組換えポリペプチドを調製するための方法
本発明は組換えポリペプチドの調製に関するものであり、このポリペプチドは発現時に形質転換された宿主細胞の周辺質中に分泌されている。詳細には本発明は、さらなる下流工程処理の前に周辺質からの前記組換えポリペプチドの抽出収率を高めるための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組換えポリペプチドの調製に関するものであり、このポリペプチドは発現時に形質転換された宿主細胞の周辺質中に分泌されている。詳細には本発明は、さらなる下流工程処理の前に周辺質からの前記組換えポリペプチドの抽出収率を高めるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリペプチドまたはタンパク質は、宿主として細菌細胞（例えば大腸菌）を使用する組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。したがって細菌細胞は、前記ポリペプチドまたはタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡで形質転換することができる。細菌は、細胞質、または周辺質または細胞外空間において多量のポリペプチドを発現することができる。細菌は大規模な発酵生産プロセスを使用して大量に増殖させることができるので、大量のポリペプチドをこのようにして生成することが可能である。
【０００３】
ポリペプチドまたはタンパク質の周辺質中への分泌には、細胞質タンパク質、特にプロテアーゼからの分離、細胞質の毒性の回避、Ｎ末端メチオニンの増大の回避、およびジスルフィド結合の形成が進行する可能性があり、タンパク質が可溶性で生物学的活性がある立体配座に折りたたまれる可能性があるさらに酸化性の強い環境における蓄積を含めた、幾つかの潜在的な利点がある。表面上、望ましいタンパク質がそのＮ末端においてシグナルペプチド（分泌リーダー）と融合することのみを必要とするが、分泌の効率もタンパク質の構造的特徴、および細胞内のその通常の位置によっておそらく影響を受ける。
【０００４】
大腸菌は細胞質膜を介して周辺質中にタンパク質を分泌する能力が充分にあり、異種タンパク質を細胞の細胞質の外に向ける時広く使用されてきている。特に生物学的活性抗体断片の生成をすでに可能にしてきており、現在では動物細胞培養における完全抗体の生成が挑戦されている。
【０００５】
異種タンパク質の分泌が１００％有効であることはめったになく、幾つかの場合、分泌リーダーが結合した未処理の前駆体タンパク質が細胞内に蓄積する。この観察結果は、分泌機構の１つまたは複数の成分が、これらのタンパク質の輸送を制限している可能性があることを示唆する。
【０００６】
大腸菌におけるタンパク質分泌に関する文献の１つの顕著な特徴は、タンパク質が増殖培地から直接回収される報告の頻度である。このことは非常に有利である可能性はあるが、根底にある機構に関する未解決な問題を提起する。タンパク質は外側膜を介した特異的な移動によってではなく、細胞からの非特異的な漏出、または細胞の溶解によって培地に放出されることが多いことを示す、幾つかの報告が存在する。この現象は理解されておらず、非常にタンパク質配列特異的であり、幾つかの抗体断片に関しては広範囲に及び、他のポリペプチドに関しては顕著ではない。
【０００７】
タンパク質の周辺質中への分泌は有用な経路であり、生物学的評価のためのタンパク質の迅速な単離につながる可能性がある。産業規模でのその適用は、細胞から周辺質タンパク質を選択的に放出させるための有効で定量可能な方法の、一般的な利用しにくさによって現在制限されている。
【０００８】
周辺質からの組換えタンパク質の回収を、細胞質タンパク質による汚染なしで実施することができれば、後の精製ステップは非常に簡略化される。何故なら、例えば大腸菌においては、２５個の知られている細胞プロテアーゼのわずか７個、全細胞タンパク質の約４〜８％が、周辺質中に所在するのみである（Ｓｗａｍｙら、Ｂａｎｅｙｘら）。
【０００９】
周辺質タンパク質を選択的に放出させるための、さまざまな頻繁に使用される方法が存在する。１つはクロロホルム、グアニジン−ＨＣｌ、臭化セチルトリメチルアンモニウム／ＣＴＡＢ、またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などの界面活性剤およびグリシンなどの化学物質が関与する細胞浸透処理である。他はリゾチーム／ＥＤＴＡ処理または浸透圧衝撃の施用を使用する浸透処理である。これらの放出法は大規模な調製にも適しており、さまざまな程度の成功で、広範囲の発現系に関する多くの異なる改変において使用されてきている。
【００１０】
周辺質のタンパク質放出に関する現況技術の方法は、例えば以下の文献中に
文書化されている：
Ｓｗａｍｙら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４７、１０２７〜１０３３、１９８２
Ｂａｎｅｙｘら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３、２６９６〜２７０３、１９９１
Ｂｌｉｇｈｔら、ＴｉｂＴｅｃｈ１２、４５０〜４５５、１９９４
Ｂａｒｂｅｒｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４、２５５〜２６７、１９８６
Ｐｉｅｒｃｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５８、１〜１１、１９９７
Ｆｒｅｎｃｈら、Ｅｎｚｙｍｅ＆Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１９、３３２〜３３８、１９９６
Ｎａｇｌａｋら、Ｅｎｚｙｍｅ＆Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２、６０３〜６１１、１９９０
Ｎｏｓｓａｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２４１（１３）、３０５５〜３０６２、１９６６
Ｎｅｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２４０、３６８５〜３６９２、１９６５
Ｈｓｉｕｎｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４、９９１〜９９５、１９８６
Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０、１６３〜１６７、１９９２
Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．３２、７４１〜７４８、１９８８
Ａｒｉｓｔｉｄｏｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ１５（４）、３３１〜３３６、１９９３
Ｃｈａｉｂら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ９（３）、１７９〜１８４、１１９５
Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６０、１１８１〜１１８３、１９８４
Ｇｅｌｌｅｒｆｏｒｓら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．７、２、１７３〜８３、１９８９
Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１７、７８０〜７８３、１９９９
Ｖｏｓｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９８、７１９〜７２５、１９９４
ＷＯ０１／９４５８５
米国特許第４，８４５，０３２号
米国特許第４，３１５，８５２号
組換え技法を使用して粗製ポリペプチドの高い収率を生み出すことはできるが、ポリペプチドの単離および精製は精巧かつ包括的な手順を必要とする。
【００１１】
典型的な単離手順では、酸性剤または腐食剤を加えることによって、発酵生産物回収培養液を中性ｐＨ（例えばｐＨ６．５〜７．５）に調節する。後に細菌細胞を例えば遠心分離またはマイクロ濾過にかけ、廃棄される望ましくない可溶性副産物を含む液体上清を分離除去する。生成した細菌細胞の塊は適切な培地、例えば適切なバッファー中に再懸濁させ、細胞を粉砕して生成物を抽出し単離する。
【００１２】
労力を要する抽出および単離手順を通常行い、発酵生産副産物および他の汚染物質からできる限り多くの当該のポリペプチドを分離して、後の精製ステップが可能な限り有効な方式で進行することを確実にする。
【００１３】
当分野で知られている精製ステップは一般に、沈殿およびクロマトグラフィー分離技法を含み、労力を要し抽出ポリペプチドの低い収率および高い生成コストをもたらす可能性がある、ダイアフィルトレーションおよび／または濃縮手順のような追加のステップを時々必要とする。
【００１４】
ポリペプチドの抽出、単離および精製は、各段階において、物質または生物活性の消失をもたらす。
【００１５】
通常は細菌細胞の粉砕の後に起こるがｉｎ ｖｉｖｏでも観察される、タンパク質分解、すなわちタンパク質分解酵素によるポリペプチドの分解は、タンパク質消失の主な原因の１つであると考えられる。この偶発的なタンパク質分解が、当該のポリペプチドの分解を最小にするための方法の改変を必要とする技術的な問題点である。
【００１６】
タンパク質分解の割合を低く保つ１つの方法は一般に、妥当に低い温度で可能な限り迅速に回収、抽出、単離および精製手順を行うことである。したがって、ポリペプチドの単離および精製に関する関連教本および標準プロトコルは一般に、不必要な遅延および中断なしで進行することを教示している（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｅｄ．Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、１９９８年１月）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、高収率かつコスト効率の良い形式で細菌細胞からの当該の組換えポリペプチドの抽出を可能にする、新規な方法が必要性である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、組換えポリペプチドを調製するための新規な方法を提供することによって前述の必要性に応ずる。
【００１９】
