組換えマンネンタケ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｉｕｍ）免疫調節タンパク質（ｒＬＺ−８）およびその使用
本発明は、抗腫瘍、白血球数の増加および免疫学的拒絶の阻害等のための、組換えマンネンタケ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｉｕｍ）免疫調節タンパク質（ｒＬＺ−８）の医学的使用に関する。該タンパク質遺伝子配列は、マンネンタケに由来し、そしてピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）の真核生物発現系による組換え発現により適するように再設計された。ｒＬＺ−８の結晶構造（三次および四次構造）は、Ｘ線回折によって得られ、前記結晶構造および関連する機能の組み合わせに基づいて分析を行い、前記構造を有する任意のタンパク質分子は、前記医学的使用を有するという結論が導き出され、これは多数のｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ薬力学的研究によってすでに検証されている。結論として、本発明の組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質は、抗腫瘍薬剤または白血球数を増加させる薬剤または免疫阻害剤として使用可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明は、腫瘍、白血球減少症およびアレルギー性疾患等の適応症のための、真菌免疫調節タンパク質、特に特定の空間的構造を有する組換えマンネンタケ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｉｕｍ）免疫調節タンパク質の医学的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]現存する研究ファイルにおいて、マンネンタケ由来の特定の種類のタンパク質は、制御、赤血球凝集、接着分子の遺伝子調節、アレルギー反応の抑制および免疫抗腫瘍効果を含む広範囲の免疫調節活性を発揮する。
【０００３】
[0003]マンネンタケ属菌糸体の抽出物からの小分子タンパク質の分離および精製は、日本人、キノらによって１９８９年に行われ（Ｋｏｈｓｕｋｅ Ｋｉｎｏら， Ｊ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ． １９８９， １：４７２−４７８）、このタンパク質はＬＺ−８と名付けられ、そのアミノ酸配列および免疫の生理学的活性もまた試験され、ＬＺ−８のタンパク質配列は１１０アミノ酸残基で構成され、アセチル化されており、分子量は１２．４ＫＤであり、そして等電点は４．４であることが示されている。
【０００４】
[0004]本発明者らは、二量体化の形成に必要な重要なＮ末端ドメインおよびＣ末端ＦＮＩＩＩドメインを主に含む、組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質の結晶構造を初めて開示した。前記Ｎ末端ドメインは、αらせん（２−ＳＤＴＡ−ＬＩＦＲＬＡＷＤＶＫ−１５のアミノ酸配列を有し、そして１４アミノ酸からなる）およびβ鎖（１６−ＫＬＳＦＤ−２０のアミノ酸配列を有し、そして５アミノ酸からなる）で構成され、αらせん上のＳｅｒ残基はアセチル化によってブロッキングされている。１つのＬＺ−８単量体のＮ末端αらせんおよびβ鎖は、別のＬＺ−８単量体の同じドメインと一緒に、ドメイン交換を介して、重要なダンベル型の二量体結合ドメインを形成する。Ｃ末端ＦＮＩＩＩドメインは、免疫グロブリン様サンドイッチ構造に属し、そしてそれぞれ、β鎖Ａ−Ｂ−Ｅおよびβ鎖Ｇ−Ｆ−Ｃ−Ｄによって形成される、βシートＩおよびβシートＩＩを含む。研究結果によって、Ｎ末端αらせんＡを通じてホモ二量体を形成し（研究によって、１３のＮ末端アミノ酸残基がＦｉｐのための機能的ホモ二量体を形成するのに非常に必須であることが示された）、前記ホモ二量体を通じてリンパ球に結合し、そしてリンパ球が一連の情報伝達を通じて多様なサイトカインを分泌するように促進することによって、組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質の免疫調節機能が本質的に達成されうることが示された。
【０００５】
[0005]白血球数を増加させる効果を有する、現存する臨床薬剤のうち、組換えコロニー刺激因子（組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子など）が、多様な理由によって引き起こされる白血球減少症または顆粒球減少症、ならびに骨髄抑制治療によって引き起こされる白血球減少症を治療するために用いられる、唯一の遺伝子組換えタンパク質調製物である。長年の臨床適用によって、組換えコロニー刺激因子の優れた効果が証明されたが、これを含有するすべての製品は、「あなたが経験しうる一般的な副作用は、骨および筋肉の痛み、発熱、皮疹、掻痒、腹痛、下痢等です。少数の患者は、顔面紅潮、発汗、血圧低下、血中酸素飽和度低下を含む、最初の投与後の用量反応を経験する可能性もあります。深刻だが稀な副作用には、アレルギー、気管支痙攣、心不全、上室性頻拍症、毛細血管漏出症候群、脳血管疾患、精神異常、痙攣、血圧低下、頭蓋内圧高進、肺浮腫等が含まれます」のような副作用が記されている。
【０００６】
[0006]ＬＺ−８に関する先の報告は、ＬＺ−８が、免疫調節経路を通じて、腫瘍細胞を殺すと示唆した。本発明において、本発明者らは、ｒＬＺ−８が、ＨＬ−６０、ＮＢ４、Ｋ５６２腫瘍細胞を、間接的な免疫調節経路ではなく、直接的経路によって殺すことを見出した。
【０００７】
[0007]マンネンタケ免疫調節タンパク質の主な機能は、末梢リンパ球および脾臓細胞の過形成を刺激し、ヒトおよび動物両方のマクロファージが多様な細胞因子（インターロイキン、腫瘍壊死因子およびインターフェロン等）を分泌するよう誘導し、そして病原体の侵害を防御しそして一掃し、健康を守りそして維持し、そして免疫調節機能を達成する点にある。本発明は、ｒｌＺ−８が全身性アレルギー反応および臓器移植後の免疫拒絶を有効に予防しうることを示唆する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋｏｈｓｕｋｅ Ｋｉｎｏら， Ｊ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ． １９８９， １：４７２−４７８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
[0008]本発明の目的は組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質（ｒＬＺ−８）の結晶構造およびその新規の医学的使用を見出すことである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
[0009]本発明は、生物医薬操作の分野に属し、抗腫瘍、白血球の産生および免疫抑制のための組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質の医学的使用を伴う。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】[0022]ｒＬＺ−８結晶構造を示す図である。。
【図２】[0023]ＮＢ４腫瘍細胞に対するｒＬＺ−８のｉｎ ｖｉｔｒｏの結果。
【図３】[0024]Ｋ５６２腫瘍細胞に対するｒＬＺ−８のｉｎ ｖｉｔｒｏの結果。
【図４−１】[0025]ｒＬＺ−８が誘導するＫ５６２およびＮＢ４細胞のアポトーシス、ＰＩ単染色試験結果。
【図４−２】[0025]ｒＬＺ−８が誘導するＫ５６２およびＮＢ４細胞のアポトーシス、ＰＩ単染色試験結果。
【図５−１】[0026]ｒＬＺ−８が誘導するＨｌ６０およびＮＢ４細胞のアポトーシス、アネキシンＶ／ＰＩ二重染色試験結果。
【図５−２】[0026]ｒＬＺ−８が誘導するＨｌ６０およびＮＢ４細胞のアポトーシス、アネキシンＶ／ＰＩ二重染色試験結果。
【図６】[0027]Ｓ１８０エールリッヒ腹水腫瘍細胞をマウスに接種した際の体重変化。
【図７】[0028]Ｈ２２腫瘍細胞をマウスに接種した際の体重変化。
【図８】[0029]ＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８（１００ｎｇ．ｍｌ−１）ラット心筋組織マーカー（暗、ＤＩＣ視野）。
【図９】[0030]ＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８（１００ｎｇ．ｍｌ−１）ウサギ軟骨細胞マーカー（暗、ＤＩＣ視野）。
【図１０】[0031]ＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８（１００ｎｇ．ｍｌ−１）ＨＬ−６０細胞マーカー（暗、ＤＩＣ視野）。
【図１１】[0032]ｒＬＺ−８によって影響を受けるラット骨髄像。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
[0010]本発明の組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質（ｒＬＺ−８）は、遺伝子操作技術を介した、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における組換え発現によって得られ、そしてｒＬＺ−８のヌクレオチド配列は、天然マンネンタケ免疫調節タンパク質の公表される遺伝子配列（Ｍ５８０３２）にしたがって再設計され、そして人工的に合成される。
【００１３】
[0011]本発明は、Ｘ線回折によって、組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質（ｒＬＺ−８）の結晶構造を初めて得る。前記タンパク質の結晶を培養するための条件は：１．７５Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．０および６．４％ＰＥＧ ４００である。空間群Ｐ３２の単結晶は、ハンギングドロップ蒸気拡散法によって得られた。Ｘ線回折計の回折データ収集系によって、１．８０Å解像度で結晶データを収集した。ＣＣＰ４などのソフトウェアを用いて構造解析を行い、そして相交換を介して結晶構造を得た。各非対称単位において、４つの分子があることが見出され、ここでＮ末端αらせんの間で疎水性相互作用によって、そして逆平行β鎖の間で水素結合によって、２つの分子間に二量体が形成された。単分子のＣ末端は、ＦＮＩＩＩ型免疫グロブリン様フォールディングを有し、このドメインは２つのβシートで構成される。βシートの表面および接合部に、それぞれ、糖結合部位があると推測される。
【００１４】
[0012]ＩＭＤＭ培地を用いて調製した異なる濃度のｒＬＺ−８を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した急性前骨髄球性白血病細胞株ＮＢ４および慢性骨髄性白血球細胞株Ｋ５６２に添加する、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍試験において、ｒＬＺ−８が前記の２つの腫瘍細胞に対して殺傷効果を課すことが明らかに観察され、そしてＭＴＴ法の実験データは、薬剤効果が投薬量に有意に依存することを示した。本発明のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍試験において、精製ｒＬＺ−８をＳ１８０／Ｈ２２所持マウスに連続して１０日間投与し、腹水腫瘍所持マウスを毎日重量測定し、そして頸椎脱臼によって屠殺し、腫瘍を皮下接種したマウスから腫瘍を切除して、そして重量測定し、その後、腫瘍阻害率を計算し、そして薬剤投与前および投与後の血中白血球数を測定した。結果によって、腫瘍に対するｒＬＺ−８の阻害は投薬量に依存することが示された。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験はどちらも、本発明のｒＬＺ−８が優れた抗腫瘍効果を有することを示した。
【００１５】
[0013]本発明において、蛍光色素（フルオレセイン−５−イソチオシアネート、ＦＩＴＣ）を用いてｒＬＺ−８を標識し、ＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８を形成し、これをＨｌ６０細胞、ラット心筋組織およびウサギ軟骨細胞とインキュベーションし、細胞を収集し、そして洗浄し、蛍光顕微鏡観察下で観察すると、ＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８と１時間および６時間インキュベーションしたＨＬ−６０は強い緑色蛍光を持ち、ラット心筋組織およびウサギ軟骨細胞と比較すると、有意な相違がある。これらの結果は、特定の受容体がｒＬＺ−８によって認識されうることを示すのに役立った。ｒＬＺ−８のＣ末端ＦＮＩＩＩドメイン上に２つの炭水化物鎖結合部位があり、そして正常細胞表面上にはいかなるオリゴ糖連結も決して見られていないため、認識機構がＨＬ−６０細胞表面上のオリゴ糖連結に関連しうることが暗示される。これに基づいて、本発明は、ｒＬＺ−８の特異的殺傷効果が、細胞表面上の受容体の認識と関連するためでありうることを示唆する。
【００１６】
[0014]抗腫瘍機構をさらに研究するため、ｒＬＺ−８で処理したＫ５６２およびＨｌ６０細胞のアポトーシス・パーセントを、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色およびアネキシンＶおよびＦＩＴＣ染色を用いたフローサイトメトリーによって測定し、結果によって、細胞のアポトーシスは、ｒＬＺ−８が腫瘍細胞を殺す方式の１つであるという結論が導き出された。
【００１７】
[0015]本発明は、ｒＬＺ−８が白血球減少症を予防しそして治療する際に有効であることを開示する。シクロホスファミドによって引き起こされた白血球減少症を患うラット／マウスに対する治療実験において、ＧｅｎｌｅｉＴＭ ＳｃｉｍａｘＴＭ（組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子注射剤）を陽性薬剤として、通常の生理食塩水で調製されたｒＬＺ−８を、シクロホスファミドによって引き起こされた白血球減少症を患うラットモデルに、連続して７日間投与し、３日目および７日目に、尾静脈血液採取を行い、血液中の白血球数を測定し、治療前および治療後の白血球数相違を比較し、そして薬剤効果を分析した。シクロホスファミド対照群と比較すると、ｒＬＺ−８群ラットにおける白血球数は、投与３日目に非常に増加し、相違は非常に有意であり、そして投与７日目には、白血球数は正常レベルに回復した。
【００１８】
[0016]γ線照射によって引き起こされる白血球減少症を患うマウスに対する治療実験において、正常対照群を除く各群のマウスに、同体積の通常の生理食塩水、陽性薬剤（ＧｅｎｌｅｉＴＭ ＳｃｉｍａｘＴＭ）および異なる用量のｒＬＺ−８を、放射線照射当日から腹腔内注射した。放射線照射条件は：１分あたり１５０レントゲンの用量率で７．５０Ｇｙ、１８０ｍＶ、１５ｍＡであった。投与前、ならびに照射５日目、７日目および９日目に、各群のマウスに対して尾静脈血液採取を行い、そして白血球数を計数した。照射７日後、マウスを重量測定し、そして頸椎脱臼によって屠殺し、脾臓を収集し、そして重量測定し、次いで脾臓指数を計算した。その後、脾臓をブアン液中で固定し、そして６時間後、脾臓表面上の造血巣数（ＣＦＵ−Ｓ）を計数した。γ線照射によって引き起こされる白血球減少症を患うマウスに対する予防実験において、照射５日前に薬剤を投与し、そして続く工程は、上記の治療実験と同じであった。どちらの実験の実験データも、ｒＬＺ−８が、γ線照射によって引き起こされる白血球減少症を予防しそして治療するのに有効であることを示した。
【００１９】
[0017]本発明は、ｒＬＺ−８が溶血効果を生じず、４種のヒト血液型の赤血球に対して凝血効果を課さず、そしてマウス骨髄に異常な変化を引き起こさないことを証明する。
[0018]本発明のｒＬＺ−８は免疫抑制剤として使用可能である。実験において、ｒＬＺ−８がマウスの全身性アナフィラキシー反応を阻害する際に有効であり、そしてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）によって刺激されたマウスに対して、痙攣（ｈｙｐｅｒｓｐａｓｍｉａ）などの陽性反応、運動の減少または死を引き起こさないことが見出された。
【００２０】
[0019]本発明は、活性成分としてｒＬＺ−８を含有する薬学的調製物を調製することを含み、該薬学的調製物は、主に、通常の注射剤、凍結乾燥注射剤、リポソーム注射剤、ターゲット送達注射剤などの非経口投与調製物であり、そして胃腸投与調製物、例えば、錠剤、カプセル、スプレー、ゲル、ゲル吸収剤、経口薬剤、懸濁物、インスタント薬剤、パッチ、丸剤、散剤、注射剤、注入溶液、座薬、希釈調製物、徐放調製物などに調製してもよい。
【００２１】
[0020]本発明の薬学的調製物におけるｒＬＺ−８の内容量は、１〜９９％であり、残りは、デンプン、デキストリン、スクロース、ラクチン、セルロース、ステアリン酸マグネシウム、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｃａｒｂｏｍｅｒ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギン酸ナトリウム、グリセリン、ゼラチン、ポリエチレングリコール、チメロサール、プロピルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、アセトンクロロホルム、安息香酸ナトリウム、ホウ砂、ブロモ−ゲラミン（ｇｅｒａｍｉｎｅ）、ソルビトール、プロパンジオール、イソプロパノール、ラウロカプラム、イソプロパノール／プロパンジオール（１：１）、イソプロパノール／（１：２）およびイソプロパノール／プロパンジオール（２：１）、トリエタノールアミン、水酸化ナトリウム、ワセリン、ステアリン酸、流動パラフィン、ラノリン、オクタデカノール、ヘキサデカノール、モノステアリン酸グリセリル、ラウリル硫酸ナトリウム、Ｓ−６０、ペレガル０、マンニトール、ソルビトール等からなる群より選択される薬学的に許容されうるキャリアーである。
【００２２】
[0021]本発明の薬学的調製物は、分野における慣用的プロセスによって調製可能である。
【実施例】
【００２３】
実施例１ 組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質の獲得
１．合成ｒＬＺ−８遺伝子、遺伝子操作細菌の構築、構築およびスクリーニング
[0033]ピキア・パストリスの遺伝暗号優先性にしたがって、元来のマンネンタケ免疫調節タンパク質遺伝子配列（Ｍ５８０３２）に基づいて、全遺伝子に関して、ＬＺ−８遺伝子（配列１）を再設計しそして合成し、配列１およびＭ５８０３２は、同じアミノ酸配列をコードし、そしてこれらの間の相違は、再設計配列において、ピキア・パストリスの発現系により適したコドンが利用されていることであった。
