組み換え細胞毒性ＲＮＡｓｅを含む融合タンパク質
【課題】非哺乳動物の細胞毒性ＲＮＡｓｅおよび免疫グロブリンおよび免疫グロブリンフラグメントの融合タンパク質を含む免疫毒素を提供する。
【解決手段】グリコシル化された免疫毒素であって、（ａ）第一の免疫グロブリン可変ドメインに融合された非哺乳動物リボヌクレアーゼを含む融合ポリペプチドと、（ｂ）第二の免疫グロブリン可変ドメインを含む第二のポリペプチドとを含み、前記第一および第二の免疫グロブリン可変ドメインが、一緒になって抗原結合部位を形成する抗体の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲを含み、前記非哺乳動物リボヌクレアーゼが、前記第一の免疫グロブリン可変ドメインのＮ末端に融合されており、前記非哺乳動物リボヌクレアーゼが、Ｎ末端ピログルタミン酸残基を保有している、免疫毒素。
【解決手段】グリコシル化された免疫毒素であって、（ａ）第一の免疫グロブリン可変ドメインに融合された非哺乳動物リボヌクレアーゼを含む融合ポリペプチドと、（ｂ）第二の免疫グロブリン可変ドメインを含む第二のポリペプチドとを含み、前記第一および第二の免疫グロブリン可変ドメインが、一緒になって抗原結合部位を形成する抗体の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲを含み、前記非哺乳動物リボヌクレアーゼが、前記第一の免疫グロブリン可変ドメインのＮ末端に融合されており、前記非哺乳動物リボヌクレアーゼが、Ｎ末端ピログルタミン酸残基を保有している、免疫毒素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、その内容が全体として引用することにより本明細書に組み込まれる、2004年2
月13日出願の米国仮特許出願第60/544,227号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、非哺乳動物の細胞毒性ＲＮＡｓｅおよび免疫グロブリンおよび免疫グロブリ
ンフラグメントの融合タンパク質を含む免疫毒素を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ランピルナーゼ(ranpirnase)は、疾患の処置のための細胞毒性因子としての見込みを示
す非哺乳動物リボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅ）のあるクラスのメンバーである。これらの
ＲＮＡｓｅの細胞毒性は、細胞表面レセプターに対する当初の結合および細胞のサイトゾ
ルへの内部移行（リボソームＲＮＡの付随する分解および細胞タンパク質合成の阻害を伴
う）に関与する機構に起因している。Wu et al.,J.Biol.Chem.,268:10686-10693(1993)を
参照のこと。当該ＲＮＡｓｅ活性は、哺乳動物のＲＮＡｓｅインヒビターに対して耐性で
あり、これによって哺乳動物の酵素に比較して観察される細胞毒性の増強が説明され得る
。同上。ランピルナーゼは、このファミリーのＲＮＡｓｅの原型的なメンバーであり、ヒ
ョウガエルの卵母細胞および初期の胚から精製され得る。ランピルナーゼは、１２，００
０の分子量を有し、そしてウサギの網状赤血球溶解物において（ＩＣ50 １０-11Ｍ）、
そしてアフリカツメガエル(Xenopus)の卵母細胞に微量注入された場合（ＩＣ50 １０-10
Ｍ）、タンパク質合成の強力な阻害を生じる。ＲＮａｓｅ Ａスーパーファミリーの他の
メンバーとは異なり、これらの細胞毒性リボヌクレアーゼは、卵母細胞ｒＲＮＡを分解し
ない。Lin et al.,Biochem Biophys Res Commun.204:156-62(1994)。これらの分子は、酵
素のリン酸結合ポケットの一部を形成し、ＲＮＡｓｅおよび抗腫瘍活性に必須である必須
のＮ末端ピログルタミル残基を含む。
【０００４】
動物の毒性研究によって、ランピルナーゼが予測可能な用量依存性でかつ可逆性の毒性
を、ラット（用量範囲０．０１〜０．０２ｍｇ／ｋｇ）およびイヌ（０．００５〜０．１
５ｍｇ／ｋｇ）の両方で示すということが示される。侵襲性のM109 Madison肺癌腫を接種
されて、かつ毎日および毎週の両方のスケジュールでランピルナーゼの腹腔内投与の処置
をされたマウスは、有意に延長された生存を示した。ほとんどの著しい結果は、ランピル
ナーゼの毎週のスケジュールで処置されたマウスの群でみられ、ここでは、１８匹の動物
のうち６匹が、長期間生存して、明らかに癌が治癒した。Mikulski et al.,J Natl Cance
r Inst.82:151-3(1990)。
【０００５】
天然のランピルナーゼは、臨床試験において、種々の固体腫瘍に対して抗腫瘍活性を有
することが示されている。これに関しては、ランピルナーゼは、例えば、膵臓癌を有する
患者を処置する場合、単独で、そしてタモキシフェンのような他の抗腫瘍因子と組み合わ
せての両方で用いられている。抗腫瘍因子として用いられる場合、これらの細胞毒性ＲＮ
Ａｓｅは、特定の細胞タイプに対する標的を可能にするためのマーカーに複合体化され得
る。
【０００６】
第Ｉ相試験では、種々の再発性および耐性の腫瘍に罹患している患者を、ランピルナー
ゼ（用量範囲６０〜９６０μｇ／ｍ2）を用いて毎週静脈内処置した。観察される副作用
としては、一般に顔面紅潮、筋肉痛、一過性の眩暈および食欲減退が含まれた。タンパク
尿の増大、末梢浮腫、高窒素血症、クレアチニンクリアランスの低下、および疲労によっ
て呈示される、用量を制限する腎臓毒性を含む、観察される毒性は、用量依存性でかつ可
逆性であり、これは、動物での毒物学的研究と一致している。真の免疫学的感作の臨床的
な顕在化は、ランピルナーゼの反復された毎週の静脈内用量後でさえ証明されていない。
最大耐容量は、主に腎毒性に起因して、９６０μｇ／ｍ2であることが見出された。非小
細胞肺癌、食道癌および結腸直腸癌にはなんらかの他覚的な応答があった。Mikulski et
al.,Int J Oncol 3:57-64,(1993);Mikulski et al.,J Clin Oncol.20:274-81(2002)を参
照のこと。それにもかかわらず、ランピルナーゼは、試験された動物およびほとんどのヒ
ト患者では十分耐容されて、一貫してかつ可逆性の臨床毒性パターンを示し、そしてほと
んどの従来の化学療法剤に伴うほとんどの毒性、例えば、骨髄抑制および脱毛症は誘発し
なかった。
【０００７】
WO97/31116は、（ａ）Ｎ末端メチオニンに続いてグルタミン酸以外のアミノ酸、（ｂ）
システインを２６位、４０位、５８位、８４位、９５位、および１１０位に、リジンを４
１位に、そしてヒスチジンを１１９位に（ウシＲＮＡｓｅＡとの最大一致について整列さ
せた場合）を有する組み換えリボヌクレアーゼ、ならびに天然のランピルナーゼ由来のア
ミノ酸配列を開示している。しかし、ＲＮＡｓｅ改変体(variant)を含む組み換え細胞毒
性ＲＮＡｓｅは、多段階のプロセスによって細菌で調製されており、このプロセスには、
細菌によって挿入されたＮ末端ホルミルメチオニン残基を除去するため、そして必須のＮ
末端ピログルタミル残基を生成するためのさらなる工程を要する。それにもかかわらず、
細菌中での産生は、グリコシル化された細胞毒性ＲＮＡｓｅ含有融合タンパク質の調製を
妨げる。従って、真核生物細胞において組み換え細胞毒性ＲＮＡｓｅ融合タンパク質を産
生することが有利である。真核生物細胞では、細胞毒性ＲＮＡｓｅは、両生類の供給源か
ら精製されたランピルナーゼの細胞毒性特性を保持するが、ヒトにおける所望されない免
疫応答は少ないか、またはない。しかし、真核生物細胞における細胞毒性ＲＮＡｓｅの発
現は、ＲＮＡｓｅの細胞毒性活性に起因して細胞死を生じるということも予想される。
【０００８】
従って、グリコシル化ＲＮＡｓｅ融合タンパク質を含む、細胞性ＲＮＡｓｅ含有融合タ
ンパク質を調製する改良方法が極めて望ましいということが明らかである。グリコシル化
細胞毒性ＲＮＡｓｅ融合タンパク質自体が極めて所望される分子であるということも明ら
かである。
【発明の開示】
【０００９】
従って、本発明の目的は、（ａ）第一の免疫グロブリン可変ドメインに融合された非哺
乳動物の細胞毒性リボヌクレアーゼを含む融合ポリペプチドと、（ｂ）第二の免疫グロブ
リン可変ドメインを含む第二のポリペプチドとを含み、この免疫グロブリン可変ドメイン
の１つが軽鎖可変ドメインであり、かつもう一方の免疫グロブリン可変ドメインが重鎖可
変ドメインであり、この第一および第二の免疫グロブリン可変ドメインが一緒になって抗
原結合部位を形成し、そしてこの免疫毒素がグリコシル化されている、免疫毒素を提供す
ることである。
【００１０】
本発明の別の目的は、哺乳動物宿主細胞を培養することによってこれらおよび他の免疫
毒素を作製する方法を提供することであって、この宿主細胞は、（ａ）第一の免疫グロブ
リン可変ドメインに融合された非哺乳動物細胞毒性リボヌクレアーゼを含む融合ポリペプ
チドをコードする核酸配列と、（ｂ）第二の免疫グロブリン可変ドメインを含む第二のポ
リペプチドをコードする核酸配列とで形質転換され、この第一および第二の免疫グロブリ
ンの可変ドメインは一緒になって抗原結合部位を形成する。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、細胞毒性ＲＮＡｓｅ部分に融合された内部移行抗体(inter
nalizing antibody)または抗体フラグメントを含む免疫毒素であって、このＲＮＡｓｅ部
分がＮ末端ピログルタミン酸残基を保有し、かつこのＲＮＡｓｅ部分がそのＣ末端におい
て、この抗体または抗体フラグメントの軽鎖を含むポリペプチドのＮ末端、あるいはこの
抗体またはフラグメントの重鎖を含むポリペプチドのＮ末端、あるいはこの抗体またはフ
ラグメントの軽鎖および重鎖の両方のＮ末端に融合されている免疫毒素を提供することで
ある。
【００１２】
例えば、一実施形態では、非哺乳動物細胞毒性リボヌクレアーゼは、第一の免疫グロブ
リン可変ドメイン、例えば、軽鎖可変ドメインのＮ末端に融合されてもよい。この非哺乳
動物リボヌクレアーゼは、Ｎ末端ピログルタミン酸残基を有してもよい。
【００１３】
上記融合ポリペプチドおよび第二の免疫グロブリン可変ドメインは、別の分子であって
もよく、そして宿主細胞中で別の分子として産生されてもよい。
【００１４】
上記融合ポリペプチドはさらに、ＣＬドメインを含んでもよく、そして上記第二のポリ
ペプチドはさらにＣＨ１ドメインを含んでもよい。
【００１５】
上記第二のポリペプチドはさらに、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含んでもよ
い。
【００１６】
別の実施形態では、非哺乳動物リボヌクレアーゼは、重鎖可変ドメインのＮ末端に融合
されてもよい。この非哺乳動物リボヌクレアーゼは、Ｎ末端ピログルタミン酸残基を有し
てもよい。この融合ポリペプチドおよび第二の免疫グロブリン可変ドメインは、別の分子
であってもよく、そして宿主細胞中で別の分子として産生されてもよい。
【００１７】
この融合ポリペプチドはさらに、ＣＨ１ドメインを含んでもよく、そして第二のポリペ
プチドはさらにＣＬドメインを含んでもよい。
【００１８】
この融合ポリペプチドはさらに、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含んでもよい
。
【００１９】
さらに別の実施形態では、非哺乳動物リボヌクレアーゼは、第一および第二の免疫グロ
ブリン可変ドメインの両方のＮ末端に融合されてもよい。この非哺乳動物リボヌクレアー
ゼは、Ｎ末端ピログルタミン酸残基を有してもよい。この第一の免疫グロブリン可変ドメ
インは、重鎖可変ドメインであってもよく、そして第二の免疫グロブリン可変ドメインは
、軽鎖可変ドメインであってもよい。
【００２０】
この第一および第二の融合ポリペプチドは、別の分子であってもよく、そして宿主細胞
中で別の分子として産生されてもよい。
【００２１】
この第一の融合ポリペプチドはさらに、ＣＨ１ドメインを含んでもよく、そして第二の
融合ポリペプチドはさらにＣＬドメインを含んでもよい。
【００２２】
この第一の融合ポリペプチドはさらに、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含んで
もよい。
【００２３】
免疫毒素は、例えば、ＣＨ２ドメイン上で、および／またはＲＮＡｓｅ上でグリコシル
化されてもよい。
【００２４】
上記の非非哺乳動物リボヌクレアーゼは、例えば、ヒョウガエルから精製されたランピ
ルナーゼの配列および構造を有する酵素であってもよい。
【００２５】
上記抗原結合部位は、細胞表面分子に対して特異的に結合してもよく、そして上記免疫
毒素は、この細胞表面分子を保有する細胞結合した際に内部移行されてもよい。
【００２６】
上記免疫毒素は、ガン細胞、感染／炎症の部位、自己免疫疾患に対するか、または微生
物および寄生生物に対するものであり得る。
【００２７】
上記免疫毒素は、Ｂ細胞抗原、Ｔ細胞抗原、形質細胞抗原、ＨＬＡ−ＤＲ系統抗原、Ｃ
ＥＡ，ＮＣＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４およびＭＵＣ１６抗原、ＥＧＰ
−１抗原、ＧＥＰ−２抗原、胎盤アルカリホスファターゼ抗原、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、Ｐ
１ＧＦ、ＩＬＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テネイシン、ＣＤ３３、ＣＤ７４、Ｐ
ＳＭＡ、ＰＳＡ、ＰＡＰ、Ｌｅyを含む腫瘍関連抗原、自己免疫疾患、感染／炎症および
感染性疾患に関連する抗原からなる群より選択される抗原に対するものであってもよい。
【００２８】
上記抗原は、Ｂ細胞もしくはＴ細胞リンパ腫に関連する標的抗原、または自己免疫疾患
に関連するＢ細胞もしくはＴ細胞であってもよい。
【００２９】
上記抗原は、悪性疾患によって発現されるＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ７４、
ＣＥＡ、ＮＣＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＥＧＰ−１
、ＥＧＰ−２、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＩＬ−１５およびＨＬＡ−ＤＲからなる群
より選択される抗原であってもよい。
【００３０】
上記免疫毒素の免疫グロブリン可変ドメインは、悪性疾患を標的する場合、例えば、Ｒ
Ｓ１１、１７−１Ａ、ＲＳ７、ＬＬ１、ＬＬ２、ＭＮ−３、ＭＮ−１４、ＭＮ−１５もし
くはＰＡＭ４，またはそのヒト化バージョンに由来し得る。
【００３１】
免疫毒素によって結合される抗原は、特定の悪性疾患に関しては、例えば、ＥＧＰ−２
，ＥＧＰ−１、ＣＤ２２、ＣＤ７４、ＣＥＡ、炭酸脱水素酵素ＩＸ、またはＭＵＣ１であ
ってもよい。
【００３２】
標的化抗原は、細菌、ウイルス、真菌、マイコプラズマ、寄生生物、または他の微生物
によって発現されてもよい。
【００３３】
標的化合物抗原は、活性化顆粒球のような、感染の部位での宿主細胞蓄積によって発現
されてもよい（例えば、ＣＤ１５、ＣＤ３３、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、およびＣＤ６６
ｃ（ＮＣＡ）など）。適切なこのような顆粒球抗体は、ＭＮ−３であり、そのＦａｂ’は
LeukoScan（商標）で用いられる。
【００３４】
上記の方法および／または組成物のいずれかにおいて、可変ドメインはヒト化されてよ
いしまたはヒトドメインであってもよい。
【００３５】
本発明の別の実施形態では、薬学的に受容可能なキャリアとともに上記されたような免
疫毒素を含む薬学的組成物が提供される。
【００３６】
本発明のさらに別の実施形態では、被験体に対して上記のような組成物を、疾患または
症候群の症状を処置または改善するために有効な量で投与することによって、この被験体
におけるこの疾患または症候群を処置する方法が提供される。この疾患または症候群は、
この被験体における細胞、例えばＴ細胞、骨髄細胞または形質細胞の望ましくないまたは
不適切な増殖または活性化によって特徴付けられ得る。あるいは、この疾患は、感染性微
生物または寄生生物の存在によって特徴付けられ得る。
【００３７】
この疾患は、例えば、癌腫、肉腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、神経芽細胞
腫、および骨髄腫からなるガンの群より選択され得る。
【００３８】
この疾患または症候群は、固形腫瘍、例えば、神経芽細胞腫、悪性黒色腫、または癌腫
、例えば、乳房、藍藻、前立腺、肺、腎臓、胃、結腸直腸、肝臓、または膵臓の癌腫の存
在によって特徴付けられ得る。
【００３９】
これらの方法では、薬学的組成物は、被験体に対して、１日あたり２回以上、例えば、
０．１〜約１０００ｍｇの量で投与されてもよいが、それより多く用いられても少なく用
いられてもよい。
【００４０】
望ましくないまたは不適切な増殖または活性化を受けている細胞は、例えば、関節リウ
マチ、シェーグレン症候群、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫
斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎
炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫
斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、多発性硬化症、サル
コイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊
椎炎、グッドパスチャー症候群、血栓血管炎(thromboangitis ubiterans)、原発性胆汁性
肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎
、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ヴェーゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症
、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎および線維化
性肺胞炎のような１つ以上の自己免疫疾患の発症および進行に関与し得る。
【００４１】
本発明の組成物が、感染の治療的処置のために用いられる場合、免疫毒素の免疫グロブ
リン構成要素は、疾患原因の微生物、例えば、病原性細菌、ウイルス、真菌および多様な
寄生生物に特異的に結合し、そして抗体は、これらの微生物、それらの産物もしくは表面
抗原、またはそれらの病変に関連する抗原を標的し得る。微生物の例としては、限定はし
ないが、
ストレプトコッカス・アガラクティエ、在郷軍人病菌、化膿連鎖球菌、大腸菌、淋菌、
髄膜炎菌、肺炎球菌、Hemophilis influenzae B、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘ
ータ、緑膿菌、ハンセン菌、ウシ流産菌、ヒト結核菌、破傷風毒素、抗ウイルスモノクロ
ーナル抗体、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−３、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ
型肝炎、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純疱疹Ｉ
およびＩＩ、ヒト血清パルボ様ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス
、Ｂ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプ
スタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内
炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、疣ウイルス、ブルー
・タングウイルス、センダイウイルス、猫白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイル
ス、シミアン・ウイルス４０、マウス乳癌ウイルス、デング熱ウイルス、ポリオーマウイ
ルス、パピローマウイルス、ＳＡＲＳウイルス、種々のインフルエンザウイルス、風疹ウ
イルス、原生動物、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(
Plasmodium vivax)、トキソプラズマ原虫、Trypanosoma rangeli、クルーズ・トリパノソ
ーマ、Trypanosoma rhodesiensei、トリパノソーマ・ブルーセイ、マンソン住血吸虫，Sc
histosoma japanicum、Babesia bovis、Elmeria tenella、回旋糸状虫、熱帯リーシュマ
ニア、旋毛虫、Theileria parva、Taenia hydatigena、Taenia ovis、無鉤条虫、単包条
虫、Mesocestoides corti、マイコプラズマ、Mycoplasma arthritidis、M.hyorhinis、M.
