１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号１２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００１７】
（Ｄ）ラクトバチルス・カルバトス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号１３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号１４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００１８】
（Ｅ）ラクトバチルス・デルブリュッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号１６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号１７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号１８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００１９】
（Ｆ）ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号１９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号２０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号２１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２０】
（Ｇ）ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号２２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号２３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号２４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２１】
（Ｈ）ラクトバチルス・マレファーメンタンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号２５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号２６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号２７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２２】
（Ｉ）ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）グループ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｅａｅ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号２８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号２９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、並びにラクトバチルス・ゼアエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｅａｅ、ただし、ラクトバチルス・カゼイの基準株を含む）に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号３０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号３１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２３】
（Ｊ）ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号３２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号３３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２４】
（Ｋ）ラクトバチルス・ブヒネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号３４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号３５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２５】
（Ｌ）ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号３６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号３７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号３８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号３９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号４５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２６】
（Ｍ）ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号４６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号４７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２７】
（Ｎ）ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号４８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号４９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２８】
（Ｏ）メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号５０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号５５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００２９】
（Ｐ）ペクチネータス属（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号５６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号５８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００３０】
（Ｑ）ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号５９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号６０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００３１】
（Ｒ）エンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号６１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号６２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００３２】
（Ｓ）ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドであって、配列番号６３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号６４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００３３】
（Ｔ）ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）の一部に属する細菌およびラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の一部に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列に共通する塩基配列のうち、配列番号７２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００３４】
上記（Ａ）〜（Ｔ）に記載のオリゴヌクレオチドを基板表面に固定化した細菌検出器具を用いることにより、食品中の汚染菌、特に麦芽アルコール飲料中の汚染菌を網羅的に検出・同定することが可能となる。
【００３５】
また、本発明に係る細菌検出器具は、上記基板表面にカルボジイミド基またはイソシアネート基を有し、当該カルボジイミド基またはイソシアネート基と上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド末端に付加されたリンカーとの反応により共有結合が形成されることが好ましい。
【００３６】
本発明に係る細菌検出方法は、被検試料中の細菌を検出・同定するための方法であって、被検試料中の細菌の核酸を調製する核酸調製工程と、当該核酸を鋳型として標識プローブを調製するプローブ調製工程と、上記プローブを、上記本発明に係る細菌検出器具の基板表面に固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるハイブリダイゼーション工程と、ハイブリダイゼーションシグナルを検出するシグナル検出工程とを含むことを特徴としている。
【００３７】
本発明に係る細菌検出方法の被検試料としては、食品が好適であり、なかでも麦芽アルコール飲料が最も適している。
【００３８】
本発明に係る細菌検出キットは、上記本発明に係る細菌検出方法を実施するためのキットであり、上記本発明に係る細菌検出器具が含まれる。さらに、ハイブリダイゼーション工程、シグナル検出工程、プローブ調製工程、核酸調製工程で用いる試薬を含むことが好ましい。
【００３９】
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１（ａ）】実施例において使用した、本発明に係る細菌検出器具の基板上に固定化されているオリゴヌクレオチドの配置を示した図である。
【図１（ｂ）】図１（ａ）に示された配置にオリゴヌクレオチドが固定化された細菌検出器具を用いてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓを検出した結果を示す画像である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【００４２】
（１）本発明に係る細菌検出器具
本発明に係る細菌検出器具は、被検試料中の細菌を検出・同定するための器具であって、対象となる細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されており、当該オリゴヌクレオチドと被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより被検試料中の細菌を検出・同定するものである。
【００４３】
〔基板〕
本発明に係る細菌検出器具に用いる基板の材質としては、オリゴヌクレオチドを安定して固定化することができるものであればよい。例えば、ポリカーボネートやプラスティックなどの合成樹脂、ガラス等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。基板の形態も特に限定されるものではないが、例えば、板状、フィルム状等の基板を好適に用いることができる。
