組換え弱毒化パルボウイルス
本発明は、パルボウイルスによる感染に対して動物を防御するためのウイルスワクチン、その製造および用途の分野におけるものである。更に特に、本発明は、別のパルボウイルスから誘導可能なカプシドタンパク質またはその断片を含む弱毒化パルボウイルスを含むワクチンに関する。驚くべきことに、そのようなワクチンは、第１のタイプのパルボウイルスに対する良好な免疫を維持しうる一方で、第２のタイプのパルボウイルス株でのチャレンジに対する防御抗体の、より高い力価を誘導しうることが判明した。また、組換えウイルス株は弱毒化されたままであった。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パルボウイルスによる感染に対して動物を防御するためのウイルスワクチン、その製造および用途の分野におけるものである。更に特に、本発明は、新規パルボウイルス分離体から誘導可能なカプシドタンパク質またはその断片を含む弱毒化パルボウイルスを含むワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
パルボウイルスは一本鎖ＤＮＡウイルスの科に属する。パルボウイルスはネコ、イヌおよびブタのような幾つかの動物において疾患を引き起こしうる。該ウイルスは、複製するためには、活発に分裂している細胞を必要とするため、感染する組織型は動物の年齢によって様々である。胃腸管およびリンパ系はいずれの年齢でも冒される可能性があり、それにより嘔吐、下痢および免疫抑制が生じうるが、子宮内または２週齢未満で感染したネコでは小脳発育不全が見られるに過ぎず、３〜８週齢で感染した子イヌでは心筋の疾患が見られる。
【０００３】
イヌパルボウイルスは、若いイヌでは特に致命的な疾患であり、約８０％の致死性を示し、非常に若い子イヌにおいては胃腸管損傷および脱水ならびに心臓症候群を引き起こす。それは、感染したイヌの糞との接触により広がる。症状は嗜眠、重度の下痢、発熱、嘔吐、食欲不振および脱水を含む。ブタパルボウイルスは、死産、ミイラ化、胚死および不妊を表すＳＭＥＤＩとしての公知の、ブタにおける生殖疾患を引き起こす。ネコ汎白血球減少症は子ネコで一般的であり、発熱、低白血球数、下痢および死を引き起こす。ネコ胎児および２週齢未満の子ネコへの感染は小脳発育不全を引き起こす。ミンク腸炎ウイルスは、それが小脳発育不全を引き起こさないこと以外はネコ汎白血球減少症と実質的に類似している。別のパルボウイルスは、リンパ節障害、脾腫、糸球体腎炎、貧血および死亡により特徴づけられる、ミンクおよび他のイタチ科動物におけるアリューシャン病を引き起こす。パルボウイルスの最も正確な診断はＥＬＩＳＡによるものである。イヌ、ネコおよびブタはパルボウイルスに対してワクチン接種されうる。
【０００４】
ＤＮＡレベルでは、イヌ、ネコおよびブタパルボウイルスは高度に相同なゲノムを有することが公知である。イヌパルボウイルス（ＣＰＶ２）は、イヌにおける急性で時には致死性の腸炎を引き起こすウイルスである（Ｋｅｌｌｙ，Ａｕｓｔ．Ｖｅｔ．Ｊ．５４；５９３，１９７８；Ａｐｐｅｌら，Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１０５；１５６−１５９，１９７９）。該ウイルスは１９７７年頃に最初に出現し、おそらく、ネコにおける非常に密接に関連したウイルスであるネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＬＶ）から、単一カプシドタンパク質における少数の突然変異［ミンクまたはアライグマのような他の肉食動物における中間的移行を含んでいた可能性のある種間跳躍（ｓｐｅｃｉｅｓ ｊｕｍｐ）］により生じたのであろう（Ｔｒｕｙｅｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１５，１８６−１８９，１９９６）。
【０００５】
早くも１９７９年に、ＣＰＶ２ａと称される、ＣＰＶ２の最初の変異体が出現し、その後まもなく、１９８４年にＣＰＶ２ｂが出現した（Ｐａｒｒｉｓｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，１０４６−１０４８，１９８５およびＪ．Ｖｉｒｏｌ．６５；６５４４−６５５２，１９９１）。
【０００６】
その元の２型ウイルスは現在では野外から消え、該２ａおよび２ｂ変異体がそれに取って代わっており、これらの２つの型の相対比率は国によって様々である（Ｔｒｕｙｅｎら，前掲；Ｃｈｉｎｃｈｋａｒら，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１５１，１８８１−１８８７，２００６；Ｐｅｒｅｉｒａら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｖｏｌ．３，３９９−４０９，２００７）。２から２ａおよび２ｂへの変化を特徴づける、カプシドタンパク質（ＶＰ２）におけるアミノ酸変化は非常に限定的である。８７位（ＭｅｔからＬｅｕへ）、３００位（ＧｌｙからＡｌａへ）、３０５位（ＴｙｒからＡｓｐへ）および５５５位（ＶａｌからＩｌｅへ）の置換は２から２ａへの進化において生じ、４２６位（ＡｓｎからＡｓｐへ）および５５５位（ＩｌｅからＶａｌへ）の置換は２ａから２ｂへの出現において生じた（Ｐａｒｒｉｓｈら，前掲；Ｔｒｕｙｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９，４７０２−４７１０，１９９５）。最近、５５５位のＶａｌからＩｌｅへの置換を欠く２ａ株が報告された（Ｗａｎｇら，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ３１，１７１−１７４，２００５；Ｍａｒｔｅｌｌａら，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ３３，１１−１３，２００６）。単一アミノ酸変化がＣＰＶ２ａとＣＰＶ２ｂとのＶＰ２配列を区別しうるらしい。
【０００７】
より最近になって、４２６位のアミノ酸（２ａではＡｓｎ、そして２ｂではＡｓｐ）がグルタミン酸（Ｇｌｕ）残基になった株がイタリアにおいて出現した（Ｂｕｏｎａｖｏｇｌｉａら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２，３０２１−３０２５，２００１；Ｍａｒｔｅｌｌａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２，１３３３−１３３６，２００４）。ＣＰＶ２ｃウイルスと称されるこれらのＧｌｕ ４２６変異体がイタリアおよび他の欧州諸国において広がりつつあり、他のＣＰＶ型と共存しており（Ｄｅｃａｒｏら，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｂ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｖｅｔ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ５３，４６８−４７２，２００６）、ベトナムおよびスコットランドのような地理的に様々な国々でも分離されている（Ｎａｋａｍｕｒａら，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．１４９，２２６１−２２６９，２００４，Ｓｐｉｂｅｙら，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １２８，４８−５５，２００８）ことは、それらがイヌ集団の少なくとも一部における利点を有することを示唆している。
