組換えポリペプチドを精製するための方法
本発明は、発現後形質転換された宿主細胞のペリプラズムに分泌された、着目組換えポリペプチドを精製するための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換された宿主細胞のペリプラズムに発現時に分泌された、着目組換えポリペプチドを調製するための方法に関する。
【０００２】
とりわけ、本発明は、組換えヒトインターフェロンα２を調製し精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
インターフェロンα２のグループのインターフェロンのようなポリペプチドまたはタンパク質は、細菌細胞（例えばエシェリヒア・コリ）を宿主として用いる組換えＤＮＡ技術によって生産し得る。従って、細菌細胞は上記ポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡにより形質転換し得る。これにより、これら細菌は、細胞質またはペリプラズムのいずれかにおいて多量のポリペプチドを発現させることができる。細菌は大規模な発酵プロセスを利用して多量に生育させることができるので、多量のポリペプチドをこの方法により生産することができる。
【０００４】
組換え技術は、粗着目ポリペプチドを高収率で生産するのに使用できる一方、このポリペプチドの単離および精製は簡単な事柄ではない。通常の単離手順においては、例えば酸性化または加熱によって、発酵ブロスは中性化される。次いで、細菌細胞を取り出し、破棄される、不要な可溶性副産物を含む液体上清が残る。生じた細菌細胞の塊は適切な培地に、例えば適切な緩衝液に再懸濁し、細胞を破壊して粗インターフェロンを抽出し単離する。この労働力を費やす手順は、着目ポリペプチドを発酵副産物および他の汚染物から可能な限り分離して、次に続く精製工程（クロマトグラフィーによる分離を含む）が可能な限り効率的に進むことを確実にするために、実施される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような従来技術の手順の労働力を要する特質は、抽出される着目ポリペプチドのより低い収率およびより高い生産コストをもたらし得る。従って、高収率および費用効率が高いやり方で、細菌細胞から着目組換えポリペプチドを精製することを可能とする方法が、依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の場面において、着目組換えポリペプチドの、例えば組換えインターフェロンα２などの、グラム陰性菌細胞のようなペリプラズムを含む宿主細胞からの効率的な抽出および単離が、ペリプラズム内に発現した着目組換えポリペプチドを含む宿主細胞に浸透圧ショックを直接与えることによって可能であることが意外にも判明し、これによって上記の分離工程および再懸濁工程が省略されることが意外にも判明した。このような方法を行うことによって、宿主細胞の外側細胞膜が、宿主細胞のペリプラズムが内容物の発酵培地中へ放出されるよう十分に破壊される。これによって、細胞内の不要な物質の、例えば細胞デブリ内の宿主細胞のタンパク質およびＤＮＡの放出を回避することができる。驚くべきことに、次のクロマトグラフィーによる精製は妥協できないが、単離される組換えポリペプチドの収率および／または純度の向上が容易にもたらされる。
【０００７】
本発明の場面において、クロマトグラフィー工程の独特の順序によって、とりわけ上記の抽出方法／破壊方法を組み合わせた場合、組換えインターフェロンα２の収率および／または純度の向上がもたらされることがさらに判明した。
【０００８】
従って、本発明の一つの側面において、
（ｉ）原核生物宿主細胞の発酵、ここにおいて、前記宿主細胞は、ペリプラズムを有し、着目ポリペプチドを前記宿主細胞のペリプラズム内に分泌させることができる組換え発現系を用いて形質転換されており、前記発酵は、発酵培地中、着目ポリペプチドが前記宿主細胞のペリプラズム内に分泌されるような条件下において行われ、および
（ｉｉ）発酵培地中に含まれる前記宿主細胞に浸透圧ショックを与えることにより前記ペリプラズムからの着目ポリペプチドの抽出
を含む、着目ポリペプチドを調製する方法が提供される。
【０００９】
適切な組換えペリプラズム発現系は、とりわけ発現ベクターおよび対応する原核生物宿主細胞加えて適切な発酵方法は、当分野において周知である。適切な実例が、下記の実施例の項に記載されている。
【００１０】
本発明の好ましい実施態様において、前記浸透圧ショックは、前記発酵培地に薬物を直接添加し、引き続いて前記発酵培地をＨ２Ｏにより希釈することによって与えられ、ここにおいて、前記薬物は、Ｈ２Ｏによる希釈後に前記宿主細胞の外側細胞膜の破壊をもたらす浸透圧を生じさせることができるものである。
【００１１】
この薬物としては、蔗糖、塩化ナトリウム、アルギニン、リジン、塩酸グアニジン、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、ポリエチレンイミンおよびこれらの適切な混合物、すなわちこのような薬物の二種以上の混合物、からなる群より選択されるものが好ましい。最も好ましくは、この薬物は蔗糖である。場合により、ＥＤＴＡのような錯形成成分が発酵培地にさらに追加され得る。
【００１２】
この薬物は、Ｈ２Ｏでの発酵培地の希釈時に、宿主細胞の外側細胞膜の、発現した着目ポリペプチドの続く放出を伴う破壊をもたらす、浸透圧ショックを引き起こすような濃度で存在する。
【００１３】
とりわけ、本発明のさらなる好ましい実施態様において、発酵培地における希釈開始時の蔗糖の濃度は約２０％重量／体積である。蔗糖含有発酵ブロスのＨ２Ｏでの希釈係数が少なくとも約３倍であることが好ましい。
【００１４】
本発明の場面において、ペリプラズムを含む原核生物宿主細胞はグラム陰性菌が好ましい。このグラム陰性菌は、好ましくは、エシェリヒア・コリ、シュードモナス・スピーシーズ、エンテロバクター・スピーシーズ、カンピロバクター・スピーシーズおよびビトレオシラ・スピーシーズからなる群より選択される。本発明の最も好ましい実施態様において、宿主細胞はエシェリヒア・コリである。
【００１５】
細胞の破壊工程に続いて、着目ポリペプチドを含む抽出物から細胞デブリおよび他の粒子状物質を分離できるようにするために、着目組換えポリペプチドの粗調製品であるところの発酵ブロスを、例えば高速遠心分離などの分離工程に付し得る。抽出物から粒子状物質を分離することを助けるために、分離工程の前に、適切な沈殿剤を発酵ブロスに添加することが好ましい。本発明の場面において、この工程のためには、ポリエチレンイミンが特に優れた沈殿剤であることが判明した。このポリエチレンイミンは、好ましくは、ｐＨが約７．５に、例えば７．３から７．７に調整された培地内で約０．０５％の濃度で用いることが好ましい。
【００１６】
本発明の方法は、多様な着目ポリペプチドの生産のために利用することができる。とりわけ、本発明によれば、着目ポリペプチドは、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、増殖因子、サイトカイン、酵素、酵素インヒビター、抗体ならびに抗体断片など、例えばインターフェロンα２Ａ、インターフェロンα２Ｂ、インターロイキン−３、インターロイキン−６、ヒト成長ホルモン、インシュリン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロンβ１、ウシソマトロピン、ブタソマトロピン、インターロイキン−１１、インターロイキン−２、Ｆａｂ断片、およびカルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはグルカゴンなどの小ペプチドからなる群より選択することができる。本発明の範囲内において、着目ポリペプチドは、組換えヒトインターフェロン２、とりわけヒトインターフェロンα２Ａまたはヒトインターフェロンα２Ｂが好ましく、後者が着目ポリペプチドとして特に好ましい。
【００１７】
着目ポリペプチドを含む抽出物は、インターフェロンを完成した剤形に調合する前に除去されるべき多数の不純物、例えば宿主細胞のタンパク質および宿主細胞のＤＮＡを含み得る。通常、このポリペプチドは、それ自体知られている沈殿技術およびクロマトグラフィーによる分離技術によって精製される。例えば、ポリペプチドは多工程クロマトグラフィーによる分離を利用して精製され得る。
【００１８】
しかしながら、着目ポリペプチドの性質に応じて、この方法は、クロマトグラフィーによる工程の間に入れられる重要な透析工程および／または濃縮工程が必要となり、複雑である。これらの余分な工程は、労働力を要し、収率をより低くしおよび生産コストをより高くし得る。
【００１９】
本発明の場面において、粗調整品の、特に前に述べた組換えインターフェロンα２の、多工程クロマトグラフィー精製は、特定のクロマトグラフィー工程を慎重に選択し順序を定めることによって、いかなる透析工程または濃縮工程を行わずとも実施できることが、判明した。
【００２０】
従って、本発明の他の側面は、
（ａ）組換えインターフェロンα２の粗調製品を得ること、
（ｂ）前記粗調製品を、次、
（ｉ）陽イオン交換クロマトグラフィー、
（ｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー、
（ｉｉｉ）疎水性相互作用クロマトグラフィー、
（ｉｖ）陽イオン交換クロマトグラフィー、
（ｖ）サイズ排除クロマトグラフィー
を順番に含む多工程クロマトグラフィーに適用する工程、
を含む、組換えインターフェロンα２を調製するための方法に関する。
【００２１】
上の本発明の側面の好ましい態様において、組換えインターフェロンα２の粗調整品は、
（ａ）原核生物宿主細胞の発酵、ここにおいて、前記宿主細胞は、ペリプラズムを有し、組換えインターフェロンα２を前記宿主細胞のペリプラズム内に分泌させることができる組換え発現系を用いて形質転換されており、前記発酵は、発酵培地中、組換えインターフェロンα２が前記ペリプラズム内に分泌されるような条件下において行われ、
（ｂ）発酵培地中に含まれる前記宿主細胞に浸透圧ショックを与えることによる前記ペリプラズムからの着目ポリペプチドの抽出
を含む方法により得られる。
【００２２】
上述のように、適切な組換えペリプラズム発現系、とりわけ発現ベクターおよび対応する原核生物宿主細胞加えて適切な発酵方法は、当分野において周知である。適切な実例が、後記実施例の項に記載されている。
【００２３】
上述のように、上記浸透圧ショックは、前記発酵培地に薬物を直接添加し、引き続いて前記発酵培地をＨ２Ｏにより希釈することによって与えられ、ここにおいて、前記薬物は、Ｈ２Ｏによる希釈後に前記宿主細胞の外側細胞膜の破壊をもたらす浸透圧を生じさせることができるものである。
【００２４】
本発明の好ましい実施態様において、この薬物は、蔗糖、塩化ナトリウム、アルギニン、リジン、塩酸グアニジン、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、ポリエチレンイミンおよびこれらの適切な混合物、すなわちこのような薬物の二種以上の混合物、からなる群より選択される。上記薬物は、好ましくは蔗糖である。場合により、ＥＤＴＡのような錯形成成分を発酵培地にさらに追加し得る。
【００２５】
この薬物は、Ｈ２Ｏでの発酵培地の希釈時に、宿主細胞の外側細胞膜の、発現した着目ポリペプチドの続く放出を伴う破壊をもたらす、浸透圧ショックを引き起こすような濃度で存在する。
【００２６】
発酵培地における希釈開始時の蔗糖の濃度は約２０％重量／体積であることが好ましい。この好ましい実施態様において、蔗糖含有発酵ブロスについてのＨ２Ｏによる希釈係数は少なくとも約３倍である。
【００２７】
上述のように、原核生物宿主細胞はグラム陰性菌が好ましく、エシェリヒア・コリ、シュードモナス・スピーシーズ、エンテロバクター・スピーシーズ、カンピロバクター・スピーシーズおよびビトレオシラ・スピーシーズからなる群より選択されるものが好ましい。とりわけ、エシェリヒア・コリが好ましい。
【００２８】
上記インターフェロンα２は、好ましくはインターフェロンα２Ａおよびインターフェロンα２Ｂからなる群より選択される。最も好ましい実施態様において、上記インターフェロンα２はインターフェロンα２Ｂである。
【００２９】
上述の抽出方法において、組換えインターフェロンα２を含む透明な粗抽出物を得ることが可能である。このポリペプチド含有抽出物は、高含有量のインターフェロンα２を高純度の形態で含む。
【００３０】
陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）工程の実施において、抽出工程から得られた粗インターフェロンα２含有粗抽出物のｐＨは約４．８から５．５のｐＨに調整してよく、場合により、濾過システム（例えば０．３マイクロメートルの濾過システム）を通過させてよい。この後、この処理した抽出物をＣＥＸカラムで溶出する。当分野において知られているいかなる陽イオン交換カラムも、不純物から抽出されたインターフェロンα２を分離することに用い得る。しかしながら、好ましくは、このカラムは、Ｓ ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｐｅｒ Ｄ Ｆが詰められる。平衡用溶出液として、ｐＨが５．０の酢酸ナトリウム（２０ｍＭ）＋ＮａＣｌ（７０ｍＭ）が好ましい。好ましくは、インターフェロンは１７５ｍＭＮａＣｌでのステップグラジエントを用いてカラムに通される。
【００３１】
ＣＥＸカラムから溶出した所望のインターフェロンα２含有画分のｐＨは、適切なアルカリ性物質、例えば水酸化ナトリウムにより、約７．３から７．７に調整してよく、およびこの画分の電気伝導率は、精製水で希釈することにより、約３．５から４．５ｍＳ／ｃｍに調整してよい。
【００３２】
次いで、この画分を陰イオン交換カラムに供給して、工程ｉｉ）の方法を実施する。当分野において知られているいかなる陰イオン交換カラムも、抽出されたインターフェロンを不純物から分離することに用い得る。しかしながら、好ましくは、このカラムは、Ｃｅｒａｍｉｃ Ｑ ＨｙｐｅｒＤ Ｆ樹脂が詰められる。平衡化は、好ましくは、ｐＨ７の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌで、例えば高速、例えば４から８ｃｍ／ｍｉｎで行われる。平衡化緩衝液でカラムを洗浄した後、適切なイオン性の溶質、例えば塩化ナトリウムを１０００ｍＭ以下の濃度で、好ましくは１５０ｍＭの濃度で添加することによって、所望のインターフェロン画分を溶出し得る。分離が行われる温度は、１０℃から１５℃が好ましい。
【００３３】
この陰イオン交換工程は極めて効率的であり、工程ｉｉ）から得られるインターフェロン画分内のインターフェロンの純度は、逆相高速液体クロマトグラフィーで測定されるように４０％を超え得る。
【００３４】
