組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター
本発明は、MVウイルス遺伝子の非コード領域によって隣接されている外来遺伝子を含む組み換えモノネガウイルス目ウイルス(MV)ベクターに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、上流のモノネガウイルス目ウイルス遺伝子開始(GS)配列及び下流のモノネガウイルス目ウイルス遺伝子終了(GE)配列と作用可能に連結された外来遺伝子を含む追加の転写単位を保有する組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターに関し、並びにこのようなモノネガウイルス目ウイルスベクターを含むワクチンに関する。
【背景技術】
【0002】
感染した宿主中で複製することができる生ウイルスは、それらの発現された抗原に対して強力で、長期間持続する免疫応答を誘導する。生ウイルスは、液性免疫応答及び細胞媒介性免疫応答を惹起する上で、並びにサイトカイン及びケモカイン経路を刺激する上で有効である。従って、弱毒化された生ウイルスは、通例、免疫系の液性アームのみを刺激することが多い不活化された免疫源又はサブユニット免疫源を基礎とするワクチン組成物に比べて極めて優位である。
【0003】
ここ10年にわたって、組み換えDNA技術は、DNAとRNAウイルスのゲノムの遺伝子操作の分野に大きな変革をもたらした。特に、現在では、宿主動物中で新たなベクターウイルスが複製した際に、宿主動物中で生物学的効果を発揮することができる外来タンパク質が発現されるように、ウイルスのゲノム中に外来遺伝子を導入することが可能である。このような組み換えベクターウイルスは、微生物感染の管理及び予防のために活用されてきたのみならず、悪性腫瘍及び遺伝子療法などの非微生物学疾患のための標的療法を考案するためにも活用されてきた。
【0004】
1994年に最初に報告された「逆遺伝学」と称される技術(Schnell et al.,EMBO J.,13,4195−4203,1994)によって、専らクローニングされたcDNAから得られたセグメント化されていないマイナス鎖のRNAウイルス(モノネガウイルス目のウイルス)の作製によって、モノネガウイルス目(MV)のウイルスもベクターとして使用することが可能となった。それ以来、病原体に対するワクチンを開発することを目指して、その病原体に由来する外来抗原を発現するために、ウイルスベクターとしてMV目の多くのウイルスの使用を記載する研究が公表されてきた。
【0005】
モノネガウイルス目は、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科及びボルナウイルス科という4つの主な科に分類される。これらの科に属するウイルスは、単一の負の(−)センスRNA分子によって表されるゲノムを有する。すなわち、RNAゲノムの極性は、プラス(+)センスとして表されるメッセンジャーRNA(mRNA)の極性とは反対である。主なヒト及び動物のMVウイルスの分類が、下表に示されている。
【0006】
【表1】
【0007】
MV目のウイルスのゲノムの組織及び生活環の詳細は、近年、詳細に理解されており、様々な著者によって概説されている(Neumann et al.,J.Gen.Virology 83,2635−2662,2002;Whelan et al.,Curr.Top.Microbiol.Immunol.203,63−119,2004;Conzelmann,K.;Curr.Top.Microbiol.Immunol.203,1−41,2004)。モノネガウイルス目ウイルスは異なる宿主及び別個の形態学的及び生物学的特性を有しているが、ゲノムの構成並びに複製及び遺伝子発現の典型的なモードにとって不可欠な要素など多くの特徴を共有しており、モノネガウイルス目ウイルスは共通の祖先から生じたことを示している。モノネガウイルス目ウイルスは、細胞の細胞質中で複製し、スプライシングされていないmRNAを産生する、エンベロープに包まれたウイルスである。
【0008】
モノネガウイルス目ウイルスは、リボヌクレオタンパク質(RNP)複合体及びエンベロープという2つの主な機能単位からなる。上に上げられている全ての科の属の代表的ウイルスに対する完全なゲノム配列が決定されている。ゲノムは約9,000ヌクレオチドから約19,000のサイズの範囲であり、5から10個の遺伝子を含有する。MVウイルスのゲノムの構造及び構成は極めて似通っており、ウイルス特有の遺伝子発現様式によって支配されている。MVウイルスゲノムは全て、ヌクレオタンパク質(N又はNP)、ホスホタンパク質(P)及びRNA依存性RNAポリメラーゼ(L)をコードする3つのコア遺伝子を含む。ウイルスのエンベロープは、マトリックス(M)タンパク質、並びにウイルスの集合/出芽及びウイルスの細胞付着及び/又は侵入において役割を果たしている1つ又はそれ以上の膜貫通糖タンパク質(例えば、G、HN及びFタンパク質)から構成される。属に応じて、タンパク質のレパートリーは、転写及びウイルス複製においてある種の特異的な制御機能を示し、又はウイルス宿主反応に関与する補助タンパク質(例えば、C,V及びNSタンパク質)によって拡張される。MVウイルスの遺伝子順序は極めて保存されており、コア遺伝子N及びPが3’末端又は3’末端付近に位置し、巨大(L)遺伝子が5’遠位に位置する。表面糖タンパク質遺伝子M及び他の補助遺伝子は、N、P及びL遺伝子の間に位置している。
【0009】
RNP複合体において、ゲノム又はアンチゲノムRNAは、Nタンパク質とともに強固にキャプシドを形成しており、L及びPタンパク質からなるRNA依存性RNAポリメラーゼを伴う。細胞の感染後に、RNP複合体は、2つの異なるRNA合成機能(すなわち、サブゲノムのmRNAの転写及び完全長ゲノムRNAの複製)に対する鋳型としての役割を果たすが、裸のRNAゲノムは鋳型としての役割を果たさない。
【0010】
直列に配置された遺伝子は全て、いわゆる「遺伝子接合部」構造によって隔てられている。遺伝子接合部は、保存された「遺伝子終了」(GE;gene end)配列、転写されない「遺伝子間領域」(IGR)及び保存された「遺伝子開始」(GS)配列を含む。これらの配列は、遺伝子転写のために必要且つ十分である。転写の間に、各遺伝子は、最初のGS配列におけるゲノムRNAの3’末端において転写プロセスを開始するウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼによって、mRNAに順次転写される。各遺伝子接合部の転写は、GE配列におけるRNAポリメラーゼの離脱の結果として中断される。転写の再開は後続のGS配列において起こるが、低下した効率で起こる。この中断されたプロセス(「停止−開始」プロセスとも称される。)の結果、後続の下流遺伝子に比べて、MVウイルスゲノム上の3’近位遺伝子がより豊富に転写されるために、各遺伝子接合部では、転写の弱化が生じる。各遺伝子が別個のシストロン又は転写単位の一部であるMVウイルス遺伝子の転写のモジュール形態のために、これらのウイルスは、外来遺伝子の挿入及び発現のために極めて適切なものとなる。MVウイルスゲノム中の各転写単位は、以下の要素:3’−GS−翻訳領域(ORF)−GE−5’を含む。
【0011】
MVウイルスゲノムの全ては、3’及び5’ゲノム末端に、それぞれ、「リーダー」(約40から50nt)及び「トレーラー」(約20から600nt)と称される転写されない短い領域を有する。リーダー及びトレーラー配列は、ゲノムRNAの複製、ウイルスのキャプシド形成及びパッケージングを調節する必須の配列である。
【0012】
逆遺伝学技術及び伝染性MVウイルスの救出によって、そのcDNAコピーを通じてそのRNAゲノムを操作することが可能となった。ウイルスRNAを合成するために必要とされる最小の複製開始複合体がRNP複合体である。感染性MVウイルスは、(T7)RNAポリメラーゼによって駆動されるプラスミドからの(アンチ)ゲノムRNA及び適切な支持タンパク質の細胞内同時発現によって救出することができる。Schnell et al.,1994(上記)による1994年の最初の報告以来、当初のプロトコール(又はその僅かな変形プロトコール)に基づいて、多くのMVウイルス種の信頼できる回収が達成されている。
【0013】
ニューキャッスル病及びトリインフルエンザは家禽の重要な病気であり、世界中の家禽産業に著しい経済的損失をもたらし得る。ニューキャッスル病ウイルスは、MV目に属する、セグメント化されていない負鎖のRNAウイルスである。約15kbの長さであるゲノムは、ヌクレオタンパク質(NP)、リン酸化タンパク質及びVタンパク質(P/V)、マトリックス(M)タンパク質、融合(F)タンパク質、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ(HN)タンパク質及びRNA依存性RNAポリメラーゼ又は巨大(L)タンパク質をコードする6つの遺伝子を含有する。NDV遺伝子は、3’−NP−P−M−F−HN−L−5’の順序で順に配置されており、異なる長さの遺伝子間領域によって隔てられている。全ての遺伝子には、遺伝子開始(GS)配列が先行しており、その後に、非コード領域、NDVタンパク質をコードする翻訳領域、第二の非コード領域及び遺伝子終了(GE)配列が続いている。NDVゲノムの長さは、6の倍数であり、外来遺伝子の導入のために考慮しなければならない。
【0014】
トリインフルエンザ(AI)は、穏やかな呼吸症状ないし死亡率が高い重度の疾病によって特徴付けられる家禽の病気である。原因因子は、オルトミクソウイルス科に属するトリインフルエンザA型ウイルス(AIV)である。AIVは、10個のタンパク質をコードする負の極性を有する8つのゲノムRNAセグメントを含有する。表面糖タンパク質ヘマグルチニン(HA)及びノイラミニダーゼ(N)の抗原性に基づいて、AIウイルスはサブタイプに分類された。現在まで、16のヘマグルチニン(H1からH16)及び9つのノイラミニダーゼ(N1からN9)サブタイプが知られている。H及びNに対する抗体は、液性免疫応答において重要であり、感染を阻害し、又は疾病を予防する。
【0015】
トリインフルエンザ及びニューキャッスル病ウイルスは、それらの病原性に従って2つの異なる病原型に分けることができる。低病原性のAIV(LPAI)又は弱毒性(lentogenic)NDVによって引き起こされる症候は、より重要性が低いと考えられている。これに対して、高病原性ウイルス(NDV:中等毒性(mesogenic)株及び強毒性(velogenic)株)によって引き起こされる高度に病原性のトリインフルエンザ(HPAI)及びニューキャッスル病は、法定伝染病である。
【0016】
弱毒性NDV株を用いたNDVに対する定型的なワクチン接種は、高度に病原性のNDV株に対してニワトリを保護するために行われているが、HPAIは根絶戦略によって駆除されるので、多くの国で、HPAIに対するワクチン接種は行われていない。しかしながら、損失を最小限に抑え、及び疾病の発生を低減するための戦略として、ワクチン接種を使用し得る。ワクチンによって誘導された免疫はサブタイプ特異的であり、これは、サブタイプH5ワクチンはH5AIVに対して保護することができるが、他のHサブタイプに対しては保護できないことを意味する。通常、LPAIウイルスのヘマグルチニンは、肺に限局したセリンプロテアーゼであるトリプターゼClaraによってのみ切断され得るのでインフルエンザウイルスの複製は肺に限局している。これまでのところ、全てのHPAIウイルスがH5及びH7サブタイプのものであった。これらのHPAIウイルスは、遍在性のフューリン及びサブチリシン様酵素によって、サブユニットHA1及びHA2へ切断され得るように、H切断部位の複数の塩基性アミノ酸を含有する。従って、このようなウイルスは、他の臓器中で増殖することができる。
【0017】
サブタイプH5及びH7ワクチンは、HPAIによる感染後の臨床兆候及び死亡に対して、ニワトリ及びシチメンチョウの保護を与えることができる。旧来の不活化されたオイルベースの完全なAIVの他に、ベクターウイルス、サブユニットタンパク質及びDNAワクチンがAIに対する免疫に関して有効であることが実験的に示されている。様々なウイルスに対する逆遺伝学の登場以来、ワクチンベクターとして使用するための組み換えウイルスの作製は重要な応用である。外来タンパク質を発現する、異なる組み換え負鎖RNAウイルスが構築されてきた。また、AIVのヘマグルチニンは、伝染性咽頭気管炎ウイルス(ILTV)(Luschow et al.,Vaccine 19,4249−59,2001)、牛疫ウイルス(Walsh et al.,J.Virol.74,10165−75,2000)及び水疱性口内炎ウイルス(VSV)(Roberts et al.,J.Virol.247,4704−11,1998)のような様々なベクターウイルス中に挿入された。
【0018】
牛疫ウイルスは、口蹄疫ウイルスVP1キャプシドタンパク質の発現のためのベクターウイルスとしても使用された(Baron et al.,1999,J.ofGen.Virol.,vol.80,p.2031−2039)。
【0019】
Taoら(1998,J.ofVirol.,vol.72,p.2955−2961)は、内在性のhPIV3型HV及びF遺伝子を(付加ではなく)置換するために、hPIV1型由来のHN及びF遺伝子が使用されたキメラヒトパラインフルエンザウイルス(hPIV)3型の構築を記載している。
【0020】
NDVは、AIVヘマグルチニンの発現のためにも使用された。インフルエンザA/WSN/33のヘマグルチニン遺伝子は、NDV株HitchnerB1のP遺伝子とM遺伝子の間に挿入された。この組み換え体は致死的な感染からマウスを保護したが、マウスに検出可能な体重減少が存在し、10日以内に完全に回復したNakayaら(J.Virol.75,11868−73,2001)。外来遺伝子に対する同一の挿入部位を有するさらなる組み換えNDVはLPAIのH7を発現したが、ワクチン接種されたニワトリの40%が強毒性NDV及びHPAIの両者から保護されたに過ぎなかった(Swayne et al.,Avian Dis.47,1047−50,2003)。
【0021】
しかしながら、これらの公報は、MVベクターのゲノム中に挿入されたさらなる外来遺伝子の発現に対する、内在性MV遺伝子のいわゆる非コード領域の有利な効果を開示していない。
【0022】
ベクターウイルスのゲノム中に挿入された外来遺伝子によってコードされるタンパク質のより高い発現レベルを示し、及び/又は既存のMVウイルスベクターより強い免疫原性を示す組み換えMVウイルスベクターを提供することが本発明の目的である。
【0023】
本発明者らは、本発明に係る組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターによって、この目的を達し得ることを見出した。従って、本発明は、上流のモノネガウイルス目ウイルス遺伝子開始(GS)配列及び下流のモノネガウイルス目ウイルス遺伝子終了(GE)配列と作用可能に連結された外来遺伝子を含む追加の転写単位を保有する組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターであり、前記GS配列と前記外来遺伝子の開始コドンとの間に、及び前記外来遺伝子の停止コドンと前記GE配列の間に、それぞれ、モノネガウイルス目ウイルス遺伝子の3’非コード領域及び5’非コード領域(ゲノムセンス)が位置していることを特徴とする、前記組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターを提供する。
【0024】
ここでの及び本明細書の他の箇所での核酸鎖の極性の表記は、mRNA及びcDNA配列の場合を除き、ゲノム(−)センスで与えられていることに注意されたい。
【0025】
MVウイルスのゲノム中に挿入された外来遺伝子を含む転写単位中のMVウイルス遺伝子の3’及び5’非コード領域の存在は、外来遺伝子の転写及び/又は発現に対して正の効果を有することが見出された。GS配列とトリインフルエンザウイルス(AIV)ヘマグルチニン(HA)遺伝子の間に及びAIVHA遺伝子とGE配列の間に、MVウイルス遺伝子の非コード領域を設計することによって、AIVHA遺伝子を保有するMVウイルスベクターによって合成されるHAmRNAの量が増加することが図3に示されている。タンパク質発現レベルに対しても、正の効果が観察される。MVウイルスベクターの比較は、外来AIVHA遺伝子を保有するMVウイルスベクターが非コード領域に隣接している場合に、AIVHA特異的抗血清での強烈な免疫学的染色を示したに過ぎなかった(図4)。従って、本発明者らは、これらの観察を説明し得る何れの理論又はモデルにも拘泥することを望まないが、外来遺伝子に隣接するMVウイルス非コード領域の存在は、生じたMVウイルスベクターの性能に対して正の効果を有することを見出した。
【0026】
外来遺伝子は、ポリペプチド又はタンパク質をコードし、レシピエントMVウイルスのゲノム中に本来存在しないポリヌクレオチド分子である。
【0027】
上で既に詳しく記載されているように、MVウイルスのゲノムの構成の共通する特徴は、直列に配置された転写単位が連続的に転写される、それらの転写のモジュール形態である。野生型MVウイルスでは、転写された遺伝子は、(i)それらの3’末端において、GS配列及び本分野において「非コード領域」と表記されるヌクレオチド配列と隣接しており、並びに(ii)それらの5’末端において、本分野において同じく「非コード領域」と表記されるヌクレオチド配列及びGE配列と隣接している。従って、本明細書において使用される(3’又は5’)「非コード領域」という用語は、MVウイルスの天然遺伝子の上流(3’)又は下流(5’)に位置し、それぞれ、GS配列とMVウイルス遺伝子の開始コドン(ATG)との間の領域及びMVウイルス遺伝子の停止コドン(TAA、TAG又はTGA)とGE配列との間の領域を貫くヌクレオチド配列を定義する。本明細書において使用される非コード領域は、ベクターウイルスと同じウイルスの遺伝子に由来する(すなわち、非コード領域は、MVウイルスベクターと相同である。)。
【0028】
様々なMVウイルス遺伝子のヌクレオチド配列及びそれらの転写調節(GS及びGE)配列及び遺伝子に隣接する非コード配列など、MVウイルスのゲノムの構成の詳しい情報は、本分野において公知である。このような情報は、例えば、インターネット上でNational Center for Biotechnology Informationv(NCBI)のウェブサイトを通じて、National Center for Biotechnology Informationv(NCBI)のデータから入手することができる(表2及び3参照)。
【0029】
本発明において好ましく使用される非コード配列は、天然のMVウイルス遺伝子に由来するが、天然の非コード領域中の1つ又はそれ以上のヌクレオチドの置換も、本発明に属すると考えられる。特に、それぞれ、外来遺伝子の開始/停止コドンのすぐ上流又は下流に位置しており、これらの領域の遺伝的操作を可能とする人工の制限酵素切断部位の導入から得られるヌクレオチド置換が想定される。
【0030】
本発明の好ましい組み換えMVウイルスベクターにおいて、非コード領域は、MVウイルスエンベロープタンパク質、特に、M、G、F若しくはHNタンパク質又はRNPタンパク質、特に、N、P若しくはLタンパク質をコードする非コード領域である。
【0031】
本発明の特に好ましい組み換えMVウイルスにおいて、非コード領域は、F又はHNタンパク質をコードする遺伝子の非コード領域である。
【0032】
本発明の組み換えMVウイルスベクター中で使用されるべき非コード領域の特異的ヌクレオチド配列が、表3に示されている。
【0033】
【表2】
【0034】
本発明において、転写調節配列として使用されるべきGS及びGE配列は、好ましくは、MVウイルスの天然遺伝子に由来するものである。これらの配列は、転写プロセスの間に、特に、転写開始及びmRNA5’末端修飾のプロセスにおいて、及び転写3’末端ポリアデニル化及び終結の調節において、RNAポリメラーゼの活性を調節すると考えられている。各MVウイルスに関して、各遺伝子の始まりは、約10ヌクレオチドの配列によって印が付されている。幾つかのMVウイルス種では、GS配列は各遺伝子に対して同じであるが、他のMVウイルス種のゲノム中のGS配列は、僅かな差を示し得る。
【0035】