本発明では、周辺質を含む細菌宿主中で発現される組換えポリペプチドの収率は、発酵生産後に単離プロセスを中断し、前記ポリペプチドの抽出および単離の後続ステップを行う前に、発酵生産物回収培養液のさらなる処理を保留することによって、増大させることができることが驚くことに分かってきている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、
ａ）周辺質を含み、ポリペプチドの周辺質中への分泌を行うことができる組換え発現系で形質転換された原核生物宿主細胞に発酵生産させ、発酵生産は、ポリペプチドが宿主細胞の周辺質中に分泌されるような条件下で発酵生産培地において行うステップ、および
ｂ）発酵生産物回収培養液のさらなる処理を中断し、および抽出前に温度およびｐＨの明確な条件下で発酵生産物回収培養液を保つステップ
を含む、組換えポリペプチドを調製するための方法に関する。
【００２１】
本発明の他の目的、特徴、利点および態様は、以下の記載事項から当業者に明らかとなるであろう。しかしながら、以下の記載事項および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しながら、例示のみによって与えられることは理解されるはずである。開示する本発明の精神および範囲内のさまざまな変更および変更形態が、以下の記載事項を読むことから、および本開示の他の部分を読むことから、当業者には容易に明らかとなるであろう。
【００２２】
本明細書に引用する全ての特許出願、特許および参照文献は、その全容が参照によりここに組み込まれている。
【００２３】
本発明を実施する際には、分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡの多くの従来の技法を使用する。これらの技法はよく知られており、例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ、１９９７（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｄ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｖｏｌｕｍｅｓ ＩおよびＩＩ、１９８５（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９８４（Ｍ．Ｌ．Ｇａｉｔ ｅｄ．）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、１９８５、（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、１９８４（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、１９８６（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｄ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ、１９８６（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）；Ｐｅｒｂａｌ、１９８４、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ、１９８７（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；およびＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１５４およびＶｏｌ．１５５（それぞれＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ、ならびにＷｕ、ｅｄｓ．）中で説明されている。
【００２４】
本発明は、
ａ）周辺質を含み、ポリペプチドの周辺質中への分泌を行うことができる組換え発現系で形質転換された原核生物宿主細胞に発酵生産させ、発酵生産は、ポリペプチドが宿主細胞の周辺質中に分泌されるような条件下で発酵生産培地において行うステップ、および
ｂ）発酵生産物回収培養液のさらなる処理を中断し、および抽出前に温度およびｐＨの明確な条件下で発酵生産物回収培養液を保つステップ
を含む、組換えポリペプチドを調製するための方法に関する。
【００２５】
本発明は、周辺質を含む細菌宿主中で発現される組換えポリペプチドの収率は、発酵生産物後に単離プロセスを中断し、前記ポリペプチドの抽出および単離の後のステップを行う前に、発酵生産物回収培養液のさらなる処理を保留することによって増大させることができるという驚くべき発見に基づく。
【００２６】
ポリペプチドの発現は、周辺質を含みポリペプチドの周辺質中への分泌を行うことができる組換え発現系で形質転換された、適切な原核生物宿主細胞中で行う（例えば、ＳｋｅｒｒａおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０、１０３８〜１０４１、１９８８中に記載されている）。
【００２７】
ポリペプチドの発酵生産は、ポリペプチドが宿主細胞の周辺質中に分泌されるような適切な条件下で、発酵生産培地において行う（例えば、ＳｋｅｒｒａおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０、１０３８〜１０４１、１９８８中に記載されている）。
【００２８】
本明細書で使用する用語「発酵生産」は、ポリペプチドが宿主細胞によって生成され周辺質中に分泌されるような適切な条件下で適切な時間の長さ、適切な発酵生産培地中で宿主細胞を増殖させることを意味すると理解されたい。
【００２９】
前記さらなる処理の中断は、生成ポリペプチドの完全性、すなわちそれが分解されないかあるいは他の場合は機能または構造を害されないことを可能な限り確実にする適切な条件下で、例えば少なくとも１時間発酵生産物回収培養液を維持、保有、保持または保存することによって実施することができる。これは発酵生産タンク（発酵槽）中に直接、例えば発酵生産物回収培養液を維持、保有、保持または保存することによって、あるいは発酵槽からの回収後に他のタンクまたは任意の他の適切な容器中に前記発酵生産物回収培養液を移すことによって行うことができる。さらに発酵生産物回収培養液は、中断ステップ中に周期的または連続的に攪拌することができる。
【００３０】
したがって、好ましい実施形態では、前記の方法のステップｂ）は発酵槽中で行う。
【００３１】
通常、生成物収率の望ましい増大に関しては、中断ステップの時間と適用する温度の間に１つの関係が存在するであろう。低い温度は長い時間期間を必要とし、一方より高い温度では、同様の結果を得るためにはより短い時間期間で充分であろう。最適なパラメータは、発現されるポリペプチド、宿主細胞および生産条件に依存する。
【００３２】
したがって、好ましい実施形態では、発酵生産物回収培養液のさらなる処理を少なくとも約１時間の長さ、例えば１時間の長さ中断する、組換えポリペプチドを調製するための方法を提供する。
【００３３】
好ましくは、発酵生産物回収培養液のさらなる処理は、約１時間〜約７２時間の長さ、例えば１時間〜７２時間の長さ中断する。さらなる処理は、この範囲内の任意の時間中断することができる。
【００３４】
より好ましくは、発酵生産物回収培養液のさらなる処理は、約１２時間〜約４８時間の長さ、例えば１２時間〜４８時間の長さ中断する。さらなる処理は、この範囲内の任意の時間中断することができる。
【００３５】
最も好ましくは、発酵生産物回収培養液のさらなる処理は、約１２時間、約２４時間または約４８時間の長さ、例えば１２時間、２４時間または４８時間の長さ中断する。
【００３６】
他の好ましい実施形態では、発酵生産物回収培養液のさらなる処理の中断を、約２℃〜約６５℃の温度、例えば２℃〜６５℃の温度で行う、組換えポリペプチドを調製するための方法を提供する。さらなる処理は、この範囲内の任意の温度で中断することができる。
【００３７】
より好ましくは、発酵生産物回収培養液のさらなる処理は、約４℃〜約２５℃の温度、例えば４℃〜２５℃の温度で中断する。さらなる処理は、この範囲内の任意の温度で中断することができる。
【００３８】
最も好ましくは、発酵生産物回収培養液のさらなる処理は、約４℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃または約２５℃の温度、例えば４℃、１０℃、１５℃、２０℃または２５℃の温度で中断する。
【００３９】
他の好ましい実施形態では、発酵生産物回収培養液のさらなる処理を約１２時間、約２４時間または約４８時間の長さ、約４℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃または約２５℃の温度で、例えば１２時間、２４時間または４８時間の長さ、４℃、１０℃、１５℃、２０℃または２５℃の温度で中断する、組換えポリペプチドを調製するための方法を提供する。
【００４０】
他の好ましい実施形態では、発酵生産物回収培養液のｐＨ値をステップｂ）中約４〜約１０の間、例えば４〜１０の間に保つ、組換えポリペプチドを調製するための方法を提供する。発酵生産物回収培養液は、この範囲内の任意のｐＨ値に保つことができる。
【００４１】
より好ましくは、発酵生産物回収培養液のｐＨ値はステップｂ）中約５〜約９の間、例えば５〜９の間に保つ。発酵生産物回収培養液は、この範囲内の任意のｐＨ値に保つことができる。
【００４２】
さらにより好ましくは、発酵生産物回収培養液のｐＨ値はステップｂ）中約６〜約８の間、例えば６〜８の間に保つ。発酵生産物回収培養液は、この範囲内の任意のｐＨ値に保つことができる。
【００４３】
最も好ましくは、発酵生産物回収培養液のｐＨ値はステップｂ）中約７、例えば７に保つ。
【００４４】
本発明を実施する際に、温度、ｐＨおよび時間の正確な値に固執することは必要ではない、すなわち前記の実施形態に関しては、前記値は近似値または平均値として理解されたい。本発明は広範囲の条件内で実施可能であり、いくらかの変更が可能である。所与の値付近のいくらかの変更が可能であり、時には実際避けがたいものでさえあることを、当業者は知っているであろう。したがって、中断ステップ期間中、例えば予め設定したｐＨ値をわずかに変えることができ、適切にあるいは必要に応じて再調節することができる。例えば低温保存室中で発酵生産物回収培養液をインキュベートすることによって中断ステップを行うとき、適用する温度をある程度変えることもできる。このような低温保存室中では、予め設定した温度は通常、一定の時間期間で一定の許容範囲内、例えば２℃〜８℃、例えば４℃または５℃の平均的な平均値で変わる。したがって、本発明の文脈内では、例えば４の所与のｐＨまたは例えば２５℃の所与の温度は、正確な４．０のｐＨまたは正確な２５．０℃の温度を意味しない。
【００４５】