【００２４】
[0034]配列（配列１）を酵母α因子リーダーペプチドコード配列に連結して融合遺伝子とし、α−ＬＺ−８遺伝子をｐＭＤ１８−Ｔキャリアー内にクローニングし、正しい配列のキャリアーを直線化し、そして酵母遺伝子ゲノム内に導入し、そしてＭＭおよびＭＤプレート上でメタノールを効率的に利用するＭｕｔ＋株をスクリーニングした。
【００２５】
[0035]天然マンネンタケ免疫調節タンパク質（Ｍ５８０３２）のコード配列は：
【００２６】
【化１】
【００２７】
である。
[0036]再設計された組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質（ｒＬＺ−８）のヌクレオチド配列（配列１）は：
【００２８】
【化２】
【００２９】
である。
[0037]前記組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質（ｒＬＺ−８）のアミノ酸配列は：
【００３０】
【化３】
【００３１】
である。
２．ｒＬＺ−８遺伝子操作細菌の発現
[0038]１００Ｌ発酵槽規模発現ｒＬＺ−８条件において、発酵規模の発現、温度、回転速度、ｐＨ値、液体体積、メタノールの補充および他の検出によって、酵母の最適化されたプロセスが確立されている。本発明者らは、ｒＬＺ−８の物理的および化学的特性にしたがって、パイロット発酵培地配合物を設計した。ｒＬＺ−８アウトプットは約８００ｍｇ・Ｌ−１である。
【００３２】
３． ｒＬＺ−８の精製プロセス
[0039]発酵ブロス遠心分離装置→上清管状分離装置→限外ろ過→陽イオン交換カラム精製→ターゲットタンパク質調製のためのＡＫＴＡタンパク質精製ワークステーション→強陰イオン交換クロマトグラフィー精製→疎水性相互作用カラム→ゲルろ過クロマトグラフィー。
【００３３】
４． ＲＬＺ−８純度および分子量決定
[0040]ＲＰ−ＨＰＬＣを用いた分離および精製の純度分析によると、ｒＬＺ−８の純度は＞９９％である。組換え発現のｒＬＺ−８分子量のレーザー飛行質量分析の評価は１２，７２２Ｄａである。
【００３４】
５． ｒＬＺ−８のより高次の空間的構造の決定
[0041]空間群Ｐ３２の単結晶をハンギングドロップ水蒸気拡散法によって得て、培養条件は：１．７５Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．０および６．４％ ＰＥＧ ４００であった。ＭａｒＲｅｓｅａｒｃｈ ３４５ ｄｔｄ回折データ収集系によって、１．８０Å解像度でｒＬＺ−８のＸ線回折データを収集した。ＣＣＰ４などのソフトウェアを用いて、構造解析を行い、そして相交換によって結晶構造を得た。結晶ｒＬＺ−８の構造は、簡潔に、以下のように記載された：ＬＺ−８の構造は、二量体化の形成に必要な重要なＮ末端ドメイン、およびＣ末端ＦＮＩＩＩドメインを含む。前記Ｎ末端ドメインは、αらせん（２−ＳＤＴＡ−ＬＩＦＲＬＡＷＤＶＫ−１５のアミノ酸配列を有し、そして１４アミノ酸からなる）およびβ鎖（１６−ＫＬＳＦＤ−２０の配列を有し、そして５アミノ酸からなる）で構成され、αらせん上のＳｅｒ残基はアセチル化によってブロッキングされる。１つのＬＺ−８単量体のＮ末端αらせんおよびβ鎖は、別のＬＺ−８単量体の同じドメインと一緒に、ドメイン交換を介して、重要なダンベル型の二量体結合ドメインを形成する。Ｃ末端ＦＮＩＩＩドメインは、免疫グロブリン様サンドイッチ構造に属し、そして図１に示すように、それぞれ、β鎖Ａ−Ｂ−Ｅおよびβ鎖Ｇ−Ｆ−Ｃ−Ｄによって形成される、βシートＩおよびβシートＩＩを含み、β鎖の配列は、Ａ． ２１−ＴＰＮＷＧＲＧ−２７； Ｂ． ３４−ＩＤＴＶＴＦＰ−３９； Ｃ． ４８−ＹＴＹＲＶＡＶ−５４； Ｄ． ５７−ＲＮＬＧＶＫＰ−６３； Ｅ． ７２−ＳＱＫＶＮ−７６； Ｆ． ９１−ＴＩＱＶＦＶＶＤＰＤ−１００； Ｇ． １０２−ＮＮＤＦＩＩＡＱＷ−１１０であった。
【００３５】
実施例２：ヒト前骨髄球性白血病ＮＢ４細胞に対するｒＬＺ−８の殺傷効果
１．実験試薬
[0042]ろ過および病原菌除去後、ＩＭＤＭ培地を用いて、それぞれ、０．７８μｇ・ｍｌ−１、１．５６μｇ・ｍｌ−１、３．１２５μｇ・ｍｌ−１、６．２５μｇ・ｍｌ−１、１２．５μｇ・ｍｌ−１、２５μｇ・ｍｌ−１、５０μｇ・ｍｌ−１、１００μｇ・ｍｌ−１である８つの濃度を調製した。
【００３６】
２．実験法
[0043]９６穴培地プレート上、パイロット穴には、ＮＢ４腫瘍細胞０．１ｍｌおよび低濃度から高濃度のｒＬＺ−８ ０．１ｍｌを加え；陰性対照群には、ＮＢ４腫瘍細胞および培地それぞれ０．１ｍｌを加え；陽性薬剤対照群には亜ヒ酸Ａｓ２Ｏ３を加え；各群に関して、複数の穴として６穴作製する。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中に４８時間入れ、終結４時間前に、ＭＴＴ１５μｌ（５ｍｇ ｍｌ−１）を添加し、１００μｌの０．１ｍｏｌ Ｌ−１塩酸イソプロピルアルコールを添加することによる細胞培養の終結後、酵素結合免疫吸着法で、ＯＤ５７０ｎｍ値に関して試験した。
【００３７】
３．実験結果
[0044]表１および図１は、ｒＬＺ−８薬剤群およびＮＢ４正常対照群のＯＤ５７０ｎｍ吸光値を示し、ｒＬＺ−８はＮＢ４腫瘍細胞に対して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで強い致死効果を有する、有意な相違がある。
【００３８】
表１ ＮＢ４腫瘍細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏのｒＬＺ−８の致死効果
【００３９】
【化４】
【００４０】
【表１】
【００４１】
ＮＢ正常対照群と薬剤群の比較、＊ｐ＜０．０１
実施例３：ヒト慢性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞に対するｒＬＺ−８の致死効果
１．実験試薬
[0045]ｒＬＺ−８の滅菌後、ＩＭＤＭ培地を用いて、それぞれ、３．１２５μｇ・ｍｌ−１、６．２５μｇ・ｍｌ−１、１２．５μｇ・ｍｌ−１、２５μｇ・ｍｌ−１、５０μｇ・ｍｌ−１、１００μｇ・ｍｌ−１である６つの濃度を調製した。
【００４２】
２．実験法
[0046]９６穴培地プレート上、パイロット穴には、Ｋ５６２腫瘍細胞０．１ｍｌおよび低濃度から高濃度のｒＬＺ−８ ０．１ｍｌを加え；陰性対照群には、Ｋ５６２腫瘍細胞および培地それぞれ０．１ｍｌを加え；陽性薬剤対照群には亜ヒ酸Ａｓ２Ｏ３を加え；各群に関して、複数の穴として６穴作製する。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中に４８時間入れ、終結４時間前に、ＭＴＴ１５μｌ（５ｍｇ ｍｌ−１）を添加し、１００μｌの０．１ｍｏｌ Ｌ−１塩酸イソプロピルアルコールを添加することによる細胞培養の終結後、酵素結合免疫吸着法で、ＯＤ５７０ｎｍ値を試験した。
【００４３】
３．実験結果
[0047]表２および図３は、ｒＬＺ−８薬剤群およびＫ５６２正常対照群のＯＤ５７０ｎｍ吸光値を示し、ｒＬＺ−８はＫ５６２腫瘍細胞に対して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで強い致死効果を有する、有意な相違がある。
【００４４】
表２ 腫瘍細胞Ｋ５６２に対するｉｎ ｖｉｔｒｏのｒＬＺ−８の致死効果
【００４５】
【化５】
【００４６】
【表２】
【００４７】
Ｋ５６２正常対照群と薬剤群の比較、＊ｐ＜０．０１
実施例４：血液腫瘍細胞のアポトーシスに対するｒＬＺ−８の影響
１． ＰＩ単染色フローサイトメトリー
１．１ 実験装置および細胞株
[0048]蛍光顕微鏡、モデルＬｅｉｃａ ＡＳＬＭＤ、Ｋ５６２、ＮＢ４。
【００４８】
１．２ 実験試薬
[0049]ｒＬＺ−８は、それぞれ、高用量、中用量および低用量の３つの群に分類され、ここで本発明者らは、２％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭ培地を用いて、２．５μｇ・ｍｌ−１、０．５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ・ｍｌ−１の調製物に調製した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）５０μｇ・ｍｌ−１。
【００４９】
１．３ 実験群分け
[0050]正常対照群、陽性薬剤対照群（Ａｓ２Ｏ３）、ｒＬＺ−８低用量群（０．１μｇ・ｍｌ−１）、ｒＬＺ−８中用量群（０．５μｇ・ｍｌ−１）、ｒＬＺ−８高用量群（２．５μｇ・ｍｌ−１）としてＫ５６２を確立し；正常対照群、ｒＬＺ−８低用量群（０．１μｇ・ｍｌ−１）、ｒＬＺ−８中用量群（０．５μｇ・ｍｌ−１）、ｒＬＺ−８高用量群（２．５μｇ・ｍｌ−１）としてＮＢ４をセットする。
【００５０】
１．４ 実験法
[0051]Ｋ５６２およびＮＢ４細胞を、それぞれ、２４穴プレート内で混合し、そして１ｍｌ／穴の異なる濃度のｒＬＺ−８を供給し、各群に関して、複数の穴として３穴セットする。これらを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中に２４時間入れ、各濃度の細胞を収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、そして細胞密度を１×１０６／ｍｌに調節して、７０％氷冷エタノールで固定し、−２０℃に調整し、そして一晩放置する。細胞を固定した後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＩ（最終密度５０μｇ・ｍｌ−１）を室温で添加し、そして１０分間、遮光してインキュベーションし、１０００ｒ・分−１で５分間遠心分離し、上清を使い捨て器具で除去し、沈殿物を４００μｌのＰＢＳに再懸濁する。そしてコンピュータ上で１時間試験する。
【００５１】
１．５ 実験結果
[0052]表３および図４は、Ｋ５６２およびＮＢ４正常対照群と比較すると、ｒＬＺ−８薬剤群のアポトーシス率が増加していることを示し、本発明者らは、細胞のアポトーシスが、ｒＬＺ−８が腫瘍細胞を殺す方法の１つであるという結論を導き出しうる。
【００５２】
表３ Ｋ５６２およびＮＢ４に対してｒＬＺ−８が誘導するアポトーシス率（％）
【００５３】
【表３】
【００５４】
２．アネキシンＶ−ＦＩＴＣフローサイトメトリー・キットは、細胞のアポトーシスを試験する
２．１ 実験装置および細胞株
[0053]ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー、Ｕ．Ｓ． Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、ＮＢ４、ＨＬ−６０。
【００５５】
２．２ 実験試薬
[0054]２％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭ培地を用いて、０．１μｇ・ｍｌ−１、０．５μｇ・ｍｌ−１、２．５μｇ・ｍｌ−１の調製物にｒＬＺ−８を調製、０．５μｇ・ｍｌ−１の亜ヒ酸（Ａｓ２Ｏ３）。アネキシンＶ−ＦＩＴＣキット：緩衝溶液４×を合わせる；ヨウ化プロピジウム溶液（ＰＩ）２０μｇ・ｍｌ−１、０．２ｍｌ。
【００５６】
２．３ 実験群分け
[0055]ＮＢ４正常対照群、陽性薬剤群（Ａｓ２Ｏ３、０．５μｇ・ｍｌ−１）、タンパク質低用量群（０．１μｇ・ｍｌ−１）、中用量群（０．５μｇ・ｍｌ−１）、高用量群（２．５μｇ・ｍｌ−１）を確立し；ＨＬ−６０正常対照群、タンパク質低用量群（０．１μｇ・ｍｌ−１）、中用量群（０．５μｇ・ｍｌ−１）、高用量群（２．５μｇ・ｍｌ−１）を確立する。
【００５７】
２．４ 実験法
[0056]ＮＢ４およびＨＬ−６０細胞を、それぞれ、２４穴プレート内で混合し、１ｍｌ／穴の異なる濃度のｒＬＺ−８を供給し、各群に関して、複数の穴として３穴セットする。これらを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中に２４時間入れ、各濃度の細胞を収集し、あらかじめ４℃に冷却したＰＢＳで細胞を２回洗浄し、２５０μｌの結合緩衝溶液で細胞を再懸濁し、そして細胞密度を１×１０６／ｍｌに調節して、１００μｌを５ｍｌフローサイトメトリー用チューブに取り、そして５μｌアネキシンＶ／ＦＩＴＣおよび１０μｌの２０μｇ・ｍｌ−１ ＰＩ溶液を添加し、混合した後、室温に置いて、そして１５分間、遮光してインキュベーションし、４００μｌ ＰＢＳを添加してフローサイトメトリー分析する。
【００５８】
２．５ 実験結果
[0057]図５および表４は、ＮＢ４−ｒＬＺ−８群およびＨＬ−６０−ｒＬＺ−８群において、アポトーシス率が正常対照群より有意に高く、そしてＨＬ−６０−ｒＬＺ−８群のアポトーシスがまた、ｒＬＺ−８濃度が増加するにつれて上昇することを示す。
【００５９】
表４ ＮＢ４およびＨＬ−６０細胞に対するｒＬＺ−８誘導性アポトーシス率（％）
【００６０】
【表４】
【００６１】
実施例５：マウスＳ１８０エールリッヒ腹水腫瘍に対するｒＬＺ−８による阻害実験
１．実験材料
[0058]吉林大学実験動物センターより提供されたマウス、１８〜２２ｇの雄および雌を等しく分けた；本発明者らの研究室によって提供されたマウス・エールリッヒ腹水細胞株Ｓ１８０；Ｊｉａｎｇｓｕ Ｈｅｎｇｒｕｉ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．によって提供されたシクロホスファミド（ＣＴＸ）、ロット番号：０６１０１９２１。実験群中のＳ１８０腹水腫瘍および固形腫瘍を、正常対照群、陰性対照群、陽性対照群、ｒＬＺ−８低用量治療群（０．２５ｍｇ・ｋｇ−１）、ｒＬＺ−８中用量治療群（０．５ｍｇ・ｋｇ−１）、ｒＬＺ−８高用量治療群（１ｍｇ・ｋｇ−１）に分けた。各群１０匹のマウス。
【００６２】
２．実験法
[0059]Ｓ１８０皮下腫瘍阻害実験法：よく増殖しているＳ１８０細胞を選択し、滅菌生理食塩水で適切に希釈して腫瘍細胞懸濁物にし、１０７・Ｌ−１の細胞数で、各マウスの右の脇の下に０．２ｍｌ皮下接種する（正常対照群を除く）。接種の２４時間後に治療する。正常対照群および陰性対照群には、一匹あたり生理食塩水０．２ｍｌ・ｄ−１を腹腔内注射し；陽性対照群には、シクロホスファミド２０ｍｇ・ｋｇ−１、一匹あたり０．２ｍｌ・ｄ−１を腹腔内注射した。ｒＬＺ−８治療群には、それぞれ尾静脈注射で、一匹あたり０．２ｍｌ・ｄ−１の用量を連続１０日間投与した。投薬のそれぞれ１０日前および１０日後に、眼窩静脈叢から血液を抜き取り、吉林大学第一病院臨床実験室に送り、試験して、そしてＷＢＣ数を分析した。投薬中止翌日にすべてのマウスを頸椎脱臼によって殺し、解剖して、そして腫瘍を取り出し、腫瘍の重量を測定し、以下の等式を用いて阻害率を計算する：
[0060]阻害率（％）＝（対照群の平均腫瘍重量−実験群の平均腫瘍重量）／対照群の平均腫瘍重量×１００％
[0061]Ｓ１８０腹水腫瘍阻害実験法：よく増殖しているＳ１８０細胞を選択し、滅菌生理食塩水で適切に希釈して腫瘍細胞懸濁物にし、１０７・Ｌ−１の細胞数で、各マウスに０．２ｍｌ腹腔内接種する（正常対照群を除く）。接種の２４時間後に治療する。正常対照群および陰性対照群には、一匹あたり生理食塩水０．２ｍｌ・ｄ−１を腹腔内注射し；陽性対照群には、シクロホスファミド２０ｍｇ・ｋｇ−１、一匹あたり０．２ｍｌ・ｄ−１を腹腔内注射した。ｒＬＺ−８治療群には、それぞれ尾静脈注射で、一匹あたり０．２ｍｌ・ｄ−１の用量を連続１０日間投与した。毎日重量測定し、マウスの重量変化を観察し、重量増殖曲線を描く。
【００６３】
３．実験結果：
[0062]Ｓ１８０皮下腫瘍阻害実験結果：表５からわかるように、ｒＬＺ−８の３つの用量は、Ｓ１８０の増殖を阻害可能であり、阻害率は１６．８％、２５．７％および４５．５％である。ｒＬＺ−８治療群の腫瘍重量を陰性対照群と比較すると、非常に有意な相違（ｐ＜０．０１）がある。
【００６４】
[0063]表６からわかるように、投薬前、マウスにおけるＷＢＣ数は、すべての群で同じレベルであり、陰性対照群と比較して、相違は示されなかった（ｐ＞０．０５）。治療１０日後、陰性対照群ＷＢＣ数は正常対照群より高く、ｒＬＺ−８低用量群および中用量群ＷＢＣ数および陰性対照群は相違を示さず（ｐ＞０．０５）、高用量群および正常対照群でもまた相違はなく（ｐ＞０．０５）、陽性対照群のＷＢＣ数は有意に減少し、そして正常対照群および陰性対照群と比較すると、大きな相違があった（ｐ＜０．０１）。
【００６５】
表５． マウス移植Ｓ１８０腫瘍に対するｒＬＺ−８の阻害効果
【００６６】
【化６】
【００６７】
【表５】
陰性対照群との比較、＊Ｐ＜０．０１
表６． マウス移植Ｓ１８０腫瘍の白血球に対するｒＬＺ−８の影響
【００６８】
【化７】
【００６９】
【表６】
陰性対照群との比較、＊ｐ＜０．０１；＊＊ｐ＞０．０５
[0064]Ｓ１８０腹水腫瘍阻害実験結果：実験結果によって、すべての群のマウス腹水は、基本的に同時に現れ、陰性対照群のマウス体重は迅速に増加し、生存時間は減少することが示された。図６から、ｒＬＺ−８群のマウスでは正常群より平均体重が増加するが、陰性対照群よりも比較的小さい傾向がわかる。ｒＬＺ−８は、ある程度まで、マウス腹腔Ｓ１８０腫瘍細胞増殖を阻害したことに注目されたい。
【００７０】
実施例６： マウス肝癌細胞Ｈ２２に対するｒＬＺ−８による阻害実験
１．実験材料
[0065]吉林大学実験動物センターより提供されたマウス、１８〜２２ｇの雄および雌を等しく分けた。本発明者らの研究室によって提供されたマウス肝癌細胞株Ｈ２２。Ｊｉａｎｇｓｕ Ｈｅｎｇｒｕｉ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．によって提供されたシクロホスファミド（ＣＴＸ）、ロット番号：０６１０１９２１。
【００７１】
２．実験法
[0066]Ｈ２２肝癌細胞実験群を、正常対照群、陰性対照群、陽性対照群、ｒＬＺ−８低用量治療群（０．２５ｍｇ・ｋｇ−１）、ｒＬＺ−８中用量治療群（０．５ｍｇ・ｋｇ−１）、ｒＬＺ−８高用量治療群（１ｍｇ・ｋｇ−１）に分けた。各群１０匹のマウス。
【００７２】
[0067]Ｈ２２皮下腫瘍阻害実験法：よく増殖しているＨ２２細胞を選択し、滅菌生理食塩水で適切に希釈して腫瘍細胞懸濁物にし、１０７・Ｌ−１の細胞数で、各マウスの右の脇の下に０．２ｍｌ皮下接種する（正常対照群を除く）。接種の２４時間後に治療する。正常対照群および陰性対照群には、一匹あたり生理食塩水０．２ｍｌ・ｄ−１を腹腔内注射し；陽性対照群には、シクロホスファミド２０ｍｇ・ｋｇ−１、一匹あたり０．２ｍｌ・ｄ−１を腹腔内注射した。ｒＬＺ−８治療群には、それぞれ尾静脈注射で、一匹あたり０．２ｍｌ・ｄ−１の用量を連続１０日間投与した。投薬のそれぞれ１０日前および１０日後に、眼窩静脈叢から血液を抜き取り、吉林大学第一病院臨床実験室に送り、試験して、そしてＷＢＣ数を分析した。投薬中止翌日にすべてのマウスを頸椎脱臼によって殺し、解剖して、そして腫瘍を取り出し、腫瘍の重量を測定し、以下の等式を用いて阻害率を計算した：
[0068]阻害率（％）＝（対照群の平均腫瘍重量−実験群の平均腫瘍重量）／対照群の平均腫瘍重量×１００％