工程ｉｉ）を終了した後、インターフェロン画分は、宿主細胞のタンパク質がまだ混入していることがあり得る。従って、精製方法における工程ｉｉｉ）は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程であり、これらのタンパク質のとりわけ実質的な量を除去するように適合させられる。この工程は、この目的に適切な樹脂を詰めたカラムを用いて、実施される。この樹脂は、１５ＰＨＥ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が好ましい。工程ｉｉｉ）において、カラムで溶出されるべきインターフェロン画分は、先ず硫酸ナトリウム溶液で希釈（１：１）されて、０．５Ｍの濃度の硫酸ナトリウムにされることが好ましい。次いで、この画分のｐＨを、適切な酸または塩基、例えばＮａＯＨまたはＨＣｌで、約７．３から７．７に調整する。次いで、ｐＨが調整されたこの溶液をＨＩＣカラムに添加する。洗浄工程の後、インターフェロンが、硫酸ナトリウムの直線勾配で、好ましくは８００から０ｍＭの硫酸ナトリウムの直線勾配で、溶出される。ＩＰＣ逆相ＨＰＬＣに基づいて、９３面積％以上の純度のインターフェロンを有し、３面積％以上の単独の不純物を含まない画分が集められてプールされる。このプールされた画分は、次の工程に直接用られ得る。
【００３５】
工程ｉｖ）は、これまでの工程から持ち越されてきた、残りのＤＮＡおよび残りの宿主細胞のタンパク質を除去することに役立つさらなる陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）工程である。
【００３６】
ＣＥＸカラムは、適切な充填材が、例えばＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰ−６５０ Ｓ （ＴｏｓｏＨａａｓ）が詰められる。好ましい工程ｉｖ）において、工程ｉｉｉ）から得られた画分は、精製水で希釈されて、約７．５から８．５ｍＳ／ｃｍの最終的な電気伝導率をとされ、例えば９９から１００％の酢酸でｐＨを４．３から４．７に調整され、カラムに適用され得る。このカラムを洗浄し、次いで、塩化ナトリウムの直線勾配（０から３００ｍＭのＮａＣｌ）の間に、約２５０ｍＭのＮａＣｌにおいてインターフェロンα２が溶出する。ＩＰＣ逆相ＨＰＬＣによって測定されるような、９５面積％以上の純度のインターフェロンのメインピークを有し、３面積％以上の単独の不純物を含まない溶出した画分が集められ、この画分は次の精製工程で直接処理され得る。
【００３７】
工程ｖ）は、二量体およびあらゆる他の凝集物を除去するために採用されるサイズ排除クロマトグラフィー工程であり、インターフェロン産物を完成した剤形に調合する前に必要な、緩衝液の交換を適切に行う工程でもある。
【００３８】
この最後の工程のために、ゲル濾過に適したあらゆるカラムおよび充填材が使用され得る。使用される充填材は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇが好ましい。この充填材は、比較的に高い付加量、例えば約５から１５％の付加量でさえ、分離能力に優れているために、選択される。このカラムを、これまでの工程ｉｖ）からのインターフェロン画分を付加する前に、平衡化緩衝液で平衡化することが好ましい。次いで、インターフェロン画分を、適切な緩衝液、好ましくは、ｐＨが７．１から７．７の、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１３０ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．３ｍＭＥＤＴＡからなる緩衝液を用いて、このカラムから溶出し、インターフェロンα２産物を含む最終的なバルク溶液を提供する。
【００３９】
上述の方法は、工業的規模で適用できるインターフェロンα２産物を得るための効率的な方法を構成する。発酵ブロス１リットルあたり１００ｍｇを超えるインターフェロン産物を得ることが可能である。
【００４０】
本発明のインターフェロンα２のポリペプチドは、ヒトへの投与に適した完成した剤形に調合し得る。本発明のインターフェロンα２産物を含む調合剤は、注射用の調合剤に調合し得る。注射用の調合剤は、投与前に水で再溶解させる凍結乾燥産物として提供され得る。あるいは、注射用の注射用の調合剤は、単回投与または複数回投与用の調製品としての注射用溶液として、提供されうる。注射用の調合剤は、この分野において一般に知られている賦形剤をさらに含み得る。
【００４１】
このような調合剤は、Ｃ型肝炎の治療に有用である。投与量は、投与方法、年齢および／または個体の状態など、種々の因子に依存し得る。
【００４２】
次の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲をいかなる意味においても制限するものではない。実施例に開示された内容は、本発明の好ましい実施態様に関するものである。
【実施例１】
【００４３】
組換えヒトインターフェロンα２Ｂ（ｒｈＩＦＮα２Ｂ）の生産のための宿主細胞株の構築
１．１ 概論
ポリペプチドｒｈＩＦＮα２ｂ（組換えヒトインターフェロン−α２ｂ）が、ｒｈＩＦＮα２ｂをコードする最適化された合成遺伝子を含むプラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリＫ−１２株Ｗ３１１０内で生産される。ｒｈＩＦＮα２ｂが、シュードモナス・ディミヌタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＣＣＭ ３９８７由来のグルタリル７−ＡＣＡアシラーゼ遺伝子（ｇａｃ）のプロモーターおよびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の制御下で、組換えエシェリヒア・コリＫ−１２の発酵によって生産される。ｒｈＩＦＮα２ｂは、同じ（ｇａｃ）遺伝子に由来するシグナル配列とのＮ−末端融合タンパク質として発現され、このタンパク質は、ペリプラズムに向かい、同時にシグナル配列の処理（切断）が行われる。従って、発酵プロセスによって、天然型のヒトインターフェロンα２ｂと同じ一次配列を有する成熟ｒｈＩＦＮα２ｂが直接得られる。この発現プラスミドをｐＭＧ４１４と名付け、この生産株をＷ３１１０［ｐＭＧ４１４］と名付ける。
【００４４】
１．２ 発現ベクターｐＭＧ４１４の構築
ｐＵＣ１９は、ベクタープラスミドの構築のための出発点として機能する。ｐＵＣ１９は、頻繁に用いられ、高コピープラスミドとして徹底的に特徴付けされている。このプラスミドは、高効率複製起点およびアンピシリン抵抗性（ａｍｐまたはｂｌａ）遺伝子を含む（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、１９８５；ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ，１９８２；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ０９１３７およびＸ０２５１４）。ｐＵＣ１９は発現プラスミドを構築するために頻繁に用いられるものであるけれども、ａｍｐ遺伝子は工業目的のためには理想的な選択マーカーではないかもしれない。この理由から、ａｍｐ遺伝子のプロモーターおよびコード領域を除去し、周知の安全なプラスミドｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒら、１９７７ａ、１９７７ｂ、１９７８；総説：Ｂａｌｂａｓら、１９８６；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０１７４９、Ｋ００００５、Ｌ０８６５４、Ｍ１０２８３、Ｍ１０２８６、Ｍ１０３５６、Ｍ１０７８４、Ｍ１０７８５、Ｍ１０７８６、Ｍ３３６９４、Ｖ０１１１９）に由来するテトラサイクリン抵抗性遺伝子（ｔｅｔ）のプロモーターおよびコード領域と置換する。高忠実度ＰＣＲ技術の助けを借りてこのクローニング作業を行う。
【００４５】
このクローニング作業を達成するために、ｐＵＣ１９の塩基対１７４３から６７９をまたぐ断片を、高忠実度ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓのＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼシステム）および次の５’−リン酸化オリゴヌクレオチドを用いて増幅する。
【００４６】
【化１】
【００４７】
得られたＰＣＲ断片は、１６２４塩基対の長さであり、ａｍｐプロモーターおよびコード配列を欠くがａｍｐ遺伝子に由来する終止コドンおよび転写終結区を含む、完全なｐＵＣ１９バックボーンを含む。
【００４８】
上述のように、ｔｅｔプロモーターおよびコード配列（終止コドンを除く）を、ｐＢＲ３２２から増幅する。再び、高忠実度ＰＣＲを用いて、ｐＢＲ３２２の塩基対４から１２７３を増幅した。次の５’−リン酸化オリゴヌクレオチドをこの増幅に用いた。
【００４９】
【化２】
【００５０】
得られたＰＣＲ断片は、１２７０塩基対の長さである。これら二つのＰＣＲ断片は、調製用アガロースゲル電気泳動により精製され、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ， Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて連結される。連結されたＤＮＡを、精製し、エシェリヒア・コリＫ−１２ ＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテントセル、遺伝子型：Ｆ− ｍｃｒＡ Δ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＳ）φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５ ΔｌａｃＸ７４ ｄｅｏＲ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ａｒａＤ１３９ Δ（ａｒａ，ｌｅｕ） ７６９７ ｇａｌＵ ｇａｌＫ λ− ｒｐｓＬ ｎｕｐＧ）内にエレクトロポレーション導入する。形質転換された細胞を、１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンおよび３ｇ／Ｌのグルコースを含むＬＢ寒天プレート上に広げる。液体培養を１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンおよび３ｇ／Ｌのグルコースを含むＬＢブロス中で生育させ、標準的なミニプレップ法を用いてこの液体培養からプラスミドＤＮＡを単離する。プラスミドＤＮＡを制限酵素分析によって分析し、ｔｅｔ断片がｐＵＣ１９バックボーン内に正しく組み込まれているか調べる。この断片の組み込みは、方向に関して特定的でなく、挿入物を含むクローン全部の約５０％だけが、正しい方向に挿入された断片、すなわちｐＵＣ１９内のａｍｐ遺伝子と同じ方向で走っているｔｅｔ遺伝子を有していた。少数のクローンの液体培養からより多量のＤＮＡを単離し、より詳細な制限酵素分析に付す。正確な制限酵素パターンを示すこれらクローンから、さらなるクローニング作業のために一つを選択する。
【００５１】
それぞれのプラスミドをｐＭＧ４０２名付けた。これは、アンピシリン含有培地の代わりにテトラサイクリン含有培地上／内で生育させなければならないという事実以外は、すべての特徴および機能においてｐＵＣ１９と同一である。このようにして、工業目的に適したｔｅｔ抵抗性高コピーベクターが作製される。
【００５２】
プラスミドｐＭＧ４０２の特徴：
塩基対１９５４から６８０：ｐＵＣ１９バックボーン（＝ａｍｐプロモーターと構造遺伝子を欠くｐＵＣ１９）
塩基対６８１から１９５３：ｐＢＲ３２２由来のｔｅｔプロモーターおよび構造遺伝子
【００５３】
ｒｈＩＦＮα２ｂは、シュードモナス・ディミヌタＣＣＭ ３９８７（ｇａｃ１ｓｓ＝配列番号５）由来グルタリル７−ＡＣＡアシラーゼのシグナル配列との、ペリプラズムに向かい、同時に宿主細胞のシグナルペプチダーゼ装置によるシグナル配列の処理（切断）が行われるＮ−末端融合体として発現される。
【００５４】
ｇａｃ１ｓｓのアミノ酸配列（２７ａａ）：ＭＬＲＶＬＨＲＡＡＳ ＡＬＶＭＡＴＶＩＧＬ ＡＰＡＶＡＦＡ
【００５５】
ｇａｃ１ｓｓのコード配列の３’領域において、３’ＰＣＲプライマーを介してＳａｃ ＩＩ制限酵素部位を導入し、サイレント突然変異（アミノ酸配列が変化しない）を生じさせる。このＳａｃ ＩＩ部位は、ｇａｃ１ｓｓコードとｒｈＩＦＮα２ｂ遺伝子との融合を可能にする。
【００５６】
ｒｈＩＦＮα２ｂの構造遺伝子を化学的に合成する。この構造遺伝子は、１６５コドンのうちの４８コドンが天然のヒトｃＤＮＡ配列と異なり、弱くて誤りやすいあらゆるコドンを消去するように設計されている。
【００５７】
次の表に、コドンの変化が示されている。この表において、「天然のコドン」は、Ｓｔｒｅｕｌｉら、１９８０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｖ００５４８）によって公開されたｃＤＮＡの配列のことである。アミノ酸番号は、成熟ｈＩＦＮα２ｂ（Ｃｙｓ １から始まる）について示してある。合成遺伝子によってコードされたアミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｄａｔａｂａｓｅ、登録番号Ｐ０１５６３／Ｐ０１５６４（アミノ酸２４から１８８）からのものとする。
【００５８】
【表１】
【００５９】
得られた遺伝子は、エシェリヒア・コリ内でのｒｈＩＦＮα２ｂの効率的で正確な転写および翻訳を可能にする。この遺伝子は、細菌系内で発現するように設計されているので、非翻訳配列（イントロンなど）を全く含んでいない。
【００６０】
この構造遺伝子を化学的に合成する。要約すると、この構造遺伝子配列の両方のストランドを隙間無く網羅するやり方で、約３０から５０ヌクレオチドの長さの重複する相補的オリゴヌクレオチドを合成する。これらオリゴヌクレオチドを互いにハイブリッド形成させ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。反応産物を制限酵素で切断し、ｐＵＣ１８ベクター内にクローニングする。得られたプラスミドは、配列決定され、正しい配列を示す。
【００６１】
このプラスミド上の合成遺伝子は、ｇａｃシグナル配列を含まない。コード領域のこの部分を、プロモーター、ＲＢＳおよびシグナル配列を含むｇａｃ断片を介して導入し、ｒｈＩＦＮα２ｂ構造遺伝子と融合させる。
【００６２】
化学合成によってｇａｃ断片を作製する。例えば、ｇａｃ断片（両側の制限酵素認識部位＋効果的な切断を可能とする最小限の６つの追加の塩基対を含む）の両方のストランドの全長を隙間無く網羅するやり方で、約３０から５０ヌクレオチドの長さの重複する相補的オリゴヌクレオチドを合成する。次いで、オリゴヌクレオチドを互いにハイブリッド形成させ（例えば、加熱、次いで冷却によって）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。次いで、反応産物をそれぞれの制限酵素（Ｘｂａ ＩおよびＥｃｏＲ Ｉ）で切断し、ｐＭＧ４０２ベクター内にクローニングする（下記を参照すること）。
【００６３】
