組換え伝染性非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルス
【課題】組換えＤＮＡ技術により産生可能な、遺伝子操作による伝染性複製非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルス突然変異体を提供する。
【解決手段】前記突然変異体は、ＲＶゲノムのＯＲＦ、偽遺伝子領域又は非コード化領域に挿入及び／又は欠失を含む。
【解決手段】前記突然変異体は、ＲＶゲノムのＯＲＦ、偽遺伝子領域又は非コード化領域に挿入及び／又は欠失を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子操作による伝染性複製非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルス突然変異体、及びこのような突然変異体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
狂犬病ウイルス（ＲＶ）は、ラブドウイルスファミリーの非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスの一例である。このファミリーに属する他の種は、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、伝染性造血壊死ウイルス（ＩＨＮＶ）、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳ、Ｅｇｔｖｅｄウイルス）、ウシ一過性熱ウイルス（ＢＥＦＶ）、及びｓｏｎｃｈｕｓ ｙｅｌｌｏｗ ｎｅｔウイルス（ＳＹＮＶ）である。
【０００３】
ラブドウイルスファミリーの他に、パラミクソウイルス（例えばセンダイウイルス（ＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）２型及び３型、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、おたふくかぜウイルス（ＭＵＶ）、はしかウイルス（ＭＥＶ）並びにイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ））やフィロウイルスに属するウイルス、及びファミリーに帰属しない数種のウイルス（例えばボルナ病ウイルス；ＢＤＶ）も非セグメント化陰性鎖ＲＮＡゲノムを有する。
【０００４】
種々のファミリーの非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスの全体的なゲノム構成は似通っている。特にパラミクソウイルスとラブドウイルスとの全体的なゲノム構成の相違はごく僅かである（Ｔｏｒｄｏ等，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：３４１−３５７，１９９２）。
【０００５】
ＲＶは全ての温血動物に感染し得、ほぼ全ての場合で発症した後に感染から死に至る。イヌ狂犬病は今でも世界の大部分で重大であり、世界中で年間に発生する推定７５，０００件のヒト狂犬病症例の大半が感染したイヌによるものである。ヨーロッパの多くの国々や、米国、カナダでは、野生生物狂犬病の重大性が増している。
【０００６】
狂犬病の臨床的特性は大半の種で同様であるが、個人差が大きい。狂犬病動物にかまれた後の潜伏期間は通常１４日から９０日であるが、これよりも長くなることもある。１年以上の潜伏期間も報告されている。この疾病では、狂暴性及び緘黙性又は麻痺性の２種の臨床形態が確認されている。狂暴型では、動物は落ち着きがなく、神経質で攻撃的になり、ヒトへの恐怖感を全く喪失し、注意を引く何にでもかみつくためにしばしば危険である。動物はしばしば感情を抑制することができず、“狂水病”の症状が現れる。しばしば、唾液過多となり、光や音への反応が過剰になり、知覚過敏になる。脳炎が進行すると、狂暴性から麻痺に移行し、動物は緘黙型疾病全体で確認される同じ臨床的特徴を示す。末期になると、しばしば麻痺性発作、昏睡状態や呼吸停止が起こり、臨床的徴候が発生してから２〜７日後には死亡する。
【０００７】
狂犬病ウイルスは、狂犬病動物にかまれて、場合によってはそのかすり傷から、又は狂犬病動物のウイルス含有唾液が傷口に入って、体内に侵入する。筋肉のかまれた部位でウイルスが複製し、その後末梢神経末端に侵入し、軸索細胞質のウイルスゲノムが中枢神経系に移動する。脊髄、次いで脳（特に大脳辺縁系）へのウイルスの侵入は、ニューロン機能不全の臨床的徴候と関連する。通常、中枢神経系の感染で狂暴的になるのとほぼ同時に、ビリオンが更に唾液腺の粘液分泌細胞の先端から放出され、高濃度で唾液に送達される。
【０００８】
狂犬病の過程では常に、宿主の特異的な炎症性免疫応答は最小の刺激を受けるにすぎない。この最も妥当な理由は、筋肉や神経細胞では感染が非細胞変性であり、感染が神経系の免疫学的に分離された（sequestered）環境にかなり集中することである。
全てのラブドウイルスのようなＲＶビリオンは、２種の主要構造成分：（ヌクレオキャプシド又はリボ核タンパク質（ＲＮＰ）コア及びＲＮＰコアを包囲する二層膜形態のエンベロープ）からなる。全てのラブドウイルスの感染成分はＲＮＰコアである。ゲノムＲＮＡは陰性センスであるため、メッセンジャーとしては機能し得ないが、ｍＲＮＡ転写のために自身の内在性ＲＮＡポリメラーゼを必要とする。ＲＮＡゲノムは、２種の少量タンパク質、即ちＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）及びリンタンパク質（Ｐ）と組合わさったヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質によってキャプシド内に被包されてＲＮＰコアを形成する。膜成分は２種のタンパク質（トランスメンブラン糖タンパク質（Ｇ）及び膜の内側に位置する基質（Ｍ）タンパク質）を含んでいる。Ｇタンパク質はＲＶの細胞付着や膜融合を担い、更には、宿主免疫系の主標的である。
【０００９】
転写中に、ゲノムは短いリーダーＲＮＡとモノシストロニックでキャップ構造を有する５個のポリアデニル化ｍＲＮＡとの逐次合成を指示する。複製中に、シストロン間の条件転写終結及び開始シグナルが、ウイルスポリメラーゼによって無視される。トランスクリプターゼ反応及びレプリカーゼ反応では共に、ＲＮＡゲノムと複合体形成したＮ−タンパク質の存在やＬ及びＰタンパク質が必要である。ＲＶゲノムの遺伝子順が決定され、図１に示すように３’−リーダー−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｇ−Ｌ−５’である。転写直後にＲＶのｍＲＮＡの各々が翻訳される。複製中に２つの事象が逐次実施され、即ちまずゲノムと相補的な被包化完全陽性鎖ＲＮＡが産生され、次いで同様にＮ、Ｌ及びＰタンパク質によって被包された完全陰性鎖ＲＮＡが産生される。最後に、作成及び発達（ｂｕｄｄｉｎｇ）プロセス中に新しく作成されたＲＮＰコアがＭタンパク質やＧタンパク質と結合すると、完全に形成された伝染性ＲＶビリオンが放出される。
【００１０】
１１．９ｋｂゲノムＲＶ ＲＮＡは、Ｇ遺伝子とＬ遺伝子との間に偽遺伝子領域（Ψ）が存在すること以外に、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬタンパク質をコードする５個の読み取り枠（ＯＲＦ）を含んでいる（図１）。
【００１１】
現存の非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスワクチンは、化学的に不活化したウイルスワクチン、又は細胞培養で何度も継代させて病原性を低減させた弱毒化ウイルス株を含む改変生ウイルスワクチンからなる。化学的に不活化した狂犬病ワクチンは例えば、Ｒａｂｉｖａｃ、Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ（ヒト）、ＨＤＣ、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ（ヒト）、Ｂａｙｏｖａｃ−ＬＴ、Ｂａｙｅｒ（動物）、Ｍａｄｉｖａｃ、Ｈｏｅｃｈｓｔ（動物）、Ｅｐｉｖａｘ−ＬＴ、Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ、Ｒａｂｉｓｉｎ、Ｒｈｏｎｅ−Ｍｅｒｉｅｕｘである。前述の弱毒化ＲＶウイルスの例は、ワクチン株ＳＡＤ Ｂ１９及びＥＲＡである。不活化ワクチンは一般に、ごく低レベルの免疫しか誘発しないので、繰り返し免疫する必要がある。更には、不活化処理で病原体の中和誘発抗原決定基が変化して、ワクチンの防御潜在能力が低下することがある。
【００１２】
一般に、弱毒化生ウイルスワクチンは、しばしば体液反応及び細胞反応の両方に基づく免疫反応を誘起するので好ましい。しかしながら、細胞培養継代中は、非調整突然変異がウイルスゲノム内に導入されて、毒性や免疫性に関して不均一なウイルス粒子集団が得られ得る。細胞培養継代中の過剰弱毒化はこれらのワクチンでは問題となり得る。ワクチンが尚防御的でありながら毒性をもたないように微妙なバランスを図らなければならない。更には、このような従来の弱毒化生ウイルスワクチンが毒性を取り戻して、接種動物が発病し、病原体が他の動物に伝染する可能性があり得ることもよく知られている。
【００１３】
更には、生ウイルスワクチン併用での問題は、抗原成分が相互に影響を受けて、１種以上の構成成分の潜在能力が低下することである。
【００１４】
更には、現在投与されている生弱毒化又は不活化ＲＶワクチンでは、特定動物がＲＶフィールドウイルスのキャリアーであるのか、それともその動物がワクチン接種を受けたのかを決定することが不可能である。従って、ＲＶワクチンの接種を受けた動物と、フィールドウイルスに感染した動物とを区別して、毒性フィールドウイルスの伝染を抑制する適切な措置を図れることが重要であり得る。通常感染した宿主動物で抗体を産生するＲＶの（糖）タンパク質をコードする遺伝子に突然変異を導入することにより、例えば血清学的に同定可能なマーカーを導入することができる。
【００１５】
例えば得られる突然変異体ＲＮＡが弱毒化するか又は外来タンパク質（例えば免疫マーカータンパク質又は病原体の抗原）のエピトープをコードする異種核酸配列を含むように、調節しながらＲＶ ＲＮＡゲノム内に突然変異を導入することが望ましい。このために、ＤＮＡウイルスや陽性鎖ＲＮＡウイルスを用いた組換えＤＮＡ技術が既に広範に使用されている。組換えＤＮＡウイルスの例は、アウジェスキーウイルス（ＰＲＶ）；アデノウイルス；ワクシニアウイルスである。組換え陽性鎖ＲＮＡウイルスの例は、アルファウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ Ｖ．，Ｓｅｍｌｉｋｉ ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ：Ｈ．Ｖ．Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｍ．Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｘｉｏｎｇ，Ｓ．Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ（１９８９）ＲＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ３，８５−９１）、ピコルナウイルス（Ｐｏｌｉｏ ｖｉｒｕｓ，Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ−ｖｉｒｕｓ，Ｆｏｏｔ− ａｎｄ ｍｏｕｔｈ−ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ：Ｊ．Ｗ．Ａｌｍｏｎｄ及びＫ．Ｌ．Ｂｕｒｋｅ（１９９０）Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｓｅｍｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．１，１１−２０）である。ＲＮＡウイルスゲノムの特異的（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ）遺伝子操作は、特定のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって鋳型として受容される組換えＲＮＡの産生能力に依存する。多数の標準的なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ又は細胞ＲＮＡポリメラーゼＩＩ）によって産生され、ウイルスゲノムを模倣する転写体は、多数の陽性鎖ＲＮＡウイルスのポリメラーゼによって認識される。これにより、ｃＤＮＡ転写体から伝染性ウイルス又はレプリコンが回収され、組換えＤＮＡ技術を適用してこれらのゲノムを部位特異的に操作することができる。陽性鎖ＲＮＡウイルスのゲノムに対応するＲＮＡはウイルスポリメラーゼの翻訳用ｍＲＮＡとして機能し得るので、ゲノム類似体を細胞内に導入することにより感染サイクルが開始し得る。しかしながら、陰性鎖ＲＮＡウイルスのポリメラーゼの鋳型は専ら、ＲＮＰ複合体である。更には、陽性鎖ＲＮＰウイルスとは対照的に、そのゲノム又は抗ゲノムＲＮＡはｍＲＮＡとして機能し得ず、従って人工ＲＮＡの複製や転写に関与する全てのウイルスタンパク質はトランスで提供しなければならない。
【００１６】
陰性鎖ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡ類似体をセグメント化ゲノムでキャプシド内に被包して適切な鋳型を提供するための適切な系が最近Ｐａｌｅｓｅ，Ｐ等によって開示されている（ＷＯ９１／０３５５２号）。インフルエンザウイルスゲノムセグメント由来のＲＮＡ転写体を精製タンパク質でキャプシド内にｉｎ ｖｉｔｒｏ被包し、これをヘルパーウイルスと併用して細胞をトランスフェクトすることができる。しかしながら、非セグメント化ゲノムを有するウイルスであるＲＶではこのアプローチは成功しないことが知見された。ウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含むＲＮＡゲノムの主要部分が欠失しているＶＳＶ及びＲＶの短いモデルゲノムをプラスミドコード化タンパク質でキャプシド内に被包して発現させることができた（Ｐａｔｔｎａｉｋ，Ａ．Ｋ．等，Ｃｅｌｌ ６９，１０１１−１０２０，１９９２；Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ，Ｋ−Ｋ．及びＭ．Ｓｃｈｎｅｌｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８，７１３−７１９，１９９４）。このアプローチは、任意にリポーター遺伝子インサートを含んでいるゲノム類似体とトランスフェクトしたプラスミドに由来する特定のウイルスタンパク質の両方を同時に発現して、欠陥ウイルス粒子を産生することからなった。Ｂａｌｌａｒｔ等は、伝染性はしかウイルス、更には非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスのクローン化ｃＤＮＡからの産生方法を記載している（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，９：３７９−３８４（１９９０））。この方法に関するヨーロッパ特許は、前記文献の著者が発明者の一人として加わって出願されている。
【００１７】
しかしながら、想定される全ての組換えウイルスは全く組換え体ではなく、単に最初に使用したワクチン株の後代ウイルスであることが別の研究によって判明したので、前記文献及び特許明細書は共に取り下げられている。
【００１８】
従って、全ゲノムの操作を必要とする大きな非セグメント化ゲノムを含む伝染性組換え陰性鎖ＲＮＡウイルスの産生は今日まで成功していないと結論付けなければならない。
【発明の開示】
【００１９】
本発明は、組換えＤＮＡ技術により産生可能であり、ＲＶゲノムのＯＲＦ、偽遺伝子領域又は非コード化領域に挿入及び／又は欠失を含む、遺伝子操作による伝染性複製非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルス突然変異体を提供する。
【００２０】
特に本発明は、パラミクソウイルスファミリー及びラブドウイルスファミリーの非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスを提供する。
【００２１】
前述したように、非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスファミリー間のゲノム構成には大きな相同性が認められる。複製、作成、細胞付着又は細胞融合のプロセスでのコード化タンパク質の機能が似通っている場合、これらのタンパク質は更に“類似体”と称する。例えばあるファミリーの２種のタンパク質の機能が他のファミリーで１種のタンパク質に統合していることもある。例えば、一緒になってラブドウイルスの糖タンパク質Ｇと同じ機能を有するパラミクソウイルスのＦタンパク質とＨＮタンパク質の場合がそうである。この場合、あるファミリーの２種のタンパク質は、他のファミリーの１種のタンパク質の類似体（ａｎａｌｏｇｏｎｓ）とみなされる。
【００２２】
対応するウイルスＯＲＦ、偽遺伝子領域又は非コード化領域に適切な突然変異を取り込むことにより、１個以上の核酸残基の挿入や欠失をＲＶゲノムに導入することができる。この改変は、ＲＶ ＯＲＦ又は親ＲＶの偽遺伝子の遺伝子情報を変化させて、本発明の挿入又は欠失ＲＶ突然変異体を得ることである。
【００２３】
１種以上のヌクレオチドが他のヌクレオチドで置換される突然変異、いわゆる置換は欠失と挿入の作用を組み合わせた結果であると考えられる。従って、この種の突然変異は更に、欠失及び（／又は）挿入という用語に含まれると考えられる。
【００２４】
本明細書に記載する任意の突然変異が、得られるＲＶ突然変異体が尚も伝染性で複製する、即ち突然変異体ＲＶが感受性細胞に感染し得、その突然変異体ＲＮＡゲノムが自律的に複製や転写を行い得る、即ちＲＶのＮ、Ｐ及びＬタンパク質の同時発現が不要であるように、適切なＲＶ配列を変化させることからなることは明白である。
【００２５】
たった１回感染して、複製し得る突然変異体ＲＶ（Ｖｉｄｅ ｉｎｆｒａ）も本発明に含まれることは言うまでもない。
【００２６】
種々のＲＶ株のゲノム構成は同一である。ワクチン株ＳＡＤ Ｂ１９及び毒性株ＲＶのヌクレオチド配列や推定上のアミノ酸配列の分析も決定されている（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ等，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７５，４８５−４９９，１９９０及びＴｏｒｄｏ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４，２６７１−２６８３，１９８６；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，３９１４−３９１８，１９８６；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６５，５６５−５６７，１９８８）。Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ等の文献（１９９０（上掲））では、ＳＡＤ Ｂ１９株のウイルスゲノムが１１，９２８ヌクレオチドを含み、５個のウイルスタンパク質Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬの推定上のアミノ酸配列が、病原性ＰＶ株のものと非常に類似していることが確定している。同明細書ではＲＶの各ＯＲＦ、偽遺伝子領域及び遺伝子間非コード化領域の位置が決定されており、ＲＶのＮ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬ遺伝子のコード化領域はそれぞれ、位置７１−１４２３、１５１４−２４０７、２４９６−３１０４、３３１７−４８９１、５４１４−１１７９７に対応する。偽遺伝子領域（Ψ）は位置４９６１−５３５９に存在し、５個のシストロンを分かち、転写開始及び終結／ポリアデニル化シグナルを含む非コード化配列に隣接する遺伝子間領域は位置１４８３−１４８４；２４７６−２４８０；３２８５−３２８９；５３６０−５３８３に存在する。突然変異を導入するために本明細書で使用する親ＲＶ株のＯＲＦ、偽遺伝子領域又は非コード化領域の番号付けやヌクレオチド配列は必ずしもＳＡＤ Ｂ１９又はＰＶ株のものと同一ではないが、前述したこれらの領域の特性は、任意のＲＶ株のゲノム上での位置を正確に限定する。
【００２７】
毒性親ＲＶ株からの弱毒化ＲＶの産生方法は、ウイルスタンパク質をコードするＯＲＦ内に挿入及び／又は欠失を導入して、例えば宿主細胞付着や膜融合のためのウイルスタンパク質の活性を改変する、例えば低減することである。ＲＶについては、トランスメンブラン糖タンパク質Ｇのアミノ酸配列の変化がＲＶの病原性に有意に作用することが知られている。更には、弱毒化に関しても、基質（Ｍ）タンパク質の変化がＧタンパク質のコンホーメーションに影響して、ウイルスを弱毒化し得る。従って、Ｇ又はＭタンパク質をコードするＯＲＦに欠失又は挿入を含む突然変異体ＲＶが本明細書で特に好ましい。
【００２８】
僅か１回感染して、複製し得る伝染性複製狂犬病ウイルス突然変異体も本明細書に含まれる。その利点を以下で説明する。
【００２９】
一般的な組換え生ワクチンは安全で効果的であることが証明されているが、このワクチンウイルスは、このウイルスに対する感受性がより高い他の動物に伝染する危険性がある。
【００３０】
従って、政治的、倫理的、及び一部には科学的見地から、この分野で組換えウイルスを使用することは非常に不本意である。
【００３１】
特に、遺伝学的に改変したワクチンウイルス、とりわけ外来遺伝子を発現する生ウイルスに関しての監視当局（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）による危険アセスメント研究では、環境でのこれらのウイルスの拡散の可能性の観点が非常に重要な観点である。
【００３２】
従って、生ウイルスワクチンの全ての利点を示すが、接種する動物に限定され、拡散しない狂犬病ウイルスワクチンが非常に望ましいと理解することができる。
【００３３】
