組換えインフルエンザ菌アドヘシンタンパク質
【技術課題】組換えアドヘシン（ｒＨｉａ）を提供すること。
【解決手段】完全長でＮ末端が切断されている形の、インフルエンザ菌の分類不能型菌株のＨiaタンパク質の組み換え生成物、分類不能型およびc型インフルエンザ菌のさまざまな菌株のＨia遺伝子の核酸およびアミノ酸配列を提供する。
【解決手段】完全長でＮ末端が切断されている形の、インフルエンザ菌の分類不能型菌株のＨiaタンパク質の組み換え生成物、分類不能型およびc型インフルエンザ菌のさまざまな菌株のＨia遺伝子の核酸およびアミノ酸配列を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願の参照)
本出願は、同時係続の米国特許出願第０９/２６８,３４７号の一部継続出願である。
【０００２】
(発明の分野)
本発明は分子遺伝学の分野に関し、詳細には組換えインフルエンザ菌(ヘモフィルス・インフルエンジー(Ｈaeｍophilus influenzae))アドヘシン(Ｈia)タンパク質の産生に関する。
【背景技術】
【０００３】
(発明の背景)
インフルエンザ菌は、髄膜炎、喉頭蓋炎、敗血症および中耳炎などのいくつかの重大なヒト疾患の原因である。インフルエンザ菌には、aからfで表され、それらの莢膜多糖によって識別される６種類の血清型がある。b型インフルエンザ菌(Ｈib)は、１９８０年代にいくつかのＨib結合ワクチンが導入されるまでは細菌性髄膜炎の主な原因であった(ref.１.本出願全体にわたって、さまざまな参考文献を括弧内に引用し、本発明が関係する分野の現状をより完全に説明する。それぞれの引用に関する完全な文献情報は、明細書の最後、特許請求の範囲の直前に見出される。これらの参考文献の開示を、参照により本開示に組み込む)。ジフテリアトキソイド(ref.２)、破傷風トキソイド(ref.３および米国特許第４,４９６,５３８号)または髄膜炎菌外膜タンパク質(ref.４)に結合したb型インフルエンザ菌莢膜多糖をベースとするワクチンは、b型インフルエンザ菌誘発髄膜炎を減らすのに有効とされてきた。他の血清型インフルエンザ菌が侵襲性疾患に関連する頻度は低いが、Ｈib疾患の発生率が減少するにつれて、これらの菌株に起因する疾患の発生率が増加するようである(ref.５、６)。非被包性すなわち分類不能型インフルエンザ菌(ＮＴＨi)もまた中耳炎、喉頭蓋炎、肺炎および気管気管支炎を含む広範囲のヒト疾患の原因となる。ＮＴＨi誘発疾患の発生率は、Ｈibワクチンの導入によって影響を受けなかった(ref.７)。
【０００４】
中耳炎は幼児期に最もよく見られる病気であり、２歳未満の子供全体の６０から７０％が１回から３回の耳感染症を経験する(ref.８)。子供の慢性中耳炎は聴力、発話および認知障害の原因となる。インフルエンザ菌感染症は、急性中耳炎の症例の約３０％、慢性中耳炎の約６０％を占める。米国だけでも中耳炎の治療には、抗生物質ならびに扁桃摘出術、咽頭扁桃切除術および中耳腔換気用チューブの挿入などの外科的処置に年間１０億ドルから２０億ドルが費やされている。言語療法および特殊教育授業などの付加的治療に対し、年間さらに３００億ドルが費やされていると推定される。さらに、中耳炎の原因となる生物の多くは、抗生物質治療に対して耐性になりつつある。したがって、中耳炎に対する有効な予防ワクチンが望まれている。ＮＴＨiによる自然感染では、抗体の応答を刺激する露出した外膜タンパク質が殺菌および/または防御的な抗体として潜在的に重要な標的であり、したがって潜在的なワクチンの候補である。ＮＴＨiの上皮細胞への付着の際に重要である高分子量タンパク質(ＨＭＷ１およびＨＭＷ２)のファミリーが、約７０から７５％のＮＴＨi菌株において同定されている(ref.９、ref.１０)。これらの高分子量アドヘシン(adhesin)は、中耳炎のチンチラモデルにおいていくらかの防御を可能にすることが分かっている(ref.１１)。高分子量アドヘシンタンパク質の第２のファミリーが、約２５％のＮＴＨiおよび被包性インフルエンザ菌株において同定されている(ref.１２、ref.１３、ref.１４)。この第２のファミリーのＮＴＨiメンバーは、インフルエンザ菌アドヘシンすなわちＨiaと呼ばれ、被包性菌株において発見される相同タンパク質はインフルエンザ菌表面原繊維タンパク質すなわちＨsfと呼ばれる。hia遺伝子は、中耳炎患者の回復期血清を使用して発現ライブラリーから最初にクローニングされ、このことはhia遺伝子が疾患における重要な免疫原であることを示す。プロトタイプのＨiaおよびＨsfタンパク質は約８２％の配列類似性を示すが、Ｈsfタンパク質はかなり高い。これらのタンパク質には保存されたアミノ酸およびカルボキシ末端およびいくつかの繰り返しモチーフが含まれ、ＨsfはＨiaと比較してより多くの繰り返し配列を含む。高分子量タンパク質(２００kＤa)も、ＨsfおよびＨiaタンパク質といくらかの配列相同性があるＭoraxella catarrhalisから同定されている(米国特許第５,８０８,０２４号)。
【０００５】
ＨiaおよびＨsfはインフルエンザ菌の被包性菌株および約２０〜２５％の非被包性菌株中で保存され、アドヘシンであることが示されているので、ＨiaまたはＨiaと特異的に反応する抗体を産生する能力のあるタンパク質を産生する、インフルエンザ菌または他の細菌性病原体によって引き起こされる疾患に対する診断および予防接種において、このタンパク質は有用性がある。
【０００６】
診断において有用であり予防接種における免疫原としてのアンチＨia抗体を産生するために、診断において抗原としてＨiaを使用することの欠点は、インフルエンザ菌種からの天然タンパク質の回収があまりできないことである。
【０００７】
他の免疫原用のワクチン、担体を含めた免疫調製、および診断試薬の生成において、抗原として使用するための組換えＨiaタンパク質を提供することが有利であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
(発明の概要)
本発明は組換えインフルエンザ菌アドヘシン(rＨia)の提供を対象とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
このような組換えタンパク質の提供に関して、本発明は単離され精製されたある種の核酸分子を提供する。したがってその一態様において、本発明は単離され精製された核酸分子を提供し、この核酸分子はインフルエンザ菌株のインフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質をエンコードしており、以下のものを含む。(a)図１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５に示される配列(配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７)からなる群から選択されるＤＮＡ配列、または(b)図１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５に示される配列(配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するインフルエンザ菌アドヘシン(rＨia)タンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列。
【００１０】
このような核酸は、プラスミドベクターである可能性のあるベクター中に含まれていてよい。詳細には、分類不能型ヘモフィルスの菌株１１または３３からのＨiaタンパク質を、核酸分子はエンコードしていてよい。
【００１１】
本発明の他の態様では、インフルエンザ菌の菌株のＮ末端切断型インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質をエンコードしており、１対のヌクレオチドによって増幅可能な単離され精製された核酸分子が提供される。ヌクレオチドは配列番号７と配列番号１５、配列番号９と配列番号１５、配列番号１１と配列番号１５、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４９、および配列番号５１からなる群から選択される。
【００１２】
このような核酸は、プラスミドベクターである可能性のあるベクター中に含まれていてよい。詳細には、分類不能型ヘモフィルスの菌株１１または３３からのコドンＶ３８またはＳ４４で始まるＮ末端切断型Ｈiaタンパク質を、核酸分子はエンコードしていてよい。
【００１３】
本発明のこれらの態様に従って提供される単離され精製された核酸を組み込んでいるプラスミドベクターは、
図１Ａ中に示されるＤＳ-２００８-２-３
図５Ａ中に示されるＤＳ-２１８６-１-１
図５Ａ中に示されるＤＳ-２２０１-１
図５Ａ中に示されるＤＳ-２１８６-２-１
図５Ａ中に示されるＤＳ-２１６８-２-６
図３２中に示される１Ａ-１９１-３-１
からなる群から選択されるプラスミドの同定特性を有する可能性がある。
【００１４】
本明細書で提供されるベクターは、大腸菌からのcer遺伝子を含んでよい。したがって、本発明の他の態様では、完全長またはＮ末端切断型インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質をエンコードしている核酸分子、前記完全長または切断型Ｈiaタンパク質を発現するためのプロモーター、任意選択で大腸菌のcer遺伝子含む、宿主を形質転換するためのベクターが提供される。ベクターはプラスミドベクターまたは他の非複製ベクターであってよく、
図６Ａ中に示されるＢＫ-９６-２-１１
図７Ａ中に示されるＤＳ-２２４２-１
図７Ａ中に示されるＤＳ-２２４２-２
図８Ａ中に示されるＤＳ-２３４０-２-３
図９Ａ中に示されるＤＳ-２２４７-２
図９Ｂ中に示されるＤＳ-２４４８-１７
図３２中に示されるＪＢ-２９３０-３
からなる群から選択されるプラスミドベクターの同定特性を有する可能性がある。
【００１５】
本明細書で提供されるベクターは、サルモネラ、ＢＣＧ、アデノウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアまたはポリオウイルスからのベクターを含めた複製ベクターを含んでよい。
【００１６】
本明細書で提供される任意のベクターを使用して、完全長または切断型である可能性のある、ヘモフィルスの分類不能型菌株の防御性インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質を発現するのに適切な宿主細胞を形質転換することができる。このような宿主は、好都合には大腸菌であってよい。このような発現はＴ７プロモーターの制御下で行うことができ、形質転換された宿主からの組換えＨiaの発現はラクトースまたは他の好都合な誘導剤の誘導用濃縮液中で培養することによって実施することができる。
【００１７】
本発明は他の態様において、形質転換された宿主、特に本明細書で提供される大腸菌によって産生される、分類不能型ヘモフィルス菌株の組換え防御性インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質をさらに含む。このようなＨiaタンパク質を組換えタンパク質の免疫原性断片またはアドヘシン官能性類縁体の形で提供することができる。
【００１８】
完全長またはＮ末端切断型である本明細書で提供される組換えＨiaタンパク質は、免疫原性組成物中の抗原、他の免疫原用の担体、診断用薬としておよび診断用薬の生成において有用である。完全長またはＮ末端切断型であるＨiaタンパク質をエンコードしている核酸分子も、診断のための使用用、および免疫原性組成物中においてもプローブとして有用である。
【００１９】
追加的な態様において本発明は、本明細書で提供されるのと同様な単離され精製された核酸分子、本明細書で提供されるのと同様なヘモフィルスの菌株の完全長またはＮ末端切断型である組換え防御性Ｈiaタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学的に活性のある成分、および薬学的に許容可能なこれらの担体を含む、免疫原性組成物を提供する。
【００２０】
本明細書で提供される免疫原性組成物を、宿主へのin vitro投与用ワクチンとして製剤化して、インフルエンザ菌に起因する疾患に対する防御を提供することができる。このような目的のために、組成物をミクロ粒子、カプセル、ＩＳＣＯＭまたはリポソーム調製物として製剤化することができる。免疫原性組成物を免疫系の特定の細胞または粘膜表面への送達用の標的分子と組み合わせて提供することができる。
【００２１】
本発明の免疫原性組成物(ワクチンを含めて)は少なくとも１種の他の免疫原性または免疫刺激性材料をさらに含んでよく、この免疫刺激性材料少なくとも１種のアジュバントまたは少なくとも１種のサイトカインであってよい。本発明で使用するのに適切なアジュバントには(これらに限らないが)リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ２１、Ｑuil Ａ、その誘導体および成分、ＩＳＣＯＭマトリックス、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類縁体、アミノ酸のオクタデシルエステル、ムラミルジペプチド、ポリホスファゼン、ＩＳＣＯＰＲＥＰ、ＤＣ-chol、ＤＤＢＡおよびリポタンパク質ならびに他のアジュバントがある。
【００２２】
アジュバントの有利な組み合わせは、本出願人と同じ譲受人に譲渡され、その開示を参照(１９９５年１１月２１日発行のＷＯ ９５/３４３０８)により本明細書に組み込む１９９４年６月１６日出願の同時係続の米国特許第０８/２６１,１９４号、および１９９５年６月７日出願の第０８/４８３,８５６号に記載されている。
【００２３】
本発明の他の態様に従って、感受性のある宿主に有効量の前述の免疫原性組成物を投与するステップを含む、宿主中で免疫応答を生み出すための方法が提供される。免疫応答は体液の免疫応答であるか、または細胞を介する免疫応答であってよい。その内部で疾患に対する防御を与えることができる宿主には、ヒトを含めた霊長類がある。
【００２４】
本発明の他の態様に従って、薬剤として使用されるとき本明細書で提供される免疫原性組成物、および疫原性組成物の製造における免疫原性組成物のこれらの成分の使用法が提供される。
【００２５】
他の追加的な態様において本発明は、インフルエンザ菌の分類不能型菌株の防御性インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質の産生のための方法を提供し、この方法は
本明細書で提供されるのと同様な菌株のＮ末端切断型のインフルエンザ菌アドヘシンタンパク質をエンコードしている核酸分子を含むベクターによって、大腸菌などの宿主を形質転換すること、
宿主を成長させてエンコードされている切断型Ｈiaを発現させること、
発現したＨiaタンパク質を単離および精製することを含む。
【００２６】
エンコードされている切断型Ｈiaを封入体中で発現させることができる。成長し形質転換された細胞を破壊して上澄みおよびＨiaを含む封入体を生成し、上澄みからの分離の後に封入体を可溶化して組換えＨiaの溶液を生成し、クロマトグラフィによって細胞の残骸のない組換えＨiaの溶液を精製し、精製された組換えＨiaタンパク質を単離することによって、単離および精製ステップを実施することができる。
【００２７】
大腸菌などの宿主細胞を形質転換するベクターはＴ７プロモーターを含んでよく、大腸菌または他の宿主細胞を誘導量のラクトースまたは他の好都合な誘導剤の存在下で培養することができる。
【００２８】
本明細書のインフルエンザ菌の菌株は、菌株１１、３３、３２、２９、Ｍ４０７１、Ｋ９、Ｋ２２および１２からなる分類不能型菌株の群から選択することができる。このような菌株からの代表的なＨiaタンパク質をエンコードしている遺伝子に特異的な核酸配列が、本明細書で提供され以下に記載される。
【００２９】
本明細書で提供される核酸配列は、診断に関する適用例において有用である。したがって本発明の他の態様では、サンプル中でインフルエンザ菌アドヘシンタンパク質をエンコードしている核酸の存在を判定するするための方法が提供され、この方法は、
a)サンプルを本明細書で提供されるのと同様な核酸分子と接触させて、本明細書で提供される核酸配列、およびサンプル中に存在し特異的にハイブリダイズすることができるヘモフィルスの菌株のＨiaタンパク質をエンコードしている核酸を含むデュプレックス(duplex)を生成するステップと、
b)デュプレックスの生成を判定するステップを含む。
【００３０】
さらに本発明は、サンプル中でインフルエンザ菌アドヘシンタンパク質をエンコードしている核酸の存在を判定するための診断キットを提供し、このキットは、
a)本明細書で提供されるのと同様な核酸分子と、
b)核酸分子とサンプルを接触させて、この核酸分子および任意のこのような核酸分子を含むデュプレックスを生成するための手段と、
c)デュプレックスの生成を判定するための手段をを含む。
【００３１】
本明細書で提供される組換えによって産生された切断型Ｈiaタンパク質も、診断に関する適用例において有用である。したがって本発明の他の態様では、サンプル中のＨiaタンパク質と特異的に反応する抗体の存在を判定するための方法が提供され、この方法は、
(a)サンプルと本明細書で提供される組換えＨiaタンパク質を接触させて、この組換えＨiaタンパク質とサンプル中に存在しタンパク質と特異的に反応する任意のこのような抗体の複合体を提供するステップと、
(b)複合体の生成を判定するステップを含む。
【００３２】
本発明の利点には以下のものがある。
【００３３】
インフルエンザ菌アドヘシンタンパク質またはこのＨiaタンパク質の断片または類縁体をエンコードしている単離され精製された核酸分子、
他のいかなるヘモフィルスのタンパク質も含まない組換えによって産生されたＨiaタンパク質、
ヘモフィルスの特異的な同定用の診断キットおよび免疫試薬。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明は、図面を参照しながら以下の記述からさらに理解されるはずである。
【００３５】
(発明の全般的な説明)
Ｈ.influenzae株は、少量のＨiaおよびＨsfタンパク質を発現するので、ＮＴＨi株由来のhia遺伝子を、Ｅ.Ｃoli中で組み換えタンパク質を過剰発現させるための発現ベクター中にクローン化した。全長組み換えＨia(rＨia)タンパク質が発現する際、それは比較的少量であった。組み換えタンパク質が発現されているのを確認するために、本出願と同じ譲受人に譲受され、その開示を参照により本明細書に組み込む米国特許第５,８０８,０２４号で２００kＤaであると同定されたＭoraxella catarrhalis高分子量アドヘシンタンパク質に対する抗体を用いてイムノブロットを実施した。ゲル精製した未変性２００kＤaタンパク質に対する抗体は、rＨiaタンパク質サンプル中に特異的に誘導されたバンドを認識した。rＨiaの収量はＴ７hia遺伝子カセットの遺伝子コピー数を増加させることによっても顕著には増加しない。
【００３６】
Ｅ.Ｃoliのcer遺伝子は、大きな挿入部を含むプラスミドを安定化するが(参考文献１５)、Ｅ.Ｃoliのcer遺伝子を発現ベクターに添加しても、rＨiaの収量は顕著には増加しない。しかし、Ｅ.Ｃoli細胞は培養中に凝集し、このことは、Ｈiaアドヘシンタンパク質の表面発現が起きていることを示唆している。rＨiaタンパク質が封入体として生成されればrＨiaタンパク質の強い毒性は克服されるので、推定シグナル配列を欠失させるために遺伝子の５’-末端を切断した。この変性の結果、Ｖ３８位置から出発している切断型rＨiaの生産および回収が良好となった。
【００３７】
全長およびＶ-３８切断型rＨiaタンパク質は免疫原性であり、得られる抗-rＨia抗体は、Ｈ.influrnzaeのタイプaまたはタイプb株による菌血症の受動的幼ラットモデルを防護する。さらに、切断型Ｖ３８rＨiaタンパク質は、チンチラの能動的抗原投与モデルにおける鼻咽頭コロニー形成に対して特に防護に働くことが見出された。ＮＴＨi株からのrＨiaによってもたらされる防護が、ＮＴＨiおよび被包性タイプaまたはタイプb株が原因となって起こる疾患に対するものであることは、一般的な防護エピトープが存在することを意味している。付加的なhia遺伝子のクローニングおよび配列分析は、保存領域の同定の助けとなる。全長またはＮ-末端切断型rＨiaタンパク質を、Ｈaeｍophilus influenzae疾患に対する防護のためのワクチン成分として使用できる。
【００３８】
hia遺伝子を有する任意のＨaeｍophilus株は、少なくとも本発明の態様で特徴付けるＨiaタンパク質をコードする部分を含有する核酸分子(おそらくＤＮＡ分子の形)の精製および単離に利用できる。このような株は一般的な臨床所およびバクテリア培養収集所、例えばＡｍerican Ｔype Ｃulture Ｃollectionから入手される。Ｈaeｍophilus influenzaeの適切な株:
分類不能型 Ｈaeｍophilus 株１１；
分類不能型 Ｈaeｍophilus 株３３；
分類不能型 Ｈaeｍophilus 株３２；
分類不能型 Ｈaeｍophilus 株２９；
分類不能型 Ｈaeｍophilus 株 Ｍ４０７１；
分類不能型 Ｈaeｍophilus 株 Ｋ９；
分類不能型 Ｈaeｍophilus 株 Ｋ２２；
分類不能型 Ｈaeｍophilus 株 １２；
タイプＣ Ｈaeｍophilus 株 ＡＰI。
【００３９】
本明細書において、“Ｈia”タンパク質という用語は、Ｈiaタンパク質のファミリーを定義するために使用され、Ｈiaタンパク質には種々のＨaeｍophilus株中で見出されるアミノ酸配列を有する天然の変異体が含まれる。
【００４０】
図１Ａは、Ｔ７プロモーターの影響下での、分類不能型 Ｈaeｍophilus influenzae株１１由来全長hia遺伝子を含むプラスミドＤＳ-２００８-２-３の制限地図を示す図である。株１１由来のhia遺伝子の核酸(配列番号:４３)および推測アミノ酸配列(配列番号:４４)は、前記米国特許第５,６４６,２５９に記載されている(該明細書中では“ＨＡ１”と定義される)。hia遺伝子を株１１の遺伝子のＡＴＧ開始コドンからＰＣＲ増幅するために使用したオリゴヌクレオチドを、図１Ｂに示す。
【００４１】
図２は、抗-未変性Ｍoraxella catarrhalis高分子量アドヘシン抗体によりrＨia(１１)タンパク質を確認するためのイムノブロットを示す図である。前記米国特許第５,８０８,０２４に記載される、Ｍ.catarrhalis高分子量アドヘシンタンパク質または２００kＤaタンパク質は、ＨiaおよびＨsfタンパク質と、特にカルボキシ末端部に、何らかの配列相同性を有する(図２８)。
【００４２】
図３は、ＮＴＨi株１１由来の全長hia遺伝子から成るＴ７hia遺伝子カセットのタンデムコピーを含むプラスミドＤＳ-２０９２-１およびＤＳ-２０９２-４０の構築スキームを示す図である。増加した遺伝子コピー数を示すこのようなプラスミドは、しばしば組み換えタンパク質の生産レベルを上昇させる。しかし、以下に示すように、組み換えＨiaの低い収率は、遺伝子コピー数の増加によって顕著には増加しない。
【００４３】
図４は、ＮＴＨi株１１タンパク質のＮ-末端配列および経時的にＮ-末端切断されたrＨiaタンパク質の位置を示す図である。Ｅ２１部分までのＮ-末端切断型は、Ｈiaのシグナル配列の構成部分であると考えられる長い疎水性領域が欠失している。Ｔ３３部分までの欠失は、長い疎水性領域を含み、潜在的なＡla-Ｘ-Ａlaシグナル切断部位を有する。Ｖ３８部分までの欠失は、長い疎水性領域を含み、潜在的なＡla-Ｘ-Ａlaシグナル切断部位を有する。Ｓ４４部分から始まる組み換えＨiaタンパク質は、長い疎水性領域を含み、潜在的なＡla-Ｘ-Ａlaシグナル切断部位を有する。Ｎ５２部分から始まる組み換えＨiaタンパク質は、Ｍoraxella catarrhalis由来の高分子量(２００kＤa)アドヘシンの近接した開始点を模倣しており、アドヘシンは米国特許第５,８０８,０２４に記載され、該組み換えタンパク質は、Ｖ５６から開始するようにＮ-末端切断型されている場合に過剰発現する。
【００４４】
図５Ａは、４種のＮ―末端切断型rＨiaを製造するための、プラスミドＤＳ-２１８６-１-１、ＤＳ-２２０１-１、ＤＳ-２１８６-２-１、およびＤＳ-２１６８-２-６を作製するための構築スキームを示す図である。５’-末端フラグメントをＰＣＲ増幅するために使用されるこのオリゴヌクレオチドを図５Ｂに示す。図３０は、Ｓ４４欠失を製造する、プラスミドＪＢ２９３０-３を作製するための構築スキームを示す図である。５’-フラグメントをＰＣＲ増幅するために使用するオリゴヌクレオチドを図２９に示す。
【００４５】
図６Ａは、ＮＴＨi株１１由来のＶ３８hia遺伝子ならびにプラスミドを安定化するＥ.Ｃoli cer遺伝子を含むプラスミドＢＫ-９６-２-１１を作製するための構築スキームを示す図である。毒性のタンパク質を産生するプラスミドへのcer遺伝子の導入により、タンパク質産生の強化が予測された。cer遺伝子の存在下で全長rＨia産生Ｅ.Ｃoli細胞の形態に変化が生じ、すなわち細胞が凝集した。このことは、凝集を起こす細胞表面のアドヘシンの発現が強化されたことを示唆する。発現プラスミドＢＫ-９６-２-１１はさらに、遺伝子安定性を高めると考えられているＴ７Ｖ３８hia遺伝子カセットの上流および下流に転写ターミネーターを含んでいる。マルチクローニング部位および転写ターミネーターを作製するために使用されるオリゴヌクレオチドを図６Ｂに示す。
【００４６】
図７Ａは、Ｔ７プロモーターの影響下に、分類不能型Ｈaeｍophilus influenzae株３３由来の全長hia遺伝子を含むプラスミドＤＳ-２２４２-１およびＤＳ-２２４２-２のための構築スキームを示す図である。発現プラスミドは、Ｔ７hia(３３)遺伝子カセットの上流および下流にＥ.Ｃoli cer遺伝子および形質転換ターミネーターをも含有する。ＤＳ-２２４２-１は、Ｔ７hia(３３)遺伝子と同一の鎖上にコードされたターミネーターを有する。しかし、２つのプラスミドに由来するrＨiaの発現には違いが見られなかった。ＮＴＨi株３３の真性５’末端の構築に使用されるオリゴヌクレオチドを図７Ｂに示す。
【００４７】
図８Ａは、ＮＴＨi株３３由来のＶ３８Ｈia遺伝子ならびにＥ.Ｃoli cer遺伝子を含むプラスミドＤＳ-２３４０-２-３のための構築スキームを示す図である。Ｔ７Ｖ３８hia遺伝子カセットの上流および下流の同一の鎖上に転写ターミネーターも存在する。ＮＴＨi株３３hia遺伝子をＶ３８コドンからＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを図８Ｂに示す。
【００４８】
図９は、Ｔ７Ｖ３８hia(１１)またはＴ７Ｖ３８hia(３３)遺伝子カセットのタンデムコピーをそれぞれ含有するプラスミドＤＳ-２４４７-２およびＤＳ-２４４８-１７の構築を示す図である。
【００４９】
図１０、パネルＡは、ＮＴＨi株１１由来の全長または切断型hia遺伝子をコードするプラスミドからのrＨiaタンパク質の産生を示す図である。全長rＨia(１１)タンパク質の産生は非常に低かった。Ｅ２１およびＴ３３切断型rＨiaタンパク質の場合も発現は低かった。しかし、Ｖ３８およびＮ５２切断型rＨiaタンパク質は顕著に改善された発現レベルを示す。図１０、パネルＢから明らかなように、Ｖ３８rＨia(１１)の産生は、Ｅ.Ｃoli cer遺伝子を発現プラスミドへ添加した場合に明らかに増加している。
【００５０】
図１１は、封入体として製造されるrＨiaタンパク質の精製スキームを示す図である。細胞を、超音波破砕により溶解し、封入体を連続した抽出により精製した。封入体を、グアニジニウムクロライド中に溶解し、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を添加して不純物を沈殿させた。(ＮＨ4)2ＳＯ4の添加によりrＨiaが沈殿し、粗rＨiaをさらにゲル濾過により精製した。
【００５１】
図１２は、株１１および３３由来の精製されたＶ３８rＨiaタンパク質を示す図である。封入体はレーン３に示され、最終精製タンパク質はレーン４に示される。精製されたタンパク質の推定純度は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥデンシトメトリーにより測定して、約９０％を上回る。
【００５２】
図１３は、ここに記載されるようにして製造されたrＨiaタンパク質の、グリ
セロールを添加した場合としない場合でかつ４℃で、およびグリセロールを添加
して−２０℃で８週間貯蔵する際の安定性に関する、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を示
す図である。タンパク質はいずれの条件でも安定である。
【００５３】
図１４は、ＣＤ-１マウス中の株１１および３３由来Ｖ３８rＨiaタンパク質の免疫原性を示す図である。０.３〜１０μgの用量では、いずれのタンパク質でも、１ないし２回投与した後に強い免疫応答を示す。これらのレベルでは顕著な用量応答は認められない。同様の結果が、ＢＡＬＢ/cマウス(図１５Ａ)およびモルモット(図１５Ｂ)でも見られ、このことはrＨiaが投与量あたり０.３μgであっても強い免疫原性を有することを示唆している。
【００５４】
図１６は、Ｖ３８rＨia(３３)によってもたらされる、ＮＴＨi株３３が引き起こすコロニー形成に対する防護を示す図である。Ｙang 等(参考文献２０)が記載しているように、チンチラ鼻咽頭コロニー形成モデルは、この疾患の初期の段階での防護を評価するために開発された。このモデルは、最初に、hｍｗ遺伝子を発現するＮＴＨi株のために確立され、hia遺伝子を発現するＮＴＨi株に適応させなければならなかった。プロトタイプhｍｗ-発現株(ＮＴＨi１２)における感染の確立には１０2〜１０8cfuを使用するが、ＮＴＨi３３株の場合には５×１０8cfuが必要であり、このような高レベルであってもプロトタイプhia-発現株１１では感染が確立されない。１００μg量で免疫化コホートは明らかに部分的に防護されるが、５０μg量では防護されない。疾患の初期の段階でのこのような防護は、ワクチン抗原としてのrＨiaアドヘシンの利用性を示している。
【００５５】
図１７は、別のＨaeｍophilus influenzae hia遺伝子をＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。配列は、ＨiaおよびＨsfタンパク質の保存アミノ酸およびカルボキシ末端配列に基づいている。
【００５６】
図１８は、ＮＴＨi株３３hia遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。図１９は、ＮＴＨi３２hia遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。図２０は、ＮＴＨi株２９hia遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。図２１は、ＮＴＨi株 Ｍ４０７１hia遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。図２２は、ＮＴＨi株 Ｋ９hia遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。図２３は、ＮＴＨi株 Ｋ２２hia遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。図２４は、Ｈaeｍophilus influenzae タイプc株ＡＰIhia遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。図２５は、ＮＴＨi株１２由来のhia座の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。ＰＣＲ増幅されたフラグメントは、hia遺伝子の３’-末端へ連結したＨaeｍophilus influenzaeタイプd株ＲdゲノムのＨI１７３３遺伝子に関連する遺伝子の３’-末端を含有する。ＨI１７３３タンパク質の上流ＯＲＦのアラインメントを図２７に示す。
【００５７】
図２６は、前記米国特許５,６４６,２５９に記載されるような、ＮＴＨi株１１由来のＨia遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。
【００５８】
図２８は、Ｈsf、Ｈiaから推定されるタンパク質の配列のアラインメント、およびＭ.catarrhalis２００kＤaタンパク質の部分配列を示す図である。
【００５９】
本発明の種々の実施態様を、ワクチン摂取、診療、Ｈaeｍophilus感染の治療、免疫剤の製造の分野の応用に利用できることは、当業者に明らかである。このような使用について以下に述べるが、これに限定するものではない。
【００６０】
ワクチンの製造および使用
ワクチンとして使用するのに好適な免疫原性組成物は、ここに記載されるような、分類不能型Ｈaeｍophilus株の免疫原性組み換えＨaeｍophilus influenzaeアドヘシン(rＨia)タンパク質、その免疫原性類似体およびフラグメントおよび/または免疫原性ペプチドから製造できる。ワクチンは免疫応答を誘起し、これにより抗-rＨia抗体およびオプソニン化または死菌化された抗体を含む抗体が産生される。
【００６１】
ワクチンを含む免疫原性組成物は、液体溶液またはエマルジョンのような注入可能な形で製造できる。rＨiaタンパク質、その免疫原性類似体およびフラグメントおよび/または免疫原性ペプチドを、製薬学的に認容性の添加剤と混合してよく、該添加剤はrＨiaタンパク質、免疫原性フラグメント類似体または免疫原性ペプチドと混和性である。このような添加物には、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せが含まれる。
【００６２】
免疫原性組成物およびワクチンはさらに、補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、pＨ緩衝剤、またはワクチンの効果を増強するためのアジュバントを含有してよい。
【００６３】
免疫原性組成物およびワクチンは、皮下注射または筋肉内注射のような非経口投与が可能である。また、本発明で製造される免疫原性組成物を処方し、粘膜表面で免疫応答を喚起する方法で輸送する。従って、免疫原性組成物は例えば鼻または口(胃)のような経路で粘膜表面に適用してよい。
【００６４】
免疫原性組成物は免疫系の特異的な細胞または粘膜表面へ輸送するために、標的分子と組み合わせてよい。標的分子には、ＷＯ９２/１７１６７に記載されるような(Ｂiotech Ａustralia Ｐty. Ｌtd.)、ビタミンＢ12およびバクテリア毒素、および米国特許第５,１９４,２５４(Ｂarber等)に記載されるようなモノクローナル抗体が含まれる。