あるいは、プロモーター、ＲＢＳおよびシグナル配列を含むｇａｃ断片を、プラスミドｐＫＳ５５のようにこのような要素を含むプラスミドから増幅することができる。この構築は、ＣＳ特許第２７８，５１５号に記載されている。クローニングされたｇａｃ遺伝子は、シュードモナス・ディミヌタ（ＣＣＭ ３９８７）株由来のものである。高忠実度ＰＣＲシステムを用いて増幅を行う。次のＰＣＲプライマーを介して、クローニングに必要な制限酵素部位を導入する。
【００６４】
【化３】
【００６５】
高忠実度ＰＣＲ増幅を介して作製したｇａｃ断片と化学的な合成によって生成したｇａｃ断片との間に、性能において違いはない。
【００６６】
このようにして作製したｇａｃ断片は、次のヌクレオチド配列を有する。
【００６７】
【化４】
【００６８】
ｇａｃ断片（合成されたまたはＰＣＲを介して生成した）とベクタープラスミドｐＭＧ４０２とを、Ｘｂａ Ｉ部位とＥｃｏＲ Ｉ部位とを用いて連結する。このようにして、発現ベクターｐＭＧ４１２が作製される。
【００６９】
発現ベクターｐＭＧ４１２は、コドン１から２３＋ｇａｃシグナル配列のコドン２４の最初のヌクレオチドを含む。サイレント変異によって、コドン２２から２４内にＳａｃ ＩＩ部位を導入する。ｐＭＧ４１２内のＳａｃ ＩＩ部位の下流側のすべてがプライマーまたはベクター配列である。
【００７０】
目的構造遺伝子（ｒｈＩＦＮα２Ｂ、上記を参照すること）についてのフォワードＰＣＲプライマーによって、コドン２４＋コドン２５から２７の最後の二つのｎｔを導入する。従って、このようなプライマーは次の要素を含む：
切断オーバーハング（例えば６ヌクレオチド）−Ｓａｃ ＩＩ部位−ｔｃ ｇｃｃ ｔｔｔ ｇｃｇ （配列番号９）−「成熟した」目的遺伝子の５’末端に対応するハイブリッド形成領域。
【００７１】
とりわけ、適切なプライマーは次のヌクレオチド配列（配列番号１０）を有する。
【００７２】
【化５】
【００７３】
ｇａｃシグナル配列の最後のアミノ酸（２４から２７）はＶＡＦＡ（配列番号１１）である。
【００７４】
上記のプラスミド構築物から、高忠実度ＰＣＲシステムを用いてｒｈＩＦＮα２ｂ遺伝子を増幅する。５’ＰＣＲプライマーは、この遺伝子とｇａｃ断片＋ｇａｃシグナル配列の最後の四コドンとを融合させるためのＳａｃ ＩＩ部位を含む。３’プライマーは、ＴＡＡ（ｏｃｈｒｅ）終止コドンとクローニング用のＭｌｕ Ｉ部位とを含む。このインターフェロンα構造遺伝子の増幅によって、次の断片（配列番号１２）が生じる。
【００７５】
【化６】
【００７６】
Ｓａｃ ＩＩ部位とＭｌｕ Ｉ部位とを用いて、このｒｈＩＦＮα２ｂのＰＣＲ断片とｐＭＧ４１２とを連結する。このようにして、最終産物／発現プラスミドｐＭＧ４１４を作成した。ｐＭＧ４１４の両ストランドの配列決定を行い、予想された配列と違いがないことを示す。
【００７７】
プラスミドｐＭＧ４１４（総サイズ３６６８塩基対）の特徴：
塩基対２７２８から２５６： ｐＵＣ１９バックボーン、部分１
塩基対２５７から５４６： ｇａｃ断片（プロモーター、ＲＢＳ、シグナル配列）
塩基対５４７から１０４４： ｒｈＩＦＮα２ｂの合成遺伝子（ＴＡＡ終止を含む）
塩基対１０４５から１４５４： クローニング部位＋ｐＵＣ１９バックボーン、部分２
塩基対１４５５から２７２７： ｐＢＲ３２２（プロモーター／ＲＢＳ１４５５から１５３６、ＴＡＡ終止を含むコード配列１５３７から２７２７）由来のｔｅｔ遺伝子
【００７８】
これによって、プロモーター、ＲＢＳおよびシグナル配列を含むｇａｃ断片は、ＰＣＲプライマーによって導入されたｇａｃ断片の３’末端における制限酵素部位を用いて、ｒｈＩＦＮα２ｂの構造遺伝子と融合される。この同じ部位は、やはりＰＣＲプライマーを用いる方法により、ｒｈＩＦＮα２ｂ構造遺伝子の５’末端と融合される。両成分（ｇａｃ断片とｒｈＩＦＮα２ｂの構造遺伝子）は基礎ベクター内にクローニングされて、ｇａｃ１ｓｓ−ｒｈＩＦＮα２ｂ融合タンパク質をコードする遺伝子が作製される。この合計で１９２コドン（５７６ヌクレオチド）の内、最初の２７コドンは最終タンパク質内には存在しないｇａｃシグナル配列をコードし、アミノ酸２８から１９２は成熟したｒｈＩＦＮα２ｂ（１６５アミノ酸、システイン１からグルタミン酸１６５）をコードする。
【００７９】
ｒｈＩＦＮα２ｂ発現プラスミドｐＭＧ４１４（８０７塩基対）（下記を参照すること）に用いられている発現カセットのヌクレオチド配列およびｇａｃ１ｓｓ−ｒｈＩＦＮα２ｂ融合タンパク質のアミノ酸配列は、次に示すとおりである
【００８０】
【化７】
【００８１】
示された配列をサブパラグラフ／領域に分割する。これらは次のものを含む。
１．ｇａｃプロモーターおよびＲＢＳ（第一パラグラフ、ｐＭＧ４１４の塩基対２５７から４６５、下記を参照すること）、
２．ｇａｃシグナル配列のコーディング領域（第二パラグラフ、ｐＭＧ４１４の塩基対４６６から５４６、下記を参照すること）、
３．ｒｈＩＦＮα２ｂ（第三パラグラフ、ｐＭＧ４１４の塩基対５４７から１０４４（下記を参照すること）−ＴＡＡ終止コドンを含む）についての合成遺伝子、および
４．３’クローニングリンカー（第四パラグラフ、ｐＭＧ４１４の塩基対１０４５から１０６３、下記を参照すること）。
【００８２】
ｐＭＧ４１４上のこれらの四領域は互いに直結している。図面では、明瞭にするための理由により、これらを分割している。
【００８３】
オープンリーディングフレームの開始（ＡＴＧ）コドンおよび終止（ＴＡＡ）コドンを太字で示す。
【００８４】
成熟したｒｈＩＦＮα２ｂの最初のコドン（ＴＧＣ）と最後のコドン（ＧＡＡ）には下線を付してある。
【００８５】
クローニングのために用いる制限酵素部位を箱で囲んでいる。これらは、
−ｇａｃ断片（プロモーター、ＲＢＳ、シグナル配列、Ｓａｃ ＩＩ部位、Ｍｌｕ Ｉ部位、Ｓｐｅ Ｉ部位）を導入するためのＸｂａ Ｉ（ＴＣＴＡＧＡ）およびＥｃｏＲ Ｉ（ＧＡＡＴＴＣ）
ｒｈＩＦＮα２ｂＰＣＲ断片−（ｇａｃ１ｓｓの最後の四アミノ酸についての四コドン、成熟したｒｈＩＦＮα２ｂについての４９５塩基対の合成遺伝子およびＴＡＡ（Ｔ）終止コドンを含む）を導入するためのＳａｃ ＩＩ（ＣＣＧＣＧＧ）およびＭｌｕ Ｉ（ＡＣＧＣＧＴ）
である。
【００８６】
ｇａｃプロモーターは高い構成／基礎活性を示し、化学的な誘導物質または物理的な刺激（培養条件の変更）の付加は必要ではない。
【００８７】
１．３ 組換え体細胞系のクローニングと構築
エレクトロポレーション導入によって、発現プラスミドｐＭＧ４１４を宿主株ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３１３２ （＝Ｗ３１１０ （ＡＴＣＣ ２７３２５））内に導入する。標準的なプロトコールに従って、エレクトロコンピテントセルを調製し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ ２５１０を用いて、０．１ｍｍのキュベット内で１８００Ｖにてエレクトロポレーション導入を行う。
【００８８】
エレクトロポレーション導入の後、反応を液体培地内で一時的に停止し、テトラサイクリンを含む寒天プレート上に広げる。
【００８９】
適切な細胞クローンの選択についての出発点は、このようにして得られた形質転換用プレートである。このプレートからの種々のクローンを液体培養で生育させ、研究用細胞バンクとして冷凍保存する。これらの生産性を、振盪フラスコ内での実験で試験し、比較する。最も優れたクローン（Ｅ１／１１６）をさらなる開発に用いる。
【００９０】
最も優れたクローンは良好な生産性を示し得るが、生育が比較的遅い。このような遅い生育は、種々の因子に、例えば産物の宿主細胞への毒性、産物の合成による代謝への負担などに起因する可能性がある。ときには、グルコースの添加によっていくらか改善される。何故ならば、グルコースは、組換えタンパク質の発現に用いられる多数のプロモーターを下方制御（例えば異化代謝産物抑制によって）するからである。さらに、グルコースは一般的に、エシェリヒア・コリの成長にプラスの効果を有する。何故ならば、炭素源として代謝に直接導入され得るからである。
【００９１】
Ｅ１／１１６の場合、生育に与えるグルコースの明白なプラスの効果が見られる。２から５ｇ／Ｌの間のグルコース濃度によって、最も良い結果が達成される。細胞系を産物の形成に対処し、その結果グルコース不存在においてより良好に生育することに適合させるために、この株を、振盪フラスコ内の液体培地中に数世代生育させる（「振盪フラスコカスケード」）。
【００９２】
より具体的には、Ｅ１／１１６の冷凍バイアルを解凍し、この細胞懸濁液を、テトラサイクリンを含むグルコースなしのＬＢ寒天プレート上に画線する。このプレートを、液体培養に接種するのに十分なサイズにコロニーが達するまで、３７℃でインキュベートする。コロニーを、テトラサイクリンを含む１５ｍＬのグルコースフリーのＬＢブロスで満たした小さな振盪フラスコ内に、プレートから移す。６００ｎｍでの光学密度が０．５を超える（通常は＞１．０）まで、培養物を３７℃で振盪する。元の単離物の生育が遅いという性質のせいで、この第一ラウンドのための振盪は４８時間を要する。
【００９３】
プレート上に画線されているこれまでのラウンドの液体培養と、次の液体培養に接種するのに使用するプレートからのコロニーとを用いて、上述のパラグラフに記載された手順を連続的に五回実施する。それぞれの液体培養から光学密度を測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ウェスタンブロットを用いて産物の力価を測定するために、サンプルを取り出した。生育と生産性との組み合わせが最良の培養からのクローンを用いて、次のラウンドを開始する。
【００９４】
この培養カスケードの異なるラウンド（すなわち複数の増殖工程および再単離工程）の過程において、下位株の生育特性が徐々に改善する。それぞれのラウンドにおける生育と生産性との最良の組み合わせを有する株を選択することによって、力価も徐々に向上する。五回目のラウンドの後、テトラサイクリンを含むＬＢ寒天プレート上に単一のコロニーを再度形成させ、テトラサイクリンを含む液体培養に接種するために用いて第一次シードロット（ＰＳＬ）を作成する。この培養を３７℃で約１．５の光学密度まで生育させ、等量の４０％ｗ／ｖの滅菌グリセリンと混合し、アリコートを冷凍貯蔵用バイアル内に分け、−８０℃で凍結する。このＰＳＬを、インターフェロンα２ｂ生産株のＧＭＰ細胞バンク（マスター細胞バンクと作業用細胞バンク）を作成するための出発点として用いる。この単離物をＥ１／１１６ａと名付ける。上述のような再単離プロセスから、再現可能な結果が得られることが分かった。
【００９５】
Ｅ１／１１６ａは、振盪フラスコ内および撹拌バイオリアクター（発酵槽）内で優れた生育特性を示す。バイオリアクターを開始することに適する接種材料は、作業用細胞バンクのバイアルから開始して振盪フラスコ内で約８時間生育させる。
【００９６】
上記の第一次シードロットから、ｃＧＭＰ条件の下でマスター細胞バンクを調製する。要約すれば、ＰＳＬバイアルを解凍し、テトラサイクリンを含む寒天プレート上に広げる。単一のコロニーを取り上げ、マスター細胞バンク（ＭＣＢ）の振盪フラスコ培養（テトラサイクリンを含むＬＢブロス培地）に接種するために用いる。対数増殖期からの細胞懸濁液を１＋１で４０％ｗ／ｖのグリセリンと混合し、１．８ｍＬのアリコートを冷凍貯蔵用バイアル内に入れ、冷凍貯蔵用管内に密封し、液体窒素タンクの液相内で凍結させる。
【００９７】
解凍したＭＣＢバイアルからの細胞懸濁液を用いて振盪フラスコ培養を接種すること以外はマスター細胞バンクと同様にして、作業用細胞バンクを作成する。
【実施例２】
【００９８】
組換えヒトインターフェロンα２Ｂ（ｒｈＩＦＮα２Ｂ）を生産するための発酵プロセス
発酵プロセスを、上記の作業用細胞バンクから得られ得るエシェリヒア・コリＫ−１２株Ｗ３１１０を、プラスミドを保持しない細胞の増殖を回避するための抗生物質の塩酸テトラサイクリンを添加したＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ−）培地中に振盪フラスコ培養にて３７℃で生育させることによって、開始する。
【００９９】
次いで、振盪フラスコ培養を用いて種培養（＝前培養）培地に接種する（接種サイズ＝０．４％）。この前培養のための培地は、唯一の炭素源としてのグルコースと複合窒素源としての酵母自己消化物とを含む脱イオン水を基礎とする。さらに、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４およびＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏのような無機塩をこの培地に添加する。消泡剤として、ポリプロピレングリコール２０００（ＰＰＧ２０００）を用いる。とりわけ、この前培養の培地は次の組成物を有する：
前培養用基礎培地：
【０１００】
【表２】
【０１０１】
これらの培地成分を、一緒に、２０分間、１２１℃で滅菌する。基礎培地を冷却した後、抗生物質の塩酸テトラサイクリンの５ｇ／Ｌの滅菌ストック溶液のアリコート（濾過（０．２２μｍのフィルター）により滅菌した）を基礎培地に添加する。
【０１０２】
塩酸テトラサイクリンのストック溶液（５ｇ／Ｌ）
【０１０３】
【表３】
【０１０４】
種培養の培養時間は約１６時間である。この種培養の培養の間、硫酸および水酸化ナトリウムまたは濃アンモニア溶液でｐＨ値を７．０±０．２の設定値に制御する。撹拌速度を増すことによって、溶存酸素の濃度を飽和の２０％よりも高いレベルに維持する。培養初期の撹拌速度を３００ｒｐｍに設定し、容器内の背圧を０．３ｂａｒに、および通気速度を３０Ｌ／ｍｉｎ（「１ｖｖｍ」に相当する）に制御する。温度を培養中常に３７℃に維持する。ブロスを発酵プロセスの主要段階に移行させる基準として、炭素源が消費された後の溶存酸素濃度の上昇を用いる。
【０１０５】
本培養の培養のために、脱イオン水、炭素源としてのグルコースおよび複合窒素源としての酵母自己消化物を基礎とする培地を用いる。無機塩（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＣａＣｌ２・２Ｈ２ＯおよびＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを添加することに加えて、ＰＰＧ ２０００を消泡剤として用いる。最初のグルコースを別に滅菌し、滅菌された培地の残りに添加する。主発酵培地に接種するサイズは、０．７５から３％の間の範囲であった。とりわけ、本培養の培地は次の組成を有する。
【０１０６】
本培養の基礎培地：
【０１０７】
【表４】
【０１０８】
これらの培地成分を、一緒に、２０分間、１２１℃で滅菌する。冷却した後、別に加熱滅菌した８００ｇ／Ｌのグルコースストック溶液のアリコートを（１２０℃で３０分間以上かけて滅菌した）主培養の基礎培地に添加する。
【０１０９】
グルコースストック溶液、８００ｇ／Ｌ：
【０１１０】
【表５】
【０１１１】