このようなウイルスは例えば、Ｍ（基質）タンパク質をコードするＭ遺伝子の突然変異によって産生され得る。Ｍタンパク質はウイルスの作成で重要な役割を果たす一方、更に糖タンパク質Ｇの取り込みやコンホーメーションに影響を及ぼす。
【００３４】
トランスでＭタンパク質を産生する操作済細胞で、機能的Ｍタンパク質の欠失したＭ（−）突然変異体を増殖させると、天然宿主に対する伝染性に関して野生型ウイルスのように挙動する健全なウイルス粒子が産生される。しかしながらこれらの粒子はＭタンパク質合成のための遺伝子情報が欠失しているために、宿主細胞に感染すると、新しい伝染性ウイルスを産生することができない。
【００３５】
従って、前記ウイルス粒子は宿主に包含されたままである。このようなウイルスの利点を以下で説明する。
【００３６】
従って、好ましい実施態様では、本発明は、基質タンパク質Ｍをコードする読み取り枠の挿入及び／又は欠失によって、非機能的基質タンパク質Ｍを産生するか又は基質タンパク質Ｍを存在させないことに関する。基質タンパク質Ｍが非機能的であるか又は不在であるＭ（−）突然変異体ウイルスを、基質タンパク質Ｍ類似体をトランスで提供する細胞で増殖させて、ウイルスの表現型を相補的なものにしなければならない。
【００３７】
あるいは、例えばＧ遺伝子の突然変異によってこのようなウイルスを産生することができる。Ｇタンパク質は前述したように、感染や、細胞付着及び膜融合のプロセスで早期に重要な役割を果たす。
【００３８】
糖タンパク質Ｇがひどく損なわれているか（又は不在である）ために、得られたＧ突然変異体ウイルスがもはや他の細胞に感染し得ない程度まで挿入及び／もしくは欠失により（又は全Ｇ遺伝子の欠失により）Ｇ遺伝子を突然変異させることが可能である。このような突然変異体はＧ−マイナス（Ｇ−−）突然変異体とも称される。
【００３９】
従って、Ｇ遺伝子のこの種の突然変異は単に毒性を低下させる前述の突然変異よりも困難である。実際のＧ−突然変異体は機能的糖タンパク質Ｇが欠失しているので、非感染性である。
【００４０】
このようなＧ−突然変異体ウイルスをＧタンパク質に対して相補性の組換え宿主細胞で増殖させると、表現型はＧ陽性であるが、遺伝子型がＧ陰性の後代ウイルスが分泌される。
【００４１】
これらのウイルスは、Ｇ陽性ウイルスに比べて重要な利点を有する。一方では、これらのウイルスは、膜内にＧタンパク質を有するために非相補性宿主細胞に感染し得る。感染した細胞では、Ｇ突然変異体ウイルスは野生型ウイルスとして複製する。これは、組換えウイルス内にクローニングされる異種遺伝子を含む全ウイルスゲノムが増殖し、コードされたゲノム産物が野生型ウイルスと同様に発現、処理されるという利点を有する。
【００４２】
しかしながら他方では、正常宿主細胞はＧタンパク質を合成せず、突然変異体ウイルス自体の遺伝型がＧ陰性であるために、伝染性後代ウイルスを宿主で産生することはできない。
【００４３】
従って、Ｇ突然変異体ウイルスに感染した動物は環境で伝染性ウイルスを拡散しない。これによりＧ突然変異体（及び前述のＭ（−）突然変異体）はワクチン基材として非常に安全なものとなる。
【００４４】
あるいは、本発明のＧ−突然変異体は、細胞付着である役割を果たすことが知られている他の非狂犬病糖タンパク質と表現型が相補的になり得る。
【００４５】
ウイルス膜から環境内に突出する糖タンパク質が細胞特異性を決定することが知られているので、全く相補性の（ｒｉｇｈｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）糖タンパク質を選択することにより、組換え伝染性狂犬病ウイルス突然変異体の標的を、狂犬病の天然宿主細胞以外の特異細胞とすることが可能である。
【００４６】
これらの糖タンパク質は、糖タンパク質Ｇのように細胞特異的付着に関与することを示すために“糖タンパク質Ｇ類似体”とも称される。
【００４７】
ウイルスによっては、細胞特異性を決定する“糖タンパク質Ｇ類似体”が糖タンパク質ではなく、非グリコシル化タンパク質であることに留意すべきである。これらのタンパク質も本発明の範囲内であることは明白である。
【００４８】
従って、本発明の他の好ましい実施態様では、糖タンパク質Ｇをコードする読み取り枠内の挿入及び／又は欠失は、糖タンパク質Ｇを非機能的とするか又は不在とするようなものである。糖タンパク質Ｇが非機能的であるか又は不在であるＧ（−）突然変異体ウイルスを、糖タンパク質Ｇ類似体をトランスで提供する細胞で増殖させて、ウイルスの表現型を相補的にしなければならない。
【００４９】
本発明の更に好ましい実施態様では、相補性のために使用する糖タンパク質類似体は狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ自体である。
【００５０】
糖タンパク質Ｇ類似体を含む組換え伝染性狂犬病ウイルスは、いくつかの重要な利点を有する：
ａ）前記ウイルスは、選択する糖タンパク質Ｇ類似体の標的に依存して、ある細胞、器官又は宿主を特異的に標的とし得る。
【００５１】
これは、例えば呼吸管又は消化管を特異的に標的とすることができることを意味している。従って、例えば所定の部位で粘膜応答が得られ得る。あるいは、免疫系の特異細胞を標的とすることができる。
ｂ）前記ウイルスは更に、前述したように非狂犬病病原体に由来するエピトープをコードする外来遺伝子情報のキャリアーであり得る。
【００５２】
あるいは、前記ウイルスは、毒性物質をコードする外来遺伝子情報のキャリアーであり得る。
【００５３】
本発明のウイルスの非常に重要な適用は、ａ）の糖タンパク質Ｇ類似体及びｂ）の外来遺伝子情報の両方を有するウイルスを用いて行われる。
【００５４】
特異的な細胞型を標的とし、通常非狂犬病ウイルスの攻撃を受けると同時に、非狂犬病ウイルスの免疫防御性決定因子を保有する組換え伝染性狂犬病ウイルスを本発明の方法で産生することができる。
【００５５】
このようなウイルスは、糖タンパク質Ｇ類似体の遺伝子情報が欠失しているために、非狂犬病ウイルスに対する宿主で免疫を誘発すると同時に全く安全である。
【００５６】
本発明の他の重要な実施態様は、例えばＣＤ４細胞を標的とし、ＨＩＶ ｇｐ１２０による遺伝子型相補化によりＨＩＶの標的細胞を示し、任意に細胞毒性タンパク質をコードする本発明のウイルスである。
【００５７】
このようなウイルスは、ＣＤ４細胞を選択的に攻撃し、一旦これらの細胞内に入ると、細胞を死滅させる。
【００５８】
あるいは、本発明の組換え伝染性狂犬病ウイルスは、現時点では安全な生ワクチンが存在していない毒性／病原性ウイルスに対する非常に安全なワクチンを提供し得る。例えばウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）糖タンパク質Ｇ類似体で相補化してＢＲＳＶの天然標的細胞を標的として、ＢＲＳＶの免疫防御性エピトープを発現する組換え伝染性狂犬病ウイルスは、このような疾病の非常に安全なワクチンとなる。
【００５９】
パラインフルエンザウイルスワクチンは今日まで、ＢＲＳＶワクチンと同じ問題に直面している。従って、パラインフルエンザ糖タンパク質Ｇ類似体及びパラインフルエンザの別の免疫原性エピトープを含む組換え伝染性狂犬病ウイルスは、この疾病の良好で安全なワクチンとなる。
【００６０】
組換え伝染性狂犬病ウイルスを基材とする他の重要な動物ワクチンは、
ｉ）トロウイルス；ウマ、ウシ及びブタトロウイルス、
ｉｉ）コロナウイルス；ウシ、イヌ、ブタ及びネココロナウイルス、特にそのスパイクタンパク質
の免疫原性決定因子を組換え狂犬病ウイルス内に導入することにより産生される。
【００６１】
従って、本発明の最も好ましい実施態様は、糖タンパク質Ｇ類似体を補体結合し、病原性ウイルス又は微生物のエピトープ又はポリペプチドをコードする異種核酸配列を保有する組換え伝染性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ（−）突然変異体に関する。
【００６２】
あるいは、酵素活性が低下するようにＲＶレプリカーゼ又はトランスクリプターゼの酵素活性を変化させてＲＶを弱毒化して、宿主動物の感染で伝染性の低いビリオンを産生することができる。Ｎ、Ｐ及びＬタンパク質はＲＶポリメラーゼ活性に関与するので、Ｎ、Ｐ又はＬタンパク質をコードするＯＲＦ内に挿入又は欠失を有するＲＶ突然変異体も本発明の一部分である。
【００６３】
本発明のＲＶ欠失及び／又は挿入突然変異体を使用して宿主にワクチン接種し、前記ＲＶ突然変異体を含むワクチンを投与した宿主と、親ＲＶに感染した宿主とを（血清学的に）区別することができる。本発明のこの実施態様では、ＲＶ挿入突然変異体のインサートは、接種した宿主の特異的な非ＲＶ免疫応答を誘発し得る異種エピトープをコードしてもよいし、ＣＡＴ又はｌａｃＺのような酵素活性を有するタンパク質をコードしてもよい（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ及びＳｃｈｎｅｌｌ、１９９４、上掲）。このようなインサートの取り込みのために好ましい領域は、ＲＶ偽遺伝子領域である。実施例で示すように、ＲＶの主要機能（例えば感染又は複製に必要な機能）を損なわずに、この領域で挿入及び欠失を実施することができる。ＲＶ欠失突然変異体は、その免疫応答が通常ワクチン接種により生じるＲＶタンパク質のエピトープが欠失していてもよい。特に、Ｇタンパク質をコードするＯＲＦに欠失を含むＲＶ突然変異体がこの目的に適している。ＲＶ挿入突然変異体の場合、挿入は、血清学的マーカー抗原又はそのエピトープをコードする核酸配列を含んでいる。
【００６４】
本発明の別の実施態様では、特異的な病原体の１個以上の異なる異種エピトープ又はポリペプチドを発現し得るＲＶ突然変異体を提供する。このような突然変異体を使用して、動物（家畜動物及び非家畜動物を含む）に野生動物狂犬病や前記病原体に対するワクチンを接種することができる。
【００６５】
このような生ベクターワクチンを接種して、ＲＶポリペプチドと共に異種エピトープ又はポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏ発現する接種宿主内でＲＶ突然変異体を複製することが好ましい。次いで、接種した宿主内で発現されたポリペプチドは、ＲＶ及び特定病原体の両方に対する免疫応答を誘発する。特定病原体に由来する異種ポリペプチドが防御的免疫応答を刺激し得るならば、本発明のＲＶ突然変異体を接種した動物は、その後の病原体感染や、ＲＶ感染に対して免疫がある。従って、ＲＶゲノムの適切な領域内に取り込まれた異種核酸配列を連続的にｉｎ ｖｉｖｏ発現することにより、病原体に対して確実、安全で寿命の長い免疫性を提供する。
【００６６】
特に、本発明は、特異的な病原体のエピトープ又はポリペプチドをコードする核酸配列の挿入を含み、該挿入が偽遺伝子領域で実施されることを特徴とするＲＶベクターを提供する。
【００６７】
所望とあれば、偽遺伝子領域の一部又は全体を前述のＲＶベクターで欠失させることができる。
【００６８】
ＲＶゲノムの適切な領域内への取り込みについては、イヌパルボウイルス、イヌコロナウイルス及び従来のブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）のエピトープ又はポリペプチドをコードする核酸配列を考察することが好ましい。
【００６９】
伝染性複製ウイルスを産生させることができなかったため、ＲＶの非セグメント化陰性鎖ＲＮＡゲノムの組換えＤＮＡ技術によるＤＮＡレベルでの操作は今日まで不可能であった。しかしながら、本明細書では、突然変異を組換えＤＮＡ技術によりＤＮＡレベルでウイルスゲノムのコード化領域又は非コード化領域内に作成し、次いでゲノム内に突然変異を保有する伝染性複製ＲＶを産生する方法を提供する。
【００７０】
本発明の方法は、
ａ）ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞内に、
１）ＲＶのＮ、Ｐ及びＬタンパク質をコードする１個以上のＤＮＡ分子と、
２）ＲＶのｃＤＮＡゲノムを含むＤＮＡ分子
とを導入し、
ｂ）前記細胞によって産生されるウイルスを単離する
段階からなる。
【００７１】
通常、狂犬病ウイルスゲノムのｃＤＮＡは、ゲノム内に突然変異を取り込むことにより改変される。
【００７２】
しかしながら、この方法を使用して、例えば汚染したＲＮＡプールを精製してもよい。この場合、元の突然変異していないｃＤＮＡを使用する。
【００７３】
タンパク質をコードするプラスミドを備えた異種インサートを含むＲＶのモデルミニゲノムのレスキュー効率は極めて低く、更にはインサート長さと相関関係にあるという事実を考慮すれば（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ及びＳｃｈｎｅｌｌ、１９９４、上掲）、トランスフェクトした全長ゲノムＲＮＡに由来する増殖性感染が、ＲＶのＮ、Ｐ及びＬタンパク質をコードするプラスミドと同時にトランスフェクトすることにより開始され得るとは予想できない。これは、同時に発現された陰性鎖ゲノムＲＮＡ転写体とハイブリダイズすると予想される、トランスフェクトしたタンパク質をコードするプラスミドにより、多量の陽性センスのＮ、Ｐ及びＬ特異的ＲＮＡが産生されるだけに一層そうである。しかしながら、ゲノムの半分以上に作用し得る可能なハイブリダイゼーションは、重要なエンカプシデーション段階に介在すると思われた。更には、Ｎ、Ｐ及びＬ ｍＲＮＡの翻訳は影響を受け得る。実際、標準的なトランスフェクションプロトコルでは伝染性ウイルスは産生できないことが知見された。しかしながら、実施例に記載するように、代替トランスフェクションプロトコルと、陽性鎖抗ゲノムＲＮＡ転写体を生成するＲＶ ｃＤＮＡゲノムの使用とを組み合わせれば、遺伝学的に作成された複製ＲＶが得られた。
【００７４】
前述の方法では、組換えＤＮＡ技術により親ＲＶのゲノム内に突然変異をｉｎ ｖｉｔｒｏ取り込み、次いで前記突然変異を有する伝染性複製ＲＶ突然変異体を産生することができる。突然変異は限定はされないが、ＲＶ親ゲノムのＲＶタンパク質をコードするＯＲＦ、非コード化領域（例えば偽遺伝子領域）又は転写シグナル配列内への核酸残基の挿入、欠失又は置換を包含する。
【００７５】
非コード化遺伝子間領域内での突然変異の作成は特異的なウイルス遺伝子の転写に影響し、ｍＲＮＡの転写及びその後のタンパク質（Ｍ及びＧタンパク質のようなエンベロープタンパク質又はＮ、Ｐ及びＬタンパク質のようなポリメラーゼ活性に関与するタンパク質）の翻訳が低減して、突然変異体の（伝染性）後代ウイルスの産生能力が低下するために弱毒性を特徴とするウイルス突然変異体が得られる。特に、この遺伝子間領域及び／又は転写シグナル配列での１個以上の核酸残基の置換は、転写効率に影響し得る。
【００７６】
更には、毒性に関与する毒性ＲＶのゲノムの領域（例えばＧタンパク質をコードするＯＲＦ）で、前述の方法を適用して行う１個以上の核酸残基の置換は本発明の一部である。
【００７７】
このような突然変異により、毒性ＲＶ株のＧタンパク質で１個のアミノ酸が交換されて病原性が（一部分）損なわれる。例えばＡｒｇ（３３３）がＩｌｅ、ＧｌｕもしくはＧｌｎで、又はＬｅｕ（１３２）がＰｈｅもしくはＴｒｐで置換され得る。
【００７８】
本発明の方法では、ＲＶ遺伝子情報を含むＤＮＡ分子は好ましくは、トランスフェクトした宿主細胞によって同時発現されるポリメラーゼにより認識可能な適切な転写イニシエーター及びターミネーター配列を備えたプラスミドを含んでいる。
【００７９】
本発明の好ましい方法は、ＲＶ ＤＮＡでトランスフェクトした宿主細胞を使用することからなり、前記細胞は、ワクシニアウイルス組換え体から例えば細胞質で発現されるバクテリオファージＴ７ ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを発現し得る。この場合、ＲＶ ＤＮＡを含むプラスミドは、Ｔ７プロモーター及びターミネーター配列を備えている（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ及びＳｃｈｎｅｌｌ、１９９４、上掲）。
【００８０】
生ワクチンを製造するため、例えばＢＨＫ又はヒト二倍体細胞に由来する細胞培養で本発明の組換えＲＶ突然変異体を増殖させることができる。組織細胞培養液及び／又は細胞を収集することにより、このようにして増殖させたウイルスを収集することができる。生ワクチンは懸濁液の形態で調製してもよいし、凍結乾燥してもよい。
【００８１】
ワクチンは、免疫学的に有効な量の組換えＲＶの他に、医薬的に許容可能なキャリアー又は希釈剤を含み得る。
【００８２】
本発明で有用な医薬的に許容可能なキャリアー又は希釈剤の例には、ＳＰＧＡのような安定剤、炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、グルコース、デキストラン）、ウシ血清又はスキムミルクのようなタンパク質、及び緩衝液（例えばリン酸緩衝液）が含まれる。
【００８３】
場合によっては、アジュバント活性を有する１種以上の化合物をワクチンに添加してもよい。適切なアジュバントは例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、（例えばＢａｙｏｌ Ｆ（Ｒ）もしくはＭａｒｃｏｌ ５２（Ｒ）の）油状エマルジョン、サポニン又はビタミンＥ溶解物である。
【００８４】
有用な投与量は、ワクチン接種すべき哺乳動物の種類、年齢、体重及び投与方法によって異なる。
【００８５】
投与量は広範囲で変動し得る。例えば１０２〜１０７ｐｆｕ／動物が適量である。
【００８６】
特定の投与量は例えば約１０６ｐｆｕ／動物であり得る。
【００８７】
本発明のＲＶ突然変異体を使用して、不活化ワクチンを製造することもできる。
【００８８】
動物への投与では、本発明のＲＶ突然変異体をとりわけ経口投与、経鼻投与、皮内投与、皮下投与又は筋肉内投与することができる。
【００８９】
本発明のＲＶワクチンをイヌだけでなく、主要ベクター、即ちアライグマ、スカンク及びキツネに投与することができる。更には、従来のブタ熱ウイルスのようなブタ病原体の異種遺伝子を発現し得る生ＲＶベクターのイノシシへのワクチン接種も考えられる。
【００９０】
（実施例）
【実施例１】
【００９１】
伝染性複製ＲＶビリオンの調製
全長ＲＶ ｃＤＮＡの構築（図２）。
【００９２】
ＲＶ株ＳＡＤ Ｂ１９の全ゲノムに及ぶｃＤＮＡのクローニングは以前に発表されている（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ等、１９９０、上掲；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３１０４６）。本明細書で使用するＲＶヌクレオチドやアミノ酸の番号付けは、Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ等、１９９０（上掲）のものに対応する。ＳＡＤ Ｂ１９全長ＤＮＡクローンの作成基材として、転写プラスミドｐＳＤＩ−１に含まれるＲＶミニゲノム配列（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ及びＳｃｈｎｅｌｌ、１９９４、上掲）を使用した（図２）。ｐＳＤＩ−１は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターと、肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）抗ゲノムリボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）配列との間に挿入されたＳＡＤ Ｂ１９ゲノム３’末端及び５’末端（それぞれＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチドの１−６８及び１１７６０−１１９２８）を含む。陽性鎖ＳＤＩ−１転写体（ｐＳＤＩ−１プラス）を産生するプラスミドを生成するために、１１塩基プライマー（５’−ＡＣＧＣＴＴＡＡＣＡＡ−３’）を用いて、ｐＳＤＩ−１に含まれるＲＶ配列をまずＰＣＲで増幅した。このプライマーは、ＲＶゲノム末端の相補性のために、陽性センス及び陰性センスの両方のウイルスＲＮＡの５’末端に対応する。Ｔ７プロモーター配列、次いで３個のＧ残基（下線）（５’−ＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）を含む合成ＥｃｏＲＩ／ブラントアダプター（Ｔ７／３）をその後増幅ＲＶ配列に部分結合した後、結合産物をｐＸ８ｄＴのＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ部位にクローニングした。このプラスミドは、元のＴ７プロモーターを含む多重クローニング部位のＢｓｓＨＩＩ／ＣｌａＩ断片が欠失しているｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の誘導体である。このプラスミドは、ＳｍａＩ部位に８４塩基ＨＤＶ抗ゲノムリボザイム配列を含み、直後にはＢａｍＨＩ部位にクローニングされたＴ７転写ターミネーター配列を含んでいる。プラスセンスＲＶ配列の上流にＴ７プロモーターを含む構築物を、制限分析及び配列決定により同定した。次いで、ｐＳＤＩ−１のＭｕｎＩ−ＢｇｌＩＩ断片（ＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチド４０−６８）を、種々のＳＡＤ Ｂ１９ ｃＤＮＡクローンの３個の断片（ＭｕｎＩ−ＳｐｈＩ（ｐＺＡＤ１−９に由来のＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチド４０−４８２）；ＳｐｈＩ−ＡａｔＩＩ（ｐＳＡＤ１３に由来の４０４１−４２７３）及びＡａｔＩＩ−ＢｇｌＩＩ（ｐＳＡＤ８５に由来の１１４７２−１１７５９））に由来する、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩに作成された１ｋｂ ＭｕｎＩ／ＢｇｌＩＩ ｃＤＮＡで置換して、ｐＳＤＩ−１１７０を得た。ＮｃｏＩ（ＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチド４８２−４０４１）によりクローンｐＳＡＤ２５及びｐＳＡＤ１３から作成したＳｐｈＩ断片、及びＸｈｏＩ（ＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチド４２７３−１１４７２）によりクローンｐＳＡＤ４９及びｐＳＡＤ８５から作成したＡａｔＩＩ断片をｐＳＤＩ−１１７０の単一のＳｐｈＩ及びＡａｔＩＩ部位に挿入して、最終全長クローンｐＳＡＤ Ｌ１６を完成した。環状プラスミドを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を実施し、産物を変性アガロースゲルで分析した。１２ｋｂ ＲＶゲノムＲＮＡと共に移動するＲＮＡ転写体の存在は、全長抗ゲノムＲＮＡがＴ７ポリメラーゼによって転写されることを示していた。