中断期間を開始する前に、例えば発酵生産物回収培養液の適切な温度およびｐＨなどの適切な条件を、発現されるポリペプチドによって決定される要件に従い調節する。特定のポリペプチドに最も適した条件は知られているか、あるいは当分野で知られている標準的な方法を適用することによって容易に決定することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｅｄ．Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、１９９８年１月）。
【００４６】
中断期間の後、通常は発酵生産物回収培養液を抽出して、組換えポリペプチドを単離し、それを細胞物質および望ましくない発酵生産副産物から分離する。周辺質タンパク質を選択的に放出させるために頻繁に使用される方法は、特にリゾチームおよび／またはＥＤＴＡ処理、場合によっては次に浸透圧衝撃処理、または指定の時間期間のｐＨまたは温度インキュベーションのような任意の他の適切な放出手順である。
【００４７】
本発明の文脈では、前記の方法のステップｂ）はステップａ）の直後に必ずしも行う必要はないことを理解されたい。他の方法のステップを、ステップａ）とｂ）の間に行うことができる。例えば、中断期間を施す前の発酵生産物回収培養液の部分的抽出は、本発明に含まれる。発酵生産物回収培養液を完全にさらなるプロセシングにかけない限り、中断期間は高いポリペプチド収率をもたらすであろう。
【００４８】
さらに、発酵生産物回収培養液を洗浄および／または濃縮して、物質の体積を減少させることができ、例えばディスクスタック分離機を使用する遠心分離、マイクロ濾過、凝集および沈降によって、あるいは湿潤状態の細胞ペレットをもたらす沈殿および濾過によって、そのさらなる処理を簡略化することができる。わずかな割合のみ体積を部分的に減少させることから可能な限り最大限まで、あるいは適切に濃縮の程度を変えることができ、これは例えば湿潤重量の割合の点で望ましい最終的なコンシステンシーによって決定することができる。発酵生産物回収培養液の濃縮は中断ステップの前または後で行うことができるが、前に行うことが好ましい。
【００４９】
したがって、好ましい実施形態では、
ａ）周辺質を含み、ポリペプチドの周辺質中への分泌を行うことができる組換え発現系で形質転換された原核生物宿主細胞に発酵生産させ、発酵生産は、ポリペプチドが宿主細胞の周辺質中に分泌されるような条件下で発酵生産培地において行うステップ、および
ｂ）発酵生産物回収培養液のさらなる処理を中断し、および抽出前に温度およびｐＨの明確な条件下で発酵生産物回収培養液を保つステップ
を含み、かつ発酵生産物回収培養液をステップｂ）の前に濃縮する、組換えポリペプチドを調製するための方法を提供する。
【００５０】
発酵生産物回収培養液は、ステップｂ）の前に遠心分離またはマイクロ濾過によって濃縮することが好ましい。
【００５１】
周辺質を含む幾つかの原核生物宿主細胞を使用して、本発明を実施することができる。
【００５２】
したがって、好ましい実施形態では、
ａ）周辺質を含み、ポリペプチドの周辺質中への分泌を行うことができる組換え発現系で形質転換された原核生物宿主細胞に発酵生産させ、発酵生産は、ポリペプチドが宿主細胞の周辺質中に分泌されるような条件下で発酵生産培地において行うステップ、および
ｂ）発酵生産物回収培養液のさらなる処理を中断し、および抽出前に温度およびｐＨの明確な条件下で発酵生産物回収培養液を保つステップ
を含み、かつ原核生物宿主細胞がグラム陰性菌である、組換えポリペプチドを調製するための方法を提供する。
【００５３】
グラム陰性菌は大腸菌種、シュードモナス菌種、腸内細菌種、エルビニア菌種、カンピロバクター菌種、プロテウス菌種、アエロモナス菌種およびビトレオシラ菌種からなる群から選択されることがより好ましい。
【００５４】
大腸菌種を使用することが最も好ましい。特に適切な大腸菌菌株は、例えば大腸菌Ｋ１２または大腸菌ＢＬ２１などの大腸菌ＫおよびＢ菌株である。
【００５５】
本発明の方法は広く適用可能であり、特定の組換えポリペプチドまたはタンパク質の調製に限られない。
【００５６】
しかしながら、好ましい実施形態において本発明は、
ａ）周辺質を含み、ポリペプチドの周辺質中への分泌を行うことができる組換え発現系で形質転換された原核生物宿主細胞に発酵生産させ、発酵生産は、ポリペプチドが宿主細胞の周辺質中に分泌されるような条件下で発酵生産培地において行うステップ、および
ｂ）発酵生産物回収培養液のさらなる処理を中断し、および抽出前に温度およびｐＨの明確な条件下で発酵生産物回収培養液を保つステップ
を含み、かつ組換えポリペプチドが抗体、ホルモンまたは免疫調節剤である、組換えポリペプチドを調製するための方法を提供する。
【００５７】
組換えポリペプチドは成長ホルモン、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤または抗体断片であることがより好ましい。
【００５８】
組換えポリペプチドはＦａｂ断片、ヒト成長ホルモン、インターフェロンα−２ｂまたは顆粒球コロニー刺激因子であることが最も好ましい。
【００５９】
以下の実施例を参照することによって、本発明をさらに記載する。これらの実施例は例示目的で与え、制限することを目的とするものではない。
【００６０】
（実施例）
実施例中では、以下の略語を使用する：
ａａ＝アミノ酸
Ａ＝ピーク領域
ＡＥＸ＝アニオン交換クロマトグラフィー
ＢＨ＝床高
Ｃ＝伝導率（ｍＳ／ｃｍ）
ＣＡＰ．Ｐ＝捕捉プール
ＣＥ＝清澄化粗製抽出物
ＣＰ＝遠心分離後のペレット
ＣＲ＝細胞再懸濁
ＣＶ＝カラム体積
ＤＢＥ＝直接の培養液抽出
ＤＲ＝ダイアリテンテート（ｄｉａｒｅｔｅｎｔａｔｅ）
ＤＳＰ＝下流工程処理
ＥＢＡ＝拡張床吸着
ＥＸＴ＝抽出
Ｆａｂ’＝抗体Ｆａｂ’断片
ＧＡＣ＝グルタリル−７−ＡＣＡ−アシラーゼ
ＨＢ＝回収培養液
ＨＣＰ＝宿主細胞タンパク質
ＨＧ＝ホモジェネート
ＨＩＣ＝疎水性相互作用クロマトグラフィー
ＩＰＣ＝方法中の対照
ＭＢＲ＝マスターバッチの記録
ＭＦ＝マイクロ濾過
Ｎ＝理論プレート
ｐ＝圧力（バール）
Ｐ＝タンパク質
ＰＣＭ＝パッケージ細胞塊
ＰＥＩ＝ポリエチレンイミン
ＰＳ＝一次分離
（ａ）ＲＰＣ＝（酸性）逆相クロマトグラフィー
ｒｐｍ＝１分間当たりの回転数
Ｒｓ＝解像度
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＝ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＥＣ＝サイズ排除クロマトグラフィー
ｓｓ＝ステンレス鋼
Ｔ＝温度（℃）
ｔ＝時間（ｈ）
ＴＭＰ＝膜間圧力差
ＵＦ／ＤＦ＝限外濾過／ダイアフィルトレーション
Ｖ＝体積（Ｌ）
Ｗ＝重量（ｋｇ）
ｗＢＭ＝湿潤バイオマス（＝ＢＦＭ）
ＷＢＲ＝精製水
ＷＦＩ＝注射水
【実施例１】
【００６１】
抗体Ｆａｂ’断片（Ｆａｂ’）の周辺質発現
（ＷＯ０１／９４５８５中に開示された）ヒト腫瘍壊死因子αに関する特異性を有する人化抗体Ｆａｂ’断片の軽鎖および重鎖をクローニングし、大腸菌Ｋ１２中で発現させた。適切なプロモーターの共通の制御下においてシグナル配列とのＮ末端融合体として、それぞれ軽鎖および重鎖の連続的な発現を可能にするベクターを使用する。
【００６２】
人化Ｆａｂ’生成大腸菌Ｋ１２菌株の発酵生産の後、回収培養液を遠心分離（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ ＣＳＣ６ディスク分離機、１００Ｌ／ｈ、１５０００×ｇ）によって清澄化し、次いで単離した細胞のペーストを直ちにあるいは示した中断期の後に（時間、温度、湿潤重量は一致）、抽出バッファー（２００ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ ｐＨ７．４、２０ｍＭのＥＤＴＡ）を用いて元の回収体積（最終濃度１００ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁させ、それぞれの調製物を２５℃で３０分間抽出させた。３０分間の抽出の後、それぞれの細胞懸濁調製物の分析用等分試料を、遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｖａｎｔｉ Ｊ２５Ｉ、Ｒｏｔｏｒ２５．５、２０．０００ｇ）および０．２μｍの濾過膜（ＰＡＬＬ Ａｃｒｏｄｉｓｃ３２シリンジ０．２μｍフィルター）によって直ちに清澄化する。清澄化した抽出物は全て、Ｆａｂ’（ａＲＰＣ）および全タンパク質含量に関して分析する（ブラッドフォード法）。
【００６３】
表１中の結果は、Ｆａｂ’の抽出収率は、清澄化後および抽出前に中断ステップを含めることによって高めることができることを示す。
【００６４】
【表１】
【実施例２】
【００６５】
組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）の周辺質発現
ヒト成長ホルモンの構造遺伝子をクローニングし、適切なプロモーターの制御下においてシグナル配列とのＮ末端融合タンパク質として、ｒｈＧＨの発現を可能にするベクターを使用して大腸菌Ｋ１２中で発現させる。シグナル配列は宿主細胞の周辺質空間中への輸送中に切断され、周辺質中に元のポリペプチド配列はそのまま残す。
【００６６】
供給バッチ発酵生産後、ｒｈＧＨ含有大腸菌回収培養液は硫酸を用いてｐＨ５に調節し、５〜１５℃まで直ちに冷却する。低ｐＨおよび低温は、内因性プロテアーゼおよびアミノペプチダーゼの失活を手助けする。次いで処理した回収培養液を、その後の遠心分離（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ分離機ＣＳＣ６、２００Ｌ／ｈ、１５０００×ｇ）またはマイクロ濾過（ＭＦ、０．２μｍ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＴＭＰ約１バール）によって元の体積の約半分まで濃縮し、３〜５ｍＳ／ｃｍの最終伝導率までプロセスウォーターで洗浄する。
【００６７】
示した中断ステップ（４℃または２０℃で２４時間または４８時間）無しあるいはその後で、濃縮した細胞ペーストおよび回収培養液自体（ＤＢＥ、事前の濃縮／洗浄ステップ無し）は、スクロース／ＥＤＴＡストック溶液を用いて条件を整えて１ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｇ／Ｌのスクロースの最終濃度および約１０〜２０％の湿細胞重量に到達させる。２〜８℃での穏かな攪拌による１時間のインキュベーションの後、条件付けした細胞懸濁液を冷水に希釈し（１＋４希釈による浸透圧衝撃）、インキュベーションをさらに１時間続ける。この浸透圧衝撃の後、ポリエチレンイミン（ポリエチレンイミン５０％、ＢＡＳＦ）を０．０５％の最終濃度まで加え、ｐＨは硫酸を用いて７．５に調節する。その後の遠心分離（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ分離機ＣＳＣ６）および濾過（０．３μｍのＰｏｌｙｇａｒｄおよび０．２μｍのＤｕｒａｐｏｒｅ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって、全ブラッドフォードタンパク質に対して０．１〜０．３ｍｇのｒｈＧＨ／ｍＬおよび２０％を超える純度で透明なタンパク質溶液を得る。