【０００８】
イヌパルボウイルスの相対的に急速な進化はネコ宿主域の喪失およびそれに続く再獲得をもたらしており（Ｔｒｕｙｅｎら，１９９６ 前掲）、この再獲得された、ネコにおいて複製する能力は、元の２型が２ａ、２ｂおよび２ｃ変異体によって取って代えられたこと説明しうる。１９７０年代後半および１９８０年代初期に、生および不活化ＦＰＬワクチンの両方が、交差防御を刺激する共有抗原により、ＣＰＶ疾患からイヌを防御するために使用されたが、それらがもたらした防御レベルは低く、免疫持続期間は短かった。これらのワクチンは生弱毒化ＣＰＶワクチンによって取って代えられており、これは優れた防御およびより長い免疫持続期間をもたらした。現在、該生弱毒化ワクチンはＣＰＶ２ｂ分離体または元の２型ウイルスから誘導されている。該２型ウイルスは野外では２ａ、２ｂおよび現在は２ｃウイルスによって完全に取って代えられているため、弱毒化２型ワクチンによりもたらされる防御レベルに関する懸念が存在する（Ｐｒａｔｅｌｌｉら，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８，６１２−６１５，２００１；Ｔｒｕｙｅｎ，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９，４７−５０，１９９９）。
【０００９】
しかし、利用可能なモノクローナル抗体での研究に基づけば、それぞれの新たな抗原変異体は、以前の変異体と比較して少なくとも１つの中和エピトープを喪失している（Ｓｔｒａｓｓｈｅｉｍら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８，１７５−１８４，１９９４；Ｐｅｒｅｉｒａら，前掲）。種々の抗原型に対して産生された血清を使用してインビトロで行われた交差中和研究が顕著な相違を示している場合であっても（Ｐｒａｔｅｌｌｉら，前掲）、生弱毒化ＣＰＶ２ワクチンは２ａおよび２ｂ野外チャレンジに対してイヌを防御しうることがこれまでに示されている（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄら，Ｖｅｔ．Ｒｅｃｏｒｄ．１３６，６３−６７，１９９５）。
【００１０】
最近、生弱毒化２型ワクチン（Ｎｏｂｉｖａｃ−Ｉｎｔｅｒｖｅｔ）が、最も最近のＣＰＶ変異体であるＣＰＶ２ｃでのチャレンジからイヌを防御しうることが示された（Ｓｐｉｂｅｙら，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １２８，４８−５５，２００８）。
【００１１】
それでもなお、パルボウイルスの新型の感染に対する動物、特にネコ、イヌおよびブタの免疫を改善するワクチンが当分野において必要とされている。しかし、そのようなワクチンは存在せず、特に、イヌパルボウイルス２ｃ型に特異的なワクチンは存在しない。
【発明の概要】
【００１２】
発明の概括
本発明は前記問題の解決法を提供するものであり、弱毒化第１パルボウイルスから入手可能なＤＮＡ配列を含む組換えパルボウイルスと医薬上許容される担体とを含むワクチンを提供し、ここで、該第１パルボウイルスのカプシドタンパク質またはその断片をコードするＤＮＡが、第２パルボウイルス、例えばイヌパルボウイルス、より詳細には２ｃ型パルボウイルスから誘導可能なカプシドタンパク質またはその断片により置換されている。
【００１３】
驚くべきことに、そのようなワクチンは、該第２イヌパルボウイルスでのチャレンジに対する防御抗体の、より高い力価を誘導しうる一方で、２型株に対する良好な免疫を維持することが可能であり、一方、該組換えイヌパルボウイルスは弱毒化されたままであることが見出された。
【００１４】
発明の詳細な説明
第２イヌパルボウイルスのカプシドタンパク質をコードするウイルスＤＮＡは、当業者の通常の技術を用いることにより、野外で分離された株から得られうる。実施例の節においては、それは、２型分離体を使用することにより例示されている。弱毒化イヌパルボウイルスからのウイルスＤＮＡも当技術分野で利用可能であり、該実施例は、Ｉｎｔｅｒｖｅｔから得られるワクチン株（Ｎｏｂｉｖａｃ ｐａｒｖｏ）に含有されている元の２型ウイルスの分離を示している。
【００１５】
より詳細には、ＣＰＶ ２ｃ型野外分離体からウイルスＤＮＡを得た。２つの重複断片が各調製物から得られるように、各ＤＮＡ調製物を異なる制限酵素で消化した。断片を精製し、分離した。ついで、選択された断片を感受性細胞内にトランスフェクトした。これを図１に図示する。
【００１６】
それらの２つの断片の自然組換えの後、通常の弱毒化２型ウイルスのＤＮＡ配列のコンテクストにおいて２ｃ型分離体のカプシドタンパク質を含有するハイブリッドウイルスを得た。このウイルスを単離し、精製し、医薬上許容される担体と混合し、ワクチンとして使用した。
【００１７】
該新規ワクチンの投与を受けたイヌをＣＰＶ ２ｃ型ウイルスの野外分離体および２型ワクチンの親ウイルスでチャレンジした。
【００１８】
驚くべきことに、該新規ワクチンは通常の２型分離体に対する適度な抗体力価および２ｃ型ＣＰＶに対する防御の改善を示した。
【００１９】
そのようなワクチンは、イヌパルボウイルス、特に２ｃ型の感染に対するイヌの防御において有利に使用されうる。
【００２０】
より一般には、前記の知見は、第１イヌパルボウイルスのカプシド領域を第２イヌパルボウイルスカプシド領域またはその関連断片で置換することにより、弱毒化ウイルスが別のイヌパルボウイルスの感染に対する組換えワクチンの基礎として使用されうることを示している。
【００２１】
したがって、本発明は、弱毒化第１パルボウイルスから入手可能なＤＮＡ配列を含む組換えパルボウイルスに関するものであり、ここで、第１パルボウイルスのカプシドタンパク質またはその断片をコードするＤＮＡが、第２パルボウイルスから誘導可能なカプシドタンパク質またはその断片により置換されている。
【００２２】
第１および第２パルボウイルスからのカプシドタンパク質は少なくとも１つアミノ酸において異なっている必要がある。この文脈における「カプシドタンパク質またはその断片」なる語は完全長カプシドタンパク質またはその一部（これは第１パルボウイルスと第２パルボウイルスとの間のカプシドタンパク質における相違を含む）を意味する。
【００２３】
好ましくは、第１パルボウイルスの完全長カプシドタンパク質は第２パルボウイルスの完全長カプシドタンパク質により置換されている。
【００２４】
本明細書中で用いる「完全長」および「実質的に完全長」なる語は、該タンパク質または核酸配列が、その機能を発揮するための全ての必要な要素を含有することを示すと意図され、好ましくは、該配列は天然配列の全ての要素（アミノ酸またはヌクレオチド）を含有すべきである。
【００２５】