【００６５】
また、座剤および経口処方を含む別の投与形態が望ましい。座剤には、結合剤および担体が含まれていてよく、例えばポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドである。経口処方には、一般的に使用される添加剤、例えば製薬学的な量のサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウムが含まれてよい。これらの組成物は、溶剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続性製剤または粉剤の形で投与され、rＨiaタンパク質、フラグメント類似体および/またはペプチドを約１〜９５％含有する。
【００６６】
ワクチンは、投与処方に適合する方法で、治療効果、防護および免疫原性として機能する量で投与される。投与量は治療対象、例えば個人の免疫系の抗体合成能力および必要であれば細胞-仲介免疫応答の発現能力により変化する。投与に必要とされる活性成分の適切な量は、専門医の評価に依存する。しかし、好適な投与範囲は当業者により容易に決定可能であり、rＨia、その類似体およびフラグメントおよび/またはペプチドはマイクログラム程度でよい。初期投与およびブースター投与のための好適な治療法も効果的であるが、初期投与には連続投与も含まれる。ワクチンの投与量は、投与経路に依存し、宿主の大きさによっても変化する。
【００６７】
分類不能型ＨaeｍophilusのrＨiaタンパク質をコードする核酸分子を免疫化に直接使用してよく、その際、ＤＮＡを直接投与、例えば遺伝子的免疫化として注入するかまたは生ベクター、例えば核酸分子を含むサルモネラ、ＢＣＧ、アデノウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアまたはポリオウイルスを構築する。異種抗体を免疫系へ運ぶために使用される数種の生ベクターについては、例えばＯ，Ｈagan(１９９２)(参考文献１６)に議論されている。遺伝子的免疫化のための、ＤＮＡの被検対象への直接的な注入方法は、例えばＵlｍer等、１９９３(参考文献１７)に記載されている。
【００６８】
抗原と一般的にリン酸バッファー生理食塩水中の０.０５〜１.０％溶液として使用されるアジュバントとを同時に投与することにより、免疫原性は著しく向上する。アジュバントは抗原の免疫原性を強化するが、それ自体は免疫原性を必ずしも有さない。アジュバントは、抗原を投与部位の近くに局所的に維持することにより、抗原の免疫系の細胞へのゆっくりとした継続的な放出を助ける、蓄積効果を生み出す。アジュバントはまた、免疫系細胞を蓄積した抗原へと誘引し、そのような細胞を刺激して免疫応答を促す。
【００６９】
免疫促進剤またはアジュバントは、宿主の免疫応答を向上させるために長年使用されてきており、例えばワクチンが挙げられる。内因性アジュバント、例えばリポポリサッカライドは、一般的にワクチンとして使用される死菌または弱毒化バクテリアの成分である。外因性アジュバントは、典型的に、抗原と非-共役結合した免疫調節物質であり、宿主の免疫応答を強化するために処方される。従って、アジュバントは非経口的に導入された抗体への免疫応答を強化するものである。これらのアジュバントのいくつかは毒性であり、不所望の副作用を起こすので、ヒトおよび多くの動物に使用するのは不適当である。実際、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム(まとめて一般的にアルムと称される)のみが、ヒトおよび家畜用のワクチン中にアジュバントとして慣用される。アルムによるジフテリアおよび破傷風トキソイドに対する抗体応答の増強は、よく確立されている。
【００７０】
外因性アジュバントの多くは抗原に対する潜在的な免疫応答を呼び起こす。これらには、前記した特異的アジュバントならびに膜タンパク質抗原と複合するサポニン(免疫刺激複合体)、鉱油を含む複合ポリマー、死んだ微生物および鉱油、フロイドの完全アジュバント、微生物の生成物、例えばムラミルジペプチド(ＭＤＰ)およびリポポリサッカライド(ＬＰＳ)ならびにリピドＡおよびリポソームが含まれる。
【００７１】
効果的に体液性免疫応答(ＨＩＲ)および細胞-仲介免疫(ＣＭＩ)を誘導するには、免疫原をアジュバント中に乳化させる。多くのアジュバントは毒性であり、肉芽腫、急性および慢性の炎症(フロイドの完全アジュバント、ＦＣＡ)、細胞溶解(サポニンおよび複合ポリマー)および発熱、関節炎および前ブドウ膜炎(ＬＰＳおよびＭＤＰ)を引き起こす。ＦＣＡは優れたアジュバントであり研究に汎用されるが、その毒性のために、ヒトまたは家畜用ワクチン中に使用することを許可されていない。
【００７２】
理想的なアジュバントの所望の特徴は:
(１)毒性の欠如；
(２)長期にわたる免疫応答刺激能力；
(３)製造の容易性および長期貯蔵における安定性；
(４)種々の経路で投与された抗原に対して、ＣＭＩおよびＨＩＲの両方を誘起する能力；所望であれば、
(５)他のアジュバントとの相乗作用；
(６)抗原提示細胞(ＡＰＣ)群と選択的に相互作用する能力；
(７)適切なＴH１またはＴH２細胞-特異的免疫応答を特異的に誘起する能力；
および
(８)抗原に対する適切な抗体イソタイプレベル(例えば、IgＡ)を選択的に増加させる能力である。
【００７３】
参照することでここに組み込んだものとする、Ｌockhoff等の１９８９年８月８日付けの米国特許第４,８５５,２８３には、免疫調節剤またはアジュバントとして、Ｎ-グリコシルアミド、Ｎ-グリコシルウレアおよびＮ-グリコシルカルバメートを含む糖脂質類似体が記載され、それぞれ糖残基をアミノ酸で置換されていてよい。また、Ｌockhoff等、１９９１(参考文献１８)は、天然の糖脂質と構造的類似性を有するＮ-糖脂質類似体、例えばグリコスフィンゴリピドおよびグリコグリセロリピドが、ヘルペス単純ウイルスワクチンおよび偽性狂犬病ウイルスワクチンの両方で強い免疫応答を誘起することを報告している。ある種の糖脂質は長鎖-アルキルアミンと脂肪酸とから合成され、芳香族炭素を介して糖と直接結合し、天然の脂質残基の機能を模倣する。
【００７４】
本出願と同じ譲受人に譲渡され、参照により本明細書に組み込む、Ｍolony等による米国特許第４,２５８,０２９には、破傷風トキソイドおよびホルマリン不活化タイプI、IIおよびIIIポリオウイルスワクチンと複合させた場合に、オクタデシルチロシンヒドロクロライド(ＯＴＨ)がアジュバントとして機能することが記載されている。またＮixon-Ｇeorge等、１９９０(参考文献１９)は、組み換えＢ型肝炎表面抗原と組み合わせた、芳香族アミノ酸のオクタデシルエステルが、Ｂ型肝炎ウイルスに対する宿主の免疫応答を強化することを報告している。
【００７５】
イムノアッセイ
本発明により製造されるＨaeｍophilusの分類不能型株のrＨiaタンパク質、その類似体およびフラグメントは、免疫原性として、酵素結合性免疫吸着剤検定(ＥＬＩＳＡ)、ＲＩＡおよび他の非-酵素結合性抗体結合アッセイまたは抗菌、Ｈaeｍophilus、および/またはＨia抗体を検出するための従来公知の方法を含むイムノアッセイ中の抗原として、有用である。ＥＬＩＳＡアッセイでは、Ｈiaタンパク質、類似体およびフラグメントを、選択された表面、例えばポリスチレンマイクロタイタープレートの壁面のようなタンパク質またはペプチドが結合可能な表面上へ固定する。不完全に吸着されているＨiaタンパク質、類似体および/またはフラグメントを除くために洗浄し、その後、非特異的タンパク質、例えば試験サンプルに対する抗原性が中性であることを知られているウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)またはカゼイン溶液を選択表面へ結合させてよい。これにより、固定表面上の非特異的吸着部位が遮断され、結果的に、表面上への抗血清の非特異的結合によって起こるバックグラウンドが減少する。
【００７６】
次いで固定表面を、臨床または生化学的材料のようなサンプルと接触させ、免疫複合体(抗原/抗体)の形成が起こる方法で試験する。この際、ＢＳＡ、ウシガンマグロブリン(ＢＧＧ)および/またはリン酸バッファー生理食塩水(ＰＢＳ)/Ｔｗeenのような希釈剤でサンプルを希釈してよい。サンプルを次に約２５℃〜３７℃程度の温度で約２〜約４時間インキュベートする。インキュベートに続き、サンプル-接触表面を洗浄して、非-免疫複合材料を除去する。洗浄方法には、ＰＢＳ/Ｔｗeen、またはホウ酸バッファーのような溶液による洗浄が含まれてよい。
【００７７】
試験サンプルと結合Ｈiaタンパク質、類似体および/またはフラグメントとの間に特異的な免疫複合体が形成された後、次いで洗浄し、複合体形成の出現およびその量を、一次抗体に特異的な二次抗体を免疫複合体へ添加することにより測定する。試験サンプルがヒト起源である場合、二次抗体はヒトイムノグロブリンに特異的な抗体であり、一般的にIgＧである。検出可能にするために、二次抗体は、例えば適当な発色性物質とインキュベートすることにより呈色が見られるような酵素活性等の関連活性を有する。定量化は、例えば可視スペクトル分光光度計を用いて呈色の度合いを測定することにより実施される。
【００７８】
ハイブリダイゼーションプローブとしての配列の使用
本発明のヌクレオチド配列は、新規に単離および特徴付けされたhia遺伝子配列を含有し、他のＨaeｍophilus分類不能型株から、hia遺伝子を同定およびクローニングすることができる。
【００７９】
本発明のhia遺伝子配列を含有するヌクレオチド配列は、その能力のために、他のhia遺伝子の補足的部分と倍体分子を選択的に形成するのが有用である。適用に応じて、種々のハイブリダイゼーション条件を利用し、他の分類不能型Ｈaeｍophilus株中の別のhia遺伝子のための、プローブの選択性の度合いを変化させる。高い選択性のためには、比較的厳しい条件を利用して倍体を形成し、例えば低塩および/または高温条件、例えばＮaＣl ０.０２Ｍ〜０.１５Ｍでありかつ約５０〜７０℃の温度という条件が挙げられる。ある種の適用では、それほど厳しいハイブリダイゼーション条件は必要とされず、例えば０.１５〜０.９Ｍの塩で２０〜５５℃の温度範囲でよい。ハイブリダイゼーション条件は、ホルムアミドの添加量が増加すると、ハイブリッドした倍体が不安定になるので、より厳しい条件が必要とされる。従って、特定のハイブリダイゼーション条件は容易に操作でき、所望の結果に応じて方法を選択するのが一般的である。一般的に、便利なハイブリダイゼーション温度は、５０％ホルムアミドの存在下かつＮaＣl ０.１５Ｍで:hia遺伝子が標的核酸フラグメントと９５〜１００％の相同性を有する場合に４２℃、９０〜９５％の相同性で３７℃および８５〜９０％の相同性で３２℃である。
【００８０】
臨床診断の態様において、本発明のhia遺伝子の核酸配列は、適当な手段、例えばハイブリダイゼーションを測定するための標識、と組み合わせて利用してよい。種々の適当な指示手段が知られており、放射活性、酵素または他のリガンド、例えばアビジン/ビオチンが含まれ、検出可能なシグナルの提供を可能にする。ある診断の態様において、放射活性タグの代わりに、酵素タグ、例えばウレアーゼ、アルカリンホスファターゼまたはペルオキシダーゼを使用してもよい。酵素タグの場合、肉眼または分光光度計で視覚的に捉えられ、Ｈia遺伝子配列を含むサンプルとの特異的ハイブリダイゼーションを同定できる手段として使用されるものとして、発色指示物質が公知である。
【００８１】
本発明のＨia遺伝子核酸配列は、溶液ハイブリダイゼーション中のハイブリダイゼーションプローブとして、および液相法で使用される態様として有用である。固相法に関する態様において、滲出液、体液(例えば血清、羊水、中耳滲出液、唾液、気管支肺胞洗浄液)または組織のような臨床サンプルを含むサンプルの試験ＤＮＡ(またはＲＮＡ)を、選択したマトリクスまたは表面へ吸着あるいは固定させる。固定された一本鎖核酸を、次いで、所望の条件下に、本発明のhia遺伝子またはそのフラグメントの核酸配列を含む選択プローブと特異的にハイブリダイゼーションさせる。選択する条件は、例えばＧ＋Ｃ含量、標的核酸のタイプ、核酸源、ハイブリダイゼーションプローブの大きさ等に応じて必要とされる特定の基準に基づく特定の状況に応じて変化する。続いてハイブリダイゼーション表面を洗浄して非特異的に結合したプローブ分子を除去し、標識の手段により、特異的ハイブリダイゼーションを検出または定量化する。Ｈaeｍophilus種で保存されている核酸配列部分を選択するのが好ましい。選択されたプローブは、少なくとも長さ１８bpであり、多くの場合３０〜９０bp長さである。
【００８２】
Ｈaeｍophilus influenzaeアドヘシン遺伝子の発現
宿主細胞に適合性の種に由来するレプリコンおよび制御配列を、発現系中のhia遺伝子の発現に利用してよい。ベクターは、通常、複製部位ならびに形質転換細胞中の表現型の選択を行うマーカー配列を有する。例えば、Ｅ.Ｃoliは、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含むpＢＲ３２２を使用して形質転換でき、従って、形質転換細胞を同定するための簡易な方法を提供する。pＢＲ３２２プラスミド、または他の微生物プラスミドまたはファージは、宿主細胞が自身のタンパク質を発現させるために使用できるプロモーターも含有するか、または含有するように変性する。
【００８３】
さらに、宿主細胞に適合性のレプリコンおよび制御配列を含有するファージベクターは、これらの宿主と一緒に形質転換ベクターとして使用できる。例えば、ラムダＧＥＭTM-１１中のファージを、Ｅ.ＣoliＬＥ３９２のような宿主細胞を形質転換させるために使用できる組み換えファージベクターを製造するために使用してよい。
【００８４】
組み換えＤＮＡ構築体中で一般的に使用されるプロモーターには、β-ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)およびラクトースプロモーターシステムおよび他の微生物プロモーター、例えばここで好ましい態様として使用されるＴ７プロモーターシステム(米国特許第４,９５２,４９６)が含まれる。プロモーターのヌクレオチド配列の詳細は公知であり、当業者にはそれらを遺伝子を用いて機能的に結合することが可能である。使用される特定のプロモーターは、一般的に、所望の結果に応じて選択されたプロモーターである。Ｈiaタンパク質および免疫学的フラグメントまたはその類似体の発現に適当な宿主には、Ｅ.Ｃoliが含まれ、Ｂordetella種、Ｂacillus種、Ｈaeｍophilusu種、菌体、酵母またはバクロウイルスシステムを使用してもよい。Ｅ.Ｃoliがここで使用される好ましい宿主である。
【００８５】
本発明において、特にＨaeｍophilus種を培養して精製した天然Ｈiaタンパク質が微量の毒性物質または他の汚染物質を含む場合に、Ｈiaタンパク質の製造は、組み換え法によるのが好ましい。この問題点は、組み換えにより製造されたＨiaタンパク質を異種システム中で使用することにより解決され、この際、Ｈiaタンパク質は、特に記載された構築体を使用して、精製物質中の汚染物質を最小化する方法で宿主から単離される。
【００８６】
微生物寄託
ここに記載し参照した分類不能型Ｈaeｍophilus株の高分子量タンパク質をコードする核酸を含むベクターを、本明細書の出願に先立って、ブタペスト条約に従い、１０８０１ Ｕniversity Ｂoulevard、Ｍanassas、Ｖirfinia ２０１１０-２２０９、米国に所在するＡｍerica Ｔype Ｃulture Ｃollection(ＡＴＣＣ)に寄託した。寄託されたベクターのサンプルは、公共に利用可能であり、課される全ての制限または寄託物を利用する権利は、この米国特許出願に基づく特許の許可を受けることとする。さらに、受託者が生存可能なサンプルを分配できない場合には、寄託物を受託者に戻すこととする。寄託された実施形態は本発明を例示するためだけのものであるので、本明細書に記載および請求された発明が、寄託された生物材料によって範囲を限定されることはない。本出願の記載と等価または同等な抗原をコードする核酸を含むいずれの等価または類似のベクターも本発明の範疇に入るものとする。
寄託概要
プラスミド ＡＴＣＣ 寄託年月日
ＢＫ-96-2-11 203771 1999年2月11日
【実施例】
【００８７】
上記の開示は概して本発明を説明している。以下の特定した実施例を参照するとさらに完全な理解が得られる。これらの実施例はただ例示の目的で説明されるものであり、本発明の範囲を限定しようとするものではない。状況によって形状の変化および同等品への置き換えを図ることで好都合なことを示唆できるかまたは提供できる。ここでは特殊な用語を使用したが、そのような用語は説明的感覚で使用するつもりであって限定を目的とするものではない。
【００８８】
本開示およびこれらの実施例には明記していないが、使用した分子遺伝学、蛋白質生化学、免疫学および発酵技術による方法は科学文献で広く報告されており、当業者の能力に充分に保有されたものである。
【００８９】
実施例１
この実施例はＮＴＨi菌株１１由来の全長のそろったrＨia蛋白質を発現するプラスミドＤＳ-２００８-２-３の構造を説明するものである。
【００９０】
ＮＴＨi菌株１１から染色体ＤＮＡを精製し、図１Ｂに記載したオリゴヌクレオチド(５０３８.ＳＬおよび５０３９.ＳＬ)を使用して全長のそろったhia遺伝子をＰＣＲ増幅した。pＴ７-７発現ベクター(ref.２１)にクローン化するためにＮde I部位をこの遺伝子の５’末端で設計し、ＢaｍＨ I部位を３’末端で設計した。増幅した断片をＮde I/ＢaｍＨ Iで切断し、同じ酵素で切断したpＴ７-７にクローン化した。プラスミドＤＳ-２００８-２-３はＴ７プロモーターの下流に３.４kbの１１株hia遺伝子を含む(図１Ａ)。このプラスミドは組換えＨiaを発現するために使用した(下記の実施例９)。
【００９１】
実施例２
この実施例は抗Ｍoraxella catarrhalis野生株高分子量アドヘシン抗体によるrＨiaの識別を例示するものである。
【００９２】
インフルエンザ菌のＨia蛋白質と前述した米国特許第５,８０８,０２４号の中でＭ.catarrhalis２００kＤa蛋白質として分類されるＭoraxella catarrhalis高分子量アドヘシン(図２８)との間にはいくらかの配列不変性が認められる。米国特許第５,８０８,０２４号の記載では、Ｍ.catarrhalis野生株２００kＤa蛋白質がゲル精製され、テンジクネズミの抗野生株２００kＤa抗体が生成された。Ｔ７ hia遺伝子はプラスミドＤＳ-２００８-２-３から発現され、rＨia蛋白質を含む細胞培養物がニトロセルロース膜に電気泳動的に転写された。抗野生株２００kＤa抗体を使用した免疫ブロット分析から、この抗体が図２に見られるように、rＨia蛋白質を認識することが示された。
【００９３】
実施例３
この実施例はＴ７ hia(１１)遺伝子カセットのタンデムコピーを含むプラスミドＤＳ-２０９２-１およびＤＳ-２０９２-４０の構造を説明するものである。
【００９４】
全長のそろった組換えＨia蛋白質の生成を向上させるために、菌株１１のhia遺伝子(実施例１)を含むＴ７ hia遺伝子カセットのタンデムコピーを単一のベクターに挿入した。プラスミドＤＳ-２００８-２-３をＢgl IIで直線化させ、脱リン酸化した。プラスミドＤＳ-２００８-２-３はまた、Ｔ７ hia遺伝子カセットを切り取るためにＢgl IIおよびＢaｍＨ Iによっても切断された。このＴ７ hia断片を直線化したベクターに連結し、反時計回り方向に配向して２つのＴ７ hia遺伝子コピーを含むプラスミドＤＳ-２０９２-１(a,a)および反対方向に配向してタンデムコピーを含むプラスミドＤＳ-２０９２-４０(a,c)(図３)を生成した。どちらの作製試料からもrＨia発現における顕著な向上は認められなかった(下記の実施例９参照)。
【００９５】
実施例４
この実施例は末端欠失した菌株１１のhia遺伝子を発現するプラスミドの作製を説明するものである。
【００９６】
Ｔ７ hia遺伝子カセットの単一またはタンデムのコピーからのrＨia蛋白質生成量は非常に低く、この蛋白質は(下記の実施例９で説明するように)Ｅ.coliに対する毒性を有するようであった。インフルエンザ菌のＨiaは表面露出したアドヘシン分子であるので、分泌をするためにはシグナル配列または補助蛋白質のいずれかを使用しなければならないが、しかし関連の補助遺伝子は判明していない。もしもＥ.coli中での組換え蛋白質発現のためにシグナル配列が除去された場合、rＨiaは封入体として発現され、毒性効果が低減される可能性がある。推定されるシグナル配列および切断部位を分類し、Ｎ末端で末端欠失したrＨia蛋白質を発現する４種類の作製試料を設計した(図４)。菌株１１のhia遺伝子では開始コドンから約５００bpに独特のＳty I切断部位が存在する。プラスミドＤＳ-２００８-２-３をＮde IおよびＳty Iで切断し、５.７kbのベクター断片を精製した(図５Ａ)。末端欠失部位からＳty I切断部位までを増幅するためにＰＣＲプライマーを設計し、末端欠失したクローンを選別するためにアンチセンスプライマーに独特のＮhe I切断部位を導入した(図５Ｂ)。増幅した断片は、より操作を容易にするためにpＣＲII中でサブクローン化し、プラスミドＤＳ-２１５３Ｒ-１-２(Ｅ２１)、ＤＳ-２１６５-４-８(Ｔ３３)、ＤＳ-２１５３-３-５(Ｖ３８)、およびＤＳ-２１５３-４-４(Ｎ５２)を生成した。このpＣＲII hiaプラスミドをＮde IおよびＳty Iで切断し、断片をＤＳ-２００８-２-３から得たベクター片と連結した。プラスミドＤＳ-２１８６-１-１(Ｅ２１)、ＤＳ-２２０１-１(Ｔ３３)、ＤＳ-２１８６-２-１(Ｖ３８)、およびＤＳ-２１６８-２-６(Ｎ５２)を、カッコ内に示したＴ７プロモーターおよび末端欠失したhia遺伝子を含ませて生成した。これらのプラスミドは組換えＨiaを発現させるために使用した(下記の実施例９参照)。
【００９７】
実施例５
この実施例はＴ７ Ｖ３８ hia(１１)カセット、Ｅ.coli cer遺伝子、およびカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＢＫ-９６-２-１１の作製を説明するものである。
【００９８】
プラスミドＤＳ-１８４３-２は多数のクローン化部位および２つの転写終結部がＥcoＲ IおよびＰst I部位の間でオリゴヌクレオチド上に導入され、これによってクロラムフェニコールおよびアンピシリン耐性遺伝子の両方が破壊されたpＢＲ３２８を基にしたプラスミドである(図６Ｂ)。pＵＣ-４Ｋから得たカナマイシン耐性遺伝子をＳal I部位に挿入し、カナマイシン耐性でかつテトラサイクリン感受性のプラスミドＤＳ-２１４７-１を生成した。プラスミドＤＳ-２２２４-１-４はオリゴヌクレオチドから作製してＢaｍＨ I切断部位に接する合成のＥ.coli cer遺伝子(ref.１５)を含むpＵＣプラスミドである。このcer遺伝子の２９０bpのＢaｍＨ I断片をＤＳ-２１４７-１のＢaｍＨ I部位に挿入してプラスミドＢＫ-２-１-２を作製した。その結果、このpＢＲを基にしたプラスミドは多数のクローン化部位、カナマイシン耐性遺伝子およびcer遺伝子を含む。プラスミドＢＫ-２-１-２はＢgl IIで直線化し、脱リン酸化した。プラスミドＤＳ-２１８６-２-１をＢgl IIおよびＢaｍＨ Iで切断し、３.６kbのＴ７ Ｖ３８ hia断片をＢＫ-２-１-２に挿入してプラスミドＢＫ-９６-２-１１を作製した(図６Ａ)。
【００９９】
実施例６
この実施例はＥ.coli cer遺伝子の存在下で全長のそろったＮＴＨi菌株３３のhia遺伝子を発現するプラスミドＤＳ-２２４２-１およびＤＳ-２２４２-２の作製を説明するものである。
【０１００】
ＮＴＨi菌株３３から染色体ＤＮＡを精製し、オリゴヌクレオチド５０３９.ＳＬおよび５０４０.ＳＬ(図１７)を使用してＰＣＲ増幅を実施した。センスプライマー(５０４０.ＳＬ)は菌株１１のhiaの５’隣接配列を基にして設計したものであって、ＮＴＨi ＨiaおよびＨib Ｈsf蛋白質のアミノ末端配列を保存していた。アンチセンスプライマー(５０３９.ＳＬ)は実施例１で述べたものと同じであって、ＨiaおよびＨsf蛋白質のカルボキシ末端配列の保存を基本とした。菌株３３の３kbのhia ＰＣＲ断片をpＣＲ II中でクローン化し、プラスミドＤＳ-１９１７-３-８を作成した。
【０１０１】
全長のそろった菌株３３ hia遺伝子を発現させるために、この遺伝子の５’末端の、開始コドンからＡlｗＮ I切断部位まで(図７Ｂ)の、およそ１０６bpをオリゴヌクレオチドから合成した。プラスミドＤＳ-１９１７-３-８をＡlｗＮ IおよびＢaｍＨ Iで切断し、hia遺伝子を含む約２.９kbの断片を精製した。プラスミドpＴ７-７をＮde IおよびＢaｍＨ Iで切断し、Ｎde I-ＡlｗＮ IオリゴヌクレオチドおよびＡlｗＮ I-ＢaｍＨ I hia断片をこのpＴ７-７ベクターに連結してプラスミドＤＳ-２１０３-４を作製した。
【０１０２】
Ｅ.coli cer遺伝子を含ませ、カナマイシンによる選択を使用するために、Ｔ７ hia(３３)遺伝子カセットを含むＢgl II-ＢaｍＨ I断片をＤＳ-２１０３-４から切り取り、Ｂgl IIで切断されて脱リン酸化されたＢＫ-２-１-１中でクローン化した。プラスミドＤＳ-２２４２-１およびＤＳ-２２４２-２は反対方向に配向したＴ７ hia(３３)遺伝子カセットの単一コピー、Ｅ.coli cer遺伝子、およびカナマイシン耐性遺伝子を含む(図７Ａ)。
【０１０３】
実施例７
この実施例は末端欠失したＶ３８菌株３３のhia遺伝子をもつＴ７ hia遺伝子カセット、Ｅ.coli cer遺伝子、およびカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＳ-２３４０-２-３の作製を説明するものである。
【０１０４】
ＮＴＨi菌株３３ hia遺伝子の、Ｖ３８開始コドンから内側のＳnaＢ I切断部位に至るまでの、５’末端の２５０bp断片を増幅するためにＰＣＲプライマーを設計した。クローン化を目的として５’末端にＮde I切断部位を追加し、鋳型としてプラスミドＤＳ-２２４２-１を使用してこの断片を増幅した。この構成図式は図８Ａに示されており、ＰＣＲプライマーは図８Ｂに示されている。この断片をpＣＲ IIにクローン化し、プラスミドＤＳ-２３２８-１-１を作製した。ＤＳ-２２４２-１をＮde IおよびＳnaＢ Iで切断し、８.５kbのベクター断片を精製した。ＤＳ-２３２８-１-１をＮde IおよびＳnaＢ Iで切断し、その０.２５kbの５’hia断片をＤＳ-２２４２-１から得た８.５kbのベクター断片と連結してプラスミドＤＳ-２３４０-２-３を作製した。
【０１０５】
実施例８
この実施例はＴ７ Ｖ３８ hia(１１)またはＴ７ Ｖ３８ hia(３３)遺伝子カセットのタンデムコピーをそれぞれと、Ｅ.coli cer遺伝子、およびカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＳ-２４４７-２およびＤＳ-２４４８-１７の作製を説明するものである。
【０１０６】
Ｔ７ Ｖ３８ hia(１１)遺伝子カセットを含むプラスミドＢＫ-９６-２-１１をＢgl IIで直線化し、脱リン酸化した。ＤＳ-２１８６-２-１から得たＢgl II-ＢaｍＨ I Ｔ７ Ｖ３８ hia(１１)遺伝子カセットをＢＫ-９６-２-１１に連結し、同じ配向でＴ７ Ｖ３８ hia(１１)遺伝子のタンデムコピーを含むプラスミドＤＳ-２４４７-２を作製した(図９Ａ)。
【０１０７】
プラスミドＤＳ-２３４０-２-３をＥcoＲ Iで切断し、そのＴ７ Ｖ３８ hia(３３)遺伝子カセットを、ＥcoＲ Iで切断して脱リン酸化したpＵＣ-ＢgＸbにサブクローン化した。その結果得られたプラスミドＤＳ-２４４０-２をＢgl IIおよびＢaｍＨ Iで切断してＴ７ Ｖ３８ hia(３３)カセットを放出させ、Ｂgl IIで直線化して脱リン酸化したＤＳ-２３４０-２-３とそれを連結した。プラスミドＤＳ-２４４８-１７は同じ配向でタンデムのＴ７ Ｖ３８ hia(３３)遺伝子を含む(図９Ｂ)。
【０１０８】
実施例９
この実施例は全長のそろったおよび末端欠失した組換えhia遺伝子の発現を説明するものである。
【０１０９】
先行の実施例で説明したようにして調製した発現プラスミドのＤＮＡを、ＢioＲad社のエレクトロポレータを使用して電子的に受容可能となったＥ.coli ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞に導入した。細胞は適切な抗生物質選別を使用して、ラクトースを１.０％になるまで加える前に、Ａ578が０.３となるまでＮＺＣＹＭ培地中で３７℃にて４時間成育させた。サンプルはＳＤＳ-ＰＡＧＥ分解液＋負荷バッファで０.２ＯＤ/μlとなるよう調整し、それぞれの蛋白質サンプルを同じ量でＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル(ref.２２)に流した。図１０は種々の作製試料からのrＨia(１１)蛋白質相対生成量を図解したものである。パネルＡに見られるように、rＨiaのサイズが低下するにつれて生成量の増加が認められる。Ｖ３８-(レーン５)およびＮ５２-末端欠失rＨia(レーン６)はそれらのさらに長い相当物質(レーン２、３、４)よりも有意差をもって高い発現レベルを有する。加えて、パネルＢはＶ３８ rＨiaの生成がcer遺伝子の存在下で明らかに増加することを示している。
【０１１０】
実施例１０
この実施例はrＨia蛋白質の精製について説明するものである。
【０１１１】
すべての組換えＨia蛋白質はＥ.coli中で封入体として発現され、同じ手法によって精製された(図１１)。５００ｍlの培養物から得たＥ.coli細胞ペレットを０.１ＭのＮaＣlを含むpＨ８.０の５０ｍＭトリス塩酸５０ｍl中に再懸濁し、超音波破砕した。この抽出物を２０,０００×gで３０分間遠心分離し、その結果生じた上清を廃棄した。このペレット(ＰＰＴ1)をさらに０.５％Ｔriton Ｘ-１００および１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍlの５０ｍＭトリス塩酸、pＨ８.０で抽出処理し、それから２０,０００×gで３０分間遠心分離して上清を廃棄した。このペレット(ＰＰＴ2)をさらに１％のオクチルグルコシドを含む５０ｍlの５０ｍＭトリス塩酸、pＨ８.０で抽出し、それから２０,０００×gで３０分間遠心分離して上清を廃棄した。
【０１１２】
以上の抽出処理後に結果として得られたペレット(ＰＰＴ3)は封入体を含んでいる。このペレットを６Ｍのグアニジンおよび５ｍＭのＤＴＴを含む６ｍlの５０ｍＭトリス塩酸、pＨ８.０に溶解した。この溶液に１２ｍlの５０ｍＭトリス塩酸、pＨ８.０を加え、混合液を２０,０００×gで３０分間遠心分離した。この上清(ＳＵＰ4)を終濃度７％のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)４０００で沈降させた。その結果生じたペレット(ＰＰＴ5)を２０,０００×gで３０分間遠心分離して除去し、上清を５０％飽和の硫酸アンモニウムで沈降させた。硫酸アンモニウムによる沈降物は２０,０００×gで３０分間遠心分離して採取した。結果として得られたペレット(ＰＰＴ6)を６Ｍのグアニジン塩酸および５ｍＭのＤＴＴを含む２ｍlの５０ｍＭトリス塩酸、pＨ８.０に溶解し、この透明な液体を、２Ｍのグアニジン塩酸を含む５０ｍＭトリス塩酸、pＨ８.０で平衡化したＳuperdex２００ゲル濾過カラムで精製した。画分はＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析し、精製されたrＨiaを含む画分をプールし、４℃でＰＢＳに対して一晩透析し、その後、２０,０００×gで３０分間遠心分離した。これらの条件では蛋白質は可溶性を維持しており、−２０℃で保存するためにこのrＨia調製液にグリセロールを終濃度２０％で加えた。精製されたＶ３８ rＨia(１１)およびＶ３８ rＨia(３３)のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析は図１２に図解されている。精製Ｖ３８ rＨia蛋白質の平均収率は約１０ｍg/Ｌ培地である。
【０１１３】
rＨiaの安定性を調べるために、精製したＶ３８ rＨia(１１)蛋白質は４℃でグリセロールなしかまたは入れて保存するか、あるいはグリセロールを入れて-２０℃で保存した。この蛋白質は３つの条件すべてにおいて安定であることが分かり、凍結と解凍を繰り返して少なくとも８週間は完全さを維持した(図１３)。
【０１１４】
実施例１１
この実施例はＶ３８ rＨia(１１)およびＶ３８ rＨia(３３)蛋白質の免疫原性を説明するものである。
【０１１５】
日程１において完全フロイントアジュバント(ＣＦＡ、Ｄifco)で乳化した５μgの抗原を筋肉内(i.ｍ.)注入して二匹のテンジクネズミ(Ｃharles Ｒiver)を免疫感作させることによってrＨia蛋白質に対する高度免疫抗血清を生成させた。日程１４および２８において不完全フロイントアジュバント(ＩＦＡ)に加えた蛋白質５μgを投与して動物を追加免疫応答させ、日程４２において血清を集めた。免疫原として熱で不活化したバクテリア調製物(１回の投与量１×１０8cfu)を使用した以外は同じプロトコルを使用して、抗Ｈib菌株ＭinnＡおよび抗ヘモフィルス属菌株ＡＴＣＣ９００６抗血清を作製した。
【０１１６】
Ｖ３８ rＨia蛋白質の免疫原性を調べるために、５匹のＣＤ-１マウス(Ｃharles Ｒiver,Ｑuebec)の複数グループを日程１および２８において、リン酸アルミニウム(aluｍ)の存在下(１回の投与量１.５ｍg)で０.３、１、３、および１０μgの抗原によりs.c.免疫感作させた。血液サンプルを日程１、２８および４２において集めた。顕著に抗Ｖ３８ rＨia抗体を生成したマウスは抗体０.３μgを１回注入されても応答を示し(図１４、パネルＡ)、両方の蛋白質ともに封入体抽出および可溶化処理の後でも免疫原性を維持することを示唆している。菌株１１または３３に由来するＶ３８ rＨia蛋白質によって誘導される抗体力価において統計学的に顕著な差異は認められなかった。
【０１１７】
ＢＡＬＢ/cマウスにおいてＶ３８ rＨia(１１)蛋白質の免疫原性を調べるために、５匹の動物(Ｃharles Ｒiver,Ｑuebec)の複数グループを日程１、２８および４２において、リン酸アルミニウムの存在下(１回の投与量１.５ｍg)で抗原０.３、１、３、および１０μgによりs.c.免疫感作させた。血液サンプルは日程１、１４、２８、４２および５６において集めた。すべてのグループにおいて高い抗体力価が認められ、この蛋白質が１回の投与量０.３μgにおいてさえ強度の免疫原性であることを示した(図１５、パネルＡ)。
【０１１８】