【００６８】
次いでｒｈＧＨ含有抽出物を３〜５ｍＳ／ｃｍの最終伝導率まで調節して（あるいは希釈によって、あるいは５〜１０ｋＤのＢｉｏｍａｘ膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅでのダイアフィルトレーションによって）、アニオン交換クロマトグラフィーによって捕捉する（Ｑ−ＨｙｐｅｒＤ Ｆ、Ｂｉｏｓｅｐｒａ、装荷量＞５０ｍｇ（全タンパク質）／ｍｌ（充填樹脂）、線流速３〜５ｃｍ／分、床高１０〜２０ｃｍ）。
【００６９】
ｒｈＧＨ抽出収率は、発酵生産／清澄化後および抽出前に中断ステップを含めることによって高めることができる。
【実施例３】
【００７０】
組換えヒトインターフェロンα−２Ｂ（ｒｈＩＦＮα−２Ｂ）の周辺質発現
ｒｈＩＦＮα−２Ｂを、Ｐｇａｃプロモーターの制御下での組換え大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０菌株の発酵生産によって生成させる。標的タンパク質は、（ＣＳ２７８５１５、ＣＳ２６００６８中に記載された）シュードモナスディミニュータＣＣＭ３９８７由来の細菌グルタリル−ＡＣＡ−アシラーゼ（ＧＡＣ）のシグナルペプチドとのＮ末端融合体として発現される。
【００７１】
実施例２中と同様に、回収培養液は一定体積でプロセスウォーターを用いて最初に洗浄し、次いでその後の遠心分離（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ分離機ＣＳＣ６、２００Ｌ／ｈ、１５０００×ｇ）またはマイクロ濾過（ＭＦ、０．２μｍ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＴＭＰ約１バール）によって、約４（３〜５の範囲）ｍＳ／ｃｍの最終伝導率および４５±５％湿潤重量の最終コンシステンシーまで濃縮する。４℃または２０℃の温度での２４時間または４８時間の後の中断ステップ有りまたは無しで、すなわち濃縮した細胞ペーストまたは回収培養液自体（ＤＢＥ、事前の濃縮／洗浄ステップ無し）の維持有りまたは無しで、さらなる処理を行う。
その後、ＥＤＴＡ／スクロースストック溶液を洗浄した細胞ペーストまたは回収培養液に加えて、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｇ／Ｌのスクロースの最終濃度および１０〜２０％の湿細胞重量に到達させ、スラリーはＮａＯＨを用いてｐＨ８．０に調節する。２〜８℃での穏かな攪拌による１時間のインキュベーションの後、条件付けした細胞懸濁液を冷水に希釈し（１＋４希釈による浸透圧衝撃）、インキュベーションをさらに１時間続け、次いでポリエチレンイミン凝集によってｒｈＧＨ実験（実施例２）中と同様に清澄化し、その後の遠心分離および濾過によって、抽出物１ｍＬ当たり約０．００５〜０．０２５ｍｇのｒｈＩＦＮα−２Ｂを有する透明なタンパク質溶液を生成させる（デンシトメトリーＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン検出によって測定）。生成物捕捉用に、この透明な抽出物を３．５〜４．５ｍＳ／ｃｍに調節し（あるいは希釈によって、あるいは５〜１０ｋＤのＢｉｏｍａｘ膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅでのダイアフィルトレーションによって）、希釈ＣＨ３ＣＯＯＨを用いてｐＨ５に調節し、平衡状態のＳ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｆカラム（Ｓ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｆ、Ｂｉｏｓｅｐｒａ、装荷量３０〜７０ｍｇ（タンパク質）／１ｍｌ（樹脂）、２〜６ｃｍ／分、ＥＱ−バッファー２０ｍＭの酢酸ナトリウム＋７０ｍＭのＮａＣＬ ｐＨ５．０）に充填する。平衡状態のバッファーを用いた洗浄ステップ後、ｒｈＩＦＮα−２Ｂは約２ＣＶの溶出バッファー（２０ｍＭの酢酸ナトリウム＋１７５ｍＭのＮａＣＬ ｐＨ５．０）を用いて溶出させる。捕捉プールにおいて、標的タンパク質はａＲＰＣによって定量化し、ブラッドフォード法で測定した全タンパク質に対する生成物含量によって純度を推定する。
【００７２】
ｒｈＩＦＮα−２Ｂ抽出収率は、発酵生産／清澄化後および抽出前に中断ステップを含めることによって高めることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は組換えポリペプチドの調製に関するものであり、このポリペプチドは発現時に形質転換された宿主細胞の周辺質中に分泌されている。詳細には本発明は、さらなる下流工程処理の前に周辺質からの前記組換えポリペプチドの抽出収率を高めるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリペプチドまたはタンパク質は、宿主として細菌細胞（例えば大腸菌）を使用する組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。したがって細菌細胞は、前記ポリペプチドまたはタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡで形質転換することができる。細菌は、細胞質、または周辺質または細胞外空間において多量のポリペプチドを発現することができる。細菌は大規模な発酵生産プロセスを使用して大量に増殖させることができるので、大量のポリペプチドをこのようにして生成することが可能である。
【０００３】
ポリペプチドまたはタンパク質の周辺質中への分泌には、細胞質タンパク質、特にプロテアーゼからの分離、細胞質の毒性の回避、Ｎ末端メチオニンの増大の回避、およびジスルフィド結合の形成が進行する可能性があり、タンパク質が可溶性で生物学的活性がある立体配座に折りたたまれる可能性があるさらに酸化性の強い環境における蓄積を含めた、幾つかの潜在的な利点がある。表面上、望ましいタンパク質がそのＮ末端においてシグナルペプチド（分泌リーダー）と融合することのみを必要とするが、分泌の効率もタンパク質の構造的特徴、および細胞内のその通常の位置によっておそらく影響を受ける。
【０００４】
大腸菌は細胞質膜を介して周辺質中にタンパク質を分泌する能力が充分にあり、異種タンパク質を細胞の細胞質の外に向ける時広く使用されてきている。特に生物学的活性抗体断片の生成をすでに可能にしてきており、現在では動物細胞培養における完全抗体の生成が挑戦されている。
【０００５】
異種タンパク質の分泌が１００％有効であることはめったになく、幾つかの場合、分泌リーダーが結合した未処理の前駆体タンパク質が細胞内に蓄積する。この観察結果は、分泌機構の１つまたは複数の成分が、これらのタンパク質の輸送を制限している可能性があることを示唆する。
【０００６】
大腸菌におけるタンパク質分泌に関する文献の１つの顕著な特徴は、タンパク質が増殖培地から直接回収される報告の頻度である。このことは非常に有利である可能性はあるが、根底にある機構に関する未解決な問題を提起する。タンパク質は外側膜を介した特異的な移動によってではなく、細胞からの非特異的な漏出、または細胞の溶解によって培地に放出されることが多いことを示す、幾つかの報告が存在する。この現象は理解されておらず、非常にタンパク質配列特異的であり、幾つかの抗体断片に関しては広範囲に及び、他のポリペプチドに関しては顕著ではない。
【０００７】
タンパク質の周辺質中への分泌は有用な経路であり、生物学的評価のためのタンパク質の迅速な単離につながる可能性がある。産業規模でのその適用は、細胞から周辺質タンパク質を選択的に放出させるための有効で定量可能な方法の、一般的な利用しにくさによって現在制限されている。
【０００８】
周辺質からの組換えタンパク質の回収を、細胞質タンパク質による汚染なしで実施することができれば、後の精製ステップは非常に簡略化される。何故なら、例えば大腸菌においては、２５個の知られている細胞プロテアーゼのわずか７個、全細胞タンパク質の約４〜８％が、周辺質中に所在するのみである（Ｓｗａｍｙら、Ｂａｎｅｙｘら）。
【０００９】
周辺質タンパク質を選択的に放出させるための、さまざまな頻繁に使用される方法が存在する。１つはクロロホルム、グアニジン−ＨＣｌ、臭化セチルトリメチルアンモニウム／ＣＴＡＢ、またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などの界面活性剤およびグリシンなどの化学物質が関与する細胞浸透処理である。他はリゾチーム／ＥＤＴＡ処理または浸透圧衝撃の施用を使用する浸透処理である。これらの放出法は大規模な調製にも適しており、さまざまな程度の成功で、広範囲の発現系に関する多くの異なる改変において使用されてきている。
【００１０】
周辺質のタンパク質放出に関する現況技術の方法は、例えば以下の文献中に
文書化されている：
Ｓｗａｍｙら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４７、１０２７〜１０３３、１９８２
Ｂａｎｅｙｘら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３、２６９６〜２７０３、１９９１
Ｂｌｉｇｈｔら、ＴｉｂＴｅｃｈ１２、４５０〜４５５、１９９４
Ｂａｒｂｅｒｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４、２５５〜２６７、１９８６
Ｐｉｅｒｃｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５８、１〜１１、１９９７
Ｆｒｅｎｃｈら、Ｅｎｚｙｍｅ＆Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１９、３３２〜３３８、１９９６
Ｎａｇｌａｋら、Ｅｎｚｙｍｅ＆Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２、６０３〜６１１、１９９０
Ｎｏｓｓａｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２４１（１３）、３０５５〜３０６２、１９６６
Ｎｅｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２４０、３６８５〜３６９２、１９６５
Ｈｓｉｕｎｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４、９９１〜９９５、１９８６
Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０、１６３〜１６７、１９９２
Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．３２、７４１〜７４８、１９８８
Ａｒｉｓｔｉｄｏｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ１５（４）、３３１〜３３６、１９９３
Ｃｈａｉｂら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ９（３）、１７９〜１８４、１１９５
Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６０、１１８１〜１１８３、１９８４
Ｇｅｌｌｅｒｆｏｒｓら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．７、２、１７３〜８３、１９８９
Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１７、７８０〜７８３、１９９９
Ｖｏｓｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９８、７１９〜７２５、１９９４
ＷＯ０１／９４５８５
米国特許第４，８４５，０３２号
米国特許第４，３１５，８５２号
組換え技法を使用して粗製ポリペプチドの高い収率を生み出すことはできるが、ポリペプチドの単離および精製は精巧かつ包括的な手順を必要とする。
【００１１】
典型的な単離手順では、酸性剤または腐食剤を加えることによって、発酵生産物回収培養液を中性ｐＨ（例えばｐＨ６．５〜７．５）に調節する。後に細菌細胞を例えば遠心分離またはマイクロ濾過にかけ、廃棄される望ましくない可溶性副産物を含む液体上清を分離除去する。生成した細菌細胞の塊は適切な培地、例えば適切なバッファー中に再懸濁させ、細胞を粉砕して生成物を抽出し単離する。
【００１２】
労力を要する抽出および単離手順を通常行い、発酵生産副産物および他の汚染物質からできる限り多くの当該のポリペプチドを分離して、後の精製ステップが可能な限り有効な方式で進行することを確実にする。
【００１３】
当分野で知られている精製ステップは一般に、沈殿およびクロマトグラフィー分離技法を含み、労力を要し抽出ポリペプチドの低い収率および高い生成コストをもたらす可能性がある、ダイアフィルトレーションおよび／または濃縮手順のような追加のステップを時々必要とする。
【００１４】
ポリペプチドの抽出、単離および精製は、各段階において、物質または生物活性の消失をもたらす。
【００１５】
通常は細菌細胞の粉砕の後に起こるがｉｎ ｖｉｖｏでも観察される、タンパク質分解、すなわちタンパク質分解酵素によるポリペプチドの分解は、タンパク質消失の主な原因の１つであると考えられる。この偶発的なタンパク質分解が、当該のポリペプチドの分解を最小にするための方法の改変を必要とする技術的な問題点である。
【００１６】
タンパク質分解の割合を低く保つ１つの方法は一般に、妥当に低い温度で可能な限り迅速に回収、抽出、単離および精製手順を行うことである。したがって、ポリペプチドの単離および精製に関する関連教本および標準プロトコルは一般に、不必要な遅延および中断なしで進行することを教示している（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｅｄ．Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、１９９８年１月）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、高収率かつコスト効率の良い形式で細菌細胞からの当該の組換えポリペプチドの抽出を可能にする、新規な方法が必要性である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、組換えポリペプチドを調製するための新規な方法を提供することによって前述の必要性に応ずる。
【００１９】
本発明では、周辺質を含む細菌宿主中で発現される組換えポリペプチドの収率は、発酵生産後に単離プロセスを中断し、前記ポリペプチドの抽出および単離の後続ステップを行う前に、発酵生産物回収培養液のさらなる処理を保留することによって、増大させることができることが驚くことに分かってきている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、
ａ）周辺質を含み、ポリペプチドの周辺質中への分泌を行うことができる組換え発現系で形質転換された原核生物宿主細胞に発酵生産させ、発酵生産は、ポリペプチドが宿主細胞の周辺質中に分泌されるような条件下で発酵生産培地において行うステップ、および
ｂ）発酵生産物回収培養液のさらなる処理を中断し、および抽出前に温度およびｐＨの明確な条件下で発酵生産物回収培養液を保つステップ
を含む、組換えポリペプチドを調製するための方法に関する。
【００２１】
本発明の他の目的、特徴、利点および態様は、以下の記載事項から当業者に明らかとなるであろう。しかしながら、以下の記載事項および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しながら、例示のみによって与えられることは理解されるはずである。開示する本発明の精神および範囲内のさまざまな変更および変更形態が、以下の記載事項を読むことから、および本開示の他の部分を読むことから、当業者には容易に明らかとなるであろう。
【００２２】
本明細書に引用する全ての特許出願、特許および参照文献は、その全容が参照によりここに組み込まれている。
【００２３】
本発明を実施する際には、分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡの多くの従来の技法を使用する。これらの技法はよく知られており、例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ、１９９７（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｄ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｖｏｌｕｍｅｓ ＩおよびＩＩ、１９８５（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９８４（Ｍ．Ｌ．Ｇａｉｔ ｅｄ．）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、１９８５、（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、１９８４（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、１９８６（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｄ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ、１９８６（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）；Ｐｅｒｂａｌ、１９８４、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ、１９８７（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；およびＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１５４およびＶｏｌ．１５５（それぞれＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ、ならびにＷｕ、ｅｄｓ．）中で説明されている。
【００２４】
本発明は、
ａ）周辺質を含み、ポリペプチドの周辺質中への分泌を行うことができる組換え発現系で形質転換された原核生物宿主細胞に発酵生産させ、発酵生産は、ポリペプチドが宿主細胞の周辺質中に分泌されるような条件下で発酵生産培地において行うステップ、および
ｂ）発酵生産物回収培養液のさらなる処理を中断し、および抽出前に温度およびｐＨの明確な条件下で発酵生産物回収培養液を保つステップ
を含む、組換えポリペプチドを調製するための方法に関する。
【００２５】
本発明は、周辺質を含む細菌宿主中で発現される組換えポリペプチドの収率は、発酵生産物後に単離プロセスを中断し、前記ポリペプチドの抽出および単離の後のステップを行う前に、発酵生産物回収培養液のさらなる処理を保留することによって増大させることができるという驚くべき発見に基づく。
【００２６】
ポリペプチドの発現は、周辺質を含みポリペプチドの周辺質中への分泌を行うことができる組換え発現系で形質転換された、適切な原核生物宿主細胞中で行う（例えば、ＳｋｅｒｒａおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０、１０３８〜１０４１、１９８８中に記載されている）。
【００２７】
ポリペプチドの発酵生産は、ポリペプチドが宿主細胞の周辺質中に分泌されるような適切な条件下で、発酵生産培地において行う（例えば、ＳｋｅｒｒａおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０、１０３８〜１０４１、１９８８中に記載されている）。
【００２８】
本明細書で使用する用語「発酵生産」は、ポリペプチドが宿主細胞によって生成され周辺質中に分泌されるような適切な条件下で適切な時間の長さ、適切な発酵生産培地中で宿主細胞を増殖させることを意味すると理解されたい。
【００２９】
前記さらなる処理の中断は、生成ポリペプチドの完全性、すなわちそれが分解されないかあるいは他の場合は機能または構造を害されないことを可能な限り確実にする適切な条件下で、例えば少なくとも１時間発酵生産物回収培養液を維持、保有、保持または保存することによって実施することができる。これは発酵生産タンク（発酵槽）中に直接、例えば発酵生産物回収培養液を維持、保有、保持または保存することによって、あるいは発酵槽からの回収後に他のタンクまたは任意の他の適切な容器中に前記発酵生産物回収培養液を移すことによって行うことができる。さらに発酵生産物回収培養液は、中断ステップ中に周期的または連続的に攪拌することができる。
【００３０】