本発明の組換えパルボウイルスは、パルボウイルスによる感染に対する動物の防御のためのワクチンにおいて有利に使用されうる。そのようなワクチンは第２ウイルスによる感染だけでなく第１ウイルスによる感染に対しても動物を防御し、一方、該組換えワクチンは弱毒化体のままであり、パルボウイルス感染のいずれの臨床的徴候をも誘導し得ないことが判明した。
【００２６】
本発明はまた、
ａ．弱毒化第１パルボウイルス株から少なくとも１つの第１ ＤＮＡ断片を得（該第１ ＤＮＡ断片はカプシドタンパク質をコードしていない）、
ｂ．第２パルボウイルス株から少なくとも１つの第２ ＤＮＡ断片を得（該第２ ＤＮＡ断片はカプシドタンパク質をコードしている）、
ｃ．パルボウイルスに許容性である細胞を、工程ａおよびｂで得られたＤＮＡ断片でトランスフェクトし、
ｄ．それらのＤＮＡ断片を組換え、
ｅ．第１パルボウイルスのゲノムの遺伝的コンテクストにおいて第２パルボウイルスに由来するウイルスカプシドタンパク質をコードする弱毒化組換えウイルスを選択し、
ｆ．細胞培養内でパルボウイルスの産生を可能にする条件下で該細胞を培養し、
ｇ．該細胞培養から該組換えパルボウイルスを得る工程を含む、本発明の組換えパルボウイルスの入手方法に関する。
【００２７】
好ましくは、該パルボウイルスはイヌパルボウイルスであり、より一層好ましくは、第１パルボウイルスは２型イヌパルボウイルスであり、第２イヌパルボウイルスは２ｃ型イヌパルボウイルスであり、これは、２ｃ型による感染だけでなく２型による感染に対してもイヌを防御する一方で弱毒化特性を維持しているワクチンを与える。
【００２８】
弱毒化部位が該カプシドタンパク質内に存在しないことを明白に示すために、弱毒化株におけるカプシドタンパク質遺伝子を、ビルレント２ｃ野外分離体に由来する配列を有する化学合成体により置換した。この方法も、本発明の弱毒化ウイルスを与えた。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ハイブリッド２／２ｃウイルス分離体を得る自然組換え（非ＧＭ）法の概要図。２型ワクチンおよび２ｃ型野外ウイルスからの２つの重複断片を細胞内にトランスフェクトし、相同組換え後にウイルスを分離した。
【図２】制限酵素部位ＰａｃＩおよびＸｍｎＩを示すＣＰＶ株１５４ａｔｔの感染性プラスミドクローンの概要図。陰影付きの箱は末端回文配列を表す。
【図３】更なる操作のために選択された部分的ＰａｃＩ／ＸｍｎＩ消化物の、選択された産物を示す概要図。
【図４】カプシド遺伝子がビルレントＣＰＶ２ｃカプシド配列により置換された、１５４ａｔｔワクチンウイルスＤＮＡを含有するプラスミド。 実施例
【実施例１】
【００３０】
組換えウイルスの作製
商業的に入手可能なＮｏｂｉｖａｃ Ｐａｒｖｏ Ｃ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）から株１５４ａｔｔを得た。株Ｊｅｓｓは２ｃ型ウイルスの野外分離体であった。
【００３１】
５％ ウシ胎児血清を含有するＭ６Ｂ８培地を使用して、付着性イヌまたはネコ腎細胞（例えば、Ａ７２およびＣｒＦＫ）上でウイルスを増殖させた。標準的な「ヒルト（Ｈｉｒｔ）」法（ＭｃＭａｓｔｅｒら １９８１）の変法を用いて、感染細胞培養から複製形態（ＲＦ）ＤＮＡを調製した。
【００３２】
１５４ ａｔｔ株から調製されたＲＦ ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで消化し、該断片をアガロースゲル電気泳動により分離した。３０５５塩基対（ｂｐ）のバンド（ＣＰＶの左側末端に対応する）を該ゲルから切り出し、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出カラムを使用して精製した。ＣＰＶ Ｊｅｓｓ感染細胞から分離されたＲＦ ＤＮＡを制限酵素ＸｍｎＩで消化した。再び該ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、ついで、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出カラムを使用して約２７５０ｂｐのバンド（カプシド配列を含むＣＰＶの右側末端に対応する）を精製した。
【００３３】
１５４ａｔｔおよびＪｅｓｓからの精製３０５５ｂｐおよび２７５０ｂｐ断片を合わせ、培養内のＡ７２またはＣｒＦＫ細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクションは、約３μｇの各断片と共にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を該製造業者の説明に従い使用して行った。
【００３４】
トランスフェクション後、細胞を継代し、赤血球凝集（ＨＡ）アッセイによりモニターした。継代４においてウイルスがＨＡにより検出された。ハイブリッドウイルスのＤＮＡ配列決定を、ＲＦ ＤＮＡまたはＰＣＲ断片鋳型を使用する標準的なＤＮＡ配列決定法を用いて行った。ウイルスを付着性感受性イヌまたはネコ細胞上で限界希釈により精製した
【実施例２】
【００３５】
クローン化ウイルスＤＮＡから構築された組換えウイルス
組換えウイルスをクローン化断片から作製した。ウイルス株１５４ａｔｔのゲノムを標準的なクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｉｎｃ．）内にクローニングした。回文末端配列を完全なままに維持するために、幾つかの組換え系が欠損している細菌宿主ＤＬ７９５内で該プラスミドを増殖させた。パルボウイルスゲノムのクローニングは文献に記載されており、要求される技術は当業者に公知である。
【００３６】
１５４ａｔｔの得られたクローン（ｐ１５４）を制限酵素ＰａｃＩで消化した。この場合、該消化が完全には進行しないように、すなわち、該制限酵素消化が部分的のみとなるようにした。ついで該消化断片を制限酵素ＸｍｎＩでの消化に付した。ついで該消化ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、後記図に示されている断片を該ゲルから切り出し、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出カラムを使用して精製した。ＸｍｎＩおよび右側Ｐａｃ部位は該パルボウイルスゲノム内のカプシド領域に隣接している。
【００３７】
１５４ａｔｔのカプシド遺伝子を以下のとおりにＣＰＶのビルレント株のカプシド遺伝子により置換した。図２に示されているＸｍｎＩ部位および右側ＰａｃＩはカプシド遺伝子の境界の外側に位置する。ＰａｃＩ部位と該カプシド遺伝子の末端との間の約１１０ｂｐの配列は１５４ａｔｔ株とビルレント分離体とで有意に異なる。ＸｍｎＩ部位と該カプシド遺伝子の開始部位との間の短い配列（〜５５ｂｐ）における配列変化は未だ示されていない。したがって、成分の置換を該カプシド配列のみに限定するために、該ビルレントＣＰＶカプシド配列を化学合成し、ＰａｃＩ部位とカプシド終止シグナルとの間のワクチン特異的配列を維持させた。以下に、ＣＰＶカプシド遺伝子を含有する化学合成配列を示す。以下に示す配列は本明細書においては配列番号１として記載されている。
【００３８】
【化１】