この培養の間の最も重要な点は、培地内に当初から存在するグルコースが完全に消費される必要があることである。このことによって、培養から約９時間後に溶存酸素の濃度の急激な上昇がもたらされる。当初のグルコースの全てが消費される前にグルコースの供給を開始することによって、産物の形成が見られない。従って、グルコース溶液を一定の速度で供給することにより制御された、グルコースの制限が極めて重要である。培養の間、温度を約２８℃の一定の値に制御する。初期の撹拌速度を３００ｒｐｍに設定し、通気速度を１００Ｌ／ｍｉｎ（「１ｖｖｍ」に相当する）に制御し、槽内背圧を０．３ｂａｒに設定する。ｐＨ値を硫酸および水酸化ナトリウムまたは濃アンモニア溶液で７．１±０．３に制御する。最初に供給されたグルコースの消費後の、８．０までのｐＨ値のピークは許容できる。
【０１１２】
溶存酸素の濃度を、飽和の２０％より高い値に制御する。バイオリアクターの酸素移動能力に依存して、先ず撹拌速度を最高値まで増すことによって、ＤＯ濃度を、飽和の２０％より高いレベルに、好ましくは飽和の約４０％から１００％の間のレベルに維持する。撹拌速度の増加では不十分なときは、最初の通気速度およびそれ以降の背圧をそれぞれ高める。培養４８から１９２時間（培養時間経過により産物形成の直線的な増加が見られる）後、培養物を回収し、１５±５℃に冷却し、蔗糖／ＥＤＴＡを冷却ブロスに添加することによって、下流でのプロセシングのための条件を整える。
【０１１３】
発酵バッチの結果を、研究室または実験工場にて産物よりペリプラズムを抽出した後、ウェスタンブロット技術またはＨＰＬＣ測定に基づいて、分析する。
【実施例３】
【０１１４】
細胞の破壊および抽出
発現されたインターフェロンα２Ｂをペリプラズムスペースに含む宿主細胞を含む発酵ブロスを、発酵直後にｐＨ５．０±０．１に硫酸で調整し、４℃±２℃に冷却する。この低ｐＨと低温は、内因性プロテアーゼの不活性化に役立つ。
【０１１５】
発酵ブロスを１０℃から２０℃に調整し、次いで細胞を濃縮または洗浄せずに、発酵ブロスに固体または液体の蔗糖（２００ｇ蔗糖／ｋｇ発酵ブロス）およびＥＤＴＡ（１０ｍＭの濃度）を添加し、発酵ブロスのｐＨを８．０に調整する。蔗糖およびＥＤＴＡを含む発酵ブロスを冷水（約４℃の温度）内に注ぐかまたは注入して、冷水による浸透圧ショック（１＋３希釈）を利用する選択的な一工程細胞透過プロトコールの後、放出されたペリプラズム抽出物を透明にする。ポリエチレンイミンを添加して最終濃度０．０５％とし、ｐＨを酢酸で約７．５に調整する。１５分から４５分後、細胞デブリおよびＤＮＡが凝集し、インターフェロンを含む透明な粗抽出物が残る。この粗抽出物を遠心分離に付して透明さを改善してもよい。
【０１１６】
この手順は、総タンパク質含有量の２０％を超える純度をもって、高収率の所望のインターフェロンα２Ｂを含む透明なペリプラズム抽出物をもたらす。ポリエチレンイミンは、可溶性タンパク質抽出物からの細胞デブリの分離に役立ち、極めて純度の高いインターフェロン溶液をもたらす。
【実施例４】
【０１１７】
組換えヒトインターフェロンα２Ｂ（ｒｈＩＦＮα２Ｂ）のクロマトグラフィーによる精製
４．１ 陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）による捕捉
実施例３の粗抽出物の、酢酸による４．８から５．２へのｐＨ調節および０．３ミクロンフィルターを用いる濾過工程の後、実施例３の粗抽出物をＣＥＸカラム（Ｓ ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｆ （Ｂｉｏｓｅｐｒａ））に適用する。平衡化緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび７０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０）による洗浄工程の後、インターフェロンをステップグラジエントによって１７５ｍＭＮａＣｌにおいて溶出する。集められた画分を、実施例４．２の処理工程により直ちに処理する。
【０１１８】
４．２ 陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー
実施例４．１からの画分を、水酸化ナトリウムで７．３から７．７のｐＨに調整し、水で希釈し精製して電気伝導率を３．５から４．５ｍＳ／ｃｍとし、ＡＥＸカラム（Ｑ ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｆ （Ｂｉｏｓｅｐｒａ））に適用する。洗浄後、インターフェロンを直線塩勾配（０から３００ｍＭのＮａＣｌ）により約１５０ｍＭＮａＣｌにおいて溶出する。ＩＰＣ逆相ＨＰＬＣに基づいて、９０面積％以上の純度を有する画分を集め、次の工程に直接用いる（実施例４．３を参照すること）。
【０１１９】
４．３ 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
実施例４．２の画分を、硫酸ナトリウム（０．５％の硫酸ナトリウム）のストック溶液を用いて希釈し（１：１）、ＮａＯＨまたはＨＣｌを用いて７．３から７．７のｐＨに調整し、ＨＩＣカラム（Ｓｏｕｒｃｅ １５ＰＨＥ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用する。洗浄後、実施例３のインターフェロン画分を硫酸ナトリウムの直線濃度（８００から０ｍＭの硫酸ナトリウム）により約４００ｍＭの硫酸ナトリウにおいて溶出する。ＩＰＣ逆相ＨＰＬＣに基づいて、９３面積％以上の純度を有し、３％以上の不純物を含まない画分を集め、次の精製工程に直接用いる。
【０１２０】
４．４ 陽イオン交クロマトグラフィー（ＣＥＸ）
実施例４で集められた画分を、水で希釈して最終的な電気伝導率を７．５から８．５ｍＳ／ｃｍとし、９９から１００％の酢酸により４．３から４．７のｐＨに調整し、ＣＥＸカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰ−６５０ Ｓ （ＴｏｓｏＨａａｓ））に適用する。洗浄工程後、インターフェロンをＮａＣｌ直線勾配（０から３００ｍＭのＮａＣｌ）にて約２５０ｍＭＮａＣｌにおいて溶出する。ＩＰＣ逆相ＨＰＬＣに基づいて、９５面積％以上の純度を有し、３％以上の不純物を含まない画分を集め、次の精製工程に直接用いる。
【０１２１】
４．５ サイズ排除クロマトグラフィー
最後の精製工程は、二量体および他の凝集物を除去し、最終的調合のために緩衝液の交換を行うための、ゲル濾過工程である。この工程で用いるＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｇは、負荷量が多い（５％から１５％）場合でさえ優れた分離能を示す。ＳＥＣを、２５ｍＭリン酸ナトリウムおよび１３０ｍＭＮａＣｌ＋０．３ｍＭＥＤＴＡにおいて、約７．３から７．７のｐＨにて実施する。
【０１２２】
最も純度が高い画分（ＲＰ−ＨＰＬＣでのメインピークが９５％を超え、サイドピークがないものが３％を超える）をプールして、所望の組換えヒトインターフェロンα２Ｂを高収率の純粋な形態で含む、最終的なバルク溶液を得る。
【０１２３】
微生物の寄託：
本明細書で用いられるエシェリヒア・コリ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）は、１０８０１ユニバーシティー・ブルバール、マナッサス、バージニア州２０１１０−２２０９、アメリカ合衆国のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に、寄託番号ＰＴＡ−３１３２の下、２００１年２月２８日に寄託された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換された宿主細胞のペリプラズムに発現時に分泌された、着目組換えポリペプチドを調製するための方法に関する。
【０００２】
とりわけ、本発明は、組換えヒトインターフェロンα２を調製し精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
インターフェロンα２のグループのインターフェロンのようなポリペプチドまたはタンパク質は、細菌細胞（例えばエシェリヒア・コリ）を宿主として用いる組換えＤＮＡ技術によって生産し得る。従って、細菌細胞は上記ポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡにより形質転換し得る。これにより、これら細菌は、細胞質またはペリプラズムのいずれかにおいて多量のポリペプチドを発現させることができる。細菌は大規模な発酵プロセスを利用して多量に生育させることができるので、多量のポリペプチドをこの方法により生産することができる。
【０００４】
組換え技術は、粗着目ポリペプチドを高収率で生産するのに使用できる一方、このポリペプチドの単離および精製は簡単な事柄ではない。通常の単離手順においては、例えば酸性化または加熱によって、発酵ブロスは中性化される。次いで、細菌細胞を取り出し、破棄される、不要な可溶性副産物を含む液体上清が残る。生じた細菌細胞の塊は適切な培地に、例えば適切な緩衝液に再懸濁し、細胞を破壊して粗インターフェロンを抽出し単離する。この労働力を費やす手順は、着目ポリペプチドを発酵副産物および他の汚染物から可能な限り分離して、次に続く精製工程（クロマトグラフィーによる分離を含む）が可能な限り効率的に進むことを確実にするために、実施される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような従来技術の手順の労働力を要する特質は、抽出される着目ポリペプチドのより低い収率およびより高い生産コストをもたらし得る。従って、高収率および費用効率が高いやり方で、細菌細胞から着目組換えポリペプチドを精製することを可能とする方法が、依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の場面において、着目組換えポリペプチドの、例えば組換えインターフェロンα２などの、グラム陰性菌細胞のようなペリプラズムを含む宿主細胞からの効率的な抽出および単離が、ペリプラズム内に発現した着目組換えポリペプチドを含む宿主細胞に浸透圧ショックを直接与えることによって可能であることが意外にも判明し、これによって上記の分離工程および再懸濁工程が省略されることが意外にも判明した。このような方法を行うことによって、宿主細胞の外側細胞膜が、宿主細胞のペリプラズムが内容物の発酵培地中へ放出されるよう十分に破壊される。これによって、細胞内の不要な物質の、例えば細胞デブリ内の宿主細胞のタンパク質およびＤＮＡの放出を回避することができる。驚くべきことに、次のクロマトグラフィーによる精製は妥協できないが、単離される組換えポリペプチドの収率および／または純度の向上が容易にもたらされる。
【０００７】
本発明の場面において、クロマトグラフィー工程の独特の順序によって、とりわけ上記の抽出方法／破壊方法を組み合わせた場合、組換えインターフェロンα２の収率および／または純度の向上がもたらされることがさらに判明した。
【０００８】
従って、本発明の一つの側面において、
（ｉ）原核生物宿主細胞の発酵、ここにおいて、前記宿主細胞は、ペリプラズムを有し、着目ポリペプチドを前記宿主細胞のペリプラズム内に分泌させることができる組換え発現系を用いて形質転換されており、前記発酵は、発酵培地中、着目ポリペプチドが前記宿主細胞のペリプラズム内に分泌されるような条件下において行われ、および
（ｉｉ）発酵培地中に含まれる前記宿主細胞に浸透圧ショックを与えることにより前記ペリプラズムからの着目ポリペプチドの抽出
を含む、着目ポリペプチドを調製する方法が提供される。
【０００９】
適切な組換えペリプラズム発現系は、とりわけ発現ベクターおよび対応する原核生物宿主細胞加えて適切な発酵方法は、当分野において周知である。適切な実例が、下記の実施例の項に記載されている。
【００１０】
本発明の好ましい実施態様において、前記浸透圧ショックは、前記発酵培地に薬物を直接添加し、引き続いて前記発酵培地をＨ２Ｏにより希釈することによって与えられ、ここにおいて、前記薬物は、Ｈ２Ｏによる希釈後に前記宿主細胞の外側細胞膜の破壊をもたらす浸透圧を生じさせることができるものである。
【００１１】
この薬物としては、蔗糖、塩化ナトリウム、アルギニン、リジン、塩酸グアニジン、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、ポリエチレンイミンおよびこれらの適切な混合物、すなわちこのような薬物の二種以上の混合物、からなる群より選択されるものが好ましい。最も好ましくは、この薬物は蔗糖である。場合により、ＥＤＴＡのような錯形成成分が発酵培地にさらに追加され得る。
【００１２】
この薬物は、Ｈ２Ｏでの発酵培地の希釈時に、宿主細胞の外側細胞膜の、発現した着目ポリペプチドの続く放出を伴う破壊をもたらす、浸透圧ショックを引き起こすような濃度で存在する。
【００１３】
とりわけ、本発明のさらなる好ましい実施態様において、発酵培地における希釈開始時の蔗糖の濃度は約２０％重量／体積である。蔗糖含有発酵ブロスのＨ２Ｏでの希釈係数が少なくとも約３倍であることが好ましい。
【００１４】
本発明の場面において、ペリプラズムを含む原核生物宿主細胞はグラム陰性菌が好ましい。このグラム陰性菌は、好ましくは、エシェリヒア・コリ、シュードモナス・スピーシーズ、エンテロバクター・スピーシーズ、カンピロバクター・スピーシーズおよびビトレオシラ・スピーシーズからなる群より選択される。本発明の最も好ましい実施態様において、宿主細胞はエシェリヒア・コリである。
【００１５】
細胞の破壊工程に続いて、着目ポリペプチドを含む抽出物から細胞デブリおよび他の粒子状物質を分離できるようにするために、着目組換えポリペプチドの粗調製品であるところの発酵ブロスを、例えば高速遠心分離などの分離工程に付し得る。抽出物から粒子状物質を分離することを助けるために、分離工程の前に、適切な沈殿剤を発酵ブロスに添加することが好ましい。本発明の場面において、この工程のためには、ポリエチレンイミンが特に優れた沈殿剤であることが判明した。このポリエチレンイミンは、好ましくは、ｐＨが約７．５に、例えば７．３から７．７に調整された培地内で約０．０５％の濃度で用いることが好ましい。
【００１６】
本発明の方法は、多様な着目ポリペプチドの生産のために利用することができる。とりわけ、本発明によれば、着目ポリペプチドは、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、増殖因子、サイトカイン、酵素、酵素インヒビター、抗体ならびに抗体断片など、例えばインターフェロンα２Ａ、インターフェロンα２Ｂ、インターロイキン−３、インターロイキン−６、ヒト成長ホルモン、インシュリン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロンβ１、ウシソマトロピン、ブタソマトロピン、インターロイキン−１１、インターロイキン−２、Ｆａｂ断片、およびカルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）またはグルカゴンなどの小ペプチドからなる群より選択することができる。本発明の範囲内において、着目ポリペプチドは、組換えヒトインターフェロン２、とりわけヒトインターフェロンα２Ａまたはヒトインターフェロンα２Ｂが好ましく、後者が着目ポリペプチドとして特に好ましい。
