組換え分子の発現に有用なＲＮＡ結合タンパク質及び結合部位
【課題】真核細胞及び原核細胞、好ましくは植物細胞及び無傷の植物における高効率遺伝子発現システムを提供することを本発明の課題とする。
【解決手段】上記課題は、a)発現される所望のコード配列を挿入するためのエンドヌクレアーゼ制限部位の上流のRB47結合部位ヌクレオチド配列；及び、b)RB47結合部位と結合するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；を含むことを特徴とする、所望の分子を発現するための発現カセットを提供することによって解決された。
【解決手段】上記課題は、a)発現される所望のコード配列を挿入するためのエンドヌクレアーゼ制限部位の上流のRB47結合部位ヌクレオチド配列；及び、b)RB47結合部位と結合するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；を含むことを特徴とする、所望の分子を発現するための発現カセットを提供することによって解決された。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【化１】
【背景技術】
【０００２】
【化２】
【０００３】
【化３】
【０００４】
【化４】
【０００５】
【化５】
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第5,234,834号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下を提供する。
【化６】
【０００８】
【化７】
【０００９】
【化８】
【００１０】
【化９】
【００１１】
【化１０】
【００１２】
【化１１】
【００１３】
【化１２】
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｄは、残基１−６２３までのＲＢ４７の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２７３２の対応するＲＢ４７配列をコードしている核酸配列と共に示されている。塩基１９７−２０６５のヌクレオチドコード領域は、前駆体型を示している。成熟型は、ヌクレオチド１９７−１４０２である。更に塩基１−１９６のｍＲＮＡリーダー配列、及び塩基２０６６−２７３２のｍＲＮＡのポリＡ尾部も示されている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：５に示されている。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｄは、残基１−６２３までのＲＢ４７の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２７３２の対応するＲＢ４７配列をコードしている核酸配列と共に示されている。塩基１９７−２０６５のヌクレオチドコード領域は、前駆体型を示している。成熟型は、ヌクレオチド１９７−１４０２である。更に塩基１−１９６のｍＲＮＡリーダー配列、及び塩基２０６６−２７３２のｍＲＮＡのポリＡ尾部も示されている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：５に示されている。
【図１Ｃ】図１Ａ−１Ｄは、残基１−６２３までのＲＢ４７の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２７３２の対応するＲＢ４７配列をコードしている核酸配列と共に示されている。塩基１９７−２０６５のヌクレオチドコード領域は、前駆体型を示している。成熟型は、ヌクレオチド１９７−１４０２である。更に塩基１−１９６のｍＲＮＡリーダー配列、及び塩基２０６６−２７３２のｍＲＮＡのポリＡ尾部も示されている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：５に示されている。
【図１Ｄ】図１Ａ−１Ｄは、残基１−６２３までのＲＢ４７の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２７３２の対応するＲＢ４７配列をコードしている核酸配列と共に示されている。塩基１９７−２０６５のヌクレオチドコード領域は、前駆体型を示している。成熟型は、ヌクレオチド１９７−１４０２である。更に塩基１−１９６のｍＲＮＡリーダー配列、及び塩基２０６６−２７３２のｍＲＮＡのポリＡ尾部も示されている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：５に示されている。
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｂは、残基１−４８８までのＲＢ６０の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２４１３までの対応する核酸配列と共に示され、この塩基１６−１６１４は、ＲＢ６０配列をコードしている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１０に示されている。
【図２Ｂ】図２Ａ−２Ｂは、残基１−４８８までのＲＢ６０の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２４１３までの対応する核酸配列と共に示され、この塩基１６−１６１４は、ＲＢ６０配列をコードしている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１０に示されている。
【図３Ａ】図３Ａ−３Ｃは、実施例３においてより詳細に説明されている、ｐｓｂＡ ｍＲＮＡの完全な配列を示し、コードされたｐｓｂＡタンパク質のアミノ酸残基配列（残基１−３５２）及び核酸配列の両方を示している。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１３に示されている。
【図３Ｂ】図３Ａ−３Ｃは、実施例３においてより詳細に説明されている、ｐｓｂＡ ｍＲＮＡの完全な配列を示し、コードされたｐｓｂＡタンパク質のアミノ酸残基配列（残基１−３５２）及び核酸配列の両方を示している。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１３に示されている。