テンジクネズミにおいてＶ３８ rＨia(１１)蛋白質の免疫原性を調べるために、５匹の動物(Ｃharles Ｒiver,Ｑuebec)の複数グループを日程１、２８および４２において、リン酸アルミニウムの存在下(１回の投与量１.５ｍg)で抗原０.３、１、３、および１０μgによりs.c.免疫感作させた。血液サンプルは日程１、１４、２８、４２および５６において集めた。すべてのグループにおいて高い抗体力価が認められ、この蛋白質がテンジクネズミにおいてもまた強度の免疫原性であることを示した(図１５、パネルＢ)。
【０１１９】
実施例１２
この実施例は菌血症の無抵抗な幼齢ラットのモデルにおいて抗rＨia抗体によって生じる防御の分析を説明するものである。
【０１２０】
妊娠中のＷistarラットをＣharles Ｒiverから入手した。インフルエンザ菌b型の菌血症モデルでは、６〜１０匹の５日齢の幼齢ラットのグループを、テンジクネズミの抗rＨiaまたは抗菌株ＭinnＡ抗血清０.１ｍl、背面 でs.c.注入した。比較対照の動物には免疫感作前の血清のみを注入した。２０時間後、元気に生育したＨib菌株ＭinnＡを２００〜２４０コロニー形成ユニット(cfu)で(０.１ｍl)腹腔内(i.p.)抗原投与した。血液サンプルを抗原投与後２０時間に、イソフルラン麻酔して心臓に針を刺して集め、チョコレート寒天培地にまいた。１日後、コロニーをカウントしてその結果をフィッシャー検定(Ｆisher’s Ｅxact test)によって統計学的に分析した。
【０１２１】
インフルエンザ菌a型菌血症モデル(ref.２３)では、９〜１０匹の５日齢の幼齢ラットのグループを、テンジクネズミの抗rＨiaまたは抗菌株ＡＴＣＣ９００６抗血清０.１ｍl、背面でs.c.注入した。比較対照グループの動物にはテンジクネズミの免疫感作前の血清を注入した。２０時間後、元気に生育したインフルエンザ菌a型菌株ＡＴＣＣ９００６を(０.１ｍl)１００,０００cfuで動物にi.p.抗原投与した。血液サンプルを抗原投与の２０時間後に集めて上述のように分析した。
【０１２２】
後述の表１および２に示したように、テンジクネズミの抗rＨia(１１)または抗Ｖ３８ rＨia(１１)抗血清のいずれかで受動免疫感作された幼齢ラットは、菌血症を引き起こしたインフルエンザ菌a型またはb型に対してすべてが顕著に防御された。これらの結果は、インフルエンザ菌a型またはb型によって引き起こされる菌血症に対して動物を防御することにおいて、わずかに末端欠失したＨia蛋白質(Ｖ３８ rＨia)に対応して生成した抗体が全長のそろった蛋白質に対応して生成したものと同程度に効果的であることを示している。ＮＴＨi由来の組換え蛋白質によって生じる、被包性のバクテリアによって引き起こされる侵襲性の疾病に対するそのような防御はrＨia蛋白質のワクチン抗原としての有用性を説明するものである。
【０１２３】
実施例１３
この実施例は鼻咽頭部でのコロニー形成のチンチラのモデルにおいて、Ｖ３８ rＨia蛋白質の免疫感作によって生じる防御を説明するものである。
【０１２４】
鼻咽頭部のコロニー形成モデルはＹangらによって報告された(ref.２０)。このモデルは、ＨＭＷアドヘシンを産生するＮＴＨi菌株については適切であるが、しかしＨiaを産生する菌株では同じ条件で再現性のあるコロニー形成は達成できなかった。原型のＨia産生ＮＴＨi菌株１１で繰り返したコロニー形成の試みは不成功であった。原型のＨＭＷ産生ＮＴＨi菌株１２ではわずか１０8cfuしか必要としなかったのに比べて、ＮＴＨi菌株３３では１回の植菌当たり５×１０8cfuでコロニー形成が達成された。これらの条件下では、１００μgのＶ３８ rＨia(３３)で免疫感作され、同様のＮＴＨi菌株３３で抗原投与された動物において部分的な防御が認められた。
【０１２５】
実施例１４
この実施例はインフルエンザ菌株に由来する追加のhia遺伝子のクローン化および配列分析を説明するものである。
【０１２６】
保存されたプロモーター、hiaおよびhsf遺伝子および蛋白質のＮ末端およびＣ末端配列に基づいて、ＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチド(５０４０.ＳＬおよび５０３９.ＳＬ)を設計した(図１７)。ＰＣＲ増幅のための選択菌株は抗rＨia(１１)抗血清との反応性に基づいて選んだ。
【０１２７】
ＮＴＨi菌株１２、２９、３２、Ｍ４０７１、Ｋ９および、Ｋ２２およびヘモフィルスc型菌株ＡＰIから染色体ＤＮＡを調製した。ＰＣＲ増幅は以下のようにして実施した。それぞれの反応混合液には５〜１００ngのＤＮＡ、それぞれ１μgのプライマー、５ユニットのtaq＋またはtsg＋(Ｓangon)またはtaqプラスロング(Ｓtratagene)、２ｍＭのdＮＴＰs、２０ｍＭのトリス塩酸(pＨ８.８)、１０ｍＭの塩化カリウム、１０ｍＭの硫酸アンモニウム、２ｍＭの硫酸マグネシウム、０.１％のＴriton Ｘ-１００、ＢＳＡを含ませた。サイクル条件は、９５℃で１分間、その後、９５℃で３０秒、４５℃で１分間、７２℃で２分間のサイクルを２５サイクル行い、その後、７２℃で１０分間とした。
【０１２８】
菌株３３のhia遺伝子のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列が図１８に示されている。予測された菌株３３由来のＨia蛋白質は１０３.６kＤaの分子量を有し、pIが９.４７であった。菌株３２のhia遺伝子のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列は図１９に示されている。予測された菌株３２由来のＨia蛋白質は７０.４kＤaの分子量を有し、pIが５.６７であった。残基４９３と４９６との間にはＫＤＥＬ配列が存在する。そのような配列は小胞体への固定蛋白質に付随するものであった。由来する菌株３２のＨia蛋白質は顕著により小さくかつ顕著に異なるpIを有するが、しかしながら他のＨia蛋白質に存在する特色の多くを含んでいる。
【０１２９】
菌株２９のhia遺伝子のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列が図２０に示されている。予測された菌株２９のＨia蛋白質は１１４.４kＤaの分子量および７.５８のpIを有する。菌株Ｋ２２のhia遺伝子のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列が図２３に示されている。予測された菌株Ｋ２２のＨia蛋白質は１１４.４kＤaの分子量および７.５８のpIを有する。ＮＴＨi菌株２９およびＫ２２に由来するＨia配列は同一であることが判明した。菌株２９はオハイオ州クリーブランドの中耳炎の生後７カ月の乳児から単離され、それに対して菌株Ｋ２２はオーストラリアのキンバリー近郊のアボリジニから単離された。
【０１３０】
菌株４０７１のhia遺伝子のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列が図２１に示されている。予測されたＭ４０７１のＨia蛋白質は１０３.４kＤaの分子量および９.４９のpIを有する。残基５３４と５３７との間にはＫＤＥＬ配列が存在する。
【０１３１】
菌株Ｋ９のhia遺伝子のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列が図２２に示されている。予測された菌株Ｋ９のＨia蛋白質は１１３.８kＤaの分子量および６.４５のpIを有する。
【０１３２】
ヘモフィルスc型菌株ＡＰIのhia遺伝子のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列が図２４に示されている。予測されたＡＰIのＨia蛋白質は２４９.４kＤaの分子量および５.３４のpIを有する。c型菌株ＡＰIの由来するＨia/Ｈsf配列は６０残基の挿入部があることを除いて公表されているb型のＨsf配列と殆ど同一である。ここに提示したＮＴＨiに基づくＨia蛋白質はa型およびb型感染の受動モデルにおいて防御をするので、b型とc型蛋白質との間の配列類似性に起因するc型の疾病に対してもまた防御をすることはありそうである。
【０１３３】
菌株１２のhia遺伝子座のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列が図２５に示されている。ＮＴＨi菌株１２はＨiaを生成しない。しかしながら、hia遺伝子部分はＰＣＲ増幅可能であり、ＳＢ１２細胞溶解物と抗rＨia抗体とのつじつまの合わない陽性の反応性が存在し、サザンブロットでは菌株１１のhia遺伝子の３’末端に由来するＤＮＡプローブとの反応性がある。ＰＣＲ増幅したＤＮＡの分析から、上流ＨI１７３２関連遺伝子の３’末端の１kbおよびhia遺伝子の３’末端の０.８kbを含む１.８kbの断片が明らかになった。
【０１３４】
菌株１２中のこれら２つの遺伝子の推定される接合部を交差して増幅するであろうプライマーを使用してＰＣＲ増幅したところ、この遺伝子座の遺伝子組成が確認された。したがって、菌株１２はhia遺伝子の５’末端の欠失を生じたためにＨiaを生成しないようであった。図２７は菌株１２の上流ＯＲＦとＲdゲノム由来ＨI１７３３蛋白質との配列比較を示すものである。相同の領域によって、これら２つの蛋白質は９５％が同一である。
【０１３５】
ＮＴＨi菌株３３、３２、２９、Ｋ２２、Ｍ４０７１、１１、９およびc型菌株ＡＰIからの由来Ｈia配列のアラインメントが、インフルエンザ菌b型Ｈsf、ＲdゲノムのaidＡ類似(Ｈsf/Ｈia)ＨI１７３２遺伝子、と菌株４２２３およびＬＥＳ-１のＭ.catarrhalis ２００kＤa蛋白質と比較して図２８に示されている。ＨI１７３２蛋白質の早期末端欠失の結果生じる、Ｒdゲノム配列内のフレーム移動が認められる。hiaに関連する付加的な下流配列はここに含まれる。配列の下にある星印は保存された残基を示している。Ｎ末端(約５０残基)およびＣ末端配列(約１５０残基)はヘモフィルス菌株の中で高度に保存されており、Ｍ.catarrhalisの相応部分とのある程度の類似性は明白である。配列分析から、Ｈia蛋白質について２つの可能性のある遺伝子集団が存在し、１つは原型の菌株１１に関係し、他方はさらに密接に菌株３３に関係することは明らかである。菌株１１およびＫ９の蛋白質は、より一層ヘモフィルス菌株のb型、c型またはd型由来のＨsf蛋白質に類似しているようであるが、一方で、菌株３３、３２、２９、Ｋ２２およびＭ４０７１の蛋白質は第２の集団を構成するようである。
【０１３６】
実施例１５
この実施例は末端欠失したＳ４４ 菌株１１ hia遺伝子をもつＴ７ hia遺伝子カセット、Ｅ.coli cer遺伝子、およびカナマイシン抗生物質耐性遺伝子を含むプラスミドＪＢ-２９３０-３の作製、およびＳ４４ Ｈia蛋白質の発現を説明するものである。
【０１３７】
Ｓ４４アミノ酸から内側のＳty I切断部位までのＮＴＨi菌株１１ hia遺伝子のＳ４４ Ｈia Ｎ末端(図２９)を増幅するためにＰＣＲプライマーを設計した。クローン化を目的として５’末端にＮde I切断部位を追加し、鋳型としてプラスミドＤＳ-２２４２-１を使用してこの断片を増幅した。この断片をpＣＲ IIにクローン化してプラスミドＪＢ-２９１０-１-１を作製した。この構成図式を図３０に示す。プラスミドＪＢ-２９１０-１-１をＮde IおよびＳty Iで切断し、５’ＰＣＲ hia断片を単離した。Ｖ３８ hia遺伝子を含むプラスミドIＡ-４６-５をＮde IおよびＳty Iで切断し、大きい方の約８.５kbの断片を精製した。これら２つの精製断片を連結してプラスミドＪＢ-２９１７-１を作製した。その後、このプラスミドをＮde Iで切断し、ウシ腸のホスファターゼ(ＣＡＰ)で処理し、プラスミドIＡ-４６-５から得たＴ７プロモーターをその中でクローン化した。このプロモーターはIＡ-４６-５のＮde I切断により切り取った。結果として得られたプラスミドＪＢ-２９２５-３をＢgl IIおよびＢaｍＨ Iで切断してhia遺伝子を単離した。Ｂgl II/ＣＡＰ処理したプラスミドＢＫ-２-１-２にこの断片を連結し、プラスミドＪＢ-２９３０-３を作製した。このプラスミドはＴ７プロモーターＳ４４ hia遺伝子およびＥ.coli cer遺伝子を含み、カナマイシン耐性である。
【０１３８】
発現を調べるため、組換えＳ４４ hiaベクターをＥ.coli ＢＬ２１(ＤＥ３)に転換した。Ｅ.coliにおける発現のための手法は実施例９に記載したりである。図３１のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析は、２つの異なるベクター、(上述の)ＪＢ-２９３０-３およびpＥＴベクターのIＡ-１９１-３-１からの組換えＳ４４ hiaの発現を示している。プラスミドIＡ-１９１-３-１は、それがlacIqリプレッサーを含むpＥＴベクターであり、したがって生成するＳ４４ Ｈiaの量がＪＢ-２９３０-３からのＴ７ Ｓ４４よりも少ないということを除くとＪＢ-２９３０-３と同じである。このプラスミドは、プラスミドＪＢ-２９３０-３とともに、図３２に示されている。図３１は二重のバンド(レーン３)としておよそ１１６kＤaのＳ４４ Ｈiaを示している。ＪＢ-２９３０-３から精製したＳ４４ hiaを使用した追加の分析によると、この二重バンドの下側のバンドはＣ末端の９４アミノ酸の末端欠失を有するがＮ末端と考えられるものはそのまま存在することが判明した。末端欠失したＨiaの単離に使用した精製方法は実施例１０に記載した通りであった。
【０１３９】
(開示の概要)
本開示の概要では、本発明は新たに単離精製した、ヘモフィルスから得たインフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)蛋白質の全長を有するものおよびＮ末端欠失したものをコードし、防御力のあるＨia蛋白質を遺伝子組換えにより生成することを可能にする核酸分子を提供する。本発明の範囲内での変更態様は可能である。
【０１４０】
【表１】
【０１４１】
【表２】
【０１４２】
参考文献
【０１４３】
【表３】
【０１４４】
【表４】
【０１４５】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１Ａ】Ｔ７プロモーターおよび完全長ＮＴＨi菌株１１のhia遺伝子を含むプラスミドＤＳ-２００８-２-３の制限地図を示す図である。
【図１Ｂ】菌株１１のhia遺伝子をＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。センス鎖(５０３８.ＳＬ):配列番号１、エンコードされているアミノ酸配列番号２；アンチセンス鎖(５０３９.ＳＬ):配列番号３、相補配列番号４、エンコードされているアミノ酸配列番号５。制限酵素部位はＢ、ＢaｍＨ I；Ｂg、Ｂgl II；Ｈ、Ｈind III；Ｎ、Ｎde I；Ｐs、Ｐst I；Ｓty、Ｓty Iである。他の略語はＴ７p、Ｔ７プロモーター；ＡpＲ、アンピシリン耐性である。
【図２】抗ネイティブＭoraxella catarrhalisの高分子量アドヘシン抗体による、完全長rＨiaタンパク質の認識のイムノブロットを示す図である。レーン１、非誘導型ＤＳ-２０４３-１；レーン２、４時間かけて誘導されたＤＳ-２０４３-１；レーン３、非誘導型ＤＳ-２０４３-２；レーン４、４時間かけて誘導されたＤＳ-２０４３-２；レーン５、分子量マーカー。ＤＳ-２０４３-１およびＤＳ-２０４３-２は、ＢＬ２１(ＤＥ３)内のpＴ７hia(１１)の独立したクローンである。
【図３】菌株１１のhia遺伝子用のＴ７hia遺伝子カセットのタンデムコピーを含むプラスミドＤＳ-２０９２-１およびＤＳ-２０９２-４０の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢaｍＨ I；Ｂg、Ｂgl II；Ｈ、Ｈind III；Ｐs、Ｐst I；Ｘb、Ｘba Iである。他の略語はＣＡＰ、子牛のアルカリホスファターゼ；Ｔ７p、Ｔ７プロモーター；ＡpＲ、アンピシリン耐性である。
【図４】菌株１１のＨiaタンパク質の切断部位(配列番号６)を示す図である。
【図５Ａ】菌株１１からの切断型hia遺伝子を発現するプラスミドの構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢaｍＨ I；Ｂg、Ｂgl II；Ｈ、Ｈind III；Ｎ、Ｎde I；Ｎhe、Ｎhe I；Ｐs、Ｐst I；Ｒ、ＥcoＲ I；Ｓty、Ｓty I；Ｘb、Ｘba Iである。他の略語はＴ７p、Ｔ７プロモーター；ＡpＲ、アンピシリン耐性；ＫanＲ、カナマイシン耐性である。
【図５Ｂ】切断型遺伝子用に５’断片をＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。Ｅ２１切断部:センス(５５２４.ＳＬ):配列番号７、エンコードされているアミノ酸配列番号８；Ｔ３３切断部:センス(５５２５.ＳＬ):配列番号９、エンコードされているアミノ酸配列番号１０；Ｖ３８切断部:センス(５５２６.ＳＬ):配列番号１１、エンコードされているアミノ酸配列番号１２；Ｎ５２切断部:センス(５５２７.ＳＬ):配列番号１３、エンコードされているアミノ酸配列番号１４；アンチセンス(５５２８.ＳＬ):配列番号１５、相補配列番号１６、エンコードされているアミノ酸配列番号１７。
【図５Ｂ１】切断型遺伝子用に５’断片をＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。Ｅ２１切断部:センス(５５２４.ＳＬ):配列番号７、エンコードされているアミノ酸配列番号８；Ｔ３３切断部:センス(５５２５.ＳＬ):配列番号９、エンコードされているアミノ酸配列番号１０；Ｖ３８切断部:センス(５５２６.ＳＬ):配列番号１１、エンコードされているアミノ酸配列番号１２；Ｎ５２切断部:センス(５５２７.ＳＬ):配列番号１３、エンコードされているアミノ酸配列番号１４；アンチセンス(５５２８.ＳＬ):配列番号１５、相補配列番号１６、エンコードされているアミノ酸配列番号１７。
【図６Ａ】ＮＴＨi菌株１１および大腸菌のcer遺伝子からのＶ３８hia遺伝子を含むプラスミドＢＫ-９６-２-１１の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢaｍＨ I；Ｂg、Ｂgl II；Ｋ、Ｋpn I；Ｎ、Ｎde I；Ｐ、Ｐst I；Ｒ、ＥcoＲ I；Ｓ、Ｓal I；Ｓｍ、Ｓｍa I；Ｓty、Ｓty I；Ｘb、Ｘba I；Ｘho、Ｘho Iである。他の略語はＴ７p、Ｔ７プロモーター；ＡpＲ、アンピシリン耐性；ＫanＲ、カナマイシン耐性；ＣＡＰ、子牛のアルカリホスファターゼ；tt１、trpＡからの転写ターミネーター１；tt２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図６Ｂ】複数のクローン部位および転写ターミネーターを構築するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。「Ｒ」および「Ｐs」はＥcoＲ IまたはＰst Iの端部とオーバーラップする末端を示すが、これらの部位を再び生成するわけではない。上側鎖(配列番号５０)、下側(配列番号５１)。
【図７Ａ】Ｔ７プロモーターおよび完全長のＮＴＨi菌株３３のhia遺伝子、大腸菌のcer遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＳ-２２４１-１およびＤＳ-２２４２-２の構築を示す図である。制限酵素部位はＡ、ＡlｗＮ I；Ｂ、ＢaｍＨ I；Ｂg、Ｂgl II；Ｈ、Ｈind III；Ｋ、Ｋpn I；Ｎ、Ｎde I；Ｐs、Ｐst I；Ｒ、ＥcoＲ I；Ｓ、Ｓal I；Ｓｍ、Ｓｍa I；；Ｘb、Ｘba I；Ｘho、Ｘho Iである。他の略語はＴ７p、Ｔ７プロモーター；ＡpＲ、アンピシリン耐性；ＫanＲ、カナマイシン耐性；tt１、trpＡからの転写ターミネーター１；tt２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図７Ｂ】鎖(配列番号５２)、相補鎖(配列番号５３)、およびエンコードされているアミノ酸配列(配列番号５４)をコードしている菌株３３のhia遺伝子の５’末端を生成するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。
【図８Ａ】Ｔ７プロモーターおよび菌株３３からのＶ３８遺伝子、大腸菌のcer遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＳ-２３４０-２-３の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢaｍＨ I；Ｂg、Ｂgl II；Ｈ、Ｈind III；Ｎ、Ｎde I；Ｐs、Ｐst I；Ｒ、ＥcoＲ I；Ｓ、Ｓal I；Ｓn、ＳnaＢ I；；Ｘb、Ｘba Iである。他の略語はＴ７p、Ｔ７プロモーター；ＡpＲ、アンピシリン耐性；ＫanＲ、カナマイシン耐性；tt１、trpＡからの転写ターミネーター１；tt２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図８Ｂ】切断型遺伝子用の５’端をＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。センス(６２８６.ＳＬ):配列番号１６、エンコードされているアミノ酸配列番号１７；アンチセンス(６２８７.ＳＬ):配列番号１８、相補配列番号１９、エンコードされているアミノ酸配列番号２０。
【図９Ａ】Ｔ７のＶ３８hia(１１)およびＴ７のＶ３８hia(３３)遺伝子のタンデムコピーをそれぞれ含むプラスミドＤＳ-２４４７-２およびＤＳ-２４４８-１７の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢaｍＨ I；Ｂg、Ｂgl II；Ｈ、Ｈind III；Ｐs、Ｐst I；Ｒ、ＥcoＲ I；Ｓ、Ｓal I；Ｘb、Ｘba Iである。他の略語はＴ７p、Ｔ７プロモーター；ＡpＲ、アンピシリン耐性；ＫanＲ、カナマイシン耐性；ＣＡＰ、子牛のアルカリホスファターゼ；tt１、trpＡからの転写ターミネーター１；tt２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図９Ｂ】Ｔ７のＶ３８hia(１１)およびＴ７のＶ３８hia(３３)遺伝子のタンデムコピーをそれぞれ含むプラスミドＤＳ-２４４７-２およびＤＳ-２４４８-１７の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢaｍＨ I；Ｂg、Ｂgl II；Ｈ、Ｈind III；Ｐs、Ｐst I；Ｒ、ＥcoＲ I；Ｓ、Ｓal I；Ｘb、Ｘba Iである。他の略語はＴ７p、Ｔ７プロモーター；ＡpＲ、アンピシリン耐性；ＫanＲ、カナマイシン耐性；ＣＡＰ、子牛のアルカリホスファターゼ；tt１、trpＡからの転写ターミネーター１；tt２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図１０】rＨiaの発現を示す図である。パネルＡ:レーン１、誘導されていない完全長rＨia(１１)；レーン２、完全長rＨia(１１)；レーン３、Ｅ２１rＨia(１１)；レーン４、Ｔ３３rＨia(１１)；レーン５、Ｖ３８rＨia(１１)；レーン６、Ｎ５２rＨia(１１)。パネルＢ:レーン１、誘導されていないＶ３８rＨia(１１)；レーン２、Ｖ３８rＨia(１１)；レーン３、Ｖ３８rＨia(１１)/cer。
【図１１】rＨiaの精製スキームを示す図である。略語はＳＰ、上澄み；ＰＰＴ、沈殿；ＤＴＴ、ジチオスレイトール；ＯＧ、オクチルグルコシドであり、(x)は捨てられたことを意味する。
【図１２】パネルＡおよびＢを有し、精製されたrＨiaのＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を示す図である。パネルＡは菌株１１からの精製されたＶ３８rＨiaタンパク質を示し、パネルＢは菌株３３からのＶ３８rＨiaタンパク質を示す。レーン１、分子量マーカー；レーン２、全細胞の溶解物；レーン３、未精製抽出物；レーン４、精製されたrＨiaタンパク質。
【図１３Ａ】パネルＡ、ＢおよびＣを有し、Ｖ３８rＨia(１１)の安定性を示す図である。パネルＡは、グリセロールなしで４℃で保存されたサンプルを示す。パネルＢは、２０％グリセロールの存在下で４℃で保存されたサンプルを示す。パネルＣは、２０％グリセロールの存在下で-２０℃で保存されたサンプルを示す。レーン０はt0を示し、レーン１〜８は１〜８週間保存されたサンプルを示す。
【図１３Ｂ】パネルＡ、ＢおよびＣを有し、Ｖ３８rＨia(１１)の安定性を示す図である。パネルＡは、グリセロールなしで４℃で保存されたサンプルを示す。パネルＢは、２０％グリセロールの存在下で４℃で保存されたサンプルを示す。パネルＣは、２０％グリセロールの存在下で-２０℃で保存されたサンプルを示す。レーン０はt0を示し、レーン１〜８は１〜８週間保存されたサンプルを示す。
【図１３Ｃ】パネルＡ、ＢおよびＣを有し、Ｖ３８rＨia(１１)の安定性を示す図である。パネルＡは、グリセロールなしで４℃で保存されたサンプルを示す。パネルＢは、２０％グリセロールの存在下で４℃で保存されたサンプルを示す。パネルＣは、２０％グリセロールの存在下で-２０℃で保存されたサンプルを示す。レーン０はt0を示し、レーン１〜８は１〜８週間保存されたサンプルを示す。
【図１４Ａ】パネルＡおよびＢを有し、ＣＤ-１マウスのＶ３８rＨia(１１)またはＶ３８rＨia(３３)の免疫原性を示す図である。パネルＡは単一の免疫化後の応答を示し、パネルＢは最初の/追加の免疫化の応答を示す。
【図１４Ｂ】パネルＡおよびＢを有し、ＣＤ-１マウスのＶ３８rＨia(１１)またはＶ３８rＨia(３３)の免疫原性を示す図である。パネルＡは単一の免疫化後の応答を示し、パネルＢは最初の/追加の免疫化の応答を示す。
【図１５Ａ】ＢＡＬＢ/cマウスおよびモルモットのＶ３８rＨia(１１)の免疫原性を示す図である。図１５Ａはマウスにおける抗体の応答を示し、図１５Ｂはモルモットにおける応答を示す。
【図１５Ｂ】ＢＡＬＢ/cマウスおよびモルモットのＶ３８rＨia(１１)の免疫原性を示す図である。図１５Ａはマウスにおける抗体の応答を示し、図１５Ｂはモルモットにおける応答を示す。
【図１６】チンチラモデルにおける鼻咽頭コロニー形成に対するＶ３８rＨia(３３)の防御能力を示す図である。
【図１７】追加のhia遺伝子をＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。センス(５０４０.ＳＬ):配列番号２１、エンコードされているアミノ酸配列番号２２；アンチセンス(５０３９.ＳＬ):配列番号３、相補配列番号４、エンコードされているアミノ酸配列番号５。
【図１８Ａ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｂ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｃ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｄ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｅ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｆ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｇ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｈ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｉ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｊ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｋ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｌ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｍ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｎ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｏ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１９Ａ】ＮＴＨi菌株３２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２５)および演繹アミノ酸配列(配列番号２６)を示す図である。
【図１９Ｂ】ＮＴＨi菌株３２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２５)および演繹アミノ酸配列(配列番号２６)を示す図である。
【図１９Ｃ】ＮＴＨi菌株３２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２５)および演繹アミノ酸配列(配列番号２６)を示す図である。
【図１９Ｄ】ＮＴＨi菌株３２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２５)および演繹アミノ酸配列(配列番号２６)を示す図である。
【図１９Ｅ】ＮＴＨi菌株３２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２５)および演繹アミノ酸配列(配列番号２６)を示す図である。
【図１９Ｆ】ＮＴＨi菌株３２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２５)および演繹アミノ酸配列(配列番号２６)を示す図である。
【図１９Ｇ】ＮＴＨi菌株３２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２５)および演繹アミノ酸配列(配列番号２６)を示す図である。
【図１９Ｈ】ＮＴＨi菌株３２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２５)および演繹アミノ酸配列(配列番号２６)を示す図である。
【図１９Ｉ】ＮＴＨi菌株３２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２５)および演繹アミノ酸配列(配列番号２６)を示す図である。
【図１９Ｊ】ＮＴＨi菌株３２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２５)および演繹アミノ酸配列(配列番号２６)を示す図である。