【００１７】
着目ポリペプチドを含む抽出物は、インターフェロンを完成した剤形に調合する前に除去されるべき多数の不純物、例えば宿主細胞のタンパク質および宿主細胞のＤＮＡを含み得る。通常、このポリペプチドは、それ自体知られている沈殿技術およびクロマトグラフィーによる分離技術によって精製される。例えば、ポリペプチドは多工程クロマトグラフィーによる分離を利用して精製され得る。
【００１８】
しかしながら、着目ポリペプチドの性質に応じて、この方法は、クロマトグラフィーによる工程の間に入れられる重要な透析工程および／または濃縮工程が必要となり、複雑である。これらの余分な工程は、労働力を要し、収率をより低くしおよび生産コストをより高くし得る。
【００１９】
本発明の場面において、粗調整品の、特に前に述べた組換えインターフェロンα２の、多工程クロマトグラフィー精製は、特定のクロマトグラフィー工程を慎重に選択し順序を定めることによって、いかなる透析工程または濃縮工程を行わずとも実施できることが、判明した。
【００２０】
従って、本発明の他の側面は、
（ａ）組換えインターフェロンα２の粗調製品を得ること、
（ｂ）前記粗調製品を、次、
（ｉ）陽イオン交換クロマトグラフィー、
（ｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー、
（ｉｉｉ）疎水性相互作用クロマトグラフィー、
（ｉｖ）陽イオン交換クロマトグラフィー、
（ｖ）サイズ排除クロマトグラフィー
を順番に含む多工程クロマトグラフィーに適用する工程、
を含む、組換えインターフェロンα２を調製するための方法に関する。
【００２１】
上の本発明の側面の好ましい態様において、組換えインターフェロンα２の粗調整品は、
（ａ）原核生物宿主細胞の発酵、ここにおいて、前記宿主細胞は、ペリプラズムを有し、組換えインターフェロンα２を前記宿主細胞のペリプラズム内に分泌させることができる組換え発現系を用いて形質転換されており、前記発酵は、発酵培地中、組換えインターフェロンα２が前記ペリプラズム内に分泌されるような条件下において行われ、
（ｂ）発酵培地中に含まれる前記宿主細胞に浸透圧ショックを与えることによる前記ペリプラズムからの着目ポリペプチドの抽出
を含む方法により得られる。
【００２２】
上述のように、適切な組換えペリプラズム発現系、とりわけ発現ベクターおよび対応する原核生物宿主細胞加えて適切な発酵方法は、当分野において周知である。適切な実例が、後記実施例の項に記載されている。
【００２３】
上述のように、上記浸透圧ショックは、前記発酵培地に薬物を直接添加し、引き続いて前記発酵培地をＨ２Ｏにより希釈することによって与えられ、ここにおいて、前記薬物は、Ｈ２Ｏによる希釈後に前記宿主細胞の外側細胞膜の破壊をもたらす浸透圧を生じさせることができるものである。
【００２４】
本発明の好ましい実施態様において、この薬物は、蔗糖、塩化ナトリウム、アルギニン、リジン、塩酸グアニジン、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、ポリエチレンイミンおよびこれらの適切な混合物、すなわちこのような薬物の二種以上の混合物、からなる群より選択される。上記薬物は、好ましくは蔗糖である。場合により、ＥＤＴＡのような錯形成成分を発酵培地にさらに追加し得る。
【００２５】
この薬物は、Ｈ２Ｏでの発酵培地の希釈時に、宿主細胞の外側細胞膜の、発現した着目ポリペプチドの続く放出を伴う破壊をもたらす、浸透圧ショックを引き起こすような濃度で存在する。
【００２６】
発酵培地における希釈開始時の蔗糖の濃度は約２０％重量／体積であることが好ましい。この好ましい実施態様において、蔗糖含有発酵ブロスについてのＨ２Ｏによる希釈係数は少なくとも約３倍である。
【００２７】
上述のように、原核生物宿主細胞はグラム陰性菌が好ましく、エシェリヒア・コリ、シュードモナス・スピーシーズ、エンテロバクター・スピーシーズ、カンピロバクター・スピーシーズおよびビトレオシラ・スピーシーズからなる群より選択されるものが好ましい。とりわけ、エシェリヒア・コリが好ましい。
【００２８】
上記インターフェロンα２は、好ましくはインターフェロンα２Ａおよびインターフェロンα２Ｂからなる群より選択される。最も好ましい実施態様において、上記インターフェロンα２はインターフェロンα２Ｂである。
【００２９】
上述の抽出方法において、組換えインターフェロンα２を含む透明な粗抽出物を得ることが可能である。このポリペプチド含有抽出物は、高含有量のインターフェロンα２を高純度の形態で含む。
【００３０】
陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）工程の実施において、抽出工程から得られた粗インターフェロンα２含有粗抽出物のｐＨは約４．８から５．５のｐＨに調整してよく、場合により、濾過システム（例えば０．３マイクロメートルの濾過システム）を通過させてよい。この後、この処理した抽出物をＣＥＸカラムで溶出する。当分野において知られているいかなる陽イオン交換カラムも、不純物から抽出されたインターフェロンα２を分離することに用い得る。しかしながら、好ましくは、このカラムは、Ｓ ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｐｅｒ Ｄ Ｆが詰められる。平衡用溶出液として、ｐＨが５．０の酢酸ナトリウム（２０ｍＭ）＋ＮａＣｌ（７０ｍＭ）が好ましい。好ましくは、インターフェロンは１７５ｍＭＮａＣｌでのステップグラジエントを用いてカラムに通される。
【００３１】
ＣＥＸカラムから溶出した所望のインターフェロンα２含有画分のｐＨは、適切なアルカリ性物質、例えば水酸化ナトリウムにより、約７．３から７．７に調整してよく、およびこの画分の電気伝導率は、精製水で希釈することにより、約３．５から４．５ｍＳ／ｃｍに調整してよい。
【００３２】
次いで、この画分を陰イオン交換カラムに供給して、工程ｉｉ）の方法を実施する。当分野において知られているいかなる陰イオン交換カラムも、抽出されたインターフェロンを不純物から分離することに用い得る。しかしながら、好ましくは、このカラムは、Ｃｅｒａｍｉｃ Ｑ ＨｙｐｅｒＤ Ｆ樹脂が詰められる。平衡化は、好ましくは、ｐＨ７の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌで、例えば高速、例えば４から８ｃｍ／ｍｉｎで行われる。平衡化緩衝液でカラムを洗浄した後、適切なイオン性の溶質、例えば塩化ナトリウムを１０００ｍＭ以下の濃度で、好ましくは１５０ｍＭの濃度で添加することによって、所望のインターフェロン画分を溶出し得る。分離が行われる温度は、１０℃から１５℃が好ましい。
【００３３】
この陰イオン交換工程は極めて効率的であり、工程ｉｉ）から得られるインターフェロン画分内のインターフェロンの純度は、逆相高速液体クロマトグラフィーで測定されるように４０％を超え得る。
【００３４】
工程ｉｉ）を終了した後、インターフェロン画分は、宿主細胞のタンパク質がまだ混入していることがあり得る。従って、精製方法における工程ｉｉｉ）は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程であり、これらのタンパク質のとりわけ実質的な量を除去するように適合させられる。この工程は、この目的に適切な樹脂を詰めたカラムを用いて、実施される。この樹脂は、１５ＰＨＥ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が好ましい。工程ｉｉｉ）において、カラムで溶出されるべきインターフェロン画分は、先ず硫酸ナトリウム溶液で希釈（１：１）されて、０．５Ｍの濃度の硫酸ナトリウムにされることが好ましい。次いで、この画分のｐＨを、適切な酸または塩基、例えばＮａＯＨまたはＨＣｌで、約７．３から７．７に調整する。次いで、ｐＨが調整されたこの溶液をＨＩＣカラムに添加する。洗浄工程の後、インターフェロンが、硫酸ナトリウムの直線勾配で、好ましくは８００から０ｍＭの硫酸ナトリウムの直線勾配で、溶出される。ＩＰＣ逆相ＨＰＬＣに基づいて、９３面積％以上の純度のインターフェロンを有し、３面積％以上の単独の不純物を含まない画分が集められてプールされる。このプールされた画分は、次の工程に直接用られ得る。
【００３５】
工程ｉｖ）は、これまでの工程から持ち越されてきた、残りのＤＮＡおよび残りの宿主細胞のタンパク質を除去することに役立つさらなる陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）工程である。
【００３６】
ＣＥＸカラムは、適切な充填材が、例えばＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰ−６５０ Ｓ （ＴｏｓｏＨａａｓ）が詰められる。好ましい工程ｉｖ）において、工程ｉｉｉ）から得られた画分は、精製水で希釈されて、約７．５から８．５ｍＳ／ｃｍの最終的な電気伝導率をとされ、例えば９９から１００％の酢酸でｐＨを４．３から４．７に調整され、カラムに適用され得る。このカラムを洗浄し、次いで、塩化ナトリウムの直線勾配（０から３００ｍＭのＮａＣｌ）の間に、約２５０ｍＭのＮａＣｌにおいてインターフェロンα２が溶出する。ＩＰＣ逆相ＨＰＬＣによって測定されるような、９５面積％以上の純度のインターフェロンのメインピークを有し、３面積％以上の単独の不純物を含まない溶出した画分が集められ、この画分は次の精製工程で直接処理され得る。
【００３７】
工程ｖ）は、二量体およびあらゆる他の凝集物を除去するために採用されるサイズ排除クロマトグラフィー工程であり、インターフェロン産物を完成した剤形に調合する前に必要な、緩衝液の交換を適切に行う工程でもある。
【００３８】
この最後の工程のために、ゲル濾過に適したあらゆるカラムおよび充填材が使用され得る。使用される充填材は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇが好ましい。この充填材は、比較的に高い付加量、例えば約５から１５％の付加量でさえ、分離能力に優れているために、選択される。このカラムを、これまでの工程ｉｖ）からのインターフェロン画分を付加する前に、平衡化緩衝液で平衡化することが好ましい。次いで、インターフェロン画分を、適切な緩衝液、好ましくは、ｐＨが７．１から７．７の、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１３０ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．３ｍＭＥＤＴＡからなる緩衝液を用いて、このカラムから溶出し、インターフェロンα２産物を含む最終的なバルク溶液を提供する。
【００３９】
上述の方法は、工業的規模で適用できるインターフェロンα２産物を得るための効率的な方法を構成する。発酵ブロス１リットルあたり１００ｍｇを超えるインターフェロン産物を得ることが可能である。
【００４０】
本発明のインターフェロンα２のポリペプチドは、ヒトへの投与に適した完成した剤形に調合し得る。本発明のインターフェロンα２産物を含む調合剤は、注射用の調合剤に調合し得る。注射用の調合剤は、投与前に水で再溶解させる凍結乾燥産物として提供され得る。あるいは、注射用の注射用の調合剤は、単回投与または複数回投与用の調製品としての注射用溶液として、提供されうる。注射用の調合剤は、この分野において一般に知られている賦形剤をさらに含み得る。
【００４１】
このような調合剤は、Ｃ型肝炎の治療に有用である。投与量は、投与方法、年齢および／または個体の状態など、種々の因子に依存し得る。
【００４２】
次の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲をいかなる意味においても制限するものではない。実施例に開示された内容は、本発明の好ましい実施態様に関するものである。
【実施例１】
【００４３】
組換えヒトインターフェロンα２Ｂ（ｒｈＩＦＮα２Ｂ）の生産のための宿主細胞株の構築
１．１ 概論
ポリペプチドｒｈＩＦＮα２ｂ（組換えヒトインターフェロン−α２ｂ）が、ｒｈＩＦＮα２ｂをコードする最適化された合成遺伝子を含むプラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリＫ−１２株Ｗ３１１０内で生産される。ｒｈＩＦＮα２ｂが、シュードモナス・ディミヌタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＣＣＭ ３９８７由来のグルタリル７−ＡＣＡアシラーゼ遺伝子（ｇａｃ）のプロモーターおよびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の制御下で、組換えエシェリヒア・コリＫ−１２の発酵によって生産される。ｒｈＩＦＮα２ｂは、同じ（ｇａｃ）遺伝子に由来するシグナル配列とのＮ−末端融合タンパク質として発現され、このタンパク質は、ペリプラズムに向かい、同時にシグナル配列の処理（切断）が行われる。従って、発酵プロセスによって、天然型のヒトインターフェロンα２ｂと同じ一次配列を有する成熟ｒｈＩＦＮα２ｂが直接得られる。この発現プラスミドをｐＭＧ４１４と名付け、この生産株をＷ３１１０［ｐＭＧ４１４］と名付ける。
【００４４】
１．２ 発現ベクターｐＭＧ４１４の構築
ｐＵＣ１９は、ベクタープラスミドの構築のための出発点として機能する。ｐＵＣ１９は、頻繁に用いられ、高コピープラスミドとして徹底的に特徴付けされている。このプラスミドは、高効率複製起点およびアンピシリン抵抗性（ａｍｐまたはｂｌａ）遺伝子を含む（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、１９８５；ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ，１９８２；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ０９１３７およびＸ０２５１４）。ｐＵＣ１９は発現プラスミドを構築するために頻繁に用いられるものであるけれども、ａｍｐ遺伝子は工業目的のためには理想的な選択マーカーではないかもしれない。この理由から、ａｍｐ遺伝子のプロモーターおよびコード領域を除去し、周知の安全なプラスミドｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒら、１９７７ａ、１９７７ｂ、１９７８；総説：Ｂａｌｂａｓら、１９８６；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０１７４９、Ｋ００００５、Ｌ０８６５４、Ｍ１０２８３、Ｍ１０２８６、Ｍ１０３５６、Ｍ１０７８４、Ｍ１０７８５、Ｍ１０７８６、Ｍ３３６９４、Ｖ０１１１９）に由来するテトラサイクリン抵抗性遺伝子（ｔｅｔ）のプロモーターおよびコード領域と置換する。高忠実度ＰＣＲ技術の助けを借りてこのクローニング作業を行う。
【００４５】