mRNA3’末端ポリA尾部の形成及び転写の終結におけるそれらの共通する機能に照らして、MVウイルス中のGE配列は共通の配列特性を共有している。典型的なGE配列は、4から8ヌクレオチド長の間のウリジントラクト(U−tract)を含む。さらに、ウリジントラクトのすぐ上流に位置するC残基の強い保存が存在し、これには、A/Uに富むヌクレオチドの連なりが先行する。様々なGE配列において、ウリジントラクトのすぐ上流の4ヌクレオチドは、3’−AUUC−5’から構成される。
【0036】
ゲノムテンプレート中のヌクレオチド配列とmRNA末端に存在するヌクレオチド配列を比較することによって、MVウイルス遺伝子の遺伝子境界又は遺伝子接合部を規定する転写調節配列が多くのMVウイルス遺伝子に対して同定されてきた。さらに、多くの研究が、効率的な遺伝子発現のために必要とされるGS及びGEコンセンサス配列を同定してきた。GS及びGE配列の一般的な特徴及び具体例は、NCBI配列データベース中の情報から得ることができ(NCBI受入番号に関しては、表2を参照)、Neumannら(J.Virol.83,2635−2662,2002)及びWhelanら(Current Topics Microbiol.Immunol.203,63−119,2004)によっても概説されている。
【0037】
本発明の組み換えMVウイルスベクター中で使用されるべき特に好ましいGS及びGE配列が表3に列記されているが、GS−、NCR−及びGE配列の間の正確な境界は、必ずしも決定できるわけではないことが認められている。この配列情報は、NCBIデータベース中に開示されている(表2中の受入番号を参照されたい。)。NDVに関しては、EMBL受入番号Y18898を、RVに関しては、GenBank受入番号M31046を参照されたい。
【0038】
【表3】
【0039】
本発明の好ましい組み換えMVウイルスベクターにおいて、GS、GE配列及び非コード領域は、同じMVウイルス遺伝子に由来する。
【0040】
外来遺伝子を含む追加の転写単位を保有する組み換えMVウイルスベクターの調製方法は、本分野において周知である。例えば、表2は、様々なMVウイルス種に関して、このような組み換えベクターウイルスの調製を記載する文献を参照している。原理的には、本発明において使用される方法は、MVウイルスゲノム中に挿入されるべき外来遺伝子が、上記のように、適切な3’及び5’非コード領域に隣接していることを除き、従来技術と同じ方法である。
【0041】
本発明の一般的な方法において、組み換えMVウイルスベクターは、得られたMVウイルスベクターにおいて、特に、GE−IGR−GS要素を含むゲノムヌクレオチド配列断片によって、外来遺伝子にMVウイルス遺伝子接合部が先行し、且つ後続するように、(i)上記のような3’及び5’非コード領域に隣接している外来遺伝子及び(ii)適切な転写調節配列を含む単離された核酸分子をMVウイルスのゲノム中に挿入することによって調製される。このような上流及び下流要素の存在は、挿入された外来遺伝子の適切な転写を保証するのみならず、挿入された外来遺伝子の上流及び下流に位置する相同的なMVウイルス遺伝子の適切な転写を保証する。
【0042】
さらに具体的には、本方法において、MVウイルスの単離された核酸分子及びゲノムは、それらのcDNA形態(+センス)で使用される。これによって、所望の核酸分子の取り扱い及びウイルスゲノム中への挿入が容易になる。
【0043】
一般に、2つの遺伝子間に、すなわち遺伝子間領域(IGR)中に、遺伝子の3’又は5’非コード領域及びゲノムの3’プロモーター近位(N/NP遺伝子の前)又は5’遠位末端(L遺伝子の後)に外来遺伝子を挿入するためにゲノムの様々な部分を使用することができる。
【0044】
外来遺伝子は、N/NP遺伝子の前、NP−P,P−M、M−G/F、G/F−HN、HN−Lの間に及びL遺伝子の後に有利に挿入することができる。
【0045】
最も単純な方法は、酵素で切断し、適切な転写カセットを導入することによって、これらの部位の1つに、既存の制限酵素(RE)認識配列を使用することである。天然に存在する制限酵素認識配列は、常に所望の位置に存在しているわけではなく、RE認識部位は、位置指定突然変異導入又はPCR突然変異導入によって、ゲノム中に都合よく導入することが可能である。外来遺伝子を挿入するための適切なIGRの例は、表3に見出すことができる。
【0046】
挿入すべき転写カセットの組成は、挿入の部位に依存する。例えば、転写カセットがIGRに挿入される場合、カセットは次のエレメント:3’RE認識部位−GS−非コード領域−(外来遺伝子の)ORF−非コード領域−GE−RE認識部位5’を含み得る。
【0047】
あるいは、転写カセットが天然のMVウイルス遺伝子の5’非コード領域に導入される場合、カセットは、3’RE認識部位−GE−IGR−GS−非コード領域−(外来遺伝子の)ORF−非コード領域−RE認識部位5’から構成され得る。
【0048】
同様に、転写カセットが天然のMVウイルス遺伝子の3’非コード領域に導入されるべき場合、カセットは、3’RE認識部位−非コード領域−(外来遺伝子の)ORF−非コード領域−GE−IGR−GS−RE認識部位5’から構成され得る。
【0049】
このような転写カセットの調製及びMVウイルスゲノムへのこの挿入は、列挙した参考文献及び本発明の実施例で例示されるものなどの通常の分子生物学的技術しか含まない。特に、この目的に対して、部位特異的及びPCR突然変異誘発などの技術を使用することができる(Peetersら、1999、前出;Current Protocols in Molecular Biology、編:F.M.Ausbelら、Wiley N.Y.、1995編集、8.5.1.−8.5.9頁;及びKunkelら、Methods in Enzymology Vol.154、376−382、1987)。
【0050】
とりわけ、MV目の分節されていない負鎖RNAウイルスの遺伝子修飾を可能にする、よく確立された「逆遺伝学」法により、本発明による組み換えMVウイルスベクターを調製することができる(例えばConzelmann、K.K.、Current Topics Microbiol.Immunol.203、1−41、2004;及びWalpitaら、FEMS Microbiol.Letters 244、9−18、2005により概説される。)。
【0051】
この方法において、MV(アンチ)ゲノム及びサポートタンパク質の転写及び同時発現及び組み換えMVベクターの作製を可能にするのに十分な条件下で、全長ゲノム又は、好ましくはMVウイルスのアンチゲノム(ポジティブセンス)をコードするヌクレオチド配列を含むcDNA分子を含むベクター及び、必要とされるサポートタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むcDNA分子を含む1つ又はそれ以上のベクターにより、適切な細胞の同時形質移入を行う。この方法において、全長MVウイルス(アンチ)ゲノムをコードする前記核酸分子は、上記で定義されるようなさらなる転写単位を含む。
【0052】
ベクターは、このベクターにより形質移入が行われた細胞において連結されるDNAセグメントの複製及びその転写及び/又は発現を起こすような、別のDNAセグメントが連結される、プラスミド、ファージ又はコスミドなどのレプリコンを意味する。
【0053】
好ましくは、完全長ゲノムの転写のためのベクターは、その5’末端でT7ポリメラーゼプロモーター及びその3’末端で(デルタ肝炎)リボザイム配列に隣接する、MVウイルスの(アンチ)ゲノムをコードするcDNA配列を含むプラスミドであるが、T3又はSP6 RNAポリメラーゼプロモーターを使用することもできる。
【0054】
適切なサポートタンパク質の細胞内発現に対して、適切な発現調節配列(例えばT7ポリメラーゼプロモーター)の調節下で、好ましくは、これらのタンパク質をコードするcDNA配列を含むプラスミドを使用する。
【0055】
本発明による組み換えMVウイルスベクターの調製のための特に好ましい方法において、MVウイルスのN(又はNP)、P及びLタンパク質をコードする発現プラスミドを使用する。
【0056】
この逆遺伝学技術で使用される形質移入されたサポートプラスミドの量又は割合は、幅広い範囲にわたる。サポートプラスミド、N:P:Lに対する割合は約20:10:1から1:1:2の範囲であり得、各ウイルスに対する効率的な形質移入プロトコールは当技術分野で公知である。
【0057】
T7RNAポリメラーゼプロモーター及びリボザイム配列の複合作用により、形質移入が行われた細胞中でゲノムRNAの正確なコピーが生成され、続いて、このRNAが、同時形質移入された発現プラスミドにより与えられるウイルスサポートタンパク質によりパッケージ化され複製される。
【0058】
形質移入された細胞に感染する組み換えワクシニアウイルスにより、特にワクシニアウイルスvTF7−3、またその他の組み換えポックスベクター(鶏痘ウイルスなど、例えばfpEFLT7pol)により、T7ポリメラーゼ酵素が与えられることが好ましいか又はT7 RNAポリメラーゼの発現のために他のウイルスベクターを使用し得る。
【0059】
ろ過など単純な物理的技術により、ワクシニアウイルスから救出されたウイルスの分離を容易に行うことができる。センダイウイルス又はNDVの救出のために、孵化卵での形質移入細胞の上清の接種によって、救出を行うことができる。
【0060】
さらにより好ましい実施形態において、(T7)RNAポリメラーゼ及び/又は必要な支持タンパク質の1以上を構成的に発現する転写及び発現ベクターの形質移入に対して、細胞株を使用する。
【0061】
例えば、T7RNAポリメラーゼ及び麻疹ウイルス支持タンパク質、N及びPの両方を発現するヒト胚腎臓細胞株、293−3−46において、麻疹ウイルスの救出を行うことができる(Radecke et al.,EMBO J.14、5773−5784、1995)。本発明において有利に使用できる別の非常に有用な細胞株は、T7 RNAポリメラーゼを発現するBSR細胞、即ち細胞株BSR−T7/5に基づく(Buchholz et al.,J.Virol.73、251−259、1999)。
【0062】
さらに、本発明によるMVウイルスの調製のために本明細書中で使用されるべき逆遺伝学技術に関するより詳細な情報はConzelmann、K.K.(前出)による概説及び実施例1において開示される。
【0063】
組み換えMVウイルスベクターが外来遺伝子を安定に発現する能力の結果、予防的及び治療的適用の両方に対してベクターが開発されてきた。
【0064】
本発明による組み換えMVウイルスベクターにおいて、特異的MVウイルスベクター種及びベクターウイルスの適用に依存して、外来遺伝子は様々であり得る。
【0065】
外来遺伝子は、(その他の)微生物病原体(例えば、ウイルス、寄生生物の細菌)抗原をコードし得、特に外来遺伝子は、防御的免疫反応を誘導することができる病原体の抗原をコードする。
【0066】
例えば、本発明のウイルスベクターに挿入することができる非相同遺伝子配列には、以下に限定されないが、インフルエンザウイルス糖タンパク質遺伝子、特に鳥インフルエンザウイルスのH5及びH7ヘマグルチニン遺伝子、伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルス(IBDV)、特に(IBDV)のVP2由来の遺伝子、感染性気管支炎ウイルス(IBV)、ネコ白血病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、狂犬病ウイルス、エールリヒア生物、特にエールリヒア犬、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヒトメタ肺炎ウイルス及び麻疹ウイルス由来の遺伝子が含まれる。
【0067】
あるいは、外来遺伝子は、例えばインターロイキンなどのサイトカイン(例えばIL−2、IL−12、INF−γ、TNF−α又はGM−CSF)を同時発現させることにより、ウイルス感染に対する免疫反応を促進又は調節することができるポリペプチド免疫調節因子をコードし得る。
【0068】
MV目には、ヒト及び動物において又は両方において複製することができるウイルスの両方が含まれる(例えば狂犬病ウイルス及びニューキャッスル病ウイルス)。従って、ヒト及び脊椎動物微生物病原体の幅広い範囲から外来遺伝子を選択することができる。
【0069】
本発明においてベクターウイルスとして全てのMVウイルスを使用することができるが、本発明の好ましい実施形態において、組み換えMVウイルスベクターはラブドウイルス科のウイルス、好ましくはリッサウイルス属又はノヴィラブドウイルス、より好ましくはそれぞれ狂犬病ウイルス又はIHNV種のウイルスである。
【0070】
また好ましい実施形態において、組み換えMVウイルスは、パラミクソウイルス科のウイルスであり、好ましくはレスポウイルス属、特にhPIV3又はbPIV3種;麻疹ウイルス、特にCDV種;肺炎ウイルス、特にRSV種;及びアブラウイルス、特にNDV種である。
【0071】
本発明の特に好ましい実施形態において、ウイルスがニューキャッスル病ウイルス(NDV)である組み換えMVウイルスベクターが提供される。NDVはヒト及び動物の両方、特に家禽、とりわけニワトリ、で複製可能なので、本発明による組み換えNDVベクターは、病原体の、特に呼吸器病原体の抗原又はヒトもしくはこれらの動物の何れにおいても適切な免疫反応を誘導し得る免疫調節因子をコードする外来遺伝子を含み得る。
【0072】
Peetersら(J.Virology 73、5001−5009、1999)、Romer−Oberdorfer et al.,(J.Gen.Virol.80、2987−2995、1999)により、及びConzelmann、K.K.(前出)による概説において、NDVの遺伝子操作のための逆遺伝学的方法が具体的にNDVについて開示されている。さらに、外来遺伝子の発現のために、例えば、NDVベクターによって感染した動物での免疫反応の誘発のために、ベクターとしてNDVを使用することができることも知られている。(Nakaya et al.,2001、上記)及び(Swayne et al.,Avian Dis.47、1047−50、2003)。
【0073】
上述のMVウイルスについて全般的に概説するように、NDVゲノムの様々な位置に外来遺伝子を有利に導入することができる。特に、本発明による組み換えNDVベクターにおいて、外来遺伝子(適切な転写単位の一部として)を次のNDV遺伝子の間(NP−P、P−M、M−F、F−HN、HN−L)及び3’隣接及び5’遠位遺伝子座に(Zhao et al.,2003、上記;Nakayaら、2001、上記)、好ましくは3’隣接、P−M、M−F及びF−HN領域に挿入することができ、F−HN領域が最も好ましい。
【0074】
さらに、本発明の組み換えNDVベクターでは、外来遺伝子に隣接する非コード領域は、天然に存在する全てのNDV遺伝子から、特に、N、P、M、F又はHN遺伝子から得ることができ、HN遺伝子が好ましい。
【0075】
本発明の特定の実施形態において、追加の転写単位がF−HN遺伝子間に位置し、及び挿入された外来遺伝子がHDVHN遺伝子の非コード領域と隣接している組み換えNDVベクターが提供される。
【0076】
より具体的には、3’及び5’NCR(並びに、場合によって、GS及びGE配列)が配列番号1及び2又は3及び4に示されているようなヌクレオチド配列を有するNDVベクターが提供される。
【0077】
その他の病原体に対して家禽、特にニワトリにおいて免疫反応を誘導するために、本発明による組み換えNDVベクターを有利に使用することができる。従って、組み換えNDVベクターは、好ましくは、鳥類病原体、特にインフルエンザウイルス、マレック病ウイルス(MDV)、伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)、感染性気管支炎ウイルス(IBV)、伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルス(IBDV)、ニワトリ貧血ウイルス(CAV)、レオウイルス、鳥類レトロウイルス、家禽アデノウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(TRTV)、E.コリ、アイメリア種、クリプトスポリジア、マイコプラズマ、例えばM.ガリナルム(M.gallinarum)、M.シノビエ(M.synoviae)及びM.メレグリディス(M.meleagridis)など、サルモネラ、カンピロバクター、オルニトバクテリウム(ORT)又はパスツレラ種、の防御抗原をコードする外来遺伝子を含む。
【0078】
より好ましくは、組み換えNDVベクターは、AIV、MDV、ILTV、IBV、TRTV、E.コリ、ORT又はマイコプラズマの抗原をコードする外来遺伝子を含む。
【0079】
特に、組み換えNDVベクター突然変異体は、インフルエンザウイルス、好ましくは鳥インフルエンザウイルス(AIV)、より好ましくは高病原性AIV、特にH5又はH7AIVの、ヘマグルチニン(HA)遺伝子を含む。
【0080】
原則として、本発明において、全ての(トリ)インフルエンザ株のHA遺伝子を使用することができる。当技術分野で多くのHA遺伝子のヌクレオチド配列が開示されており、GenBank又はEMBLデータベースなどの核酸配列データベースから検索することができる。
【0081】
上記で概説されるように、本発明において、最近単離された高病原性H5N2サブタイプAVIA/ニワトリ/イタリア/8/98のヘマグルチニン(HA)遺伝子を外来遺伝子として有利に使用することができる。この遺伝子を逆転写し、真核発現ベクターpcDNA3(Invitrogen)においてクローニングし、配列決定を行う(Luschowら、Vaccine、vol.19、4249−4259頁、2001年及びGenBank受託番号AJ305306)。得られた発現プラスミドpCD−HA5から、NDVゲノム配列におけるHA遺伝子の挿入を可能にする人為的RE認識部位を生成する特異的プライマーを用いた増幅によって、HA遺伝子を得ることができる。
【0082】
さらなる実施形態において、上記で概説されるように、本発明において、高病原性H7N1サブタイプAIVA/ニワトリ/イタリア/445/99のHA遺伝子を外来遺伝子として使用することができる。このHA遺伝子を逆転写しPCRにより増幅する。SmaIで消化したベクターpUC18(Amersham)において1711bp産物をクローニングし、配列決定を行う(Veitsら、J.Gen.Virol.84.3343−3352、2003;及びGenBank受入番号AJ580353)。
【0083】
本発明による特に有利な組み換えMVウイルスベクターにおいて、MVベクターウイルスは弱毒化されている、つまり、このベクターウイルスは標的動物にとって病原性ではないか、又は野生型ウイルスと比較して毒性が顕著に低下している。ウイルスベクターとして本明細書中で使用される多くのMVウイルスは、麻疹ウイルス及びNDVなどの弱毒化生ワクチンとして長らく安全であった記録があり、一方、SeV及びVSVなどのその他のウイルスはヒトに対して非病原性であると考えられる。さらに、限定的な複製又は感染能を示す弱毒化ウイルスを得てそれに対してスクリーニングを行うために、従来の技術が存在する。このような技術には、異種培養基におけるウイルスの連続的(コールド)継代及び化学的突然変異誘発が含まれる。
【0084】
本発明による組み換えNDVベクターは、何らかの従来のNDワクチン株由来であり得る。市販のNDワクチンにおいて存在するこのような適切なNDV株の例は:Clone−30(R)、La Sota、Hitchner BI、NDW、C2及びAV4であり;Clone−30(R)は好ましい株である。
【0085】
本発明による組み換えMVウイルスベクターが動物において防御的免疫反応を誘導できることもまた本発明により見出された。
【0086】
従って、本発明の別の実施形態において、生又は不活性化型の上記で定義されるような組み換えMVウイルスベクターと、医薬的に許容可能な担体又は希釈剤と、を含む微生物病原体に対するワクチンが提供される。
【0087】
市販の生及び不活性化MVウイルスワクチンに対して一般に使用されるものなどの従来の方法により、本発明によるワクチンを調製することができる。
【0088】
簡潔に述べると、組み換えMVウイルスベクターを用いて感受性物質を接種し、所望のタイターにウイルスが複製するまで増殖させ、その後、物質を含有するウイルスを回収する。続いて、免疫付与特性を有する医薬製剤へと回収した物質を処方する。
【0089】