【図２０Ａ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｂ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｃ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｄ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｅ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｆ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｇ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｈ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｉ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｊ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｋ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｌ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｍ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｎ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｏ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｐ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２１Ａ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｂ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｃ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｄ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｅ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｆ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｇ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｈ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｉ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｊ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｋ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｌ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｍ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｎ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｏ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２２Ａ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｂ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｃ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｄ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｅ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｆ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｇ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｈ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｉ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｊ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｋ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｌ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｍ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｎ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｏ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｐ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２３Ａ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｂ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｃ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｄ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｅ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｆ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｇ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｈ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｉ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｊ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｋ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｌ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｍ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｎ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｏ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｐ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２４Ａ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｂ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｃ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｄ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｅ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｆ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｇ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｈ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｉ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｊ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｋ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｌ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｍ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｎ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｏ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｐ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｑ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｒ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｓ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｔ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｕ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｖ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｗ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｘ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｙ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｚ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ａ１】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｂ１】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｃ１】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｄ１】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｅ１】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｆ１】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｇ１】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｈ１】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｉ１】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２５Ａ】ＮＴＨi菌株１２からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号３７)および演繹アミノ酸配列(配列番号３８)を示す図である。上線または下線を引かれた配列は、２つのorfの接合部を越えてＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。センス(６４３１.ＳＬ):配列番号３９、(６４３２.ＳＬ)配列番号４０；アンチセンス(６２９５.ＳＬ)配列番号４１、(６２７１.ＳＬ)配列番号４２。
【図２５Ｂ】ＮＴＨi菌株１２からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号３７)および演繹アミノ酸配列(配列番号３８)を示す図である。上線または下線を引かれた配列は、２つのorfの接合部を越えてＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。センス(６４３１.ＳＬ):配列番号３９、(６４３２.ＳＬ)配列番号４０；アンチセンス(６２９５.ＳＬ)配列番号４１、(６２７１.ＳＬ)配列番号４２。
【図２５Ｃ】ＮＴＨi菌株１２からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号３７)および演繹アミノ酸配列(配列番号３８)を示す図である。上線または下線を引かれた配列は、２つのorfの接合部を越えてＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。センス(６４３１.ＳＬ):配列番号３９、(６４３２.ＳＬ)配列番号４０；アンチセンス(６２９５.ＳＬ)配列番号４１、(６２７１.ＳＬ)配列番号４２。
【図２５Ｄ】ＮＴＨi菌株１２からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号３７)および演繹アミノ酸配列(配列番号３８)を示す図である。上線または下線を引かれた配列は、２つのorfの接合部を越えてＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。センス(６４３１.ＳＬ):配列番号３９、(６４３２.ＳＬ)配列番号４０；アンチセンス(６２９５.ＳＬ)配列番号４１、(６２７１.ＳＬ)配列番号４２。
【図２５Ｅ】ＮＴＨi菌株１２からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号３７)および演繹アミノ酸配列(配列番号３８)を示す図である。上線または下線を引かれた配列は、２つのorfの接合部を越えてＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。センス(６４３１.ＳＬ):配列番号３９、(６４３２.ＳＬ)配列番号４０；アンチセンス(６２９５.ＳＬ)配列番号４１、(６２７１.ＳＬ)配列番号４２。
【図２５Ｆ】ＮＴＨi菌株１２からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号３７)および演繹アミノ酸配列(配列番号３８)を示す図である。上線または下線を引かれた配列は、２つのorfの接合部を越えてＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。センス(６４３１.ＳＬ):配列番号３９、(６４３２.ＳＬ)配列番号４０；アンチセンス(６２９５.ＳＬ)配列番号４１、(６２７１.ＳＬ)配列番号４２。
【図２５Ｇ】ＮＴＨi菌株１２からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号３７)および演繹アミノ酸配列(配列番号３８)を示す図である。上線または下線を引かれた配列は、２つのorfの接合部を越えてＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。センス(６４３１.ＳＬ):配列番号３９、(６４３２.ＳＬ)配列番号４０；アンチセンス(６２９５.ＳＬ)配列番号４１、(６２７１.ＳＬ)配列番号４２。
【図２５Ｈ】ＮＴＨi菌株１２からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号３７)および演繹アミノ酸配列(配列番号３８)を示す図である。上線または下線を引かれた配列は、２つのorfの接合部を越えてＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。センス(６４３１.ＳＬ):配列番号３９、(６４３２.ＳＬ)配列番号４０；アンチセンス(６２９５.ＳＬ)配列番号４１、(６２７１.ＳＬ)配列番号４２。
【図２５Ｉ】ＮＴＨi菌株１２からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号３７)および演繹アミノ酸配列(配列番号３８)を示す図である。上線または下線を引かれた配列は、２つのorfの接合部を越えてＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。センス(６４３１.ＳＬ):配列番号３９、(６４３２.ＳＬ)配列番号４０；アンチセンス(６２９５.ＳＬ)配列番号４１、(６２７１.ＳＬ)配列番号４２。
【図２６Ａ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２６Ｂ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２６Ｃ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２６Ｄ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２６Ｅ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２６Ｆ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２６Ｇ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２６Ｈ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２６Ｉ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２６Ｊ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２６Ｋ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２６Ｌ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２７Ａ】菌株１２のhia遺伝子座からの上流ＯＲＦ(配列番号４５)の配列およびb型インフルエンザ菌株ＲdからのＨＩ１７３２タンパク質(配列番号４６)の一部の整列を示す図である。
【図２７Ｂ】菌株１２のhia遺伝子座からの上流ＯＲＦ(配列番号４５)の配列およびb型インフルエンザ菌株ＲdからのＨＩ１７３２タンパク質(配列番号４６)の一部の整列を示す図である。
【図２８Ａ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｂ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｃ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｄ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｅ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｆ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｇ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｈ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｉ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｊ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｋ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｌ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｍ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｎ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｏ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｐ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｑ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｒ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｓ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｔ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｕ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｖ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｗ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｘ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｙ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｚ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ａ１】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｂ１】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｃ１】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｄ１】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２９】hia遺伝子の５’端をＳ４４切断位置でＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。センス(６８１７.ＳＬ)配列番号４９、エンコードされているアミノ酸配列番号５０；アンチセンス(６８１８.ＳＬ)配列番号５１、相補配列番号５２、エンコードされているアミノ酸配列番号５３。
【図３０Ａ】ＮＴＨi菌株１１からのＳ４４hia遺伝子および大腸菌のcer遺伝子およびＴ７プロモーターを含む、プラスミドＪＢ-２９３０-３の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢaｍＨ I；Ｂg、Ｂgl II；Ｋ、Ｋpn I；Ｎ、Ｎde I；Ｐ、Ｐst I；Ｒ、ＥcoＲ I；Ｓ、Ｓal I；Ｓｍ、Ｓｍa I；Ｓty、Ｓty I；Ｘb、Ｘba I；Ｘho、Ｘho Iである。他の略語はＴ７p、Ｔ７プロモーター；ＡpＲ、アンピシリン耐性；ＫanＲ、カナマイシン耐性；ＣＡＰ、子牛のアルカリホスファターゼ；tt１、trpＡからの転写ターミネーター１；tt２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図３０Ｂ】ＮＴＨi菌株１１からのＳ４４hia遺伝子および大腸菌のcer遺伝子およびＴ７プロモーターを含む、プラスミドＪＢ-２９３０-３の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢaｍＨ I；Ｂg、Ｂgl II；Ｋ、Ｋpn I；Ｎ、Ｎde I；Ｐ、Ｐst I；Ｒ、ＥcoＲ I；Ｓ、Ｓal I；Ｓｍ、Ｓｍa I；Ｓty、Ｓty I；Ｘb、Ｘba I；Ｘho、Ｘho Iである。他の略語はＴ７p、Ｔ７プロモーター；ＡpＲ、アンピシリン耐性；ＫanＲ、カナマイシン耐性；ＣＡＰ、子牛のアルカリホスファターゼ；tt１、trpＡからの転写ターミネーター１；tt２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図３１】Ｓ４４からのrＨiaの発現のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１、時間０での(誘導なしで)pＥＴＳ４４ベクターからの発現体；レーン２、４時間の誘導後のpＥＴＳ４４ベクターからの発現体；レーン３、４時間の誘導後のＪＢ-２９３０-３からの発現体。
【図３２】発現試験用に使用された２つのベクター、Ｓ４４切断型rＨiaのＪＢ-２９３０-３およびIＡ-１９１-３-１の概略を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
(関連出願の参照)
本出願は、同時係続の米国特許出願第０９/２６８,３４７号の一部継続出願である。
【０００２】
(発明の分野)
本発明は分子遺伝学の分野に関し、詳細には組換えインフルエンザ菌(ヘモフィルス・インフルエンジー(Ｈaeｍophilus influenzae))アドヘシン(Ｈia)タンパク質の産生に関する。
【背景技術】
【０００３】
(発明の背景)
インフルエンザ菌は、髄膜炎、喉頭蓋炎、敗血症および中耳炎などのいくつかの重大なヒト疾患の原因である。インフルエンザ菌には、aからfで表され、それらの莢膜多糖によって識別される６種類の血清型がある。b型インフルエンザ菌(Ｈib)は、１９８０年代にいくつかのＨib結合ワクチンが導入されるまでは細菌性髄膜炎の主な原因であった(ref.１.本出願全体にわたって、さまざまな参考文献を括弧内に引用し、本発明が関係する分野の現状をより完全に説明する。それぞれの引用に関する完全な文献情報は、明細書の最後、特許請求の範囲の直前に見出される。これらの参考文献の開示を、参照により本開示に組み込む)。ジフテリアトキソイド(ref.２)、破傷風トキソイド(ref.３および米国特許第４,４９６,５３８号)または髄膜炎菌外膜タンパク質(ref.４)に結合したb型インフルエンザ菌莢膜多糖をベースとするワクチンは、b型インフルエンザ菌誘発髄膜炎を減らすのに有効とされてきた。他の血清型インフルエンザ菌が侵襲性疾患に関連する頻度は低いが、Ｈib疾患の発生率が減少するにつれて、これらの菌株に起因する疾患の発生率が増加するようである(ref.５、６)。非被包性すなわち分類不能型インフルエンザ菌(ＮＴＨi)もまた中耳炎、喉頭蓋炎、肺炎および気管気管支炎を含む広範囲のヒト疾患の原因となる。ＮＴＨi誘発疾患の発生率は、Ｈibワクチンの導入によって影響を受けなかった(ref.７)。
【０００４】
中耳炎は幼児期に最もよく見られる病気であり、２歳未満の子供全体の６０から７０％が１回から３回の耳感染症を経験する(ref.８)。子供の慢性中耳炎は聴力、発話および認知障害の原因となる。インフルエンザ菌感染症は、急性中耳炎の症例の約３０％、慢性中耳炎の約６０％を占める。米国だけでも中耳炎の治療には、抗生物質ならびに扁桃摘出術、咽頭扁桃切除術および中耳腔換気用チューブの挿入などの外科的処置に年間１０億ドルから２０億ドルが費やされている。言語療法および特殊教育授業などの付加的治療に対し、年間さらに３００億ドルが費やされていると推定される。さらに、中耳炎の原因となる生物の多くは、抗生物質治療に対して耐性になりつつある。したがって、中耳炎に対する有効な予防ワクチンが望まれている。ＮＴＨiによる自然感染では、抗体の応答を刺激する露出した外膜タンパク質が殺菌および/または防御的な抗体として潜在的に重要な標的であり、したがって潜在的なワクチンの候補である。ＮＴＨiの上皮細胞への付着の際に重要である高分子量タンパク質(ＨＭＷ１およびＨＭＷ２)のファミリーが、約７０から７５％のＮＴＨi菌株において同定されている(ref.９、ref.１０)。これらの高分子量アドヘシン(adhesin)は、中耳炎のチンチラモデルにおいていくらかの防御を可能にすることが分かっている(ref.１１)。高分子量アドヘシンタンパク質の第２のファミリーが、約２５％のＮＴＨiおよび被包性インフルエンザ菌株において同定されている(ref.１２、ref.１３、ref.１４)。この第２のファミリーのＮＴＨiメンバーは、インフルエンザ菌アドヘシンすなわちＨiaと呼ばれ、被包性菌株において発見される相同タンパク質はインフルエンザ菌表面原繊維タンパク質すなわちＨsfと呼ばれる。hia遺伝子は、中耳炎患者の回復期血清を使用して発現ライブラリーから最初にクローニングされ、このことはhia遺伝子が疾患における重要な免疫原であることを示す。プロトタイプのＨiaおよびＨsfタンパク質は約８２％の配列類似性を示すが、Ｈsfタンパク質はかなり高い。これらのタンパク質には保存されたアミノ酸およびカルボキシ末端およびいくつかの繰り返しモチーフが含まれ、ＨsfはＨiaと比較してより多くの繰り返し配列を含む。高分子量タンパク質(２００kＤa)も、ＨsfおよびＨiaタンパク質といくらかの配列相同性があるＭoraxella catarrhalisから同定されている(米国特許第５,８０８,０２４号)。
【０００５】
ＨiaおよびＨsfはインフルエンザ菌の被包性菌株および約２０〜２５％の非被包性菌株中で保存され、アドヘシンであることが示されているので、ＨiaまたはＨiaと特異的に反応する抗体を産生する能力のあるタンパク質を産生する、インフルエンザ菌または他の細菌性病原体によって引き起こされる疾患に対する診断および予防接種において、このタンパク質は有用性がある。
【０００６】
診断において有用であり予防接種における免疫原としてのアンチＨia抗体を産生するために、診断において抗原としてＨiaを使用することの欠点は、インフルエンザ菌種からの天然タンパク質の回収があまりできないことである。
【０００７】
他の免疫原用のワクチン、担体を含めた免疫調製、および診断試薬の生成において、抗原として使用するための組換えＨiaタンパク質を提供することが有利であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
(発明の概要)
本発明は組換えインフルエンザ菌アドヘシン(rＨia)の提供を対象とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
このような組換えタンパク質の提供に関して、本発明は単離され精製されたある種の核酸分子を提供する。したがってその一態様において、本発明は単離され精製された核酸分子を提供し、この核酸分子はインフルエンザ菌株のインフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質をエンコードしており、以下のものを含む。(a)図１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５に示される配列(配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７)からなる群から選択されるＤＮＡ配列、または(b)図１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５に示される配列(配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するインフルエンザ菌アドヘシン(rＨia)タンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列。
【００１０】
このような核酸は、プラスミドベクターである可能性のあるベクター中に含まれていてよい。詳細には、分類不能型ヘモフィルスの菌株１１または３３からのＨiaタンパク質を、核酸分子はエンコードしていてよい。
【００１１】
本発明の他の態様では、インフルエンザ菌の菌株のＮ末端切断型インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質をエンコードしており、１対のヌクレオチドによって増幅可能な単離され精製された核酸分子が提供される。ヌクレオチドは配列番号７と配列番号１５、配列番号９と配列番号１５、配列番号１１と配列番号１５、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４９、および配列番号５１からなる群から選択される。
【００１２】
このような核酸は、プラスミドベクターである可能性のあるベクター中に含まれていてよい。詳細には、分類不能型ヘモフィルスの菌株１１または３３からのコドンＶ３８またはＳ４４で始まるＮ末端切断型Ｈiaタンパク質を、核酸分子はエンコードしていてよい。
【００１３】
本発明のこれらの態様に従って提供される単離され精製された核酸を組み込んでいるプラスミドベクターは、
図１Ａ中に示されるＤＳ-２００８-２-３
図５Ａ中に示されるＤＳ-２１８６-１-１
図５Ａ中に示されるＤＳ-２２０１-１
図５Ａ中に示されるＤＳ-２１８６-２-１
図５Ａ中に示されるＤＳ-２１６８-２-６
図３２中に示される１Ａ-１９１-３-１
からなる群から選択されるプラスミドの同定特性を有する可能性がある。
【００１４】
本明細書で提供されるベクターは、大腸菌からのcer遺伝子を含んでよい。したがって、本発明の他の態様では、完全長またはＮ末端切断型インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質をエンコードしている核酸分子、前記完全長または切断型Ｈiaタンパク質を発現するためのプロモーター、任意選択で大腸菌のcer遺伝子含む、宿主を形質転換するためのベクターが提供される。ベクターはプラスミドベクターまたは他の非複製ベクターであってよく、
図６Ａ中に示されるＢＫ-９６-２-１１
図７Ａ中に示されるＤＳ-２２４２-１
図７Ａ中に示されるＤＳ-２２４２-２
図８Ａ中に示されるＤＳ-２３４０-２-３
図９Ａ中に示されるＤＳ-２２４７-２
図９Ｂ中に示されるＤＳ-２４４８-１７
図３２中に示されるＪＢ-２９３０-３
からなる群から選択されるプラスミドベクターの同定特性を有する可能性がある。
【００１５】
本明細書で提供されるベクターは、サルモネラ、ＢＣＧ、アデノウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアまたはポリオウイルスからのベクターを含めた複製ベクターを含んでよい。
【００１６】
本明細書で提供される任意のベクターを使用して、完全長または切断型である可能性のある、ヘモフィルスの分類不能型菌株の防御性インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質を発現するのに適切な宿主細胞を形質転換することができる。このような宿主は、好都合には大腸菌であってよい。このような発現はＴ７プロモーターの制御下で行うことができ、形質転換された宿主からの組換えＨiaの発現はラクトースまたは他の好都合な誘導剤の誘導用濃縮液中で培養することによって実施することができる。
【００１７】
本発明は他の態様において、形質転換された宿主、特に本明細書で提供される大腸菌によって産生される、分類不能型ヘモフィルス菌株の組換え防御性インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質をさらに含む。このようなＨiaタンパク質を組換えタンパク質の免疫原性断片またはアドヘシン官能性類縁体の形で提供することができる。
【００１８】
完全長またはＮ末端切断型である本明細書で提供される組換えＨiaタンパク質は、免疫原性組成物中の抗原、他の免疫原用の担体、診断用薬としておよび診断用薬の生成において有用である。完全長またはＮ末端切断型であるＨiaタンパク質をエンコードしている核酸分子も、診断のための使用用、および免疫原性組成物中においてもプローブとして有用である。
【００１９】
追加的な態様において本発明は、本明細書で提供されるのと同様な単離され精製された核酸分子、本明細書で提供されるのと同様なヘモフィルスの菌株の完全長またはＮ末端切断型である組換え防御性Ｈiaタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学的に活性のある成分、および薬学的に許容可能なこれらの担体を含む、免疫原性組成物を提供する。
【００２０】
本明細書で提供される免疫原性組成物を、宿主へのin vitro投与用ワクチンとして製剤化して、インフルエンザ菌に起因する疾患に対する防御を提供することができる。このような目的のために、組成物をミクロ粒子、カプセル、ＩＳＣＯＭまたはリポソーム調製物として製剤化することができる。免疫原性組成物を免疫系の特定の細胞または粘膜表面への送達用の標的分子と組み合わせて提供することができる。
【００２１】
本発明の免疫原性組成物(ワクチンを含めて)は少なくとも１種の他の免疫原性または免疫刺激性材料をさらに含んでよく、この免疫刺激性材料少なくとも１種のアジュバントまたは少なくとも１種のサイトカインであってよい。本発明で使用するのに適切なアジュバントには(これらに限らないが)リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ２１、Ｑuil Ａ、その誘導体および成分、ＩＳＣＯＭマトリックス、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類縁体、アミノ酸のオクタデシルエステル、ムラミルジペプチド、ポリホスファゼン、ＩＳＣＯＰＲＥＰ、ＤＣ-chol、ＤＤＢＡおよびリポタンパク質ならびに他のアジュバントがある。
【００２２】
アジュバントの有利な組み合わせは、本出願人と同じ譲受人に譲渡され、その開示を参照(１９９５年１１月２１日発行のＷＯ ９５/３４３０８)により本明細書に組み込む１９９４年６月１６日出願の同時係続の米国特許第０８/２６１,１９４号、および１９９５年６月７日出願の第０８/４８３,８５６号に記載されている。
【００２３】
本発明の他の態様に従って、感受性のある宿主に有効量の前述の免疫原性組成物を投与するステップを含む、宿主中で免疫応答を生み出すための方法が提供される。免疫応答は体液の免疫応答であるか、または細胞を介する免疫応答であってよい。その内部で疾患に対する防御を与えることができる宿主には、ヒトを含めた霊長類がある。
【００２４】
本発明の他の態様に従って、薬剤として使用されるとき本明細書で提供される免疫原性組成物、および疫原性組成物の製造における免疫原性組成物のこれらの成分の使用法が提供される。
【００２５】
他の追加的な態様において本発明は、インフルエンザ菌の分類不能型菌株の防御性インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質の産生のための方法を提供し、この方法は