ＸｍｎＩおよびＰａｃＩ部位が下線で示されている。カプシドコード領域の終止コドン（ＴＡＡ）が示されている。カプシド（Ｖｐ１／Ｖｐ２）コード配列が太字で示されている。
【００３９】
該合成断片を、酵素ＸｍｎＩおよびＰａｃＩを使用してそれが付与されたプラスミドから遊離させ、ついでそれを、図３に示されている断片に連結した。標準的な方法を用いて、コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（株ＤＬ７９５）を該連結混合物で形質転換し、該組換えプラスミドを含有する細菌を単離し、同定した。ついで、該クローン化大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から、後記（図４）に示されている生じたプラスミドｐ１５４２ｃを調製した。
【００４０】
以下のとおりにハイブリッドウイルスを調製した。プラスミドｐ１５４２ｃ ＤＮＡを培養内のＡ７２またはＣｒＦＫ細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクションは、約３μｇのＤＮＡと共にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を該製造業者の説明に従い使用して行った。トランスフェクション後、細胞を継代し、赤血球凝集（ＨＡ）アッセイによりモニターした。継代４においてウイルスがＨＡにより検出された。ハイブリッドウイルスのＤＮＡ配列決定を、ＲＦ ＤＮＡまたはＰＣＲ断片鋳型を使用する標準的なＤＮＡ配列決定法を用いて行った。ウイルスを付着性感受性イヌまたはネコ細胞上で限界希釈により精製した
【実施例３】
【００４１】
インビボ試験
ワクチン接種されていない母イヌから生まれた（したがって、ＣＰＶに対する母体由来抗体を欠いている）ワクチン接種されていない６週齢のＳＰＦ子イヌの３つの群に、２／２ｃハイブリッドウイルス、および親ウイルス（２型ワクチンおよび２ｃ型野外ウイルス）のそれぞれを接種した。動物を臨床的に監視し、血液サンプルを採取した。
【００４２】
群１は、２型ＣＰＶを含む通常のＩｎｔｅｒｖｅｔワクチンであるＰａｒｖｏ Ｃで皮下ワクチン接種された５匹のイヌを含んでいた。群２は、新規ハイブリッド２／２ｃワクチンで１０７．５ ＴＣＩＤ５０／ｍｌで皮下ワクチン接種された５匹のイヌを含んでいた。
【００４３】
群１のイヌは、２型ウイルスに対する特異的抗体の、該ハイブリッドの場合より高い力価を示すことが判明した。これに対して、群２のイヌは、該ハイブリッドウイルスに対する血清中和（ＳＮ）力価、および赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）の、より高い力価を示した。
【００４４】
したがって、該ハイブリッドウイルス株は、通常の２型ウイルス株に関する適度な防御を維持する一方で、ＣＰＶ ２ｃ型による感染に対する防御の改善をもたらすと結論づけられうる。
【００４５】
既存ワクチンが接種されたイヌはいずれも、疾患の徴候を示さなかったが、野外ウイルスが接種された対照イヌは重篤な出血性腸炎を示す。したがって、本発明者らは、驚くべきことに、ＣＰＶにおける主要な弱毒化突然変異がカプシドタンパク質遺伝子の外部に位置することを見出した。
【実施例４】
【００４６】
安全性試験
母体由来抗体（ＭＤＡ）を有する子イヌにおける２／２ｃハイブリッドウイルスの安全性を調べるための研究を行った。ワクチン接種された全ての子イヌは該研究の全体にわたって完全に正常なままであった。更に、該ハイブリッドウイルスでワクチン接種されたイヌは良好な血清学的応答を示した。このことは、該ハイブリッドウイルスが通常レベルのＭＤＡを打ち破ること（これは、有効なイヌパルボウイルスワクチンの必須要件である）が可能であったことを示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パルボウイルスによる感染に対して動物を防御するためのウイルスワクチン、その製造および用途の分野におけるものである。更に特に、本発明は、新規パルボウイルス分離体から誘導可能なカプシドタンパク質またはその断片を含む弱毒化パルボウイルスを含むワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
パルボウイルスは一本鎖ＤＮＡウイルスの科に属する。パルボウイルスはネコ、イヌおよびブタのような幾つかの動物において疾患を引き起こしうる。該ウイルスは、複製するためには、活発に分裂している細胞を必要とするため、感染する組織型は動物の年齢によって様々である。胃腸管およびリンパ系はいずれの年齢でも冒される可能性があり、それにより嘔吐、下痢および免疫抑制が生じうるが、子宮内または２週齢未満で感染したネコでは小脳発育不全が見られるに過ぎず、３〜８週齢で感染した子イヌでは心筋の疾患が見られる。
【０００３】
イヌパルボウイルスは、若いイヌでは特に致命的な疾患であり、約８０％の致死性を示し、非常に若い子イヌにおいては胃腸管損傷および脱水ならびに心臓症候群を引き起こす。それは、感染したイヌの糞との接触により広がる。症状は嗜眠、重度の下痢、発熱、嘔吐、食欲不振および脱水を含む。ブタパルボウイルスは、死産、ミイラ化、胚死および不妊を表すＳＭＥＤＩとしての公知の、ブタにおける生殖疾患を引き起こす。ネコ汎白血球減少症は子ネコで一般的であり、発熱、低白血球数、下痢および死を引き起こす。ネコ胎児および２週齢未満の子ネコへの感染は小脳発育不全を引き起こす。ミンク腸炎ウイルスは、それが小脳発育不全を引き起こさないこと以外はネコ汎白血球減少症と実質的に類似している。別のパルボウイルスは、リンパ節障害、脾腫、糸球体腎炎、貧血および死亡により特徴づけられる、ミンクおよび他のイタチ科動物におけるアリューシャン病を引き起こす。パルボウイルスの最も正確な診断はＥＬＩＳＡによるものである。イヌ、ネコおよびブタはパルボウイルスに対してワクチン接種されうる。
【０００４】
ＤＮＡレベルでは、イヌ、ネコおよびブタパルボウイルスは高度に相同なゲノムを有することが公知である。イヌパルボウイルス（ＣＰＶ２）は、イヌにおける急性で時には致死性の腸炎を引き起こすウイルスである（Ｋｅｌｌｙ，Ａｕｓｔ．Ｖｅｔ．Ｊ．５４；５９３，１９７８；Ａｐｐｅｌら，Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１０５；１５６−１５９，１９７９）。該ウイルスは１９７７年頃に最初に出現し、おそらく、ネコにおける非常に密接に関連したウイルスであるネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＬＶ）から、単一カプシドタンパク質における少数の突然変異［ミンクまたはアライグマのような他の肉食動物における中間的移行を含んでいた可能性のある種間跳躍（ｓｐｅｃｉｅｓ ｊｕｍｐ）］により生じたのであろう（Ｔｒｕｙｅｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１５，１８６−１８９，１９９６）。
【０００５】
早くも１９７９年に、ＣＰＶ２ａと称される、ＣＰＶ２の最初の変異体が出現し、その後まもなく、１９８４年にＣＰＶ２ｂが出現した（Ｐａｒｒｉｓｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，１０４６−１０４８，１９８５およびＪ．Ｖｉｒｏｌ．６５；６５４４−６５５２，１９９１）。