本発明において、組み換えMVウイルスベクターの複製を支えることができる全ての培養基を使用することができる。培養基として、MVウイルスに依存して、原核及び真核源の両方からの宿主細胞を使用することができる。適切な宿主細胞は脊椎動物、例えば霊長類細胞であり得る。適切な例は;ヒト細胞株HEK、WI−38、MRC−5又はH−239、サル細胞株Vero、げっ歯類細胞株CHO、BHK、イヌ細胞株MDCK又は鳥類CEF又はCEK細胞である。
【0090】
本発明による組み換えNDVベクターを増殖させることができる特に適切な培養基はSPF孵化卵である。例えば卵あたり少なくとも102.0EID50を含む尿膜腔液を含有する0.2mL NDVを孵化卵に接種することができる。好ましくは、9から11日胚の孵化卵に約105.0EID50を接種し、続いて37℃で2−4日間温置する。2−4日後、好ましくは尿膜腔液を回収することによって、NDウイルス産物を回収することができる。その後、2500gで10分間、この液体を遠心し、続いてフィルター(100μm)に通して上清を濾過することができる。
【0091】
本発明によるワクチンは、このような組成物に対して慣習的に使用される医薬的に許容可能な担体又は希釈剤とともに、組み換えMVウイルスベクターを含む。
【0092】
生ウイルスを含有するワクチンを懸濁液又は乾燥凍結形態で調製し、販売することができる。担体には、安定化剤、保存料及び緩衝剤が含まれる。希釈剤には、水、水性緩衝液及びポリオールが含まれる。
【0093】
本発明の別の態様において、不活性形態の組み換えMVウイルスベクターを含むワクチンが提供される。不活性化ワクチンの主要な長所は、その安全性及び長期にわたり高レベルの防御抗体を誘導できることである。
【0094】
増殖段階後に回収されたウイルスの不活性化の目的は、ウイルスの複製を排除することである。一般に、周知の化学又は物理的手段によってこれを達成することができる。
【0095】
必要に応じて、本発明によるワクチンは、アジュバントを含有し得る。この目的のためのアジュバント活性のある適切な化合物及び組成物の例は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又は酸化アルミニウム、例えば鉱物油(Bayol F(R)又はMarcol 52(R)など)又は植物油(ビタミンEアセタートなど)に基づく水中油又は油中水乳液及びサポニンである。
【0096】
本発明によるワクチンの投与は、周知の有効な形態の何れかによるものであり得、MVウイルスベクターのタイプに基づき得る。投与の適切な形式には、非経口、鼻腔内、経口及び噴霧ワクチン接種が含まれる。
【0097】
本発明によるNDVベクターワクチンは、好ましくは、NDVワクチン接種に対して一般に使用される安価な大量適用技術により投与される。NDVワクチン接種の場合、これらの技術には、飲用水及び噴霧ワクチン接種が含まれる。
【0098】
本発明によるワクチンは、活性成分として組み換えMVウイルスベクターの有効量、即ちワクチン接種された鳥類において毒性微生物による曝露処置に対して免疫を誘導する免疫付与MVウイルス物質の量、を含む。免疫は、本明明細書中で、ワクチン接種していない群と比較した、ワクチン接種後の死亡及び臨床症状に対する、ヒト又は動物集団における顕著に高い防御レベルの誘導として定義される。特に、本発明によるワクチンは、ワクチン接種されたヒト又は動物の大部分において、疾患の臨床症状の発生及び死亡を防ぐ。
【0099】
通常、102.0−108.0組織培養/胚感染用量(TC/EID50)の用量で、好ましくは、104.0−107.0TC/EID50の範囲の用量で、生ワクチンを投与することができる。不活性化ワクチンは、104.0−109.0の抗原当量(antigenic equivalent)を含有し得る。
【0100】
本発明はまた、本発明による組み換えMVウイルスベクターに加えてさらなる病原体に対する保護を誘導することができるワクチン株を含む、混合ワクチンも含む。
【0101】
実施例
【実施例1】
【0102】
トリインフルエンザウイルスHA遺伝子を発現する組み換えMVウイルスの作製(NDV/AIVH5)
・ウイルスと細胞
救出された組み換えNDV及びインフルエンザウイルス単離株A/ニワトリ/イタリア/8/98を、特定病原体が除去された(SPF)10日齢の有胚のニワトリの卵中で増殖させた。強毒性NDV株Herts33/56及びNDVクローン30ワクチン(Nobilis(R))を使用した。
【0103】
cDNAから伝染性NDVを回収するために、ファージT7RNAポリメラーゼを安定に発現するBSR−T7/5細胞を使用した。
【0104】
・AIVH5遺伝子を含有するNDVアンチゲノムRNAをコードするcDNAの構築
NDVゲノム上のヌクレオチド位置及びNDVタンパク質中のアミノ酸残基上を特定するために、本明細書において使用されている括弧内の付番は、Romer−Oberdorderら(J.Gen.Virol.80,2987−2995,1999,EMBL受入番号Y18898)によって記載されているとおりである。rNDV/AIVH5−Aに対する人工のMluI制限部位(PH5F1:5’−cta aac gcg taa aat gga gaa aat agt gc−3’(配列番号5)及びPH5R1:5’−tcg gac gag ttt aaa tgc aaa ttc tgc act g−3’(配列番号6)、MluI部位には下線が付されている。)並びにrNDV/AIVH5−Bに対するNcoI又はAflII部位(PH5F2:5’−cct tcc atg gag aaa ata gtg ctt c−3’(配列番号7)及びPH5R2:5’−cct cct taa gta taa ttg act caa tta aat gca aat tct gca ctg caa tga tcc−3’(配列番号8)、制限部位には下線が付されている。)を有する特異的なプライマーによってプラスミドpCD−HA5(Luschow et al.,上記)から増幅されたAIVH5遺伝子を導入するために、クローン30の完全長アンチゲノムRNAを発現する(Romer−Oberdorferら、上記)プラスミドpflNDVを使用した。クローン30アンチゲノム(図1A)中へのH5の導入は、GFP挿入に関して以前に記載されたように(Engel−Herbert et al.,J.Virol.Methods 108,19−28,2003)、MluI部位を用いて行った。簡潔に述べると、完全長プラスミドpflNDV/AIVH5−Aの構築のために、NDVのF及びHN遺伝子の間の最小遺伝子カセット中にH5OFRを挿入するために使用された人工MluI部位を含有するプライマーを用いて、H5ORFを増幅した。rNDV/AlVH5−Bの作製のためのAIVH5遺伝子を含有する完全長プラスミドの構築は、図1Bに記載されている。突然変異導入反応は、QuikChange(R)IIXL位置指定突然変異導入キット(Stratagene)を用いて行った。この目的のために、クローン30ゲノムのNotIBsiWI断片(ヌクレオチド4953−8825)を含有するpUC18プラスミド(pUCNDV1)及び突然変異導入A(図1B)のための以下のプライマーMP1(5’−gac aac agt cct caa cca tgg acc gcg ccg−3’)(配列番号9)及びMP2(5’−ctg gct agt tga gtc aat tct taa gga gtt gga aag atg gc−3’)(配列番号10)を使用して、新たに作出されたNcoI及びAflII部位を有するプラスミドpUCNDVIaを得た(プライマー中の制限部位には、下線が付されている。)。NcoI及びAflIIでの消化後、増幅されたAIVH5ORFによって、クローン30のHNOFRを置換した。pUCNDVHSのL遺伝子の前の遺伝子間領域中にSgfI−及びSnaBI部位を作出し、pUCNDV/AIVH5−1bをもたらす突然変異導入Bに関しては(図1B)、プライマーMP3(5’−caa aac agc tca tgg tac gta ata cgg gta gga cat gg−3’)(配列番号11)及びMP4(5’−gta agt ggc aat gcg atc gca ggc aaa aca gct cat gg−3’)(配列番号12)を使用した。MP3及びMP5(5’−gaa aaa act acc ggc gat cgc tga cca aag gac gat ata cgg g −3’)(配列番号13)を用いて突然変異導入Cを行い、プラスミドpUCNDVH5 1b中のL遺伝子の前の遺伝子間領域中にクローン30HN遺伝子を導入するために使用したSgfI及びSnaBI部位を取得するためのプラスミドpUCNDVIcを得た。最後に、pflNDV−1のNotI/BsiWI断片を、pUCNDVH5 1cのNotI/BsiWI断片によって置換した(図1B)。生成された新しい完全長ゲノムの長さは、6の倍数に相当する(rNDV/AIVH5−Aに関しては16938ヌクレオチド及びrNDV/AIVH5−Bに関しては17196ヌクレオチド)。
【0105】
形質移入及びウイルス増殖
形質移入実験、ウイルス増殖及び伝染性ウイルスの回収の確認は、以前に記載されたとおりに実施した(Romer−Oberdorfer et al.,上記;Engel−Herbert et al.,上記)。唯一の差は、形質移入のために20μgのDNAの総量(完全長ゲノム含有プラスミド10μg、pCiteNP6μg、pCiteP2μg及びpCiteL2μg)を使用したことであった。
【0106】
・結果
以前に記載されたプラスミドpfINDVのF及びHN遺伝子の間に、AIVH5翻訳領域を挿入した(Romer−Oberdorfer et al.,上記)。この目的のために、pfINDVoligo1の唯一のMluI制限部位中にAIVH5OFRを挿入するために使用されたMluI制限部位を有する特異的プライマーによって、プラスミドCD−HA5(Luschow et al.,上記)からAIV単離株A/ニワトリ/イタリア/8/98(H5N2)のAIVH5ORFを増幅し(Engel−Herbert et al.,上記)、プラスミドpflNDV/AIVH5−Aを得た(図1A)。この構築物中において、AIVH5ORFは、NDVのF及びHN遺伝子間の遺伝子間領域中で、人工の遺伝子開始(GS)及び遺伝子終了(GE)配列と隣接していた。完全長プラスミドpflNDV/AlVH5−Bの構築のために、プラスミドpUCNDV1aのHNORFを、NcoI/AflII断片として増幅されたH5FRによって置換した(図1B)。得られたプラスミドpUCNDVH5中において、H5遺伝子の下流の遺伝子間領域中にSgfI及びSnaBI制限部位を作製して、プラスミドpUCNDVH5 1bを得た(図1B)。その中でHN遺伝子がSgfI及びSnaBI制限部位とも隣接しているプラスミドpUCNDVIcから得られたHN遺伝子を導入するために、作製されたSgfI及びSnaBI制限部位を使用した(図1B)。最後に、pflNDVのNotI/BsWI断片を置換するために、得られたプラスミドpUCNDVH5 1cを使用した(図1B)。NDVHNの非コード領域が転写調節要素(GS、GE)及びH5ORFの間にさらに挿入されていたので、構築されたpflNDV/AIVH5−Bは、プラスミドpflNDV/AIVH5−Aとは異なる。
【0107】
NDV組み換えrNDV/AIVH5−A及びrNDV/AIVH5−Bは、以前に記載されたように、それぞれの完全長cDNA及び支持プラスミドで形質移入されたBSR−T7/5細胞から回収した(Romer−Oberdorfer et al.,上記;Engel−Herbert et al.,上記)。ウイルス回収のために、10日齢の有胚のニワトリの卵の尿膜腔中に形質移入上清を注入し、5日間温置した。尿膜液を採集し、血球凝集検査又は間接免疫蛍光(IF)によって、ウイルスの存在に関して分析を行った。さらなるウイルス増殖のための第二の卵の継代のために、ウイルスを含有する尿膜液を使用した。rNDV/AIVH5−A及びrNDV/AIVH5−Bのウイルスゲノム中の挿入されたH5遺伝子の存在は、逆転写−PCR及び配列決定によって確認した(データは示さず。)。図2A及び2Bは、NDV中のHNORFに隣接する領域のヌクレオチド配列及びNDVベクター中のH5ORFのヌクレオチド配列を示している。
【実施例2】
【0108】
NDV/AIVH5ベクターのインビトロでの性質決定
・RNA分析
細胞当り10の感染効率で、CEF細胞をNDVクローン30、rNDV/AIVH5−A、rNDV/AIVH5−B及びAIVA/ニワトリ/イタリア/8/98(H5N2)に感染させ、37℃で8時間温置した。感染細胞及び非感染細胞の全RNAを調製し、変性アガロースゲル中で分離し、放射線標識されたcRNAとハイブリッド形成させた。32P標識されたcRNAのインビトロ転写のために、それぞれ、AIVA/ニワトリ/イタリア/8/98(H5N2)H5及びNDVクローン30HNの翻訳領域を含有するプラスミドpCD−HA5及びpCD−NDVHNを使用した(SP6/T7 Transcription kit,Roche)。
【0109】
rNDV/AIVH5−A及びB中の挿入されたAIVH5遺伝子の転写を確認するために、NDV/AIVH5組み換え感染された一次ニワトリ胚繊維芽細胞の全RNAを用いて、ノーザンブロット分析を行った。NDVクローン30及びAIVA/ニワトリ/イタリア/8/98(H5N2)感染細胞のRNA調製を、対照として使用した。遺伝子特異的cRNAを用いて、rNDV/AIVH5−A及びrNDV/AIVH5−Bに関して、挿入されたAIVH5遺伝子の転写を検出した(図3)。AIV−H5B転写物が約81ヌクレオチド伸長されていること、AIV−H5A転写物より豊富に存在していることを観察することができる。
【0110】
・ウェスタンブロット分析
CEK細胞をNDVクローン30、rNDV/AIVH5−A、rNDV/AIVH5−B及びAIVA/ニワトリ/イタリア/8/98(H5N2)に感染させ、37℃で20時間温置した。SDS−PAGE(約104細胞/レーン)によって、感染細胞及び非感染対照細胞の可溶化液を分離し、ニトロセルロースフィルター(Trans−Blot(R)SD cell,Bio−Rad)に転写した。それぞれ、1:20000及び1:2500の希釈で、NDVに対するポリクローナルウサギ抗血清又はサブタイプH5のAIVに対するポリクローナルニワトリ抗血清とともにブロットを温置した。X線フィルム(Hyperfilm(R)MP,Amersham)上のSuperSigna(R)West Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce)を使用する化学発光によって、ペルオキシダーゼが連結された種特異的二次抗体の結合を検出した。
【0111】
ウェスタンブロット分析では、H5タンパク質は、rNDV/AIVH5−B感染細胞中においてのみ検出可能であった。AIVサブタイプH5特異的抗血清は、約70及び50kDaの2つの主要なタンパク質並びにNDVクローン30感染細胞中には見出されなかった約25kDaの殆ど見えないタンパク質を検出した(図4)。
【0112】
・間接免疫蛍光(IF)試験
間接IF試験のために、CEK細胞をNDVクローン30、rNDV/AIVH5−A、rNDV/AIVH5−B及びAIVA/ニワトリ/イタリア/8/98(H5N2)に、低いMOIで20時間感染させた。メタノール及びアセトン(1:1)で固定した後、続いて、それぞれ、1:3000及び1:100の希釈で、NDVに対するポリクローナルウサギ抗血清又はサブタイプH5のAIVに対するポリクローナルニワトリ抗血清の何れかとともに細胞を温置した。抗ウサギIgGのF(ab)2断片及びフルオレセイン連結された抗ニワトリIgG抗体試料との温置後、慣用の蛍光顕微鏡によって、試料を分析した。
【0113】
感染したCEF細胞の間接IF試験によって、H5発現を調べた。NDV特異的抗血清との温置後に、NDVクローン、rNDV/AIVH5−A及びrNDV/AIVH5−Bに感染された細胞中で顕著な蛍光を検出することが可能であったが、AIVA/ニワトリ/イタリア/8/98(H5N2)に感染された細胞中又は非感染細胞中では検出することができなかった(図5、右パネル)。AIVサブタイプH5特異的抗血清との温置は、AIV感染細胞中に顕著な蛍光を示した。2つの組み換え体を比較すると、rNDV/AIVH5−Bは、rNDV/AIVH5−Aより強烈なH5特異的蛍光を示し、H5タンパク質のより高い発現レベルを示唆した(図5、左パネル)。
【0114】
・免疫電子顕微鏡
Formvarで被覆された銅の格子に、ウイルス粒子を7分間吸着させた。0.5%ウシ血清アルブミンを含有するPBSで格子を4回洗浄し、続いて、NDV特異的又はAIVサブタイプH5特異的抗血清とともに45分間温置した。PBで数回洗浄した後、プロテインAゴールド(10nm,PAG10,Biocell International)又はウサギ抗ニワトリゴールド(10nm,RCHL10,Biocell International)とともに、格子をさらに45分間温置した。PBでの最終洗浄後、リンタングステン酸(PTA、pH7.2)でウイルス粒子を対比し、電子顕微鏡を用いて調べた。
【0115】
NDVクローン30又はrNDV/AIVH5−Aのビリオンを調べると、NDV特異的抗血清を用いた場合のみ染色が観察された。これに対して、rNDV/AIVH5−Bに関しては、NDVに対する抗血清を用いて染色が観察されるとともに、AIVに対する抗血清を使用することによっても染色が観察され、rNDV/AIVH5−BのビリオンがヘマグルチニンH5を含有することを示している。金粒子は、主に、rNDV/AIVH5−Bビリオンの表面に沿って見出され、ヘマグルチニンがウイルスの膜に固着されたことを示唆している。
【実施例3】
【0116】
NDV/AIVH5ベクターのインビトロでの性質決定
組み換えrNDV/AIVH5−A及びrNDV/AIVH5−Bによる保護の評価:
1日齢のニワトリを、2つの群へ無作為に割り振り、スプレーを介して、rNDV/AIVH5−Aの106EID50又は市販のNDVクローン30ワクチン(Nobilis(R),Intervet,NL)を眼鼻的にワクチン接種した。28日齢の時点で、同じように、第二の免疫化を施した。第二の免疫化から12日後に、HI試験によって、NDV及びAIVH5抗体の存在を評価するために血液を集めた。第二のワクチン接種から2週後に、免疫化された群を分け、高度に病原性のAIV単離株A/ニワトリ/イタリア/8/98(H5N2)の108EID50で、眼鼻的に各群の一部に攻撃誘発を行った。残りのニワトリは、強毒性NDVに対するワクチンの防御効果を評価するために使用した。従って、トリ及びさらなる対照動物は、筋肉内に、NDV株Herts33/56の105.3EID50を受けた。
【0117】
免疫化及び攻撃誘発感染後、臨床兆候に関して、全てのトリを10日の期間にわたって毎日観察し、健康(0)、病気(1;以下の兆候の1つ:呼吸器兆候、抑うつ、下痢、チアノーゼ、浮腫、神経兆候)、重度の病気(2;以下の兆候の2以上:呼吸器兆候、抑うつ、下痢、チアノーゼ、浮腫、神経兆候)又は死亡(3)として分類した。
【0118】
この期間にわたる全てのニワトリ/群の平均値に相当する臨床スコアを計算した。最後に、攻撃誘発から3週後、AIV及びNDVに対する抗体力価を評価するために、生存している全ての動物から血液試料を採取した。
【0119】
ほぼ同一の実験デザインの別個の動物試験において、NDV組み換えrNDV/AIVH5−Bを検査した。唯一の差は、rNDV/AIVH5−B又はNDVクローン30ワクチンの106EID50での免疫化が両群において眼鼻的に施されたこと、及びNDV攻撃誘発感染が行われなかったことであった。
【0120】
これらの実験の全データは、表4及び図6に要約されている。ワクチン接種から3週後に、HI試験によって、免疫化されたニワトリの血清を分析したが、何れの事例でも、HA特異的血清抗体は検出することができなかった。第一の免疫化(26−27の平均HI力価)後に、既に、両群の全ての動物は、高いレベルでNDV特異的抗体を生成し、強毒性NDVでの感染に対して動物が完全に保護されたのに対して、NDの典型的な兆候を示して、4日以内に、全ての対照動物が死亡した。予想されたとおり、AIV攻撃誘発感染は、NDVIクローン30で免疫化されたニワトリに、90%の死亡率で、重い疾病を引き起こした。rNDV/AIVH5−Aによって免疫化された群の動物は、高度に病原性のAIVの致死用量を生き延びたが、全てのニワトリは、0.64の臨床スコアで、トリインフルエンザの変動する兆候を示し、有意であるが、部分的な保護であることを示唆した。しかしながら、rNDV/AIVH5−Bで免疫化されたニワトリは、高度に病原性のトリインフルエンザAウイルスでの感染後に、疾病のあらゆる兆候に対して完全に保護された。