【００４４】
〔基板表面に固定化されるオリゴヌクレオチド〕
本発明に係る細菌検出器具の基板表面に固定化されるオリゴヌクレオチドは、検出対象細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドであればよい。当該オリゴヌクレオチドと被検試料由来の核酸との間にハイブリダイゼーションが成立することにより、被検試料中に含まれている目的の種または属に属する細菌を検出することが可能となる。なお、上記検出対象細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドを、以下適宜「キャプチャーオリゴ」と称する。
【００４５】
上記特異的な塩基配列は、検出対象細菌のゲノムの塩基配列から属または種特異的な塩基配列を見出せばよいが、検出対象細菌のリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列から見出すことが好ましい。なかでも細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子は属または種特異的な塩基配列を多く有していることが知られており、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応するＤＮＡ配列中から属または種特異的な塩基配列を見出すことが特に好ましい。リボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ等のデータベース等から入手することができる。
【００４６】
キャプチャーオリゴは上記属または種特異的な塩基配列に基づいて設計すればよい。したがって、上記属または種特異的な塩基配列そのものであってもよいし、検出対象細菌から調製した核酸と特異的なハイブリダイゼーションが成立する限りにおいて、変異が含まれていてもよい。変異の位置は特に限定されるものではない。
【００４７】
キャプチャーオリゴの長さ（塩基数）は特に限定されるものではないが、短すぎるとハイブリダイゼーションの検出が困難になり、長すぎると非特異的ハイブリダイゼーションを許容してしまう。発明者らは、キャプチャーオリゴの長さの最適化について検討を重ね、標準的な長さを１２〜２４塩基とした。より好ましくは１３〜２２塩基である。ただし、これに限定されるものではない。塩基長は主として配列特性（特定の塩基の含有率，同一塩基のリピート）に依存するものであり、結合性の良いものは短鎖でも特異的ハイブリダイゼーションが可能であることが、発明者らにより確認されている。
【００４８】
キャプチャーオリゴが、被検試料由来の核酸とのハイブリダイゼーションを妨害するヘアピン構造、ループ構造、またはそれ以外の立体構造を持つ場合、キャプチャーオリゴを構成する１またはそれ以上のヌクレオチドをイノシンまたはいずれのヌクレオチドとも対合しない核酸に置換することにより、その立体構造を解除することができる。
【００４９】
キャプチャーオリゴの合成法は特に限定されるものではなく、公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の方法等）により合成すればよい。一般的には、市販のＤＮＡ合成機を用いて化学合成することができる。
【００５０】
本発明に係る細菌検出器具において、上記検出対象細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドのみではなく、それらに加えて、いわゆるコントロール・キャプチャーオリゴを基板表面に固定化することが好ましい。コントロール・キャプチャーオリゴには、陽性コントロール・キャプチャーオリゴおよび陰性コントロール・キャプチャーオリゴが含まれる。陽性コントロール・キャプチャーオリゴは、後述するプローブ調製工程において増幅反応がうまくいっているかどうかを判定するために用いるものである。陰性コントロール・キャプチャーオリゴは、非特異的ハイブリダイゼーションが生じていないこと、すなわち擬陽性のハイブリダイゼーションシグナルが生じていないことを確認するために用いるものである。これらの陽性コントロール・キャプチャーオリゴおよび陰性コントロール・キャプチャーオリゴが基板表面に固定化された細菌検出器具も本発明に含まれる。
【００５１】
陽性コントロール・キャプチャーオリゴは検出対象細菌から調製するプローブに含まれる塩基配列に基づいて設計されるものであればよい。また、複数の検出対象細菌を同時に同一の細菌検出器具を用いて検出する場合には、各検出対象細菌について陽性コントロール・キャプチャーオリゴを設計してもよいが、複数の検出対象細菌から調製するプローブに共通する塩基配列に基づいて設計してもよい。すべての検出対象細菌から調製するプローブに共通する塩基配列がない場合は、いくつかのグループごとに陽性コントロール・キャプチャーオリゴを設計してもよい。あるいは、プライマー配列部分が同じで、対象となる細菌の配列とは異なる人工的な配列を設計し、この配列の一部を陽性コントロール・キャプチャーオリゴとすることもできる。上記人工的な配列を鋳型としてプローブを調製し（本明細書では、このようなプローブをコントロールプローブと称する。）、被検試料から調製したプローブに添加することにより、ハイブリダイゼーションの特異性を検証することが可能となる。なお、上記プローブについては後述する。
【００５２】
陰性コントロール・キャプチャーオリゴは、陽性コントロール・キャプチャーオリゴの塩基配列において、１塩基以上であり、かつ、当該配列の有する塩基数の２０％未満の範囲内で人為的な塩基の置換を含む塩基配列を有するように設計することが好ましい。塩基置換を行う塩基数は、ハイブリダイゼーションの条件との関係で決定され、検出対象細菌由来のプローブがハイブリダイゼーションを生じないような塩基数を選択すればよい。
【００５３】
検出対象細菌は特に限定されるものではなく、目的とする被検試料中から検出しようとする細菌を適宜選択すればよい。例えば、食品中に混入し当該食品を汚染する可能性のある細菌を挙げることができる。なかでも麦芽アルコール飲料に混入・汚染する可能性のある細菌を検出対象細菌とすることが好ましい。食品中に有害な細菌が混入することは、公衆衛生上非常に大きな問題となる。また、ビールや発泡酒に代表される麦芽アルコール飲料においては、有害な細菌が混入した場合、濁りや風味劣化などの品質劣化の原因となるため、これらの有害細菌を迅速かつ正確に検出・同定する方法の開発が特に強く望まれている。
【００５４】
麦芽アルコール飲料を汚染する細菌としては、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）およびペクチネータス属（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）に属する細菌を挙げることができる。また、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌種としては、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・コリニフォルミス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ラクトバチルス・カルバトス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・マレファーメンタンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ブヒネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・ゼアエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉの基準株を含む）を挙げることができる。また、食品を汚染する細菌として、上記の他にロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）およびザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）に属する細菌、並びにエンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）およびラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）を挙げることができる。ただし、検出対象細菌はこれらに限定されるものではない。
【００５５】
上記例示した細菌を検出・同定するためのキャプチャーオリゴとしては、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）、ペクチネータス属（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）およびザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、各属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチド、およびラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・コリニフォルミス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ラクトバチルス・カルバトス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・マレファーメンタンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ブヒネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・ゼアエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉの基準株を含む）、エンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）およびラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、各細菌種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドを挙げることができる。具体的には、配列番号１〜６４、７１および７２に示されたいずれかの塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に特異的な塩基配列に基づくキャプチャーオリゴ（配列番号１〜６）、およびラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の一部とロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）の一部とに対応する塩基配列に基づくキャプチャーオリゴ（配列番号７２）により検出可能なラクトバチルス属細菌を表１に例示した。ただし、配列番号１〜６および７２に示されたいずれかの塩基配列を有するキャプチャーオリゴにより検出可能な細菌は、これらに限定されるものではない。
【００５７】
【表１】
【００５８】
ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）に特異的な塩基配列に基づくキャプチャーオリゴ（配列番号３６〜４５）により検出可能な細菌を表２に例示した。ただし、配列番号３６〜４５に示されたいずれかの塩基配列を有するキャプチャーオリゴにより検出可能な細菌は、これらに限定されるものではない。
【００５９】
【表２】
【００６０】
ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に特異的な塩基配列に基づくキャプチャーオリゴ（配列番号４６、４７）により検出可能な細菌を表３に例示した。ただし、配列番号４６または４７に示された塩基配列を有するキャプチャーオリゴにより検出可能な細菌は、これらに限定されるものではない。