[0069]Ｈ２２腹水腫瘍阻害実験法：よく増殖しているＨ２２細胞を選択し、滅菌生理食塩水で適切に希釈して腫瘍細胞懸濁物にし、１０７・Ｌ−１の細胞数で、各マウスに０．２ｍｌ腹腔内接種する（正常対照群を除く）。接種の２４時間後に治療する。正常対照群および陰性対照群には、一匹あたり生理食塩水０．２ｍｌ・ｄ−１を腹腔内注射し；陽性対照群には、シクロホスファミド２０ｍｇ・ｋｇ−１、一匹あたり０．２ｍｌ・ｄ−１を腹腔内注射した。ｒＬＺ−８治療群には、それぞれ尾静脈注射で、一匹あたり０．２ｍｌ・ｄ−１の用量を連続１０日間投与した。毎日重量測定し、マウスの重量変化を観察し、重量増殖曲線を描く。
【００７３】
３．実験結果：
[0070]Ｈ２２皮下腫瘍阻害実験結果：表７からわかるように、ｒＬＺ−８の３つの用量群は、Ｓ１８０の増殖を阻害可能であり、阻害率は１６．７％、３０．０％および４２．５％であった。ｒＬＺ−８治療群の腫瘍重量を陰性対照群と比較すると、非常に有意な相違（ｐ＜０．０１）がある。
【００７４】
表７． マウス移植腫瘍Ｈ２２に対するｒＬＺ−８の阻害効果
【００７５】
【化８】
【００７６】
【表７】
陰性群との比較、＊ｐ＜０．０１
[0071]表８からわかるように、投薬前、これらの群におけるマウスのＷＢＣ数は、陰性対照群と比較して、同じレベルであり、相違は示されなかった（ｐ＞０．０５）。治療１０日後、陰性対照群ＷＢＣ数は正常対照群のものより高く、ｒＬＺ−８低用量群および中用量群ＷＢＣ数ならびに陰性対照群のものは相違を示さず（ｐ＞０．０５）、高用量群を正常対照群と比較すると相違はなく（ｐ＞０．０５）、陽性対照群のＷＢＣ数は、正常対照群および陰性対照群と比較すると、有意に減少し、有意に相違があった（ｐ＜０．０１）。
【００７７】
表８． マウス移植腫瘍Ｈ２２の白血球に対するｒＬＺ−８の影響
【００７８】
【化９】
【００７９】
【表８】
陰性群との比較、＊ｐ＜０．０１；＊＊ｐ＞０．０５
[0072]Ｈ２２腹水腫瘍阻害実験結果：結果によって、マウスのｒＬＺ−８群が陰性対照群より長く生き残り、陰性対照群のマウスは食欲の喪失を示したが、重量は迅速に増加し、そして運動は減少したことがわかった。図７から、ｒＬＺ−８群では、マウスの体重増加は平均して正常群より大きいが、陰性対照群より少ないことがわかる。これは、ｒＬＺ−８がマウス腹腔内Ｈ２２腫瘍細胞増殖をある程度阻害したことを示す。
【００８０】
実施例７： ｒＬＺ−８蛍光標識、ならびに正常組織細胞およびＨｌ−６０細胞に対するその影響
１． ＦＩＴＣ標識のｒＬｚ−８蛍光
１．１ 実験試薬および装置
[0073]蛍光色素（フルオレセイン−５−イソチオシアネート、ＦＩＴＣ）、ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ（上海）；ジメチルスルホキシド；炭酸緩衝溶液（ｐＨ８〜９．５）（Ｎａ２ＣＯ３ ４．３ｇ、ＮａＨＣＯ３ ８．６ｇ、ｄｄＨ２Ｏを５００ｍｌまで添加）；リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；脱塩Ｈｉｐｒｅｐ ２６／１０脱塩カラム；ＡＫＴＡ精製装置；Ｈｉｔａｃｈｉモデルとしての分光光度計。
【００８１】
１．２ 実験法
[0074]精製ｒＬＺ−８（７．５ｍｇ・ｍｌ−１）２０ｍｌと炭酸緩衝液（ｐＨ８．３）を混合して、一晩透析し、３．７５ｍｇ ＦＩＴＣを重量測定し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）３．７５ｍｌを添加してＦＩＴＣ−ＤＭＳＯ溶液とする。まず、ｒＬＺ−８を小さい５０ｍｌビーカーに入れ、そして次いで、ＦＩＴＣ−ＤＭＳＯ溶液滴をｒＬＺ−８溶液内に混合して、そしてＰＢＳで３０ｍｌに増加させ、磁気スターラーを用いて室温および遮光化で４時間攪拌し、ＡＫＴＡ精製系において、脱塩Ｈｉｐｒｅｐ ２６／１０でカラムを脱塩して、遊離フルオレセインを除去し、７５ｍｌのＰＢＳで溶出し、２８０ｎｍ、４９５ｎｍで検出し、そしてピークを収集する。
【００８２】
１．３ 実験結果：
[0075]調製したＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８（１０倍希釈）を２２０ｎｍ〜５２０ｎｍでスキャンすると、Ａ４９５＝０．４４５、Ａ２８０＝０．６７であり、タグ効率（Ｆ／Ｐ）を計算すると３．８０である。
【００８３】
２． ラット心筋組織に対する標識の影響
２．１ 実験試薬および装置
[0076]Ｌｅｉｃａ ＣＭ１８５０凍結切片作製装置；ウィスターラット；蛍光顕微鏡８０ｉ（Ｎｉｋｏｎ）；等張ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）；ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）；ＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８は本発明者らの研究室で調製される。
【００８４】
２．２ 実験法
[0077]ラットの首を切断し、そして殺し、そして心臓を取り出し、切片作製のために−２０℃に温度が低下するまで、これらを凍結マイクロトームに入れ、そして心筋およびＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８溶液（１００ｎｇ・ｍｌ−１）のＰＢＳ調製物を合わせて３７℃で１時間インキュベーションし、蛍光顕微鏡下で観察し、ブランク対照群を確立した。
【００８５】
２．３ 実験結果：
[0078]心筋組織の蛍光顕微鏡観察下、可視蛍光はなく、ブランク対照群と比較すると、相違はなかった。図８を参照されたい。
【００８６】
３． ウサギ軟骨細胞の初代培養に対する標識の影響
３．１ 実験試薬および装置
[0079]日本白ウサギ（雄、２．５ｋｇ）４匹；手術器具；０．２５％トリプソゲン＋０．０２％ＥＤＴＡ；０．２％コラゲナーゼ；Ｄ−Ｈａｎｋｓ；ＩＭＤＭ培地（５０ｍｌ・ｍｌ−１、ビタミンＣ、二重抗体）；０．０２５ｍｇ・ｍｌ−１ポリリジン溶液；注射用滅菌水（ＷＦＩ）。
【００８７】
３．２ 実験法
[0080]実験動物を固定し、そして空気塞栓によって死亡させ、腹部の中央の皮を剥ぎ、そして肢を暴露し、筋膜をはさみで切り、長骨から背骨を外し、大まかに余分なものを削りながら、膝全体、臀部および肩の骨を注意深く取り除き、Ｄ−Ｈａｎｋｓ内に浸した。組織を入れたビーカーを超清潔装置内に移し、削ってそしてきれいにした後、組織を第二の滅菌Ｄ−Ｈａｎｋｓカップ内に移し；ナイフを組み立て、軟骨の薄い層を取り除き、カーブしたピンセットを用いて、６ｃｍ培養インキュベーター内に移し、Ｄ−Ｈａｎｋｓで３回洗浄し、Ｄ−Ｈａｎｋｓの大部分を廃棄し、眼科用はさみを用いて、軟骨を１ｍｍスライスに切り、Ｄ−Ｈａｎｋｓの大部分を廃棄し、壊れた骨片をすくって取り除き、１０ｃｍ２培養フラスコ内に入れ、消化のため、トリプソゲンＥＤＴＡと３７℃で３０分間混合し；トリプソゲンをコラゲナーゼと置き換え、３７℃のインキュベーターに入れ、１時間ごとに取り出してそして５分間振盪し、４〜４．５時間で消化を終了する。これを調製して細胞懸濁物溶液として、そしてＦＢＳ １５％を含有する３ｍｌ ＩＭＤＭと混合し、５×１０４・ｍｌ−１を培養フラスコ内に接種する。
【００８８】
[0081]２４穴プレート上、細胞を０．５ｍｌ／穴で播種し、ブランク対照群を確立し、最終濃度０．２５μｇ・ｍｌ−１ ＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８ ０．５ｍｌと３７℃で１時間インキュベーションし、細胞を１．５ｍｌ ＥＰ遠心分離（１０００ｒ・分−１、７分間）内に移し、等張ＰＢＳで３回洗浄し、ＥＰ試験管を０．１ｍｌ ＰＢＳと混合し、細胞を再懸濁し、懸濁物をチェックして、蛍光顕微鏡下で観察を行う。
【００８９】
３．３ 実験結果：
[0082]蛍光顕微鏡下で観察すると、ウサギの軟骨細胞型は損なわれておらず（ｉｎｔａｃｔ）、緑色蛍光を伴わず、対照群と比較して、有意な相違はなかった。実験群の写真を図９に示す。
【００９０】
４． Ｈｌ−６０細胞の標識の影響
４．１ 実験試薬および装置
[0083]蛍光顕微鏡８０ｉ（Ｎｉｋｏｎ）、ＩＭＤＭ細胞培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、ＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８および等張ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）を本発明者らの研究室で調製した。
【００９１】
４．２ 実験法
[0084]２４穴プレート上、各穴０．５ｍｌで、２×１０６を接種することによって、ＨＬ−６０を播種し、ＩＭＤＭ（２％ＦＢＳ）培地でＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８を１００ｎｇ・ｍｌ−１に調製し、各穴０．５ｍｌでインキュベーションし（３７℃）、対照群、実験群１時間および実験群６時間を確立し、細胞を１時間および６時間でそれぞれ抜き取って、１．５ｍｌ ＥＰ試験管内で混合し、１０００ｒ・分−１で遠心分離し、上清を除去し、ＦＢＳで３回洗浄し、洗浄後に再懸濁する。
【００９２】
４．３ 実験結果
[0085]図１０は、蛍光顕微鏡下で観察したものであり、１時間および６時間、ＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８とともにＨＬ−６０細胞をインキュベーションしたものでは強い緑色蛍光を伴い、６時間群では、細胞の凝集があるが、ブランク対照群では、前者に比較して、緑色蛍光はなく、有意な相違がある。
【００９３】
実施例８： マウスにおける白血球の予防におけるｒＬＺ−８の影響
１． 薬剤調製
[0086]滅菌生理食塩水のｒＬＺ−８調製。これらを５μｇ・ｋｇ−１、２．５μｇ・ｋｇ−１、１．２５μｇ・ｋｇ−１、０．６２μｇ・ｋｇ−１用量群、０．２ｍｌ／片に分けた。
【００９４】
[0087]ＧｅｎｌｅｉＴＭ ＳｃｉｍａｘＴＭ［組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子注射剤（ｒｈＧ−ＣＳＦ）］、製造ロット番号：２００６０４０３；７５μｇ／片を通常の滅菌生理食塩水で調製して、３．２μｇ・ｋｇ−１、０．２ｍｌ／片の調製物にした。
【００９５】
[0088]注射用のシクロホスファミド（ＣＴＸ）（製造ロット番号０７１２１８２１；２００ｍｇ／バイアル）を通常の滅菌生理食塩水で調製して、１２．５ｍｇ・ｋｇ−１、０．２ｍｌ／片の調製物にした。
【００９６】
[0089]３ｍｌ氷酢酸を取り、そしてＨ２Ｏを１００ｍｌまで添加し、次いで、生じた溶液をろ過することによって、酢酸の３％溶液を調製する。
２ 実験法
[0090]マウスを７つの群に分け、そして各群は５匹の雄マウスおよび５匹の雌マウスを含む。同一体積の通常の滅菌生理食塩水を投与した正常対照群のマウスを除いて、各群の各マウスに、１日１回３日間の腹腔内注射を通じて、０．２ｍｌのシクロホスファミド溶液（１２．５ｍｇ・ｋｇ−１）を連続投与した。尾静脈血液試料採取を３日目に行い、血液中の白血球数を顕微鏡下で測定した。モデリングに成功した後、同一体積の滅菌生理食塩水を投与した、正常対照群のマウスおよびシクロホスファミド（ＣＴＸ）治療群のマウスを除いて、各群の前記各マウスを、対応する用量のｒＬＺ−８および陽性薬剤（ＧｅｎｌｅｉＴＭ ＳｃｉｍａｘＴＭ）で治療した。尾静脈血を治療の３日目、７日目、１４日目に、それぞれ収集する。治療前および後の白血球数相違を比較し、そして薬剤効果を分析した。
【００９７】
[0091]白血球数を計数するための方法：赤血球を溶解させるため、３％酢酸溶液で、血液を２０倍希釈する。生じた溶液を白血球計数セル内に滴下し、そして顕微鏡下で白血球数を計数し、そして白血球数／ｍｍ３を計算した。
【００９８】
３ 実験結果
[0092]表９からわかるように、ＣＴＸ群と比較すると、マウスにおけるｒＬＺ−８薬剤群の治療３日目、有意により多いＷＢＣがあり、相違は非常に有意であり、ＷＢＣは治療７日目に回復する。
【００９９】
表９ 低インターロイキンマウスモデルに対するｒＬＺ−８の影響
【０１００】
【化１０】
【０１０１】
【表９】
比較は、ＣＰ対照群間である、＊Ｐ＜０．０１
実施例９： ラットにおける白血球の治療におけるｒＬＺ−８の影響
１． 薬剤調製
[0093]滅菌生理食塩水のｒＬＺ−８調製。これらを２０μｇ・ｋｇ−１、１０μｇ・ｋｇ−１、５μｇ・ｋｇ−１、２．５μｇ・ｋｇ−１、１．２５μｇ・ｋｇ−１、０．６２５μｇ・ｋｇ−１、０．３１μｇ・ｋｇ−１用量群に分けた。
【０１０２】
[0094]ＧｅｎｌｅｉＴＭ ＳｃｉｍａｘＴＭ［組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子注射剤（ｒｈＧ−ＣＳＦ）］、製造ロット番号：２００７１１０４；１５０μｇ／片を通常の滅菌生理食塩水で調製して、９．４５μｇ・ｍｌ−１、０．１ｍｌ／片の調製物にした。
【０１０３】
[0095]注射用のシクロホスファミド（ＣＴＸ）（製造ロット番号０７１２１８２１；２００ｍｇ／バイアル）を通常の滅菌生理食塩水で調製して、４９ｍｇ・ｋｇ−１、０．２ｍｌ／片にした。
【０１０４】
[0096]３ｍｌ氷酢酸を取り、そしてｄＨ２Ｏを１００ｍｌまで添加し、次いで、生じた溶液をろ過することによって、酢酸の３％溶液を調製する。
２ 実験法
[0097]ラットを１０群に分け、そして各群は５匹の雄ラットおよび５匹の雌ラットを含む。同一体積の通常の滅菌生理食塩水を投与した正常対照群のラットを除いて、各群の各ラットに、１日１回３日間の腹腔内注射を通じて、０．２ｍｌのシクロホスファミド溶液（４９ｍｇ・ｋｇ−１）を連続投与した。尾静脈血液試料採取を３日目に行い、血液中の白血球数を顕微鏡下で計数した。モデリングに成功した後、同一体積の滅菌生理食塩水を投与した、正常対照群のラットおよびシクロホスファミド（ＣＴＸ）治療群のラットを除いて、各群の前記各ラットを、対応する用量のｒＬＺ−８および陽性薬剤（ＧｅｎｌｅｉＴＭ ＳｃｉｍａｘＴＭ）で治療した。尾静脈血を、治療の３日目、７日目、１４日目に、それぞれ収集する。治療前および後の白血球数相違を比較し、そして薬剤効果を分析した。
【０１０５】
[0098]白血球数を計数するための方法：赤血球を溶解させるため、３％酢酸溶液で、血液を２０倍希釈する。生じた溶液を白血球計数セル内に滴下し、そして顕微鏡下で白血球数を計数し、そして白血球数／ｍｍ３を計算した。
【０１０６】
３ 実験結果
[0099]表１０からわかるように、ＣＴＸ群と比較すると、ラットにおけるｒＬＺ−８薬剤群の治療３日目、有意により多いＷＢＣがあり、相違は非常に有意であり、ＷＢＣは治療７日目に回復した。
【０１０７】
表１０ 低インターロイキンラットモデルに対するｒＬＺ−８の影響
【０１０８】
【化１１】
【０１０９】
【表１０】
比較は、ＣＰ対照群間である、＊ｐ＜０．０１
実施例１０
放射線照射によるマウスモデルの予防におけるｒＬＺ−８の影響
１． 薬剤調製
[0100]滅菌生理食塩水のｒＬＺ−８調製。これらを５μｇ・ｋｇ−１、２．５μｇ・ｋｇ−１、１．２５μｇ・ｋｇ−１、０．６２μｇ・ｋｇ−１用量群に分ける。０．２ｍｌ／片。
【０１１０】
[0101]ＧｅｎｌｅｉＴＭ ＳｃｉｍａｘＴＭ［組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子注射剤（ｒｈＧ−ＣＳＦ）］、製造ロット番号：２００６０４０３；１５０μｇ／片を通常の滅菌生理食塩水で調製して、３．２μｇ・ｋｇ−１、０．２ｍｌ／バイアルの調製物にした。
【０１１１】
[0102]注射用のシクロホスファミド（ＣＴＸ）（製造ロット番号０７１２１８２１；２００ｍｇ／バイアル）を通常の滅菌生理食塩水で調製して、１２．５ｍｇ・ｋｇ−１、０．２ｍｌ／片とした。
【０１１２】
２ 実験法
[0103]マウスを７つの群に分け、そして各群は５匹の雄マウスおよび５匹の雌マウスを含む。同一体積の通常の滅菌生理食塩水を投与した正常対照群のマウスを除いて、各群の各マウスに、陽性薬剤（ＧｅｎｌｅｉＴＭ ＳｃｉｍａｘＴＭ）および異なる用量のｒＬＺ−８を１日１回５日間連続投与した。放射線照射を５日目に行い、そして放射線照射条件は、１分あたり１５０レントゲンの用量率で７．５０Ｇｙ、１８０ｍＶ、１５ｍＡであった。投与前、および投与５日目、ならびに照射５日目および７日目に、各群のマウスに対して尾静脈血液採取を行い、そして白血球数を計数した。白血球計数法は上述のものと同じである。マウスを重量測定し、そして頸椎脱臼によって屠殺し、脾臓を収集し、そして重量測定し、次いで脾臓指数を計算した。その後、脾臓をブアン液中で固定し、そして６時間後、脾臓表面上の造血巣数（ＣＦＵ−Ｓ）を計数した。
【０１１３】
３ 実験結果
[0104]表１１からわかるように、ＣＴＸモデル群と比較すると、投与５日目、異なる用量のｒＬＺ−８で治療した群のマウスの白血球数は有意に増加しており、そしてＣＴＸ群およびｒＬＺ−８群間には有意差が存在する（ｐ＜０．０５）。ｒＬＺ−８群の白血球数は、放射線照射５日目に最低であり、そして７日目に増加し、そしてモデル群およびｒＬＺ−８群間には有意差が存在する（ｐ＜０．０５）。
【０１１４】
表１１． 照射によるマウスモデルの予防における影響の結果
【０１１５】
【化１２】
【０１１６】
【表１１】
比較は、モデル群間である、＊ｐ＜０．０５
実施例１１
放射線照射によるマウスモデルの治療におけるｒＬＺ−８の影響
１． 薬剤調製
[0105]滅菌生理食塩水のｒＬＺ−８調製。これらを５μｇ・ｋｇ−１、２．５μｇ・ｋｇ−１、１．２５μｇ・ｋｇ−１、０．６２μｇ・ｋｇ−１用量群に分ける。０．２ｍｌ／片。
【０１１７】
[0106]ＧｅｎｌｅｉＴＭ ＳｃｉｍａｘＴＭ［組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子注射剤（ｒｈＧ−ＣＳＦ）］、製造ロット番号：２００６０４０３；１５０μｇ／バイアルを通常の滅菌生理食塩水で調製して、３．２μｇ・ｋｇ−１、０．２ｍｌ／バイアルにした。
【０１１８】
[0107]注射用のシクロホスファミド（ＣＴＸ）（製造ロット番号０７１２１８２１；２００ｍｇ／バイアル）を通常の滅菌生理食塩水で調製して、１２．５ｍｇ・ｋｇ−１、０．２ｍｌ／バイアルの調製物にした。
【０１１９】
２ 実験法
[0108]マウスを７つの群に分け、そして各群は５匹の雄マウスおよび５匹の雌マウスを含む。正常対照群のマウスを除く各群の各マウスに、同体積の通常の滅菌生理食塩水、陽性薬剤（ＧｅｎｌｅｉＴＭ ＳｃｉｍａｘＴＭ）および異なる用量のｒＬＺ−８を、放射線照射当日から腹腔内注射した。放射線照射条件は：１分あたり１５０レントゲンの用量率で７．５０Ｇｙ、１８０ｍＶ、１５ｍＡであった。投与前、ならびに照射５日目、７日目および９日目に、各群のマウスに対して尾静脈血液採取を行い、そして白血球数を計数した。照射７日後、マウスを重量測定し、そして頸椎脱臼によって屠殺し、脾臓を収集し、そして重量測定し、そして次いで脾臓指数を計算した。その後、脾臓をブアン液中で固定し、そして６時間後、脾臓表面上の造血巣数（ＣＦＵ−Ｓ）を計数した。
【０１２０】
３ 実験結果
[0109]表１２からわかるように、ｒＬＺ−８群の白血球数は、照射７日目に最低であり、そして９日目に増加し、そしてモデル群およびｒＬＺ−８群間には有意差が存在する（ｐ＜０．０５）。