【０００６】
その元の２型ウイルスは現在では野外から消え、該２ａおよび２ｂ変異体がそれに取って代わっており、これらの２つの型の相対比率は国によって様々である（Ｔｒｕｙｅｎら，前掲；Ｃｈｉｎｃｈｋａｒら，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１５１，１８８１−１８８７，２００６；Ｐｅｒｅｉｒａら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｖｏｌ．３，３９９−４０９，２００７）。２から２ａおよび２ｂへの変化を特徴づける、カプシドタンパク質（ＶＰ２）におけるアミノ酸変化は非常に限定的である。８７位（ＭｅｔからＬｅｕへ）、３００位（ＧｌｙからＡｌａへ）、３０５位（ＴｙｒからＡｓｐへ）および５５５位（ＶａｌからＩｌｅへ）の置換は２から２ａへの進化において生じ、４２６位（ＡｓｎからＡｓｐへ）および５５５位（ＩｌｅからＶａｌへ）の置換は２ａから２ｂへの出現において生じた（Ｐａｒｒｉｓｈら，前掲；Ｔｒｕｙｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９，４７０２−４７１０，１９９５）。最近、５５５位のＶａｌからＩｌｅへの置換を欠く２ａ株が報告された（Ｗａｎｇら，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ３１，１７１−１７４，２００５；Ｍａｒｔｅｌｌａら，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ３３，１１−１３，２００６）。単一アミノ酸変化がＣＰＶ２ａとＣＰＶ２ｂとのＶＰ２配列を区別しうるらしい。
【０００７】
より最近になって、４２６位のアミノ酸（２ａではＡｓｎ、そして２ｂではＡｓｐ）がグルタミン酸（Ｇｌｕ）残基になった株がイタリアにおいて出現した（Ｂｕｏｎａｖｏｇｌｉａら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２，３０２１−３０２５，２００１；Ｍａｒｔｅｌｌａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２，１３３３−１３３６，２００４）。ＣＰＶ２ｃウイルスと称されるこれらのＧｌｕ ４２６変異体がイタリアおよび他の欧州諸国において広がりつつあり、他のＣＰＶ型と共存しており（Ｄｅｃａｒｏら，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｂ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｖｅｔ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ５３，４６８−４７２，２００６）、ベトナムおよびスコットランドのような地理的に様々な国々でも分離されている（Ｎａｋａｍｕｒａら，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．１４９，２２６１−２２６９，２００４，Ｓｐｉｂｅｙら，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １２８，４８−５５，２００８）ことは、それらがイヌ集団の少なくとも一部における利点を有することを示唆している。
【０００８】
イヌパルボウイルスの相対的に急速な進化はネコ宿主域の喪失およびそれに続く再獲得をもたらしており（Ｔｒｕｙｅｎら，１９９６ 前掲）、この再獲得された、ネコにおいて複製する能力は、元の２型が２ａ、２ｂおよび２ｃ変異体によって取って代えられたこと説明しうる。１９７０年代後半および１９８０年代初期に、生および不活化ＦＰＬワクチンの両方が、交差防御を刺激する共有抗原により、ＣＰＶ疾患からイヌを防御するために使用されたが、それらがもたらした防御レベルは低く、免疫持続期間は短かった。これらのワクチンは生弱毒化ＣＰＶワクチンによって取って代えられており、これは優れた防御およびより長い免疫持続期間をもたらした。現在、該生弱毒化ワクチンはＣＰＶ２ｂ分離体または元の２型ウイルスから誘導されている。該２型ウイルスは野外では２ａ、２ｂおよび現在は２ｃウイルスによって完全に取って代えられているため、弱毒化２型ワクチンによりもたらされる防御レベルに関する懸念が存在する（Ｐｒａｔｅｌｌｉら，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８，６１２−６１５，２００１；Ｔｒｕｙｅｎ，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９，４７−５０，１９９９）。
【０００９】
しかし、利用可能なモノクローナル抗体での研究に基づけば、それぞれの新たな抗原変異体は、以前の変異体と比較して少なくとも１つの中和エピトープを喪失している（Ｓｔｒａｓｓｈｅｉｍら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８，１７５−１８４，１９９４；Ｐｅｒｅｉｒａら，前掲）。種々の抗原型に対して産生された血清を使用してインビトロで行われた交差中和研究が顕著な相違を示している場合であっても（Ｐｒａｔｅｌｌｉら，前掲）、生弱毒化ＣＰＶ２ワクチンは２ａおよび２ｂ野外チャレンジに対してイヌを防御しうることがこれまでに示されている（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄら，Ｖｅｔ．Ｒｅｃｏｒｄ．１３６，６３−６７，１９９５）。
【００１０】
最近、生弱毒化２型ワクチン（Ｎｏｂｉｖａｃ−Ｉｎｔｅｒｖｅｔ）が、最も最近のＣＰＶ変異体であるＣＰＶ２ｃでのチャレンジからイヌを防御しうることが示された（Ｓｐｉｂｅｙら，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １２８，４８−５５，２００８）。
【００１１】
それでもなお、パルボウイルスの新型の感染に対する動物、特にネコ、イヌおよびブタの免疫を改善するワクチンが当分野において必要とされている。しかし、そのようなワクチンは存在せず、特に、イヌパルボウイルス２ｃ型に特異的なワクチンは存在しない。
【発明の概要】
【００１２】
発明の概括
本発明は前記問題の解決法を提供するものであり、弱毒化第１パルボウイルスから入手可能なＤＮＡ配列を含む組換えパルボウイルスと医薬上許容される担体とを含むワクチンを提供し、ここで、該第１パルボウイルスのカプシドタンパク質またはその断片をコードするＤＮＡが、第２パルボウイルス、例えばイヌパルボウイルス、より詳細には２ｃ型パルボウイルスから誘導可能なカプシドタンパク質またはその断片により置換されている。
【００１３】
驚くべきことに、そのようなワクチンは、該第２イヌパルボウイルスでのチャレンジに対する防御抗体の、より高い力価を誘導しうる一方で、２型株に対する良好な免疫を維持することが可能であり、一方、該組換えイヌパルボウイルスは弱毒化されたままであることが見出された。
【００１４】