【００６１】
【表３】
【００６２】
ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）に特異的な塩基配列に基づくキャプチャーオリゴ（配列番号４８、４９）、およびラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の一部とロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）の一部とに対応する塩基配列に基づくキャプチャーオリゴ（配列番号７２）により検出可能なロイコノストック属細菌を表４に例示した。ただし、配列番号４８、４９および７２に示されたいずれかの塩基配列を有するキャプチャーオリゴにより検出可能な細菌は、これらに限定されるものではない。
【００６３】
【表４】
【００６４】
メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）に特異的な塩基配列に基づくキャプチャーオリゴ（配列番号５０〜５５）により検出可能な細菌としては、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｍｉｃｒｏｎｕｃｉｆｏｒｍｉｓを挙げることができる。ただし、配列番号５０〜５５に示されたいずれかの塩基配列を有するキャプチャーオリゴにより検出可能な細菌は、これらに限定されるものではない。
【００６５】
ペクチネータス属（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）に特異的な塩基配列に基づくキャプチャーオリゴ（配列番号５６〜５８）により検出可能な細菌としては、Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉｉｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓを挙げることができる。ただし、配列番号５６〜５８に示されたいずれかの塩基配列を有するキャプチャーオリゴにより検出可能な細菌は、これらに限定されるものではない。
【００６６】
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）に特異的な塩基配列に基づくキャプチャーオリゴ（配列番号５９、６０）により検出可能な細菌としては、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｐｏｍａｃｅａｅを挙げることができる。ただし、配列番号５９または６０に示された塩基配列を有するキャプチャーオリゴにより検出可能な細菌は、これらに限定されるものではない。
【００６７】
本発明に係る細菌検出器具の基板表面に固定化されるキャプチャーオリゴは、対象とする細菌から調製されたプローブとハイブリダイゼーションが成立するものであれば特に限定されるものではない。したがって、上記配列番号１〜６４、７１および７２に示されたいずれかの塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１〜６４、７１および７２に示されたいずれかの塩基配列のみからなるものであってもよく、配列番号１〜６４、７１および７２に示されたいずれかの塩基配列以外の配列を含むものであってもよい。配列番号１〜６４、７１および７２に示されたいずれかの塩基配列以外の配列を含むキャプチャーオリゴとしては、配列番号１〜６４、７１および７２に示された各塩基配列の５’側もしくは３’側またはその両方に対して、各々の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいて伸長させた塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができ、このようなオリゴヌクレオチドを基板表面に固定化された細菌検出器具も本発明に含まれる。
【００６８】
１つの基板上に固定化するキャプチャーオリゴは、少なくとも１種類以上であればよく、特に上限はない。一般に、試料中に混入した細菌を検出する場合は、被検試料中から検出可能な細菌を１つの基板で網羅的に検出できることが、操作の簡便性および検査の迅速性の観点から好ましいといえる。したがって、本発明に係る細菌検出器具も、１つの基板上に目的の細菌種または属に対応するキャプチャーオリゴを複数固定化した、いわゆるマイクロアレイ型の器具とすることが最も好ましい。例えば、麦芽アルコール飲料を被検試料とする場合には、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）、ペクチネータス属（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）等に属する細菌に対応したキャプチャーオリゴを基板表面に固定化することが好ましい。
【００６９】
〔オリゴヌクレオチド（キャプチャーオリゴ）の固定化〕
オリゴヌクレオチドの基板表面への固定化法は特に限定されるものではなく、公知の方法を適宜選択して用いればよい。例えば、物理的吸着、電気的結合または分子共有結合などの一般的なハイブリダイゼーション法に用いられる手法が利用可能である。本発明に係る細菌検出器具においては、表面にカルボジイミド基またはイソシアネート基を有する基材を使用し（米国特許：ＵＳ５，９０８，７４６、特開平８−２３９７５号）、固定化することが好ましい。
【００７０】
オリゴヌクレオチドをスポッティングする際に、オリゴヌクレオチドのスポット量が少なすぎると、オリゴヌクレオチドとプローブとの間の反応性を十分に確保することができず、判定が困難になることがある。また、高集積度のスポッティングは技術的な問題と同時にコストがかかり、さらにプローブの蛍光標識や化学発色などを用いたハイブリダイゼーションシグナルの検出にもより精密で高額な検出装置（例えば、スキャナー）が必要となる。したがって、オリゴヌクレオチドは、基板の表面に径１０〜１，０００μｍのサイズに固定することが好ましい。オリゴヌクレオチドの基板上へのスポッティング方法は特に限定されるものではない。例えば、スポッティングマシンを使用して基板上にオリゴヌクレオチド溶液をスポッティングすることにより行うことができる。これによりオリゴヌクレオチド溶液は、通常ほぼ円形にスポッティングされる。
【００７１】
（２）本発明に係る細菌検出方法
本発明に係る細菌検出方法は、被検試料中の細菌の核酸を調製する核酸調製工程と、当該核酸を鋳型として標識プローブを調製するプローブ調製工程と、対象となる細菌が属する種または属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドと上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行うハイブリダイゼーション工程と、ハイブリダイゼーションシグナルを検出するシグナル検出工程とを含む、被検試料中の細菌を検出・同定するための方法である。本検出方法のハイブリダイゼーション工程においては、上記本発明に係る細菌検出器具を用いることが好ましい。当該細菌検出器具を用いることにより、簡便、迅速かつ正確に網羅的な検出・同定を行うことが可能となる。また、本検出方法の被検試料としては、食品であることが好ましく、麦芽アルコール飲料であることが特に好ましい。以下各工程に分けて詳細に説明する。
【００７２】
〔核酸調製工程〕
被検試料中の細菌の核酸を調製する工程である。被検試料からの核酸の調製法は、公知の核酸の調製法を適宜選択して用いることができる。例えば、ＤＮＡの調製は、Ｒ−Ｆ．Ｗａｎｇが紹介する方法に従って抽出することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（２０００）１４，１−５）。この方法は標準的な調製法であるが、多くの代替法があり、いずれを採用してもよいことはいうまでもない。また、市販のキットを使用してもよい。
【００７３】
〔プローブ調製工程〕
上記核酸調製工程で調製した核酸を鋳型として標識プローブを調製する工程である。プローブは、例えば、キャプチャーオリゴおよび陽性コントロール・キャプチャーオリゴの塩基配列を含むよう設計されたプライマーを使用して核酸増幅により作製することができる。核酸増幅の方法としては、例えば、ＰＣＲによりＤＮＡとして増幅する方法、あるいはインビトロ・トランスクリプション（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）法によりＲＮＡとして増幅する方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
例えば、ＰＣＲにより標識プローブを調製する場合には、ＰＣＲに用いるプライマーは、プローブがキャプチャーオリゴおよび陽性コントロール・キャプチャーオリゴと相補的な塩基配列を含むように設計される。なお、ハイブリダイゼーションが可能である限りにおいて、プローブはキャプチャーオリゴまたは陽性コントロール・キャプチャーオリゴよりも長くても短くてもよい。標識プローブを得るために、ＰＣＲに用いるプライマーを予め標識しておくことが可能である。また、ＰＣＲの基質（デオキシヌクレオシド三リン酸）を標識しておくことにより標識プローブを得ることもできる。あるいはＰＣＲ終了後にプローブを標識してもよい。標識物質は特に限定されるものではなく、例えば、蛍光物質、ハプテン、放射性物質等、通常のハイブリダイゼーションに用いるプローブと同様の標識物質を使用することができる。具体的には、蛍光物質としてはフルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ローダミン（Ｒｏｄａｍｉｎｅ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、シアニン系蛍光色素等が、ハプテンとしてはビオチン（ＢＩＯＴＩＮ）、ジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、フルオレセイン等を挙げることができる。
【００７５】
〔ハイブリダイゼーション工程〕
ハイブリダイゼーション工程は、対象となる細菌が属する種または属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドと上記標識プローブとのハイブリダイゼーションを行う工程である。ハイブリダイゼーションは上記オリゴヌクレオチドを固定化したメンブレン上等で行うことができるが、本発明に係る細菌検出器具を用いることが好ましい。当該細菌検出器具を用いることにより、簡便、迅速かつ正確に網羅的な検出・同定を行うことが可能となる。ハイブリダイゼーション工程に用いる方法は特に限定されるものではなく、公知の核酸ハイブリダイゼーション方法を適宜選択して用いることができる。以下に、具体的なハイブリダイゼーション方法の一例を示す。
【００７６】
ＳＳＣ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｃｉｔｒａｔｅ）などの塩溶液、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのブロッキング溶液、および融合反応促進のための添加剤からなる融合液に、標識プローブを加える。プローブが２本鎖の場合は熱等による変性を行う。基板上に標識プローブ液を数μＬ添加した後、数時間加熱操作（通常３７〜５０℃）を行い、基板上に固定化されているオリゴヌクレオチドと標識プローブ間でハイブリッドを形成させる。その後、基板上に５×ＳＳＣまたは３Ｍテトラメチルアンモニウムクロライドを加えて加熱し（通常３７〜５０℃）、特異的なハイブリッドを形成していない標識プローブを基板から剥離させ、特異的なハイブリッドのみを選択的に基板上に残す。
【００７７】
〔シグナル検出工程〕
シグナル検出工程は、上記ハイブリダイゼーション工程においてハイブリダイゼーションの成立の有無を判定する工程であり、通常上記ハイブリダイゼーション工程と連続的に行われる。
【００７８】