orale、M.arginini、Acholeplasma laidlawii、M.salivarium、およびＭ肺炎が挙げられ
る。
【００４２】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、
この詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示のため
だけに示していることが理解されるべきである。なぜなら、本発明の趣旨および範囲内の
種々の変化および改変が、この詳細な説明から当業者には明白になるからである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ベクターｐｄＨＬ２−ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐの構成を示す。構築物である、リーダーペプチド−ＲＮＡｓｅ、−リンカー−ｈＬＬ１のＶｋ領域を含むＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＢＳベクターに挿入して、ｐｄＨＬ２ベクターに連結した。注記：本発明においては、ｒｐＲＮＡｓｅおよびｒａｐという用語は、交換可能である。
【図２】宿主細胞から分泌された融合タンパク質のＨＰＬＣプロフィールを示す。単一のピークが７．７分で観察された。
【図３】分泌された融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。２つの接近して移動する軽鎖バンドをみることができるが、これはｈＬＬ１単独の軽鎖よりも長い（２５ｋＤ）。
【図４ａ】天然の条件下で分泌された融合タンパク質の質量スペクトルを示す：１７７１５０の質量を有するｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐ融合タンパク質に相当する、１つの主要なピークが観察された。
【図４ｂ】変性条件下の質量スペクトルを示す。重鎖、およびｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐ融合タンパク質の糖分子の有無の２つの軽鎖に相当する３つの主要なピークが見出され得る。
【図５】融合タンパク質のウエスタンブロットを示す。両方の分子ともｒａｐを含むことを示している、糖有の軽鎖および糖無の軽鎖が示され得る。
【図６】Ｎ−グリコシダーゼ処理による軽鎖糖分子の除去を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す：レーン１は、未処理のサンプルに相当し、ここでは２つの軽鎖バンドを見ることができる。レーン２〜５は、Ｎグリコシダーゼ酵素で処理されたサンプルである。２つの軽鎖に相当するバンドは、糖の除去の際に１つのバンドに集束した。
【図７】インビトロ転写翻訳アッセイによるＲＮＡｓｅ活性を示す。
【図８】競合結合アッセイを示しており、これは、ｈＬＬ１およびｒａｐ−ｈＬＬ１融合タンパク質の両方が、ｈＬＬ１の抗イディオタイプ抗体であるＷＰについて同じ親和性を有することを示している。
【図９】Daudi細胞における融合タンパク質のインビトロ細胞毒性を示す：Ａ）ＭＴＳアッセイによって測定した細胞毒性；Ｂ）ＢＲｄＵアッセイ法によって測定した細胞毒性。
【図１０】ＭＴＳアッセイによるＭＣ／ＣＡＲ細胞における融合タンパク質のインビトロ細胞毒性を示す。
【図１１】ナイーブなＳＣＩＤマウスにおける２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐの血液クリアランスを示す。ナイーブなＳＣＩＤマウスに、88Ｙ−ＤＴＰＡ−ｈＬＬ１（Ｏ）および111Ｉｎ−ＤＴＰＡ−２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐ（□）を静脈内に同時注射した。投与後選択された時間で、心臓穿刺によってマウスを放血させて、血液サンプルを放射能についてカウントした。データは、血液中の注射用量の平均±Ｓ．Ｄ．である（ｎ＝３）。
【図１２】２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐまたは成分のタンパク質を用いた侵襲最小ダウディリンパ腫(aggressive minimal Daudi lymphoma)の処置を示す。ＳＣＩＤマウス（１群あたり８〜１０匹のマウス）に、１．５×１０7個のDaudi細胞を静脈内に接種した。１日後、マウスを、２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐの１μｇ（×）、５μｇ（黒四角）、１５μｇ（黒三角）、３０μｇ（下向き黒三角）、４０μｇ（◆）、または５０μｇ（●）の単回ボーラス注射で処置した。コントロール群には、５０μｇの免疫毒素（＊）に等価な構成要素のタンパク質またはＰＢＳ（□）のみを注射した。
【図１３】インビトロの転写／翻訳アッセイによって測定されたＲＮａｓｅ活性を示す。ｒＲａｐ（黒四角）、２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐ（黒上向き三角）およびｈＬＬ１−γ４Ｐ（◆）の濃度を、相対発光単位(relative luminescence units)（ＲＬＵ）に対してプロットした。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明者らは、驚くべき事に、細胞毒性ＲＮＡｓｅ分子を含む融合分子が哺乳動物細胞
において調製され得ることを見出した。この結果は、驚くべきである。なぜなら、酵素的
に活性な細胞毒性ＲＮＡｓｅ分子を含む分子は、細胞増殖を妨害して、これによって融合
タンパク質の組み換え産生を妨げる程度まで細胞毒性であることが予想されるからである
。
【００４５】
この結果によって、原核生物宿主細胞を用いて組み換え方法によって調製することが以
前には困難であるかまたは不能であった哺乳動物細胞において、細胞毒性ＲＮＡｓｅ融合
タンパク質を調製する可能性がもたらされる。例えば、哺乳動物宿主細胞における産生に
よって、原核生物宿主細胞を用いる場合、必須のＮ末端ピログルタミル残基を生成するこ
とに関連する困難性が回避される。さらに、哺乳動物宿主細胞の使用によって、マルチサ
ブユニットタンパク質、例えば、インタクトなＦｃ領域を含むＩｇＧ構造の容易な調製が
可能になり、そしてまたグリコシル化融合タンパク質、例えば、Ｆｃ領域上でグリコシル
化されるインタクトな抗体の調製が可能になる。細胞毒性ＲＮＡｓｅと免疫グロブリン、
例えば抗体または抗体フラグメントとの間の融合タンパク質は、本明細書において以降で
は免疫毒素と呼ばれる。この方法はまた、任意の適切な抗体フラグメント、例えば、Ｆ（
ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖを含む免疫毒素を調製
するために用いられ得る。
【００４６】
本発明はまた、ＲＮＡｓｅが、Ｉｇ可変ドメイン（例えばＶＨまたはＶＬドメイン）の
１つのＮ末端に融合される、細胞毒性ＲＮＡｓｅ含有免疫グロブリン融合タンパク質を提
供する。これは驚くべきことに、細胞毒性ＲＮＡｓｅ活性を保持するだけでなく、抗原結
合部位でＩｇ結合特異性を保持しており、Ｎ末端融合の調製によって立体的にブロックさ
れることが期待されている融合タンパク質を提供する。
【００４７】
さらに、本発明者らは、驚くべきことに、本発明の細胞毒性ＲＮＡｓｅ融合タンパク質
が細胞および微生物／寄生生物の殺傷に有効であることを見出している。詳細には、迅速
な内部移行抗体成分を含む免疫毒素は細胞特異的な様式で極めて細胞毒性であることが見
出されている。例えば、ヒト化ＬＬ１抗体のＮ末端に対する細胞毒性ＲＮＡｓｅの融合に
よって、ＣＤ７４（ＬＬ−１の標的）の不変鎖を発現する細胞に対して特異的に結合して
、結合の際その細胞集団に対して細胞毒性である免疫毒素が産生された。この結果は、驚
くべきことである。なぜなら、融合タンパク質は、融合タンパク質の細胞毒性を大きく低
下させるか、またはさらに排除する可能性が高いことが予期される、内部移行の際に細胞
のリソソームに送達されて、そこで分解されることが予想されるからである。
【００４８】
本発明はまた、疾患または症候群に罹患している被験体を、上記で記載されるタイプの
免疫毒素の有効量をこの被験体に投与することによって処置する方法を提供する。
【００４９】
（定義）
他に特定しない限り、用いられる全ての技術および科学的用語は、当業者によって通常
理解されるのと同じ意味を有する。さらに、本明細書に引用される全ての特許および他の
引用文献の内容は、その全体が引用することにより組み込まれる。本発明の目的のために
は、以下の用語は以下のとおり規定される：
【００５０】
アミノ酸は、名称によるか、またはその一般に公知の３文字記号か、もしくは１文字の
ＩＵＰＡＣ記号のいずれかによって言及される。ヌクレオチドは、その通常受容される一
文字コードによって呼ばれる。
【００５１】
特定の核酸配列の「保存的に改変されたバリエーション(conservatively modified var
iations)」とは、同一であるかまたは本質的に同一であるアミノ酸配列をコードする核酸
をいうか、またはこの核酸が、アミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列
をいう。遺伝子コードの縮重の理由で、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所定のポリ
ペプチドをコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てがア
ラニンというアミノ酸をコードする。従って、アラニンがコドンによって特定されるあら
ゆる位置では、このコドンは、コードされたポリペプチドを変化させることなく、記載さ
れる任意の対応するコドンに変化され得る。メチオニンをコードするＡＵＧ以外の核酸中
の各々のコドンが、機能的に同一の分子を生じるように改変され得る。本明細書に記載さ
れる核酸配列はまた、これらの変更を包含する。
【００５２】
アミノ酸配列の「保存的に改変されたバリエーション」とは、コードされた配列中の単
独のアミノ酸または小さい割合のアミノ酸を変更させる個々の置換であって、この変更に
よって、化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換が生じる置換を包含する。保存的置
換は当業者に周知である。以下の６つの群の各々は、お互いについて保存的置換であるア
ミノ酸を含む：
１．アラニン、セリン、トレオニン
２．アスパラギン酸、グルタミン酸
３．アスパラギン、グルタミン
４．アルギニン、リジン
５．イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、そして
６．フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン。
【００５３】
アミノ酸配列の「保存的に改変されたバリエーション」はまた、コードされた配列中の
単独のアミノ酸または小さい割合のアミノ酸の欠失または付加であって、この付加および
欠失が、化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換を生じる欠失または付加を包含する
。本明細書に記載されるアミノ酸配列はまた、これらのバリエーションを包含する。
【００５４】
「単離された(isolated)」または「生物学的に純粋な(biologically pure)」という用
語は、その天然に存在する環境において見出されるような通常伴う成分を実質的にまたは
本質的に含まない物質をいう。この単離された物質は状況に応じて、その天然の環境にお
いてこの物質とともに見出されない物質を含む。
【００５５】
「核酸(nucleic acid)」という用語は、デオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレオ
チドポリマーであって、一本鎖型または二本鎖型のいずれかをいい、他に限定しない限り
、天然に存在するヌクレオチドに対して同様の様式で核酸にハイブリダイズする天然のヌ
クレオチドの公知のアナログを包含する。他に示さない限り、特定の核酸配列とは、その
相補的な配列を含む。
【００５６】
「発現ベクター(expression vector)」とは、組み換え発現カセットを含み、この組み
換え発現カセットは、細胞によって転写および翻訳され得る、本発明によるポリペプチド
をコードする核酸を包含する。組み換え発現カセットとは、組み換え的にまたは合成的に
生成された核酸構築物であり、標的細胞において特定の核酸の転写を可能にする一連の特
定の核酸エレメントを伴う。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスまたは核酸フラグメ
ントの一部であってもよい。代表的には、この発現ベクターのこの組み換え発現カセット
部分は、転写されるべき核酸およびそれに作動可能に連結されるプロモーターを包含する
。
【００５７】
「組み換え体(recombinant)」という用語は、タンパク質に関して用いられる場合、あ
る細胞がその細胞には外因性である起源の核酸によってコードされるペプチドまたはタン
パク質を発現することを示す。組み換え細胞は、その細胞の天然の（非組み換え体）型内
では見出されない遺伝子を発現し得る。組み換え細胞はまた、細胞の天然の形態で見出さ
れる遺伝子を発現し得、この遺伝子は、人工的な方法によって、例えば、異種プロモータ
ーの制御下で細胞に再導入される。
【００５８】
「実質的な同一性(substantial identity)」または「実質的な類似性(substantial sim
ilarity)」という用語は、ポリペプチドの文脈では、あるポリペプチドが参照配列と少な
くとも８０％、さらに好ましくは９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一
性を有する配列を含むことを示す。実質的に同一である２つのポリペプチドとは、このポ
リペプチドの１つが第二のペプチドに対して惹起された抗体と免疫学的に反応性であるこ
とを意味する。２つの核酸が実質的に同一であるとは、この２つの分子がストリンジェン
トな条件下でお互いにハイブリダイズすることである。一般に、ストリンジェントな条件
とは、所定のイオン強度およびｐＨにおいて特定の配列についての融点（Ｔｍ）よりも約
５℃〜２０℃低いように選択される。このＴｍは、標的配列の５０％が完全にマッチした
プローブにハイブリダイズする温度（所定のイオン強度およびｐＨ下で）である。しかし
、ストリンジェントな条件下でお互いに対してハイブリダイズしない核酸は、それらがコ
ードするポリペプチドが実質的に同一であるならば、やはり実質的に同一である。
【００５９】
「抗体(antibody)」とは、当分野で周知の種々の免疫グロブリン種（ＩｇＧ1、ＩｇＧ4
、ＩｇＭなど）の抗体全体および抗体フラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ
）2、Ｆａｂ’Ｆａｂ、Ｆｖなどを含み、このフラグメントとしては、標的抗原に結合す
る能力を保持するハイブリッドフラグメントが挙げられる。また、免疫グロブリンの超可
変性の抗原結合領域を保持する任意の小フラグメントも有用である。抗体全体から、抗原
に特異的に結合する能力を保持している抗体フラグメントを作成する方法は、当分野で周
知であり、そして例えば、Harlow and Lane「Antibodies:A Laboratory Manual」CSHL Pr
ess(1988)に記載されている。組み換え抗体または抗体フラグメントを作成する方法は、
当分野で周知であり、例えば、McCafferty et al.,「Antibody Engineering:A Practical
Approach」IRL Press(1996)に記載されている。Ｆａｂフラグメントは、代表的には鎖間
ジスルフィド結合を含む（ＶＬ−ＣＬ）−（ＶＨ−ＣＨ１）二量体を含む。Ｆａｂ’フラ
グメントは、類似であるが、また重鎖ヒンジドメインの一部を含む。Ｆ（ａｂ’）2フラ
グメントとは、従来、２つのＦａｂ’フラグメントのジスルフィド結合二量体を指すこと
が理解される。本発明の抗体は、任意の種の抗体であってもよいが、この抗体はヒト抗体
またはヒト化抗体であることが有利である。抗体はまた、任意の周知の形態または組み換
え抗体、例えば、単鎖Ｆｖ（ＶＨ鎖に対する任意のリンカーによって結合されたＶＬ鎖を
含む）であってもよい。このリンカーが短いかまたは存在しない場合、この単鎖Ｆｖは二
量体または多量体に二量化し、この二量体とは二重特異性抗体として公知である。特定の
環境下では、本発明の抗体はまた、単結合ドメイン抗体、例えば、ラクダ科抗体（Dumoul
in et al.,「Single-domain antibody fragments with high conformational stability.
」Protein Sci. 11,500-515(2002);Hamers-Casterman et al.,「Naturally occurring an
tibodies devoid of light chains」Nature 363,446-448(1993);ならびにMuyldermans.「
Single domain camel antibodies:current status」J Biotechnol.74,277-302(2001)を参
照のこと）、または「ドメイン抗体(domain antibody)」を含み得る。WO92/01787および
そこに引用される参考文献を参照のこと。ヒト抗体とは、ヒト被験体において産生される
抗体由来であるか、またはヒトにおいて産生される抗体の特徴である配列を有するかのい
ずれかの配列を有する、抗体または抗体フラグメントである。このような抗体は、例えば
、米国特許第6,300,064号に記載される。ヒト抗体はまた、ヒト抗体ライブラリーから単
離され得る。例えば、米国特許第6,300,064号および同第6,172,197号、ならびにそこに記
載される参考文献を参照のこと。ヒト化抗体は、非ヒト抗体からヒトフレームワークへＣ
ＲＤ領域を挿入することによって、続いて必要に応じて抗原結合を回復または最適化させ
るための特定のフレームワーク残基の変異によって調製される抗体である。ヒト化抗体は
当分野で周知である、そして例えば、Jones et al.,Nature 321:522(1988);Riechmann et
al.,Nature 332:323(1988);およびWinter&Milstein,Nature,349:293(1991)に記載される
。
【００６０】
「標的化部分(targeting moiety)」とは、所定の細胞タイプの上のマーカーまたはレセ
プターに特異的である抗体、ペプチド、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、または増殖
因子である。標的化部分は、所定の細胞タイプに関連するマーカーと優先的に関連するこ
とによって、その細胞タイプに対して、結合された分子を特異的に送達するために用いら
れ得る。
【００６１】
「融合タンパク質(fusion protein)」とは、２つ以上のポリペプチド、さらに詳細には
、細胞毒性ＲＮＡｓｅおよび標的化部分を結合することによって形成されるキメラ分子で
ある。細胞毒性ＲＮＡｓｅおよび標的化部分は、標的化部分のアミノ末端とＲＮＡｓｅの
カルボキシル末端との間で形成されたペプチド結合を通じて結合され、そして融合タンパ
ク質をコードする核酸配列によって組み換え的に発現される。単鎖融合タンパク質は、単
一の連続するポリペプチド骨格を有する融合タンパク質である。
【００６２】
「化学的複合体(chemical conjugate)」とは、細胞毒性ＲＮＡｓｅおよび標的化部分の
化学的カップリングによって形成される複合体である。
【００６３】
「薬学的に受容可能なキャリア(pharmaceutically acceptable carrier)」とは、免疫
毒素を投与するためのビヒクルとして用いられ得る物質であって、この物質は、不活性で
あるかそうでなければ医学的に受容可能であり、そして融合タンパク質またはアームのリ
ガンドと適合性であるという理由でビヒクルとして用いられ得る物質である。
【００６４】
（細胞毒性ＲＮＡｓｅをコードする核酸の調製）
当業者は、本発明における使用に適切な細胞毒性ＲＮＡｓｅ部分が、天然のランピルナ
ーゼ構造を有するポリペプチドおよび全ての酵素的に活性なその改変体を含むことを認識
する。これらの分子は有利には、ＲＮＡｓｅ活性に必須であると考えられるＮ末端ピログ
ルタミン酸残基を有し、哺乳動物ＲＮＡｓｅインヒビターによって実質的に阻害されない
。天然の細胞毒性ＲＮＡｓｅをコードする核酸は、適切な配列のクローニングおよび制限
によって、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅を用いることによっ
て調製され得る。ヒョウガエルのランピルナーゼのアミノ酸配列は、Ardelt et al.,J.Bi
ol.Chem.,256:245(1991)から得ることが可能であり、そして天然のランピルナーゼをコー
ドするｃＤＮＡ配列、またはその保存的に改変された改変体は、Leung et al.,Mol.Immun
ol.,32:1413(1995)のｈＬＬ２ヒト化に用いられるen bloc V-geneアセンブリ法と同様の
方法によって遺伝子合成され得る。細胞毒性ＲＮＡｓｅ改変体を作成する方法は、当分野
で公知であり、そして慣用的な技術の範囲内である。
【００６５】
あるいは、細胞毒性ＲＮＡｓｅまたはその改変体をコードする核酸は、インビトロで合
成され得る。化学的合成によって一本鎖オリゴヌクレオチドが生成される。相補的な配列
とのハイブリダイゼーションによって、または短いプライマーおよび一本鎖をテンプレー
トとして用いるＤＮＡポリメラーゼでの重合によって、これは二本鎖ＤＮＡに変換され得
る。化学的合成は、約１００塩基の配列に最も適合するが、より短い配列を連結すること
によってそれより長い配列を得てもよい。下の実施例２は、細胞毒性ＲＮＡｓｅ遺伝子を
得るための１つの例示的な方法を提供する。
【００６６】
（免疫グロブリン遺伝子の調製）
抗体をコードする遺伝子を調製する方法は、当分野で周知である。例えば、変性プライ
マーセットを用いるＰＣＲを用いて、抗体産生細胞、例えばハイブリドーマから得られる
可変鎖配列ｃＤＮＡを増幅してもよい（または周知の方法を用いる直接ＲＴ−ＰＣＲが、
細胞から得られるｍＲＮＡに対して直接用いられ得る）。例えば、Marks et al.,J Mol B
iol.(1991)222:581-97、およびそこに引用される参考文献を参照のこと。非ヒト抗体は、
当分野で周知である方法によってヒト化されてもよい。Leung、前出およびそこに引用さ
れる方法を参照のこと。あるいは、ヒト（または他の種）の抗体可変領域ドメインをコー
ドする遺伝子は、MorphoSys(Martinsried,Germany)またはCambridge Antibody Technolog
y(Cambridge,UK)から市販されているタイプのファージ・ディスプレイ・ライブラリーか
ら得てもよい。下の実施例１および実施例３はまた、抗体可変ドメインをコードする核酸
配列を得るための例示的な方法を示す。
【００６７】
本質的に、所望の特異性を有する任意の抗体配列が、本発明による免疫毒素を調製する
ために用いられ得る。特に好ましいのは、治療上有用であることが示されている特異性を
有する抗体である。適切な例としては、限定はしないが、腫瘍に結合する抗体、例えば、
Ｂ細胞抗原、Ｔ細胞抗原、形質細胞抗原、ＨＬＡ−ＤＲ系統抗原、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、
ＭＵＣ３、およびＭＵＣ４およびＭＵＣ１６抗原、ＥＧＰ−１抗原、ＥＧＰ−２抗原、胎
盤アルカリホスファターゼ抗原、炭酸脱水素酵素ＩＸ、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、Ｐ１ＧＦ、
ＩＬＧＦ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テネイシン、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、
ＰＳＭＡ、ＰＳＡおよびＰＡＰ；ならびにＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２７、ＣＤ４０、Ｂ細胞お
よびＴ細胞抗原（例えば、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２５およびＣ
Ｄ２２抗原）を含む自己免疫疾患に関連する抗原が挙げられる。この抗原は、ＣＤ１９、
ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＭＵＣ１、ＨＬＡ−ＤＲおよびＩＬ−１５のようなＢ細
胞またはＴ細胞リンパ腫または白血病に関連する抗原であってもよい。この抗原がＣＤ７
４またはＣＤ７４−ＨＬＡ−ＤＲ複合体である場合、適切な抗体はＬＬ１またはそのヒト
化バージョンである。抗原がＣＤ２２である場合、適切な抗体はＬＬ２もしくはＲＢＦ４
であるか、またはそのヒト化バージョンである。抗原がＭＵＣ１である場合、適切な抗体
はＰＡＭ４、またはそのヒト化バージョンである。抗原がＣＤ１６である場合、適切な抗
体は、ＣＡ１２５またはＭｕ−９のいずれかである。抗原がＥＧＰ−１である場合、適切
な抗体はＲＳ７またはそのヒト化バージョンである。抗原がＥＧＰ−２である場合、適切
な抗体としてはＲＳ１１もしくは１７−１Ａまたはそのヒト化バージョンが挙げられる。
この抗体は急速に内部移行する抗体であることが有利である。
【００６８】
可変ドメイン遺伝子の挿入に適切な抗体定常ドメインを含むか、または含むように操作
され得るベクターは、当分野で公知であり、そしてこのようなベクターはまた、本発明の
免疫毒素の発現のために適切である。このようなベクターは、哺乳動物宿主細胞において
、コードされた遺伝子の転写を開始するのに必須である必須の制御配列を含む。このよう
なコントロール配列は、当分野で周知である。例えば、その全体において引用することに
より本明細書に組み込まれる、米国特許第5,650,150号および同第6,472,511号のｐｄＨＬ
２ベクターの説明を参照のこと。あるいは、定常ドメイン遺伝子（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ
３およびＣＬ）は、抗体産生細胞から得られてもよいし、当分野で周知の方法を用いて適
切な発現ベクターにクローニングされてもよい。
【００６９】
（免疫毒素遺伝子の調製）
本発明による免疫毒素コード遺伝子の調製は、例示の目的でのみ提供されて、限定され
るものではない、下の実施例１および４に詳細に例示される。要するに、ＰＣＲを用いて
例えば、抗体軽鎖可変ドメイン（または必要に応じて重鎖可変ドメイン）をコードする遺
伝子を得てもよく、当分野で公知のＰＣＲ法を用いて得てもよい。適切な制限部位が、Ｐ
ＣＲプライマーに導入されてもよく、それによってこの遺伝子とさらなる配列とのその後
の結合が容易になる。同様に、細胞毒性ＲＮＡｓｅコード遺伝子は、都合のよい制限部位
を提供するプライマーをここでも用いて、適切なテンプレートからＰＣＲによって得られ
てもよい。次いで、細胞毒性ＲＮＡｓｅ遺伝子および可変ドメイン遺伝子は、適切な制限
エンドヌクレアーゼで消化されて、可変鎖ＲＮＡｓｅ融合タンパク質をコードする遺伝子
を提供するために直接一緒に結合されてもよい。細胞毒性ＲＮＡｓｅ遺伝子は、有利には
、可変ドメイン遺伝子のＮ末端に結合され、さらに有利には軽鎖可変鎖遺伝子のＮ末端に
結合されるが、ＲＮＡｓｅ遺伝子は、あるいは、重鎖可変ドメインのＮ末端に、または重
鎖および軽鎖可変ドメインの両方のＮ末端に結合されてもよい。
【００７０】
あるいは、適切なリンカーは、合成オリゴヌクレオチド（例えば、細胞毒性ＲＮＡｓｅ
および免疫グロブリン遺伝子に含まれる制限部位と適合しており、そして細胞毒性ＲＮＡ
ｓｅと可変ドメイン遺伝子とリンカー配列との直接の結合をもたらす制限部位を含むよう
に調製され得る）を用いて、可変ドメイン遺伝子と細胞毒性ＲＮＡｓｅ遺伝子との間に導
入され得る。当業者は、種々のリンカーが本発明における使用に適切であることを認識す
る。しかし、リンカーは有利には、１０〜３０アミノ酸長であり、そして二次構造も三次
構造もほとんどまたは全く有さない、親水性アミノ酸を含むリンカーである。このような
リンカーは当分野で周知であり、そして例えば、単鎖Ｆｖ分子を構築するのに用いられる
。例えば、米国特許第4,946,778号を参照のこと。適切なリンカーとしては、配列ＧＧＧ
ＧＳなどの多量体が挙げられる。免疫毒素遺伝子を調製する他の方法は、その全体が引用
することにより本明細書に組み込まれる、米国特許出願第20030099629号に記載される。
【００７１】
インタクトな抗体構造を含む免疫毒素（すなわち、軽鎖ＶＬおよびＣＬドメイン、なら
びに重鎖ＶＨおよびＣＨ１−３ドメインを含む免疫毒素）が調製されるべき場合、上記の
可変ドメイン鎖は、これらのさらなる定常ドメインをコードする配列に結合されなければ
ならない。有利には、適切な定常ドメインを既に含むベクター、例えば、上記のｐｄＨＬ
２を用いる。適切な定常ドメインを調製して、それらを可変ドメインに結合させる別の方
法が当分野で周知である。Ｆａｂフラグメントについては、ＣＬおよびＣＨ１ドメインの
みが必要である。一旦、適切な形態に結合されれば、次にこれらの配列は、宿主細胞のト
ランスフェクションの前に適切な発現ベクターに挿入され得る。哺乳動物発現に適切であ
る発現ベクターは、当分野で周知であり、そしてまた例えば、Invitrogen,Carlsbad,CAか
らも市販されている。
【００７２】
（哺乳動物細胞における免疫毒素の発現）
一旦適切な発現ベクターが調製されれば、適切な宿主細胞にトランスフェクトされる。
組み換え抗体の発現に適切な宿主細胞は、当分野で周知であり、そしてこれには例えば、
ＣＨＯ細胞、および有利には、骨髄細胞株、例えば、ＮＳＯ細胞が挙げられる。ＣＨＯお
よびＮＳＯ細胞の両方がＡＴＣＣ(Manassas,VA)から入手可能である。ヒト抗体配列を含
む免疫毒素の産生のために特に適切な別の宿主細胞は、Karpas et al.,Proc.Natl.Acad.S
ci USA 98:1799(2001)に記載されるKarpas 707H系統である。トランスフェクションは、
周知の方法、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、およびＤＥＡＥデキ
ストラン媒介性トランスフェクションによって達成され得る。有利には、発現ベクターは
、選択マーカー、例えば、ＤＨＦＲを含み、そして宿主細胞はＤＨＦＲ-である。この細
胞は、選択因子（例えば、選択マーカーがＤＨＦＲである場合はメトトレキセート）の存
在下で培養される。陽性のクローンは、例えば、免疫毒素の細胞毒性ＲＮＡｓｅ部分に特
異的に結合する抗体を用いてＥＬＩＳＡ法によって確認され得る。陽性クローンは、後の
増殖のために凍結されてもよいし、または直接増殖されてもよい。陽性クローンの培養物
を、適切な培地、例えば完全ＨＳＦＭ培地中で増殖させる場合、免疫毒素を含む培養上清
を収集する。
【００７３】
（免疫毒素の精製）
免疫毒素は、当分野で周知である方法を用いて容易に精製され得る。例えば、アフィニ
ティー精製が用いられてもよい。完全な抗体構造を含む免疫毒素については、プロテイン
Ａアフィニティー精製を用いて、純粋な免疫毒素を単独の精製工程で得てもよい。さらな
る精製工程は、必要に応じて、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラ
フィーなどのような従来の方法を用いて行なわれ得る。免疫毒素は、従来の方法、例えば
、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析、および例えば抗細胞毒性ＲＮＡｓｅ抗
体を用いるウエスタンブロットによって特徴付けられ得る。ヒョウガエル由来のランピル
ナーゼは、潜在的なグリコシル化部位を含む（実施例１を参照のこと）。この部位のグリ
コシル化が所望されない事象では、免疫毒素は、オンコナーゼ(onconase)上に存在する炭
水化物部分を除去するためにグリコシダーゼ酵素で処理されてもよい。あるいは、ＲＮＡ