このクローニング作業を達成するために、ｐＵＣ１９の塩基対１７４３から６７９をまたぐ断片を、高忠実度ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓのＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼシステム）および次の５’−リン酸化オリゴヌクレオチドを用いて増幅する。
【００４６】
【化１】
【００４７】
得られたＰＣＲ断片は、１６２４塩基対の長さであり、ａｍｐプロモーターおよびコード配列を欠くがａｍｐ遺伝子に由来する終止コドンおよび転写終結区を含む、完全なｐＵＣ１９バックボーンを含む。
【００４８】
上述のように、ｔｅｔプロモーターおよびコード配列（終止コドンを除く）を、ｐＢＲ３２２から増幅する。再び、高忠実度ＰＣＲを用いて、ｐＢＲ３２２の塩基対４から１２７３を増幅した。次の５’−リン酸化オリゴヌクレオチドをこの増幅に用いた。
【００４９】
【化２】
【００５０】
得られたＰＣＲ断片は、１２７０塩基対の長さである。これら二つのＰＣＲ断片は、調製用アガロースゲル電気泳動により精製され、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ， Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて連結される。連結されたＤＮＡを、精製し、エシェリヒア・コリＫ−１２ ＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテントセル、遺伝子型：Ｆ− ｍｃｒＡ Δ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＳ）φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５ ΔｌａｃＸ７４ ｄｅｏＲ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ａｒａＤ１３９ Δ（ａｒａ，ｌｅｕ） ７６９７ ｇａｌＵ ｇａｌＫ λ− ｒｐｓＬ ｎｕｐＧ）内にエレクトロポレーション導入する。形質転換された細胞を、１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンおよび３ｇ／Ｌのグルコースを含むＬＢ寒天プレート上に広げる。液体培養を１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンおよび３ｇ／Ｌのグルコースを含むＬＢブロス中で生育させ、標準的なミニプレップ法を用いてこの液体培養からプラスミドＤＮＡを単離する。プラスミドＤＮＡを制限酵素分析によって分析し、ｔｅｔ断片がｐＵＣ１９バックボーン内に正しく組み込まれているか調べる。この断片の組み込みは、方向に関して特定的でなく、挿入物を含むクローン全部の約５０％だけが、正しい方向に挿入された断片、すなわちｐＵＣ１９内のａｍｐ遺伝子と同じ方向で走っているｔｅｔ遺伝子を有していた。少数のクローンの液体培養からより多量のＤＮＡを単離し、より詳細な制限酵素分析に付す。正確な制限酵素パターンを示すこれらクローンから、さらなるクローニング作業のために一つを選択する。
【００５１】
それぞれのプラスミドをｐＭＧ４０２名付けた。これは、アンピシリン含有培地の代わりにテトラサイクリン含有培地上／内で生育させなければならないという事実以外は、すべての特徴および機能においてｐＵＣ１９と同一である。このようにして、工業目的に適したｔｅｔ抵抗性高コピーベクターが作製される。
【００５２】
プラスミドｐＭＧ４０２の特徴：
塩基対１９５４から６８０：ｐＵＣ１９バックボーン（＝ａｍｐプロモーターと構造遺伝子を欠くｐＵＣ１９）
塩基対６８１から１９５３：ｐＢＲ３２２由来のｔｅｔプロモーターおよび構造遺伝子
【００５３】
ｒｈＩＦＮα２ｂは、シュードモナス・ディミヌタＣＣＭ ３９８７（ｇａｃ１ｓｓ＝配列番号５）由来グルタリル７−ＡＣＡアシラーゼのシグナル配列との、ペリプラズムに向かい、同時に宿主細胞のシグナルペプチダーゼ装置によるシグナル配列の処理（切断）が行われるＮ−末端融合体として発現される。
【００５４】
ｇａｃ１ｓｓのアミノ酸配列（２７ａａ）：ＭＬＲＶＬＨＲＡＡＳ ＡＬＶＭＡＴＶＩＧＬ ＡＰＡＶＡＦＡ
【００５５】
ｇａｃ１ｓｓのコード配列の３’領域において、３’ＰＣＲプライマーを介してＳａｃ ＩＩ制限酵素部位を導入し、サイレント突然変異（アミノ酸配列が変化しない）を生じさせる。このＳａｃ ＩＩ部位は、ｇａｃ１ｓｓコードとｒｈＩＦＮα２ｂ遺伝子との融合を可能にする。
【００５６】
ｒｈＩＦＮα２ｂの構造遺伝子を化学的に合成する。この構造遺伝子は、１６５コドンのうちの４８コドンが天然のヒトｃＤＮＡ配列と異なり、弱くて誤りやすいあらゆるコドンを消去するように設計されている。
【００５７】
次の表に、コドンの変化が示されている。この表において、「天然のコドン」は、Ｓｔｒｅｕｌｉら、１９８０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｖ００５４８）によって公開されたｃＤＮＡの配列のことである。アミノ酸番号は、成熟ｈＩＦＮα２ｂ（Ｃｙｓ １から始まる）について示してある。合成遺伝子によってコードされたアミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｄａｔａｂａｓｅ、登録番号Ｐ０１５６３／Ｐ０１５６４（アミノ酸２４から１８８）からのものとする。
【００５８】
【表１】
【００５９】
得られた遺伝子は、エシェリヒア・コリ内でのｒｈＩＦＮα２ｂの効率的で正確な転写および翻訳を可能にする。この遺伝子は、細菌系内で発現するように設計されているので、非翻訳配列（イントロンなど）を全く含んでいない。
【００６０】
この構造遺伝子を化学的に合成する。要約すると、この構造遺伝子配列の両方のストランドを隙間無く網羅するやり方で、約３０から５０ヌクレオチドの長さの重複する相補的オリゴヌクレオチドを合成する。これらオリゴヌクレオチドを互いにハイブリッド形成させ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。反応産物を制限酵素で切断し、ｐＵＣ１８ベクター内にクローニングする。得られたプラスミドは、配列決定され、正しい配列を示す。
【００６１】
このプラスミド上の合成遺伝子は、ｇａｃシグナル配列を含まない。コード領域のこの部分を、プロモーター、ＲＢＳおよびシグナル配列を含むｇａｃ断片を介して導入し、ｒｈＩＦＮα２ｂ構造遺伝子と融合させる。
【００６２】
化学合成によってｇａｃ断片を作製する。例えば、ｇａｃ断片（両側の制限酵素認識部位＋効果的な切断を可能とする最小限の６つの追加の塩基対を含む）の両方のストランドの全長を隙間無く網羅するやり方で、約３０から５０ヌクレオチドの長さの重複する相補的オリゴヌクレオチドを合成する。次いで、オリゴヌクレオチドを互いにハイブリッド形成させ（例えば、加熱、次いで冷却によって）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。次いで、反応産物をそれぞれの制限酵素（Ｘｂａ ＩおよびＥｃｏＲ Ｉ）で切断し、ｐＭＧ４０２ベクター内にクローニングする（下記を参照すること）。
【００６３】
あるいは、プロモーター、ＲＢＳおよびシグナル配列を含むｇａｃ断片を、プラスミドｐＫＳ５５のようにこのような要素を含むプラスミドから増幅することができる。この構築は、ＣＳ特許第２７８，５１５号に記載されている。クローニングされたｇａｃ遺伝子は、シュードモナス・ディミヌタ（ＣＣＭ ３９８７）株由来のものである。高忠実度ＰＣＲシステムを用いて増幅を行う。次のＰＣＲプライマーを介して、クローニングに必要な制限酵素部位を導入する。
【００６４】
【化３】
【００６５】
高忠実度ＰＣＲ増幅を介して作製したｇａｃ断片と化学的な合成によって生成したｇａｃ断片との間に、性能において違いはない。
【００６６】
このようにして作製したｇａｃ断片は、次のヌクレオチド配列を有する。
【００６７】
【化４】
【００６８】
ｇａｃ断片（合成されたまたはＰＣＲを介して生成した）とベクタープラスミドｐＭＧ４０２とを、Ｘｂａ Ｉ部位とＥｃｏＲ Ｉ部位とを用いて連結する。このようにして、発現ベクターｐＭＧ４１２が作製される。
【００６９】
発現ベクターｐＭＧ４１２は、コドン１から２３＋ｇａｃシグナル配列のコドン２４の最初のヌクレオチドを含む。サイレント変異によって、コドン２２から２４内にＳａｃ ＩＩ部位を導入する。ｐＭＧ４１２内のＳａｃ ＩＩ部位の下流側のすべてがプライマーまたはベクター配列である。
【００７０】
目的構造遺伝子（ｒｈＩＦＮα２Ｂ、上記を参照すること）についてのフォワードＰＣＲプライマーによって、コドン２４＋コドン２５から２７の最後の二つのｎｔを導入する。従って、このようなプライマーは次の要素を含む：
切断オーバーハング（例えば６ヌクレオチド）−Ｓａｃ ＩＩ部位−ｔｃ ｇｃｃ ｔｔｔ ｇｃｇ （配列番号９）−「成熟した」目的遺伝子の５’末端に対応するハイブリッド形成領域。
【００７１】
とりわけ、適切なプライマーは次のヌクレオチド配列（配列番号１０）を有する。
【００７２】
【化５】
【００７３】
ｇａｃシグナル配列の最後のアミノ酸（２４から２７）はＶＡＦＡ（配列番号１１）である。
【００７４】
上記のプラスミド構築物から、高忠実度ＰＣＲシステムを用いてｒｈＩＦＮα２ｂ遺伝子を増幅する。５’ＰＣＲプライマーは、この遺伝子とｇａｃ断片＋ｇａｃシグナル配列の最後の四コドンとを融合させるためのＳａｃ ＩＩ部位を含む。３’プライマーは、ＴＡＡ（ｏｃｈｒｅ）終止コドンとクローニング用のＭｌｕ Ｉ部位とを含む。このインターフェロンα構造遺伝子の増幅によって、次の断片（配列番号１２）が生じる。
【００７５】
【化６】
【００７６】
Ｓａｃ ＩＩ部位とＭｌｕ Ｉ部位とを用いて、このｒｈＩＦＮα２ｂのＰＣＲ断片とｐＭＧ４１２とを連結する。このようにして、最終産物／発現プラスミドｐＭＧ４１４を作成した。ｐＭＧ４１４の両ストランドの配列決定を行い、予想された配列と違いがないことを示す。
【００７７】
プラスミドｐＭＧ４１４（総サイズ３６６８塩基対）の特徴：
塩基対２７２８から２５６： ｐＵＣ１９バックボーン、部分１
塩基対２５７から５４６： ｇａｃ断片（プロモーター、ＲＢＳ、シグナル配列）
塩基対５４７から１０４４： ｒｈＩＦＮα２ｂの合成遺伝子（ＴＡＡ終止を含む）
塩基対１０４５から１４５４： クローニング部位＋ｐＵＣ１９バックボーン、部分２
塩基対１４５５から２７２７： ｐＢＲ３２２（プロモーター／ＲＢＳ１４５５から１５３６、ＴＡＡ終止を含むコード配列１５３７から２７２７）由来のｔｅｔ遺伝子
【００７８】
これによって、プロモーター、ＲＢＳおよびシグナル配列を含むｇａｃ断片は、ＰＣＲプライマーによって導入されたｇａｃ断片の３’末端における制限酵素部位を用いて、ｒｈＩＦＮα２ｂの構造遺伝子と融合される。この同じ部位は、やはりＰＣＲプライマーを用いる方法により、ｒｈＩＦＮα２ｂ構造遺伝子の５’末端と融合される。両成分（ｇａｃ断片とｒｈＩＦＮα２ｂの構造遺伝子）は基礎ベクター内にクローニングされて、ｇａｃ１ｓｓ−ｒｈＩＦＮα２ｂ融合タンパク質をコードする遺伝子が作製される。この合計で１９２コドン（５７６ヌクレオチド）の内、最初の２７コドンは最終タンパク質内には存在しないｇａｃシグナル配列をコードし、アミノ酸２８から１９２は成熟したｒｈＩＦＮα２ｂ（１６５アミノ酸、システイン１からグルタミン酸１６５）をコードする。
【００７９】
ｒｈＩＦＮα２ｂ発現プラスミドｐＭＧ４１４（８０７塩基対）（下記を参照すること）に用いられている発現カセットのヌクレオチド配列およびｇａｃ１ｓｓ−ｒｈＩＦＮα２ｂ融合タンパク質のアミノ酸配列は、次に示すとおりである
【００８０】
【化７】
【００８１】
示された配列をサブパラグラフ／領域に分割する。これらは次のものを含む。
１．ｇａｃプロモーターおよびＲＢＳ（第一パラグラフ、ｐＭＧ４１４の塩基対２５７から４６５、下記を参照すること）、
２．ｇａｃシグナル配列のコーディング領域（第二パラグラフ、ｐＭＧ４１４の塩基対４６６から５４６、下記を参照すること）、
３．ｒｈＩＦＮα２ｂ（第三パラグラフ、ｐＭＧ４１４の塩基対５４７から１０４４（下記を参照すること）−ＴＡＡ終止コドンを含む）についての合成遺伝子、および
４．３’クローニングリンカー（第四パラグラフ、ｐＭＧ４１４の塩基対１０４５から１０６３、下記を参照すること）。
【００８２】
ｐＭＧ４１４上のこれらの四領域は互いに直結している。図面では、明瞭にするための理由により、これらを分割している。
【００８３】
オープンリーディングフレームの開始（ＡＴＧ）コドンおよび終止（ＴＡＡ）コドンを太字で示す。
【００８４】
成熟したｒｈＩＦＮα２ｂの最初のコドン（ＴＧＣ）と最後のコドン（ＧＡＡ）には下線を付してある。
【００８５】
クローニングのために用いる制限酵素部位を箱で囲んでいる。これらは、
−ｇａｃ断片（プロモーター、ＲＢＳ、シグナル配列、Ｓａｃ ＩＩ部位、Ｍｌｕ Ｉ部位、Ｓｐｅ Ｉ部位）を導入するためのＸｂａ Ｉ（ＴＣＴＡＧＡ）およびＥｃｏＲ Ｉ（ＧＡＡＴＴＣ）
ｒｈＩＦＮα２ｂＰＣＲ断片−（ｇａｃ１ｓｓの最後の四アミノ酸についての四コドン、成熟したｒｈＩＦＮα２ｂについての４９５塩基対の合成遺伝子およびＴＡＡ（Ｔ）終止コドンを含む）を導入するためのＳａｃ ＩＩ（ＣＣＧＣＧＧ）およびＭｌｕ Ｉ（ＡＣＧＣＧＴ）
である。
【００８６】
ｇａｃプロモーターは高い構成／基礎活性を示し、化学的な誘導物質または物理的な刺激（培養条件の変更）の付加は必要ではない。
【００８７】
１．３ 組換え体細胞系のクローニングと構築
エレクトロポレーション導入によって、発現プラスミドｐＭＧ４１４を宿主株ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３１３２ （＝Ｗ３１１０ （ＡＴＣＣ ２７３２５））内に導入する。標準的なプロトコールに従って、エレクトロコンピテントセルを調製し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ ２５１０を用いて、０．１ｍｍのキュベット内で１８００Ｖにてエレクトロポレーション導入を行う。
【００８８】
エレクトロポレーション導入の後、反応を液体培地内で一時的に停止し、テトラサイクリンを含む寒天プレート上に広げる。
【００８９】
適切な細胞クローンの選択についての出発点は、このようにして得られた形質転換用プレートである。このプレートからの種々のクローンを液体培養で生育させ、研究用細胞バンクとして冷凍保存する。これらの生産性を、振盪フラスコ内での実験で試験し、比較する。最も優れたクローン（Ｅ１／１１６）をさらなる開発に用いる。
【００９０】
最も優れたクローンは良好な生産性を示し得るが、生育が比較的遅い。このような遅い生育は、種々の因子に、例えば産物の宿主細胞への毒性、産物の合成による代謝への負担などに起因する可能性がある。ときには、グルコースの添加によっていくらか改善される。何故ならば、グルコースは、組換えタンパク質の発現に用いられる多数のプロモーターを下方制御（例えば異化代謝産物抑制によって）するからである。さらに、グルコースは一般的に、エシェリヒア・コリの成長にプラスの効果を有する。何故ならば、炭素源として代謝に直接導入され得るからである。