【図３Ｃ】図３Ａ−３Ｃは、実施例３においてより詳細に説明されている、ｐｓｂＡ ｍＲＮＡの完全な配列を示し、コードされたｐｓｂＡタンパク質のアミノ酸残基配列（残基１−３５２）及び核酸配列の両方を示している。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１３に示されている。
【図４】図４は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含むＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、異種又はヘテロのコード領域の挿入のための領域、ＲＢ４７コード領域、ＲＢ６０コード領域、並びに転写終結点（ＴＳ）を含み複製起点及び選択マーカーが隣接している３’側フランキング領域を含む、発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、実施例４Ａに更に説明されている。
【図５Ａ】図５Ａ−５Ｂは、ヒスチジンタグをつけたＲＢ４７分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示していて、これは配列番号：１４としても示されている。
【図５Ｂ】図５Ａ−５Ｂは、ヒスチジンタグをつけたＲＢ４７分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示していて、これは配列番号：１４としても示されている。
【図６】図６は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含んでいるＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、異種又はヘテロのコード領域の挿入領域、ＲＢ４７コード領域、及び転写終結点（ＴＳ）を含んでいる３’側フランキング領域を含んでいる発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、かつ実施例４Ｅに更に説明されている。
【図７】図７は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含んでいるＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、異種又はヘテロのコード領域の挿入領域、及び転写終結点（ＴＳ）を含んでいる３’側フランキング領域を含んでいる発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、かつ実施例４Ｇに更に説明されている。
【図８】図８は、実施例４Ｇ１）において更に説明されている本発明の構築物によって発現された破傷風菌毒素の１本鎖抗体のウェスタンブロットである。
【図９】図９は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含んでいるＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、翻訳終止コドンＴＡＡを含んでいる細菌のルシフェラーゼＡ及びＢタンパク質のコード配列の挿入のための領域を含んでいる発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、かつ実施例４Ｇ２）に更に説明されている。
【図１０】図１０は、葉緑体中で発現された細菌性ルシフェラーゼタンパク質の蓄積を示しており、実施例４Ｇ２）に更に説明されている。
【図１１】図１１は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含んでいるＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、二量体ＩｇＡ（ｄＩｇＡ）の異種又はヘテロのコード領域の挿入領域、及び転写終結点（ＴＳ）を含んでいる３’側フランキング領域を含んでいる発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、かつ実施例４Ｇ３）に更に説明されている。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
【化１３】
【化１４】
【００１６】
【化１５】
【００１７】
【化１６】
【００１８】
【化１７】
【００１９】
【化１８】
【００２０】
【化１９】
【００２１】
【化２０】
【００２２】
【化２１】
【００２３】
【化２２】
【００２４】
【化２３】
【００２５】
【化２４】
【００２６】
【化２５】
【００２７】
【化２６】
【００２８】
【化２７】
【００２９】
【化２８】
【００３０】
【化２９】
【００３１】
【化３０】
【００３２】
【化３１】
【００３３】
【化３２】
【００３４】
【化３３】
【００３５】
【化３４】
【００３６】
【化３５】
【００３７】
【化３６】
【００３８】
【化３７】
【００３９】
【化３８】
【００４０】
【化３９】
【００４１】
【化４０】
【００４２】
【化４１】
【００４３】
【化４２】
【００４４】
【化４３】
【００４５】
【化４４】
【００４６】
【化４５】
【００４７】
【化４６】
【００４８】
【化４７】
【００４９】
【化４８】
【００５０】
【化４９】
【００５１】
【化５０】
【実施例】
【００５２】
【化５１】
【００５３】
【化５２】
【００５４】
【化５３】
【００５５】
【化５４】
【００５６】
【化５５】
【００５７】
【化５６】
【００５８】
【化５７】
【００５９】
【化５８】
【００６０】
【化５９】
【００６１】
【化６０】
【００６２】
【化６１】
【００６３】
【化６２】
【００６４】
【化６３】
【００６５】
【化６４】
【００６６】
【化６５】
【００６７】
【化６６】
【００６８】
【化６７】
【技術分野】
【０００１】
【化１】
【背景技術】
【０００２】
【化２】
【０００３】
【化３】
【０００４】
【化４】
【０００５】
【化５】