本明細書で提供されるのと同様な菌株のＮ末端切断型のインフルエンザ菌アドヘシンタンパク質をエンコードしている核酸分子を含むベクターによって、大腸菌などの宿主を形質転換すること、
宿主を成長させてエンコードされている切断型Ｈiaを発現させること、
発現したＨiaタンパク質を単離および精製することを含む。
【００２６】
エンコードされている切断型Ｈiaを封入体中で発現させることができる。成長し形質転換された細胞を破壊して上澄みおよびＨiaを含む封入体を生成し、上澄みからの分離の後に封入体を可溶化して組換えＨiaの溶液を生成し、クロマトグラフィによって細胞の残骸のない組換えＨiaの溶液を精製し、精製された組換えＨiaタンパク質を単離することによって、単離および精製ステップを実施することができる。
【００２７】
大腸菌などの宿主細胞を形質転換するベクターはＴ７プロモーターを含んでよく、大腸菌または他の宿主細胞を誘導量のラクトースまたは他の好都合な誘導剤の存在下で培養することができる。
【００２８】
本明細書のインフルエンザ菌の菌株は、菌株１１、３３、３２、２９、Ｍ４０７１、Ｋ９、Ｋ２２および１２からなる分類不能型菌株の群から選択することができる。このような菌株からの代表的なＨiaタンパク質をエンコードしている遺伝子に特異的な核酸配列が、本明細書で提供され以下に記載される。
【００２９】
本明細書で提供される核酸配列は、診断に関する適用例において有用である。したがって本発明の他の態様では、サンプル中でインフルエンザ菌アドヘシンタンパク質をエンコードしている核酸の存在を判定するするための方法が提供され、この方法は、
a)サンプルを本明細書で提供されるのと同様な核酸分子と接触させて、本明細書で提供される核酸配列、およびサンプル中に存在し特異的にハイブリダイズすることができるヘモフィルスの菌株のＨiaタンパク質をエンコードしている核酸を含むデュプレックス(duplex)を生成するステップと、
b)デュプレックスの生成を判定するステップを含む。
【００３０】
さらに本発明は、サンプル中でインフルエンザ菌アドヘシンタンパク質をエンコードしている核酸の存在を判定するための診断キットを提供し、このキットは、
a)本明細書で提供されるのと同様な核酸分子と、
b)核酸分子とサンプルを接触させて、この核酸分子および任意のこのような核酸分子を含むデュプレックスを生成するための手段と、
c)デュプレックスの生成を判定するための手段をを含む。
【００３１】
本明細書で提供される組換えによって産生された切断型Ｈiaタンパク質も、診断に関する適用例において有用である。したがって本発明の他の態様では、サンプル中のＨiaタンパク質と特異的に反応する抗体の存在を判定するための方法が提供され、この方法は、
(a)サンプルと本明細書で提供される組換えＨiaタンパク質を接触させて、この組換えＨiaタンパク質とサンプル中に存在しタンパク質と特異的に反応する任意のこのような抗体の複合体を提供するステップと、
(b)複合体の生成を判定するステップを含む。
【００３２】
本発明の利点には以下のものがある。
【００３３】
インフルエンザ菌アドヘシンタンパク質またはこのＨiaタンパク質の断片または類縁体をエンコードしている単離され精製された核酸分子、
他のいかなるヘモフィルスのタンパク質も含まない組換えによって産生されたＨiaタンパク質、
ヘモフィルスの特異的な同定用の診断キットおよび免疫試薬。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明は、図面を参照しながら以下の記述からさらに理解されるはずである。
【００３５】
(発明の全般的な説明)
Ｈ.influenzae株は、少量のＨiaおよびＨsfタンパク質を発現するので、ＮＴＨi株由来のhia遺伝子を、Ｅ.Ｃoli中で組み換えタンパク質を過剰発現させるための発現ベクター中にクローン化した。全長組み換えＨia(rＨia)タンパク質が発現する際、それは比較的少量であった。組み換えタンパク質が発現されているのを確認するために、本出願と同じ譲受人に譲受され、その開示を参照により本明細書に組み込む米国特許第５,８０８,０２４号で２００kＤaであると同定されたＭoraxella catarrhalis高分子量アドヘシンタンパク質に対する抗体を用いてイムノブロットを実施した。ゲル精製した未変性２００kＤaタンパク質に対する抗体は、rＨiaタンパク質サンプル中に特異的に誘導されたバンドを認識した。rＨiaの収量はＴ７hia遺伝子カセットの遺伝子コピー数を増加させることによっても顕著には増加しない。
【００３６】
Ｅ.Ｃoliのcer遺伝子は、大きな挿入部を含むプラスミドを安定化するが(参考文献１５)、Ｅ.Ｃoliのcer遺伝子を発現ベクターに添加しても、rＨiaの収量は顕著には増加しない。しかし、Ｅ.Ｃoli細胞は培養中に凝集し、このことは、Ｈiaアドヘシンタンパク質の表面発現が起きていることを示唆している。rＨiaタンパク質が封入体として生成されればrＨiaタンパク質の強い毒性は克服されるので、推定シグナル配列を欠失させるために遺伝子の５’-末端を切断した。この変性の結果、Ｖ３８位置から出発している切断型rＨiaの生産および回収が良好となった。
【００３７】
全長およびＶ-３８切断型rＨiaタンパク質は免疫原性であり、得られる抗-rＨia抗体は、Ｈ.influrnzaeのタイプaまたはタイプb株による菌血症の受動的幼ラットモデルを防護する。さらに、切断型Ｖ３８rＨiaタンパク質は、チンチラの能動的抗原投与モデルにおける鼻咽頭コロニー形成に対して特に防護に働くことが見出された。ＮＴＨi株からのrＨiaによってもたらされる防護が、ＮＴＨiおよび被包性タイプaまたはタイプb株が原因となって起こる疾患に対するものであることは、一般的な防護エピトープが存在することを意味している。付加的なhia遺伝子のクローニングおよび配列分析は、保存領域の同定の助けとなる。全長またはＮ-末端切断型rＨiaタンパク質を、Ｈaeｍophilus influenzae疾患に対する防護のためのワクチン成分として使用できる。
【００３８】
hia遺伝子を有する任意のＨaeｍophilus株は、少なくとも本発明の態様で特徴付けるＨiaタンパク質をコードする部分を含有する核酸分子(おそらくＤＮＡ分子の形)の精製および単離に利用できる。このような株は一般的な臨床所およびバクテリア培養収集所、例えばＡｍerican Ｔype Ｃulture Ｃollectionから入手される。Ｈaeｍophilus influenzaeの適切な株:
分類不能型 Ｈaeｍophilus 株１１；
分類不能型 Ｈaeｍophilus 株３３；
分類不能型 Ｈaeｍophilus 株３２；
分類不能型 Ｈaeｍophilus 株２９；
分類不能型 Ｈaeｍophilus 株 Ｍ４０７１；
分類不能型 Ｈaeｍophilus 株 Ｋ９；
分類不能型 Ｈaeｍophilus 株 Ｋ２２；
分類不能型 Ｈaeｍophilus 株 １２；
タイプＣ Ｈaeｍophilus 株 ＡＰI。
【００３９】
本明細書において、“Ｈia”タンパク質という用語は、Ｈiaタンパク質のファミリーを定義するために使用され、Ｈiaタンパク質には種々のＨaeｍophilus株中で見出されるアミノ酸配列を有する天然の変異体が含まれる。
【００４０】
図１Ａは、Ｔ７プロモーターの影響下での、分類不能型 Ｈaeｍophilus influenzae株１１由来全長hia遺伝子を含むプラスミドＤＳ-２００８-２-３の制限地図を示す図である。株１１由来のhia遺伝子の核酸(配列番号:４３)および推測アミノ酸配列(配列番号:４４)は、前記米国特許第５,６４６,２５９に記載されている(該明細書中では“ＨＡ１”と定義される)。hia遺伝子を株１１の遺伝子のＡＴＧ開始コドンからＰＣＲ増幅するために使用したオリゴヌクレオチドを、図１Ｂに示す。
【００４１】
図２は、抗-未変性Ｍoraxella catarrhalis高分子量アドヘシン抗体によりrＨia(１１)タンパク質を確認するためのイムノブロットを示す図である。前記米国特許第５,８０８,０２４に記載される、Ｍ.catarrhalis高分子量アドヘシンタンパク質または２００kＤaタンパク質は、ＨiaおよびＨsfタンパク質と、特にカルボキシ末端部に、何らかの配列相同性を有する(図２８)。
【００４２】
図３は、ＮＴＨi株１１由来の全長hia遺伝子から成るＴ７hia遺伝子カセットのタンデムコピーを含むプラスミドＤＳ-２０９２-１およびＤＳ-２０９２-４０の構築スキームを示す図である。増加した遺伝子コピー数を示すこのようなプラスミドは、しばしば組み換えタンパク質の生産レベルを上昇させる。しかし、以下に示すように、組み換えＨiaの低い収率は、遺伝子コピー数の増加によって顕著には増加しない。
【００４３】
図４は、ＮＴＨi株１１タンパク質のＮ-末端配列および経時的にＮ-末端切断されたrＨiaタンパク質の位置を示す図である。Ｅ２１部分までのＮ-末端切断型は、Ｈiaのシグナル配列の構成部分であると考えられる長い疎水性領域が欠失している。Ｔ３３部分までの欠失は、長い疎水性領域を含み、潜在的なＡla-Ｘ-Ａlaシグナル切断部位を有する。Ｖ３８部分までの欠失は、長い疎水性領域を含み、潜在的なＡla-Ｘ-Ａlaシグナル切断部位を有する。Ｓ４４部分から始まる組み換えＨiaタンパク質は、長い疎水性領域を含み、潜在的なＡla-Ｘ-Ａlaシグナル切断部位を有する。Ｎ５２部分から始まる組み換えＨiaタンパク質は、Ｍoraxella catarrhalis由来の高分子量(２００kＤa)アドヘシンの近接した開始点を模倣しており、アドヘシンは米国特許第５,８０８,０２４に記載され、該組み換えタンパク質は、Ｖ５６から開始するようにＮ-末端切断型されている場合に過剰発現する。
【００４４】
図５Ａは、４種のＮ―末端切断型rＨiaを製造するための、プラスミドＤＳ-２１８６-１-１、ＤＳ-２２０１-１、ＤＳ-２１８６-２-１、およびＤＳ-２１６８-２-６を作製するための構築スキームを示す図である。５’-末端フラグメントをＰＣＲ増幅するために使用されるこのオリゴヌクレオチドを図５Ｂに示す。図３０は、Ｓ４４欠失を製造する、プラスミドＪＢ２９３０-３を作製するための構築スキームを示す図である。５’-フラグメントをＰＣＲ増幅するために使用するオリゴヌクレオチドを図２９に示す。
【００４５】
図６Ａは、ＮＴＨi株１１由来のＶ３８hia遺伝子ならびにプラスミドを安定化するＥ.Ｃoli cer遺伝子を含むプラスミドＢＫ-９６-２-１１を作製するための構築スキームを示す図である。毒性のタンパク質を産生するプラスミドへのcer遺伝子の導入により、タンパク質産生の強化が予測された。cer遺伝子の存在下で全長rＨia産生Ｅ.Ｃoli細胞の形態に変化が生じ、すなわち細胞が凝集した。このことは、凝集を起こす細胞表面のアドヘシンの発現が強化されたことを示唆する。発現プラスミドＢＫ-９６-２-１１はさらに、遺伝子安定性を高めると考えられているＴ７Ｖ３８hia遺伝子カセットの上流および下流に転写ターミネーターを含んでいる。マルチクローニング部位および転写ターミネーターを作製するために使用されるオリゴヌクレオチドを図６Ｂに示す。
【００４６】
図７Ａは、Ｔ７プロモーターの影響下に、分類不能型Ｈaeｍophilus influenzae株３３由来の全長hia遺伝子を含むプラスミドＤＳ-２２４２-１およびＤＳ-２２４２-２のための構築スキームを示す図である。発現プラスミドは、Ｔ７hia(３３)遺伝子カセットの上流および下流にＥ.Ｃoli cer遺伝子および形質転換ターミネーターをも含有する。ＤＳ-２２４２-１は、Ｔ７hia(３３)遺伝子と同一の鎖上にコードされたターミネーターを有する。しかし、２つのプラスミドに由来するrＨiaの発現には違いが見られなかった。ＮＴＨi株３３の真性５’末端の構築に使用されるオリゴヌクレオチドを図７Ｂに示す。
【００４７】
図８Ａは、ＮＴＨi株３３由来のＶ３８Ｈia遺伝子ならびにＥ.Ｃoli cer遺伝子を含むプラスミドＤＳ-２３４０-２-３のための構築スキームを示す図である。Ｔ７Ｖ３８hia遺伝子カセットの上流および下流の同一の鎖上に転写ターミネーターも存在する。ＮＴＨi株３３hia遺伝子をＶ３８コドンからＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを図８Ｂに示す。
【００４８】
図９は、Ｔ７Ｖ３８hia(１１)またはＴ７Ｖ３８hia(３３)遺伝子カセットのタンデムコピーをそれぞれ含有するプラスミドＤＳ-２４４７-２およびＤＳ-２４４８-１７の構築を示す図である。
【００４９】
図１０、パネルＡは、ＮＴＨi株１１由来の全長または切断型hia遺伝子をコードするプラスミドからのrＨiaタンパク質の産生を示す図である。全長rＨia(１１)タンパク質の産生は非常に低かった。Ｅ２１およびＴ３３切断型rＨiaタンパク質の場合も発現は低かった。しかし、Ｖ３８およびＮ５２切断型rＨiaタンパク質は顕著に改善された発現レベルを示す。図１０、パネルＢから明らかなように、Ｖ３８rＨia(１１)の産生は、Ｅ.Ｃoli cer遺伝子を発現プラスミドへ添加した場合に明らかに増加している。
【００５０】
図１１は、封入体として製造されるrＨiaタンパク質の精製スキームを示す図である。細胞を、超音波破砕により溶解し、封入体を連続した抽出により精製した。封入体を、グアニジニウムクロライド中に溶解し、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を添加して不純物を沈殿させた。(ＮＨ4)2ＳＯ4の添加によりrＨiaが沈殿し、粗rＨiaをさらにゲル濾過により精製した。
【００５１】
図１２は、株１１および３３由来の精製されたＶ３８rＨiaタンパク質を示す図である。封入体はレーン３に示され、最終精製タンパク質はレーン４に示される。精製されたタンパク質の推定純度は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥデンシトメトリーにより測定して、約９０％を上回る。
【００５２】
図１３は、ここに記載されるようにして製造されたrＨiaタンパク質の、グリ
セロールを添加した場合としない場合でかつ４℃で、およびグリセロールを添加
して−２０℃で８週間貯蔵する際の安定性に関する、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を示
す図である。タンパク質はいずれの条件でも安定である。
【００５３】
図１４は、ＣＤ-１マウス中の株１１および３３由来Ｖ３８rＨiaタンパク質の免疫原性を示す図である。０.３〜１０μgの用量では、いずれのタンパク質でも、１ないし２回投与した後に強い免疫応答を示す。これらのレベルでは顕著な用量応答は認められない。同様の結果が、ＢＡＬＢ/cマウス(図１５Ａ)およびモルモット(図１５Ｂ)でも見られ、このことはrＨiaが投与量あたり０.３μgであっても強い免疫原性を有することを示唆している。
【００５４】
図１６は、Ｖ３８rＨia(３３)によってもたらされる、ＮＴＨi株３３が引き起こすコロニー形成に対する防護を示す図である。Ｙang 等(参考文献２０)が記載しているように、チンチラ鼻咽頭コロニー形成モデルは、この疾患の初期の段階での防護を評価するために開発された。このモデルは、最初に、hｍｗ遺伝子を発現するＮＴＨi株のために確立され、hia遺伝子を発現するＮＴＨi株に適応させなければならなかった。プロトタイプhｍｗ-発現株(ＮＴＨi１２)における感染の確立には１０2〜１０8cfuを使用するが、ＮＴＨi３３株の場合には５×１０8cfuが必要であり、このような高レベルであってもプロトタイプhia-発現株１１では感染が確立されない。１００μg量で免疫化コホートは明らかに部分的に防護されるが、５０μg量では防護されない。疾患の初期の段階でのこのような防護は、ワクチン抗原としてのrＨiaアドヘシンの利用性を示している。
【００５５】
図１７は、別のＨaeｍophilus influenzae hia遺伝子をＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。配列は、ＨiaおよびＨsfタンパク質の保存アミノ酸およびカルボキシ末端配列に基づいている。
【００５６】
図１８は、ＮＴＨi株３３hia遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。図１９は、ＮＴＨi３２hia遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。図２０は、ＮＴＨi株２９hia遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。図２１は、ＮＴＨi株 Ｍ４０７１hia遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。図２２は、ＮＴＨi株 Ｋ９hia遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。図２３は、ＮＴＨi株 Ｋ２２hia遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。図２４は、Ｈaeｍophilus influenzae タイプc株ＡＰIhia遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。図２５は、ＮＴＨi株１２由来のhia座の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。ＰＣＲ増幅されたフラグメントは、hia遺伝子の３’-末端へ連結したＨaeｍophilus influenzaeタイプd株ＲdゲノムのＨI１７３３遺伝子に関連する遺伝子の３’-末端を含有する。ＨI１７３３タンパク質の上流ＯＲＦのアラインメントを図２７に示す。
【００５７】
図２６は、前記米国特許５,６４６,２５９に記載されるような、ＮＴＨi株１１由来のＨia遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す図である。
【００５８】
図２８は、Ｈsf、Ｈiaから推定されるタンパク質の配列のアラインメント、およびＭ.catarrhalis２００kＤaタンパク質の部分配列を示す図である。
【００５９】
本発明の種々の実施態様を、ワクチン摂取、診療、Ｈaeｍophilus感染の治療、免疫剤の製造の分野の応用に利用できることは、当業者に明らかである。このような使用について以下に述べるが、これに限定するものではない。
【００６０】
ワクチンの製造および使用
ワクチンとして使用するのに好適な免疫原性組成物は、ここに記載されるような、分類不能型Ｈaeｍophilus株の免疫原性組み換えＨaeｍophilus influenzaeアドヘシン(rＨia)タンパク質、その免疫原性類似体およびフラグメントおよび/または免疫原性ペプチドから製造できる。ワクチンは免疫応答を誘起し、これにより抗-rＨia抗体およびオプソニン化または死菌化された抗体を含む抗体が産生される。
【００６１】
ワクチンを含む免疫原性組成物は、液体溶液またはエマルジョンのような注入可能な形で製造できる。rＨiaタンパク質、その免疫原性類似体およびフラグメントおよび/または免疫原性ペプチドを、製薬学的に認容性の添加剤と混合してよく、該添加剤はrＨiaタンパク質、免疫原性フラグメント類似体または免疫原性ペプチドと混和性である。このような添加物には、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せが含まれる。
【００６２】
免疫原性組成物およびワクチンはさらに、補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、pＨ緩衝剤、またはワクチンの効果を増強するためのアジュバントを含有してよい。
【００６３】
免疫原性組成物およびワクチンは、皮下注射または筋肉内注射のような非経口投与が可能である。また、本発明で製造される免疫原性組成物を処方し、粘膜表面で免疫応答を喚起する方法で輸送する。従って、免疫原性組成物は例えば鼻または口(胃)のような経路で粘膜表面に適用してよい。
【００６４】
免疫原性組成物は免疫系の特異的な細胞または粘膜表面へ輸送するために、標的分子と組み合わせてよい。標的分子には、ＷＯ９２/１７１６７に記載されるような(Ｂiotech Ａustralia Ｐty. Ｌtd.)、ビタミンＢ12およびバクテリア毒素、および米国特許第５,１９４,２５４(Ｂarber等)に記載されるようなモノクローナル抗体が含まれる。
【００６５】
また、座剤および経口処方を含む別の投与形態が望ましい。座剤には、結合剤および担体が含まれていてよく、例えばポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドである。経口処方には、一般的に使用される添加剤、例えば製薬学的な量のサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウムが含まれてよい。これらの組成物は、溶剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続性製剤または粉剤の形で投与され、rＨiaタンパク質、フラグメント類似体および/またはペプチドを約１〜９５％含有する。
【００６６】
ワクチンは、投与処方に適合する方法で、治療効果、防護および免疫原性として機能する量で投与される。投与量は治療対象、例えば個人の免疫系の抗体合成能力および必要であれば細胞-仲介免疫応答の発現能力により変化する。投与に必要とされる活性成分の適切な量は、専門医の評価に依存する。しかし、好適な投与範囲は当業者により容易に決定可能であり、rＨia、その類似体およびフラグメントおよび/またはペプチドはマイクログラム程度でよい。初期投与およびブースター投与のための好適な治療法も効果的であるが、初期投与には連続投与も含まれる。ワクチンの投与量は、投与経路に依存し、宿主の大きさによっても変化する。
【００６７】
分類不能型ＨaeｍophilusのrＨiaタンパク質をコードする核酸分子を免疫化に直接使用してよく、その際、ＤＮＡを直接投与、例えば遺伝子的免疫化として注入するかまたは生ベクター、例えば核酸分子を含むサルモネラ、ＢＣＧ、アデノウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアまたはポリオウイルスを構築する。異種抗体を免疫系へ運ぶために使用される数種の生ベクターについては、例えばＯ，Ｈagan(１９９２)(参考文献１６)に議論されている。遺伝子的免疫化のための、ＤＮＡの被検対象への直接的な注入方法は、例えばＵlｍer等、１９９３(参考文献１７)に記載されている。
【００６８】
抗原と一般的にリン酸バッファー生理食塩水中の０.０５〜１.０％溶液として使用されるアジュバントとを同時に投与することにより、免疫原性は著しく向上する。アジュバントは抗原の免疫原性を強化するが、それ自体は免疫原性を必ずしも有さない。アジュバントは、抗原を投与部位の近くに局所的に維持することにより、抗原の免疫系の細胞へのゆっくりとした継続的な放出を助ける、蓄積効果を生み出す。アジュバントはまた、免疫系細胞を蓄積した抗原へと誘引し、そのような細胞を刺激して免疫応答を促す。
【００６９】
免疫促進剤またはアジュバントは、宿主の免疫応答を向上させるために長年使用されてきており、例えばワクチンが挙げられる。内因性アジュバント、例えばリポポリサッカライドは、一般的にワクチンとして使用される死菌または弱毒化バクテリアの成分である。外因性アジュバントは、典型的に、抗原と非-共役結合した免疫調節物質であり、宿主の免疫応答を強化するために処方される。従って、アジュバントは非経口的に導入された抗体への免疫応答を強化するものである。これらのアジュバントのいくつかは毒性であり、不所望の副作用を起こすので、ヒトおよび多くの動物に使用するのは不適当である。実際、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム(まとめて一般的にアルムと称される)のみが、ヒトおよび家畜用のワクチン中にアジュバントとして慣用される。アルムによるジフテリアおよび破傷風トキソイドに対する抗体応答の増強は、よく確立されている。
【００７０】
外因性アジュバントの多くは抗原に対する潜在的な免疫応答を呼び起こす。これらには、前記した特異的アジュバントならびに膜タンパク質抗原と複合するサポニン(免疫刺激複合体)、鉱油を含む複合ポリマー、死んだ微生物および鉱油、フロイドの完全アジュバント、微生物の生成物、例えばムラミルジペプチド(ＭＤＰ)およびリポポリサッカライド(ＬＰＳ)ならびにリピドＡおよびリポソームが含まれる。
【００７１】
効果的に体液性免疫応答(ＨＩＲ)および細胞-仲介免疫(ＣＭＩ)を誘導するには、免疫原をアジュバント中に乳化させる。多くのアジュバントは毒性であり、肉芽腫、急性および慢性の炎症(フロイドの完全アジュバント、ＦＣＡ)、細胞溶解(サポニンおよび複合ポリマー)および発熱、関節炎および前ブドウ膜炎(ＬＰＳおよびＭＤＰ)を引き起こす。ＦＣＡは優れたアジュバントであり研究に汎用されるが、その毒性のために、ヒトまたは家畜用ワクチン中に使用することを許可されていない。
【００７２】
理想的なアジュバントの所望の特徴は:
(１)毒性の欠如；
(２)長期にわたる免疫応答刺激能力；
(３)製造の容易性および長期貯蔵における安定性；
(４)種々の経路で投与された抗原に対して、ＣＭＩおよびＨＩＲの両方を誘起する能力；所望であれば、
(５)他のアジュバントとの相乗作用；
(６)抗原提示細胞(ＡＰＣ)群と選択的に相互作用する能力；
(７)適切なＴH１またはＴH２細胞-特異的免疫応答を特異的に誘起する能力；
および
(８)抗原に対する適切な抗体イソタイプレベル(例えば、IgＡ)を選択的に増加させる能力である。
【００７３】
参照することでここに組み込んだものとする、Ｌockhoff等の１９８９年８月８日付けの米国特許第４,８５５,２８３には、免疫調節剤またはアジュバントとして、Ｎ-グリコシルアミド、Ｎ-グリコシルウレアおよびＮ-グリコシルカルバメートを含む糖脂質類似体が記載され、それぞれ糖残基をアミノ酸で置換されていてよい。また、Ｌockhoff等、１９９１(参考文献１８)は、天然の糖脂質と構造的類似性を有するＮ-糖脂質類似体、例えばグリコスフィンゴリピドおよびグリコグリセロリピドが、ヘルペス単純ウイルスワクチンおよび偽性狂犬病ウイルスワクチンの両方で強い免疫応答を誘起することを報告している。ある種の糖脂質は長鎖-アルキルアミンと脂肪酸とから合成され、芳香族炭素を介して糖と直接結合し、天然の脂質残基の機能を模倣する。
【００７４】
本出願と同じ譲受人に譲渡され、参照により本明細書に組み込む、Ｍolony等による米国特許第４,２５８,０２９には、破傷風トキソイドおよびホルマリン不活化タイプI、IIおよびIIIポリオウイルスワクチンと複合させた場合に、オクタデシルチロシンヒドロクロライド(ＯＴＨ)がアジュバントとして機能することが記載されている。またＮixon-Ｇeorge等、１９９０(参考文献１９)は、組み換えＢ型肝炎表面抗原と組み合わせた、芳香族アミノ酸のオクタデシルエステルが、Ｂ型肝炎ウイルスに対する宿主の免疫応答を強化することを報告している。
【００７５】
イムノアッセイ
本発明により製造されるＨaeｍophilusの分類不能型株のrＨiaタンパク質、その類似体およびフラグメントは、免疫原性として、酵素結合性免疫吸着剤検定(ＥＬＩＳＡ)、ＲＩＡおよび他の非-酵素結合性抗体結合アッセイまたは抗菌、Ｈaeｍophilus、および/またはＨia抗体を検出するための従来公知の方法を含むイムノアッセイ中の抗原として、有用である。ＥＬＩＳＡアッセイでは、Ｈiaタンパク質、類似体およびフラグメントを、選択された表面、例えばポリスチレンマイクロタイタープレートの壁面のようなタンパク質またはペプチドが結合可能な表面上へ固定する。不完全に吸着されているＨiaタンパク質、類似体および/またはフラグメントを除くために洗浄し、その後、非特異的タンパク質、例えば試験サンプルに対する抗原性が中性であることを知られているウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)またはカゼイン溶液を選択表面へ結合させてよい。これにより、固定表面上の非特異的吸着部位が遮断され、結果的に、表面上への抗血清の非特異的結合によって起こるバックグラウンドが減少する。
【００７６】
次いで固定表面を、臨床または生化学的材料のようなサンプルと接触させ、免疫複合体(抗原/抗体)の形成が起こる方法で試験する。この際、ＢＳＡ、ウシガンマグロブリン(ＢＧＧ)および/またはリン酸バッファー生理食塩水(ＰＢＳ)/Ｔｗeenのような希釈剤でサンプルを希釈してよい。サンプルを次に約２５℃〜３７℃程度の温度で約２〜約４時間インキュベートする。インキュベートに続き、サンプル-接触表面を洗浄して、非-免疫複合材料を除去する。洗浄方法には、ＰＢＳ/Ｔｗeen、またはホウ酸バッファーのような溶液による洗浄が含まれてよい。
【００７７】
試験サンプルと結合Ｈiaタンパク質、類似体および/またはフラグメントとの間に特異的な免疫複合体が形成された後、次いで洗浄し、複合体形成の出現およびその量を、一次抗体に特異的な二次抗体を免疫複合体へ添加することにより測定する。試験サンプルがヒト起源である場合、二次抗体はヒトイムノグロブリンに特異的な抗体であり、一般的にIgＧである。検出可能にするために、二次抗体は、例えば適当な発色性物質とインキュベートすることにより呈色が見られるような酵素活性等の関連活性を有する。定量化は、例えば可視スペクトル分光光度計を用いて呈色の度合いを測定することにより実施される。
【００７８】
ハイブリダイゼーションプローブとしての配列の使用
本発明のヌクレオチド配列は、新規に単離および特徴付けされたhia遺伝子配列を含有し、他のＨaeｍophilus分類不能型株から、hia遺伝子を同定およびクローニングすることができる。
【００７９】
本発明のhia遺伝子配列を含有するヌクレオチド配列は、その能力のために、他のhia遺伝子の補足的部分と倍体分子を選択的に形成するのが有用である。適用に応じて、種々のハイブリダイゼーション条件を利用し、他の分類不能型Ｈaeｍophilus株中の別のhia遺伝子のための、プローブの選択性の度合いを変化させる。高い選択性のためには、比較的厳しい条件を利用して倍体を形成し、例えば低塩および/または高温条件、例えばＮaＣl ０.０２Ｍ〜０.１５Ｍでありかつ約５０〜７０℃の温度という条件が挙げられる。ある種の適用では、それほど厳しいハイブリダイゼーション条件は必要とされず、例えば０.１５〜０.９Ｍの塩で２０〜５５℃の温度範囲でよい。ハイブリダイゼーション条件は、ホルムアミドの添加量が増加すると、ハイブリッドした倍体が不安定になるので、より厳しい条件が必要とされる。従って、特定のハイブリダイゼーション条件は容易に操作でき、所望の結果に応じて方法を選択するのが一般的である。一般的に、便利なハイブリダイゼーション温度は、５０％ホルムアミドの存在下かつＮaＣl ０.１５Ｍで:hia遺伝子が標的核酸フラグメントと９５〜１００％の相同性を有する場合に４２℃、９０〜９５％の相同性で３７℃および８５〜９０％の相同性で３２℃である。
【００８０】
臨床診断の態様において、本発明のhia遺伝子の核酸配列は、適当な手段、例えばハイブリダイゼーションを測定するための標識、と組み合わせて利用してよい。種々の適当な指示手段が知られており、放射活性、酵素または他のリガンド、例えばアビジン/ビオチンが含まれ、検出可能なシグナルの提供を可能にする。ある診断の態様において、放射活性タグの代わりに、酵素タグ、例えばウレアーゼ、アルカリンホスファターゼまたはペルオキシダーゼを使用してもよい。酵素タグの場合、肉眼または分光光度計で視覚的に捉えられ、Ｈia遺伝子配列を含むサンプルとの特異的ハイブリダイゼーションを同定できる手段として使用されるものとして、発色指示物質が公知である。
【００８１】
本発明のＨia遺伝子核酸配列は、溶液ハイブリダイゼーション中のハイブリダイゼーションプローブとして、および液相法で使用される態様として有用である。固相法に関する態様において、滲出液、体液(例えば血清、羊水、中耳滲出液、唾液、気管支肺胞洗浄液)または組織のような臨床サンプルを含むサンプルの試験ＤＮＡ(またはＲＮＡ)を、選択したマトリクスまたは表面へ吸着あるいは固定させる。固定された一本鎖核酸を、次いで、所望の条件下に、本発明のhia遺伝子またはそのフラグメントの核酸配列を含む選択プローブと特異的にハイブリダイゼーションさせる。選択する条件は、例えばＧ＋Ｃ含量、標的核酸のタイプ、核酸源、ハイブリダイゼーションプローブの大きさ等に応じて必要とされる特定の基準に基づく特定の状況に応じて変化する。続いてハイブリダイゼーション表面を洗浄して非特異的に結合したプローブ分子を除去し、標識の手段により、特異的ハイブリダイゼーションを検出または定量化する。Ｈaeｍophilus種で保存されている核酸配列部分を選択するのが好ましい。選択されたプローブは、少なくとも長さ１８bpであり、多くの場合３０〜９０bp長さである。
【００８２】
Ｈaeｍophilus influenzaeアドヘシン遺伝子の発現
宿主細胞に適合性の種に由来するレプリコンおよび制御配列を、発現系中のhia遺伝子の発現に利用してよい。ベクターは、通常、複製部位ならびに形質転換細胞中の表現型の選択を行うマーカー配列を有する。例えば、Ｅ.Ｃoliは、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含むpＢＲ３２２を使用して形質転換でき、従って、形質転換細胞を同定するための簡易な方法を提供する。pＢＲ３２２プラスミド、または他の微生物プラスミドまたはファージは、宿主細胞が自身のタンパク質を発現させるために使用できるプロモーターも含有するか、または含有するように変性する。
【００８３】
さらに、宿主細胞に適合性のレプリコンおよび制御配列を含有するファージベクターは、これらの宿主と一緒に形質転換ベクターとして使用できる。例えば、ラムダＧＥＭTM-１１中のファージを、Ｅ.ＣoliＬＥ３９２のような宿主細胞を形質転換させるために使用できる組み換えファージベクターを製造するために使用してよい。
【００８４】
組み換えＤＮＡ構築体中で一般的に使用されるプロモーターには、β-ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)およびラクトースプロモーターシステムおよび他の微生物プロモーター、例えばここで好ましい態様として使用されるＴ７プロモーターシステム(米国特許第４,９５２,４９６)が含まれる。プロモーターのヌクレオチド配列の詳細は公知であり、当業者にはそれらを遺伝子を用いて機能的に結合することが可能である。使用される特定のプロモーターは、一般的に、所望の結果に応じて選択されたプロモーターである。Ｈiaタンパク質および免疫学的フラグメントまたはその類似体の発現に適当な宿主には、Ｅ.Ｃoliが含まれ、Ｂordetella種、Ｂacillus種、Ｈaeｍophilusu種、菌体、酵母またはバクロウイルスシステムを使用してもよい。Ｅ.Ｃoliがここで使用される好ましい宿主である。