【００９１】
Ｅ１／１１６の場合、生育に与えるグルコースの明白なプラスの効果が見られる。２から５ｇ／Ｌの間のグルコース濃度によって、最も良い結果が達成される。細胞系を産物の形成に対処し、その結果グルコース不存在においてより良好に生育することに適合させるために、この株を、振盪フラスコ内の液体培地中に数世代生育させる（「振盪フラスコカスケード」）。
【００９２】
より具体的には、Ｅ１／１１６の冷凍バイアルを解凍し、この細胞懸濁液を、テトラサイクリンを含むグルコースなしのＬＢ寒天プレート上に画線する。このプレートを、液体培養に接種するのに十分なサイズにコロニーが達するまで、３７℃でインキュベートする。コロニーを、テトラサイクリンを含む１５ｍＬのグルコースフリーのＬＢブロスで満たした小さな振盪フラスコ内に、プレートから移す。６００ｎｍでの光学密度が０．５を超える（通常は＞１．０）まで、培養物を３７℃で振盪する。元の単離物の生育が遅いという性質のせいで、この第一ラウンドのための振盪は４８時間を要する。
【００９３】
プレート上に画線されているこれまでのラウンドの液体培養と、次の液体培養に接種するのに使用するプレートからのコロニーとを用いて、上述のパラグラフに記載された手順を連続的に五回実施する。それぞれの液体培養から光学密度を測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ウェスタンブロットを用いて産物の力価を測定するために、サンプルを取り出した。生育と生産性との組み合わせが最良の培養からのクローンを用いて、次のラウンドを開始する。
【００９４】
この培養カスケードの異なるラウンド（すなわち複数の増殖工程および再単離工程）の過程において、下位株の生育特性が徐々に改善する。それぞれのラウンドにおける生育と生産性との最良の組み合わせを有する株を選択することによって、力価も徐々に向上する。五回目のラウンドの後、テトラサイクリンを含むＬＢ寒天プレート上に単一のコロニーを再度形成させ、テトラサイクリンを含む液体培養に接種するために用いて第一次シードロット（ＰＳＬ）を作成する。この培養を３７℃で約１．５の光学密度まで生育させ、等量の４０％ｗ／ｖの滅菌グリセリンと混合し、アリコートを冷凍貯蔵用バイアル内に分け、−８０℃で凍結する。このＰＳＬを、インターフェロンα２ｂ生産株のＧＭＰ細胞バンク（マスター細胞バンクと作業用細胞バンク）を作成するための出発点として用いる。この単離物をＥ１／１１６ａと名付ける。上述のような再単離プロセスから、再現可能な結果が得られることが分かった。
【００９５】
Ｅ１／１１６ａは、振盪フラスコ内および撹拌バイオリアクター（発酵槽）内で優れた生育特性を示す。バイオリアクターを開始することに適する接種材料は、作業用細胞バンクのバイアルから開始して振盪フラスコ内で約８時間生育させる。
【００９６】
上記の第一次シードロットから、ｃＧＭＰ条件の下でマスター細胞バンクを調製する。要約すれば、ＰＳＬバイアルを解凍し、テトラサイクリンを含む寒天プレート上に広げる。単一のコロニーを取り上げ、マスター細胞バンク（ＭＣＢ）の振盪フラスコ培養（テトラサイクリンを含むＬＢブロス培地）に接種するために用いる。対数増殖期からの細胞懸濁液を１＋１で４０％ｗ／ｖのグリセリンと混合し、１．８ｍＬのアリコートを冷凍貯蔵用バイアル内に入れ、冷凍貯蔵用管内に密封し、液体窒素タンクの液相内で凍結させる。
【００９７】
解凍したＭＣＢバイアルからの細胞懸濁液を用いて振盪フラスコ培養を接種すること以外はマスター細胞バンクと同様にして、作業用細胞バンクを作成する。
【実施例２】
【００９８】
組換えヒトインターフェロンα２Ｂ（ｒｈＩＦＮα２Ｂ）を生産するための発酵プロセス
発酵プロセスを、上記の作業用細胞バンクから得られ得るエシェリヒア・コリＫ−１２株Ｗ３１１０を、プラスミドを保持しない細胞の増殖を回避するための抗生物質の塩酸テトラサイクリンを添加したＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ−）培地中に振盪フラスコ培養にて３７℃で生育させることによって、開始する。
【００９９】
次いで、振盪フラスコ培養を用いて種培養（＝前培養）培地に接種する（接種サイズ＝０．４％）。この前培養のための培地は、唯一の炭素源としてのグルコースと複合窒素源としての酵母自己消化物とを含む脱イオン水を基礎とする。さらに、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４およびＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏのような無機塩をこの培地に添加する。消泡剤として、ポリプロピレングリコール２０００（ＰＰＧ２０００）を用いる。とりわけ、この前培養の培地は次の組成物を有する：
前培養用基礎培地：
【０１００】
【表２】
【０１０１】
これらの培地成分を、一緒に、２０分間、１２１℃で滅菌する。基礎培地を冷却した後、抗生物質の塩酸テトラサイクリンの５ｇ／Ｌの滅菌ストック溶液のアリコート（濾過（０．２２μｍのフィルター）により滅菌した）を基礎培地に添加する。
【０１０２】
塩酸テトラサイクリンのストック溶液（５ｇ／Ｌ）
【０１０３】
【表３】
【０１０４】
種培養の培養時間は約１６時間である。この種培養の培養の間、硫酸および水酸化ナトリウムまたは濃アンモニア溶液でｐＨ値を７．０±０．２の設定値に制御する。撹拌速度を増すことによって、溶存酸素の濃度を飽和の２０％よりも高いレベルに維持する。培養初期の撹拌速度を３００ｒｐｍに設定し、容器内の背圧を０．３ｂａｒに、および通気速度を３０Ｌ／ｍｉｎ（「１ｖｖｍ」に相当する）に制御する。温度を培養中常に３７℃に維持する。ブロスを発酵プロセスの主要段階に移行させる基準として、炭素源が消費された後の溶存酸素濃度の上昇を用いる。
【０１０５】
本培養の培養のために、脱イオン水、炭素源としてのグルコースおよび複合窒素源としての酵母自己消化物を基礎とする培地を用いる。無機塩（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＣａＣｌ２・２Ｈ２ＯおよびＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを添加することに加えて、ＰＰＧ ２０００を消泡剤として用いる。最初のグルコースを別に滅菌し、滅菌された培地の残りに添加する。主発酵培地に接種するサイズは、０．７５から３％の間の範囲であった。とりわけ、本培養の培地は次の組成を有する。
【０１０６】
本培養の基礎培地：
【０１０７】
【表４】
【０１０８】
これらの培地成分を、一緒に、２０分間、１２１℃で滅菌する。冷却した後、別に加熱滅菌した８００ｇ／Ｌのグルコースストック溶液のアリコートを（１２０℃で３０分間以上かけて滅菌した）主培養の基礎培地に添加する。
【０１０９】
グルコースストック溶液、８００ｇ／Ｌ：
【０１１０】
【表５】
【０１１１】
この培養の間の最も重要な点は、培地内に当初から存在するグルコースが完全に消費される必要があることである。このことによって、培養から約９時間後に溶存酸素の濃度の急激な上昇がもたらされる。当初のグルコースの全てが消費される前にグルコースの供給を開始することによって、産物の形成が見られない。従って、グルコース溶液を一定の速度で供給することにより制御された、グルコースの制限が極めて重要である。培養の間、温度を約２８℃の一定の値に制御する。初期の撹拌速度を３００ｒｐｍに設定し、通気速度を１００Ｌ／ｍｉｎ（「１ｖｖｍ」に相当する）に制御し、槽内背圧を０．３ｂａｒに設定する。ｐＨ値を硫酸および水酸化ナトリウムまたは濃アンモニア溶液で７．１±０．３に制御する。最初に供給されたグルコースの消費後の、８．０までのｐＨ値のピークは許容できる。
【０１１２】
溶存酸素の濃度を、飽和の２０％より高い値に制御する。バイオリアクターの酸素移動能力に依存して、先ず撹拌速度を最高値まで増すことによって、ＤＯ濃度を、飽和の２０％より高いレベルに、好ましくは飽和の約４０％から１００％の間のレベルに維持する。撹拌速度の増加では不十分なときは、最初の通気速度およびそれ以降の背圧をそれぞれ高める。培養４８から１９２時間（培養時間経過により産物形成の直線的な増加が見られる）後、培養物を回収し、１５±５℃に冷却し、蔗糖／ＥＤＴＡを冷却ブロスに添加することによって、下流でのプロセシングのための条件を整える。
【０１１３】
発酵バッチの結果を、研究室または実験工場にて産物よりペリプラズムを抽出した後、ウェスタンブロット技術またはＨＰＬＣ測定に基づいて、分析する。
【実施例３】
【０１１４】
細胞の破壊および抽出
発現されたインターフェロンα２Ｂをペリプラズムスペースに含む宿主細胞を含む発酵ブロスを、発酵直後にｐＨ５．０±０．１に硫酸で調整し、４℃±２℃に冷却する。この低ｐＨと低温は、内因性プロテアーゼの不活性化に役立つ。
【０１１５】
発酵ブロスを１０℃から２０℃に調整し、次いで細胞を濃縮または洗浄せずに、発酵ブロスに固体または液体の蔗糖（２００ｇ蔗糖／ｋｇ発酵ブロス）およびＥＤＴＡ（１０ｍＭの濃度）を添加し、発酵ブロスのｐＨを８．０に調整する。蔗糖およびＥＤＴＡを含む発酵ブロスを冷水（約４℃の温度）内に注ぐかまたは注入して、冷水による浸透圧ショック（１＋３希釈）を利用する選択的な一工程細胞透過プロトコールの後、放出されたペリプラズム抽出物を透明にする。ポリエチレンイミンを添加して最終濃度０．０５％とし、ｐＨを酢酸で約７．５に調整する。１５分から４５分後、細胞デブリおよびＤＮＡが凝集し、インターフェロンを含む透明な粗抽出物が残る。この粗抽出物を遠心分離に付して透明さを改善してもよい。
【０１１６】
この手順は、総タンパク質含有量の２０％を超える純度をもって、高収率の所望のインターフェロンα２Ｂを含む透明なペリプラズム抽出物をもたらす。ポリエチレンイミンは、可溶性タンパク質抽出物からの細胞デブリの分離に役立ち、極めて純度の高いインターフェロン溶液をもたらす。
【実施例４】
【０１１７】
組換えヒトインターフェロンα２Ｂ（ｒｈＩＦＮα２Ｂ）のクロマトグラフィーによる精製
４．１ 陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）による捕捉
実施例３の粗抽出物の、酢酸による４．８から５．２へのｐＨ調節および０．３ミクロンフィルターを用いる濾過工程の後、実施例３の粗抽出物をＣＥＸカラム（Ｓ ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｆ （Ｂｉｏｓｅｐｒａ））に適用する。平衡化緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび７０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０）による洗浄工程の後、インターフェロンをステップグラジエントによって１７５ｍＭＮａＣｌにおいて溶出する。集められた画分を、実施例４．２の処理工程により直ちに処理する。
【０１１８】
４．２ 陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー
実施例４．１からの画分を、水酸化ナトリウムで７．３から７．７のｐＨに調整し、水で希釈し精製して電気伝導率を３．５から４．５ｍＳ／ｃｍとし、ＡＥＸカラム（Ｑ ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｆ （Ｂｉｏｓｅｐｒａ））に適用する。洗浄後、インターフェロンを直線塩勾配（０から３００ｍＭのＮａＣｌ）により約１５０ｍＭＮａＣｌにおいて溶出する。ＩＰＣ逆相ＨＰＬＣに基づいて、９０面積％以上の純度を有する画分を集め、次の工程に直接用いる（実施例４．３を参照すること）。
【０１１９】
４．３ 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
実施例４．２の画分を、硫酸ナトリウム（０．５％の硫酸ナトリウム）のストック溶液を用いて希釈し（１：１）、ＮａＯＨまたはＨＣｌを用いて７．３から７．７のｐＨに調整し、ＨＩＣカラム（Ｓｏｕｒｃｅ １５ＰＨＥ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用する。洗浄後、実施例３のインターフェロン画分を硫酸ナトリウムの直線濃度（８００から０ｍＭの硫酸ナトリウム）により約４００ｍＭの硫酸ナトリウにおいて溶出する。ＩＰＣ逆相ＨＰＬＣに基づいて、９３面積％以上の純度を有し、３％以上の不純物を含まない画分を集め、次の精製工程に直接用いる。
【０１２０】
４．４ 陽イオン交クロマトグラフィー（ＣＥＸ）
実施例４で集められた画分を、水で希釈して最終的な電気伝導率を７．５から８．５ｍＳ／ｃｍとし、９９から１００％の酢酸により４．３から４．７のｐＨに調整し、ＣＥＸカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰ−６５０ Ｓ （ＴｏｓｏＨａａｓ））に適用する。洗浄工程後、インターフェロンをＮａＣｌ直線勾配（０から３００ｍＭのＮａＣｌ）にて約２５０ｍＭＮａＣｌにおいて溶出する。ＩＰＣ逆相ＨＰＬＣに基づいて、９５面積％以上の純度を有し、３％以上の不純物を含まない画分を集め、次の精製工程に直接用いる。
【０１２１】
４．５ サイズ排除クロマトグラフィー
最後の精製工程は、二量体および他の凝集物を除去し、最終的調合のために緩衝液の交換を行うための、ゲル濾過工程である。この工程で用いるＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｇは、負荷量が多い（５％から１５％）場合でさえ優れた分離能を示す。ＳＥＣを、２５ｍＭリン酸ナトリウムおよび１３０ｍＭＮａＣｌ＋０．３ｍＭＥＤＴＡにおいて、約７．３から７．７のｐＨにて実施する。
【０１２２】
最も純度が高い画分（ＲＰ−ＨＰＬＣでのメインピークが９５％を超え、サイドピークがないものが３％を超える）をプールして、所望の組換えヒトインターフェロンα２Ｂを高収率の純粋な形態で含む、最終的なバルク溶液を得る。
【０１２３】
微生物の寄託：
本明細書で用いられるエシェリヒア・コリ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）は、１０８０１ユニバーシティー・ブルバール、マナッサス、バージニア州２０１１０−２２０９、アメリカ合衆国のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に、寄託番号ＰＴＡ−３１３２の下、２００１年２月２８日に寄託された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）原核生物宿主細胞の発酵、ここにおいて、前記宿主細胞は、ペリプラズムを有し、着目ポリペプチドを前記宿主細胞のペリプラズム内に分泌させることができる組換え発現系を用いて形質転換されており、前記発酵は、発酵培地中、着目ポリペプチドが前記宿主細胞のペリプラズム内に分泌されるような条件下にて行われ、および