【００９３】
伝染性組換えＲＶの回収
ＲＶのタンパク質Ｎ、Ｐ、Ｌをコードするプラスミドと、プラスミドｐＳＡＤ Ｌ１６とのコトランスフェクションをＣｏｎｚｅｌｍａｎｎ及びＳｃｈｎｅｌｌ，１９９４（上掲）に記載された方法で実施した。
【００９４】
以前に発表された方法でトランスフェクション実験を実施した。クローンＢＳＲ細胞のＢＨＫ−２１を、１０％ウシ血清を補充したイーグル培地を含む３．２ｃｍ直径の皿に入れて一晩増殖させ８０％の集密度にして、組換えワクシニアウイルスｖＴＦ７−３をｍ．ｏ．ｉ．５で感染させた（Ｆｏｕｒｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，８１２２−８１２６、１９８６）。１時間放置したｐｏｎｔｉｆｉｃａｔｉｎｇ細胞を、ウシ血清を含まない培地で２度洗浄し、哺乳動物トランスフェクションキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；ＣａＰＯ４プロトコル）を供給業者の指示に従って用いて、５μｇのｐＴ７Ｔ−Ｎ、２．５μｇのｐＴ７Ｔ−Ｐ及び２．５μｇのｐＴ７Ｔ−Ｌを含むプラスミド混合物、並びに２μｇのｐＳＡＤ−Ｌ１６プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトしてから４時間後に沈殿物を除去し、細胞を洗浄し、１０％ウシ血清を含むイーグル培地でインンキュベートした。ｐＳＡＤ−Ｌ１６に由来するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写体のキャプシド内被包、及びヌクレオキャプシドに由来するＲＶタンパク質の発現を間接蛍光法で検査した。組換えＲＶゲノムからのみ発現し得るＲＶ Ｇタンパク質に対するモノクローナル抗体を使用して培養物をスクリーニングした。トランスフェクトしてから１日後、染色細胞が存在していた。このことは、ＲＶゲノム由来の遺伝子の発現を実証している。しかしながら、一連の２０のトランスフェクション実験では、１個の陽性細胞群のみが観察された。これらの実験では、伝染性ウイルスの存在を示す蛍光細胞フォーカスは得られなかった。更には、２日後に、トランスフェクトした細胞に由来する全上清を接種した細胞培養物からは、伝染性ウイルスを回収することができなかった。従って、トランスフェクトした細胞で産生した推定上の非常に少量の伝染性ウイルスを単離するために、実験手順を変更した。トランスフェクタントウイルスを単離するために、細胞及び上清をトランスフェクトしてから２日後に採取した。細胞をゴムポリスマンで掻き取って、上清に懸濁させた。この懸濁液を３サイクル凍結融解処理した（−７０℃／３７℃、それぞれ５分）。細胞破片や、このような条件下で凝集物を生成する過剰ワクシニアウイルスをｍｉｃｒｏｆｕｇｅ内にて１０，０００ｇで１０分間遠心分離にかけてペレット化した。全上清を使用して、培養皿に集密性単層の細胞を接種した。２時間インキュベートした後に、上清を２ｍｌの新しい培地に代えた。ワクシニアウイルスによって生じる細胞変性効果（ｃｐｅ）が感染から１〜２日後に観察された。１０，０００ｇで遠心分離した後に、平均で僅か１０個のプラークが観察された。感染から２日後に、全単層の抗Ｎ結合体（Ｃｅｎｔｏｃｏｒｅ）による直接免疫蛍光染色により、ｃｐｅが検出不能であるＲＶ細胞感染を実証した。２０のうち２つの実験で、蛍光フォーカスが観察され、各上清は、ｃＤＮＡ転写体から生成されるトランスフェクタントウイルスを示すと思われる伝染性ＲＶ（ＳＡＤ Ｌ１６）を含んでいた。
【００９５】
フォーカスが観察される培養物に由来する上清の半分を１０，０００ｇで遠心分離にかけた後に第２の継代で使用した。更なる継代（それぞれ２日）のために、ＲＶ感染の程度によってより少ない上清の分注液を使用した。ワクシニアウイルスを完全に除去するために、全ての細胞の感染に関与する培養物（第三継代）に由来する上清をｍｉｃｒｏｆｕｇｅにて２度、１４，０００ｇで１０分間ずつ遠心分離した。次いで、滅菌ＭＩＬＬＥＸ−ＶＶ ０．１μｍフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ０１７３０）を用いて最終上清を濾過し、次いでこれを使用して組換えＲＶの高力価ストックを生成した。
【００９６】
以下の実施例では後半のトランスフェクション及び単離プロトコルを使用した。
【実施例２】
【００９７】
ＲＶ偽遺伝子領域へのオリゴヌクレオチドの挿入
ＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチド３８２３−６６６８を示すｐＳＡＤ Ｌ１６の２．８ｋｂ ＸｈｏＩ−ＳｃａＩ断片を含むサブクローンｐＰｓｉＸ８でΨの操作を実施した。次いで、改変ｐＰｓｉＸ８プラスミドのＳｔｕＩ断片を単離し、これを使用して全長クローンｐＳＡＤ Ｌ１６（図１）の対応断片（ＳＡＤ Ｂ１９位置４０１４−６３６４）を置換した。ｐＰｓｉＸ８をＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、エキステンションをクレノー酵素でフィルインし、再結合することにより、４個のヌクレオチドをΨに挿入して、新たなＮｈｅＩ部位を生成した。ヌクレオチド５３３８−５３４１を重複させて、最後の全長クローンｐＳＡＤ Ｕ２をＳＡＤ Ｌ１６と区別する。
【００９８】
トランスフェクトした細胞に由来する抽出物を上清と一緒に新しい細胞に移動させた後に、伝染性ウイルスの生成が実証された。各一連の実験では、一実験でフォーカス形成が観察された。更に２回上清を新しい細胞に移して、トランスフェクタントウイルス（クローンＳＡＤ Ｕ２−１３及びＳＡＤ Ｕ２−３２）を継代すると、細胞がほぼ１００％感染した。ＳＡＤ Ｕ２ウイルスゲノム内への挿入を実証するために、全ＲＮＡをＳＡＤ Ｕ２−１３に感染した細胞から単離し、Ψの逆トランスクリプターゼ−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。それぞれＧ遺伝子及びＬ遺伝子に特異的なプライマーＧ３Ｐ及びＬ４Ｍ（図１）を使用して、トランスフェクタントウイルスＳＡＤ Ｕ２、ＳＡＤ Ｌ１６、及び標準ＲＶ ＳＡＤ Ｂ１９のゲノムから約７３０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。しかしながら、ＳＡＤ Ｕ２から得られるＰＣＲ ＤＮＡではなく、ＳＡＤ Ｂ１９及びＳＡＤ Ｌ１６から得られるＰＣＲ ＤＮＡでのみ、その後のＨｉｎｄＩＩＩでの消化が観察された。逆に、ＳＡＤ Ｕ２由来のＤＮＡだけがＮｈｅＩで消化されて、それぞれ約５３０ｂｐ及び２００ｂｐの２個の断片が得られた（図３）。トランスフェクタントウイルスＳＡＤ Ｕ２のゲノムＲＮＡの直接ＲＴ配列決定により更に、予測される部位に予想される４個の残基の挿入の存在が確定され、決定した配列の残部は元のＳＡＤ Ｂ１９ゲノムのものに対応していた。従って、ＳＡＤ Ｕ２ウイルスが、作成されたｃＤＮＡに由来するゲノムを含むトランスフェクタントウイルスを示すことは明白であった。
【００９９】
ＲＶΨの末端付近に４個のヌクレオチドを導入しても、トランスフェクタントウイルスＳＡＤ Ｕ２の生存に影響せず、この導入はＧ ｍＲＮＡの正しい転写終結も阻害しなかった。
【実施例３】
【０１００】
Ｇコード化領域とＬコード化領域との間の挿入又は欠失によるＲＶ転写の改変
ＳｔｙＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで二重に消化し、クレノーフィルインし、再結合して、３９６塩基（ＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチド４９４２−５３３７）を欠失させた。最終構築物はｐＳＡＤ Ｗ９であった。ｐＳＡＤ Ｖ＊の構築のために、ＳＡＤ Ｂ１９ Ｎ／Ｐシストロンボーダー領域を含む１８０ｂｐ ＢｇＩＩＩ−ＡｓｕＩＩ断片をｐＳＡＤ１３から単離した（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ等、１９９０、上掲）。その断片は、Ｎコード化領域の９７ヌクレオチドと、全３’非コード化領域と、Ｎ転写終結／ポリアデニル化シグナル、遺伝子間領域、及び転写開始シグナルを含むＰシストロンの最初の１６ヌクレオチドからなるＮ／Ｐシストロンボーダーとを含んでいた。まずｃＤＮＡ断片を、３’陥凹末端をクレノー酵素でフィルインした後のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした（ｐＮｉｇＰ−１８０）。ｐＮｉｇＰからＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで切り出し、ブラント末端を産生した後、それぞれ１６ｐｂ及び３４ｂｐのベクター由来配列に隣接するＲＶインサートを含む２３０ｂｐ断片産物をｐＰｓｉＸ８のフィルインしたＳｔｙＩ部位にクローニングした。かくして、最終全長構築物（ｐＳＡＤ Ｖ＊）は、ｐＳＡＤ Ｌ１６に匹敵する２３４ｂｐの挿入を有していた。
【０１０１】
前述のように、ｐＳＡＤ Ｖ＊及びｐＳＡＤ Ｗ９を使用して、２０個の培養皿をそれぞれトランスフェクトした。ＳＡＤ Ｖ＊でトランスフェクトした３個の培養物及びＳＡＤ Ｗ９でトランスフェクトした１個の培養物で、生存可能なウイルスをその後単離することによりレスキューが示された。５回続けて継代した後に、感染細胞由来のＲＮＡ及び上清を単離し、前述の実験と同一のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにより分析した。標準ＳＡＤ Ｂ１９ウイルスと比較して、ＳＡＤ Ｖ＊に感染した細胞のＲＮＡから約０．９ｋｂの拡大ＤＮＡ断片が得られ、このことは、このトランスフェクタントウイルスのΨ領域に付加された配列が存在することを示した（図４）。対照的に、ＳＡＤ Ｗ９に感染した細胞のＲＮＡからは、僅かに０．３ｋｂのＤＮＡ断片が得られた。この寸法は、ｃＤＮＡゲノムコピーで行われた欠失によるものと推測された。ＰＣＲ産物の配列決定により更に、最初に作成したｃＤＮＡ配列がＳＡＤ Ｖ＊及びＳＡＤ Ｗ９トランスフェクタントウイルスのゲノム内にレスキューされることが確定した。従って、Ｇ読み取り枠とΨとの間に付加された配列（例えば５０個のベクター由来ヌクレオチド）が存在しても、全Ψを欠失しても、トランスフェクタント狂犬病ウイルスの感染性や増殖は妨げられなかった。ＳＡＤ Ｖ＊及びＳＡＤ Ｗ９のゲノム内に作成される改変は、転写パターンに表現型の変化をもたらすように設計され、これが各トランスフェクタントウイルスの増殖性に影響するかどうかを調査した。しかしながら、細胞培養での増殖及び伝染性ＳＡＤ Ｖ＊及びＳＡＤ Ｗ９ウイルスの最終力価は、標準ＳＡＤ Ｂ１９ ＲＶの場合と同様であった。ｍ．ｏ．ｉ．０．０１で細胞感染させてから３日後に、ＳＡＤ Ｂ１９、ＳＡＤ Ｖ＊及びＳＡＤ Ｗ９の上清で１０８フォーカス形成単位（ｆｆｕ）の力価に達した。このことは、ＲＶ Ψが細胞培養の増殖で重要でないことを示している。
【０１０２】
Ψ特異的プローブを用いると、Ψ欠失ＳＡＤ Ｗ９ウイルスに感染した細胞に由来するＲＮＡでハイブリダイゼーションは検出されなかった。他のウイルスのゲノムＲＮＡ及びＳＡＤ Ｂ１９及びＳＡＤ Ｌ１６のＧ ｍＲＮＡはこのプローブで認識されたが、ＳＡＤ Ｖ＊Ｇ ｍＲＮＡは反応しなかった。対照的に、ＳＡＤ Ｖ＊Ψ配列に先行する余分のＰ遺伝子転写開始シグナルの存在によって予測される新たな余分のΨ−ｍＲＮＡの寸法に相当する弱いＲＮＡバンドが出現した。天然ＲＶとは対照的に、トランスフェクタントウイルスＳＡＤ Ｖ＊は、ゲノムが６個の機能的シストロンからなるＲＶを示している。
【実施例４】
【０１０３】
組換えＲＶ由来の外来タンパク質コード化遺伝子の発現
ブラント末端をクレノー酵素で生成した後に、実施例３に記載した多重制限部位に隣接するＮ／Ｐシストロンボーダーを含む２３０ｂｐ ｃＤＮＡ断片を、全長ｃＤＮＡ ｐＳＡＤ Ｌ１６の偽遺伝子領域のＢｓｔＸＩ部位（ＳＡＤ Ｂ１９位置４９９５）に導入した。得られたｃＤＮＡ ｐＳＡＤ Ｖを細菌クロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の導入基材として使用した。ｐＳＡＤ ＸＣＡＴを得るため、全ＣＡＴコード化領域を含むｐＣＭ７（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の０．８ｋｂ ＤＮＡ断片を、偽遺伝子配列の上流のＮ／Ｐシストロンボーダーに含まれるｐＳＡＤ ＶのＡｓｕＩＩ部位にクローニングした。ｐＳＡＤ ＶＣＡＴの構築のために、偽遺伝子配列（ＳＡＤ Ｂ１９位置５３３７）の末端付近に位置する、ＡｓｕＩＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間のｃＤＮＡを欠失し、クレノー酵素でブラント末端を形成した後に、ｐＣＭ７由来のＣＡＴコード化ＨｉｎｄＩＩＩ−ＤＮＡで置換した。従って、組換えＲＶ ＳＡＤ ＸＣＡＴの転写により、偽遺伝子配列を非翻訳化３’領域として有するＣＡＴ ｍＲＮＡが得られるはずであり、ＳＡＤ ＶＣＡＴは偽遺伝子配列の欠失したＣＡＴ ｍＲＮＡを転写するはずである。
【０１０４】
実施例１に記載したようにＲＶのＮ、Ｐ及びＬタンパク質、ｐＳＡＤ−ＸＣＡＴ、ｐＳＡＤ−ＶＣＡＴをそれぞれコードするプラスミドをトランスフェクトした後に、組換え狂犬病ウイルスはレスキューされた。ワクシニアウイルスを除去した後に、組換えＲＶの転写パターンをノーザンハイブリダイゼーションで分析した。両方のウイルスは、予想される寸法及び組成のＣＡＴ ｍＲＮＡを転写した（図５）。ＣＡＴ酵素活性の発現を、２種のウイルスに感染した細胞でそれぞれ標準ＣＡＴアッセイ（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ及びＳｃｈｎｅｌｌ、１９９４、上掲）により決定した。両者とも、ＣＡＴを効果的に発現することが知見された。細胞培養細胞での連続継代により、導入した外来配列が遺伝学的に安定であることが判明した。４０継代後でも、両方のウイルスはＣＡＴを効果的に発現した（図６）。感染動物の組換えウイルスの発現や挙動を調べるために別の実験を実施した。６週齢マウス（５匹ずつ）に１０４ｆｆｕのＳＡＤ ＶＣＡＴ、ＳＡＤ ＸＣＡＴ及び標準配列ＲＶ ＳＡＤ Ｌ１６をそれぞれ大脳内注射した。感染から７日後に、全ての動物は典型的な狂犬病の症状を示し、次週までに狂犬病で死亡した。ＳＡＤ ＶＣＡＴ及びＳＡＤ ＸＣＡＴにそれぞれ感染したマウスの脳でＣＡＴ活性が示された。両方のウイルスをマウス脳から再度単離することができ、これらはＣＡＴ細胞培養を発現した。従って、外来遺伝子は、伝染性ＲＶのゲノムに導入して、安定的に発現させることができ、更には組換えウイルスを区別するためのマーカーとして機能し得る。
【実施例５】
【０１０５】
組換えＲＶ由来の異種ウイルス抗原の発現及びＲＶ及び異種ウイルスに対する免疫応答の誘導
従来のブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）のゲノムは、３種の構造糖タンパク質（Ｅ０、Ｅ１及びＥ２）をコードする。ＣＳＦＶ感染動物では、中和抗体はＥ２に対するものであり、Ｅ０は細胞免疫応答を誘発する。ＣＳＦＶ株ＡｌｆｏｒｔのＥ２タンパク質及びＥ０タンパク質それぞれのコード化領域を包含するｃＤＮＡを使用して、実施例４に記載したようにｐＳＡＤ ＶのＡｓｕＩＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間の偽遺伝子を置換した。実施例１で詳述したように、組換えウイルス（それぞれＳＡＤ−ＶＥ０及びＳＡＤ−ＶＥ２）をトランスフェクション実験から回収した。感染細胞では、ウイルスはそれぞれＣＳＦＶ Ｅ０タンパク質及びＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を発現した（図７）。
【０１０６】
組換えウイルスＳＡＤ ＶＥ０及びＶＥ２を使用して、経口経路によりブタを免疫した。通常、キツネを弱毒化ＲＶ ＳＡＤ Ｂ１９株で経口免疫するために使用されている標準的なキツネ餌に１０７ｐｆｕのＳＡＤ−ＶＥ０、ＳＡＤ−ＶＥ２及びＳＡＤ Ｂ１９をそれぞれ導入した。各調製物の餌をそれぞれ２匹のブタに２回与えた（ブタ＃１及び＃２：ＳＡＤ ＶＥ０、＃３及び＃４：ＳＡＤ Ｂ１９、＃５及び＃６：ＳＡＤ ＶＥ２）。免疫から４週間後に、ＲＶ及びＣＳＦＶに対する中和抗体の存在を分析した。＃５の場合を除いて、全てのブタは、ワクチン餌の吸収を確定するＲＶ中和抗体（力価＞２５０）を有していた。従って、ブタ５は以後考察しなかった。ブタ＃６は、１６より大きい力価でＣＳＦＶ中和抗体を産生した。予想通り、ブタ＃１〜＃４はＣＳＦＶ中和抗体を産生しなかった。免疫から５週間後に、１０７ｐｆｕのＣＳＦＶ株Ａｌｆｏｒｔで経鼻攻撃した。攻撃後にブタの白血球数と体温を監視し、これをそれぞれ図８及び図９に示す。全てのブタは発熱したが、ブタ＃１、＃２、＃６はより早く回復した。対照動物＃４は典型的なＣＳＦＶ症状を示し、攻撃から１５日後に死亡し、対照＃３は２１日目に死亡した。ＳＡＤ ＶＥ２を与えたブタにＣＳＦＶ中和抗体が存在し、ＳＡＤ ＶＥ０又はＳＡＤ ＶＥ２の投与を受けたブタが一部感染予防を示すことは、２種の異種ウイルスに対する体液免疫反応及び細胞免疫反応が共に、経口経路による投与後に組換えＲＶ生ワクチンによって誘発され得ることを実証している。
【実施例６】
【０１０７】
Ｇ遺伝子配列内への突然変異導入による弱毒化ＲＶの生成
標準ウイルスＳＡＤ Ｂ１９ほどは効率的に増殖しないウイルスを生成するために、突然変異Ｇタンパク質を有する組換え体を調製した。
【０１０８】
このために、Ｇタンパク質の最後の４６アミノ酸をコードする配列を欠失させた。Ｇタンパク質コード化プラスミド：ｐＴ７Ｔ−Ｇ（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ及びＳｃｈｎｅｌｌ、１９９４、上掲）をＡｆｌＩＩＩ（ＳＡＤ Ｂ１９配列の位置４７５２）及びＥｃｏＲＶ（後半部位はプラスミドの多重クローニング部位に存在する）で消化し、クレノー酵素によりブラント末端を生成した。得られたＡｆｌＩＩＩ末端及びＥｃｏＲＶ末端を結合すると、前者のＡｆｌＩＩＩ配列に翻訳終結コドンが形成された。改変領域を含む０．３ｋｂ ＤＮＡ ＰｐｕＭＩ−ＳＭａＩ断片を使用して、ｐＳＡＤ Ｌ１６の本物のＰｐｕＭＩ−ＢｓｔＸＩ断片４４６９−４９９５を置換した。この操作により、Ｇタンパク質細胞質テールのカルボキシ末端４６ａａ及び偽遺伝子配列の一部分をコードするＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチド４７５３−４９９５が欠失した。別の結果は、新しいＧ翻訳終結コドンのすぐ下流に１８個のベクター由来ヌクレオチドが導入されることである。
【０１０９】
実施例１に記載したように組換えＲＶ（ＳＡＤ ＤＣＤ）を回収した。予想通り、端を切り取ったＧタンパク質はＳＡＤ ＤＣＤに感染した細胞で発現された（図１０）。標準配列ウイルスＳＡＤ Ｌ１６と比較して、ＳＡＤ ＤＣＤウイルスではｍ．ｏ．ｉ．１で細胞に感染させた後に１００分の１の力価が得られた。更には、細胞培養物で低い伝染速度が観察され（図１１）、このことはＧタンパク質の先端を切ることで、ビリオンの作成が低下するか又はビリオンの細胞感染が低下することを示している。感染動物でのＳＡＤ ＤＣＤの挙動を分析するために、５匹のマウスに１０５ｆｆｕのＳＡＤ ＤＣＤを脳内注射し、５匹のマウスに同量のＳＡＤ Ｌ１６を脳内注射した。
【実施例７】
【０１１０】
トランス相補化による狂犬病ウイルスＧ−マイナス（Ｇ−）突然変異体の生成
ＲＶゲノム由来の全Ｇタンパク質コード化領域を欠失させるために、全長クローンｐＳＡＤ ＵＥ（実施例２）を使用した。このクローンは、Ｇ遺伝子の非翻訳化３’領域（ＳＡＤ Ｂ１９位置５３３９）内に単一のＮｈｅＩ部位が存在することがｐＳＡＤ Ｌ１６と異なる。ｐＳＡＤ Ｕ２をＰｆｌＭＩ（ＳＡＤ位置３１７６）で部分的に消化し、ＮｈｅＩで完全消化し、その後クレノー酵素でフィルインし、再結合することにより、ＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチド３１７７−５３３９を含むｃＤＮＡ断片を除去した。得られたクローンｐＳＡＤ ｄＧをトランスフェクション実験で使用して、組換えウイルスを回収した。しかしながら、Ｎ、Ｐ及びＬタンパク質をコードするプラスミドの他に、Ｇタンパク質をコードするプラスミドをｐＳＡＤ ｄＧと一緒にトランスフェクトして、ウイルスゲノムのＧ欠失を補った。得られたウイルスＳＡＤ ｄＧを、Ｇコード化プラスミドで再度トランスフェクトした細胞に通し、ワクシニアウイルスｖＴＦ−７−３に感染させて、Ｇタンパク質を得た。
【０１１１】
ノーザンブロッティング実験により、ＳＡＤ ｄＧのＲＮＡ転写体を分析した。Ｎ特異的プローブでハイブリダイズした後に、ＳＡＤ ｄＧゲノムが狂犬病ウイルスｗｔゲノムよりも遥かに小さいことが知見された。このことは、２．１ｋｂのｃＤＮＡの欠失を反映している。しかしながら、全Ｇコード化領域に及ぶプローブでは、ＳＡＤ ｄＧ ＲＮＡとハイブリダイズできず、このことはＧコード化配列の欠失を示している（図１２）。欠失の同定は更にＲＴ−ＰＣＲ及び配列決定により確定された。
【０１１２】
表現型が相補化したＳＡＤ ｄＧは、非相補性ＢＳＲ細胞に感染し、そのゲノムを複製して、ゲノムによってコードされる遺伝子を発現することができた。しかしながら、伝染性ビリオンを生成することはできず、従って、感染を他の細胞に拡散させることも（図１３）、培養上清の他の細胞培養への継代により移行させることもできなかった。
【実施例８】
【０１１３】
異種糖タンパク質によるＧ突然変異体の相補化：ウイルスの特異細胞への指向
