【課題】
改善されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ組成物およびその製造方法の開発。
【解決手段】
本発明は、組み換えCTLA4−Igおよびその変異体を生産し得る哺乳類細胞を提供する。また本発明は、CTLA4−Igを含む組成物およびその製剤を提供する。さらに本発明は、この組み換えタンパク質を生産し得る哺乳類細胞からCTLA4−Igを大量生産するため、およびCTLA−Igを精製するための方法を提供する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の単離した集団を含む組成物を液体培地から得る方法であって、前記培地がＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の初期集団を含み、その中で
（１）該初期集団のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は一つ以上のシアル酸残基を有し、
（２）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子１個あたりのシアル酸残基の数は初期集団内で異なり、
（３）該初期集団はＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体および高分子量凝集体を含み、並びに
（４）該液体培地はＭＣＰ−１を含み、前記方法は
（ａ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を発現している哺乳類細胞の培養物から液体培地を収集する工程；
（ｂ）該ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を細胞成分から分離する工程；
（ｃ）該ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子をＭＣＰ−１から分離する工程；
（ｄ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体をＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量凝集体から分離する工程；並びに
（ｅ）該ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を二つ以上の画分に分離する工程であって、少なくとも一つの画分のシアル酸対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のモル比は少なくとも一つの他の画分よりも大きい工程を含み、
工程（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を同時にまたは任意の順序で実施して、前記組成物を得ることを特徴とする方法。
【請求項２】
（ａ）該組成物のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のＮＡＮＡ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が８．０以上であり、かつサイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって測定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が２．５面積％以下であり；並びに
（ｂ）該組成物が、３ｎｇ／ｍｇ（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子）以下のＭＣＰ−１量を含むことを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項３】
（ａ）該組成物のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子のＮＡＮＡ対ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子の平均モル比が５．０以上であり、かつサイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって測定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が４．０面積％以下であり；並びに
（ｂ）該組成物が、５ｐｐｍ以下のＭＣＰ−１を含むことを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項４】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を単離する方法であって、
（ｉ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を産生する哺乳類細胞を含む液体培養物の可溶性画分を得る工程；
（ｉｉ）該可溶性画分を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、溶離されたタンパク質産物を得る工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）のタンパク質産物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、濃縮されたタンパク質産物を得る工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）のタンパク質産物をアフィニティークロマトグラフィーに供して、溶離および濃縮されたタンパク質産物を得る工程；並びに
（ｖ）工程（ｉｖ）のタンパク質産物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を単離する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を単離する方法であって、
（ｉ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を産生する哺乳類細胞を含む液体培養物の細胞培養上清を得る工程；
（ｉｉ）上清を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、溶離されたタンパク質産物を得る工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）のタンパク質産物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、濃縮されたタンパク質産物を得る工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）のタンパク質産物をアフィニティークロマトグラフィーに供して、溶離および濃縮されたタンパク質産物を得る工程；並びに
（ｖ）工程（ｉｖ）のタンパク質産物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を単離する工程（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、タンパク質１モルあたり≧８．０モルのシアル酸比を有している）を含み；その中で
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物のＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子は、３％未満が二量体形よりも大きなＣＴＬＡ４−Ｉｇ多量体であり、および
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物は、ＭＣＰ−１≦５ｎｇ／ｍｇ（ＣＴＬＡ４−Ｉｇ二量体）の特徴を有する方法。
【請求項６】
（ａ）工程（ｉｉ）で得られたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物が、サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって測定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が２５．７面積％以下である特徴を有しており、
（ｂ）工程（ｉｉｉ）で得られたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物が、サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって測定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が２．５面積％以下である特徴を有しており、
（ｃ）工程（ｉｖ）で得られたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物が、サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって測定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が２．５面積％以下である特徴を有しており、並びに
（ｄ）工程（ｖ）で得られたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物が、サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって測定されたＣＴＬＡ４−Ｉｇ高分子量種が２．０面積％以下である特徴を有している、請求項４の方法。
【請求項７】
（ａ）工程（ｉｉｉ）で得られたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物のＭＣＰ−１が５６００ｎｇ／ｍｌ未満である特徴を有しており、
（ｂ）工程（ｉｖ）で得られたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物のＭＣＰ−１が３８ｎｇ／ｍｌ未満である特徴を有しており、並びに
（ｃ）工程（ｖ）で得られたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物のＭＣＰ−１が９．５ｎｇ／ｍｌ未満である特徴を有している、請求項４の方法。
【請求項８】
（ａ）工程（ｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーを、
第一級、第二級、第三級、または第四級アミン官能基を含む陰イオン交換樹脂を有するカラム；
約７５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約３６０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約８．０の洗浄バッファー；および
約２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約８５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約７．０の溶離バッファーを用いて実施し、
（ｂ）工程（ｉｉｉ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーを、
フェニル、オクチル、プロピル、アルコキシ、ブチル、またはイソアミル官能基を含む疎水性相互作用樹脂；および
約２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約８５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約７．０の単一の洗浄バッファーを用いて実施し、
（ｃ）工程（ｉｖ）のアフィニティークロマトグラフィーを、
タンパク質Ａを含むアフィニティークロマトグラフィー樹脂；
約２５ｍＭのトリスおよび約２５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約８．０の洗浄バッファー；および
約１００ｍＭのグリシンを含み、ｐＨが約３．５の溶離バッファーを用いて実施し、並びに
（ｄ）工程（ｖ）の陰イオン交換クロマトグラフィーを、
約２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約１２０ｍＭのＮａＣｌ〜約１３０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約８．０の洗浄バッファー；および
約２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約２００ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約８．０の溶離バッファーを用いて実施する、請求項４の方法。
【請求項９】
ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物を単離する方法であって、
（ｉ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を産生する哺乳類細胞を含む液体培養物の可溶性画分を得る工程と、任意の順序の；
（ｉｉ）該可溶性画分をアフィニティークロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む溶離された組成物を得る工程；
（ｉｉｉ）該可溶性画分を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む溶離および濃縮された組成物を得る工程；並びに
（ｉｖ）該可溶性画分を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む溶離および濃縮された組成物を得る工程を含み、その中で
該アフィニティークロマトグラフィー工程を最初に行うことを特徴とする方法。
【請求項１０】
工程（ｉｉ）のアフィニティークロマトグラフィーを、グアニジンまたは尿素を含む溶離バッファーを用いて実施する、請求項９の方法。
【請求項１１】
（ｉ）ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を産生する哺乳類細胞を含む液体培養物の可溶性画分を得る工程；
（ｉｉ）該可溶性画分をアフィニティークロマトグラフィーに供して、溶離されたタンパク質産物を得る工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）のタンパク質産物を陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、溶離および濃縮されたタンパク質産物を得る工程；並びに
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）のタンパク質産物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含むさらに濃縮された組成物を得る工程を含むことを特徴とする、請求項９の方法。
【請求項１２】
工程（ｉｖ）で得られた組成物が、サイズ排除クロマトグラフィーおよび分光光度検出によって測定された高分子量種の割合が約２．５面積％未満であり、
細胞タンパク質の割合が約９５ｎｇ／ｍｌ未満であり、並びに
ＭＣＰ−１の割合が約５ｐｐｍ未満である特徴を有する、請求項１１の方法。
【請求項１３】
（ａ）工程（ｉｉ）のアフィニティークロマトグラフィーを、
タンパク質Ａを含む樹脂；
約２５ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４および約１５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約７．５の洗浄バッファー；および
約２５０ｍＭのグリシンを含み、ｐＨが約３の溶離バッファーを用いて実施し；
（ｂ）工程（ｉｉｉ）の陰イオン交換クロマトグラフィーを、
第一級、第二級、第三級、または第四級アミン官能基を含む陰イオン交換樹脂を有するカラム；
約５０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約１３５ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約７の洗浄バッファー；および
約５０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約２００ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨが約７の溶離バッファーを用いて実施し；並びに
（ｃ）工程（ｉｖ）の疎水性相互作用クロマトグラフィーを、
フェニル、オクチル、プロピル、アルコキシ、ブチル、またはイソアミル官能基を含む疎水性相互作用樹脂；および
約５０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび約１．２Ｍの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を含み、ｐＨが約７の洗浄バッファーを用いて実施する、請求項１１の方法。
【請求項１４】
該ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が配列番号２、５、６、７、８、９または１０を有する一つ以上のポリペプチドを含む、請求項１０〜１３のいずれか一つの方法。
【請求項１５】
該ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が配列番号１８を有する一つ以上のポリペプチドを含む、請求項１０〜１３のいずれか一つの方法。
【請求項１６】
該ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が配列番号４、１１、１２、１３、１４、１５または１６を有する一つ以上のポリペプチドを含む、請求項１０〜１３のいずれか一つの方法。
【請求項１７】
該ＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子が配列番号２４を有する一つ以上のポリペプチドを含む、請求項１０〜１３のいずれか一つの方法。
【請求項１８】
請求項１０〜１３のいずれか一つの方法によって得られたＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を含む組成物。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１５Ａ】