ｓｅをコードする遺伝子配列は、保存的アミノ酸置換を介してＡｓｎ残基を置換すること
によってグリコシル化部位を欠失するために、部位特異的変異誘発法によって変異されて
もよい。例えば、６９位置のＡｓｎは、グルタミンで（変異体Ｎ６９Ｑ）、または本明細
書に記載される任意の構築物中の他の適切なアミノ酸で置換されてもよい。このグリコシ
ル化変異体の適切な例としては、２Ｌ−Ｒａｐ（Ｎ６９Ｑ）−ｈＬＬ１−ｒ４Ｐ、２Ｌ−
Ｒａｐ（Ｎ６９Ｑ）−ｈＲＳ７および２Ｌ−Ｒａｐ（Ｎ６９Ｑ）−ｈＬＬ２が挙げられる
。
【００７４】
（細胞毒性ＲＮＡｓｅ免疫毒性を用いる治療方法）
本明細書に記載の免疫毒素は、広範な種々の細胞毒性の治療様式のための薬学的組成物
に処方され得る。これらの組成物は、任意の欲されない細胞タイプ、例えば、不適切な増
殖または活性化を受けている細胞を標的するために用いられてもよいし、または病原性微
生物を標的することによって感染性疾患を処置するために用いられてもよい。詳細には、
この組成物は、種々のガンおよび自己免疫疾患を処置するために有用である。処置され得
るガンとしては、例えば、リンパ腫、白血病、黒色腫、神経芽細胞腫、および骨髄腫、肉
腫、神経膠腫、または癌腫、例えば、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、結腸直
腸癌、前立腺癌、肺癌、腎臓癌または膵臓癌が挙げられる。処置され得る自己免疫疾患と
しては、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、急性特
発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、
重症筋無力症、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘ
ノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソ
ン病、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節
性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、血栓血管炎(thromboangitis
ubiterans)、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝
炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ヴェーゲナー肉芽腫症、膜性
腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行
性糸球体腎炎および線維化性肺胞炎が挙げられる。
【００７５】
本発明の組成物はまた、感染の治療的処置のためにも有用であり、ここでは免疫毒素の
免疫グロブリン成分は、疾患を生じる微生物に特異的に結合する。本発明の状況では、疾
患を生じる微生物としては、病原性細菌、ウイルス、真菌および多様な寄生生物が挙げら
れ、そしてこの抗体は、これらの微生物、それらの産物またはそれらの病変に関連する抗
原を標的し得る。微生物の例としては、限定はしないが以下が挙げられる：
ストレプトコッカス・アガラクティエ、在郷軍人病菌、化膿連鎖球菌、大腸菌、淋菌、
髄膜炎菌、肺炎球菌、Hemophilis influenzae B、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘ
ータ、緑膿菌、ハンセン菌、ウシ流産菌、ヒト結核菌、破傷風毒素、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ
−２、ＨＩＶ−３、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、狂犬病ウイルス、インフ
ルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純疱疹ＩおよびＩＩ、ヒト血清パルボ様ウ
イルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、水痘帯状疱
疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、
ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、流行
性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜
炎ウイルス、疣ウイルス、ブルー・タングウイルス、センダイウイルス、猫白血病ウイル
ス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアン・ウイルス４０、マウス乳癌ウイルス、デ
ング熱ウイルス、風疹ウイルス、原生動物、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、
トキソプラズマ原虫、Trypanosoma rangeli、クルーズ・トリパノソーマ、Trypanosoma r
hodesiensei、トリパノソーマ・ブルーセイ、マンソン住血吸虫，Schistosoma japanicum
、Babesia bovis、Elmeria tenella、回旋糸状虫、熱帯リーシュマニア、旋毛虫、Theile
ria parva、Taenia hydatigena、Taenia ovis、無鉤条虫、単包条虫、Mesocestoides cor
ti、抗マイコプラズマモノクローナル抗体、Mycoplasma arthritidis、M.hyorhinis、M.o
rale、M.arginini、Acholeplasma laidlawii、M.salivarium、およびＭ肺炎。これらの病
原性微生物に結合するモノクローナル抗体は当分野で周知である。
【００７６】
当業者は、これらの実施例が例示的であって、本発明を限定するものではないことを理
解する。
【００７７】
これらの方法では、薬学的組成物は、被験体に１日あたり２回以上、例えば、０．１〜
約１０００ｍｇの量で投与されてもよいが、それより多くてもまたは少なくても適切とみ
なして用いられ得る。
【００７８】
この組成物のタンパク質性の性質に起因して、それらの組成物は特に、非経口投与、例
えば静脈内投与または皮下投与（または皮内投与）に適切であるが、当業者は、他の送達
方法が用いられ得ることを理解する。この方法は、現在開発中であるか、または将来開発
されるタンパク質送達のための方法を包含し、そしてまた例えば、腹腔、頭蓋、胸膜など
のような局所投与を包含し得る。非経口投与のためには、組成物は、薬学的に受容可能な
キャリア、好ましくは、緩衝化生理食塩水のような水性キャリアに溶解されるかまたは懸
濁された免疫毒素の溶液を含んでもよい。これらの溶液は、無菌であって、補助物質、例
えば、ｐＨ調節剤および緩衝化剤、ならびに毒性および等張性の調節剤を含んでもよい。
【００７９】
免疫毒素の用量は、１日あたり１患者あたり約０．１〜１０ｍｇであるが、特にこの薬
物が局所的に投与され、血流中ではない場合には、１日あたり１患者あたり最大１００ｍ
ｇの用量が用いられてもよい。この用量は、より少量のＲＮＡｓｅ成分を含む、抗体融合
タンパク質に基づく。
【００８０】
治療適用では、この組成物は、疾患に罹患している被験体に対して、目的の細胞を殺傷
するのに十分な量として規定される、治療上細胞毒性の量で投与される。これを達成する
のに十分な量は、「薬学的に有効な量(therapeutically effective amount)」として規定
される。任意の所定の環境における正確な量は、疾患の重篤度および患者の健康の一般的
状態を含む種々の要因に依存する。この組成物の単回投与または複数回投与は、必要な用
量に依存して投与され得る。適切な投薬レジメンの決定は、当分野で周知の慣用的方法を
用いて行なわれる。
【００８１】
免疫毒素はまた、インビトロにおいて細胞の集団を処置するために用いられ得る。例え
ば、それらは、骨髄アブレーションを受けている患者への移植の前に骨髄中の欲されない
細胞タイプを選択的に殺傷するために用いられ得る。
【００８２】
このように一般的に記載された本発明は、例示のために記載されており、本発明の限定
は意図していない以下の実施例を参照してさらに容易に理解される。
【実施例１】
【００８３】
（２Ｌ−ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐの発現および特徴付け）
実施例１では、ｒａｐはランピルナーゼである。
【００８４】
（ｐｄＨＬ−ＩｇＧ４Ｐ改変体の構築）
ＩｇＧ４遺伝子を含むＢ１３−２４細胞は、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ番号 ＣＲＬ−１１３
９７）から購入して、ゲノムＤＮＡを単離した。要するに、細胞をＰＢＳで洗浄して、消
化緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２５ｍＭ
のＥＤＴＡ ｐＨ８．０、０．５％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ）に
再懸濁して、５０℃で１８時間インキュベートさせた。等容積のフェノール／クロロホル
ム／イソアミルアルコールを用いてこのサンプルを抽出して、７．５ＭのＮＨ4Ａｃ／１
００％ ＥｔＯＨで沈殿させた。ゲノムＤＮＡは、遠心分離によって回収して、ＴＥ緩衝
液に溶解した。テンプレートとしてゲノムＤＮＡを用い、ＩｇＧ４遺伝子を、以下のプラ
イマーを用いてＰＣＲによって増幅させた。
プライマー−ＳａｃＩＩ：5'CCGCGGTCAC ATGGCACCAC CTCTCTTGCA GCTTCCACCA AGGGCCC 3'
（４７マー）；
プライマー−ＥａｇＩ：5'CCGGCCGTCG CACTCAT TTA CCCAGAGACA GGG 3'（３３マー）
【００８５】
増幅されたＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ−ＴＡ配列決定ベクター(Invitrogen)中にクローニ
ングして、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ｐｄＨＬ−ｈＬＬ２中のＩｇＧ１の重鎖定
常領域を含むＳａｃＩＩ−ＥａｇＩフラグメントを、ＴＯＰＯ−ＴＡ−ＩｇＧ４プラスミ
ドのＳａｃＩＩ−ＥａｇＩで置換して、ｐｄＨＬ２−ｈＬＬ２−ＩｇＧ４（ｐｄＨＬ２−
ｈＬＬ２−γ４）ベクターを生成した。
【００８６】
（ＩｇＧ4−プロリン変異）
Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏの変異をＩｇＧ４のヒンジ領域に導入して、半分子の形成を回避し
た。変異したヒンジ領域の５６ｂｐフラグメント（ＰｓｔＩ−ＳｔｕＩ）を合成し（トッ
プ：5'GAG TCC AAA TAT GGT CCC CCA TGC CCA CCG TGC CCA GGT AAG CCA ACC CAG G3';ホ
゛トム:5'C CTG GGT TGG CTT ACC TGG GCA CGG TGG GCA TGG GGG ACC ATA TTT GGA CTC T
GC A 3'）、アニーリングして、ＩｇＧ4のＰｓｔＩ−ＳｔｕＩフラグメントで置換した。
この構築で、最終ベクターｐｄＨＬ２−ｈＬＬ２−γ４Ｐを得た。
【００８７】
（ｐｄＨＬ２−ｈＬＬ１−γ４Ｐの構築）
ｐｄＨＬ２−ｈＬＬ２−γ４ＰのＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｖｋおよ
びＶＨ領域を含むｐｄＨＬ２−ｈＬＬ１のＸｂａ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントで置換し
て、ｈＬＬ１−γ４Ｐ構築物を生成した。
【００８８】
（ｐｄＨＬ２−２Ｌ−ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐの構築）
可塑性リンカー（ＧＧＧＧＳ）3を用いて、ｈＬＬ１のＶｋのＮ末端に対してＲａｐの
Ｃ末端を結合させた。各々の軽鎖のＮ末端に１つのｒａｐ分子を結合させた。この分子に
ついてのＤＮＡの構築は、以下のプライマーを用いてＰＣＲによって行なった：
Ｐ１；リーダー５’（ＸｂａＩ）：5'CTC TAG ACA CAG GAC CTC ACC ATG GGA TGG 3'（
３０マー）
Ｐ２；リーダー３’：5'TGA AAC GTT AGC CAA TCC TGG GAG TGG ACA CCT GTG GA 3'（
３８マー）
Ｐ３；Ｏｎｃ ５’：5'TCC ACA GGT GTC CAC TCC CAG GAT TGG CTA ACG TTT CA 3'（
３８マー）
Ｐ４；Ｏｎｃ ３’（ＥｃｏＲＶ）：5'AGT CAG CTG GAT ATC GGA GCC ACC GCC TCC AG
A TC 3'（３５マー）
Ｐ５；ＬＬ１−Ｖｋ ５’（ＥｃｏＲＶ）：5'GAT CTG GAG GCG GTG GCT CCG ATA TCC
AGC TGA CT 3'（３５マー）
Ｐ６；ＬＬ１−Ｖｋ ３’（ＢａｍＨＩ）：5'GGG ATC CAA CTG AGG AAG CAA AGT TTA
A 3'（２８マー）
【００８９】
図１に図示されるように、ｐｄＨＬ２−ｈＬＬ１−γ４ＰのＸｂａ−ＢａｍＨＩフラグ
メントを、ｐＢＳ−２Ｌ−ｒａｐ−ｈＬＬ１のＸｂａ−ＢａｍＨＩ（Ｘｂａ−Ｌｅａｄｅ
ｒ−ｒａｐ−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｖｋ−ＢａｍＨＩ）フラグメントで置換して、最終のベクタ
ーｐｄＨＬ２−２Ｌ−ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐを完成させた。
【００９０】
（トランスフェクション）
ベクターＤＮＡ（３０μｇ）をＳａｌＩ酵素で直線化して、エレクトロポレーション（
４５０Ｖ）によってＮＳ０（４×１０6細胞／ｍＬ）またはＳｐ２／０−Ａｇ１４（５×
１０6個の細胞／ｍＬ）の骨髄腫細胞にトランスフェクトした。低ＩｇＧ ＦＢＳ（１０
％）、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、Ｌ
−グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、非必須アミノ酸（１００μ
Ｍ）およびメトトレキセート（０．１μＭ）を補充した完全なハイブリドーマ−ＳＦＭ培
地中で細胞を増殖させた。陽性のクローンをＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。要
するに、プレートを、ＰＢＳ培地中に含まれる５μｇ／ｍＬの５０μｌの抗ｒａｐ抗体を
用いてコーティングして、４℃で一晩インキュベートさせた。ＰＢＳでプレートを洗浄し
、２％ＢＳＡでブロックした後に細胞培養上清を添加した。ＨＲＰ複合体化ヤギ抗ヒトＩ
ｇＧ4抗体を検出のために用いて、ＯＰＤを発色のための基質として用いた。プレートを
４９０ｎｍで読み取った。陽性のクローンを増殖させて、さらなる使用のために凍結させ
た。クローンＣ６を、最適のプロデューサーとして特定して、さらなる開発のために用い
た。
【００９１】
（発現および精製）
各々に５００ｍｌの培地を有する２つのローラーボトル中で細胞を最終培養物まで増殖
させて（１０〜２０％の生存度）、その細胞を遠心分離によって取り出した。培養上清を
充填して、プロテインＡカラムに加え、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化した。ローディング後、このカラムを１００ｍＭのク
エン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄して、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ３．５）で溶出させ、融合タンパク質を得た。生成物を含有するピークを、３
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を用いてｐＨ７．０に調節して、１０ｍＭのＰＢＳ緩
衝液に対して透析した。濃縮後、この生成物を０．２２μｍのフィルターを通して濾過し
、２〜８℃で保管した。１Ｌの培養物から、精製後に１６ｍｇを回収した。
【００９２】
（２Ｌ−ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐの特徴付け）
ＨＰＬＣ：タンパク質の純度および濃度は、ＨＰＬＣでチエックした。先鋭な単独のピ
ークが、図２に示されるように７．７分で観察され、この保持時間によって、この分子が
ＩｇＧより大きいことが示された。
【００９３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：４〜２０％ Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅゲル（ＰＡＧＥｒ（商標）
Gold Precast Gels,Cambrex）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元条件下で行なった。図
３に示されるように、予想されるサイズ約５０ｋＤの重鎖に関連するバンド、ならびにｈ
ＬＬ１の軽鎖（約２５ｋＤ）よりも両方とも大きい、約３７ｋＤおよび３９ｋＤの分子量
の２つのバンドが観察された。２つの軽鎖の存在は、融合タンパク質上のｒａｐのグリコ
シル化に起因することが示された（以下参照）。
【００９４】
質量分析法：The Scripps Research Institute,CAにおいて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法に
よって質量分析を行った。２つのサンプル、その１つは天然の状態（１．６ｍｇ／ｍＬを
１０ｍＭのＰＢＳに含有）、そしてもう一方は、還元状態（１．６ｍｇ／ｍＬを１ｍＭの
ＨＥＰＥＳ／１０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．５緩衝液）を、分析のために送った。天然のサ
ンプル（図４ａ）は、質量１７７１５０の１つの主要なピークを示し、これは、ＩｇＧに
加えて２つのｒａｐのＭＷとよく一致している。この還元サンプルは、５０５６０（重鎖
に相当する）、３８５２６および３６７００（ｒａｐを含有する２つの軽鎖に相当する）
において３つの主なピークを示した（図４ｂ）。
【００９５】
ウエスタンブロッティング：精製されたタンパク質におけるｒａｐの存在を確認するた
めに、ウエスタンブロッティングを行った。還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル由来のサ
ンプルを、PVDF-Plus(Osmonics,Inc.,)メンブレン上に電気的に転写した。５％ ＢＳＡ
でのブロッキング後、マウスの抗ｒａｐ抗体を、１：１０，０００希釈または１００ｎｇ
／ｍｌで添加して、１時間インキュベートさせた。洗浄後、ＨＲＰ複合体化ヤギ抗マウス
Ｆｃ抗体を添加して１時間インキュベートさせた。６回の洗浄後、LumiGloTM(Kirkegaard
&Perry Laboratories)基質を添加して、コダックのフィルムを現像した。図５に示される
ように、融合された軽鎖に相当する両方のバンドをフィルム上で検出し、これによって両
方の軽鎖上のｒａｐの存在を確認した。
【００９６】
Ｎ−グリコシダーゼでの処理：ｒａｐは、潜在的なＮグリコシル化部位、Ａｓｎ−Ｘ−
Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｓｎ６９−Ｖａｌ７０−Ｔｈｒ７１を有するので、分子量で２ｋＤの
相違があるという２つの軽鎖の観察は、ｒａｐの一様でないグリコシル化の結果であり得
る。この可能性を検討するために、ｒａｐ−ｈＬＬ１抗体を、供給業者の推奨に従って変
性条件下でＮグリコシダーゼ(New England Biolabs)とともにインキュベートさせた。図
６に示されるとおり、Ｎ−グリコシダーゼ処理後、２つの軽鎖に相当する２つのバンドが
１つ（より早く移動するバンド）に集束し、これによってカルボヒドラーゼの一様でない
分解が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの２つのバンドという観察の原因であったことが確認された
。除去されたグリコシル化部位を有するＲａｐの改変体であるＲａｐ（Ｎ６９Ｑ）が組み
換え構築物中でＲａｐについて置換される場合、唯一のｒａｐ融合軽鎖の観察によってさ
らなる支持が得られた（データ示さず）。
【００９７】
ｒａｐの活性：ＲＮＡｓｅ活性は、供給業者の推奨に従ってBright-GloTM Luciferase
Reporter Assayシステム(Promega)を用いてＴＮＴ（商標）Quick Coupled Transcription
/Translation System(Promega)によって試験した。このアッセイの原理は、ルシフェラー
ゼレポーター系を用いるＲＮａｓｅ活性の結果としてのタンパク質合成の阻害（ｍＲＮＡ
分解）の測定であって。サンプルは、種々の希釈中で遊離のｒａｐ（０．００１〜２．５
ｎＭ）、ｈＬＬ１−ｒａｐ（０．０１−２０ｎＭ）またはＰＫＩ−ＬＬ２−Ｏｎｃおよび
ＰＫＩＩ−ＬＬ２−Ｏｎｃ（０．０１〜２０ｎＭ）として表されるｈＬＬ２−ｒａｐの化
学的複合体を調製した。各々のサンプル（５μＬ）を、２０μｌのＴＮＴマスター混合物
と混合して、９６ウェルプレート中で３０℃で２時間インキュベートして、それから１μ
ｌを、５０μｌのBright-GloTM基質での分析のために取り出した。その結果を、Excelま
たはPrism Padソフトウェアを用いて、図７に示した。ＥＣ50値は、ｒａｐ−ｈＬＬ１お
よびｈＬＬ２−Ｏｎｃの化学的複合体については約３００ｐＭ、そして遊離のｒａｐにつ
いては３０ｐＭであった。
【００９８】
ＷＰについての競合結合：ＷＰはｈＬＬ１の抗イディオタイプ抗体である。ＷＰに対す
るｈＬＬ１抗体と比較したｒａｐ−ｈＬＬ１抗体の親和性は、競合結合アッセイによって
評価した。要するに、９６ウェルプレートを５０μｌのＷＰを５μｇ／ｍＬで用いてコー
ティングして、４℃で一晩インキュベートさせた。タンパク質サンプルの３つのタイプで
あるｈＬＬ１、ｒａｐ−ｈＬＬ、またはｈＡ２０は、種々の２倍希釈（最終濃度は０．４
９〜１０００ｎＭに及ぶ）中で調製して、等容積の２×ＨＲＰ複合体化ｍＬＬ１抗体（最
終希釈は１／２０，０００）と混合した。上記のようなＨＲＰ複合体化ｍＬＬ１と混合し
た５０μＬのタンパク質サンプルを、各々のウェルに添加して、１時間インキュベートさ
せた。洗浄後、Ｈ2Ｏ2を含有するＯＰＤ基質を添加してプレートを４９０ｎｍで読んだ。
図８に示されるように、吸光度に対するタンパク質濃度を、ExcelまたはPrism Pad graph
ソフトウェアを用いてプロットした。ｈＡ２０（ヒト化抗−ＣＤ２０抗体）を、陰性のコ
ントロールとして用いた。図８から、ｒａｐ−ｈＬＬ１は、ｈＬＬ１と同様の結合親和性
を有し、そして陰性コントロールｈＡ２０は、親和性を全く有さないことが明らかである
。抗原の供給源としてRaji細胞を用いて同様の結果を得た。
【００９９】
インビトロ細胞毒性：インビトロ細胞毒性は、Ｂ細胞リンパ腫細胞株(Daudi)および複
数の黒色腫細胞株（ＭＣ／ＣＡＲ）で測定した。細胞（０．１ｍｌ中に１０，０００個）
を、９６ウェルプレートの各々のウェルに入れた。２４時間後、遊離のｈＬＬ１、遊離の
ｒａｐまたはｒａｐ−ｈＬＬ１（１０μｌ）を適切なウェルに添加して、その細胞をイン
キュベーター中で３７℃で３日間インキュベートした。細胞増殖は、ＭＴＳテトラゾリウ
ム色素還元アッセイまたはＢｒＤＵ比色定量アッセイを用いて決定した。結果は、Prism
Padソフトウェアを用いてグラフとして得られたＥＣ50で表す。図（図９〜１０）から、
ｒａｐ−ｈＬＬ１が、Ｂ−細胞リンパ腫細胞株(Daudi)および多発性骨髄腫細胞株（ＭＣ
／ＣＡＲ）の両方に対して感受性であることが証明される。ｒａｐ−ｈＬＬ１は、ＥＣ50
値によって反映されるように、ＭＣ／ＣＡＲ細胞に比較してDaudi細胞に対して有意によ
り強力（細胞毒性）であった（図９および図１０）。ＭＣ／ＣＡＲ細胞については、ＥＣ
50値は、試験した濃度では達成されなかった。最高濃度（５６ｎＭ）では、細胞の生存度
は５７％であった。将来の実験は、Daudi細胞上のｒａｐ−ｈＬＬ１について正確なＥＣ5
0値を測定することが目的である。ｈＬＬ１または遊離のｒａｐは、それ自体では、いず
れの細胞株でも細胞毒性を実証しなかった。
【０１００】
薬物動態および体内分布：ｈＬＬ１または２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐを、Sharke
y et al.,(Int J Cancer.1990;46:79-85)に記載のように、２−（４−イソチオシアナー
トベンジル）ＤＴＰＡ(Macrocyclics,Dallas,TX)を用いてジエチレントリアミノペンタ酢
酸（ＤＴＰＡ）と複合体化させて、ＤＴＰＡ−ｈＬＬ１またはＤＴＰＡ−２Ｌ−Ｒａｐ−
ｈＬＬ１−γ４Ｐを得た。これはそれぞれ、薬物動態学的研究および生体分布の研究のた
めに、88Ｙ塩化物(Los Alamos National Laboratory(Los Alamos,NM)または111Ｉｎ塩化
物(Perkin Elmer Life Sciences,Boston,MA)で標識された。ナイーブな雌性ＳＣＩＤマウ
ス（８週齢、１８〜２２ｇ）に対して各々の動物に、ｈＬＬ１および２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬ
Ｌ１−γ４Ｐの各々１０μｇの総用量を投与するように、未標識の、ｈＬＬ１または２Ｌ
−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４ＰのＤＴＰＡ複合体を補充した０．００１ｍＣｉ88Ｙ−ＤＴＰ
Ａ−ｈＬＬ１および０．０２ｍＣｉの111Ｉｎ−ＤＴＰＡ−２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ
４Ｐの混合物を静脈内注射した。投与後選択された時点（１、２、４、１６、４８、７２
、１６８時間）後に、５匹のマウスの群を麻酔して、血液サンプルを心臓穿刺によって採
取した。主な組織を取り出して、秤量して、容器中に入れた。血液サンプルおよび組織を
、目盛り付きのガンマカウンターであるMinaxiλ Auto-Gamma（商標）５０００シリーズ
のガンマカウンター(Packard Instrument Company;Downers Grove,IL)で、111Ｉｎ（チャ
ネル１２０〜４８０）および88Ｙ（チャネル６００〜２０００）についてカウントした。
111Ｉｎカウンティングウインドウへの88Ｙエネルギーの後方散乱について補正するため
に交差曲線を作成した。
【０１０１】
インビトロの毒性：ナイーブなＳＣＩＤまたはＢＡＬＢ／ｃマウスに、マウス１匹あた
り２５〜４００μｇに及ぶ種々の用量の２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐを静脈内注射し
て、毒性および体重の損失の可視的な徴候について毎日モニターした。最大耐容用量（Ｍ
ＴＤ）は、死亡が生じず、かつ体重減少が処置前の動物の重量（約２０ｇ）の２０％以下
である最高用量として規定した。毒性効果を経験した動物は屠殺して、回収して、組織病
理学的分析に供した。ナイーブなＳＣＩＤマウスでは、２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐ
の１００、１５０、２００、２５０、３００または４００μｇの単回静脈内用量によって
、動物の重篤な体重減少および死亡が生じたが、全てのマウスは、２５または５０μｇの
用量で生残した（表２）。ＢＡＬＢ／ｃマウスでは、全てのマウスが２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬ
Ｌ１−γ４Ｐの３０または５０μｇの単回静脈内用量で生残したが、１００または２００
μｇでは生残しなかった。別の実験では、２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐの７５μｇの
用量は、ＳＣＩＤマウスに対して毒性であることが見いだされた（データ示さず）。従っ
て、単回ボーラス注射として与えられた２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４ＰのＭＴＤは、Ｓ
ＣＩＤマウスでは５０〜７５μｇであって、ＢＡＬＢ／ｃマウスでは５０〜１００μｇで
ある。死亡マウスおよび屠殺されたマウスの全体の病理学的な検査では、重篤な肝臓およ
び脾臓の毒性が示された。肝臓は、色が青ざめており、脾臓は縮んで、通常のサイズより
小さかった。組織病理学的検査によって、肝臓および脾臓の壊死が明らかになった。代表
的なマウスの血清サンプルでは、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アアス
パルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）および総ビリルビンのレベル上昇があり
、このことはこれらの高用量での有意な肝臓毒性を示唆していた。
【０１０２】
データ分析：インビトロの細胞毒性研究のために、三連の測定値の平均から用量応答曲
線を作成して、GraphPad Prismソフトウェア(Advanced Graphics Software,Encinitas,CA
)を用いて５０％阻害濃度（ＩＣ50）値を得た。薬物動態学的データは、ノンコンパート
メント分析プログラムWinNonlin，バージョン４．１(Pharsight,Mountain View,CA)の標
準的アルゴリズムを用いて分析した。このプログラムは、線形補間による線形台形公式を
用いて曲線下免疫（ＡＵＣ）を算出する。排出速度定数（ｋβ）は、一次速度式を仮定し
て終末半減期（ｔ1/2β）から算出した。生残研究は、GraphPad Prismソフトウェアを用
いるKaplan-Meierプロット（ログランク分析）を用いて分析した。相違はＰ＜０．０５で
有意とみなした。
【０１０３】
薬物動態および生体分布のデータ：放射性標識したｈＬＬ１および２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬ
Ｌ１−γ４Ｐの薬物動態および生体分布を、ナイーブなＳＣＩＤマウスで測定した。ｈＬ
Ｌ１および２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐを、ＤＴＰＡと結合体化して、それぞれ標識
した88Ｙおよび111Ｉｎで追跡した。図１１に示されるように、111ＩＩｎ−標識した２Ｌ
−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐは、初期の急速な再分布相（α）および後期の緩徐な排出相
（β）によって特徴付けられる、88Ｙ−標識されたｈＬＬ１と同様の血液からの二相性の
クリアランスを示す。わずかに短いα半減期が、ｈＬＬ１（４時間）に比較して、２Ｌ−
Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐ（５．１時間）について観察された。５時間を超えるデータポ
イントを用いて、ｔ1/2β、ｋβ、ＡＵＣ、平均滞留時間(mean residence time)（ＭＲＴ
）、見かけの分布容積（Ｖｄ）、およびクリアランスの速度（Ｃｌ）を算出して、これら
のパラメーターの値を表１に示す。111Ｉｎ−標識された２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４
Ｐの組織取り込みは、88Ｙ−標識ｈＬＬ１の取り込みと同様であった（データ示さず）。
【表１】
【０１０４】
インビトロの毒性：ナイーブなＳＣＩＤマウスでは、１００、１５０、２００、２５０
、３００または４００μｇの単回静脈内用量の２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐは、動物
の重篤な体重減少および死亡を生じたが、全てのマウスは、２５または５０μｇの用量で
生残した（表２）。ＢＡＬＢ／ｃマウスでは、全てのマウスが２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−