発明の詳細な説明
第２イヌパルボウイルスのカプシドタンパク質をコードするウイルスＤＮＡは、当業者の通常の技術を用いることにより、野外で分離された株から得られうる。実施例の節においては、それは、２型分離体を使用することにより例示されている。弱毒化イヌパルボウイルスからのウイルスＤＮＡも当技術分野で利用可能であり、該実施例は、Ｉｎｔｅｒｖｅｔから得られるワクチン株（Ｎｏｂｉｖａｃ ｐａｒｖｏ）に含有されている元の２型ウイルスの分離を示している。
【００１５】
より詳細には、ＣＰＶ ２ｃ型野外分離体からウイルスＤＮＡを得た。２つの重複断片が各調製物から得られるように、各ＤＮＡ調製物を異なる制限酵素で消化した。断片を精製し、分離した。ついで、選択された断片を感受性細胞内にトランスフェクトした。これを図１に図示する。
【００１６】
それらの２つの断片の自然組換えの後、通常の弱毒化２型ウイルスのＤＮＡ配列のコンテクストにおいて２ｃ型分離体のカプシドタンパク質を含有するハイブリッドウイルスを得た。このウイルスを単離し、精製し、医薬上許容される担体と混合し、ワクチンとして使用した。
【００１７】
該新規ワクチンの投与を受けたイヌをＣＰＶ ２ｃ型ウイルスの野外分離体および２型ワクチンの親ウイルスでチャレンジした。
【００１８】
驚くべきことに、該新規ワクチンは通常の２型分離体に対する適度な抗体力価および２ｃ型ＣＰＶに対する防御の改善を示した。
【００１９】
そのようなワクチンは、イヌパルボウイルス、特に２ｃ型の感染に対するイヌの防御において有利に使用されうる。
【００２０】
より一般には、前記の知見は、第１イヌパルボウイルスのカプシド領域を第２イヌパルボウイルスカプシド領域またはその関連断片で置換することにより、弱毒化ウイルスが別のイヌパルボウイルスの感染に対する組換えワクチンの基礎として使用されうることを示している。
【００２１】
したがって、本発明は、弱毒化第１パルボウイルスから入手可能なＤＮＡ配列を含む組換えパルボウイルスに関するものであり、ここで、第１パルボウイルスのカプシドタンパク質またはその断片をコードするＤＮＡが、第２パルボウイルスから誘導可能なカプシドタンパク質またはその断片により置換されている。
【００２２】
第１および第２パルボウイルスからのカプシドタンパク質は少なくとも１つアミノ酸において異なっている必要がある。この文脈における「カプシドタンパク質またはその断片」なる語は完全長カプシドタンパク質またはその一部（これは第１パルボウイルスと第２パルボウイルスとの間のカプシドタンパク質における相違を含む）を意味する。
【００２３】
好ましくは、第１パルボウイルスの完全長カプシドタンパク質は第２パルボウイルスの完全長カプシドタンパク質により置換されている。
【００２４】
本明細書中で用いる「完全長」および「実質的に完全長」なる語は、該タンパク質または核酸配列が、その機能を発揮するための全ての必要な要素を含有することを示すと意図され、好ましくは、該配列は天然配列の全ての要素（アミノ酸またはヌクレオチド）を含有すべきである。
【００２５】
本発明の組換えパルボウイルスは、パルボウイルスによる感染に対する動物の防御のためのワクチンにおいて有利に使用されうる。そのようなワクチンは第２ウイルスによる感染だけでなく第１ウイルスによる感染に対しても動物を防御し、一方、該組換えワクチンは弱毒化体のままであり、パルボウイルス感染のいずれの臨床的徴候をも誘導し得ないことが判明した。
【００２６】
本発明はまた、
ａ．弱毒化第１パルボウイルス株から少なくとも１つの第１ ＤＮＡ断片を得（該第１ ＤＮＡ断片はカプシドタンパク質をコードしていない）、
ｂ．第２パルボウイルス株から少なくとも１つの第２ ＤＮＡ断片を得（該第２ ＤＮＡ断片はカプシドタンパク質をコードしている）、
ｃ．パルボウイルスに許容性である細胞を、工程ａおよびｂで得られたＤＮＡ断片でトランスフェクトし、
ｄ．それらのＤＮＡ断片を組換え、
ｅ．第１パルボウイルスのゲノムの遺伝的コンテクストにおいて第２パルボウイルスに由来するウイルスカプシドタンパク質をコードする弱毒化組換えウイルスを選択し、
ｆ．細胞培養内でパルボウイルスの産生を可能にする条件下で該細胞を培養し、
ｇ．該細胞培養から該組換えパルボウイルスを得る工程を含む、本発明の組換えパルボウイルスの入手方法に関する。
【００２７】
好ましくは、該パルボウイルスはイヌパルボウイルスであり、より一層好ましくは、第１パルボウイルスは２型イヌパルボウイルスであり、第２イヌパルボウイルスは２ｃ型イヌパルボウイルスであり、これは、２ｃ型による感染だけでなく２型による感染に対してもイヌを防御する一方で弱毒化特性を維持しているワクチンを与える。
【００２８】
弱毒化部位が該カプシドタンパク質内に存在しないことを明白に示すために、弱毒化株におけるカプシドタンパク質遺伝子を、ビルレント２ｃ野外分離体に由来する配列を有する化学合成体により置換した。この方法も、本発明の弱毒化ウイルスを与えた。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ハイブリッド２／２ｃウイルス分離体を得る自然組換え（非ＧＭ）法の概要図。２型ワクチンおよび２ｃ型野外ウイルスからの２つの重複断片を細胞内にトランスフェクトし、相同組換え後にウイルスを分離した。
【図２】制限酵素部位ＰａｃＩおよびＸｍｎＩを示すＣＰＶ株１５４ａｔｔの感染性プラスミドクローンの概要図。陰影付きの箱は末端回文配列を表す。
【図３】更なる操作のために選択された部分的ＰａｃＩ／ＸｍｎＩ消化物の、選択された産物を示す概要図。
【図４】カプシド遺伝子がビルレントＣＰＶ２ｃカプシド配列により置換された、１５４ａｔｔワクチンウイルスＤＮＡを含有するプラスミド。 実施例
【実施例１】
【００３０】
組換えウイルスの作製
商業的に入手可能なＮｏｂｉｖａｃ Ｐａｒｖｏ Ｃ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）から株１５４ａｔｔを得た。株Ｊｅｓｓは２ｃ型ウイルスの野外分離体であった。
【００３１】
５％ ウシ胎児血清を含有するＭ６Ｂ８培地を使用して、付着性イヌまたはネコ腎細胞（例えば、Ａ７２およびＣｒＦＫ）上でウイルスを増殖させた。標準的な「ヒルト（Ｈｉｒｔ）」法（ＭｃＭａｓｔｅｒら １９８１）の変法を用いて、感染細胞培養から複製形態（ＲＦ）ＤＮＡを調製した。
【００３２】
１５４ ａｔｔ株から調製されたＲＦ ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで消化し、該断片をアガロースゲル電気泳動により分離した。３０５５塩基対（ｂｐ）のバンド（ＣＰＶの左側末端に対応する）を該ゲルから切り出し、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出カラムを使用して精製した。ＣＰＶ Ｊｅｓｓ感染細胞から分離されたＲＦ ＤＮＡを制限酵素ＸｍｎＩで消化した。再び該ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、ついで、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出カラムを使用して約２７５０ｂｐのバンド（カプシド配列を含むＣＰＶの右側末端に対応する）を精製した。