異種表面タンパク質が組換えウイルスのエンベロープに機能的に取り込まれ得ることを実証するために、Ｇ突然変異体ＳＡＤ ｄＧを狂犬病ウイルスＧについて実施例７に記載したように組換えウイルス糖タンパク質で相補化した。Ｍｏｋｏｌａウイルス、狂犬病ウイルス属の他の類、ラブドウイルス水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ；血清型Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ベシキュロウイルス属）、及びレトロウイルスヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、株ＮＬ−４３）に由来するスパイクタンパク質を含む伝染性偽型粒子を生成した。
【０１１４】
真正のＭｏｋｏｌａ及びＶＳＶ−Ｇタンパク質のトランスフェクトプラスミドからの発現や、細胞のＳＡＤ ｄＧ感染により、伝染性偽型ウイルスが生成した。しかしながら、狂犬病ウイルスＧや密接に関連するＭｏｋｏｌａウイルスＧに比べて、ＶＳＶ−Ｇでは低い力価が観察された（１０６／ｍｌとは対照的に１０４／ｍｌ）。しかしながら、ＶＳＶ−Ｇの細胞質ドメイン配列及びトランスメンブランドメイン配列を、狂犬病ウイルスＧタンパク質の対応するドメインで置換した後に、１０６個の伝染性粒子が生成した。このことは、ＲＶ Ｇの細胞質ドメインがそのタンパク質をウイルスエンベロープに指向させることを示唆している。
【０１１５】
真正のＨＩＶ ｇｐ１６０（ｇｐ１２０／４０）スパイクを含む偽型粒子の生成は観察されなかった。対照的に、ＲＶ Ｇの細胞質ドメインに融合したＨＩＶ ｇｐの膜外及びトランスメンブランドメインからなるキメラタンパク質の発現により、ＲＶ（ＨＩＶ）偽型が形成された。これにより、Ｇタンパク質の細胞質ドメインがラブドウイルスのエンベロープ内へのスパイクタンパク質の効果的な取り込みを担うことが確定した。ＲＶ（ＨＩＶ）偽型粒子は、ヒトＣＤ４表面タンパク質を発現するＶｅｒｏ細胞（Ｔ４＋細胞）にはうまく感染したが、ＣＤ８を発現する対照細胞（Ｔ８＋細胞）には感染しなかった（細胞はＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅから入手）。従って、偽型ウイルスはＨＩＶの宿主範囲及び細胞特異性を有する。
【０１１６】
図面の説明
図１：
ＲＶ偽遺伝子（Ψ）の構成及び組換えＲＶゲノムの構築（一定の比率で記述）。番号は、ＳＡＤ Ｂ１９の抗ゲノム配列のヌクレオチド位置を示す。上部に、５個の読み取り枠を有する全ＲＶゲノムを示す。ゲノムの一部（３８２３−６６６８）を含むｐＰｓｉＸ８で突然変異を実施し、ＳｔｕＩ断片（４０１４−６３６４）を交換して前記突然変異を全長クローンｐＳＡＤ Ｌ１６に再度導入した。詳細な図面では、コード化領域を灰色の枠で示し、非コード化配列は線として示す。機能的転写シグナル配列は黒い縦棒（終結／ポリアデニル化）及び矢印（ｍＲＮＡ転写開始）で示す。Ψ領域の開始を限定する非機能的シグナル様配列は白い縦棒で示す。矢印は、Ψ領域のＲＴ−ＰＣＲ分析で使用するオリゴヌクレオチドプライマーＧ３Ｐ及びＬ４Ｍの位置を示す。ＳＡＤ Ｕ２では、ＨｉｎｄＩＩＩエキステンションのフィルインにより、４個のヌクレオチドが挿入され、単一のＮｈｅＩ部位が生成した。ＳＡＤ Ｖ*では、ＲＶ Ｎ／Ｐシストロンボーダーを含むｃＤＮＡ断片（ＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチド１３２３−１５０２）をＳｔｙＩ部位に挿入した。ＳＡＤ Ｗ９はＳｔｙＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片の欠失を有する。
【０１１７】
図２：
全長ＲＶ ｃＤＮＡを含む転写プラスミドの構築概略図。番号は、ＳＡＤ Ｂ１９ ＲＶ抗ゲノム配列（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ等、１９９０）のヌクレオチド位置を示す。全長ＲＶゲノムＤＮＡの再構築の基材として機能するプラスミドｐＳＤＩ−１プラスは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｔ７）及び肝炎デルタウイルス抗ゲノムリボザイム配列（ＨＤＶ）に対して反対方向に末端ヌクレオチド１−６８及び１１７６０−１１９２８を含むＳＤＩ−１ ＲＶミニ−ゲノムを含むｐＳＤＩ−１（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ及びＳｃｈｎｅｌｌ、１９９４）の対応プラスミドである。ｐＳＤＩ−１プラスのＭｕｎＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、前述の３個のＳＡＤ Ｂ１９ ｃＤＮＡクローンから作成した１ｋｂ ｃＤＮＡ構築物で置換した。２個のｃＤＮＡクローンからそれぞれ作成した３．６ｋｂＳｐｈＩ断片及び７．２ｋｂ ＡａｔＩＩ断片を挿入すると、全長ＳＡＤ Ｂ１９ ｃＤＮＡを含む最終プラスミドｐＳＡＤ Ｌ１６が得られた。このプラスミドをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼで転写すると、リボザイムの自己融解の後に、５’末端及び正に３’末端に３個の余分の非ウイルスＧ残基を有する陽性鎖（抗ゲノム）ＲＮＡが得られるはずである。（Ｔ７）Ｔ７プロモーター；（Ｔ７Ｔ）Ｔ７転写ターミネーター；（ＨＤＶ）ＨＤＶ抗ゲノムリボザイム配列。
【０１１８】
図３：
トランスフェクタントウイルスＳＡＤ Ｕ２のゲノム内の遺伝子タグの例示。
【０１１９】
標準ＲＶ ＳＡＤ Ｂ１９（Ｂ１９）及びトランスフェクタントウイルスＳＡＤ Ｌ１６（Ｌ１６）、ＳＡＤ Ｕ２（Ｕ２）に感染した細胞に由来する全ＲＮＡを感染から２日後に単離し、これをプライマーＧ３Ｐ及びＬ４Ｍを用いる各Ψ領域のＲＴ−ＰＣＲ増幅のために使用した。それぞれＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｈｅＩで消化した後に、増幅したＤＮＡを直接１％アガロースゲルで分離した。ＮｈｅＩ制限部位は、ＳＡＤ Ｕ２．Ｍ，ＤＮＡサイズマーカー由来のＤＮＡにのみ存在する。
【０１２０】
図４：
ＳＡＤ Ｂ１９（Ｂ１９）、ＳＡＤ Ｖ*（Ｖ*）及びＳＡＤ Ｗ９（Ｗ９）ゲノムのＰＣＲ分析。プライマーＧ３Ｐ及びＬ４Ｍを用いる図３に記載の方法で、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。増幅産物を１％アガロースゲルで分離した。
【０１２１】
図５：
組換えＲＶＳによって転写されるＣＡＴ ｍＲＮＡの例示。
【０１２２】
ＳＡＤ Ｌ１６（Ｌ１６）、ＳＡＤ ＸＣＡＴ（Ｘ６）及びＳＡＤ ＶＣＡＴ（ＶＣ１８）に感染した細胞に由来する全ＲＮＡのノーザンブロットを、それぞれＧ遺伝子（Ｇ）、偽遺伝子（Ｙ）及びＣＡＴ遺伝子に特異的なプローブでハイブリダイズした。左側にウイルスゲノム（ｖ）及び特定のｍＲＮＡを示す。ＳＡＤ ＸＣＡＴは、ＣＡＴ及び偽遺伝子配列（“ＣＡＴＹ”）の両方を含むｍＲＮＡを転写するが、ＳＡＤ ＶＣＡＴは偽遺伝子配列が欠失し、ＣＡＴ配列のみを有するｍＲＮＡ（“ＣＡＴ”）を転写する。ＲＮＡマーカーの寸法はｋｂで示す。
【０１２３】
図６：
細胞培養で多数回継代した後のＳＡＤ ＸＣＡＴ及びＳＡＤ ＶＣＡＴのＣＡＴ活性。細胞に特定継代（継代数は記載の通り）のウイルスを感染させ、同量の細胞抽出物の、感染から２日後のＣＡＴ活性を分析した。レーン“−”では、ＳＡＤ Ｌ１６感染細胞由来の抽出物を分析した。
【０１２４】
図７：
組換えＲＶによるＥ０及びＥ２タンパク質の発現。
【０１２５】
細胞にそれぞれＳＡＤ ＶＥ０（単離物１、２、３）及びＳＡＤ ＶＥ２（単離物ａ、ｂ、ｃ）を感染させた。感染から２日後、細胞抽出物を還元条件下にてＰＡＡゲル中で分離し、ニトロセルロース膜に移した。それぞれＣＳＦＶ Ｅ０及びＥ２タンパク質に対するモノクローナル抗体、次いでアルカリ性ホスファターゼに結合した二次抗体と共にインキュベートした後に、基質を添加し、Ｘ線フィルムに暴露してタンパク質を可視化した。対照としては、バキュロウイルスが発現した、Ｅ０及びＥ２精製タンパク質を使用した（Ｂ）。更には、ＣＳＦＣ（Ｖ）感染細胞に由来する抽出物を比較のため使用した。
【０１２６】
図８：
ＳＡＤ ＶＥ０（＃１及び＃２）、ＳＡＤ ＶＥ２（＃６）及び標準狂犬病ウイルスＳＡＤ Ｂ１９（＃３及び＃４）で免疫し、ＣＳＦＶで攻撃したブタの白血球。白血球量は、攻撃（０日）前に存在した絶対数のパーセントで表す。＊（＃１、攻撃から１０日後）：計測せず、推定値である。
【０１２７】
図９：ＣＳＦＶ攻撃（０日）後のブタの体温。
【０１２８】
ａ．ＳＡＤ ＶＥ０で免疫した動物（＃１及び＃２）は、１１日まで微熱を生じた（＃１）か又は発熱しなかった（＃２）。ＳＡＤ Ｂ１９で免疫した対照動物（＃３及び＃４）は共に、長期間にわたり高熱を示した。＃４は重症のため、通常のブタ熱により攻撃から１５日後に死亡し、＃４は攻撃から２１日後に死亡した。
【０１２９】
ｂ．ＳＡＤ ＶＥ２で免疫した動物は、６〜８日のみ微熱を生じた。対照はａ）と同一である。
【０１３０】
図１０：
ＳＡＤ ＤＣＤ感染細胞での端を切り取ったＧタンパク質の発現。
【０１３１】
ＢＳＲ細胞にＳＡＤ ＤＣＤ又はＳＡＤ Ｌ１６をｍ．ｏ．ｉ．１で感染させ、感染から１６時間後に、５０μＣｉの［35Ｓ］メチオニンで３時間標識した。細胞抽出物を抗狂犬病Ｇ ＭＡｂと共にインキュベートし、免疫沈殿試料の分注物をＰＮＧａｓｅＦ（＋ＰＦ）で消化してタンパク質バックボーンを示すか又は偽性処理（−）してグリコシル化タンパク質を示した。＋ＴＭ：標識前９０分間及び３時間の標識期間中に、感染細胞を２μｇ／ｍｌのツニカマイシンの存在下でインキュベートした。タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、オートラジオグラフィーで可視化した。細胞抽出物を前述したように分析した。Ｌ１６：ＳＡＤ Ｌ１６ウイルス、ΔＣＤ：ＳＡＤ ＤＣＤ突然変異体ウイルス、Ｍ：タンパク質サイズマーカー。
【０１３２】
図１１：
細胞培養物でのＳＡＤ Ｌ１６及びＳＡＤ ＤＣＤの伝染。
【０１３３】
培養細胞にそれぞれＳＡＤ Ｌ１６（Ｌ１６）及びＳＡＤ ＤＣＤ（ＤＣＤ）をｍ．ｏ．ｉ．０．０５で感染させ、感染後規定の時間に、狂犬病ウイルスＮタンパク質に対する結合体（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ(R)）による直接免疫蛍光により分析した。ＳＡＤ ＤＣＤ感染細胞の方が隣接細胞への伝染速度が遅いことが観察された。
【０１３４】
図１２：
ＳＡＤ ｄＧ（実施例７）及びＳＡＤ ｄＣＤ（実施例６）に特異的なＲＮＡの分析。
【０１３５】
ＳＡＤ Ｌ１６（実施例１）、ＳＡＤ ｄＣＤ（ΔＣＤ）及び表現型が相補化したＳＡＤ ｄＧウイルス（ΔＧ）をｍ．ｏ．ｉ．１で感染させたＢＳＲ細胞の全ＲＮＡを感染から２日後に単離し、ノーザンハイブリダイゼーションで分析した。Ｎ遺伝子特異的プローブ（Ａ）とのハイブリダイゼーションで示すように、ＳＡＤ ｄＧのゲノムは標準狂犬病ウイルスゲノム（ｖ）よりもかなり小さく、Ｇ遺伝子の２．１ｋｂ欠失を反映している。全Ｇタンパク質コード化配列に及ぶプローブはＳＡＤ ｄＧ ＲＮＡとはハイブリダイズしない。ＳＡＤ ｄＣＤゲノムの細胞質ドメインコード化領域の小さな欠失が、標準狂犬病ウイルスＧ ｍＲＮＡよりも短いＧ ｍＲＮＡ（Ｇ）の出現により実証される。
【０１３６】
ｖ：ゲノムＲＮＡ；Ｎ，Ｇ：モノシストロニックｍＲＮＡ；Ｎ＋Ｐ，Ｍ＋Ｇ，Ｇ＋Ｌ：ビシストロニック（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ｍＲＮＡ。
【０１３７】
図１３：
Ｇ-突然変異体ＳＡＤ ｄＧの非伝染性ＢＳＲ細胞に、表現型が相補化されたＳＡＤ ｄＧを感染させ、トランスフェクションから３６時間後に免疫蛍光顕微鏡検査法により分析した。（Ａ）では、細胞をＮタンパク質に対するＦＩＴＣ結合抗体（Ｃｅｎｔｏｃｏｒｅ）と共にインキュベートして、Ｎタンパク質の発現を示す。単細胞のみが感染し、隣接細胞へのウイルスの伝染は観察されなかった。（Ｂ）：Ｇ特異抗体での対照。
【０１３８】
図１４
ＲＶ（ＨＩＶ）偽型ビリオンの生成に使用する機能的キメラＨＩＶ／ＲＶ糖タンパク質の組成。トランスメンブランドメインのすぐ下流にある３個のアミノ酸を除く全ＨＩＶ−ＮＬ４３ｇｐ１６０細胞質ドメインを、完全ＰＶ−Ｇ細胞質ドメインで置換した。“ｐ”は、親タンパク質に存在しないプロリン残基を示す。細胞質ドメイン配列とトランスメンブランドメイン配列はスラッシュ（／）で離す。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】ＲＶ偽遺伝子（Ψ）の構成及び組換えＲＶゲノムの構築を示す図である。
【図２】全長ＲＶ ｃＤＮＡを含む転写プラスミドの構築概略図である。
【図３】トランスフェクタントウイルスＳＡＤ Ｕ２のゲノム内の遺伝子タグを示す電気泳動の写真である。
【図４】ＳＡＤ Ｂ１９（Ｂ１９）、ＳＡＤ Ｖ＊（Ｖ＊）及びＳＡＤ Ｗ９（Ｗ９）ゲノムのＰＣＲ分析を示す電気泳動の写真である。
【図５】組換えＲＶＳによって転写されるＣＡＴ ｍＲＮＡを例示する電気泳動の写真である。
【図６】細胞培養で多数回継代した後のＳＡＤ ＸＣＡＴ及びＳＡＤ ＶＣＡＴのＣＡＴ活性を示すクロマトグラフの写真である。
【図７】組換えＲＶによるＥ０及びＥ２タンパク質の発現を示す電気泳動の写真である。
【図８】ＳＡＤ ＶＥ０（＃１及び＃２）、ＳＡＤ ＶＥ２（＃６）及び標準狂犬病ウイルスＳＡＤ Ｂ１９（＃３及び＃４）で免疫し、ＣＳＦＶで攻撃したブタの白血球を示す図である。
【図９Ａ】ＣＳＦＶ攻撃（０日）後のブタの体温を示す図である。
【図９Ｂ】ＣＳＦＶ攻撃（０日）後のブタの体温を示す図である。
【図１０】ＳＡＤ ＤＣＤ感染細胞での端を切り取ったＧタンパク質の発現を示す電気泳動の写真である。
【図１１】細胞培養物でのＳＡＤ Ｌ１６及びＳＡＤ ＤＣＤの伝染を示す顕微鏡写真である。
【図１２】ＳＡＤ ｄＧ（実施例７）及びＳＡＤ ｄＣＤ（実施例６）に特異的なＲＮＡの分析を示す電気泳動の写真である。
【図１３】Ｇ−突然変異体ＳＡＤ ｄＧの非伝染性を示す顕微鏡写真である。
【図１４】ＲＶ（ＨＩＶ）偽型ビリオンの生成に使用する機能的キメラＨＩＶ／ＲＶ糖タンパク質の組成を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子操作による伝染性複製非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルス突然変異体、及びこのような突然変異体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
狂犬病ウイルス（ＲＶ）は、ラブドウイルスファミリーの非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスの一例である。このファミリーに属する他の種は、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、伝染性造血壊死ウイルス（ＩＨＮＶ）、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳ、Ｅｇｔｖｅｄウイルス）、ウシ一過性熱ウイルス（ＢＥＦＶ）、及びｓｏｎｃｈｕｓ ｙｅｌｌｏｗ ｎｅｔウイルス（ＳＹＮＶ）である。
【０００３】
ラブドウイルスファミリーの他に、パラミクソウイルス（例えばセンダイウイルス（ＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）２型及び３型、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、おたふくかぜウイルス（ＭＵＶ）、はしかウイルス（ＭＥＶ）並びにイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ））やフィロウイルスに属するウイルス、及びファミリーに帰属しない数種のウイルス（例えばボルナ病ウイルス；ＢＤＶ）も非セグメント化陰性鎖ＲＮＡゲノムを有する。
【０００４】
種々のファミリーの非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスの全体的なゲノム構成は似通っている。特にパラミクソウイルスとラブドウイルスとの全体的なゲノム構成の相違はごく僅かである（Ｔｏｒｄｏ等，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：３４１−３５７，１９９２）。
【０００５】
ＲＶは全ての温血動物に感染し得、ほぼ全ての場合で発症した後に感染から死に至る。イヌ狂犬病は今でも世界の大部分で重大であり、世界中で年間に発生する推定７５，０００件のヒト狂犬病症例の大半が感染したイヌによるものである。ヨーロッパの多くの国々や、米国、カナダでは、野生生物狂犬病の重大性が増している。
【０００６】
狂犬病の臨床的特性は大半の種で同様であるが、個人差が大きい。狂犬病動物にかまれた後の潜伏期間は通常１４日から９０日であるが、これよりも長くなることもある。１年以上の潜伏期間も報告されている。この疾病では、狂暴性及び緘黙性又は麻痺性の２種の臨床形態が確認されている。狂暴型では、動物は落ち着きがなく、神経質で攻撃的になり、ヒトへの恐怖感を全く喪失し、注意を引く何にでもかみつくためにしばしば危険である。動物はしばしば感情を抑制することができず、“狂水病”の症状が現れる。しばしば、唾液過多となり、光や音への反応が過剰になり、知覚過敏になる。脳炎が進行すると、狂暴性から麻痺に移行し、動物は緘黙型疾病全体で確認される同じ臨床的特徴を示す。末期になると、しばしば麻痺性発作、昏睡状態や呼吸停止が起こり、臨床的徴候が発生してから２〜７日後には死亡する。
【０００７】
狂犬病ウイルスは、狂犬病動物にかまれて、場合によってはそのかすり傷から、又は狂犬病動物のウイルス含有唾液が傷口に入って、体内に侵入する。筋肉のかまれた部位でウイルスが複製し、その後末梢神経末端に侵入し、軸索細胞質のウイルスゲノムが中枢神経系に移動する。脊髄、次いで脳（特に大脳辺縁系）へのウイルスの侵入は、ニューロン機能不全の臨床的徴候と関連する。通常、中枢神経系の感染で狂暴的になるのとほぼ同時に、ビリオンが更に唾液腺の粘液分泌細胞の先端から放出され、高濃度で唾液に送達される。
【０００８】
狂犬病の過程では常に、宿主の特異的な炎症性免疫応答は最小の刺激を受けるにすぎない。この最も妥当な理由は、筋肉や神経細胞では感染が非細胞変性であり、感染が神経系の免疫学的に分離された（sequestered）環境にかなり集中することである。
全てのラブドウイルスのようなＲＶビリオンは、２種の主要構造成分：（ヌクレオキャプシド又はリボ核タンパク質（ＲＮＰ）コア及びＲＮＰコアを包囲する二層膜形態のエンベロープ）からなる。全てのラブドウイルスの感染成分はＲＮＰコアである。ゲノムＲＮＡは陰性センスであるため、メッセンジャーとしては機能し得ないが、ｍＲＮＡ転写のために自身の内在性ＲＮＡポリメラーゼを必要とする。ＲＮＡゲノムは、２種の少量タンパク質、即ちＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）及びリンタンパク質（Ｐ）と組合わさったヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質によってキャプシド内に被包されてＲＮＰコアを形成する。膜成分は２種のタンパク質（トランスメンブラン糖タンパク質（Ｇ）及び膜の内側に位置する基質（Ｍ）タンパク質）を含んでいる。Ｇタンパク質はＲＶの細胞付着や膜融合を担い、更には、宿主免疫系の主標的である。
【０００９】
転写中に、ゲノムは短いリーダーＲＮＡとモノシストロニックでキャップ構造を有する５個のポリアデニル化ｍＲＮＡとの逐次合成を指示する。複製中に、シストロン間の条件転写終結及び開始シグナルが、ウイルスポリメラーゼによって無視される。トランスクリプターゼ反応及びレプリカーゼ反応では共に、ＲＮＡゲノムと複合体形成したＮ−タンパク質の存在やＬ及びＰタンパク質が必要である。ＲＶゲノムの遺伝子順が決定され、図１に示すように３’−リーダー−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｇ−Ｌ−５’である。転写直後にＲＶのｍＲＮＡの各々が翻訳される。複製中に２つの事象が逐次実施され、即ちまずゲノムと相補的な被包化完全陽性鎖ＲＮＡが産生され、次いで同様にＮ、Ｌ及びＰタンパク質によって被包された完全陰性鎖ＲＮＡが産生される。最後に、作成及び発達（ｂｕｄｄｉｎｇ）プロセス中に新しく作成されたＲＮＰコアがＭタンパク質やＧタンパク質と結合すると、完全に形成された伝染性ＲＶビリオンが放出される。
【００１０】
１１．９ｋｂゲノムＲＶ ＲＮＡは、Ｇ遺伝子とＬ遺伝子との間に偽遺伝子領域（Ψ）が存在すること以外に、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬタンパク質をコードする５個の読み取り枠（ＯＲＦ）を含んでいる（図１）。
【００１１】
現存の非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスワクチンは、化学的に不活化したウイルスワクチン、又は細胞培養で何度も継代させて病原性を低減させた弱毒化ウイルス株を含む改変生ウイルスワクチンからなる。化学的に不活化した狂犬病ワクチンは例えば、Ｒａｂｉｖａｃ、Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ（ヒト）、ＨＤＣ、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ（ヒト）、Ｂａｙｏｖａｃ−ＬＴ、Ｂａｙｅｒ（動物）、Ｍａｄｉｖａｃ、Ｈｏｅｃｈｓｔ（動物）、Ｅｐｉｖａｘ−ＬＴ、Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ、Ｒａｂｉｓｉｎ、Ｒｈｏｎｅ−Ｍｅｒｉｅｕｘである。前述の弱毒化ＲＶウイルスの例は、ワクチン株ＳＡＤ Ｂ１９及びＥＲＡである。不活化ワクチンは一般に、ごく低レベルの免疫しか誘発しないので、繰り返し免疫する必要がある。更には、不活化処理で病原体の中和誘発抗原決定基が変化して、ワクチンの防御潜在能力が低下することがある。
【００１２】
一般に、弱毒化生ウイルスワクチンは、しばしば体液反応及び細胞反応の両方に基づく免疫反応を誘起するので好ましい。しかしながら、細胞培養継代中は、非調整突然変異がウイルスゲノム内に導入されて、毒性や免疫性に関して不均一なウイルス粒子集団が得られ得る。細胞培養継代中の過剰弱毒化はこれらのワクチンでは問題となり得る。ワクチンが尚防御的でありながら毒性をもたないように微妙なバランスを図らなければならない。更には、このような従来の弱毒化生ウイルスワクチンが毒性を取り戻して、接種動物が発病し、病原体が他の動物に伝染する可能性があり得ることもよく知られている。