【０１２１】
[0110]表１３からわかるように、すべてのｒＬＺ−８群は、脾臓増殖の過形成を刺激した。各ｒＬＺ−８群のマウスの脾臓指数およびコロニー形成単位−脾臓（ＣＦＵ−Ｓ）は、モデル群のマウスのものより高かった（ｐ＜０．０５）。
【０１２２】
表１２． 照射によるマウスモデルの治療における影響の結果
【０１２３】
【化１３】
【０１２４】
【表１２】
比較は、モデル群間である、＊ｐ＜０．０５
表１３． 照射によるマウスモデルにおけるコロニー形成単位−脾臓の数値
【０１２５】
【化１４】
【０１２６】
【表１３】
比較は、モデル群間である、＊ｐ＜０．０１
実施例１２：マウスにおけるｒＬＺ−８が阻害する全身アレルギー反応実験
１．実験試薬
[0111]ｒＬＺ−８（７００μｇ／ｍｌ−１）を通常の生理食塩水で調製して、７００μｇ・ｍｌ−１の調製物にした；水酸化アルミニウム（アジュバント）をＰＢＳ緩衝液で調製して、１５ｍｇ・ｍｌ−１の調製物にした；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびオボアルブミン（ＯＶＡ）。
【０１２７】
２．実験法
[0112]熱源のない環境に置いた４０匹の雄マウス（１５週齢、体重１８〜２２ｇ）を、４群に分けた：ｒＬＺ−８の第Ｉ群、ｒＬＺ−８の第ＩＩ群、陽性対照群、正常対照群。ｒＬＺ−８の第Ｉ群の各マウスに、０．１ｍｌ／１０ｇ体重のｒＬＺ−８を週２回腹腔内注射し、そして全部で６回注射し；２回注射した後、感作のため、前記マウスにＢＳＡ（１ｍｇ）および０．２ｍｌの水酸化アルミニウムの懸濁物（１５ｍｇ・ｍｌ−１）の混合物を腹腔内注射し；そしてこれらに、感作１７日目に、尾静脈を介して、０．２ｍｌ ＰＢＳに加えた１ｍｇ ＢＳＡを注射し、そしてアレルギー反応を観察した。正常対照群の各マウスには、ｒＬＺ−８の代わりに、等体積の通常の生理食塩水を投与した。ｒＬＺ−８の第ＩＩ群の各マウスには、感作１７日目に、静脈を介して、ＢＳＡ−ｒＬＺ−８の混合物（ｒＬＺ−８ ７０μｇ・ｍｌ−１およびＢＳＡ ５ｍｇ・ｍｌ−１、ＰＢＳで調製）を０．１ｍｌ／１０ｇ体重で注射した。陽性対照群の各マウスには、感作１７日目に、静脈を介して、ＢＳＡの代わりに１ｍｇ ＯＡを注射した。観察基準：静脈を通じた注射後、３０分間、全身アレルギー性反応を観察した。陽性反応の判断基準：過剰痙攣症、運動減少または死。陰性反応の判断基準：通常の運動。
【０１２８】
[0113]表１４に示すように、ｒＬＺ−８は、ＢＳＡによって引き起こされたマウスの全身性アレルギー反応を阻害した。ｒＬＺ−８、およびショックを引き起こす用量のＢＳＡを同時注射すると、ｒＬＺ−８は全身性アレルギー反応を予防しなかった。
【０１２９】
表１４． マウスにおいて、ｒＬＺ−８が阻害する全身性アレルギー反応の結果
【０１３０】
【表１４】
実施例１３ ｒＬＺ−８の溶血試験
１．実験試薬
[0114]ｒＬＺ−８を５％グルコース溶液で調製して、１ｍｇ・ｍｌ−１の調製物にした；血液細胞懸濁物調製：ヒト血液４ｍｌを１０００ｒ／分で１０分間遠心分離し、上清を除去する。赤血球沈降物に、５％グルコース溶液を体積の約１０倍添加し、振盪し、１０００ｒ／分で２０分間遠心分離し、上清を除去し、上清が顕著に赤くなくなるまで、洗浄を２〜３回反復する。実験のため、得た赤血球を５％グルコース溶液で調製して、２％懸濁物に調製する。
【０１３１】
２．実験法
[0115]２８の清浄な試験管を取り、そしてこれらに番号を付け、第１〜５番をｒＬＺ−８薬剤群とし、第６番を陰性対照群（５％グルコース溶液）とし、第７番を陽性対照試験管（蒸留水）とし、そして総数４つの平行比較試験管を用意する。２％赤血球懸濁物、５％グルコースまたは蒸留水を順番に供給し、振盪し、これらをインキュベーションするため、３７℃±０．５℃のインキュベーター内に直ちに入れる。１５分ごとに１時間これらを観察した後、３時間で１回観察する。観察終了後、試験管からすべての溶液を遠心分離乾燥試験管に入れ、１５００ｒ・分−１で２５分間遠心分離した。上清を除去し、ＯＤ値に関してブランク蒸留水試験管を読み取って、溶血率を計算する。
【０１３２】
３．実験結果
[0116]表１５中、薬剤群のｒＬＺ−８溶血率は、第１〜５群で＜５％であり、溶血反応の徴候はないことがわかる。
【０１３３】
表１５ ヒト赤血球可溶化に対するｒＬＺ−８溶血の実験結果
【０１３４】
【化１５】
【０１３５】
【表１５】
実施例１４：ラット骨髄像に対するｒＬＺ−８の影響
１．実験試薬
[0117]ウィスター、９匹、約１００ｇ。ｒＬＺ−８を滅菌生理食塩水溶液で６０ｍｇ・ｋｇ−１、３０ｍｇ・ｋｇ−１、１５ｍｇ・ｋｇ−１の３用量群用に調製する。
【０１３６】
２．実験法
[0118]正常対照群３匹（ラット）、タンパク質低用量群２匹、タンパク質中用量群２匹、およびタンパク質高用量群２匹。ｒＬＺ−８薬剤群ラットには、それぞれ、１回／日で、ｒＬＺ−８の異なる用量を尾静脈注射で投与する；正常対照群には等量の生理食塩水を投与する。注射７日目、右大腿骨骨髄をスメアについてチェックする。
【０１３７】
３．実験結果
[0119]図１１に示されるように、ラット骨髄スメアを正常対照群と比較したところ、異常は見られない。
【０１３８】
実施例１５：ヒト赤血球接着に対するｒＬＺ−８の影響
１．実験試薬
[0120]Ａ、Ｂ、ＯおよびＡＢ血液型の健康な志願者から、それぞれ２ｍｌ、ＳＲＢＣ（ヒツジ赤血球）２ｍｌ。上記ＲＢＣを１２００ｇ・分−１で１０分間遠心分離し、上清を除去し、そして５ｍｌ ＰＢＳで洗浄し、上記の操作を３〜５回反復し、そして次いで、１．５％の０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ懸濁調製物を用いる。通常の生理食塩水で最終濃度５０μｇ・ｍｌ−１、２５μｇ・ｍｌ−１、１２．５μｇ・ｍｌ−１、６．２５μｇ・ｍｌ−１、３．１３μｇ・ｍｌ−１、１．５６μｇ・ｍｌ−１、０．７８μｇ・ｍｌ−１、０．３９μｇ・ｍｌ−１、０．２０μｇ・ｍｌ−１、０．１０μｇ・ｍｌ−１、０．０５μｇ・ｍｌ−１、０．０３μｇ・ｍｌ−１に調製する。植物凝集素（ＰＨＡ）調製、前記。
【０１３９】
２．実験法
[0121]実験被験体をｒＬＺ−８濃度群、陽性薬剤対照、および正常対照群に分ける。９６穴赤血球凝集板上、Ａ型１．５％の赤血球２５μｌ／穴を添加し、そして次いで、０．２％ゼラチン、７５μｌ／穴を添加する。薬剤群には、異なる濃度のｒＬＺ−８を上記最終濃度まで添加し；陽性薬剤対照群にはＰＨＡ ２５μｌ／穴を添加し；正常対照群にはＰＢＳ ２５μｌ／穴を添加する。各群６つの平行対照群。通常の室温で３０秒間振盪し、３７℃でインキュベーションし、１時間後に被験体を観察する。Ｂ型、ＡＢ型、Ｏ型、およびＳＲＢＣ（ヒツジ赤血球）に関しては、上記と同じ実験法である。
【０１４０】
３．実験結果
[0122]以下の表１６は、陽性薬剤ＰＨＡが、ヒト赤血球の４つの型すべておよびヒツジ赤血球に対して凝集性であり；ｒＬＺ−８がヒト赤血球の４つの型に対して凝集性ではないが、１２．５μｇ・ｍｌ−１〜５０μｇ・ｍｌ−１の濃度でＳＲＢＣが活性凝集を示すことを示す。
【０１４１】
表１６ ４つの型のヒト赤血球凝集のｒＬＺ−８実験結果
【０１４２】
【表１６】
実施例１６：組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質抗腫瘍調製物
[0123]上記薬理学的実験を通じて、組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質ｒＬＺ−８の抗腫瘍効果およびインターロイキンレベル上昇効果が非常に高く、そして非毒性で副作用を伴わないことが証明される。したがって、抗腫瘍調製物として組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質ｒＬＺ−８が薬剤使用に適切であり、そして安全であると言ってもよい。
【０１４３】
[0124]抗癌薬剤の適用として本発明の組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質ｒＬＺ−８を経口投与し、そして非腸管薬剤送達してもよい。症状、年齢、重量および他の要因によって投薬型を決定してもよい。成人に関しては、１人あたりの経口投薬量は１０〜１０００ｍｇを１日数回であり、非腸管送達は１０〜１００ｍｇを１日数回である。
【０１４４】
[0125]本発明において、経口錠剤、丸剤およびカプセル（硬および軟カプセルを含む）のキットを有し、これらの調製配合物には、組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質ｒＬＺ−８および少なくとも１つの不活性希釈剤（ラクトース、マンノースアルコール、グルコース、デンプン、ポリビニルピロリドンなど）が含まれ、不活性希釈剤薬理学以外に潤滑剤、崩壊剤、安定化剤などの許容されうる添加剤が加わってもよい。必要であれば、１または１より多い層のコーティング上、胃可溶性または溶腸コーティング物質で錠剤または丸剤をコーティングしてもよい。非腸管注射には、組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質ｒＬＺ−８および少なくとも１つの不活性水希釈剤（例えば蒸留注射用水および通常の生理食塩水）が含まれ、組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質ｒＬＺ−８はまた、凍結乾燥粉末であってもよく；該粉末を使用前に注射用不活性希釈水に溶解してもよい。
【０１４５】
（１）調製例１
[0126]組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質ｒＬＺ−８ １０００ｍｇを取り；１００ｍｌの滅菌生理食塩水中に溶解し、均等に混合し、次いで、ｒＬＺ−８ １０ｍｇ／ｍｌ／片の濃度で溶液注射瓶内にこれらをサブパッキングし；密封し、滅菌し、そして製品にした。他の項目は、注射の必要条件下、中国薬局方２００５年版に一致するものとする。
【０１４６】
（２）調製例２
[0127]組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質ｒＬＺ−８ １００ｇ；薬剤デンプン０．５ｋｇを取り、公的に知られる技術および装置にしたがって、これらをカプセル型、ｒｌｚ８ １０ｍｇ／錠剤にし、そして他の項目は、カプセルの必要条件下、中国薬局方２００５年版に一致するものとする。
【０１４７】
（３）調製例３
[0128]組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質ｒＬＺ−８ １００ｇ；結晶セルロース５６０ｇ；無水ラクトース３８０ｇ；ステアリン酸マグネシウム２００ｇを取り、公的に知られる技術および装置にしたがって、これらを丸剤／錠剤、ｒＬＺ−８ １０ｍｇ／錠剤にし、他の項目は、錠剤の必要条件下、中国薬局方２００５年版に一致するものとする。
【０１４８】
（４）調製例４
[0129]適量の組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質ｒＬＺ−８を取り、項目は、経口液体の必要条件下、中国薬局方２００５年版に一致するものとし、公的に知られる技術および装置にしたがって経口液体を製造する。
【産業上の利用可能性】
【０１４９】
[0130]本発明の結果によって、組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質は、多様な理由によって引き起こされる白血球減少症の治療および予防に対して顕著な効果を有し、そして臨床用量、治療効果および臨床的不快感において、現存する臨床薬剤より優れている。動物試験によって、組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質の副作用が、組換えコロニー刺激因子よりはるかに低いことが示される。
【０１５０】
[0131]本発明者らは：ピキア・パストリスの真核生物発現系を用いて、組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質を発現し；世界の類似の研究の中で、最初に、ｒＬＺ−８の１００Ｌ発酵産生を実現し、そして産生および精製プロセスを確立し；そしてｒＬＺ−８の空間的構造の決定を最初に完了し、そしてこうしてｒＬＺ−８の抗腫瘍機構に対してさらに研究するための優れた基盤を提供することに成功した。
【０１５１】
[0132]本発明は、革新的に：ｒＬＺ−８が、低リンパ球レベルを持つ動物モデルの白血球数を増加させるのに有効であり、そしてコロニー刺激因子より明らかに優れた薬力学効果を有し；ｒＬＺ−８が白血病細胞Ｎｂ４、Ｋ５６２およびＨＬ−６０のアポトーシスを誘導可能である（本発明者らは、初めて、これが、真菌免疫調節タンパク質が腫瘍細胞を殺す別の可能な方法であるという結論を導き出した）ことを見出す。腫瘍所持マウスに対する治療実験によって、ｒＬＺ−８がｉｎ ｖｉｖｏで移植腫瘍の増殖を阻害するのに有効であることがさらに示され；安全性実験によって、ｒＬＺ−８がラット血球に対して明らかな病原性を持たず、そして大動脈および大静脈の血管壁に病的な破壊的影響を課さないことが示され；そして骨髄スメアの結果によって、ｒＬＺ−８が造血機能に対して病原性の影響を持たないことが示された。本発明は、初めて、ＬＺ−８の結晶空間的構造を開示し、ＬＺ−８が正常細胞を損傷することなく、腫瘍細胞を直接殺すことが可能であることを開示し、そして多様な理由によって引き起こされる白血球減少症の予防および治療におけるＬＺ−８の新規治療を開示する。
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明は、腫瘍、白血球減少症およびアレルギー性疾患等の適応症のための、真菌免疫調節タンパク質、特に特定の空間的構造を有する組換えマンネンタケ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｉｕｍ）免疫調節タンパク質の医学的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]現存する研究ファイルにおいて、マンネンタケ由来の特定の種類のタンパク質は、制御、赤血球凝集、接着分子の遺伝子調節、アレルギー反応の抑制および免疫抗腫瘍効果を含む広範囲の免疫調節活性を発揮する。
【０００３】
[0003]マンネンタケ属菌糸体の抽出物からの小分子タンパク質の分離および精製は、日本人、キノらによって１９８９年に行われ（Ｋｏｈｓｕｋｅ Ｋｉｎｏら， Ｊ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ． １９８９， １：４７２−４７８）、このタンパク質はＬＺ−８と名付けられ、そのアミノ酸配列および免疫の生理学的活性もまた試験され、ＬＺ−８のタンパク質配列は１１０アミノ酸残基で構成され、アセチル化されており、分子量は１２．４ＫＤであり、そして等電点は４．４であることが示されている。
【０００４】
[0004]本発明者らは、二量体化の形成に必要な重要なＮ末端ドメインおよびＣ末端ＦＮＩＩＩドメインを主に含む、組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質の結晶構造を初めて開示した。前記Ｎ末端ドメインは、αらせん（２−ＳＤＴＡ−ＬＩＦＲＬＡＷＤＶＫ−１５のアミノ酸配列を有し、そして１４アミノ酸からなる）およびβ鎖（１６−ＫＬＳＦＤ−２０のアミノ酸配列を有し、そして５アミノ酸からなる）で構成され、αらせん上のＳｅｒ残基はアセチル化によってブロッキングされている。１つのＬＺ−８単量体のＮ末端αらせんおよびβ鎖は、別のＬＺ−８単量体の同じドメインと一緒に、ドメイン交換を介して、重要なダンベル型の二量体結合ドメインを形成する。Ｃ末端ＦＮＩＩＩドメインは、免疫グロブリン様サンドイッチ構造に属し、そしてそれぞれ、β鎖Ａ−Ｂ−Ｅおよびβ鎖Ｇ−Ｆ−Ｃ−Ｄによって形成される、βシートＩおよびβシートＩＩを含む。研究結果によって、Ｎ末端αらせんＡを通じてホモ二量体を形成し（研究によって、１３のＮ末端アミノ酸残基がＦｉｐのための機能的ホモ二量体を形成するのに非常に必須であることが示された）、前記ホモ二量体を通じてリンパ球に結合し、そしてリンパ球が一連の情報伝達を通じて多様なサイトカインを分泌するように促進することによって、組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質の免疫調節機能が本質的に達成されうることが示された。
【０００５】
[0005]白血球数を増加させる効果を有する、現存する臨床薬剤のうち、組換えコロニー刺激因子（組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子など）が、多様な理由によって引き起こされる白血球減少症または顆粒球減少症、ならびに骨髄抑制治療によって引き起こされる白血球減少症を治療するために用いられる、唯一の遺伝子組換えタンパク質調製物である。長年の臨床適用によって、組換えコロニー刺激因子の優れた効果が証明されたが、これを含有するすべての製品は、「あなたが経験しうる一般的な副作用は、骨および筋肉の痛み、発熱、皮疹、掻痒、腹痛、下痢等です。少数の患者は、顔面紅潮、発汗、血圧低下、血中酸素飽和度低下を含む、最初の投与後の用量反応を経験する可能性もあります。深刻だが稀な副作用には、アレルギー、気管支痙攣、心不全、上室性頻拍症、毛細血管漏出症候群、脳血管疾患、精神異常、痙攣、血圧低下、頭蓋内圧高進、肺浮腫等が含まれます」のような副作用が記されている。
【０００６】
[0006]ＬＺ−８に関する先の報告は、ＬＺ−８が、免疫調節経路を通じて、腫瘍細胞を殺すと示唆した。本発明において、本発明者らは、ｒＬＺ−８が、ＨＬ−６０、ＮＢ４、Ｋ５６２腫瘍細胞を、間接的な免疫調節経路ではなく、直接的経路によって殺すことを見出した。
【０００７】
[0007]マンネンタケ免疫調節タンパク質の主な機能は、末梢リンパ球および脾臓細胞の過形成を刺激し、ヒトおよび動物両方のマクロファージが多様な細胞因子（インターロイキン、腫瘍壊死因子およびインターフェロン等）を分泌するよう誘導し、そして病原体の侵害を防御しそして一掃し、健康を守りそして維持し、そして免疫調節機能を達成する点にある。本発明は、ｒｌＺ−８が全身性アレルギー反応および臓器移植後の免疫拒絶を有効に予防しうることを示唆する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋｏｈｓｕｋｅ Ｋｉｎｏら， Ｊ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ． １９８９， １：４７２−４７８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
[0008]本発明の目的は組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質（ｒＬＺ−８）の結晶構造およびその新規の医学的使用を見出すことである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