【００８５】
本発明において、特にＨaeｍophilus種を培養して精製した天然Ｈiaタンパク質が微量の毒性物質または他の汚染物質を含む場合に、Ｈiaタンパク質の製造は、組み換え法によるのが好ましい。この問題点は、組み換えにより製造されたＨiaタンパク質を異種システム中で使用することにより解決され、この際、Ｈiaタンパク質は、特に記載された構築体を使用して、精製物質中の汚染物質を最小化する方法で宿主から単離される。
【００８６】
微生物寄託
ここに記載し参照した分類不能型Ｈaeｍophilus株の高分子量タンパク質をコードする核酸を含むベクターを、本明細書の出願に先立って、ブタペスト条約に従い、１０８０１ Ｕniversity Ｂoulevard、Ｍanassas、Ｖirfinia ２０１１０-２２０９、米国に所在するＡｍerica Ｔype Ｃulture Ｃollection(ＡＴＣＣ)に寄託した。寄託されたベクターのサンプルは、公共に利用可能であり、課される全ての制限または寄託物を利用する権利は、この米国特許出願に基づく特許の許可を受けることとする。さらに、受託者が生存可能なサンプルを分配できない場合には、寄託物を受託者に戻すこととする。寄託された実施形態は本発明を例示するためだけのものであるので、本明細書に記載および請求された発明が、寄託された生物材料によって範囲を限定されることはない。本出願の記載と等価または同等な抗原をコードする核酸を含むいずれの等価または類似のベクターも本発明の範疇に入るものとする。
寄託概要
プラスミド ＡＴＣＣ 寄託年月日
ＢＫ-96-2-11 203771 1999年2月11日
【実施例】
【００８７】
上記の開示は概して本発明を説明している。以下の特定した実施例を参照するとさらに完全な理解が得られる。これらの実施例はただ例示の目的で説明されるものであり、本発明の範囲を限定しようとするものではない。状況によって形状の変化および同等品への置き換えを図ることで好都合なことを示唆できるかまたは提供できる。ここでは特殊な用語を使用したが、そのような用語は説明的感覚で使用するつもりであって限定を目的とするものではない。
【００８８】
本開示およびこれらの実施例には明記していないが、使用した分子遺伝学、蛋白質生化学、免疫学および発酵技術による方法は科学文献で広く報告されており、当業者の能力に充分に保有されたものである。
【００８９】
実施例１
この実施例はＮＴＨi菌株１１由来の全長のそろったrＨia蛋白質を発現するプラスミドＤＳ-２００８-２-３の構造を説明するものである。
【００９０】
ＮＴＨi菌株１１から染色体ＤＮＡを精製し、図１Ｂに記載したオリゴヌクレオチド(５０３８.ＳＬおよび５０３９.ＳＬ)を使用して全長のそろったhia遺伝子をＰＣＲ増幅した。pＴ７-７発現ベクター(ref.２１)にクローン化するためにＮde I部位をこの遺伝子の５’末端で設計し、ＢaｍＨ I部位を３’末端で設計した。増幅した断片をＮde I/ＢaｍＨ Iで切断し、同じ酵素で切断したpＴ７-７にクローン化した。プラスミドＤＳ-２００８-２-３はＴ７プロモーターの下流に３.４kbの１１株hia遺伝子を含む(図１Ａ)。このプラスミドは組換えＨiaを発現するために使用した(下記の実施例９)。
【００９１】
実施例２
この実施例は抗Ｍoraxella catarrhalis野生株高分子量アドヘシン抗体によるrＨiaの識別を例示するものである。
【００９２】
インフルエンザ菌のＨia蛋白質と前述した米国特許第５,８０８,０２４号の中でＭ.catarrhalis２００kＤa蛋白質として分類されるＭoraxella catarrhalis高分子量アドヘシン(図２８)との間にはいくらかの配列不変性が認められる。米国特許第５,８０８,０２４号の記載では、Ｍ.catarrhalis野生株２００kＤa蛋白質がゲル精製され、テンジクネズミの抗野生株２００kＤa抗体が生成された。Ｔ７ hia遺伝子はプラスミドＤＳ-２００８-２-３から発現され、rＨia蛋白質を含む細胞培養物がニトロセルロース膜に電気泳動的に転写された。抗野生株２００kＤa抗体を使用した免疫ブロット分析から、この抗体が図２に見られるように、rＨia蛋白質を認識することが示された。
【００９３】
実施例３
この実施例はＴ７ hia(１１)遺伝子カセットのタンデムコピーを含むプラスミドＤＳ-２０９２-１およびＤＳ-２０９２-４０の構造を説明するものである。
【００９４】
全長のそろった組換えＨia蛋白質の生成を向上させるために、菌株１１のhia遺伝子(実施例１)を含むＴ７ hia遺伝子カセットのタンデムコピーを単一のベクターに挿入した。プラスミドＤＳ-２００８-２-３をＢgl IIで直線化させ、脱リン酸化した。プラスミドＤＳ-２００８-２-３はまた、Ｔ７ hia遺伝子カセットを切り取るためにＢgl IIおよびＢaｍＨ Iによっても切断された。このＴ７ hia断片を直線化したベクターに連結し、反時計回り方向に配向して２つのＴ７ hia遺伝子コピーを含むプラスミドＤＳ-２０９２-１(a,a)および反対方向に配向してタンデムコピーを含むプラスミドＤＳ-２０９２-４０(a,c)(図３)を生成した。どちらの作製試料からもrＨia発現における顕著な向上は認められなかった(下記の実施例９参照)。
【００９５】
実施例４
この実施例は末端欠失した菌株１１のhia遺伝子を発現するプラスミドの作製を説明するものである。
【００９６】
Ｔ７ hia遺伝子カセットの単一またはタンデムのコピーからのrＨia蛋白質生成量は非常に低く、この蛋白質は(下記の実施例９で説明するように)Ｅ.coliに対する毒性を有するようであった。インフルエンザ菌のＨiaは表面露出したアドヘシン分子であるので、分泌をするためにはシグナル配列または補助蛋白質のいずれかを使用しなければならないが、しかし関連の補助遺伝子は判明していない。もしもＥ.coli中での組換え蛋白質発現のためにシグナル配列が除去された場合、rＨiaは封入体として発現され、毒性効果が低減される可能性がある。推定されるシグナル配列および切断部位を分類し、Ｎ末端で末端欠失したrＨia蛋白質を発現する４種類の作製試料を設計した(図４)。菌株１１のhia遺伝子では開始コドンから約５００bpに独特のＳty I切断部位が存在する。プラスミドＤＳ-２００８-２-３をＮde IおよびＳty Iで切断し、５.７kbのベクター断片を精製した(図５Ａ)。末端欠失部位からＳty I切断部位までを増幅するためにＰＣＲプライマーを設計し、末端欠失したクローンを選別するためにアンチセンスプライマーに独特のＮhe I切断部位を導入した(図５Ｂ)。増幅した断片は、より操作を容易にするためにpＣＲII中でサブクローン化し、プラスミドＤＳ-２１５３Ｒ-１-２(Ｅ２１)、ＤＳ-２１６５-４-８(Ｔ３３)、ＤＳ-２１５３-３-５(Ｖ３８)、およびＤＳ-２１５３-４-４(Ｎ５２)を生成した。このpＣＲII hiaプラスミドをＮde IおよびＳty Iで切断し、断片をＤＳ-２００８-２-３から得たベクター片と連結した。プラスミドＤＳ-２１８６-１-１(Ｅ２１)、ＤＳ-２２０１-１(Ｔ３３)、ＤＳ-２１８６-２-１(Ｖ３８)、およびＤＳ-２１６８-２-６(Ｎ５２)を、カッコ内に示したＴ７プロモーターおよび末端欠失したhia遺伝子を含ませて生成した。これらのプラスミドは組換えＨiaを発現させるために使用した(下記の実施例９参照)。
【００９７】
実施例５
この実施例はＴ７ Ｖ３８ hia(１１)カセット、Ｅ.coli cer遺伝子、およびカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＢＫ-９６-２-１１の作製を説明するものである。
【００９８】
プラスミドＤＳ-１８４３-２は多数のクローン化部位および２つの転写終結部がＥcoＲ IおよびＰst I部位の間でオリゴヌクレオチド上に導入され、これによってクロラムフェニコールおよびアンピシリン耐性遺伝子の両方が破壊されたpＢＲ３２８を基にしたプラスミドである(図６Ｂ)。pＵＣ-４Ｋから得たカナマイシン耐性遺伝子をＳal I部位に挿入し、カナマイシン耐性でかつテトラサイクリン感受性のプラスミドＤＳ-２１４７-１を生成した。プラスミドＤＳ-２２２４-１-４はオリゴヌクレオチドから作製してＢaｍＨ I切断部位に接する合成のＥ.coli cer遺伝子(ref.１５)を含むpＵＣプラスミドである。このcer遺伝子の２９０bpのＢaｍＨ I断片をＤＳ-２１４７-１のＢaｍＨ I部位に挿入してプラスミドＢＫ-２-１-２を作製した。その結果、このpＢＲを基にしたプラスミドは多数のクローン化部位、カナマイシン耐性遺伝子およびcer遺伝子を含む。プラスミドＢＫ-２-１-２はＢgl IIで直線化し、脱リン酸化した。プラスミドＤＳ-２１８６-２-１をＢgl IIおよびＢaｍＨ Iで切断し、３.６kbのＴ７ Ｖ３８ hia断片をＢＫ-２-１-２に挿入してプラスミドＢＫ-９６-２-１１を作製した(図６Ａ)。
【００９９】
実施例６
この実施例はＥ.coli cer遺伝子の存在下で全長のそろったＮＴＨi菌株３３のhia遺伝子を発現するプラスミドＤＳ-２２４２-１およびＤＳ-２２４２-２の作製を説明するものである。
【０１００】
ＮＴＨi菌株３３から染色体ＤＮＡを精製し、オリゴヌクレオチド５０３９.ＳＬおよび５０４０.ＳＬ(図１７)を使用してＰＣＲ増幅を実施した。センスプライマー(５０４０.ＳＬ)は菌株１１のhiaの５’隣接配列を基にして設計したものであって、ＮＴＨi ＨiaおよびＨib Ｈsf蛋白質のアミノ末端配列を保存していた。アンチセンスプライマー(５０３９.ＳＬ)は実施例１で述べたものと同じであって、ＨiaおよびＨsf蛋白質のカルボキシ末端配列の保存を基本とした。菌株３３の３kbのhia ＰＣＲ断片をpＣＲ II中でクローン化し、プラスミドＤＳ-１９１７-３-８を作成した。
【０１０１】
全長のそろった菌株３３ hia遺伝子を発現させるために、この遺伝子の５’末端の、開始コドンからＡlｗＮ I切断部位まで(図７Ｂ)の、およそ１０６bpをオリゴヌクレオチドから合成した。プラスミドＤＳ-１９１７-３-８をＡlｗＮ IおよびＢaｍＨ Iで切断し、hia遺伝子を含む約２.９kbの断片を精製した。プラスミドpＴ７-７をＮde IおよびＢaｍＨ Iで切断し、Ｎde I-ＡlｗＮ IオリゴヌクレオチドおよびＡlｗＮ I-ＢaｍＨ I hia断片をこのpＴ７-７ベクターに連結してプラスミドＤＳ-２１０３-４を作製した。
【０１０２】
Ｅ.coli cer遺伝子を含ませ、カナマイシンによる選択を使用するために、Ｔ７ hia(３３)遺伝子カセットを含むＢgl II-ＢaｍＨ I断片をＤＳ-２１０３-４から切り取り、Ｂgl IIで切断されて脱リン酸化されたＢＫ-２-１-１中でクローン化した。プラスミドＤＳ-２２４２-１およびＤＳ-２２４２-２は反対方向に配向したＴ７ hia(３３)遺伝子カセットの単一コピー、Ｅ.coli cer遺伝子、およびカナマイシン耐性遺伝子を含む(図７Ａ)。
【０１０３】
実施例７
この実施例は末端欠失したＶ３８菌株３３のhia遺伝子をもつＴ７ hia遺伝子カセット、Ｅ.coli cer遺伝子、およびカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＳ-２３４０-２-３の作製を説明するものである。
【０１０４】
ＮＴＨi菌株３３ hia遺伝子の、Ｖ３８開始コドンから内側のＳnaＢ I切断部位に至るまでの、５’末端の２５０bp断片を増幅するためにＰＣＲプライマーを設計した。クローン化を目的として５’末端にＮde I切断部位を追加し、鋳型としてプラスミドＤＳ-２２４２-１を使用してこの断片を増幅した。この構成図式は図８Ａに示されており、ＰＣＲプライマーは図８Ｂに示されている。この断片をpＣＲ IIにクローン化し、プラスミドＤＳ-２３２８-１-１を作製した。ＤＳ-２２４２-１をＮde IおよびＳnaＢ Iで切断し、８.５kbのベクター断片を精製した。ＤＳ-２３２８-１-１をＮde IおよびＳnaＢ Iで切断し、その０.２５kbの５’hia断片をＤＳ-２２４２-１から得た８.５kbのベクター断片と連結してプラスミドＤＳ-２３４０-２-３を作製した。
【０１０５】
実施例８
この実施例はＴ７ Ｖ３８ hia(１１)またはＴ７ Ｖ３８ hia(３３)遺伝子カセットのタンデムコピーをそれぞれと、Ｅ.coli cer遺伝子、およびカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＳ-２４４７-２およびＤＳ-２４４８-１７の作製を説明するものである。
【０１０６】
Ｔ７ Ｖ３８ hia(１１)遺伝子カセットを含むプラスミドＢＫ-９６-２-１１をＢgl IIで直線化し、脱リン酸化した。ＤＳ-２１８６-２-１から得たＢgl II-ＢaｍＨ I Ｔ７ Ｖ３８ hia(１１)遺伝子カセットをＢＫ-９６-２-１１に連結し、同じ配向でＴ７ Ｖ３８ hia(１１)遺伝子のタンデムコピーを含むプラスミドＤＳ-２４４７-２を作製した(図９Ａ)。
【０１０７】
プラスミドＤＳ-２３４０-２-３をＥcoＲ Iで切断し、そのＴ７ Ｖ３８ hia(３３)遺伝子カセットを、ＥcoＲ Iで切断して脱リン酸化したpＵＣ-ＢgＸbにサブクローン化した。その結果得られたプラスミドＤＳ-２４４０-２をＢgl IIおよびＢaｍＨ Iで切断してＴ７ Ｖ３８ hia(３３)カセットを放出させ、Ｂgl IIで直線化して脱リン酸化したＤＳ-２３４０-２-３とそれを連結した。プラスミドＤＳ-２４４８-１７は同じ配向でタンデムのＴ７ Ｖ３８ hia(３３)遺伝子を含む(図９Ｂ)。
【０１０８】
実施例９
この実施例は全長のそろったおよび末端欠失した組換えhia遺伝子の発現を説明するものである。
【０１０９】
先行の実施例で説明したようにして調製した発現プラスミドのＤＮＡを、ＢioＲad社のエレクトロポレータを使用して電子的に受容可能となったＥ.coli ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞に導入した。細胞は適切な抗生物質選別を使用して、ラクトースを１.０％になるまで加える前に、Ａ578が０.３となるまでＮＺＣＹＭ培地中で３７℃にて４時間成育させた。サンプルはＳＤＳ-ＰＡＧＥ分解液＋負荷バッファで０.２ＯＤ/μlとなるよう調整し、それぞれの蛋白質サンプルを同じ量でＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル(ref.２２)に流した。図１０は種々の作製試料からのrＨia(１１)蛋白質相対生成量を図解したものである。パネルＡに見られるように、rＨiaのサイズが低下するにつれて生成量の増加が認められる。Ｖ３８-(レーン５)およびＮ５２-末端欠失rＨia(レーン６)はそれらのさらに長い相当物質(レーン２、３、４)よりも有意差をもって高い発現レベルを有する。加えて、パネルＢはＶ３８ rＨiaの生成がcer遺伝子の存在下で明らかに増加することを示している。
【０１１０】
実施例１０
この実施例はrＨia蛋白質の精製について説明するものである。
【０１１１】
すべての組換えＨia蛋白質はＥ.coli中で封入体として発現され、同じ手法によって精製された(図１１)。５００ｍlの培養物から得たＥ.coli細胞ペレットを０.１ＭのＮaＣlを含むpＨ８.０の５０ｍＭトリス塩酸５０ｍl中に再懸濁し、超音波破砕した。この抽出物を２０,０００×gで３０分間遠心分離し、その結果生じた上清を廃棄した。このペレット(ＰＰＴ1)をさらに０.５％Ｔriton Ｘ-１００および１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍlの５０ｍＭトリス塩酸、pＨ８.０で抽出処理し、それから２０,０００×gで３０分間遠心分離して上清を廃棄した。このペレット(ＰＰＴ2)をさらに１％のオクチルグルコシドを含む５０ｍlの５０ｍＭトリス塩酸、pＨ８.０で抽出し、それから２０,０００×gで３０分間遠心分離して上清を廃棄した。
【０１１２】
以上の抽出処理後に結果として得られたペレット(ＰＰＴ3)は封入体を含んでいる。このペレットを６Ｍのグアニジンおよび５ｍＭのＤＴＴを含む６ｍlの５０ｍＭトリス塩酸、pＨ８.０に溶解した。この溶液に１２ｍlの５０ｍＭトリス塩酸、pＨ８.０を加え、混合液を２０,０００×gで３０分間遠心分離した。この上清(ＳＵＰ4)を終濃度７％のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)４０００で沈降させた。その結果生じたペレット(ＰＰＴ5)を２０,０００×gで３０分間遠心分離して除去し、上清を５０％飽和の硫酸アンモニウムで沈降させた。硫酸アンモニウムによる沈降物は２０,０００×gで３０分間遠心分離して採取した。結果として得られたペレット(ＰＰＴ6)を６Ｍのグアニジン塩酸および５ｍＭのＤＴＴを含む２ｍlの５０ｍＭトリス塩酸、pＨ８.０に溶解し、この透明な液体を、２Ｍのグアニジン塩酸を含む５０ｍＭトリス塩酸、pＨ８.０で平衡化したＳuperdex２００ゲル濾過カラムで精製した。画分はＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析し、精製されたrＨiaを含む画分をプールし、４℃でＰＢＳに対して一晩透析し、その後、２０,０００×gで３０分間遠心分離した。これらの条件では蛋白質は可溶性を維持しており、−２０℃で保存するためにこのrＨia調製液にグリセロールを終濃度２０％で加えた。精製されたＶ３８ rＨia(１１)およびＶ３８ rＨia(３３)のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析は図１２に図解されている。精製Ｖ３８ rＨia蛋白質の平均収率は約１０ｍg/Ｌ培地である。
【０１１３】
rＨiaの安定性を調べるために、精製したＶ３８ rＨia(１１)蛋白質は４℃でグリセロールなしかまたは入れて保存するか、あるいはグリセロールを入れて-２０℃で保存した。この蛋白質は３つの条件すべてにおいて安定であることが分かり、凍結と解凍を繰り返して少なくとも８週間は完全さを維持した(図１３)。
【０１１４】
実施例１１
この実施例はＶ３８ rＨia(１１)およびＶ３８ rＨia(３３)蛋白質の免疫原性を説明するものである。
【０１１５】
日程１において完全フロイントアジュバント(ＣＦＡ、Ｄifco)で乳化した５μgの抗原を筋肉内(i.ｍ.)注入して二匹のテンジクネズミ(Ｃharles Ｒiver)を免疫感作させることによってrＨia蛋白質に対する高度免疫抗血清を生成させた。日程１４および２８において不完全フロイントアジュバント(ＩＦＡ)に加えた蛋白質５μgを投与して動物を追加免疫応答させ、日程４２において血清を集めた。免疫原として熱で不活化したバクテリア調製物(１回の投与量１×１０8cfu)を使用した以外は同じプロトコルを使用して、抗Ｈib菌株ＭinnＡおよび抗ヘモフィルス属菌株ＡＴＣＣ９００６抗血清を作製した。
【０１１６】
Ｖ３８ rＨia蛋白質の免疫原性を調べるために、５匹のＣＤ-１マウス(Ｃharles Ｒiver,Ｑuebec)の複数グループを日程１および２８において、リン酸アルミニウム(aluｍ)の存在下(１回の投与量１.５ｍg)で０.３、１、３、および１０μgの抗原によりs.c.免疫感作させた。血液サンプルを日程１、２８および４２において集めた。顕著に抗Ｖ３８ rＨia抗体を生成したマウスは抗体０.３μgを１回注入されても応答を示し(図１４、パネルＡ)、両方の蛋白質ともに封入体抽出および可溶化処理の後でも免疫原性を維持することを示唆している。菌株１１または３３に由来するＶ３８ rＨia蛋白質によって誘導される抗体力価において統計学的に顕著な差異は認められなかった。
【０１１７】
ＢＡＬＢ/cマウスにおいてＶ３８ rＨia(１１)蛋白質の免疫原性を調べるために、５匹の動物(Ｃharles Ｒiver,Ｑuebec)の複数グループを日程１、２８および４２において、リン酸アルミニウムの存在下(１回の投与量１.５ｍg)で抗原０.３、１、３、および１０μgによりs.c.免疫感作させた。血液サンプルは日程１、１４、２８、４２および５６において集めた。すべてのグループにおいて高い抗体力価が認められ、この蛋白質が１回の投与量０.３μgにおいてさえ強度の免疫原性であることを示した(図１５、パネルＡ)。
【０１１８】
テンジクネズミにおいてＶ３８ rＨia(１１)蛋白質の免疫原性を調べるために、５匹の動物(Ｃharles Ｒiver,Ｑuebec)の複数グループを日程１、２８および４２において、リン酸アルミニウムの存在下(１回の投与量１.５ｍg)で抗原０.３、１、３、および１０μgによりs.c.免疫感作させた。血液サンプルは日程１、１４、２８、４２および５６において集めた。すべてのグループにおいて高い抗体力価が認められ、この蛋白質がテンジクネズミにおいてもまた強度の免疫原性であることを示した(図１５、パネルＢ)。
【０１１９】
実施例１２
この実施例は菌血症の無抵抗な幼齢ラットのモデルにおいて抗rＨia抗体によって生じる防御の分析を説明するものである。
【０１２０】
妊娠中のＷistarラットをＣharles Ｒiverから入手した。インフルエンザ菌b型の菌血症モデルでは、６〜１０匹の５日齢の幼齢ラットのグループを、テンジクネズミの抗rＨiaまたは抗菌株ＭinnＡ抗血清０.１ｍl、背面 でs.c.注入した。比較対照の動物には免疫感作前の血清のみを注入した。２０時間後、元気に生育したＨib菌株ＭinnＡを２００〜２４０コロニー形成ユニット(cfu)で(０.１ｍl)腹腔内(i.p.)抗原投与した。血液サンプルを抗原投与後２０時間に、イソフルラン麻酔して心臓に針を刺して集め、チョコレート寒天培地にまいた。１日後、コロニーをカウントしてその結果をフィッシャー検定(Ｆisher’s Ｅxact test)によって統計学的に分析した。
【０１２１】
インフルエンザ菌a型菌血症モデル(ref.２３)では、９〜１０匹の５日齢の幼齢ラットのグループを、テンジクネズミの抗rＨiaまたは抗菌株ＡＴＣＣ９００６抗血清０.１ｍl、背面でs.c.注入した。比較対照グループの動物にはテンジクネズミの免疫感作前の血清を注入した。２０時間後、元気に生育したインフルエンザ菌a型菌株ＡＴＣＣ９００６を(０.１ｍl)１００,０００cfuで動物にi.p.抗原投与した。血液サンプルを抗原投与の２０時間後に集めて上述のように分析した。
【０１２２】
後述の表１および２に示したように、テンジクネズミの抗rＨia(１１)または抗Ｖ３８ rＨia(１１)抗血清のいずれかで受動免疫感作された幼齢ラットは、菌血症を引き起こしたインフルエンザ菌a型またはb型に対してすべてが顕著に防御された。これらの結果は、インフルエンザ菌a型またはb型によって引き起こされる菌血症に対して動物を防御することにおいて、わずかに末端欠失したＨia蛋白質(Ｖ３８ rＨia)に対応して生成した抗体が全長のそろった蛋白質に対応して生成したものと同程度に効果的であることを示している。ＮＴＨi由来の組換え蛋白質によって生じる、被包性のバクテリアによって引き起こされる侵襲性の疾病に対するそのような防御はrＨia蛋白質のワクチン抗原としての有用性を説明するものである。
【０１２３】
実施例１３
この実施例は鼻咽頭部でのコロニー形成のチンチラのモデルにおいて、Ｖ３８ rＨia蛋白質の免疫感作によって生じる防御を説明するものである。
【０１２４】
鼻咽頭部のコロニー形成モデルはＹangらによって報告された(ref.２０)。このモデルは、ＨＭＷアドヘシンを産生するＮＴＨi菌株については適切であるが、しかしＨiaを産生する菌株では同じ条件で再現性のあるコロニー形成は達成できなかった。原型のＨia産生ＮＴＨi菌株１１で繰り返したコロニー形成の試みは不成功であった。原型のＨＭＷ産生ＮＴＨi菌株１２ではわずか１０8cfuしか必要としなかったのに比べて、ＮＴＨi菌株３３では１回の植菌当たり５×１０8cfuでコロニー形成が達成された。これらの条件下では、１００μgのＶ３８ rＨia(３３)で免疫感作され、同様のＮＴＨi菌株３３で抗原投与された動物において部分的な防御が認められた。
【０１２５】
実施例１４
この実施例はインフルエンザ菌株に由来する追加のhia遺伝子のクローン化および配列分析を説明するものである。
【０１２６】
保存されたプロモーター、hiaおよびhsf遺伝子および蛋白質のＮ末端およびＣ末端配列に基づいて、ＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチド(５０４０.ＳＬおよび５０３９.ＳＬ)を設計した(図１７)。ＰＣＲ増幅のための選択菌株は抗rＨia(１１)抗血清との反応性に基づいて選んだ。
【０１２７】
ＮＴＨi菌株１２、２９、３２、Ｍ４０７１、Ｋ９および、Ｋ２２およびヘモフィルスc型菌株ＡＰIから染色体ＤＮＡを調製した。ＰＣＲ増幅は以下のようにして実施した。それぞれの反応混合液には５〜１００ngのＤＮＡ、それぞれ１μgのプライマー、５ユニットのtaq＋またはtsg＋(Ｓangon)またはtaqプラスロング(Ｓtratagene)、２ｍＭのdＮＴＰs、２０ｍＭのトリス塩酸(pＨ８.８)、１０ｍＭの塩化カリウム、１０ｍＭの硫酸アンモニウム、２ｍＭの硫酸マグネシウム、０.１％のＴriton Ｘ-１００、ＢＳＡを含ませた。サイクル条件は、９５℃で１分間、その後、９５℃で３０秒、４５℃で１分間、７２℃で２分間のサイクルを２５サイクル行い、その後、７２℃で１０分間とした。
【０１２８】
菌株３３のhia遺伝子のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列が図１８に示されている。予測された菌株３３由来のＨia蛋白質は１０３.６kＤaの分子量を有し、pIが９.４７であった。菌株３２のhia遺伝子のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列は図１９に示されている。予測された菌株３２由来のＨia蛋白質は７０.４kＤaの分子量を有し、pIが５.６７であった。残基４９３と４９６との間にはＫＤＥＬ配列が存在する。そのような配列は小胞体への固定蛋白質に付随するものであった。由来する菌株３２のＨia蛋白質は顕著により小さくかつ顕著に異なるpIを有するが、しかしながら他のＨia蛋白質に存在する特色の多くを含んでいる。
【０１２９】
菌株２９のhia遺伝子のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列が図２０に示されている。予測された菌株２９のＨia蛋白質は１１４.４kＤaの分子量および７.５８のpIを有する。菌株Ｋ２２のhia遺伝子のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列が図２３に示されている。予測された菌株Ｋ２２のＨia蛋白質は１１４.４kＤaの分子量および７.５８のpIを有する。ＮＴＨi菌株２９およびＫ２２に由来するＨia配列は同一であることが判明した。菌株２９はオハイオ州クリーブランドの中耳炎の生後７カ月の乳児から単離され、それに対して菌株Ｋ２２はオーストラリアのキンバリー近郊のアボリジニから単離された。
【０１３０】
菌株４０７１のhia遺伝子のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列が図２１に示されている。予測されたＭ４０７１のＨia蛋白質は１０３.４kＤaの分子量および９.４９のpIを有する。残基５３４と５３７との間にはＫＤＥＬ配列が存在する。
【０１３１】
菌株Ｋ９のhia遺伝子のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列が図２２に示されている。予測された菌株Ｋ９のＨia蛋白質は１１３.８kＤaの分子量および６.４５のpIを有する。
【０１３２】
ヘモフィルスc型菌株ＡＰIのhia遺伝子のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列が図２４に示されている。予測されたＡＰIのＨia蛋白質は２４９.４kＤaの分子量および５.３４のpIを有する。c型菌株ＡＰIの由来するＨia/Ｈsf配列は６０残基の挿入部があることを除いて公表されているb型のＨsf配列と殆ど同一である。ここに提示したＮＴＨiに基づくＨia蛋白質はa型およびb型感染の受動モデルにおいて防御をするので、b型とc型蛋白質との間の配列類似性に起因するc型の疾病に対してもまた防御をすることはありそうである。
【０１３３】
菌株１２のhia遺伝子座のヌクレオチドおよびそれに由来するアミノ酸の配列が図２５に示されている。ＮＴＨi菌株１２はＨiaを生成しない。しかしながら、hia遺伝子部分はＰＣＲ増幅可能であり、ＳＢ１２細胞溶解物と抗rＨia抗体とのつじつまの合わない陽性の反応性が存在し、サザンブロットでは菌株１１のhia遺伝子の３’末端に由来するＤＮＡプローブとの反応性がある。ＰＣＲ増幅したＤＮＡの分析から、上流ＨI１７３２関連遺伝子の３’末端の１kbおよびhia遺伝子の３’末端の０.８kbを含む１.８kbの断片が明らかになった。
【０１３４】
菌株１２中のこれら２つの遺伝子の推定される接合部を交差して増幅するであろうプライマーを使用してＰＣＲ増幅したところ、この遺伝子座の遺伝子組成が確認された。したがって、菌株１２はhia遺伝子の５’末端の欠失を生じたためにＨiaを生成しないようであった。図２７は菌株１２の上流ＯＲＦとＲdゲノム由来ＨI１７３３蛋白質との配列比較を示すものである。相同の領域によって、これら２つの蛋白質は９５％が同一である。
【０１３５】
ＮＴＨi菌株３３、３２、２９、Ｋ２２、Ｍ４０７１、１１、９およびc型菌株ＡＰIからの由来Ｈia配列のアラインメントが、インフルエンザ菌b型Ｈsf、ＲdゲノムのaidＡ類似(Ｈsf/Ｈia)ＨI１７３２遺伝子、と菌株４２２３およびＬＥＳ-１のＭ.catarrhalis ２００kＤa蛋白質と比較して図２８に示されている。ＨI１７３２蛋白質の早期末端欠失の結果生じる、Ｒdゲノム配列内のフレーム移動が認められる。hiaに関連する付加的な下流配列はここに含まれる。配列の下にある星印は保存された残基を示している。Ｎ末端(約５０残基)およびＣ末端配列(約１５０残基)はヘモフィルス菌株の中で高度に保存されており、Ｍ.catarrhalisの相応部分とのある程度の類似性は明白である。配列分析から、Ｈia蛋白質について２つの可能性のある遺伝子集団が存在し、１つは原型の菌株１１に関係し、他方はさらに密接に菌株３３に関係することは明らかである。菌株１１およびＫ９の蛋白質は、より一層ヘモフィルス菌株のb型、c型またはd型由来のＨsf蛋白質に類似しているようであるが、一方で、菌株３３、３２、２９、Ｋ２２およびＭ４０７１の蛋白質は第２の集団を構成するようである。
【０１３６】
実施例１５
この実施例は末端欠失したＳ４４ 菌株１１ hia遺伝子をもつＴ７ hia遺伝子カセット、Ｅ.coli cer遺伝子、およびカナマイシン抗生物質耐性遺伝子を含むプラスミドＪＢ-２９３０-３の作製、およびＳ４４ Ｈia蛋白質の発現を説明するものである。
【０１３７】
Ｓ４４アミノ酸から内側のＳty I切断部位までのＮＴＨi菌株１１ hia遺伝子のＳ４４ Ｈia Ｎ末端(図２９)を増幅するためにＰＣＲプライマーを設計した。クローン化を目的として５’末端にＮde I切断部位を追加し、鋳型としてプラスミドＤＳ-２２４２-１を使用してこの断片を増幅した。この断片をpＣＲ IIにクローン化してプラスミドＪＢ-２９１０-１-１を作製した。この構成図式を図３０に示す。プラスミドＪＢ-２９１０-１-１をＮde IおよびＳty Iで切断し、５’ＰＣＲ hia断片を単離した。Ｖ３８ hia遺伝子を含むプラスミドIＡ-４６-５をＮde IおよびＳty Iで切断し、大きい方の約８.５kbの断片を精製した。これら２つの精製断片を連結してプラスミドＪＢ-２９１７-１を作製した。その後、このプラスミドをＮde Iで切断し、ウシ腸のホスファターゼ(ＣＡＰ)で処理し、プラスミドIＡ-４６-５から得たＴ７プロモーターをその中でクローン化した。このプロモーターはIＡ-４６-５のＮde I切断により切り取った。結果として得られたプラスミドＪＢ-２９２５-３をＢgl IIおよびＢaｍＨ Iで切断してhia遺伝子を単離した。Ｂgl II/ＣＡＰ処理したプラスミドＢＫ-２-１-２にこの断片を連結し、プラスミドＪＢ-２９３０-３を作製した。このプラスミドはＴ７プロモーターＳ４４ hia遺伝子およびＥ.coli cer遺伝子を含み、カナマイシン耐性である。
【０１３８】
発現を調べるため、組換えＳ４４ hiaベクターをＥ.coli ＢＬ２１(ＤＥ３)に転換した。Ｅ.coliにおける発現のための手法は実施例９に記載したりである。図３１のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析は、２つの異なるベクター、(上述の)ＪＢ-２９３０-３およびpＥＴベクターのIＡ-１９１-３-１からの組換えＳ４４ hiaの発現を示している。プラスミドIＡ-１９１-３-１は、それがlacIqリプレッサーを含むpＥＴベクターであり、したがって生成するＳ４４ Ｈiaの量がＪＢ-２９３０-３からのＴ７ Ｓ４４よりも少ないということを除くとＪＢ-２９３０-３と同じである。このプラスミドは、プラスミドＪＢ-２９３０-３とともに、図３２に示されている。図３１は二重のバンド(レーン３)としておよそ１１６kＤaのＳ４４ Ｈiaを示している。ＪＢ-２９３０-３から精製したＳ４４ hiaを使用した追加の分析によると、この二重バンドの下側のバンドはＣ末端の９４アミノ酸の末端欠失を有するがＮ末端と考えられるものはそのまま存在することが判明した。末端欠失したＨiaの単離に使用した精製方法は実施例１０に記載した通りであった。
【０１３９】
(開示の概要)
本開示の概要では、本発明は新たに単離精製した、ヘモフィルスから得たインフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)蛋白質の全長を有するものおよびＮ末端欠失したものをコードし、防御力のあるＨia蛋白質を遺伝子組換えにより生成することを可能にする核酸分子を提供する。本発明の範囲内での変更態様は可能である。
【０１４０】
【表１】
【０１４１】
【表２】
【０１４２】
参考文献
【０１４３】
【表３】
【０１４４】
【表４】
【０１４５】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１Ａ】Ｔ７プロモーターおよび完全長ＮＴＨi菌株１１のhia遺伝子を含むプラスミドＤＳ-２００８-２-３の制限地図を示す図である。
【図１Ｂ】菌株１１のhia遺伝子をＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。センス鎖(５０３８.ＳＬ):配列番号１、エンコードされているアミノ酸配列番号２；アンチセンス鎖(５０３９.ＳＬ):配列番号３、相補配列番号４、エンコードされているアミノ酸配列番号５。制限酵素部位はＢ、ＢaｍＨ I；Ｂg、Ｂgl II；Ｈ、Ｈind III；Ｎ、Ｎde I；Ｐs、Ｐst I；Ｓty、Ｓty Iである。他の略語はＴ７p、Ｔ７プロモーター；ＡpＲ、アンピシリン耐性である。