【００１３】
更には、生ウイルスワクチン併用での問題は、抗原成分が相互に影響を受けて、１種以上の構成成分の潜在能力が低下することである。
【００１４】
更には、現在投与されている生弱毒化又は不活化ＲＶワクチンでは、特定動物がＲＶフィールドウイルスのキャリアーであるのか、それともその動物がワクチン接種を受けたのかを決定することが不可能である。従って、ＲＶワクチンの接種を受けた動物と、フィールドウイルスに感染した動物とを区別して、毒性フィールドウイルスの伝染を抑制する適切な措置を図れることが重要であり得る。通常感染した宿主動物で抗体を産生するＲＶの（糖）タンパク質をコードする遺伝子に突然変異を導入することにより、例えば血清学的に同定可能なマーカーを導入することができる。
【００１５】
例えば得られる突然変異体ＲＮＡが弱毒化するか又は外来タンパク質（例えば免疫マーカータンパク質又は病原体の抗原）のエピトープをコードする異種核酸配列を含むように、調節しながらＲＶ ＲＮＡゲノム内に突然変異を導入することが望ましい。このために、ＤＮＡウイルスや陽性鎖ＲＮＡウイルスを用いた組換えＤＮＡ技術が既に広範に使用されている。組換えＤＮＡウイルスの例は、アウジェスキーウイルス（ＰＲＶ）；アデノウイルス；ワクシニアウイルスである。組換え陽性鎖ＲＮＡウイルスの例は、アルファウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ Ｖ．，Ｓｅｍｌｉｋｉ ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ：Ｈ．Ｖ．Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｍ．Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｘｉｏｎｇ，Ｓ．Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ（１９８９）ＲＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ３，８５−９１）、ピコルナウイルス（Ｐｏｌｉｏ ｖｉｒｕｓ，Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ−ｖｉｒｕｓ，Ｆｏｏｔ− ａｎｄ ｍｏｕｔｈ−ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ：Ｊ．Ｗ．Ａｌｍｏｎｄ及びＫ．Ｌ．Ｂｕｒｋｅ（１９９０）Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｓｅｍｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．１，１１−２０）である。ＲＮＡウイルスゲノムの特異的（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ）遺伝子操作は、特定のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって鋳型として受容される組換えＲＮＡの産生能力に依存する。多数の標準的なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ又は細胞ＲＮＡポリメラーゼＩＩ）によって産生され、ウイルスゲノムを模倣する転写体は、多数の陽性鎖ＲＮＡウイルスのポリメラーゼによって認識される。これにより、ｃＤＮＡ転写体から伝染性ウイルス又はレプリコンが回収され、組換えＤＮＡ技術を適用してこれらのゲノムを部位特異的に操作することができる。陽性鎖ＲＮＡウイルスのゲノムに対応するＲＮＡはウイルスポリメラーゼの翻訳用ｍＲＮＡとして機能し得るので、ゲノム類似体を細胞内に導入することにより感染サイクルが開始し得る。しかしながら、陰性鎖ＲＮＡウイルスのポリメラーゼの鋳型は専ら、ＲＮＰ複合体である。更には、陽性鎖ＲＮＰウイルスとは対照的に、そのゲノム又は抗ゲノムＲＮＡはｍＲＮＡとして機能し得ず、従って人工ＲＮＡの複製や転写に関与する全てのウイルスタンパク質はトランスで提供しなければならない。
【００１６】
陰性鎖ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡ類似体をセグメント化ゲノムでキャプシド内に被包して適切な鋳型を提供するための適切な系が最近Ｐａｌｅｓｅ，Ｐ等によって開示されている（ＷＯ９１／０３５５２号）。インフルエンザウイルスゲノムセグメント由来のＲＮＡ転写体を精製タンパク質でキャプシド内にｉｎ ｖｉｔｒｏ被包し、これをヘルパーウイルスと併用して細胞をトランスフェクトすることができる。しかしながら、非セグメント化ゲノムを有するウイルスであるＲＶではこのアプローチは成功しないことが知見された。ウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含むＲＮＡゲノムの主要部分が欠失しているＶＳＶ及びＲＶの短いモデルゲノムをプラスミドコード化タンパク質でキャプシド内に被包して発現させることができた（Ｐａｔｔｎａｉｋ，Ａ．Ｋ．等，Ｃｅｌｌ ６９，１０１１−１０２０，１９９２；Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ，Ｋ−Ｋ．及びＭ．Ｓｃｈｎｅｌｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６８，７１３−７１９，１９９４）。このアプローチは、任意にリポーター遺伝子インサートを含んでいるゲノム類似体とトランスフェクトしたプラスミドに由来する特定のウイルスタンパク質の両方を同時に発現して、欠陥ウイルス粒子を産生することからなった。Ｂａｌｌａｒｔ等は、伝染性はしかウイルス、更には非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスのクローン化ｃＤＮＡからの産生方法を記載している（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，９：３７９−３８４（１９９０））。この方法に関するヨーロッパ特許は、前記文献の著者が発明者の一人として加わって出願されている。
【００１７】
しかしながら、想定される全ての組換えウイルスは全く組換え体ではなく、単に最初に使用したワクチン株の後代ウイルスであることが別の研究によって判明したので、前記文献及び特許明細書は共に取り下げられている。
【００１８】
従って、全ゲノムの操作を必要とする大きな非セグメント化ゲノムを含む伝染性組換え陰性鎖ＲＮＡウイルスの産生は今日まで成功していないと結論付けなければならない。
【発明の開示】
【００１９】
本発明は、組換えＤＮＡ技術により産生可能であり、ＲＶゲノムのＯＲＦ、偽遺伝子領域又は非コード化領域に挿入及び／又は欠失を含む、遺伝子操作による伝染性複製非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルス突然変異体を提供する。
【００２０】
特に本発明は、パラミクソウイルスファミリー及びラブドウイルスファミリーの非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスを提供する。
【００２１】
前述したように、非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスファミリー間のゲノム構成には大きな相同性が認められる。複製、作成、細胞付着又は細胞融合のプロセスでのコード化タンパク質の機能が似通っている場合、これらのタンパク質は更に“類似体”と称する。例えばあるファミリーの２種のタンパク質の機能が他のファミリーで１種のタンパク質に統合していることもある。例えば、一緒になってラブドウイルスの糖タンパク質Ｇと同じ機能を有するパラミクソウイルスのＦタンパク質とＨＮタンパク質の場合がそうである。この場合、あるファミリーの２種のタンパク質は、他のファミリーの１種のタンパク質の類似体（ａｎａｌｏｇｏｎｓ）とみなされる。
【００２２】
対応するウイルスＯＲＦ、偽遺伝子領域又は非コード化領域に適切な突然変異を取り込むことにより、１個以上の核酸残基の挿入や欠失をＲＶゲノムに導入することができる。この改変は、ＲＶ ＯＲＦ又は親ＲＶの偽遺伝子の遺伝子情報を変化させて、本発明の挿入又は欠失ＲＶ突然変異体を得ることである。
【００２３】
１種以上のヌクレオチドが他のヌクレオチドで置換される突然変異、いわゆる置換は欠失と挿入の作用を組み合わせた結果であると考えられる。従って、この種の突然変異は更に、欠失及び（／又は）挿入という用語に含まれると考えられる。
【００２４】
本明細書に記載する任意の突然変異が、得られるＲＶ突然変異体が尚も伝染性で複製する、即ち突然変異体ＲＶが感受性細胞に感染し得、その突然変異体ＲＮＡゲノムが自律的に複製や転写を行い得る、即ちＲＶのＮ、Ｐ及びＬタンパク質の同時発現が不要であるように、適切なＲＶ配列を変化させることからなることは明白である。
【００２５】
たった１回感染して、複製し得る突然変異体ＲＶ（Ｖｉｄｅ ｉｎｆｒａ）も本発明に含まれることは言うまでもない。
【００２６】
種々のＲＶ株のゲノム構成は同一である。ワクチン株ＳＡＤ Ｂ１９及び毒性株ＲＶのヌクレオチド配列や推定上のアミノ酸配列の分析も決定されている（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ等，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７５，４８５−４９９，１９９０及びＴｏｒｄｏ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４，２６７１−２６８３，１９８６；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，３９１４−３９１８，１９８６；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６５，５６５−５６７，１９８８）。Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ等の文献（１９９０（上掲））では、ＳＡＤ Ｂ１９株のウイルスゲノムが１１，９２８ヌクレオチドを含み、５個のウイルスタンパク質Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬの推定上のアミノ酸配列が、病原性ＰＶ株のものと非常に類似していることが確定している。同明細書ではＲＶの各ＯＲＦ、偽遺伝子領域及び遺伝子間非コード化領域の位置が決定されており、ＲＶのＮ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬ遺伝子のコード化領域はそれぞれ、位置７１−１４２３、１５１４−２４０７、２４９６−３１０４、３３１７−４８９１、５４１４−１１７９７に対応する。偽遺伝子領域（Ψ）は位置４９６１−５３５９に存在し、５個のシストロンを分かち、転写開始及び終結／ポリアデニル化シグナルを含む非コード化配列に隣接する遺伝子間領域は位置１４８３−１４８４；２４７６−２４８０；３２８５−３２８９；５３６０−５３８３に存在する。突然変異を導入するために本明細書で使用する親ＲＶ株のＯＲＦ、偽遺伝子領域又は非コード化領域の番号付けやヌクレオチド配列は必ずしもＳＡＤ Ｂ１９又はＰＶ株のものと同一ではないが、前述したこれらの領域の特性は、任意のＲＶ株のゲノム上での位置を正確に限定する。
【００２７】
毒性親ＲＶ株からの弱毒化ＲＶの産生方法は、ウイルスタンパク質をコードするＯＲＦ内に挿入及び／又は欠失を導入して、例えば宿主細胞付着や膜融合のためのウイルスタンパク質の活性を改変する、例えば低減することである。ＲＶについては、トランスメンブラン糖タンパク質Ｇのアミノ酸配列の変化がＲＶの病原性に有意に作用することが知られている。更には、弱毒化に関しても、基質（Ｍ）タンパク質の変化がＧタンパク質のコンホーメーションに影響して、ウイルスを弱毒化し得る。従って、Ｇ又はＭタンパク質をコードするＯＲＦに欠失又は挿入を含む突然変異体ＲＶが本明細書で特に好ましい。
【００２８】
僅か１回感染して、複製し得る伝染性複製狂犬病ウイルス突然変異体も本明細書に含まれる。その利点を以下で説明する。
【００２９】
一般的な組換え生ワクチンは安全で効果的であることが証明されているが、このワクチンウイルスは、このウイルスに対する感受性がより高い他の動物に伝染する危険性がある。
【００３０】
従って、政治的、倫理的、及び一部には科学的見地から、この分野で組換えウイルスを使用することは非常に不本意である。
【００３１】
特に、遺伝学的に改変したワクチンウイルス、とりわけ外来遺伝子を発現する生ウイルスに関しての監視当局（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）による危険アセスメント研究では、環境でのこれらのウイルスの拡散の可能性の観点が非常に重要な観点である。
【００３２】
従って、生ウイルスワクチンの全ての利点を示すが、接種する動物に限定され、拡散しない狂犬病ウイルスワクチンが非常に望ましいと理解することができる。
【００３３】
このようなウイルスは例えば、Ｍ（基質）タンパク質をコードするＭ遺伝子の突然変異によって産生され得る。Ｍタンパク質はウイルスの作成で重要な役割を果たす一方、更に糖タンパク質Ｇの取り込みやコンホーメーションに影響を及ぼす。
【００３４】
トランスでＭタンパク質を産生する操作済細胞で、機能的Ｍタンパク質の欠失したＭ（−）突然変異体を増殖させると、天然宿主に対する伝染性に関して野生型ウイルスのように挙動する健全なウイルス粒子が産生される。しかしながらこれらの粒子はＭタンパク質合成のための遺伝子情報が欠失しているために、宿主細胞に感染すると、新しい伝染性ウイルスを産生することができない。
【００３５】
従って、前記ウイルス粒子は宿主に包含されたままである。このようなウイルスの利点を以下で説明する。
【００３６】
従って、好ましい実施態様では、本発明は、基質タンパク質Ｍをコードする読み取り枠の挿入及び／又は欠失によって、非機能的基質タンパク質Ｍを産生するか又は基質タンパク質Ｍを存在させないことに関する。基質タンパク質Ｍが非機能的であるか又は不在であるＭ（−）突然変異体ウイルスを、基質タンパク質Ｍ類似体をトランスで提供する細胞で増殖させて、ウイルスの表現型を相補的なものにしなければならない。
【００３７】
あるいは、例えばＧ遺伝子の突然変異によってこのようなウイルスを産生することができる。Ｇタンパク質は前述したように、感染や、細胞付着及び膜融合のプロセスで早期に重要な役割を果たす。
【００３８】
糖タンパク質Ｇがひどく損なわれているか（又は不在である）ために、得られたＧ突然変異体ウイルスがもはや他の細胞に感染し得ない程度まで挿入及び／もしくは欠失により（又は全Ｇ遺伝子の欠失により）Ｇ遺伝子を突然変異させることが可能である。このような突然変異体はＧ−マイナス（Ｇ−−）突然変異体とも称される。
【００３９】
従って、Ｇ遺伝子のこの種の突然変異は単に毒性を低下させる前述の突然変異よりも困難である。実際のＧ−突然変異体は機能的糖タンパク質Ｇが欠失しているので、非感染性である。
【００４０】
このようなＧ−突然変異体ウイルスをＧタンパク質に対して相補性の組換え宿主細胞で増殖させると、表現型はＧ陽性であるが、遺伝子型がＧ陰性の後代ウイルスが分泌される。
【００４１】
これらのウイルスは、Ｇ陽性ウイルスに比べて重要な利点を有する。一方では、これらのウイルスは、膜内にＧタンパク質を有するために非相補性宿主細胞に感染し得る。感染した細胞では、Ｇ突然変異体ウイルスは野生型ウイルスとして複製する。これは、組換えウイルス内にクローニングされる異種遺伝子を含む全ウイルスゲノムが増殖し、コードされたゲノム産物が野生型ウイルスと同様に発現、処理されるという利点を有する。
【００４２】
しかしながら他方では、正常宿主細胞はＧタンパク質を合成せず、突然変異体ウイルス自体の遺伝型がＧ陰性であるために、伝染性後代ウイルスを宿主で産生することはできない。
【００４３】
従って、Ｇ突然変異体ウイルスに感染した動物は環境で伝染性ウイルスを拡散しない。これによりＧ突然変異体（及び前述のＭ（−）突然変異体）はワクチン基材として非常に安全なものとなる。
【００４４】
あるいは、本発明のＧ−突然変異体は、細胞付着である役割を果たすことが知られている他の非狂犬病糖タンパク質と表現型が相補的になり得る。
【００４５】
ウイルス膜から環境内に突出する糖タンパク質が細胞特異性を決定することが知られているので、全く相補性の（ｒｉｇｈｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）糖タンパク質を選択することにより、組換え伝染性狂犬病ウイルス突然変異体の標的を、狂犬病の天然宿主細胞以外の特異細胞とすることが可能である。
【００４６】
これらの糖タンパク質は、糖タンパク質Ｇのように細胞特異的付着に関与することを示すために“糖タンパク質Ｇ類似体”とも称される。
【００４７】
ウイルスによっては、細胞特異性を決定する“糖タンパク質Ｇ類似体”が糖タンパク質ではなく、非グリコシル化タンパク質であることに留意すべきである。これらのタンパク質も本発明の範囲内であることは明白である。
【００４８】
従って、本発明の他の好ましい実施態様では、糖タンパク質Ｇをコードする読み取り枠内の挿入及び／又は欠失は、糖タンパク質Ｇを非機能的とするか又は不在とするようなものである。糖タンパク質Ｇが非機能的であるか又は不在であるＧ（−）突然変異体ウイルスを、糖タンパク質Ｇ類似体をトランスで提供する細胞で増殖させて、ウイルスの表現型を相補的にしなければならない。
【００４９】
本発明の更に好ましい実施態様では、相補性のために使用する糖タンパク質類似体は狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ自体である。
【００５０】
糖タンパク質Ｇ類似体を含む組換え伝染性狂犬病ウイルスは、いくつかの重要な利点を有する：
ａ）前記ウイルスは、選択する糖タンパク質Ｇ類似体の標的に依存して、ある細胞、器官又は宿主を特異的に標的とし得る。
【００５１】
これは、例えば呼吸管又は消化管を特異的に標的とすることができることを意味している。従って、例えば所定の部位で粘膜応答が得られ得る。あるいは、免疫系の特異細胞を標的とすることができる。
ｂ）前記ウイルスは更に、前述したように非狂犬病病原体に由来するエピトープをコードする外来遺伝子情報のキャリアーであり得る。
【００５２】
あるいは、前記ウイルスは、毒性物質をコードする外来遺伝子情報のキャリアーであり得る。
【００５３】
本発明のウイルスの非常に重要な適用は、ａ）の糖タンパク質Ｇ類似体及びｂ）の外来遺伝子情報の両方を有するウイルスを用いて行われる。
【００５４】
特異的な細胞型を標的とし、通常非狂犬病ウイルスの攻撃を受けると同時に、非狂犬病ウイルスの免疫防御性決定因子を保有する組換え伝染性狂犬病ウイルスを本発明の方法で産生することができる。
【００５５】
このようなウイルスは、糖タンパク質Ｇ類似体の遺伝子情報が欠失しているために、非狂犬病ウイルスに対する宿主で免疫を誘発すると同時に全く安全である。
【００５６】
本発明の他の重要な実施態様は、例えばＣＤ４細胞を標的とし、ＨＩＶ ｇｐ１２０による遺伝子型相補化によりＨＩＶの標的細胞を示し、任意に細胞毒性タンパク質をコードする本発明のウイルスである。
【００５７】
このようなウイルスは、ＣＤ４細胞を選択的に攻撃し、一旦これらの細胞内に入ると、細胞を死滅させる。
【００５８】
あるいは、本発明の組換え伝染性狂犬病ウイルスは、現時点では安全な生ワクチンが存在していない毒性／病原性ウイルスに対する非常に安全なワクチンを提供し得る。例えばウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）糖タンパク質Ｇ類似体で相補化してＢＲＳＶの天然標的細胞を標的として、ＢＲＳＶの免疫防御性エピトープを発現する組換え伝染性狂犬病ウイルスは、このような疾病の非常に安全なワクチンとなる。
【００５９】
パラインフルエンザウイルスワクチンは今日まで、ＢＲＳＶワクチンと同じ問題に直面している。従って、パラインフルエンザ糖タンパク質Ｇ類似体及びパラインフルエンザの別の免疫原性エピトープを含む組換え伝染性狂犬病ウイルスは、この疾病の良好で安全なワクチンとなる。
【００６０】
組換え伝染性狂犬病ウイルスを基材とする他の重要な動物ワクチンは、
ｉ）トロウイルス；ウマ、ウシ及びブタトロウイルス、
ｉｉ）コロナウイルス；ウシ、イヌ、ブタ及びネココロナウイルス、特にそのスパイクタンパク質
の免疫原性決定因子を組換え狂犬病ウイルス内に導入することにより産生される。
【００６１】
従って、本発明の最も好ましい実施態様は、糖タンパク質Ｇ類似体を補体結合し、病原性ウイルス又は微生物のエピトープ又はポリペプチドをコードする異種核酸配列を保有する組換え伝染性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ（−）突然変異体に関する。
【００６２】
あるいは、酵素活性が低下するようにＲＶレプリカーゼ又はトランスクリプターゼの酵素活性を変化させてＲＶを弱毒化して、宿主動物の感染で伝染性の低いビリオンを産生することができる。Ｎ、Ｐ及びＬタンパク質はＲＶポリメラーゼ活性に関与するので、Ｎ、Ｐ又はＬタンパク質をコードするＯＲＦ内に挿入又は欠失を有するＲＶ突然変異体も本発明の一部分である。
【００６３】
本発明のＲＶ欠失及び／又は挿入突然変異体を使用して宿主にワクチン接種し、前記ＲＶ突然変異体を含むワクチンを投与した宿主と、親ＲＶに感染した宿主とを（血清学的に）区別することができる。本発明のこの実施態様では、ＲＶ挿入突然変異体のインサートは、接種した宿主の特異的な非ＲＶ免疫応答を誘発し得る異種エピトープをコードしてもよいし、ＣＡＴ又はｌａｃＺのような酵素活性を有するタンパク質をコードしてもよい（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ及びＳｃｈｎｅｌｌ、１９９４、上掲）。このようなインサートの取り込みのために好ましい領域は、ＲＶ偽遺伝子領域である。実施例で示すように、ＲＶの主要機能（例えば感染又は複製に必要な機能）を損なわずに、この領域で挿入及び欠失を実施することができる。ＲＶ欠失突然変異体は、その免疫応答が通常ワクチン接種により生じるＲＶタンパク質のエピトープが欠失していてもよい。特に、Ｇタンパク質をコードするＯＲＦに欠失を含むＲＶ突然変異体がこの目的に適している。ＲＶ挿入突然変異体の場合、挿入は、血清学的マーカー抗原又はそのエピトープをコードする核酸配列を含んでいる。