[0009]本発明は、生物医薬操作の分野に属し、抗腫瘍、白血球の産生および免疫抑制のための組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質の医学的使用を伴う。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】[0022]ｒＬＺ−８結晶構造を示す図である。。
【図２】[0023]ＮＢ４腫瘍細胞に対するｒＬＺ−８のｉｎ ｖｉｔｒｏの結果。
【図３】[0024]Ｋ５６２腫瘍細胞に対するｒＬＺ−８のｉｎ ｖｉｔｒｏの結果。
【図４−１】[0025]ｒＬＺ−８が誘導するＫ５６２およびＮＢ４細胞のアポトーシス、ＰＩ単染色試験結果。
【図４−２】[0025]ｒＬＺ−８が誘導するＫ５６２およびＮＢ４細胞のアポトーシス、ＰＩ単染色試験結果。
【図５−１】[0026]ｒＬＺ−８が誘導するＨｌ６０およびＮＢ４細胞のアポトーシス、アネキシンＶ／ＰＩ二重染色試験結果。
【図５−２】[0026]ｒＬＺ−８が誘導するＨｌ６０およびＮＢ４細胞のアポトーシス、アネキシンＶ／ＰＩ二重染色試験結果。
【図６】[0027]Ｓ１８０エールリッヒ腹水腫瘍細胞をマウスに接種した際の体重変化。
【図７】[0028]Ｈ２２腫瘍細胞をマウスに接種した際の体重変化。
【図８】[0029]ＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８（１００ｎｇ．ｍｌ−１）ラット心筋組織マーカー（暗、ＤＩＣ視野）。
【図９】[0030]ＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８（１００ｎｇ．ｍｌ−１）ウサギ軟骨細胞マーカー（暗、ＤＩＣ視野）。
【図１０】[0031]ＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８（１００ｎｇ．ｍｌ−１）ＨＬ−６０細胞マーカー（暗、ＤＩＣ視野）。
【図１１】[0032]ｒＬＺ−８によって影響を受けるラット骨髄像。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
[0010]本発明の組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質（ｒＬＺ−８）は、遺伝子操作技術を介した、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における組換え発現によって得られ、そしてｒＬＺ−８のヌクレオチド配列は、天然マンネンタケ免疫調節タンパク質の公表される遺伝子配列（Ｍ５８０３２）にしたがって再設計され、そして人工的に合成される。
【００１３】
[0011]本発明は、Ｘ線回折によって、組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質（ｒＬＺ−８）の結晶構造を初めて得る。前記タンパク質の結晶を培養するための条件は：１．７５Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．０および６．４％ＰＥＧ ４００である。空間群Ｐ３２の単結晶は、ハンギングドロップ蒸気拡散法によって得られた。Ｘ線回折計の回折データ収集系によって、１．８０Å解像度で結晶データを収集した。ＣＣＰ４などのソフトウェアを用いて構造解析を行い、そして相交換を介して結晶構造を得た。各非対称単位において、４つの分子があることが見出され、ここでＮ末端αらせんの間で疎水性相互作用によって、そして逆平行β鎖の間で水素結合によって、２つの分子間に二量体が形成された。単分子のＣ末端は、ＦＮＩＩＩ型免疫グロブリン様フォールディングを有し、このドメインは２つのβシートで構成される。βシートの表面および接合部に、それぞれ、糖結合部位があると推測される。
【００１４】
[0012]ＩＭＤＭ培地を用いて調製した異なる濃度のｒＬＺ−８を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した急性前骨髄球性白血病細胞株ＮＢ４および慢性骨髄性白血球細胞株Ｋ５６２に添加する、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍試験において、ｒＬＺ−８が前記の２つの腫瘍細胞に対して殺傷効果を課すことが明らかに観察され、そしてＭＴＴ法の実験データは、薬剤効果が投薬量に有意に依存することを示した。本発明のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍試験において、精製ｒＬＺ−８をＳ１８０／Ｈ２２所持マウスに連続して１０日間投与し、腹水腫瘍所持マウスを毎日重量測定し、そして頸椎脱臼によって屠殺し、腫瘍を皮下接種したマウスから腫瘍を切除して、そして重量測定し、その後、腫瘍阻害率を計算し、そして薬剤投与前および投与後の血中白血球数を測定した。結果によって、腫瘍に対するｒＬＺ−８の阻害は投薬量に依存することが示された。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験はどちらも、本発明のｒＬＺ−８が優れた抗腫瘍効果を有することを示した。
【００１５】
[0013]本発明において、蛍光色素（フルオレセイン−５−イソチオシアネート、ＦＩＴＣ）を用いてｒＬＺ−８を標識し、ＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８を形成し、これをＨｌ６０細胞、ラット心筋組織およびウサギ軟骨細胞とインキュベーションし、細胞を収集し、そして洗浄し、蛍光顕微鏡観察下で観察すると、ＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８と１時間および６時間インキュベーションしたＨＬ−６０は強い緑色蛍光を持ち、ラット心筋組織およびウサギ軟骨細胞と比較すると、有意な相違がある。これらの結果は、特定の受容体がｒＬＺ−８によって認識されうることを示すのに役立った。ｒＬＺ−８のＣ末端ＦＮＩＩＩドメイン上に２つの炭水化物鎖結合部位があり、そして正常細胞表面上にはいかなるオリゴ糖連結も決して見られていないため、認識機構がＨＬ−６０細胞表面上のオリゴ糖連結に関連しうることが暗示される。これに基づいて、本発明は、ｒＬＺ−８の特異的殺傷効果が、細胞表面上の受容体の認識と関連するためでありうることを示唆する。
【００１６】
[0014]抗腫瘍機構をさらに研究するため、ｒＬＺ−８で処理したＫ５６２およびＨｌ６０細胞のアポトーシス・パーセントを、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色およびアネキシンＶおよびＦＩＴＣ染色を用いたフローサイトメトリーによって測定し、結果によって、細胞のアポトーシスは、ｒＬＺ−８が腫瘍細胞を殺す方式の１つであるという結論が導き出された。
【００１７】
[0015]本発明は、ｒＬＺ−８が白血球減少症を予防しそして治療する際に有効であることを開示する。シクロホスファミドによって引き起こされた白血球減少症を患うラット／マウスに対する治療実験において、ＧｅｎｌｅｉＴＭ ＳｃｉｍａｘＴＭ（組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子注射剤）を陽性薬剤として、通常の生理食塩水で調製されたｒＬＺ−８を、シクロホスファミドによって引き起こされた白血球減少症を患うラットモデルに、連続して７日間投与し、３日目および７日目に、尾静脈血液採取を行い、血液中の白血球数を測定し、治療前および治療後の白血球数相違を比較し、そして薬剤効果を分析した。シクロホスファミド対照群と比較すると、ｒＬＺ−８群ラットにおける白血球数は、投与３日目に非常に増加し、相違は非常に有意であり、そして投与７日目には、白血球数は正常レベルに回復した。
【００１８】
[0016]γ線照射によって引き起こされる白血球減少症を患うマウスに対する治療実験において、正常対照群を除く各群のマウスに、同体積の通常の生理食塩水、陽性薬剤（ＧｅｎｌｅｉＴＭ ＳｃｉｍａｘＴＭ）および異なる用量のｒＬＺ−８を、放射線照射当日から腹腔内注射した。放射線照射条件は：１分あたり１５０レントゲンの用量率で７．５０Ｇｙ、１８０ｍＶ、１５ｍＡであった。投与前、ならびに照射５日目、７日目および９日目に、各群のマウスに対して尾静脈血液採取を行い、そして白血球数を計数した。照射７日後、マウスを重量測定し、そして頸椎脱臼によって屠殺し、脾臓を収集し、そして重量測定し、次いで脾臓指数を計算した。その後、脾臓をブアン液中で固定し、そして６時間後、脾臓表面上の造血巣数（ＣＦＵ−Ｓ）を計数した。γ線照射によって引き起こされる白血球減少症を患うマウスに対する予防実験において、照射５日前に薬剤を投与し、そして続く工程は、上記の治療実験と同じであった。どちらの実験の実験データも、ｒＬＺ−８が、γ線照射によって引き起こされる白血球減少症を予防しそして治療するのに有効であることを示した。
【００１９】
[0017]本発明は、ｒＬＺ−８が溶血効果を生じず、４種のヒト血液型の赤血球に対して凝血効果を課さず、そしてマウス骨髄に異常な変化を引き起こさないことを証明する。
[0018]本発明のｒＬＺ−８は免疫抑制剤として使用可能である。実験において、ｒＬＺ−８がマウスの全身性アナフィラキシー反応を阻害する際に有効であり、そしてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）によって刺激されたマウスに対して、痙攣（ｈｙｐｅｒｓｐａｓｍｉａ）などの陽性反応、運動の減少または死を引き起こさないことが見出された。
【００２０】
[0019]本発明は、活性成分としてｒＬＺ−８を含有する薬学的調製物を調製することを含み、該薬学的調製物は、主に、通常の注射剤、凍結乾燥注射剤、リポソーム注射剤、ターゲット送達注射剤などの非経口投与調製物であり、そして胃腸投与調製物、例えば、錠剤、カプセル、スプレー、ゲル、ゲル吸収剤、経口薬剤、懸濁物、インスタント薬剤、パッチ、丸剤、散剤、注射剤、注入溶液、座薬、希釈調製物、徐放調製物などに調製してもよい。
【００２１】
[0020]本発明の薬学的調製物におけるｒＬＺ−８の内容量は、１〜９９％であり、残りは、デンプン、デキストリン、スクロース、ラクチン、セルロース、ステアリン酸マグネシウム、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｃａｒｂｏｍｅｒ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギン酸ナトリウム、グリセリン、ゼラチン、ポリエチレングリコール、チメロサール、プロピルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、アセトンクロロホルム、安息香酸ナトリウム、ホウ砂、ブロモ−ゲラミン（ｇｅｒａｍｉｎｅ）、ソルビトール、プロパンジオール、イソプロパノール、ラウロカプラム、イソプロパノール／プロパンジオール（１：１）、イソプロパノール／（１：２）およびイソプロパノール／プロパンジオール（２：１）、トリエタノールアミン、水酸化ナトリウム、ワセリン、ステアリン酸、流動パラフィン、ラノリン、オクタデカノール、ヘキサデカノール、モノステアリン酸グリセリル、ラウリル硫酸ナトリウム、Ｓ−６０、ペレガル０、マンニトール、ソルビトール等からなる群より選択される薬学的に許容されうるキャリアーである。
【００２２】
[0021]本発明の薬学的調製物は、分野における慣用的プロセスによって調製可能である。
【実施例】
【００２３】
実施例１ 組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質の獲得
１．合成ｒＬＺ−８遺伝子、遺伝子操作細菌の構築、構築およびスクリーニング
[0033]ピキア・パストリスの遺伝暗号優先性にしたがって、元来のマンネンタケ免疫調節タンパク質遺伝子配列（Ｍ５８０３２）に基づいて、全遺伝子に関して、ＬＺ−８遺伝子（配列１）を再設計しそして合成し、配列１およびＭ５８０３２は、同じアミノ酸配列をコードし、そしてこれらの間の相違は、再設計配列において、ピキア・パストリスの発現系により適したコドンが利用されていることであった。
【００２４】
[0034]配列（配列１）を酵母α因子リーダーペプチドコード配列に連結して融合遺伝子とし、α−ＬＺ−８遺伝子をｐＭＤ１８−Ｔキャリアー内にクローニングし、正しい配列のキャリアーを直線化し、そして酵母遺伝子ゲノム内に導入し、そしてＭＭおよびＭＤプレート上でメタノールを効率的に利用するＭｕｔ＋株をスクリーニングした。
【００２５】
[0035]天然マンネンタケ免疫調節タンパク質（Ｍ５８０３２）のコード配列は：
【００２６】
【化１】
【００２７】
である。
[0036]再設計された組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質（ｒＬＺ−８）のヌクレオチド配列（配列１）は：
【００２８】
【化２】
【００２９】
である。
[0037]前記組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質（ｒＬＺ−８）のアミノ酸配列は：
【００３０】
【化３】
【００３１】
である。
２．ｒＬＺ−８遺伝子操作細菌の発現
[0038]１００Ｌ発酵槽規模発現ｒＬＺ−８条件において、発酵規模の発現、温度、回転速度、ｐＨ値、液体体積、メタノールの補充および他の検出によって、酵母の最適化されたプロセスが確立されている。本発明者らは、ｒＬＺ−８の物理的および化学的特性にしたがって、パイロット発酵培地配合物を設計した。ｒＬＺ−８アウトプットは約８００ｍｇ・Ｌ−１である。
【００３２】
３． ｒＬＺ−８の精製プロセス
[0039]発酵ブロス遠心分離装置→上清管状分離装置→限外ろ過→陽イオン交換カラム精製→ターゲットタンパク質調製のためのＡＫＴＡタンパク質精製ワークステーション→強陰イオン交換クロマトグラフィー精製→疎水性相互作用カラム→ゲルろ過クロマトグラフィー。
【００３３】
４． ＲＬＺ−８純度および分子量決定
[0040]ＲＰ−ＨＰＬＣを用いた分離および精製の純度分析によると、ｒＬＺ−８の純度は＞９９％である。組換え発現のｒＬＺ−８分子量のレーザー飛行質量分析の評価は１２，７２２Ｄａである。
【００３４】
５． ｒＬＺ−８のより高次の空間的構造の決定
[0041]空間群Ｐ３２の単結晶をハンギングドロップ水蒸気拡散法によって得て、培養条件は：１．７５Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．０および６．４％ ＰＥＧ ４００であった。ＭａｒＲｅｓｅａｒｃｈ ３４５ ｄｔｄ回折データ収集系によって、１．８０Å解像度でｒＬＺ−８のＸ線回折データを収集した。ＣＣＰ４などのソフトウェアを用いて、構造解析を行い、そして相交換によって結晶構造を得た。結晶ｒＬＺ−８の構造は、簡潔に、以下のように記載された：ＬＺ−８の構造は、二量体化の形成に必要な重要なＮ末端ドメイン、およびＣ末端ＦＮＩＩＩドメインを含む。前記Ｎ末端ドメインは、αらせん（２−ＳＤＴＡ−ＬＩＦＲＬＡＷＤＶＫ−１５のアミノ酸配列を有し、そして１４アミノ酸からなる）およびβ鎖（１６−ＫＬＳＦＤ−２０の配列を有し、そして５アミノ酸からなる）で構成され、αらせん上のＳｅｒ残基はアセチル化によってブロッキングされる。１つのＬＺ−８単量体のＮ末端αらせんおよびβ鎖は、別のＬＺ−８単量体の同じドメインと一緒に、ドメイン交換を介して、重要なダンベル型の二量体結合ドメインを形成する。Ｃ末端ＦＮＩＩＩドメインは、免疫グロブリン様サンドイッチ構造に属し、そして図１に示すように、それぞれ、β鎖Ａ−Ｂ−Ｅおよびβ鎖Ｇ−Ｆ−Ｃ−Ｄによって形成される、βシートＩおよびβシートＩＩを含み、β鎖の配列は、Ａ． ２１−ＴＰＮＷＧＲＧ−２７； Ｂ． ３４−ＩＤＴＶＴＦＰ−３９； Ｃ． ４８−ＹＴＹＲＶＡＶ−５４； Ｄ． ５７−ＲＮＬＧＶＫＰ−６３； Ｅ． ７２−ＳＱＫＶＮ−７６； Ｆ． ９１−ＴＩＱＶＦＶＶＤＰＤ−１００； Ｇ． １０２−ＮＮＤＦＩＩＡＱＷ−１１０であった。
【００３５】
実施例２：ヒト前骨髄球性白血病ＮＢ４細胞に対するｒＬＺ−８の殺傷効果
１．実験試薬
[0042]ろ過および病原菌除去後、ＩＭＤＭ培地を用いて、それぞれ、０．７８μｇ・ｍｌ−１、１．５６μｇ・ｍｌ−１、３．１２５μｇ・ｍｌ−１、６．２５μｇ・ｍｌ−１、１２．５μｇ・ｍｌ−１、２５μｇ・ｍｌ−１、５０μｇ・ｍｌ−１、１００μｇ・ｍｌ−１である８つの濃度を調製した。
【００３６】
２．実験法
[0043]９６穴培地プレート上、パイロット穴には、ＮＢ４腫瘍細胞０．１ｍｌおよび低濃度から高濃度のｒＬＺ−８ ０．１ｍｌを加え；陰性対照群には、ＮＢ４腫瘍細胞および培地それぞれ０．１ｍｌを加え；陽性薬剤対照群には亜ヒ酸Ａｓ２Ｏ３を加え；各群に関して、複数の穴として６穴作製する。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中に４８時間入れ、終結４時間前に、ＭＴＴ１５μｌ（５ｍｇ ｍｌ−１）を添加し、１００μｌの０．１ｍｏｌ Ｌ−１塩酸イソプロピルアルコールを添加することによる細胞培養の終結後、酵素結合免疫吸着法で、ＯＤ５７０ｎｍ値に関して試験した。
【００３７】
３．実験結果
[0044]表１および図１は、ｒＬＺ−８薬剤群およびＮＢ４正常対照群のＯＤ５７０ｎｍ吸光値を示し、ｒＬＺ−８はＮＢ４腫瘍細胞に対して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで強い致死効果を有する、有意な相違がある。
【００３８】
表１ ＮＢ４腫瘍細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏのｒＬＺ−８の致死効果
【００３９】
【化４】
【００４０】
【表１】
【００４１】
ＮＢ正常対照群と薬剤群の比較、＊ｐ＜０．０１
実施例３：ヒト慢性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞に対するｒＬＺ−８の致死効果
１．実験試薬
[0045]ｒＬＺ−８の滅菌後、ＩＭＤＭ培地を用いて、それぞれ、３．１２５μｇ・ｍｌ−１、６．２５μｇ・ｍｌ−１、１２．５μｇ・ｍｌ−１、２５μｇ・ｍｌ−１、５０μｇ・ｍｌ−１、１００μｇ・ｍｌ−１である６つの濃度を調製した。
【００４２】
２．実験法
[0046]９６穴培地プレート上、パイロット穴には、Ｋ５６２腫瘍細胞０．１ｍｌおよび低濃度から高濃度のｒＬＺ−８ ０．１ｍｌを加え；陰性対照群には、Ｋ５６２腫瘍細胞および培地それぞれ０．１ｍｌを加え；陽性薬剤対照群には亜ヒ酸Ａｓ２Ｏ３を加え；各群に関して、複数の穴として６穴作製する。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中に４８時間入れ、終結４時間前に、ＭＴＴ１５μｌ（５ｍｇ ｍｌ−１）を添加し、１００μｌの０．１ｍｏｌ Ｌ−１塩酸イソプロピルアルコールを添加することによる細胞培養の終結後、酵素結合免疫吸着法で、ＯＤ５７０ｎｍ値を試験した。
【００４３】
３．実験結果