【図２】抗ネイティブＭoraxella catarrhalisの高分子量アドヘシン抗体による、完全長rＨiaタンパク質の認識のイムノブロットを示す図である。レーン１、非誘導型ＤＳ-２０４３-１；レーン２、４時間かけて誘導されたＤＳ-２０４３-１；レーン３、非誘導型ＤＳ-２０４３-２；レーン４、４時間かけて誘導されたＤＳ-２０４３-２；レーン５、分子量マーカー。ＤＳ-２０４３-１およびＤＳ-２０４３-２は、ＢＬ２１(ＤＥ３)内のpＴ７hia(１１)の独立したクローンである。
【図３】菌株１１のhia遺伝子用のＴ７hia遺伝子カセットのタンデムコピーを含むプラスミドＤＳ-２０９２-１およびＤＳ-２０９２-４０の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢaｍＨ I；Ｂg、Ｂgl II；Ｈ、Ｈind III；Ｐs、Ｐst I；Ｘb、Ｘba Iである。他の略語はＣＡＰ、子牛のアルカリホスファターゼ；Ｔ７p、Ｔ７プロモーター；ＡpＲ、アンピシリン耐性である。
【図４】菌株１１のＨiaタンパク質の切断部位(配列番号６)を示す図である。
【図５Ａ】菌株１１からの切断型hia遺伝子を発現するプラスミドの構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢaｍＨ I；Ｂg、Ｂgl II；Ｈ、Ｈind III；Ｎ、Ｎde I；Ｎhe、Ｎhe I；Ｐs、Ｐst I；Ｒ、ＥcoＲ I；Ｓty、Ｓty I；Ｘb、Ｘba Iである。他の略語はＴ７p、Ｔ７プロモーター；ＡpＲ、アンピシリン耐性；ＫanＲ、カナマイシン耐性である。
【図５Ｂ】切断型遺伝子用に５’断片をＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。Ｅ２１切断部:センス(５５２４.ＳＬ):配列番号７、エンコードされているアミノ酸配列番号８；Ｔ３３切断部:センス(５５２５.ＳＬ):配列番号９、エンコードされているアミノ酸配列番号１０；Ｖ３８切断部:センス(５５２６.ＳＬ):配列番号１１、エンコードされているアミノ酸配列番号１２；Ｎ５２切断部:センス(５５２７.ＳＬ):配列番号１３、エンコードされているアミノ酸配列番号１４；アンチセンス(５５２８.ＳＬ):配列番号１５、相補配列番号１６、エンコードされているアミノ酸配列番号１７。
【図５Ｂ１】切断型遺伝子用に５’断片をＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。Ｅ２１切断部:センス(５５２４.ＳＬ):配列番号７、エンコードされているアミノ酸配列番号８；Ｔ３３切断部:センス(５５２５.ＳＬ):配列番号９、エンコードされているアミノ酸配列番号１０；Ｖ３８切断部:センス(５５２６.ＳＬ):配列番号１１、エンコードされているアミノ酸配列番号１２；Ｎ５２切断部:センス(５５２７.ＳＬ):配列番号１３、エンコードされているアミノ酸配列番号１４；アンチセンス(５５２８.ＳＬ):配列番号１５、相補配列番号１６、エンコードされているアミノ酸配列番号１７。
【図６Ａ】ＮＴＨi菌株１１および大腸菌のcer遺伝子からのＶ３８hia遺伝子を含むプラスミドＢＫ-９６-２-１１の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢaｍＨ I；Ｂg、Ｂgl II；Ｋ、Ｋpn I；Ｎ、Ｎde I；Ｐ、Ｐst I；Ｒ、ＥcoＲ I；Ｓ、Ｓal I；Ｓｍ、Ｓｍa I；Ｓty、Ｓty I；Ｘb、Ｘba I；Ｘho、Ｘho Iである。他の略語はＴ７p、Ｔ７プロモーター；ＡpＲ、アンピシリン耐性；ＫanＲ、カナマイシン耐性；ＣＡＰ、子牛のアルカリホスファターゼ；tt１、trpＡからの転写ターミネーター１；tt２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図６Ｂ】複数のクローン部位および転写ターミネーターを構築するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。「Ｒ」および「Ｐs」はＥcoＲ IまたはＰst Iの端部とオーバーラップする末端を示すが、これらの部位を再び生成するわけではない。上側鎖(配列番号５０)、下側(配列番号５１)。
【図７Ａ】Ｔ７プロモーターおよび完全長のＮＴＨi菌株３３のhia遺伝子、大腸菌のcer遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＳ-２２４１-１およびＤＳ-２２４２-２の構築を示す図である。制限酵素部位はＡ、ＡlｗＮ I；Ｂ、ＢaｍＨ I；Ｂg、Ｂgl II；Ｈ、Ｈind III；Ｋ、Ｋpn I；Ｎ、Ｎde I；Ｐs、Ｐst I；Ｒ、ＥcoＲ I；Ｓ、Ｓal I；Ｓｍ、Ｓｍa I；；Ｘb、Ｘba I；Ｘho、Ｘho Iである。他の略語はＴ７p、Ｔ７プロモーター；ＡpＲ、アンピシリン耐性；ＫanＲ、カナマイシン耐性；tt１、trpＡからの転写ターミネーター１；tt２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図７Ｂ】鎖(配列番号５２)、相補鎖(配列番号５３)、およびエンコードされているアミノ酸配列(配列番号５４)をコードしている菌株３３のhia遺伝子の５’末端を生成するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。
【図８Ａ】Ｔ７プロモーターおよび菌株３３からのＶ３８遺伝子、大腸菌のcer遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＳ-２３４０-２-３の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢaｍＨ I；Ｂg、Ｂgl II；Ｈ、Ｈind III；Ｎ、Ｎde I；Ｐs、Ｐst I；Ｒ、ＥcoＲ I；Ｓ、Ｓal I；Ｓn、ＳnaＢ I；；Ｘb、Ｘba Iである。他の略語はＴ７p、Ｔ７プロモーター；ＡpＲ、アンピシリン耐性；ＫanＲ、カナマイシン耐性；tt１、trpＡからの転写ターミネーター１；tt２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図８Ｂ】切断型遺伝子用の５’端をＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。センス(６２８６.ＳＬ):配列番号１６、エンコードされているアミノ酸配列番号１７；アンチセンス(６２８７.ＳＬ):配列番号１８、相補配列番号１９、エンコードされているアミノ酸配列番号２０。
【図９Ａ】Ｔ７のＶ３８hia(１１)およびＴ７のＶ３８hia(３３)遺伝子のタンデムコピーをそれぞれ含むプラスミドＤＳ-２４４７-２およびＤＳ-２４４８-１７の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢaｍＨ I；Ｂg、Ｂgl II；Ｈ、Ｈind III；Ｐs、Ｐst I；Ｒ、ＥcoＲ I；Ｓ、Ｓal I；Ｘb、Ｘba Iである。他の略語はＴ７p、Ｔ７プロモーター；ＡpＲ、アンピシリン耐性；ＫanＲ、カナマイシン耐性；ＣＡＰ、子牛のアルカリホスファターゼ；tt１、trpＡからの転写ターミネーター１；tt２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図９Ｂ】Ｔ７のＶ３８hia(１１)およびＴ７のＶ３８hia(３３)遺伝子のタンデムコピーをそれぞれ含むプラスミドＤＳ-２４４７-２およびＤＳ-２４４８-１７の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢaｍＨ I；Ｂg、Ｂgl II；Ｈ、Ｈind III；Ｐs、Ｐst I；Ｒ、ＥcoＲ I；Ｓ、Ｓal I；Ｘb、Ｘba Iである。他の略語はＴ７p、Ｔ７プロモーター；ＡpＲ、アンピシリン耐性；ＫanＲ、カナマイシン耐性；ＣＡＰ、子牛のアルカリホスファターゼ；tt１、trpＡからの転写ターミネーター１；tt２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図１０】rＨiaの発現を示す図である。パネルＡ:レーン１、誘導されていない完全長rＨia(１１)；レーン２、完全長rＨia(１１)；レーン３、Ｅ２１rＨia(１１)；レーン４、Ｔ３３rＨia(１１)；レーン５、Ｖ３８rＨia(１１)；レーン６、Ｎ５２rＨia(１１)。パネルＢ:レーン１、誘導されていないＶ３８rＨia(１１)；レーン２、Ｖ３８rＨia(１１)；レーン３、Ｖ３８rＨia(１１)/cer。
【図１１】rＨiaの精製スキームを示す図である。略語はＳＰ、上澄み；ＰＰＴ、沈殿；ＤＴＴ、ジチオスレイトール；ＯＧ、オクチルグルコシドであり、(x)は捨てられたことを意味する。
【図１２】パネルＡおよびＢを有し、精製されたrＨiaのＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を示す図である。パネルＡは菌株１１からの精製されたＶ３８rＨiaタンパク質を示し、パネルＢは菌株３３からのＶ３８rＨiaタンパク質を示す。レーン１、分子量マーカー；レーン２、全細胞の溶解物；レーン３、未精製抽出物；レーン４、精製されたrＨiaタンパク質。
【図１３Ａ】パネルＡ、ＢおよびＣを有し、Ｖ３８rＨia(１１)の安定性を示す図である。パネルＡは、グリセロールなしで４℃で保存されたサンプルを示す。パネルＢは、２０％グリセロールの存在下で４℃で保存されたサンプルを示す。パネルＣは、２０％グリセロールの存在下で-２０℃で保存されたサンプルを示す。レーン０はt0を示し、レーン１〜８は１〜８週間保存されたサンプルを示す。
【図１３Ｂ】パネルＡ、ＢおよびＣを有し、Ｖ３８rＨia(１１)の安定性を示す図である。パネルＡは、グリセロールなしで４℃で保存されたサンプルを示す。パネルＢは、２０％グリセロールの存在下で４℃で保存されたサンプルを示す。パネルＣは、２０％グリセロールの存在下で-２０℃で保存されたサンプルを示す。レーン０はt0を示し、レーン１〜８は１〜８週間保存されたサンプルを示す。
【図１３Ｃ】パネルＡ、ＢおよびＣを有し、Ｖ３８rＨia(１１)の安定性を示す図である。パネルＡは、グリセロールなしで４℃で保存されたサンプルを示す。パネルＢは、２０％グリセロールの存在下で４℃で保存されたサンプルを示す。パネルＣは、２０％グリセロールの存在下で-２０℃で保存されたサンプルを示す。レーン０はt0を示し、レーン１〜８は１〜８週間保存されたサンプルを示す。
【図１４Ａ】パネルＡおよびＢを有し、ＣＤ-１マウスのＶ３８rＨia(１１)またはＶ３８rＨia(３３)の免疫原性を示す図である。パネルＡは単一の免疫化後の応答を示し、パネルＢは最初の/追加の免疫化の応答を示す。
【図１４Ｂ】パネルＡおよびＢを有し、ＣＤ-１マウスのＶ３８rＨia(１１)またはＶ３８rＨia(３３)の免疫原性を示す図である。パネルＡは単一の免疫化後の応答を示し、パネルＢは最初の/追加の免疫化の応答を示す。
【図１５Ａ】ＢＡＬＢ/cマウスおよびモルモットのＶ３８rＨia(１１)の免疫原性を示す図である。図１５Ａはマウスにおける抗体の応答を示し、図１５Ｂはモルモットにおける応答を示す。
【図１５Ｂ】ＢＡＬＢ/cマウスおよびモルモットのＶ３８rＨia(１１)の免疫原性を示す図である。図１５Ａはマウスにおける抗体の応答を示し、図１５Ｂはモルモットにおける応答を示す。
【図１６】チンチラモデルにおける鼻咽頭コロニー形成に対するＶ３８rＨia(３３)の防御能力を示す図である。
【図１７】追加のhia遺伝子をＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。センス(５０４０.ＳＬ):配列番号２１、エンコードされているアミノ酸配列番号２２；アンチセンス(５０３９.ＳＬ):配列番号３、相補配列番号４、エンコードされているアミノ酸配列番号５。
【図１８Ａ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｂ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｃ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｄ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｅ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｆ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｇ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｈ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｉ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｊ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｋ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｌ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｍ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｎ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１８Ｏ】ＮＴＨi菌株３３からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２３)および演繹アミノ酸配列(配列番号２４)を示す図である。
【図１９Ａ】ＮＴＨi菌株３２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２５)および演繹アミノ酸配列(配列番号２６)を示す図である。
【図１９Ｂ】ＮＴＨi菌株３２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２５)および演繹アミノ酸配列(配列番号２６)を示す図である。
【図１９Ｃ】ＮＴＨi菌株３２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２５)および演繹アミノ酸配列(配列番号２６)を示す図である。
【図１９Ｄ】ＮＴＨi菌株３２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２５)および演繹アミノ酸配列(配列番号２６)を示す図である。
【図１９Ｅ】ＮＴＨi菌株３２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２５)および演繹アミノ酸配列(配列番号２６)を示す図である。
【図１９Ｆ】ＮＴＨi菌株３２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２５)および演繹アミノ酸配列(配列番号２６)を示す図である。
【図１９Ｇ】ＮＴＨi菌株３２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２５)および演繹アミノ酸配列(配列番号２６)を示す図である。
【図１９Ｈ】ＮＴＨi菌株３２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２５)および演繹アミノ酸配列(配列番号２６)を示す図である。
【図１９Ｉ】ＮＴＨi菌株３２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２５)および演繹アミノ酸配列(配列番号２６)を示す図である。
【図１９Ｊ】ＮＴＨi菌株３２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２５)および演繹アミノ酸配列(配列番号２６)を示す図である。
【図２０Ａ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｂ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｃ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｄ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｅ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｆ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｇ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｈ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｉ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｊ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｋ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｌ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｍ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｎ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｏ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２０Ｐ】ＮＴＨi菌株２９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２７)および演繹アミノ酸配列(配列番号２８)を示す図である。
【図２１Ａ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｂ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｃ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｄ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｅ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｆ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｇ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｈ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｉ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｊ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｋ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｌ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｍ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｎ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２１Ｏ】ＮＴＨi菌株Ｍ４０７１からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号２９)および演繹アミノ酸配列(配列番号３０)を示す図である。
【図２２Ａ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｂ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｃ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｄ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｅ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｆ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｇ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｈ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｉ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｊ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｋ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｌ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｍ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｎ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｏ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２２Ｐ】ＮＴＨi菌株Ｋ９からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３１)および演繹アミノ酸配列(配列番号３２)を示す図である。
【図２３Ａ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｂ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｃ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｄ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｅ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｆ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｇ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｈ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｉ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｊ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｋ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｌ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｍ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｎ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｏ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２３Ｐ】ＮＴＨi菌株Ｋ２２からのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３３)および演繹アミノ酸配列(配列番号３４)を示す図である。
【図２４Ａ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｂ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｃ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｄ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｅ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｆ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｇ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｈ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｉ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｊ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｋ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｌ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｍ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｎ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｏ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｐ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｑ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｒ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｓ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｔ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｕ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｖ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｗ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｘ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｙ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｚ】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ａ１】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｂ１】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｃ１】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｄ１】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｅ１】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｆ１】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｇ１】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｈ１】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２４Ｉ１】c型菌株ＡＰIからのhia遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号３５)および演繹アミノ酸配列(配列番号３６)を示す図である。
【図２５Ａ】ＮＴＨi菌株１２からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号３７)および演繹アミノ酸配列(配列番号３８)を示す図である。上線または下線を引かれた配列は、２つのorfの接合部を越えてＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。センス(６４３１.ＳＬ):配列番号３９、(６４３２.ＳＬ)配列番号４０；アンチセンス(６２９５.ＳＬ)配列番号４１、(６２７１.ＳＬ)配列番号４２。
【図２５Ｂ】ＮＴＨi菌株１２からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号３７)および演繹アミノ酸配列(配列番号３８)を示す図である。上線または下線を引かれた配列は、２つのorfの接合部を越えてＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。センス(６４３１.ＳＬ):配列番号３９、(６４３２.ＳＬ)配列番号４０；アンチセンス(６２９５.ＳＬ)配列番号４１、(６２７１.ＳＬ)配列番号４２。
【図２５Ｃ】ＮＴＨi菌株１２からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号３７)および演繹アミノ酸配列(配列番号３８)を示す図である。上線または下線を引かれた配列は、２つのorfの接合部を越えてＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。センス(６４３１.ＳＬ):配列番号３９、(６４３２.ＳＬ)配列番号４０；アンチセンス(６２９５.ＳＬ)配列番号４１、(６２７１.ＳＬ)配列番号４２。
【図２５Ｄ】ＮＴＨi菌株１２からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号３７)および演繹アミノ酸配列(配列番号３８)を示す図である。上線または下線を引かれた配列は、２つのorfの接合部を越えてＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。センス(６４３１.ＳＬ):配列番号３９、(６４３２.ＳＬ)配列番号４０；アンチセンス(６２９５.ＳＬ)配列番号４１、(６２７１.ＳＬ)配列番号４２。
【図２５Ｅ】ＮＴＨi菌株１２からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号３７)および演繹アミノ酸配列(配列番号３８)を示す図である。上線または下線を引かれた配列は、２つのorfの接合部を越えてＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。センス(６４３１.ＳＬ):配列番号３９、(６４３２.ＳＬ)配列番号４０；アンチセンス(６２９５.ＳＬ)配列番号４１、(６２７１.ＳＬ)配列番号４２。
【図２５Ｆ】ＮＴＨi菌株１２からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号３７)および演繹アミノ酸配列(配列番号３８)を示す図である。上線または下線を引かれた配列は、２つのorfの接合部を越えてＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。センス(６４３１.ＳＬ):配列番号３９、(６４３２.ＳＬ)配列番号４０；アンチセンス(６２９５.ＳＬ)配列番号４１、(６２７１.ＳＬ)配列番号４２。
【図２５Ｇ】ＮＴＨi菌株１２からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号３７)および演繹アミノ酸配列(配列番号３８)を示す図である。上線または下線を引かれた配列は、２つのorfの接合部を越えてＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。センス(６４３１.ＳＬ):配列番号３９、(６４３２.ＳＬ)配列番号４０；アンチセンス(６２９５.ＳＬ)配列番号４１、(６２７１.ＳＬ)配列番号４２。
【図２５Ｈ】ＮＴＨi菌株１２からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号３７)および演繹アミノ酸配列(配列番号３８)を示す図である。上線または下線を引かれた配列は、２つのorfの接合部を越えてＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。センス(６４３１.ＳＬ):配列番号３９、(６４３２.ＳＬ)配列番号４０；アンチセンス(６２９５.ＳＬ)配列番号４１、(６２７１.ＳＬ)配列番号４２。
【図２５Ｉ】ＮＴＨi菌株１２からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号３７)および演繹アミノ酸配列(配列番号３８)を示す図である。上線または下線を引かれた配列は、２つのorfの接合部を越えてＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。センス(６４３１.ＳＬ):配列番号３９、(６４３２.ＳＬ)配列番号４０；アンチセンス(６２９５.ＳＬ)配列番号４１、(６２７１.ＳＬ)配列番号４２。
【図２６Ａ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２６Ｂ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２６Ｃ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２６Ｄ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２６Ｅ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２６Ｆ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２６Ｇ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２６Ｈ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２６Ｉ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２６Ｊ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２６Ｋ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２６Ｌ】米国特許第５,６４６,２５９号において公開されている、ＮＴＨi菌株１１からのhia遺伝子座のヌクレオチド配列(配列番号４３)および演繹アミノ酸配列(配列番号４４)を示す図である。