【0121】
【表4】
【実施例4】
【0122】
NDVF遺伝子由来の隣接するncrを有するNDV/AIV−H5ベクターの構築
上述のものと実質的に同一の方法及び材料を用いて(Engel−Herbert et al.,上記)、以前に記載されたプラスミドpflNDV(Romer−Oberdorfer et al.,上記)のF及びHN遺伝子間にH5AIV遺伝子を担持するNDVベクター構築物が作製されたが、ここでは、H5挿入物は、NDVF−遺伝子由来の非コード領域と隣接していた。
【0123】
簡潔に述べると、使用した様々な工程及び材料は、以下のとおりであった。
【0124】
突然変異導入プライマー:pMPMLUIGRFHNF
【0125】
【化1】
(MluI部位には下線が付されており、GS配列は太字で記載されている。)を用いて、MluI制限酵素部位を作出するために、NDVH5(pUCIRA)の1.6kbNotI−PstI断片を有するpUCプラスミドを変異させ、プラスミドpUCIRAMLUを得た。
【0126】
2つのオリゴ:OFVOF:5’−agg acg cgt tac ggg tag aag att ctg gat ccc ggt tgg cgc cct cca ggt gca gca cca tgg ag−3’(配列番号16、MluI部位に下線が付されている。)及びOFVOR:5’−etc cat ggt gct gca cct gga ggg cgc caa ccg gga tec aga atc ttc tac ccg taa cgc gtc ct−3’(配列番号17、MluI部位に下線が付されている。)を徐冷した。次に、MluI及びNcoIでこれらを消化した。
【0127】
MluI及びNcoIでのプラスミドpUCIRAMLUの消化
pUCIRAMLUの約4.3kbのMluI−NcoI断片の、MluI−NcoIによって消化されたOFVOF/OFVORオリゴハイブリッドとの連結。得られたプラスミドは、pUC1RA2と名付けられた。
【0128】
HNorfの代わりにH5orfを有するNDVのNotI−BsiWI断片を有するpUCプラスミド(pUCAROK)及びpUCIRA2を、NcoI及びSgfIで消化し、pUCAROKのNotI−NcoI断片をpUCIRA2のNotI−NcoI断片によって置換して、プラスミドpUCAROK2を得た。
【0129】
プライマーPNCRFHIF:5’−ata ctt aag ttc cct aat agt aat ttg tgt−3’(配列番号18,AflII部位に下線が付されている。)及びPNCRFHIR:5’−cac gag atc gca ttg cca ctg tac att ttt tct taa ctc tct gaa ctg aca gac tac c −3’(配列番号19、SgfI部位に下線が付されている。)及びプラスミドpUCAROA(NDVのNotI−SpeI断片を有するpUC)を用いて、挿入されたF遺伝子の後ろにNDVF遺伝子のncrを増幅するためにHF−PCR(Roche)を実施した。得られた約100bp断片をpGEMTeasyベクター中に連結して、pGEMFncrhiプラスミドを得た。
【0130】
プラスミドpUCAROK2のH5の後ろのHNncrを、pGEMFncrhi由来のFのものによって置換するために、pUCAROK2及びpGEMFncrhiプラスミドをAflII及びSgfIで消化した。得られたプラスミドは、pUCAROK4と名付けられた。
【0131】
最後の工程において、NDVH5プラスミドのNotI−SgfI断片を、pUCAROK4のものによって置換して、F及びHNの間においてNDVベクター中に挿入されたAIVH5遺伝子を含み、F遺伝子ncrによって隣接された新しい完全長プラスミドE18Cを得た。
【0132】
新しい構築物形質移入実験を用いて、recウイルスの増殖及び伝染性ウイルスの回収の確認を上述のように実施した。次に、生化学的に及び生物学的にウイルスを性質決定した。
【実施例5】
【0133】
他のNDVベクター構築物及びrecウイルスの作製:
類似の技術を使用し、異なる挿入遺伝子及び異なる挿入部位を用いて、幾つかの他の挿入物をNDVベクター中に作製した。
【0134】
本明細書に既に記載されている詳細を用いて、これらは全て当業者が容易に到達できる範疇にあり、従って、これらは表の形態で与えれば十分である。
【0135】
【表5】
【実施例6】
【0136】
EIAVエンベロープ遺伝子を発現する組み換え狂犬病ウイルスベクターの作製
本発明の有利な効果(recMVビリオン中の外来タンパク質の発現及び/又は提示を増加させるためのMV遺伝子非コード領域の使用)は、パラミクソウイルス科を超えて及ぶことを実証するために、無関係なウイルスであるウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)から得られたエンベロープタンパク質を発現させるためのベクターとして、ラブドウイルス科のメンバーである狂犬病ウイルスを使用した。
【0137】
本実施例では、狂犬病遺伝子G及びLの間に挿入されたEIAVエンベロープタンパク質を含むrec狂犬病ベクターウイルスの構築物が記載されており、ここで、env遺伝子は狂犬病Gタンパク質遺伝子由来のncrに隣接している。
【0138】
SAD−D29完全長クローンを用いて、狂犬病ウイルスのサブクローンをpBluescript(R)SK+ファジミド中に調製し(Mebatsion,2001,J.Virol.,vol.75,p.11496−11502)、ここでは、ORA−Dと称する。クローニングベクターを調製するために、まず、SacIでpSKベクターを消化し、Klenow酵素で平滑末端化した後、HindIIIで消化し、約3Kb断片のゲル精製を行った。StuI及びHindIIIでORA−Dを消化し、得られた1.3kb断片を精製し、調製されたpSKベクター中への連結によって、挿入物を調製して、プラスミドpNCR−bを作製した。
【0139】
BstXI及びHindIIIでpNCR−bプラスミドを消化し、約4.0kb断片を精製し、最小転写カセットを含有するプラスミドpSSNscを作出するためのオリゴBSSNH+及びBSSNH−(表6参照)との連結及び最小の転写単位の他に非コード領域を含有する構築物GNCR−bを作製するためのオリゴRABGNCR1−4(表6)との連結のために使用した(図7)。
【0140】
コドンが最適化され、RNAスプライス部位が除去され(Cook,et al.2005,Vet.Micro.,vol.108,p.23−37)、元の遺伝子の3’コード領域の134アミノ酸が末端切断された2052ヌクレオチドの合成遺伝子からの増幅によって、EIAV株ワイオミングenv遺伝子を得た。
【0141】
【表6】
【0142】
増幅されたenv遺伝子をキナーゼ処理し、以下のようにサブクローン中へ挿入した。プライマーセットEIAsynCDF+EIAsynCDstopRを用いて、末端切断されたEIAVエンベロープタンパク質全体に対応するように加工された約2.0Kbアンプリコンを作製した(表6参照)。SnaBiで予め消化され、脱リン酸化されたサブクローンGNCR−b中にアンプリコンを挿入して、組み換えプラスミドpGNCR−b:envGを作製した。NheIで予め消化され、平滑末端化され、及び脱リン酸化されたSSNscサブクローン中に約2.0Kb断片を挿入して、組み換えプラスミドpSSNsc−b:envを作製した。
【0143】
SphI及びHindIIIで、各組み換え構築物を消化し、SSNscサブクローン中に連結し、これをSphI/HindIIで予め消化し、CIAPで脱リン酸化した。SSNscサブクローンに復帰した後、修飾された挿入物は、SphI及びMluIでの消化によってORA−D骨格に復帰して、組み換え狂犬病ウイルスRV−env及びRV−envGが生成された(図8)Big−Dye(R)Terminator Cycle Sequencing chemistry(Applied Biosystems)を用いた配列分析によって構築物の5’及び3’末端を確認し、Applied Biosystems 3100− Avant Capillary Electrophoresis Sequencerを用いて分析した。
【0144】
修飾されたSAD狂犬病株ORA−Dを基礎とする完全長cDNAクローンの構築及び組み換え狂犬病ウイルスの作製が記載されている(Schnelt et al.,1994,EMBO J.,vol.13,p.4195−4203;Mebatsion,2001、上記)。Mirus Trans−IT−LT1を用いて、以前に記載されたように(Schnell,et al.,1994,上記)、各組み換え狂犬病ウイルスをBSR細胞中に形質移入した。形質移入から3日後に、細胞及び上清を採集し、継代した。その後の継代は、0.5の推定moiを使用する上清のみによって行った。安定性を確認するために、各組み換えウイルスは、最低5回継代した。
【0145】
組み換え狂犬病に感染したBSR細胞を、感染から約40時間後に固定した。FITC抗狂犬病モノクローナルグロブリン(FDI Diagnostics Inc.)を用いた又は抗EIAVポリクローナルウマ血清を用いた直接免疫蛍光によって、これらを分析した。10倍の系列希釈において、ウイルス安定性及び組み換え抗原発現をモニターするために、狂犬病ウイルスを産生する感染細胞の比を、EIAVenvを発現する感染細胞とも比較した。
【0146】
0.01のmoiの新鮮なBSR細胞を有するT−75フラスコ中に、継代5から得られた組み換え狂犬病ウイルスを接種した。感染から24時間後、培地を無血清に交換した。感染から72時間後に、上清を集め、遠心(10,000×g)によって清澄化した。精製されたビリオンを分析するために、スクロース勾配によって、ウイルス上清を精製した。
【0147】
精製されたビリオン及び全ての感染された細胞タンパク質を、2×Laemmli還元試料緩衝液と合わせ、5から10分間、沸騰水中に入れた。1×SDS−PAGE Running Buffer中の10%Tris−HCLアクリルアミドゲル(Bio−Rad)上に試料を載せた。色素の先頭がゲルの底付近に又はゲルの底に位置するまで、SDS−PAGEゲルを20mAで走行させた。225mAで45分間ブロッティングすることによって、Immobilon−P(PVDF)膜(IPVH10100,Immobilon)上に、分離したタンパク質を転写した。室温で1時間、ブロッキング緩衝液(PBS−Tween20+1%乾燥無脂肪乳)中でブロックを温置し、次いで、PBS−Tween20中で、5分間、3回濯いだ。ブロッキング緩衝液中の、それぞれ、1:20000及び1:2,000に希釈された狂犬病糖タンパク質及び核タンパク質に対して誘導されたウサギ抗狂犬病ポリクローナル血清を用いて、狂犬病発現を検出した。
【0148】
同時に、ブロッキング緩衝液中に1:500希釈された抗EIAVポリクローナルウマ血清を用いて、EIAVenv発現を検出した。室温で1時間、ブロットを温置し、次いで、PBS−Tween20中で5分間、3回濯いだ。それぞれ、ブロッキング緩衝液中に1:2000希釈された、HRP標識された連結体ヤギ抗ウサギIgG(H+L)(KPL)及びHRP標識された連結体ヤギ抗ウマIgG(H+L)(Bethyl Labs)中にブロットを配置し、室温で1時間温置した。次いで、PBS−Tween20中で、ブロットを3×5分濯いだ。展開が完結するまで(約1から3分)、TMB膜ペルオキシダーゼ基質(KPL)中でブロットを温置した。反応を停止させるために、ブロットを蒸留水中に配置した。
【0149】
このようなウェスタンブロット実験の典型的な結果が図9に示されており、EIAVエンベロープタンパク質を発現する組み換え狂犬病ウイルスのタンパク質組成を示している。
【0150】
レーン1:広範囲の分子量ラダー(Bio−Rad);
レーン2:ORA−D骨格ウイルス:
レーン3:狂犬病G及びL遺伝子の間に挿入され、隣接するncrを持たないEIAV−env遺伝子を含むRV−env
レーン4:狂犬病ウイルスGタンパク質のncr領域に隣接するEIAV−env遺伝子を含むRV−envG
両組み換え狂犬病ウイルスは、同等の感染力価を与え、インビトロでの複数回の継代後に、EIAV−env遺伝子挿入物を安定に発現した。
【0151】
しかしながら、ウェスタンブロットへビリオンの同等量を供したにもかかわらず、通常の様式で構築された(従って、隣接するncrを持たない。)組み換えRV−envは、EIAV−envタンパク質に対応する極めて弱いバンドのみを示した。これに対して、挿入されたEIAV−envタンパク質に隣接するGタンパク質非コード領域を有する組み換えウイルスRV−envGは、ずっと高い割合で発現された。図9、レーン3から4中のenvタンパク質に対するバンドを比較されたい。
【0152】
RV−envG及びRV−envの構築物及び挿入物は、それ以外では同一なので、外来タンパク質の産生及び免疫提示の高いレベルを促進する上で、非コード領域が正の効果を有するという確かな証拠である。
【図面の簡単な説明】
【0153】
【図1A】rNDV/AIVH5−Aを示す図である。
【図1B】rNDV/AIVH5−Aを示す図である。
【図2A】NDVクローン30HN隣接配列を示す図である。
【図2B】AIV−H5遺伝子挿入物及びNDV−HN隣接配列を有するrNDVを示す図である。
【図3】ノーザンブロットを示す図である。
【図4】ウェスタンブロットを示す図である。
【図5】IF試験を示す図である。
【図6】臨床指標及び死亡率を示す図である。
【図7】GNCR/SSN構築物のクローニング領域を示す図である。
【図8】組み換え狂犬病/EIAV構築物の要約を示す図である。
【図9】狂犬病−EIAVenv精製されたビリオンのウェスタンブロットを示す図である。
【技術分野】
【0001】
本発明は、上流のモノネガウイルス目ウイルス遺伝子開始(GS)配列及び下流のモノネガウイルス目ウイルス遺伝子終了(GE)配列と作用可能に連結された外来遺伝子を含む追加の転写単位を保有する組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターに関し、並びにこのようなモノネガウイルス目ウイルスベクターを含むワクチンに関する。
【背景技術】
【0002】
感染した宿主中で複製することができる生ウイルスは、それらの発現された抗原に対して強力で、長期間持続する免疫応答を誘導する。生ウイルスは、液性免疫応答及び細胞媒介性免疫応答を惹起する上で、並びにサイトカイン及びケモカイン経路を刺激する上で有効である。従って、弱毒化された生ウイルスは、通例、免疫系の液性アームのみを刺激することが多い不活化された免疫源又はサブユニット免疫源を基礎とするワクチン組成物に比べて極めて優位である。
【0003】
ここ10年にわたって、組み換えDNA技術は、DNAとRNAウイルスのゲノムの遺伝子操作の分野に大きな変革をもたらした。特に、現在では、宿主動物中で新たなベクターウイルスが複製した際に、宿主動物中で生物学的効果を発揮することができる外来タンパク質が発現されるように、ウイルスのゲノム中に外来遺伝子を導入することが可能である。このような組み換えベクターウイルスは、微生物感染の管理及び予防のために活用されてきたのみならず、悪性腫瘍及び遺伝子療法などの非微生物学疾患のための標的療法を考案するためにも活用されてきた。
【0004】
1994年に最初に報告された「逆遺伝学」と称される技術(Schnell et al.,EMBO J.,13,4195−4203,1994)によって、専らクローニングされたcDNAから得られたセグメント化されていないマイナス鎖のRNAウイルス(モノネガウイルス目のウイルス)の作製によって、モノネガウイルス目(MV)のウイルスもベクターとして使用することが可能となった。それ以来、病原体に対するワクチンを開発することを目指して、その病原体に由来する外来抗原を発現するために、ウイルスベクターとしてMV目の多くのウイルスの使用を記載する研究が公表されてきた。
【0005】
モノネガウイルス目は、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科及びボルナウイルス科という4つの主な科に分類される。これらの科に属するウイルスは、単一の負の(−)センスRNA分子によって表されるゲノムを有する。すなわち、RNAゲノムの極性は、プラス(+)センスとして表されるメッセンジャーRNA(mRNA)の極性とは反対である。主なヒト及び動物のMVウイルスの分類が、下表に示されている。
【0006】
【表1】
【0007】
MV目のウイルスのゲノムの組織及び生活環の詳細は、近年、詳細に理解されており、様々な著者によって概説されている(Neumann et al.,J.Gen.Virology 83,2635−2662,2002;Whelan et al.,Curr.Top.Microbiol.Immunol.203,63−119,2004;Conzelmann,K.;Curr.Top.Microbiol.Immunol.203,1−41,2004)。モノネガウイルス目ウイルスは異なる宿主及び別個の形態学的及び生物学的特性を有しているが、ゲノムの構成並びに複製及び遺伝子発現の典型的なモードにとって不可欠な要素など多くの特徴を共有しており、モノネガウイルス目ウイルスは共通の祖先から生じたことを示している。モノネガウイルス目ウイルスは、細胞の細胞質中で複製し、スプライシングされていないmRNAを産生する、エンベロープに包まれたウイルスである。
【0008】
モノネガウイルス目ウイルスは、リボヌクレオタンパク質(RNP)複合体及びエンベロープという2つの主な機能単位からなる。上に上げられている全ての科の属の代表的ウイルスに対する完全なゲノム配列が決定されている。ゲノムは約9,000ヌクレオチドから約19,000のサイズの範囲であり、5から10個の遺伝子を含有する。MVウイルスのゲノムの構造及び構成は極めて似通っており、ウイルス特有の遺伝子発現様式によって支配されている。MVウイルスゲノムは全て、ヌクレオタンパク質(N又はNP)、ホスホタンパク質(P)及びRNA依存性RNAポリメラーゼ(L)をコードする3つのコア遺伝子を含む。ウイルスのエンベロープは、マトリックス(M)タンパク質、並びにウイルスの集合/出芽及びウイルスの細胞付着及び/又は侵入において役割を果たしている1つ又はそれ以上の膜貫通糖タンパク質(例えば、G、HN及びFタンパク質)から構成される。属に応じて、タンパク質のレパートリーは、転写及びウイルス複製においてある種の特異的な制御機能を示し、又はウイルス宿主反応に関与する補助タンパク質(例えば、C,V及びNSタンパク質)によって拡張される。MVウイルスの遺伝子順序は極めて保存されており、コア遺伝子N及びPが3’末端又は3’末端付近に位置し、巨大(L)遺伝子が5’遠位に位置する。表面糖タンパク質遺伝子M及び他の補助遺伝子は、N、P及びL遺伝子の間に位置している。
【0009】
RNP複合体において、ゲノム又はアンチゲノムRNAは、Nタンパク質とともに強固にキャプシドを形成しており、L及びPタンパク質からなるRNA依存性RNAポリメラーゼを伴う。細胞の感染後に、RNP複合体は、2つの異なるRNA合成機能(すなわち、サブゲノムのmRNAの転写及び完全長ゲノムRNAの複製)に対する鋳型としての役割を果たすが、裸のRNAゲノムは鋳型としての役割を果たさない。
【0010】
直列に配置された遺伝子は全て、いわゆる「遺伝子接合部」構造によって隔てられている。遺伝子接合部は、保存された「遺伝子終了」(GE;gene end)配列、転写されない「遺伝子間領域」(IGR)及び保存された「遺伝子開始」(GS)配列を含む。これらの配列は、遺伝子転写のために必要且つ十分である。転写の間に、各遺伝子は、最初のGS配列におけるゲノムRNAの3’末端において転写プロセスを開始するウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼによって、mRNAに順次転写される。各遺伝子接合部の転写は、GE配列におけるRNAポリメラーゼの離脱の結果として中断される。転写の再開は後続のGS配列において起こるが、低下した効率で起こる。この中断されたプロセス(「停止−開始」プロセスとも称される。)の結果、後続の下流遺伝子に比べて、MVウイルスゲノム上の3’近位遺伝子がより豊富に転写されるために、各遺伝子接合部では、転写の弱化が生じる。各遺伝子が別個のシストロン又は転写単位の一部であるMVウイルス遺伝子の転写のモジュール形態のために、これらのウイルスは、外来遺伝子の挿入及び発現のために極めて適切なものとなる。MVウイルスゲノム中の各転写単位は、以下の要素:3’−GS−翻訳領域(ORF)−GE−5’を含む。