[0047]表２および図３は、ｒＬＺ−８薬剤群およびＫ５６２正常対照群のＯＤ５７０ｎｍ吸光値を示し、ｒＬＺ−８はＫ５６２腫瘍細胞に対して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで強い致死効果を有する、有意な相違がある。
【００４４】
表２ 腫瘍細胞Ｋ５６２に対するｉｎ ｖｉｔｒｏのｒＬＺ−８の致死効果
【００４５】
【化５】
【００４６】
【表２】
【００４７】
Ｋ５６２正常対照群と薬剤群の比較、＊ｐ＜０．０１
実施例４：血液腫瘍細胞のアポトーシスに対するｒＬＺ−８の影響
１． ＰＩ単染色フローサイトメトリー
１．１ 実験装置および細胞株
[0048]蛍光顕微鏡、モデルＬｅｉｃａ ＡＳＬＭＤ、Ｋ５６２、ＮＢ４。
【００４８】
１．２ 実験試薬
[0049]ｒＬＺ−８は、それぞれ、高用量、中用量および低用量の３つの群に分類され、ここで本発明者らは、２％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭ培地を用いて、２．５μｇ・ｍｌ−１、０．５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ・ｍｌ−１の調製物に調製した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）５０μｇ・ｍｌ−１。
【００４９】
１．３ 実験群分け
[0050]正常対照群、陽性薬剤対照群（Ａｓ２Ｏ３）、ｒＬＺ−８低用量群（０．１μｇ・ｍｌ−１）、ｒＬＺ−８中用量群（０．５μｇ・ｍｌ−１）、ｒＬＺ−８高用量群（２．５μｇ・ｍｌ−１）としてＫ５６２を確立し；正常対照群、ｒＬＺ−８低用量群（０．１μｇ・ｍｌ−１）、ｒＬＺ−８中用量群（０．５μｇ・ｍｌ−１）、ｒＬＺ−８高用量群（２．５μｇ・ｍｌ−１）としてＮＢ４をセットする。
【００５０】
１．４ 実験法
[0051]Ｋ５６２およびＮＢ４細胞を、それぞれ、２４穴プレート内で混合し、そして１ｍｌ／穴の異なる濃度のｒＬＺ−８を供給し、各群に関して、複数の穴として３穴セットする。これらを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中に２４時間入れ、各濃度の細胞を収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、そして細胞密度を１×１０６／ｍｌに調節して、７０％氷冷エタノールで固定し、−２０℃に調整し、そして一晩放置する。細胞を固定した後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＩ（最終密度５０μｇ・ｍｌ−１）を室温で添加し、そして１０分間、遮光してインキュベーションし、１０００ｒ・分−１で５分間遠心分離し、上清を使い捨て器具で除去し、沈殿物を４００μｌのＰＢＳに再懸濁する。そしてコンピュータ上で１時間試験する。
【００５１】
１．５ 実験結果
[0052]表３および図４は、Ｋ５６２およびＮＢ４正常対照群と比較すると、ｒＬＺ−８薬剤群のアポトーシス率が増加していることを示し、本発明者らは、細胞のアポトーシスが、ｒＬＺ−８が腫瘍細胞を殺す方法の１つであるという結論を導き出しうる。
【００５２】
表３ Ｋ５６２およびＮＢ４に対してｒＬＺ−８が誘導するアポトーシス率（％）
【００５３】
【表３】
【００５４】
２．アネキシンＶ−ＦＩＴＣフローサイトメトリー・キットは、細胞のアポトーシスを試験する
２．１ 実験装置および細胞株
[0053]ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー、Ｕ．Ｓ． Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、ＮＢ４、ＨＬ−６０。
【００５５】
２．２ 実験試薬
[0054]２％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭ培地を用いて、０．１μｇ・ｍｌ−１、０．５μｇ・ｍｌ−１、２．５μｇ・ｍｌ−１の調製物にｒＬＺ−８を調製、０．５μｇ・ｍｌ−１の亜ヒ酸（Ａｓ２Ｏ３）。アネキシンＶ−ＦＩＴＣキット：緩衝溶液４×を合わせる；ヨウ化プロピジウム溶液（ＰＩ）２０μｇ・ｍｌ−１、０．２ｍｌ。
【００５６】
２．３ 実験群分け
[0055]ＮＢ４正常対照群、陽性薬剤群（Ａｓ２Ｏ３、０．５μｇ・ｍｌ−１）、タンパク質低用量群（０．１μｇ・ｍｌ−１）、中用量群（０．５μｇ・ｍｌ−１）、高用量群（２．５μｇ・ｍｌ−１）を確立し；ＨＬ−６０正常対照群、タンパク質低用量群（０．１μｇ・ｍｌ−１）、中用量群（０．５μｇ・ｍｌ−１）、高用量群（２．５μｇ・ｍｌ−１）を確立する。
【００５７】
２．４ 実験法
[0056]ＮＢ４およびＨＬ−６０細胞を、それぞれ、２４穴プレート内で混合し、１ｍｌ／穴の異なる濃度のｒＬＺ−８を供給し、各群に関して、複数の穴として３穴セットする。これらを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中に２４時間入れ、各濃度の細胞を収集し、あらかじめ４℃に冷却したＰＢＳで細胞を２回洗浄し、２５０μｌの結合緩衝溶液で細胞を再懸濁し、そして細胞密度を１×１０６／ｍｌに調節して、１００μｌを５ｍｌフローサイトメトリー用チューブに取り、そして５μｌアネキシンＶ／ＦＩＴＣおよび１０μｌの２０μｇ・ｍｌ−１ ＰＩ溶液を添加し、混合した後、室温に置いて、そして１５分間、遮光してインキュベーションし、４００μｌ ＰＢＳを添加してフローサイトメトリー分析する。
【００５８】
２．５ 実験結果
[0057]図５および表４は、ＮＢ４−ｒＬＺ−８群およびＨＬ−６０−ｒＬＺ−８群において、アポトーシス率が正常対照群より有意に高く、そしてＨＬ−６０−ｒＬＺ−８群のアポトーシスがまた、ｒＬＺ−８濃度が増加するにつれて上昇することを示す。
【００５９】
表４ ＮＢ４およびＨＬ−６０細胞に対するｒＬＺ−８誘導性アポトーシス率（％）
【００６０】
【表４】
【００６１】
実施例５：マウスＳ１８０エールリッヒ腹水腫瘍に対するｒＬＺ−８による阻害実験
１．実験材料
[0058]吉林大学実験動物センターより提供されたマウス、１８〜２２ｇの雄および雌を等しく分けた；本発明者らの研究室によって提供されたマウス・エールリッヒ腹水細胞株Ｓ１８０；Ｊｉａｎｇｓｕ Ｈｅｎｇｒｕｉ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．によって提供されたシクロホスファミド（ＣＴＸ）、ロット番号：０６１０１９２１。実験群中のＳ１８０腹水腫瘍および固形腫瘍を、正常対照群、陰性対照群、陽性対照群、ｒＬＺ−８低用量治療群（０．２５ｍｇ・ｋｇ−１）、ｒＬＺ−８中用量治療群（０．５ｍｇ・ｋｇ−１）、ｒＬＺ−８高用量治療群（１ｍｇ・ｋｇ−１）に分けた。各群１０匹のマウス。
【００６２】
２．実験法
[0059]Ｓ１８０皮下腫瘍阻害実験法：よく増殖しているＳ１８０細胞を選択し、滅菌生理食塩水で適切に希釈して腫瘍細胞懸濁物にし、１０７・Ｌ−１の細胞数で、各マウスの右の脇の下に０．２ｍｌ皮下接種する（正常対照群を除く）。接種の２４時間後に治療する。正常対照群および陰性対照群には、一匹あたり生理食塩水０．２ｍｌ・ｄ−１を腹腔内注射し；陽性対照群には、シクロホスファミド２０ｍｇ・ｋｇ−１、一匹あたり０．２ｍｌ・ｄ−１を腹腔内注射した。ｒＬＺ−８治療群には、それぞれ尾静脈注射で、一匹あたり０．２ｍｌ・ｄ−１の用量を連続１０日間投与した。投薬のそれぞれ１０日前および１０日後に、眼窩静脈叢から血液を抜き取り、吉林大学第一病院臨床実験室に送り、試験して、そしてＷＢＣ数を分析した。投薬中止翌日にすべてのマウスを頸椎脱臼によって殺し、解剖して、そして腫瘍を取り出し、腫瘍の重量を測定し、以下の等式を用いて阻害率を計算する：
[0060]阻害率（％）＝（対照群の平均腫瘍重量−実験群の平均腫瘍重量）／対照群の平均腫瘍重量×１００％
[0061]Ｓ１８０腹水腫瘍阻害実験法：よく増殖しているＳ１８０細胞を選択し、滅菌生理食塩水で適切に希釈して腫瘍細胞懸濁物にし、１０７・Ｌ−１の細胞数で、各マウスに０．２ｍｌ腹腔内接種する（正常対照群を除く）。接種の２４時間後に治療する。正常対照群および陰性対照群には、一匹あたり生理食塩水０．２ｍｌ・ｄ−１を腹腔内注射し；陽性対照群には、シクロホスファミド２０ｍｇ・ｋｇ−１、一匹あたり０．２ｍｌ・ｄ−１を腹腔内注射した。ｒＬＺ−８治療群には、それぞれ尾静脈注射で、一匹あたり０．２ｍｌ・ｄ−１の用量を連続１０日間投与した。毎日重量測定し、マウスの重量変化を観察し、重量増殖曲線を描く。
【００６３】
３．実験結果：
[0062]Ｓ１８０皮下腫瘍阻害実験結果：表５からわかるように、ｒＬＺ−８の３つの用量は、Ｓ１８０の増殖を阻害可能であり、阻害率は１６．８％、２５．７％および４５．５％である。ｒＬＺ−８治療群の腫瘍重量を陰性対照群と比較すると、非常に有意な相違（ｐ＜０．０１）がある。
【００６４】
[0063]表６からわかるように、投薬前、マウスにおけるＷＢＣ数は、すべての群で同じレベルであり、陰性対照群と比較して、相違は示されなかった（ｐ＞０．０５）。治療１０日後、陰性対照群ＷＢＣ数は正常対照群より高く、ｒＬＺ−８低用量群および中用量群ＷＢＣ数および陰性対照群は相違を示さず（ｐ＞０．０５）、高用量群および正常対照群でもまた相違はなく（ｐ＞０．０５）、陽性対照群のＷＢＣ数は有意に減少し、そして正常対照群および陰性対照群と比較すると、大きな相違があった（ｐ＜０．０１）。
【００６５】
表５． マウス移植Ｓ１８０腫瘍に対するｒＬＺ−８の阻害効果
【００６６】
【化６】
【００６７】
【表５】
陰性対照群との比較、＊Ｐ＜０．０１
表６． マウス移植Ｓ１８０腫瘍の白血球に対するｒＬＺ−８の影響
【００６８】
【化７】
【００６９】
【表６】
陰性対照群との比較、＊ｐ＜０．０１；＊＊ｐ＞０．０５
[0064]Ｓ１８０腹水腫瘍阻害実験結果：実験結果によって、すべての群のマウス腹水は、基本的に同時に現れ、陰性対照群のマウス体重は迅速に増加し、生存時間は減少することが示された。図６から、ｒＬＺ−８群のマウスでは正常群より平均体重が増加するが、陰性対照群よりも比較的小さい傾向がわかる。ｒＬＺ−８は、ある程度まで、マウス腹腔Ｓ１８０腫瘍細胞増殖を阻害したことに注目されたい。
【００７０】
実施例６： マウス肝癌細胞Ｈ２２に対するｒＬＺ−８による阻害実験
１．実験材料
[0065]吉林大学実験動物センターより提供されたマウス、１８〜２２ｇの雄および雌を等しく分けた。本発明者らの研究室によって提供されたマウス肝癌細胞株Ｈ２２。Ｊｉａｎｇｓｕ Ｈｅｎｇｒｕｉ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．によって提供されたシクロホスファミド（ＣＴＸ）、ロット番号：０６１０１９２１。
【００７１】
２．実験法
[0066]Ｈ２２肝癌細胞実験群を、正常対照群、陰性対照群、陽性対照群、ｒＬＺ−８低用量治療群（０．２５ｍｇ・ｋｇ−１）、ｒＬＺ−８中用量治療群（０．５ｍｇ・ｋｇ−１）、ｒＬＺ−８高用量治療群（１ｍｇ・ｋｇ−１）に分けた。各群１０匹のマウス。
【００７２】
[0067]Ｈ２２皮下腫瘍阻害実験法：よく増殖しているＨ２２細胞を選択し、滅菌生理食塩水で適切に希釈して腫瘍細胞懸濁物にし、１０７・Ｌ−１の細胞数で、各マウスの右の脇の下に０．２ｍｌ皮下接種する（正常対照群を除く）。接種の２４時間後に治療する。正常対照群および陰性対照群には、一匹あたり生理食塩水０．２ｍｌ・ｄ−１を腹腔内注射し；陽性対照群には、シクロホスファミド２０ｍｇ・ｋｇ−１、一匹あたり０．２ｍｌ・ｄ−１を腹腔内注射した。ｒＬＺ−８治療群には、それぞれ尾静脈注射で、一匹あたり０．２ｍｌ・ｄ−１の用量を連続１０日間投与した。投薬のそれぞれ１０日前および１０日後に、眼窩静脈叢から血液を抜き取り、吉林大学第一病院臨床実験室に送り、試験して、そしてＷＢＣ数を分析した。投薬中止翌日にすべてのマウスを頸椎脱臼によって殺し、解剖して、そして腫瘍を取り出し、腫瘍の重量を測定し、以下の等式を用いて阻害率を計算した：
[0068]阻害率（％）＝（対照群の平均腫瘍重量−実験群の平均腫瘍重量）／対照群の平均腫瘍重量×１００％
[0069]Ｈ２２腹水腫瘍阻害実験法：よく増殖しているＨ２２細胞を選択し、滅菌生理食塩水で適切に希釈して腫瘍細胞懸濁物にし、１０７・Ｌ−１の細胞数で、各マウスに０．２ｍｌ腹腔内接種する（正常対照群を除く）。接種の２４時間後に治療する。正常対照群および陰性対照群には、一匹あたり生理食塩水０．２ｍｌ・ｄ−１を腹腔内注射し；陽性対照群には、シクロホスファミド２０ｍｇ・ｋｇ−１、一匹あたり０．２ｍｌ・ｄ−１を腹腔内注射した。ｒＬＺ−８治療群には、それぞれ尾静脈注射で、一匹あたり０．２ｍｌ・ｄ−１の用量を連続１０日間投与した。毎日重量測定し、マウスの重量変化を観察し、重量増殖曲線を描く。
【００７３】
３．実験結果：
[0070]Ｈ２２皮下腫瘍阻害実験結果：表７からわかるように、ｒＬＺ−８の３つの用量群は、Ｓ１８０の増殖を阻害可能であり、阻害率は１６．７％、３０．０％および４２．５％であった。ｒＬＺ−８治療群の腫瘍重量を陰性対照群と比較すると、非常に有意な相違（ｐ＜０．０１）がある。
【００７４】
表７． マウス移植腫瘍Ｈ２２に対するｒＬＺ−８の阻害効果
【００７５】
【化８】
【００７６】
【表７】
陰性群との比較、＊ｐ＜０．０１
[0071]表８からわかるように、投薬前、これらの群におけるマウスのＷＢＣ数は、陰性対照群と比較して、同じレベルであり、相違は示されなかった（ｐ＞０．０５）。治療１０日後、陰性対照群ＷＢＣ数は正常対照群のものより高く、ｒＬＺ−８低用量群および中用量群ＷＢＣ数ならびに陰性対照群のものは相違を示さず（ｐ＞０．０５）、高用量群を正常対照群と比較すると相違はなく（ｐ＞０．０５）、陽性対照群のＷＢＣ数は、正常対照群および陰性対照群と比較すると、有意に減少し、有意に相違があった（ｐ＜０．０１）。
【００７７】
表８． マウス移植腫瘍Ｈ２２の白血球に対するｒＬＺ−８の影響
【００７８】
【化９】
【００７９】
【表８】
陰性群との比較、＊ｐ＜０．０１；＊＊ｐ＞０．０５
[0072]Ｈ２２腹水腫瘍阻害実験結果：結果によって、マウスのｒＬＺ−８群が陰性対照群より長く生き残り、陰性対照群のマウスは食欲の喪失を示したが、重量は迅速に増加し、そして運動は減少したことがわかった。図７から、ｒＬＺ−８群では、マウスの体重増加は平均して正常群より大きいが、陰性対照群より少ないことがわかる。これは、ｒＬＺ−８がマウス腹腔内Ｈ２２腫瘍細胞増殖をある程度阻害したことを示す。
【００８０】
実施例７： ｒＬＺ−８蛍光標識、ならびに正常組織細胞およびＨｌ−６０細胞に対するその影響
１． ＦＩＴＣ標識のｒＬｚ−８蛍光
１．１ 実験試薬および装置
[0073]蛍光色素（フルオレセイン−５−イソチオシアネート、ＦＩＴＣ）、ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ（上海）；ジメチルスルホキシド；炭酸緩衝溶液（ｐＨ８〜９．５）（Ｎａ２ＣＯ３ ４．３ｇ、ＮａＨＣＯ３ ８．６ｇ、ｄｄＨ２Ｏを５００ｍｌまで添加）；リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；脱塩Ｈｉｐｒｅｐ ２６／１０脱塩カラム；ＡＫＴＡ精製装置；Ｈｉｔａｃｈｉモデルとしての分光光度計。
【００８１】
１．２ 実験法
[0074]精製ｒＬＺ−８（７．５ｍｇ・ｍｌ−１）２０ｍｌと炭酸緩衝液（ｐＨ８．３）を混合して、一晩透析し、３．７５ｍｇ ＦＩＴＣを重量測定し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）３．７５ｍｌを添加してＦＩＴＣ−ＤＭＳＯ溶液とする。まず、ｒＬＺ−８を小さい５０ｍｌビーカーに入れ、そして次いで、ＦＩＴＣ−ＤＭＳＯ溶液滴をｒＬＺ−８溶液内に混合して、そしてＰＢＳで３０ｍｌに増加させ、磁気スターラーを用いて室温および遮光化で４時間攪拌し、ＡＫＴＡ精製系において、脱塩Ｈｉｐｒｅｐ ２６／１０でカラムを脱塩して、遊離フルオレセインを除去し、７５ｍｌのＰＢＳで溶出し、２８０ｎｍ、４９５ｎｍで検出し、そしてピークを収集する。
【００８２】
１．３ 実験結果：
[0075]調製したＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８（１０倍希釈）を２２０ｎｍ〜５２０ｎｍでスキャンすると、Ａ４９５＝０．４４５、Ａ２８０＝０．６７であり、タグ効率（Ｆ／Ｐ）を計算すると３．８０である。
【００８３】
２． ラット心筋組織に対する標識の影響
２．１ 実験試薬および装置
[0076]Ｌｅｉｃａ ＣＭ１８５０凍結切片作製装置；ウィスターラット；蛍光顕微鏡８０ｉ（Ｎｉｋｏｎ）；等張ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）；ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）；ＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８は本発明者らの研究室で調製される。
【００８４】
２．２ 実験法
[0077]ラットの首を切断し、そして殺し、そして心臓を取り出し、切片作製のために−２０℃に温度が低下するまで、これらを凍結マイクロトームに入れ、そして心筋およびＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８溶液（１００ｎｇ・ｍｌ−１）のＰＢＳ調製物を合わせて３７℃で１時間インキュベーションし、蛍光顕微鏡下で観察し、ブランク対照群を確立した。
【００８５】
２．３ 実験結果：
[0078]心筋組織の蛍光顕微鏡観察下、可視蛍光はなく、ブランク対照群と比較すると、相違はなかった。図８を参照されたい。
【００８６】
３． ウサギ軟骨細胞の初代培養に対する標識の影響
３．１ 実験試薬および装置
[0079]日本白ウサギ（雄、２．５ｋｇ）４匹；手術器具；０．２５％トリプソゲン＋０．０２％ＥＤＴＡ；０．２％コラゲナーゼ；Ｄ−Ｈａｎｋｓ；ＩＭＤＭ培地（５０ｍｌ・ｍｌ−１、ビタミンＣ、二重抗体）；０．０２５ｍｇ・ｍｌ−１ポリリジン溶液；注射用滅菌水（ＷＦＩ）。
【００８７】
３．２ 実験法
[0080]実験動物を固定し、そして空気塞栓によって死亡させ、腹部の中央の皮を剥ぎ、そして肢を暴露し、筋膜をはさみで切り、長骨から背骨を外し、大まかに余分なものを削りながら、膝全体、臀部および肩の骨を注意深く取り除き、Ｄ−Ｈａｎｋｓ内に浸した。組織を入れたビーカーを超清潔装置内に移し、削ってそしてきれいにした後、組織を第二の滅菌Ｄ−Ｈａｎｋｓカップ内に移し；ナイフを組み立て、軟骨の薄い層を取り除き、カーブしたピンセットを用いて、６ｃｍ培養インキュベーター内に移し、Ｄ−Ｈａｎｋｓで３回洗浄し、Ｄ−Ｈａｎｋｓの大部分を廃棄し、眼科用はさみを用いて、軟骨を１ｍｍスライスに切り、Ｄ−Ｈａｎｋｓの大部分を廃棄し、壊れた骨片をすくって取り除き、１０ｃｍ２培養フラスコ内に入れ、消化のため、トリプソゲンＥＤＴＡと３７℃で３０分間混合し；トリプソゲンをコラゲナーゼと置き換え、３７℃のインキュベーターに入れ、１時間ごとに取り出してそして５分間振盪し、４〜４．５時間で消化を終了する。これを調製して細胞懸濁物溶液として、そしてＦＢＳ １５％を含有する３ｍｌ ＩＭＤＭと混合し、５×１０４・ｍｌ−１を培養フラスコ内に接種する。