【図２７Ａ】菌株１２のhia遺伝子座からの上流ＯＲＦ(配列番号４５)の配列およびb型インフルエンザ菌株ＲdからのＨＩ１７３２タンパク質(配列番号４６)の一部の整列を示す図である。
【図２７Ｂ】菌株１２のhia遺伝子座からの上流ＯＲＦ(配列番号４５)の配列およびb型インフルエンザ菌株ＲdからのＨＩ１７３２タンパク質(配列番号４６)の一部の整列を示す図である。
【図２８Ａ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｂ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｃ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｄ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｅ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｆ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｇ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｈ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｉ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｊ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｋ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｌ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｍ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｎ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｏ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｐ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｑ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｒ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｓ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｔ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｕ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｖ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｗ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｘ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｙ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｚ】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ａ１】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｂ１】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｃ１】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２８Ｄ１】Ｈia(配列番号２４、２６、２８、３４、３０、４４、３２)、Ｈsf(配列番号４７)、および菌株４２２３およびＬＥＳ-１(配列番号４８、４９)からのＭoraxella catarrhalisの高分子量タンパク質(２００kＤa)からの一部の配列からのアミノ酸配列の整列を示す図である。配列内の星印はストップコドンを示すが、配列の下部では配列の相同性が示された。ドットは同一の残基を示す。配列の整列は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列を直接比較することによって作製された。
【図２９】hia遺伝子の５’端をＳ４４切断位置でＰＣＲ増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドを示す図である。センス(６８１７.ＳＬ)配列番号４９、エンコードされているアミノ酸配列番号５０；アンチセンス(６８１８.ＳＬ)配列番号５１、相補配列番号５２、エンコードされているアミノ酸配列番号５３。
【図３０Ａ】ＮＴＨi菌株１１からのＳ４４hia遺伝子および大腸菌のcer遺伝子およびＴ７プロモーターを含む、プラスミドＪＢ-２９３０-３の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢaｍＨ I；Ｂg、Ｂgl II；Ｋ、Ｋpn I；Ｎ、Ｎde I；Ｐ、Ｐst I；Ｒ、ＥcoＲ I；Ｓ、Ｓal I；Ｓｍ、Ｓｍa I；Ｓty、Ｓty I；Ｘb、Ｘba I；Ｘho、Ｘho Iである。他の略語はＴ７p、Ｔ７プロモーター；ＡpＲ、アンピシリン耐性；ＫanＲ、カナマイシン耐性；ＣＡＰ、子牛のアルカリホスファターゼ；tt１、trpＡからの転写ターミネーター１；tt２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図３０Ｂ】ＮＴＨi菌株１１からのＳ４４hia遺伝子および大腸菌のcer遺伝子およびＴ７プロモーターを含む、プラスミドＪＢ-２９３０-３の構築を示す図である。制限酵素部位はＢ、ＢaｍＨ I；Ｂg、Ｂgl II；Ｋ、Ｋpn I；Ｎ、Ｎde I；Ｐ、Ｐst I；Ｒ、ＥcoＲ I；Ｓ、Ｓal I；Ｓｍ、Ｓｍa I；Ｓty、Ｓty I；Ｘb、Ｘba I；Ｘho、Ｘho Iである。他の略語はＴ７p、Ｔ７プロモーター；ＡpＲ、アンピシリン耐性；ＫanＲ、カナマイシン耐性；ＣＡＰ、子牛のアルカリホスファターゼ；tt１、trpＡからの転写ターミネーター１；tt２、Ｔ７遺伝子１０からの転写ターミネーター２である。
【図３１】Ｓ４４からのrＨiaの発現のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１、時間０での(誘導なしで)pＥＴＳ４４ベクターからの発現体；レーン２、４時間の誘導後のpＥＴＳ４４ベクターからの発現体；レーン３、４時間の誘導後のＪＢ-２９３０-３からの発現体。
【図３２】発現試験用に使用された２つのベクター、Ｓ４４切断型rＨiaのＪＢ-２９３０-３およびIＡ-１９１-３-１の概略を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザ菌(ヘモフィルス・インフルエンジー(Ｈaeｍophilus influenzae))の菌株のインフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質をエンコードしている単離され精製された核酸分子であって、
(a)図１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５に示される配列(配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７)からなる群から選択されるＤＮＡ配列、または
(b)図１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５に示される配列(配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するインフルエンザ菌アドヘシン(rＨia)タンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列を有する単離され精製された核酸分子。
【請求項２】
インフルエンザ菌の菌株のＮ末端切断型インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質をエンコードしており、
配列番号７と配列番号１５
配列番号９と配列番号１５
配列番号１１と配列番号１５
配列番号１３と配列番号１５
配列番号４９と配列番号５１
からなる群から選択されるヌクレオチドの１対によって増幅可能な、単離され精製された核酸分子。
【請求項３】
封入体として発現可能なインフルエンザ菌の菌株の切断型インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質をエンコードしている、単離され精製された核酸。
【請求項４】
請求項１に記載の前記核酸分子を含む宿主を形質転換するためのベクター。
【請求項５】
請求項２または３に記載の前記核酸分子を含む宿主を形質転換するためのベクター。
【請求項６】
プラスミドベクターである、請求項４または５に記載のベクター。
【請求項７】
前記プラスミドベクターが、
図１Ａ中に示されるＤＳ-２００８-２-３
図５Ａ中に示されるＤＳ-２１８６-１-１
図５Ａ中に示されるＤＳ-２２０１-１
図５Ａ中に示されるＤＳ-２１８６-２-１
図５Ａ中に示されるＤＳ-２１６８-２-６
図３２中に示されるIＡ-１９１-３-１
からなる群から選択されるプラスミドの同定特性を有する、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
完全長またはＮ末端切断型インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質および前記完全長または切断型Ｈiaタンパク質を発現するためのプロモーターを含む、宿主を形質転換するためのベクター。
【請求項９】
大腸菌の遺伝子をさらに含む、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
プラスミドベクターである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１１】
前記プラスミドベクターが、
図６Ａ中に示されるＢＫ-９６-２-１１
図７Ａ中に示されるＤＳ-２２４２-１
図７Ａ中に示されるＤＳ-２２４２-２
図８Ａ中に示されるＤＳ-２３４０-２-３
図９Ａ中に示されるＤＳ-２４４７-２
図９Ｂ中に示されるＤＳ-２４４８-１７
図３２中に示されるＪＢ-２９３０-３
からなる群から選択されるプラスミドベクターの同定特性を有する請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項４、５または８に記載のベクターによって形質転換され、ヘモフィルスの分類不能型菌株の防御性インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質を発現する宿主細胞。
【請求項１３】
大腸菌の菌株である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の形質転換された大腸菌またはその免疫原性断片またはアドヘシン官能性類縁体によって産生可能な、インフルエンザ菌の菌株の組換え防御性インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質。
【請求項１５】
(Ａ)インフルエンザ菌の菌株のインフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質をエンコードしている単離され精製された核酸分子であって、
(a)図１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５に示される配列(配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７)からなる群から選択されるＤＮＡ配列、または
(b)図１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５に示される配列(配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するインフルエンザ菌アドヘシン(rＨia)タンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列を有する単離され精製された核酸分子、
(Ｂ)インフルエンザ菌の菌株のＮ末端切断型インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質をエンコードしており、
配列番号７と配列番号１５
配列番号９と配列番号１５
配列番号１１と配列番号１５
配列番号１３と配列番号１５
配列番号４９と配列番号５１
からなる群から選択されるヌクレオチドの１対によって増幅可能な、単離され精製された核酸分子、
(Ｃ)封入体として発現可能なインフルエンザ菌の菌株の切断型インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質をエンコードしている、単離され精製された核酸分子、
(Ｄ)請求項４、５または８に記載の発現ベクターによって形質転換された大腸菌によって産生可能な、インフルエンザ菌の菌株の組換え防御性インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学的に活性のある成分、および薬学的に許容可能なこれらの担体を含む免疫原性組成物。
【請求項１６】
ヘモフィルスに起因する疾患に対して防御するために宿主へのin vitro投与用ワクチンとして製剤化される、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
免疫系の特定の細胞または粘膜表面への送達用の標的分子と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
ミクロ粒子、カプセル、またはリポソーム調製物として製剤化される、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
アジュバントをさらに含む、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
感受性のある宿主に請求項１５に記載の免疫原性組成物を有効量投与すること含む、ヘモフィルスに起因する疾患に対する防御を誘導するための方法。
【請求項２１】
前記感受性のある宿主がヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
インフルエンザ菌の分類不能型菌株の防御性インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質の産生のための方法であって、
請求項５と同様にベクターによって宿主を形質転換すること、
宿主を成長させてエンコードされている切断型Ｈiaを発現させること、
前記発現されたＨiaタンパク質を単離および精製することを含む方法。
【請求項２３】
前記宿主細胞が大腸菌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記エンコードされている切断型Ｈiaが封入体内で発現される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記発現されたＨiaの前記単離および精製が、
成長し形質転換された細胞を破壊して上澄みおよび前記封入体を生成すること、
前記封入体を可溶化して組換えＨiaの溶液を生成すること、
クロマトグラフィによって細胞の残骸のない組換えＨiaの前記溶液を精製すること、および
前記精製された組換えＨiaタンパク質を単離することによって実施される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヘモフィルスの分類不能型菌株が菌株１１、３３、３２、２９、Ｍ４０７１、Ｋ９、Ｋ２２および１２からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記ベクターがＴ７プロモーターを含み、前記大腸菌が誘導量のラクトースの存在下で培養される、請求項２２に記載の方法。
【請求項１】
インフルエンザ菌(ヘモフィルス・インフルエンジー(Ｈaeｍophilus influenzae))の菌株のインフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質をエンコードしている単離され精製された核酸分子であって、
(a)図１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５に示される配列(配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７)からなる群から選択されるＤＮＡ配列、または
(b)図１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５に示される配列(配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するインフルエンザ菌アドヘシン(rＨia)タンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列を有する単離され精製された核酸分子。
【請求項２】
インフルエンザ菌の菌株のＮ末端切断型インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質をエンコードしており、
配列番号７と配列番号１５
配列番号９と配列番号１５
配列番号１１と配列番号１５
配列番号１３と配列番号１５
配列番号４９と配列番号５１
からなる群から選択されるヌクレオチドの１対によって増幅可能な、単離され精製された核酸分子。
【請求項３】
封入体として発現可能なインフルエンザ菌の菌株の切断型インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質をエンコードしている、単離され精製された核酸。
【請求項４】
請求項１に記載の前記核酸分子を含む宿主を形質転換するためのベクター。
【請求項５】
請求項２または３に記載の前記核酸分子を含む宿主を形質転換するためのベクター。
【請求項６】
プラスミドベクターである、請求項４または５に記載のベクター。
【請求項７】
前記プラスミドベクターが、
図１Ａ中に示されるＤＳ-２００８-２-３
図５Ａ中に示されるＤＳ-２１８６-１-１
図５Ａ中に示されるＤＳ-２２０１-１
図５Ａ中に示されるＤＳ-２１８６-２-１
図５Ａ中に示されるＤＳ-２１６８-２-６
図３２中に示されるIＡ-１９１-３-１
からなる群から選択されるプラスミドの同定特性を有する、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
完全長またはＮ末端切断型インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質および前記完全長または切断型Ｈiaタンパク質を発現するためのプロモーターを含む、宿主を形質転換するためのベクター。
【請求項９】
大腸菌の遺伝子をさらに含む、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
プラスミドベクターである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１１】
前記プラスミドベクターが、
図６Ａ中に示されるＢＫ-９６-２-１１
図７Ａ中に示されるＤＳ-２２４２-１
図７Ａ中に示されるＤＳ-２２４２-２
図８Ａ中に示されるＤＳ-２３４０-２-３
図９Ａ中に示されるＤＳ-２４４７-２
図９Ｂ中に示されるＤＳ-２４４８-１７
図３２中に示されるＪＢ-２９３０-３
からなる群から選択されるプラスミドベクターの同定特性を有する請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項４、５または８に記載のベクターによって形質転換され、ヘモフィルスの分類不能型菌株の防御性インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質を発現する宿主細胞。
【請求項１３】
大腸菌の菌株である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の形質転換された大腸菌またはその免疫原性断片またはアドヘシン官能性類縁体によって産生可能な、インフルエンザ菌の菌株の組換え防御性インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質。
【請求項１５】
(Ａ)インフルエンザ菌の菌株のインフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質をエンコードしている単離され精製された核酸分子であって、
(a)図１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５に示される配列(配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７)からなる群から選択されるＤＮＡ配列、または
(b)図１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５に示される配列(配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するインフルエンザ菌アドヘシン(rＨia)タンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列を有する単離され精製された核酸分子、
(Ｂ)インフルエンザ菌の菌株のＮ末端切断型インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質をエンコードしており、
配列番号７と配列番号１５
配列番号９と配列番号１５
配列番号１１と配列番号１５
配列番号１３と配列番号１５
配列番号４９と配列番号５１
からなる群から選択されるヌクレオチドの１対によって増幅可能な、単離され精製された核酸分子、
(Ｃ)封入体として発現可能なインフルエンザ菌の菌株の切断型インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質をエンコードしている、単離され精製された核酸分子、
(Ｄ)請求項４、５または８に記載の発現ベクターによって形質転換された大腸菌によって産生可能な、インフルエンザ菌の菌株の組換え防御性インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質からなる群から選択される少なくとも１つの免疫学的に活性のある成分、および薬学的に許容可能なこれらの担体を含む免疫原性組成物。
【請求項１６】
ヘモフィルスに起因する疾患に対して防御するために宿主へのin vitro投与用ワクチンとして製剤化される、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
免疫系の特定の細胞または粘膜表面への送達用の標的分子と組み合わせた、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
ミクロ粒子、カプセル、またはリポソーム調製物として製剤化される、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
アジュバントをさらに含む、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
感受性のある宿主に請求項１５に記載の免疫原性組成物を有効量投与すること含む、ヘモフィルスに起因する疾患に対する防御を誘導するための方法。
【請求項２１】
前記感受性のある宿主がヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
インフルエンザ菌の分類不能型菌株の防御性インフルエンザ菌アドヘシン(Ｈia)タンパク質の産生のための方法であって、
請求項５と同様にベクターによって宿主を形質転換すること、
宿主を成長させてエンコードされている切断型Ｈiaを発現させること、
前記発現されたＨiaタンパク質を単離および精製することを含む方法。
【請求項２３】
前記宿主細胞が大腸菌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記エンコードされている切断型Ｈiaが封入体内で発現される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記発現されたＨiaの前記単離および精製が、
成長し形質転換された細胞を破壊して上澄みおよび前記封入体を生成すること、
前記封入体を可溶化して組換えＨiaの溶液を生成すること、
クロマトグラフィによって細胞の残骸のない組換えＨiaの前記溶液を精製すること、および
前記精製された組換えＨiaタンパク質を単離することによって実施される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヘモフィルスの分類不能型菌株が菌株１１、３３、３２、２９、Ｍ４０７１、Ｋ９、Ｋ２２および１２からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記ベクターがＴ７プロモーターを含み、前記大腸菌が誘導量のラクトースの存在下で培養される、請求項２２に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｂ１】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１８Ｄ】
【図１８Ｅ】
【図１８Ｆ】
【図１８Ｇ】
【図１８Ｈ】
【図１８Ｉ】
【図１８Ｊ】
【図１８Ｋ】
【図１８Ｌ】
【図１８Ｍ】
【図１８Ｎ】
【図１８Ｏ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図１９Ｃ】
【図１９Ｄ】
【図１９Ｅ】
【図１９Ｆ】
【図１９Ｇ】
【図１９Ｈ】
【図１９Ｉ】
【図１９Ｊ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２０Ｃ】
【図２０Ｄ】
【図２０Ｅ】
【図２０Ｆ】
【図２０Ｇ】
【図２０Ｈ】
【図２０Ｉ】
【図２０Ｊ】
【図２０Ｋ】
【図２０Ｌ】
【図２０Ｍ】
【図２０Ｎ】
【図２０Ｏ】
【図２０Ｐ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２１Ｄ】
【図２１Ｅ】
【図２１Ｆ】
【図２１Ｇ】
【図２１Ｈ】
【図２１Ｉ】
【図２１Ｊ】
【図２１Ｋ】
【図２１Ｌ】
【図２１Ｍ】
【図２１Ｎ】
【図２１Ｏ】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２２Ｃ】
【図２２Ｄ】
【図２２Ｅ】
【図２２Ｆ】
【図２２Ｇ】
【図２２Ｈ】
【図２２Ｉ】
【図２２Ｊ】
【図２２Ｋ】
【図２２Ｌ】
【図２２Ｍ】
【図２２Ｎ】
【図２２Ｏ】
【図２２Ｐ】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２３Ｃ】
【図２３Ｄ】
【図２３Ｅ】
【図２３Ｆ】
【図２３Ｇ】
【図２３Ｈ】
【図２３Ｉ】
【図２３Ｊ】
【図２３Ｋ】
【図２３Ｌ】
【図２３Ｍ】
【図２３Ｎ】
【図２３Ｏ】
【図２３Ｐ】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２４Ｃ】
【図２４Ｄ】
【図２４Ｅ】
【図２４Ｆ】
【図２４Ｇ】
【図２４Ｈ】
【図２４Ｉ】
【図２４Ｊ】
【図２４Ｋ】
【図２４Ｌ】
【図２４Ｍ】
【図２４Ｎ】
【図２４Ｏ】
【図２４Ｐ】
【図２４Ｑ】
【図２４Ｒ】
【図２４Ｓ】
【図２４Ｔ】
【図２４Ｕ】
【図２４Ｖ】
【図２４Ｗ】
【図２４Ｘ】
【図２４Ｙ】
【図２４Ｚ】
【図２４Ａ１】
【図２４Ｂ１】
【図２４Ｃ１】
【図２４Ｄ１】
【図２４Ｅ１】
【図２４Ｆ１】
【図２４Ｇ１】
【図２４Ｈ１】
【図２４Ｉ１】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【図２５Ｃ】
【図２５Ｄ】
【図２５Ｅ】
【図２５Ｆ】
【図２５Ｇ】
【図２５Ｈ】
【図２５Ｉ】
【図２６Ａ】
【図２６Ｂ】
【図２６Ｃ】
【図２６Ｄ】
【図２６Ｅ】
【図２６Ｆ】
【図２６Ｇ】
【図２６Ｈ】
【図２６Ｉ】
【図２６Ｊ】
【図２６Ｋ】
【図２６Ｌ】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２８Ｃ】
【図２８Ｄ】
【図２８Ｅ】
【図２８Ｆ】
【図２８Ｇ】
【図２８Ｈ】
【図２８Ｉ】
【図２８Ｊ】
【図２８Ｋ】
【図２８Ｌ】
【図２８Ｍ】
【図２８Ｎ】
【図２８Ｏ】
【図２８Ｐ】
【図２８Ｑ】
【図２８Ｒ】
【図２８Ｓ】
【図２８Ｔ】
【図２８Ｕ】
【図２８Ｖ】
【図２８Ｗ】
【図２８Ｘ】
【図２８Ｙ】
【図２８Ｚ】
【図２８Ａ１】
【図２８Ｂ１】
【図２８Ｃ１】
【図２９】
【図３０Ａ】
【図３０Ｂ】
【図３１】
【図２８Ｄ１】
【図３２】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｂ１】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１８Ｄ】
【図１８Ｅ】
【図１８Ｆ】
【図１８Ｇ】
【図１８Ｈ】
【図１８Ｉ】
【図１８Ｊ】
【図１８Ｋ】
【図１８Ｌ】
【図１８Ｍ】
【図１８Ｎ】
【図１８Ｏ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図１９Ｃ】
【図１９Ｄ】
【図１９Ｅ】
【図１９Ｆ】
【図１９Ｇ】
【図１９Ｈ】
【図１９Ｉ】
【図１９Ｊ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２０Ｃ】
【図２０Ｄ】
【図２０Ｅ】
【図２０Ｆ】
【図２０Ｇ】
【図２０Ｈ】
【図２０Ｉ】
【図２０Ｊ】
【図２０Ｋ】
【図２０Ｌ】
【図２０Ｍ】
【図２０Ｎ】
【図２０Ｏ】
【図２０Ｐ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２１Ｄ】
【図２１Ｅ】
【図２１Ｆ】
【図２１Ｇ】
【図２１Ｈ】
【図２１Ｉ】
【図２１Ｊ】
【図２１Ｋ】
【図２１Ｌ】
【図２１Ｍ】
【図２１Ｎ】
【図２１Ｏ】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２２Ｃ】
【図２２Ｄ】
【図２２Ｅ】
【図２２Ｆ】
【図２２Ｇ】
【図２２Ｈ】
【図２２Ｉ】
【図２２Ｊ】
【図２２Ｋ】
【図２２Ｌ】
【図２２Ｍ】
【図２２Ｎ】
【図２２Ｏ】
【図２２Ｐ】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２３Ｃ】
【図２３Ｄ】
【図２３Ｅ】
【図２３Ｆ】
【図２３Ｇ】
【図２３Ｈ】
【図２３Ｉ】
【図２３Ｊ】
【図２３Ｋ】
【図２３Ｌ】
【図２３Ｍ】
【図２３Ｎ】
【図２３Ｏ】
【図２３Ｐ】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２４Ｃ】
【図２４Ｄ】
【図２４Ｅ】
【図２４Ｆ】
【図２４Ｇ】
【図２４Ｈ】
【図２４Ｉ】
【図２４Ｊ】
【図２４Ｋ】
【図２４Ｌ】
【図２４Ｍ】
【図２４Ｎ】
【図２４Ｏ】
【図２４Ｐ】
【図２４Ｑ】
【図２４Ｒ】
【図２４Ｓ】
【図２４Ｔ】
【図２４Ｕ】
【図２４Ｖ】
【図２４Ｗ】
【図２４Ｘ】
【図２４Ｙ】
【図２４Ｚ】
【図２４Ａ１】
【図２４Ｂ１】
【図２４Ｃ１】
【図２４Ｄ１】
【図２４Ｅ１】
【図２４Ｆ１】
【図２４Ｇ１】
【図２４Ｈ１】
【図２４Ｉ１】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【図２５Ｃ】
【図２５Ｄ】
【図２５Ｅ】
【図２５Ｆ】
【図２５Ｇ】
【図２５Ｈ】
【図２５Ｉ】
【図２６Ａ】
【図２６Ｂ】
【図２６Ｃ】
【図２６Ｄ】
【図２６Ｅ】
【図２６Ｆ】
【図２６Ｇ】
【図２６Ｈ】
【図２６Ｉ】
【図２６Ｊ】
【図２６Ｋ】
【図２６Ｌ】
【図２７Ａ】
【図２７Ｂ】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２８Ｃ】
【図２８Ｄ】
【図２８Ｅ】
【図２８Ｆ】
【図２８Ｇ】
【図２８Ｈ】
【図２８Ｉ】
【図２８Ｊ】
【図２８Ｋ】
【図２８Ｌ】
【図２８Ｍ】
【図２８Ｎ】
【図２８Ｏ】
【図２８Ｐ】
【図２８Ｑ】
【図２８Ｒ】
【図２８Ｓ】
【図２８Ｔ】
【図２８Ｕ】
【図２８Ｖ】
【図２８Ｗ】
【図２８Ｘ】
【図２８Ｙ】
【図２８Ｚ】
【図２８Ａ１】
【図２８Ｂ１】
【図２８Ｃ１】
【図２９】
【図３０Ａ】
【図３０Ｂ】
【図３１】
【図２８Ｄ１】
【図３２】
【公開番号】特開２００８−１８８０１８（Ｐ２００８−１８８０１８Ａ）
【公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８４４９９（Ｐ２００８−８４４９９）
【出願日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【分割の表示】特願２０００−６０５６１７（Ｐ２０００−６０５６１７）の分割
【原出願日】平成１２年３月１６日（２０００．３．１６）
【出願人】（５０００９６９９４）サノフィ パスツ−ル リミテッド (12)
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ ＰＡＳＴＥＵＲ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【分割の表示】特願２０００−６０５６１７（Ｐ２０００−６０５６１７）の分割
【原出願日】平成１２年３月１６日（２０００．３．１６）
【出願人】（５０００９６９９４）サノフィ パスツ−ル リミテッド (12)
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＯＦＩ ＰＡＳＴＥＵＲ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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