【0011】
MVウイルスゲノムの全ては、3’及び5’ゲノム末端に、それぞれ、「リーダー」(約40から50nt)及び「トレーラー」(約20から600nt)と称される転写されない短い領域を有する。リーダー及びトレーラー配列は、ゲノムRNAの複製、ウイルスのキャプシド形成及びパッケージングを調節する必須の配列である。
【0012】
逆遺伝学技術及び伝染性MVウイルスの救出によって、そのcDNAコピーを通じてそのRNAゲノムを操作することが可能となった。ウイルスRNAを合成するために必要とされる最小の複製開始複合体がRNP複合体である。感染性MVウイルスは、(T7)RNAポリメラーゼによって駆動されるプラスミドからの(アンチ)ゲノムRNA及び適切な支持タンパク質の細胞内同時発現によって救出することができる。Schnell et al.,1994(上記)による1994年の最初の報告以来、当初のプロトコール(又はその僅かな変形プロトコール)に基づいて、多くのMVウイルス種の信頼できる回収が達成されている。
【0013】
ニューキャッスル病及びトリインフルエンザは家禽の重要な病気であり、世界中の家禽産業に著しい経済的損失をもたらし得る。ニューキャッスル病ウイルスは、MV目に属する、セグメント化されていない負鎖のRNAウイルスである。約15kbの長さであるゲノムは、ヌクレオタンパク質(NP)、リン酸化タンパク質及びVタンパク質(P/V)、マトリックス(M)タンパク質、融合(F)タンパク質、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ(HN)タンパク質及びRNA依存性RNAポリメラーゼ又は巨大(L)タンパク質をコードする6つの遺伝子を含有する。NDV遺伝子は、3’−NP−P−M−F−HN−L−5’の順序で順に配置されており、異なる長さの遺伝子間領域によって隔てられている。全ての遺伝子には、遺伝子開始(GS)配列が先行しており、その後に、非コード領域、NDVタンパク質をコードする翻訳領域、第二の非コード領域及び遺伝子終了(GE)配列が続いている。NDVゲノムの長さは、6の倍数であり、外来遺伝子の導入のために考慮しなければならない。
【0014】
トリインフルエンザ(AI)は、穏やかな呼吸症状ないし死亡率が高い重度の疾病によって特徴付けられる家禽の病気である。原因因子は、オルトミクソウイルス科に属するトリインフルエンザA型ウイルス(AIV)である。AIVは、10個のタンパク質をコードする負の極性を有する8つのゲノムRNAセグメントを含有する。表面糖タンパク質ヘマグルチニン(HA)及びノイラミニダーゼ(N)の抗原性に基づいて、AIウイルスはサブタイプに分類された。現在まで、16のヘマグルチニン(H1からH16)及び9つのノイラミニダーゼ(N1からN9)サブタイプが知られている。H及びNに対する抗体は、液性免疫応答において重要であり、感染を阻害し、又は疾病を予防する。
【0015】
トリインフルエンザ及びニューキャッスル病ウイルスは、それらの病原性に従って2つの異なる病原型に分けることができる。低病原性のAIV(LPAI)又は弱毒性(lentogenic)NDVによって引き起こされる症候は、より重要性が低いと考えられている。これに対して、高病原性ウイルス(NDV:中等毒性(mesogenic)株及び強毒性(velogenic)株)によって引き起こされる高度に病原性のトリインフルエンザ(HPAI)及びニューキャッスル病は、法定伝染病である。
【0016】
弱毒性NDV株を用いたNDVに対する定型的なワクチン接種は、高度に病原性のNDV株に対してニワトリを保護するために行われているが、HPAIは根絶戦略によって駆除されるので、多くの国で、HPAIに対するワクチン接種は行われていない。しかしながら、損失を最小限に抑え、及び疾病の発生を低減するための戦略として、ワクチン接種を使用し得る。ワクチンによって誘導された免疫はサブタイプ特異的であり、これは、サブタイプH5ワクチンはH5AIVに対して保護することができるが、他のHサブタイプに対しては保護できないことを意味する。通常、LPAIウイルスのヘマグルチニンは、肺に限局したセリンプロテアーゼであるトリプターゼClaraによってのみ切断され得るのでインフルエンザウイルスの複製は肺に限局している。これまでのところ、全てのHPAIウイルスがH5及びH7サブタイプのものであった。これらのHPAIウイルスは、遍在性のフューリン及びサブチリシン様酵素によって、サブユニットHA1及びHA2へ切断され得るように、H切断部位の複数の塩基性アミノ酸を含有する。従って、このようなウイルスは、他の臓器中で増殖することができる。
【0017】
サブタイプH5及びH7ワクチンは、HPAIによる感染後の臨床兆候及び死亡に対して、ニワトリ及びシチメンチョウの保護を与えることができる。旧来の不活化されたオイルベースの完全なAIVの他に、ベクターウイルス、サブユニットタンパク質及びDNAワクチンがAIに対する免疫に関して有効であることが実験的に示されている。様々なウイルスに対する逆遺伝学の登場以来、ワクチンベクターとして使用するための組み換えウイルスの作製は重要な応用である。外来タンパク質を発現する、異なる組み換え負鎖RNAウイルスが構築されてきた。また、AIVのヘマグルチニンは、伝染性咽頭気管炎ウイルス(ILTV)(Luschow et al.,Vaccine 19,4249−59,2001)、牛疫ウイルス(Walsh et al.,J.Virol.74,10165−75,2000)及び水疱性口内炎ウイルス(VSV)(Roberts et al.,J.Virol.247,4704−11,1998)のような様々なベクターウイルス中に挿入された。
【0018】
牛疫ウイルスは、口蹄疫ウイルスVP1キャプシドタンパク質の発現のためのベクターウイルスとしても使用された(Baron et al.,1999,J.ofGen.Virol.,vol.80,p.2031−2039)。
【0019】
Taoら(1998,J.ofVirol.,vol.72,p.2955−2961)は、内在性のhPIV3型HV及びF遺伝子を(付加ではなく)置換するために、hPIV1型由来のHN及びF遺伝子が使用されたキメラヒトパラインフルエンザウイルス(hPIV)3型の構築を記載している。
【0020】
NDVは、AIVヘマグルチニンの発現のためにも使用された。インフルエンザA/WSN/33のヘマグルチニン遺伝子は、NDV株HitchnerB1のP遺伝子とM遺伝子の間に挿入された。この組み換え体は致死的な感染からマウスを保護したが、マウスに検出可能な体重減少が存在し、10日以内に完全に回復したNakayaら(J.Virol.75,11868−73,2001)。外来遺伝子に対する同一の挿入部位を有するさらなる組み換えNDVはLPAIのH7を発現したが、ワクチン接種されたニワトリの40%が強毒性NDV及びHPAIの両者から保護されたに過ぎなかった(Swayne et al.,Avian Dis.47,1047−50,2003)。
【0021】
しかしながら、これらの公報は、MVベクターのゲノム中に挿入されたさらなる外来遺伝子の発現に対する、内在性MV遺伝子のいわゆる非コード領域の有利な効果を開示していない。
【0022】
ベクターウイルスのゲノム中に挿入された外来遺伝子によってコードされるタンパク質のより高い発現レベルを示し、及び/又は既存のMVウイルスベクターより強い免疫原性を示す組み換えMVウイルスベクターを提供することが本発明の目的である。
【0023】
本発明者らは、本発明に係る組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターによって、この目的を達し得ることを見出した。従って、本発明は、上流のモノネガウイルス目ウイルス遺伝子開始(GS)配列及び下流のモノネガウイルス目ウイルス遺伝子終了(GE)配列と作用可能に連結された外来遺伝子を含む追加の転写単位を保有する組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターであり、前記GS配列と前記外来遺伝子の開始コドンとの間に、及び前記外来遺伝子の停止コドンと前記GE配列の間に、それぞれ、モノネガウイルス目ウイルス遺伝子の3’非コード領域及び5’非コード領域(ゲノムセンス)が位置していることを特徴とする、前記組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターを提供する。
【0024】
ここでの及び本明細書の他の箇所での核酸鎖の極性の表記は、mRNA及びcDNA配列の場合を除き、ゲノム(−)センスで与えられていることに注意されたい。
【0025】
MVウイルスのゲノム中に挿入された外来遺伝子を含む転写単位中のMVウイルス遺伝子の3’及び5’非コード領域の存在は、外来遺伝子の転写及び/又は発現に対して正の効果を有することが見出された。GS配列とトリインフルエンザウイルス(AIV)ヘマグルチニン(HA)遺伝子の間に及びAIVHA遺伝子とGE配列の間に、MVウイルス遺伝子の非コード領域を設計することによって、AIVHA遺伝子を保有するMVウイルスベクターによって合成されるHAmRNAの量が増加することが図3に示されている。タンパク質発現レベルに対しても、正の効果が観察される。MVウイルスベクターの比較は、外来AIVHA遺伝子を保有するMVウイルスベクターが非コード領域に隣接している場合に、AIVHA特異的抗血清での強烈な免疫学的染色を示したに過ぎなかった(図4)。従って、本発明者らは、これらの観察を説明し得る何れの理論又はモデルにも拘泥することを望まないが、外来遺伝子に隣接するMVウイルス非コード領域の存在は、生じたMVウイルスベクターの性能に対して正の効果を有することを見出した。
【0026】
外来遺伝子は、ポリペプチド又はタンパク質をコードし、レシピエントMVウイルスのゲノム中に本来存在しないポリヌクレオチド分子である。
【0027】
上で既に詳しく記載されているように、MVウイルスのゲノムの構成の共通する特徴は、直列に配置された転写単位が連続的に転写される、それらの転写のモジュール形態である。野生型MVウイルスでは、転写された遺伝子は、(i)それらの3’末端において、GS配列及び本分野において「非コード領域」と表記されるヌクレオチド配列と隣接しており、並びに(ii)それらの5’末端において、本分野において同じく「非コード領域」と表記されるヌクレオチド配列及びGE配列と隣接している。従って、本明細書において使用される(3’又は5’)「非コード領域」という用語は、MVウイルスの天然遺伝子の上流(3’)又は下流(5’)に位置し、それぞれ、GS配列とMVウイルス遺伝子の開始コドン(ATG)との間の領域及びMVウイルス遺伝子の停止コドン(TAA、TAG又はTGA)とGE配列との間の領域を貫くヌクレオチド配列を定義する。本明細書において使用される非コード領域は、ベクターウイルスと同じウイルスの遺伝子に由来する(すなわち、非コード領域は、MVウイルスベクターと相同である。)。
【0028】
様々なMVウイルス遺伝子のヌクレオチド配列及びそれらの転写調節(GS及びGE)配列及び遺伝子に隣接する非コード配列など、MVウイルスのゲノムの構成の詳しい情報は、本分野において公知である。このような情報は、例えば、インターネット上でNational Center for Biotechnology Informationv(NCBI)のウェブサイトを通じて、National Center for Biotechnology Informationv(NCBI)のデータから入手することができる(表2及び3参照)。
【0029】
本発明において好ましく使用される非コード配列は、天然のMVウイルス遺伝子に由来するが、天然の非コード領域中の1つ又はそれ以上のヌクレオチドの置換も、本発明に属すると考えられる。特に、それぞれ、外来遺伝子の開始/停止コドンのすぐ上流又は下流に位置しており、これらの領域の遺伝的操作を可能とする人工の制限酵素切断部位の導入から得られるヌクレオチド置換が想定される。
【0030】
本発明の好ましい組み換えMVウイルスベクターにおいて、非コード領域は、MVウイルスエンベロープタンパク質、特に、M、G、F若しくはHNタンパク質又はRNPタンパク質、特に、N、P若しくはLタンパク質をコードする非コード領域である。
【0031】
本発明の特に好ましい組み換えMVウイルスにおいて、非コード領域は、F又はHNタンパク質をコードする遺伝子の非コード領域である。
【0032】
本発明の組み換えMVウイルスベクター中で使用されるべき非コード領域の特異的ヌクレオチド配列が、表3に示されている。
【0033】
【表2】
【0034】
本発明において、転写調節配列として使用されるべきGS及びGE配列は、好ましくは、MVウイルスの天然遺伝子に由来するものである。これらの配列は、転写プロセスの間に、特に、転写開始及びmRNA5’末端修飾のプロセスにおいて、及び転写3’末端ポリアデニル化及び終結の調節において、RNAポリメラーゼの活性を調節すると考えられている。各MVウイルスに関して、各遺伝子の始まりは、約10ヌクレオチドの配列によって印が付されている。幾つかのMVウイルス種では、GS配列は各遺伝子に対して同じであるが、他のMVウイルス種のゲノム中のGS配列は、僅かな差を示し得る。
【0035】
mRNA3’末端ポリA尾部の形成及び転写の終結におけるそれらの共通する機能に照らして、MVウイルス中のGE配列は共通の配列特性を共有している。典型的なGE配列は、4から8ヌクレオチド長の間のウリジントラクト(U−tract)を含む。さらに、ウリジントラクトのすぐ上流に位置するC残基の強い保存が存在し、これには、A/Uに富むヌクレオチドの連なりが先行する。様々なGE配列において、ウリジントラクトのすぐ上流の4ヌクレオチドは、3’−AUUC−5’から構成される。
【0036】
ゲノムテンプレート中のヌクレオチド配列とmRNA末端に存在するヌクレオチド配列を比較することによって、MVウイルス遺伝子の遺伝子境界又は遺伝子接合部を規定する転写調節配列が多くのMVウイルス遺伝子に対して同定されてきた。さらに、多くの研究が、効率的な遺伝子発現のために必要とされるGS及びGEコンセンサス配列を同定してきた。GS及びGE配列の一般的な特徴及び具体例は、NCBI配列データベース中の情報から得ることができ(NCBI受入番号に関しては、表2を参照)、Neumannら(J.Virol.83,2635−2662,2002)及びWhelanら(Current Topics Microbiol.Immunol.203,63−119,2004)によっても概説されている。
【0037】
本発明の組み換えMVウイルスベクター中で使用されるべき特に好ましいGS及びGE配列が表3に列記されているが、GS−、NCR−及びGE配列の間の正確な境界は、必ずしも決定できるわけではないことが認められている。この配列情報は、NCBIデータベース中に開示されている(表2中の受入番号を参照されたい。)。NDVに関しては、EMBL受入番号Y18898を、RVに関しては、GenBank受入番号M31046を参照されたい。
【0038】
【表3】
【0039】
本発明の好ましい組み換えMVウイルスベクターにおいて、GS、GE配列及び非コード領域は、同じMVウイルス遺伝子に由来する。
【0040】
外来遺伝子を含む追加の転写単位を保有する組み換えMVウイルスベクターの調製方法は、本分野において周知である。例えば、表2は、様々なMVウイルス種に関して、このような組み換えベクターウイルスの調製を記載する文献を参照している。原理的には、本発明において使用される方法は、MVウイルスゲノム中に挿入されるべき外来遺伝子が、上記のように、適切な3’及び5’非コード領域に隣接していることを除き、従来技術と同じ方法である。
【0041】
本発明の一般的な方法において、組み換えMVウイルスベクターは、得られたMVウイルスベクターにおいて、特に、GE−IGR−GS要素を含むゲノムヌクレオチド配列断片によって、外来遺伝子にMVウイルス遺伝子接合部が先行し、且つ後続するように、(i)上記のような3’及び5’非コード領域に隣接している外来遺伝子及び(ii)適切な転写調節配列を含む単離された核酸分子をMVウイルスのゲノム中に挿入することによって調製される。このような上流及び下流要素の存在は、挿入された外来遺伝子の適切な転写を保証するのみならず、挿入された外来遺伝子の上流及び下流に位置する相同的なMVウイルス遺伝子の適切な転写を保証する。
【0042】
さらに具体的には、本方法において、MVウイルスの単離された核酸分子及びゲノムは、それらのcDNA形態(+センス)で使用される。これによって、所望の核酸分子の取り扱い及びウイルスゲノム中への挿入が容易になる。
【0043】
一般に、2つの遺伝子間に、すなわち遺伝子間領域(IGR)中に、遺伝子の3’又は5’非コード領域及びゲノムの3’プロモーター近位(N/NP遺伝子の前)又は5’遠位末端(L遺伝子の後)に外来遺伝子を挿入するためにゲノムの様々な部分を使用することができる。
【0044】
外来遺伝子は、N/NP遺伝子の前、NP−P,P−M、M−G/F、G/F−HN、HN−Lの間に及びL遺伝子の後に有利に挿入することができる。
【0045】
最も単純な方法は、酵素で切断し、適切な転写カセットを導入することによって、これらの部位の1つに、既存の制限酵素(RE)認識配列を使用することである。天然に存在する制限酵素認識配列は、常に所望の位置に存在しているわけではなく、RE認識部位は、位置指定突然変異導入又はPCR突然変異導入によって、ゲノム中に都合よく導入することが可能である。外来遺伝子を挿入するための適切なIGRの例は、表3に見出すことができる。
【0046】
挿入すべき転写カセットの組成は、挿入の部位に依存する。例えば、転写カセットがIGRに挿入される場合、カセットは次のエレメント:3’RE認識部位−GS−非コード領域−(外来遺伝子の)ORF−非コード領域−GE−RE認識部位5’を含み得る。
【0047】
あるいは、転写カセットが天然のMVウイルス遺伝子の5’非コード領域に導入される場合、カセットは、3’RE認識部位−GE−IGR−GS−非コード領域−(外来遺伝子の)ORF−非コード領域−RE認識部位5’から構成され得る。
【0048】
同様に、転写カセットが天然のMVウイルス遺伝子の3’非コード領域に導入されるべき場合、カセットは、3’RE認識部位−非コード領域−(外来遺伝子の)ORF−非コード領域−GE−IGR−GS−RE認識部位5’から構成され得る。
【0049】
このような転写カセットの調製及びMVウイルスゲノムへのこの挿入は、列挙した参考文献及び本発明の実施例で例示されるものなどの通常の分子生物学的技術しか含まない。特に、この目的に対して、部位特異的及びPCR突然変異誘発などの技術を使用することができる(Peetersら、1999、前出;Current Protocols in Molecular Biology、編:F.M.Ausbelら、Wiley N.Y.、1995編集、8.5.1.−8.5.9頁;及びKunkelら、Methods in Enzymology Vol.154、376−382、1987)。
【0050】
とりわけ、MV目の分節されていない負鎖RNAウイルスの遺伝子修飾を可能にする、よく確立された「逆遺伝学」法により、本発明による組み換えMVウイルスベクターを調製することができる(例えばConzelmann、K.K.、Current Topics Microbiol.Immunol.203、1−41、2004;及びWalpitaら、FEMS Microbiol.Letters 244、9−18、2005により概説される。)。
【0051】
この方法において、MV(アンチ)ゲノム及びサポートタンパク質の転写及び同時発現及び組み換えMVベクターの作製を可能にするのに十分な条件下で、全長ゲノム又は、好ましくはMVウイルスのアンチゲノム(ポジティブセンス)をコードするヌクレオチド配列を含むcDNA分子を含むベクター及び、必要とされるサポートタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むcDNA分子を含む1つ又はそれ以上のベクターにより、適切な細胞の同時形質移入を行う。この方法において、全長MVウイルス(アンチ)ゲノムをコードする前記核酸分子は、上記で定義されるようなさらなる転写単位を含む。
【0052】