γ４Ｐの３０または５０μｇの単回静脈内用量では生残したが、１００または２００μｇ
では生残しなかった（表２）。別の実験では、２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐの７５μ
ｇの用量は、ＳＣＩＤマウスに対して毒性であることが見いだされた（データ示さず）。
従って、単回ボーラス注射として与えられた２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４ＰのＭＴＤは
、ＳＣＩＤマウスでは５０〜７５μｇであって、ＢＡＬＢ／ｃマウスでは５０〜１００μ
ｇである。死亡マウスおよび屠殺されたマウスの全体的な病理学的な検査では、重篤な肝
臓および脾臓の毒性が示された。肝臓は、色が青ざめており、脾臓は縮んで、通常のサイ
ズより小さかった。組織病理学的検査によって、肝臓および脾臓の壊死が明らかになった
。代表的なマウスの血清サンプルでは、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、
アアスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）および総ビリルビンのレベル上昇
があり、このことはこれらの高用量での有意な肝臓毒性を示唆していた。
【表２】
【０１０５】
（腫瘍保有マウスでの治療有効性）
腫瘍保有マウスでの治療有効性：１群あたり８〜９匹の雌性ＳＣＩＤマウス（８週齢、
１８〜２２ｇ）に、１．５×１０7個のDaudi細胞を静脈内注射して、１日後に処置した。
後肢の麻痺についてマウスを毎日検査して、毎週秤量した。動物が後肢の麻痺を発症する
かまたはその処置前の体重の２０％が低下した場合、それらの動物を安楽死させた。各々
のセットの治療実験は１８０日後に終えた。
【０１０６】
図１２に示されるように、未処置のマウス（ＰＢＳのみ）は、３０日内に全て死亡し、
平均生残時間(median survival time)（ＭＳＴ）は２８日であった。５０μｇの２Ｌ−Ｒ
ａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐ中の成分タンパク質の組成に相当する、ｈＬＬ１−γ４Ｐ（４３
．２μｇ）およびＲａｐ（６．６μｇ）の混合物を投与されたコントロール群のＭＳＴは
、７０日であった（Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ群）。対照的に、５μｇまたは１５μｇの
いずれかの２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐの単回注射を受けた全てのマウスでは、１０
０日より長く生きており（ＭＳＴ＞１８０日；Ｐ＝０．０００５対成分処置群）、そして
この研究の終わり近くで各々の群から欠けたのは１匹のマウスだけであった。１８０日後
に研究が終わったとき、５、１５、３０、４０または５０μｇの２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１
−γ４Ｐの単回注射を投与されたマウスの９０％が治癒した。１μｇの単回注射を受けた
マウスのＭＳＴは、２３０％の増大に相当する、未処置の群の２８日に比較して９２日で
あった（Ｐ＜０．０００１）ことに注目すべきである。
【実施例２】
【０１０７】
（細胞毒性ＲＮＡｓｅをコードするＰＣＲ増幅したＤＮＡの合成）
組み換え細胞毒性ＲＮＡｓｅのＮ末端配列（４６アミノ酸）をコードするセンス鎖配列
［5'-TGG CTA ACG TTT CAG AAG AAA CAT ATC ACG AAT ACA CGA GAT GTA GAC TGG GAC AAT
ATA ATG TCT ACG AAT CTG TTT CAC TGT AAG GAT AAG AAT ACC TTT ATA TAC AGT CGC CCA
GAG CCT GTA AAG GCT ATC TGT A-3'］を有する１３９マーのＤＮＡヌクレオチド、ＯＮ
ＣＯ−Ｎを、自動ＤＮＡシンセサイザー(Applied Biosystem 392 DNA/RNA Synthesizer)
によって合成して、隣接するプライマーＯＮＮＢＡＣＫ［5'-AAG CTT CAT ATG CAG GAT T
GG CTA ACG TTT CAG AAG AAA-3'、およびＯＮＮＦＯＲ［5'-CTT ACT CGC GAT AAT GCC TT
T ACA GAT AGC CTT TAC AGG CTC TG-3'］を用いるＰＣＲ増幅のためのテンプレートとし
て用いた。得られた二本鎖ＰＣＲ産物は、細胞毒性ＲＮＡｓｅのＮ末端の半分の５４アミ
ノ酸残基をコードするｃＤＮＡ配列を含む。ＯＮＮＢＡＣＫは、ステージングベクターに
、または細菌発現ベクターへのインフレーム結合のために（ＮｄｅＩ部位）サブクローニ
ングを容易にするために、制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＡＧＣＴＴ）およびＮｄｅＩ（
ＣＡＴＡＴＧ）を含む。ＮｒｕＩ部位（ＴＣＧＣＧＡ）を、ＯＮＮＦＯＲプライマーに組
み込んで、細胞毒性ＲＮＡｓｅのＣ末端半分をコードするｃＤＮＡとのインフレーム結合
を容易にする。
【０１０８】
同様に、細胞毒性ＤＮＡｓｅのＣ末端配列（４６アミノ酸）をコードするセンス鎖配列
［TGC TGA CTA CTT CCG AGT TCT ATC TGT CCG ATT GCA ATG TGA CTT CAC GGC CCT GCA AA
T ATA AGC TGA AGA AAA GCA CTA ACA AAT TTT GCG TAA CTT GCG AGA ACC AGG CTC CTG TA
C ATT TCG TTG GAG TCG GG-3'］を有する１３７マーのＤＮＡヌクレオチド、ＯＮＣＯ−
Ｃを合成して、プライマーＯＮＣＢＡＣＫ［5'-ATT ATC GCG AGT AAG AAC GTG CTG ACT A
CT TCC GAG TTC TAT-、およびONCFOR[5'-TTA GGA TCC TTA GCA GCT CCC GAC TCC AAC GAA
ATG TAC-3'］によってＰＣＲ増幅させる。最終の二本鎖ＰＣＲ産物は、細胞毒性ＲＮＡ
ｓｅのＣ末端の半分の残りの５１アミノ酸をコードするｃＤＮＡ配列を含んだ。ＮｒｕＩ
部位によって、ＯＮＣＢＡＣＫに組み込まれたＰＣＲ増幅されたＤＮＡのＮ末端の半分と
のインフレームの結合が可能になった。ステージングベクターへ、または細菌発現ベクタ
ーへのサブクローニングのために、終止コドン（太字で示される）およびＢａｍＨＩ制限
部位（下線）をＯＮＣＦＯＲ配列に入れた。
【０１０９】
適切な制限酵素での処理後に細胞毒性ＲＮＡｓｅのＮ末端およびＣ末端の半分をコード
する、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡをＮｒｕＩ部位に結合して、ステージングベクター、例え
ばStratageneのpBluescript中にサブクローニングした。この結合された配列は、Ｎ末端
のＭｅｔを有する１０５アミノ酸のポリペプチドをコードしなければならない。
【実施例３】
【０１１０】
（ＬＬ２およびＭＮ−１４のＶ−領域配列のクローニング、ならびにＬＬ２およびＭＮ−
１４のヒト化）
ｈＬＬ２およびｈＭＮ−１４のＶ領域配列は公開されている。Leung et al.,Mol.Immun
ol.,32:1413(1995)；米国特許第5,874,540号。ＬＬ２およびＭＮ−１４のＶＫおよびＶＨ
の配列は、公開された方法およびプライマーを用いてＰＣＲ増幅させた。
【０１１１】
ＰＣＲ増幅されたＤＮＡの配列分析によって、それらが抗体のＶＫおよびＶＨドメイン
の代表的なタンパク質をコードすることが示された。ＰＣＲ−増幅されたＬＬ２およびＭ
Ｎ−１４の配列に基づいて構築されたキメラ抗体は、その親抗体に匹敵する免疫反応性を
示しており、これによって得られた配列の信頼性が確認された。
【０１１２】
ＬＬ２抗体の配列分析によって、フレームワーク−１領域におけるＶＫ付加されたＮ結
合グリコシル化部位の存在が明らかになった。突然変異研究によって、ＶＫ付加部位での
グリコシル化は、抗体の免疫反応性を維持するには必要ないことが示された。ＦＲ−１グ
リコシル化部位の包含なしに、ＲＥＩフレームワーク配列を、軽鎖ＣＤＲを接合するため
、そしてＥＵ／ＮＥＷＭをＬＬ２の重鎖ＣＤＲを接合するための足場として用いた。ヒト
化ＬＬ２（ｈＬＬ２）の免疫反応性は、マウスおよびキメラのＬＬ２の免疫反応性に匹敵
することが示された。ＬＬ２の内部移行の速度は、抗体のキメラ化またはヒト化によって
は影響されなかった。
【実施例４】
【０１１３】
（ヒト化ＬＬ２および細胞毒性ＲＮＡｓｅの融合タンパク質をコードする遺伝子の構築）
ｈＬＬ２のＶＨおよびＶＫの配列をテンプレートとして用いて、標準的なＰＣＲ手順に
よってｈＬＬ２−ｓｃＦｖ遺伝子をアセンブルした。遺伝子の構成は、Ｍｅｔ（−１）−
ＶＬ−（ＧＧＧＳ）4−ＶＨ−（Ｈｉｓ）6であった。ＶＨドメインに対して１６アミノ酸
のリンカー（ＧＧＧＳ）6を介して結合されたＶＬ遺伝子のＮ末端に、Ｍｅｔ（ＡＴＧ）
開始コドンを−１位置で組み込んだ。６つのヒスチジル残基からなるテールを、ＶＨ鎖の
カルボキシル末端に入れて、金属キレートクロマトグラフィーを介した融合タンパク質の
精製を容易にする。
【０１１４】
ランピルナーゼ−ｈＬＬ２ｓｃＦｖの免疫毒素融合タンパク質遺伝子を、制限消化およ
び結合方法によって同様の方式で構築した。ｃＤＮＡ配列は発現された場合、以下の構築
物：
ランピルナーゼ−［リンカー］−ＶＬ−（ＧＧＧＳ）4−ＶＨ−（Ｈｉｓ）6の融合タン
パク質をコードした。
【０１１５】
細胞毒性ＲＮＡｓｅのＣ末端とＶＬドメインのＮ末端との間に挿入され得る種々のリン
カーが存在する。好ましいリンカーは、シュードモナスの外毒素（ＰＥ）のＣ末端位置２
７３〜２８１由来のアミノ酸配列ＴＲＨＲＱＰＲＧＷである。この配列は、配列のＧ残基
とＷ残基との間に存在する切断でのサブチリシンによる、活性フラグメントへのＰＥの細
胞内切断の認識部位であることが示されている。Chiron et al.,J.Biol Chem.,269:18167
(1994)。この配列の組み込みによって、融合免疫毒素の内部移行後の活性細胞毒性ＲＮＡ
ｓｅの放出が容易になる。あるいは、細胞毒性ＲＮＡｓｅとｓｃＦｖとの間の可塑性の結
合を可能にするために、ＥＤＮ−ｓｃＦｖの構築に用いられるStaphylococcalのプロテイ
ンＡのフラグメントＢのアミノ酸残基４８〜６０からなる１３アミノ酸残基のスペーサー
を代わりに用いてもよい。Tai et al.,Biochemistry,29:8024(1990)、およびRybak et al
.,Tumor Targeting,1:141(1995)。
【実施例５】
【０１１６】
（ヒト化ＭＮ−１４およびランピルナーゼの融合タンパク質をコードする遺伝子の構築）
ＭＮ−１４ｓｃＦｖは、ヒト化ＭＮ−１４トランスフェクトーマ(transfectoma)由来の
ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって生成した。ＭＮ−１４ ｓｃＦｖのために用いられるリン
カーは、１５アミノ酸リンカー（ＧＧＳＧＳ）3であり、そして方向はＶL−リンカー−Ｖ
Hであった。ＤＮＡ配列の確認後、単鎖構築物を、実施例１に記載のような真核生物発現
ベクター中にサブクローニングして、発現のために適切な哺乳動物宿主細胞中にトランス
フェクトする。
【０１１７】
別の単鎖構築物も作成した。これは、重鎖および軽鎖の反対の５’−３’方向で作成し
、ｐＣＡＮＴＡＢＥ５Ｅ(Pharmacia Biotech,Piscataway,N.J.)中でアセンブルして、フ
ァージ中で発現させた。このｓｃＦｖを発現する組み換えファージの特異的結合はＥＬＩ
ＳＡによって実証された。
【０１１８】
ＶL−リンカー−Ｖ配列を、以下に図示されるように、ランピルナーゼ−ＭＮ−１４融
合タンパク質の構築のために用いた。ランピルナーゼをコードするＤＮＡフラグメントを
実施例１に記載のように得た。２３アミノ酸リンカーをランピルナーゼ配列とｓｃＦｖと
の間で用いた。Kurucz et al.(1995)。あるいは、上記のＭＮ−１４ ｓｃＦｖの構築に
用いられる（ＧＧＳＧＳ）3リンカーを用いた。融合タンパク質の好ましい構成は以下：
ランピルナーゼ−リンカー−−ＶＬ−−（ＧＧＳＧＳ）3−−ＶH
であった。
【０１１９】
本明細書に引用される全ての特許および他の引用文献の内容は、その全体が引用するこ
とにより本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００１】
本願は、その内容が全体として引用することにより本明細書に組み込まれる、2004年2
月13日出願の米国仮特許出願第60/544,227号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、非哺乳動物の細胞毒性ＲＮＡｓｅおよび免疫グロブリンおよび免疫グロブリ
ンフラグメントの融合タンパク質を含む免疫毒素を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ランピルナーゼ(ranpirnase)は、疾患の処置のための細胞毒性因子としての見込みを示
す非哺乳動物リボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅ）のあるクラスのメンバーである。これらの
ＲＮＡｓｅの細胞毒性は、細胞表面レセプターに対する当初の結合および細胞のサイトゾ
ルへの内部移行（リボソームＲＮＡの付随する分解および細胞タンパク質合成の阻害を伴
う）に関与する機構に起因している。Wu et al.,J.Biol.Chem.,268:10686-10693(1993)を
参照のこと。当該ＲＮＡｓｅ活性は、哺乳動物のＲＮＡｓｅインヒビターに対して耐性で
あり、これによって哺乳動物の酵素に比較して観察される細胞毒性の増強が説明され得る
。同上。ランピルナーゼは、このファミリーのＲＮＡｓｅの原型的なメンバーであり、ヒ
ョウガエルの卵母細胞および初期の胚から精製され得る。ランピルナーゼは、１２，００
０の分子量を有し、そしてウサギの網状赤血球溶解物において（ＩＣ50 １０-11Ｍ）、
そしてアフリカツメガエル(Xenopus)の卵母細胞に微量注入された場合（ＩＣ50 １０-10
Ｍ）、タンパク質合成の強力な阻害を生じる。ＲＮａｓｅ Ａスーパーファミリーの他の
メンバーとは異なり、これらの細胞毒性リボヌクレアーゼは、卵母細胞ｒＲＮＡを分解し
ない。Lin et al.,Biochem Biophys Res Commun.204:156-62(1994)。これらの分子は、酵
素のリン酸結合ポケットの一部を形成し、ＲＮＡｓｅおよび抗腫瘍活性に必須である必須
のＮ末端ピログルタミル残基を含む。
【０００４】
動物の毒性研究によって、ランピルナーゼが予測可能な用量依存性でかつ可逆性の毒性
を、ラット（用量範囲０．０１〜０．０２ｍｇ／ｋｇ）およびイヌ（０．００５〜０．１
５ｍｇ／ｋｇ）の両方で示すということが示される。侵襲性のM109 Madison肺癌腫を接種
されて、かつ毎日および毎週の両方のスケジュールでランピルナーゼの腹腔内投与の処置
をされたマウスは、有意に延長された生存を示した。ほとんどの著しい結果は、ランピル
ナーゼの毎週のスケジュールで処置されたマウスの群でみられ、ここでは、１８匹の動物
のうち６匹が、長期間生存して、明らかに癌が治癒した。Mikulski et al.,J Natl Cance
r Inst.82:151-3(1990)。
【０００５】
天然のランピルナーゼは、臨床試験において、種々の固体腫瘍に対して抗腫瘍活性を有
することが示されている。これに関しては、ランピルナーゼは、例えば、膵臓癌を有する
患者を処置する場合、単独で、そしてタモキシフェンのような他の抗腫瘍因子と組み合わ
せての両方で用いられている。抗腫瘍因子として用いられる場合、これらの細胞毒性ＲＮ
Ａｓｅは、特定の細胞タイプに対する標的を可能にするためのマーカーに複合体化され得
る。
【０００６】
第Ｉ相試験では、種々の再発性および耐性の腫瘍に罹患している患者を、ランピルナー
ゼ（用量範囲６０〜９６０μｇ／ｍ2）を用いて毎週静脈内処置した。観察される副作用
としては、一般に顔面紅潮、筋肉痛、一過性の眩暈および食欲減退が含まれた。タンパク
尿の増大、末梢浮腫、高窒素血症、クレアチニンクリアランスの低下、および疲労によっ
て呈示される、用量を制限する腎臓毒性を含む、観察される毒性は、用量依存性でかつ可
逆性であり、これは、動物での毒物学的研究と一致している。真の免疫学的感作の臨床的
な顕在化は、ランピルナーゼの反復された毎週の静脈内用量後でさえ証明されていない。
最大耐容量は、主に腎毒性に起因して、９６０μｇ／ｍ2であることが見出された。非小
細胞肺癌、食道癌および結腸直腸癌にはなんらかの他覚的な応答があった。Mikulski et
al.,Int J Oncol 3:57-64,(1993);Mikulski et al.,J Clin Oncol.20:274-81(2002)を参
照のこと。それにもかかわらず、ランピルナーゼは、試験された動物およびほとんどのヒ
ト患者では十分耐容されて、一貫してかつ可逆性の臨床毒性パターンを示し、そしてほと
んどの従来の化学療法剤に伴うほとんどの毒性、例えば、骨髄抑制および脱毛症は誘発し
なかった。
【０００７】
WO97/31116は、（ａ）Ｎ末端メチオニンに続いてグルタミン酸以外のアミノ酸、（ｂ）
システインを２６位、４０位、５８位、８４位、９５位、および１１０位に、リジンを４
１位に、そしてヒスチジンを１１９位に（ウシＲＮＡｓｅＡとの最大一致について整列さ
せた場合）を有する組み換えリボヌクレアーゼ、ならびに天然のランピルナーゼ由来のア
ミノ酸配列を開示している。しかし、ＲＮＡｓｅ改変体(variant)を含む組み換え細胞毒
性ＲＮＡｓｅは、多段階のプロセスによって細菌で調製されており、このプロセスには、
細菌によって挿入されたＮ末端ホルミルメチオニン残基を除去するため、そして必須のＮ
末端ピログルタミル残基を生成するためのさらなる工程を要する。それにもかかわらず、
細菌中での産生は、グリコシル化された細胞毒性ＲＮＡｓｅ含有融合タンパク質の調製を
妨げる。従って、真核生物細胞において組み換え細胞毒性ＲＮＡｓｅ融合タンパク質を産
生することが有利である。真核生物細胞では、細胞毒性ＲＮＡｓｅは、両生類の供給源か
ら精製されたランピルナーゼの細胞毒性特性を保持するが、ヒトにおける所望されない免
疫応答は少ないか、またはない。しかし、真核生物細胞における細胞毒性ＲＮＡｓｅの発
現は、ＲＮＡｓｅの細胞毒性活性に起因して細胞死を生じるということも予想される。
【０００８】
従って、グリコシル化ＲＮＡｓｅ融合タンパク質を含む、細胞性ＲＮＡｓｅ含有融合タ
ンパク質を調製する改良方法が極めて望ましいということが明らかである。グリコシル化
細胞毒性ＲＮＡｓｅ融合タンパク質自体が極めて所望される分子であるということも明ら
かである。
【発明の開示】
【０００９】
従って、本発明の目的は、（ａ）第一の免疫グロブリン可変ドメインに融合された非哺
乳動物の細胞毒性リボヌクレアーゼを含む融合ポリペプチドと、（ｂ）第二の免疫グロブ
リン可変ドメインを含む第二のポリペプチドとを含み、この免疫グロブリン可変ドメイン
の１つが軽鎖可変ドメインであり、かつもう一方の免疫グロブリン可変ドメインが重鎖可
変ドメインであり、この第一および第二の免疫グロブリン可変ドメインが一緒になって抗
原結合部位を形成し、そしてこの免疫毒素がグリコシル化されている、免疫毒素を提供す
ることである。
【００１０】
本発明の別の目的は、哺乳動物宿主細胞を培養することによってこれらおよび他の免疫
毒素を作製する方法を提供することであって、この宿主細胞は、（ａ）第一の免疫グロブ
リン可変ドメインに融合された非哺乳動物細胞毒性リボヌクレアーゼを含む融合ポリペプ
チドをコードする核酸配列と、（ｂ）第二の免疫グロブリン可変ドメインを含む第二のポ
リペプチドをコードする核酸配列とで形質転換され、この第一および第二の免疫グロブリ
ンの可変ドメインは一緒になって抗原結合部位を形成する。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、細胞毒性ＲＮＡｓｅ部分に融合された内部移行抗体(inter
nalizing antibody)または抗体フラグメントを含む免疫毒素であって、このＲＮＡｓｅ部
分がＮ末端ピログルタミン酸残基を保有し、かつこのＲＮＡｓｅ部分がそのＣ末端におい
て、この抗体または抗体フラグメントの軽鎖を含むポリペプチドのＮ末端、あるいはこの
抗体またはフラグメントの重鎖を含むポリペプチドのＮ末端、あるいはこの抗体またはフ
ラグメントの軽鎖および重鎖の両方のＮ末端に融合されている免疫毒素を提供することで
ある。
【００１２】
例えば、一実施形態では、非哺乳動物細胞毒性リボヌクレアーゼは、第一の免疫グロブ
リン可変ドメイン、例えば、軽鎖可変ドメインのＮ末端に融合されてもよい。この非哺乳
動物リボヌクレアーゼは、Ｎ末端ピログルタミン酸残基を有してもよい。
【００１３】
上記融合ポリペプチドおよび第二の免疫グロブリン可変ドメインは、別の分子であって
もよく、そして宿主細胞中で別の分子として産生されてもよい。
【００１４】
上記融合ポリペプチドはさらに、ＣＬドメインを含んでもよく、そして上記第二のポリ
ペプチドはさらにＣＨ１ドメインを含んでもよい。
【００１５】
上記第二のポリペプチドはさらに、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含んでもよ
い。
【００１６】
別の実施形態では、非哺乳動物リボヌクレアーゼは、重鎖可変ドメインのＮ末端に融合
されてもよい。この非哺乳動物リボヌクレアーゼは、Ｎ末端ピログルタミン酸残基を有し
てもよい。この融合ポリペプチドおよび第二の免疫グロブリン可変ドメインは、別の分子
であってもよく、そして宿主細胞中で別の分子として産生されてもよい。
【００１７】
この融合ポリペプチドはさらに、ＣＨ１ドメインを含んでもよく、そして第二のポリペ
プチドはさらにＣＬドメインを含んでもよい。
【００１８】
この融合ポリペプチドはさらに、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含んでもよい
。
【００１９】
さらに別の実施形態では、非哺乳動物リボヌクレアーゼは、第一および第二の免疫グロ
ブリン可変ドメインの両方のＮ末端に融合されてもよい。この非哺乳動物リボヌクレアー
ゼは、Ｎ末端ピログルタミン酸残基を有してもよい。この第一の免疫グロブリン可変ドメ
インは、重鎖可変ドメインであってもよく、そして第二の免疫グロブリン可変ドメインは
、軽鎖可変ドメインであってもよい。
【００２０】
この第一および第二の融合ポリペプチドは、別の分子であってもよく、そして宿主細胞
中で別の分子として産生されてもよい。
【００２１】
この第一の融合ポリペプチドはさらに、ＣＨ１ドメインを含んでもよく、そして第二の
融合ポリペプチドはさらにＣＬドメインを含んでもよい。
【００２２】
この第一の融合ポリペプチドはさらに、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含んで
もよい。
【００２３】
免疫毒素は、例えば、ＣＨ２ドメイン上で、および／またはＲＮＡｓｅ上でグリコシル
化されてもよい。
【００２４】
上記の非非哺乳動物リボヌクレアーゼは、例えば、ヒョウガエルから精製されたランピ
ルナーゼの配列および構造を有する酵素であってもよい。
【００２５】
上記抗原結合部位は、細胞表面分子に対して特異的に結合してもよく、そして上記免疫
毒素は、この細胞表面分子を保有する細胞結合した際に内部移行されてもよい。
【００２６】
上記免疫毒素は、ガン細胞、感染／炎症の部位、自己免疫疾患に対するか、または微生
物および寄生生物に対するものであり得る。
【００２７】
上記免疫毒素は、Ｂ細胞抗原、Ｔ細胞抗原、形質細胞抗原、ＨＬＡ−ＤＲ系統抗原、Ｃ
ＥＡ，ＮＣＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４およびＭＵＣ１６抗原、ＥＧＰ
−１抗原、ＧＥＰ−２抗原、胎盤アルカリホスファターゼ抗原、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、Ｐ
１ＧＦ、ＩＬＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テネイシン、ＣＤ３３、ＣＤ７４、Ｐ
ＳＭＡ、ＰＳＡ、ＰＡＰ、Ｌｅyを含む腫瘍関連抗原、自己免疫疾患、感染／炎症および
感染性疾患に関連する抗原からなる群より選択される抗原に対するものであってもよい。
【００２８】
上記抗原は、Ｂ細胞もしくはＴ細胞リンパ腫に関連する標的抗原、または自己免疫疾患
に関連するＢ細胞もしくはＴ細胞であってもよい。
【００２９】
上記抗原は、悪性疾患によって発現されるＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ７４、
ＣＥＡ、ＮＣＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＥＧＰ−１
、ＥＧＰ−２、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＩＬ−１５およびＨＬＡ−ＤＲからなる群
より選択される抗原であってもよい。
【００３０】
上記免疫毒素の免疫グロブリン可変ドメインは、悪性疾患を標的する場合、例えば、Ｒ
Ｓ１１、１７−１Ａ、ＲＳ７、ＬＬ１、ＬＬ２、ＭＮ−３、ＭＮ−１４、ＭＮ−１５もし
くはＰＡＭ４，またはそのヒト化バージョンに由来し得る。
【００３１】
免疫毒素によって結合される抗原は、特定の悪性疾患に関しては、例えば、ＥＧＰ−２
，ＥＧＰ−１、ＣＤ２２、ＣＤ７４、ＣＥＡ、炭酸脱水素酵素ＩＸ、またはＭＵＣ１であ
ってもよい。
【００３２】
標的化抗原は、細菌、ウイルス、真菌、マイコプラズマ、寄生生物、または他の微生物
によって発現されてもよい。
【００３３】
標的化合物抗原は、活性化顆粒球のような、感染の部位での宿主細胞蓄積によって発現
されてもよい（例えば、ＣＤ１５、ＣＤ３３、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、およびＣＤ６６
ｃ（ＮＣＡ）など）。適切なこのような顆粒球抗体は、ＭＮ−３であり、そのＦａｂ’は
LeukoScan（商標）で用いられる。
【００３４】
上記の方法および／または組成物のいずれかにおいて、可変ドメインはヒト化されてよ
いしまたはヒトドメインであってもよい。
【００３５】
本発明の別の実施形態では、薬学的に受容可能なキャリアとともに上記されたような免
疫毒素を含む薬学的組成物が提供される。
【００３６】
本発明のさらに別の実施形態では、被験体に対して上記のような組成物を、疾患または
症候群の症状を処置または改善するために有効な量で投与することによって、この被験体
におけるこの疾患または症候群を処置する方法が提供される。この疾患または症候群は、
この被験体における細胞、例えばＴ細胞、骨髄細胞または形質細胞の望ましくないまたは
不適切な増殖または活性化によって特徴付けられ得る。あるいは、この疾患は、感染性微
生物または寄生生物の存在によって特徴付けられ得る。
【００３７】
この疾患は、例えば、癌腫、肉腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、神経芽細胞
腫、および骨髄腫からなるガンの群より選択され得る。
【００３８】
この疾患または症候群は、固形腫瘍、例えば、神経芽細胞腫、悪性黒色腫、または癌腫
、例えば、乳房、藍藻、前立腺、肺、腎臓、胃、結腸直腸、肝臓、または膵臓の癌腫の存
在によって特徴付けられ得る。
【００３９】
これらの方法では、薬学的組成物は、被験体に対して、１日あたり２回以上、例えば、
０．１〜約１０００ｍｇの量で投与されてもよいが、それより多く用いられても少なく用
いられてもよい。
【００４０】
望ましくないまたは不適切な増殖または活性化を受けている細胞は、例えば、関節リウ
マチ、シェーグレン症候群、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫
斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎
炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫
斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、多発性硬化症、サル
コイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊
椎炎、グッドパスチャー症候群、血栓血管炎(thromboangitis ubiterans)、原発性胆汁性
肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎
、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ヴェーゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症
、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎および線維化
性肺胞炎のような１つ以上の自己免疫疾患の発症および進行に関与し得る。
【００４１】
本発明の組成物が、感染の治療的処置のために用いられる場合、免疫毒素の免疫グロブ
リン構成要素は、疾患原因の微生物、例えば、病原性細菌、ウイルス、真菌および多様な
寄生生物に特異的に結合し、そして抗体は、これらの微生物、それらの産物もしくは表面
抗原、またはそれらの病変に関連する抗原を標的し得る。微生物の例としては、限定はし
ないが、
ストレプトコッカス・アガラクティエ、在郷軍人病菌、化膿連鎖球菌、大腸菌、淋菌、
髄膜炎菌、肺炎球菌、Hemophilis influenzae B、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘ
ータ、緑膿菌、ハンセン菌、ウシ流産菌、ヒト結核菌、破傷風毒素、抗ウイルスモノクロ
ーナル抗体、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−３、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ
型肝炎、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純疱疹Ｉ
およびＩＩ、ヒト血清パルボ様ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス
、Ｂ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプ
スタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内
炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、疣ウイルス、ブルー
・タングウイルス、センダイウイルス、猫白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイル
ス、シミアン・ウイルス４０、マウス乳癌ウイルス、デング熱ウイルス、ポリオーマウイ
ルス、パピローマウイルス、ＳＡＲＳウイルス、種々のインフルエンザウイルス、風疹ウ
イルス、原生動物、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(
Plasmodium vivax)、トキソプラズマ原虫、Trypanosoma rangeli、クルーズ・トリパノソ
ーマ、Trypanosoma rhodesiensei、トリパノソーマ・ブルーセイ、マンソン住血吸虫，Sc
histosoma japanicum、Babesia bovis、Elmeria tenella、回旋糸状虫、熱帯リーシュマ
ニア、旋毛虫、Theileria parva、Taenia hydatigena、Taenia ovis、無鉤条虫、単包条
虫、Mesocestoides corti、マイコプラズマ、Mycoplasma arthritidis、M.hyorhinis、M.