【図１５Ｂ】

【図１６】

【図１７】

【図１８Ａ】

【図１８Ｂ】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７Ａ】

【図２７Ｂ】

【図２７Ｃ】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４Ａ】

【図３４Ｂ】

【図３４Ｃ】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４４】

【図４５】

【図４６】

【図４７】

【図４８】

【図４９】

【図５０】

【図５１】

【図５２】

【図５３】

【図５４】

【図５５Ａ】

【図５５Ｂ】

【図５５Ｃ】

【図５５Ｄ】

【図５６】

【図５７】

【図５８Ａ】

【図５８Ｂ】

【図５９】

【図６０】

【図６１Ａ】

【図６１Ｂ】

【図６２】

【図６３】

【図６４】

【図６５】

【図６６】

【図６７Ａ】

【図６７Ｂ】

【図６８】

【図６９】

【図７０】

【図７１Ａ】

【図７１Ｂ】

【図７２】

【図７３】

【図７４】

【図７５】

【図７６】

【図７７】

【図７８】

【図７９】

【図８０】

【図８１】

【図８２】

【図８３】

【図８４】

【図８５】

【図８６】

【図８７】

【公開番号】特開２０１０−１１６４０２（Ｐ２０１０−１１６４０２Ａ）
【公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２８９５７０（Ｐ２００９−２８９５７０）
【出願日】平成２１年１２月２１日（２００９．１２．２１）
【分割の表示】特願２００８−５４７６２１（Ｐ２００８−５４７６２１）の分割
【原出願日】平成１８年１２月１９日（２００６．１２．１９）
【出願人】（３９１０１５７０８）ブリストル−マイヤーズ　スクイブ　カンパニー (494)
【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ　ＳＱＵＩＢＢ　ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】