ベクターは、このベクターにより形質移入が行われた細胞において連結されるDNAセグメントの複製及びその転写及び/又は発現を起こすような、別のDNAセグメントが連結される、プラスミド、ファージ又はコスミドなどのレプリコンを意味する。
【0053】
好ましくは、完全長ゲノムの転写のためのベクターは、その5’末端でT7ポリメラーゼプロモーター及びその3’末端で(デルタ肝炎)リボザイム配列に隣接する、MVウイルスの(アンチ)ゲノムをコードするcDNA配列を含むプラスミドであるが、T3又はSP6 RNAポリメラーゼプロモーターを使用することもできる。
【0054】
適切なサポートタンパク質の細胞内発現に対して、適切な発現調節配列(例えばT7ポリメラーゼプロモーター)の調節下で、好ましくは、これらのタンパク質をコードするcDNA配列を含むプラスミドを使用する。
【0055】
本発明による組み換えMVウイルスベクターの調製のための特に好ましい方法において、MVウイルスのN(又はNP)、P及びLタンパク質をコードする発現プラスミドを使用する。
【0056】
この逆遺伝学技術で使用される形質移入されたサポートプラスミドの量又は割合は、幅広い範囲にわたる。サポートプラスミド、N:P:Lに対する割合は約20:10:1から1:1:2の範囲であり得、各ウイルスに対する効率的な形質移入プロトコールは当技術分野で公知である。
【0057】
T7RNAポリメラーゼプロモーター及びリボザイム配列の複合作用により、形質移入が行われた細胞中でゲノムRNAの正確なコピーが生成され、続いて、このRNAが、同時形質移入された発現プラスミドにより与えられるウイルスサポートタンパク質によりパッケージ化され複製される。
【0058】
形質移入された細胞に感染する組み換えワクシニアウイルスにより、特にワクシニアウイルスvTF7−3、またその他の組み換えポックスベクター(鶏痘ウイルスなど、例えばfpEFLT7pol)により、T7ポリメラーゼ酵素が与えられることが好ましいか又はT7 RNAポリメラーゼの発現のために他のウイルスベクターを使用し得る。
【0059】
ろ過など単純な物理的技術により、ワクシニアウイルスから救出されたウイルスの分離を容易に行うことができる。センダイウイルス又はNDVの救出のために、孵化卵での形質移入細胞の上清の接種によって、救出を行うことができる。
【0060】
さらにより好ましい実施形態において、(T7)RNAポリメラーゼ及び/又は必要な支持タンパク質の1以上を構成的に発現する転写及び発現ベクターの形質移入に対して、細胞株を使用する。
【0061】
例えば、T7RNAポリメラーゼ及び麻疹ウイルス支持タンパク質、N及びPの両方を発現するヒト胚腎臓細胞株、293−3−46において、麻疹ウイルスの救出を行うことができる(Radecke et al.,EMBO J.14、5773−5784、1995)。本発明において有利に使用できる別の非常に有用な細胞株は、T7 RNAポリメラーゼを発現するBSR細胞、即ち細胞株BSR−T7/5に基づく(Buchholz et al.,J.Virol.73、251−259、1999)。
【0062】
さらに、本発明によるMVウイルスの調製のために本明細書中で使用されるべき逆遺伝学技術に関するより詳細な情報はConzelmann、K.K.(前出)による概説及び実施例1において開示される。
【0063】
組み換えMVウイルスベクターが外来遺伝子を安定に発現する能力の結果、予防的及び治療的適用の両方に対してベクターが開発されてきた。
【0064】
本発明による組み換えMVウイルスベクターにおいて、特異的MVウイルスベクター種及びベクターウイルスの適用に依存して、外来遺伝子は様々であり得る。
【0065】
外来遺伝子は、(その他の)微生物病原体(例えば、ウイルス、寄生生物の細菌)抗原をコードし得、特に外来遺伝子は、防御的免疫反応を誘導することができる病原体の抗原をコードする。
【0066】
例えば、本発明のウイルスベクターに挿入することができる非相同遺伝子配列には、以下に限定されないが、インフルエンザウイルス糖タンパク質遺伝子、特に鳥インフルエンザウイルスのH5及びH7ヘマグルチニン遺伝子、伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルス(IBDV)、特に(IBDV)のVP2由来の遺伝子、感染性気管支炎ウイルス(IBV)、ネコ白血病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、狂犬病ウイルス、エールリヒア生物、特にエールリヒア犬、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヒトメタ肺炎ウイルス及び麻疹ウイルス由来の遺伝子が含まれる。
【0067】
あるいは、外来遺伝子は、例えばインターロイキンなどのサイトカイン(例えばIL−2、IL−12、INF−γ、TNF−α又はGM−CSF)を同時発現させることにより、ウイルス感染に対する免疫反応を促進又は調節することができるポリペプチド免疫調節因子をコードし得る。
【0068】
MV目には、ヒト及び動物において又は両方において複製することができるウイルスの両方が含まれる(例えば狂犬病ウイルス及びニューキャッスル病ウイルス)。従って、ヒト及び脊椎動物微生物病原体の幅広い範囲から外来遺伝子を選択することができる。
【0069】
本発明においてベクターウイルスとして全てのMVウイルスを使用することができるが、本発明の好ましい実施形態において、組み換えMVウイルスベクターはラブドウイルス科のウイルス、好ましくはリッサウイルス属又はノヴィラブドウイルス、より好ましくはそれぞれ狂犬病ウイルス又はIHNV種のウイルスである。
【0070】
また好ましい実施形態において、組み換えMVウイルスは、パラミクソウイルス科のウイルスであり、好ましくはレスポウイルス属、特にhPIV3又はbPIV3種;麻疹ウイルス、特にCDV種;肺炎ウイルス、特にRSV種;及びアブラウイルス、特にNDV種である。
【0071】
本発明の特に好ましい実施形態において、ウイルスがニューキャッスル病ウイルス(NDV)である組み換えMVウイルスベクターが提供される。NDVはヒト及び動物の両方、特に家禽、とりわけニワトリ、で複製可能なので、本発明による組み換えNDVベクターは、病原体の、特に呼吸器病原体の抗原又はヒトもしくはこれらの動物の何れにおいても適切な免疫反応を誘導し得る免疫調節因子をコードする外来遺伝子を含み得る。
【0072】
Peetersら(J.Virology 73、5001−5009、1999)、Romer−Oberdorfer et al.,(J.Gen.Virol.80、2987−2995、1999)により、及びConzelmann、K.K.(前出)による概説において、NDVの遺伝子操作のための逆遺伝学的方法が具体的にNDVについて開示されている。さらに、外来遺伝子の発現のために、例えば、NDVベクターによって感染した動物での免疫反応の誘発のために、ベクターとしてNDVを使用することができることも知られている。(Nakaya et al.,2001、上記)及び(Swayne et al.,Avian Dis.47、1047−50、2003)。
【0073】
上述のMVウイルスについて全般的に概説するように、NDVゲノムの様々な位置に外来遺伝子を有利に導入することができる。特に、本発明による組み換えNDVベクターにおいて、外来遺伝子(適切な転写単位の一部として)を次のNDV遺伝子の間(NP−P、P−M、M−F、F−HN、HN−L)及び3’隣接及び5’遠位遺伝子座に(Zhao et al.,2003、上記;Nakayaら、2001、上記)、好ましくは3’隣接、P−M、M−F及びF−HN領域に挿入することができ、F−HN領域が最も好ましい。
【0074】
さらに、本発明の組み換えNDVベクターでは、外来遺伝子に隣接する非コード領域は、天然に存在する全てのNDV遺伝子から、特に、N、P、M、F又はHN遺伝子から得ることができ、HN遺伝子が好ましい。
【0075】
本発明の特定の実施形態において、追加の転写単位がF−HN遺伝子間に位置し、及び挿入された外来遺伝子がHDVHN遺伝子の非コード領域と隣接している組み換えNDVベクターが提供される。
【0076】
より具体的には、3’及び5’NCR(並びに、場合によって、GS及びGE配列)が配列番号1及び2又は3及び4に示されているようなヌクレオチド配列を有するNDVベクターが提供される。
【0077】
その他の病原体に対して家禽、特にニワトリにおいて免疫反応を誘導するために、本発明による組み換えNDVベクターを有利に使用することができる。従って、組み換えNDVベクターは、好ましくは、鳥類病原体、特にインフルエンザウイルス、マレック病ウイルス(MDV)、伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)、感染性気管支炎ウイルス(IBV)、伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルス(IBDV)、ニワトリ貧血ウイルス(CAV)、レオウイルス、鳥類レトロウイルス、家禽アデノウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(TRTV)、E.コリ、アイメリア種、クリプトスポリジア、マイコプラズマ、例えばM.ガリナルム(M.gallinarum)、M.シノビエ(M.synoviae)及びM.メレグリディス(M.meleagridis)など、サルモネラ、カンピロバクター、オルニトバクテリウム(ORT)又はパスツレラ種、の防御抗原をコードする外来遺伝子を含む。
【0078】
より好ましくは、組み換えNDVベクターは、AIV、MDV、ILTV、IBV、TRTV、E.コリ、ORT又はマイコプラズマの抗原をコードする外来遺伝子を含む。
【0079】
特に、組み換えNDVベクター突然変異体は、インフルエンザウイルス、好ましくは鳥インフルエンザウイルス(AIV)、より好ましくは高病原性AIV、特にH5又はH7AIVの、ヘマグルチニン(HA)遺伝子を含む。
【0080】
原則として、本発明において、全ての(トリ)インフルエンザ株のHA遺伝子を使用することができる。当技術分野で多くのHA遺伝子のヌクレオチド配列が開示されており、GenBank又はEMBLデータベースなどの核酸配列データベースから検索することができる。
【0081】
上記で概説されるように、本発明において、最近単離された高病原性H5N2サブタイプAVIA/ニワトリ/イタリア/8/98のヘマグルチニン(HA)遺伝子を外来遺伝子として有利に使用することができる。この遺伝子を逆転写し、真核発現ベクターpcDNA3(Invitrogen)においてクローニングし、配列決定を行う(Luschowら、Vaccine、vol.19、4249−4259頁、2001年及びGenBank受託番号AJ305306)。得られた発現プラスミドpCD−HA5から、NDVゲノム配列におけるHA遺伝子の挿入を可能にする人為的RE認識部位を生成する特異的プライマーを用いた増幅によって、HA遺伝子を得ることができる。
【0082】
さらなる実施形態において、上記で概説されるように、本発明において、高病原性H7N1サブタイプAIVA/ニワトリ/イタリア/445/99のHA遺伝子を外来遺伝子として使用することができる。このHA遺伝子を逆転写しPCRにより増幅する。SmaIで消化したベクターpUC18(Amersham)において1711bp産物をクローニングし、配列決定を行う(Veitsら、J.Gen.Virol.84.3343−3352、2003;及びGenBank受入番号AJ580353)。
【0083】
本発明による特に有利な組み換えMVウイルスベクターにおいて、MVベクターウイルスは弱毒化されている、つまり、このベクターウイルスは標的動物にとって病原性ではないか、又は野生型ウイルスと比較して毒性が顕著に低下している。ウイルスベクターとして本明細書中で使用される多くのMVウイルスは、麻疹ウイルス及びNDVなどの弱毒化生ワクチンとして長らく安全であった記録があり、一方、SeV及びVSVなどのその他のウイルスはヒトに対して非病原性であると考えられる。さらに、限定的な複製又は感染能を示す弱毒化ウイルスを得てそれに対してスクリーニングを行うために、従来の技術が存在する。このような技術には、異種培養基におけるウイルスの連続的(コールド)継代及び化学的突然変異誘発が含まれる。
【0084】
本発明による組み換えNDVベクターは、何らかの従来のNDワクチン株由来であり得る。市販のNDワクチンにおいて存在するこのような適切なNDV株の例は:Clone−30(R)、La Sota、Hitchner BI、NDW、C2及びAV4であり;Clone−30(R)は好ましい株である。
【0085】
本発明による組み換えMVウイルスベクターが動物において防御的免疫反応を誘導できることもまた本発明により見出された。
【0086】
従って、本発明の別の実施形態において、生又は不活性化型の上記で定義されるような組み換えMVウイルスベクターと、医薬的に許容可能な担体又は希釈剤と、を含む微生物病原体に対するワクチンが提供される。
【0087】
市販の生及び不活性化MVウイルスワクチンに対して一般に使用されるものなどの従来の方法により、本発明によるワクチンを調製することができる。
【0088】
簡潔に述べると、組み換えMVウイルスベクターを用いて感受性物質を接種し、所望のタイターにウイルスが複製するまで増殖させ、その後、物質を含有するウイルスを回収する。続いて、免疫付与特性を有する医薬製剤へと回収した物質を処方する。
【0089】
本発明において、組み換えMVウイルスベクターの複製を支えることができる全ての培養基を使用することができる。培養基として、MVウイルスに依存して、原核及び真核源の両方からの宿主細胞を使用することができる。適切な宿主細胞は脊椎動物、例えば霊長類細胞であり得る。適切な例は;ヒト細胞株HEK、WI−38、MRC−5又はH−239、サル細胞株Vero、げっ歯類細胞株CHO、BHK、イヌ細胞株MDCK又は鳥類CEF又はCEK細胞である。
【0090】
本発明による組み換えNDVベクターを増殖させることができる特に適切な培養基はSPF孵化卵である。例えば卵あたり少なくとも102.0EID50を含む尿膜腔液を含有する0.2mL NDVを孵化卵に接種することができる。好ましくは、9から11日胚の孵化卵に約105.0EID50を接種し、続いて37℃で2−4日間温置する。2−4日後、好ましくは尿膜腔液を回収することによって、NDウイルス産物を回収することができる。その後、2500gで10分間、この液体を遠心し、続いてフィルター(100μm)に通して上清を濾過することができる。
【0091】
本発明によるワクチンは、このような組成物に対して慣習的に使用される医薬的に許容可能な担体又は希釈剤とともに、組み換えMVウイルスベクターを含む。
【0092】
生ウイルスを含有するワクチンを懸濁液又は乾燥凍結形態で調製し、販売することができる。担体には、安定化剤、保存料及び緩衝剤が含まれる。希釈剤には、水、水性緩衝液及びポリオールが含まれる。
【0093】
本発明の別の態様において、不活性形態の組み換えMVウイルスベクターを含むワクチンが提供される。不活性化ワクチンの主要な長所は、その安全性及び長期にわたり高レベルの防御抗体を誘導できることである。
【0094】
増殖段階後に回収されたウイルスの不活性化の目的は、ウイルスの複製を排除することである。一般に、周知の化学又は物理的手段によってこれを達成することができる。
【0095】
必要に応じて、本発明によるワクチンは、アジュバントを含有し得る。この目的のためのアジュバント活性のある適切な化合物及び組成物の例は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又は酸化アルミニウム、例えば鉱物油(Bayol F(R)又はMarcol 52(R)など)又は植物油(ビタミンEアセタートなど)に基づく水中油又は油中水乳液及びサポニンである。
【0096】
本発明によるワクチンの投与は、周知の有効な形態の何れかによるものであり得、MVウイルスベクターのタイプに基づき得る。投与の適切な形式には、非経口、鼻腔内、経口及び噴霧ワクチン接種が含まれる。
【0097】
本発明によるNDVベクターワクチンは、好ましくは、NDVワクチン接種に対して一般に使用される安価な大量適用技術により投与される。NDVワクチン接種の場合、これらの技術には、飲用水及び噴霧ワクチン接種が含まれる。
【0098】
本発明によるワクチンは、活性成分として組み換えMVウイルスベクターの有効量、即ちワクチン接種された鳥類において毒性微生物による曝露処置に対して免疫を誘導する免疫付与MVウイルス物質の量、を含む。免疫は、本明明細書中で、ワクチン接種していない群と比較した、ワクチン接種後の死亡及び臨床症状に対する、ヒト又は動物集団における顕著に高い防御レベルの誘導として定義される。特に、本発明によるワクチンは、ワクチン接種されたヒト又は動物の大部分において、疾患の臨床症状の発生及び死亡を防ぐ。
【0099】
通常、102.0−108.0組織培養/胚感染用量(TC/EID50)の用量で、好ましくは、104.0−107.0TC/EID50の範囲の用量で、生ワクチンを投与することができる。不活性化ワクチンは、104.0−109.0の抗原当量(antigenic equivalent)を含有し得る。
【0100】
本発明はまた、本発明による組み換えMVウイルスベクターに加えてさらなる病原体に対する保護を誘導することができるワクチン株を含む、混合ワクチンも含む。
【0101】
実施例
【実施例1】
【0102】
トリインフルエンザウイルスHA遺伝子を発現する組み換えMVウイルスの作製(NDV/AIVH5)
・ウイルスと細胞
救出された組み換えNDV及びインフルエンザウイルス単離株A/ニワトリ/イタリア/8/98を、特定病原体が除去された(SPF)10日齢の有胚のニワトリの卵中で増殖させた。強毒性NDV株Herts33/56及びNDVクローン30ワクチン(Nobilis(R))を使用した。
【0103】
cDNAから伝染性NDVを回収するために、ファージT7RNAポリメラーゼを安定に発現するBSR−T7/5細胞を使用した。
【0104】
・AIVH5遺伝子を含有するNDVアンチゲノムRNAをコードするcDNAの構築
NDVゲノム上のヌクレオチド位置及びNDVタンパク質中のアミノ酸残基上を特定するために、本明細書において使用されている括弧内の付番は、Romer−Oberdorderら(J.Gen.Virol.80,2987−2995,1999,EMBL受入番号Y18898)によって記載されているとおりである。rNDV/AIVH5−Aに対する人工のMluI制限部位(PH5F1:5’−cta aac gcg taa aat gga gaa aat agt gc−3’(配列番号5)及びPH5R1:5’−tcg gac gag ttt aaa tgc aaa ttc tgc act g−3’(配列番号6)、MluI部位には下線が付されている。)並びにrNDV/AIVH5−Bに対するNcoI又はAflII部位(PH5F2:5’−cct tcc atg gag aaa ata gtg ctt c−3’(配列番号7)及びPH5R2:5’−cct cct taa gta taa ttg act caa tta aat gca aat tct gca ctg caa tga tcc−3’(配列番号8)、制限部位には下線が付されている。)を有する特異的なプライマーによってプラスミドpCD−HA5(Luschow et al.,上記)から増幅されたAIVH5遺伝子を導入するために、クローン30の完全長アンチゲノムRNAを発現する(Romer−Oberdorferら、上記)プラスミドpflNDVを使用した。クローン30アンチゲノム(図1A)中へのH5の導入は、GFP挿入に関して以前に記載されたように(Engel−Herbert et al.,J.Virol.Methods 108,19−28,2003)、MluI部位を用いて行った。簡潔に述べると、完全長プラスミドpflNDV/AIVH5−Aの構築のために、NDVのF及びHN遺伝子の間の最小遺伝子カセット中にH5OFRを挿入するために使用された人工MluI部位を含有するプライマーを用いて、H5ORFを増幅した。rNDV/AlVH5−Bの作製のためのAIVH5遺伝子を含有する完全長プラスミドの構築は、図1Bに記載されている。突然変異導入反応は、QuikChange(R)IIXL位置指定突然変異導入キット(Stratagene)を用いて行った。この目的のために、クローン30ゲノムのNotIBsiWI断片(ヌクレオチド4953−8825)を含有するpUC18プラスミド(pUCNDV1)及び突然変異導入A(図1B)のための以下のプライマーMP1(5’−gac aac agt cct caa cca tgg acc gcg ccg−3’)(配列番号9)及びMP2(5’−ctg gct agt tga gtc aat tct taa gga gtt gga aag atg gc−3’)(配列番号10)を使用して、新たに作出されたNcoI及びAflII部位を有するプラスミドpUCNDVIaを得た(プライマー中の制限部位には、下線が付されている。)。NcoI及びAflIIでの消化後、増幅されたAIVH5ORFによって、クローン30のHNOFRを置換した。pUCNDVHSのL遺伝子の前の遺伝子間領域中にSgfI−及びSnaBI部位を作出し、pUCNDV/AIVH5−1bをもたらす突然変異導入Bに関しては(図1B)、プライマーMP3(5’−caa aac agc tca tgg tac gta ata cgg gta gga cat gg−3’)(配列番号11)及びMP4(5’−gta agt ggc aat gcg atc gca ggc aaa aca gct cat gg−3’)(配列番号12)を使用した。MP3及びMP5(5’−gaa aaa act acc ggc gat cgc tga cca aag gac gat ata cgg g −3’)(配列番号13)を用いて突然変異導入Cを行い、プラスミドpUCNDVH5 1b中のL遺伝子の前の遺伝子間領域中にクローン30HN遺伝子を導入するために使用したSgfI及びSnaBI部位を取得するためのプラスミドpUCNDVIcを得た。最後に、pflNDV−1のNotI/BsiWI断片を、pUCNDVH5 1cのNotI/BsiWI断片によって置換した(図1B)。生成された新しい完全長ゲノムの長さは、6の倍数に相当する(rNDV/AIVH5−Aに関しては16938ヌクレオチド及びrNDV/AIVH5−Bに関しては17196ヌクレオチド)。