【００６４】
本発明の別の実施態様では、特異的な病原体の１個以上の異なる異種エピトープ又はポリペプチドを発現し得るＲＶ突然変異体を提供する。このような突然変異体を使用して、動物（家畜動物及び非家畜動物を含む）に野生動物狂犬病や前記病原体に対するワクチンを接種することができる。
【００６５】
このような生ベクターワクチンを接種して、ＲＶポリペプチドと共に異種エピトープ又はポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏ発現する接種宿主内でＲＶ突然変異体を複製することが好ましい。次いで、接種した宿主内で発現されたポリペプチドは、ＲＶ及び特定病原体の両方に対する免疫応答を誘発する。特定病原体に由来する異種ポリペプチドが防御的免疫応答を刺激し得るならば、本発明のＲＶ突然変異体を接種した動物は、その後の病原体感染や、ＲＶ感染に対して免疫がある。従って、ＲＶゲノムの適切な領域内に取り込まれた異種核酸配列を連続的にｉｎ ｖｉｖｏ発現することにより、病原体に対して確実、安全で寿命の長い免疫性を提供する。
【００６６】
特に、本発明は、特異的な病原体のエピトープ又はポリペプチドをコードする核酸配列の挿入を含み、該挿入が偽遺伝子領域で実施されることを特徴とするＲＶベクターを提供する。
【００６７】
所望とあれば、偽遺伝子領域の一部又は全体を前述のＲＶベクターで欠失させることができる。
【００６８】
ＲＶゲノムの適切な領域内への取り込みについては、イヌパルボウイルス、イヌコロナウイルス及び従来のブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）のエピトープ又はポリペプチドをコードする核酸配列を考察することが好ましい。
【００６９】
伝染性複製ウイルスを産生させることができなかったため、ＲＶの非セグメント化陰性鎖ＲＮＡゲノムの組換えＤＮＡ技術によるＤＮＡレベルでの操作は今日まで不可能であった。しかしながら、本明細書では、突然変異を組換えＤＮＡ技術によりＤＮＡレベルでウイルスゲノムのコード化領域又は非コード化領域内に作成し、次いでゲノム内に突然変異を保有する伝染性複製ＲＶを産生する方法を提供する。
【００７０】
本発明の方法は、
ａ）ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞内に、
１）ＲＶのＮ、Ｐ及びＬタンパク質をコードする１個以上のＤＮＡ分子と、
２）ＲＶのｃＤＮＡゲノムを含むＤＮＡ分子
とを導入し、
ｂ）前記細胞によって産生されるウイルスを単離する
段階からなる。
【００７１】
通常、狂犬病ウイルスゲノムのｃＤＮＡは、ゲノム内に突然変異を取り込むことにより改変される。
【００７２】
しかしながら、この方法を使用して、例えば汚染したＲＮＡプールを精製してもよい。この場合、元の突然変異していないｃＤＮＡを使用する。
【００７３】
タンパク質をコードするプラスミドを備えた異種インサートを含むＲＶのモデルミニゲノムのレスキュー効率は極めて低く、更にはインサート長さと相関関係にあるという事実を考慮すれば（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ及びＳｃｈｎｅｌｌ、１９９４、上掲）、トランスフェクトした全長ゲノムＲＮＡに由来する増殖性感染が、ＲＶのＮ、Ｐ及びＬタンパク質をコードするプラスミドと同時にトランスフェクトすることにより開始され得るとは予想できない。これは、同時に発現された陰性鎖ゲノムＲＮＡ転写体とハイブリダイズすると予想される、トランスフェクトしたタンパク質をコードするプラスミドにより、多量の陽性センスのＮ、Ｐ及びＬ特異的ＲＮＡが産生されるだけに一層そうである。しかしながら、ゲノムの半分以上に作用し得る可能なハイブリダイゼーションは、重要なエンカプシデーション段階に介在すると思われた。更には、Ｎ、Ｐ及びＬ ｍＲＮＡの翻訳は影響を受け得る。実際、標準的なトランスフェクションプロトコルでは伝染性ウイルスは産生できないことが知見された。しかしながら、実施例に記載するように、代替トランスフェクションプロトコルと、陽性鎖抗ゲノムＲＮＡ転写体を生成するＲＶ ｃＤＮＡゲノムの使用とを組み合わせれば、遺伝学的に作成された複製ＲＶが得られた。
【００７４】
前述の方法では、組換えＤＮＡ技術により親ＲＶのゲノム内に突然変異をｉｎ ｖｉｔｒｏ取り込み、次いで前記突然変異を有する伝染性複製ＲＶ突然変異体を産生することができる。突然変異は限定はされないが、ＲＶ親ゲノムのＲＶタンパク質をコードするＯＲＦ、非コード化領域（例えば偽遺伝子領域）又は転写シグナル配列内への核酸残基の挿入、欠失又は置換を包含する。
【００７５】
非コード化遺伝子間領域内での突然変異の作成は特異的なウイルス遺伝子の転写に影響し、ｍＲＮＡの転写及びその後のタンパク質（Ｍ及びＧタンパク質のようなエンベロープタンパク質又はＮ、Ｐ及びＬタンパク質のようなポリメラーゼ活性に関与するタンパク質）の翻訳が低減して、突然変異体の（伝染性）後代ウイルスの産生能力が低下するために弱毒性を特徴とするウイルス突然変異体が得られる。特に、この遺伝子間領域及び／又は転写シグナル配列での１個以上の核酸残基の置換は、転写効率に影響し得る。
【００７６】
更には、毒性に関与する毒性ＲＶのゲノムの領域（例えばＧタンパク質をコードするＯＲＦ）で、前述の方法を適用して行う１個以上の核酸残基の置換は本発明の一部である。
【００７７】
このような突然変異により、毒性ＲＶ株のＧタンパク質で１個のアミノ酸が交換されて病原性が（一部分）損なわれる。例えばＡｒｇ（３３３）がＩｌｅ、ＧｌｕもしくはＧｌｎで、又はＬｅｕ（１３２）がＰｈｅもしくはＴｒｐで置換され得る。
【００７８】
本発明の方法では、ＲＶ遺伝子情報を含むＤＮＡ分子は好ましくは、トランスフェクトした宿主細胞によって同時発現されるポリメラーゼにより認識可能な適切な転写イニシエーター及びターミネーター配列を備えたプラスミドを含んでいる。
【００７９】
本発明の好ましい方法は、ＲＶ ＤＮＡでトランスフェクトした宿主細胞を使用することからなり、前記細胞は、ワクシニアウイルス組換え体から例えば細胞質で発現されるバクテリオファージＴ７ ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを発現し得る。この場合、ＲＶ ＤＮＡを含むプラスミドは、Ｔ７プロモーター及びターミネーター配列を備えている（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ及びＳｃｈｎｅｌｌ、１９９４、上掲）。
【００８０】
生ワクチンを製造するため、例えばＢＨＫ又はヒト二倍体細胞に由来する細胞培養で本発明の組換えＲＶ突然変異体を増殖させることができる。組織細胞培養液及び／又は細胞を収集することにより、このようにして増殖させたウイルスを収集することができる。生ワクチンは懸濁液の形態で調製してもよいし、凍結乾燥してもよい。
【００８１】
ワクチンは、免疫学的に有効な量の組換えＲＶの他に、医薬的に許容可能なキャリアー又は希釈剤を含み得る。
【００８２】
本発明で有用な医薬的に許容可能なキャリアー又は希釈剤の例には、ＳＰＧＡのような安定剤、炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、グルコース、デキストラン）、ウシ血清又はスキムミルクのようなタンパク質、及び緩衝液（例えばリン酸緩衝液）が含まれる。
【００８３】
場合によっては、アジュバント活性を有する１種以上の化合物をワクチンに添加してもよい。適切なアジュバントは例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、（例えばＢａｙｏｌ Ｆ（Ｒ）もしくはＭａｒｃｏｌ ５２（Ｒ）の）油状エマルジョン、サポニン又はビタミンＥ溶解物である。
【００８４】
有用な投与量は、ワクチン接種すべき哺乳動物の種類、年齢、体重及び投与方法によって異なる。
【００８５】
投与量は広範囲で変動し得る。例えば１０２〜１０７ｐｆｕ／動物が適量である。
【００８６】
特定の投与量は例えば約１０６ｐｆｕ／動物であり得る。
【００８７】
本発明のＲＶ突然変異体を使用して、不活化ワクチンを製造することもできる。
【００８８】
動物への投与では、本発明のＲＶ突然変異体をとりわけ経口投与、経鼻投与、皮内投与、皮下投与又は筋肉内投与することができる。
【００８９】
本発明のＲＶワクチンをイヌだけでなく、主要ベクター、即ちアライグマ、スカンク及びキツネに投与することができる。更には、従来のブタ熱ウイルスのようなブタ病原体の異種遺伝子を発現し得る生ＲＶベクターのイノシシへのワクチン接種も考えられる。
【００９０】
（実施例）
【実施例１】
【００９１】
伝染性複製ＲＶビリオンの調製
全長ＲＶ ｃＤＮＡの構築（図２）。
【００９２】
ＲＶ株ＳＡＤ Ｂ１９の全ゲノムに及ぶｃＤＮＡのクローニングは以前に発表されている（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ等、１９９０、上掲；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３１０４６）。本明細書で使用するＲＶヌクレオチドやアミノ酸の番号付けは、Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ等、１９９０（上掲）のものに対応する。ＳＡＤ Ｂ１９全長ＤＮＡクローンの作成基材として、転写プラスミドｐＳＤＩ−１に含まれるＲＶミニゲノム配列（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ及びＳｃｈｎｅｌｌ、１９９４、上掲）を使用した（図２）。ｐＳＤＩ−１は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターと、肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）抗ゲノムリボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）配列との間に挿入されたＳＡＤ Ｂ１９ゲノム３’末端及び５’末端（それぞれＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチドの１−６８及び１１７６０−１１９２８）を含む。陽性鎖ＳＤＩ−１転写体（ｐＳＤＩ−１プラス）を産生するプラスミドを生成するために、１１塩基プライマー（５’−ＡＣＧＣＴＴＡＡＣＡＡ−３’）を用いて、ｐＳＤＩ−１に含まれるＲＶ配列をまずＰＣＲで増幅した。このプライマーは、ＲＶゲノム末端の相補性のために、陽性センス及び陰性センスの両方のウイルスＲＮＡの５’末端に対応する。Ｔ７プロモーター配列、次いで３個のＧ残基（下線）（５’−ＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）を含む合成ＥｃｏＲＩ／ブラントアダプター（Ｔ７／３）をその後増幅ＲＶ配列に部分結合した後、結合産物をｐＸ８ｄＴのＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ部位にクローニングした。このプラスミドは、元のＴ７プロモーターを含む多重クローニング部位のＢｓｓＨＩＩ／ＣｌａＩ断片が欠失しているｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の誘導体である。このプラスミドは、ＳｍａＩ部位に８４塩基ＨＤＶ抗ゲノムリボザイム配列を含み、直後にはＢａｍＨＩ部位にクローニングされたＴ７転写ターミネーター配列を含んでいる。プラスセンスＲＶ配列の上流にＴ７プロモーターを含む構築物を、制限分析及び配列決定により同定した。次いで、ｐＳＤＩ−１のＭｕｎＩ−ＢｇｌＩＩ断片（ＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチド４０−６８）を、種々のＳＡＤ Ｂ１９ ｃＤＮＡクローンの３個の断片（ＭｕｎＩ−ＳｐｈＩ（ｐＺＡＤ１−９に由来のＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチド４０−４８２）；ＳｐｈＩ−ＡａｔＩＩ（ｐＳＡＤ１３に由来の４０４１−４２７３）及びＡａｔＩＩ−ＢｇｌＩＩ（ｐＳＡＤ８５に由来の１１４７２−１１７５９））に由来する、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩに作成された１ｋｂ ＭｕｎＩ／ＢｇｌＩＩ ｃＤＮＡで置換して、ｐＳＤＩ−１１７０を得た。ＮｃｏＩ（ＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチド４８２−４０４１）によりクローンｐＳＡＤ２５及びｐＳＡＤ１３から作成したＳｐｈＩ断片、及びＸｈｏＩ（ＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチド４２７３−１１４７２）によりクローンｐＳＡＤ４９及びｐＳＡＤ８５から作成したＡａｔＩＩ断片をｐＳＤＩ−１１７０の単一のＳｐｈＩ及びＡａｔＩＩ部位に挿入して、最終全長クローンｐＳＡＤ Ｌ１６を完成した。環状プラスミドを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を実施し、産物を変性アガロースゲルで分析した。１２ｋｂ ＲＶゲノムＲＮＡと共に移動するＲＮＡ転写体の存在は、全長抗ゲノムＲＮＡがＴ７ポリメラーゼによって転写されることを示していた。
【００９３】
伝染性組換えＲＶの回収
ＲＶのタンパク質Ｎ、Ｐ、Ｌをコードするプラスミドと、プラスミドｐＳＡＤ Ｌ１６とのコトランスフェクションをＣｏｎｚｅｌｍａｎｎ及びＳｃｈｎｅｌｌ，１９９４（上掲）に記載された方法で実施した。
【００９４】
以前に発表された方法でトランスフェクション実験を実施した。クローンＢＳＲ細胞のＢＨＫ−２１を、１０％ウシ血清を補充したイーグル培地を含む３．２ｃｍ直径の皿に入れて一晩増殖させ８０％の集密度にして、組換えワクシニアウイルスｖＴＦ７−３をｍ．ｏ．ｉ．５で感染させた（Ｆｏｕｒｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，８１２２−８１２６、１９８６）。１時間放置したｐｏｎｔｉｆｉｃａｔｉｎｇ細胞を、ウシ血清を含まない培地で２度洗浄し、哺乳動物トランスフェクションキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；ＣａＰＯ４プロトコル）を供給業者の指示に従って用いて、５μｇのｐＴ７Ｔ−Ｎ、２．５μｇのｐＴ７Ｔ−Ｐ及び２．５μｇのｐＴ７Ｔ−Ｌを含むプラスミド混合物、並びに２μｇのｐＳＡＤ−Ｌ１６プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトしてから４時間後に沈殿物を除去し、細胞を洗浄し、１０％ウシ血清を含むイーグル培地でインンキュベートした。ｐＳＡＤ−Ｌ１６に由来するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写体のキャプシド内被包、及びヌクレオキャプシドに由来するＲＶタンパク質の発現を間接蛍光法で検査した。組換えＲＶゲノムからのみ発現し得るＲＶ Ｇタンパク質に対するモノクローナル抗体を使用して培養物をスクリーニングした。トランスフェクトしてから１日後、染色細胞が存在していた。このことは、ＲＶゲノム由来の遺伝子の発現を実証している。しかしながら、一連の２０のトランスフェクション実験では、１個の陽性細胞群のみが観察された。これらの実験では、伝染性ウイルスの存在を示す蛍光細胞フォーカスは得られなかった。更には、２日後に、トランスフェクトした細胞に由来する全上清を接種した細胞培養物からは、伝染性ウイルスを回収することができなかった。従って、トランスフェクトした細胞で産生した推定上の非常に少量の伝染性ウイルスを単離するために、実験手順を変更した。トランスフェクタントウイルスを単離するために、細胞及び上清をトランスフェクトしてから２日後に採取した。細胞をゴムポリスマンで掻き取って、上清に懸濁させた。この懸濁液を３サイクル凍結融解処理した（−７０℃／３７℃、それぞれ５分）。細胞破片や、このような条件下で凝集物を生成する過剰ワクシニアウイルスをｍｉｃｒｏｆｕｇｅ内にて１０，０００ｇで１０分間遠心分離にかけてペレット化した。全上清を使用して、培養皿に集密性単層の細胞を接種した。２時間インキュベートした後に、上清を２ｍｌの新しい培地に代えた。ワクシニアウイルスによって生じる細胞変性効果（ｃｐｅ）が感染から１〜２日後に観察された。１０，０００ｇで遠心分離した後に、平均で僅か１０個のプラークが観察された。感染から２日後に、全単層の抗Ｎ結合体（Ｃｅｎｔｏｃｏｒｅ）による直接免疫蛍光染色により、ｃｐｅが検出不能であるＲＶ細胞感染を実証した。２０のうち２つの実験で、蛍光フォーカスが観察され、各上清は、ｃＤＮＡ転写体から生成されるトランスフェクタントウイルスを示すと思われる伝染性ＲＶ（ＳＡＤ Ｌ１６）を含んでいた。
【００９５】
フォーカスが観察される培養物に由来する上清の半分を１０，０００ｇで遠心分離にかけた後に第２の継代で使用した。更なる継代（それぞれ２日）のために、ＲＶ感染の程度によってより少ない上清の分注液を使用した。ワクシニアウイルスを完全に除去するために、全ての細胞の感染に関与する培養物（第三継代）に由来する上清をｍｉｃｒｏｆｕｇｅにて２度、１４，０００ｇで１０分間ずつ遠心分離した。次いで、滅菌ＭＩＬＬＥＸ−ＶＶ ０．１μｍフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ０１７３０）を用いて最終上清を濾過し、次いでこれを使用して組換えＲＶの高力価ストックを生成した。
【００９６】
以下の実施例では後半のトランスフェクション及び単離プロトコルを使用した。
【実施例２】
【００９７】
ＲＶ偽遺伝子領域へのオリゴヌクレオチドの挿入
ＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチド３８２３−６６６８を示すｐＳＡＤ Ｌ１６の２．８ｋｂ ＸｈｏＩ−ＳｃａＩ断片を含むサブクローンｐＰｓｉＸ８でΨの操作を実施した。次いで、改変ｐＰｓｉＸ８プラスミドのＳｔｕＩ断片を単離し、これを使用して全長クローンｐＳＡＤ Ｌ１６（図１）の対応断片（ＳＡＤ Ｂ１９位置４０１４−６３６４）を置換した。ｐＰｓｉＸ８をＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、エキステンションをクレノー酵素でフィルインし、再結合することにより、４個のヌクレオチドをΨに挿入して、新たなＮｈｅＩ部位を生成した。ヌクレオチド５３３８−５３４１を重複させて、最後の全長クローンｐＳＡＤ Ｕ２をＳＡＤ Ｌ１６と区別する。
【００９８】
トランスフェクトした細胞に由来する抽出物を上清と一緒に新しい細胞に移動させた後に、伝染性ウイルスの生成が実証された。各一連の実験では、一実験でフォーカス形成が観察された。更に２回上清を新しい細胞に移して、トランスフェクタントウイルス（クローンＳＡＤ Ｕ２−１３及びＳＡＤ Ｕ２−３２）を継代すると、細胞がほぼ１００％感染した。ＳＡＤ Ｕ２ウイルスゲノム内への挿入を実証するために、全ＲＮＡをＳＡＤ Ｕ２−１３に感染した細胞から単離し、Ψの逆トランスクリプターゼ−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。それぞれＧ遺伝子及びＬ遺伝子に特異的なプライマーＧ３Ｐ及びＬ４Ｍ（図１）を使用して、トランスフェクタントウイルスＳＡＤ Ｕ２、ＳＡＤ Ｌ１６、及び標準ＲＶ ＳＡＤ Ｂ１９のゲノムから約７３０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。しかしながら、ＳＡＤ Ｕ２から得られるＰＣＲ ＤＮＡではなく、ＳＡＤ Ｂ１９及びＳＡＤ Ｌ１６から得られるＰＣＲ ＤＮＡでのみ、その後のＨｉｎｄＩＩＩでの消化が観察された。逆に、ＳＡＤ Ｕ２由来のＤＮＡだけがＮｈｅＩで消化されて、それぞれ約５３０ｂｐ及び２００ｂｐの２個の断片が得られた（図３）。トランスフェクタントウイルスＳＡＤ Ｕ２のゲノムＲＮＡの直接ＲＴ配列決定により更に、予測される部位に予想される４個の残基の挿入の存在が確定され、決定した配列の残部は元のＳＡＤ Ｂ１９ゲノムのものに対応していた。従って、ＳＡＤ Ｕ２ウイルスが、作成されたｃＤＮＡに由来するゲノムを含むトランスフェクタントウイルスを示すことは明白であった。
【００９９】
ＲＶΨの末端付近に４個のヌクレオチドを導入しても、トランスフェクタントウイルスＳＡＤ Ｕ２の生存に影響せず、この導入はＧ ｍＲＮＡの正しい転写終結も阻害しなかった。
【実施例３】
【０１００】
Ｇコード化領域とＬコード化領域との間の挿入又は欠失によるＲＶ転写の改変
ＳｔｙＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで二重に消化し、クレノーフィルインし、再結合して、３９６塩基（ＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチド４９４２−５３３７）を欠失させた。最終構築物はｐＳＡＤ Ｗ９であった。ｐＳＡＤ Ｖ＊の構築のために、ＳＡＤ Ｂ１９ Ｎ／Ｐシストロンボーダー領域を含む１８０ｂｐ ＢｇＩＩＩ−ＡｓｕＩＩ断片をｐＳＡＤ１３から単離した（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ等、１９９０、上掲）。その断片は、Ｎコード化領域の９７ヌクレオチドと、全３’非コード化領域と、Ｎ転写終結／ポリアデニル化シグナル、遺伝子間領域、及び転写開始シグナルを含むＰシストロンの最初の１６ヌクレオチドからなるＮ／Ｐシストロンボーダーとを含んでいた。まずｃＤＮＡ断片を、３’陥凹末端をクレノー酵素でフィルインした後のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした（ｐＮｉｇＰ−１８０）。ｐＮｉｇＰからＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで切り出し、ブラント末端を産生した後、それぞれ１６ｐｂ及び３４ｂｐのベクター由来配列に隣接するＲＶインサートを含む２３０ｂｐ断片産物をｐＰｓｉＸ８のフィルインしたＳｔｙＩ部位にクローニングした。かくして、最終全長構築物（ｐＳＡＤ Ｖ＊）は、ｐＳＡＤ Ｌ１６に匹敵する２３４ｂｐの挿入を有していた。