したがって、好ましい実施形態では、前記の方法のステップｂ）は発酵槽中で行う。
【００３１】
通常、生成物収率の望ましい増大に関しては、中断ステップの時間と適用する温度の間に１つの関係が存在するであろう。低い温度は長い時間期間を必要とし、一方より高い温度では、同様の結果を得るためにはより短い時間期間で充分であろう。最適なパラメータは、発現されるポリペプチド、宿主細胞および生産条件に依存する。
【００３２】
したがって、好ましい実施形態では、発酵生産物回収培養液のさらなる処理を少なくとも約１時間の長さ、例えば１時間の長さ中断する、組換えポリペプチドを調製するための方法を提供する。
【００３３】
好ましくは、発酵生産物回収培養液のさらなる処理は、約１時間〜約７２時間の長さ、例えば１時間〜７２時間の長さ中断する。さらなる処理は、この範囲内の任意の時間中断することができる。
【００３４】
より好ましくは、発酵生産物回収培養液のさらなる処理は、約１２時間〜約４８時間の長さ、例えば１２時間〜４８時間の長さ中断する。さらなる処理は、この範囲内の任意の時間中断することができる。
【００３５】
最も好ましくは、発酵生産物回収培養液のさらなる処理は、約１２時間、約２４時間または約４８時間の長さ、例えば１２時間、２４時間または４８時間の長さ中断する。
【００３６】
他の好ましい実施形態では、発酵生産物回収培養液のさらなる処理の中断を、約２℃〜約６５℃の温度、例えば２℃〜６５℃の温度で行う、組換えポリペプチドを調製するための方法を提供する。さらなる処理は、この範囲内の任意の温度で中断することができる。
【００３７】
より好ましくは、発酵生産物回収培養液のさらなる処理は、約４℃〜約２５℃の温度、例えば４℃〜２５℃の温度で中断する。さらなる処理は、この範囲内の任意の温度で中断することができる。
【００３８】
最も好ましくは、発酵生産物回収培養液のさらなる処理は、約４℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃または約２５℃の温度、例えば４℃、１０℃、１５℃、２０℃または２５℃の温度で中断する。
【００３９】
他の好ましい実施形態では、発酵生産物回収培養液のさらなる処理を約１２時間、約２４時間または約４８時間の長さ、約４℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃または約２５℃の温度で、例えば１２時間、２４時間または４８時間の長さ、４℃、１０℃、１５℃、２０℃または２５℃の温度で中断する、組換えポリペプチドを調製するための方法を提供する。
【００４０】
他の好ましい実施形態では、発酵生産物回収培養液のｐＨ値をステップｂ）中約４〜約１０の間、例えば４〜１０の間に保つ、組換えポリペプチドを調製するための方法を提供する。発酵生産物回収培養液は、この範囲内の任意のｐＨ値に保つことができる。
【００４１】
より好ましくは、発酵生産物回収培養液のｐＨ値はステップｂ）中約５〜約９の間、例えば５〜９の間に保つ。発酵生産物回収培養液は、この範囲内の任意のｐＨ値に保つことができる。
【００４２】
さらにより好ましくは、発酵生産物回収培養液のｐＨ値はステップｂ）中約６〜約８の間、例えば６〜８の間に保つ。発酵生産物回収培養液は、この範囲内の任意のｐＨ値に保つことができる。
【００４３】
最も好ましくは、発酵生産物回収培養液のｐＨ値はステップｂ）中約７、例えば７に保つ。
【００４４】
本発明を実施する際に、温度、ｐＨおよび時間の正確な値に固執することは必要ではない、すなわち前記の実施形態に関しては、前記値は近似値または平均値として理解されたい。本発明は広範囲の条件内で実施可能であり、いくらかの変更が可能である。所与の値付近のいくらかの変更が可能であり、時には実際避けがたいものでさえあることを、当業者は知っているであろう。したがって、中断ステップ期間中、例えば予め設定したｐＨ値をわずかに変えることができ、適切にあるいは必要に応じて再調節することができる。例えば低温保存室中で発酵生産物回収培養液をインキュベートすることによって中断ステップを行うとき、適用する温度をある程度変えることもできる。このような低温保存室中では、予め設定した温度は通常、一定の時間期間で一定の許容範囲内、例えば２℃〜８℃、例えば４℃または５℃の平均的な平均値で変わる。したがって、本発明の文脈内では、例えば４の所与のｐＨまたは例えば２５℃の所与の温度は、正確な４．０のｐＨまたは正確な２５．０℃の温度を意味しない。
【００４５】
中断期間を開始する前に、例えば発酵生産物回収培養液の適切な温度およびｐＨなどの適切な条件を、発現されるポリペプチドによって決定される要件に従い調節する。特定のポリペプチドに最も適した条件は知られているか、あるいは当分野で知られている標準的な方法を適用することによって容易に決定することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｅｄ．Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、１９９８年１月）。
【００４６】
中断期間の後、通常は発酵生産物回収培養液を抽出して、組換えポリペプチドを単離し、それを細胞物質および望ましくない発酵生産副産物から分離する。周辺質タンパク質を選択的に放出させるために頻繁に使用される方法は、特にリゾチームおよび／またはＥＤＴＡ処理、場合によっては次に浸透圧衝撃処理、または指定の時間期間のｐＨまたは温度インキュベーションのような任意の他の適切な放出手順である。
【００４７】
本発明の文脈では、前記の方法のステップｂ）はステップａ）の直後に必ずしも行う必要はないことを理解されたい。他の方法のステップを、ステップａ）とｂ）の間に行うことができる。例えば、中断期間を施す前の発酵生産物回収培養液の部分的抽出は、本発明に含まれる。発酵生産物回収培養液を完全にさらなるプロセシングにかけない限り、中断期間は高いポリペプチド収率をもたらすであろう。
【００４８】
さらに、発酵生産物回収培養液を洗浄および／または濃縮して、物質の体積を減少させることができ、例えばディスクスタック分離機を使用する遠心分離、マイクロ濾過、凝集および沈降によって、あるいは湿潤状態の細胞ペレットをもたらす沈殿および濾過によって、そのさらなる処理を簡略化することができる。わずかな割合のみ体積を部分的に減少させることから可能な限り最大限まで、あるいは適切に濃縮の程度を変えることができ、これは例えば湿潤重量の割合の点で望ましい最終的なコンシステンシーによって決定することができる。発酵生産物回収培養液の濃縮は中断ステップの前または後で行うことができるが、前に行うことが好ましい。
【００４９】
したがって、好ましい実施形態では、
ａ）周辺質を含み、ポリペプチドの周辺質中への分泌を行うことができる組換え発現系で形質転換された原核生物宿主細胞に発酵生産させ、発酵生産は、ポリペプチドが宿主細胞の周辺質中に分泌されるような条件下で発酵生産培地において行うステップ、および
ｂ）発酵生産物回収培養液のさらなる処理を中断し、および抽出前に温度およびｐＨの明確な条件下で発酵生産物回収培養液を保つステップ
を含み、かつ発酵生産物回収培養液をステップｂ）の前に濃縮する、組換えポリペプチドを調製するための方法を提供する。
【００５０】
発酵生産物回収培養液は、ステップｂ）の前に遠心分離またはマイクロ濾過によって濃縮することが好ましい。
【００５１】
周辺質を含む幾つかの原核生物宿主細胞を使用して、本発明を実施することができる。
【００５２】
したがって、好ましい実施形態では、
ａ）周辺質を含み、ポリペプチドの周辺質中への分泌を行うことができる組換え発現系で形質転換された原核生物宿主細胞に発酵生産させ、発酵生産は、ポリペプチドが宿主細胞の周辺質中に分泌されるような条件下で発酵生産培地において行うステップ、および
ｂ）発酵生産物回収培養液のさらなる処理を中断し、および抽出前に温度およびｐＨの明確な条件下で発酵生産物回収培養液を保つステップ
を含み、かつ原核生物宿主細胞がグラム陰性菌である、組換えポリペプチドを調製するための方法を提供する。
【００５３】
グラム陰性菌は大腸菌種、シュードモナス菌種、腸内細菌種、エルビニア菌種、カンピロバクター菌種、プロテウス菌種、アエロモナス菌種およびビトレオシラ菌種からなる群から選択されることがより好ましい。
【００５４】
大腸菌種を使用することが最も好ましい。特に適切な大腸菌菌株は、例えば大腸菌Ｋ１２または大腸菌ＢＬ２１などの大腸菌ＫおよびＢ菌株である。
【００５５】
本発明の方法は広く適用可能であり、特定の組換えポリペプチドまたはタンパク質の調製に限られない。
【００５６】
しかしながら、好ましい実施形態において本発明は、
ａ）周辺質を含み、ポリペプチドの周辺質中への分泌を行うことができる組換え発現系で形質転換された原核生物宿主細胞に発酵生産させ、発酵生産は、ポリペプチドが宿主細胞の周辺質中に分泌されるような条件下で発酵生産培地において行うステップ、および
ｂ）発酵生産物回収培養液のさらなる処理を中断し、および抽出前に温度およびｐＨの明確な条件下で発酵生産物回収培養液を保つステップ
を含み、かつ組換えポリペプチドが抗体、ホルモンまたは免疫調節剤である、組換えポリペプチドを調製するための方法を提供する。
【００５７】
組換えポリペプチドは成長ホルモン、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤または抗体断片であることがより好ましい。
【００５８】
組換えポリペプチドはＦａｂ断片、ヒト成長ホルモン、インターフェロンα−２ｂまたは顆粒球コロニー刺激因子であることが最も好ましい。
【００５９】
以下の実施例を参照することによって、本発明をさらに記載する。これらの実施例は例示目的で与え、制限することを目的とするものではない。
【００６０】
（実施例）
実施例中では、以下の略語を使用する：
ａａ＝アミノ酸
Ａ＝ピーク領域
ＡＥＸ＝アニオン交換クロマトグラフィー
ＢＨ＝床高
Ｃ＝伝導率（ｍＳ／ｃｍ）
ＣＡＰ．Ｐ＝捕捉プール
ＣＥ＝清澄化粗製抽出物
ＣＰ＝遠心分離後のペレット
ＣＲ＝細胞再懸濁
ＣＶ＝カラム体積
ＤＢＥ＝直接の培養液抽出
ＤＲ＝ダイアリテンテート（ｄｉａｒｅｔｅｎｔａｔｅ）
ＤＳＰ＝下流工程処理
ＥＢＡ＝拡張床吸着
ＥＸＴ＝抽出
Ｆａｂ’＝抗体Ｆａｂ’断片
ＧＡＣ＝グルタリル−７−ＡＣＡ−アシラーゼ
ＨＢ＝回収培養液
ＨＣＰ＝宿主細胞タンパク質
ＨＧ＝ホモジェネート
ＨＩＣ＝疎水性相互作用クロマトグラフィー
ＩＰＣ＝方法中の対照
ＭＢＲ＝マスターバッチの記録
ＭＦ＝マイクロ濾過
Ｎ＝理論プレート
ｐ＝圧力（バール）
Ｐ＝タンパク質
ＰＣＭ＝パッケージ細胞塊
ＰＥＩ＝ポリエチレンイミン
ＰＳ＝一次分離
（ａ）ＲＰＣ＝（酸性）逆相クロマトグラフィー
ｒｐｍ＝１分間当たりの回転数
Ｒｓ＝解像度