【００３３】
１５４ａｔｔおよびＪｅｓｓからの精製３０５５ｂｐおよび２７５０ｂｐ断片を合わせ、培養内のＡ７２またはＣｒＦＫ細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクションは、約３μｇの各断片と共にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を該製造業者の説明に従い使用して行った。
【００３４】
トランスフェクション後、細胞を継代し、赤血球凝集（ＨＡ）アッセイによりモニターした。継代４においてウイルスがＨＡにより検出された。ハイブリッドウイルスのＤＮＡ配列決定を、ＲＦ ＤＮＡまたはＰＣＲ断片鋳型を使用する標準的なＤＮＡ配列決定法を用いて行った。ウイルスを付着性感受性イヌまたはネコ細胞上で限界希釈により精製した
【実施例２】
【００３５】
クローン化ウイルスＤＮＡから構築された組換えウイルス
組換えウイルスをクローン化断片から作製した。ウイルス株１５４ａｔｔのゲノムを標準的なクローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｉｎｃ．）内にクローニングした。回文末端配列を完全なままに維持するために、幾つかの組換え系が欠損している細菌宿主ＤＬ７９５内で該プラスミドを増殖させた。パルボウイルスゲノムのクローニングは文献に記載されており、要求される技術は当業者に公知である。
【００３６】
１５４ａｔｔの得られたクローン（ｐ１５４）を制限酵素ＰａｃＩで消化した。この場合、該消化が完全には進行しないように、すなわち、該制限酵素消化が部分的のみとなるようにした。ついで該消化断片を制限酵素ＸｍｎＩでの消化に付した。ついで該消化ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、後記図に示されている断片を該ゲルから切り出し、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出カラムを使用して精製した。ＸｍｎＩおよび右側Ｐａｃ部位は該パルボウイルスゲノム内のカプシド領域に隣接している。
【００３７】
１５４ａｔｔのカプシド遺伝子を以下のとおりにＣＰＶのビルレント株のカプシド遺伝子により置換した。図２に示されているＸｍｎＩ部位および右側ＰａｃＩはカプシド遺伝子の境界の外側に位置する。ＰａｃＩ部位と該カプシド遺伝子の末端との間の約１１０ｂｐの配列は１５４ａｔｔ株とビルレント分離体とで有意に異なる。ＸｍｎＩ部位と該カプシド遺伝子の開始部位との間の短い配列（〜５５ｂｐ）における配列変化は未だ示されていない。したがって、成分の置換を該カプシド配列のみに限定するために、該ビルレントＣＰＶカプシド配列を化学合成し、ＰａｃＩ部位とカプシド終止シグナルとの間のワクチン特異的配列を維持させた。以下に、ＣＰＶカプシド遺伝子を含有する化学合成配列を示す。以下に示す配列は本明細書においては配列番号１として記載されている。
【００３８】
【化１】
ＸｍｎＩおよびＰａｃＩ部位が下線で示されている。カプシドコード領域の終止コドン（ＴＡＡ）が示されている。カプシド（Ｖｐ１／Ｖｐ２）コード配列が太字で示されている。
【００３９】
該合成断片を、酵素ＸｍｎＩおよびＰａｃＩを使用してそれが付与されたプラスミドから遊離させ、ついでそれを、図３に示されている断片に連結した。標準的な方法を用いて、コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（株ＤＬ７９５）を該連結混合物で形質転換し、該組換えプラスミドを含有する細菌を単離し、同定した。ついで、該クローン化大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から、後記（図４）に示されている生じたプラスミドｐ１５４２ｃを調製した。
【００４０】
以下のとおりにハイブリッドウイルスを調製した。プラスミドｐ１５４２ｃ ＤＮＡを培養内のＡ７２またはＣｒＦＫ細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクションは、約３μｇのＤＮＡと共にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を該製造業者の説明に従い使用して行った。トランスフェクション後、細胞を継代し、赤血球凝集（ＨＡ）アッセイによりモニターした。継代４においてウイルスがＨＡにより検出された。ハイブリッドウイルスのＤＮＡ配列決定を、ＲＦ ＤＮＡまたはＰＣＲ断片鋳型を使用する標準的なＤＮＡ配列決定法を用いて行った。ウイルスを付着性感受性イヌまたはネコ細胞上で限界希釈により精製した
【実施例３】
【００４１】
インビボ試験
ワクチン接種されていない母イヌから生まれた（したがって、ＣＰＶに対する母体由来抗体を欠いている）ワクチン接種されていない６週齢のＳＰＦ子イヌの３つの群に、２／２ｃハイブリッドウイルス、および親ウイルス（２型ワクチンおよび２ｃ型野外ウイルス）のそれぞれを接種した。動物を臨床的に監視し、血液サンプルを採取した。
【００４２】
群１は、２型ＣＰＶを含む通常のＩｎｔｅｒｖｅｔワクチンであるＰａｒｖｏ Ｃで皮下ワクチン接種された５匹のイヌを含んでいた。群２は、新規ハイブリッド２／２ｃワクチンで１０７．５ ＴＣＩＤ５０／ｍｌで皮下ワクチン接種された５匹のイヌを含んでいた。
【００４３】
群１のイヌは、２型ウイルスに対する特異的抗体の、該ハイブリッドの場合より高い力価を示すことが判明した。これに対して、群２のイヌは、該ハイブリッドウイルスに対する血清中和（ＳＮ）力価、および赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）の、より高い力価を示した。
【００４４】
したがって、該ハイブリッドウイルス株は、通常の２型ウイルス株に関する適度な防御を維持する一方で、ＣＰＶ ２ｃ型による感染に対する防御の改善をもたらすと結論づけられうる。
【００４５】
既存ワクチンが接種されたイヌはいずれも、疾患の徴候を示さなかったが、野外ウイルスが接種された対照イヌは重篤な出血性腸炎を示す。したがって、本発明者らは、驚くべきことに、ＣＰＶにおける主要な弱毒化突然変異がカプシドタンパク質遺伝子の外部に位置することを見出した。
【実施例４】
【００４６】
安全性試験
母体由来抗体（ＭＤＡ）を有する子イヌにおける２／２ｃハイブリッドウイルスの安全性を調べるための研究を行った。ワクチン接種された全ての子イヌは該研究の全体にわたって完全に正常なままであった。更に、該ハイブリッドウイルスでワクチン接種されたイヌは良好な血清学的応答を示した。このことは、該ハイブリッドウイルスが通常レベルのＭＤＡを打ち破ること（これは、有効なイヌパルボウイルスワクチンの必須要件である）が可能であったことを示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
弱毒化第１パルボウイルスから入手可能なＤＮＡ配列を含む弱毒化組換えパルボウイルスであって、該第１パルボウイルスのカプシドタンパク質またはその断片をコードするＤＮＡが、第２パルボウイルスから誘導可能なカプシドタンパク質またはその断片により置換されている、弱毒化組換えパルボウイルス。