【０１０１】
前述のように、ｐＳＡＤ Ｖ＊及びｐＳＡＤ Ｗ９を使用して、２０個の培養皿をそれぞれトランスフェクトした。ＳＡＤ Ｖ＊でトランスフェクトした３個の培養物及びＳＡＤ Ｗ９でトランスフェクトした１個の培養物で、生存可能なウイルスをその後単離することによりレスキューが示された。５回続けて継代した後に、感染細胞由来のＲＮＡ及び上清を単離し、前述の実験と同一のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにより分析した。標準ＳＡＤ Ｂ１９ウイルスと比較して、ＳＡＤ Ｖ＊に感染した細胞のＲＮＡから約０．９ｋｂの拡大ＤＮＡ断片が得られ、このことは、このトランスフェクタントウイルスのΨ領域に付加された配列が存在することを示した（図４）。対照的に、ＳＡＤ Ｗ９に感染した細胞のＲＮＡからは、僅かに０．３ｋｂのＤＮＡ断片が得られた。この寸法は、ｃＤＮＡゲノムコピーで行われた欠失によるものと推測された。ＰＣＲ産物の配列決定により更に、最初に作成したｃＤＮＡ配列がＳＡＤ Ｖ＊及びＳＡＤ Ｗ９トランスフェクタントウイルスのゲノム内にレスキューされることが確定した。従って、Ｇ読み取り枠とΨとの間に付加された配列（例えば５０個のベクター由来ヌクレオチド）が存在しても、全Ψを欠失しても、トランスフェクタント狂犬病ウイルスの感染性や増殖は妨げられなかった。ＳＡＤ Ｖ＊及びＳＡＤ Ｗ９のゲノム内に作成される改変は、転写パターンに表現型の変化をもたらすように設計され、これが各トランスフェクタントウイルスの増殖性に影響するかどうかを調査した。しかしながら、細胞培養での増殖及び伝染性ＳＡＤ Ｖ＊及びＳＡＤ Ｗ９ウイルスの最終力価は、標準ＳＡＤ Ｂ１９ ＲＶの場合と同様であった。ｍ．ｏ．ｉ．０．０１で細胞感染させてから３日後に、ＳＡＤ Ｂ１９、ＳＡＤ Ｖ＊及びＳＡＤ Ｗ９の上清で１０８フォーカス形成単位（ｆｆｕ）の力価に達した。このことは、ＲＶ Ψが細胞培養の増殖で重要でないことを示している。
【０１０２】
Ψ特異的プローブを用いると、Ψ欠失ＳＡＤ Ｗ９ウイルスに感染した細胞に由来するＲＮＡでハイブリダイゼーションは検出されなかった。他のウイルスのゲノムＲＮＡ及びＳＡＤ Ｂ１９及びＳＡＤ Ｌ１６のＧ ｍＲＮＡはこのプローブで認識されたが、ＳＡＤ Ｖ＊Ｇ ｍＲＮＡは反応しなかった。対照的に、ＳＡＤ Ｖ＊Ψ配列に先行する余分のＰ遺伝子転写開始シグナルの存在によって予測される新たな余分のΨ−ｍＲＮＡの寸法に相当する弱いＲＮＡバンドが出現した。天然ＲＶとは対照的に、トランスフェクタントウイルスＳＡＤ Ｖ＊は、ゲノムが６個の機能的シストロンからなるＲＶを示している。
【実施例４】
【０１０３】
組換えＲＶ由来の外来タンパク質コード化遺伝子の発現
ブラント末端をクレノー酵素で生成した後に、実施例３に記載した多重制限部位に隣接するＮ／Ｐシストロンボーダーを含む２３０ｂｐ ｃＤＮＡ断片を、全長ｃＤＮＡ ｐＳＡＤ Ｌ１６の偽遺伝子領域のＢｓｔＸＩ部位（ＳＡＤ Ｂ１９位置４９９５）に導入した。得られたｃＤＮＡ ｐＳＡＤ Ｖを細菌クロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の導入基材として使用した。ｐＳＡＤ ＸＣＡＴを得るため、全ＣＡＴコード化領域を含むｐＣＭ７（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の０．８ｋｂ ＤＮＡ断片を、偽遺伝子配列の上流のＮ／Ｐシストロンボーダーに含まれるｐＳＡＤ ＶのＡｓｕＩＩ部位にクローニングした。ｐＳＡＤ ＶＣＡＴの構築のために、偽遺伝子配列（ＳＡＤ Ｂ１９位置５３３７）の末端付近に位置する、ＡｓｕＩＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間のｃＤＮＡを欠失し、クレノー酵素でブラント末端を形成した後に、ｐＣＭ７由来のＣＡＴコード化ＨｉｎｄＩＩＩ−ＤＮＡで置換した。従って、組換えＲＶ ＳＡＤ ＸＣＡＴの転写により、偽遺伝子配列を非翻訳化３’領域として有するＣＡＴ ｍＲＮＡが得られるはずであり、ＳＡＤ ＶＣＡＴは偽遺伝子配列の欠失したＣＡＴ ｍＲＮＡを転写するはずである。
【０１０４】
実施例１に記載したようにＲＶのＮ、Ｐ及びＬタンパク質、ｐＳＡＤ−ＸＣＡＴ、ｐＳＡＤ−ＶＣＡＴをそれぞれコードするプラスミドをトランスフェクトした後に、組換え狂犬病ウイルスはレスキューされた。ワクシニアウイルスを除去した後に、組換えＲＶの転写パターンをノーザンハイブリダイゼーションで分析した。両方のウイルスは、予想される寸法及び組成のＣＡＴ ｍＲＮＡを転写した（図５）。ＣＡＴ酵素活性の発現を、２種のウイルスに感染した細胞でそれぞれ標準ＣＡＴアッセイ（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ及びＳｃｈｎｅｌｌ、１９９４、上掲）により決定した。両者とも、ＣＡＴを効果的に発現することが知見された。細胞培養細胞での連続継代により、導入した外来配列が遺伝学的に安定であることが判明した。４０継代後でも、両方のウイルスはＣＡＴを効果的に発現した（図６）。感染動物の組換えウイルスの発現や挙動を調べるために別の実験を実施した。６週齢マウス（５匹ずつ）に１０４ｆｆｕのＳＡＤ ＶＣＡＴ、ＳＡＤ ＸＣＡＴ及び標準配列ＲＶ ＳＡＤ Ｌ１６をそれぞれ大脳内注射した。感染から７日後に、全ての動物は典型的な狂犬病の症状を示し、次週までに狂犬病で死亡した。ＳＡＤ ＶＣＡＴ及びＳＡＤ ＸＣＡＴにそれぞれ感染したマウスの脳でＣＡＴ活性が示された。両方のウイルスをマウス脳から再度単離することができ、これらはＣＡＴ細胞培養を発現した。従って、外来遺伝子は、伝染性ＲＶのゲノムに導入して、安定的に発現させることができ、更には組換えウイルスを区別するためのマーカーとして機能し得る。
【実施例５】
【０１０５】
組換えＲＶ由来の異種ウイルス抗原の発現及びＲＶ及び異種ウイルスに対する免疫応答の誘導
従来のブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）のゲノムは、３種の構造糖タンパク質（Ｅ０、Ｅ１及びＥ２）をコードする。ＣＳＦＶ感染動物では、中和抗体はＥ２に対するものであり、Ｅ０は細胞免疫応答を誘発する。ＣＳＦＶ株ＡｌｆｏｒｔのＥ２タンパク質及びＥ０タンパク質それぞれのコード化領域を包含するｃＤＮＡを使用して、実施例４に記載したようにｐＳＡＤ ＶのＡｓｕＩＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間の偽遺伝子を置換した。実施例１で詳述したように、組換えウイルス（それぞれＳＡＤ−ＶＥ０及びＳＡＤ−ＶＥ２）をトランスフェクション実験から回収した。感染細胞では、ウイルスはそれぞれＣＳＦＶ Ｅ０タンパク質及びＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を発現した（図７）。
【０１０６】
組換えウイルスＳＡＤ ＶＥ０及びＶＥ２を使用して、経口経路によりブタを免疫した。通常、キツネを弱毒化ＲＶ ＳＡＤ Ｂ１９株で経口免疫するために使用されている標準的なキツネ餌に１０７ｐｆｕのＳＡＤ−ＶＥ０、ＳＡＤ−ＶＥ２及びＳＡＤ Ｂ１９をそれぞれ導入した。各調製物の餌をそれぞれ２匹のブタに２回与えた（ブタ＃１及び＃２：ＳＡＤ ＶＥ０、＃３及び＃４：ＳＡＤ Ｂ１９、＃５及び＃６：ＳＡＤ ＶＥ２）。免疫から４週間後に、ＲＶ及びＣＳＦＶに対する中和抗体の存在を分析した。＃５の場合を除いて、全てのブタは、ワクチン餌の吸収を確定するＲＶ中和抗体（力価＞２５０）を有していた。従って、ブタ５は以後考察しなかった。ブタ＃６は、１６より大きい力価でＣＳＦＶ中和抗体を産生した。予想通り、ブタ＃１〜＃４はＣＳＦＶ中和抗体を産生しなかった。免疫から５週間後に、１０７ｐｆｕのＣＳＦＶ株Ａｌｆｏｒｔで経鼻攻撃した。攻撃後にブタの白血球数と体温を監視し、これをそれぞれ図８及び図９に示す。全てのブタは発熱したが、ブタ＃１、＃２、＃６はより早く回復した。対照動物＃４は典型的なＣＳＦＶ症状を示し、攻撃から１５日後に死亡し、対照＃３は２１日目に死亡した。ＳＡＤ ＶＥ２を与えたブタにＣＳＦＶ中和抗体が存在し、ＳＡＤ ＶＥ０又はＳＡＤ ＶＥ２の投与を受けたブタが一部感染予防を示すことは、２種の異種ウイルスに対する体液免疫反応及び細胞免疫反応が共に、経口経路による投与後に組換えＲＶ生ワクチンによって誘発され得ることを実証している。
【実施例６】
【０１０７】
Ｇ遺伝子配列内への突然変異導入による弱毒化ＲＶの生成
標準ウイルスＳＡＤ Ｂ１９ほどは効率的に増殖しないウイルスを生成するために、突然変異Ｇタンパク質を有する組換え体を調製した。
【０１０８】
このために、Ｇタンパク質の最後の４６アミノ酸をコードする配列を欠失させた。Ｇタンパク質コード化プラスミド：ｐＴ７Ｔ−Ｇ（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ及びＳｃｈｎｅｌｌ、１９９４、上掲）をＡｆｌＩＩＩ（ＳＡＤ Ｂ１９配列の位置４７５２）及びＥｃｏＲＶ（後半部位はプラスミドの多重クローニング部位に存在する）で消化し、クレノー酵素によりブラント末端を生成した。得られたＡｆｌＩＩＩ末端及びＥｃｏＲＶ末端を結合すると、前者のＡｆｌＩＩＩ配列に翻訳終結コドンが形成された。改変領域を含む０．３ｋｂ ＤＮＡ ＰｐｕＭＩ−ＳＭａＩ断片を使用して、ｐＳＡＤ Ｌ１６の本物のＰｐｕＭＩ−ＢｓｔＸＩ断片４４６９−４９９５を置換した。この操作により、Ｇタンパク質細胞質テールのカルボキシ末端４６ａａ及び偽遺伝子配列の一部分をコードするＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチド４７５３−４９９５が欠失した。別の結果は、新しいＧ翻訳終結コドンのすぐ下流に１８個のベクター由来ヌクレオチドが導入されることである。
【０１０９】
実施例１に記載したように組換えＲＶ（ＳＡＤ ＤＣＤ）を回収した。予想通り、端を切り取ったＧタンパク質はＳＡＤ ＤＣＤに感染した細胞で発現された（図１０）。標準配列ウイルスＳＡＤ Ｌ１６と比較して、ＳＡＤ ＤＣＤウイルスではｍ．ｏ．ｉ．１で細胞に感染させた後に１００分の１の力価が得られた。更には、細胞培養物で低い伝染速度が観察され（図１１）、このことはＧタンパク質の先端を切ることで、ビリオンの作成が低下するか又はビリオンの細胞感染が低下することを示している。感染動物でのＳＡＤ ＤＣＤの挙動を分析するために、５匹のマウスに１０５ｆｆｕのＳＡＤ ＤＣＤを脳内注射し、５匹のマウスに同量のＳＡＤ Ｌ１６を脳内注射した。
【実施例７】
【０１１０】
トランス相補化による狂犬病ウイルスＧ−マイナス（Ｇ−）突然変異体の生成
ＲＶゲノム由来の全Ｇタンパク質コード化領域を欠失させるために、全長クローンｐＳＡＤ ＵＥ（実施例２）を使用した。このクローンは、Ｇ遺伝子の非翻訳化３’領域（ＳＡＤ Ｂ１９位置５３３９）内に単一のＮｈｅＩ部位が存在することがｐＳＡＤ Ｌ１６と異なる。ｐＳＡＤ Ｕ２をＰｆｌＭＩ（ＳＡＤ位置３１７６）で部分的に消化し、ＮｈｅＩで完全消化し、その後クレノー酵素でフィルインし、再結合することにより、ＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチド３１７７−５３３９を含むｃＤＮＡ断片を除去した。得られたクローンｐＳＡＤ ｄＧをトランスフェクション実験で使用して、組換えウイルスを回収した。しかしながら、Ｎ、Ｐ及びＬタンパク質をコードするプラスミドの他に、Ｇタンパク質をコードするプラスミドをｐＳＡＤ ｄＧと一緒にトランスフェクトして、ウイルスゲノムのＧ欠失を補った。得られたウイルスＳＡＤ ｄＧを、Ｇコード化プラスミドで再度トランスフェクトした細胞に通し、ワクシニアウイルスｖＴＦ−７−３に感染させて、Ｇタンパク質を得た。
【０１１１】
ノーザンブロッティング実験により、ＳＡＤ ｄＧのＲＮＡ転写体を分析した。Ｎ特異的プローブでハイブリダイズした後に、ＳＡＤ ｄＧゲノムが狂犬病ウイルスｗｔゲノムよりも遥かに小さいことが知見された。このことは、２．１ｋｂのｃＤＮＡの欠失を反映している。しかしながら、全Ｇコード化領域に及ぶプローブでは、ＳＡＤ ｄＧ ＲＮＡとハイブリダイズできず、このことはＧコード化配列の欠失を示している（図１２）。欠失の同定は更にＲＴ−ＰＣＲ及び配列決定により確定された。
【０１１２】
表現型が相補化したＳＡＤ ｄＧは、非相補性ＢＳＲ細胞に感染し、そのゲノムを複製して、ゲノムによってコードされる遺伝子を発現することができた。しかしながら、伝染性ビリオンを生成することはできず、従って、感染を他の細胞に拡散させることも（図１３）、培養上清の他の細胞培養への継代により移行させることもできなかった。
【実施例８】
【０１１３】
異種糖タンパク質によるＧ突然変異体の相補化：ウイルスの特異細胞への指向
異種表面タンパク質が組換えウイルスのエンベロープに機能的に取り込まれ得ることを実証するために、Ｇ突然変異体ＳＡＤ ｄＧを狂犬病ウイルスＧについて実施例７に記載したように組換えウイルス糖タンパク質で相補化した。Ｍｏｋｏｌａウイルス、狂犬病ウイルス属の他の類、ラブドウイルス水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ；血清型Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ベシキュロウイルス属）、及びレトロウイルスヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、株ＮＬ−４３）に由来するスパイクタンパク質を含む伝染性偽型粒子を生成した。
【０１１４】
真正のＭｏｋｏｌａ及びＶＳＶ−Ｇタンパク質のトランスフェクトプラスミドからの発現や、細胞のＳＡＤ ｄＧ感染により、伝染性偽型ウイルスが生成した。しかしながら、狂犬病ウイルスＧや密接に関連するＭｏｋｏｌａウイルスＧに比べて、ＶＳＶ−Ｇでは低い力価が観察された（１０６／ｍｌとは対照的に１０４／ｍｌ）。しかしながら、ＶＳＶ−Ｇの細胞質ドメイン配列及びトランスメンブランドメイン配列を、狂犬病ウイルスＧタンパク質の対応するドメインで置換した後に、１０６個の伝染性粒子が生成した。このことは、ＲＶ Ｇの細胞質ドメインがそのタンパク質をウイルスエンベロープに指向させることを示唆している。
【０１１５】
真正のＨＩＶ ｇｐ１６０（ｇｐ１２０／４０）スパイクを含む偽型粒子の生成は観察されなかった。対照的に、ＲＶ Ｇの細胞質ドメインに融合したＨＩＶ ｇｐの膜外及びトランスメンブランドメインからなるキメラタンパク質の発現により、ＲＶ（ＨＩＶ）偽型が形成された。これにより、Ｇタンパク質の細胞質ドメインがラブドウイルスのエンベロープ内へのスパイクタンパク質の効果的な取り込みを担うことが確定した。ＲＶ（ＨＩＶ）偽型粒子は、ヒトＣＤ４表面タンパク質を発現するＶｅｒｏ細胞（Ｔ４＋細胞）にはうまく感染したが、ＣＤ８を発現する対照細胞（Ｔ８＋細胞）には感染しなかった（細胞はＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅから入手）。従って、偽型ウイルスはＨＩＶの宿主範囲及び細胞特異性を有する。
【０１１６】
図面の説明
図１：
ＲＶ偽遺伝子（Ψ）の構成及び組換えＲＶゲノムの構築（一定の比率で記述）。番号は、ＳＡＤ Ｂ１９の抗ゲノム配列のヌクレオチド位置を示す。上部に、５個の読み取り枠を有する全ＲＶゲノムを示す。ゲノムの一部（３８２３−６６６８）を含むｐＰｓｉＸ８で突然変異を実施し、ＳｔｕＩ断片（４０１４−６３６４）を交換して前記突然変異を全長クローンｐＳＡＤ Ｌ１６に再度導入した。詳細な図面では、コード化領域を灰色の枠で示し、非コード化配列は線として示す。機能的転写シグナル配列は黒い縦棒（終結／ポリアデニル化）及び矢印（ｍＲＮＡ転写開始）で示す。Ψ領域の開始を限定する非機能的シグナル様配列は白い縦棒で示す。矢印は、Ψ領域のＲＴ−ＰＣＲ分析で使用するオリゴヌクレオチドプライマーＧ３Ｐ及びＬ４Ｍの位置を示す。ＳＡＤ Ｕ２では、ＨｉｎｄＩＩＩエキステンションのフィルインにより、４個のヌクレオチドが挿入され、単一のＮｈｅＩ部位が生成した。ＳＡＤ Ｖ*では、ＲＶ Ｎ／Ｐシストロンボーダーを含むｃＤＮＡ断片（ＳＡＤ Ｂ１９ヌクレオチド１３２３−１５０２）をＳｔｙＩ部位に挿入した。ＳＡＤ Ｗ９はＳｔｙＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片の欠失を有する。
【０１１７】
図２：
全長ＲＶ ｃＤＮＡを含む転写プラスミドの構築概略図。番号は、ＳＡＤ Ｂ１９ ＲＶ抗ゲノム配列（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ等、１９９０）のヌクレオチド位置を示す。全長ＲＶゲノムＤＮＡの再構築の基材として機能するプラスミドｐＳＤＩ−１プラスは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｔ７）及び肝炎デルタウイルス抗ゲノムリボザイム配列（ＨＤＶ）に対して反対方向に末端ヌクレオチド１−６８及び１１７６０−１１９２８を含むＳＤＩ−１ ＲＶミニ−ゲノムを含むｐＳＤＩ−１（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ及びＳｃｈｎｅｌｌ、１９９４）の対応プラスミドである。ｐＳＤＩ−１プラスのＭｕｎＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、前述の３個のＳＡＤ Ｂ１９ ｃＤＮＡクローンから作成した１ｋｂ ｃＤＮＡ構築物で置換した。２個のｃＤＮＡクローンからそれぞれ作成した３．６ｋｂＳｐｈＩ断片及び７．２ｋｂ ＡａｔＩＩ断片を挿入すると、全長ＳＡＤ Ｂ１９ ｃＤＮＡを含む最終プラスミドｐＳＡＤ Ｌ１６が得られた。このプラスミドをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼで転写すると、リボザイムの自己融解の後に、５’末端及び正に３’末端に３個の余分の非ウイルスＧ残基を有する陽性鎖（抗ゲノム）ＲＮＡが得られるはずである。（Ｔ７）Ｔ７プロモーター；（Ｔ７Ｔ）Ｔ７転写ターミネーター；（ＨＤＶ）ＨＤＶ抗ゲノムリボザイム配列。
【０１１８】
図３：
トランスフェクタントウイルスＳＡＤ Ｕ２のゲノム内の遺伝子タグの例示。
【０１１９】
標準ＲＶ ＳＡＤ Ｂ１９（Ｂ１９）及びトランスフェクタントウイルスＳＡＤ Ｌ１６（Ｌ１６）、ＳＡＤ Ｕ２（Ｕ２）に感染した細胞に由来する全ＲＮＡを感染から２日後に単離し、これをプライマーＧ３Ｐ及びＬ４Ｍを用いる各Ψ領域のＲＴ−ＰＣＲ増幅のために使用した。それぞれＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｈｅＩで消化した後に、増幅したＤＮＡを直接１％アガロースゲルで分離した。ＮｈｅＩ制限部位は、ＳＡＤ Ｕ２．Ｍ，ＤＮＡサイズマーカー由来のＤＮＡにのみ存在する。
【０１２０】
図４：
ＳＡＤ Ｂ１９（Ｂ１９）、ＳＡＤ Ｖ*（Ｖ*）及びＳＡＤ Ｗ９（Ｗ９）ゲノムのＰＣＲ分析。プライマーＧ３Ｐ及びＬ４Ｍを用いる図３に記載の方法で、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。増幅産物を１％アガロースゲルで分離した。
【０１２１】
図５：
組換えＲＶＳによって転写されるＣＡＴ ｍＲＮＡの例示。
【０１２２】
ＳＡＤ Ｌ１６（Ｌ１６）、ＳＡＤ ＸＣＡＴ（Ｘ６）及びＳＡＤ ＶＣＡＴ（ＶＣ１８）に感染した細胞に由来する全ＲＮＡのノーザンブロットを、それぞれＧ遺伝子（Ｇ）、偽遺伝子（Ｙ）及びＣＡＴ遺伝子に特異的なプローブでハイブリダイズした。左側にウイルスゲノム（ｖ）及び特定のｍＲＮＡを示す。ＳＡＤ ＸＣＡＴは、ＣＡＴ及び偽遺伝子配列（“ＣＡＴＹ”）の両方を含むｍＲＮＡを転写するが、ＳＡＤ ＶＣＡＴは偽遺伝子配列が欠失し、ＣＡＴ配列のみを有するｍＲＮＡ（“ＣＡＴ”）を転写する。ＲＮＡマーカーの寸法はｋｂで示す。
【０１２３】
図６：
細胞培養で多数回継代した後のＳＡＤ ＸＣＡＴ及びＳＡＤ ＶＣＡＴのＣＡＴ活性。細胞に特定継代（継代数は記載の通り）のウイルスを感染させ、同量の細胞抽出物の、感染から２日後のＣＡＴ活性を分析した。レーン“−”では、ＳＡＤ Ｌ１６感染細胞由来の抽出物を分析した。
【０１２４】
図７：
組換えＲＶによるＥ０及びＥ２タンパク質の発現。
【０１２５】
細胞にそれぞれＳＡＤ ＶＥ０（単離物１、２、３）及びＳＡＤ ＶＥ２（単離物ａ、ｂ、ｃ）を感染させた。感染から２日後、細胞抽出物を還元条件下にてＰＡＡゲル中で分離し、ニトロセルロース膜に移した。それぞれＣＳＦＶ Ｅ０及びＥ２タンパク質に対するモノクローナル抗体、次いでアルカリ性ホスファターゼに結合した二次抗体と共にインキュベートした後に、基質を添加し、Ｘ線フィルムに暴露してタンパク質を可視化した。対照としては、バキュロウイルスが発現した、Ｅ０及びＥ２精製タンパク質を使用した（Ｂ）。更には、ＣＳＦＣ（Ｖ）感染細胞に由来する抽出物を比較のため使用した。
【０１２６】
図８：
ＳＡＤ ＶＥ０（＃１及び＃２）、ＳＡＤ ＶＥ２（＃６）及び標準狂犬病ウイルスＳＡＤ Ｂ１９（＃３及び＃４）で免疫し、ＣＳＦＶで攻撃したブタの白血球。白血球量は、攻撃（０日）前に存在した絶対数のパーセントで表す。＊（＃１、攻撃から１０日後）：計測せず、推定値である。
【０１２７】
図９：ＣＳＦＶ攻撃（０日）後のブタの体温。
【０１２８】
ａ．ＳＡＤ ＶＥ０で免疫した動物（＃１及び＃２）は、１１日まで微熱を生じた（＃１）か又は発熱しなかった（＃２）。ＳＡＤ Ｂ１９で免疫した対照動物（＃３及び＃４）は共に、長期間にわたり高熱を示した。＃４は重症のため、通常のブタ熱により攻撃から１５日後に死亡し、＃４は攻撃から２１日後に死亡した。
【０１２９】
ｂ．ＳＡＤ ＶＥ２で免疫した動物は、６〜８日のみ微熱を生じた。対照はａ）と同一である。
【０１３０】
図１０：
ＳＡＤ ＤＣＤ感染細胞での端を切り取ったＧタンパク質の発現。
【０１３１】