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＝ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＥＣ＝サイズ排除クロマトグラフィー
ｓｓ＝ステンレス鋼
Ｔ＝温度（℃）
ｔ＝時間（ｈ）
ＴＭＰ＝膜間圧力差
ＵＦ／ＤＦ＝限外濾過／ダイアフィルトレーション
Ｖ＝体積（Ｌ）
Ｗ＝重量（ｋｇ）
ｗＢＭ＝湿潤バイオマス（＝ＢＦＭ）
ＷＢＲ＝精製水
ＷＦＩ＝注射水
【実施例１】
【００６１】
抗体Ｆａｂ’断片（Ｆａｂ’）の周辺質発現
（ＷＯ０１／９４５８５中に開示された）ヒト腫瘍壊死因子αに関する特異性を有する人化抗体Ｆａｂ’断片の軽鎖および重鎖をクローニングし、大腸菌Ｋ１２中で発現させた。適切なプロモーターの共通の制御下においてシグナル配列とのＮ末端融合体として、それぞれ軽鎖および重鎖の連続的な発現を可能にするベクターを使用する。
【００６２】
人化Ｆａｂ’生成大腸菌Ｋ１２菌株の発酵生産の後、回収培養液を遠心分離（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ ＣＳＣ６ディスク分離機、１００Ｌ／ｈ、１５０００×ｇ）によって清澄化し、次いで単離した細胞のペーストを直ちにあるいは示した中断期の後に（時間、温度、湿潤重量は一致）、抽出バッファー（２００ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ ｐＨ７．４、２０ｍＭのＥＤＴＡ）を用いて元の回収体積（最終濃度１００ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁させ、それぞれの調製物を２５℃で３０分間抽出させた。３０分間の抽出の後、それぞれの細胞懸濁調製物の分析用等分試料を、遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｖａｎｔｉ Ｊ２５Ｉ、Ｒｏｔｏｒ２５．５、２０．０００ｇ）および０．２μｍの濾過膜（ＰＡＬＬ Ａｃｒｏｄｉｓｃ３２シリンジ０．２μｍフィルター）によって直ちに清澄化する。清澄化した抽出物は全て、Ｆａｂ’（ａＲＰＣ）および全タンパク質含量に関して分析する（ブラッドフォード法）。
【００６３】
表１中の結果は、Ｆａｂ’の抽出収率は、清澄化後および抽出前に中断ステップを含めることによって高めることができることを示す。
【００６４】
【表１】
【実施例２】
【００６５】
組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）の周辺質発現
ヒト成長ホルモンの構造遺伝子をクローニングし、適切なプロモーターの制御下においてシグナル配列とのＮ末端融合タンパク質として、ｒｈＧＨの発現を可能にするベクターを使用して大腸菌Ｋ１２中で発現させる。シグナル配列は宿主細胞の周辺質空間中への輸送中に切断され、周辺質中に元のポリペプチド配列はそのまま残す。
【００６６】
供給バッチ発酵生産後、ｒｈＧＨ含有大腸菌回収培養液は硫酸を用いてｐＨ５に調節し、５〜１５℃まで直ちに冷却する。低ｐＨおよび低温は、内因性プロテアーゼおよびアミノペプチダーゼの失活を手助けする。次いで処理した回収培養液を、その後の遠心分離（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ分離機ＣＳＣ６、２００Ｌ／ｈ、１５０００×ｇ）またはマイクロ濾過（ＭＦ、０．２μｍ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＴＭＰ約１バール）によって元の体積の約半分まで濃縮し、３〜５ｍＳ／ｃｍの最終伝導率までプロセスウォーターで洗浄する。
【００６７】
示した中断ステップ（４℃または２０℃で２４時間または４８時間）無しあるいはその後で、濃縮した細胞ペーストおよび回収培養液自体（ＤＢＥ、事前の濃縮／洗浄ステップ無し）は、スクロース／ＥＤＴＡストック溶液を用いて条件を整えて１ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｇ／Ｌのスクロースの最終濃度および約１０〜２０％の湿細胞重量に到達させる。２〜８℃での穏かな攪拌による１時間のインキュベーションの後、条件付けした細胞懸濁液を冷水に希釈し（１＋４希釈による浸透圧衝撃）、インキュベーションをさらに１時間続ける。この浸透圧衝撃の後、ポリエチレンイミン（ポリエチレンイミン５０％、ＢＡＳＦ）を０．０５％の最終濃度まで加え、ｐＨは硫酸を用いて７．５に調節する。その後の遠心分離（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ分離機ＣＳＣ６）および濾過（０．３μｍのＰｏｌｙｇａｒｄおよび０．２μｍのＤｕｒａｐｏｒｅ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって、全ブラッドフォードタンパク質に対して０．１〜０．３ｍｇのｒｈＧＨ／ｍＬおよび２０％を超える純度で透明なタンパク質溶液を得る。
【００６８】
次いでｒｈＧＨ含有抽出物を３〜５ｍＳ／ｃｍの最終伝導率まで調節して（あるいは希釈によって、あるいは５〜１０ｋＤのＢｉｏｍａｘ膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅでのダイアフィルトレーションによって）、アニオン交換クロマトグラフィーによって捕捉する（Ｑ−ＨｙｐｅｒＤ Ｆ、Ｂｉｏｓｅｐｒａ、装荷量＞５０ｍｇ（全タンパク質）／ｍｌ（充填樹脂）、線流速３〜５ｃｍ／分、床高１０〜２０ｃｍ）。
【００６９】
ｒｈＧＨ抽出収率は、発酵生産／清澄化後および抽出前に中断ステップを含めることによって高めることができる。
【実施例３】
【００７０】
組換えヒトインターフェロンα−２Ｂ（ｒｈＩＦＮα−２Ｂ）の周辺質発現
ｒｈＩＦＮα−２Ｂを、Ｐｇａｃプロモーターの制御下での組換え大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０菌株の発酵生産によって生成させる。標的タンパク質は、（ＣＳ２７８５１５、ＣＳ２６００６８中に記載された）シュードモナスディミニュータＣＣＭ３９８７由来の細菌グルタリル−ＡＣＡ−アシラーゼ（ＧＡＣ）のシグナルペプチドとのＮ末端融合体として発現される。
【００７１】
実施例２中と同様に、回収培養液は一定体積でプロセスウォーターを用いて最初に洗浄し、次いでその後の遠心分離（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ分離機ＣＳＣ６、２００Ｌ／ｈ、１５０００×ｇ）またはマイクロ濾過（ＭＦ、０．２μｍ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＴＭＰ約１バール）によって、約４（３〜５の範囲）ｍＳ／ｃｍの最終伝導率および４５±５％湿潤重量の最終コンシステンシーまで濃縮する。４℃または２０℃の温度での２４時間または４８時間の後の中断ステップ有りまたは無しで、すなわち濃縮した細胞ペーストまたは回収培養液自体（ＤＢＥ、事前の濃縮／洗浄ステップ無し）の維持有りまたは無しで、さらなる処理を行う。
その後、ＥＤＴＡ／スクロースストック溶液を洗浄した細胞ペーストまたは回収培養液に加えて、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｇ／Ｌのスクロースの最終濃度および１０〜２０％の湿細胞重量に到達させ、スラリーはＮａＯＨを用いてｐＨ８．０に調節する。２〜８℃での穏かな攪拌による１時間のインキュベーションの後、条件付けした細胞懸濁液を冷水に希釈し（１＋４希釈による浸透圧衝撃）、インキュベーションをさらに１時間続け、次いでポリエチレンイミン凝集によってｒｈＧＨ実験（実施例２）中と同様に清澄化し、その後の遠心分離および濾過によって、抽出物１ｍＬ当たり約０．００５〜０．０２５ｍｇのｒｈＩＦＮα−２Ｂを有する透明なタンパク質溶液を生成させる（デンシトメトリーＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン検出によって測定）。生成物捕捉用に、この透明な抽出物を３．５〜４．５ｍＳ／ｃｍに調節し（あるいは希釈によって、あるいは５〜１０ｋＤのＢｉｏｍａｘ膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅでのダイアフィルトレーションによって）、希釈ＣＨ３ＣＯＯＨを用いてｐＨ５に調節し、平衡状態のＳ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｆカラム（Ｓ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｆ、Ｂｉｏｓｅｐｒａ、装荷量３０〜７０ｍｇ（タンパク質）／１ｍｌ（樹脂）、２〜６ｃｍ／分、ＥＱ−バッファー２０ｍＭの酢酸ナトリウム＋７０ｍＭのＮａＣＬ ｐＨ５．０）に充填する。平衡状態のバッファーを用いた洗浄ステップ後、ｒｈＩＦＮα−２Ｂは約２ＣＶの溶出バッファー（２０ｍＭの酢酸ナトリウム＋１７５ｍＭのＮａＣＬ ｐＨ５．０）を用いて溶出させる。捕捉プールにおいて、標的タンパク質はａＲＰＣによって定量化し、ブラッドフォード法で測定した全タンパク質に対する生成物含量によって純度を推定する。
【００７２】
ｒｈＩＦＮα−２Ｂ抽出収率は、発酵生産／清澄化後および抽出前に中断ステップを含めることによって高めることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）周辺質を含み、ポリペプチドの周辺質中への分泌を行うことができる組換え発現系で形質転換された原核生物宿主細胞に発酵生産させ、前記発酵生産は、ポリペプチドが宿主細胞の周辺質中に分泌されるような条件下で発酵生産培地において行うステップ、および
ｂ）発酵生産物回収培養液のさらなる処理を中断し、および抽出前に温度およびｐＨの明確な条件下で発酵生産物回収培養液を保つステップ
を含む、組換えポリペプチドを調製するための方法。
【請求項２】
発酵生産物回収培養液のさらなる処理を、少なくとも約１時間の長さ中断する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
発酵生産物回収培養液のさらなる処理を、約１時間〜約７２時間の長さ中断する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
発酵生産物回収培養液のさらなる処理を、約１２時間〜約４８時間の長さ中断する請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