orale、M.arginini、Acholeplasma laidlawii、M.salivarium、およびＭ肺炎が挙げられ
る。
【００４２】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、
この詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示のため
だけに示していることが理解されるべきである。なぜなら、本発明の趣旨および範囲内の
種々の変化および改変が、この詳細な説明から当業者には明白になるからである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ベクターｐｄＨＬ２−ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐの構成を示す。構築物である、リーダーペプチド−ＲＮＡｓｅ、−リンカー−ｈＬＬ１のＶｋ領域を含むＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＢＳベクターに挿入して、ｐｄＨＬ２ベクターに連結した。注記：本発明においては、ｒｐＲＮＡｓｅおよびｒａｐという用語は、交換可能である。
【図２】宿主細胞から分泌された融合タンパク質のＨＰＬＣプロフィールを示す。単一のピークが７．７分で観察された。
【図３】分泌された融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。２つの接近して移動する軽鎖バンドをみることができるが、これはｈＬＬ１単独の軽鎖よりも長い（２５ｋＤ）。
【図４ａ】天然の条件下で分泌された融合タンパク質の質量スペクトルを示す：１７７１５０の質量を有するｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐ融合タンパク質に相当する、１つの主要なピークが観察された。
【図４ｂ】変性条件下の質量スペクトルを示す。重鎖、およびｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐ融合タンパク質の糖分子の有無の２つの軽鎖に相当する３つの主要なピークが見出され得る。
【図５】融合タンパク質のウエスタンブロットを示す。両方の分子ともｒａｐを含むことを示している、糖有の軽鎖および糖無の軽鎖が示され得る。
【図６】Ｎ−グリコシダーゼ処理による軽鎖糖分子の除去を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す：レーン１は、未処理のサンプルに相当し、ここでは２つの軽鎖バンドを見ることができる。レーン２〜５は、Ｎグリコシダーゼ酵素で処理されたサンプルである。２つの軽鎖に相当するバンドは、糖の除去の際に１つのバンドに集束した。
【図７】インビトロ転写翻訳アッセイによるＲＮＡｓｅ活性を示す。
【図８】競合結合アッセイを示しており、これは、ｈＬＬ１およびｒａｐ−ｈＬＬ１融合タンパク質の両方が、ｈＬＬ１の抗イディオタイプ抗体であるＷＰについて同じ親和性を有することを示している。
【図９】Daudi細胞における融合タンパク質のインビトロ細胞毒性を示す：Ａ）ＭＴＳアッセイによって測定した細胞毒性；Ｂ）ＢＲｄＵアッセイ法によって測定した細胞毒性。
【図１０】ＭＴＳアッセイによるＭＣ／ＣＡＲ細胞における融合タンパク質のインビトロ細胞毒性を示す。
【図１１】ナイーブなＳＣＩＤマウスにおける２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐの血液クリアランスを示す。ナイーブなＳＣＩＤマウスに、88Ｙ−ＤＴＰＡ−ｈＬＬ１（Ｏ）および111Ｉｎ−ＤＴＰＡ−２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐ（□）を静脈内に同時注射した。投与後選択された時間で、心臓穿刺によってマウスを放血させて、血液サンプルを放射能についてカウントした。データは、血液中の注射用量の平均±Ｓ．Ｄ．である（ｎ＝３）。
【図１２】２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐまたは成分のタンパク質を用いた侵襲最小ダウディリンパ腫(aggressive minimal Daudi lymphoma)の処置を示す。ＳＣＩＤマウス（１群あたり８〜１０匹のマウス）に、１．５×１０7個のDaudi細胞を静脈内に接種した。１日後、マウスを、２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐの１μｇ（×）、５μｇ（黒四角）、１５μｇ（黒三角）、３０μｇ（下向き黒三角）、４０μｇ（◆）、または５０μｇ（●）の単回ボーラス注射で処置した。コントロール群には、５０μｇの免疫毒素（＊）に等価な構成要素のタンパク質またはＰＢＳ（□）のみを注射した。
【図１３】インビトロの転写／翻訳アッセイによって測定されたＲＮａｓｅ活性を示す。ｒＲａｐ（黒四角）、２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐ（黒上向き三角）およびｈＬＬ１−γ４Ｐ（◆）の濃度を、相対発光単位(relative luminescence units)（ＲＬＵ）に対してプロットした。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明者らは、驚くべき事に、細胞毒性ＲＮＡｓｅ分子を含む融合分子が哺乳動物細胞
において調製され得ることを見出した。この結果は、驚くべきである。なぜなら、酵素的
に活性な細胞毒性ＲＮＡｓｅ分子を含む分子は、細胞増殖を妨害して、これによって融合
タンパク質の組み換え産生を妨げる程度まで細胞毒性であることが予想されるからである
。
【００４５】
この結果によって、原核生物宿主細胞を用いて組み換え方法によって調製することが以
前には困難であるかまたは不能であった哺乳動物細胞において、細胞毒性ＲＮＡｓｅ融合
タンパク質を調製する可能性がもたらされる。例えば、哺乳動物宿主細胞における産生に
よって、原核生物宿主細胞を用いる場合、必須のＮ末端ピログルタミル残基を生成するこ
とに関連する困難性が回避される。さらに、哺乳動物宿主細胞の使用によって、マルチサ
ブユニットタンパク質、例えば、インタクトなＦｃ領域を含むＩｇＧ構造の容易な調製が
可能になり、そしてまたグリコシル化融合タンパク質、例えば、Ｆｃ領域上でグリコシル
化されるインタクトな抗体の調製が可能になる。細胞毒性ＲＮＡｓｅと免疫グロブリン、
例えば抗体または抗体フラグメントとの間の融合タンパク質は、本明細書において以降で
は免疫毒素と呼ばれる。この方法はまた、任意の適切な抗体フラグメント、例えば、Ｆ（
ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖを含む免疫毒素を調製
するために用いられ得る。
【００４６】
本発明はまた、ＲＮＡｓｅが、Ｉｇ可変ドメイン（例えばＶＨまたはＶＬドメイン）の
１つのＮ末端に融合される、細胞毒性ＲＮＡｓｅ含有免疫グロブリン融合タンパク質を提
供する。これは驚くべきことに、細胞毒性ＲＮＡｓｅ活性を保持するだけでなく、抗原結
合部位でＩｇ結合特異性を保持しており、Ｎ末端融合の調製によって立体的にブロックさ
れることが期待されている融合タンパク質を提供する。
【００４７】
さらに、本発明者らは、驚くべきことに、本発明の細胞毒性ＲＮＡｓｅ融合タンパク質
が細胞および微生物／寄生生物の殺傷に有効であることを見出している。詳細には、迅速
な内部移行抗体成分を含む免疫毒素は細胞特異的な様式で極めて細胞毒性であることが見
出されている。例えば、ヒト化ＬＬ１抗体のＮ末端に対する細胞毒性ＲＮＡｓｅの融合に
よって、ＣＤ７４（ＬＬ−１の標的）の不変鎖を発現する細胞に対して特異的に結合して
、結合の際その細胞集団に対して細胞毒性である免疫毒素が産生された。この結果は、驚
くべきことである。なぜなら、融合タンパク質は、融合タンパク質の細胞毒性を大きく低
下させるか、またはさらに排除する可能性が高いことが予期される、内部移行の際に細胞
のリソソームに送達されて、そこで分解されることが予想されるからである。
【００４８】
本発明はまた、疾患または症候群に罹患している被験体を、上記で記載されるタイプの
免疫毒素の有効量をこの被験体に投与することによって処置する方法を提供する。
【００４９】
（定義）
他に特定しない限り、用いられる全ての技術および科学的用語は、当業者によって通常
理解されるのと同じ意味を有する。さらに、本明細書に引用される全ての特許および他の
引用文献の内容は、その全体が引用することにより組み込まれる。本発明の目的のために
は、以下の用語は以下のとおり規定される：
【００５０】
アミノ酸は、名称によるか、またはその一般に公知の３文字記号か、もしくは１文字の
ＩＵＰＡＣ記号のいずれかによって言及される。ヌクレオチドは、その通常受容される一
文字コードによって呼ばれる。
【００５１】
特定の核酸配列の「保存的に改変されたバリエーション(conservatively modified var
iations)」とは、同一であるかまたは本質的に同一であるアミノ酸配列をコードする核酸
をいうか、またはこの核酸が、アミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列
をいう。遺伝子コードの縮重の理由で、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所定のポリ
ペプチドをコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てがア
ラニンというアミノ酸をコードする。従って、アラニンがコドンによって特定されるあら
ゆる位置では、このコドンは、コードされたポリペプチドを変化させることなく、記載さ
れる任意の対応するコドンに変化され得る。メチオニンをコードするＡＵＧ以外の核酸中
の各々のコドンが、機能的に同一の分子を生じるように改変され得る。本明細書に記載さ
れる核酸配列はまた、これらの変更を包含する。
【００５２】
アミノ酸配列の「保存的に改変されたバリエーション」とは、コードされた配列中の単
独のアミノ酸または小さい割合のアミノ酸を変更させる個々の置換であって、この変更に
よって、化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換が生じる置換を包含する。保存的置
換は当業者に周知である。以下の６つの群の各々は、お互いについて保存的置換であるア
ミノ酸を含む：
１．アラニン、セリン、トレオニン
２．アスパラギン酸、グルタミン酸
３．アスパラギン、グルタミン
４．アルギニン、リジン
５．イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、そして
６．フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン。
【００５３】
アミノ酸配列の「保存的に改変されたバリエーション」はまた、コードされた配列中の
単独のアミノ酸または小さい割合のアミノ酸の欠失または付加であって、この付加および
欠失が、化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換を生じる欠失または付加を包含する
。本明細書に記載されるアミノ酸配列はまた、これらのバリエーションを包含する。
【００５４】
「単離された(isolated)」または「生物学的に純粋な(biologically pure)」という用
語は、その天然に存在する環境において見出されるような通常伴う成分を実質的にまたは
本質的に含まない物質をいう。この単離された物質は状況に応じて、その天然の環境にお
いてこの物質とともに見出されない物質を含む。
【００５５】
「核酸(nucleic acid)」という用語は、デオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレオ
チドポリマーであって、一本鎖型または二本鎖型のいずれかをいい、他に限定しない限り
、天然に存在するヌクレオチドに対して同様の様式で核酸にハイブリダイズする天然のヌ
クレオチドの公知のアナログを包含する。他に示さない限り、特定の核酸配列とは、その
相補的な配列を含む。
【００５６】
「発現ベクター(expression vector)」とは、組み換え発現カセットを含み、この組み
換え発現カセットは、細胞によって転写および翻訳され得る、本発明によるポリペプチド
をコードする核酸を包含する。組み換え発現カセットとは、組み換え的にまたは合成的に
生成された核酸構築物であり、標的細胞において特定の核酸の転写を可能にする一連の特
定の核酸エレメントを伴う。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスまたは核酸フラグメ
ントの一部であってもよい。代表的には、この発現ベクターのこの組み換え発現カセット
部分は、転写されるべき核酸およびそれに作動可能に連結されるプロモーターを包含する
。
【００５７】
「組み換え体(recombinant)」という用語は、タンパク質に関して用いられる場合、あ
る細胞がその細胞には外因性である起源の核酸によってコードされるペプチドまたはタン
パク質を発現することを示す。組み換え細胞は、その細胞の天然の（非組み換え体）型内
では見出されない遺伝子を発現し得る。組み換え細胞はまた、細胞の天然の形態で見出さ
れる遺伝子を発現し得、この遺伝子は、人工的な方法によって、例えば、異種プロモータ
ーの制御下で細胞に再導入される。
【００５８】
「実質的な同一性(substantial identity)」または「実質的な類似性(substantial sim
ilarity)」という用語は、ポリペプチドの文脈では、あるポリペプチドが参照配列と少な
くとも８０％、さらに好ましくは９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一
性を有する配列を含むことを示す。実質的に同一である２つのポリペプチドとは、このポ
リペプチドの１つが第二のペプチドに対して惹起された抗体と免疫学的に反応性であるこ
とを意味する。２つの核酸が実質的に同一であるとは、この２つの分子がストリンジェン
トな条件下でお互いにハイブリダイズすることである。一般に、ストリンジェントな条件
とは、所定のイオン強度およびｐＨにおいて特定の配列についての融点（Ｔｍ）よりも約
５℃〜２０℃低いように選択される。このＴｍは、標的配列の５０％が完全にマッチした
プローブにハイブリダイズする温度（所定のイオン強度およびｐＨ下で）である。しかし
、ストリンジェントな条件下でお互いに対してハイブリダイズしない核酸は、それらがコ
ードするポリペプチドが実質的に同一であるならば、やはり実質的に同一である。
【００５９】
「抗体(antibody)」とは、当分野で周知の種々の免疫グロブリン種（ＩｇＧ1、ＩｇＧ4
、ＩｇＭなど）の抗体全体および抗体フラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ
）2、Ｆａｂ’Ｆａｂ、Ｆｖなどを含み、このフラグメントとしては、標的抗原に結合す
る能力を保持するハイブリッドフラグメントが挙げられる。また、免疫グロブリンの超可
変性の抗原結合領域を保持する任意の小フラグメントも有用である。抗体全体から、抗原
に特異的に結合する能力を保持している抗体フラグメントを作成する方法は、当分野で周
知であり、そして例えば、Harlow and Lane「Antibodies:A Laboratory Manual」CSHL Pr
ess(1988)に記載されている。組み換え抗体または抗体フラグメントを作成する方法は、
当分野で周知であり、例えば、McCafferty et al.,「Antibody Engineering:A Practical
Approach」IRL Press(1996)に記載されている。Ｆａｂフラグメントは、代表的には鎖間
ジスルフィド結合を含む（ＶＬ−ＣＬ）−（ＶＨ−ＣＨ１）二量体を含む。Ｆａｂ’フラ
グメントは、類似であるが、また重鎖ヒンジドメインの一部を含む。Ｆ（ａｂ’）2フラ
グメントとは、従来、２つのＦａｂ’フラグメントのジスルフィド結合二量体を指すこと
が理解される。本発明の抗体は、任意の種の抗体であってもよいが、この抗体はヒト抗体
またはヒト化抗体であることが有利である。抗体はまた、任意の周知の形態または組み換
え抗体、例えば、単鎖Ｆｖ（ＶＨ鎖に対する任意のリンカーによって結合されたＶＬ鎖を
含む）であってもよい。このリンカーが短いかまたは存在しない場合、この単鎖Ｆｖは二
量体または多量体に二量化し、この二量体とは二重特異性抗体として公知である。特定の
環境下では、本発明の抗体はまた、単結合ドメイン抗体、例えば、ラクダ科抗体（Dumoul
in et al.,「Single-domain antibody fragments with high conformational stability.