ＢＳＲ細胞にＳＡＤ ＤＣＤ又はＳＡＤ Ｌ１６をｍ．ｏ．ｉ．１で感染させ、感染から１６時間後に、５０μＣｉの［35Ｓ］メチオニンで３時間標識した。細胞抽出物を抗狂犬病Ｇ ＭＡｂと共にインキュベートし、免疫沈殿試料の分注物をＰＮＧａｓｅＦ（＋ＰＦ）で消化してタンパク質バックボーンを示すか又は偽性処理（−）してグリコシル化タンパク質を示した。＋ＴＭ：標識前９０分間及び３時間の標識期間中に、感染細胞を２μｇ／ｍｌのツニカマイシンの存在下でインキュベートした。タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、オートラジオグラフィーで可視化した。細胞抽出物を前述したように分析した。Ｌ１６：ＳＡＤ Ｌ１６ウイルス、ΔＣＤ：ＳＡＤ ＤＣＤ突然変異体ウイルス、Ｍ：タンパク質サイズマーカー。
【０１３２】
図１１：
細胞培養物でのＳＡＤ Ｌ１６及びＳＡＤ ＤＣＤの伝染。
【０１３３】
培養細胞にそれぞれＳＡＤ Ｌ１６（Ｌ１６）及びＳＡＤ ＤＣＤ（ＤＣＤ）をｍ．ｏ．ｉ．０．０５で感染させ、感染後規定の時間に、狂犬病ウイルスＮタンパク質に対する結合体（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ(R)）による直接免疫蛍光により分析した。ＳＡＤ ＤＣＤ感染細胞の方が隣接細胞への伝染速度が遅いことが観察された。
【０１３４】
図１２：
ＳＡＤ ｄＧ（実施例７）及びＳＡＤ ｄＣＤ（実施例６）に特異的なＲＮＡの分析。
【０１３５】
ＳＡＤ Ｌ１６（実施例１）、ＳＡＤ ｄＣＤ（ΔＣＤ）及び表現型が相補化したＳＡＤ ｄＧウイルス（ΔＧ）をｍ．ｏ．ｉ．１で感染させたＢＳＲ細胞の全ＲＮＡを感染から２日後に単離し、ノーザンハイブリダイゼーションで分析した。Ｎ遺伝子特異的プローブ（Ａ）とのハイブリダイゼーションで示すように、ＳＡＤ ｄＧのゲノムは標準狂犬病ウイルスゲノム（ｖ）よりもかなり小さく、Ｇ遺伝子の２．１ｋｂ欠失を反映している。全Ｇタンパク質コード化配列に及ぶプローブはＳＡＤ ｄＧ ＲＮＡとはハイブリダイズしない。ＳＡＤ ｄＣＤゲノムの細胞質ドメインコード化領域の小さな欠失が、標準狂犬病ウイルスＧ ｍＲＮＡよりも短いＧ ｍＲＮＡ（Ｇ）の出現により実証される。
【０１３６】
ｖ：ゲノムＲＮＡ；Ｎ，Ｇ：モノシストロニックｍＲＮＡ；Ｎ＋Ｐ，Ｍ＋Ｇ，Ｇ＋Ｌ：ビシストロニック（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ｍＲＮＡ。
【０１３７】
図１３：
Ｇ-突然変異体ＳＡＤ ｄＧの非伝染性ＢＳＲ細胞に、表現型が相補化されたＳＡＤ ｄＧを感染させ、トランスフェクションから３６時間後に免疫蛍光顕微鏡検査法により分析した。（Ａ）では、細胞をＮタンパク質に対するＦＩＴＣ結合抗体（Ｃｅｎｔｏｃｏｒｅ）と共にインキュベートして、Ｎタンパク質の発現を示す。単細胞のみが感染し、隣接細胞へのウイルスの伝染は観察されなかった。（Ｂ）：Ｇ特異抗体での対照。
【０１３８】
図１４
ＲＶ（ＨＩＶ）偽型ビリオンの生成に使用する機能的キメラＨＩＶ／ＲＶ糖タンパク質の組成。トランスメンブランドメインのすぐ下流にある３個のアミノ酸を除く全ＨＩＶ−ＮＬ４３ｇｐ１６０細胞質ドメインを、完全ＰＶ−Ｇ細胞質ドメインで置換した。“ｐ”は、親タンパク質に存在しないプロリン残基を示す。細胞質ドメイン配列とトランスメンブランドメイン配列はスラッシュ（／）で離す。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】ＲＶ偽遺伝子（Ψ）の構成及び組換えＲＶゲノムの構築を示す図である。
【図２】全長ＲＶ ｃＤＮＡを含む転写プラスミドの構築概略図である。
【図３】トランスフェクタントウイルスＳＡＤ Ｕ２のゲノム内の遺伝子タグを示す電気泳動の写真である。
【図４】ＳＡＤ Ｂ１９（Ｂ１９）、ＳＡＤ Ｖ＊（Ｖ＊）及びＳＡＤ Ｗ９（Ｗ９）ゲノムのＰＣＲ分析を示す電気泳動の写真である。
【図５】組換えＲＶＳによって転写されるＣＡＴ ｍＲＮＡを例示する電気泳動の写真である。
【図６】細胞培養で多数回継代した後のＳＡＤ ＸＣＡＴ及びＳＡＤ ＶＣＡＴのＣＡＴ活性を示すクロマトグラフの写真である。
【図７】組換えＲＶによるＥ０及びＥ２タンパク質の発現を示す電気泳動の写真である。
【図８】ＳＡＤ ＶＥ０（＃１及び＃２）、ＳＡＤ ＶＥ２（＃６）及び標準狂犬病ウイルスＳＡＤ Ｂ１９（＃３及び＃４）で免疫し、ＣＳＦＶで攻撃したブタの白血球を示す図である。
【図９Ａ】ＣＳＦＶ攻撃（０日）後のブタの体温を示す図である。
【図９Ｂ】ＣＳＦＶ攻撃（０日）後のブタの体温を示す図である。
【図１０】ＳＡＤ ＤＣＤ感染細胞での端を切り取ったＧタンパク質の発現を示す電気泳動の写真である。
【図１１】細胞培養物でのＳＡＤ Ｌ１６及びＳＡＤ ＤＣＤの伝染を示す顕微鏡写真である。
【図１２】ＳＡＤ ｄＧ（実施例７）及びＳＡＤ ｄＣＤ（実施例６）に特異的なＲＮＡの分析を示す電気泳動の写真である。
【図１３】Ｇ−突然変異体ＳＡＤ ｄＧの非伝染性を示す顕微鏡写真である。
【図１４】ＲＶ（ＨＩＶ）偽型ビリオンの生成に使用する機能的キメラＨＩＶ／ＲＶ糖タンパク質の組成を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスゲノムの読み取り枠、偽遺伝子領域又は遺伝子間領域に挿入及び／又は欠失を含む遺伝子操作による伝染性複製非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルス突然変異体。
【請求項２】
ウイルス突然変異体が偽遺伝子領域に挿入及び／又は欠失を含むことを特徴とする請求項１に記載のウイルス突然変異体。
【請求項３】
ウイルス突然変異体が読み取り枠に挿入及び／又は欠失を含むことを特徴とする請求項１に記載のウイルス突然変異体。
【請求項４】
ウイルス突然変異体が基質タンパク質又はその類似体をコードする読み取り枠に挿入及び／又は欠失を含むため、機能的基質タンパク質が不在となり、前記突然変異体の表現型が基質タンパク質で相補化されることを特徴とする請求項３に記載のウイルス突然変異体。
【請求項５】
ウイルス突然変異体が糖タンパク質Ｇをコードする読み取り枠に挿入及び／又は欠失を含むことを特徴とする請求項３に記載のウイルス突然変異体。
【請求項６】
挿入及び／又は欠失により、機能的糖タンパク質Ｇが不在化し、前記突然変異体の表現型が糖タンパク質Ｇ類似体で相補化されることを特徴とする請求項５に記載のウイルス突然変異体。
【請求項７】
糖タンパク質Ｇ類似体が狂犬病糖タンパク質Ｇであることを特徴とする請求項６に記載のウイルス突然変異体。
【請求項８】
病原性ウイルス又は微生物のエピトープ又はポリペプチドをコードする異種核酸配列を保有することを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載のウイルス突然変異体。
【請求項９】
ウイルス突然変異体がパラミクソウイルスファミリーに属することを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載のウイルス突然変異体。
【請求項１０】
ウイルス突然変異体がラブドウイルスファミリーに属することを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載のウイルス突然変異体。
【請求項１１】
ウイルス突然変異体が狂犬病ウイルスであることを特徴とする請求項１０に記載のウイルス突然変異体。
【請求項１２】
ワクチンが請求項１から１１のいずれか一項に記載のウイルス突然変異体と医薬的に許容可能なキャリアー又は希釈剤とを含んでなることを特徴とする、哺乳動物の非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスによって引き起こされる感染を予防するためのワクチン。
【請求項１３】
ａ）ＲＮＡポリメラーゼを発現する宿主細胞内に、
１）ウイルスのＮ、Ｐ及びＬタンパク質又はその類似体をコードする１個以上のＤＮＡ分子と、
２）非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡを含むＤＮＡ分子
とを導入し、
ｂ）前記細胞によって産生されるウイルスを単離する
段階からなる伝染性複製非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスの製造方法。
【請求項１４】
非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡが突然変異の取り込みによって改変されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスｃＤＮＡゲノムの転写体が陽性鎖抗ゲノムＲＮＡであることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＲＮＡポリメラーゼが、好ましくは組換えワクシニアウイルスから発現されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスゲノムがパラミクソウイルスファミリーから得られることを特徴とする請求項１３から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスゲノムがラブドウイルスファミリーから得られることを特徴とする請求項１３から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスゲノムが狂犬病ウイルスから得られることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスゲノムの読み取り枠、偽遺伝子領域又は遺伝子間領域に挿入及び／又は欠失を含む遺伝子操作による狂犬病ウイルス以外の伝染性複製非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルス突然変異体。
【請求項２】
ウイルス突然変異体が偽遺伝子領域に挿入及び／又は欠失を含むことを特徴とする請求項１に記載のウイルス突然変異体。
【請求項３】
ウイルス突然変異体が読み取り枠に挿入及び／又は欠失を含むことを特徴とする請求項１に記載のウイルス突然変異体。
【請求項４】
ウイルス突然変異体が基質タンパク質をコードする読み取り枠に挿入及び／又は欠失を含むため、機能的基質タンパク質が不在となり、前記突然変異体の表現型が基質タンパク質で相補化されることを特徴とする請求項３に記載のウイルス突然変異体。
【請求項５】
ウイルス突然変異体が糖タンパク質Ｇをコードする読み取り枠に挿入及び／又は欠失を含むことを特徴とする請求項３に記載のウイルス突然変異体。
【請求項６】
挿入及び／又は欠失により、機能的糖タンパク質Ｇが不在化し、前記突然変異体の表現型が相補性糖タンパク質Ｇで相補化されることを特徴とする請求項５に記載のウイルス突然変異体。
【請求項７】
相補性糖タンパク質Ｇが狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇであることを特徴とする請求項６に記載のウイルス突然変異体。
【請求項８】
病原性ウイルス又は微生物のエピトープ又はポリペプチドをコードする異種核酸配列を保有することを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載のウイルス突然変異体。
【請求項９】
パラミクソウイルスファミリーに属することを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載のウイルス突然変異体。
【請求項１０】
ラブドウイルスファミリーに属することを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載のウイルス突然変異体。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のウイルス突然変異体と医薬的に許容可能なキャリアー又は希釈剤とを含むワクチン。
【請求項１２】
ａ）ＲＮＡポリメラーゼを発現する宿主細胞内に、
１）ウイルスのＮ、Ｐ及びＬタンパク質をコードする１個以上のＤＮＡ分子と、
２）非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡを含むＤＮＡ分子
とを導入し、
ｂ）前記細胞によって産生されるウイルスを単離する
段階からなる狂犬病ウイルス以外の伝染性複製非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスの製造方法。
【請求項１３】
非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡが突然変異の取り込みによって改変されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスｃＤＮＡゲノムの転写体が陽性鎖抗ゲノムＲＮＡであることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが組換えワクシニアウイルスから発現されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスゲノムがパラミクソウイルスファミリーから得られることを特徴とする請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスゲノムがラブドウイルスファミリーから得られることを特徴とする請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
ウイルスゲノムの読み取り枠、偽遺伝子領域又は遺伝子間領域に挿入及び／又は欠失を含む遺伝子操作による伝染性複製非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルス突然変異体。
【請求項２】
ウイルス突然変異体が偽遺伝子領域に挿入及び／又は欠失を含むことを特徴とする請求項１に記載のウイルス突然変異体。
【請求項３】
ウイルス突然変異体が読み取り枠に挿入及び／又は欠失を含むことを特徴とする請求項１に記載のウイルス突然変異体。
【請求項４】
ウイルス突然変異体が基質タンパク質又はその類似体をコードする読み取り枠に挿入及び／又は欠失を含むため、機能的基質タンパク質が不在となり、前記突然変異体の表現型が基質タンパク質で相補化されることを特徴とする請求項３に記載のウイルス突然変異体。
【請求項５】
ウイルス突然変異体が糖タンパク質Ｇをコードする読み取り枠に挿入及び／又は欠失を含むことを特徴とする請求項３に記載のウイルス突然変異体。
【請求項６】
挿入及び／又は欠失により、機能的糖タンパク質Ｇが不在化し、前記突然変異体の表現型が糖タンパク質Ｇ類似体で相補化されることを特徴とする請求項５に記載のウイルス突然変異体。
【請求項７】
糖タンパク質Ｇ類似体が狂犬病糖タンパク質Ｇであることを特徴とする請求項６に記載のウイルス突然変異体。
【請求項８】
病原性ウイルス又は微生物のエピトープ又はポリペプチドをコードする異種核酸配列を保有することを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載のウイルス突然変異体。
【請求項９】
ウイルス突然変異体がパラミクソウイルスファミリーに属することを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載のウイルス突然変異体。
【請求項１０】
ウイルス突然変異体がラブドウイルスファミリーに属することを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載のウイルス突然変異体。
【請求項１１】
ウイルス突然変異体が狂犬病ウイルスであることを特徴とする請求項１０に記載のウイルス突然変異体。
【請求項１２】
ワクチンが請求項１から１１のいずれか一項に記載のウイルス突然変異体と医薬的に許容可能なキャリアー又は希釈剤とを含んでなることを特徴とする、哺乳動物の非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスによって引き起こされる感染を予防するためのワクチン。
【請求項１３】
ａ）ＲＮＡポリメラーゼを発現する宿主細胞内に、
１）ウイルスのＮ、Ｐ及びＬタンパク質又はその類似体をコードする１個以上のＤＮＡ分子と、
２）非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡを含むＤＮＡ分子
とを導入し、
ｂ）前記細胞によって産生されるウイルスを単離する
段階からなる伝染性複製非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスの製造方法。
【請求項１４】
非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡが突然変異の取り込みによって改変されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスｃＤＮＡゲノムの転写体が陽性鎖抗ゲノムＲＮＡであることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＲＮＡポリメラーゼが、好ましくは組換えワクシニアウイルスから発現されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスゲノムがパラミクソウイルスファミリーから得られることを特徴とする請求項１３から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスゲノムがラブドウイルスファミリーから得られることを特徴とする請求項１３から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスゲノムが狂犬病ウイルスから得られることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスゲノムの読み取り枠、偽遺伝子領域又は遺伝子間領域に挿入及び／又は欠失を含む遺伝子操作による狂犬病ウイルス以外の伝染性複製非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルス突然変異体。
【請求項２】
ウイルス突然変異体が偽遺伝子領域に挿入及び／又は欠失を含むことを特徴とする請求項１に記載のウイルス突然変異体。
【請求項３】
ウイルス突然変異体が読み取り枠に挿入及び／又は欠失を含むことを特徴とする請求項１に記載のウイルス突然変異体。
【請求項４】
ウイルス突然変異体が基質タンパク質をコードする読み取り枠に挿入及び／又は欠失を含むため、機能的基質タンパク質が不在となり、前記突然変異体の表現型が基質タンパク質で相補化されることを特徴とする請求項３に記載のウイルス突然変異体。
【請求項５】
ウイルス突然変異体が糖タンパク質Ｇをコードする読み取り枠に挿入及び／又は欠失を含むことを特徴とする請求項３に記載のウイルス突然変異体。
【請求項６】
挿入及び／又は欠失により、機能的糖タンパク質Ｇが不在化し、前記突然変異体の表現型が相補性糖タンパク質Ｇで相補化されることを特徴とする請求項５に記載のウイルス突然変異体。
【請求項７】
相補性糖タンパク質Ｇが狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇであることを特徴とする請求項６に記載のウイルス突然変異体。
【請求項８】
病原性ウイルス又は微生物のエピトープ又はポリペプチドをコードする異種核酸配列を保有することを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載のウイルス突然変異体。
【請求項９】
パラミクソウイルスファミリーに属することを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載のウイルス突然変異体。
【請求項１０】
ラブドウイルスファミリーに属することを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載のウイルス突然変異体。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のウイルス突然変異体と医薬的に許容可能なキャリアー又は希釈剤とを含むワクチン。
【請求項１２】
ａ）ＲＮＡポリメラーゼを発現する宿主細胞内に、
１）ウイルスのＮ、Ｐ及びＬタンパク質をコードする１個以上のＤＮＡ分子と、
２）非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡを含むＤＮＡ分子
とを導入し、
ｂ）前記細胞によって産生されるウイルスを単離する
段階からなる狂犬病ウイルス以外の伝染性複製非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスの製造方法。
【請求項１３】
非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡが突然変異の取り込みによって改変されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスｃＤＮＡゲノムの転写体が陽性鎖抗ゲノムＲＮＡであることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが組換えワクシニアウイルスから発現されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスゲノムがパラミクソウイルスファミリーから得られることを特徴とする請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
非セグメント化陰性鎖ＲＮＡウイルスゲノムがラブドウイルスファミリーから得られることを特徴とする請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２００６−１３６３４０（Ｐ２００６−１３６３４０Ａ）
【公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３１３６４（Ｐ２００６−３１３６４）
【出願日】平成１８年２月８日（２００６．２．８）
【分割の表示】特願平７−１８１９８４の分割
【原出願日】平成７年７月１８日（１９９５．７．１８）
【出願人】（５００２１５１１５）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月８日（２００６．２．８）
【分割の表示】特願平７−１８１９８４の分割
【原出願日】平成７年７月１８日（１９９５．７．１８）
【出願人】（５００２１５１１５）
【Ｆターム（参考）】
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