【請求項２】
弱毒化第１パルボウイルスから入手可能なＤＮＡ配列が実質的に完全長である、請求項１記載の組換えパルボウイルス。
【請求項３】
該第２パルボウイルスからのカプシドタンパク質が実質的に完全長である、請求項１または２記載の組換えパルボウイルス。
【請求項４】
該パルボウイルスが、イヌパルボウイルス、ネコパルボウイルスおよびブタパルボウイルスからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の組換えパルボウイルス。
【請求項５】
該第１パルボウイルスが２型イヌパルボウイルスであり、および／または該第２パルボウイルスが２ｃ型イヌパルボウイルスである、請求項１〜４のいずれか１項記載の組換えパルボウイルス。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の組換えパルボウイルスと医薬上許容される担体とを含む、パルボウイルスによる感染に対する動物の防御のためのワクチン。
【請求項７】
ａ．カプシドタンパク質をコードしない少なくとも１つのＤＮＡ断片を弱毒化第１パルボウイルス株から得、
ｂ．カプシドタンパク質をコードする少なくとも１つのＤＮＡ断片を第２パルボウイルス株から得、
ｃ．パルボウイルスに許容性である細胞を、工程ａおよびｂで得られたＤＮＡ断片でトランスフェクトし、
ｄ．それらのＤＮＡ断片を組換え、
ｅ．該第１パルボウイルスのゲノムの遺伝的コンテクストにおいて該第２パルボウイルスに由来するウイルスカプシドタンパク質をコードする弱毒化組換えウイルスを選択し、
ｆ．細胞培養内でパルボウイルスの産生を可能にする条件下で該細胞を培養し、
ｇ．該細胞培養から該組換えパルボウイルスを得る工程を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の組換えパルボウイルスの入手方法
【請求項８】
該パルボウイルスが、イヌパルボウイルス、ネコパルボウイルスおよびブタパルボウイルスからなる群から選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該第１パルボウイルスがイヌパルボウイルス２型株であり、該第２パルボウイルスがイヌパルボウイルス２ｃ型株である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
パルボウイルスによる感染に対する動物の防御のための、請求項６記載のワクチンの使用。
【請求項１１】
該パルボウイルスがイヌパルボウイルス、特にイヌパルボウイルス２ｃ型である、請求項１０記載の使用。
【請求項１】
弱毒化第１パルボウイルスから入手可能なＤＮＡ配列を含む弱毒化組換えパルボウイルスであって、該第１パルボウイルスのカプシドタンパク質またはその断片をコードするＤＮＡが、第２パルボウイルスから誘導可能なカプシドタンパク質またはその断片により置換されている、弱毒化組換えパルボウイルス。
【請求項２】
弱毒化第１パルボウイルスから入手可能なＤＮＡ配列が実質的に完全長である、請求項１記載の組換えパルボウイルス。
【請求項３】
該第２パルボウイルスからのカプシドタンパク質が実質的に完全長である、請求項１または２記載の組換えパルボウイルス。
【請求項４】
該パルボウイルスが、イヌパルボウイルス、ネコパルボウイルスおよびブタパルボウイルスからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の組換えパルボウイルス。
【請求項５】
該第１パルボウイルスが２型イヌパルボウイルスであり、および／または該第２パルボウイルスが２ｃ型イヌパルボウイルスである、請求項１〜４のいずれか１項記載の組換えパルボウイルス。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の組換えパルボウイルスと医薬上許容される担体とを含む、パルボウイルスによる感染に対する動物の防御のためのワクチン。
【請求項７】
ａ．カプシドタンパク質をコードしない少なくとも１つのＤＮＡ断片を弱毒化第１パルボウイルス株から得、
ｂ．カプシドタンパク質をコードする少なくとも１つのＤＮＡ断片を第２パルボウイルス株から得、
ｃ．パルボウイルスに許容性である細胞を、工程ａおよびｂで得られたＤＮＡ断片でトランスフェクトし、
ｄ．それらのＤＮＡ断片を組換え、
ｅ．該第１パルボウイルスのゲノムの遺伝的コンテクストにおいて該第２パルボウイルスに由来するウイルスカプシドタンパク質をコードする弱毒化組換えウイルスを選択し、
ｆ．細胞培養内でパルボウイルスの産生を可能にする条件下で該細胞を培養し、
ｇ．該細胞培養から該組換えパルボウイルスを得る工程を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の組換えパルボウイルスの入手方法
【請求項８】
該パルボウイルスが、イヌパルボウイルス、ネコパルボウイルスおよびブタパルボウイルスからなる群から選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該第１パルボウイルスがイヌパルボウイルス２型株であり、該第２パルボウイルスがイヌパルボウイルス２ｃ型株である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
パルボウイルスによる感染に対する動物の防御のための、請求項６記載のワクチンの使用。
【請求項１１】
該パルボウイルスがイヌパルボウイルス、特にイヌパルボウイルス２ｃ型である、請求項１０記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１３−５２０９７７（Ｐ２０１３−５２０９７７Ａ）
【公表日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５５４２４（Ｐ２０１２−５５５４２４）
【出願日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５３１６４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０７５３４
【国際公開日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【出願人】（５０６１９６２４７）インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー (85)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５３１６４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０７５３４
【国際公開日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【出願人】（５０６１９６２４７）インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー (85)
【Ｆターム（参考）】
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