ハイブリッド検出工程で用いる方法は、上記プローブ調製工程で調製したプローブに導入された標識物質に依存する。すなわち、ハイブリッドの検出には、プローブに導入されている蛍光物質、ハプテン等の標識物質を使用する。したがって、用いたプローブに導入した標識物質を検出するための公知の方法を適宜選択して使用すればよい。
【００７９】
例えば、ハプテンを使用する場合は、ハプテンを認識するタンパクまたはそれに結合するタンパクと、アルカリフォスファターゼまたはホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ等の結合体（酵素コンジュゲート）を含む溶液を基板上に加え、室温で数１０分間反応させる。なお、このハプテンと酵素コンジュゲートの結合反応を行う前に、オリゴヌクレオチドを固定した領域以外の基板の領域をカゼインなどのタンパクを用いて完全に被覆することによって、酵素コンジュゲートと基板の非特異的吸着反応を阻止することができる。これは、オリゴヌクレオチドを固定した後に基板上にカゼインなどのタンパクの溶液を加え、室温で数１０分間放置することによって行うことができる。酵素コンジュゲートとプローブ中のハプテンとの結合反応終了後、ハプテンと結合しなかった酵素コンジュゲートを、界面活性剤を含む適当な緩衝液で洗浄し排除する。これによって、基板上にはプローブ中のハプテンと結合した酵素コンジュゲートのみが残ることになる。
【００８０】
ハイブリッドの視覚化には、ハプテンと酵素コンジュゲート結合体のみが存在する場合にのみ不溶化合物が形成されるような化合物を添加する。その不溶性化合物の生成は、酵素反応によって増幅され可視化される。添加される化合物として、酵素コンジュゲート中の酵素がアルカリフォスファターゼの場合には、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）とＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸−ｐトルイジン塩）が用いられ、酵素がホースラディッシ・ペルオキシダーゼの場合には、ＴＭＢ（３，３’，５，５’テトラメチルベンチジン）などが用いられる。
【００８１】
キャプチャーオリゴを固定化した位置におけるハイブリッドの色素沈着または蛍光発色等のハイブリダイゼーションシグナルを見ることによって、被検試料中に含まれる細菌種の判定を行う。すなわち、ハイブリダイゼーションシグナルが検出された場合には、当該シグナルがある位置にスポットされたオリゴヌクレオチドに対応する細菌が、被検試料中に含まれていることを意味する。なお、陽性コントロール・キャプチャーオリゴの位置にシグナルが認められれば、本試験が正常に機能していることが確認でき、陰性コントロール・キャプチャーオリゴの位置にシグナルが認められなければ、ハイブリダイゼーションが適当な条件で行われたことが確認できる。
【００８２】
（３）本発明に係る細菌検出キット
本発明に係る細菌検出キットは、上述の本発明に係る細菌検出方法を実施するためのキットである。したがって、本発明に係る細菌検出方法を実施できるものであれば、キットに含まれる構成は特に限定されるものではない。
【００８３】
本細菌検出キットは、本発明に係る細菌検出器具を含むものであることが好ましい。当該細菌検出器具を含むキットとすることにより、簡便、迅速かつ正確に網羅的な検出・同定を行うことが可能となる。また、本細菌検出キットには、上記ハイブリダイゼーション工程およびシグナル検出工程で使用する試薬を含むことが好ましい。ハイブリダイゼーション工程で用いる試薬としては、例えば、ＳＳＣ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｃｉｔｒａｔｅ）などの塩溶液、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのブロッキング溶液、融合反応促進のための添加剤等を挙げることができ、シグナル検出工程で使用する試薬としては、例えば、ハプテンを認識するタンパクと酵素との結合体（酵素コンジュゲート）や、ＮＢＴ、ＢＣＩＰ、ＴＭＢ等の発色基質等を挙げることができるが、これに限定されるものではなく、目的に適合するように適宜適切な試薬を選択してキットの構成とすればよい。
【００８４】
本細菌検出キットには、上記プローブ調製工程で使用する試薬を含むことが好ましく、さらに、上記核酸調製工程で使用する試薬を含むことが好ましい。プローブ調製工程で使用する試薬としては、例えば、ＰＣＲ用緩衝液、耐熱性ＤＮＡ合成酵素、デオキシヌクレオシド三リン酸混合液等を挙げることができ、核酸調製工程で使用する試薬としては、溶菌用緩衝液、ＤＮＡ回収用カラム、ＤＮＡ抽出用緩衝液等を挙げることができる。ただしこれに限定されるものではなく、目的に適合するように適宜適切な試薬を選択してキットの構成とすればよい。
【００８５】
本発明に係るキット（本発明に係る細菌検出器具および各工程に使用する試薬を含むもの）を用いることにより、被検試料受領後約６時間で被検試料中に含まれる細菌の検出・同定を実施することができる。
【００８６】
（４）本発明の用途
本発明に係る細菌検出器具、細菌検出方法および細菌検出キットの用途は特に限定されるものではなく、細菌の判定が必要な用途全てに用いることができる。具体的には、例えば、細菌による汚染が品質に大きな影響を及ぼす各種工業製品の製造工程で、同工業製品やその製造環境等から分離された細菌を迅速かつ正確に検出・同定する必要がある場合に好適に用いられる。
【００８７】
判定の対象となる被判定細菌の由来となる上記工業製品としては、代表的なものとして、食品、飲料、医薬品・試薬・医薬部外品、使い捨ての医療用器具等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。本発明は上記例示した工業製品のなかでの食品に応用することが好ましい。食品としては、より具体的には、パン、和洋菓子（冷菓等も含む）、惣菜食品、乳製品、シリアル食品、豆腐・油揚げ類、麺類、弁当類、調味料、小麦粉や食肉等の農産加工品、栄養補助食品（サプリメント等）、長期保存食品（缶詰、冷凍食品、レトルト食品等）等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００８８】
本発明は、上記例示した食品のなかでも、特に麦芽アルコール飲料に好適に応用することができる。麦芽アルコール飲料としては、ビール、発泡酒等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【実施例】
【００８９】
〔オリゴヌクレオチドの合成〕
定法に従い、オリゴヌクレオチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ−ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、脱保護を施した後乾燥させた。このオリゴヌクレオチド乾燥体を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）・１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液を用いて溶解し、１００ｐｍｏｌ／μＬのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。本実施例に使用したすべてのオリゴヌクレオチドはこの方法で合成した。合成したオリゴヌクレオチドの塩基配列を配列番号１〜７２に示した。これらのうち、配列番号１〜６４、７１および７２がキャプチャーオリゴであり、配列番号６５が検出対象細菌に対する陽性コントロール・キャプチャーオリゴであり、配列番号６６が陰性コントロール・キャプチャーオリゴであり、配列番号６７〜６８がプライマーであり、配列番号６９がコントロールプローブであり、配列番号７０がコントロールプローブに対する陽性コントロール・キャプチャーオリゴある。キャプチャーオリゴヌクレオチドについては上記合成機を用いて５’末端にアミノ基を結合させ、プライマーは５’末端にビオチンを結合させた。
【００９０】
〔基板へのキャプチャーオリゴヌクレオチドのスポッティング〕
５’末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチド溶液１０μＬに対してマイクロスポッティング溶液（ＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．製）を１０μＬ混合し、マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｃ．製）上に分注した。スポッティングマシンの所定の位置にカルボジイミド樹脂処理スライドグラスＣａｒｂｏｓｔａｔｉｏｎ（日清紡績株式会社製）を配置し、スポッティングマシンを作動させた。スポッティング終了後、スライドグラスに熱水からの蒸気を数秒間あて、その後紫外線を６００ｍＪ照射した。再度蒸気に数秒間曝露した後、ホットプレート上にスライドグラスを置いて水分を除去した。スライドグラスを３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）・１００ｍＭ ＮａＣｌ・０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に室温で３０分間浸し、ブロッキングした。その後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）・１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液で洗浄した。スライドグラスを室温で乾燥させ、使用まで乾燥状態で冷暗所にて保存した。図１（ａ）に、本実施例で実際に使用した細菌検出器具の基板上に固定化されているオリゴヌクレオチドの配置を示した。
【００９１】
〔核酸調製工程〕
検体として用いた細菌はラクトバチルス属１４種、ペディオコッカス属５種、ストレプトコッカス属１種、ロイコノストック属１種、メガスフェラ属３種、ペクチネータス属２種、ザイモモナス属２種、エンテロコッカス属１種、ラクトコッカス属１種の合計３０種類の細菌である。検体として用いた細菌を表５に示した。
【００９２】
【表５】
【００９３】
これらの各細菌に最適な培養条件で培養した菌液から、Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆ． Ｋｉｔ（ＥｄｇｅＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ製、Ｃａｔ．Ｎｏ．＃８５１７１）を用いて各細菌のゲノムＤＮＡをそれぞれ調製した。
【００９４】
〔プローブ調製工程〕
得られた各細菌のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによりプローブ核酸を調製した。ＰＣＲ反応液の組成は、Ｔａｑポリメラーゼ：１ｕｎｉｔ、ビオチン化プライマー（配列番号６８および６９）：各１０ｐｍｏｌ、反応用緩衝液（１０×）：５μＬ、ｄＮＴＰ：各１０ｎｍｏｌ、鋳型ＤＮＡ：１００ｎｇに滅菌蒸留水を加えて総量５０μＬとした。サーマルサイクラーを用いて、９５℃で３分間保持した後、９５℃：３０秒間、５５℃：１５秒間、７２℃：１分間の反応を３０サイクル行い、７２℃で５分間保持して反応を終了した。
【００９５】
また、プライマー配列部分が同じで対象となる細菌の配列とは異なる人工的な配列を設計し、これをコントロールプローブとした。これを鋳型としてＰＣＲを行い、ビオチン化コントロールプローブを調製した。ＰＣＲ反応液の組成は、鋳型ＤＮＡを１ｎｇとした点を除いて上記と同様である。また、反応温度およびサイクル数は上記と同一である。プローブの精製は行わず、ＰＣＲ反応液をそのままプローブ溶液として、以下のハイブリダイゼーション工程で使用した。
【００９６】
〔ハイブリダイゼーション工程およびシグナル検出工程〕