【0105】
形質移入及びウイルス増殖
形質移入実験、ウイルス増殖及び伝染性ウイルスの回収の確認は、以前に記載されたとおりに実施した(Romer−Oberdorfer et al.,上記;Engel−Herbert et al.,上記)。唯一の差は、形質移入のために20μgのDNAの総量(完全長ゲノム含有プラスミド10μg、pCiteNP6μg、pCiteP2μg及びpCiteL2μg)を使用したことであった。
【0106】
・結果
以前に記載されたプラスミドpfINDVのF及びHN遺伝子の間に、AIVH5翻訳領域を挿入した(Romer−Oberdorfer et al.,上記)。この目的のために、pfINDVoligo1の唯一のMluI制限部位中にAIVH5OFRを挿入するために使用されたMluI制限部位を有する特異的プライマーによって、プラスミドCD−HA5(Luschow et al.,上記)からAIV単離株A/ニワトリ/イタリア/8/98(H5N2)のAIVH5ORFを増幅し(Engel−Herbert et al.,上記)、プラスミドpflNDV/AIVH5−Aを得た(図1A)。この構築物中において、AIVH5ORFは、NDVのF及びHN遺伝子間の遺伝子間領域中で、人工の遺伝子開始(GS)及び遺伝子終了(GE)配列と隣接していた。完全長プラスミドpflNDV/AlVH5−Bの構築のために、プラスミドpUCNDV1aのHNORFを、NcoI/AflII断片として増幅されたH5FRによって置換した(図1B)。得られたプラスミドpUCNDVH5中において、H5遺伝子の下流の遺伝子間領域中にSgfI及びSnaBI制限部位を作製して、プラスミドpUCNDVH5 1bを得た(図1B)。その中でHN遺伝子がSgfI及びSnaBI制限部位とも隣接しているプラスミドpUCNDVIcから得られたHN遺伝子を導入するために、作製されたSgfI及びSnaBI制限部位を使用した(図1B)。最後に、pflNDVのNotI/BsWI断片を置換するために、得られたプラスミドpUCNDVH5 1cを使用した(図1B)。NDVHNの非コード領域が転写調節要素(GS、GE)及びH5ORFの間にさらに挿入されていたので、構築されたpflNDV/AIVH5−Bは、プラスミドpflNDV/AIVH5−Aとは異なる。
【0107】
NDV組み換えrNDV/AIVH5−A及びrNDV/AIVH5−Bは、以前に記載されたように、それぞれの完全長cDNA及び支持プラスミドで形質移入されたBSR−T7/5細胞から回収した(Romer−Oberdorfer et al.,上記;Engel−Herbert et al.,上記)。ウイルス回収のために、10日齢の有胚のニワトリの卵の尿膜腔中に形質移入上清を注入し、5日間温置した。尿膜液を採集し、血球凝集検査又は間接免疫蛍光(IF)によって、ウイルスの存在に関して分析を行った。さらなるウイルス増殖のための第二の卵の継代のために、ウイルスを含有する尿膜液を使用した。rNDV/AIVH5−A及びrNDV/AIVH5−Bのウイルスゲノム中の挿入されたH5遺伝子の存在は、逆転写−PCR及び配列決定によって確認した(データは示さず。)。図2A及び2Bは、NDV中のHNORFに隣接する領域のヌクレオチド配列及びNDVベクター中のH5ORFのヌクレオチド配列を示している。
【実施例2】
【0108】
NDV/AIVH5ベクターのインビトロでの性質決定
・RNA分析
細胞当り10の感染効率で、CEF細胞をNDVクローン30、rNDV/AIVH5−A、rNDV/AIVH5−B及びAIVA/ニワトリ/イタリア/8/98(H5N2)に感染させ、37℃で8時間温置した。感染細胞及び非感染細胞の全RNAを調製し、変性アガロースゲル中で分離し、放射線標識されたcRNAとハイブリッド形成させた。32P標識されたcRNAのインビトロ転写のために、それぞれ、AIVA/ニワトリ/イタリア/8/98(H5N2)H5及びNDVクローン30HNの翻訳領域を含有するプラスミドpCD−HA5及びpCD−NDVHNを使用した(SP6/T7 Transcription kit,Roche)。
【0109】
rNDV/AIVH5−A及びB中の挿入されたAIVH5遺伝子の転写を確認するために、NDV/AIVH5組み換え感染された一次ニワトリ胚繊維芽細胞の全RNAを用いて、ノーザンブロット分析を行った。NDVクローン30及びAIVA/ニワトリ/イタリア/8/98(H5N2)感染細胞のRNA調製を、対照として使用した。遺伝子特異的cRNAを用いて、rNDV/AIVH5−A及びrNDV/AIVH5−Bに関して、挿入されたAIVH5遺伝子の転写を検出した(図3)。AIV−H5B転写物が約81ヌクレオチド伸長されていること、AIV−H5A転写物より豊富に存在していることを観察することができる。
【0110】
・ウェスタンブロット分析
CEK細胞をNDVクローン30、rNDV/AIVH5−A、rNDV/AIVH5−B及びAIVA/ニワトリ/イタリア/8/98(H5N2)に感染させ、37℃で20時間温置した。SDS−PAGE(約104細胞/レーン)によって、感染細胞及び非感染対照細胞の可溶化液を分離し、ニトロセルロースフィルター(Trans−Blot(R)SD cell,Bio−Rad)に転写した。それぞれ、1:20000及び1:2500の希釈で、NDVに対するポリクローナルウサギ抗血清又はサブタイプH5のAIVに対するポリクローナルニワトリ抗血清とともにブロットを温置した。X線フィルム(Hyperfilm(R)MP,Amersham)上のSuperSigna(R)West Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce)を使用する化学発光によって、ペルオキシダーゼが連結された種特異的二次抗体の結合を検出した。
【0111】
ウェスタンブロット分析では、H5タンパク質は、rNDV/AIVH5−B感染細胞中においてのみ検出可能であった。AIVサブタイプH5特異的抗血清は、約70及び50kDaの2つの主要なタンパク質並びにNDVクローン30感染細胞中には見出されなかった約25kDaの殆ど見えないタンパク質を検出した(図4)。
【0112】
・間接免疫蛍光(IF)試験
間接IF試験のために、CEK細胞をNDVクローン30、rNDV/AIVH5−A、rNDV/AIVH5−B及びAIVA/ニワトリ/イタリア/8/98(H5N2)に、低いMOIで20時間感染させた。メタノール及びアセトン(1:1)で固定した後、続いて、それぞれ、1:3000及び1:100の希釈で、NDVに対するポリクローナルウサギ抗血清又はサブタイプH5のAIVに対するポリクローナルニワトリ抗血清の何れかとともに細胞を温置した。抗ウサギIgGのF(ab)2断片及びフルオレセイン連結された抗ニワトリIgG抗体試料との温置後、慣用の蛍光顕微鏡によって、試料を分析した。
【0113】
感染したCEF細胞の間接IF試験によって、H5発現を調べた。NDV特異的抗血清との温置後に、NDVクローン、rNDV/AIVH5−A及びrNDV/AIVH5−Bに感染された細胞中で顕著な蛍光を検出することが可能であったが、AIVA/ニワトリ/イタリア/8/98(H5N2)に感染された細胞中又は非感染細胞中では検出することができなかった(図5、右パネル)。AIVサブタイプH5特異的抗血清との温置は、AIV感染細胞中に顕著な蛍光を示した。2つの組み換え体を比較すると、rNDV/AIVH5−Bは、rNDV/AIVH5−Aより強烈なH5特異的蛍光を示し、H5タンパク質のより高い発現レベルを示唆した(図5、左パネル)。
【0114】
・免疫電子顕微鏡
Formvarで被覆された銅の格子に、ウイルス粒子を7分間吸着させた。0.5%ウシ血清アルブミンを含有するPBSで格子を4回洗浄し、続いて、NDV特異的又はAIVサブタイプH5特異的抗血清とともに45分間温置した。PBで数回洗浄した後、プロテインAゴールド(10nm,PAG10,Biocell International)又はウサギ抗ニワトリゴールド(10nm,RCHL10,Biocell International)とともに、格子をさらに45分間温置した。PBでの最終洗浄後、リンタングステン酸(PTA、pH7.2)でウイルス粒子を対比し、電子顕微鏡を用いて調べた。
【0115】
NDVクローン30又はrNDV/AIVH5−Aのビリオンを調べると、NDV特異的抗血清を用いた場合のみ染色が観察された。これに対して、rNDV/AIVH5−Bに関しては、NDVに対する抗血清を用いて染色が観察されるとともに、AIVに対する抗血清を使用することによっても染色が観察され、rNDV/AIVH5−BのビリオンがヘマグルチニンH5を含有することを示している。金粒子は、主に、rNDV/AIVH5−Bビリオンの表面に沿って見出され、ヘマグルチニンがウイルスの膜に固着されたことを示唆している。
【実施例3】
【0116】
NDV/AIVH5ベクターのインビトロでの性質決定
組み換えrNDV/AIVH5−A及びrNDV/AIVH5−Bによる保護の評価:
1日齢のニワトリを、2つの群へ無作為に割り振り、スプレーを介して、rNDV/AIVH5−Aの106EID50又は市販のNDVクローン30ワクチン(Nobilis(R),Intervet,NL)を眼鼻的にワクチン接種した。28日齢の時点で、同じように、第二の免疫化を施した。第二の免疫化から12日後に、HI試験によって、NDV及びAIVH5抗体の存在を評価するために血液を集めた。第二のワクチン接種から2週後に、免疫化された群を分け、高度に病原性のAIV単離株A/ニワトリ/イタリア/8/98(H5N2)の108EID50で、眼鼻的に各群の一部に攻撃誘発を行った。残りのニワトリは、強毒性NDVに対するワクチンの防御効果を評価するために使用した。従って、トリ及びさらなる対照動物は、筋肉内に、NDV株Herts33/56の105.3EID50を受けた。
【0117】
免疫化及び攻撃誘発感染後、臨床兆候に関して、全てのトリを10日の期間にわたって毎日観察し、健康(0)、病気(1;以下の兆候の1つ:呼吸器兆候、抑うつ、下痢、チアノーゼ、浮腫、神経兆候)、重度の病気(2;以下の兆候の2以上:呼吸器兆候、抑うつ、下痢、チアノーゼ、浮腫、神経兆候)又は死亡(3)として分類した。
【0118】
この期間にわたる全てのニワトリ/群の平均値に相当する臨床スコアを計算した。最後に、攻撃誘発から3週後、AIV及びNDVに対する抗体力価を評価するために、生存している全ての動物から血液試料を採取した。
【0119】
ほぼ同一の実験デザインの別個の動物試験において、NDV組み換えrNDV/AIVH5−Bを検査した。唯一の差は、rNDV/AIVH5−B又はNDVクローン30ワクチンの106EID50での免疫化が両群において眼鼻的に施されたこと、及びNDV攻撃誘発感染が行われなかったことであった。
【0120】
これらの実験の全データは、表4及び図6に要約されている。ワクチン接種から3週後に、HI試験によって、免疫化されたニワトリの血清を分析したが、何れの事例でも、HA特異的血清抗体は検出することができなかった。第一の免疫化(26−27の平均HI力価)後に、既に、両群の全ての動物は、高いレベルでNDV特異的抗体を生成し、強毒性NDVでの感染に対して動物が完全に保護されたのに対して、NDの典型的な兆候を示して、4日以内に、全ての対照動物が死亡した。予想されたとおり、AIV攻撃誘発感染は、NDVIクローン30で免疫化されたニワトリに、90%の死亡率で、重い疾病を引き起こした。rNDV/AIVH5−Aによって免疫化された群の動物は、高度に病原性のAIVの致死用量を生き延びたが、全てのニワトリは、0.64の臨床スコアで、トリインフルエンザの変動する兆候を示し、有意であるが、部分的な保護であることを示唆した。しかしながら、rNDV/AIVH5−Bで免疫化されたニワトリは、高度に病原性のトリインフルエンザAウイルスでの感染後に、疾病のあらゆる兆候に対して完全に保護された。
【0121】
【表4】
【実施例4】
【0122】
NDVF遺伝子由来の隣接するncrを有するNDV/AIV−H5ベクターの構築
上述のものと実質的に同一の方法及び材料を用いて(Engel−Herbert et al.,上記)、以前に記載されたプラスミドpflNDV(Romer−Oberdorfer et al.,上記)のF及びHN遺伝子間にH5AIV遺伝子を担持するNDVベクター構築物が作製されたが、ここでは、H5挿入物は、NDVF−遺伝子由来の非コード領域と隣接していた。
【0123】
簡潔に述べると、使用した様々な工程及び材料は、以下のとおりであった。
【0124】
突然変異導入プライマー:pMPMLUIGRFHNF
【0125】
【化1】
(MluI部位には下線が付されており、GS配列は太字で記載されている。)を用いて、MluI制限酵素部位を作出するために、NDVH5(pUCIRA)の1.6kbNotI−PstI断片を有するpUCプラスミドを変異させ、プラスミドpUCIRAMLUを得た。
【0126】
2つのオリゴ:OFVOF:5’−agg acg cgt tac ggg tag aag att ctg gat ccc ggt tgg cgc cct cca ggt gca gca cca tgg ag−3’(配列番号16、MluI部位に下線が付されている。)及びOFVOR:5’−etc cat ggt gct gca cct gga ggg cgc caa ccg gga tec aga atc ttc tac ccg taa cgc gtc ct−3’(配列番号17、MluI部位に下線が付されている。)を徐冷した。次に、MluI及びNcoIでこれらを消化した。
【0127】
MluI及びNcoIでのプラスミドpUCIRAMLUの消化
pUCIRAMLUの約4.3kbのMluI−NcoI断片の、MluI−NcoIによって消化されたOFVOF/OFVORオリゴハイブリッドとの連結。得られたプラスミドは、pUC1RA2と名付けられた。
【0128】
HNorfの代わりにH5orfを有するNDVのNotI−BsiWI断片を有するpUCプラスミド(pUCAROK)及びpUCIRA2を、NcoI及びSgfIで消化し、pUCAROKのNotI−NcoI断片をpUCIRA2のNotI−NcoI断片によって置換して、プラスミドpUCAROK2を得た。
【0129】
プライマーPNCRFHIF:5’−ata ctt aag ttc cct aat agt aat ttg tgt−3’(配列番号18,AflII部位に下線が付されている。)及びPNCRFHIR:5’−cac gag atc gca ttg cca ctg tac att ttt tct taa ctc tct gaa ctg aca gac tac c −3’(配列番号19、SgfI部位に下線が付されている。)及びプラスミドpUCAROA(NDVのNotI−SpeI断片を有するpUC)を用いて、挿入されたF遺伝子の後ろにNDVF遺伝子のncrを増幅するためにHF−PCR(Roche)を実施した。得られた約100bp断片をpGEMTeasyベクター中に連結して、pGEMFncrhiプラスミドを得た。
【0130】
プラスミドpUCAROK2のH5の後ろのHNncrを、pGEMFncrhi由来のFのものによって置換するために、pUCAROK2及びpGEMFncrhiプラスミドをAflII及びSgfIで消化した。得られたプラスミドは、pUCAROK4と名付けられた。
【0131】
最後の工程において、NDVH5プラスミドのNotI−SgfI断片を、pUCAROK4のものによって置換して、F及びHNの間においてNDVベクター中に挿入されたAIVH5遺伝子を含み、F遺伝子ncrによって隣接された新しい完全長プラスミドE18Cを得た。
【0132】
新しい構築物形質移入実験を用いて、recウイルスの増殖及び伝染性ウイルスの回収の確認を上述のように実施した。次に、生化学的に及び生物学的にウイルスを性質決定した。
【実施例5】
【0133】
他のNDVベクター構築物及びrecウイルスの作製:
類似の技術を使用し、異なる挿入遺伝子及び異なる挿入部位を用いて、幾つかの他の挿入物をNDVベクター中に作製した。
【0134】
本明細書に既に記載されている詳細を用いて、これらは全て当業者が容易に到達できる範疇にあり、従って、これらは表の形態で与えれば十分である。
【0135】
【表5】
【実施例6】
【0136】
EIAVエンベロープ遺伝子を発現する組み換え狂犬病ウイルスベクターの作製
本発明の有利な効果(recMVビリオン中の外来タンパク質の発現及び/又は提示を増加させるためのMV遺伝子非コード領域の使用)は、パラミクソウイルス科を超えて及ぶことを実証するために、無関係なウイルスであるウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)から得られたエンベロープタンパク質を発現させるためのベクターとして、ラブドウイルス科のメンバーである狂犬病ウイルスを使用した。
【0137】
本実施例では、狂犬病遺伝子G及びLの間に挿入されたEIAVエンベロープタンパク質を含むrec狂犬病ベクターウイルスの構築物が記載されており、ここで、env遺伝子は狂犬病Gタンパク質遺伝子由来のncrに隣接している。
【0138】
SAD−D29完全長クローンを用いて、狂犬病ウイルスのサブクローンをpBluescript(R)SK+ファジミド中に調製し(Mebatsion,2001,J.Virol.,vol.75,p.11496−11502)、ここでは、ORA−Dと称する。クローニングベクターを調製するために、まず、SacIでpSKベクターを消化し、Klenow酵素で平滑末端化した後、HindIIIで消化し、約3Kb断片のゲル精製を行った。StuI及びHindIIIでORA−Dを消化し、得られた1.3kb断片を精製し、調製されたpSKベクター中への連結によって、挿入物を調製して、プラスミドpNCR−bを作製した。
【0139】
BstXI及びHindIIIでpNCR−bプラスミドを消化し、約4.0kb断片を精製し、最小転写カセットを含有するプラスミドpSSNscを作出するためのオリゴBSSNH+及びBSSNH−(表6参照)との連結及び最小の転写単位の他に非コード領域を含有する構築物GNCR−bを作製するためのオリゴRABGNCR1−4(表6)との連結のために使用した(図7)。
【0140】
コドンが最適化され、RNAスプライス部位が除去され(Cook,et al.2005,Vet.Micro.,vol.108,p.23−37)、元の遺伝子の3’コード領域の134アミノ酸が末端切断された2052ヌクレオチドの合成遺伝子からの増幅によって、EIAV株ワイオミングenv遺伝子を得た。
【0141】
【表6】
【0142】