」Protein Sci. 11,500-515(2002);Hamers-Casterman et al.,「Naturally occurring an
tibodies devoid of light chains」Nature 363,446-448(1993);ならびにMuyldermans.「
Single domain camel antibodies:current status」J Biotechnol.74,277-302(2001)を参
照のこと）、または「ドメイン抗体(domain antibody)」を含み得る。WO92/01787および
そこに引用される参考文献を参照のこと。ヒト抗体とは、ヒト被験体において産生される
抗体由来であるか、またはヒトにおいて産生される抗体の特徴である配列を有するかのい
ずれかの配列を有する、抗体または抗体フラグメントである。このような抗体は、例えば
、米国特許第6,300,064号に記載される。ヒト抗体はまた、ヒト抗体ライブラリーから単
離され得る。例えば、米国特許第6,300,064号および同第6,172,197号、ならびにそこに記
載される参考文献を参照のこと。ヒト化抗体は、非ヒト抗体からヒトフレームワークへＣ
ＲＤ領域を挿入することによって、続いて必要に応じて抗原結合を回復または最適化させ
るための特定のフレームワーク残基の変異によって調製される抗体である。ヒト化抗体は
当分野で周知である、そして例えば、Jones et al.,Nature 321:522(1988);Riechmann et
al.,Nature 332:323(1988);およびWinter&Milstein,Nature,349:293(1991)に記載される
。
【００６０】
「標的化部分(targeting moiety)」とは、所定の細胞タイプの上のマーカーまたはレセ
プターに特異的である抗体、ペプチド、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、または増殖
因子である。標的化部分は、所定の細胞タイプに関連するマーカーと優先的に関連するこ
とによって、その細胞タイプに対して、結合された分子を特異的に送達するために用いら
れ得る。
【００６１】
「融合タンパク質(fusion protein)」とは、２つ以上のポリペプチド、さらに詳細には
、細胞毒性ＲＮＡｓｅおよび標的化部分を結合することによって形成されるキメラ分子で
ある。細胞毒性ＲＮＡｓｅおよび標的化部分は、標的化部分のアミノ末端とＲＮＡｓｅの
カルボキシル末端との間で形成されたペプチド結合を通じて結合され、そして融合タンパ
ク質をコードする核酸配列によって組み換え的に発現される。単鎖融合タンパク質は、単
一の連続するポリペプチド骨格を有する融合タンパク質である。
【００６２】
「化学的複合体(chemical conjugate)」とは、細胞毒性ＲＮＡｓｅおよび標的化部分の
化学的カップリングによって形成される複合体である。
【００６３】
「薬学的に受容可能なキャリア(pharmaceutically acceptable carrier)」とは、免疫
毒素を投与するためのビヒクルとして用いられ得る物質であって、この物質は、不活性で
あるかそうでなければ医学的に受容可能であり、そして融合タンパク質またはアームのリ
ガンドと適合性であるという理由でビヒクルとして用いられ得る物質である。
【００６４】
（細胞毒性ＲＮＡｓｅをコードする核酸の調製）
当業者は、本発明における使用に適切な細胞毒性ＲＮＡｓｅ部分が、天然のランピルナ
ーゼ構造を有するポリペプチドおよび全ての酵素的に活性なその改変体を含むことを認識
する。これらの分子は有利には、ＲＮＡｓｅ活性に必須であると考えられるＮ末端ピログ
ルタミン酸残基を有し、哺乳動物ＲＮＡｓｅインヒビターによって実質的に阻害されない
。天然の細胞毒性ＲＮＡｓｅをコードする核酸は、適切な配列のクローニングおよび制限
によって、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅を用いることによっ
て調製され得る。ヒョウガエルのランピルナーゼのアミノ酸配列は、Ardelt et al.,J.Bi
ol.Chem.,256:245(1991)から得ることが可能であり、そして天然のランピルナーゼをコー
ドするｃＤＮＡ配列、またはその保存的に改変された改変体は、Leung et al.,Mol.Immun
ol.,32:1413(1995)のｈＬＬ２ヒト化に用いられるen bloc V-geneアセンブリ法と同様の
方法によって遺伝子合成され得る。細胞毒性ＲＮＡｓｅ改変体を作成する方法は、当分野
で公知であり、そして慣用的な技術の範囲内である。
【００６５】
あるいは、細胞毒性ＲＮＡｓｅまたはその改変体をコードする核酸は、インビトロで合
成され得る。化学的合成によって一本鎖オリゴヌクレオチドが生成される。相補的な配列
とのハイブリダイゼーションによって、または短いプライマーおよび一本鎖をテンプレー
トとして用いるＤＮＡポリメラーゼでの重合によって、これは二本鎖ＤＮＡに変換され得
る。化学的合成は、約１００塩基の配列に最も適合するが、より短い配列を連結すること
によってそれより長い配列を得てもよい。下の実施例２は、細胞毒性ＲＮＡｓｅ遺伝子を
得るための１つの例示的な方法を提供する。
【００６６】
（免疫グロブリン遺伝子の調製）
抗体をコードする遺伝子を調製する方法は、当分野で周知である。例えば、変性プライ
マーセットを用いるＰＣＲを用いて、抗体産生細胞、例えばハイブリドーマから得られる
可変鎖配列ｃＤＮＡを増幅してもよい（または周知の方法を用いる直接ＲＴ−ＰＣＲが、
細胞から得られるｍＲＮＡに対して直接用いられ得る）。例えば、Marks et al.,J Mol B
iol.(1991)222:581-97、およびそこに引用される参考文献を参照のこと。非ヒト抗体は、
当分野で周知である方法によってヒト化されてもよい。Leung、前出およびそこに引用さ
れる方法を参照のこと。あるいは、ヒト（または他の種）の抗体可変領域ドメインをコー
ドする遺伝子は、MorphoSys(Martinsried,Germany)またはCambridge Antibody Technolog
y(Cambridge,UK)から市販されているタイプのファージ・ディスプレイ・ライブラリーか
ら得てもよい。下の実施例１および実施例３はまた、抗体可変ドメインをコードする核酸
配列を得るための例示的な方法を示す。
【００６７】
本質的に、所望の特異性を有する任意の抗体配列が、本発明による免疫毒素を調製する
ために用いられ得る。特に好ましいのは、治療上有用であることが示されている特異性を
有する抗体である。適切な例としては、限定はしないが、腫瘍に結合する抗体、例えば、
Ｂ細胞抗原、Ｔ細胞抗原、形質細胞抗原、ＨＬＡ−ＤＲ系統抗原、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、
ＭＵＣ３、およびＭＵＣ４およびＭＵＣ１６抗原、ＥＧＰ−１抗原、ＥＧＰ−２抗原、胎
盤アルカリホスファターゼ抗原、炭酸脱水素酵素ＩＸ、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、Ｐ１ＧＦ、
ＩＬＧＦ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テネイシン、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、
ＰＳＭＡ、ＰＳＡおよびＰＡＰ；ならびにＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２７、ＣＤ４０、Ｂ細胞お
よびＴ細胞抗原（例えば、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２５およびＣ
Ｄ２２抗原）を含む自己免疫疾患に関連する抗原が挙げられる。この抗原は、ＣＤ１９、
ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＭＵＣ１、ＨＬＡ−ＤＲおよびＩＬ−１５のようなＢ細
胞またはＴ細胞リンパ腫または白血病に関連する抗原であってもよい。この抗原がＣＤ７
４またはＣＤ７４−ＨＬＡ−ＤＲ複合体である場合、適切な抗体はＬＬ１またはそのヒト
化バージョンである。抗原がＣＤ２２である場合、適切な抗体はＬＬ２もしくはＲＢＦ４
であるか、またはそのヒト化バージョンである。抗原がＭＵＣ１である場合、適切な抗体
はＰＡＭ４、またはそのヒト化バージョンである。抗原がＣＤ１６である場合、適切な抗
体は、ＣＡ１２５またはＭｕ−９のいずれかである。抗原がＥＧＰ−１である場合、適切
な抗体はＲＳ７またはそのヒト化バージョンである。抗原がＥＧＰ−２である場合、適切
な抗体としてはＲＳ１１もしくは１７−１Ａまたはそのヒト化バージョンが挙げられる。
この抗体は急速に内部移行する抗体であることが有利である。
【００６８】
可変ドメイン遺伝子の挿入に適切な抗体定常ドメインを含むか、または含むように操作
され得るベクターは、当分野で公知であり、そしてこのようなベクターはまた、本発明の
免疫毒素の発現のために適切である。このようなベクターは、哺乳動物宿主細胞において
、コードされた遺伝子の転写を開始するのに必須である必須の制御配列を含む。このよう
なコントロール配列は、当分野で周知である。例えば、その全体において引用することに
より本明細書に組み込まれる、米国特許第5,650,150号および同第6,472,511号のｐｄＨＬ
２ベクターの説明を参照のこと。あるいは、定常ドメイン遺伝子（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ
３およびＣＬ）は、抗体産生細胞から得られてもよいし、当分野で周知の方法を用いて適
切な発現ベクターにクローニングされてもよい。
【００６９】
（免疫毒素遺伝子の調製）
本発明による免疫毒素コード遺伝子の調製は、例示の目的でのみ提供されて、限定され
るものではない、下の実施例１および４に詳細に例示される。要するに、ＰＣＲを用いて
例えば、抗体軽鎖可変ドメイン（または必要に応じて重鎖可変ドメイン）をコードする遺
伝子を得てもよく、当分野で公知のＰＣＲ法を用いて得てもよい。適切な制限部位が、Ｐ
ＣＲプライマーに導入されてもよく、それによってこの遺伝子とさらなる配列とのその後
の結合が容易になる。同様に、細胞毒性ＲＮＡｓｅコード遺伝子は、都合のよい制限部位
を提供するプライマーをここでも用いて、適切なテンプレートからＰＣＲによって得られ
てもよい。次いで、細胞毒性ＲＮＡｓｅ遺伝子および可変ドメイン遺伝子は、適切な制限
エンドヌクレアーゼで消化されて、可変鎖ＲＮＡｓｅ融合タンパク質をコードする遺伝子
を提供するために直接一緒に結合されてもよい。細胞毒性ＲＮＡｓｅ遺伝子は、有利には
、可変ドメイン遺伝子のＮ末端に結合され、さらに有利には軽鎖可変鎖遺伝子のＮ末端に
結合されるが、ＲＮＡｓｅ遺伝子は、あるいは、重鎖可変ドメインのＮ末端に、または重
鎖および軽鎖可変ドメインの両方のＮ末端に結合されてもよい。
【００７０】
あるいは、適切なリンカーは、合成オリゴヌクレオチド（例えば、細胞毒性ＲＮＡｓｅ
および免疫グロブリン遺伝子に含まれる制限部位と適合しており、そして細胞毒性ＲＮＡ
ｓｅと可変ドメイン遺伝子とリンカー配列との直接の結合をもたらす制限部位を含むよう
に調製され得る）を用いて、可変ドメイン遺伝子と細胞毒性ＲＮＡｓｅ遺伝子との間に導
入され得る。当業者は、種々のリンカーが本発明における使用に適切であることを認識す
る。しかし、リンカーは有利には、１０〜３０アミノ酸長であり、そして二次構造も三次
構造もほとんどまたは全く有さない、親水性アミノ酸を含むリンカーである。このような
リンカーは当分野で周知であり、そして例えば、単鎖Ｆｖ分子を構築するのに用いられる
。例えば、米国特許第4,946,778号を参照のこと。適切なリンカーとしては、配列ＧＧＧ
ＧＳなどの多量体が挙げられる。免疫毒素遺伝子を調製する他の方法は、その全体が引用
することにより本明細書に組み込まれる、米国特許出願第20030099629号に記載される。
【００７１】
インタクトな抗体構造を含む免疫毒素（すなわち、軽鎖ＶＬおよびＣＬドメイン、なら
びに重鎖ＶＨおよびＣＨ１−３ドメインを含む免疫毒素）が調製されるべき場合、上記の
可変ドメイン鎖は、これらのさらなる定常ドメインをコードする配列に結合されなければ
ならない。有利には、適切な定常ドメインを既に含むベクター、例えば、上記のｐｄＨＬ
２を用いる。適切な定常ドメインを調製して、それらを可変ドメインに結合させる別の方
法が当分野で周知である。Ｆａｂフラグメントについては、ＣＬおよびＣＨ１ドメインの
みが必要である。一旦、適切な形態に結合されれば、次にこれらの配列は、宿主細胞のト
ランスフェクションの前に適切な発現ベクターに挿入され得る。哺乳動物発現に適切であ
る発現ベクターは、当分野で周知であり、そしてまた例えば、Invitrogen,Carlsbad,CAか
らも市販されている。
【００７２】
（哺乳動物細胞における免疫毒素の発現）
一旦適切な発現ベクターが調製されれば、適切な宿主細胞にトランスフェクトされる。
組み換え抗体の発現に適切な宿主細胞は、当分野で周知であり、そしてこれには例えば、
ＣＨＯ細胞、および有利には、骨髄細胞株、例えば、ＮＳＯ細胞が挙げられる。ＣＨＯお
よびＮＳＯ細胞の両方がＡＴＣＣ(Manassas,VA)から入手可能である。ヒト抗体配列を含
む免疫毒素の産生のために特に適切な別の宿主細胞は、Karpas et al.,Proc.Natl.Acad.S
ci USA 98:1799(2001)に記載されるKarpas 707H系統である。トランスフェクションは、
周知の方法、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、およびＤＥＡＥデキ
ストラン媒介性トランスフェクションによって達成され得る。有利には、発現ベクターは
、選択マーカー、例えば、ＤＨＦＲを含み、そして宿主細胞はＤＨＦＲ-である。この細
胞は、選択因子（例えば、選択マーカーがＤＨＦＲである場合はメトトレキセート）の存
在下で培養される。陽性のクローンは、例えば、免疫毒素の細胞毒性ＲＮＡｓｅ部分に特
異的に結合する抗体を用いてＥＬＩＳＡ法によって確認され得る。陽性クローンは、後の
増殖のために凍結されてもよいし、または直接増殖されてもよい。陽性クローンの培養物
を、適切な培地、例えば完全ＨＳＦＭ培地中で増殖させる場合、免疫毒素を含む培養上清
を収集する。
【００７３】
（免疫毒素の精製）
免疫毒素は、当分野で周知である方法を用いて容易に精製され得る。例えば、アフィニ
ティー精製が用いられてもよい。完全な抗体構造を含む免疫毒素については、プロテイン
Ａアフィニティー精製を用いて、純粋な免疫毒素を単独の精製工程で得てもよい。さらな
る精製工程は、必要に応じて、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラ
フィーなどのような従来の方法を用いて行なわれ得る。免疫毒素は、従来の方法、例えば
、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析、および例えば抗細胞毒性ＲＮＡｓｅ抗
体を用いるウエスタンブロットによって特徴付けられ得る。ヒョウガエル由来のランピル
ナーゼは、潜在的なグリコシル化部位を含む（実施例１を参照のこと）。この部位のグリ
コシル化が所望されない事象では、免疫毒素は、オンコナーゼ(onconase)上に存在する炭
水化物部分を除去するためにグリコシダーゼ酵素で処理されてもよい。あるいは、ＲＮＡ
ｓｅをコードする遺伝子配列は、保存的アミノ酸置換を介してＡｓｎ残基を置換すること
によってグリコシル化部位を欠失するために、部位特異的変異誘発法によって変異されて
もよい。例えば、６９位置のＡｓｎは、グルタミンで（変異体Ｎ６９Ｑ）、または本明細
書に記載される任意の構築物中の他の適切なアミノ酸で置換されてもよい。このグリコシ
ル化変異体の適切な例としては、２Ｌ−Ｒａｐ（Ｎ６９Ｑ）−ｈＬＬ１−ｒ４Ｐ、２Ｌ−
Ｒａｐ（Ｎ６９Ｑ）−ｈＲＳ７および２Ｌ−Ｒａｐ（Ｎ６９Ｑ）−ｈＬＬ２が挙げられる
。
【００７４】
（細胞毒性ＲＮＡｓｅ免疫毒性を用いる治療方法）
本明細書に記載の免疫毒素は、広範な種々の細胞毒性の治療様式のための薬学的組成物
に処方され得る。これらの組成物は、任意の欲されない細胞タイプ、例えば、不適切な増
殖または活性化を受けている細胞を標的するために用いられてもよいし、または病原性微
生物を標的することによって感染性疾患を処置するために用いられてもよい。詳細には、
この組成物は、種々のガンおよび自己免疫疾患を処置するために有用である。処置され得
るガンとしては、例えば、リンパ腫、白血病、黒色腫、神経芽細胞腫、および骨髄腫、肉
腫、神経膠腫、または癌腫、例えば、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、結腸直
腸癌、前立腺癌、肺癌、腎臓癌または膵臓癌が挙げられる。処置され得る自己免疫疾患と
しては、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、急性特
発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、
重症筋無力症、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘ
ノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソ
ン病、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節
性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、血栓血管炎(thromboangitis
ubiterans)、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝
炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ヴェーゲナー肉芽腫症、膜性
腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行
性糸球体腎炎および線維化性肺胞炎が挙げられる。
【００７５】
本発明の組成物はまた、感染の治療的処置のためにも有用であり、ここでは免疫毒素の
免疫グロブリン成分は、疾患を生じる微生物に特異的に結合する。本発明の状況では、疾
患を生じる微生物としては、病原性細菌、ウイルス、真菌および多様な寄生生物が挙げら
れ、そしてこの抗体は、これらの微生物、それらの産物またはそれらの病変に関連する抗
原を標的し得る。微生物の例としては、限定はしないが以下が挙げられる：
ストレプトコッカス・アガラクティエ、在郷軍人病菌、化膿連鎖球菌、大腸菌、淋菌、
髄膜炎菌、肺炎球菌、Hemophilis influenzae B、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘ
ータ、緑膿菌、ハンセン菌、ウシ流産菌、ヒト結核菌、破傷風毒素、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ
−２、ＨＩＶ−３、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、狂犬病ウイルス、インフ
ルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純疱疹ＩおよびＩＩ、ヒト血清パルボ様ウ
イルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、水痘帯状疱
疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、
ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、流行
性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜
炎ウイルス、疣ウイルス、ブルー・タングウイルス、センダイウイルス、猫白血病ウイル
ス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアン・ウイルス４０、マウス乳癌ウイルス、デ
ング熱ウイルス、風疹ウイルス、原生動物、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、
トキソプラズマ原虫、Trypanosoma rangeli、クルーズ・トリパノソーマ、Trypanosoma r
hodesiensei、トリパノソーマ・ブルーセイ、マンソン住血吸虫，Schistosoma japanicum
、Babesia bovis、Elmeria tenella、回旋糸状虫、熱帯リーシュマニア、旋毛虫、Theile
ria parva、Taenia hydatigena、Taenia ovis、無鉤条虫、単包条虫、Mesocestoides cor
ti、抗マイコプラズマモノクローナル抗体、Mycoplasma arthritidis、M.hyorhinis、M.o
rale、M.arginini、Acholeplasma laidlawii、M.salivarium、およびＭ肺炎。これらの病
原性微生物に結合するモノクローナル抗体は当分野で周知である。
【００７６】
当業者は、これらの実施例が例示的であって、本発明を限定するものではないことを理
解する。
【００７７】
これらの方法では、薬学的組成物は、被験体に１日あたり２回以上、例えば、０．１〜
約１０００ｍｇの量で投与されてもよいが、それより多くてもまたは少なくても適切とみ
なして用いられ得る。
【００７８】
この組成物のタンパク質性の性質に起因して、それらの組成物は特に、非経口投与、例
えば静脈内投与または皮下投与（または皮内投与）に適切であるが、当業者は、他の送達
方法が用いられ得ることを理解する。この方法は、現在開発中であるか、または将来開発
されるタンパク質送達のための方法を包含し、そしてまた例えば、腹腔、頭蓋、胸膜など
のような局所投与を包含し得る。非経口投与のためには、組成物は、薬学的に受容可能な
キャリア、好ましくは、緩衝化生理食塩水のような水性キャリアに溶解されるかまたは懸
濁された免疫毒素の溶液を含んでもよい。これらの溶液は、無菌であって、補助物質、例
えば、ｐＨ調節剤および緩衝化剤、ならびに毒性および等張性の調節剤を含んでもよい。
【００７９】
免疫毒素の用量は、１日あたり１患者あたり約０．１〜１０ｍｇであるが、特にこの薬
物が局所的に投与され、血流中ではない場合には、１日あたり１患者あたり最大１００ｍ
ｇの用量が用いられてもよい。この用量は、より少量のＲＮＡｓｅ成分を含む、抗体融合
タンパク質に基づく。
【００８０】
治療適用では、この組成物は、疾患に罹患している被験体に対して、目的の細胞を殺傷
するのに十分な量として規定される、治療上細胞毒性の量で投与される。これを達成する
のに十分な量は、「薬学的に有効な量(therapeutically effective amount)」として規定
される。任意の所定の環境における正確な量は、疾患の重篤度および患者の健康の一般的
状態を含む種々の要因に依存する。この組成物の単回投与または複数回投与は、必要な用
量に依存して投与され得る。適切な投薬レジメンの決定は、当分野で周知の慣用的方法を
用いて行なわれる。
【００８１】
免疫毒素はまた、インビトロにおいて細胞の集団を処置するために用いられ得る。例え
ば、それらは、骨髄アブレーションを受けている患者への移植の前に骨髄中の欲されない
細胞タイプを選択的に殺傷するために用いられ得る。
【００８２】
このように一般的に記載された本発明は、例示のために記載されており、本発明の限定
は意図していない以下の実施例を参照してさらに容易に理解される。
【実施例１】
【００８３】
（２Ｌ−ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐの発現および特徴付け）
実施例１では、ｒａｐはランピルナーゼである。
【００８４】
（ｐｄＨＬ−ＩｇＧ４Ｐ改変体の構築）
ＩｇＧ４遺伝子を含むＢ１３−２４細胞は、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ番号 ＣＲＬ−１１３
９７）から購入して、ゲノムＤＮＡを単離した。要するに、細胞をＰＢＳで洗浄して、消
化緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２５ｍＭ
のＥＤＴＡ ｐＨ８．０、０．５％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ）に
再懸濁して、５０℃で１８時間インキュベートさせた。等容積のフェノール／クロロホル
ム／イソアミルアルコールを用いてこのサンプルを抽出して、７．５ＭのＮＨ4Ａｃ／１
００％ ＥｔＯＨで沈殿させた。ゲノムＤＮＡは、遠心分離によって回収して、ＴＥ緩衝
液に溶解した。テンプレートとしてゲノムＤＮＡを用い、ＩｇＧ４遺伝子を、以下のプラ
イマーを用いてＰＣＲによって増幅させた。
プライマー−ＳａｃＩＩ：5'CCGCGGTCAC ATGGCACCAC CTCTCTTGCA GCTTCCACCA AGGGCCC 3'
（４７マー）；
プライマー−ＥａｇＩ：5'CCGGCCGTCG CACTCAT TTA CCCAGAGACA GGG 3'（３３マー）
【００８５】
増幅されたＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ−ＴＡ配列決定ベクター(Invitrogen)中にクローニ
ングして、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ｐｄＨＬ−ｈＬＬ２中のＩｇＧ１の重鎖定
常領域を含むＳａｃＩＩ−ＥａｇＩフラグメントを、ＴＯＰＯ−ＴＡ−ＩｇＧ４プラスミ
ドのＳａｃＩＩ−ＥａｇＩで置換して、ｐｄＨＬ２−ｈＬＬ２−ＩｇＧ４（ｐｄＨＬ２−
ｈＬＬ２−γ４）ベクターを生成した。
【００８６】
（ＩｇＧ4−プロリン変異）
Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏの変異をＩｇＧ４のヒンジ領域に導入して、半分子の形成を回避し
た。変異したヒンジ領域の５６ｂｐフラグメント（ＰｓｔＩ−ＳｔｕＩ）を合成し（トッ
プ：5'GAG TCC AAA TAT GGT CCC CCA TGC CCA CCG TGC CCA GGT AAG CCA ACC CAG G3';ホ
゛トム:5'C CTG GGT TGG CTT ACC TGG GCA CGG TGG GCA TGG GGG ACC ATA TTT GGA CTC T
GC A 3'）、アニーリングして、ＩｇＧ4のＰｓｔＩ−ＳｔｕＩフラグメントで置換した。
この構築で、最終ベクターｐｄＨＬ２−ｈＬＬ２−γ４Ｐを得た。
【００８７】
（ｐｄＨＬ２−ｈＬＬ１−γ４Ｐの構築）
ｐｄＨＬ２−ｈＬＬ２−γ４ＰのＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｖｋおよ
びＶＨ領域を含むｐｄＨＬ２−ｈＬＬ１のＸｂａ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントで置換し
て、ｈＬＬ１−γ４Ｐ構築物を生成した。
【００８８】
（ｐｄＨＬ２−２Ｌ−ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐの構築）
可塑性リンカー（ＧＧＧＧＳ）3を用いて、ｈＬＬ１のＶｋのＮ末端に対してＲａｐの
Ｃ末端を結合させた。各々の軽鎖のＮ末端に１つのｒａｐ分子を結合させた。この分子に
ついてのＤＮＡの構築は、以下のプライマーを用いてＰＣＲによって行なった：
Ｐ１；リーダー５’（ＸｂａＩ）：5'CTC TAG ACA CAG GAC CTC ACC ATG GGA TGG 3'（
３０マー）
Ｐ２；リーダー３’：5'TGA AAC GTT AGC CAA TCC TGG GAG TGG ACA CCT GTG GA 3'（
３８マー）
Ｐ３；Ｏｎｃ ５’：5'TCC ACA GGT GTC CAC TCC CAG GAT TGG CTA ACG TTT CA 3'（
３８マー）
Ｐ４；Ｏｎｃ ３’（ＥｃｏＲＶ）：5'AGT CAG CTG GAT ATC GGA GCC ACC GCC TCC AG
A TC 3'（３５マー）
Ｐ５；ＬＬ１−Ｖｋ ５’（ＥｃｏＲＶ）：5'GAT CTG GAG GCG GTG GCT CCG ATA TCC
AGC TGA CT 3'（３５マー）
Ｐ６；ＬＬ１−Ｖｋ ３’（ＢａｍＨＩ）：5'GGG ATC CAA CTG AGG AAG CAA AGT TTA
A 3'（２８マー）
【００８９】
図１に図示されるように、ｐｄＨＬ２−ｈＬＬ１−γ４ＰのＸｂａ−ＢａｍＨＩフラグ
メントを、ｐＢＳ−２Ｌ−ｒａｐ−ｈＬＬ１のＸｂａ−ＢａｍＨＩ（Ｘｂａ−Ｌｅａｄｅ
ｒ−ｒａｐ−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｖｋ−ＢａｍＨＩ）フラグメントで置換して、最終のベクタ
ーｐｄＨＬ２−２Ｌ−ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐを完成させた。
【００９０】
（トランスフェクション）
ベクターＤＮＡ（３０μｇ）をＳａｌＩ酵素で直線化して、エレクトロポレーション（
４５０Ｖ）によってＮＳ０（４×１０6細胞／ｍＬ）またはＳｐ２／０−Ａｇ１４（５×
１０6個の細胞／ｍＬ）の骨髄腫細胞にトランスフェクトした。低ＩｇＧ ＦＢＳ（１０
％）、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、Ｌ
−グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、非必須アミノ酸（１００μ
Ｍ）およびメトトレキセート（０．１μＭ）を補充した完全なハイブリドーマ−ＳＦＭ培
地中で細胞を増殖させた。陽性のクローンをＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。要
するに、プレートを、ＰＢＳ培地中に含まれる５μｇ／ｍＬの５０μｌの抗ｒａｐ抗体を
用いてコーティングして、４℃で一晩インキュベートさせた。ＰＢＳでプレートを洗浄し
、２％ＢＳＡでブロックした後に細胞培養上清を添加した。ＨＲＰ複合体化ヤギ抗ヒトＩ
ｇＧ4抗体を検出のために用いて、ＯＰＤを発色のための基質として用いた。プレートを
４９０ｎｍで読み取った。陽性のクローンを増殖させて、さらなる使用のために凍結させ
た。クローンＣ６を、最適のプロデューサーとして特定して、さらなる開発のために用い
た。
【００９１】
（発現および精製）
各々に５００ｍｌの培地を有する２つのローラーボトル中で細胞を最終培養物まで増殖
させて（１０〜２０％の生存度）、その細胞を遠心分離によって取り出した。培養上清を
充填して、プロテインＡカラムに加え、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化した。ローディング後、このカラムを１００ｍＭのク
エン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄して、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ３．５）で溶出させ、融合タンパク質を得た。生成物を含有するピークを、３
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を用いてｐＨ７．０に調節して、１０ｍＭのＰＢＳ緩
衝液に対して透析した。濃縮後、この生成物を０．２２μｍのフィルターを通して濾過し
、２〜８℃で保管した。１Ｌの培養物から、精製後に１６ｍｇを回収した。
【００９２】
（２Ｌ−ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐの特徴付け）