【００８８】
[0081]２４穴プレート上、細胞を０．５ｍｌ／穴で播種し、ブランク対照群を確立し、最終濃度０．２５μｇ・ｍｌ−１ ＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８ ０．５ｍｌと３７℃で１時間インキュベーションし、細胞を１．５ｍｌ ＥＰ遠心分離（１０００ｒ・分−１、７分間）内に移し、等張ＰＢＳで３回洗浄し、ＥＰ試験管を０．１ｍｌ ＰＢＳと混合し、細胞を再懸濁し、懸濁物をチェックして、蛍光顕微鏡下で観察を行う。
【００８９】
３．３ 実験結果：
[0082]蛍光顕微鏡下で観察すると、ウサギの軟骨細胞型は損なわれておらず（ｉｎｔａｃｔ）、緑色蛍光を伴わず、対照群と比較して、有意な相違はなかった。実験群の写真を図９に示す。
【００９０】
４． Ｈｌ−６０細胞の標識の影響
４．１ 実験試薬および装置
[0083]蛍光顕微鏡８０ｉ（Ｎｉｋｏｎ）、ＩＭＤＭ細胞培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、ＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８および等張ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）を本発明者らの研究室で調製した。
【００９１】
４．２ 実験法
[0084]２４穴プレート上、各穴０．５ｍｌで、２×１０６を接種することによって、ＨＬ−６０を播種し、ＩＭＤＭ（２％ＦＢＳ）培地でＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８を１００ｎｇ・ｍｌ−１に調製し、各穴０．５ｍｌでインキュベーションし（３７℃）、対照群、実験群１時間および実験群６時間を確立し、細胞を１時間および６時間でそれぞれ抜き取って、１．５ｍｌ ＥＰ試験管内で混合し、１０００ｒ・分−１で遠心分離し、上清を除去し、ＦＢＳで３回洗浄し、洗浄後に再懸濁する。
【００９２】
４．３ 実験結果
[0085]図１０は、蛍光顕微鏡下で観察したものであり、１時間および６時間、ＦＩＴＣ−ｒＬＺ−８とともにＨＬ−６０細胞をインキュベーションしたものでは強い緑色蛍光を伴い、６時間群では、細胞の凝集があるが、ブランク対照群では、前者に比較して、緑色蛍光はなく、有意な相違がある。
【００９３】
実施例８： マウスにおける白血球の予防におけるｒＬＺ−８の影響
１． 薬剤調製
[0086]滅菌生理食塩水のｒＬＺ−８調製。これらを５μｇ・ｋｇ−１、２．５μｇ・ｋｇ−１、１．２５μｇ・ｋｇ−１、０．６２μｇ・ｋｇ−１用量群、０．２ｍｌ／片に分けた。
【００９４】
[0087]ＧｅｎｌｅｉＴＭ ＳｃｉｍａｘＴＭ［組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子注射剤（ｒｈＧ−ＣＳＦ）］、製造ロット番号：２００６０４０３；７５μｇ／片を通常の滅菌生理食塩水で調製して、３．２μｇ・ｋｇ−１、０．２ｍｌ／片の調製物にした。
【００９５】
[0088]注射用のシクロホスファミド（ＣＴＸ）（製造ロット番号０７１２１８２１；２００ｍｇ／バイアル）を通常の滅菌生理食塩水で調製して、１２．５ｍｇ・ｋｇ−１、０．２ｍｌ／片の調製物にした。
【００９６】
[0089]３ｍｌ氷酢酸を取り、そしてＨ２Ｏを１００ｍｌまで添加し、次いで、生じた溶液をろ過することによって、酢酸の３％溶液を調製する。
２ 実験法
[0090]マウスを７つの群に分け、そして各群は５匹の雄マウスおよび５匹の雌マウスを含む。同一体積の通常の滅菌生理食塩水を投与した正常対照群のマウスを除いて、各群の各マウスに、１日１回３日間の腹腔内注射を通じて、０．２ｍｌのシクロホスファミド溶液（１２．５ｍｇ・ｋｇ−１）を連続投与した。尾静脈血液試料採取を３日目に行い、血液中の白血球数を顕微鏡下で測定した。モデリングに成功した後、同一体積の滅菌生理食塩水を投与した、正常対照群のマウスおよびシクロホスファミド（ＣＴＸ）治療群のマウスを除いて、各群の前記各マウスを、対応する用量のｒＬＺ−８および陽性薬剤（ＧｅｎｌｅｉＴＭ ＳｃｉｍａｘＴＭ）で治療した。尾静脈血を治療の３日目、７日目、１４日目に、それぞれ収集する。治療前および後の白血球数相違を比較し、そして薬剤効果を分析した。
【００９７】
[0091]白血球数を計数するための方法：赤血球を溶解させるため、３％酢酸溶液で、血液を２０倍希釈する。生じた溶液を白血球計数セル内に滴下し、そして顕微鏡下で白血球数を計数し、そして白血球数／ｍｍ３を計算した。
【００９８】
３ 実験結果
[0092]表９からわかるように、ＣＴＸ群と比較すると、マウスにおけるｒＬＺ−８薬剤群の治療３日目、有意により多いＷＢＣがあり、相違は非常に有意であり、ＷＢＣは治療７日目に回復する。
【００９９】
表９ 低インターロイキンマウスモデルに対するｒＬＺ−８の影響
【０１００】
【化１０】
【０１０１】
【表９】
比較は、ＣＰ対照群間である、＊Ｐ＜０．０１
実施例９： ラットにおける白血球の治療におけるｒＬＺ−８の影響
１． 薬剤調製
[0093]滅菌生理食塩水のｒＬＺ−８調製。これらを２０μｇ・ｋｇ−１、１０μｇ・ｋｇ−１、５μｇ・ｋｇ−１、２．５μｇ・ｋｇ−１、１．２５μｇ・ｋｇ−１、０．６２５μｇ・ｋｇ−１、０．３１μｇ・ｋｇ−１用量群に分けた。
【０１０２】
[0094]ＧｅｎｌｅｉＴＭ ＳｃｉｍａｘＴＭ［組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子注射剤（ｒｈＧ−ＣＳＦ）］、製造ロット番号：２００７１１０４；１５０μｇ／片を通常の滅菌生理食塩水で調製して、９．４５μｇ・ｍｌ−１、０．１ｍｌ／片の調製物にした。
【０１０３】
[0095]注射用のシクロホスファミド（ＣＴＸ）（製造ロット番号０７１２１８２１；２００ｍｇ／バイアル）を通常の滅菌生理食塩水で調製して、４９ｍｇ・ｋｇ−１、０．２ｍｌ／片にした。
【０１０４】
[0096]３ｍｌ氷酢酸を取り、そしてｄＨ２Ｏを１００ｍｌまで添加し、次いで、生じた溶液をろ過することによって、酢酸の３％溶液を調製する。
２ 実験法
[0097]ラットを１０群に分け、そして各群は５匹の雄ラットおよび５匹の雌ラットを含む。同一体積の通常の滅菌生理食塩水を投与した正常対照群のラットを除いて、各群の各ラットに、１日１回３日間の腹腔内注射を通じて、０．２ｍｌのシクロホスファミド溶液（４９ｍｇ・ｋｇ−１）を連続投与した。尾静脈血液試料採取を３日目に行い、血液中の白血球数を顕微鏡下で計数した。モデリングに成功した後、同一体積の滅菌生理食塩水を投与した、正常対照群のラットおよびシクロホスファミド（ＣＴＸ）治療群のラットを除いて、各群の前記各ラットを、対応する用量のｒＬＺ−８および陽性薬剤（ＧｅｎｌｅｉＴＭ ＳｃｉｍａｘＴＭ）で治療した。尾静脈血を、治療の３日目、７日目、１４日目に、それぞれ収集する。治療前および後の白血球数相違を比較し、そして薬剤効果を分析した。
【０１０５】
[0098]白血球数を計数するための方法：赤血球を溶解させるため、３％酢酸溶液で、血液を２０倍希釈する。生じた溶液を白血球計数セル内に滴下し、そして顕微鏡下で白血球数を計数し、そして白血球数／ｍｍ３を計算した。
【０１０６】
３ 実験結果
[0099]表１０からわかるように、ＣＴＸ群と比較すると、ラットにおけるｒＬＺ−８薬剤群の治療３日目、有意により多いＷＢＣがあり、相違は非常に有意であり、ＷＢＣは治療７日目に回復した。
【０１０７】
表１０ 低インターロイキンラットモデルに対するｒＬＺ−８の影響
【０１０８】
【化１１】
【０１０９】
【表１０】
比較は、ＣＰ対照群間である、＊ｐ＜０．０１
実施例１０
放射線照射によるマウスモデルの予防におけるｒＬＺ−８の影響
１． 薬剤調製
[0100]滅菌生理食塩水のｒＬＺ−８調製。これらを５μｇ・ｋｇ−１、２．５μｇ・ｋｇ−１、１．２５μｇ・ｋｇ−１、０．６２μｇ・ｋｇ−１用量群に分ける。０．２ｍｌ／片。
【０１１０】
[0101]ＧｅｎｌｅｉＴＭ ＳｃｉｍａｘＴＭ［組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子注射剤（ｒｈＧ−ＣＳＦ）］、製造ロット番号：２００６０４０３；１５０μｇ／片を通常の滅菌生理食塩水で調製して、３．２μｇ・ｋｇ−１、０．２ｍｌ／バイアルの調製物にした。
【０１１１】
[0102]注射用のシクロホスファミド（ＣＴＸ）（製造ロット番号０７１２１８２１；２００ｍｇ／バイアル）を通常の滅菌生理食塩水で調製して、１２．５ｍｇ・ｋｇ−１、０．２ｍｌ／片とした。
【０１１２】
２ 実験法
[0103]マウスを７つの群に分け、そして各群は５匹の雄マウスおよび５匹の雌マウスを含む。同一体積の通常の滅菌生理食塩水を投与した正常対照群のマウスを除いて、各群の各マウスに、陽性薬剤（ＧｅｎｌｅｉＴＭ ＳｃｉｍａｘＴＭ）および異なる用量のｒＬＺ−８を１日１回５日間連続投与した。放射線照射を５日目に行い、そして放射線照射条件は、１分あたり１５０レントゲンの用量率で７．５０Ｇｙ、１８０ｍＶ、１５ｍＡであった。投与前、および投与５日目、ならびに照射５日目および７日目に、各群のマウスに対して尾静脈血液採取を行い、そして白血球数を計数した。白血球計数法は上述のものと同じである。マウスを重量測定し、そして頸椎脱臼によって屠殺し、脾臓を収集し、そして重量測定し、次いで脾臓指数を計算した。その後、脾臓をブアン液中で固定し、そして６時間後、脾臓表面上の造血巣数（ＣＦＵ−Ｓ）を計数した。
【０１１３】
３ 実験結果
[0104]表１１からわかるように、ＣＴＸモデル群と比較すると、投与５日目、異なる用量のｒＬＺ−８で治療した群のマウスの白血球数は有意に増加しており、そしてＣＴＸ群およびｒＬＺ−８群間には有意差が存在する（ｐ＜０．０５）。ｒＬＺ−８群の白血球数は、放射線照射５日目に最低であり、そして７日目に増加し、そしてモデル群およびｒＬＺ−８群間には有意差が存在する（ｐ＜０．０５）。
【０１１４】
表１１． 照射によるマウスモデルの予防における影響の結果
【０１１５】
【化１２】
【０１１６】
【表１１】
比較は、モデル群間である、＊ｐ＜０．０５
実施例１１
放射線照射によるマウスモデルの治療におけるｒＬＺ−８の影響
１． 薬剤調製
[0105]滅菌生理食塩水のｒＬＺ−８調製。これらを５μｇ・ｋｇ−１、２．５μｇ・ｋｇ−１、１．２５μｇ・ｋｇ−１、０．６２μｇ・ｋｇ−１用量群に分ける。０．２ｍｌ／片。
【０１１７】
[0106]ＧｅｎｌｅｉＴＭ ＳｃｉｍａｘＴＭ［組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子注射剤（ｒｈＧ−ＣＳＦ）］、製造ロット番号：２００６０４０３；１５０μｇ／バイアルを通常の滅菌生理食塩水で調製して、３．２μｇ・ｋｇ−１、０．２ｍｌ／バイアルにした。
【０１１８】
[0107]注射用のシクロホスファミド（ＣＴＸ）（製造ロット番号０７１２１８２１；２００ｍｇ／バイアル）を通常の滅菌生理食塩水で調製して、１２．５ｍｇ・ｋｇ−１、０．２ｍｌ／バイアルの調製物にした。
【０１１９】
２ 実験法
[0108]マウスを７つの群に分け、そして各群は５匹の雄マウスおよび５匹の雌マウスを含む。正常対照群のマウスを除く各群の各マウスに、同体積の通常の滅菌生理食塩水、陽性薬剤（ＧｅｎｌｅｉＴＭ ＳｃｉｍａｘＴＭ）および異なる用量のｒＬＺ−８を、放射線照射当日から腹腔内注射した。放射線照射条件は：１分あたり１５０レントゲンの用量率で７．５０Ｇｙ、１８０ｍＶ、１５ｍＡであった。投与前、ならびに照射５日目、７日目および９日目に、各群のマウスに対して尾静脈血液採取を行い、そして白血球数を計数した。照射７日後、マウスを重量測定し、そして頸椎脱臼によって屠殺し、脾臓を収集し、そして重量測定し、そして次いで脾臓指数を計算した。その後、脾臓をブアン液中で固定し、そして６時間後、脾臓表面上の造血巣数（ＣＦＵ−Ｓ）を計数した。
【０１２０】
３ 実験結果
[0109]表１２からわかるように、ｒＬＺ−８群の白血球数は、照射７日目に最低であり、そして９日目に増加し、そしてモデル群およびｒＬＺ−８群間には有意差が存在する（ｐ＜０．０５）。
【０１２１】
[0110]表１３からわかるように、すべてのｒＬＺ−８群は、脾臓増殖の過形成を刺激した。各ｒＬＺ−８群のマウスの脾臓指数およびコロニー形成単位−脾臓（ＣＦＵ−Ｓ）は、モデル群のマウスのものより高かった（ｐ＜０．０５）。
【０１２２】
表１２． 照射によるマウスモデルの治療における影響の結果
【０１２３】
【化１３】
【０１２４】
【表１２】
比較は、モデル群間である、＊ｐ＜０．０５
表１３． 照射によるマウスモデルにおけるコロニー形成単位−脾臓の数値
【０１２５】
【化１４】
【０１２６】
【表１３】
比較は、モデル群間である、＊ｐ＜０．０１
実施例１２：マウスにおけるｒＬＺ−８が阻害する全身アレルギー反応実験
１．実験試薬
[0111]ｒＬＺ−８（７００μｇ／ｍｌ−１）を通常の生理食塩水で調製して、７００μｇ・ｍｌ−１の調製物にした；水酸化アルミニウム（アジュバント）をＰＢＳ緩衝液で調製して、１５ｍｇ・ｍｌ−１の調製物にした；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびオボアルブミン（ＯＶＡ）。
【０１２７】
２．実験法
[0112]熱源のない環境に置いた４０匹の雄マウス（１５週齢、体重１８〜２２ｇ）を、４群に分けた：ｒＬＺ−８の第Ｉ群、ｒＬＺ−８の第ＩＩ群、陽性対照群、正常対照群。ｒＬＺ−８の第Ｉ群の各マウスに、０．１ｍｌ／１０ｇ体重のｒＬＺ−８を週２回腹腔内注射し、そして全部で６回注射し；２回注射した後、感作のため、前記マウスにＢＳＡ（１ｍｇ）および０．２ｍｌの水酸化アルミニウムの懸濁物（１５ｍｇ・ｍｌ−１）の混合物を腹腔内注射し；そしてこれらに、感作１７日目に、尾静脈を介して、０．２ｍｌ ＰＢＳに加えた１ｍｇ ＢＳＡを注射し、そしてアレルギー反応を観察した。正常対照群の各マウスには、ｒＬＺ−８の代わりに、等体積の通常の生理食塩水を投与した。ｒＬＺ−８の第ＩＩ群の各マウスには、感作１７日目に、静脈を介して、ＢＳＡ−ｒＬＺ−８の混合物（ｒＬＺ−８ ７０μｇ・ｍｌ−１およびＢＳＡ ５ｍｇ・ｍｌ−１、ＰＢＳで調製）を０．１ｍｌ／１０ｇ体重で注射した。陽性対照群の各マウスには、感作１７日目に、静脈を介して、ＢＳＡの代わりに１ｍｇ ＯＡを注射した。観察基準：静脈を通じた注射後、３０分間、全身アレルギー性反応を観察した。陽性反応の判断基準：過剰痙攣症、運動減少または死。陰性反応の判断基準：通常の運動。
【０１２８】
[0113]表１４に示すように、ｒＬＺ−８は、ＢＳＡによって引き起こされたマウスの全身性アレルギー反応を阻害した。ｒＬＺ−８、およびショックを引き起こす用量のＢＳＡを同時注射すると、ｒＬＺ−８は全身性アレルギー反応を予防しなかった。
【０１２９】
表１４． マウスにおいて、ｒＬＺ−８が阻害する全身性アレルギー反応の結果
【０１３０】
【表１４】
実施例１３ ｒＬＺ−８の溶血試験
１．実験試薬
[0114]ｒＬＺ−８を５％グルコース溶液で調製して、１ｍｇ・ｍｌ−１の調製物にした；血液細胞懸濁物調製：ヒト血液４ｍｌを１０００ｒ／分で１０分間遠心分離し、上清を除去する。赤血球沈降物に、５％グルコース溶液を体積の約１０倍添加し、振盪し、１０００ｒ／分で２０分間遠心分離し、上清を除去し、上清が顕著に赤くなくなるまで、洗浄を２〜３回反復する。実験のため、得た赤血球を５％グルコース溶液で調製して、２％懸濁物に調製する。
【０１３１】
２．実験法
[0115]２８の清浄な試験管を取り、そしてこれらに番号を付け、第１〜５番をｒＬＺ−８薬剤群とし、第６番を陰性対照群（５％グルコース溶液）とし、第７番を陽性対照試験管（蒸留水）とし、そして総数４つの平行比較試験管を用意する。２％赤血球懸濁物、５％グルコースまたは蒸留水を順番に供給し、振盪し、これらをインキュベーションするため、３７℃±０．５℃のインキュベーター内に直ちに入れる。１５分ごとに１時間これらを観察した後、３時間で１回観察する。観察終了後、試験管からすべての溶液を遠心分離乾燥試験管に入れ、１５００ｒ・分−１で２５分間遠心分離した。上清を除去し、ＯＤ値に関してブランク蒸留水試験管を読み取って、溶血率を計算する。
【０１３２】
３．実験結果
[0116]表１５中、薬剤群のｒＬＺ−８溶血率は、第１〜５群で＜５％であり、溶血反応の徴候はないことがわかる。
【０１３３】
表１５ ヒト赤血球可溶化に対するｒＬＺ−８溶血の実験結果
【０１３４】
【化１５】
【０１３５】
【表１５】
実施例１４：ラット骨髄像に対するｒＬＺ−８の影響
１．実験試薬
[0117]ウィスター、９匹、約１００ｇ。ｒＬＺ−８を滅菌生理食塩水溶液で６０ｍｇ・ｋｇ−１、３０ｍｇ・ｋｇ−１、１５ｍｇ・ｋｇ−１の３用量群用に調製する。
【０１３６】
２．実験法
[0118]正常対照群３匹（ラット）、タンパク質低用量群２匹、タンパク質中用量群２匹、およびタンパク質高用量群２匹。ｒＬＺ−８薬剤群ラットには、それぞれ、１回／日で、ｒＬＺ−８の異なる用量を尾静脈注射で投与する；正常対照群には等量の生理食塩水を投与する。注射７日目、右大腿骨骨髄をスメアについてチェックする。
【０１３７】
３．実験結果
[0119]図１１に示されるように、ラット骨髄スメアを正常対照群と比較したところ、異常は見られない。
【０１３８】
実施例１５：ヒト赤血球接着に対するｒＬＺ−８の影響
１．実験試薬
[0120]Ａ、Ｂ、ＯおよびＡＢ血液型の健康な志願者から、それぞれ２ｍｌ、ＳＲＢＣ（ヒツジ赤血球）２ｍｌ。上記ＲＢＣを１２００ｇ・分−１で１０分間遠心分離し、上清を除去し、そして５ｍｌ ＰＢＳで洗浄し、上記の操作を３〜５回反復し、そして次いで、１．５％の０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ懸濁調製物を用いる。通常の生理食塩水で最終濃度５０μｇ・ｍｌ−１、２５μｇ・ｍｌ−１、１２．５μｇ・ｍｌ−１、６．２５μｇ・ｍｌ−１、３．１３μｇ・ｍｌ−１、１．５６μｇ・ｍｌ−１、０．７８μｇ・ｍｌ−１、０．３９μｇ・ｍｌ−１、０．２０μｇ・ｍｌ−１、０．１０μｇ・ｍｌ−１、０．０５μｇ・ｍｌ−１、０．０３μｇ・ｍｌ−１に調製する。植物凝集素（ＰＨＡ）調製、前記。
【０１３９】
２．実験法
[0121]実験被験体をｒＬＺ−８濃度群、陽性薬剤対照、および正常対照群に分ける。９６穴赤血球凝集板上、Ａ型１．５％の赤血球２５μｌ／穴を添加し、そして次いで、０．２％ゼラチン、７５μｌ／穴を添加する。薬剤群には、異なる濃度のｒＬＺ−８を上記最終濃度まで添加し；陽性薬剤対照群にはＰＨＡ ２５μｌ／穴を添加し；正常対照群にはＰＢＳ ２５μｌ／穴を添加する。各群６つの平行対照群。通常の室温で３０秒間振盪し、３７℃でインキュベーションし、１時間後に被験体を観察する。Ｂ型、ＡＢ型、Ｏ型、およびＳＲＢＣ（ヒツジ赤血球）に関しては、上記と同じ実験法である。
【０１４０】
３．実験結果
[0122]以下の表１６は、陽性薬剤ＰＨＡが、ヒト赤血球の４つの型すべておよびヒツジ赤血球に対して凝集性であり；ｒＬＺ−８がヒト赤血球の４つの型に対して凝集性ではないが、１２．５μｇ・ｍｌ−１〜５０μｇ・ｍｌ−１の濃度でＳＲＢＣが活性凝集を示すことを示す。