上記プローブ核酸溶液３μＬと、ビオチン化コントロールプローブ溶液１μＬと、Ａｒｒａｙｌｔ Ｕｎｉｈｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．製）１６μＬとを加えて混合し、１００℃で１分間加熱処理を行った後、氷中に５分間浸した。このプローブ核酸溶液を全量とり、キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定化した基板に載せ、その上にカバーグラスを載せた。これを保湿箱に入れ、３７℃に設定した恒温器中に１２０分間静置した。基板を取り出し、すばやく室温下で２×ＳＳＣ溶液（２×ＳＳＣ：０．０３３ＭＮａＣｌ、０．０３３Ｍクエン酸ナトリウム）に浸してカバーグラスを除去し、３７℃に保温した２×ＳＳＣ中に５分間浸した。
【００９７】
基板を２×ＳＳＣから取り出し、遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）にセットして、２，０００ｒｐｍで１分間遠心した。次にＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ ｋｉｔ（ＶＥＣＴＯＲ社製）を用いてアビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体を作製し基板上に１．４ｍＬ滴下し、室温で３０分間静置した。その後、ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、０．９％塩化ナトリウム）中で洗浄した。ＴＭＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｋｉｔ ｆｏｒ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＶＥＣＴＯＲ社）を用いて発色溶液を作製し、基板上に１．４ｍＬ滴下して室温で３０分間静置した。基盤を蒸留水で洗浄して発色反応を止めた。
【００９８】
〔判定〕
ＥＰＳＯＮ社製スキャナーＧＴ−８７００Ｆおよびその透過型ユニットを用いてハイブリダイゼーションを行った領域を６００ｄｐｉにてスキャンし、スキャン画像を目視により発色の有無を確認した。図１（ｂ）にスキャン画像の一例として、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓのスキャン画像を示した。なお、図１（ａ）は基板上のオリゴヌクレオチドの配置を示している。
【００９９】
〔結果〕
検体として用いた３０種類の各細菌についての結果を表６〜３５に示した。各表とも○印が発色の確認されたスポットを表し、−印が発色の確認されなかったスポットを表す。表６〜３５から明らかなように全ての場合、コントロールプローブではそれに対する陽性コントロール・キャプチャーオリゴ（配列番号７０）に発色が見られ、また、陰性コントロール・キャプチャーオリゴでは発色が認められず、増幅およびハイブリダイゼーションの工程が共に正常に機能していることが確認された。また、全ての細菌に対して陽性コントロール・キャプチャーオリゴ（配列番号６５）で発色が確認された。このことより細菌より調整した核酸が増幅されていることも確認された。なお、以下の結果の説明においては陽性コントロール・キャプチャーオリゴ（配列番号６５および７０）の発色は含めないものとする。
【０１００】
表６にはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓの結果を示した。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓは１個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号１）と、４個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号７、８、９、７１）との合計５箇所のみで発色が確認された（図１参照）。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ（表８）は、１個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号５）と、２個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号１３、１４）との合計３箇所のみで発色が確認された。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ（表７）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ（表９）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ（表１１）およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ（表１２）は、６個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号１〜６）のうちいずれか１個所と、各細菌に対応する３個所の種特異的キャプチャーオリゴとの合計４個所のみに発色が認められた。
【０１０１】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ（表１０）は、１個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号６）と、１個所のＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属の一部およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の一部検出用キャプチャーオリゴ（配列番号７２）と、３個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号１９〜２１）との合計５個所のみに発色が認められた。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ（表１３）は、２個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号３、４）と、２個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号２８、２９）との合計４個所のみに発色が認められた。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ（表１４）は、２個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号３、４）と、２個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号３２、３３）との合計４個所のみに発色が認められた。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ（表１５）は、１個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号１）と、２個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号３４、３５）との合計３個所のみに発色が認められた。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｅａｅ（表１９）は、２個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号３、４）と、２個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｅａｅ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号３０、３１）との合計４個所のみに発色が認められた。
【０１０２】
また、種特異的キャプチャーオリゴが設計されていないＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ（表１６）およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ（表１８）は、６個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号１〜６）のうちいずれか１個所のみに発色が認められた。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｉｔｔａｃｉ（表１７）は、１個所のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号６）とＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属の一部およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の一部検出用キャプチャーオリゴ（配列番号７２）の合計２個所のみに発色が認められた。
【０１０３】
Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｄａｍｎｏｓｕｓ（表２０）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ（表２１）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ（表２２）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｄｅｘｔｒｉｎｉｃｕｓ（表２３）およびＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｕｒｉｎａｅｅｑｕｉ（表２４）は１０個所のＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号３６〜４５）のうちいずれか２個所のみに発色が認められた。
【０１０４】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ（表２５）は２個所のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号４６、４７）のみに発色が認められた。
【０１０５】
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ（表２６）は２個所のＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号４８、４９）と、１個所のＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属の一部およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の一部検出用キャプチャーオリゴ（配列番号７２）の合計３箇所のみに発色が認められた。
【０１０６】
Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｃｅｒｅｃｉｓｉａｅ（表２７）、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ（表２８）およびＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｍｉｃｒｏｎｕｃｉｆｏｒｍｉｓ（表２９）は６個所のＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号５０〜５５）のうちいずれか２個所のみに発色が認められた。
【０１０７】
Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉｉｐｈｉｌｓ（表３０）およびＰｅｃｔｉｎａｔｕｓ ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓ（表３１）は３個所のＰｅｃｔｉｎａｔｕｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号５６〜５８）のうちいずれか２個所のみに発色が認められた。
【０１０８】
Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ（表３２）およびＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｐｏｍａｃｅａｅ（表３３）は２個所のＺｙｍｏｍｏｎａｓ属検出用キャプチャーオリゴ（配列番号５９、６０）にのみ発色が認められた。
【０１０９】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ（表３４）は２個所のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号６１、６２）のみに発色が認められた。
【０１１０】
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ（表３５）は２個所のＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ検出用キャプチャーオリゴ（配列番号６３、６４）のみに発色が認められた。
【０１１１】
以上の結果は、検体として用いた各細菌において、各細菌に特異的なキャプチャーオリゴを固定化したスポットのみで発色が認められ、非特異的な発色は全く認められなかったことを示すものである。したがって、本実施例において作製した細菌検出器具は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ属、Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属を特異的に検出でき、かつ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉを含む）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｚｅａｅ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉの基準株を含む）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓおよびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓを種特異的に検出できる細菌検出器具であることが確認された。
【０１１２】
【表６】
【０１１３】
【表７】
【０１１４】
【表８】
【０１１５】
【表９】
【０１１６】
【表１０】
【０１１７】
【表１１】
【０１１８】
【表１２】
【０１１９】
【表１３】
【０１２０】
【表１４】
【０１２１】
【表１５】
【０１２２】
【表１６】
【０１２３】
【表１７】
【０１２４】
【表１８】
【０１２５】
【表１９】
【０１２６】
【表２０】
【０１２７】
【表２１】
【０１２８】
【表２２】
【０１２９】
【表２３】
【０１３０】
【表２４】
【０１３１】
【表２５】
【０１３２】
【表２６】
【０１３３】
【表２７】
【０１３４】
【表２８】
【０１３５】
【表２９】
【０１３６】
【表３０】
【０１３７】
【表３１】
【０１３８】
【表３２】
【０１３９】
【表３３】
【０１４０】
【表３４】
【０１４１】
【表３５】
【０１４２】
なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０１４３】
本発明に係る細菌検出器具は、対象となる細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されており、当該オリゴヌクレオチドと被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより、被検試料中の細菌を検出・同定することが可能となる。それゆえ、本発明によれば、正確かつ簡便に細菌の検出・同定を行うことができるという効果を奏する。
【０１４４】
また、基板表面に複数の細菌種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドを固定化しておけば、網羅的な検査を行うことができるという効果を奏する。
【０１４５】
さらに、本発明に係る細菌検出キットは、上記細菌検査器具および必要な試薬を含むものであるため、操作性が向上し、一層簡便に細菌の検出・同定を行うことができるという効果を奏する。
【０１４６】
本発明は、食品製造業、飲食産業、薬品産業等における衛生管理、工程管理、品質管理に利用することが可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中の細菌を検出・同定するための器具であって、
対象となる細菌は以下の（１）〜（５）に記載の細菌から選ばれる少なくとも２種類以上の細菌であり、
対象となる細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されており、
当該オリゴヌクレオチドと被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより被検試料中の細菌を検出・同定することを特徴とする細菌検出器具。
（１）ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する細菌
（２）ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）に属する細菌
（３）ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌
（４）メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）に属する細菌
（５）ペクチネータス属（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）に属する細菌
【請求項２】
上記対象となる細菌には、さらに以下の（６）〜（１９）に記載の細菌が含まれることを特徴とする請求項１に記載の細菌検出器具。
（６）ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌
（７）ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌
（８）ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）に属する細菌
（９）ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）に属する細菌
（１０）ラクトバチルス・コリニフォルミス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）に属する細菌
（１１）ラクトバチルス・カルバトス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）に属する細菌
（１２）ラクトバチルス・デルブリュッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）に属する細菌
（１３）ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に属する細菌
（１４）ラクトバチルス・マレファーメンタンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）に属する細菌
（１５）ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）グループに属する細菌
（１６）ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）に属する細菌
（１７）ラクトバチルス・ブヒネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）に属する細菌
（１８）エンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）に属する細菌
（１９）ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）に属する細菌
【請求項３】
ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項４】
ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号７１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１または２に記載の細菌検出器具。
【請求項５】
ラクトバチルス・コリニフォルミス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号１０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号１１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号１２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項６】
ラクトバチルス・カルバトス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号１３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号１４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項７】
ラクトバチルス・デルブリュッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号１６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号１７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号１８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項８】
ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号１９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号２０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号２１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項９】
ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号２２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号２３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号２４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１または２に記載の細菌検出器具。
【請求項１０】
ラクトバチルス・マレファーメンタンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号２５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号２６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号２７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項１１】
ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）グループの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号２８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号２９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号３０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号３１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項１２】
ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の１６Ｓリボソー厶ＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号３２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号３３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項１３】
ラクトバチルス・ブヒネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号３４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号３５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項１４】
ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号３６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号３７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号３８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号３９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号４５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１または２に記載の細菌検出器具。
【請求項１５】
ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号４６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号４７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項１６】
ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号４８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号４９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項１７】
メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号５０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号５５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１または２に記載の細菌検出器具。
【請求項１８】
ペクチネータス属（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号５６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号５８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１または２に記載の細菌検出器具。
【請求項１９】
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号５９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号６０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項２０】
エンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号６１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号６２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項２１】
ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号６３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号６４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項２２】
上記基板表面にカルボジイミド基またはイソシアネート基を有し、当該カルボジイミド基またはイソシアネート基と上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド末端に付加されたリンカーとの反応により共有結合が形成されることを特徴とする請求項１ないし２１のいずれか１項に記載の細菌検出器具。
【請求項２３】
被検試料中の細菌を検出・同定するための器具であって、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）に属する細菌および／またはラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号７２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されており、当該オリゴヌクレオチドと被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより被検試料中の細菌を検出・同定することを特徴とする細菌検出器具。
【請求項２４】
被検試料中の細菌を検出・同定するための方法であって、
被検試料中の細菌の核酸を調製する核酸調製工程と、
当該核酸を鋳型として標識プローブを調製するプローブ調製工程と、
上記プローブを、請求項１ないし２３のいずれか１項に記載の細菌検出器具の基板表面に固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるハイブリダイゼーション工程と、
ハイブリダイゼーションシグナルを検出するシグナル検出工程とを含むことを特徴とする細菌検出方法。
【請求項２５】
上記被検試料が食品であることを特徴とする、請求項２４に記載の細菌検出方法。
【請求項２６】
上記食品が麦芽アルコール飲料であることを特徴とする、請求項２５に記載の細菌検出方法。
【請求項２７】
請求項２４ないし２６のいずれか１項に記載の細菌検出方法を実施するための細菌検出キット。
【請求項２８】
請求項２４ないし２６のいずれか１項に記載の細菌検出方法を実施するためのキットであって、上記ハイブリダイゼーション工程および／またはシグナル検出工程で用いる試薬を含むことを特徴とする細菌検出キット。
【請求項２９】
さらに、上記プローブ調製工程および／または上記核酸調製工程で用いる試薬を含む請求項２８に記載の細菌検出キット。
【請求項１】
被検試料中の細菌を検出・同定するための器具であって、
対象となる細菌は以下の（１）〜（５）に記載の細菌から選ばれる少なくとも２種類以上の細菌であり、
対象となる細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されており、
当該オリゴヌクレオチドと被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより被検試料中の細菌を検出・同定することを特徴とする細菌検出器具。
（１）ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に属する細菌
（２）ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）に属する細菌
（３）ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌
（４）メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）に属する細菌
（５）ペクチネータス属（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）に属する細菌
【請求項２】
上記対象となる細菌には、さらに以下の（６）〜（１９）に記載の細菌が含まれることを特徴とする請求項１に記載の細菌検出器具。
（６）ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌
（７）ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌
（８）ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）に属する細菌
（９）ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）に属する細菌
（１０）ラクトバチルス・コリニフォルミス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）に属する細菌
（１１）ラクトバチルス・カルバトス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）に属する細菌
（１２）ラクトバチルス・デルブリュッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）に属する細菌
（１３）ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に属する細菌
（１４）ラクトバチルス・マレファーメンタンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）に属する細菌
（１５）ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）グループに属する細菌
（１６）ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）に属する細菌
（１７）ラクトバチルス・ブヒネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）に属する細菌
（１８）エンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）に属する細菌
（１９）ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）に属する細菌
【請求項３】
ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項４】
ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号７１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１または２に記載の細菌検出器具。
【請求項５】
ラクトバチルス・コリニフォルミス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号１０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号１１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号１２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項６】