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第5,234,834号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下を提供する。
【化６】
【０００８】
【化７】
【０００９】
【化８】
【００１０】
【化９】
【００１１】
【化１０】
【００１２】
【化１１】
【００１３】
【化１２】
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｄは、残基１−６２３までのＲＢ４７の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２７３２の対応するＲＢ４７配列をコードしている核酸配列と共に示されている。塩基１９７−２０６５のヌクレオチドコード領域は、前駆体型を示している。成熟型は、ヌクレオチド１９７−１４０２である。更に塩基１−１９６のｍＲＮＡリーダー配列、及び塩基２０６６−２７３２のｍＲＮＡのポリＡ尾部も示されている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：５に示されている。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｄは、残基１−６２３までのＲＢ４７の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２７３２の対応するＲＢ４７配列をコードしている核酸配列と共に示されている。塩基１９７−２０６５のヌクレオチドコード領域は、前駆体型を示している。成熟型は、ヌクレオチド１９７−１４０２である。更に塩基１−１９６のｍＲＮＡリーダー配列、及び塩基２０６６−２７３２のｍＲＮＡのポリＡ尾部も示されている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：５に示されている。
【図１Ｃ】図１Ａ−１Ｄは、残基１−６２３までのＲＢ４７の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２７３２の対応するＲＢ４７配列をコードしている核酸配列と共に示されている。塩基１９７−２０６５のヌクレオチドコード領域は、前駆体型を示している。成熟型は、ヌクレオチド１９７−１４０２である。更に塩基１−１９６のｍＲＮＡリーダー配列、及び塩基２０６６−２７３２のｍＲＮＡのポリＡ尾部も示されている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：５に示されている。
【図１Ｄ】図１Ａ−１Ｄは、残基１−６２３までのＲＢ４７の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２７３２の対応するＲＢ４７配列をコードしている核酸配列と共に示されている。塩基１９７−２０６５のヌクレオチドコード領域は、前駆体型を示している。成熟型は、ヌクレオチド１９７−１４０２である。更に塩基１−１９６のｍＲＮＡリーダー配列、及び塩基２０６６−２７３２のｍＲＮＡのポリＡ尾部も示されている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：５に示されている。
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｂは、残基１−４８８までのＲＢ６０の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２４１３までの対応する核酸配列と共に示され、この塩基１６−１６１４は、ＲＢ６０配列をコードしている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１０に示されている。
【図２Ｂ】図２Ａ−２Ｂは、残基１−４８８までのＲＢ６０の完全なタンパク質のアミノ酸残基配列が、塩基１−２４１３までの対応する核酸配列と共に示され、この塩基１６−１６１４は、ＲＢ６０配列をコードしている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１０に示されている。
【図３Ａ】図３Ａ−３Ｃは、実施例３においてより詳細に説明されている、ｐｓｂＡ ｍＲＮＡの完全な配列を示し、コードされたｐｓｂＡタンパク質のアミノ酸残基配列（残基１−３５２）及び核酸配列の両方を示している。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１３に示されている。
【図３Ｂ】図３Ａ−３Ｃは、実施例３においてより詳細に説明されている、ｐｓｂＡ ｍＲＮＡの完全な配列を示し、コードされたｐｓｂＡタンパク質のアミノ酸残基配列（残基１−３５２）及び核酸配列の両方を示している。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１３に示されている。
【図３Ｃ】図３Ａ−３Ｃは、実施例３においてより詳細に説明されている、ｐｓｂＡ ｍＲＮＡの完全な配列を示し、コードされたｐｓｂＡタンパク質のアミノ酸残基配列（残基１−３５２）及び核酸配列の両方を示している。ヌクレオチド及びアミノ酸配列は両方共、配列番号：１３に示されている。
【図４】図４は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含むＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、異種又はヘテロのコード領域の挿入のための領域、ＲＢ４７コード領域、ＲＢ６０コード領域、並びに転写終結点（ＴＳ）を含み複製起点及び選択マーカーが隣接している３’側フランキング領域を含む、発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、実施例４Ａに更に説明されている。
【図５Ａ】図５Ａ−５Ｂは、ヒスチジンタグをつけたＲＢ４７分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示していて、これは配列番号：１４としても示されている。