ＨＰＬＣ：タンパク質の純度および濃度は、ＨＰＬＣでチエックした。先鋭な単独のピ
ークが、図２に示されるように７．７分で観察され、この保持時間によって、この分子が
ＩｇＧより大きいことが示された。
【００９３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：４〜２０％ Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅゲル（ＰＡＧＥｒ（商標）
Gold Precast Gels,Cambrex）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元条件下で行なった。図
３に示されるように、予想されるサイズ約５０ｋＤの重鎖に関連するバンド、ならびにｈ
ＬＬ１の軽鎖（約２５ｋＤ）よりも両方とも大きい、約３７ｋＤおよび３９ｋＤの分子量
の２つのバンドが観察された。２つの軽鎖の存在は、融合タンパク質上のｒａｐのグリコ
シル化に起因することが示された（以下参照）。
【００９４】
質量分析法：The Scripps Research Institute,CAにおいて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法に
よって質量分析を行った。２つのサンプル、その１つは天然の状態（１．６ｍｇ／ｍＬを
１０ｍＭのＰＢＳに含有）、そしてもう一方は、還元状態（１．６ｍｇ／ｍＬを１ｍＭの
ＨＥＰＥＳ／１０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．５緩衝液）を、分析のために送った。天然のサ
ンプル（図４ａ）は、質量１７７１５０の１つの主要なピークを示し、これは、ＩｇＧに
加えて２つのｒａｐのＭＷとよく一致している。この還元サンプルは、５０５６０（重鎖
に相当する）、３８５２６および３６７００（ｒａｐを含有する２つの軽鎖に相当する）
において３つの主なピークを示した（図４ｂ）。
【００９５】
ウエスタンブロッティング：精製されたタンパク質におけるｒａｐの存在を確認するた
めに、ウエスタンブロッティングを行った。還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル由来のサ
ンプルを、PVDF-Plus(Osmonics,Inc.,)メンブレン上に電気的に転写した。５％ ＢＳＡ
でのブロッキング後、マウスの抗ｒａｐ抗体を、１：１０，０００希釈または１００ｎｇ
／ｍｌで添加して、１時間インキュベートさせた。洗浄後、ＨＲＰ複合体化ヤギ抗マウス
Ｆｃ抗体を添加して１時間インキュベートさせた。６回の洗浄後、LumiGloTM(Kirkegaard
&Perry Laboratories)基質を添加して、コダックのフィルムを現像した。図５に示される
ように、融合された軽鎖に相当する両方のバンドをフィルム上で検出し、これによって両
方の軽鎖上のｒａｐの存在を確認した。
【００９６】
Ｎ−グリコシダーゼでの処理：ｒａｐは、潜在的なＮグリコシル化部位、Ａｓｎ−Ｘ−
Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｓｎ６９−Ｖａｌ７０−Ｔｈｒ７１を有するので、分子量で２ｋＤの
相違があるという２つの軽鎖の観察は、ｒａｐの一様でないグリコシル化の結果であり得
る。この可能性を検討するために、ｒａｐ−ｈＬＬ１抗体を、供給業者の推奨に従って変
性条件下でＮグリコシダーゼ(New England Biolabs)とともにインキュベートさせた。図
６に示されるとおり、Ｎ−グリコシダーゼ処理後、２つの軽鎖に相当する２つのバンドが
１つ（より早く移動するバンド）に集束し、これによってカルボヒドラーゼの一様でない
分解が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの２つのバンドという観察の原因であったことが確認された
。除去されたグリコシル化部位を有するＲａｐの改変体であるＲａｐ（Ｎ６９Ｑ）が組み
換え構築物中でＲａｐについて置換される場合、唯一のｒａｐ融合軽鎖の観察によってさ
らなる支持が得られた（データ示さず）。
【００９７】
ｒａｐの活性：ＲＮＡｓｅ活性は、供給業者の推奨に従ってBright-GloTM Luciferase
Reporter Assayシステム(Promega)を用いてＴＮＴ（商標）Quick Coupled Transcription
/Translation System(Promega)によって試験した。このアッセイの原理は、ルシフェラー
ゼレポーター系を用いるＲＮａｓｅ活性の結果としてのタンパク質合成の阻害（ｍＲＮＡ
分解）の測定であって。サンプルは、種々の希釈中で遊離のｒａｐ（０．００１〜２．５
ｎＭ）、ｈＬＬ１−ｒａｐ（０．０１−２０ｎＭ）またはＰＫＩ−ＬＬ２−Ｏｎｃおよび
ＰＫＩＩ−ＬＬ２−Ｏｎｃ（０．０１〜２０ｎＭ）として表されるｈＬＬ２−ｒａｐの化
学的複合体を調製した。各々のサンプル（５μＬ）を、２０μｌのＴＮＴマスター混合物
と混合して、９６ウェルプレート中で３０℃で２時間インキュベートして、それから１μ
ｌを、５０μｌのBright-GloTM基質での分析のために取り出した。その結果を、Excelま
たはPrism Padソフトウェアを用いて、図７に示した。ＥＣ50値は、ｒａｐ−ｈＬＬ１お
よびｈＬＬ２−Ｏｎｃの化学的複合体については約３００ｐＭ、そして遊離のｒａｐにつ
いては３０ｐＭであった。
【００９８】
ＷＰについての競合結合：ＷＰはｈＬＬ１の抗イディオタイプ抗体である。ＷＰに対す
るｈＬＬ１抗体と比較したｒａｐ−ｈＬＬ１抗体の親和性は、競合結合アッセイによって
評価した。要するに、９６ウェルプレートを５０μｌのＷＰを５μｇ／ｍＬで用いてコー
ティングして、４℃で一晩インキュベートさせた。タンパク質サンプルの３つのタイプで
あるｈＬＬ１、ｒａｐ−ｈＬＬ、またはｈＡ２０は、種々の２倍希釈（最終濃度は０．４
９〜１０００ｎＭに及ぶ）中で調製して、等容積の２×ＨＲＰ複合体化ｍＬＬ１抗体（最
終希釈は１／２０，０００）と混合した。上記のようなＨＲＰ複合体化ｍＬＬ１と混合し
た５０μＬのタンパク質サンプルを、各々のウェルに添加して、１時間インキュベートさ
せた。洗浄後、Ｈ2Ｏ2を含有するＯＰＤ基質を添加してプレートを４９０ｎｍで読んだ。
図８に示されるように、吸光度に対するタンパク質濃度を、ExcelまたはPrism Pad graph
ソフトウェアを用いてプロットした。ｈＡ２０（ヒト化抗−ＣＤ２０抗体）を、陰性のコ
ントロールとして用いた。図８から、ｒａｐ−ｈＬＬ１は、ｈＬＬ１と同様の結合親和性
を有し、そして陰性コントロールｈＡ２０は、親和性を全く有さないことが明らかである
。抗原の供給源としてRaji細胞を用いて同様の結果を得た。
【００９９】
インビトロ細胞毒性：インビトロ細胞毒性は、Ｂ細胞リンパ腫細胞株(Daudi)および複
数の黒色腫細胞株（ＭＣ／ＣＡＲ）で測定した。細胞（０．１ｍｌ中に１０，０００個）
を、９６ウェルプレートの各々のウェルに入れた。２４時間後、遊離のｈＬＬ１、遊離の
ｒａｐまたはｒａｐ−ｈＬＬ１（１０μｌ）を適切なウェルに添加して、その細胞をイン
キュベーター中で３７℃で３日間インキュベートした。細胞増殖は、ＭＴＳテトラゾリウ
ム色素還元アッセイまたはＢｒＤＵ比色定量アッセイを用いて決定した。結果は、Prism
Padソフトウェアを用いてグラフとして得られたＥＣ50で表す。図（図９〜１０）から、
ｒａｐ−ｈＬＬ１が、Ｂ−細胞リンパ腫細胞株(Daudi)および多発性骨髄腫細胞株（ＭＣ
／ＣＡＲ）の両方に対して感受性であることが証明される。ｒａｐ−ｈＬＬ１は、ＥＣ50
値によって反映されるように、ＭＣ／ＣＡＲ細胞に比較してDaudi細胞に対して有意によ
り強力（細胞毒性）であった（図９および図１０）。ＭＣ／ＣＡＲ細胞については、ＥＣ
50値は、試験した濃度では達成されなかった。最高濃度（５６ｎＭ）では、細胞の生存度
は５７％であった。将来の実験は、Daudi細胞上のｒａｐ−ｈＬＬ１について正確なＥＣ5
0値を測定することが目的である。ｈＬＬ１または遊離のｒａｐは、それ自体では、いず
れの細胞株でも細胞毒性を実証しなかった。
【０１００】
薬物動態および体内分布：ｈＬＬ１または２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐを、Sharke
y et al.,(Int J Cancer.1990;46:79-85)に記載のように、２−（４−イソチオシアナー
トベンジル）ＤＴＰＡ(Macrocyclics,Dallas,TX)を用いてジエチレントリアミノペンタ酢
酸（ＤＴＰＡ）と複合体化させて、ＤＴＰＡ−ｈＬＬ１またはＤＴＰＡ−２Ｌ−Ｒａｐ−
ｈＬＬ１−γ４Ｐを得た。これはそれぞれ、薬物動態学的研究および生体分布の研究のた
めに、88Ｙ塩化物(Los Alamos National Laboratory(Los Alamos,NM)または111Ｉｎ塩化
物(Perkin Elmer Life Sciences,Boston,MA)で標識された。ナイーブな雌性ＳＣＩＤマウ
ス（８週齢、１８〜２２ｇ）に対して各々の動物に、ｈＬＬ１および２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬ
Ｌ１−γ４Ｐの各々１０μｇの総用量を投与するように、未標識の、ｈＬＬ１または２Ｌ
−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４ＰのＤＴＰＡ複合体を補充した０．００１ｍＣｉ88Ｙ−ＤＴＰ
Ａ−ｈＬＬ１および０．０２ｍＣｉの111Ｉｎ−ＤＴＰＡ−２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ
４Ｐの混合物を静脈内注射した。投与後選択された時点（１、２、４、１６、４８、７２
、１６８時間）後に、５匹のマウスの群を麻酔して、血液サンプルを心臓穿刺によって採
取した。主な組織を取り出して、秤量して、容器中に入れた。血液サンプルおよび組織を
、目盛り付きのガンマカウンターであるMinaxiλ Auto-Gamma（商標）５０００シリーズ
のガンマカウンター(Packard Instrument Company;Downers Grove,IL)で、111Ｉｎ（チャ
ネル１２０〜４８０）および88Ｙ（チャネル６００〜２０００）についてカウントした。
111Ｉｎカウンティングウインドウへの88Ｙエネルギーの後方散乱について補正するため
に交差曲線を作成した。
【０１０１】
インビトロの毒性：ナイーブなＳＣＩＤまたはＢＡＬＢ／ｃマウスに、マウス１匹あた
り２５〜４００μｇに及ぶ種々の用量の２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐを静脈内注射し
て、毒性および体重の損失の可視的な徴候について毎日モニターした。最大耐容用量（Ｍ
ＴＤ）は、死亡が生じず、かつ体重減少が処置前の動物の重量（約２０ｇ）の２０％以下
である最高用量として規定した。毒性効果を経験した動物は屠殺して、回収して、組織病
理学的分析に供した。ナイーブなＳＣＩＤマウスでは、２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐ
の１００、１５０、２００、２５０、３００または４００μｇの単回静脈内用量によって
、動物の重篤な体重減少および死亡が生じたが、全てのマウスは、２５または５０μｇの
用量で生残した（表２）。ＢＡＬＢ／ｃマウスでは、全てのマウスが２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬ
Ｌ１−γ４Ｐの３０または５０μｇの単回静脈内用量で生残したが、１００または２００
μｇでは生残しなかった。別の実験では、２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐの７５μｇの
用量は、ＳＣＩＤマウスに対して毒性であることが見いだされた（データ示さず）。従っ
て、単回ボーラス注射として与えられた２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４ＰのＭＴＤは、Ｓ
ＣＩＤマウスでは５０〜７５μｇであって、ＢＡＬＢ／ｃマウスでは５０〜１００μｇで
ある。死亡マウスおよび屠殺されたマウスの全体の病理学的な検査では、重篤な肝臓およ
び脾臓の毒性が示された。肝臓は、色が青ざめており、脾臓は縮んで、通常のサイズより
小さかった。組織病理学的検査によって、肝臓および脾臓の壊死が明らかになった。代表
的なマウスの血清サンプルでは、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アアス
パルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）および総ビリルビンのレベル上昇があり
、このことはこれらの高用量での有意な肝臓毒性を示唆していた。
【０１０２】
データ分析：インビトロの細胞毒性研究のために、三連の測定値の平均から用量応答曲
線を作成して、GraphPad Prismソフトウェア(Advanced Graphics Software,Encinitas,CA
)を用いて５０％阻害濃度（ＩＣ50）値を得た。薬物動態学的データは、ノンコンパート
メント分析プログラムWinNonlin，バージョン４．１(Pharsight,Mountain View,CA)の標
準的アルゴリズムを用いて分析した。このプログラムは、線形補間による線形台形公式を
用いて曲線下免疫（ＡＵＣ）を算出する。排出速度定数（ｋβ）は、一次速度式を仮定し
て終末半減期（ｔ1/2β）から算出した。生残研究は、GraphPad Prismソフトウェアを用
いるKaplan-Meierプロット（ログランク分析）を用いて分析した。相違はＰ＜０．０５で
有意とみなした。
【０１０３】
薬物動態および生体分布のデータ：放射性標識したｈＬＬ１および２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬ
Ｌ１−γ４Ｐの薬物動態および生体分布を、ナイーブなＳＣＩＤマウスで測定した。ｈＬ
Ｌ１および２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐを、ＤＴＰＡと結合体化して、それぞれ標識
した88Ｙおよび111Ｉｎで追跡した。図１１に示されるように、111ＩＩｎ−標識した２Ｌ
−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐは、初期の急速な再分布相（α）および後期の緩徐な排出相
（β）によって特徴付けられる、88Ｙ−標識されたｈＬＬ１と同様の血液からの二相性の
クリアランスを示す。わずかに短いα半減期が、ｈＬＬ１（４時間）に比較して、２Ｌ−
Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐ（５．１時間）について観察された。５時間を超えるデータポ
イントを用いて、ｔ1/2β、ｋβ、ＡＵＣ、平均滞留時間(mean residence time)（ＭＲＴ
）、見かけの分布容積（Ｖｄ）、およびクリアランスの速度（Ｃｌ）を算出して、これら
のパラメーターの値を表１に示す。111Ｉｎ−標識された２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４
Ｐの組織取り込みは、88Ｙ−標識ｈＬＬ１の取り込みと同様であった（データ示さず）。
【表１】
【０１０４】
インビトロの毒性：ナイーブなＳＣＩＤマウスでは、１００、１５０、２００、２５０
、３００または４００μｇの単回静脈内用量の２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐは、動物
の重篤な体重減少および死亡を生じたが、全てのマウスは、２５または５０μｇの用量で
生残した（表２）。ＢＡＬＢ／ｃマウスでは、全てのマウスが２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−
γ４Ｐの３０または５０μｇの単回静脈内用量では生残したが、１００または２００μｇ
では生残しなかった（表２）。別の実験では、２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐの７５μ
ｇの用量は、ＳＣＩＤマウスに対して毒性であることが見いだされた（データ示さず）。
従って、単回ボーラス注射として与えられた２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４ＰのＭＴＤは
、ＳＣＩＤマウスでは５０〜７５μｇであって、ＢＡＬＢ／ｃマウスでは５０〜１００μ
ｇである。死亡マウスおよび屠殺されたマウスの全体的な病理学的な検査では、重篤な肝
臓および脾臓の毒性が示された。肝臓は、色が青ざめており、脾臓は縮んで、通常のサイ
ズより小さかった。組織病理学的検査によって、肝臓および脾臓の壊死が明らかになった
。代表的なマウスの血清サンプルでは、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、
アアスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）および総ビリルビンのレベル上昇
があり、このことはこれらの高用量での有意な肝臓毒性を示唆していた。
【表２】
【０１０５】
（腫瘍保有マウスでの治療有効性）
腫瘍保有マウスでの治療有効性：１群あたり８〜９匹の雌性ＳＣＩＤマウス（８週齢、
１８〜２２ｇ）に、１．５×１０7個のDaudi細胞を静脈内注射して、１日後に処置した。
後肢の麻痺についてマウスを毎日検査して、毎週秤量した。動物が後肢の麻痺を発症する
かまたはその処置前の体重の２０％が低下した場合、それらの動物を安楽死させた。各々
のセットの治療実験は１８０日後に終えた。
【０１０６】
図１２に示されるように、未処置のマウス（ＰＢＳのみ）は、３０日内に全て死亡し、
平均生残時間(median survival time)（ＭＳＴ）は２８日であった。５０μｇの２Ｌ−Ｒ
ａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐ中の成分タンパク質の組成に相当する、ｈＬＬ１−γ４Ｐ（４３
．２μｇ）およびＲａｐ（６．６μｇ）の混合物を投与されたコントロール群のＭＳＴは
、７０日であった（Ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ群）。対照的に、５μｇまたは１５μｇの
いずれかの２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１−γ４Ｐの単回注射を受けた全てのマウスでは、１０
０日より長く生きており（ＭＳＴ＞１８０日；Ｐ＝０．０００５対成分処置群）、そして
この研究の終わり近くで各々の群から欠けたのは１匹のマウスだけであった。１８０日後
に研究が終わったとき、５、１５、３０、４０または５０μｇの２Ｌ−Ｒａｐ−ｈＬＬ１
−γ４Ｐの単回注射を投与されたマウスの９０％が治癒した。１μｇの単回注射を受けた
マウスのＭＳＴは、２３０％の増大に相当する、未処置の群の２８日に比較して９２日で
あった（Ｐ＜０．０００１）ことに注目すべきである。
【実施例２】
【０１０７】
（細胞毒性ＲＮＡｓｅをコードするＰＣＲ増幅したＤＮＡの合成）
組み換え細胞毒性ＲＮＡｓｅのＮ末端配列（４６アミノ酸）をコードするセンス鎖配列
［5'-TGG CTA ACG TTT CAG AAG AAA CAT ATC ACG AAT ACA CGA GAT GTA GAC TGG GAC AAT
ATA ATG TCT ACG AAT CTG TTT CAC TGT AAG GAT AAG AAT ACC TTT ATA TAC AGT CGC CCA
GAG CCT GTA AAG GCT ATC TGT A-3'］を有する１３９マーのＤＮＡヌクレオチド、ＯＮ
ＣＯ−Ｎを、自動ＤＮＡシンセサイザー(Applied Biosystem 392 DNA/RNA Synthesizer)
によって合成して、隣接するプライマーＯＮＮＢＡＣＫ［5'-AAG CTT CAT ATG CAG GAT T
GG CTA ACG TTT CAG AAG AAA-3'、およびＯＮＮＦＯＲ［5'-CTT ACT CGC GAT AAT GCC TT
T ACA GAT AGC CTT TAC AGG CTC TG-3'］を用いるＰＣＲ増幅のためのテンプレートとし
て用いた。得られた二本鎖ＰＣＲ産物は、細胞毒性ＲＮＡｓｅのＮ末端の半分の５４アミ
ノ酸残基をコードするｃＤＮＡ配列を含む。ＯＮＮＢＡＣＫは、ステージングベクターに
、または細菌発現ベクターへのインフレーム結合のために（ＮｄｅＩ部位）サブクローニ
ングを容易にするために、制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＡＧＣＴＴ）およびＮｄｅＩ（
ＣＡＴＡＴＧ）を含む。ＮｒｕＩ部位（ＴＣＧＣＧＡ）を、ＯＮＮＦＯＲプライマーに組
み込んで、細胞毒性ＲＮＡｓｅのＣ末端半分をコードするｃＤＮＡとのインフレーム結合
を容易にする。
【０１０８】
同様に、細胞毒性ＤＮＡｓｅのＣ末端配列（４６アミノ酸）をコードするセンス鎖配列
［TGC TGA CTA CTT CCG AGT TCT ATC TGT CCG ATT GCA ATG TGA CTT CAC GGC CCT GCA AA
T ATA AGC TGA AGA AAA GCA CTA ACA AAT TTT GCG TAA CTT GCG AGA ACC AGG CTC CTG TA
C ATT TCG TTG GAG TCG GG-3'］を有する１３７マーのＤＮＡヌクレオチド、ＯＮＣＯ−
Ｃを合成して、プライマーＯＮＣＢＡＣＫ［5'-ATT ATC GCG AGT AAG AAC GTG CTG ACT A
CT TCC GAG TTC TAT-、およびONCFOR[5'-TTA GGA TCC TTA GCA GCT CCC GAC TCC AAC GAA
ATG TAC-3'］によってＰＣＲ増幅させる。最終の二本鎖ＰＣＲ産物は、細胞毒性ＲＮＡ
ｓｅのＣ末端の半分の残りの５１アミノ酸をコードするｃＤＮＡ配列を含んだ。ＮｒｕＩ
部位によって、ＯＮＣＢＡＣＫに組み込まれたＰＣＲ増幅されたＤＮＡのＮ末端の半分と
のインフレームの結合が可能になった。ステージングベクターへ、または細菌発現ベクタ
ーへのサブクローニングのために、終止コドン（太字で示される）およびＢａｍＨＩ制限
部位（下線）をＯＮＣＦＯＲ配列に入れた。
【０１０９】
適切な制限酵素での処理後に細胞毒性ＲＮＡｓｅのＮ末端およびＣ末端の半分をコード
する、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡをＮｒｕＩ部位に結合して、ステージングベクター、例え
ばStratageneのpBluescript中にサブクローニングした。この結合された配列は、Ｎ末端
のＭｅｔを有する１０５アミノ酸のポリペプチドをコードしなければならない。
【実施例３】
【０１１０】
（ＬＬ２およびＭＮ−１４のＶ−領域配列のクローニング、ならびにＬＬ２およびＭＮ−
１４のヒト化）
ｈＬＬ２およびｈＭＮ−１４のＶ領域配列は公開されている。Leung et al.,Mol.Immun
ol.,32:1413(1995)；米国特許第5,874,540号。ＬＬ２およびＭＮ−１４のＶＫおよびＶＨ
の配列は、公開された方法およびプライマーを用いてＰＣＲ増幅させた。
【０１１１】
ＰＣＲ増幅されたＤＮＡの配列分析によって、それらが抗体のＶＫおよびＶＨドメイン
の代表的なタンパク質をコードすることが示された。ＰＣＲ−増幅されたＬＬ２およびＭ
Ｎ−１４の配列に基づいて構築されたキメラ抗体は、その親抗体に匹敵する免疫反応性を
示しており、これによって得られた配列の信頼性が確認された。
【０１１２】
ＬＬ２抗体の配列分析によって、フレームワーク−１領域におけるＶＫ付加されたＮ結
合グリコシル化部位の存在が明らかになった。突然変異研究によって、ＶＫ付加部位での
グリコシル化は、抗体の免疫反応性を維持するには必要ないことが示された。ＦＲ−１グ
リコシル化部位の包含なしに、ＲＥＩフレームワーク配列を、軽鎖ＣＤＲを接合するため
、そしてＥＵ／ＮＥＷＭをＬＬ２の重鎖ＣＤＲを接合するための足場として用いた。ヒト
化ＬＬ２（ｈＬＬ２）の免疫反応性は、マウスおよびキメラのＬＬ２の免疫反応性に匹敵
することが示された。ＬＬ２の内部移行の速度は、抗体のキメラ化またはヒト化によって
は影響されなかった。
【実施例４】
【０１１３】
（ヒト化ＬＬ２および細胞毒性ＲＮＡｓｅの融合タンパク質をコードする遺伝子の構築）
ｈＬＬ２のＶＨおよびＶＫの配列をテンプレートとして用いて、標準的なＰＣＲ手順に
よってｈＬＬ２−ｓｃＦｖ遺伝子をアセンブルした。遺伝子の構成は、Ｍｅｔ（−１）−
ＶＬ−（ＧＧＧＳ）4−ＶＨ−（Ｈｉｓ）6であった。ＶＨドメインに対して１６アミノ酸
のリンカー（ＧＧＧＳ）6を介して結合されたＶＬ遺伝子のＮ末端に、Ｍｅｔ（ＡＴＧ）
開始コドンを−１位置で組み込んだ。６つのヒスチジル残基からなるテールを、ＶＨ鎖の
カルボキシル末端に入れて、金属キレートクロマトグラフィーを介した融合タンパク質の
精製を容易にする。
【０１１４】
ランピルナーゼ−ｈＬＬ２ｓｃＦｖの免疫毒素融合タンパク質遺伝子を、制限消化およ
び結合方法によって同様の方式で構築した。ｃＤＮＡ配列は発現された場合、以下の構築
物：
ランピルナーゼ−［リンカー］−ＶＬ−（ＧＧＧＳ）4−ＶＨ−（Ｈｉｓ）6の融合タン
パク質をコードした。
【０１１５】
細胞毒性ＲＮＡｓｅのＣ末端とＶＬドメインのＮ末端との間に挿入され得る種々のリン
カーが存在する。好ましいリンカーは、シュードモナスの外毒素（ＰＥ）のＣ末端位置２
７３〜２８１由来のアミノ酸配列ＴＲＨＲＱＰＲＧＷである。この配列は、配列のＧ残基
とＷ残基との間に存在する切断でのサブチリシンによる、活性フラグメントへのＰＥの細
胞内切断の認識部位であることが示されている。Chiron et al.,J.Biol Chem.,269:18167
(1994)。この配列の組み込みによって、融合免疫毒素の内部移行後の活性細胞毒性ＲＮＡ
ｓｅの放出が容易になる。あるいは、細胞毒性ＲＮＡｓｅとｓｃＦｖとの間の可塑性の結
合を可能にするために、ＥＤＮ−ｓｃＦｖの構築に用いられるStaphylococcalのプロテイ
ンＡのフラグメントＢのアミノ酸残基４８〜６０からなる１３アミノ酸残基のスペーサー
を代わりに用いてもよい。Tai et al.,Biochemistry,29:8024(1990)、およびRybak et al
.,Tumor Targeting,1:141(1995)。
【実施例５】
【０１１６】
（ヒト化ＭＮ−１４およびランピルナーゼの融合タンパク質をコードする遺伝子の構築）
ＭＮ−１４ｓｃＦｖは、ヒト化ＭＮ−１４トランスフェクトーマ(transfectoma)由来の
ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって生成した。ＭＮ−１４ ｓｃＦｖのために用いられるリン
カーは、１５アミノ酸リンカー（ＧＧＳＧＳ）3であり、そして方向はＶL−リンカー−Ｖ
Hであった。ＤＮＡ配列の確認後、単鎖構築物を、実施例１に記載のような真核生物発現
ベクター中にサブクローニングして、発現のために適切な哺乳動物宿主細胞中にトランス
フェクトする。
【０１１７】
別の単鎖構築物も作成した。これは、重鎖および軽鎖の反対の５’−３’方向で作成し
、ｐＣＡＮＴＡＢＥ５Ｅ(Pharmacia Biotech,Piscataway,N.J.)中でアセンブルして、フ
ァージ中で発現させた。このｓｃＦｖを発現する組み換えファージの特異的結合はＥＬＩ
ＳＡによって実証された。
【０１１８】
ＶL−リンカー−Ｖ配列を、以下に図示されるように、ランピルナーゼ−ＭＮ−１４融
合タンパク質の構築のために用いた。ランピルナーゼをコードするＤＮＡフラグメントを
実施例１に記載のように得た。２３アミノ酸リンカーをランピルナーゼ配列とｓｃＦｖと
の間で用いた。Kurucz et al.(1995)。あるいは、上記のＭＮ−１４ ｓｃＦｖの構築に
用いられる（ＧＧＳＧＳ）3リンカーを用いた。融合タンパク質の好ましい構成は以下：
ランピルナーゼ−リンカー−−ＶＬ−−（ＧＧＳＧＳ）3−−ＶH
であった。
【０１１９】
本明細書に引用される全ての特許および他の引用文献の内容は、その全体が引用するこ
とにより本明細書に組み込まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物宿主細胞を培養するステップを含む、免疫毒素を調製する方法であって、
前記宿主細胞が、（ａ）第一の免疫グロブリン可変ドメインに融合された非哺乳動物リ
ボヌクレアーゼを含む融合ポリペプチドをコードする第一の核酸配列と、（ｂ）第二の免
疫グロブリン可変ドメインを含む第二のポリペプチドをコードする第二の核酸配列とで形
質転換されており、前記第一および第二の免疫グロブリンの可変ドメインが一緒になって
抗原結合部位を形成する、方法。
【請求項２】
前記非哺乳動物リボヌクレアーゼが、前記第一の免疫グロブリン可変ドメインのＮ末端
に融合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非哺乳動物リボヌクレアーゼが、Ｎ末端ピログルタミン酸残基を保有する、請求項
２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一の免疫グロブリン可変ドメインが軽鎖可変ドメインである、請求項３に記載の
方法。
【請求項５】
前記融合ポリペプチドと前記第二の免疫グロブリン可変ドメインとが、前記宿主細胞中
で別の分子として産生される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記融合ポリペプチドがＣＬドメインをさらに含み、前記第二のポリペプチドがＣＨ１
ドメインをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記融合ポリペプチドがＣＨ１ドメインをさらに含み、前記第二のポリペプチドがＣＬ
ドメインをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記第二のポリペプチドが、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインをさらに含む、請求
項６に記載の方法。
【請求項９】
前記融合ポリペプチドが、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインをさらに含む、請求項
６に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫毒素がグリコシル化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫毒素が、ＣＨ２ドメイン上でグリコシル化されている、請求項８または９に記
載の方法。
【請求項１２】
前記非哺乳動物のリボヌクレアーゼが、ランピルナーゼまたはその改変体である、請求
項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞毒性ＲＮＡｓｅが、ヒョウガエルから精製されたランピルナーゼの配列および
構造を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
免疫毒素であって、（ａ）第一の免疫グロブリン可変ドメインに融合された非哺乳動物
リボヌクレアーゼを含む融合ポリペプチドと、（ｂ）第二の免疫グロブリン可変ドメイン
を含む第二のポリペプチドとを含み、前記免疫グロブリン可変ドメインの１つが軽鎖可変
ドメインであり、もう一方の免疫グロブリン可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、前
記第一および第二の免疫グロブリン可変ドメインが一緒になって抗原結合部位を形成し、
前記免疫毒素がグリコシル化されている、免疫毒素。
【請求項１５】