発酵生産物回収培養液のさらなる処理を、約１２時間、約２４時間または約４８時間の長さ中断する請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
発酵生産物回収培養液のさらなる処理の中断を、約２℃〜約６５℃の温度で行う請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
発酵生産物回収培養液のさらなる処理の中断を、約４℃〜約２５℃の温度で行う請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
発酵生産物回収培養液のさらなる処理の中断を、約４℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃または約２５℃の温度で行う請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
発酵生産物回収培養液のｐＨ値をステップｂ）の間約４〜約１０の間に保つ請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
発酵生産物回収培養液のｐＨ値をステップｂ）の間約５〜約９の間に保つ請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
発酵生産物回収培養液のｐＨ値をステップｂ）の間約６〜約８の間に保つ請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
発酵生産物回収培養液のｐＨ値をステップｂ）の間約７に保つ請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
発酵生産物回収培養液のさらなる処理を約１２時間、約２４時間または約４８時間の長さ、約４℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃または約２５℃の温度で中断する請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
発酵生産物回収培養液をステップｂ）の前に濃縮する請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
発酵生産物回収培養液を、ステップｂ）の前に遠心分離またはマイクロ濾過によって濃縮する請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ステップｂ）を発酵槽中で行う請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
原核生物宿主細胞がグラム陰性菌である請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
グラム陰性菌が大腸菌種、シュードモナス菌種、腸内細菌種、エルビニア菌種、カンピロバクター菌種、プロテウス菌種、アエロモナス菌種およびビトレオシラ菌種からなる群から選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
グラム陰性菌が大腸菌である請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
組換えポリペプチドが抗体、ホルモンまたは免疫調節剤である請求項１から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
組換えポリペプチドが成長ホルモン、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤または抗体断片である請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
組換えポリペプチドがＦａｂ断片、ヒト成長ホルモン、インターフェロンα−２ｂまたは顆粒球コロニー刺激因子である請求項１から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
実施例への個々の参照と共に本明細書に実質的に記載された通りの方法。
【請求項１】
ａ）周辺質を含み、ポリペプチドの周辺質中への分泌を行うことができる組換え発現系で形質転換された原核生物宿主細胞に発酵生産させ、前記発酵生産は、ポリペプチドが宿主細胞の周辺質中に分泌されるような条件下で発酵生産培地において行うステップ、および
ｂ）発酵生産物回収培養液のさらなる処理を中断し、および抽出前に温度およびｐＨの明確な条件下で発酵生産物回収培養液を保つステップ
を含む、組換えポリペプチドを調製するための方法。
【請求項２】
発酵生産物回収培養液のさらなる処理を、少なくとも約１時間の長さ中断する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
発酵生産物回収培養液のさらなる処理を、約１時間〜約７２時間の長さ中断する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
発酵生産物回収培養液のさらなる処理を、約１２時間〜約４８時間の長さ中断する請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
発酵生産物回収培養液のさらなる処理を、約１２時間、約２４時間または約４８時間の長さ中断する請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
発酵生産物回収培養液のさらなる処理の中断を、約２℃〜約６５℃の温度で行う請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
発酵生産物回収培養液のさらなる処理の中断を、約４℃〜約２５℃の温度で行う請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
発酵生産物回収培養液のさらなる処理の中断を、約４℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃または約２５℃の温度で行う請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
発酵生産物回収培養液のｐＨ値をステップｂ）の間約４〜約１０の間に保つ請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
発酵生産物回収培養液のｐＨ値をステップｂ）の間約５〜約９の間に保つ請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
発酵生産物回収培養液のｐＨ値をステップｂ）の間約６〜約８の間に保つ請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
発酵生産物回収培養液のｐＨ値をステップｂ）の間約７に保つ請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
発酵生産物回収培養液のさらなる処理を約１２時間、約２４時間または約４８時間の長さ、約４℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃または約２５℃の温度で中断する請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
発酵生産物回収培養液をステップｂ）の前に濃縮する請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
発酵生産物回収培養液を、ステップｂ）の前に遠心分離またはマイクロ濾過によって濃縮する請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ステップｂ）を発酵槽中で行う請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
原核生物宿主細胞がグラム陰性菌である請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
グラム陰性菌が大腸菌種、シュードモナス菌種、腸内細菌種、エルビニア菌種、カンピロバクター菌種、プロテウス菌種、アエロモナス菌種およびビトレオシラ菌種からなる群から選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
グラム陰性菌が大腸菌である請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
組換えポリペプチドが抗体、ホルモンまたは免疫調節剤である請求項１から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
組換えポリペプチドが成長ホルモン、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤または抗体断片である請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
組換えポリペプチドがＦａｂ断片、ヒト成長ホルモン、インターフェロンα−２ｂまたは顆粒球コロニー刺激因子である請求項１から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
実施例への個々の参照と共に本明細書に実質的に記載された通りの方法。
【公表番号】特表２００７−５０２６０９（Ｐ２００７−５０２６０９Ａ）
【公表日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２３６０７（Ｐ２００６−５２３６０７）
【出願日】平成１６年８月１９日（２００４．８．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００９３２１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１９４６６
【国際公開日】平成１７年３月３日（２００５．３．３）
【出願人】（３０５００８０４２）サンド・アクチエンゲゼルシヤフト (54)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月１９日（２００４．８．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００９３２１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１９４６６
【国際公開日】平成１７年３月３日（２００５．３．３）
【出願人】（３０５００８０４２）サンド・アクチエンゲゼルシヤフト (54)
【Ｆターム（参考）】
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