【図５Ｂ】図５Ａ−５Ｂは、ヒスチジンタグをつけたＲＢ４７分子のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示していて、これは配列番号：１４としても示されている。
【図６】図６は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含んでいるＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、異種又はヘテロのコード領域の挿入領域、ＲＢ４７コード領域、及び転写終結点（ＴＳ）を含んでいる３’側フランキング領域を含んでいる発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、かつ実施例４Ｅに更に説明されている。
【図７】図７は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含んでいるＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、異種又はヘテロのコード領域の挿入領域、及び転写終結点（ＴＳ）を含んでいる３’側フランキング領域を含んでいる発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、かつ実施例４Ｇに更に説明されている。
【図８】図８は、実施例４Ｇ１）において更に説明されている本発明の構築物によって発現された破傷風菌毒素の１本鎖抗体のウェスタンブロットである。
【図９】図９は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含んでいるＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、翻訳終止コドンＴＡＡを含んでいる細菌のルシフェラーゼＡ及びＢタンパク質のコード配列の挿入のための領域を含んでいる発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、かつ実施例４Ｇ２）に更に説明されている。
【図１０】図１０は、葉緑体中で発現された細菌性ルシフェラーゼタンパク質の蓄積を示しており、実施例４Ｇ２）に更に説明されている。
【図１１】図１１は、５’側から３’側へのひとつの転写ユニット上に、更に転写開始点（ＴＳ）を含んでいるＣ．レインハルディチのＤ１タンパク質をコードしているｐｓｂＡ遺伝子由来のプロモーター領域、ＲＢ４７結合部位、二量体ＩｇＡ（ｄＩｇＡ）の異種又はヘテロのコード領域の挿入領域、及び転写終結点（ＴＳ）を含んでいる３’側フランキング領域を含んでいる発現カセットの概略図である。独立した遺伝要素の挿入を促進するためのエンドヌクレアーゼ制限部位が示され、かつ実施例４Ｇ３）に更に説明されている。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
【化１３】
【化１４】
【００１６】
【化１５】
【００１７】
【化１６】
【００１８】
【化１７】
【００１９】
【化１８】
【００２０】
【化１９】
【００２１】
【化２０】
【００２２】
【化２１】
【００２３】
【化２２】
【００２４】
【化２３】
【００２５】
【化２４】
【００２６】
【化２５】
【００２７】
【化２６】
【００２８】
【化２７】
【００２９】
【化２８】
【００３０】
【化２９】
【００３１】
【化３０】
【００３２】
【化３１】
【００３３】
【化３２】
【００３４】
【化３３】
【００３５】
【化３４】
【００３６】
【化３５】
【００３７】
【化３６】
【００３８】
【化３７】
【００３９】
【化３８】
【００４０】
【化３９】
【００４１】
【化４０】
【００４２】
【化４１】
【００４３】
【化４２】
【００４４】
【化４３】
【００４５】
【化４４】
【００４６】
【化４５】
【００４７】
【化４６】
【００４８】
【化４７】
【００４９】
【化４８】
【００５０】
【化４９】
【００５１】
【化５０】
【実施例】
【００５２】
【化５１】
【００５３】
【化５２】
【００５４】
【化５３】
【００５５】
【化５４】
【００５６】
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【化５７】
【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
【化６１】
【００６３】
【化６２】
【００６４】
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【００６５】
【化６４】
【００６６】
【化６５】
【００６７】
【化６６】
【００６８】
【化６７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載される発現カセット。
【請求項１】
本明細書中に記載される発現カセット。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００９−１８３３０４（Ｐ２００９−１８３３０４Ａ）
【公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１２２５５３（Ｐ２００９−１２２５５３）
【出願日】平成２１年５月２０日（２００９．５．２０）
【分割の表示】特願平１０−５３４５５３の分割
【原出願日】平成１０年１月１６日（１９９８．１．１６）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ スクリップス リサーチ インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月２０日（２００９．５．２０）
【分割の表示】特願平１０−５３４５５３の分割
【原出願日】平成１０年１月１６日（１９９８．１．１６）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ スクリップス リサーチ インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】
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