ラクトバチルス・カルバトス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号１３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号１４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項７】
ラクトバチルス・デルブリュッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号１６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号１７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号１８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項８】
ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号１９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号２０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号２１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項９】
ラクトバチルス・リンドネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号２２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号２３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号２４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１または２に記載の細菌検出器具。
【請求項１０】
ラクトバチルス・マレファーメンタンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号２５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号２６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号２７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項１１】
ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）グループの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号２８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号２９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号３０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号３１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項１２】
ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の１６Ｓリボソー厶ＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号３２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号３３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項１３】
ラクトバチルス・ブヒネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号３４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号３５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項１４】
ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号３６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号３７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号３８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号３９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号４５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１または２に記載の細菌検出器具。
【請求項１５】
ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号４６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号４７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項１６】
ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号４８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号４９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項１７】
メガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号５０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号５５に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１または２に記載の細菌検出器具。
【請求項１８】
ペクチネータス属（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号５６に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５７に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号５８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１または２に記載の細菌検出器具。
【請求項１９】
ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号５９に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号６０に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項２０】
エンテロコッカス・デュランス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号６１に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号６２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項２１】
ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、同種に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されている細菌検出器具であって、
当該オリゴヌクレオチドが、配列番号６３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号６４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１つ以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の細菌検出器具。
【請求項２２】
上記基板表面にカルボジイミド基またはイソシアネート基を有し、当該カルボジイミド基またはイソシアネート基と上記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド末端に付加されたリンカーとの反応により共有結合が形成されることを特徴とする請求項１ないし２１のいずれか１項に記載の細菌検出器具。
【請求項２３】
被検試料中の細菌を検出・同定するための器具であって、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）に属する細菌および／またはラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対応する塩基配列のうち、配列番号７２に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されており、当該オリゴヌクレオチドと被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより被検試料中の細菌を検出・同定することを特徴とする細菌検出器具。
【請求項２４】
被検試料中の細菌を検出・同定するための方法であって、
被検試料中の細菌の核酸を調製する核酸調製工程と、
当該核酸を鋳型として標識プローブを調製するプローブ調製工程と、
上記プローブを、請求項１ないし２３のいずれか１項に記載の細菌検出器具の基板表面に固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるハイブリダイゼーション工程と、
ハイブリダイゼーションシグナルを検出するシグナル検出工程とを含むことを特徴とする細菌検出方法。
【請求項２５】
上記被検試料が食品であることを特徴とする、請求項２４に記載の細菌検出方法。
【請求項２６】
上記食品が麦芽アルコール飲料であることを特徴とする、請求項２５に記載の細菌検出方法。
【請求項２７】
請求項２４ないし２６のいずれか１項に記載の細菌検出方法を実施するための細菌検出キット。
【請求項２８】
請求項２４ないし２６のいずれか１項に記載の細菌検出方法を実施するためのキットであって、上記ハイブリダイゼーション工程および／またはシグナル検出工程で用いる試薬を含むことを特徴とする細菌検出キット。
【請求項２９】
さらに、上記プローブ調製工程および／または上記核酸調製工程で用いる試薬を含む請求項２８に記載の細菌検出キット。
【図１（ａ）】
【図１（ｂ）】
【図１（ｂ）】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８０５９９
【国際公開日】平成１７年９月１日（２００５．９．１）
【発行日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１０３２３（Ｐ２００６−５１０３２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００３１５２
【国際出願日】平成１７年２月２５日（２００５．２．２５）
【出願人】（０００００１９０４）サントリー株式会社 (319)
【出願人】（０００００４３７４）日清紡績株式会社 (370)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年９月１日（２００５．９．１）
【発行日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００３１５２
【国際出願日】平成１７年２月２５日（２００５．２．２５）
【出願人】（０００００１９０４）サントリー株式会社 (319)
【出願人】（０００００４３７４）日清紡績株式会社 (370)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]