（ｉｉ）発酵培地中に含まれる前記宿主細胞に浸透圧ショックを与えることによる前記ペリプラズムからの着目ポリペプチドの抽出
を含む、着目ポリペプチドを調製する方法。
【請求項２】
前記浸透圧ショックが、前記発酵培地に薬物を直接添加し、次いで前記発酵培地をＨ２Ｏにより希釈することによって与えられ、ここにおいて、前記薬物は、Ｈ２Ｏによる希釈後に前記宿主細胞の外側細胞膜の破壊を導く浸透圧を生じさせることができるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記薬物が、蔗糖、塩化ナトリウム、アルギニン、リジン、塩酸グアニジン、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、ポリエチレンイミンおよびこれらの適切な混合物からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記薬物が蔗糖である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記発酵培地における希釈開始時の蔗糖の濃度が約２０％重量／体積である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
蔗糖含有発酵ブロスのＨ２Ｏでの希釈係数が少なくとも約３倍である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記原核生物宿主細胞がグラム陰性菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記グラム陰性菌が、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、エンテロバクター・スピーシーズ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、カンピロバクター・スピーシーズ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）およびビトレオシラ・スピーシーズ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ ｓｐ．）からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記グラム陰性菌がエシェリヒア・コリである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
着目ポリペプチドが、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、増殖因子、サイトカイン、酵素、酵素インヒビター、抗体および抗体断片からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
着目ポリペプチドがインターフェロンα２である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
インターフェロンα２が、インターフェロンα２Ａおよびインターフェロンα２Ｂからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）組換えインターフェロンα２の粗調製品を得ること、
（ｂ）前記粗調製品を、次、
（ｉ）陽イオン交換クロマトグラフィー、
（ｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー、
（ｉｉｉ）疎水性相互作用クロマトグラフィー、
（ｉｖ）陽イオン交換クロマトグラフィー、
（ｖ）サイズ排除クロマトグラフィー
を順番に含む多工程クロマトグラフィーに適用する工程、
を含む、組換えインターフェロンα２を調製するための方法。
【請求項１４】
組換えインターフェロンα２の前記粗調整品が、
（ａ）原核生物宿主細胞の発酵、ここにおいて、前記宿主細胞は、ペリプラズムを有し、組換えインターフェロンα２を前記宿主細胞のペリプラズム内に分泌させることができる組換え発現系を用いて形質転換されており、前記発酵は、発酵培地中、組換えインターフェロンα２が前記ペリプラズム内に分泌されるような条件下にて行われ、
（ｂ）発酵培地中に含まれる前記宿主細胞に浸透圧ショックを与えることによる前記ペリプラズムからの着目ポリペプチドの抽出
を含む方法により得られる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記浸透圧ショックが、前記発酵培地に薬物を直接添加し、次いで前記発酵培地をＨ２Ｏにより希釈することによって与えられ、ここにおいて、前記薬物は、Ｈ２Ｏによる希釈後に前記宿主細胞の外側細胞膜の破壊をもたらす浸透圧を生じさせることができるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬物が、蔗糖、塩化ナトリウム、アルギニン、リジン、塩酸グアニジン、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、ポリエチレンイミンおよびこれらの適切な混合物からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬物が蔗糖である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記発酵培地における希釈開始時の蔗糖の濃度が約２０％重量／体積である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
蔗糖含有発酵ブロスのＨ２Ｏでの希釈係数が少なくとも約３倍である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記原核生物宿主細胞がグラム陰性菌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記グラム陰性菌が、エシェリヒア・コリ、シュードモナス・スピーシーズ、エンテロバクター・スピーシーズ、カンピロバクター・スピーシーズおよびビトレオシラ・スピーシーズからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記グラム陰性菌がエシェリヒア・コリである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記インターフェロンα２が、インターフェロンα２Ａおよびインターフェロンα２Ｂからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１】
（ｉ）原核生物宿主細胞の発酵、ここにおいて、前記宿主細胞は、ペリプラズムを有し、着目ポリペプチドを前記宿主細胞のペリプラズム内に分泌させることができる組換え発現系を用いて形質転換されており、前記発酵は、発酵培地中、着目ポリペプチドが前記宿主細胞のペリプラズム内に分泌されるような条件下にて行われ、および
（ｉｉ）発酵培地中に含まれる前記宿主細胞に浸透圧ショックを与えることによる前記ペリプラズムからの着目ポリペプチドの抽出
を含む、着目ポリペプチドを調製する方法。
【請求項２】
前記浸透圧ショックが、前記発酵培地に薬物を直接添加し、次いで前記発酵培地をＨ２Ｏにより希釈することによって与えられ、ここにおいて、前記薬物は、Ｈ２Ｏによる希釈後に前記宿主細胞の外側細胞膜の破壊を導く浸透圧を生じさせることができるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記薬物が、蔗糖、塩化ナトリウム、アルギニン、リジン、塩酸グアニジン、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、ポリエチレンイミンおよびこれらの適切な混合物からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記薬物が蔗糖である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記発酵培地における希釈開始時の蔗糖の濃度が約２０％重量／体積である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
蔗糖含有発酵ブロスのＨ２Ｏでの希釈係数が少なくとも約３倍である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記原核生物宿主細胞がグラム陰性菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記グラム陰性菌が、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、エンテロバクター・スピーシーズ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、カンピロバクター・スピーシーズ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）およびビトレオシラ・スピーシーズ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ ｓｐ．）からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記グラム陰性菌がエシェリヒア・コリである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
着目ポリペプチドが、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、増殖因子、サイトカイン、酵素、酵素インヒビター、抗体および抗体断片からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
着目ポリペプチドがインターフェロンα２である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
インターフェロンα２が、インターフェロンα２Ａおよびインターフェロンα２Ｂからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）組換えインターフェロンα２の粗調製品を得ること、
（ｂ）前記粗調製品を、次、
（ｉ）陽イオン交換クロマトグラフィー、
（ｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー、
（ｉｉｉ）疎水性相互作用クロマトグラフィー、
（ｉｖ）陽イオン交換クロマトグラフィー、
（ｖ）サイズ排除クロマトグラフィー
を順番に含む多工程クロマトグラフィーに適用する工程、
を含む、組換えインターフェロンα２を調製するための方法。
【請求項１４】
組換えインターフェロンα２の前記粗調整品が、
（ａ）原核生物宿主細胞の発酵、ここにおいて、前記宿主細胞は、ペリプラズムを有し、組換えインターフェロンα２を前記宿主細胞のペリプラズム内に分泌させることができる組換え発現系を用いて形質転換されており、前記発酵は、発酵培地中、組換えインターフェロンα２が前記ペリプラズム内に分泌されるような条件下にて行われ、
（ｂ）発酵培地中に含まれる前記宿主細胞に浸透圧ショックを与えることによる前記ペリプラズムからの着目ポリペプチドの抽出
を含む方法により得られる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記浸透圧ショックが、前記発酵培地に薬物を直接添加し、次いで前記発酵培地をＨ２Ｏにより希釈することによって与えられ、ここにおいて、前記薬物は、Ｈ２Ｏによる希釈後に前記宿主細胞の外側細胞膜の破壊をもたらす浸透圧を生じさせることができるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬物が、蔗糖、塩化ナトリウム、アルギニン、リジン、塩酸グアニジン、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、ポリエチレンイミンおよびこれらの適切な混合物からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬物が蔗糖である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記発酵培地における希釈開始時の蔗糖の濃度が約２０％重量／体積である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
蔗糖含有発酵ブロスのＨ２Ｏでの希釈係数が少なくとも約３倍である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記原核生物宿主細胞がグラム陰性菌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記グラム陰性菌が、エシェリヒア・コリ、シュードモナス・スピーシーズ、エンテロバクター・スピーシーズ、カンピロバクター・スピーシーズおよびビトレオシラ・スピーシーズからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記グラム陰性菌がエシェリヒア・コリである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記インターフェロンα２が、インターフェロンα２Ａおよびインターフェロンα２Ｂからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【公表番号】特表２００７−５０１６２２（Ｐ２００７−５０１６２２Ａ）
【公表日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２２９８９（Ｐ２００６−５２２９８９）
【出願日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００９０５５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１７１７４
【国際公開日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【出願人】（３０５００８０４２）サンド・アクチエンゲゼルシヤフト (54)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００９０５５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１７１７４
【国際公開日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【出願人】（３０５００８０４２）サンド・アクチエンゲゼルシヤフト (54)
【Ｆターム（参考）】
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