増幅されたenv遺伝子をキナーゼ処理し、以下のようにサブクローン中へ挿入した。プライマーセットEIAsynCDF+EIAsynCDstopRを用いて、末端切断されたEIAVエンベロープタンパク質全体に対応するように加工された約2.0Kbアンプリコンを作製した(表6参照)。SnaBiで予め消化され、脱リン酸化されたサブクローンGNCR−b中にアンプリコンを挿入して、組み換えプラスミドpGNCR−b:envGを作製した。NheIで予め消化され、平滑末端化され、及び脱リン酸化されたSSNscサブクローン中に約2.0Kb断片を挿入して、組み換えプラスミドpSSNsc−b:envを作製した。
【0143】
SphI及びHindIIIで、各組み換え構築物を消化し、SSNscサブクローン中に連結し、これをSphI/HindIIで予め消化し、CIAPで脱リン酸化した。SSNscサブクローンに復帰した後、修飾された挿入物は、SphI及びMluIでの消化によってORA−D骨格に復帰して、組み換え狂犬病ウイルスRV−env及びRV−envGが生成された(図8)Big−Dye(R)Terminator Cycle Sequencing chemistry(Applied Biosystems)を用いた配列分析によって構築物の5’及び3’末端を確認し、Applied Biosystems 3100− Avant Capillary Electrophoresis Sequencerを用いて分析した。
【0144】
修飾されたSAD狂犬病株ORA−Dを基礎とする完全長cDNAクローンの構築及び組み換え狂犬病ウイルスの作製が記載されている(Schnelt et al.,1994,EMBO J.,vol.13,p.4195−4203;Mebatsion,2001、上記)。Mirus Trans−IT−LT1を用いて、以前に記載されたように(Schnell,et al.,1994,上記)、各組み換え狂犬病ウイルスをBSR細胞中に形質移入した。形質移入から3日後に、細胞及び上清を採集し、継代した。その後の継代は、0.5の推定moiを使用する上清のみによって行った。安定性を確認するために、各組み換えウイルスは、最低5回継代した。
【0145】
組み換え狂犬病に感染したBSR細胞を、感染から約40時間後に固定した。FITC抗狂犬病モノクローナルグロブリン(FDI Diagnostics Inc.)を用いた又は抗EIAVポリクローナルウマ血清を用いた直接免疫蛍光によって、これらを分析した。10倍の系列希釈において、ウイルス安定性及び組み換え抗原発現をモニターするために、狂犬病ウイルスを産生する感染細胞の比を、EIAVenvを発現する感染細胞とも比較した。
【0146】
0.01のmoiの新鮮なBSR細胞を有するT−75フラスコ中に、継代5から得られた組み換え狂犬病ウイルスを接種した。感染から24時間後、培地を無血清に交換した。感染から72時間後に、上清を集め、遠心(10,000×g)によって清澄化した。精製されたビリオンを分析するために、スクロース勾配によって、ウイルス上清を精製した。
【0147】
精製されたビリオン及び全ての感染された細胞タンパク質を、2×Laemmli還元試料緩衝液と合わせ、5から10分間、沸騰水中に入れた。1×SDS−PAGE Running Buffer中の10%Tris−HCLアクリルアミドゲル(Bio−Rad)上に試料を載せた。色素の先頭がゲルの底付近に又はゲルの底に位置するまで、SDS−PAGEゲルを20mAで走行させた。225mAで45分間ブロッティングすることによって、Immobilon−P(PVDF)膜(IPVH10100,Immobilon)上に、分離したタンパク質を転写した。室温で1時間、ブロッキング緩衝液(PBS−Tween20+1%乾燥無脂肪乳)中でブロックを温置し、次いで、PBS−Tween20中で、5分間、3回濯いだ。ブロッキング緩衝液中の、それぞれ、1:20000及び1:2,000に希釈された狂犬病糖タンパク質及び核タンパク質に対して誘導されたウサギ抗狂犬病ポリクローナル血清を用いて、狂犬病発現を検出した。
【0148】
同時に、ブロッキング緩衝液中に1:500希釈された抗EIAVポリクローナルウマ血清を用いて、EIAVenv発現を検出した。室温で1時間、ブロットを温置し、次いで、PBS−Tween20中で5分間、3回濯いだ。それぞれ、ブロッキング緩衝液中に1:2000希釈された、HRP標識された連結体ヤギ抗ウサギIgG(H+L)(KPL)及びHRP標識された連結体ヤギ抗ウマIgG(H+L)(Bethyl Labs)中にブロットを配置し、室温で1時間温置した。次いで、PBS−Tween20中で、ブロットを3×5分濯いだ。展開が完結するまで(約1から3分)、TMB膜ペルオキシダーゼ基質(KPL)中でブロットを温置した。反応を停止させるために、ブロットを蒸留水中に配置した。
【0149】
このようなウェスタンブロット実験の典型的な結果が図9に示されており、EIAVエンベロープタンパク質を発現する組み換え狂犬病ウイルスのタンパク質組成を示している。
【0150】
レーン1:広範囲の分子量ラダー(Bio−Rad);
レーン2:ORA−D骨格ウイルス:
レーン3:狂犬病G及びL遺伝子の間に挿入され、隣接するncrを持たないEIAV−env遺伝子を含むRV−env
レーン4:狂犬病ウイルスGタンパク質のncr領域に隣接するEIAV−env遺伝子を含むRV−envG
両組み換え狂犬病ウイルスは、同等の感染力価を与え、インビトロでの複数回の継代後に、EIAV−env遺伝子挿入物を安定に発現した。
【0151】
しかしながら、ウェスタンブロットへビリオンの同等量を供したにもかかわらず、通常の様式で構築された(従って、隣接するncrを持たない。)組み換えRV−envは、EIAV−envタンパク質に対応する極めて弱いバンドのみを示した。これに対して、挿入されたEIAV−envタンパク質に隣接するGタンパク質非コード領域を有する組み換えウイルスRV−envGは、ずっと高い割合で発現された。図9、レーン3から4中のenvタンパク質に対するバンドを比較されたい。
【0152】
RV−envG及びRV−envの構築物及び挿入物は、それ以外では同一なので、外来タンパク質の産生及び免疫提示の高いレベルを促進する上で、非コード領域が正の効果を有するという確かな証拠である。
【図面の簡単な説明】
【0153】
【図1A】rNDV/AIVH5−Aを示す図である。
【図1B】rNDV/AIVH5−Aを示す図である。
【図2A】NDVクローン30HN隣接配列を示す図である。
【図2B】AIV−H5遺伝子挿入物及びNDV−HN隣接配列を有するrNDVを示す図である。
【図3】ノーザンブロットを示す図である。
【図4】ウェスタンブロットを示す図である。
【図5】IF試験を示す図である。
【図6】臨床指標及び死亡率を示す図である。
【図7】GNCR/SSN構築物のクローニング領域を示す図である。
【図8】組み換え狂犬病/EIAV構築物の要約を示す図である。
【図9】狂犬病−EIAVenv精製されたビリオンのウェスタンブロットを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
上流のモノネガウイルス目ウイルス遺伝子開始(GS)配列及び下流のモノネガウイルス目ウイルス遺伝子終了(GE)配列と作用可能に連結された外来遺伝子を含む追加の転写単位を保有する組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターであり、前記GS配列と前記外来遺伝子の開始コドンとの間に、及び前記外来遺伝子の停止コドンと前記GE配列の間に、それぞれ、モノネガウイルス目ウイルス遺伝子の3’非コード領域及び5’非コード領域(ゲノムセンス)が位置していることを特徴とする、前記組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項2】
3’及び5’非コード領域が、モノネガウイルス目ウイルスのエンベロープをコードする遺伝子、特に、M、G、F又はHN遺伝子のものであることを特徴とする、請求項1に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項3】
3’及び5’非コード領域が、モノネガウイルス目ウイルスのRNPタンパク質をコードする遺伝子のものであることを特徴とする、請求項1に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項4】
外来遺伝子が病原体の抗原をコードすることを特徴とする、請求項1から3に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項5】
外来遺伝子が免疫調節物質をコードすることを特徴とする、請求項1から3に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項6】
モノネガウイルス目ウイルスベクターがラブドウイルス科のウイルスであることを特徴とする、請求項1から5に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項7】
モノネガウイルス目ウイルスベクターが狂犬病ウイルスであることを特徴とする、請求項6に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項8】
モノネガウイルス目ウイルスベクターが伝染性造血器壊死症ウイルスであることを特徴とする、請求項6に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項9】
3’及び5’非コード領域が、N、P、M又はG遺伝子のものであることを特徴とする、請求項6から8に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項10】
追加の転写単位が、P−M、M−G若しくはG−L遺伝子の3’近位に、又はこれらの間に位置することを特徴とする、請求項6から9に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項11】
モノネガウイルス目ウイルスベクターがパラミクソウイルス科のウイルスであることを特徴とする、請求項1から5に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項12】
モノネガウイルス目ウイルスベクターがニューキャッスル病ウイルス、イヌジステンパーウイルス又は(ウシ)パラインフルエンザウイルスであることを特徴とする、請求項11に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項13】
3’及び5’非コード領域が、NP、P、M、F又はHN遺伝子のものであることを特徴とする、請求項11から12に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項14】
追加の転写単位が、P−M、M−F、F−HN若しくはHN−L遺伝子の3’近位に、又はこれらの間に位置することを特徴とする、請求項11から13に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項15】
モノネガウイルス目ウイルスベクターがニューキャッスル病ウイルスであることを特徴とする、請求項11から14に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項16】
追加の転写単位がF−HN遺伝子の間に位置することを特徴とする、請求項15に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項17】
非コード領域がHN遺伝子のものであることを特徴とする、請求項15から16に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項18】
外来遺伝子がトリ病原体の抗原をコードすることを特徴とする、請求項15から17に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項19】
外来遺伝子がインフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)、好ましくはH5又はH7ヘマグルチニンをコードすることを特徴とする、請求項15から18に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項20】
モノネガウイルス目ウイルスベクターが弱毒化ウイルスであることを特徴とする、請求項1から19に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項21】
生又は不活化形態の、請求項1から20に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター及び医薬として許容される担体又は希釈剤を含むことを特徴とする、微生物病原体に対するワクチン。
【請求項22】
アジュバントをさらに含むことを特徴とする、請求項21に記載のワクチン。
【請求項23】
さらなるワクチン株を含むことを特徴とする、請求項21から22に記載のワクチン。
【請求項1】
上流のモノネガウイルス目ウイルス遺伝子開始(GS)配列及び下流のモノネガウイルス目ウイルス遺伝子終了(GE)配列と作用可能に連結された外来遺伝子を含む追加の転写単位を保有する組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクターであり、前記GS配列と前記外来遺伝子の開始コドンとの間に、及び前記外来遺伝子の停止コドンと前記GE配列の間に、それぞれ、モノネガウイルス目ウイルス遺伝子の3’非コード領域及び5’非コード領域(ゲノムセンス)が位置していることを特徴とする、前記組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項2】
3’及び5’非コード領域が、モノネガウイルス目ウイルスのエンベロープをコードする遺伝子、特に、M、G、F又はHN遺伝子のものであることを特徴とする、請求項1に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項3】
3’及び5’非コード領域が、モノネガウイルス目ウイルスのRNPタンパク質をコードする遺伝子のものであることを特徴とする、請求項1に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項4】
外来遺伝子が病原体の抗原をコードすることを特徴とする、請求項1から3に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項5】
外来遺伝子が免疫調節物質をコードすることを特徴とする、請求項1から3に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項6】
モノネガウイルス目ウイルスベクターがラブドウイルス科のウイルスであることを特徴とする、請求項1から5に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項7】
モノネガウイルス目ウイルスベクターが狂犬病ウイルスであることを特徴とする、請求項6に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項8】
モノネガウイルス目ウイルスベクターが伝染性造血器壊死症ウイルスであることを特徴とする、請求項6に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項9】
3’及び5’非コード領域が、N、P、M又はG遺伝子のものであることを特徴とする、請求項6から8に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項10】
追加の転写単位が、P−M、M−G若しくはG−L遺伝子の3’近位に、又はこれらの間に位置することを特徴とする、請求項6から9に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項11】
モノネガウイルス目ウイルスベクターがパラミクソウイルス科のウイルスであることを特徴とする、請求項1から5に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項12】
モノネガウイルス目ウイルスベクターがニューキャッスル病ウイルス、イヌジステンパーウイルス又は(ウシ)パラインフルエンザウイルスであることを特徴とする、請求項11に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項13】
3’及び5’非コード領域が、NP、P、M、F又はHN遺伝子のものであることを特徴とする、請求項11から12に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項14】
追加の転写単位が、P−M、M−F、F−HN若しくはHN−L遺伝子の3’近位に、又はこれらの間に位置することを特徴とする、請求項11から13に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項15】
モノネガウイルス目ウイルスベクターがニューキャッスル病ウイルスであることを特徴とする、請求項11から14に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項16】
追加の転写単位がF−HN遺伝子の間に位置することを特徴とする、請求項15に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項17】
非コード領域がHN遺伝子のものであることを特徴とする、請求項15から16に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項18】
外来遺伝子がトリ病原体の抗原をコードすることを特徴とする、請求項15から17に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項19】
外来遺伝子がインフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)、好ましくはH5又はH7ヘマグルチニンをコードすることを特徴とする、請求項15から18に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項20】
モノネガウイルス目ウイルスベクターが弱毒化ウイルスであることを特徴とする、請求項1から19に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター。
【請求項21】
生又は不活化形態の、請求項1から20に記載の組み換えモノネガウイルス目ウイルスベクター及び医薬として許容される担体又は希釈剤を含むことを特徴とする、微生物病原体に対するワクチン。
【請求項22】
アジュバントをさらに含むことを特徴とする、請求項21に記載のワクチン。
【請求項23】
さらなるワクチン株を含むことを特徴とする、請求項21から22に記載のワクチン。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【公表番号】特表2009−529889(P2009−529889A)
【公表日】平成21年8月27日(2009.8.27)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2009−500604(P2009−500604)
【出願日】平成19年3月15日(2007.3.15)
【国際出願番号】PCT/US2007/064046
【国際公開番号】WO2007/106882
【国際公開日】平成19年9月20日(2007.9.20)
【出願人】(506196247)インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー (85)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成21年8月27日(2009.8.27)
【国際特許分類】
【出願日】平成19年3月15日(2007.3.15)
【国際出願番号】PCT/US2007/064046
【国際公開番号】WO2007/106882
【国際公開日】平成19年9月20日(2007.9.20)
【出願人】(506196247)インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー (85)
【Fターム(参考)】
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