前記非哺乳動物リボヌクレアーゼが、前記第一の免疫グロブリン可変ドメインのＮ末端
に融合されている、請求項１４に記載の免疫毒素。
【請求項１６】
前記非哺乳動物リボヌクレアーゼが、Ｎ末端ピログルタミン酸残基を保有する、請求項
１５に記載の免疫毒素。
【請求項１７】
前記第一の免疫グロブリン可変ドメインが軽鎖可変ドメインである、請求項１６に記載
の免疫毒素。
【請求項１８】
前記融合ポリペプチドと前記第二の免疫グロブリン可変ドメインとが、別の分子である
、請求項１４〜１７のいずれかに記載の免疫毒素。
【請求項１９】
前記融合ポリペプチドがＣＬドメインをさらに含み、前記第二のポリペプチドがＣＨ１
ドメインをさらに含む、請求項１７に記載の免疫毒素。
【請求項２０】
前記融合ポリペプチドがＣＨ１ドメインをさらに含み、前記第二のポリペプチドがＣＬ
ドメインをさらに含む、請求項１７に記載の免疫毒素。
【請求項２１】
前記第二のポリペプチドが、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインをさらに含む、請求
項１９に記載の免疫毒素。
【請求項２２】
前記融合ポリペプチドが、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインをさらに含む、請求項
２０に記載の免疫毒素。
【請求項２３】
前記免疫毒素が、ＶLドメイン上でグリコシル化されている、請求項１４〜２２のいず
れかに記載の免疫毒素。
【請求項２４】
前記免疫毒素が、ＣＨ２ドメイン上でグリコシル化されている、請求項１９〜２３に記
載の免疫毒素。
【請求項２５】
前記非哺乳動物のリボヌクレアーゼが、ランピルナーゼまたはその改変体である、請求
項１４〜２５のいずれかに記載の免疫毒素。
【請求項２６】
前記細胞毒性ＲＮＡｓｅが、ヒョウガエルから精製されたランピルナーゼの配列および
構造を有する、請求項２５に記載の免疫毒素。
【請求項２７】
前記抗原結合部位が細胞表面分子に対して特異的に結合し、前記免疫毒素が前記細胞表
面分子を保有する細胞に結合した際に内部移行されるという特性を有する、請求項１４〜
２６のいずれかに記載の免疫毒素。
【請求項２８】
細胞毒性ＲＮＡｓｅ部分に融合された内部移行抗体または抗体フラグメントを含む免疫
毒素であって、前記細胞毒性ＲＮＡｓｅ部分がＮ末端ピログルタミン酸残基を保有し、前
記細胞毒性ＲＮＡｓｅ部分がそのＣ末端において前記抗体または抗体フラグメントの軽鎖
を含むポリペプチドのＮ末端に融合されており、前記抗体または抗体フラグメントが別の
軽鎖および重鎖を含む、免疫毒素。
【請求項２９】
腫瘍関連抗原、Ｂ細胞抗原、Ｔ細胞抗原、形質細胞抗原、ＨＬＡ−ＤＲ系統抗原、ＣＥ
Ａ，ＮＣＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４およびＭＵＣ１６抗原、ＥＧＰ−
１抗原、ＧＥＰ−２抗原、胎盤アルカリホスファターゼ抗原、ＩＬ−６、ＥＧＦＲ、ＶＥ
ＧＦ、ＩＬＧＦ、Ｐ１ＧＦ、テネイシン、ＣＤ３３、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＰＡＰ、Ｈｅｒ
２／ｎｅｕ、炭酸脱水素酵素ＩＸ、および自己免疫疾患に関連する抗原からなる群より選
択される抗原に対する、請求項１４〜２８のいずれかに記載の免疫毒素。
【請求項３０】
前記抗原が、Ｂ細胞またはＴ細胞リンパ腫または白血病に関連する標的抗原である、請
求項２９に記載の免疫毒素。
【請求項３１】
前記抗原が、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ８
０、ＭＵＣ１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＬ−６、Ｐ１ＧＦ、ＶＥＧＦ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ
、ＣＤ６６ｃ、およびＣＤ６６ｄからなる群より選択される抗原である、請求項３０に記
載の免疫毒素。
【請求項３２】
前記抗原がＨＬＡ−ＤＲである、請求項３１に記載の免疫毒素。
【請求項３３】
前記免疫グロブリン可変ドメインが、ＬＬ１に由来する、請求項３２に記載の免疫毒素
。
【請求項３４】
前記抗原がＣＤ２２である、請求項３１に記載の免疫毒素。
【請求項３５】
前記免疫グロブリン可変ドメインが、ＬＬ２に由来する、請求項３４に記載の免疫毒素
。
【請求項３６】
前記抗原がＭＵＣ１である、請求項３１に記載の免疫毒素。
【請求項３７】
前記免疫グロブリン可変ドメインがＰＡＭ４由来である、請求項３６に記載の免疫毒素
。
【請求項３８】
前記抗原がＥＧＰ−１である、請求項３１に記載の免疫毒素。
【請求項３９】
前記免疫グロブリン可変ドメインが、ＲＳ７に由来する、請求項３８に記載の免疫毒素
。
【請求項４０】
前記抗原がＥＧＰ−２である、請求項３１に記載の免疫毒素。
【請求項４１】
前記免疫グロブリン可変ドメインが、ＲＳ１１または１７−１Ａに由来する、請求項４
０に記載の免疫毒素。
【請求項４２】
前記抗原がＣＥＡである、請求項３１に記載の免疫毒素。
【請求項４３】
前記免疫グロブリン可変ドメインがＭＮ−１４由来である、請求項４２に記載の免疫毒
素。
【請求項４４】
前記抗原がＮＣＡである、請求項３１に記載の免疫毒素。
【請求項４５】
前記免疫グロブリン可変ドメインが、ＭＮ−３またはＭＮ−１５に由来する、請求項４
４に記載の免疫毒素。
【請求項４６】
前記可変ドメインが、ヒト化ドメインまたはヒトドメインである、請求項１〜１３のい
ずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記可変ドメインが、ヒト化ドメインまたはヒトドメインである、請求項１４〜４６の
いずれかに記載の免疫毒素。
【請求項４８】
請求項１〜４７のいずれかに記載の免疫毒素、および薬学的に受容可能なキャリアを含
む薬学的組成物。
【請求項４９】
被験体における疾患または症候群を処置する方法であって、前記被験体に対して、請求
項４８に記載の組成物を、前記疾患または症候群の症状を処置または改善するのに有効な
量で投与するステップを含む、方法。
【請求項５０】
前記疾患またな症候群が、前記被験体における細胞の望ましくないまたは不適切な増殖
または活性化によって特徴付けられる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記疾患または症候群が、前記被験体におけるＢ細胞、Ｔ細胞、骨髄細胞または形質細
胞の望ましくないまたは不適切な増殖または活性化によって特徴付けられる、請求項５０
に記載の方法。
【請求項５２】
前記疾患が、癌腫、肉腫、神経膠腫、リンパ腫、白血病、黒色腫、神経芽細胞腫および
骨髄腫からなるガンの群より選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記疾患または症候群が、固形腫瘍の存在によって特徴付けられる、請求項５０に記載
の方法。
【請求項５４】
前記固形腫瘍が、神経芽細胞腫、神経膠腫、悪性黒色腫、乳房、結腸直腸、胃、卵巣、
前立腺、膀胱、肝臓、肺、腎臓、および膵臓の腫瘍からなる群より選択される腫瘍である
、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記薬学的組成物が、前記被験体に対して２回以上投与される、請求項４８〜５４のい
ずれかに記載の方法。
【請求項５６】
１日あたり０．１〜約１０００ｍｇの前記薬学的組成物が、前記被験体に投与される、
請求項４８〜５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
前記組成物が非経口的に投与される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記組成物が、静脈内に、動脈内に、皮内にまたは皮下に投与される、請求項５６に記
載の方法。
【請求項５９】
前記細胞が、１つ以上の自己免疫疾患の発生および進行に関与する、請求項５０に記載
の方法。
【請求項６０】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、
急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞
踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候
群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、
結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎
、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候
群、血栓血管炎(thromboangitis ubiterans)、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状
腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱
瘡、ヴェーゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／
多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎および線維化性肺胞炎からなる群より選択
される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
感染性の生物によって引き起こされる疾患を処置する方法であって、前記疾患に罹患し
ている被験体に対して、請求項１４に記載の免疫毒素の有効量を投与するステップを含み
、前記免疫毒素の免疫グロブリン成分が、疾患を引き起こす微生物または寄生生物に特異
的に結合する、方法。
【請求項６２】
前記疾患を引き起こす微生物が、
ストレプトコッカス・アガラクティエ、在郷軍人病菌、化膿連鎖球菌、大腸菌、淋菌、
髄膜炎菌、肺炎球菌、Hemophilis influenzae B、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘ
ータ、緑膿菌、ハンセン菌、ウシ流産菌、ヒト結核菌、破傷風毒素、抗ウイルスモノクロ
ーナル抗体、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−３、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ
型肝炎、パピローマウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロ
ウイルス、単純疱疹ＩおよびＩＩ、ヒト血清パルボ様ウイルス、ポリオーマウイルス、パ
ピローマウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、
麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイル
ス、マウス白血病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビ
スウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、疣ウイルス、ブルー・タングウイルス、セ
ンダイウイルス、猫白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアン・ウイル
ス４０、マウス乳癌ウイルス、デング熱ウイルス、風疹ウイルス、原生動物、熱帯熱マラ
リア原虫、三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ原虫、Trypanosoma rangeli、クルーズ
・トリパノソーマ、Trypanosoma rhodesiensei、トリパノソーマ・ブルーセイ、マンソン
住血吸虫、Schistosoma japanicum、Babesia bovis、Elmeria tenella、回旋糸状虫、熱
帯リーシュマニア、旋毛虫、Theileria parva、Taenia hydatigena、Taenia ovis、無鉤
条虫、単包条虫、Mesocestoides corti、抗マイコプラズマＭＡｂｓ、Mycoplasma arthri
tidis、M.hyorhinis、M.orale、M.arginini、Acholeplasma laidlawii、M.salivarium、
およびＭ肺炎からなる群より選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記第一および第二の核酸配列が、ｐｄＨＬ２ベクター内に含まれる、請求項１〜１３
のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記第一および第二の免疫グロブリンドメインが、半分子の形成を阻害する変異を含む
ＩｇＧ4ドメインである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項６５】
前記第一の免疫グロブリン可変ドメインが重鎖可変ドメインである、請求項３に記載の
方法。
【請求項６６】
前記第一の免疫グロブリン可変ドメインが軽鎖可変ドメインであり、前記第二の免疫グ
ロブリン可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、前記免疫グロブリン重鎖可変ドメイン
が、前記第二の免疫グロブリン重鎖可変ドメインのＮ末端に融合された非哺乳動物リボヌ
クレアーゼを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１】
哺乳動物宿主細胞を培養するステップを含む、免疫毒素を調製する方法であって、
前記宿主細胞が、（ａ）第一の免疫グロブリン可変ドメインに融合された非哺乳動物リ
ボヌクレアーゼを含む融合ポリペプチドをコードする第一の核酸配列と、（ｂ）第二の免
疫グロブリン可変ドメインを含む第二のポリペプチドをコードする第二の核酸配列とで形
質転換されており、前記第一および第二の免疫グロブリンの可変ドメインが一緒になって
抗原結合部位を形成する、方法。
【請求項２】
前記非哺乳動物リボヌクレアーゼが、前記第一の免疫グロブリン可変ドメインのＮ末端
に融合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非哺乳動物リボヌクレアーゼが、Ｎ末端ピログルタミン酸残基を保有する、請求項
２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一の免疫グロブリン可変ドメインが軽鎖可変ドメインである、請求項３に記載の
方法。
【請求項５】
前記融合ポリペプチドと前記第二の免疫グロブリン可変ドメインとが、前記宿主細胞中
で別の分子として産生される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記融合ポリペプチドがＣＬドメインをさらに含み、前記第二のポリペプチドがＣＨ１
ドメインをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記融合ポリペプチドがＣＨ１ドメインをさらに含み、前記第二のポリペプチドがＣＬ
ドメインをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記第二のポリペプチドが、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインをさらに含む、請求
項６に記載の方法。
【請求項９】
前記融合ポリペプチドが、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインをさらに含む、請求項
６に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫毒素がグリコシル化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫毒素が、ＣＨ２ドメイン上でグリコシル化されている、請求項８または９に記
載の方法。
【請求項１２】
前記非哺乳動物のリボヌクレアーゼが、ランピルナーゼまたはその改変体である、請求
項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞毒性ＲＮＡｓｅが、ヒョウガエルから精製されたランピルナーゼの配列および
構造を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
免疫毒素であって、（ａ）第一の免疫グロブリン可変ドメインに融合された非哺乳動物
リボヌクレアーゼを含む融合ポリペプチドと、（ｂ）第二の免疫グロブリン可変ドメイン
を含む第二のポリペプチドとを含み、前記免疫グロブリン可変ドメインの１つが軽鎖可変
ドメインであり、もう一方の免疫グロブリン可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、前
記第一および第二の免疫グロブリン可変ドメインが一緒になって抗原結合部位を形成し、
前記免疫毒素がグリコシル化されている、免疫毒素。
【請求項１５】
前記非哺乳動物リボヌクレアーゼが、前記第一の免疫グロブリン可変ドメインのＮ末端
に融合されている、請求項１４に記載の免疫毒素。
【請求項１６】
前記非哺乳動物リボヌクレアーゼが、Ｎ末端ピログルタミン酸残基を保有する、請求項
１５に記載の免疫毒素。
【請求項１７】
前記第一の免疫グロブリン可変ドメインが軽鎖可変ドメインである、請求項１６に記載
の免疫毒素。
【請求項１８】
前記融合ポリペプチドと前記第二の免疫グロブリン可変ドメインとが、別の分子である
、請求項１４〜１７のいずれかに記載の免疫毒素。
【請求項１９】
前記融合ポリペプチドがＣＬドメインをさらに含み、前記第二のポリペプチドがＣＨ１
ドメインをさらに含む、請求項１７に記載の免疫毒素。
【請求項２０】
前記融合ポリペプチドがＣＨ１ドメインをさらに含み、前記第二のポリペプチドがＣＬ
ドメインをさらに含む、請求項１７に記載の免疫毒素。
【請求項２１】
前記第二のポリペプチドが、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインをさらに含む、請求
項１９に記載の免疫毒素。
【請求項２２】
前記融合ポリペプチドが、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインをさらに含む、請求項
２０に記載の免疫毒素。
【請求項２３】
前記免疫毒素が、ＶLドメイン上でグリコシル化されている、請求項１４〜２２のいず
れかに記載の免疫毒素。
【請求項２４】
前記免疫毒素が、ＣＨ２ドメイン上でグリコシル化されている、請求項１９〜２３に記
載の免疫毒素。
【請求項２５】
前記非哺乳動物のリボヌクレアーゼが、ランピルナーゼまたはその改変体である、請求
項１４〜２５のいずれかに記載の免疫毒素。
【請求項２６】
前記細胞毒性ＲＮＡｓｅが、ヒョウガエルから精製されたランピルナーゼの配列および
構造を有する、請求項２５に記載の免疫毒素。
【請求項２７】
前記抗原結合部位が細胞表面分子に対して特異的に結合し、前記免疫毒素が前記細胞表
面分子を保有する細胞に結合した際に内部移行されるという特性を有する、請求項１４〜
２６のいずれかに記載の免疫毒素。
【請求項２８】
細胞毒性ＲＮＡｓｅ部分に融合された内部移行抗体または抗体フラグメントを含む免疫
毒素であって、前記細胞毒性ＲＮＡｓｅ部分がＮ末端ピログルタミン酸残基を保有し、前
記細胞毒性ＲＮＡｓｅ部分がそのＣ末端において前記抗体または抗体フラグメントの軽鎖
を含むポリペプチドのＮ末端に融合されており、前記抗体または抗体フラグメントが別の
軽鎖および重鎖を含む、免疫毒素。
【請求項２９】
腫瘍関連抗原、Ｂ細胞抗原、Ｔ細胞抗原、形質細胞抗原、ＨＬＡ−ＤＲ系統抗原、ＣＥ
Ａ，ＮＣＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４およびＭＵＣ１６抗原、ＥＧＰ−
１抗原、ＧＥＰ−２抗原、胎盤アルカリホスファターゼ抗原、ＩＬ−６、ＥＧＦＲ、ＶＥ
ＧＦ、ＩＬＧＦ、Ｐ１ＧＦ、テネイシン、ＣＤ３３、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＰＡＰ、Ｈｅｒ
２／ｎｅｕ、炭酸脱水素酵素ＩＸ、および自己免疫疾患に関連する抗原からなる群より選
択される抗原に対する、請求項１４〜２８のいずれかに記載の免疫毒素。
【請求項３０】
前記抗原が、Ｂ細胞またはＴ細胞リンパ腫または白血病に関連する標的抗原である、請
求項２９に記載の免疫毒素。
【請求項３１】
前記抗原が、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ８
０、ＭＵＣ１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＬ−６、Ｐ１ＧＦ、ＶＥＧＦ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ
、ＣＤ６６ｃ、およびＣＤ６６ｄからなる群より選択される抗原である、請求項３０に記
載の免疫毒素。
【請求項３２】
前記抗原がＨＬＡ−ＤＲである、請求項３１に記載の免疫毒素。
【請求項３３】
前記免疫グロブリン可変ドメインが、ＬＬ１に由来する、請求項３２に記載の免疫毒素
。
【請求項３４】
前記抗原がＣＤ２２である、請求項３１に記載の免疫毒素。
【請求項３５】
前記免疫グロブリン可変ドメインが、ＬＬ２に由来する、請求項３４に記載の免疫毒素
。
【請求項３６】
前記抗原がＭＵＣ１である、請求項３１に記載の免疫毒素。
【請求項３７】
前記免疫グロブリン可変ドメインがＰＡＭ４由来である、請求項３６に記載の免疫毒素
。
【請求項３８】
前記抗原がＥＧＰ−１である、請求項３１に記載の免疫毒素。
【請求項３９】
前記免疫グロブリン可変ドメインが、ＲＳ７に由来する、請求項３８に記載の免疫毒素
。
【請求項４０】
前記抗原がＥＧＰ−２である、請求項３１に記載の免疫毒素。
【請求項４１】
前記免疫グロブリン可変ドメインが、ＲＳ１１または１７−１Ａに由来する、請求項４
０に記載の免疫毒素。
【請求項４２】
前記抗原がＣＥＡである、請求項３１に記載の免疫毒素。
【請求項４３】
前記免疫グロブリン可変ドメインがＭＮ−１４由来である、請求項４２に記載の免疫毒
素。
【請求項４４】
前記抗原がＮＣＡである、請求項３１に記載の免疫毒素。
【請求項４５】
前記免疫グロブリン可変ドメインが、ＭＮ−３またはＭＮ−１５に由来する、請求項４
４に記載の免疫毒素。
【請求項４６】
前記可変ドメインが、ヒト化ドメインまたはヒトドメインである、請求項１〜１３のい
ずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記可変ドメインが、ヒト化ドメインまたはヒトドメインである、請求項１４〜４６の
いずれかに記載の免疫毒素。
【請求項４８】
請求項１〜４７のいずれかに記載の免疫毒素、および薬学的に受容可能なキャリアを含
む薬学的組成物。
【請求項４９】
被験体における疾患または症候群を処置する方法であって、前記被験体に対して、請求
項４８に記載の組成物を、前記疾患または症候群の症状を処置または改善するのに有効な
量で投与するステップを含む、方法。
【請求項５０】
前記疾患またな症候群が、前記被験体における細胞の望ましくないまたは不適切な増殖
または活性化によって特徴付けられる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記疾患または症候群が、前記被験体におけるＢ細胞、Ｔ細胞、骨髄細胞または形質細
胞の望ましくないまたは不適切な増殖または活性化によって特徴付けられる、請求項５０
に記載の方法。
【請求項５２】
前記疾患が、癌腫、肉腫、神経膠腫、リンパ腫、白血病、黒色腫、神経芽細胞腫および
骨髄腫からなるガンの群より選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記疾患または症候群が、固形腫瘍の存在によって特徴付けられる、請求項５０に記載
の方法。
【請求項５４】
前記固形腫瘍が、神経芽細胞腫、神経膠腫、悪性黒色腫、乳房、結腸直腸、胃、卵巣、
前立腺、膀胱、肝臓、肺、腎臓、および膵臓の腫瘍からなる群より選択される腫瘍である
、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記薬学的組成物が、前記被験体に対して２回以上投与される、請求項４８〜５４のい
ずれかに記載の方法。
【請求項５６】
１日あたり０．１〜約１０００ｍｇの前記薬学的組成物が、前記被験体に投与される、
請求項４８〜５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
前記組成物が非経口的に投与される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記組成物が、静脈内に、動脈内に、皮内にまたは皮下に投与される、請求項５６に記
載の方法。
【請求項５９】
前記細胞が、１つ以上の自己免疫疾患の発生および進行に関与する、請求項５０に記載
の方法。
【請求項６０】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、
急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞
踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候
群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、
結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎
、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候
群、血栓血管炎(thromboangitis ubiterans)、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状
腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱
瘡、ヴェーゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／
多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎および線維化性肺胞炎からなる群より選択
される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
感染性の生物によって引き起こされる疾患を処置する方法であって、前記疾患に罹患し
ている被験体に対して、請求項１４に記載の免疫毒素の有効量を投与するステップを含み
、前記免疫毒素の免疫グロブリン成分が、疾患を引き起こす微生物または寄生生物に特異
的に結合する、方法。
【請求項６２】
前記疾患を引き起こす微生物が、
ストレプトコッカス・アガラクティエ、在郷軍人病菌、化膿連鎖球菌、大腸菌、淋菌、
髄膜炎菌、肺炎球菌、Hemophilis influenzae B、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘ
ータ、緑膿菌、ハンセン菌、ウシ流産菌、ヒト結核菌、破傷風毒素、抗ウイルスモノクロ
ーナル抗体、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−３、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ
型肝炎、パピローマウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロ
ウイルス、単純疱疹ＩおよびＩＩ、ヒト血清パルボ様ウイルス、ポリオーマウイルス、パ
ピローマウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、
麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイル
ス、マウス白血病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビ
スウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、疣ウイルス、ブルー・タングウイルス、セ
ンダイウイルス、猫白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアン・ウイル
ス４０、マウス乳癌ウイルス、デング熱ウイルス、風疹ウイルス、原生動物、熱帯熱マラ
リア原虫、三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ原虫、Trypanosoma rangeli、クルーズ
・トリパノソーマ、Trypanosoma rhodesiensei、トリパノソーマ・ブルーセイ、マンソン
住血吸虫、Schistosoma japanicum、Babesia bovis、Elmeria tenella、回旋糸状虫、熱
帯リーシュマニア、旋毛虫、Theileria parva、Taenia hydatigena、Taenia ovis、無鉤
条虫、単包条虫、Mesocestoides corti、抗マイコプラズマＭＡｂｓ、Mycoplasma arthri
tidis、M.hyorhinis、M.orale、M.arginini、Acholeplasma laidlawii、M.salivarium、
およびＭ肺炎からなる群より選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記第一および第二の核酸配列が、ｐｄＨＬ２ベクター内に含まれる、請求項１〜１３
のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記第一および第二の免疫グロブリンドメインが、半分子の形成を阻害する変異を含む
ＩｇＧ4ドメインである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項６５】
前記第一の免疫グロブリン可変ドメインが重鎖可変ドメインである、請求項３に記載の
方法。
【請求項６６】
前記第一の免疫グロブリン可変ドメインが軽鎖可変ドメインであり、前記第二の免疫グ
ロブリン可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、前記免疫グロブリン重鎖可変ドメイン
が、前記第二の免疫グロブリン重鎖可変ドメインのＮ末端に融合された非哺乳動物リボヌ
クレアーゼを含む、請求項３に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１２−１９７２８６（Ｐ２０１２−１９７２８６Ａ）
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１１６４０１（Ｐ２０１２−１１６４０１）
【出願日】平成２４年５月２２日（２０１２．５．２２）
【分割の表示】特願２００６−５５３３５２（Ｐ２００６−５５３３５２）の分割
【原出願日】平成１７年２月１４日（２００５．２．１４）
【出願人】（５０４１４９９７１）イミューノメディクス、インコーポレイテッド (48)
【氏名又は名称原語表記】ＩＭＭＵＮＯＭＥＤＩＣＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年５月２２日（２０１２．５．２２）
【分割の表示】特願２００６−５５３３５２（Ｐ２００６−５５３３５２）の分割
【原出願日】平成１７年２月１４日（２００５．２．１４）
【出願人】（５０４１４９９７１）イミューノメディクス、インコーポレイテッド (48)
【氏名又は名称原語表記】ＩＭＭＵＮＯＭＥＤＩＣＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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