【０１４１】
表１６ ４つの型のヒト赤血球凝集のｒＬＺ−８実験結果
【０１４２】
【表１６】
実施例１６：組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質抗腫瘍調製物
[0123]上記薬理学的実験を通じて、組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質ｒＬＺ−８の抗腫瘍効果およびインターロイキンレベル上昇効果が非常に高く、そして非毒性で副作用を伴わないことが証明される。したがって、抗腫瘍調製物として組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質ｒＬＺ−８が薬剤使用に適切であり、そして安全であると言ってもよい。
【０１４３】
[0124]抗癌薬剤の適用として本発明の組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質ｒＬＺ−８を経口投与し、そして非腸管薬剤送達してもよい。症状、年齢、重量および他の要因によって投薬型を決定してもよい。成人に関しては、１人あたりの経口投薬量は１０〜１０００ｍｇを１日数回であり、非腸管送達は１０〜１００ｍｇを１日数回である。
【０１４４】
[0125]本発明において、経口錠剤、丸剤およびカプセル（硬および軟カプセルを含む）のキットを有し、これらの調製配合物には、組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質ｒＬＺ−８および少なくとも１つの不活性希釈剤（ラクトース、マンノースアルコール、グルコース、デンプン、ポリビニルピロリドンなど）が含まれ、不活性希釈剤薬理学以外に潤滑剤、崩壊剤、安定化剤などの許容されうる添加剤が加わってもよい。必要であれば、１または１より多い層のコーティング上、胃可溶性または溶腸コーティング物質で錠剤または丸剤をコーティングしてもよい。非腸管注射には、組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質ｒＬＺ−８および少なくとも１つの不活性水希釈剤（例えば蒸留注射用水および通常の生理食塩水）が含まれ、組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質ｒＬＺ−８はまた、凍結乾燥粉末であってもよく；該粉末を使用前に注射用不活性希釈水に溶解してもよい。
【０１４５】
（１）調製例１
[0126]組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質ｒＬＺ−８ １０００ｍｇを取り；１００ｍｌの滅菌生理食塩水中に溶解し、均等に混合し、次いで、ｒＬＺ−８ １０ｍｇ／ｍｌ／片の濃度で溶液注射瓶内にこれらをサブパッキングし；密封し、滅菌し、そして製品にした。他の項目は、注射の必要条件下、中国薬局方２００５年版に一致するものとする。
【０１４６】
（２）調製例２
[0127]組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質ｒＬＺ−８ １００ｇ；薬剤デンプン０．５ｋｇを取り、公的に知られる技術および装置にしたがって、これらをカプセル型、ｒｌｚ８ １０ｍｇ／錠剤にし、そして他の項目は、カプセルの必要条件下、中国薬局方２００５年版に一致するものとする。
【０１４７】
（３）調製例３
[0128]組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質ｒＬＺ−８ １００ｇ；結晶セルロース５６０ｇ；無水ラクトース３８０ｇ；ステアリン酸マグネシウム２００ｇを取り、公的に知られる技術および装置にしたがって、これらを丸剤／錠剤、ｒＬＺ−８ １０ｍｇ／錠剤にし、他の項目は、錠剤の必要条件下、中国薬局方２００５年版に一致するものとする。
【０１４８】
（４）調製例４
[0129]適量の組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質ｒＬＺ−８を取り、項目は、経口液体の必要条件下、中国薬局方２００５年版に一致するものとし、公的に知られる技術および装置にしたがって経口液体を製造する。
【産業上の利用可能性】
【０１４９】
[0130]本発明の結果によって、組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質は、多様な理由によって引き起こされる白血球減少症の治療および予防に対して顕著な効果を有し、そして臨床用量、治療効果および臨床的不快感において、現存する臨床薬剤より優れている。動物試験によって、組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質の副作用が、組換えコロニー刺激因子よりはるかに低いことが示される。
【０１５０】
[0131]本発明者らは：ピキア・パストリスの真核生物発現系を用いて、組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質を発現し；世界の類似の研究の中で、最初に、ｒＬＺ−８の１００Ｌ発酵産生を実現し、そして産生および精製プロセスを確立し；そしてｒＬＺ−８の空間的構造の決定を最初に完了し、そしてこうしてｒＬＺ−８の抗腫瘍機構に対してさらに研究するための優れた基盤を提供することに成功した。
【０１５１】
[0132]本発明は、革新的に：ｒＬＺ−８が、低リンパ球レベルを持つ動物モデルの白血球数を増加させるのに有効であり、そしてコロニー刺激因子より明らかに優れた薬力学効果を有し；ｒＬＺ−８が白血病細胞Ｎｂ４、Ｋ５６２およびＨＬ−６０のアポトーシスを誘導可能である（本発明者らは、初めて、これが、真菌免疫調節タンパク質が腫瘍細胞を殺す別の可能な方法であるという結論を導き出した）ことを見出す。腫瘍所持マウスに対する治療実験によって、ｒＬＺ−８がｉｎ ｖｉｖｏで移植腫瘍の増殖を阻害するのに有効であることがさらに示され；安全性実験によって、ｒＬＺ−８がラット血球に対して明らかな病原性を持たず、そして大動脈および大静脈の血管壁に病的な破壊的影響を課さないことが示され；そして骨髄スメアの結果によって、ｒＬＺ−８が造血機能に対して病原性の影響を持たないことが示された。本発明は、初めて、ＬＺ−８の結晶空間的構造を開示し、ＬＺ−８が正常細胞を損傷することなく、腫瘍細胞を直接殺すことが可能であることを開示し、そして多様な理由によって引き起こされる白血球減少症の予防および治療におけるＬＺ−８の新規治療を開示する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の空間的構造を有し、そしてヌクレオチド配列（配列１）によってコードされる組換えマンネンタケ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｉｕｍ）免疫調節タンパク質（ｒＬＺ−８）の、抗腫瘍、白血球数の増加および免疫学的拒絶の阻害のための薬剤調製における使用。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列（配列１）が：
【化１】
であり；
前記組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質（ｒＬＺ−８）のアミノ酸配列が：
【化２】
であり；
前記組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質（ｒＬＺ−８）の高次構造が：
二量体化の形成に必要な重要なＮ末端ドメイン；および
Ｃ末端ＦＮＩＩＩドメインを含み；
前記Ｎ末端ドメインが、αらせん（２−ＳＤＴＡＬＩＦＲＬＡＷＤＶＫ−１５のアミノ酸配列を有し、そして１４アミノ酸からなる）およびβ鎖（１６−ＫＬＳＦＤ−２０のアミノ酸配列を有し、そして５アミノ酸からなる）で構成され、前記αらせん上のＳｅｒ残基がアセチル化によってブロッキングされており；１つのＬＺ−８単量体のＮ末端αらせんおよびβ鎖が、別のＬＺ−８単量体の同じドメインと一緒に、ドメイン交換を介して、重要なダンベル型の二量体結合ドメインを形成しており；Ｃ末端ＦＮＩＩＩドメインが、免疫グロブリン様サンドイッチ構造に属し、そしてそれぞれ、β鎖Ａ−Ｂ−Ｅおよびβ鎖Ｇ−Ｆ−Ｃ−Ｄによって形成される、βシートＩおよびβシートＩＩを含み；β鎖の配列が、Ａ． ２１−ＴＰＮＷＧＲＧ−２７； Ｂ． ３４−ＩＤＴＶＴＦＰ−３９； Ｃ． ４８−ＹＴＹＲＶＡＶ−５４； Ｄ． ５７−ＲＮＬＧＶＫＰ−６３； Ｅ． ７２−ＳＱＫＶＮ−７６； Ｆ． ９１−ＴＩＱＶＦＶＶＤＰＤ−１００； Ｇ． １０２−ＮＮＤＦＩＩＡＱＷ−１１０である
請求項１記載の使用。
【請求項３】
腫瘍が、白血病、肺癌、膵臓癌、肝臓癌、腸癌、リンパ腫、前立腺癌、子宮癌、骨癌、乳癌等である、請求項１記載の使用。
【請求項４】
白血球数の増加に関する適応症が、癌の化学療法および放射線療法によって引き起こされる好中球性顆粒球減少症であってもよい、請求項１記載の使用。
【請求項５】
白血球数の増加に関する前記適応症が、骨髄移植、または骨髄異形成症候群、または骨髄異形成症候群によって引き起こされる好中球性顆粒球減少症であってもよい、請求項４記載の使用。
【請求項６】
白血球数の増加に関する適応症が、再生不良性貧血によって引き起こされる好中球性顆粒球減少症、または先天性もしくは特発性好中球性顆粒球減少症、または周期性好中球性顆粒球減少症であってもよい、請求項４記載の使用。
【請求項７】
白血球数の増加に関する前記適応症が、化学的中毒または放射線への曝露によって引き起こされる白血球減少症であってもよい、請求項４記載の使用。
【請求項８】
白血球数の増加に関する前記適応症が、腸チフス、ウイルス感染、マイコプラズマ肺炎、感染性肺炎、粟粒結核症等を含んでもよい感染性疾患によって引き起こされる白血球減少症であってもよい、請求項４記載の使用。
【請求項９】
白血球数の増加に関する前記適応症が、慣用的な薬剤投与によって引き起こされる白血球減少症であってもよく、そして前記薬剤が、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド、マクロライド、クロロマイセチン、リンコサミドなどの抗生物質薬剤、ポリペプチド等、甲状腺機能亢進症を治療するための薬剤、および糖尿病を治療するための薬剤を含む、請求項４記載の使用。
【請求項１０】
白血球数の増加機能を用いて、化学療法および放射線療法または骨髄移植によって引き起こされる白血球減少症を予防しうる、請求項１記載の使用。
【請求項１１】
免疫学的拒絶の前記阻害が、臓器移植によって引き起こされる免疫学的拒絶の阻害であり；全抗原提示プロセスを抑制するために抗原被覆を行う、請求項１記載の使用。
【請求項１２】
免疫学的拒絶の阻害のための適応症が、肝臓移植または腎臓移植によって引き起こされる免疫学的拒絶、あるいは慣用的免疫抑制剤に対する、肝臓移植または腎臓移植によって引き起こされる免疫学的拒絶の薬剤耐性であってもよい、請求項１０記載の使用。
【請求項１３】
請求項１記載の組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質（ｒＬＺ−８）および場合によって薬学的に許容されうるアジュバントを含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
経口投与されても、そして非経口投与されてもよい、請求項１３記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
経口投与される薬剤が、錠剤、丸剤およびカプセルを含む、請求項１３記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
非経口投与される薬剤が、外用および注射用の薬剤を含む、請求項１３記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
注射剤が凍結粉末注射および液体注射剤を含む、請求項１３記載の薬学的組成物。
【請求項１】
特定の空間的構造を有し、そしてヌクレオチド配列（配列１）によってコードされる組換えマンネンタケ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｉｕｍ）免疫調節タンパク質（ｒＬＺ−８）の、抗腫瘍、白血球数の増加および免疫学的拒絶の阻害のための薬剤調製における使用。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列（配列１）が：
【化１】
であり；
前記組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質（ｒＬＺ−８）のアミノ酸配列が：
【化２】
であり；
前記組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質（ｒＬＺ−８）の高次構造が：
二量体化の形成に必要な重要なＮ末端ドメイン；および
Ｃ末端ＦＮＩＩＩドメインを含み；
前記Ｎ末端ドメインが、αらせん（２−ＳＤＴＡＬＩＦＲＬＡＷＤＶＫ−１５のアミノ酸配列を有し、そして１４アミノ酸からなる）およびβ鎖（１６−ＫＬＳＦＤ−２０のアミノ酸配列を有し、そして５アミノ酸からなる）で構成され、前記αらせん上のＳｅｒ残基がアセチル化によってブロッキングされており；１つのＬＺ−８単量体のＮ末端αらせんおよびβ鎖が、別のＬＺ−８単量体の同じドメインと一緒に、ドメイン交換を介して、重要なダンベル型の二量体結合ドメインを形成しており；Ｃ末端ＦＮＩＩＩドメインが、免疫グロブリン様サンドイッチ構造に属し、そしてそれぞれ、β鎖Ａ−Ｂ−Ｅおよびβ鎖Ｇ−Ｆ−Ｃ−Ｄによって形成される、βシートＩおよびβシートＩＩを含み；β鎖の配列が、Ａ． ２１−ＴＰＮＷＧＲＧ−２７； Ｂ． ３４−ＩＤＴＶＴＦＰ−３９； Ｃ． ４８−ＹＴＹＲＶＡＶ−５４； Ｄ． ５７−ＲＮＬＧＶＫＰ−６３； Ｅ． ７２−ＳＱＫＶＮ−７６； Ｆ． ９１−ＴＩＱＶＦＶＶＤＰＤ−１００； Ｇ． １０２−ＮＮＤＦＩＩＡＱＷ−１１０である
請求項１記載の使用。
【請求項３】
腫瘍が、白血病、肺癌、膵臓癌、肝臓癌、腸癌、リンパ腫、前立腺癌、子宮癌、骨癌、乳癌等である、請求項１記載の使用。
【請求項４】
白血球数の増加に関する適応症が、癌の化学療法および放射線療法によって引き起こされる好中球性顆粒球減少症であってもよい、請求項１記載の使用。
【請求項５】
白血球数の増加に関する前記適応症が、骨髄移植、または骨髄異形成症候群、または骨髄異形成症候群によって引き起こされる好中球性顆粒球減少症であってもよい、請求項４記載の使用。
【請求項６】
白血球数の増加に関する適応症が、再生不良性貧血によって引き起こされる好中球性顆粒球減少症、または先天性もしくは特発性好中球性顆粒球減少症、または周期性好中球性顆粒球減少症であってもよい、請求項４記載の使用。
【請求項７】
白血球数の増加に関する前記適応症が、化学的中毒または放射線への曝露によって引き起こされる白血球減少症であってもよい、請求項４記載の使用。
【請求項８】
白血球数の増加に関する前記適応症が、腸チフス、ウイルス感染、マイコプラズマ肺炎、感染性肺炎、粟粒結核症等を含んでもよい感染性疾患によって引き起こされる白血球減少症であってもよい、請求項４記載の使用。
【請求項９】
白血球数の増加に関する前記適応症が、慣用的な薬剤投与によって引き起こされる白血球減少症であってもよく、そして前記薬剤が、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド、マクロライド、クロロマイセチン、リンコサミドなどの抗生物質薬剤、ポリペプチド等、甲状腺機能亢進症を治療するための薬剤、および糖尿病を治療するための薬剤を含む、請求項４記載の使用。
【請求項１０】
白血球数の増加機能を用いて、化学療法および放射線療法または骨髄移植によって引き起こされる白血球減少症を予防しうる、請求項１記載の使用。
【請求項１１】
免疫学的拒絶の前記阻害が、臓器移植によって引き起こされる免疫学的拒絶の阻害であり；全抗原提示プロセスを抑制するために抗原被覆を行う、請求項１記載の使用。
【請求項１２】
免疫学的拒絶の阻害のための適応症が、肝臓移植または腎臓移植によって引き起こされる免疫学的拒絶、あるいは慣用的免疫抑制剤に対する、肝臓移植または腎臓移植によって引き起こされる免疫学的拒絶の薬剤耐性であってもよい、請求項１０記載の使用。
【請求項１３】
請求項１記載の組換えマンネンタケ免疫調節タンパク質（ｒＬＺ−８）および場合によって薬学的に許容されうるアジュバントを含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
経口投与されても、そして非経口投与されてもよい、請求項１３記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
経口投与される薬剤が、錠剤、丸剤およびカプセルを含む、請求項１３記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
非経口投与される薬剤が、外用および注射用の薬剤を含む、請求項１３記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
注射剤が凍結粉末注射および液体注射剤を含む、請求項１３記載の薬学的組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５−１】
【図５−２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５−１】
【図５−２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１１−５０８７４９（Ｐ２０１１−５０８７４９Ａ）
【公表日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４１００２（Ｐ２０１０−５４１００２）
【出願日】平成２０年１２月３０日（２００８．１２．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００８／００２１４２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９４８５０
【国際公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【出願人】（５１０１８５７８９）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月３０日（２００８．１２．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００８／００２１４２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９４８５０
【国際公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【出願人】（５１０１８５７８９）
【Ｆターム（参考）】
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